生着のための細胞を調製するための方法
本発明は、増大した付着性を有する前駆細胞を調製するためのインビトロでの方法であって、前駆細胞がＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され、それにより増大した付着性を示す前駆細胞を産生する、前記方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、生着のための細胞を調製するための方法、及び再生細胞治療の範囲内における前記方法によって得られる傾向にある細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最近１０年間に渡る、胎児及び成人組織中における幹細胞のより優れた特徴の発見は、細胞治療のための開かれた新たな可能性を有する。これらの原始的な、又は完全に分化していない、高い自己再生能力を有する「前駆細胞」は、完全に分化した細胞を生じさせ得、又は患者へ一度投与された場合において、特異的に分化した表現型を獲得し得る。前駆細胞は、例えば、末梢血、骨髄及び脂肪組織、並びに他の特化した組織、例えば臍帯血を含む、胎児又は成人の組織から単離され得る。
【０００３】
前駆細胞群の同定及び単離のための非常に洗練された方法は、臨床において展開されるべき幹細胞をベースとした治療の開発を強く促進している。さらに、ヒト胎児組織の使用に関する倫理的問題を回避する手段として、成人組織由来の前駆細胞の単離及び移植が好ましい。
【０００４】
前駆細胞を用いた再生細胞治療は、例えば、罹病器官の機能を回復させるために、又は生理学的修復機構が損なわれているときに組織の復元が必要とされているような、器官が危険にさらされている疾患に特に関連があると思われる。
【０００５】
従って、前駆細胞治療の適用の一つの有名な分野は、心疾患に関する。これらの場合において、主要な目的は、新規の血管樹の増殖又は出現を促進することによって、組織灌流を向上させること、或いは現存する血管の機能を改善することである。前駆細胞治療の適用の他の例はまた、血管再生、及び血管前駆体を用いた欠陥のある心臓組織の修復を含む。
【０００６】
大部分の例において、対象となる前駆細胞は、全身循環へと送達される。したがって、現在の手法は、当該循環中におけるそれらの効果を直接的に及ぼす、移植細胞の能力に、又は標的組織に到達し、それらの中に結合し、そして先天性の及びあまり理解されていない機構を通じた、利益のある効果を起こさせる能力に大部分が依存している。
【０００７】
治療効果を最大化するために、前駆細胞の局所的投与がまた、試みられた。より多くの比率の移植された前駆細胞が、組織中に生着し、そしてそれは利益のある効果の向上を提供するだろうと期待される。しかし、移植細胞は通常、局所的基質へ付着することができず、そして大部分が不可解のままであるが、アポトーシスを含むと思われる機構を通じて、速やかに受容組織から排除される。
【０００８】
したがって、生着される細胞の付着能力の欠如、特に標的組織に特異的な付着能力の欠如は、標的組織への細胞生着を危うくし得、そして投与された細胞の著しい損失へとつながり得る（Ａｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０７：２１３４−９）。その結果、投与された細胞は、例えば先天的免疫応答経路を通じてイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で破壊され、血流に入り、そして肝臓及び脾臓のような器官によって排除されるか、又は肺毛細血管中で捕捉されるかのいずれかであり得る。
【０００９】
さらに、細胞治療は、標的組織への投与細胞の生着を超える、さらなる制限を受ける。生着された細胞は、標的組織の復元への関与について有効ではない可能性がある。特に、生着された細胞の不具合は、中期間および長期間の生存の減少によるものであり得、或いは、それらの特性の幾つかの喪失、例えばそれらの血管新生活性（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）及び／又は血管形成活性（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ）の喪失、例えば、増殖因子の減少、及びサイトカイン分泌、又は分化のための及び所望のフェノタイプを獲得するための能力の低下によるものであり得る。
【００１０】
細胞治療に対する上で言及された障害に加えて、他の問題が、生着のための細胞が単離された個体を苦しめる病変から生じる。例えば、糖尿病患者、肥満患者、アテローム性動脈硬化患者、高血圧患者、又は喫煙患者由来の、循環する血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、健常対象のものよりも付着性ではなく、このことは、これらの細胞の、欠陥のある血管新生及び血管形成特性をもたらすことが知られている（Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｎｉｃｋｅｎｉｇ（２００６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．２６：２５７−２６６；Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｎｉｃｋｅｎｉｇ（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：３１８−３３２；Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ７：１４７６−１４８２；Ｌｏｏｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ７：１４６８−１４７５；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：５８３−５９１）。
【００１１】
移植に先立って、ＥＰＣ調製物を成長因子と共に処理することが、血管新生促進効果を向上させ得ることが以前に提案された。したがって、脂肪組織由来サイトカインであるレプチンは、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）で被覆した培養プレートへの、及び成熟内皮細胞へのＥＰＣの付着を著しく向上させ得ることが示された（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）１１４：１２１）。しかし、かかる処置は、インビボにおいては評価されなかった。
【００１２】
したがって、生着されるべき細胞を調製するための既存の方法を改良することが、本発明の目的である。
【００１３】
血液の凝固、及び特に動脈血栓症は、血小板凝集に関与する。凝集した血小板の必須の機能は、脱顆粒化し、そしてそれらの内容物を血流へ放出することである。血小板α顆粒は、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）−１（ＴＳＰ１）を含み、そしてそれは、放出された血小板タンパク質の２５％までを構成する。ＴＳＰ１は、血小板−血小板、血小板−内皮細胞、及び血小板−細胞外マトリックスブリッジの形成に関与することによって、そして単球−マクロファージ、リンパ球、好中球、好塩基球、及び線維芽細胞にさえ関わる炎症反応にさらに関与することによって、血小板凝集の向上を促進する。
【００１４】
ＴＳＰ１は、トロンビンの活性化を後に行う、血小板が放出するタンパク質として最初は同定された。ＴＳＰ１はまた、血管壁中において、機械的損傷後又は糖尿病の間は平滑筋細胞によって、及び血栓症の間、層流血流の摂動の後、又は連続的な低酸素症の後においては内皮細胞によって発現され得る。
【００１５】
ＴＳＰ１は、複数のドメインを有する、独特かつ複雑な構造を有し、そしてそれは、多くの特定の細胞外受容体を活性化する。したがって異なるドメインは、以下に詳述される通り、単一の細胞のタイプにおいて、時折明らかに逆のシグナル経路を誘導し得る。
【００１６】
ＴＳＰ１は、細胞表面において、スカベンジャー受容体ＣＤ３６と主に相互作用し、同様に、インテグリン関連タンパク質（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＤ４７／ＩＡＰ）及びインテグリンと相互作用する。
【００１７】
ＴＳＰ１は、典型的な内因性抗血管新生因子として主に知られている。ＴＳＰ１は、腫瘍において抗血管新生機能を果たし、そしてそれらの進行を阻害する。ＴＳＰ１はまた、再内皮化（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｓａｔｉｏｎ）を阻害し、その後の血管障害及びインビボにおける網膜血管新生を阻害する。
【００１８】
ＴＳＰ１の抗血管新生効果は、少なくとも一つのそのタイプＩドメイン、及びＣＤ３６受容体の活性化によって媒介される。実際ＴＳＰ１は、そのタイプＩドメインのＣＳＶＴＣＧ配列を通じてＣＤ３６と結合する（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５７：１７３５−１７４２）。微小血管内皮細胞、及び腫瘍内皮細胞において、ＣＤ３６と結合するＴＳＰ１は、カスパーゼの活性化、ｐ３８−ＭＡＰＫ、及びｐ５９−Ｆｙｎキナーゼのリン酸化を誘導し、それはアポトーシスをもたらす（Ｊｉｍｅｎｅｚ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：４１−４８）。ＴＳＰ１はまた、線維芽細胞のアポトーシスを引き起こすことが知られており（Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ７：４９３−４９８）、どのようにしてＴＳＰ１が組織の修復及び血管新生を危険にさらすかに関するさらなる手がかりである。
【００１９】
別の周知のＴＳＰ１受容体は、準偏在性（ｑｕａｓｉ−ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）インテグリン関連タンパク質（ＣＤ４７／ＩＡＰ）である。ＣＤ４７／ＩＡＰへのＴＳＰ１の結合は、配列ＲＦＹＶＶＭＷＫ（４Ｎ１−１、配列番号３）を特に含む、ＴＳＰ１のカルボキシ末端で起こる。
【００２０】
４Ｎ１−１（Ｆｒａｚｉｅｒ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８８０８−１４）として知られるトロンボスポンジン−１のＣ末端ドメイン由来のペプチド、又はその誘導体である４Ｎ１Ｋは、ＣＤ４７／ＩＡＰと、ＴＳＰ１と同様の様式で結合し得る。ＣＤ４７／ＩＡＰ結合ドメインは、種とＴＳＰアイソフォームとの間で高度に保存されている。
【００２１】
ＴＳＰ１及び４Ｎ１−１によるＣＤ４７の活性化は、成熟内皮細胞中のＣＡＭファミリータンパク質の発現を誘導することが示された。したがってＴＳＰ１は、ＣＡＭ発現血管内皮への、循環細胞、特にα4β1インテグリン発現炎症性細胞の動員を可能とする（Ｎａｒｉｚｈｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２００５；ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９：１１５８−６０）。
【００２２】
しかし、かかる機構は、循環する未分化前駆細胞について説明されていない。さらに、ＴＳＰ１又は４Ｎ１−１によるＣＤ４７の活性化はまた、アポトーシス及び成熟内皮細胞の死滅を誘導する（Ｆｒｅｙｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２７１：５８４−５８８；Ｆｒｅｙｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２８６：１４１−１４９；Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ８：５３１−５３８）。したがって、ＣＤ４７作動薬は、抗血管新生剤として知られ、そしてそれは、血管新生及び固形腫瘍の成長を防止するための新規潜在的手法において使用され得る（Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：１０２６−１０３６）。ＣＤ４７の発現及び活性化はまた、インビボにおける血管新生モデルにおいて、血管新生及び内皮細胞の死滅を阻害することと関連している（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１００：７１２−２０）。
【００２３】
ＴＳＰ１が、細胞内骨格及び接着斑プラークの分解、増殖阻害、カスパーゼの活性化、及び最終的にアポトーシスへとつながることがさらに提案された。さらに、ＴＳＰ１は、正常内皮細胞の機能及び生存の強力な促進剤である一酸化炭素（ＮＯ）シグナルを阻害する（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２６０６９−８０；Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：１５４０４−１５）。したがって、内皮細胞のアポトーシスは、ＴＳＰ１の抗血管新生効果の主要な特徴であると思われる。
【００２４】
さらに、ＴＳＰ１は、糖尿病の骨髄由来の前駆細胞によって発現され得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９８：６９７−７０４）。この場合において、ＴＳＰ１が成熟内皮細胞において抗血管新生を行う役割を維持しているとき、ＴＳＰ１は、血管損傷後における前駆細胞の付着及び再内皮細胞化（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）への前駆細胞の貢献を阻害することが示された。
【００２５】
したがって、先の研究の観点から、ＴＳＰ１及びＣＤ４７作動薬は、細胞の付着を増大させることができず、したがって、血管形成促進（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）療法又は血管新生を促進することができないと思われる。
【００２６】
さらに、血小板凝集における既知の血栓形成促進性効果（Ｖｏｉｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４４：２４０−５）にも関わらず、大量の４Ｎ１Ｋペプチドの全身注射が致死性のものではなく、そして全凝固パラメータを調節しない（Ｂｏｎｎｅｆｏｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：９５５−６４）点に注目することは特に興味深い。したがって、４Ｎ１−１、４Ｎ１Ｋ又は派生ペプチドは、健常対象において著しい毒性効果を有するとは思われない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
発明の説明
本発明は、ＴＳＰ１によって、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ（配列番号３）を含むＴＳＰ１誘導体によって処理された、分化時において内皮細胞を産生する可能性の高い細胞が、細胞外マトリックスへと付着し、そして内皮細胞へと分化する増大した能力を有し、そしてそれらが虚血組織において機能的な血管系を回復することを支援することが可能であるという、発明者による予想外の発見から特に生じている。
【００２８】
したがって、本発明は、増大した付着性を有する前駆細胞を調製するインビトロでの方法であって、前駆細胞がＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され、それにより増大した付着性を示す前駆細胞を産生する、前記方法に関する。
【００２９】
本発明はまた、増大した付着性を有する前駆細胞を調製するためのインビトロでの方法であって、前駆細胞がＲＦＹＶＶＭＷＫ若しくはＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む、又はからなるポリペプチドと接触され、それにより増大した付着性を示す前駆細胞を産生する、前記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＢＳＡ、又は組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１を用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン又はフィブリンゲル上における、３０分間のＰＢＭＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２】図２は、増加する濃度の組み換えＴＳＰ１を用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン上における、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図３】図３は、ＰＰＰ、組み換えＴＳＰ１、若しくはペプチド４Ｎ１−１の不在下、又は存在下における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、１６時間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ゼラチン＋ビトロネクチン）。
【図４】図４は、ＢＳＡ、又は組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１又は４Ｎ１−２を用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン、又はフィブリンゲル上への、３０分間のＰＢＭＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図５】図５は、ＢＳＡ、増加する濃度の組み換えＴＳＰ１、又は増加する濃度のペプチド４Ｎ１−１を用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着の比較試験を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図６】図６は、ＢＭ−ＭＮＣをペプチド４Ｎ１−１（５０ｍＭ）で、０、１、５、１０、３０又は１２０分間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図７】図７は、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチドＣＳＶＴＣＧ、４Ｎ１−１、又は対照としてのＢＳＡを用いて（左側のパネル；*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）、或いはＧＳＴ結合組み換えドメインＮＨ２であるヒトＴＳＰ１のタイプＩ、タイプＩＩ、若しくはタイプＩＩＩ、又はＧＳＴタグ単体（右側のパネル）を用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す。
【図８】図８は、ＢＳＡ、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン、又はフィブリンゲル上への、１５分間のＨＵＣＢ−ＥＰＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図９】図９は、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１、又はＢＳＡを用いた２時間の前処理後における、ＩＬ１βで活性化されたマウス内皮単層上への、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１０】図１０は、ペプチド４Ｎ１−１、又はＢＳＡを用いた２時間の前処理後における、ＩＬ１βで活性化されたマウス内皮単層上への、３０分間の、蛍光ラベルされたＢＭ−ＭＮＣ付着の顕微鏡写真を示す（倍率４００倍）。
【図１１】図１１は、ペプチド４Ｎ１−１、又はＢＳＡを用いた３０分間の刺激前及び刺激後における、ＢＭ−ＭＮＣの表面上でのインテグリンβ1、β2、β3及びαV、並びにＰＳＧＬ１の発現を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１２】図１２は、対照のＢＳＡ、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１、４Ｎ１−２、又はＣＳＶＴＣＧを用いた２時間の前処理後、５日間培養されたＢＭ−ＭＮＣの内皮細胞分化を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ、又は対照）。
【図１３】図１３は、対照のＢＳＡ、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１、４Ｎ１−２、又はＣＳＶＴＣＧを用いて、培養前に２時間（左側のパネル）、或いは連続的に５日間（真ん中のパネル）、或いはスタウロスポリンと共に最終的に６時間（右側のパネル）処理した後、培地中で５日後におけるＢＭ−ＭＮＣのアポトーシスを示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１４】図１４は、画像解析により細胞面積を測定することによる、ＢＳＡ、又はペプチド４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて２時間前処理し、そして３０分間付着させた後における、ゼラチン−ビトロネクチンマトリックス上へのＢＭ−ＭＮＣの拡散を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１５】図１５は、ペプチド４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて０、１０、若しくは６０秒、又は１０若しくは３０分間前処理した後における、ＦＡＣＳの前方散乱光（ＦＳｃ）及び側方散乱光（ＳＳｃ）によって測定される、ＢＭ−ＭＮＣ形状の速やかな変化を示す。データは、ＦＳｃ及びＳＳｃの点の分布として示される。
【図１６】図１６は、ペプチド４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて又は用いないで、６０秒間前処理した後に、ＦＡＣＳの前方散乱光（ＦＳｃ）及び側方散乱光（ＳＳｃ）によって測定される、ＢＭ−ＭＮＣ形状の速やかな変化を示す。データは、ＦＳｃ及びＳＳｃ分布の個々のプロファイルとして示される。
【図１７】図１７は、生体顕微鏡検査によって観測される、ＦｅＣｌ3で誘導される血栓症前（−２〜０分）、及び血栓症後におけるＣ５７ＢＬ／６野生型マウスの腸間膜静脈におけるＢＭ−ＭＮＣの時間依存的動員（１分あたりの新しい細胞の相互作用、毎分）を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ｔ＝０分）。
【図１８】図１８は、ペプチド４Ｎ１−１又はＢＳＡで２時間前処理された後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜静脈において、血栓症に罹患した表面上におけるＢＭ−ＭＮＣの回転速度（損傷後の最初の１０分間における平均回転速度）を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１９】図１９は、ペプチド４Ｎ１−１又はＢＳＡで２時間前処理された後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜静脈における、血栓症に罹患した表面上へ安定して付着したＢＭ−ＭＮＣの数（損傷後の最初の１０分間における、累積した安定な付着）を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２０】図２０は、ＢＳＡ又はペプチド４Ｎ１−１で２時間前処理されたＢＭ−ＭＮＣの結紮及び注射から１４日経過後における、虚血性後肢皮膚血流量を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２１】図２１は、ＢＳＡ又はペプチド４Ｎ１−１で２時間前処理されたＢＭ−ＭＮＣの結紮及び注射から１４日経過後における、微小血管造影スコアを示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。灌流される血管ネットワークは、Ｘ線画像解析を通じて定量化される。
【図２２】図２２は、ペプチド４Ｎ１−１又は対照としてＢＳＡを用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間の、野生型又はＯｂ／Ｏｂレプチン欠損肥満マウスから得られたＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ；**ｐ＜０．０５野生型 ｖｓ Ｏｂ／Ｏｂ）。
【図２３】図２３は、ペプチド４Ｎ１−１又は対照としてＢＳＡを用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間の、非糖尿病の野生型マウス、又はストレプトゾトシンで処置された糖尿病の野生型マウスから得られたＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ対照；**ｐ＜０．０５非糖尿病 ｖｓ 糖尿病）。
【図２４】図２４は、ＢＳＡ、又は、野生型若しくはＴＳＰ１−／−ＳＷＩＳＳマウスから得られた血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ）を用いて２時間前処理した後、フィブリンゲル上への、３０分間の、ＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２５】図２５は、生体顕微鏡検査によって観測される、ＦｅＣｌ3で誘導される血栓症前（−２〜０分）、及び血栓症後における、野生型、又はＴＳＰ１−／−ＳＷＩＳＳマウスの腸間膜静脈における野生型ＢＭ−ＭＮＣの時間依存的動員（１分あたりの新しい細胞の相互作用、毎分）を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ 野生型）。
