癌の診断方法および治療方法
本発明は、リボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）およびチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子発現の腫瘍内発現レベルに基づいて、患者のために適当な癌治療を決定する方法、およびＴＳタンパク質の細胞質レベルに基づいて、臨床的な結果（予後）を予測する方法に関連する。その方法のために有用な組成物およびキットも提供される。本発明は、ＴＳの発現レベルが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、例えば初期（ステージＩ）ＮＳＣＬＣを有する患者の予後を示すという発見に基づく。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
この出願は、２００７年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／９４４，１５７号および２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，５５５号（これらの全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府によって後援された研究または開発
本発明は、国立衛生研究所の国立癌研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金番号ＲＯｌ ＣＡ １０２７２６の下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、癌、例えば非小細胞肺癌を診断および治療する方法に関連する。
【背景技術】
【０００４】
肺癌は、米国において、癌死の最も一般的な原因である。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、肺癌の８０％超を占める、最も一般的なタイプの肺癌である。それは一般的に小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）よりもゆっくりと増殖および拡散する。多くの場合肺の外側領域で見出される腺癌；通常気管支の側の肺の中心で見出される扁平上皮癌；および肺のあらゆる部分において起こり得、そして他の２つのタイプのＮＳＣＬＣより速く増殖および拡散する傾向がある大細胞癌を含む、３つの主な形態のＮＳＣＬＣが存在する。例えば非特許文献１を参照のこと。
【０００５】
最近の研究は、ヌクレオチド代謝およびＤＮＡ修復に関与する遺伝子が、初期の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の表現型の挙動の重要な決定因子であることを示した。具体的には、リボヌクレオチド還元酵素の調節性サブユニットである、リボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）、およびヌクレオチド切除修復に関与する５’ヌクレアーゼの成分であるＥＲＣＣ１が、患者の予後を示す（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。これらの遺伝子の、高レベルのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、患者における長期生存、そして動物モデルにおける転移形成の抑制と関連する（非特許文献６）。それに加えて、トランスジェニック動物における高いＲＲＭ１レベルは、発癌物質誘発肺腫瘍形成に保護的であることが見出された（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｒａｖｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ（１９９５）７５（Ｓｕｐｐｌ．１）：１９１−２０２
【非特許文献２】Ｂｅｐｌｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００４）２２：１８７８−１８８５
【非特許文献３】Ｓｉｍｏｎら、Ｃｈｅｓｔ（２００５）１２７（３）：９７８−８３
【非特許文献４】Ｏｌａｕｓｓｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００６）３５５：９８３−９９１
【非特許文献５】Ｚｈｅｎｇら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００７）３５６：８００−８０８
【非特許文献６】Ｇａｕｔａｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００３）２２：２１３５−２１４２
【非特許文献７】Ｇａｕｔａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００６）６６：６４９７−６５０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）の発現レベルが、ＮＳＣＬＣ、例えば初期（ステージＩ）ＮＳＣＬＣを有する被験体の予後を示すという発見に基づく。それに加えて、ＴＳおよびＲＲＭ１の発現レベルは、外科的に切除可能なＳＮＣＬＣを有する患者における、非白金ダブレット（ｎｏｎ−ｐｌａｔｉｎｕｍ ｄｏｕｂｌｅｔ）、すなわちゲムシタビンおよびペメトレキセドによる術前治療に対する反応と関連する。
【０００８】
従って、１つの局面において、本発明は、ＮＳＣＬＣ、例えば初期（ステージＩ）ＮＳＣＬＣを有する被験体において予後を予測する方法を提供する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、周術期治療、例えば非白金代謝拮抗剤、例えばゲムシタビンおよびペメトレキセドの１つまたは両方による、術前または術後治療のために患者を選択する方法を提供する。その方法は、ＴＳ、またはＴＳおよびＲＲＭ１の腫瘍内発現レベルを決定する工程、およびその発現レベルに基づいて患者を選択する工程を含む。
【００１０】
別の局面において、本発明は、被験体のために適当な化学療法を選択するための方法を提供する。本方法は、被験体から腫瘍サンプルを得る工程；その腫瘍サンプルにおいてリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）およびチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子発現のレベルを決定する工程；およびＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルに基づいて、適当な化学療法を選択する工程を含む。もしＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルが、参照コホートのメジアンのＲＲＭ１発現レベルより低いか、またはそれと同じなら、ゲムシタビンおよびペメトレキセドを含む化学療法が選択される。いくつかの実施態様において、その方法はさらに、被験体に選択した適当な化学療法を施す工程を含む。いくつかの実施態様において、その方法はまた、被験体に第二の化学療法剤、例えば抗チューブリンまたは白金を含む薬剤を投与する工程を含み得る。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、癌、例えばＮＳＣＬＣ、例えば手術可能なＮＳＣＬＣを有する被験体を治療する方法を提供する。本方法は、ＴＳおよびＲＲＭ１の低発現レベルの存在に基づいて被験体を選択する工程、およびその被験体に、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせを、例えば４回の隔週治療として投与する工程を含む。いくつかの実施態様において、本方法はさらに、ＴＳ、またはＴＳおよびＲＲＭ１の腫瘍内発現レベルを決定する工程を含む。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、治療、例えば非白金代謝拮抗剤、例えばゲムシタビンおよびペメトレキセドの１つまたは両方による、術前または術後治療に対する被験体の反応を予測する方法を提供する。さらなる局面において、本発明は、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの投与を含む治療に対する被験体の反応を予測するための方法を提供する。その方法は、被験体から腫瘍サンプルを得る工程；その腫瘍サンプルにおけるリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）およびチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子発現のレベルを決定する工程；およびその腫瘍サンプルにおけるＲＲＭ１およびＴＳ遺伝子発現のレベルに基づいて、治療に対する被験体の反応を予測する工程を含む。低レベルのＲＲＭ１およびＴＳの発現は、その被験体が治療に対して陽性の反応を有する可能性が高いことを示す。
【００１３】
さらに別の局面において、本発明は、非小細胞肺癌と診断された被験体の予後を提供する方法を提供する。本方法は、被験体から腫瘍サンプルを得る工程；その腫瘍サンプルにおいて、細胞質のチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）タンパク質のレベルを決定する工程；およびサンプル中の細胞質ＴＳタンパク質のレベルを、細胞質ＴＳタンパク質の参照レベルと比較する工程を含む。参照レベルと比較して、高レベルのサンプル中の細胞質ＴＳタンパク質は、良好な予後を示し、そして参照レベルと比較して、低レベルの細胞質ＴＳタンパク質は、不良な予後を示す。いくつかの実施態様において、細胞質ＴＳタンパク質のレベルを、定量的インサイチュ分析方法、例えば本明細書中で記載されるようなＡＱＵＡを用いて決定する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、非白金代謝拮抗剤、例えばゲムシタビンおよびペメトレキセドの１つまたは両方による、治療、例えば術前または術後治療の有効性を決定またはモニターする方法を提供する。本方法は、ベースラインレベルを確立するために、治療の前に、ＴＳおよび／またはＲＲＭ１のレベルを決定する工程、ならびに治療を開始した後に、ＴＳおよび／またはＲＲＭ１の１つまたはそれ以上のレベルを決定する工程を含む。測定した遺伝子のレベルの変化は、治療の有効性を示す；例えば、ＴＳおよび／またはＲＲＭ１の発現の増加は、その治療が有効であることを示す。本方法はまた、ＴＳおよび／またはＲＲＭ１のレベルの変化に基づいて、治療の決定をすることも含み得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、患者由来の組織サンプルにおいて、ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬、および説明書を含むキットを提供する。いくつかの実施態様において、ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬は、オリゴｄＴプライマー、ＲＲＭ１またはＴＳ ｃＤＮＡにハイブリダイズする正方向プライマー、ＲＲＭ１またはＴＳ ｃＤＮＡにハイブリダイズする逆方向プライマー、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、およびヌクレオチドから選択されるグループから選択された試薬の事前に測定された部分を含む。いくつかの実施態様において、ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬は、ウェスタンブロットまたは免疫組織化学的アッセイを行うための、抗ＲＲＭ１および抗ＴＳ抗体ならびに緩衝液の事前に測定された部分を含む。いくつかの実施態様において、そのキットはまた、患者由来の組織サンプルを処理するための試薬も含む。
【００１６】
「増殖性疾患」は、細胞分裂における不規則性によって特徴付けられる疾患である。癌（例えばグリオーム、前立腺癌、黒色腫、癌腫、子宮頸癌、乳癌、大腸癌または肉腫）は、増殖性疾患の例である。増殖性疾患に特徴的な細胞（すなわち「新生物細胞」または「腫瘍細胞」）は、自律的な増殖の能力を有する、すなわち細胞集団の不適切な増殖性成長によって特徴付けられる異常な状態または状況である。新生物細胞または腫瘍細胞は、異常に高速で増殖する細胞である。新生物細胞を含む新しい増殖は、「腫瘍」としても知られる新生物である。腫瘍は、通常区別できる塊を形成する、異常な組織の増殖であり、それは正常組織よりも速い細胞増殖によって増殖する。腫瘍は、構造的な組織化および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し得る。本明細書中で使用する場合、腫瘍は造血性腫瘍および固形腫瘍を含むよう意図される。
【００１７】
腫瘍は、良性（良性腫瘍）または悪性（悪性腫瘍または癌）であり得る。悪性腫瘍を、３つの主要な型におおまかに分類し得る。上皮構造から生じる悪性腫瘍は、癌腫と呼ばれる；筋肉、軟骨、脂肪、または骨のような結合組織から生じる悪性腫瘍は、肉腫と呼ばれる；および免疫系の構成要素を含む、造血性の構造（血液細胞の形成に関係する構造）に影響を与える悪性腫瘍は、白血病およびリンパ腫と呼ばれる。他の腫瘍は、神経線維腫症を含むがこれに限らない。
【００１８】
増殖性疾患は、病理組織学的な型または浸潤性の段階にかかわらず、全ての型の癌性増殖または腫瘍発生過程、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織、または臓器を含む。癌は、肺、乳房、甲状腺、リンパ球系、胃腸および泌尿生殖器のような、様々な臓器系の悪性疾患、およびほとんどの大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌、および食道の癌のような悪性疾患を含む腺癌を含む。癌腫は、呼吸器系の癌腫、胃腸系の癌腫、尿生殖器系の癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺の癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫のような、上皮または内分泌組織の悪性疾患を含む。他の癌腫は、子宮頸部、肺、頭部および頸部、大腸および卵巣の組織から形成されるものを含む。中枢神経系の癌は、グリオーム（星状細胞腫、混合神経膠腫（ｍｉｘｅｄ ｏｌｉｇｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、多型神経膠芽腫、上衣腫、および乏突起神経膠腫を含む）、髄膜腫、下垂体腫瘍、血管芽腫、聴神経腫、松果体腫瘍、脊髄腫瘍、造血性腫瘍、および中枢神経系リンパ腫を含む。脂肪、筋肉、血管、深部皮膚組織、神経、骨、および軟骨のような、結合組織に影響を与える癌は、肉腫と呼ばれる。肉腫は、例えば脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、線維肉腫、神経線維肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、類腱腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、および軟骨肉腫を含む。
【００１９】
本明細書中で記載された方法は、肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、乳癌、結腸直腸癌、頭部および頸部癌、または卵巣癌のような、上皮の悪性疾患を有するヒトの治療に特に関連する。上皮の悪性疾患は、上皮組織に影響を与える癌である。
【００２０】
本明細書中で記載される「被験体」は、増殖性疾患を有するあらゆる被験体であり得る。例えば、その被験体はヒト癌患者を含む、ヒトのようなあらゆる哺乳類であり得る。代表的な非ヒト哺乳類は、非ヒト霊長類（サルまたは類人猿のような）、マウス、ラット、ヤギ、ウシ、雄ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イノシシ、ラッコ、ネコ、およびイヌを含む。本明細書中で記載された方法を、胎児（例えば子宮内）、乳児、幼児、青年、成人、または高齢のヒトを含む、あらゆる年齢のあらゆる被験体に対して行い得る。いくつかの実施態様において、その被験体は上皮の悪性疾患；肺癌、例えば非小細胞肺癌；乳癌；結腸直腸癌；頭部および頸部癌；または卵巣癌を有する。
【００２１】
本明細書中で使用される「代謝拮抗剤」は、正常な生化学的反応に必要な物質（代謝物）と類似の構造を有するが、細胞の正常な機能に干渉するのに十分異なっている化学物質である。代謝拮抗剤は、ＤＮＡ合成に干渉する、プリンおよびピリミジンアナログを含む。代表的な代謝拮抗剤は、例えばアミノプテリン、２−クロロデオキシアデノシン、シトシンアラビノシド（ａｒａＣ）、シタラビン、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）（およびその誘導体、それはカペシタビンおよびテガフールを含む）、ゲムシタビン、メトプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、トリメトレキセート、６−メルカプトプリン、および６−チオグアニンを含む。
【００２２】
本明細書中で使用される「抗チューブリン」は、紡錘体を阻害することによって、細胞分裂を阻害する化学療法剤を指す。抗チューブリン剤は、例えばタキサンのパクリタキセルおよびドセタキセル、およびビンカアルカロイドのビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンフルニン、およびビンデシンを含む。
【００２３】
本明細書中で使用される「白金を含む薬剤」は、白金を含む化学療法剤を含む。白金を含む薬剤は、ＤＮＡと架橋およびアルキル化し、それはＤＮＡ合成および転写の阻害を引き起こす。白金を含む薬剤は、あらゆる細胞周期で作用し得、そして従って新生物および健康な分裂中の細胞を殺傷する。白金を含む薬剤は、例えばシスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンを含む。
【００２４】
他に規定されなければ、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、この発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明において使用するために、方法および材料が本明細書中で記載される；当該分野で公知の、他の適当な方法および材料も使用し得る。その材料、方法、および実施例は、説明のためのみであり、制限することを意図しない。本明細書中で述べた全ての出版物、特許申請、特許、配列、データベース記載事項、および他の参考文献は、その全体として参考文献に組み込まれる。対立する場合、定義を含む本明細書が統制する。
【００２５】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および図から、および請求から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ＴＳの発現を示す細胞株のウェスタンブロットである。サイトゾルおよび核抽出物を、細胞株Ｈ２３−ＣｔおよびＨ２３−Ｒ１から調製した。それらをポリアクリルアミドゲルで分離し、膜に移し、そしてＴＳ、Ｏｃｔ−１（核タンパク質）、およびＧＡＰＤＨ（サイトゾルタンパク質）に対する抗体でプローブした。ＴＳを表す３８ｋＤのバンドが、細胞質において見出された。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、ＴＳ発現によって推定された、カプラン・マイヤー全生存曲線である。２Ａ、インサイチュタンパク質発現による、１６０人の患者の生存。うすい灰色の線は、＞５７．０２のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝１２０；メジアン＝８１．３ヶ月、９５％ＣＩ６２．９−９９．６）、および濃い灰色の線は、≦５７．０２の発現を示す（Ｎ＝４０；メジアン＝５１．７ヶ月、９５％ＣＩ２１．５−８１．９）。未調整のｐ値は、０．００１３であった。２Ｂ、第二に良いカットポイントを含む、同じ患者のグループの生存。薄い灰色の線は、≧１２９．３３のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝１８；メジアンは達していない（ｎｏｔ ｒｅａｃｈｅｄ））、中間の灰色は、５７．５８から１２４．２７のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝８２；メジアン８０．８ヶ月）、そして濃い灰色の線は、≦５７．０２の発現を示す（Ｎ＝４０；メジアン＝５１．７ヶ月）。未調整のｐ値は０．００２であった。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、ＴＳ発現によって推定された、カプラン・マイヤー全生存曲線である。２Ａ、インサイチュタンパク質発現による、１６０人の患者の生存期間。うすい灰色の線は、＞５７．０２のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝１２０；メジアン＝８１．３ヶ月、９５％ＣＩ６２．９−９９．６）、および濃い灰色の線は、≦５７．０２の発現を示す（Ｎ＝４０；メジアン＝５１．７ヶ月、９５％ＣＩ２１．５−８１．９）。未調整のｐ値は、０．００１３であった。２Ｂ、第二に良いカットポイントを含む、同じ患者のグループの生存期間。薄い灰色の線は、≧１２９．３３のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝１８；メジアンは達していない（ｎｏｔ ｒｅａｃｈｅｄ））、中間の灰色は、５７．５８から１２４．２７のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝８２；メジアン８０．８ヶ月）、そして濃い灰色の線は、≦５７．０２の発現を示す（Ｎ＝４０；メジアン＝５１．７ヶ月）。未調整のｐ値は０．００２であった。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｘ線で測定した、治療に対する反応を示す棒グラフである。その反応は、測定可能な病変のサイズにおいて、９５％の増加から１００％の減少までの範囲であった。