【図２６】図２６は、ペプチド４Ｎ１−１、４ＮＧＧ、４Ｎ１−２、７Ｎ３、７ＮＧＧ、若しくは組み換えＴＳＰ１、又は対照としてのＢＳＡを用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間の、ＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２７】図２７は、組み換えＴＳＰ１、ＳＤＦ１、ＥｐｈＢ２−Ｆｃ、ＶＥＧＦ−豊富培地ＥＢＭ２、又は組み換えマウスレプチン、対照としてＢＳＡを用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間の、ＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２８】図２８は、対照ＢＳＡ、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７ＩｇＧ１クローンＢ６Ｈ１２、又は適合された対照アイソタイプマウスＩｇＧ１を用いて３０分間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、１５分間の、ＨＵＣＢ−ＥＰＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２９】図２９は、スタウロスポリンの存在下における０時間（対照）又は６時間後の懸濁液における、又はペプチド４Ｎ１−１（斜線のバー）又は４Ｎ１−２（黒色のバー）を用いて、１０及び１２０分間の前処理に引き続き、培地中２４時間後の懸濁液におけるＢＭ−ＭＮＣのアポトーシスを示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ 対照）。
【図３０】図３０は、ペプチド４Ｎ１−１、又はＢＳＡを用いた３０分間の刺激前及び刺激後における、ＢＭ−ＭＮＣの表面上でのインテグリンβ1、β2、及びβ3、並びにαV、及びＰＳＧＬ１の共発現を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書において意図される、表現「増大した付着性」は、本発明の方法を用いて調製された前駆細胞が、未処理の前駆細胞よりも高い付着を示すことを意味する。より高い付着は、試験組織上における、又は試験基質上、例えばゼラチン／ビトロネクチン、又はフィブリンのゲル上における付着性前駆細胞の数を定量することによって決定され得る。
【００３２】
調製された前駆細胞が、個体の標的組織中における生着を目的としていることが特に好ましい。したがって、本発明はまた、個体の標的組織中における生着のための前駆細胞を調製するための方法であって、生着されるべき前記前駆細胞が、生着に先立って、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ若しくはＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む、又はからなるポリペプチドと接触される、前記方法に関する。
【００３３】
本明細書において意図される、表現「生着」は、標的組織内への細胞の送達及び付着、又は取り込みに関する。
【００３４】
本明細書において意図される、表現「標的組織」は、類似の又は異なる表現型を有し、全体的に一つの又は幾つかの特性を示し、その環境からそれを区別可能とする任意の細胞群に関する。本明細書において意図される標的組織は、多細胞生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト中において見られ得る。好ましくは、当該組織は、非液体組織である。より好ましくは、当該組織は、心筋及び骨格筋、脳、膵臓、皮膚、腎臓、血管及び他の血管構造から構成される群から選択される。
【００３５】
本明細書において意図される、表現「前駆細胞」は、一つ以上の細胞のタイプに分化する傾向にある、ディビジョン・コンピテント細胞（ｄｉｖｉｓｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）である。好ましくは、前駆細胞は分化していない。前駆細胞は幹細胞を、特に成人の幹細胞及び胎児の幹細胞を含む。
【００３６】
本明細書において意図される、表現「細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞」は、増大した付着性のような特性を示し、個体へ送達されたときに、その後に、標的組織中における成功した付着又は取り込みを一般的に示す、上で定義された前駆細胞に関する。
【００３７】
本明細書において意図される、表現「細胞治療」は、欠如、障害又は疾患を処置するための、個体における生細胞の送達に関する。
【００３８】
当業者にとって明らかなことであるが、調製されるべき前駆細胞が真核細胞であることが好ましい。より好ましくは、前駆細胞は、標的組織中において見られる細胞とタイプにおいて類似しており、又は分化時に、標的組織中において見られる細胞とタイプが類似の細胞を産生する傾向にある。特に、前駆細胞は、内皮細胞へと分化する傾向にあり、すなわち当該前駆細胞は内皮前駆細胞（ＥＰＣ）である。
【００３９】
好ましくは、前駆細胞は、脂肪組織、骨髄、肝臓、脾臓、及び血液から構成される群から選択される組織に由来する。当業者にとって明らかであろうことだが、前駆細胞は、精製された形態で、又は前駆細胞と同一の組織に特に由来し得る他の細胞を含む、精製されていない形態のいずれかで使用され得る。当該前駆細胞が骨髄に由来し、そして血管を修復することを特に目的とするとき、非分画の骨髄単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）は、前駆細胞の非精製形態として使用され得る。
【００４０】
好ましくは、前駆細胞は、個体のものよりも同一種のものである。前駆細胞はまた、個体由来のものであることが特に好ましい。
【００４１】
同様に好ましくは、上で定義された方法において使用される前駆細胞は、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体を発現する。
【００４２】
本明細書において使用される、表現「ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体を発現する」は、調製されるべき前駆細胞が、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体をコードするｍＲＮＡ、若しくはそのＲＮＡ前駆体、及び／又はＣＤ４７／ＩＡＰ受容体からなるタンパク質を含む。好ましくは、ｍＲＮＡは、配列番号１の配列を含む。同様に好ましくは、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体は、配列番号２の配列からなる。ｍＲＮＡ、又はその前駆体の検出は、当業者に周知の種々の技術、例えばＲＴ−ＰＣＲによって行われ得る。タンパク質の検出はまた、当業者に周知の種々の技術、例えば抗ＣＤ４７／ＩＡＰ抗体を使用する免疫検出によって行われ得る。
【００４３】
本明細書において意図される、表現「ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬」は、ＴＳＰ１タンパク質又はＲＦＹＶＶＭＷＫペプチド（配列番号３）の結合によって誘導される応答と事実上類似している、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の応答を誘導する傾向にある任意の分子に関する。例として、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ９：８６５−８７４に記載されたように、ＣＤ４７／ＩＡＰの作動薬は、血管平滑筋細胞におけるα2β1インテグリンの発現及び活性化を促進する傾向にある。
【００４４】
例えば、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬は、抗ＣＤ４７作動薬抗体、例えばＧｒｅｓｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１９３５−１９４３；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ（１９９８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：８６５−８７４；Ｔｉｃｃｈｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ（２００１）１５：３４１−３５０；及びＢａｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２８５９−４２８６６によって記載されたＢ６Ｈ１２抗体、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：３６２１−３６２８によって記載されたＣＩＫｍ１抗体、又はＷａｎｇ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ（１９９８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：８６５−８７４によって記載された１Ｆ７抗体であり得る。
【００４５】
当該作動薬はまた、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：５５９−５６２；Ｂａｂｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：３６５２−３６５８；Ｓｅｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９７：２７４１−２７４９；及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６５：６８０−６９３によって記載されたＳＩＲＰα１タンパク質であり得る。
【００４６】
しかし、当該作動薬は、アミノ酸配列ＶＶＭを含むポリペプチドであることが好ましい。
【００４７】
かかる作動薬は、当業者に周知である。
【００４８】
特にそれらは、以下に記載されたような、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体結合ペプチドから選択される：
−Ｖｏｉｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５４４：２４０−２４５；Ｂａｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２８５９−４２８６６（配列ＲＦＹＶＶＭＷＫのペプチド４Ｎ１−１）；
−Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３５：５３３−５４４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４７：３８９−３９９；Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５２：２６２−２７２；Ｔｉｃｃｈｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＦＡＳＥＢ Ｊ １５：３４１−３５０；Ｂａｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２８５９−４２８６６；及びＬｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：６５４−６６１（配列ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ、配列番号４のペプチド４Ｎ１Ｋ）；
−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：３６２１−３６２８；Ｂａｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２８５９−４２８６６；及びＩｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２６０６９−２６０８０（配列ＦＩＲＶＶＭＹＥＧＫＫ（配列番号９）のペプチド７Ｎ３）；並びに
−米国特許第６，４６９，１３８号明細書（ＲＦＹＶＶＭＷＫＱＶＴＱＳ（配列番号１０）；及びＦＩＲＶＶＭＹＥＧＫＫ（配列番号９））。
【００４９】
好ましくは、当該作動薬は、ＲＦＹＶＶＭＷＫ（４Ｎ１−１、配列番号３）、例えばＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ（４Ｎ１Ｋ、配列番号４）若しくはＲＦＹＶＶＭＷＫの誘導体を含む、又はからなるポリメプチドである。
【００５０】
４Ｎ１−１は、ヒトＴＳＰ１の１０３４〜１０４１番のアミノ酸を特に表す。
【００５１】
本明細書において意図される、ＲＦＹＶＶＭＷＫの誘導体は、当該誘導体が、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体に対するＲＦＹＶＶＭＷＫと、本質的に同一の作動薬特性を示すという条件下において、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失又は挿入によって、及び／又は化学的処理によってＲＦＹＶＶＭＷＫから得られる任意のポリペプチドに関する。
【００５２】
好ましくは、当該作動薬は、ＴＳＰ１タンパク質の断片である。本明細書において意図されるＴＳＰ１タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＮＰ−００３２３７及び配列番号５で特に表されるヒトＴＳＰ１タンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＡＡ５０６１１及び配列番号６で特に表されるマウスＴＳＰ１タンパク質、又はＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＮＰ−０００１０１３０８０及び配列番号７で特に表されるラットＴＳＰ１タンパク質であることが好ましい。最も好ましくは、ＴＳＰ１タンパク質は、ヒトＴＳＰ１である。特に、当業者にとって明らかであろうことだが、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含むＴＳＰ１タンパク質の任意の断片は、本明細書において意図されるＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と考えられ得る。
【００５３】
好ましくは、当該作動薬がＴＳＰ１タンパク質の断片であるとき、それはタイプＩリピート及びＣＤ３６作動薬ドメイン、例えば配列ＣＳＶＴＣＧ（配列番号８）のいずれも含まない。
【００５４】
本明細書において意図されるＲＦＹＶＶＭＷＫペプチドの「類縁体」は、形状、電荷分布、及び親水性／疎水性分布において、ペプチドＲＦＹＶＶＭＷＫと類似している任意の分子に関する。
【００５５】
上で定義された方法の別の有利な実施形態において、調製された前駆細胞は、標的組織中において成熟細胞へと分化する傾向にあり、そして前記方法に従って調製されなかった類似の細胞と比較して、調製された細胞の分化が加速される。
【００５６】
上で定義された方法のさらなる実施形態において、当該細胞は、好ましくは１０秒〜２時間、作動薬と接触される。
【００５７】
別の実施形態において、上の方法は、例えばゼラチン／ビトロネクチン又はフィブリンのゲル上において、調製された細胞中の付着細胞をさらに選択するステップを含む。
【００５８】
実際に、異なる細胞は、作動薬接触段階において異なるように応答し得、したがって、細胞を付着画分及び非付着画分へと分離し得、そして向上した付着能力を有する画分を使用することは、治療的細胞生着率を向上させるために有利である。
【００５９】
本発明はまた、細胞生着を必要とする個体を処置することを目的とした医薬の製造のための、上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞の使用に関し、又は細胞生着を必要とする個体を処置するための方法であって、上で定義されたインビトロでの方法によって調製された治療上有効な量の細胞が、前記個体へ投与される、前記方法に関する。それはまた、細胞生着を必要とする個体を治療するための、上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関する。
【００６０】
本発明は、血管系の機能不全を患う個体を処置することを目的とした医薬の製造のための、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の上で定義された作動薬の少なくとも一つの使用にさらに関し、又は血管系の機能不全を患う個体を処置するための方法であって、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の上で定義された少なくとも一つの作動薬の治療上有効な量が、前記個体へ投与される、前記方法に関する。それはまた、血管系の機能不全を患う個体を処置するための、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の上で定義された作動薬に関する。
【００６１】
本発明はまた、血管系の機能不全を患う個体を処置することを目的とした医薬の製造のための、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなる、上で定義されたポリペプチドの少なくとも一つの使用に関し、又は血管系の機能不全を患う個体を処置するための方法であって、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなる、上で定義されたポリペプチドの少なくとも一つの治療上有効な量が前記個体に投与される、前記方法に関する。それはまた、血管系の機能不全を患う個体を処置するための、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなる、上で定義されたポリペプチドに関する。
【００６２】
本明細書において意図される個体は、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに関する。
【００６３】
好ましくは、個体は、血管系の機能不全を患っている。より好ましくは、個体は、血管の再生又は新生を必要としている。最も好ましくは、個体は、アテローム性動脈硬化、糖尿病、肥満、心筋梗塞、コロナロパシー（ｃｏｒｏｎａｒｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性網膜症、腎血管硬化症、脳虚血、血栓症、内皮機能不全、肺高血圧、外傷性皮膚創傷、潰瘍、及び熱傷から構成される群から選択される病変を患う。
【００６４】
本発明はまた、上で定義された個体が、上で定義された細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞を用いた処置から利益を受けるか否かを決定するためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記個体から採取された、上で定義された前駆細胞、好ましくは細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞と同一タイプの前駆細胞が、上で定義されたＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と、又は上で定義された、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなるポリペプチドと接触され；
（ｉｉ）前記接触された前駆細胞の付着性が評価され；
それにより、前記前駆細胞が増大した付着性を示す場合には、患者は細胞治療において有効であることが知られている前記前駆細胞を用いた処置から利益を受ける可能性があると決定されること
を含む、前記方法に関する。
【００６５】
本発明はまた、上で定義された個体が、上で定義された増大した付着性を有する前駆細胞を調製するためのインビトロでの方法によって調製された細胞を用いた処置から利益を得るか否かを決定するためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記個体から採取された、上で定義された前駆細胞が、上で定義されたＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と、又は上で定義された、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなるポリペプチドと接触され；
（ｉｉ）前記接触された前駆細胞の付着性が評価され；
それにより、前記前駆細胞が増大した付着性を示す場合には、上で定義された増大した付着性を有する前駆細胞を調製するためのインビトロでの方法によって調製された細胞を用いた処置から利益を得る可能性があると決定されること
を含む、前記方法に関する。
【００６６】
逆に、本発明は、野生型のＴＳＰ１発現をノックアウトしたマウスにおいて、分化時に内皮細胞を産生する傾向にある細胞において、血栓部位へと動員される能力が減少したことを示した。さらに、これらの動物から単離されたＴＳＰ１欠損血小板によって放出される血小板の脱顆粒化産物は、分化時に内皮細胞を産生する傾向にある細胞の、インビトロにおける固定化された細胞外マトリックスへの付着を刺激する能力の減少を示した。
【００６７】
したがって、本発明は、細胞付着又は細胞生着を示唆する病的過程を示す個体における細胞付着又は細胞生着を防止するための方法であって、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の少なくとも一つの拮抗薬の有効量が前記個体へ投与される、前記方法に関する。
【００６８】
本発明はまた、細胞付着又は細胞生着を示唆する病的過程を示す個体における細胞付着又は細胞生着を防止することを目的とする医薬の製造のための、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の少なくとも一つの拮抗薬の使用に関する。それはまた、細胞付着又は細胞生着を示唆する病的過程を示す個体における細胞付着又は細胞生着を防止するための、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の拮抗薬に関する。
【００６９】
本明細書において意図される、表現「ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の拮抗薬」は、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の活性を阻害する、及び／又はＣＤ４７／ＩＡＰ受容体を不活性化する傾向にある任意の化合物であって、しかし同様にＴＳＰ１の結合を阻害する傾向にある任意の化合物、そして同様にＲＦＹＶＶＭＷＫ配列を含有する作動薬、又は任意のＲＦＹＶＶＭＷＫ配列様作動薬の、それらの同種受容体、例えば、特にＣＤ４７／ＩＡＰ受容体への結合を阻害する傾向にある任意の化合物に関する。
【００７０】
好ましくは、病的過程は、糖尿病性網膜症及びアテローム性動脈硬化である。
【００７１】
かかる使用又は方法は、特に細胞治療の範囲内において、非標的組織への及び／又は好ましくない部位における、投与された治療細胞の所望ではない付着又は生着を防止するために有用であり得る。この特定の場合において、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体拮抗薬は、前駆細胞の付着が防止され得る部位に、局所的に投与され得る。
【実施例】
【００７２】
材料及び方法
試薬及び抗体
ヒト組み換えＴＳＰ１は、ＥＭＰ−Ｇｅｎｅｔｅｃｈにより製造され、そしてヒト精製ＴＳＰ１は、Ｄｒ．Ａｒｎａｕｄ Ｂｏｎｎｅｆｏｙ、Ｉｎｓｅｒｍ Ｕｎｉｔ Ｕ５５３、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｓt Ｌｏｕｉｓ（Ｐａｒｉｓ）により調製された。合成ペプチド４Ｎ１−１（ＲＦＹＶＶＭＷＫ、配列番号３）及び４Ｎ１−２（ＲＦＹＶＶＭ、配列番号１１）を、Ｂａｃｈｅｍ Ｌｔｄから得た。ペプチド７Ｎ３（ＦＩＲＶＶＭＹＥＧＫＫ、配列番号９）、４ＮＧＧと呼ばれる変異した４Ｎ１−１（ＲＦＹＧＧＭＷＫ、配列番号：１２）、及び７ＮＧＧと呼ばれる変異した７Ｎ３（ＦＩＲＧＧＭＹＥＧＫＫ、配列番号：１３）は、ＮｅｏＭＰＳ，Ｆｒａｎｃｅにより合成された。精製ヒトフィブロネクチン及びトロンビン、スタウロスポリン及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＳｉｇｍａから得、フィブリノーゲンをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから得た。
【００７３】
細胞表面受容体の蛍光ラベル化及び阻害のために、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７ＩｇＧ１（クローンＢ６Ｈ１２）、及びＦＩＴＣ結合抗マウスインテグリンβ１アルメニアン（ｈａｒｍｅｎｉａｎ）ハムスターＩｇＧをＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入した。Ｂ６Ｈ１２と適合した対照アイソタイプマウスＩｇＧ１はＣｈｅｍｉｃｏｎより提供された。ビオチン結合抗マウスインテグリンβ2ラットＩｇＧ２ａｋａｐｐａ、フィコエリトリン結合抗マウスＰＳＧＬ１ラットＩｇＧ１ｋａｐｐａ、ＦＩＴＣ結合アルメニアンハムスターＩｇＧ、ビオチン結合ラットＩｇＧ２ａ−ｋａｐｐａ、フィコエリトリン結合ラットＩｇＧ１ｋａｐｐａ、及びＰｅｒ−ＣＰ結合ストレプトアビジンを、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。フィコエリトリン結合抗マウスインテグリンβ3アルメニアンハムスターＩｇＧ、ビオチン結合抗マウスインテグリンαvラットＩｇＧ１ｋａｐｐａ、フィコエリトリン結合アルメニアンハムスターＩｇＧ、及びビオチン結合ラットＩｇＧ１ｋａｐｐａは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより提供された。分析を、Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｋｉｎｓｏｎのＣａｎｔｏ−ＩＩ蛍光支援セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて行った。
【００７４】
組み換えヒトストローマ由来因子１α（ＳＤＦ１）を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、組み換えキメラエフリン−Ｂ２-Ｆｃ（ＥｐｈＢ２−Ｆｃ）を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得、そして組み換えヒトレプチンはＢｉｏｖｉｓｉｏｎから提供された。
【００７５】
動物