【図３Ｂ】図３Ｂ−Ｅは、Ｘ線写真での疾患反応およびｍＲＮＡ遺伝子発現を示す棒グラフである。３Ｂ、ＲＲＭ１；３Ｃ、ＲＲＭ２；３Ｄ、ＴＳ；３Ｅ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）。
【図３Ｃ】図３Ｂ−Ｅは、Ｘ線写真での疾患反応およびｍＲＮＡ遺伝子発現を示す棒グラフである。３Ｂ、ＲＲＭ１；３Ｃ、ＲＲＭ２；３Ｄ、ＴＳ；３Ｅ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）。
【図３Ｄ】図３Ｂ−Ｅは、Ｘ線写真での疾患反応およびｍＲＮＡ遺伝子発現を示す棒グラフである。３Ｂ、ＲＲＭ１；３Ｃ、ＲＲＭ２；３Ｄ、ＴＳ；３Ｅ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）。
【図３Ｅ】図３Ｂ−Ｅは、Ｘ線写真での疾患反応およびｍＲＮＡ遺伝子発現を示す棒グラフである。３Ｂ、ＲＲＭ１；３Ｃ、ＲＲＭ２；３Ｄ、ＴＳ；３Ｅ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）。
【図４】図４は、カプラン・マイヤー全体および疾患なしの生存推定値の結果を示すグラフである。黒い曲線（上の線）は、ＯＳを示し、そして灰色の曲線（下の線）は、ＤＦＳを示す。印は、検閲した症例を示す。
【図５】図５は、１０人の患者における、ＲＲＭ１およびＴＳ遺伝子の治療前および治療後のｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ＮＳＣＬＣにおける現在の研究努力の主な目的は、完全な外科的切除を行う患者において、分子パラメーターを臨床的な治療決定に組み込むことによって、周術期の全身性治療の有効性を増加させることである。本明細書中で記載されるように、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子の腫瘍内発現レベルは、臨床的な予後と関連し、そしてＴＳおよびリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）のレベルは、非白金代謝拮抗剤による治療に対する腫瘍反応性と関連する。
【００２８】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）
ＮＳＣＬＣを診断する方法は、当該分野で公知である。診断手順は、個々の患者のために個別化されるべきであり、そして以下のものを含み得る：
−長期にわたる良性病変を除外するため、または悪性病変の進行の速度を決定するために、古い胸部Ｘ線を再調査する
−痰細胞学
−気管支鏡検査、気管支内病変の生検、ブラッシングおよび洗浄、気管支鏡検査後の痰細胞学
−縦隔リンパ節における手術不能の転移を除外するための縦隔鏡検査
−経皮的細針生検
−容易に接近可能な２次的沈着物の切除または針生検
診断の組織学的または細胞学的検証を得るべきである。
【００２９】
当該分野において公知の方法、例えばＭｏｕｎｔａｉｎ、Ｃｈｅｓｔ １１１：１７１０−１７（１９９７）；ＰｉｓｔｅｒｓおよびＧａｉｌ、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（７）：５８３−５８４（２００７）；Ｒａｍｉ−Ｐｏｒｔａら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（７）：５９３−６０２（２００７）；Ｒｕｓｃｈら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（７）：６０３−６１２（２００７）；Ｐｏｓｔｍｕｓら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（８）：６８６−６９３（２００７）；Ｇｒｏｏｍｅら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（８）：６９４−７０５（２００７）；Ｇｏｌｄｓｔｒａｗら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（８）：７０６−７１４（２００７）において記載されたような、国際的に受け入れられたＵＩＣＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ）ＴＮＭ（Ｔｕｍｏｒ／Ｎｏｄｅ／Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）分類システムを用いて、病期分類も行い得る。簡単には、「Ｔ」は腫瘍のサイズおよび付近の組織に浸潤したかどうかを説明し、「Ｎ」は関与するあらゆるリンパ節を説明し、そして「Ｍ」は転移（１つの体の部分から別の部分への癌の広がり）を説明する。ＴＮＭスケールによって、ステージ０はインサイチュにおける癌腫を示し、それはそれが始まった細胞の層だけに存在する初期の癌である。ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、漸次悪化する疾患状態を示す。より高いステージは、より大きな腫瘍サイズおよび／または付近のリンパ節および／または一次腫瘍に隣接する臓器への癌の広がりによって証明されるような、より広範な疾患を示す。ステージＩＶにおいて、腫瘍は少なくとも１つの他の臓器に広がっている。
【００３０】
予後の方法
本明細書中で記載したように、ＴＳタンパク質のレベル、例えば細胞質ＴＳタンパク質を用いて、予後を決定し得る、例えば延長した期間を超えた生存の可能性を決定し得る。これらの方法において、腫瘍細胞を含むサンプルを被験体から取り、そして例えば本明細書中で記載したような、当該分野で公知の方法を用いて、ＴＳタンパク質のレベルを決定する。例えば、ＴＳタンパク質発現レベルを、例えば自動化定量分析（ＡＱＵＡ）によって、タンパク質発現の定量的インサイチュ分析の方法を用いて決定し得る、例えばＣａｍｐら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１３２３−１３２７（２００２）を参照のこと。サンプル中の腫瘍細胞におけるＴＳのレベルの、参照レベルとの比較は、被験体の可能性のある予後を示す。いくつかの実施態様において、本明細書中で記載したように、参照コホートにおけるＴＳタンパク質発現によって決定されたカットポイントパーセンタイルに対して比較を行う。いくつかの実施態様において、その参照カットポイントは、約８９パーセンタイルの発現レベルである；そのカットポイントより上、例えば上位１１％の発現レベルの被験体は、改善した生存の機会を有し、そしてそのカットポイントより下の被験体は、より不良な予後を有する。いくつかの実施態様において、下位２５％のグループ、中位６４％グループ、および上位１１％グループにおいて、２つの参照カットポイントを使用する；下位２５％に入る被験体は、不利な結果（死亡）の最も高いリスクを有し、中位６４％の被験体は、中程度のリスクレベルを有し、そして上位１１％の被験体はより低いリスクを有する。例えば実施例１および図２Ａ−Ｂを参照のこと。いくつかの実施態様において、どれだけ積極的に被験体を治療するかに関する決定を、これらの方法によって提供される予後の情報に基づいて行う、例えば不利な結果のより高いリスクを有する被験体をより積極的に、またはさらなる治療様式、例えば照射または本明細書中で記載したような他の化学療法剤の投与によって治療する。
【００３１】
癌治療を決定する方法
適当な癌治療を決定または選択する方法は、患者から腫瘍サンプルを得る工程または提供する工程、および患者におけるＲＲＭ１またはＴＳの発現レベルを決定する工程を含む。もしＲＲＭ１およびＴＳの腫瘍内レベルが低ければ、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組合せを含む化学療法が適当であることを決定し得る。もしＲＲＭ１および／またはＴＳの腫瘍内レベルが高ければ、ゲムシタビンおよびペメトレキセドを欠く化学療法が適当であることを決定し得る。
【００３２】
「低い」および「高い」発現レベルは相対的な値であり、そして参照コホートのものとの比較に基づく。本明細書中で使用される「参照コホート」は、サンプル癌集団であり、そこからＲＲＭ１および／またはＴＳ発現データが収集される。参照コホートにおける発現レベルを、サンプル集団における腫瘍内遺伝子発現レベルを測定することによって決定する（例えばＲｏｓｅｌｌら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０：１３１８−２５、２００４；Ｌｏｒｄら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８：２２８６−２２９１、２００２；Ｂｅｐｌｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２：１８７８−８５、２００４；およびＳｉｍｏｎら、Ｃｈｅｓｔ １２７：９７８−８３、２００５を参照のこと）。典型的には、もし発現レベルが参照コホートにおけるメジアンのＲＲＭ１発現レベルと同じまたはそれより低ければ、腫瘍は「低い」ＲＲＭ１レベルを示し、そしてもし発現レベルが参照コホートにおけるメジアンのＲＲＭ１発現レベルより高ければ、腫瘍は「高い」ＲＲＭ１レベルを示す。同様に、もし発現レベルが参照コホートにおけるＴＳ発現レベルのメジアンと同じまたはそれより低ければ、腫瘍は「低い」ＴＳレベルを示す。「低い」および「高い」発現レベルは相対的であり、そして新しい参照グループそれぞれに関して確立し得る。１つの選択肢において、化学療法に対する被験体の反応を予測するために決定される発現レベルは、参照コホートの下位３分の１、または下位４分の１の発現レベルと同じかまたはそれより低くあり得る、または予測発現レベルを、参照コホートの上位３分の１、または上位４分の１の発現レベルと同じまたはそれより高いレベルと決定し得る。
【００３３】
腫瘍サンプル
生検（例えば針生検）のような、あらゆる方法を、腫瘍サンプルを得るために使用し得、そして処理のために組織をＯＣＴ（登録商標）（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｔｔｉｎｇ化合物）に包埋し得る。例えば、ＯＣＴ（登録商標）中の組織を、凍結切片として処理し得る。例えばレーザーキャプチャー法（ＬＣＭ）によって、腫瘍細胞を採取し得、そして遺伝子発現を、例えばポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）またはＲＮＡレベルを測定するためのノーザンブロット分析によって、またはタンパク質レベルを測定するためのウェスタンブロットによって、アッセイし得る。１つの典型的なアプローチにおいて、ＲＲＭ１またはＴＳ発現レベルを、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイする。これらの遺伝子の発現レベルを、例えば固定した、例えばホルマリン固定した標本において、免疫組織化学によっても決定し得る。
【００３４】
参照コホート
参照コホートからのサンプルを、同じ種の被験体（例えばヒト被験体）から取り、そして参照コホートの腫瘍は、好ましくは同じ型（例えばＮＳＣＬＣの腫瘍）である。例えば、参照コホートの腫瘍は、全て例えば癌腫、造血系腫瘍、脳腫瘍、または肉腫であり得る。いくつかの実施態様において、参照コホートの腫瘍は、全て例えば肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部および頸部癌、または卵巣癌由来であり得る。参照コホートの個々のメンバーは、疾患のステージ、以前の治療レジメ、ライフスタイル（たとえば喫煙者または非喫煙者、過体重または低体重）、または他の人口統計（例えば年齢、遺伝的素因）における類似性のような、他の類似性も共有し得る。例えば、同じ型の腫瘍を有することに加えて、参照コホートの患者は、以前に全身性の化学療法を受けたことがないかもしれない。参照コホートは、少なくとも１０人の被験体由来の、例えば１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または２００またはより多くの被験体由来の、腫瘍サンプルからの遺伝子発現分析データを含むべきである。
【００３５】
遺伝子発現およびタンパク質レベルの決定
参照コホートにおける遺伝子発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学のような、あらゆる方法によって決定し得る。試験被験体由来の腫瘍サンプルにおける発現レベルを、参照コホートにおける発現レベルと同じ方式で決定する。
【００３６】
ヒトで実施する場合、本方法において有用な配列は、以下のものを含むがこれに限らない：
−ＲＲＭ１配列：ＧｅｎｅＩＤ：６２４０−ヒトＲＲＭ１−ＮＭ＿００１０３３．３およびＮＰ＿ ００１０２４．１；遺伝子＝ＮＣ＿００００１１．８ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｒａｎｇｅ４０７２５００−４１１６６８２；ＮＴ＿００９２３７．１７、Ｒａｎｇｅ２９０３１６５−２９４７３４７
−ＴＳ配列：ＧｅｎｅＩＤ：７２９８−ヒトＴＳ ＮＭ＿００１０７１．２およびＮＰ＿００１０６２．１；遺伝子＝ＮＣ＿００００１８．８ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ−Ｒａｎｇｅ６４７６５１−６６３４９２；ＮＴ＿０１０８５９．１４、Ｒａｎｇｅ６４７６５１−６６３４９２ 。
【００３７】
例えばウェスタンブロッティングを用いて、タンパク質レベルを決定することが望ましい場合には、以下の抗体を使用し得る；他のものも有用であり得る。
【００３８】
−とりわけＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、およびＡｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販で入手可能な、抗ＲＲＭ１
−とりわけＡｂｃａｍ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＰｒｏＳｃｉ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から市販で入手可能な、抗ＴＳ 。
【００３９】
治療レジメの選択
腫瘍をＲＲＭ１またはＴＳまたは両方の発現レベルに関してサンプリングし得、そして適当な化学療法を、観察された発現レベルに基づいて決定し得る。その化学療法は、単一の薬剤または複数の化学療法剤（例えば２つ、３つ、またはそれ以上の化学療法剤）を含み得る。
【００４０】
１つの例において、ＲＲＭ１およびＴＳ両方の腫瘍内発現レベルを決定し、そして両方の遺伝子の発現レベルに基づいて、適当な化学療法剤を決定する。例えば、もしＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルがどちらも低いと決定されたら、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせを含む適当な化学療法を選択し得る。もしＲＲＭ１レベルが低いと決定され、そしてＴＳレベルが高いと決定されたら、適当な化学療法は、ゲムシタビンを含み、そしてペメトレキセドを除くことを決定し得、そして抗チューブリンまたはアルキル化剤のような最適な第二の薬剤を含み得る。そのような化学療法組成物は、白金を含む薬剤を含み得る。もしＲＲＭ１レベルが高いと決定され、そしてＴＳレベルが低いと決定されたら、適当な化学療法は、ゲムシタビンを含むべきではないがペメトレキセド、および抗チューブリンまたはアルキル化剤のような、最適な第二の薬剤を含み得る。もしＲＲＭ１およびＴＳレベルが両方とも高いと決定されたら、適当な化学療法は、抗チューブリンを含むことを決定し得る。その化学療法は、代謝拮抗剤を含むべきではない。
【００４１】
さらなる治療
一般的に、ＮＳＣＬＣと診断された被験体を、外科的切除；照射；およびアジュバントおよび／または新補助療法化学療法によって治療する、例えばＫｒｉｓら、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １０（Ｓｕｐｐｌ．２）：２３−２９（２００５）を参照のこと。ＮＳＣＬＣを治療するための現在の標準治療は、外科的切除、可能な場合は、ステージＩＩおよびＩＩＩにおいては続いて術後補助化学療法である；ＡｌｌｅｎおよびＪａｈａｎｚｅｂ、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃｏｍｐｒ．Ｃａｎｃ．Ｎｅｔｗ．６（３）：２８５−２９３（２００８）を参照のこと。同時または連続的な放射線療法の追加を含む３重様式（ｔｒｉｍｏｄａｌ）アプローチも使用する。従って、本明細書中で記載された方法は、あらゆる追加の治療様式、例えば外科的切除および／または照射の使用を含み得る。
【００４２】
他の化学療法剤、例えば抗チューブリンまたは白金を含む薬剤も、代謝拮抗剤の組み合わせと共に投与し得る。他の化学療法剤は、例えばＬ−アスパラギナーゼ、ビカルタミド、ブレオマイシン、カンプトテシン（ＣＰＴ−１１）、カルミノマイシン、シクロホスファミド、シトシンアラビノシド、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エクチナサイジン７４３、エストラムスチン、エトポシド、リン酸エトポシド、エポチロン、フルタミド、ＦＫ５０６、ヘキサメチルメラミン、エダトレキセート（ｉｄａｔｒｅｘａｔｅ）、レフルノミド、ロイプロリド、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸モフェチル、プリカマイシン、ポドフィロトキシン、ポルフィロマイシン、ｒａｎｐｉｍａｓｅ、ラパマイシン、トポテカン、テニポシド、およびチオテパを含む。
【００４３】
投薬および投与
本明細書中で記載されたように、ＲＲＭ１および／またはＴＳ発現レベルに基づいて、被験体のために選択された化学療法、例えばペメトレキセド／ゲムシタビン併用療法を、従来の投与レジメを用いて被験体に投与し得る。
【００４４】
化学療法を、丸剤の形態におけるような経口、静脈内、体腔（膀胱のような）への注射による、筋肉内、またはくも膜下腔内を含む、標準的な方法によって投与し得る。化学療法レジメを、持続的なレジメとして、例えば静脈内、経口、または体腔内に送達し得る。化学療法レジメを、薬剤が投与される日または日々に続いて休止および回復期を含むサイクルで送達し得る。回復期は、１、２、３、または４週間またはそれ以上続き得、そして次いでそのサイクルを反復し得る。化学療法の過程は、少なくとも２から１２サイクル（例えば３、４、５、６、７、１０、または１２サイクル）を含み得る。
【００４５】
上記で記載されたようにデザインされた化学療法の投与後に、増殖性疾患の予後に関連する結論を調整するために、本明細書中で注目された方法から得られた遺伝子発現データを、人口統計データ；生命状態；教育；飲酒、喫煙、および薬物乱用の履歴；治療歴；および記録された治療を含む、患者の医療記録からの情報を組み合わせ得る。
【００４６】
腫瘍内ＲＲＭ１またはＴＳ発現レベルによる化学療法の投与時に、その治療に対する反応に関して患者をモニターし得る。例えば、疾患の進行をモニターするために、化学療法の投与前および投与後に、腫瘍の測定を行い得る。もし腫瘍サイズが減少すれば、疾患は寛解にある、または寛解に向かって退縮していると決定し得る。腫瘍サイズの部分的な減少は、疾患が部分的な寛解にあることを示し得、そしてもし腫瘍が完全に消失したら、疾患は完全な寛解にあると言い得る。もし腫瘍サイズが増加するなら、疾患は進行していると決定し得る。もし腫瘍サイズが化学療法の投与後に変化しないなら、疾患は安定と分類し得る。
【００４７】
患者を、体重減少、胸水、および癌に関連する他の症状のような要因に注意して、その身体的な状態によっても評価し得る。例えば、小細胞および非小細胞肺癌を含む肺癌の症状は、持続する咳、血液の混じった痰、胸痛、および再発する肺炎または気管支炎を含む。その評価を、当該分野で公知の方法によって、併用療法の投与量および投与レジメを仕立てるために使用し得る。
【００４８】
有効性を予測する方法およびスクリーニング方法
本発明はまた、化学療法剤を含む組成物の有効性を評価または予測する方法を特徴とする。その方法は、少なくとも２つの細胞株、および１つまたはそれ以上の化学療法剤を含む組成物を採用する。その細胞株は、そのＲＲＭ１および／またはＴＳの発現レベルにおいて異なる。例えば、１つの細胞株は、標準コントロール細胞株より低いレベルのＲＲＭ１を発現する、または１つの細胞株は、標準コントロール細胞株より高いレベルのＲＲＭ１を発現する。より高い発現細胞株は、好ましくは１つのより低い発現細胞株より、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、または３００％より多いＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する。
【００４９】
増加または減少したＲＲＭ１および／またはＴＳの発現を引き起こすあらゆる方法を利用し得る。例えば、低レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する細胞株を、低レベルの発現を引き起こすｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを発現するよう操作し得る。あるいは、ＲＲＭ１および／またはＴＳの発現を、テトラサイクリン−、ＩＰＴＧ−、またはエクジソン応答プロモーターのような、調節可能なプロモーターのコントロール下に置き得る。ＲＲＭ１および／またはＴＳの発現は、親株における発現より低くあり得る、または発現は誘導の前には完全に欠如し得る。高レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する細胞は、ＲＲＭ１および／またはＴＳを、内因性ＲＲＭ１および／またはＴＳプロモーターより高いレベルで発現する、構成的プロモーターのコントロール下にＲＲＭ１および／またはＴＳ遺伝子を含み得る、または誘導が発現を親株におけるよりも高いレベルまで促進するように、ＲＲＭ１および／またはＴＳを、テトラサイクリン−またはＩＰＴＧ−応答プロモーターのような、誘導性プロモーターから発現し得る。高レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳ発現を促進する、または低レベルの発現を誘導する外来性の配列を、親株のゲノムに安定に組み込み得る、または親株に一時的にトランスフェクトし得る。
【００５０】
高および低レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する細胞を、候補化学療法剤または化学療法剤の組み合わせ（例えば２、３、または４つの化学療法剤）と接触させ、そしてコントロール株と比較して、化学療法剤に対する感受性または耐性の増加に関して細胞をモニターする。１つの細胞株に、コントロール細胞に対して増加した感受性を生じる薬剤、または薬剤の組み合わせを、対応するレベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する腫瘍を有する患者のための候補治療薬として同定し得る。
【００５１】
別の実施例において、もし低レベルの（すなわちコントロール親株より低いレベルの）ＴＳを発現する細胞が、コントロール株の細胞よりも、化学療法剤に対して感受性であるなら、その薬剤は、低レベルのＴＳを発現する腫瘍を有する患者の治療のための候補治療薬である。もし高レベルの（すなわちコントロール親株より高いレベルの）ＴＳを発現する細胞が、コントロール株の細胞よりも、化学療法剤に対して感受性であるなら、その薬剤は、高レベルのＴＳを発現する腫瘍を有する患者の治療のための候補治療薬である。
【００５２】
本明細書中で記載された方法を、高または低レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する腫瘍の治療のための候補である薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用し得る。上記で記載したもののような細胞株を、薬剤のパネル（例えば小分子薬剤、核酸、またはポリペプチド）と接触させて、低または高レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する細胞の感受性の増加を引き起こす薬剤を同定し得る。
【００５３】
上記のスクリーニング方法において同定された薬剤、または候補化学療法として上記の方法によって同定された薬剤または薬剤の組み合わせを、ヒトで試験する前に動物モデルで試験し得る。例えば、その治療を、ヒトにおいて試験する前に、マウスまたは霊長類モデルにおいて、腫瘍サイズを抑制する能力に関して試験し得る。
【００５４】
キット
本明細書中で記載された方法を実施するための試薬、道具、および／または説明書を、キットにおいて提供し得る。例えば、そのキットは、癌患者のために適当な治療を決定するための試薬、道具、および説明書を含み得る。そのようなキットは、例えば生検によって患者から組織サンプルを採取するための試薬、およびその組織を処理するための試薬を含み得る。そのキットはまた、ヒトの腫瘍サンプルにおいてＲＲＭ１および／またはＴＳ発現レベルを決定するための、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学を行うための試薬のような、遺伝子発現分析を行うための、１つまたはそれ以上の試薬を含み得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを行うためのプライマー、ノーザンブロット分析を行うためのプローブ、および／またはウェスタンブロットおよび免疫組織化学的分析を行うための抗体を、そのようなキットに含み得る。アッセイのための適当な緩衝液も含み得る。これらのアッセイのいずれかに必要な検出試薬も含み得る。
【００５５】
本明細書中で特徴となるキットはまた、遺伝子発現を測定するためのアッセイをどのように行うかを記載した説明書も含み得る。その説明書は、参照コホートにおけるＲＲＭ１および／またはＴＳ発現レベルをどのように決定するか、および試験患者との比較のための参照を確立するために発現データをどのように構築するかを含む、参照コホートをどのように決定するかに関する説明も含む。その説明書は、試験患者において遺伝子発現をアッセイするための、およびその発現レベルを参照コホートの発現と比較して、続いて試験患者に適当な化学療法を決定するための説明も含み得る。適当な化学療法を決定するための方法は、上記で記載され、そして説明書において詳細に記載し得る。
【００５６】
別の実施例において、本発明で特徴となるキットは、ＲＲＭ１またはＴＳ発現レベルに基づいて、候補化学療法剤の有効性を予測するための試薬、道具、および説明書を含み得る。そのようなキットは、細胞においてＲＲＭ１またはＴＳ発現レベルを調節するためのベクター、およびアポトーシスを検出するための試薬のような、細胞表現型をモニターするための試薬を含み得る。組織サンプルにおいてＲＲＭ１およびＴＳの発現レベルを決定するための試薬も、上記で記載したように含み得る。
【００５７】
キットに含まれる情報資料は、本明細書中で記載された方法および／または本明細書中で記載された方法のための試薬の使用に関連する、説明の、指示の、売買の、または他の資料であり得る。例えば、そのキットの情報資料は、キットの使用者が、特に彼らが特定の化学療法に対する陽性の反応を有するヒトの可能性に適用する場合、遺伝子発現分析の実施および結果の解釈についての実質的な情報を得ることができる連絡情報、例えば物理的な住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号を含み得る。
【００５８】
キットは、試薬および情報資料のための別々の容器、仕切り、または区画を含み得る。容器は、ＲＲＭ１およびＴＳ遺伝子発現レベルの決定、および続くヒトのための適当な化学療法の決定に使用するために、ラベルを貼付し得る。
【００５９】
キットの情報資料は、その形態において制限されない。多くの場合、その情報資料、例えば説明書は、印刷されたもの、例えば印刷された文字、図、および／または写真、例えばラベルまたは印刷された紙で提供される。しかし、その情報資料を、点字、コンピューターで読み取り可能な資料、ビデオ記録、またはオーディオ記録のような、他の形態でも提供し得る。もちろん、その情報資料を、あらゆる形態の組み合わせでも提供し得る。
【実施例】
【００６０】
本発明を以下の実施例においてさらに説明し、それは請求において記載される本発明の範囲を制限しない。
【００６１】
実施例１−インサイチュでのチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）タンパク質発現
チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）は、デオキシウリジン１リン酸（ｄＵＭＰ）の、（デオキシ）チミジン１リン酸（ＴＭＰ）への変換を触媒し、それはテトラヒドロ葉酸のジヒドロ葉酸への酸化を必要とする。ＴＭＰは続いてＴＴＰへリン酸化され、それはＤＮＡ合成および修復に必要である。５−フルオロウラシル（５ＦＵ）は、ＴＭＰ合成を阻害し、そして有効な化学療法剤である（Ｗａｓｈｔｉｅｎ、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９８４；２５：１７１−７７；Ｍｏｅｒｔｅｌら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９０；３２２：３５２−５８；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １９５７；１７９（４５６１）：６６３−６）。ＴＳの高い腫瘍レベルは、特に結腸直腸癌（ＣＲＣ）および胃癌を有する患者において、５ＦＵに基づく化学療法に対する耐性と関連する（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９５；５５（７）：１４０７−１２；Ｌｅｉｃｈｍａｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９７；１５（１０）：３２２３−９；Ｓｈｉｒｏｔａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００１；１９（２３）：４２９８−３０４）。
【００６２】
ＴＳはリボヌクレオチド還元酵素の下流であり、そしてＤＮＡ合成および修復に必要なデオキシヌクレオチドの１つの形成に重要であるので、タンパク質およびｍＲＮＡレベルにおけるＴＳ発現が、さらなる化学療法も照射もうけなかった、完全に切除したステージＩのＮＳＣＬＣを有する患者における予後を予測するかどうか、およびインサイチュでのＴＳ発現が、ＲＲＭ１およびＥＲＣＣ１発現と関連するかどうかを決定するために、本研究を行った。
【００６３】
これらの研究において使用した２つの集団は、１９９１年から２００１年にＭｏｆｆｉｔｔ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒにおいてＮＳＣＬＣの完全切除を受けた患者から成っており、そして他で記載された（Ｚｈｅｎｇ ら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００７；３５６：８００−０８）。簡単には、患者は病理学的ステージＩＡまたはＩＢの疾患を有する；腺癌、扁平上皮癌、または大細胞癌を有する；周術期の化学療法または照射なし；以前の肺癌なし；そして胸部への以前の照射なしでなければならなかった。組織マイクロアレイの構築に十分な腫瘍組織を有する１８７人の患者が同定され、それはタンパク質レベルにおける遺伝子発現の評価のための集団を構成した（表１）。新しい凍結腫瘍組織を有する９２人の患者が、ｍＲＮＡレベルにおける遺伝子発現の評価のための集団を構成した（表２）。タンパク質およびｍＲＮＡレベルにおいて遺伝子発現値を有する３２人の患者が２つの集団の間で重複していた。２年間は３ヶ月に１回、３年間は６ヶ月に１回、および次いで１年に１回の訪問時のフォローアップが推奨された。全体的な生存に関して、診断から死亡までの時間を記録し、そして人口動態統計記録を用いて検証した。
【００６４】
研究のために使用したモノクローナルＴＳ抗体は、ＬａｂＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販で入手可能であった（オーダー＃ＭＳ−４７１−Ｐ、ロット＃４７１Ｐ５０４Ｂ）。それは、抗原として組換えヒトＴＳを用いて、マウスにおいて産生された。その抗体は、肺癌細胞株Ｈ２３の溶解物のウェスタンブロットにおいて、ＴＳの予測分子量である約３８ｋＤの主なバンドを検出し、これは細胞質に局在した（図１）。ウェスタンブロッティングを、以下のように行った。細胞株ＮＣＩ−Ｈ２３の永続的に遺伝的修飾した培養物由来の細胞質および核抽出物を、核／サイトゾル分画キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて調製した。タンパク質抽出物（５０μｇ）を、１０％Ｎｏｖｅｘ トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって分離し、そして純粋なニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にブロットした。そのブロットを、ＴＳ抗体（マウスクローンＴＳ−１０６、１：２００、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．）、Ｏｃｔ−１抗血清（＃３３４２−１００、１：１０００、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）およびＧＡＰＤＨ抗血清（＃ｓｃ−２０３５７、１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）と、４℃で一晩インキュベートした。タンパク質のバンドを、抗ウサギ、抗マウス、または抗ヤギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ２次抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で可視化した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを、等量添加のコントロールとして使用した。
【００６５】
共焦点顕微鏡を用いて、以下のようにＴＳタンパク質の細胞内局在を決定した。肺腺癌細胞株（Ｈ２３、Ｈ１２５、Ｈ２９２、Ｈ３２２、Ａ５４９）および大腸癌細胞株（Ｈ４９８、Ｈ５０８、Ｈ７４７、ＳＮＵ−Ｃ２Ａ、ＳＮＵ−Ｃ４）を、Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバースライドに直接増殖させた。接着細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド中で２０分間インキュベートすることによって固定し、そしてＰＢＳで洗浄した。それらを、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳ中で１時間透過処理し、そしてＰＢＳで洗浄した。ＴＳ（１：１００）抗体を結合緩衝液（１％のＢＳＡ／０．１％のＮＰ４０／ＰＢＳ）で希釈し、チャンバーに加え、そして１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後、スライドをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）の１：５００希釈物と４５分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄し、そしてＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止剤（ａｎｔｉｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてカバーした。ネガティブコントロールとして、同じ手順を、一次抗体無しで行った。サンプルを、６３×／１．２０ＮＡ水浸（ｗａｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を用いた倒立Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡によって観察した。核をＤＡＰＩによって可視化した。二重光電子増倍管検出器およびＬＳＭ５バージョン３．２．０．１１５ソフトウェアセット（ｓｕｉｔｅ）によって画像を作成した。
【００６６】
その結果は、５つの肺癌細胞株における、ＴＳの顕著な細胞質局在が確認されたことを示した（図２Ａ）；しかし、核ＴＳ発現が全てにおいて観察され、そしてそれはＨ２３において最も低く、そしてＡ５４９において最も高かった。対照的に、大腸癌由来の５つの細胞株において、ＴＳ発現は主に核であった。
【００６７】
組織マイクロアレイを作成するために、腫瘍標本を、将来を見越して採取し、中性緩衝化ホルマリン（１０％ｖ／ｖ）中で固定し、そしてパラフィンワックスに完全に包埋した。組織全体の切片をＨ＆Ｅ染色し、そして代表的な腫瘍領域を指定した。直径０．６ｍｍの組織コアを打ち抜いて、そして組織アレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いて、レシピエントブロックに並べた。厚さ５μｍの切片を切断し、４×接着被覆スライド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ、ＮＪ）に移し、そして紫外光に３０秒間あてて接着を増強した。
【００６８】
インサイチュでのＴＳタンパク質発現を、周術期の化学療法または照射を受けなかった、完全に切除されたＮＳＣＬＣを有する全部で１８７人の患者を含む、２つの複製組織マイクロアレイにおいて、腫瘍細胞質におけるＡＱＵＡによって決定した。
【００６９】
自動化定量分析（ＡＱＵＡ）と組み合わせた、免疫蛍光に基づく免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて、標的分子のインサイチュ発現を評価した。ｐＨ６．０の０．０１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム中で１５分間の電子レンジ処理によって、１３個の抗原を回復させた（ｒｅｔｒｉｅｖｅ）。スライドを、０．３％のＢＳＡで３０分間ブロックし、そして次いで一次抗体（マウスクローンＴＳ−１０６、１：３０、＃ＭＳ−４７１−Ｐ、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）と室温で一晩インキュベートした。癌性細胞の同定のために、サイトケラチンに対する抗血清を用いた（ウサギ抗ヒト汎サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３、１：２００、＃Ｚ０６２２、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。スライドを洗浄し、そして２つの異なる二次抗体と１時間インキュベートした（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）標識ポリマー−ＨＲＰ抗マウス、＃Ｋ４００７、およびＡｌｅｘａ５５５ヤギ抗ウサギ、＃Ａ２１４２９、１：２００、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。蛍光増幅のために、スライドをＣｙ５−Ｔｙｒａｍｉｄｅ（１：５０）に室温で１０分間曝露した。それらをＤＡＰＩ（４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）マウント溶液を含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止剤と共にマウントした。最終的な組織マイクロアレイスライドを、ＳｐｏｔＧｒａｂｂｅｒでスキャンし、そして画像データをＡＱＵＡ（ＰＭ−２０００、ＨｉｓｔｏＲｘ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で分析した。最も低い可能性のあるＡＱＵＡスコアは０であり、そして最も高いものは２５５である。
【００７０】
その結果を、図２Ｂに示す。ＴＳ発現データを、１６０／１８７（８６％）人の患者について得た。スポットが切片上に無かった、または処理の間に洗い流されたために、２７個の標本に関して、二連の発現データが得られなかった。平均値は５．８から２３８．６（０−２５５のスケールで）の範囲であり、メジアンは９８．４、および平均は９８．３（標準偏差５３．０）であった。そのデータはほとんど正規分布であり、そして正規化のためのデータ変換は行わなかった。複製アレイ間でＴＳ発現における有意な関連が存在した（ｒ＝０．５９９、ｐ≦０．００１）。
【００７１】
ＴＳタンパク質発現および腫瘍ステージ、組織学、パフォーマンスステータス、体重減少の有無、喫煙状態、または性別の間に、統計学的に有意な関連は存在しなかった（表１）。この患者コホートにおける一次元の腫瘍直径は、０．５から１０．８ｃｍの範囲であり、そしてＴＳ発現と有意に関連していなかった（ｒ＝０．０５１、ｐ＝０．５２）。以前に報告されたＲＲＭ１およびＥＲＣＣ１タンパク質レベルと有意な関連は存在しなかった（それぞれｒ＝０．１３および−０．０７、ｐ＞０．１）（Ｚｈｅｎｇら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００７；３５６：８００−０８）。
【００７２】
【表１】
＊ＮＲ、達しなかった。
【００７３】
最適なカットポイント決定のために最大ログランク法（ｍａｘｉｍａｌ ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、ＴＳ発現の２５パーセンタイル（４０／１６０人の患者）である、＞５７．０２のレベルを有するものから、≦５７．０２のレベルを有する患者を分離した場合、最も有意な全生存の差が見られた（図２Ａ）。低ＴＳグループにおけるメジアン生存は５１．７ヶ月であり、そして高ＴＳグループでは８１．３ヶ月であった（ｐ＝０．００１３）。この生存の差は、複数の調査（ｌｏｏｋ）のためにｐ値を調整した後も有意なままであった（ｐ＝０．０３４）。
【００７４】
ＴＳタンパク質発現および腫瘍ステージを含む、最終的な多変量モデルにおいて（表２）、ＴＳは全体の生存期間と有意に関連したままであった（ｐ＝０．００１３、調整ｐ＝０．０３２）。死亡のハザード比は、高対低ＴＳタンパク質発現に関して０．４５であった。
【００７５】
【表２】
＊ＣＩ、信頼区間
＊＊パフォーマンスステータスは最終的な多変量分析から除かれたので、１６０人の患者に基づく
＊＊＊最適なカットポイントの選択の原因となる調整ｐ値。
【００７６】
計画された生存分析に加えて、ＴＳ発現および生存の関連の予備的な試験を行った。ＴＳ発現をＣＯＸ回帰分析に連続変数として含み、そして未調整（ｐ＝０．００６）および腫瘍ステージに関して調整（ｐ＝０．００２）した、両方の低いｐ値を得た。１２９．３３（８９パーセンタイル）のＡＱＵＡスコアの、ＴＳタンパク質発現の第二のカットポイントも見出した。このカットポイントを生存分析に含むことで、患者の３つの生存グループへの分類を得た（図２Ｂ）。最も高いＴＳグループのメジアン生存は＞１２０ヶ月であり、中程度のＴＳグループでそれは８０．９ヶ月であり、そして最も低いＴＳグループで５１．７ヶ月であった（ｐ＝０．００２）。