１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６及びＳｗｉｓｓ遺伝的背景を有する野性型雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用した。雄ＴＳＰ欠損ＳＷＩＳＳマウスを、Ｄｒ．Ａｒｎａｕｄ Ｂｏｎｎｅｆｏｙ、Ｉｎｓｅｒｍ Ｕｎｉｔ Ｕ５５３、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｓt Ｌｏｕｉｓ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。生体顕微鏡検査に関しては、マウスを４週齢で使用した。Ｃ５７Ｂｌ６遺伝的背景を有する肥満Ｏｂ／Ｏｂレプチン欠損トランスジェニックマウスを、Ｈａｒｌａｎ−Ｆｒａｎｃｅから得た。１型糖尿病（インスリン依存性）を雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎｅ）（膵臓のベータ細胞を破壊することが知られている）を毎日、１〜２週間、血糖が３００ｍｇ／ｋｇに達するまで注射することによって導入した。当該マウスはその後、糖尿病と見なされ、そして２か月間、標準食餌（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）で飼育される。
【００７６】
細胞培養
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの大腿骨及び上腕を注意深く切開し、骨髄を抽出及び解離し、そして骨髄単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０８３，Ｓｉｇｍａ）での分画遠心法（２，０００ｒ．ｐ．ｍ、２５分）によって分離した。ＢＭ−ＭＮＣをその後ＰＢＳで洗浄し、そしてペレット化した（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）（２，０００ｒ．ｐ．ｍ、１０分）。
【００７７】
ＦＡＣＳアッセイに関して、新鮮細胞を、指示されたペプチド及び時間で処理し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定化し、そして細胞の大きさの分布を前方散乱光及び側方散乱光の分析によって決定するために、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ−ＸＬセルソーターを用いて分析した。データは、点分布図として又は個々のＦｓｃ及びＳｓｃの分布特性としてのいずれか一方で示された。
【００７８】
代わりに、ＢＭ−ＭＮＣを再懸濁し、そして内皮細胞基本成長培地（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｂａｓａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＢＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、又は血管内皮増殖因子−１６５（ＶＥＧＦ）及び線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）を豊富に含み、そしてウシ胎仔血清（ＦＣＳ、２０％）をさらに添加したＥＢＭ２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で培養された。細胞をゼラチン（０．１％）−ビトロネクチン（０．５％μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）であらかじめ被膜したウェル中で培養した。ペプチド濃度及び時間の指示された条件で培養した後、個々の細胞が占める領域を決定するために、ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを用いて、当該細胞の範囲を定めることによって細胞拡散を測定した。５０個超の細胞を３つの独立した細胞培養に関する３つのランダムに選択した領域において測定した（倍率４００倍）。拡散を一細胞あたりの相対面積単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｒｅａ ｕｎｉｔｓ）で表現した。
【００７９】
マウスの循環血液を、後方の眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）における静脈穿刺を通じて得、そしてヘパリン（５ＵＩ／ｍｌ）を含有する抗凝結バッファーと混合した。循環末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０８３、Ｓｉｇｍａ）（２，０００ｒ．ｐ．ｍ、２５分）を通じて精製した。そして血小板の混入を排除するために、細胞をＰＢＳ中で２度洗浄かつペレット化した（２，０００ｒ．ｐ．ｍ、５分）。
【００８０】
ＳＶ４０形質転換マウス骨髄内皮細胞（ＡＴＣＣからのＳＶＥＣ）を、２４ウェルプラーク中、２０％ＦＣＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中で、それらが完全培養密度に達するまで（７日間）増殖させた。細胞−細胞付着実験に先立って、ＳＶＥＣ単層を、５ｎＭマウスインターロイキン−１β（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で２時間活性化した。
【００８１】
Ｈｏｐｉｔａｌ Ｌａｒｉｂｏｉｓｉｅｒｅ ａｎｄ Ｉｎｓｅｒｍ倫理ガイドラインに従って標準的な手順によって、ヒト臍帯血（３０〜５０ｍｌ）を、ヘパリン（１５ＵＩ／ｍｌ、Ｓａｎｏｆｉ）を含有する滅菌チューブ中に集めた。ＰＢＭＣを、フィコール勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）を通じて単離した。成熟内皮細胞を除去するために、単核細胞（６．１０6細胞／ｍｌ）を培養ディッシュ（１００×２０ｍｍ）中、３７℃、５％ＣＯ2で１６時間、播種した。付着細胞を除去した。非付着細胞を培養し、そして６ウェルプレート（１０7細胞／ウェル）において、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳバッファー（２５ｍＭ；Ｅｕｒｏｂｉｏ）、抗生剤及び抗真菌剤（ペニシリン１００００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍｌ、ファンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）２５μｇ／ｍｌ）及び２０％ＦＣＳ（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）、並びに１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたＭ１９９成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中のコラーゲンタイプ１マトリックス（Ｃｏｌｌｉ；９０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）上で、ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞（ＨＵＣＢ−ＥＰＣ）へと分化させた。
【００８２】
細胞調製物の前処理
ゼラチン／ビトロネクチン、フィブリンゲル又は活性化ＳＶＥＣ単層上への細胞付着における、ＴＳＰ１又はそのカルボキシ末端配列由来のペプチド、４Ｎ１−１、及び４Ｎ１-２の効果を評価するために、特定の長さの時間でのＰＢＳ洗浄及び培養以前に、２．１０6／ｍｌ ＢＭ−ＭＮＣ若しくはＰＢＭＣ、又は１０6／ｍｌ ＨＵＣＢ−ＥＰＣを、ＴＳＰ１（５０〜１００μＭ）、又は４Ｎ１−１若しくは４Ｎ１−２ペプチド（１００μＭ）、又は対照ＢＳＡ（１％）の存在下、又はマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７ ＩｇＧ１ Ｂ６Ｈ１２（４０μｇ／ｍｌ）、又は適合された対照アイソタイプマウスＩｇＧ１（４０μｇ／ｍｌ）の存在下、５％ＣＯ2下のインキュベーター中、３７℃で２時間前処理した。付着実験に関して、上清を除去し、付着細胞をＰＢＳにて軽く洗浄した。高倍率視野あたりの付着細胞の数を、倒立型位相コントラスト顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を高倍率（４００倍）で使用して、１ウェルあたり３〜５つの領域で集計した。
【００８３】
血小板の欠乏した血漿
マウスの循環血液を、後方眼窩洞の静脈穿刺（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）を通じて得、そしてヘパリン（５ＵＩ／ｍｌ）を含有する抗凝結バッファーと混合し、そして赤血球及び白血球を除去するために、２０００ｒ．ｐ．ｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、そして血小板を除去するために、１１，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離した。この最後の上清は、血小板の欠乏した血漿（ＰＰＰ）と見なされた。
【００８４】
血小板脱顆粒化産物
ペントバルビタールナトリウム（Ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ−Ｎａ）の過剰用量（Ｃｅｒｖａｌ、Ｆｒａｎｃｅ）を通じた末端麻酔（ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）の後、マウス血液を、心臓内穿刺を通じて得た。血液をＡＣＤ−Ｃバッファー（クエン酸１３０ｍＭ、クエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｃ ｃｉｔｒａｔｅ）１２４ｍＭ、グルコース１１０ｍＭ）を用いて抗凝固され、そして自発的血小板活性化を防止するために、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１ １０〜８Ｍ）と共に、１時間、室温でインキュベートした。血液をその後、１５分間、１２０ｇで、１５℃にて遠心分離し、血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）を回収した。ＰＲＰをその後、洗浄バッファー（ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、クエン酸三ナトリウム １２ｍＭ、グルコース １０ｍＭ、ショ糖 １２．５ｍＭ、ｐＨ６．０）と混合し、そして１５分間、１，２００ｇで遠心分離した。血小板が反応バッファー（ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ３ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ０．５ｍＭ、ＮａＨＣＯ3 ５ｍＭ、グルコース １０ｍＭ、ｐＨ７．４）中にて再懸濁される前に、血小板のペレットを洗浄し、そして１５分間、１，２００ｇにて、再度ペレット化した。血小板を数え、当該懸濁液を６００，０００血小板／μｌへと調整し、そして機能的凝集試験に先立ちＰＧＥ１を除去するために、室温で３０分間放置した。
【００８５】
血小板凝集を、Ｂｏｒｎ（１９６２）による濁度法に従うＣｈｒｏｎｏｌｏｇ血小板凝集計（Ｋｏｒｄｉａ、Ｈｏｌｌａｎｄ）を用いて測定した。血小板懸濁液（４００μｌ）を、３７℃で５分間インキュベートし、そして攪拌しながら血小板凝集計へと入れた。０％の光透過を、血小板懸濁液を用いて較正し、１００％透過をバッファー単体に合わせた。光透過の記録を、カルシウム及び他の作動薬、例えばトロンビン受容体活性化ペプチド−６（ＴＲＡＰ、１００μＭ）及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ １０μＭ）の添加後に開始した。５分間の凝集−脱顆粒の後、血小板を１５秒間、パルス遠心分離（ｐｕｌｓｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）し、そして除去した。上清は、血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ）を含有した。
【００８６】
骨髄由来ＥＰＣ標識化
ＢＭ−ＭＮＣを、ＥＢＭ培地中、５日間、ゼラチン／ビトロネクチン上で培養した。非付着細胞を除去した後、２つの内皮細胞特性に関する二重標識化を通じてＥＰＣを同定した：Ｄｉｌ標識化・アセチル化・低濃度リポタンパク質（Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ；１μｇ／ｍｌ、ＢｉｏＨａｒｂｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；赤色の蛍光）の結合、及びＦＩＴＣ標識されたＢＳ１−レクチン（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ；緑色の蛍光）の結合。二重蛍光により、１ウェルあたり３〜５つの領域中におけるＥＰＣの顕微鏡による同定及び集計（倍率４００倍）が可能となった。実験を、少なくとも３回繰り返し、そして結果をＥＰＣのパーセンテージとして表現した。
【００８７】
インテグリン及びＰＳＧＬ１の、細胞表面の発現
細胞表面のタンパク質発現を決定するために、ＦＩＴＣ結合抗インテグリンβ１、ビオチン結合抗インテグリンβ2、ＰＥ結合抗インテグリンβ3、ビオチン結合抗インテグリンαv、ＰＥ結合抗ＰＳＧＬ１抗体、又はそれらに適合した対照アイソタイプ（全て０．５ｍｇ／ｌ）と共に、４５分間、ＰＢＳ−ＢＳＡ２％中でインキュベーションする前に、ＢＭ−ＭＮＣを、ＰＢＳ−ＢＳＡ５％を用いて、３０分間ブロッキングした。ＢＭ−ＭＮＣをペレット化し（５分、２，０００ｒ．ｐ．ｍ）、そしてＰＢＳ−ＢＳＡ２％と共に再懸濁した。標識化された細胞のパーセンテージを、Ｃａｎｔｏ−ＩＩセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーにより決定した。非免疫アイソタイプ対照抗体標識細胞のパーセンテージは、補正された。
【００８８】
核形態学の観察を通じたアポトーシスの評価
ＢＭ−ＭＮＣを、ＥＢＭ中、ＴＳＰ１、又は４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２ペプチドの継続的な存在下で、或いは最後の２４時間のみ処理されて、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックス上で５日間増殖させた。スタウロスポリン（２μｇ／ｍｌ、６時間）を、アポトーシス誘導のための陽性対照として使用した。非付着細胞を除去し、そして付着細胞をＰＢＳ−ＰＦＡ ４％で固定化し、その後、ＤＮＡ塩基間における結合後に蛍光性となるＤＡＰＩ（ジアミジノフェニルインドール、０．０１ｍｇ／ｍｌ）を添加した。核形態学を、蛍光顕微鏡検査法によって分析し、そして断片化又はクロマチンの凝縮を示したアポトーシス核のパーセンテージを１ウェルあたり３〜５つの領域中において計算した（倍率４００倍）。実験を少なくとも３回繰り返した。
【００８９】
無傷ＤＮＡ内容物の定量を通じたアポトーシス評価
ＢＭ−ＭＮＣを単離し、そして４Ｎ１−１ペプチドを用いて１０又は１２０分間処理し、ＰＢＳで洗浄し、そしてＥＢＭ中、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックス上で２４時間まで培養した。未処理の新鮮細胞を、生細胞のための対照とした。アポトーシスの陽性対照として、懸濁液中の細胞をスタウロスポリン（２μｇ／ｍｌ、６時間）で処理した。処理及び培養後、非付着及び付着細胞を採取し、そして別々に分析し、氷冷した７０％エタノールのＰＢＳ溶液で固定化し、そしてトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（０．０５％）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；５０μｇ／ｍｌ）及びＲＮａｓｅ−Ａ（１００μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ中、４５分間インキュベートした。ＰＩは、ＤＮＡ塩基間における結合の後に蛍光性となる。ＤＮＡ内容物をその後、蛍光支援細胞ソーティング（ＦＡＣＳ；Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって分析し、そしてＤＮＡの断片化、及び蛍光の減少を示したアポトーシス核のパーセンテージを測定した。実験を３回繰り返した。
【００９０】
実験的血栓症におけるＢＭ−ＭＮＣの時間依存的動員
発明者は、Ｋｕｒｚ他（１９９０）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ６０：２６９−２８０による、動脈血栓症の実験モデルを適用し、そして塩化鉄（ＦｅＣｌ3）を化学誘導物質として使用した。野生型Ｃ５７ｂｌ６、Ｓｗｉｓｓ、又はＴＳＰ１欠損Ｓｗｉｓｓマウスは、ペントバルビタールを用いた末端麻酔後に、及び追加の鎮痛剤としてキシロカイン５％を局所に皮膚へ塗布した後に、腹壁切開手術された。ＢＭ−ＭＮＣを、蛍光染料「Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ」（５μＭ；分子プローブ）、及び合成ペプチド４Ｎ１−１若しくは４Ｎ１−２（１００μＭ）、又は対照ＢＳＡ（１％）を用いて２時間前処理した。ＢＭ−ＭＮＣをＰＢＳで洗浄し、そして後方の眼窩洞を通じた血液循環へと投与した（２．１０6細胞／１００μｌ／動物）。腸間膜動脈−静脈対を切開し、そしてリアルタイム生体顕微鏡検査にさらした。調製された全マウスを、ＶＨＳレコーダーと接続されたアナログカメラ（ａｎａｌｏｇｉｃ ｃａｍｅｒａ）（ＬＨＥＳＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｌ、４０イメージ／秒）を取り付けた、又はＡｃｔ−１画像収集ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）とリンクした、高解像度ニューメリック（ｎｕｍｅｒｉｃ）カメラ（ＤＸＭ１２００、Ｎｉｋｏｎ）とつながった、落射蛍光顕微鏡（Ｅｌｌｉｐｓｅ ＴＥ３００）の台に載せた。選択された小静脈の無傷血管壁上における基本的ＢＭ−ＭＮＣ動員を２分間記録した。ＦｅＣｌ3（５００ｍＭ）を含有する寒天ゲル（１％）片（１〜２ｍｍ3）をその後、局所的に適用して、拡散を通じた進行性の血管内血栓を誘導した。血栓症に罹患した血管表面上におけるＢＭ−ＭＮＣの動員を、さらに１５分間記録した。記録を分析し、そして新規ＢＭ−ＭＮＣ／血管壁相互作用の数を毎分ごとに計算した。安定した付着（３０秒超の間静止している付着細胞）を集計し、そして血栓症の誘導後、初めの１０分間にわたって蓄積した。血管壁と相互作用するＢＭ−ＭＮＣの平均回転速度を、較正されたスクリーン上における時間にわたる移動距離を測定し、そしてμｍ／秒へと変換することによって血栓症誘導後における最初の１０分間にわたって、一細胞あたりで計算した。
【００９１】
実験的な後肢虚血の間における、ＢＭ−ＭＮＣの血管新生促進効果
麻酔マウス（ｍ＝８〜１０動物／群）は、右大腿深動脈の近位起始部（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｏｒｉｇｉｎ）における動脈結紮を受け、後肢虚血を誘導された。全てのマウスの操作を、我々の団体の倫理規則及びガイドラインに従って行った。結紮されたマウスへ、上で示したように調製されたＢＭ−ＭＮＣを注射した。虚血１４日後、後肢における血管新生を、２つの独立した方法を使用して調べた：血管密度を、高解像度ミクロ血管造影を通じて評価した。麻酔動物へ、腹部大動脈中に挿入された、シリンジと連結されたカテーテルを通じて、較正されたポンプの制御下において、造影剤として硫酸バリウムを注射した。このシステムにより、一定の注入量の連続的なモニタリングを行うことができた。後肢血管系の画像を、Ｘ線ミクロ血管造影を介して得た。血管造影スコアは、血管で占められる画像画素を定量することによって決定され、そしてパーセンテージで表現された。皮膚血流量における変化を、画像分析ソフトウェアと接続されたＬａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒにより分析した。証明変動及び室温は、虚血性の右肢において得られる値を、非虚血性の対照である左肢の値で割った割合として後肢灌流を表現することによって考慮された。
【００９２】
統計分析
全ての実験を、少なくとも３回繰り返した。インビトロの実験に関して、統計分析を、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った。血管新生の結果を、ＡＮＯＶＡ検定を用いて分析し、そしてグループ間の比較（ｍ＝５〜１０動物／グループ）を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて行った。有意性は、ｐ＜０．０５の時に得られた。
【００９３】
実施例１
マウスＢＭ−ＭＮＣ、マウスＰＢＭＣ、及びヒトＨＵＣＢ−ＥＰＣ付着における血小板タンパク質の効果
マウスＢＭ−ＭＮＣ及びＨＵＣＢ−ＥＰＣ付着を、インビトロで評価した。精製若しくは組み換え血小板タンパク質、又はＣＤ４７／ＩＡＰ受容体のペプチド作動薬の効果を特徴付けした。主に２つの手法を使用した：
１．ゼラチン／ビトロネクチン対照マトリックス又はフィブリンゲル上における３０分間の細胞付着を測定する以前における、血小板タンパク質と共にした、細胞の２時間のプレインキュベーション。
２．溶液中血小板タンパク質の存在下で、ゼラチン／ビトロネクチン対照マトリックス又はフィブリンゲル上における、１６時間の細胞付着
【００９４】
−ゼラチン／ビトロネクチン又はフィブリンゲル上へのＢＭ−ＭＮＣの付着における、ＢＭ−ＭＮＣをＴＳＰ１又はペプチド４Ｎ１−１と共にプレインキュベーションをしたことの効果：
ＢＭ−ＭＮＣを、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１又はペプチド４Ｎ１−１で２時間前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチンマトリックス又はフィブリンゲルへのそれらの付着を３０分間測定した。ＴＳＰ１を用いた前処理、及び特に４Ｎ１−１ペプチドを用いた前処理は、ＢＳＡを用いた場合と比較して、ゼラチン／ビトロネクチンへの付着（それぞれ、＋１６０．６％、ｐ＜０．０５；及び＋２４９．６％、ｐ＜０．０５）及びフィブリンへの付着（それぞれ、＋７４．０％、ｐ＜０．０５；及び＋１８６．０％、ｐ＜０．０５）を強く刺激した（図１）。ＢＭ−ＭＮＣを、組み換えＴＳＰ１を１〜４０ｍｇ／ｍｌの増大する濃度で２時間前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチンへのそれらの付着を３０分後に測定した。ＴＳＰ１は、５μｇ／ｍｌ超から、ゼラチン／ビトロネクチンへのＢＭ−ＭＮＣの付着を有意に刺激した。ＢＳＡの場合と比較して、最大刺激は２０μｇ／ｍｌにおいて到達された（＋１７９．３％、ｐ＜０．０５）（図２）。４Ｎ１−１ペプチドを用いた刺激は、フィブリンゲル上へのものよりも、ゼラチン／ビトロネクチン上へのものの方が相対的により強力であり、そして１００ｎＭから用量依存的であった（図５）。１００μＭの４Ｎ１−１ペプチドは、ＴＳＰ１の最も効果的な試験用量（１００ｎＭ）よりも、約６倍効果的に付着を刺激した。ＢＭ−ＭＮＣ付着の４Ｎ１−１ペプチド刺激が完了し、そしてたった５〜３０分間のプレインキュベーションの後においてほぼ最大効果を生じた（図６）。細胞の付着能力の増大は、刺激開始後少なくとも２時間維持された。
【００９５】
−ゼラチン／ビトロネクチン又はフィブリンゲル上へのＰＢＭＣの付着における、ＰＢＭＣをＴＳＰ１又はペプチド４Ｎ１−１と共にプレインキュベーションをしたことの効果：
４Ｎ１−１ペプチドと共にするＰＢＭＣのプレインキュベーションは、ＢＭ−ＭＮＣにおける場合と同様の効果を誘導し、そしてゼラチン−ビトロネクチンへのそれらの付着を刺激し（＋４０３．２％、ｐ＜０．０５）、そしてフィブリンゲル上への付着をさらに刺激した（＋１，１０７．８％、ｐ＜０．０５）（図４）。
【００９６】
−ゼラチン／ビトロネクチンへの１６時間のＢＭ−ＭＮＣ付着に対する、溶液中のＴＳＰ１、４Ｎ１−１ペプチド及びＰＰＰの効果：
付着を、位相差顕微鏡による直接的細胞集計を通じて定量する以前に、ＢＭ−ＭＮＣを１６時間、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックス上で、ＰＰＰ、組み換えＴＳＰ１（１００μｇ／ｍｌ）、又はペプチド４Ｎ１−１（１００μＭ）の存在下、インキュベートした。図３で報告されたように、ＴＳＰ１は、ゼラチン／ビトロネクチン対照と比較して３倍超付着を刺激した（＋２０６．８％、ｐ＜０．０５）。合成ペプチド４Ｎ１−１はまた、２時間のプレインキュベーションを用いた場合よりもあまり有効ではないが、１６時間かけて有意に付着を増大させた。
【００９７】
−ゼラチン／ビトロネクチン上へのＢＭ−ＭＮＣの付着における、ＢＭ−ＭＮＣをヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチドＣＳＶＴＣＧ、４Ｎ１−１、又はＴＳＰ１の種々の組み換えドメインと共にプレインキュベーションをしたことの効果：
ＢＭ−ＭＮＣを２時間、ＢＳＡ（対照）、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチドＣＳＶＴＣＧ、４Ｎ１−１、又はペプチドＧＳＴ単体若しくはヒトＴＳＰ１の組み換えドメインＮＨ２、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩと連結したペプチドＧＳＴで前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチンへのそれらの付着を３０分後に測定した。図７で示されるように、ペプチド４Ｎ１−１は、ＢＳＡと比較して特に強くＢＭ−ＭＮＣの付着を刺激した（＋３１０．４％、ｐ＜０．０５）。組み換え及び精製ＴＳＰ１も、付着を有意に刺激した（それぞれ＋６５．６及び＋１４３．８％、ｐ＜０．０５）。それら各々の効果の間に有意差は存在しなかった（ｐ＝０．０５８）。試験された組み換えＧＳＴ結合ＴＳＰ１ドメインは、対照ＧＳＴ単体と比較して効果を有さなかった。一方、ペプチドＣＳＶＴＣＧを用いた付着はＢＳＡの場合と比較して２１％の阻害を示した（ｐ＜０．０５）。
【００９８】
代わりに、ＢＭ−ＭＮＣを２時間、ＢＳＡ（対照）、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１、７Ｎ３、及び４Ｎ１−２，又は変異配列４ＮＧＧ若しくは７ＮＧＧで前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチンへのそれらの付着を３０分後に測定した。図２６で示されるように、トロンボスポンジン−１のカルボキシ末端における２つのＣＤ４７活性化部位に相当する両方のペプチド（４Ｎ１−１及び７Ｎ３）は、ＢＳＡと比較してＢＭ−ＭＮＣ付着を有意に刺激した（ｐ＜０．０５）。変異ペプチドを用いたＢＭ−ＭＮＣ付着の有意な調節は存在しなかった。