【００７７】
カットポイントとして９８．４のサンプルメジアンを用いたＴＳ発現データの二分化（ｄｉｃｈｏｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）は、高ＴＳ発現を有する患者の８１．３ヶ月、および低ＴＳ発現を有する患者の６２．２ヶ月のメジアンＯＳを明らかにした（ｐ＝０．０７１）。
【００７８】
この実施例における統計学的分析を、以下のように行った。２つの複製読み取り値からのＡＱＵＡスコアの平均値を計算し、そして独立した連続変数として処理した。ＴＳ ｍＲＮＡ発現の平均を、三連の読み取り値から計算し、そして独立した連続変数として処理した。主な目的は、インサイチュでのＴＳタンパク質発現および全生存の間の関連を評価することであった。このためにＴＳ発現を先験的に高および低カテゴリーに分類しなかった。その代わりに、最適なカットポイントの決定のために最大ログランク法を用い、そして複数の調査に関してｐ値を調整した（ＭｉｌｌｅｒおよびＳｉｅｇｍｕｎｄ、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ １９８２；３８：１０１１−１６；ＨｉｌｓｅｎｂｅｃｋおよびＣｌａｒｋ、Ｓｔａｔ Ｍｅｄ １９９６；１５（１）：１０３−１２）。順序付けたＴＳタンパク質発現の中央８０％内のカットポイントを考えた。次いで生存および低および高ＴＳ発現の間の関連を、ＴＳタンパク質発現によって決定したカットポイントパーセンタイルを用いて、カプラン・マイヤー生存曲線で要約（ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ）した。潜在的な共変数である腫瘍ステージ、パフォーマンスステータス、性別、ＲＲＭ１タンパク質発現、およびＥＲＣＣ１タンパク質発現に関して調整しながら、生存期間に対するＴＳタンパク質発現の影響を評価するために、０．１５の有意性の留まる水準（ｌｅｖｅｌ−ｔｏ−ｓｔａｙ）による後方除去（ｂａｃｋｗａｒｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を用いた多変量コックス回帰分析を行った。ＲＲＭ１およびＥＲＣＣ１タンパク質発現を、連続変数として含めた。ＴＳタンパク質発現の二分化は、最適な選択によって得られたので、そのコックス回帰ｐ値を調整した。ＴＳ ｍＲＮＡ発現および全生存の関連を調査するためにも、最適なカットポイント決定のための最大ログランク法を使用した。
【００７９】
連続変数間の関連を、スピアマンの相関係数を用いて分析した。連続変数および離散変数の間の関連を、離散グループの数に依存して、ウィルコクソン順位和検定またはクラスカル・ウォリス検定を用いて分析した。人口統計学的および臨床的グループの間の生存の差を評価するために、ログランク検定を用いた。
【００８０】
複数の検定を説明する厳密な統計学的アプローチを用いて、その結果は、増加した細胞質ＴＳ発現は、生存の延長と関連していたことを示す。２つの予備的な分析が、この発見を支持した。最初に、もし本発明者らがコックス回帰分析によって増加するＴＳレベルに伴う死亡リスクの減少を先験的に探すことを選択したならば、統計学的に有意な結果（ｐ＝０．００６）が得られたであろう。第二に、死亡のリスクは、２つの別々のＴＳ発現レベル、５７．０２および１２９．３３において劇的に変化する。この生存モデルは、患者を下位２５％グループ、中位６４％グループ、および上位１１％グループに分けた。
【００８１】
実施例２−ＴＳ ｍＲＮＡ発現
ＴＳ ｍＲＮＡ発現を、以下のように、完全に切除したステージＩのＮＳＣＬＣを有する９２人の患者由来の新しい凍結腫瘍標本において決定した。新しく凍結した腫瘍標本を、実施例１で記載したのと同じ選択基準を満たす９２人の患者について、将来を見越して採取した（表３）。
【００８２】
【表３】
＊ＮＲ、達しなかった。
【００８３】
ＲＮＡを、腫瘍を構成する＞６０％の細胞を有する腫瘍標本から単離し、そして逆転写酵素によって、オリゴ−ＤＴおよびランダムプライマーを用いて、ｃＤＮＡを産生した（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）。約５ｎｇのサンプルｃＤＮＡを、リアルタイム技術によるＴＳ発現分析のために三連で用いた（ＡＢＩ ７９００ＨＴ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。サンプル中のＴＳ ｍＲＮＡの相対的な量を、閾値サイクルを標準曲線と比較することによって決定し、そして次いでＴＳ量（ＡＢＩ、ＨＳ００４２６５９１−ｍ１、アンプリコンサイズ８７ｂｐ）を、１８ＳｒＲＮＡ量（ＡＢＩ、＃４３１９４１３Ｅ）で割ることによって、規準化された量を決定した。
【００８４】
データを８５人の患者（９２％）から得て、そして発現は０．２から１０４．３の範囲であり、メジアンは３．５および平均は６．７であった（標準偏差１２．９）。ｍＲＮＡレベルは、腫瘍ステージ、パフォーマンスステータス、体重減少の有無、喫煙状態、または性別と有意に関連していなかった（表３）。しかしそれらは、組織学的サブタイプの間で有意に異なっていた；扁平上皮および大細胞癌と比較して、腺癌においてそのレベルはより低かった（表３）。この患者コホートにおける一次元の腫瘍直径は、１．４から１０．８ｃｍの範囲であり、そしてそれらはＴＳ発現と関連していなかった（ｒ＝０．１３５、ｐ＝０．２１８）。
【００８５】
最大ログランク法を、最適なカットポイント決定のために使用し、そして複数の調査に関して調整した後、ＴＳ ｍＲＮＡ発現の統計学的に有意なカットポイントは見出されなかった（調整ｐ＝１．０）。
【００８６】
３２人の患者が両方のデータベースで共通であり、そして従ってタンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方でＴＳ発現値を有していた。そのレベルの間にゼロに近い関連が存在した（ｒ＝０．０２８、ｐ＝０．８７７）。
【００８７】
統計学的な分析を、実施例１で記載したように行った。
【００８８】
定量的分析のために特別に開発された方法を用いてＴＳタンパク質およびｍＲＮＡ発現の間の関連を見出せなかったこれらの結果は、遺伝子の大部分に関して、肺癌においてタンパク質およびｍＲＮＡレベルの間の関連の欠如を示す、より最近の報告と一致する（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００２；１（４）：３０４−１３）。
【００８９】
実施例３−切除可能な非小細胞肺癌における、新補助療法、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの臨床的有効性および予測可能な分子マーカー
切除可能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の管理に、白金を含む化学療法を含むことは、Ｎ１またはＮ２リンパ節に転移性疾患を有する患者の標準的な治療になった（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｉａｌ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：３５１−３６０；Ｗｉｎｔｏｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００５；３５２：２５８９−２５９７；Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ ら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ ２００６；７：７１９−７２７）。新補助療法治療は、約３３−６４％の反応率を生じ（Ｄｅｐｉｅｒｒｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００２；２０：２４７−２５３；Ｓｃａｇｌｉｏｔｔｉ、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００５；２３：６２６ｓ；Ｇｉｌｌｉｇａｎら、Ｌａｎｃｅｔ ２００７；３６９：１９２９−１９３７；Ｐｉｓｔｅｒｓら、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００７；２５：３８９ｓ）、そしてアジュバント治療は約５−１５％絶対的な全生存を増加させる（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｉａｌ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：３５１−３６０；Ｗｉｎｔｏｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００５；３５２：２５８９−２５９７；Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ ら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ ２００６；７：７１９−７２７）。しかし、全ての患者を、白金を含むレジメで治療するアプローチは、有効性に関してプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）に達し得た。それに加えて、約１−２％の治療に関連する死亡率を含む、このアプローチに関連する有意な毒性が存在する（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｉａｌ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：３５１−３６０；Ｐｉｓｔｅｒｓら、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００７；２５：３８９ｓ）。分子的な腫瘍の特徴を治療の決定に組み込むことは、有効性を改善し、そして毒性を抑制し得る。
【００９０】
この実施例は、選択したレジメの臨床的有効性および耐容性を記載し、そして治療的有効性に対するこれら薬剤の代謝に関わる遺伝子のｍＲＮＡ発現の予測有用性を調査することを目的とした、切除可能なＮＳＣＬＣを有する患者における、新補助療法、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの単一施設試験を記載する。
【００９１】
導入補助化学療法および毒性：全部で５２人の適格患者、２６人の男性および２６人の女性、年齢４１歳および８３歳の間（メジアン６７歳）に、少なくとも１回の化学療法を投与した。彼らは２００４年４月および２００６年４月の間に登録され、そしてその特徴を表４に記載する。
【００９２】
臨床的病期分類を、理学的検査、胸部および上腹部のコンピューター断層撮影（ＣＴ）、全身ＦＤＧポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、脳の核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、気管支鏡検査、および縦隔鏡検査によって決定した。ＮＳＣＬＣの組織学的確認；ステージＩＢ−ＩＩＩＡおよび選択されたＩＩＩＢ（１つの葉に２つの病変）；年齢＞１８歳；０−１のパフォーマンスステータス（ＰＳ）；ＲＥＣＩＳＴによる測定可能な疾患；および肺癌のための以前の治療は適格性のために必要ではなかった。これらの基準を、５２人の患者が満たした。
【００９３】
ゲムシタビン１，５００ｍｇ／ｍ２に続いてペメトレキセド５００ｍｇ／ｍ２による術前化学療法を、１、１５、２９および４３日目に施した。続く化学療法の投与を、適当なら毒性のために遅延または抑制した。患者は、化学療法の１週間前から始めて、毎日３５０−１，０００μｇの投与量で葉酸を経口に、および９週間ごとに１，０００μｇの投与量でビタミンＢ１２を皮下に受容した。全ての毒性を、共通の毒性基準（ＣＴＣ、バージョン３．０）によって格付けした。
【００９４】
化学療法後、５０および６３日目の間に、ＣＴおよびＰＥＴスキャンを繰り返した。Ｘ線写真での反応を、治療後および治療前ＣＴスキャンを比較して、全ての最大の腫瘍直径の合計における変化のパーセンテージ（１−［後病変合計／前病変合計］×１００）を計算することによって、および最良の全体反応としてＲＥＣＩＳＴによっても、連続変数として表した。
【００９５】
切除可能な疾患を有する患者は、６４および７７日目の間に開胸術を受けた。推奨される手術は、縦隔リンパ節切開を伴う肺葉切除術または肺切除術であった。区域切除または楔状切除は推奨しなかった。切除不能な疾患を有する患者、および不完全な切除を有する患者は、その医師の考えで治療した。全ての患者を、２年間３ヶ月間隔でＣＴによって追跡した。
【００９６】
４２人の患者が、全ての計画された化学療法を時間通りに、そして投与量を抑制せずに投与された。３人の患者が、投与量を抑制せずに投与を遅らせた。その理由は、グレード３の下肢蜂巣炎、グレード２の血小板減少症、およびグレード３の肝酵素上昇であった。７人の患者が、意図された４回の隔週治療より少ない治療を受けた。３人の患者は、腎不全を伴うグレード３の好中球減少性の発熱、グレード３の熱性薬剤反応、および１人の患者は治療に関連した副作用を経験せずに即時の手術を依頼したために、最初のサイクルのみを投与された。３人の患者は、サイクル１および２のみを投与された。その理由は、１人の患者におけるグレード３の下肢静脈炎、および２人の患者におけるグレード３の疲労であった。１人の患者が、サイクル３の後に、おそらくウイルスが原因の間質性肺炎で死亡した；しかし、治療に関連した原因を除外できなかった。
【００９７】
【表４】
表４に対する説明文
１３人の患者において評価されなかった；２９人の患者において評価されなかった；３完全な腫瘍切除を受けた４０人の患者において；４診断の前３ヶ月の間に５％と同じまたはそれより多い；５生涯非喫煙者は、全部で１００本より少ないタバコを吸ったことのある人として定義した；６ＮＡ、該当なし；７２１人の患者は、細気管支肺胞性の特徴を有する５人を含んで腺癌を有し、１２人は、２人の腺扁平上皮癌、２人の混合腺−および扁平上皮癌、および１人の神経内分泌の特徴を示唆させる大細胞癌を含んで、他のＮＳＣＬＣサブタイプを有していた；８単一の肺葉にある２つの別々の腫瘍小結節のために、２つのＴ４Ｎ０、Ｔ４；９病理学的疾患反応カテゴリーｐＰＲおよびｐＮＲは、ＯＳ（ｐＰＲ対ｐＮＲのハザード比＝１．１、ｐ＝０．９０）またはＤＦＳ（ｐＰＲ対ｐＮＲのハザード比＝０．８７、ｐ＝０．７８）と有意に関連していなかった。
【００９８】
化学療法に対するＸ線写真での反応：Ｘ線写真での反応の評価は、４９人の患者において可能であった。最も良い全体の反応は、１人（２％；９５％ＣＩ：０．１−１０．９％）の患者における完全な寛解（ＣＲ）であった；１６人（３３％；９５％ＣＩ：２０．０−４７．５％）において部分的な寛解（ＰＲ）、２９人（５９％；９５％ＣＩ：４４．２−７３．０％）において安定な疾患（ＳＤ）、および３人（６％；９５％ＣＩ：１．３−１６．９％）の患者において進行性疾患（ＰＤ）であった。その反応は、測定可能な病変のサイズにおいて９５％の増加から１００％の減少までの範囲であった（図３Ａ）。Ｘ線写真での疾患反応および臨床パラメーターである年齢（ｐ＝０．６２）、性別（ｐ＝０．９６）、パフォーマンスステータス（ｐ＝０．９４）、体重減少（ｐ＝０．８８）、喫煙状態（ｐ＝０．８５）、腫瘍組織学（ｐ＝０．９５）、およびステージ（ｐ＝０．３１）の間に、統計学的に有意な関連はなかった（表４）。
【００９９】
化学療法に対する病理学的反応：Ｈ＆Ｅによって染色した外科的切除標本の光学顕微鏡による評価における、壊死および／または線維性物質の割合を決定することによって、病理学的反応の評価を行った。これは４３人の患者で可能であり、そして０−９０％の範囲であった。病理学的ＣＲ（≧９５％壊死／線維症）の患者はおらず、１３人（３０％）は病理学的ＰＲ（５０−９４％壊死／線維症）を有し、そして３０人（７０％）は病理学的反応を有さなかった（ｐＮＲ）。病理学的疾患反応および臨床パラメーターである年齢（ｐ＝０．３９）、性別（ｐ＝０．６５）、パフォーマンスステータス（ｐ＝０．１８）、体重減少（ｐ＝０．６９）、喫煙状態（ｐ＝０．９６）、腫瘍組織学（ｐ＝０．４３）、およびステージ（ｐ＝０．６６）の間に、統計学的に有意な関連はなかった。Ｘ線写真での反応および病理学的反応の間に関連はあった（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒｈｏ＝０．２３）；すなわちよりよい臨床反応は、より高い壊死および線維症の割合と関連していたが、それは統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．１４）。
【０１００】
外科的治療：開胸術を４６人の患者において行い、そして４０人の患者において完全な切除を行った。３２人の患者は肺葉切除術を行い、２人は二肺葉切除術を行い、８人は肺切除術を行い、２人は楔状切除を行い、そして２人は腫瘍の切除を行わなかった。外科的切除において、最初の病期分類と比較して、１７人の患者はステージが下がり（ｄｏｗｎ−ｓｔａｇｅｄ）、１７人は変化無く、そして１２人はステージが上った（ｕｐ−ｓｔａｇｅｄ）。１人の患者が、気管支瘻のＴ２Ｎ１扁平上皮癌のための完全な右上葉および中葉切除の２．７ヶ月後に死亡した。
【０１０１】
生存：２００８年２月の時点で、２０件のイベントが起こり、そして３２人の患者が生存していた（５人が再発、そして５人が不完全な切除を受けた）。メジアンＯＳは＞２８．０ヶ月であり、完全な外科的切除を受けた患者のメジアンＤＦＳは＞２１．１ヶ月であった（図４）。１２ヶ月および２４ヶ月ＯＳ率は、８４．６％（９５％ＣＩ：７１．６−９２．０％）、および７１．０％（９５％ＣＩ：５６．５−８１．４％）であり、そして対応するＤＦＳ率は、それぞれ６７．５％（９５％ＣＩ：５０．７−７９．７％）および５３．０％（９５％ＣＩ：３６．０−６７．４％）であった。化学療法に対するＸ線写真での反応または病理学的反応は、ＯＳまたはＤＦＳと有意に関連していなかった（表４）。
【０１０２】
疾患の反応を予測可能な薬理ゲノミクス変数：リアルタイムＲＴＰＣＲによる遺伝子発現分析に十分な量および質の、治療前腫瘍標本が１０人の患者で、そして治療後標本が３５人の患者で入手可能であった。ゲムシタビンおよびペメトレキセド治療が、ＲＲＭ１およびＴＳのｍＲＮＡレベルを変化させたかどうかを評価した。
【０１０３】
腫瘍サンプルを、治療前および後に、凍結標本として採取した。採取のために標準的な操作手順は、生検または切除から凍結までの時間を記録することを含んでおり、そして経過時間は全ての症例で３０分以下であった。凍結標本を、ＯＣＴに包埋し、そして５−７μｍの切片に切断した。
【０１０４】
腫瘍細胞を、Ａｒｃｔｕｒｕｓシステムを用いたレーザーキャプチャー法（ＬＣＭ）によって採取した。全ＲＮＡを、市販の方法（Ａｒｃｔｕｒｕｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて抽出し、そしてオリゴｄＴおよびランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを産生した。リアルタイム定量的ＰＣＲ分析を、サンプルあたり三連行った（７９００ＨＴ、ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。ＲＲＭ１のプローブおよびプライマーは、以前に記載したものであった（Ｂｅｐｌｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００４；２２：１８７８−１８８５）。全ての他の標的遺伝子の発現分析のために、市販で入手可能なプライマーおよびプローブを用いた（表５）。サンプル中のＲＲＭ１およびＴＳ ｍＲＮＡの相対的な量を、記載されたように、標準曲線と閾値サイクルを比較することによって決定した（Ｂｅｐｌｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００４；２２：１８７８−１８８５）。残りの遺伝子に関して、流体カード（ｆｌｕｉｄｉｃ ｃａｒｄ）アッセイにおいて、試験サンプルを単一の較正物質（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）サンプルと比較することによって、相対的な定量を行った。ｃＤＮＡテンプレートを含まないネガティブコントロールを、全ての実験に含めた。
【０１０５】
両方の遺伝子に関して、治療前および後のレベルの間に有意な関連が存在し（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒｈｏ＝０．７８６、ｐ＝０．０２５）、化学療法後の遺伝子発現レベルは、治療前のレベルを表すことを示唆した。しかし、遺伝子発現レベルは、治療によって増加するようである（図５）。全ての続く分析を、３５個の治療後標本に対して行った。１４遺伝子全ての発現の範囲および他のマーカーの特徴を、表５にまとめる。ＲＲＭ１のｍＲＮＡレベルは、疾患反応と有意に関連していた（ｒｈｏ＝０．６４９、ｐ＝＜０．００１）；すなわち、低レベルは腫瘍サイズの抑制を予測し、そして高レベルは腫瘍の増殖を予測した（図３Ｂ）。１．６８のメジアンと同じまたはそれより低いＲＲＭ１発現を有する１８人の患者のうち、１０人はＰＲまたはＣＲを有し、一方高ＲＲＭ１発現を有する１７人のうち２人のみが反応した。ＴＳのｍＲＮＡレベルは、同様に疾患反応と関連していた（ｒｈｏ＝０．４５４、ｐ＝０．００６）（図３Ｄ）；しかし、データ分析の多重度に関してボンフェローニ補正を用いた後、ｐ値は０．００３６のレベルより上であった。３．４０のメジアンと同じまたはそれより低いＴＳ発現を有する１８人の患者のうち、７人がＰＲまたはＣＲを有し、一方高ＴＳ発現を有する１７人のうち５人のみが反応した。
【０１０６】
驚くべきことに、全ての他の遺伝子の発現レベルは、それらも投与された治療の標的と考えられるが、疾患反応と有意に関連していなかった（図３ＣおよびＥ）；表５に列挙した上の７つの遺伝子は、ゲムシタビン代謝経路にあり、一方表５の下の７つはペメトレキセド代謝に関与し、そしてＲＲＭ１およびＴＳのみが有意な関連を示した（表５の一番右側の列を参照のこと）。
【０１０７】
【表５】
結果
非白金ダブレット、すなわちゲムシタビンおよびペメトレキセドの術前有効性を、外科的に切除可能なＮＳＣＬＣを有する患者において調査した。この組み合わせの理論的根拠は、両方の薬剤が比較的周知の作用メカニズムを有する代謝拮抗剤であり、両方とも耐容性が高く、そして両方とも有効であり、そして患者の治療に既に組み込まれていることであった。白金に基づく化学療法を利用した、以前の無作為化第ＩＩＩ相新補助療法試験は、３３％，５、４１％，７、４９％，６、および６４％，４の反応率を報告した。約７５％の患者が予定された全ての化学療法を受け、そして化学療法に関連する死亡率は約２％であった。これらの反応率は、３５％の反応率よりも高く見えるが、この研究の１８／５２人の患者は、ステージＩＩＩの疾患を有しており、一方参照試験のうち２つはステージＩＩＩの患者を含まず、５、７、そして他の２つの試験におけるステージＩＩＩ患者の割合は、それぞれ７％６および４７％４であった。ステージＩＩＩの疾患を有する患者における白金に基づく治療による、２つの以前の無作為化新補助療法試験において、報告された反応率は５３％（１６／３０）１６および３５％（９／２６）であった（Ｒｏｔｈら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １９９４；８６：６７３−６８０）。予測される反応率を、先験的に５０％に設定した；その目的は達成されなかった。従って、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせは、もし切除可能なＮＳＣＬＣを有する患者の選択されないグループに投与された場合、白金含有ダブレット（ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅｔ）を超えそうにない。
【０１０８】
試験において８７％（４５／５２）の患者が、予定された４サイクルの治療を受けた。５人の患者が、治療に関連するグレード３の毒性のために、４サイクルより少なく受け、そしてこのうち４人は、完全切除の手術を受けた。１人の患者が、推定ウイルス性間質性肺炎によって、手術の前に死亡した。従って、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせは耐容性が高く、そして４回の隔週の治療として、白金含有ダブレットを投与し得る患者の割合と少なくとも同じ割合の患者に送達可能である。
【０１０９】
これらの薬理ゲノミクス試験は、ゲムシタビンおよびペメトレキセドに対する腫瘍反応の程度は、遺伝子ＲＲＭ１およびＴＳの腫瘍発現と関連することを示す。その腫瘍がこれらの遺伝子を低レベルで発現する患者は、高レベルの遺伝子発現を有するものと比較して、腫瘍サイズの抑制を経験する可能性が高い。この関連は、遺伝子ＲＲＭ１に関して有意であったが、ＴＳに関しては０．００３６の有意レベルに達しなかった。全部で１４個の遺伝子が、これらの患者において評価されたので、有意性レベルをボンフェローニによって調整した。これは、データ分析の多重性に関して調整するための保守的なアプローチであり、そしてほとんどの相関性調査を、より厳密でない条件下で行う。従って、ＴＳ発現および治療に対する反応の間の関連に関してみられた（−）０．４５４の相関係数は注目すべきであり、そしてさらなる調査を必要とする。
【０１１０】
まとめると、記載された臨床的相関性調査は、以前から公知のＲＲＭ１発現およびゲムシタビン有効性の間の関係を、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせまで延長する。それらはまた、ＴＳ発現およびこの組み合わせの有効性の間の関連の妥当な証拠を提供する。切除可能なＮＳＣＬＣを有する選択されない患者のグループにおいて、ゲムシタビンおよびペメトレキセドは、耐容性が高く、３５％の客観的なＸ線写真による反応率を提供する。
【０１１１】
さらなる参考文献
【０１１２】
【化１】
他の実施態様
本発明はその詳細な説明に関連して記載されたが、前述の説明は説明することを意図し、そして添付の請求の範囲によって規定される本発明の範囲を制限しないことが理解される。他の局面、利点、および修飾が、以下の請求の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
この出願は、２００７年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／９４４，１５７号および２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，５５５号（これらの全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府によって後援された研究または開発
本発明は、国立衛生研究所の国立癌研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金番号ＲＯｌ ＣＡ １０２７２６の下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、癌、例えば非小細胞肺癌を診断および治療する方法に関連する。
【背景技術】
【０００４】
肺癌は、米国において、癌死の最も一般的な原因である。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、肺癌の８０％超を占める、最も一般的なタイプの肺癌である。それは一般的に小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）よりもゆっくりと増殖および拡散する。多くの場合肺の外側領域で見出される腺癌；通常気管支の側の肺の中心で見出される扁平上皮癌；および肺のあらゆる部分において起こり得、そして他の２つのタイプのＮＳＣＬＣより速く増殖および拡散する傾向がある大細胞癌を含む、３つの主な形態のＮＳＣＬＣが存在する。例えば非特許文献１を参照のこと。
【０００５】
最近の研究は、ヌクレオチド代謝およびＤＮＡ修復に関与する遺伝子が、初期の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の表現型の挙動の重要な決定因子であることを示した。具体的には、リボヌクレオチド還元酵素の調節性サブユニットである、リボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）、およびヌクレオチド切除修復に関与する５’ヌクレアーゼの成分であるＥＲＣＣ１が、患者の予後を示す（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。これらの遺伝子の、高レベルのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、患者における長期生存、そして動物モデルにおける転移形成の抑制と関連する（非特許文献６）。それに加えて、トランスジェニック動物における高いＲＲＭ１レベルは、発癌物質誘発肺腫瘍形成に保護的であることが見出された（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｒａｖｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ（１９９５）７５（Ｓｕｐｐｌ．１）：１９１−２０２
【非特許文献２】Ｂｅｐｌｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００４）２２：１８７８−１８８５
【非特許文献３】Ｓｉｍｏｎら、Ｃｈｅｓｔ（２００５）１２７（３）：９７８−８３
【非特許文献４】Ｏｌａｕｓｓｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００６）３５５：９８３−９９１
【非特許文献５】Ｚｈｅｎｇら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００７）３５６：８００−８０８
【非特許文献６】Ｇａｕｔａｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００３）２２：２１３５−２１４２
【非特許文献７】Ｇａｕｔａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００６）６６：６４９７−６５０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）の発現レベルが、ＮＳＣＬＣ、例えば初期（ステージＩ）ＮＳＣＬＣを有する被験体の予後を示すという発見に基づく。それに加えて、ＴＳおよびＲＲＭ１の発現レベルは、外科的に切除可能なＳＮＣＬＣを有する患者における、非白金ダブレット（ｎｏｎ−ｐｌａｔｉｎｕｍ ｄｏｕｂｌｅｔ）、すなわちゲムシタビンおよびペメトレキセドによる術前治療に対する反応と関連する。
【０００８】
従って、１つの局面において、本発明は、ＮＳＣＬＣ、例えば初期（ステージＩ）ＮＳＣＬＣを有する被験体において予後を予測する方法を提供する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、周術期治療、例えば非白金代謝拮抗剤、例えばゲムシタビンおよびペメトレキセドの１つまたは両方による、術前または術後治療のために患者を選択する方法を提供する。その方法は、ＴＳ、またはＴＳおよびＲＲＭ１の腫瘍内発現レベルを決定する工程、およびその発現レベルに基づいて患者を選択する工程を含む。
【００１０】
別の局面において、本発明は、被験体のために適当な化学療法を選択するための方法を提供する。本方法は、被験体から腫瘍サンプルを得る工程；その腫瘍サンプルにおいてリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）およびチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子発現のレベルを決定する工程；およびＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルに基づいて、適当な化学療法を選択する工程を含む。もしＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルが、参照コホートのメジアンのＲＲＭ１発現レベルより低いか、またはそれと同じなら、ゲムシタビンおよびペメトレキセドを含む化学療法が選択される。いくつかの実施態様において、その方法はさらに、被験体に選択した適当な化学療法を施す工程を含む。いくつかの実施態様において、その方法はまた、被験体に第二の化学療法剤、例えば抗チューブリンまたは白金を含む薬剤を投与する工程を含み得る。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、癌、例えばＮＳＣＬＣ、例えば手術可能なＮＳＣＬＣを有する被験体を治療する方法を提供する。本方法は、ＴＳおよびＲＲＭ１の低発現レベルの存在に基づいて被験体を選択する工程、およびその被験体に、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせを、例えば４回の隔週治療として投与する工程を含む。いくつかの実施態様において、本方法はさらに、ＴＳ、またはＴＳおよびＲＲＭ１の腫瘍内発現レベルを決定する工程を含む。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、治療、例えば非白金代謝拮抗剤、例えばゲムシタビンおよびペメトレキセドの１つまたは両方による、術前または術後治療に対する被験体の反応を予測する方法を提供する。さらなる局面において、本発明は、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの投与を含む治療に対する被験体の反応を予測するための方法を提供する。その方法は、被験体から腫瘍サンプルを得る工程；その腫瘍サンプルにおけるリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）およびチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子発現のレベルを決定する工程；およびその腫瘍サンプルにおけるＲＲＭ１およびＴＳ遺伝子発現のレベルに基づいて、治療に対する被験体の反応を予測する工程を含む。低レベルのＲＲＭ１およびＴＳの発現は、その被験体が治療に対して陽性の反応を有する可能性が高いことを示す。
【００１３】
さらに別の局面において、本発明は、非小細胞肺癌と診断された被験体の予後を提供する方法を提供する。本方法は、被験体から腫瘍サンプルを得る工程；その腫瘍サンプルにおいて、細胞質のチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）タンパク質のレベルを決定する工程；およびサンプル中の細胞質ＴＳタンパク質のレベルを、細胞質ＴＳタンパク質の参照レベルと比較する工程を含む。参照レベルと比較して、高レベルのサンプル中の細胞質ＴＳタンパク質は、良好な予後を示し、そして参照レベルと比較して、低レベルの細胞質ＴＳタンパク質は、不良な予後を示す。いくつかの実施態様において、細胞質ＴＳタンパク質のレベルを、定量的インサイチュ分析方法、例えば本明細書中で記載されるようなＡＱＵＡを用いて決定する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、非白金代謝拮抗剤、例えばゲムシタビンおよびペメトレキセドの１つまたは両方による、治療、例えば術前または術後治療の有効性を決定またはモニターする方法を提供する。本方法は、ベースラインレベルを確立するために、治療の前に、ＴＳおよび／またはＲＲＭ１のレベルを決定する工程、ならびに治療を開始した後に、ＴＳおよび／またはＲＲＭ１の１つまたはそれ以上のレベルを決定する工程を含む。測定した遺伝子のレベルの変化は、治療の有効性を示す；例えば、ＴＳおよび／またはＲＲＭ１の発現の増加は、その治療が有効であることを示す。本方法はまた、ＴＳおよび／またはＲＲＭ１のレベルの変化に基づいて、治療の決定をすることも含み得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、患者由来の組織サンプルにおいて、ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬、および説明書を含むキットを提供する。いくつかの実施態様において、ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬は、オリゴｄＴプライマー、ＲＲＭ１またはＴＳ ｃＤＮＡにハイブリダイズする正方向プライマー、ＲＲＭ１またはＴＳ ｃＤＮＡにハイブリダイズする逆方向プライマー、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、およびヌクレオチドから選択されるグループから選択された試薬の事前に測定された部分を含む。いくつかの実施態様において、ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬は、ウェスタンブロットまたは免疫組織化学的アッセイを行うための、抗ＲＲＭ１および抗ＴＳ抗体ならびに緩衝液の事前に測定された部分を含む。いくつかの実施態様において、そのキットはまた、患者由来の組織サンプルを処理するための試薬も含む。
【００１６】
「増殖性疾患」は、細胞分裂における不規則性によって特徴付けられる疾患である。癌（例えばグリオーム、前立腺癌、黒色腫、癌腫、子宮頸癌、乳癌、大腸癌または肉腫）は、増殖性疾患の例である。増殖性疾患に特徴的な細胞（すなわち「新生物細胞」または「腫瘍細胞」）は、自律的な増殖の能力を有する、すなわち細胞集団の不適切な増殖性成長によって特徴付けられる異常な状態または状況である。新生物細胞または腫瘍細胞は、異常に高速で増殖する細胞である。新生物細胞を含む新しい増殖は、「腫瘍」としても知られる新生物である。腫瘍は、通常区別できる塊を形成する、異常な組織の増殖であり、それは正常組織よりも速い細胞増殖によって増殖する。腫瘍は、構造的な組織化および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し得る。本明細書中で使用する場合、腫瘍は造血性腫瘍および固形腫瘍を含むよう意図される。
【００１７】
腫瘍は、良性（良性腫瘍）または悪性（悪性腫瘍または癌）であり得る。悪性腫瘍を、３つの主要な型におおまかに分類し得る。上皮構造から生じる悪性腫瘍は、癌腫と呼ばれる；筋肉、軟骨、脂肪、または骨のような結合組織から生じる悪性腫瘍は、肉腫と呼ばれる；および免疫系の構成要素を含む、造血性の構造（血液細胞の形成に関係する構造）に影響を与える悪性腫瘍は、白血病およびリンパ腫と呼ばれる。他の腫瘍は、神経線維腫症を含むがこれに限らない。
【００１８】
増殖性疾患は、病理組織学的な型または浸潤性の段階にかかわらず、全ての型の癌性増殖または腫瘍発生過程、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織、または臓器を含む。癌は、肺、乳房、甲状腺、リンパ球系、胃腸および泌尿生殖器のような、様々な臓器系の悪性疾患、およびほとんどの大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌、および食道の癌のような悪性疾患を含む腺癌を含む。癌腫は、呼吸器系の癌腫、胃腸系の癌腫、尿生殖器系の癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺の癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫のような、上皮または内分泌組織の悪性疾患を含む。他の癌腫は、子宮頸部、肺、頭部および頸部、大腸および卵巣の組織から形成されるものを含む。中枢神経系の癌は、グリオーム（星状細胞腫、混合神経膠腫（ｍｉｘｅｄ ｏｌｉｇｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、多型神経膠芽腫、上衣腫、および乏突起神経膠腫を含む）、髄膜腫、下垂体腫瘍、血管芽腫、聴神経腫、松果体腫瘍、脊髄腫瘍、造血性腫瘍、および中枢神経系リンパ腫を含む。脂肪、筋肉、血管、深部皮膚組織、神経、骨、および軟骨のような、結合組織に影響を与える癌は、肉腫と呼ばれる。肉腫は、例えば脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、線維肉腫、神経線維肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、類腱腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、および軟骨肉腫を含む。
【００１９】
本明細書中で記載された方法は、肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、乳癌、結腸直腸癌、頭部および頸部癌、または卵巣癌のような、上皮の悪性疾患を有するヒトの治療に特に関連する。上皮の悪性疾患は、上皮組織に影響を与える癌である。
【００２０】
本明細書中で記載される「被験体」は、増殖性疾患を有するあらゆる被験体であり得る。例えば、その被験体はヒト癌患者を含む、ヒトのようなあらゆる哺乳類であり得る。代表的な非ヒト哺乳類は、非ヒト霊長類（サルまたは類人猿のような）、マウス、ラット、ヤギ、ウシ、雄ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イノシシ、ラッコ、ネコ、およびイヌを含む。本明細書中で記載された方法を、胎児（例えば子宮内）、乳児、幼児、青年、成人、または高齢のヒトを含む、あらゆる年齢のあらゆる被験体に対して行い得る。いくつかの実施態様において、その被験体は上皮の悪性疾患；肺癌、例えば非小細胞肺癌；乳癌；結腸直腸癌；頭部および頸部癌；または卵巣癌を有する。
【００２１】
本明細書中で使用される「代謝拮抗剤」は、正常な生化学的反応に必要な物質（代謝物）と類似の構造を有するが、細胞の正常な機能に干渉するのに十分異なっている化学物質である。代謝拮抗剤は、ＤＮＡ合成に干渉する、プリンおよびピリミジンアナログを含む。代表的な代謝拮抗剤は、例えばアミノプテリン、２−クロロデオキシアデノシン、シトシンアラビノシド（ａｒａＣ）、シタラビン、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）（およびその誘導体、それはカペシタビンおよびテガフールを含む）、ゲムシタビン、メトプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、トリメトレキセート、６−メルカプトプリン、および６−チオグアニンを含む。
【００２２】
本明細書中で使用される「抗チューブリン」は、紡錘体を阻害することによって、細胞分裂を阻害する化学療法剤を指す。抗チューブリン剤は、例えばタキサンのパクリタキセルおよびドセタキセル、およびビンカアルカロイドのビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンフルニン、およびビンデシンを含む。
【００２３】
本明細書中で使用される「白金を含む薬剤」は、白金を含む化学療法剤を含む。白金を含む薬剤は、ＤＮＡと架橋およびアルキル化し、それはＤＮＡ合成および転写の阻害を引き起こす。白金を含む薬剤は、あらゆる細胞周期で作用し得、そして従って新生物および健康な分裂中の細胞を殺傷する。白金を含む薬剤は、例えばシスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンを含む。
【００２４】