【００９９】
比較の目的のために、ＢＭ−ＭＮＣを、ＢＳＡ（対照）、ヒト組み換えＴＳＰ１、又は前駆細胞付着又は分化を調節することが知られている他の因子、例えば組み換えヒト間質由来因子１α（ＳＤＦ１；１００ｎｇ／ｍｌ）、組み換えキメラエフリン−Ｂ２−Ｆｃ（ＥｐｈＢ２−Ｆｃ；３μｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ−豊富培養培地ＥＢＭ２（５０％）、又は組み換えヒトレプチン（１及び１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて２時間前処理した。ゼラチン／ビトロネクチンへのＢＭ−ＭＮＣ付着を、３０分後に測定した。図２７に示すように、ＥＢＭ２培地及びレプチン（１００ｎｇ／ｍｌ）は、ＢＳＡと比較して（ｐ＜０．０５）、又はペプチド４Ｎ１−１で得られる刺激と比較して、ＢＭ−ＭＮＣ付着において中等度の増加（２倍未満）を刺激した（図７）。ＳＤＦ１又はＥｐｈＢ２−Ｆｃを用いたＢＭ−ＭＮＣ付着の有意な調節はなかった。
【０１００】
−ゼラチン／ビトロネクチン及びフィブリンゲル上へのＨＵＣＢ−ＥＰＣの付着における、ＨＵＣＢ−ＥＰＣをヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１と共にプレインキュベーションをしたことの効果：
ＨＵＣＢ−ＥＰＣを、２時間、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１を用いて２時間前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチン及びフィブリンゲル上へのそれらの付着を１５分後に測定した。図８に示されるように、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、及びペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、ＢＳＡと比較して、ゼラチン／ビトロネクチン上（それぞれ＋１０６．３％；＋５２．５％；及び＋５８．５％、ｐ＜０．０５）及びフィブリンゲル上（それぞれ＋１０６．３％；＋５２．５％；及び＋５８．５％、ｐ＜０．０５）の両方への付着を有意に刺激した。ＴＳＰ１のタイプ又はペプチド４Ｎ１−１のいずれかを用いて得られる刺激範囲は、両タイプのマトリックスにおいて同等であった。
【０１０１】
ＰＢＳ洗浄及び培養以前に、ＨＵＣＢ−ＥＰＣを、対照ＢＳＡ（１％）の存在下、又はマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７ ＩｇＧ１ Ｂ６Ｈ１２（４０μｇ／ｍｌ）、又は適合された対照アイソタイプマウスＩｇＧ１（４０μｇ／ｍｌ）の存在下、５％ＣＯ2下のインキュベーター中、３７℃で２時間前処理した。図２８で示されるように、Ｂ６Ｈ１２を用いた前処理は、ＢＳＡ又は対照マウスＩｇＧ１と比較して、ゼラチン／ビトロネクチン上への付着を有意に刺激した（それぞれ、＋１４．６％、又は＋１６．６％、ｐ＜０．０５）。これは、抗ＣＤ４７抗体が、作動薬として機能し得、そして作動薬ペプチドと同様の付着促進効果を示し得ることを示唆している。
【０１０２】
−内皮細胞単層上へのＢＭ−ＭＮＣの付着における、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１と共にＢＭ−ＭＮＣをプレインキュベーションしたことの効果：
ＢＭ−ＭＮＣを、組み換え若しくは精製ヒトＴＳＰ１（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、又はペプチド４Ｎ１−１（１００μＭ）を用いて２時間前処理し、そして３０分後に、インターロイキン−１βで前もって活性化されたマウス内皮細胞単層上へのそれらの付着を測定した。図９において示されるように、ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、ＢＳＡと比較して、付着を強力に刺激した（＋３５９．５％、ｐ＜０．０５）。組み換え及び精製ＴＳＰ１はまた、有意な刺激を誘導した（それぞれ＋３４．２％及び＋４０．５％、ｐ＜０．０５）。マウス内皮細胞単層へのＢＭ−ＭＮＣ付着に対する４Ｎ１−１の効果を、蛍光顕微鏡によって証明することができた（図１０）。
【０１０３】
−ゼラチン／ビトロネクチンへのＢＭ−ＭＮＣの付着における、ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１と共にＢＭ−ＭＮＣをプレインキュベーションしたことの効果：
トランスジェニック肥満マウス（Ｏｂ／Ｏｂ遺伝型、レプチン欠損）、及び糖尿病マウス(ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病)から得たマウスＢＭ−ＭＮＣの付着を、インビトロで評価した。３０分間の、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックスへのＢＭ−ＭＮＣ付着の測定前に、ＢＭ−ＭＮＣを、対照ＢＳＡ又は４Ｎ１−１と、２時間プレインキュベーションした。肥満Ｏｂ／Ｏｂ ＢＭ−ＭＮＣは、野生型対照と比較して、インビトロにおいて付着の減少を示し（−３１％；ｐ＜０．０５）（図２２）、そしてそれはＥＰＣの機能障害と整合がとれる。しかし付着は、４Ｎ１−１を用いた前処理によって、少なくとも野生型ＢＭ−ＭＮＣと同程度の強さで、著しく向上した（関連性ＢＳＡ対照と比較して、それぞれ８９４．７％及び１，２４５．０％、ｐ＜０．０５対対照）。ストレプトゾトシンで処理したマウスから得られた糖尿病ＢＭ−ＭＮＣ（図２３）は、非糖尿病細胞と比較して、有意ではなく、基本付着レベルが減少する傾向を示した（−１９％；ｐ＞０．０５）。しかし、糖尿病ＢＭ−ＭＮＣの付着は、４Ｎ１−１を用いた前処理によって著しく向上し、そして糖尿病細胞は、非糖尿病細胞よりも４Ｎ１−１対して有意により大きく応答した（それらの関連ＢＳＡ対照と比較してそれぞれ２７０．３％対５８７．８％；ｐ＜０．０５対対象、及び細胞タイプ間においてｐ＜０．０５）。
【０１０４】
実施例２
ＴＳＰ１又はペプチド４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２を用いた刺激の後、ＢＭ−ＭＮＣにおける細胞表面付着タンパク質の発現
発明者が、ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理後における増大したＢＭ−ＭＮＣ付着を観測した後、発明者は、当該ペプチドがそれらの表面における付着タンパク質の発現を調節するか否か決定することとした。したがってＢＭ−ＭＮＣを、対照ＢＳＡ又はペプチド４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて３０分間前処理し、そしてインテグリン及びＰＳＧＬ１発現を分析した。免疫標識及びＦＡＣＳにより分析した。図１１に示されるように、ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、ＢＳＡの場合と比較して、インテグリンβ1発現（３０．７％〜４８．１％、ｐ＜０．０５）、インテグリンαV発現（２２．８％〜６４．８％、ｐ＜０．０５）、及びＰＳＧＬ１（４４．４％〜６１．８％、ｐ＜０．０５）を刺激した。さらに、４Ｎ１−１は、有意ではないものの（ｐ＝０．０７）、インテグリンβ3発現を刺激する傾向を示したが（７２．０％〜７９．４％）、４Ｎ１−１は、これらの実験において、インテグリンβ2発現を調節することができなかった（ｐ＞０．５）。
【０１０５】
図３０に示されるように、ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、ＢＳＡを用いた場合と比較して、インテグリンβ1及びβ2の同時共発現（２９．８％〜５４．４％、ｐ＜０．０５）、インテグリンβ1及びβ3の同時共発現（２２．４％〜５３．１％、ｐ＜０．０５）、インテグリンβ2及びβ3の同時共発現（６７．４％〜７５．６％、ｐ＜０．０５）、又はインテグリンβ1及びβ2及びβ3の同時共発現（１８．８％〜４４．８％、ｐ＜０．０５）、インテグリンαVとＰＳＧＬ１の同時共発現（１１．５％〜４８．４％、ｐ＜０．０５）を刺激した。したがって、４Ｎ１−１は、ＢＭ−ＭＮＣ表面にある複数の付着受容体の同時発現を強く刺激した。
【０１０６】
実施例３
ペプチド４Ｎ１−１を用いた刺激後における、ＢＭ−ＭＮＣ拡散の調節
ペプチド４Ｎ１−１を用いた処理の後におけるＢＭ−ＭＮＣ付着の増大を観察した後、発明者は、インビトロにおける、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックス上への細胞拡散の程度を調べた。ＢＭ−ＭＮＣを、４Ｎ１−１（１００μＭ）、又は対照ＢＳＡを用いて前処理し、そして３０分間、付着のために放置した（図１４）。４Ｎ１−１は、個々の細胞により占められる領域において、ＢＳＡの場合と比較して４１％の細胞拡散増大を刺激した（ｐ＜０．０５）。
【０１０７】
実施例４
ペプチド４Ｎ１−１を用いた刺激後におけるＢＭ−ＭＮＣの形状の調節
ペプチド４Ｎ１−１を用いた処理の後におけるＢＭ−ＭＮＣ付着の増大を観察した後、発明者は、ペプチド４Ｎ１−１により引き起こされた細胞形状変化を調べた。ＢＭ−ＭＮＣを、増加する時間で、４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて前処理し、そして速やかにＦＡＣＳによって分析して、セルソーターの前方散乱光及び側方散乱光チャンネル（ＦＳｃ及びＳＳｃ）におけるそれらの形状分布を決定した（図１５）。６０秒と同程度の時間の処理は、細胞形状における有意な変化を引き起こすために十分であり、そしてそれは、速やかかつ活発な細胞骨格の再構築を示唆した。図１６は、ＢＳＡ又は４Ｎ１−１を用いて１０分間インキュベーションした後における、個々のＦＳｃ及びＳＳｃにおけるＢＭ−ＭＮＣの形状分布を示し、そしてそれは、当該群にわたる、ＢＭ−ＭＮＣの形状及び構造の全体的な均質化を明らかにした。
【０１０８】
実施例５
ペプチド４Ｎ１−１を用いた刺激後における、ＢＭ−ＭＮＣアポトーシスの調節
ペプチド４Ｎ１−１を用いた処理の後におけるＢＭ−ＭＮＣ付着の増大を観察した後、発明者は、ペプチド４Ｎ１−１により引き起こされるアポトーシスの程度を調べた。ＢＭ−ＭＮＣを、４Ｎ１−１（１００μＭ）又は対照ＢＳＡを用いて前処理し、そして５日間培養し、又は４Ｎ１−１の継続的な存在下において５日間培養し、又はスタウロスポリンと共に６時間培養した（図１３）。４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２ペプチドは、ＢＳＡと比較して、培養５日後でさえアポトーシスを有意に刺激しなかった。
【０１０９】
発明者は、第二の方法を使用して、ペプチド４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２で処理したＢＭ−ＭＮＣにおけるアポトーシスの程度を調べた。ＢＭ−ＭＮＣを、４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２（５０μＭ）で１０又は１２０分間前処理し、そして、血清及び成長因子を用いた完全ＥＢＮ２培地中で２４時間まで培養し、潜在的なアポトーシス反応を進行させた（図２９）。未処理の新鮮細胞を対照として用い、そして懸濁液中、６時間のスタウロスポリンによるアポトーシスの誘導が同様に観測された。培養後、付着及び非付着細胞を別々に採取し、そして分析した。ペプチド４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２は、スタウロスポリン又は対照と比較して、付着細胞及び非付着細胞のいずれにおいても、１２０分のインキュベーション後においてさえ、アポトーシスを有意に刺激しなかった。ＢＭＣ付着の最適刺激を誘導するＣＤ４７作動薬を用いた処理に関して、アポトーシスの誘導は見られなかった。対照的に、アポトーシス促進性のスタウロスポリンを用いたたった６時間の処理は、７２．５％の細胞死の増加を誘導した（*ｐ＜０．０５）。
【０１１０】
実施例６
ＢＭ−ＭＮＣの内皮細胞分化における、ＴＳＰ１、並びにペプチド４Ｎ１−１、４Ｎ１−２及びＣＳＶＴＣＧの効果
ＴＳＰ１及びペプチド４Ｎ１−１が、インビトロにおけるＢＭ−ＭＮＣ付着を刺激する先の観察の後、発明者は、処理されたＢＭ−ＭＮＣの内皮細胞分化を測定した。ＢＭ−ＭＮＣを５日間培養し、その後２時間組み換え若しくは精製ＴＳＰ１を用いて、又はペプチド４Ｎ１−１、４Ｎ１−２及びＣＳＶＴＣＧ（ＴＳＰ１配列由来のペプチド）を用いて２時間前処理した。ＥＰＣ分化ＢＭ−ＭＮＣを、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの結合及びＢＳ１レクチンの結合による二重標識化後に、蛍光顕微鏡により同定した。
【０１１１】
２時間の前処理後における内皮細胞分化を刺激する、組み換え及び精製ＴＳＰ１並びに４Ｎ１−１の傾向が観察された（それぞれ、＋２８．０％；＋２８．９％；及び２８．９％ ｖｓ ＢＳＡ；ｐ＜０．０５）（図１２）。
【０１１２】
実施例７
実験的血栓症の間における、ＴＳＰ１によるＢＭ−ＭＮＣ動員の調節
発明者は、血管壁の血栓症部位におけるＢＭ−ＭＮＣの動員、及びこの工程におけるＴＳＰ１の寄与を証明しようとした。この目的を達成するために、蛍光標識ＢＭ−ＭＮＣを、後方の眼窩洞経由で野生型マウス又はＴＳＰ１欠損マウスへ注射した。その後、ＦｅＣｌ3を用いて、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜静脈に損傷を誘導し、そして血液凝固が進行したときに、ＢＭ−ＭＮＣ動員を局所的に観測した。腸間膜管をさらした麻酔マウスを、倒立型蛍光顕微鏡のレンズの下に置き、損傷部位の境界に位置合わせし、そしてリアルタイムで、血管壁とのＢＭ−ＭＮＣ相互作用を記録した。
【０１１３】
−ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、血栓症に罹患した血管壁へのＢＭ−ＭＮＣ動員を刺激する。
図１７に示されるように、血栓症に罹患した血管表面上へのＢＭ−ＭＮＣの特異的動員を、ＦｅＣｌ3を接種したＣ５７ＢＬ／６型マウスの腸間膜静脈において評価した。実験的血栓症は、血栓症前と同一の血管断片又は無傷の隣接断片のいずれかと比較して、血栓症に罹患した血管表面と相互作用し、そして当該血管表面に沿って回転するＢＭ−ＭＮＣの増加率（毎分おきにおける新規相互作用の数）へ翻訳された。血栓症を罹患した表面へのＢＭ−ＭＮＣ動員は、２〜６分の間の血栓症後誘導においてピークに達し（＋２４１．８％； ｖｓ 無傷；ｐ＜０．０５）、１２分の後に基準レベルへと減少した。
【０１１４】
血栓症を罹患した表面へのＢＭ−ＭＮＣ動員は、血栓症誘導後２〜６分間の間でピークに達し（＋２４１．８％；ｖｓ無傷；ｐ＜０．０５）、１２分後に基準レベルへと減少した。対照ＢＳＡと比較した、損傷後の最初の１０分の間における、ＢＭ−ＭＮＣと血栓症を罹患した血管表面との相互作用のタイプに対するペプチド４Ｎ１−１前処理の効果をさらに特徴付けした。その結果、ペプチド４Ｎ１−１は、血管内血栓部位において１２倍以上、平均ＢＭ−ＭＮＣ回転速度を強く減少させ（１４９．８〜１２．８μｍ／秒；ｐ＜０．０５）（図１８）、そして安定的な付着の数を１４倍以上、急激に増大させた（０．３〜４．３の安定的付着；ｐ＜０．０５））（図１９）。これは、４Ｎ１−１で処理したＢＭ−ＭＮＣの、血栓症に罹患した血管表面と相互作用し、かつ安定的に結合する能力を増大させたことを示した。
【０１１５】
実施例８
ペプチド４Ｎ１−１を用いた細胞治療における、ＢＭ−ＭＮＣの血管新生促進機能の刺激
ＢＭ−ＭＮＣの血管新生促進機能におけるペプチド４Ｎ１−１の効果、及び細胞治療におけるそれらの有効性がその後、試験された。後肢虚血のマウスモデルが使用された。Ｃ５７ＢＬ／６の右大腿動脈を結紮し、そして後方の眼窩洞を通じて、ペプチド４Ｎ１−１又は対照ＢＳＡで前処理されたＢＭ−ＭＮＣの血管内投与で、血管新生を刺激した。無傷の左大腿動脈を対照として使用した。虚血性血管新生後を１４日後に２つの手順で評価した：（ｉ）後肢再灌流評価のための、足部皮膚血流のレーザー・ドップラー・イメージング（ｌａｓｅｒ−ｄｏｐｐｌｅｒ ｉｍａｇｉｎｇ）（図２０）、及び（ｉｉ）血管新生スコアの決定のための機能的血管ネットワークのＸ線ミクロ血管造影（図２１）。ペプチド４Ｎ１−１を用いたＢＭ−ＭＮＣの前処理は、ＢＳＡを用いた場合と比較して、皮膚再灌流におけるそれらの効果を著しく刺激し（＋３０．２０％、ｐ＜０．０５）、そして灌流血管ネットワークのより多くの拡張をもたらした（＋４１．４５％、ｐ＜０．０５）。
【０１１６】
実施例９
ＴＳＰ１の阻害の間におけるＢＭ−ＭＮＣ付着及び再動員の調節
−血小板脱顆粒化産物を用いたプレインキュベーション後におけるフィブリンゲル上へのＢＭ−ＭＮＣ付着におけるＴＳＰ１遺伝的欠損の効果：
ＢＭ−ＭＮＣを、野生型又はＴＳＰ１欠損血小板のいずれかから得られる血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ）を用いて２時間前処理し（希釈係数１：１０、ＥＢＭ中）、そしてそれらのフィブリンゲルへの付着を３０分後に測定した。野生型血小板から得られた血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ−ＷＴ）を用いた前処理は、ＢＳＡの場合と比較して、著しくＢＭ−ＭＮＣ付着を刺激したが（＋３６．９％、ｐ＜０．０５）、ＴＳＰ１−／−の血小板から得られた血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ−ＴＳＰ１−／−）を用いた場合では、刺激しなかった（＋１０．４％、ｐ＝０．２１ ｖｓ ＢＳＡ；及びｐ＜０．０５ ｖｓ ＰＤＰ−ＷＴ）（図２４）。
【０１１７】
−血栓症に罹患した血管壁へのＢＭ−ＭＮＣ動員における、ＴＳＰ１遺伝的欠損の効果
血栓症に罹患した血管壁へのＢＭ−ＭＮＣの動員における、内因性ＴＳＰ１の寄与を決定するために、野生型ＢＭ−ＭＮＣ投与の後における野生型及びＴＳＰ１欠損ＳＷＩＳＳマウスの腸間膜静脈を使用した。
【０１１８】
図２５において示されるように、野生型マウスにおいて、発明者は、損傷部位において、血栓症誘導後１〜３分間の間において最大比率の動員を示す、循環性ＢＭ−ＭＮＣの特異的動員を観察し（最大＋２５０．０％；ｐ＜０．０５）、そして８分後に基準レベルへの減少を観察した。野生型と比較して、ＴＳＰ１欠損マウスにおいて、この現象のほぼ全ての抑止が測定された。ＴＳＰ１不在下におけるＢＭ−ＭＮＣ動員のこの下方制御は、１分間あたりの、損傷部位における細胞動員の最大比率における減少へと翻訳され（−７１．０％ ｖｓ 野生型マウス、ｐ＜０．０５）、そして野生型マウスと比較して、動員期間の開始及び終了において少なくとも３分間の遅れに翻訳された。これは、例えば遺伝的欠失を通じたＴＳＰ１−ＣＤ４７シグナルの排除又は除去が、前駆細胞の局所的付着及び生着を阻害し得ることを示唆している。
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、生着のための細胞を調製するための方法、及び再生細胞治療の範囲内における前記方法によって得られる傾向にある細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最近１０年間に渡る、胎児及び成人組織中における幹細胞のより優れた特徴の発見は、細胞治療のための開かれた新たな可能性を有する。これらの原始的な、又は完全に分化していない、高い自己再生能力を有する「前駆細胞」は、完全に分化した細胞を生じさせ得、又は患者へ一度投与された場合において、特異的に分化した表現型を獲得し得る。前駆細胞は、例えば、末梢血、骨髄及び脂肪組織、並びに他の特化した組織、例えば臍帯血を含む、胎児又は成人の組織から単離され得る。
【０００３】
前駆細胞群の同定及び単離のための非常に洗練された方法は、臨床において展開されるべき幹細胞をベースとした治療の開発を強く促進している。さらに、ヒト胎児組織の使用に関する倫理的問題を回避する手段として、成人組織由来の前駆細胞の単離及び移植が好ましい。
【０００４】
前駆細胞を用いた再生細胞治療は、例えば、罹病器官の機能を回復させるために、又は生理学的修復機構が損なわれているときに組織の復元が必要とされているような、器官が危険にさらされている疾患に特に関連があると思われる。
【０００５】
従って、前駆細胞治療の適用の一つの有名な分野は、心疾患に関する。これらの場合において、主要な目的は、新規の血管樹の増殖又は出現を促進することによって、組織灌流を向上させること、或いは現存する血管の機能を改善することである。前駆細胞治療の適用の他の例はまた、血管再生、及び血管前駆体を用いた欠陥のある心臓組織の修復を含む。
【０００６】
大部分の例において、対象となる前駆細胞は、全身循環へと送達される。したがって、現在の手法は、当該循環中におけるそれらの効果を直接的に及ぼす、移植細胞の能力に、又は標的組織に到達し、それらの中に結合し、そして先天性の及びあまり理解されていない機構を通じた、利益のある効果を起こさせる能力に大部分が依存している。
【０００７】
治療効果を最大化するために、前駆細胞の局所的投与がまた、試みられた。より多くの比率の移植された前駆細胞が、組織中に生着し、そしてそれは利益のある効果の向上を提供するだろうと期待される。しかし、移植細胞は通常、局所的基質へ付着することができず、そして大部分が不可解のままであるが、アポトーシスを含むと思われる機構を通じて、速やかに受容組織から排除される。
【０００８】
したがって、生着される細胞の付着能力の欠如、特に標的組織に特異的な付着能力の欠如は、標的組織への細胞生着を危うくし得、そして投与された細胞の著しい損失へとつながり得る（Ａｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０７：２１３４−９）。その結果、投与された細胞は、例えば先天的免疫応答経路を通じてイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で破壊され、血流に入り、そして肝臓及び脾臓のような器官によって排除されるか、又は肺毛細血管中で捕捉されるかのいずれかであり得る。
【０００９】
さらに、細胞治療は、標的組織への投与細胞の生着を超える、さらなる制限を受ける。生着された細胞は、標的組織の復元への関与について有効ではない可能性がある。特に、生着された細胞の不具合は、中期間および長期間の生存の減少によるものであり得、或いは、それらの特性の幾つかの喪失、例えばそれらの血管新生活性（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）及び／又は血管形成活性（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ）の喪失、例えば、増殖因子の減少、及びサイトカイン分泌、又は分化のための及び所望のフェノタイプを獲得するための能力の低下によるものであり得る。
【００１０】
細胞治療に対する上で言及された障害に加えて、他の問題が、生着のための細胞が単離された個体を苦しめる病変から生じる。例えば、糖尿病患者、肥満患者、アテローム性動脈硬化患者、高血圧患者、又は喫煙患者由来の、循環する血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、健常対象のものよりも付着性ではなく、このことは、これらの細胞の、欠陥のある血管新生及び血管形成特性をもたらすことが知られている（Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｎｉｃｋｅｎｉｇ（２００６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．２６：２５７−２６６；Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｎｉｃｋｅｎｉｇ（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：３１８−３３２；Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ７：１４７６−１４８２；Ｌｏｏｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ７：１４６８−１４７５；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：５８３−５９１）。
【００１１】
移植に先立って、ＥＰＣ調製物を成長因子と共に処理することが、血管新生促進効果を向上させ得ることが以前に提案された。したがって、脂肪組織由来サイトカインであるレプチンは、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）で被覆した培養プレートへの、及び成熟内皮細胞へのＥＰＣの付着を著しく向上させ得ることが示された（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）１１４：１２１）。しかし、かかる処置は、インビボにおいては評価されなかった。
【００１２】
したがって、生着されるべき細胞を調製するための既存の方法を改良することが、本発明の目的である。
【００１３】
血液の凝固、及び特に動脈血栓症は、血小板凝集に関与する。凝集した血小板の必須の機能は、脱顆粒化し、そしてそれらの内容物を血流へ放出することである。血小板α顆粒は、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）−１（ＴＳＰ１）を含み、そしてそれは、放出された血小板タンパク質の２５％までを構成する。ＴＳＰ１は、血小板−血小板、血小板−内皮細胞、及び血小板−細胞外マトリックスブリッジの形成に関与することによって、そして単球−マクロファージ、リンパ球、好中球、好塩基球、及び線維芽細胞にさえ関わる炎症反応にさらに関与することによって、血小板凝集の向上を促進する。
【００１４】
ＴＳＰ１は、トロンビンの活性化を後に行う、血小板が放出するタンパク質として最初は同定された。ＴＳＰ１はまた、血管壁中において、機械的損傷後又は糖尿病の間は平滑筋細胞によって、及び血栓症の間、層流血流の摂動の後、又は連続的な低酸素症の後においては内皮細胞によって発現され得る。
【００１５】
ＴＳＰ１は、複数のドメインを有する、独特かつ複雑な構造を有し、そしてそれは、多くの特定の細胞外受容体を活性化する。したがって異なるドメインは、以下に詳述される通り、単一の細胞のタイプにおいて、時折明らかに逆のシグナル経路を誘導し得る。
【００１６】
ＴＳＰ１は、細胞表面において、スカベンジャー受容体ＣＤ３６と主に相互作用し、同様に、インテグリン関連タンパク質（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＤ４７／ＩＡＰ）及びインテグリンと相互作用する。
【００１７】
ＴＳＰ１は、典型的な内因性抗血管新生因子として主に知られている。ＴＳＰ１は、腫瘍において抗血管新生機能を果たし、そしてそれらの進行を阻害する。ＴＳＰ１はまた、再内皮化（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｓａｔｉｏｎ）を阻害し、その後の血管障害及びインビボにおける網膜血管新生を阻害する。
【００１８】
ＴＳＰ１の抗血管新生効果は、少なくとも一つのそのタイプＩドメイン、及びＣＤ３６受容体の活性化によって媒介される。実際ＴＳＰ１は、そのタイプＩドメインのＣＳＶＴＣＧ配列を通じてＣＤ３６と結合する（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５７：１７３５−１７４２）。微小血管内皮細胞、及び腫瘍内皮細胞において、ＣＤ３６と結合するＴＳＰ１は、カスパーゼの活性化、ｐ３８−ＭＡＰＫ、及びｐ５９−Ｆｙｎキナーゼのリン酸化を誘導し、それはアポトーシスをもたらす（Ｊｉｍｅｎｅｚ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：４１−４８）。ＴＳＰ１はまた、線維芽細胞のアポトーシスを引き起こすことが知られており（Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ７：４９３−４９８）、どのようにしてＴＳＰ１が組織の修復及び血管新生を危険にさらすかに関するさらなる手がかりである。
【００１９】
別の周知のＴＳＰ１受容体は、準偏在性（ｑｕａｓｉ−ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）インテグリン関連タンパク質（ＣＤ４７／ＩＡＰ）である。ＣＤ４７／ＩＡＰへのＴＳＰ１の結合は、配列ＲＦＹＶＶＭＷＫ（４Ｎ１−１、配列番号３）を特に含む、ＴＳＰ１のカルボキシ末端で起こる。
【００２０】
４Ｎ１−１（Ｆｒａｚｉｅｒ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８８０８−１４）として知られるトロンボスポンジン−１のＣ末端ドメイン由来のペプチド、又はその誘導体である４Ｎ１Ｋは、ＣＤ４７／ＩＡＰと、ＴＳＰ１と同様の様式で結合し得る。ＣＤ４７／ＩＡＰ結合ドメインは、種とＴＳＰアイソフォームとの間で高度に保存されている。
【００２１】
ＴＳＰ１及び４Ｎ１−１によるＣＤ４７の活性化は、成熟内皮細胞中のＣＡＭファミリータンパク質の発現を誘導することが示された。したがってＴＳＰ１は、ＣＡＭ発現血管内皮への、循環細胞、特にα4β1インテグリン発現炎症性細胞の動員を可能とする（Ｎａｒｉｚｈｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２００５；ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９：１１５８−６０）。
【００２２】
しかし、かかる機構は、循環する未分化前駆細胞について説明されていない。さらに、ＴＳＰ１又は４Ｎ１−１によるＣＤ４７の活性化はまた、アポトーシス及び成熟内皮細胞の死滅を誘導する（Ｆｒｅｙｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２７１：５８４−５８８；Ｆｒｅｙｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２８６：１４１−１４９；Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ８：５３１−５３８）。したがって、ＣＤ４７作動薬は、抗血管新生剤として知られ、そしてそれは、血管新生及び固形腫瘍の成長を防止するための新規潜在的手法において使用され得る（Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：１０２６−１０３６）。ＣＤ４７の発現及び活性化はまた、インビボにおける血管新生モデルにおいて、血管新生及び内皮細胞の死滅を阻害することと関連している（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１００：７１２−２０）。
【００２３】
ＴＳＰ１が、細胞内骨格及び接着斑プラークの分解、増殖阻害、カスパーゼの活性化、及び最終的にアポトーシスへとつながることがさらに提案された。さらに、ＴＳＰ１は、正常内皮細胞の機能及び生存の強力な促進剤である一酸化炭素（ＮＯ）シグナルを阻害する（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２６０６９−８０；Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：１５４０４−１５）。したがって、内皮細胞のアポトーシスは、ＴＳＰ１の抗血管新生効果の主要な特徴であると思われる。
【００２４】
さらに、ＴＳＰ１は、糖尿病の骨髄由来の前駆細胞によって発現され得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９８：６９７−７０４）。この場合において、ＴＳＰ１が成熟内皮細胞において抗血管新生を行う役割を維持しているとき、ＴＳＰ１は、血管損傷後における前駆細胞の付着及び再内皮細胞化（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）への前駆細胞の貢献を阻害することが示された。
【００２５】
したがって、先の研究の観点から、ＴＳＰ１及びＣＤ４７作動薬は、細胞の付着を増大させることができず、したがって、血管形成促進（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）療法又は血管新生を促進することができないと思われる。
【００２６】
さらに、血小板凝集における既知の血栓形成促進性効果（Ｖｏｉｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４４：２４０−５）にも関わらず、大量の４Ｎ１Ｋペプチドの全身注射が致死性のものではなく、そして全凝固パラメータを調節しない（Ｂｏｎｎｅｆｏｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：９５５−６４）点に注目することは特に興味深い。したがって、４Ｎ１−１、４Ｎ１Ｋ又は派生ペプチドは、健常対象において著しい毒性効果を有するとは思われない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
発明の説明
本発明は、ＴＳＰ１によって、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ（配列番号３）を含むＴＳＰ１誘導体によって処理された、分化時において内皮細胞を産生する可能性の高い細胞が、細胞外マトリックスへと付着し、そして内皮細胞へと分化する増大した能力を有し、そしてそれらが虚血組織において機能的な血管系を回復することを支援することが可能であるという、発明者による予想外の発見から特に生じている。
【００２８】
したがって、本発明は、増大した付着性を有する前駆細胞を調製するインビトロでの方法であって、前駆細胞がＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され、それにより増大した付着性を示す前駆細胞を産生する、前記方法に関する。
【００２９】
本発明はまた、増大した付着性を有する前駆細胞を調製するためのインビトロでの方法であって、前駆細胞がＲＦＹＶＶＭＷＫ若しくはＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む、又はからなるポリペプチドと接触され、それにより増大した付着性を示す前駆細胞を産生する、前記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＢＳＡ、又は組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１を用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン又はフィブリンゲル上における、３０分間のＰＢＭＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２】図２は、増加する濃度の組み換えＴＳＰ１を用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン上における、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図３】図３は、ＰＰＰ、組み換えＴＳＰ１、若しくはペプチド４Ｎ１−１の不在下、又は存在下における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、１６時間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ゼラチン＋ビトロネクチン）。
【図４】図４は、ＢＳＡ、又は組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１又は４Ｎ１−２を用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン、又はフィブリンゲル上への、３０分間のＰＢＭＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図５】図５は、ＢＳＡ、増加する濃度の組み換えＴＳＰ１、又は増加する濃度のペプチド４Ｎ１−１を用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着の比較試験を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図６】図６は、ＢＭ−ＭＮＣをペプチド４Ｎ１−１（５０ｍＭ）で、０、１、５、１０、３０又は１２０分間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図７】図７は、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチドＣＳＶＴＣＧ、４Ｎ１−１、又は対照としてのＢＳＡを用いて（左側のパネル；*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）、或いはＧＳＴ結合組み換えドメインＮＨ２であるヒトＴＳＰ１のタイプＩ、タイプＩＩ、若しくはタイプＩＩＩ、又はＧＳＴタグ単体（右側のパネル）を用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す。
【図８】図８は、ＢＳＡ、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１用いた２時間の前処理後における、ゼラチン−ビトロネクチン、又はフィブリンゲル上への、１５分間のＨＵＣＢ−ＥＰＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図９】図９は、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１、又はＢＳＡを用いた２時間の前処理後における、ＩＬ１βで活性化されたマウス内皮単層上への、３０分間のＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１０】図１０は、ペプチド４Ｎ１−１、又はＢＳＡを用いた２時間の前処理後における、ＩＬ１βで活性化されたマウス内皮単層上への、３０分間の、蛍光ラベルされたＢＭ−ＭＮＣ付着の顕微鏡写真を示す（倍率４００倍）。
【図１１】図１１は、ペプチド４Ｎ１−１、又はＢＳＡを用いた３０分間の刺激前及び刺激後における、ＢＭ−ＭＮＣの表面上でのインテグリンβ1、β2、β3及びαV、並びにＰＳＧＬ１の発現を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１２】図１２は、対照のＢＳＡ、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１、４Ｎ１−２、又はＣＳＶＴＣＧを用いた２時間の前処理後、５日間培養されたＢＭ−ＭＮＣの内皮細胞分化を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ、又は対照）。
【図１３】図１３は、対照のＢＳＡ、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１、４Ｎ１−２、又はＣＳＶＴＣＧを用いて、培養前に２時間（左側のパネル）、或いは連続的に５日間（真ん中のパネル）、或いはスタウロスポリンと共に最終的に６時間（右側のパネル）処理した後、培地中で５日後におけるＢＭ−ＭＮＣのアポトーシスを示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１４】図１４は、画像解析により細胞面積を測定することによる、ＢＳＡ、又はペプチド４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて２時間前処理し、そして３０分間付着させた後における、ゼラチン−ビトロネクチンマトリックス上へのＢＭ−ＭＮＣの拡散を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１５】図１５は、ペプチド４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて０、１０、若しくは６０秒、又は１０若しくは３０分間前処理した後における、ＦＡＣＳの前方散乱光（ＦＳｃ）及び側方散乱光（ＳＳｃ）によって測定される、ＢＭ−ＭＮＣ形状の速やかな変化を示す。データは、ＦＳｃ及びＳＳｃの点の分布として示される。
【図１６】図１６は、ペプチド４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて又は用いないで、６０秒間前処理した後に、ＦＡＣＳの前方散乱光（ＦＳｃ）及び側方散乱光（ＳＳｃ）によって測定される、ＢＭ−ＭＮＣ形状の速やかな変化を示す。データは、ＦＳｃ及びＳＳｃ分布の個々のプロファイルとして示される。
【図１７】図１７は、生体顕微鏡検査によって観測される、ＦｅＣｌ3で誘導される血栓症前（−２〜０分）、及び血栓症後におけるＣ５７ＢＬ／６野生型マウスの腸間膜静脈におけるＢＭ−ＭＮＣの時間依存的動員（１分あたりの新しい細胞の相互作用、毎分）を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ｔ＝０分）。
【図１８】図１８は、ペプチド４Ｎ１−１又はＢＳＡで２時間前処理された後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜静脈において、血栓症に罹患した表面上におけるＢＭ−ＭＮＣの回転速度（損傷後の最初の１０分間における平均回転速度）を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図１９】図１９は、ペプチド４Ｎ１−１又はＢＳＡで２時間前処理された後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜静脈における、血栓症に罹患した表面上へ安定して付着したＢＭ−ＭＮＣの数（損傷後の最初の１０分間における、累積した安定な付着）を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２０】図２０は、ＢＳＡ又はペプチド４Ｎ１−１で２時間前処理されたＢＭ−ＭＮＣの結紮及び注射から１４日経過後における、虚血性後肢皮膚血流量を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２１】図２１は、ＢＳＡ又はペプチド４Ｎ１−１で２時間前処理されたＢＭ−ＭＮＣの結紮及び注射から１４日経過後における、微小血管造影スコアを示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。灌流される血管ネットワークは、Ｘ線画像解析を通じて定量化される。
【図２２】図２２は、ペプチド４Ｎ１−１又は対照としてＢＳＡを用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間の、野生型又はＯｂ／Ｏｂレプチン欠損肥満マウスから得られたＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ；**ｐ＜０．０５野生型 ｖｓ Ｏｂ／Ｏｂ）。
【図２３】図２３は、ペプチド４Ｎ１−１又は対照としてＢＳＡを用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間の、非糖尿病の野生型マウス、又はストレプトゾトシンで処置された糖尿病の野生型マウスから得られたＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ対照；**ｐ＜０．０５非糖尿病 ｖｓ 糖尿病）。
【図２４】図２４は、ＢＳＡ、又は、野生型若しくはＴＳＰ１−／−ＳＷＩＳＳマウスから得られた血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ）を用いて２時間前処理した後、フィブリンゲル上への、３０分間の、ＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２５】図２５は、生体顕微鏡検査によって観測される、ＦｅＣｌ3で誘導される血栓症前（−２〜０分）、及び血栓症後における、野生型、又はＴＳＰ１−／−ＳＷＩＳＳマウスの腸間膜静脈における野生型ＢＭ−ＭＮＣの時間依存的動員（１分あたりの新しい細胞の相互作用、毎分）を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ 野生型）。
【図２６】図２６は、ペプチド４Ｎ１−１、４ＮＧＧ、４Ｎ１−２、７Ｎ３、７ＮＧＧ、若しくは組み換えＴＳＰ１、又は対照としてのＢＳＡを用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間の、ＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２７】図２７は、組み換えＴＳＰ１、ＳＤＦ１、ＥｐｈＢ２−Ｆｃ、ＶＥＧＦ−豊富培地ＥＢＭ２、又は組み換えマウスレプチン、対照としてＢＳＡを用いて２時間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、３０分間の、ＢＭ−ＭＮＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２８】図２８は、対照ＢＳＡ、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７ＩｇＧ１クローンＢ６Ｈ１２、又は適合された対照アイソタイプマウスＩｇＧ１を用いて３０分間前処理した後における、ゼラチン−ビトロネクチン上への、１５分間の、ＨＵＣＢ−ＥＰＣの付着を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【図２９】図２９は、スタウロスポリンの存在下における０時間（対照）又は６時間後の懸濁液における、又はペプチド４Ｎ１−１（斜線のバー）又は４Ｎ１−２（黒色のバー）を用いて、１０及び１２０分間の前処理に引き続き、培地中２４時間後の懸濁液におけるＢＭ−ＭＮＣのアポトーシスを示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ 対照）。
【図３０】図３０は、ペプチド４Ｎ１−１、又はＢＳＡを用いた３０分間の刺激前及び刺激後における、ＢＭ−ＭＮＣの表面上でのインテグリンβ1、β2、及びβ3、並びにαV、及びＰＳＧＬ１の共発現を示す（*ｐ＜０．０５ ｖｓ ＢＳＡ）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書において意図される、表現「増大した付着性」は、本発明の方法を用いて調製された前駆細胞が、未処理の前駆細胞よりも高い付着を示すことを意味する。より高い付着は、試験組織上における、又は試験基質上、例えばゼラチン／ビトロネクチン、又はフィブリンのゲル上における付着性前駆細胞の数を定量することによって決定され得る。
【００３２】
調製された前駆細胞が、個体の標的組織中における生着を目的としていることが特に好ましい。したがって、本発明はまた、個体の標的組織中における生着のための前駆細胞を調製するための方法であって、生着されるべき前記前駆細胞が、生着に先立って、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ若しくはＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む、又はからなるポリペプチドと接触される、前記方法に関する。
【００３３】
本明細書において意図される、表現「生着」は、標的組織内への細胞の送達及び付着、又は取り込みに関する。
【００３４】
本明細書において意図される、表現「標的組織」は、類似の又は異なる表現型を有し、全体的に一つの又は幾つかの特性を示し、その環境からそれを区別可能とする任意の細胞群に関する。本明細書において意図される標的組織は、多細胞生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト中において見られ得る。好ましくは、当該組織は、非液体組織である。より好ましくは、当該組織は、心筋及び骨格筋、脳、膵臓、皮膚、腎臓、血管及び他の血管構造から構成される群から選択される。
【００３５】
本明細書において意図される、表現「前駆細胞」は、一つ以上の細胞のタイプに分化する傾向にある、ディビジョン・コンピテント細胞（ｄｉｖｉｓｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）である。好ましくは、前駆細胞は分化していない。前駆細胞は幹細胞を、特に成人の幹細胞及び胎児の幹細胞を含む。
【００３６】
本明細書において意図される、表現「細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞」は、増大した付着性のような特性を示し、個体へ送達されたときに、その後に、標的組織中における成功した付着又は取り込みを一般的に示す、上で定義された前駆細胞に関する。
【００３７】
本明細書において意図される、表現「細胞治療」は、欠如、障害又は疾患を処置するための、個体における生細胞の送達に関する。
【００３８】
当業者にとって明らかなことであるが、調製されるべき前駆細胞が真核細胞であることが好ましい。より好ましくは、前駆細胞は、標的組織中において見られる細胞とタイプにおいて類似しており、又は分化時に、標的組織中において見られる細胞とタイプが類似の細胞を産生する傾向にある。特に、前駆細胞は、内皮細胞へと分化する傾向にあり、すなわち当該前駆細胞は内皮前駆細胞（ＥＰＣ）である。
【００３９】
好ましくは、前駆細胞は、脂肪組織、骨髄、肝臓、脾臓、及び血液から構成される群から選択される組織に由来する。当業者にとって明らかであろうことだが、前駆細胞は、精製された形態で、又は前駆細胞と同一の組織に特に由来し得る他の細胞を含む、精製されていない形態のいずれかで使用され得る。当該前駆細胞が骨髄に由来し、そして血管を修復することを特に目的とするとき、非分画の骨髄単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）は、前駆細胞の非精製形態として使用され得る。
【００４０】
好ましくは、前駆細胞は、個体のものよりも同一種のものである。前駆細胞はまた、個体由来のものであることが特に好ましい。
【００４１】
同様に好ましくは、上で定義された方法において使用される前駆細胞は、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体を発現する。
【００４２】
本明細書において使用される、表現「ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体を発現する」は、調製されるべき前駆細胞が、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体をコードするｍＲＮＡ、若しくはそのＲＮＡ前駆体、及び／又はＣＤ４７／ＩＡＰ受容体からなるタンパク質を含む。好ましくは、ｍＲＮＡは、配列番号１の配列を含む。同様に好ましくは、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体は、配列番号２の配列からなる。ｍＲＮＡ、又はその前駆体の検出は、当業者に周知の種々の技術、例えばＲＴ−ＰＣＲによって行われ得る。タンパク質の検出はまた、当業者に周知の種々の技術、例えば抗ＣＤ４７／ＩＡＰ抗体を使用する免疫検出によって行われ得る。
【００４３】
本明細書において意図される、表現「ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬」は、ＴＳＰ１タンパク質又はＲＦＹＶＶＭＷＫペプチド（配列番号３）の結合によって誘導される応答と事実上類似している、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の応答を誘導する傾向にある任意の分子に関する。例として、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ９：８６５−８７４に記載されたように、ＣＤ４７／ＩＡＰの作動薬は、血管平滑筋細胞におけるα2β1インテグリンの発現及び活性化を促進する傾向にある。
【００４４】