他に規定されなければ、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、この発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明において使用するために、方法および材料が本明細書中で記載される；当該分野で公知の、他の適当な方法および材料も使用し得る。その材料、方法、および実施例は、説明のためのみであり、制限することを意図しない。本明細書中で述べた全ての出版物、特許申請、特許、配列、データベース記載事項、および他の参考文献は、その全体として参考文献に組み込まれる。対立する場合、定義を含む本明細書が統制する。
【００２５】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および図から、および請求から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ＴＳの発現を示す細胞株のウェスタンブロットである。サイトゾルおよび核抽出物を、細胞株Ｈ２３−ＣｔおよびＨ２３−Ｒ１から調製した。それらをポリアクリルアミドゲルで分離し、膜に移し、そしてＴＳ、Ｏｃｔ−１（核タンパク質）、およびＧＡＰＤＨ（サイトゾルタンパク質）に対する抗体でプローブした。ＴＳを表す３８ｋＤのバンドが、細胞質において見出された。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、ＴＳ発現によって推定された、カプラン・マイヤー全生存曲線である。２Ａ、インサイチュタンパク質発現による、１６０人の患者の生存。うすい灰色の線は、＞５７．０２のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝１２０；メジアン＝８１．３ヶ月、９５％ＣＩ６２．９−９９．６）、および濃い灰色の線は、≦５７．０２の発現を示す（Ｎ＝４０；メジアン＝５１．７ヶ月、９５％ＣＩ２１．５−８１．９）。未調整のｐ値は、０．００１３であった。２Ｂ、第二に良いカットポイントを含む、同じ患者のグループの生存。薄い灰色の線は、≧１２９．３３のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝１８；メジアンは達していない（ｎｏｔ ｒｅａｃｈｅｄ））、中間の灰色は、５７．５８から１２４．２７のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝８２；メジアン８０．８ヶ月）、そして濃い灰色の線は、≦５７．０２の発現を示す（Ｎ＝４０；メジアン＝５１．７ヶ月）。未調整のｐ値は０．００２であった。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、ＴＳ発現によって推定された、カプラン・マイヤー全生存曲線である。２Ａ、インサイチュタンパク質発現による、１６０人の患者の生存期間。うすい灰色の線は、＞５７．０２のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝１２０；メジアン＝８１．３ヶ月、９５％ＣＩ６２．９−９９．６）、および濃い灰色の線は、≦５７．０２の発現を示す（Ｎ＝４０；メジアン＝５１．７ヶ月、９５％ＣＩ２１．５−８１．９）。未調整のｐ値は、０．００１３であった。２Ｂ、第二に良いカットポイントを含む、同じ患者のグループの生存期間。薄い灰色の線は、≧１２９．３３のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝１８；メジアンは達していない（ｎｏｔ ｒｅａｃｈｅｄ））、中間の灰色は、５７．５８から１２４．２７のマーカー発現を有する患者を示し（Ｎ＝８２；メジアン８０．８ヶ月）、そして濃い灰色の線は、≦５７．０２の発現を示す（Ｎ＝４０；メジアン＝５１．７ヶ月）。未調整のｐ値は０．００２であった。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｘ線で測定した、治療に対する反応を示す棒グラフである。その反応は、測定可能な病変のサイズにおいて、９５％の増加から１００％の減少までの範囲であった。
【図３Ｂ】図３Ｂ−Ｅは、Ｘ線写真での疾患反応およびｍＲＮＡ遺伝子発現を示す棒グラフである。３Ｂ、ＲＲＭ１；３Ｃ、ＲＲＭ２；３Ｄ、ＴＳ；３Ｅ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）。
【図３Ｃ】図３Ｂ−Ｅは、Ｘ線写真での疾患反応およびｍＲＮＡ遺伝子発現を示す棒グラフである。３Ｂ、ＲＲＭ１；３Ｃ、ＲＲＭ２；３Ｄ、ＴＳ；３Ｅ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）。
【図３Ｄ】図３Ｂ−Ｅは、Ｘ線写真での疾患反応およびｍＲＮＡ遺伝子発現を示す棒グラフである。３Ｂ、ＲＲＭ１；３Ｃ、ＲＲＭ２；３Ｄ、ＴＳ；３Ｅ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）。
【図３Ｅ】図３Ｂ−Ｅは、Ｘ線写真での疾患反応およびｍＲＮＡ遺伝子発現を示す棒グラフである。３Ｂ、ＲＲＭ１；３Ｃ、ＲＲＭ２；３Ｄ、ＴＳ；３Ｅ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）。
【図４】図４は、カプラン・マイヤー全体および疾患なしの生存推定値の結果を示すグラフである。黒い曲線（上の線）は、ＯＳを示し、そして灰色の曲線（下の線）は、ＤＦＳを示す。印は、検閲した症例を示す。
【図５】図５は、１０人の患者における、ＲＲＭ１およびＴＳ遺伝子の治療前および治療後のｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ＮＳＣＬＣにおける現在の研究努力の主な目的は、完全な外科的切除を行う患者において、分子パラメーターを臨床的な治療決定に組み込むことによって、周術期の全身性治療の有効性を増加させることである。本明細書中で記載されるように、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子の腫瘍内発現レベルは、臨床的な予後と関連し、そしてＴＳおよびリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）のレベルは、非白金代謝拮抗剤による治療に対する腫瘍反応性と関連する。
【００２８】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）
ＮＳＣＬＣを診断する方法は、当該分野で公知である。診断手順は、個々の患者のために個別化されるべきであり、そして以下のものを含み得る：
−長期にわたる良性病変を除外するため、または悪性病変の進行の速度を決定するために、古い胸部Ｘ線を再調査する
−痰細胞学
−気管支鏡検査、気管支内病変の生検、ブラッシングおよび洗浄、気管支鏡検査後の痰細胞学
−縦隔リンパ節における手術不能の転移を除外するための縦隔鏡検査
−経皮的細針生検
−容易に接近可能な２次的沈着物の切除または針生検
診断の組織学的または細胞学的検証を得るべきである。
【００２９】
当該分野において公知の方法、例えばＭｏｕｎｔａｉｎ、Ｃｈｅｓｔ １１１：１７１０−１７（１９９７）；ＰｉｓｔｅｒｓおよびＧａｉｌ、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（７）：５８３−５８４（２００７）；Ｒａｍｉ−Ｐｏｒｔａら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（７）：５９３−６０２（２００７）；Ｒｕｓｃｈら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（７）：６０３−６１２（２００７）；Ｐｏｓｔｍｕｓら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（８）：６８６−６９３（２００７）；Ｇｒｏｏｍｅら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（８）：６９４−７０５（２００７）；Ｇｏｌｄｓｔｒａｗら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃ．２（８）：７０６−７１４（２００７）において記載されたような、国際的に受け入れられたＵＩＣＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ）ＴＮＭ（Ｔｕｍｏｒ／Ｎｏｄｅ／Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）分類システムを用いて、病期分類も行い得る。簡単には、「Ｔ」は腫瘍のサイズおよび付近の組織に浸潤したかどうかを説明し、「Ｎ」は関与するあらゆるリンパ節を説明し、そして「Ｍ」は転移（１つの体の部分から別の部分への癌の広がり）を説明する。ＴＮＭスケールによって、ステージ０はインサイチュにおける癌腫を示し、それはそれが始まった細胞の層だけに存在する初期の癌である。ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、漸次悪化する疾患状態を示す。より高いステージは、より大きな腫瘍サイズおよび／または付近のリンパ節および／または一次腫瘍に隣接する臓器への癌の広がりによって証明されるような、より広範な疾患を示す。ステージＩＶにおいて、腫瘍は少なくとも１つの他の臓器に広がっている。
【００３０】
予後の方法
本明細書中で記載したように、ＴＳタンパク質のレベル、例えば細胞質ＴＳタンパク質を用いて、予後を決定し得る、例えば延長した期間を超えた生存の可能性を決定し得る。これらの方法において、腫瘍細胞を含むサンプルを被験体から取り、そして例えば本明細書中で記載したような、当該分野で公知の方法を用いて、ＴＳタンパク質のレベルを決定する。例えば、ＴＳタンパク質発現レベルを、例えば自動化定量分析（ＡＱＵＡ）によって、タンパク質発現の定量的インサイチュ分析の方法を用いて決定し得る、例えばＣａｍｐら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１３２３−１３２７（２００２）を参照のこと。サンプル中の腫瘍細胞におけるＴＳのレベルの、参照レベルとの比較は、被験体の可能性のある予後を示す。いくつかの実施態様において、本明細書中で記載したように、参照コホートにおけるＴＳタンパク質発現によって決定されたカットポイントパーセンタイルに対して比較を行う。いくつかの実施態様において、その参照カットポイントは、約８９パーセンタイルの発現レベルである；そのカットポイントより上、例えば上位１１％の発現レベルの被験体は、改善した生存の機会を有し、そしてそのカットポイントより下の被験体は、より不良な予後を有する。いくつかの実施態様において、下位２５％のグループ、中位６４％グループ、および上位１１％グループにおいて、２つの参照カットポイントを使用する；下位２５％に入る被験体は、不利な結果（死亡）の最も高いリスクを有し、中位６４％の被験体は、中程度のリスクレベルを有し、そして上位１１％の被験体はより低いリスクを有する。例えば実施例１および図２Ａ−Ｂを参照のこと。いくつかの実施態様において、どれだけ積極的に被験体を治療するかに関する決定を、これらの方法によって提供される予後の情報に基づいて行う、例えば不利な結果のより高いリスクを有する被験体をより積極的に、またはさらなる治療様式、例えば照射または本明細書中で記載したような他の化学療法剤の投与によって治療する。
【００３１】
癌治療を決定する方法
適当な癌治療を決定または選択する方法は、患者から腫瘍サンプルを得る工程または提供する工程、および患者におけるＲＲＭ１またはＴＳの発現レベルを決定する工程を含む。もしＲＲＭ１およびＴＳの腫瘍内レベルが低ければ、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組合せを含む化学療法が適当であることを決定し得る。もしＲＲＭ１および／またはＴＳの腫瘍内レベルが高ければ、ゲムシタビンおよびペメトレキセドを欠く化学療法が適当であることを決定し得る。
【００３２】
「低い」および「高い」発現レベルは相対的な値であり、そして参照コホートのものとの比較に基づく。本明細書中で使用される「参照コホート」は、サンプル癌集団であり、そこからＲＲＭ１および／またはＴＳ発現データが収集される。参照コホートにおける発現レベルを、サンプル集団における腫瘍内遺伝子発現レベルを測定することによって決定する（例えばＲｏｓｅｌｌら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０：１３１８−２５、２００４；Ｌｏｒｄら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８：２２８６−２２９１、２００２；Ｂｅｐｌｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２：１８７８−８５、２００４；およびＳｉｍｏｎら、Ｃｈｅｓｔ １２７：９７８−８３、２００５を参照のこと）。典型的には、もし発現レベルが参照コホートにおけるメジアンのＲＲＭ１発現レベルと同じまたはそれより低ければ、腫瘍は「低い」ＲＲＭ１レベルを示し、そしてもし発現レベルが参照コホートにおけるメジアンのＲＲＭ１発現レベルより高ければ、腫瘍は「高い」ＲＲＭ１レベルを示す。同様に、もし発現レベルが参照コホートにおけるＴＳ発現レベルのメジアンと同じまたはそれより低ければ、腫瘍は「低い」ＴＳレベルを示す。「低い」および「高い」発現レベルは相対的であり、そして新しい参照グループそれぞれに関して確立し得る。１つの選択肢において、化学療法に対する被験体の反応を予測するために決定される発現レベルは、参照コホートの下位３分の１、または下位４分の１の発現レベルと同じかまたはそれより低くあり得る、または予測発現レベルを、参照コホートの上位３分の１、または上位４分の１の発現レベルと同じまたはそれより高いレベルと決定し得る。
【００３３】
腫瘍サンプル
生検（例えば針生検）のような、あらゆる方法を、腫瘍サンプルを得るために使用し得、そして処理のために組織をＯＣＴ（登録商標）（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｔｔｉｎｇ化合物）に包埋し得る。例えば、ＯＣＴ（登録商標）中の組織を、凍結切片として処理し得る。例えばレーザーキャプチャー法（ＬＣＭ）によって、腫瘍細胞を採取し得、そして遺伝子発現を、例えばポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）またはＲＮＡレベルを測定するためのノーザンブロット分析によって、またはタンパク質レベルを測定するためのウェスタンブロットによって、アッセイし得る。１つの典型的なアプローチにおいて、ＲＲＭ１またはＴＳ発現レベルを、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイする。これらの遺伝子の発現レベルを、例えば固定した、例えばホルマリン固定した標本において、免疫組織化学によっても決定し得る。
【００３４】
参照コホート
参照コホートからのサンプルを、同じ種の被験体（例えばヒト被験体）から取り、そして参照コホートの腫瘍は、好ましくは同じ型（例えばＮＳＣＬＣの腫瘍）である。例えば、参照コホートの腫瘍は、全て例えば癌腫、造血系腫瘍、脳腫瘍、または肉腫であり得る。いくつかの実施態様において、参照コホートの腫瘍は、全て例えば肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部および頸部癌、または卵巣癌由来であり得る。参照コホートの個々のメンバーは、疾患のステージ、以前の治療レジメ、ライフスタイル（たとえば喫煙者または非喫煙者、過体重または低体重）、または他の人口統計（例えば年齢、遺伝的素因）における類似性のような、他の類似性も共有し得る。例えば、同じ型の腫瘍を有することに加えて、参照コホートの患者は、以前に全身性の化学療法を受けたことがないかもしれない。参照コホートは、少なくとも１０人の被験体由来の、例えば１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または２００またはより多くの被験体由来の、腫瘍サンプルからの遺伝子発現分析データを含むべきである。
【００３５】
遺伝子発現およびタンパク質レベルの決定
参照コホートにおける遺伝子発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学のような、あらゆる方法によって決定し得る。試験被験体由来の腫瘍サンプルにおける発現レベルを、参照コホートにおける発現レベルと同じ方式で決定する。
【００３６】
ヒトで実施する場合、本方法において有用な配列は、以下のものを含むがこれに限らない：
−ＲＲＭ１配列：ＧｅｎｅＩＤ：６２４０−ヒトＲＲＭ１−ＮＭ＿００１０３３．３およびＮＰ＿ ００１０２４．１；遺伝子＝ＮＣ＿００００１１．８ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｒａｎｇｅ４０７２５００−４１１６６８２；ＮＴ＿００９２３７．１７、Ｒａｎｇｅ２９０３１６５−２９４７３４７
−ＴＳ配列：ＧｅｎｅＩＤ：７２９８−ヒトＴＳ ＮＭ＿００１０７１．２およびＮＰ＿００１０６２．１；遺伝子＝ＮＣ＿００００１８．８ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ−Ｒａｎｇｅ６４７６５１−６６３４９２；ＮＴ＿０１０８５９．１４、Ｒａｎｇｅ６４７６５１−６６３４９２ 。
【００３７】
例えばウェスタンブロッティングを用いて、タンパク質レベルを決定することが望ましい場合には、以下の抗体を使用し得る；他のものも有用であり得る。
【００３８】
−とりわけＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、およびＡｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販で入手可能な、抗ＲＲＭ１
−とりわけＡｂｃａｍ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＰｒｏＳｃｉ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から市販で入手可能な、抗ＴＳ 。
【００３９】
治療レジメの選択
腫瘍をＲＲＭ１またはＴＳまたは両方の発現レベルに関してサンプリングし得、そして適当な化学療法を、観察された発現レベルに基づいて決定し得る。その化学療法は、単一の薬剤または複数の化学療法剤（例えば２つ、３つ、またはそれ以上の化学療法剤）を含み得る。
【００４０】
１つの例において、ＲＲＭ１およびＴＳ両方の腫瘍内発現レベルを決定し、そして両方の遺伝子の発現レベルに基づいて、適当な化学療法剤を決定する。例えば、もしＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルがどちらも低いと決定されたら、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせを含む適当な化学療法を選択し得る。もしＲＲＭ１レベルが低いと決定され、そしてＴＳレベルが高いと決定されたら、適当な化学療法は、ゲムシタビンを含み、そしてペメトレキセドを除くことを決定し得、そして抗チューブリンまたはアルキル化剤のような最適な第二の薬剤を含み得る。そのような化学療法組成物は、白金を含む薬剤を含み得る。もしＲＲＭ１レベルが高いと決定され、そしてＴＳレベルが低いと決定されたら、適当な化学療法は、ゲムシタビンを含むべきではないがペメトレキセド、および抗チューブリンまたはアルキル化剤のような、最適な第二の薬剤を含み得る。もしＲＲＭ１およびＴＳレベルが両方とも高いと決定されたら、適当な化学療法は、抗チューブリンを含むことを決定し得る。その化学療法は、代謝拮抗剤を含むべきではない。
【００４１】
さらなる治療
一般的に、ＮＳＣＬＣと診断された被験体を、外科的切除；照射；およびアジュバントおよび／または新補助療法化学療法によって治療する、例えばＫｒｉｓら、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １０（Ｓｕｐｐｌ．２）：２３−２９（２００５）を参照のこと。ＮＳＣＬＣを治療するための現在の標準治療は、外科的切除、可能な場合は、ステージＩＩおよびＩＩＩにおいては続いて術後補助化学療法である；ＡｌｌｅｎおよびＪａｈａｎｚｅｂ、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃｏｍｐｒ．Ｃａｎｃ．Ｎｅｔｗ．６（３）：２８５−２９３（２００８）を参照のこと。同時または連続的な放射線療法の追加を含む３重様式（ｔｒｉｍｏｄａｌ）アプローチも使用する。従って、本明細書中で記載された方法は、あらゆる追加の治療様式、例えば外科的切除および／または照射の使用を含み得る。
【００４２】
他の化学療法剤、例えば抗チューブリンまたは白金を含む薬剤も、代謝拮抗剤の組み合わせと共に投与し得る。他の化学療法剤は、例えばＬ−アスパラギナーゼ、ビカルタミド、ブレオマイシン、カンプトテシン（ＣＰＴ−１１）、カルミノマイシン、シクロホスファミド、シトシンアラビノシド、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エクチナサイジン７４３、エストラムスチン、エトポシド、リン酸エトポシド、エポチロン、フルタミド、ＦＫ５０６、ヘキサメチルメラミン、エダトレキセート（ｉｄａｔｒｅｘａｔｅ）、レフルノミド、ロイプロリド、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸モフェチル、プリカマイシン、ポドフィロトキシン、ポルフィロマイシン、ｒａｎｐｉｍａｓｅ、ラパマイシン、トポテカン、テニポシド、およびチオテパを含む。
【００４３】
投薬および投与
本明細書中で記載されたように、ＲＲＭ１および／またはＴＳ発現レベルに基づいて、被験体のために選択された化学療法、例えばペメトレキセド／ゲムシタビン併用療法を、従来の投与レジメを用いて被験体に投与し得る。
【００４４】