例えば、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬は、抗ＣＤ４７作動薬抗体、例えばＧｒｅｓｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１９３５−１９４３；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ（１９９８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：８６５−８７４；Ｔｉｃｃｈｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ（２００１）１５：３４１−３５０；及びＢａｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２８５９−４２８６６によって記載されたＢ６Ｈ１２抗体、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：３６２１−３６２８によって記載されたＣＩＫｍ１抗体、又はＷａｎｇ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ（１９９８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：８６５−８７４によって記載された１Ｆ７抗体であり得る。
【００４５】
当該作動薬はまた、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：５５９−５６２；Ｂａｂｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：３６５２−３６５８；Ｓｅｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９７：２７４１−２７４９；及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６５：６８０−６９３によって記載されたＳＩＲＰα１タンパク質であり得る。
【００４６】
しかし、当該作動薬は、アミノ酸配列ＶＶＭを含むポリペプチドであることが好ましい。
【００４７】
かかる作動薬は、当業者に周知である。
【００４８】
特にそれらは、以下に記載されたような、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体結合ペプチドから選択される：
−Ｖｏｉｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５４４：２４０−２４５；Ｂａｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２８５９−４２８６６（配列ＲＦＹＶＶＭＷＫのペプチド４Ｎ１−１）；
−Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３５：５３３−５４４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４７：３８９−３９９；Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５２：２６２−２７２；Ｔｉｃｃｈｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＦＡＳＥＢ Ｊ １５：３４１−３５０；Ｂａｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２８５９−４２８６６；及びＬｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：６５４−６６１（配列ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ、配列番号４のペプチド４Ｎ１Ｋ）；
−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：３６２１−３６２８；Ｂａｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２８５９−４２８６６；及びＩｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２６０６９−２６０８０（配列ＦＩＲＶＶＭＹＥＧＫＫ（配列番号９）のペプチド７Ｎ３）；並びに
−米国特許第６，４６９，１３８号明細書（ＲＦＹＶＶＭＷＫＱＶＴＱＳ（配列番号１０）；及びＦＩＲＶＶＭＹＥＧＫＫ（配列番号９））。
【００４９】
好ましくは、当該作動薬は、ＲＦＹＶＶＭＷＫ（４Ｎ１−１、配列番号３）、例えばＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ（４Ｎ１Ｋ、配列番号４）若しくはＲＦＹＶＶＭＷＫの誘導体を含む、又はからなるポリメプチドである。
【００５０】
４Ｎ１−１は、ヒトＴＳＰ１の１０３４〜１０４１番のアミノ酸を特に表す。
【００５１】
本明細書において意図される、ＲＦＹＶＶＭＷＫの誘導体は、当該誘導体が、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体に対するＲＦＹＶＶＭＷＫと、本質的に同一の作動薬特性を示すという条件下において、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失又は挿入によって、及び／又は化学的処理によってＲＦＹＶＶＭＷＫから得られる任意のポリペプチドに関する。
【００５２】
好ましくは、当該作動薬は、ＴＳＰ１タンパク質の断片である。本明細書において意図されるＴＳＰ１タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＮＰ−００３２３７及び配列番号５で特に表されるヒトＴＳＰ１タンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＡＡ５０６１１及び配列番号６で特に表されるマウスＴＳＰ１タンパク質、又はＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＮＰ−０００１０１３０８０及び配列番号７で特に表されるラットＴＳＰ１タンパク質であることが好ましい。最も好ましくは、ＴＳＰ１タンパク質は、ヒトＴＳＰ１である。特に、当業者にとって明らかであろうことだが、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含むＴＳＰ１タンパク質の任意の断片は、本明細書において意図されるＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と考えられ得る。
【００５３】
好ましくは、当該作動薬がＴＳＰ１タンパク質の断片であるとき、それはタイプＩリピート及びＣＤ３６作動薬ドメイン、例えば配列ＣＳＶＴＣＧ（配列番号８）のいずれも含まない。
【００５４】
本明細書において意図されるＲＦＹＶＶＭＷＫペプチドの「類縁体」は、形状、電荷分布、及び親水性／疎水性分布において、ペプチドＲＦＹＶＶＭＷＫと類似している任意の分子に関する。
【００５５】
上で定義された方法の別の有利な実施形態において、調製された前駆細胞は、標的組織中において成熟細胞へと分化する傾向にあり、そして前記方法に従って調製されなかった類似の細胞と比較して、調製された細胞の分化が加速される。
【００５６】
上で定義された方法のさらなる実施形態において、当該細胞は、好ましくは１０秒〜２時間、作動薬と接触される。
【００５７】
別の実施形態において、上の方法は、例えばゼラチン／ビトロネクチン又はフィブリンのゲル上において、調製された細胞中の付着細胞をさらに選択するステップを含む。
【００５８】
実際に、異なる細胞は、作動薬接触段階において異なるように応答し得、したがって、細胞を付着画分及び非付着画分へと分離し得、そして向上した付着能力を有する画分を使用することは、治療的細胞生着率を向上させるために有利である。
【００５９】
本発明はまた、細胞生着を必要とする個体を処置することを目的とした医薬の製造のための、上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞の使用に関し、又は細胞生着を必要とする個体を処置するための方法であって、上で定義されたインビトロでの方法によって調製された治療上有効な量の細胞が、前記個体へ投与される、前記方法に関する。それはまた、細胞生着を必要とする個体を治療するための、上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関する。
【００６０】
本発明は、血管系の機能不全を患う個体を処置することを目的とした医薬の製造のための、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の上で定義された作動薬の少なくとも一つの使用にさらに関し、又は血管系の機能不全を患う個体を処置するための方法であって、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の上で定義された少なくとも一つの作動薬の治療上有効な量が、前記個体へ投与される、前記方法に関する。それはまた、血管系の機能不全を患う個体を処置するための、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の上で定義された作動薬に関する。
【００６１】
本発明はまた、血管系の機能不全を患う個体を処置することを目的とした医薬の製造のための、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなる、上で定義されたポリペプチドの少なくとも一つの使用に関し、又は血管系の機能不全を患う個体を処置するための方法であって、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなる、上で定義されたポリペプチドの少なくとも一つの治療上有効な量が前記個体に投与される、前記方法に関する。それはまた、血管系の機能不全を患う個体を処置するための、好ましくは上で定義されたインビトロでの方法によって調製された細胞に関連する、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなる、上で定義されたポリペプチドに関する。
【００６２】
本明細書において意図される個体は、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに関する。
【００６３】
好ましくは、個体は、血管系の機能不全を患っている。より好ましくは、個体は、血管の再生又は新生を必要としている。最も好ましくは、個体は、アテローム性動脈硬化、糖尿病、肥満、心筋梗塞、コロナロパシー（ｃｏｒｏｎａｒｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性網膜症、腎血管硬化症、脳虚血、血栓症、内皮機能不全、肺高血圧、外傷性皮膚創傷、潰瘍、及び熱傷から構成される群から選択される病変を患う。
【００６４】
本発明はまた、上で定義された個体が、上で定義された細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞を用いた処置から利益を受けるか否かを決定するためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記個体から採取された、上で定義された前駆細胞、好ましくは細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞と同一タイプの前駆細胞が、上で定義されたＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と、又は上で定義された、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなるポリペプチドと接触され；
（ｉｉ）前記接触された前駆細胞の付着性が評価され；
それにより、前記前駆細胞が増大した付着性を示す場合には、患者は細胞治療において有効であることが知られている前記前駆細胞を用いた処置から利益を受ける可能性があると決定されること
を含む、前記方法に関する。
【００６５】
本発明はまた、上で定義された個体が、上で定義された増大した付着性を有する前駆細胞を調製するためのインビトロでの方法によって調製された細胞を用いた処置から利益を得るか否かを決定するためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記個体から採取された、上で定義された前駆細胞が、上で定義されたＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と、又は上で定義された、ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む若しくはからなる、又はＲＦＹＶＶＭＷＫ類縁体を含む若しくはからなるポリペプチドと接触され；
（ｉｉ）前記接触された前駆細胞の付着性が評価され；
それにより、前記前駆細胞が増大した付着性を示す場合には、上で定義された増大した付着性を有する前駆細胞を調製するためのインビトロでの方法によって調製された細胞を用いた処置から利益を得る可能性があると決定されること
を含む、前記方法に関する。
【００６６】
逆に、本発明は、野生型のＴＳＰ１発現をノックアウトしたマウスにおいて、分化時に内皮細胞を産生する傾向にある細胞において、血栓部位へと動員される能力が減少したことを示した。さらに、これらの動物から単離されたＴＳＰ１欠損血小板によって放出される血小板の脱顆粒化産物は、分化時に内皮細胞を産生する傾向にある細胞の、インビトロにおける固定化された細胞外マトリックスへの付着を刺激する能力の減少を示した。
【００６７】
したがって、本発明は、細胞付着又は細胞生着を示唆する病的過程を示す個体における細胞付着又は細胞生着を防止するための方法であって、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の少なくとも一つの拮抗薬の有効量が前記個体へ投与される、前記方法に関する。
【００６８】
本発明はまた、細胞付着又は細胞生着を示唆する病的過程を示す個体における細胞付着又は細胞生着を防止することを目的とする医薬の製造のための、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の少なくとも一つの拮抗薬の使用に関する。それはまた、細胞付着又は細胞生着を示唆する病的過程を示す個体における細胞付着又は細胞生着を防止するための、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の拮抗薬に関する。
【００６９】
本明細書において意図される、表現「ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の拮抗薬」は、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の活性を阻害する、及び／又はＣＤ４７／ＩＡＰ受容体を不活性化する傾向にある任意の化合物であって、しかし同様にＴＳＰ１の結合を阻害する傾向にある任意の化合物、そして同様にＲＦＹＶＶＭＷＫ配列を含有する作動薬、又は任意のＲＦＹＶＶＭＷＫ配列様作動薬の、それらの同種受容体、例えば、特にＣＤ４７／ＩＡＰ受容体への結合を阻害する傾向にある任意の化合物に関する。
【００７０】
好ましくは、病的過程は、糖尿病性網膜症及びアテローム性動脈硬化である。
【００７１】
かかる使用又は方法は、特に細胞治療の範囲内において、非標的組織への及び／又は好ましくない部位における、投与された治療細胞の所望ではない付着又は生着を防止するために有用であり得る。この特定の場合において、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体拮抗薬は、前駆細胞の付着が防止され得る部位に、局所的に投与され得る。
【実施例】
【００７２】
材料及び方法
試薬及び抗体
ヒト組み換えＴＳＰ１は、ＥＭＰ−Ｇｅｎｅｔｅｃｈにより製造され、そしてヒト精製ＴＳＰ１は、Ｄｒ．Ａｒｎａｕｄ Ｂｏｎｎｅｆｏｙ、Ｉｎｓｅｒｍ Ｕｎｉｔ Ｕ５５３、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｓt Ｌｏｕｉｓ（Ｐａｒｉｓ）により調製された。合成ペプチド４Ｎ１−１（ＲＦＹＶＶＭＷＫ、配列番号３）及び４Ｎ１−２（ＲＦＹＶＶＭ、配列番号１１）を、Ｂａｃｈｅｍ Ｌｔｄから得た。ペプチド７Ｎ３（ＦＩＲＶＶＭＹＥＧＫＫ、配列番号９）、４ＮＧＧと呼ばれる変異した４Ｎ１−１（ＲＦＹＧＧＭＷＫ、配列番号：１２）、及び７ＮＧＧと呼ばれる変異した７Ｎ３（ＦＩＲＧＧＭＹＥＧＫＫ、配列番号：１３）は、ＮｅｏＭＰＳ，Ｆｒａｎｃｅにより合成された。精製ヒトフィブロネクチン及びトロンビン、スタウロスポリン及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＳｉｇｍａから得、フィブリノーゲンをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから得た。
【００７３】
細胞表面受容体の蛍光ラベル化及び阻害のために、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７ＩｇＧ１（クローンＢ６Ｈ１２）、及びＦＩＴＣ結合抗マウスインテグリンβ１アルメニアン（ｈａｒｍｅｎｉａｎ）ハムスターＩｇＧをＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入した。Ｂ６Ｈ１２と適合した対照アイソタイプマウスＩｇＧ１はＣｈｅｍｉｃｏｎより提供された。ビオチン結合抗マウスインテグリンβ2ラットＩｇＧ２ａｋａｐｐａ、フィコエリトリン結合抗マウスＰＳＧＬ１ラットＩｇＧ１ｋａｐｐａ、ＦＩＴＣ結合アルメニアンハムスターＩｇＧ、ビオチン結合ラットＩｇＧ２ａ−ｋａｐｐａ、フィコエリトリン結合ラットＩｇＧ１ｋａｐｐａ、及びＰｅｒ−ＣＰ結合ストレプトアビジンを、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。フィコエリトリン結合抗マウスインテグリンβ3アルメニアンハムスターＩｇＧ、ビオチン結合抗マウスインテグリンαvラットＩｇＧ１ｋａｐｐａ、フィコエリトリン結合アルメニアンハムスターＩｇＧ、及びビオチン結合ラットＩｇＧ１ｋａｐｐａは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより提供された。分析を、Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｋｉｎｓｏｎのＣａｎｔｏ−ＩＩ蛍光支援セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて行った。
【００７４】
組み換えヒトストローマ由来因子１α（ＳＤＦ１）を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、組み換えキメラエフリン−Ｂ２-Ｆｃ（ＥｐｈＢ２−Ｆｃ）を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得、そして組み換えヒトレプチンはＢｉｏｖｉｓｉｏｎから提供された。
【００７５】
動物
１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６及びＳｗｉｓｓ遺伝的背景を有する野性型雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用した。雄ＴＳＰ欠損ＳＷＩＳＳマウスを、Ｄｒ．Ａｒｎａｕｄ Ｂｏｎｎｅｆｏｙ、Ｉｎｓｅｒｍ Ｕｎｉｔ Ｕ５５３、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｓt Ｌｏｕｉｓ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。生体顕微鏡検査に関しては、マウスを４週齢で使用した。Ｃ５７Ｂｌ６遺伝的背景を有する肥満Ｏｂ／Ｏｂレプチン欠損トランスジェニックマウスを、Ｈａｒｌａｎ−Ｆｒａｎｃｅから得た。１型糖尿病（インスリン依存性）を雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎｅ）（膵臓のベータ細胞を破壊することが知られている）を毎日、１〜２週間、血糖が３００ｍｇ／ｋｇに達するまで注射することによって導入した。当該マウスはその後、糖尿病と見なされ、そして２か月間、標準食餌（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）で飼育される。
【００７６】
細胞培養
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの大腿骨及び上腕を注意深く切開し、骨髄を抽出及び解離し、そして骨髄単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０８３，Ｓｉｇｍａ）での分画遠心法（２，０００ｒ．ｐ．ｍ、２５分）によって分離した。ＢＭ−ＭＮＣをその後ＰＢＳで洗浄し、そしてペレット化した（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）（２，０００ｒ．ｐ．ｍ、１０分）。
【００７７】
ＦＡＣＳアッセイに関して、新鮮細胞を、指示されたペプチド及び時間で処理し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定化し、そして細胞の大きさの分布を前方散乱光及び側方散乱光の分析によって決定するために、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ−ＸＬセルソーターを用いて分析した。データは、点分布図として又は個々のＦｓｃ及びＳｓｃの分布特性としてのいずれか一方で示された。
【００７８】
代わりに、ＢＭ−ＭＮＣを再懸濁し、そして内皮細胞基本成長培地（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｂａｓａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＢＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、又は血管内皮増殖因子−１６５（ＶＥＧＦ）及び線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）を豊富に含み、そしてウシ胎仔血清（ＦＣＳ、２０％）をさらに添加したＥＢＭ２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で培養された。細胞をゼラチン（０．１％）−ビトロネクチン（０．５％μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）であらかじめ被膜したウェル中で培養した。ペプチド濃度及び時間の指示された条件で培養した後、個々の細胞が占める領域を決定するために、ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを用いて、当該細胞の範囲を定めることによって細胞拡散を測定した。５０個超の細胞を３つの独立した細胞培養に関する３つのランダムに選択した領域において測定した（倍率４００倍）。拡散を一細胞あたりの相対面積単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｒｅａ ｕｎｉｔｓ）で表現した。
【００７９】
マウスの循環血液を、後方の眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）における静脈穿刺を通じて得、そしてヘパリン（５ＵＩ／ｍｌ）を含有する抗凝結バッファーと混合した。循環末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０８３、Ｓｉｇｍａ）（２，０００ｒ．ｐ．ｍ、２５分）を通じて精製した。そして血小板の混入を排除するために、細胞をＰＢＳ中で２度洗浄かつペレット化した（２，０００ｒ．ｐ．ｍ、５分）。
【００８０】
ＳＶ４０形質転換マウス骨髄内皮細胞（ＡＴＣＣからのＳＶＥＣ）を、２４ウェルプラーク中、２０％ＦＣＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中で、それらが完全培養密度に達するまで（７日間）増殖させた。細胞−細胞付着実験に先立って、ＳＶＥＣ単層を、５ｎＭマウスインターロイキン−１β（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で２時間活性化した。
【００８１】
Ｈｏｐｉｔａｌ Ｌａｒｉｂｏｉｓｉｅｒｅ ａｎｄ Ｉｎｓｅｒｍ倫理ガイドラインに従って標準的な手順によって、ヒト臍帯血（３０〜５０ｍｌ）を、ヘパリン（１５ＵＩ／ｍｌ、Ｓａｎｏｆｉ）を含有する滅菌チューブ中に集めた。ＰＢＭＣを、フィコール勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）を通じて単離した。成熟内皮細胞を除去するために、単核細胞（６．１０6細胞／ｍｌ）を培養ディッシュ（１００×２０ｍｍ）中、３７℃、５％ＣＯ2で１６時間、播種した。付着細胞を除去した。非付着細胞を培養し、そして６ウェルプレート（１０7細胞／ウェル）において、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳバッファー（２５ｍＭ；Ｅｕｒｏｂｉｏ）、抗生剤及び抗真菌剤（ペニシリン１００００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍｌ、ファンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）２５μｇ／ｍｌ）及び２０％ＦＣＳ（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）、並びに１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたＭ１９９成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中のコラーゲンタイプ１マトリックス（Ｃｏｌｌｉ；９０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）上で、ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞（ＨＵＣＢ−ＥＰＣ）へと分化させた。
【００８２】
細胞調製物の前処理