化学療法を、丸剤の形態におけるような経口、静脈内、体腔（膀胱のような）への注射による、筋肉内、またはくも膜下腔内を含む、標準的な方法によって投与し得る。化学療法レジメを、持続的なレジメとして、例えば静脈内、経口、または体腔内に送達し得る。化学療法レジメを、薬剤が投与される日または日々に続いて休止および回復期を含むサイクルで送達し得る。回復期は、１、２、３、または４週間またはそれ以上続き得、そして次いでそのサイクルを反復し得る。化学療法の過程は、少なくとも２から１２サイクル（例えば３、４、５、６、７、１０、または１２サイクル）を含み得る。
【００４５】
上記で記載されたようにデザインされた化学療法の投与後に、増殖性疾患の予後に関連する結論を調整するために、本明細書中で注目された方法から得られた遺伝子発現データを、人口統計データ；生命状態；教育；飲酒、喫煙、および薬物乱用の履歴；治療歴；および記録された治療を含む、患者の医療記録からの情報を組み合わせ得る。
【００４６】
腫瘍内ＲＲＭ１またはＴＳ発現レベルによる化学療法の投与時に、その治療に対する反応に関して患者をモニターし得る。例えば、疾患の進行をモニターするために、化学療法の投与前および投与後に、腫瘍の測定を行い得る。もし腫瘍サイズが減少すれば、疾患は寛解にある、または寛解に向かって退縮していると決定し得る。腫瘍サイズの部分的な減少は、疾患が部分的な寛解にあることを示し得、そしてもし腫瘍が完全に消失したら、疾患は完全な寛解にあると言い得る。もし腫瘍サイズが増加するなら、疾患は進行していると決定し得る。もし腫瘍サイズが化学療法の投与後に変化しないなら、疾患は安定と分類し得る。
【００４７】
患者を、体重減少、胸水、および癌に関連する他の症状のような要因に注意して、その身体的な状態によっても評価し得る。例えば、小細胞および非小細胞肺癌を含む肺癌の症状は、持続する咳、血液の混じった痰、胸痛、および再発する肺炎または気管支炎を含む。その評価を、当該分野で公知の方法によって、併用療法の投与量および投与レジメを仕立てるために使用し得る。
【００４８】
有効性を予測する方法およびスクリーニング方法
本発明はまた、化学療法剤を含む組成物の有効性を評価または予測する方法を特徴とする。その方法は、少なくとも２つの細胞株、および１つまたはそれ以上の化学療法剤を含む組成物を採用する。その細胞株は、そのＲＲＭ１および／またはＴＳの発現レベルにおいて異なる。例えば、１つの細胞株は、標準コントロール細胞株より低いレベルのＲＲＭ１を発現する、または１つの細胞株は、標準コントロール細胞株より高いレベルのＲＲＭ１を発現する。より高い発現細胞株は、好ましくは１つのより低い発現細胞株より、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、または３００％より多いＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する。
【００４９】
増加または減少したＲＲＭ１および／またはＴＳの発現を引き起こすあらゆる方法を利用し得る。例えば、低レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する細胞株を、低レベルの発現を引き起こすｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを発現するよう操作し得る。あるいは、ＲＲＭ１および／またはＴＳの発現を、テトラサイクリン−、ＩＰＴＧ−、またはエクジソン応答プロモーターのような、調節可能なプロモーターのコントロール下に置き得る。ＲＲＭ１および／またはＴＳの発現は、親株における発現より低くあり得る、または発現は誘導の前には完全に欠如し得る。高レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する細胞は、ＲＲＭ１および／またはＴＳを、内因性ＲＲＭ１および／またはＴＳプロモーターより高いレベルで発現する、構成的プロモーターのコントロール下にＲＲＭ１および／またはＴＳ遺伝子を含み得る、または誘導が発現を親株におけるよりも高いレベルまで促進するように、ＲＲＭ１および／またはＴＳを、テトラサイクリン−またはＩＰＴＧ−応答プロモーターのような、誘導性プロモーターから発現し得る。高レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳ発現を促進する、または低レベルの発現を誘導する外来性の配列を、親株のゲノムに安定に組み込み得る、または親株に一時的にトランスフェクトし得る。
【００５０】
高および低レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する細胞を、候補化学療法剤または化学療法剤の組み合わせ（例えば２、３、または４つの化学療法剤）と接触させ、そしてコントロール株と比較して、化学療法剤に対する感受性または耐性の増加に関して細胞をモニターする。１つの細胞株に、コントロール細胞に対して増加した感受性を生じる薬剤、または薬剤の組み合わせを、対応するレベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する腫瘍を有する患者のための候補治療薬として同定し得る。
【００５１】
別の実施例において、もし低レベルの（すなわちコントロール親株より低いレベルの）ＴＳを発現する細胞が、コントロール株の細胞よりも、化学療法剤に対して感受性であるなら、その薬剤は、低レベルのＴＳを発現する腫瘍を有する患者の治療のための候補治療薬である。もし高レベルの（すなわちコントロール親株より高いレベルの）ＴＳを発現する細胞が、コントロール株の細胞よりも、化学療法剤に対して感受性であるなら、その薬剤は、高レベルのＴＳを発現する腫瘍を有する患者の治療のための候補治療薬である。
【００５２】
本明細書中で記載された方法を、高または低レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する腫瘍の治療のための候補である薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用し得る。上記で記載したもののような細胞株を、薬剤のパネル（例えば小分子薬剤、核酸、またはポリペプチド）と接触させて、低または高レベルのＲＲＭ１および／またはＴＳを発現する細胞の感受性の増加を引き起こす薬剤を同定し得る。
【００５３】
上記のスクリーニング方法において同定された薬剤、または候補化学療法として上記の方法によって同定された薬剤または薬剤の組み合わせを、ヒトで試験する前に動物モデルで試験し得る。例えば、その治療を、ヒトにおいて試験する前に、マウスまたは霊長類モデルにおいて、腫瘍サイズを抑制する能力に関して試験し得る。
【００５４】
キット
本明細書中で記載された方法を実施するための試薬、道具、および／または説明書を、キットにおいて提供し得る。例えば、そのキットは、癌患者のために適当な治療を決定するための試薬、道具、および説明書を含み得る。そのようなキットは、例えば生検によって患者から組織サンプルを採取するための試薬、およびその組織を処理するための試薬を含み得る。そのキットはまた、ヒトの腫瘍サンプルにおいてＲＲＭ１および／またはＴＳ発現レベルを決定するための、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学を行うための試薬のような、遺伝子発現分析を行うための、１つまたはそれ以上の試薬を含み得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを行うためのプライマー、ノーザンブロット分析を行うためのプローブ、および／またはウェスタンブロットおよび免疫組織化学的分析を行うための抗体を、そのようなキットに含み得る。アッセイのための適当な緩衝液も含み得る。これらのアッセイのいずれかに必要な検出試薬も含み得る。
【００５５】
本明細書中で特徴となるキットはまた、遺伝子発現を測定するためのアッセイをどのように行うかを記載した説明書も含み得る。その説明書は、参照コホートにおけるＲＲＭ１および／またはＴＳ発現レベルをどのように決定するか、および試験患者との比較のための参照を確立するために発現データをどのように構築するかを含む、参照コホートをどのように決定するかに関する説明も含む。その説明書は、試験患者において遺伝子発現をアッセイするための、およびその発現レベルを参照コホートの発現と比較して、続いて試験患者に適当な化学療法を決定するための説明も含み得る。適当な化学療法を決定するための方法は、上記で記載され、そして説明書において詳細に記載し得る。
【００５６】
別の実施例において、本発明で特徴となるキットは、ＲＲＭ１またはＴＳ発現レベルに基づいて、候補化学療法剤の有効性を予測するための試薬、道具、および説明書を含み得る。そのようなキットは、細胞においてＲＲＭ１またはＴＳ発現レベルを調節するためのベクター、およびアポトーシスを検出するための試薬のような、細胞表現型をモニターするための試薬を含み得る。組織サンプルにおいてＲＲＭ１およびＴＳの発現レベルを決定するための試薬も、上記で記載したように含み得る。
【００５７】
キットに含まれる情報資料は、本明細書中で記載された方法および／または本明細書中で記載された方法のための試薬の使用に関連する、説明の、指示の、売買の、または他の資料であり得る。例えば、そのキットの情報資料は、キットの使用者が、特に彼らが特定の化学療法に対する陽性の反応を有するヒトの可能性に適用する場合、遺伝子発現分析の実施および結果の解釈についての実質的な情報を得ることができる連絡情報、例えば物理的な住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号を含み得る。
【００５８】
キットは、試薬および情報資料のための別々の容器、仕切り、または区画を含み得る。容器は、ＲＲＭ１およびＴＳ遺伝子発現レベルの決定、および続くヒトのための適当な化学療法の決定に使用するために、ラベルを貼付し得る。
【００５９】
キットの情報資料は、その形態において制限されない。多くの場合、その情報資料、例えば説明書は、印刷されたもの、例えば印刷された文字、図、および／または写真、例えばラベルまたは印刷された紙で提供される。しかし、その情報資料を、点字、コンピューターで読み取り可能な資料、ビデオ記録、またはオーディオ記録のような、他の形態でも提供し得る。もちろん、その情報資料を、あらゆる形態の組み合わせでも提供し得る。
【実施例】
【００６０】
本発明を以下の実施例においてさらに説明し、それは請求において記載される本発明の範囲を制限しない。
【００６１】
実施例１−インサイチュでのチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）タンパク質発現
チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）は、デオキシウリジン１リン酸（ｄＵＭＰ）の、（デオキシ）チミジン１リン酸（ＴＭＰ）への変換を触媒し、それはテトラヒドロ葉酸のジヒドロ葉酸への酸化を必要とする。ＴＭＰは続いてＴＴＰへリン酸化され、それはＤＮＡ合成および修復に必要である。５−フルオロウラシル（５ＦＵ）は、ＴＭＰ合成を阻害し、そして有効な化学療法剤である（Ｗａｓｈｔｉｅｎ、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９８４；２５：１７１−７７；Ｍｏｅｒｔｅｌら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９０；３２２：３５２−５８；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １９５７；１７９（４５６１）：６６３−６）。ＴＳの高い腫瘍レベルは、特に結腸直腸癌（ＣＲＣ）および胃癌を有する患者において、５ＦＵに基づく化学療法に対する耐性と関連する（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９５；５５（７）：１４０７−１２；Ｌｅｉｃｈｍａｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９７；１５（１０）：３２２３−９；Ｓｈｉｒｏｔａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００１；１９（２３）：４２９８−３０４）。
【００６２】
ＴＳはリボヌクレオチド還元酵素の下流であり、そしてＤＮＡ合成および修復に必要なデオキシヌクレオチドの１つの形成に重要であるので、タンパク質およびｍＲＮＡレベルにおけるＴＳ発現が、さらなる化学療法も照射もうけなかった、完全に切除したステージＩのＮＳＣＬＣを有する患者における予後を予測するかどうか、およびインサイチュでのＴＳ発現が、ＲＲＭ１およびＥＲＣＣ１発現と関連するかどうかを決定するために、本研究を行った。
【００６３】
これらの研究において使用した２つの集団は、１９９１年から２００１年にＭｏｆｆｉｔｔ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒにおいてＮＳＣＬＣの完全切除を受けた患者から成っており、そして他で記載された（Ｚｈｅｎｇ ら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００７；３５６：８００−０８）。簡単には、患者は病理学的ステージＩＡまたはＩＢの疾患を有する；腺癌、扁平上皮癌、または大細胞癌を有する；周術期の化学療法または照射なし；以前の肺癌なし；そして胸部への以前の照射なしでなければならなかった。組織マイクロアレイの構築に十分な腫瘍組織を有する１８７人の患者が同定され、それはタンパク質レベルにおける遺伝子発現の評価のための集団を構成した（表１）。新しい凍結腫瘍組織を有する９２人の患者が、ｍＲＮＡレベルにおける遺伝子発現の評価のための集団を構成した（表２）。タンパク質およびｍＲＮＡレベルにおいて遺伝子発現値を有する３２人の患者が２つの集団の間で重複していた。２年間は３ヶ月に１回、３年間は６ヶ月に１回、および次いで１年に１回の訪問時のフォローアップが推奨された。全体的な生存に関して、診断から死亡までの時間を記録し、そして人口動態統計記録を用いて検証した。
【００６４】
研究のために使用したモノクローナルＴＳ抗体は、ＬａｂＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販で入手可能であった（オーダー＃ＭＳ−４７１−Ｐ、ロット＃４７１Ｐ５０４Ｂ）。それは、抗原として組換えヒトＴＳを用いて、マウスにおいて産生された。その抗体は、肺癌細胞株Ｈ２３の溶解物のウェスタンブロットにおいて、ＴＳの予測分子量である約３８ｋＤの主なバンドを検出し、これは細胞質に局在した（図１）。ウェスタンブロッティングを、以下のように行った。細胞株ＮＣＩ−Ｈ２３の永続的に遺伝的修飾した培養物由来の細胞質および核抽出物を、核／サイトゾル分画キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて調製した。タンパク質抽出物（５０μｇ）を、１０％Ｎｏｖｅｘ トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって分離し、そして純粋なニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にブロットした。そのブロットを、ＴＳ抗体（マウスクローンＴＳ−１０６、１：２００、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．）、Ｏｃｔ−１抗血清（＃３３４２−１００、１：１０００、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）およびＧＡＰＤＨ抗血清（＃ｓｃ−２０３５７、１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）と、４℃で一晩インキュベートした。タンパク質のバンドを、抗ウサギ、抗マウス、または抗ヤギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ２次抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で可視化した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを、等量添加のコントロールとして使用した。
【００６５】
共焦点顕微鏡を用いて、以下のようにＴＳタンパク質の細胞内局在を決定した。肺腺癌細胞株（Ｈ２３、Ｈ１２５、Ｈ２９２、Ｈ３２２、Ａ５４９）および大腸癌細胞株（Ｈ４９８、Ｈ５０８、Ｈ７４７、ＳＮＵ−Ｃ２Ａ、ＳＮＵ−Ｃ４）を、Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバースライドに直接増殖させた。接着細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド中で２０分間インキュベートすることによって固定し、そしてＰＢＳで洗浄した。それらを、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳ中で１時間透過処理し、そしてＰＢＳで洗浄した。ＴＳ（１：１００）抗体を結合緩衝液（１％のＢＳＡ／０．１％のＮＰ４０／ＰＢＳ）で希釈し、チャンバーに加え、そして１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後、スライドをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）の１：５００希釈物と４５分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄し、そしてＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止剤（ａｎｔｉｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてカバーした。ネガティブコントロールとして、同じ手順を、一次抗体無しで行った。サンプルを、６３×／１．２０ＮＡ水浸（ｗａｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を用いた倒立Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡によって観察した。核をＤＡＰＩによって可視化した。二重光電子増倍管検出器およびＬＳＭ５バージョン３．２．０．１１５ソフトウェアセット（ｓｕｉｔｅ）によって画像を作成した。
【００６６】
その結果は、５つの肺癌細胞株における、ＴＳの顕著な細胞質局在が確認されたことを示した（図２Ａ）；しかし、核ＴＳ発現が全てにおいて観察され、そしてそれはＨ２３において最も低く、そしてＡ５４９において最も高かった。対照的に、大腸癌由来の５つの細胞株において、ＴＳ発現は主に核であった。
【００６７】
組織マイクロアレイを作成するために、腫瘍標本を、将来を見越して採取し、中性緩衝化ホルマリン（１０％ｖ／ｖ）中で固定し、そしてパラフィンワックスに完全に包埋した。組織全体の切片をＨ＆Ｅ染色し、そして代表的な腫瘍領域を指定した。直径０．６ｍｍの組織コアを打ち抜いて、そして組織アレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いて、レシピエントブロックに並べた。厚さ５μｍの切片を切断し、４×接着被覆スライド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ、ＮＪ）に移し、そして紫外光に３０秒間あてて接着を増強した。
【００６８】
インサイチュでのＴＳタンパク質発現を、周術期の化学療法または照射を受けなかった、完全に切除されたＮＳＣＬＣを有する全部で１８７人の患者を含む、２つの複製組織マイクロアレイにおいて、腫瘍細胞質におけるＡＱＵＡによって決定した。
【００６９】
自動化定量分析（ＡＱＵＡ）と組み合わせた、免疫蛍光に基づく免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて、標的分子のインサイチュ発現を評価した。ｐＨ６．０の０．０１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム中で１５分間の電子レンジ処理によって、１３個の抗原を回復させた（ｒｅｔｒｉｅｖｅ）。スライドを、０．３％のＢＳＡで３０分間ブロックし、そして次いで一次抗体（マウスクローンＴＳ−１０６、１：３０、＃ＭＳ−４７１−Ｐ、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）と室温で一晩インキュベートした。癌性細胞の同定のために、サイトケラチンに対する抗血清を用いた（ウサギ抗ヒト汎サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３、１：２００、＃Ｚ０６２２、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。スライドを洗浄し、そして２つの異なる二次抗体と１時間インキュベートした（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）標識ポリマー−ＨＲＰ抗マウス、＃Ｋ４００７、およびＡｌｅｘａ５５５ヤギ抗ウサギ、＃Ａ２１４２９、１：２００、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。蛍光増幅のために、スライドをＣｙ５−Ｔｙｒａｍｉｄｅ（１：５０）に室温で１０分間曝露した。それらをＤＡＰＩ（４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）マウント溶液を含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止剤と共にマウントした。最終的な組織マイクロアレイスライドを、ＳｐｏｔＧｒａｂｂｅｒでスキャンし、そして画像データをＡＱＵＡ（ＰＭ−２０００、ＨｉｓｔｏＲｘ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で分析した。最も低い可能性のあるＡＱＵＡスコアは０であり、そして最も高いものは２５５である。