ゼラチン／ビトロネクチン、フィブリンゲル又は活性化ＳＶＥＣ単層上への細胞付着における、ＴＳＰ１又はそのカルボキシ末端配列由来のペプチド、４Ｎ１−１、及び４Ｎ１-２の効果を評価するために、特定の長さの時間でのＰＢＳ洗浄及び培養以前に、２．１０6／ｍｌ ＢＭ−ＭＮＣ若しくはＰＢＭＣ、又は１０6／ｍｌ ＨＵＣＢ−ＥＰＣを、ＴＳＰ１（５０〜１００μＭ）、又は４Ｎ１−１若しくは４Ｎ１−２ペプチド（１００μＭ）、又は対照ＢＳＡ（１％）の存在下、又はマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７ ＩｇＧ１ Ｂ６Ｈ１２（４０μｇ／ｍｌ）、又は適合された対照アイソタイプマウスＩｇＧ１（４０μｇ／ｍｌ）の存在下、５％ＣＯ2下のインキュベーター中、３７℃で２時間前処理した。付着実験に関して、上清を除去し、付着細胞をＰＢＳにて軽く洗浄した。高倍率視野あたりの付着細胞の数を、倒立型位相コントラスト顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を高倍率（４００倍）で使用して、１ウェルあたり３〜５つの領域で集計した。
【００８３】
血小板の欠乏した血漿
マウスの循環血液を、後方眼窩洞の静脈穿刺（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）を通じて得、そしてヘパリン（５ＵＩ／ｍｌ）を含有する抗凝結バッファーと混合し、そして赤血球及び白血球を除去するために、２０００ｒ．ｐ．ｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、そして血小板を除去するために、１１，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離した。この最後の上清は、血小板の欠乏した血漿（ＰＰＰ）と見なされた。
【００８４】
血小板脱顆粒化産物
ペントバルビタールナトリウム（Ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ−Ｎａ）の過剰用量（Ｃｅｒｖａｌ、Ｆｒａｎｃｅ）を通じた末端麻酔（ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）の後、マウス血液を、心臓内穿刺を通じて得た。血液をＡＣＤ−Ｃバッファー（クエン酸１３０ｍＭ、クエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｃ ｃｉｔｒａｔｅ）１２４ｍＭ、グルコース１１０ｍＭ）を用いて抗凝固され、そして自発的血小板活性化を防止するために、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１ １０〜８Ｍ）と共に、１時間、室温でインキュベートした。血液をその後、１５分間、１２０ｇで、１５℃にて遠心分離し、血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）を回収した。ＰＲＰをその後、洗浄バッファー（ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、クエン酸三ナトリウム １２ｍＭ、グルコース １０ｍＭ、ショ糖 １２．５ｍＭ、ｐＨ６．０）と混合し、そして１５分間、１，２００ｇで遠心分離した。血小板が反応バッファー（ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ３ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ０．５ｍＭ、ＮａＨＣＯ3 ５ｍＭ、グルコース １０ｍＭ、ｐＨ７．４）中にて再懸濁される前に、血小板のペレットを洗浄し、そして１５分間、１，２００ｇにて、再度ペレット化した。血小板を数え、当該懸濁液を６００，０００血小板／μｌへと調整し、そして機能的凝集試験に先立ちＰＧＥ１を除去するために、室温で３０分間放置した。
【００８５】
血小板凝集を、Ｂｏｒｎ（１９６２）による濁度法に従うＣｈｒｏｎｏｌｏｇ血小板凝集計（Ｋｏｒｄｉａ、Ｈｏｌｌａｎｄ）を用いて測定した。血小板懸濁液（４００μｌ）を、３７℃で５分間インキュベートし、そして攪拌しながら血小板凝集計へと入れた。０％の光透過を、血小板懸濁液を用いて較正し、１００％透過をバッファー単体に合わせた。光透過の記録を、カルシウム及び他の作動薬、例えばトロンビン受容体活性化ペプチド−６（ＴＲＡＰ、１００μＭ）及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ １０μＭ）の添加後に開始した。５分間の凝集−脱顆粒の後、血小板を１５秒間、パルス遠心分離（ｐｕｌｓｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）し、そして除去した。上清は、血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ）を含有した。
【００８６】
骨髄由来ＥＰＣ標識化
ＢＭ−ＭＮＣを、ＥＢＭ培地中、５日間、ゼラチン／ビトロネクチン上で培養した。非付着細胞を除去した後、２つの内皮細胞特性に関する二重標識化を通じてＥＰＣを同定した：Ｄｉｌ標識化・アセチル化・低濃度リポタンパク質（Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ；１μｇ／ｍｌ、ＢｉｏＨａｒｂｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；赤色の蛍光）の結合、及びＦＩＴＣ標識されたＢＳ１−レクチン（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ；緑色の蛍光）の結合。二重蛍光により、１ウェルあたり３〜５つの領域中におけるＥＰＣの顕微鏡による同定及び集計（倍率４００倍）が可能となった。実験を、少なくとも３回繰り返し、そして結果をＥＰＣのパーセンテージとして表現した。
【００８７】
インテグリン及びＰＳＧＬ１の、細胞表面の発現
細胞表面のタンパク質発現を決定するために、ＦＩＴＣ結合抗インテグリンβ１、ビオチン結合抗インテグリンβ2、ＰＥ結合抗インテグリンβ3、ビオチン結合抗インテグリンαv、ＰＥ結合抗ＰＳＧＬ１抗体、又はそれらに適合した対照アイソタイプ（全て０．５ｍｇ／ｌ）と共に、４５分間、ＰＢＳ−ＢＳＡ２％中でインキュベーションする前に、ＢＭ−ＭＮＣを、ＰＢＳ−ＢＳＡ５％を用いて、３０分間ブロッキングした。ＢＭ−ＭＮＣをペレット化し（５分、２，０００ｒ．ｐ．ｍ）、そしてＰＢＳ−ＢＳＡ２％と共に再懸濁した。標識化された細胞のパーセンテージを、Ｃａｎｔｏ−ＩＩセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーにより決定した。非免疫アイソタイプ対照抗体標識細胞のパーセンテージは、補正された。
【００８８】
核形態学の観察を通じたアポトーシスの評価
ＢＭ−ＭＮＣを、ＥＢＭ中、ＴＳＰ１、又は４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２ペプチドの継続的な存在下で、或いは最後の２４時間のみ処理されて、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックス上で５日間増殖させた。スタウロスポリン（２μｇ／ｍｌ、６時間）を、アポトーシス誘導のための陽性対照として使用した。非付着細胞を除去し、そして付着細胞をＰＢＳ−ＰＦＡ ４％で固定化し、その後、ＤＮＡ塩基間における結合後に蛍光性となるＤＡＰＩ（ジアミジノフェニルインドール、０．０１ｍｇ／ｍｌ）を添加した。核形態学を、蛍光顕微鏡検査法によって分析し、そして断片化又はクロマチンの凝縮を示したアポトーシス核のパーセンテージを１ウェルあたり３〜５つの領域中において計算した（倍率４００倍）。実験を少なくとも３回繰り返した。
【００８９】
無傷ＤＮＡ内容物の定量を通じたアポトーシス評価
ＢＭ−ＭＮＣを単離し、そして４Ｎ１−１ペプチドを用いて１０又は１２０分間処理し、ＰＢＳで洗浄し、そしてＥＢＭ中、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックス上で２４時間まで培養した。未処理の新鮮細胞を、生細胞のための対照とした。アポトーシスの陽性対照として、懸濁液中の細胞をスタウロスポリン（２μｇ／ｍｌ、６時間）で処理した。処理及び培養後、非付着及び付着細胞を採取し、そして別々に分析し、氷冷した７０％エタノールのＰＢＳ溶液で固定化し、そしてトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（０．０５％）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；５０μｇ／ｍｌ）及びＲＮａｓｅ−Ａ（１００μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ中、４５分間インキュベートした。ＰＩは、ＤＮＡ塩基間における結合の後に蛍光性となる。ＤＮＡ内容物をその後、蛍光支援細胞ソーティング（ＦＡＣＳ；Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって分析し、そしてＤＮＡの断片化、及び蛍光の減少を示したアポトーシス核のパーセンテージを測定した。実験を３回繰り返した。
【００９０】
実験的血栓症におけるＢＭ−ＭＮＣの時間依存的動員
発明者は、Ｋｕｒｚ他（１９９０）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ６０：２６９−２８０による、動脈血栓症の実験モデルを適用し、そして塩化鉄（ＦｅＣｌ3）を化学誘導物質として使用した。野生型Ｃ５７ｂｌ６、Ｓｗｉｓｓ、又はＴＳＰ１欠損Ｓｗｉｓｓマウスは、ペントバルビタールを用いた末端麻酔後に、及び追加の鎮痛剤としてキシロカイン５％を局所に皮膚へ塗布した後に、腹壁切開手術された。ＢＭ−ＭＮＣを、蛍光染料「Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ」（５μＭ；分子プローブ）、及び合成ペプチド４Ｎ１−１若しくは４Ｎ１−２（１００μＭ）、又は対照ＢＳＡ（１％）を用いて２時間前処理した。ＢＭ−ＭＮＣをＰＢＳで洗浄し、そして後方の眼窩洞を通じた血液循環へと投与した（２．１０6細胞／１００μｌ／動物）。腸間膜動脈−静脈対を切開し、そしてリアルタイム生体顕微鏡検査にさらした。調製された全マウスを、ＶＨＳレコーダーと接続されたアナログカメラ（ａｎａｌｏｇｉｃ ｃａｍｅｒａ）（ＬＨＥＳＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｌ、４０イメージ／秒）を取り付けた、又はＡｃｔ−１画像収集ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）とリンクした、高解像度ニューメリック（ｎｕｍｅｒｉｃ）カメラ（ＤＸＭ１２００、Ｎｉｋｏｎ）とつながった、落射蛍光顕微鏡（Ｅｌｌｉｐｓｅ ＴＥ３００）の台に載せた。選択された小静脈の無傷血管壁上における基本的ＢＭ−ＭＮＣ動員を２分間記録した。ＦｅＣｌ3（５００ｍＭ）を含有する寒天ゲル（１％）片（１〜２ｍｍ3）をその後、局所的に適用して、拡散を通じた進行性の血管内血栓を誘導した。血栓症に罹患した血管表面上におけるＢＭ−ＭＮＣの動員を、さらに１５分間記録した。記録を分析し、そして新規ＢＭ−ＭＮＣ／血管壁相互作用の数を毎分ごとに計算した。安定した付着（３０秒超の間静止している付着細胞）を集計し、そして血栓症の誘導後、初めの１０分間にわたって蓄積した。血管壁と相互作用するＢＭ−ＭＮＣの平均回転速度を、較正されたスクリーン上における時間にわたる移動距離を測定し、そしてμｍ／秒へと変換することによって血栓症誘導後における最初の１０分間にわたって、一細胞あたりで計算した。
【００９１】
実験的な後肢虚血の間における、ＢＭ−ＭＮＣの血管新生促進効果
麻酔マウス（ｍ＝８〜１０動物／群）は、右大腿深動脈の近位起始部（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｏｒｉｇｉｎ）における動脈結紮を受け、後肢虚血を誘導された。全てのマウスの操作を、我々の団体の倫理規則及びガイドラインに従って行った。結紮されたマウスへ、上で示したように調製されたＢＭ−ＭＮＣを注射した。虚血１４日後、後肢における血管新生を、２つの独立した方法を使用して調べた：血管密度を、高解像度ミクロ血管造影を通じて評価した。麻酔動物へ、腹部大動脈中に挿入された、シリンジと連結されたカテーテルを通じて、較正されたポンプの制御下において、造影剤として硫酸バリウムを注射した。このシステムにより、一定の注入量の連続的なモニタリングを行うことができた。後肢血管系の画像を、Ｘ線ミクロ血管造影を介して得た。血管造影スコアは、血管で占められる画像画素を定量することによって決定され、そしてパーセンテージで表現された。皮膚血流量における変化を、画像分析ソフトウェアと接続されたＬａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒにより分析した。証明変動及び室温は、虚血性の右肢において得られる値を、非虚血性の対照である左肢の値で割った割合として後肢灌流を表現することによって考慮された。
【００９２】
統計分析
全ての実験を、少なくとも３回繰り返した。インビトロの実験に関して、統計分析を、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った。血管新生の結果を、ＡＮＯＶＡ検定を用いて分析し、そしてグループ間の比較（ｍ＝５〜１０動物／グループ）を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて行った。有意性は、ｐ＜０．０５の時に得られた。
【００９３】
実施例１
マウスＢＭ−ＭＮＣ、マウスＰＢＭＣ、及びヒトＨＵＣＢ−ＥＰＣ付着における血小板タンパク質の効果
マウスＢＭ−ＭＮＣ及びＨＵＣＢ−ＥＰＣ付着を、インビトロで評価した。精製若しくは組み換え血小板タンパク質、又はＣＤ４７／ＩＡＰ受容体のペプチド作動薬の効果を特徴付けした。主に２つの手法を使用した：
１．ゼラチン／ビトロネクチン対照マトリックス又はフィブリンゲル上における３０分間の細胞付着を測定する以前における、血小板タンパク質と共にした、細胞の２時間のプレインキュベーション。
２．溶液中血小板タンパク質の存在下で、ゼラチン／ビトロネクチン対照マトリックス又はフィブリンゲル上における、１６時間の細胞付着
【００９４】
−ゼラチン／ビトロネクチン又はフィブリンゲル上へのＢＭ−ＭＮＣの付着における、ＢＭ−ＭＮＣをＴＳＰ１又はペプチド４Ｎ１−１と共にプレインキュベーションをしたことの効果：
ＢＭ−ＭＮＣを、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１又はペプチド４Ｎ１−１で２時間前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチンマトリックス又はフィブリンゲルへのそれらの付着を３０分間測定した。ＴＳＰ１を用いた前処理、及び特に４Ｎ１−１ペプチドを用いた前処理は、ＢＳＡを用いた場合と比較して、ゼラチン／ビトロネクチンへの付着（それぞれ、＋１６０．６％、ｐ＜０．０５；及び＋２４９．６％、ｐ＜０．０５）及びフィブリンへの付着（それぞれ、＋７４．０％、ｐ＜０．０５；及び＋１８６．０％、ｐ＜０．０５）を強く刺激した（図１）。ＢＭ−ＭＮＣを、組み換えＴＳＰ１を１〜４０ｍｇ／ｍｌの増大する濃度で２時間前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチンへのそれらの付着を３０分後に測定した。ＴＳＰ１は、５μｇ／ｍｌ超から、ゼラチン／ビトロネクチンへのＢＭ−ＭＮＣの付着を有意に刺激した。ＢＳＡの場合と比較して、最大刺激は２０μｇ／ｍｌにおいて到達された（＋１７９．３％、ｐ＜０．０５）（図２）。４Ｎ１−１ペプチドを用いた刺激は、フィブリンゲル上へのものよりも、ゼラチン／ビトロネクチン上へのものの方が相対的により強力であり、そして１００ｎＭから用量依存的であった（図５）。１００μＭの４Ｎ１−１ペプチドは、ＴＳＰ１の最も効果的な試験用量（１００ｎＭ）よりも、約６倍効果的に付着を刺激した。ＢＭ−ＭＮＣ付着の４Ｎ１−１ペプチド刺激が完了し、そしてたった５〜３０分間のプレインキュベーションの後においてほぼ最大効果を生じた（図６）。細胞の付着能力の増大は、刺激開始後少なくとも２時間維持された。
【００９５】
−ゼラチン／ビトロネクチン又はフィブリンゲル上へのＰＢＭＣの付着における、ＰＢＭＣをＴＳＰ１又はペプチド４Ｎ１−１と共にプレインキュベーションをしたことの効果：
４Ｎ１−１ペプチドと共にするＰＢＭＣのプレインキュベーションは、ＢＭ−ＭＮＣにおける場合と同様の効果を誘導し、そしてゼラチン−ビトロネクチンへのそれらの付着を刺激し（＋４０３．２％、ｐ＜０．０５）、そしてフィブリンゲル上への付着をさらに刺激した（＋１，１０７．８％、ｐ＜０．０５）（図４）。
【００９６】
−ゼラチン／ビトロネクチンへの１６時間のＢＭ−ＭＮＣ付着に対する、溶液中のＴＳＰ１、４Ｎ１−１ペプチド及びＰＰＰの効果：
付着を、位相差顕微鏡による直接的細胞集計を通じて定量する以前に、ＢＭ−ＭＮＣを１６時間、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックス上で、ＰＰＰ、組み換えＴＳＰ１（１００μｇ／ｍｌ）、又はペプチド４Ｎ１−１（１００μＭ）の存在下、インキュベートした。図３で報告されたように、ＴＳＰ１は、ゼラチン／ビトロネクチン対照と比較して３倍超付着を刺激した（＋２０６．８％、ｐ＜０．０５）。合成ペプチド４Ｎ１−１はまた、２時間のプレインキュベーションを用いた場合よりもあまり有効ではないが、１６時間かけて有意に付着を増大させた。
【００９７】
−ゼラチン／ビトロネクチン上へのＢＭ−ＭＮＣの付着における、ＢＭ−ＭＮＣをヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチドＣＳＶＴＣＧ、４Ｎ１−１、又はＴＳＰ１の種々の組み換えドメインと共にプレインキュベーションをしたことの効果：
ＢＭ−ＭＮＣを２時間、ＢＳＡ（対照）、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチドＣＳＶＴＣＧ、４Ｎ１−１、又はペプチドＧＳＴ単体若しくはヒトＴＳＰ１の組み換えドメインＮＨ２、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩと連結したペプチドＧＳＴで前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチンへのそれらの付着を３０分後に測定した。図７で示されるように、ペプチド４Ｎ１−１は、ＢＳＡと比較して特に強くＢＭ−ＭＮＣの付着を刺激した（＋３１０．４％、ｐ＜０．０５）。組み換え及び精製ＴＳＰ１も、付着を有意に刺激した（それぞれ＋６５．６及び＋１４３．８％、ｐ＜０．０５）。それら各々の効果の間に有意差は存在しなかった（ｐ＝０．０５８）。試験された組み換えＧＳＴ結合ＴＳＰ１ドメインは、対照ＧＳＴ単体と比較して効果を有さなかった。一方、ペプチドＣＳＶＴＣＧを用いた付着はＢＳＡの場合と比較して２１％の阻害を示した（ｐ＜０．０５）。
【００９８】
代わりに、ＢＭ−ＭＮＣを２時間、ＢＳＡ（対照）、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１、７Ｎ３、及び４Ｎ１−２，又は変異配列４ＮＧＧ若しくは７ＮＧＧで前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチンへのそれらの付着を３０分後に測定した。図２６で示されるように、トロンボスポンジン−１のカルボキシ末端における２つのＣＤ４７活性化部位に相当する両方のペプチド（４Ｎ１−１及び７Ｎ３）は、ＢＳＡと比較してＢＭ−ＭＮＣ付着を有意に刺激した（ｐ＜０．０５）。変異ペプチドを用いたＢＭ−ＭＮＣ付着の有意な調節は存在しなかった。
【００９９】
比較の目的のために、ＢＭ−ＭＮＣを、ＢＳＡ（対照）、ヒト組み換えＴＳＰ１、又は前駆細胞付着又は分化を調節することが知られている他の因子、例えば組み換えヒト間質由来因子１α（ＳＤＦ１；１００ｎｇ／ｍｌ）、組み換えキメラエフリン−Ｂ２−Ｆｃ（ＥｐｈＢ２−Ｆｃ；３μｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ−豊富培養培地ＥＢＭ２（５０％）、又は組み換えヒトレプチン（１及び１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて２時間前処理した。ゼラチン／ビトロネクチンへのＢＭ−ＭＮＣ付着を、３０分後に測定した。図２７に示すように、ＥＢＭ２培地及びレプチン（１００ｎｇ／ｍｌ）は、ＢＳＡと比較して（ｐ＜０．０５）、又はペプチド４Ｎ１−１で得られる刺激と比較して、ＢＭ−ＭＮＣ付着において中等度の増加（２倍未満）を刺激した（図７）。ＳＤＦ１又はＥｐｈＢ２−Ｆｃを用いたＢＭ−ＭＮＣ付着の有意な調節はなかった。
【０１００】
−ゼラチン／ビトロネクチン及びフィブリンゲル上へのＨＵＣＢ−ＥＰＣの付着における、ＨＵＣＢ−ＥＰＣをヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１と共にプレインキュベーションをしたことの効果：
ＨＵＣＢ−ＥＰＣを、２時間、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１を用いて２時間前処理し、そしてゼラチン／ビトロネクチン及びフィブリンゲル上へのそれらの付着を１５分後に測定した。図８に示されるように、組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、及びペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、ＢＳＡと比較して、ゼラチン／ビトロネクチン上（それぞれ＋１０６．３％；＋５２．５％；及び＋５８．５％、ｐ＜０．０５）及びフィブリンゲル上（それぞれ＋１０６．３％；＋５２．５％；及び＋５８．５％、ｐ＜０．０５）の両方への付着を有意に刺激した。ＴＳＰ１のタイプ又はペプチド４Ｎ１−１のいずれかを用いて得られる刺激範囲は、両タイプのマトリックスにおいて同等であった。
【０１０１】
ＰＢＳ洗浄及び培養以前に、ＨＵＣＢ−ＥＰＣを、対照ＢＳＡ（１％）の存在下、又はマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７ ＩｇＧ１ Ｂ６Ｈ１２（４０μｇ／ｍｌ）、又は適合された対照アイソタイプマウスＩｇＧ１（４０μｇ／ｍｌ）の存在下、５％ＣＯ2下のインキュベーター中、３７℃で２時間前処理した。図２８で示されるように、Ｂ６Ｈ１２を用いた前処理は、ＢＳＡ又は対照マウスＩｇＧ１と比較して、ゼラチン／ビトロネクチン上への付着を有意に刺激した（それぞれ、＋１４．６％、又は＋１６．６％、ｐ＜０．０５）。これは、抗ＣＤ４７抗体が、作動薬として機能し得、そして作動薬ペプチドと同様の付着促進効果を示し得ることを示唆している。
【０１０２】
−内皮細胞単層上へのＢＭ−ＭＮＣの付着における、ヒト組み換え若しくは精製ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１と共にＢＭ−ＭＮＣをプレインキュベーションしたことの効果：
ＢＭ−ＭＮＣを、組み換え若しくは精製ヒトＴＳＰ１（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、又はペプチド４Ｎ１−１（１００μＭ）を用いて２時間前処理し、そして３０分後に、インターロイキン−１βで前もって活性化されたマウス内皮細胞単層上へのそれらの付着を測定した。図９において示されるように、ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、ＢＳＡと比較して、付着を強力に刺激した（＋３５９．５％、ｐ＜０．０５）。組み換え及び精製ＴＳＰ１はまた、有意な刺激を誘導した（それぞれ＋３４．２％及び＋４０．５％、ｐ＜０．０５）。マウス内皮細胞単層へのＢＭ−ＭＮＣ付着に対する４Ｎ１−１の効果を、蛍光顕微鏡によって証明することができた（図１０）。
【０１０３】
−ゼラチン／ビトロネクチンへのＢＭ−ＭＮＣの付着における、ＴＳＰ１、又はペプチド４Ｎ１−１と共にＢＭ−ＭＮＣをプレインキュベーションしたことの効果：
トランスジェニック肥満マウス（Ｏｂ／Ｏｂ遺伝型、レプチン欠損）、及び糖尿病マウス(ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病)から得たマウスＢＭ−ＭＮＣの付着を、インビトロで評価した。３０分間の、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックスへのＢＭ−ＭＮＣ付着の測定前に、ＢＭ−ＭＮＣを、対照ＢＳＡ又は４Ｎ１−１と、２時間プレインキュベーションした。肥満Ｏｂ／Ｏｂ ＢＭ−ＭＮＣは、野生型対照と比較して、インビトロにおいて付着の減少を示し（−３１％；ｐ＜０．０５）（図２２）、そしてそれはＥＰＣの機能障害と整合がとれる。しかし付着は、４Ｎ１−１を用いた前処理によって、少なくとも野生型ＢＭ−ＭＮＣと同程度の強さで、著しく向上した（関連性ＢＳＡ対照と比較して、それぞれ８９４．７％及び１，２４５．０％、ｐ＜０．０５対対照）。ストレプトゾトシンで処理したマウスから得られた糖尿病ＢＭ−ＭＮＣ（図２３）は、非糖尿病細胞と比較して、有意ではなく、基本付着レベルが減少する傾向を示した（−１９％；ｐ＞０．０５）。しかし、糖尿病ＢＭ−ＭＮＣの付着は、４Ｎ１−１を用いた前処理によって著しく向上し、そして糖尿病細胞は、非糖尿病細胞よりも４Ｎ１−１対して有意により大きく応答した（それらの関連ＢＳＡ対照と比較してそれぞれ２７０．３％対５８７．８％；ｐ＜０．０５対対象、及び細胞タイプ間においてｐ＜０．０５）。
【０１０４】
実施例２
ＴＳＰ１又はペプチド４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２を用いた刺激の後、ＢＭ−ＭＮＣにおける細胞表面付着タンパク質の発現
発明者が、ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理後における増大したＢＭ−ＭＮＣ付着を観測した後、発明者は、当該ペプチドがそれらの表面における付着タンパク質の発現を調節するか否か決定することとした。したがってＢＭ−ＭＮＣを、対照ＢＳＡ又はペプチド４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて３０分間前処理し、そしてインテグリン及びＰＳＧＬ１発現を分析した。免疫標識及びＦＡＣＳにより分析した。図１１に示されるように、ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、ＢＳＡの場合と比較して、インテグリンβ1発現（３０．７％〜４８．１％、ｐ＜０．０５）、インテグリンαV発現（２２．８％〜６４．８％、ｐ＜０．０５）、及びＰＳＧＬ１（４４．４％〜６１．８％、ｐ＜０．０５）を刺激した。さらに、４Ｎ１−１は、有意ではないものの（ｐ＝０．０７）、インテグリンβ3発現を刺激する傾向を示したが（７２．０％〜７９．４％）、４Ｎ１−１は、これらの実験において、インテグリンβ2発現を調節することができなかった（ｐ＞０．５）。
【０１０５】
図３０に示されるように、ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、ＢＳＡを用いた場合と比較して、インテグリンβ1及びβ2の同時共発現（２９．８％〜５４．４％、ｐ＜０．０５）、インテグリンβ1及びβ3の同時共発現（２２．４％〜５３．１％、ｐ＜０．０５）、インテグリンβ2及びβ3の同時共発現（６７．４％〜７５．６％、ｐ＜０．０５）、又はインテグリンβ1及びβ2及びβ3の同時共発現（１８．８％〜４４．８％、ｐ＜０．０５）、インテグリンαVとＰＳＧＬ１の同時共発現（１１．５％〜４８．４％、ｐ＜０．０５）を刺激した。したがって、４Ｎ１−１は、ＢＭ−ＭＮＣ表面にある複数の付着受容体の同時発現を強く刺激した。
【０１０６】
実施例３
ペプチド４Ｎ１−１を用いた刺激後における、ＢＭ−ＭＮＣ拡散の調節
ペプチド４Ｎ１−１を用いた処理の後におけるＢＭ−ＭＮＣ付着の増大を観察した後、発明者は、インビトロにおける、ゼラチン／ビトロネクチンマトリックス上への細胞拡散の程度を調べた。ＢＭ−ＭＮＣを、４Ｎ１−１（１００μＭ）、又は対照ＢＳＡを用いて前処理し、そして３０分間、付着のために放置した（図１４）。４Ｎ１−１は、個々の細胞により占められる領域において、ＢＳＡの場合と比較して４１％の細胞拡散増大を刺激した（ｐ＜０．０５）。
【０１０７】
実施例４
ペプチド４Ｎ１−１を用いた刺激後におけるＢＭ−ＭＮＣの形状の調節
ペプチド４Ｎ１−１を用いた処理の後におけるＢＭ−ＭＮＣ付着の増大を観察した後、発明者は、ペプチド４Ｎ１−１により引き起こされた細胞形状変化を調べた。ＢＭ−ＭＮＣを、増加する時間で、４Ｎ１−１（５０μＭ）を用いて前処理し、そして速やかにＦＡＣＳによって分析して、セルソーターの前方散乱光及び側方散乱光チャンネル（ＦＳｃ及びＳＳｃ）におけるそれらの形状分布を決定した（図１５）。６０秒と同程度の時間の処理は、細胞形状における有意な変化を引き起こすために十分であり、そしてそれは、速やかかつ活発な細胞骨格の再構築を示唆した。図１６は、ＢＳＡ又は４Ｎ１−１を用いて１０分間インキュベーションした後における、個々のＦＳｃ及びＳＳｃにおけるＢＭ−ＭＮＣの形状分布を示し、そしてそれは、当該群にわたる、ＢＭ−ＭＮＣの形状及び構造の全体的な均質化を明らかにした。
【０１０８】
実施例５
ペプチド４Ｎ１−１を用いた刺激後における、ＢＭ−ＭＮＣアポトーシスの調節
ペプチド４Ｎ１−１を用いた処理の後におけるＢＭ−ＭＮＣ付着の増大を観察した後、発明者は、ペプチド４Ｎ１−１により引き起こされるアポトーシスの程度を調べた。ＢＭ−ＭＮＣを、４Ｎ１−１（１００μＭ）又は対照ＢＳＡを用いて前処理し、そして５日間培養し、又は４Ｎ１−１の継続的な存在下において５日間培養し、又はスタウロスポリンと共に６時間培養した（図１３）。４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２ペプチドは、ＢＳＡと比較して、培養５日後でさえアポトーシスを有意に刺激しなかった。
【０１０９】
発明者は、第二の方法を使用して、ペプチド４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２で処理したＢＭ−ＭＮＣにおけるアポトーシスの程度を調べた。ＢＭ−ＭＮＣを、４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２（５０μＭ）で１０又は１２０分間前処理し、そして、血清及び成長因子を用いた完全ＥＢＮ２培地中で２４時間まで培養し、潜在的なアポトーシス反応を進行させた（図２９）。未処理の新鮮細胞を対照として用い、そして懸濁液中、６時間のスタウロスポリンによるアポトーシスの誘導が同様に観測された。培養後、付着及び非付着細胞を別々に採取し、そして分析した。ペプチド４Ｎ１−１及び４Ｎ１−２は、スタウロスポリン又は対照と比較して、付着細胞及び非付着細胞のいずれにおいても、１２０分のインキュベーション後においてさえ、アポトーシスを有意に刺激しなかった。ＢＭＣ付着の最適刺激を誘導するＣＤ４７作動薬を用いた処理に関して、アポトーシスの誘導は見られなかった。対照的に、アポトーシス促進性のスタウロスポリンを用いたたった６時間の処理は、７２．５％の細胞死の増加を誘導した（*ｐ＜０．０５）。
【０１１０】
実施例６
ＢＭ−ＭＮＣの内皮細胞分化における、ＴＳＰ１、並びにペプチド４Ｎ１−１、４Ｎ１−２及びＣＳＶＴＣＧの効果
ＴＳＰ１及びペプチド４Ｎ１−１が、インビトロにおけるＢＭ−ＭＮＣ付着を刺激する先の観察の後、発明者は、処理されたＢＭ−ＭＮＣの内皮細胞分化を測定した。ＢＭ−ＭＮＣを５日間培養し、その後２時間組み換え若しくは精製ＴＳＰ１を用いて、又はペプチド４Ｎ１−１、４Ｎ１−２及びＣＳＶＴＣＧ（ＴＳＰ１配列由来のペプチド）を用いて２時間前処理した。ＥＰＣ分化ＢＭ−ＭＮＣを、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの結合及びＢＳ１レクチンの結合による二重標識化後に、蛍光顕微鏡により同定した。
【０１１１】
２時間の前処理後における内皮細胞分化を刺激する、組み換え及び精製ＴＳＰ１並びに４Ｎ１−１の傾向が観察された（それぞれ、＋２８．０％；＋２８．９％；及び２８．９％ ｖｓ ＢＳＡ；ｐ＜０．０５）（図１２）。
【０１１２】
実施例７
実験的血栓症の間における、ＴＳＰ１によるＢＭ−ＭＮＣ動員の調節
発明者は、血管壁の血栓症部位におけるＢＭ−ＭＮＣの動員、及びこの工程におけるＴＳＰ１の寄与を証明しようとした。この目的を達成するために、蛍光標識ＢＭ−ＭＮＣを、後方の眼窩洞経由で野生型マウス又はＴＳＰ１欠損マウスへ注射した。その後、ＦｅＣｌ3を用いて、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜静脈に損傷を誘導し、そして血液凝固が進行したときに、ＢＭ−ＭＮＣ動員を局所的に観測した。腸間膜管をさらした麻酔マウスを、倒立型蛍光顕微鏡のレンズの下に置き、損傷部位の境界に位置合わせし、そしてリアルタイムで、血管壁とのＢＭ−ＭＮＣ相互作用を記録した。
【０１１３】
−ペプチド４Ｎ１−１を用いた前処理は、血栓症に罹患した血管壁へのＢＭ−ＭＮＣ動員を刺激する。
図１７に示されるように、血栓症に罹患した血管表面上へのＢＭ−ＭＮＣの特異的動員を、ＦｅＣｌ3を接種したＣ５７ＢＬ／６型マウスの腸間膜静脈において評価した。実験的血栓症は、血栓症前と同一の血管断片又は無傷の隣接断片のいずれかと比較して、血栓症に罹患した血管表面と相互作用し、そして当該血管表面に沿って回転するＢＭ−ＭＮＣの増加率（毎分おきにおける新規相互作用の数）へ翻訳された。血栓症を罹患した表面へのＢＭ−ＭＮＣ動員は、２〜６分の間の血栓症後誘導においてピークに達し（＋２４１．８％； ｖｓ 無傷；ｐ＜０．０５）、１２分の後に基準レベルへと減少した。
【０１１４】
血栓症を罹患した表面へのＢＭ−ＭＮＣ動員は、血栓症誘導後２〜６分間の間でピークに達し（＋２４１．８％；ｖｓ無傷；ｐ＜０．０５）、１２分後に基準レベルへと減少した。対照ＢＳＡと比較した、損傷後の最初の１０分の間における、ＢＭ−ＭＮＣと血栓症を罹患した血管表面との相互作用のタイプに対するペプチド４Ｎ１−１前処理の効果をさらに特徴付けした。その結果、ペプチド４Ｎ１−１は、血管内血栓部位において１２倍以上、平均ＢＭ−ＭＮＣ回転速度を強く減少させ（１４９．８〜１２．８μｍ／秒；ｐ＜０．０５）（図１８）、そして安定的な付着の数を１４倍以上、急激に増大させた（０．３〜４．３の安定的付着；ｐ＜０．０５））（図１９）。これは、４Ｎ１−１で処理したＢＭ−ＭＮＣの、血栓症に罹患した血管表面と相互作用し、かつ安定的に結合する能力を増大させたことを示した。
【０１１５】
実施例８
ペプチド４Ｎ１−１を用いた細胞治療における、ＢＭ−ＭＮＣの血管新生促進機能の刺激
ＢＭ−ＭＮＣの血管新生促進機能におけるペプチド４Ｎ１−１の効果、及び細胞治療におけるそれらの有効性がその後、試験された。後肢虚血のマウスモデルが使用された。Ｃ５７ＢＬ／６の右大腿動脈を結紮し、そして後方の眼窩洞を通じて、ペプチド４Ｎ１−１又は対照ＢＳＡで前処理されたＢＭ−ＭＮＣの血管内投与で、血管新生を刺激した。無傷の左大腿動脈を対照として使用した。虚血性血管新生後を１４日後に２つの手順で評価した：（ｉ）後肢再灌流評価のための、足部皮膚血流のレーザー・ドップラー・イメージング（ｌａｓｅｒ−ｄｏｐｐｌｅｒ ｉｍａｇｉｎｇ）（図２０）、及び（ｉｉ）血管新生スコアの決定のための機能的血管ネットワークのＸ線ミクロ血管造影（図２１）。ペプチド４Ｎ１−１を用いたＢＭ−ＭＮＣの前処理は、ＢＳＡを用いた場合と比較して、皮膚再灌流におけるそれらの効果を著しく刺激し（＋３０．２０％、ｐ＜０．０５）、そして灌流血管ネットワークのより多くの拡張をもたらした（＋４１．４５％、ｐ＜０．０５）。
【０１１６】
実施例９
ＴＳＰ１の阻害の間におけるＢＭ−ＭＮＣ付着及び再動員の調節
−血小板脱顆粒化産物を用いたプレインキュベーション後におけるフィブリンゲル上へのＢＭ−ＭＮＣ付着におけるＴＳＰ１遺伝的欠損の効果：
ＢＭ−ＭＮＣを、野生型又はＴＳＰ１欠損血小板のいずれかから得られる血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ）を用いて２時間前処理し（希釈係数１：１０、ＥＢＭ中）、そしてそれらのフィブリンゲルへの付着を３０分後に測定した。野生型血小板から得られた血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ−ＷＴ）を用いた前処理は、ＢＳＡの場合と比較して、著しくＢＭ−ＭＮＣ付着を刺激したが（＋３６．９％、ｐ＜０．０５）、ＴＳＰ１−／−の血小板から得られた血小板脱顆粒化産物（ＰＤＰ−ＴＳＰ１−／−）を用いた場合では、刺激しなかった（＋１０．４％、ｐ＝０．２１ ｖｓ ＢＳＡ；及びｐ＜０．０５ ｖｓ ＰＤＰ−ＷＴ）（図２４）。
【０１１７】
−血栓症に罹患した血管壁へのＢＭ−ＭＮＣ動員における、ＴＳＰ１遺伝的欠損の効果
血栓症に罹患した血管壁へのＢＭ−ＭＮＣの動員における、内因性ＴＳＰ１の寄与を決定するために、野生型ＢＭ−ＭＮＣ投与の後における野生型及びＴＳＰ１欠損ＳＷＩＳＳマウスの腸間膜静脈を使用した。
【０１１８】
図２５において示されるように、野生型マウスにおいて、発明者は、損傷部位において、血栓症誘導後１〜３分間の間において最大比率の動員を示す、循環性ＢＭ−ＭＮＣの特異的動員を観察し（最大＋２５０．０％；ｐ＜０．０５）、そして８分後に基準レベルへの減少を観察した。野生型と比較して、ＴＳＰ１欠損マウスにおいて、この現象のほぼ全ての抑止が測定された。ＴＳＰ１不在下におけるＢＭ−ＭＮＣ動員のこの下方制御は、１分間あたりの、損傷部位における細胞動員の最大比率における減少へと翻訳され（−７１．０％ ｖｓ 野生型マウス、ｐ＜０．０５）、そして野生型マウスと比較して、動員期間の開始及び終了において少なくとも３分間の遅れに翻訳された。これは、例えば遺伝的欠失を通じたＴＳＰ１−ＣＤ４７シグナルの排除又は除去が、前駆細胞の局所的付着及び生着を阻害し得ることを示唆している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増大した付着性を有する前駆細胞を調製するインビトロでの方法であって、前駆細胞がＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され、それにより増大した付着性を示す前駆細胞を産生する、前記方法。
【請求項２】
前記調製された前駆細胞が、個体の標的組織中の付着を目的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調製された前駆細胞が、前記標的組織中の成熟細胞へと分化する傾向にあり、そして前記調製された細胞の分化が、前記方法に従って調製されなかった類似の細胞に対して加速される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記前駆細胞が、前記個体に由来する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記作動薬が、配列ＶＶＭを含むポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記作動薬が、配列ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む又はからなるポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記作動薬がＴＳＰ１タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記作動薬が、抗ＣＤ４７作動薬抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記前駆細胞が、１０秒〜２時間、前記作動薬と接触される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
付着細胞の選択のステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記前駆細胞が、脂肪組織、骨髄、肝臓、及び血液から構成される群から選択される組織に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記前駆細胞が、内皮細胞へと分化する傾向にある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記前駆細胞が骨髄単核細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞生着を必要とする個体を処置するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のインビトロでの方法によって調製された細胞。
【請求項１５】
前記個体が、血管系の機能不全を患う、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記個体が、血管の再生又は新生を必要としている、請求項１４又は１５の細胞。
【請求項１７】
前記個体が、アテローム性動脈硬化、糖尿病、肥満、心筋梗塞、コロナロパシー（ｃｏｒｏｎａｒｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性網膜症、腎血管硬化症、脳虚血、血栓症、内皮機能不全、肺高血圧、外傷性皮膚創傷、潰瘍、及び熱傷から構成される群から選択される病変を患う、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
個体が、細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞を用いた処置から利益を受けるか否かを決定するためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記個体から採取された、前駆細胞、好ましくは細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞と同一タイプの前駆細胞が、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され；
（ｉｉ）前記接触された前駆細胞の付着性が評価され；
それにより、前記前駆細胞が増大した付着性を示す場合には、前記患者は細胞治療において有効であることが知られている前記前駆細胞を用いた処置から利益を受ける可能性があると決定されること
を含む、前記方法。
【請求項１９】
個体が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の、インビトロでの方法によって調製された細胞を用いた処置から利益を得るか否かを決定するためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記個体から採取された前駆細胞が、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され；
（ｉｉ）前記接触された前駆細胞の付着性が評価され；
それにより、前記前駆細胞が増大した付着性を示す場合には、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の、前駆細胞を調製するためのインビトロでの方法によって調製された細胞を用いた処置から利益を得る可能性があると決定されること
を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記個体が、請求項１６又は１７に定められた通りである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬が、請求項５〜８のいずれか一項において定められた通りである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
血管系の機能不全を患う個体を処置するためのＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬。
【請求項２３】
前記個体が、請求項１６又は１７に定められた通りである、請求項２２に記載のＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬。
【請求項２４】
前記ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬が、請求項５〜８のいずれか一項において定められた通りである、請求項２２又は２３に記載のＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬。
【請求項２５】
細胞付着又は細胞生着を示唆する病的過程を示す個体における、細胞付着又は細胞生着を防止するための、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の拮抗薬。
【請求項２６】
前記病的過程が、糖尿病性網膜症及びアテローム性動脈硬化である、請求項２５に記載のＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の拮抗薬。
【請求項１】
増大した付着性を有する前駆細胞を調製するインビトロでの方法であって、前駆細胞がＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され、それにより増大した付着性を示す前駆細胞を産生する、前記方法。
【請求項２】
前記調製された前駆細胞が、個体の標的組織中の付着を目的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調製された前駆細胞が、前記標的組織中の成熟細胞へと分化する傾向にあり、そして前記調製された細胞の分化が、前記方法に従って調製されなかった類似の細胞に対して加速される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記前駆細胞が、前記個体に由来する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記作動薬が、配列ＶＶＭを含むポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記作動薬が、配列ＲＦＹＶＶＭＷＫを含む又はからなるポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記作動薬がＴＳＰ１タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記作動薬が、抗ＣＤ４７作動薬抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記前駆細胞が、１０秒〜２時間、前記作動薬と接触される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
付着細胞の選択のステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記前駆細胞が、脂肪組織、骨髄、肝臓、及び血液から構成される群から選択される組織に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記前駆細胞が、内皮細胞へと分化する傾向にある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記前駆細胞が骨髄単核細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞生着を必要とする個体を処置するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のインビトロでの方法によって調製された細胞。
【請求項１５】
前記個体が、血管系の機能不全を患う、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記個体が、血管の再生又は新生を必要としている、請求項１４又は１５の細胞。
【請求項１７】
前記個体が、アテローム性動脈硬化、糖尿病、肥満、心筋梗塞、コロナロパシー（ｃｏｒｏｎａｒｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性網膜症、腎血管硬化症、脳虚血、血栓症、内皮機能不全、肺高血圧、外傷性皮膚創傷、潰瘍、及び熱傷から構成される群から選択される病変を患う、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
個体が、細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞を用いた処置から利益を受けるか否かを決定するためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記個体から採取された、前駆細胞、好ましくは細胞治療において有効であることが知られている前駆細胞と同一タイプの前駆細胞が、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され；
（ｉｉ）前記接触された前駆細胞の付着性が評価され；
それにより、前記前駆細胞が増大した付着性を示す場合には、前記患者は細胞治療において有効であることが知られている前記前駆細胞を用いた処置から利益を受ける可能性があると決定されること
を含む、前記方法。
【請求項１９】
個体が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の、インビトロでの方法によって調製された細胞を用いた処置から利益を得るか否かを決定するためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
（ｉ）前記個体から採取された前駆細胞が、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬と接触され；
（ｉｉ）前記接触された前駆細胞の付着性が評価され；
それにより、前記前駆細胞が増大した付着性を示す場合には、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の、前駆細胞を調製するためのインビトロでの方法によって調製された細胞を用いた処置から利益を得る可能性があると決定されること
を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記個体が、請求項１６又は１７に定められた通りである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬が、請求項５〜８のいずれか一項において定められた通りである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
血管系の機能不全を患う個体を処置するためのＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬。
【請求項２３】
前記個体が、請求項１６又は１７に定められた通りである、請求項２２に記載のＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬。
【請求項２４】
前記ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬が、請求項５〜８のいずれか一項において定められた通りである、請求項２２又は２３に記載のＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の作動薬。
【請求項２５】
細胞付着又は細胞生着を示唆する病的過程を示す個体における、細胞付着又は細胞生着を防止するための、ＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の拮抗薬。
【請求項２６】
前記病的過程が、糖尿病性網膜症及びアテローム性動脈硬化である、請求項２５に記載のＣＤ４７／ＩＡＰ受容体の拮抗薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公表番号】特表２０１０−５３６３３１（Ｐ２０１０−５３６３３１Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０５８８（Ｐ２０１０−５２０５８８）
【出願日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０７１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４５３８
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５００２４８４６７）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム） (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０７１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４５３８
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５００２４８４６７）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム） (19)
【Ｆターム（参考）】
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