【００７０】
その結果を、図２Ｂに示す。ＴＳ発現データを、１６０／１８７（８６％）人の患者について得た。スポットが切片上に無かった、または処理の間に洗い流されたために、２７個の標本に関して、二連の発現データが得られなかった。平均値は５．８から２３８．６（０−２５５のスケールで）の範囲であり、メジアンは９８．４、および平均は９８．３（標準偏差５３．０）であった。そのデータはほとんど正規分布であり、そして正規化のためのデータ変換は行わなかった。複製アレイ間でＴＳ発現における有意な関連が存在した（ｒ＝０．５９９、ｐ≦０．００１）。
【００７１】
ＴＳタンパク質発現および腫瘍ステージ、組織学、パフォーマンスステータス、体重減少の有無、喫煙状態、または性別の間に、統計学的に有意な関連は存在しなかった（表１）。この患者コホートにおける一次元の腫瘍直径は、０．５から１０．８ｃｍの範囲であり、そしてＴＳ発現と有意に関連していなかった（ｒ＝０．０５１、ｐ＝０．５２）。以前に報告されたＲＲＭ１およびＥＲＣＣ１タンパク質レベルと有意な関連は存在しなかった（それぞれｒ＝０．１３および−０．０７、ｐ＞０．１）（Ｚｈｅｎｇら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００７；３５６：８００−０８）。
【００７２】
【表１】
＊ＮＲ、達しなかった。
【００７３】
最適なカットポイント決定のために最大ログランク法（ｍａｘｉｍａｌ ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、ＴＳ発現の２５パーセンタイル（４０／１６０人の患者）である、＞５７．０２のレベルを有するものから、≦５７．０２のレベルを有する患者を分離した場合、最も有意な全生存の差が見られた（図２Ａ）。低ＴＳグループにおけるメジアン生存は５１．７ヶ月であり、そして高ＴＳグループでは８１．３ヶ月であった（ｐ＝０．００１３）。この生存の差は、複数の調査（ｌｏｏｋ）のためにｐ値を調整した後も有意なままであった（ｐ＝０．０３４）。
【００７４】
ＴＳタンパク質発現および腫瘍ステージを含む、最終的な多変量モデルにおいて（表２）、ＴＳは全体の生存期間と有意に関連したままであった（ｐ＝０．００１３、調整ｐ＝０．０３２）。死亡のハザード比は、高対低ＴＳタンパク質発現に関して０．４５であった。
【００７５】
【表２】
＊ＣＩ、信頼区間
＊＊パフォーマンスステータスは最終的な多変量分析から除かれたので、１６０人の患者に基づく
＊＊＊最適なカットポイントの選択の原因となる調整ｐ値。
【００７６】
計画された生存分析に加えて、ＴＳ発現および生存の関連の予備的な試験を行った。ＴＳ発現をＣＯＸ回帰分析に連続変数として含み、そして未調整（ｐ＝０．００６）および腫瘍ステージに関して調整（ｐ＝０．００２）した、両方の低いｐ値を得た。１２９．３３（８９パーセンタイル）のＡＱＵＡスコアの、ＴＳタンパク質発現の第二のカットポイントも見出した。このカットポイントを生存分析に含むことで、患者の３つの生存グループへの分類を得た（図２Ｂ）。最も高いＴＳグループのメジアン生存は＞１２０ヶ月であり、中程度のＴＳグループでそれは８０．９ヶ月であり、そして最も低いＴＳグループで５１．７ヶ月であった（ｐ＝０．００２）。
【００７７】
カットポイントとして９８．４のサンプルメジアンを用いたＴＳ発現データの二分化（ｄｉｃｈｏｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）は、高ＴＳ発現を有する患者の８１．３ヶ月、および低ＴＳ発現を有する患者の６２．２ヶ月のメジアンＯＳを明らかにした（ｐ＝０．０７１）。
【００７８】
この実施例における統計学的分析を、以下のように行った。２つの複製読み取り値からのＡＱＵＡスコアの平均値を計算し、そして独立した連続変数として処理した。ＴＳ ｍＲＮＡ発現の平均を、三連の読み取り値から計算し、そして独立した連続変数として処理した。主な目的は、インサイチュでのＴＳタンパク質発現および全生存の間の関連を評価することであった。このためにＴＳ発現を先験的に高および低カテゴリーに分類しなかった。その代わりに、最適なカットポイントの決定のために最大ログランク法を用い、そして複数の調査に関してｐ値を調整した（ＭｉｌｌｅｒおよびＳｉｅｇｍｕｎｄ、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ １９８２；３８：１０１１−１６；ＨｉｌｓｅｎｂｅｃｋおよびＣｌａｒｋ、Ｓｔａｔ Ｍｅｄ １９９６；１５（１）：１０３−１２）。順序付けたＴＳタンパク質発現の中央８０％内のカットポイントを考えた。次いで生存および低および高ＴＳ発現の間の関連を、ＴＳタンパク質発現によって決定したカットポイントパーセンタイルを用いて、カプラン・マイヤー生存曲線で要約（ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ）した。潜在的な共変数である腫瘍ステージ、パフォーマンスステータス、性別、ＲＲＭ１タンパク質発現、およびＥＲＣＣ１タンパク質発現に関して調整しながら、生存期間に対するＴＳタンパク質発現の影響を評価するために、０．１５の有意性の留まる水準（ｌｅｖｅｌ−ｔｏ−ｓｔａｙ）による後方除去（ｂａｃｋｗａｒｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を用いた多変量コックス回帰分析を行った。ＲＲＭ１およびＥＲＣＣ１タンパク質発現を、連続変数として含めた。ＴＳタンパク質発現の二分化は、最適な選択によって得られたので、そのコックス回帰ｐ値を調整した。ＴＳ ｍＲＮＡ発現および全生存の関連を調査するためにも、最適なカットポイント決定のための最大ログランク法を使用した。
【００７９】
連続変数間の関連を、スピアマンの相関係数を用いて分析した。連続変数および離散変数の間の関連を、離散グループの数に依存して、ウィルコクソン順位和検定またはクラスカル・ウォリス検定を用いて分析した。人口統計学的および臨床的グループの間の生存の差を評価するために、ログランク検定を用いた。
【００８０】
複数の検定を説明する厳密な統計学的アプローチを用いて、その結果は、増加した細胞質ＴＳ発現は、生存の延長と関連していたことを示す。２つの予備的な分析が、この発見を支持した。最初に、もし本発明者らがコックス回帰分析によって増加するＴＳレベルに伴う死亡リスクの減少を先験的に探すことを選択したならば、統計学的に有意な結果（ｐ＝０．００６）が得られたであろう。第二に、死亡のリスクは、２つの別々のＴＳ発現レベル、５７．０２および１２９．３３において劇的に変化する。この生存モデルは、患者を下位２５％グループ、中位６４％グループ、および上位１１％グループに分けた。
【００８１】
実施例２−ＴＳ ｍＲＮＡ発現
ＴＳ ｍＲＮＡ発現を、以下のように、完全に切除したステージＩのＮＳＣＬＣを有する９２人の患者由来の新しい凍結腫瘍標本において決定した。新しく凍結した腫瘍標本を、実施例１で記載したのと同じ選択基準を満たす９２人の患者について、将来を見越して採取した（表３）。
【００８２】
【表３】
＊ＮＲ、達しなかった。
【００８３】
ＲＮＡを、腫瘍を構成する＞６０％の細胞を有する腫瘍標本から単離し、そして逆転写酵素によって、オリゴ−ＤＴおよびランダムプライマーを用いて、ｃＤＮＡを産生した（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）。約５ｎｇのサンプルｃＤＮＡを、リアルタイム技術によるＴＳ発現分析のために三連で用いた（ＡＢＩ ７９００ＨＴ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。サンプル中のＴＳ ｍＲＮＡの相対的な量を、閾値サイクルを標準曲線と比較することによって決定し、そして次いでＴＳ量（ＡＢＩ、ＨＳ００４２６５９１−ｍ１、アンプリコンサイズ８７ｂｐ）を、１８ＳｒＲＮＡ量（ＡＢＩ、＃４３１９４１３Ｅ）で割ることによって、規準化された量を決定した。
【００８４】
データを８５人の患者（９２％）から得て、そして発現は０．２から１０４．３の範囲であり、メジアンは３．５および平均は６．７であった（標準偏差１２．９）。ｍＲＮＡレベルは、腫瘍ステージ、パフォーマンスステータス、体重減少の有無、喫煙状態、または性別と有意に関連していなかった（表３）。しかしそれらは、組織学的サブタイプの間で有意に異なっていた；扁平上皮および大細胞癌と比較して、腺癌においてそのレベルはより低かった（表３）。この患者コホートにおける一次元の腫瘍直径は、１．４から１０．８ｃｍの範囲であり、そしてそれらはＴＳ発現と関連していなかった（ｒ＝０．１３５、ｐ＝０．２１８）。
【００８５】
最大ログランク法を、最適なカットポイント決定のために使用し、そして複数の調査に関して調整した後、ＴＳ ｍＲＮＡ発現の統計学的に有意なカットポイントは見出されなかった（調整ｐ＝１．０）。
【００８６】
３２人の患者が両方のデータベースで共通であり、そして従ってタンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方でＴＳ発現値を有していた。そのレベルの間にゼロに近い関連が存在した（ｒ＝０．０２８、ｐ＝０．８７７）。
【００８７】
統計学的な分析を、実施例１で記載したように行った。
【００８８】
定量的分析のために特別に開発された方法を用いてＴＳタンパク質およびｍＲＮＡ発現の間の関連を見出せなかったこれらの結果は、遺伝子の大部分に関して、肺癌においてタンパク質およびｍＲＮＡレベルの間の関連の欠如を示す、より最近の報告と一致する（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００２；１（４）：３０４−１３）。
【００８９】
実施例３−切除可能な非小細胞肺癌における、新補助療法、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの臨床的有効性および予測可能な分子マーカー
切除可能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の管理に、白金を含む化学療法を含むことは、Ｎ１またはＮ２リンパ節に転移性疾患を有する患者の標準的な治療になった（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｉａｌ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：３５１−３６０；Ｗｉｎｔｏｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００５；３５２：２５８９−２５９７；Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ ら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ ２００６；７：７１９−７２７）。新補助療法治療は、約３３−６４％の反応率を生じ（Ｄｅｐｉｅｒｒｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００２；２０：２４７−２５３；Ｓｃａｇｌｉｏｔｔｉ、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００５；２３：６２６ｓ；Ｇｉｌｌｉｇａｎら、Ｌａｎｃｅｔ ２００７；３６９：１９２９−１９３７；Ｐｉｓｔｅｒｓら、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００７；２５：３８９ｓ）、そしてアジュバント治療は約５−１５％絶対的な全生存を増加させる（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｉａｌ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：３５１−３６０；Ｗｉｎｔｏｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００５；３５２：２５８９−２５９７；Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ ら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ ２００６；７：７１９−７２７）。しかし、全ての患者を、白金を含むレジメで治療するアプローチは、有効性に関してプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）に達し得た。それに加えて、約１−２％の治療に関連する死亡率を含む、このアプローチに関連する有意な毒性が存在する（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｉａｌ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：３５１−３６０；Ｐｉｓｔｅｒｓら、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００７；２５：３８９ｓ）。分子的な腫瘍の特徴を治療の決定に組み込むことは、有効性を改善し、そして毒性を抑制し得る。
【００９０】
この実施例は、選択したレジメの臨床的有効性および耐容性を記載し、そして治療的有効性に対するこれら薬剤の代謝に関わる遺伝子のｍＲＮＡ発現の予測有用性を調査することを目的とした、切除可能なＮＳＣＬＣを有する患者における、新補助療法、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの単一施設試験を記載する。
【００９１】
導入補助化学療法および毒性：全部で５２人の適格患者、２６人の男性および２６人の女性、年齢４１歳および８３歳の間（メジアン６７歳）に、少なくとも１回の化学療法を投与した。彼らは２００４年４月および２００６年４月の間に登録され、そしてその特徴を表４に記載する。
【００９２】
臨床的病期分類を、理学的検査、胸部および上腹部のコンピューター断層撮影（ＣＴ）、全身ＦＤＧポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、脳の核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、気管支鏡検査、および縦隔鏡検査によって決定した。ＮＳＣＬＣの組織学的確認；ステージＩＢ−ＩＩＩＡおよび選択されたＩＩＩＢ（１つの葉に２つの病変）；年齢＞１８歳；０−１のパフォーマンスステータス（ＰＳ）；ＲＥＣＩＳＴによる測定可能な疾患；および肺癌のための以前の治療は適格性のために必要ではなかった。これらの基準を、５２人の患者が満たした。
【００９３】
ゲムシタビン１，５００ｍｇ／ｍ２に続いてペメトレキセド５００ｍｇ／ｍ２による術前化学療法を、１、１５、２９および４３日目に施した。続く化学療法の投与を、適当なら毒性のために遅延または抑制した。患者は、化学療法の１週間前から始めて、毎日３５０−１，０００μｇの投与量で葉酸を経口に、および９週間ごとに１，０００μｇの投与量でビタミンＢ１２を皮下に受容した。全ての毒性を、共通の毒性基準（ＣＴＣ、バージョン３．０）によって格付けした。
【００９４】
化学療法後、５０および６３日目の間に、ＣＴおよびＰＥＴスキャンを繰り返した。Ｘ線写真での反応を、治療後および治療前ＣＴスキャンを比較して、全ての最大の腫瘍直径の合計における変化のパーセンテージ（１−［後病変合計／前病変合計］×１００）を計算することによって、および最良の全体反応としてＲＥＣＩＳＴによっても、連続変数として表した。
【００９５】
切除可能な疾患を有する患者は、６４および７７日目の間に開胸術を受けた。推奨される手術は、縦隔リンパ節切開を伴う肺葉切除術または肺切除術であった。区域切除または楔状切除は推奨しなかった。切除不能な疾患を有する患者、および不完全な切除を有する患者は、その医師の考えで治療した。全ての患者を、２年間３ヶ月間隔でＣＴによって追跡した。
【００９６】
４２人の患者が、全ての計画された化学療法を時間通りに、そして投与量を抑制せずに投与された。３人の患者が、投与量を抑制せずに投与を遅らせた。その理由は、グレード３の下肢蜂巣炎、グレード２の血小板減少症、およびグレード３の肝酵素上昇であった。７人の患者が、意図された４回の隔週治療より少ない治療を受けた。３人の患者は、腎不全を伴うグレード３の好中球減少性の発熱、グレード３の熱性薬剤反応、および１人の患者は治療に関連した副作用を経験せずに即時の手術を依頼したために、最初のサイクルのみを投与された。３人の患者は、サイクル１および２のみを投与された。その理由は、１人の患者におけるグレード３の下肢静脈炎、および２人の患者におけるグレード３の疲労であった。１人の患者が、サイクル３の後に、おそらくウイルスが原因の間質性肺炎で死亡した；しかし、治療に関連した原因を除外できなかった。
【００９７】
【表４】
表４に対する説明文
１３人の患者において評価されなかった；２９人の患者において評価されなかった；３完全な腫瘍切除を受けた４０人の患者において；４診断の前３ヶ月の間に５％と同じまたはそれより多い；５生涯非喫煙者は、全部で１００本より少ないタバコを吸ったことのある人として定義した；６ＮＡ、該当なし；７２１人の患者は、細気管支肺胞性の特徴を有する５人を含んで腺癌を有し、１２人は、２人の腺扁平上皮癌、２人の混合腺−および扁平上皮癌、および１人の神経内分泌の特徴を示唆させる大細胞癌を含んで、他のＮＳＣＬＣサブタイプを有していた；８単一の肺葉にある２つの別々の腫瘍小結節のために、２つのＴ４Ｎ０、Ｔ４；９病理学的疾患反応カテゴリーｐＰＲおよびｐＮＲは、ＯＳ（ｐＰＲ対ｐＮＲのハザード比＝１．１、ｐ＝０．９０）またはＤＦＳ（ｐＰＲ対ｐＮＲのハザード比＝０．８７、ｐ＝０．７８）と有意に関連していなかった。
【００９８】
化学療法に対するＸ線写真での反応：Ｘ線写真での反応の評価は、４９人の患者において可能であった。最も良い全体の反応は、１人（２％；９５％ＣＩ：０．１−１０．９％）の患者における完全な寛解（ＣＲ）であった；１６人（３３％；９５％ＣＩ：２０．０−４７．５％）において部分的な寛解（ＰＲ）、２９人（５９％；９５％ＣＩ：４４．２−７３．０％）において安定な疾患（ＳＤ）、および３人（６％；９５％ＣＩ：１．３−１６．９％）の患者において進行性疾患（ＰＤ）であった。その反応は、測定可能な病変のサイズにおいて９５％の増加から１００％の減少までの範囲であった（図３Ａ）。Ｘ線写真での疾患反応および臨床パラメーターである年齢（ｐ＝０．６２）、性別（ｐ＝０．９６）、パフォーマンスステータス（ｐ＝０．９４）、体重減少（ｐ＝０．８８）、喫煙状態（ｐ＝０．８５）、腫瘍組織学（ｐ＝０．９５）、およびステージ（ｐ＝０．３１）の間に、統計学的に有意な関連はなかった（表４）。
【００９９】
化学療法に対する病理学的反応：Ｈ＆Ｅによって染色した外科的切除標本の光学顕微鏡による評価における、壊死および／または線維性物質の割合を決定することによって、病理学的反応の評価を行った。これは４３人の患者で可能であり、そして０−９０％の範囲であった。病理学的ＣＲ（≧９５％壊死／線維症）の患者はおらず、１３人（３０％）は病理学的ＰＲ（５０−９４％壊死／線維症）を有し、そして３０人（７０％）は病理学的反応を有さなかった（ｐＮＲ）。病理学的疾患反応および臨床パラメーターである年齢（ｐ＝０．３９）、性別（ｐ＝０．６５）、パフォーマンスステータス（ｐ＝０．１８）、体重減少（ｐ＝０．６９）、喫煙状態（ｐ＝０．９６）、腫瘍組織学（ｐ＝０．４３）、およびステージ（ｐ＝０．６６）の間に、統計学的に有意な関連はなかった。Ｘ線写真での反応および病理学的反応の間に関連はあった（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒｈｏ＝０．２３）；すなわちよりよい臨床反応は、より高い壊死および線維症の割合と関連していたが、それは統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．１４）。
【０１００】
外科的治療：開胸術を４６人の患者において行い、そして４０人の患者において完全な切除を行った。３２人の患者は肺葉切除術を行い、２人は二肺葉切除術を行い、８人は肺切除術を行い、２人は楔状切除を行い、そして２人は腫瘍の切除を行わなかった。外科的切除において、最初の病期分類と比較して、１７人の患者はステージが下がり（ｄｏｗｎ−ｓｔａｇｅｄ）、１７人は変化無く、そして１２人はステージが上った（ｕｐ−ｓｔａｇｅｄ）。１人の患者が、気管支瘻のＴ２Ｎ１扁平上皮癌のための完全な右上葉および中葉切除の２．７ヶ月後に死亡した。
【０１０１】
生存：２００８年２月の時点で、２０件のイベントが起こり、そして３２人の患者が生存していた（５人が再発、そして５人が不完全な切除を受けた）。メジアンＯＳは＞２８．０ヶ月であり、完全な外科的切除を受けた患者のメジアンＤＦＳは＞２１．１ヶ月であった（図４）。１２ヶ月および２４ヶ月ＯＳ率は、８４．６％（９５％ＣＩ：７１．６−９２．０％）、および７１．０％（９５％ＣＩ：５６．５−８１．４％）であり、そして対応するＤＦＳ率は、それぞれ６７．５％（９５％ＣＩ：５０．７−７９．７％）および５３．０％（９５％ＣＩ：３６．０−６７．４％）であった。化学療法に対するＸ線写真での反応または病理学的反応は、ＯＳまたはＤＦＳと有意に関連していなかった（表４）。
【０１０２】
疾患の反応を予測可能な薬理ゲノミクス変数：リアルタイムＲＴＰＣＲによる遺伝子発現分析に十分な量および質の、治療前腫瘍標本が１０人の患者で、そして治療後標本が３５人の患者で入手可能であった。ゲムシタビンおよびペメトレキセド治療が、ＲＲＭ１およびＴＳのｍＲＮＡレベルを変化させたかどうかを評価した。
【０１０３】
腫瘍サンプルを、治療前および後に、凍結標本として採取した。採取のために標準的な操作手順は、生検または切除から凍結までの時間を記録することを含んでおり、そして経過時間は全ての症例で３０分以下であった。凍結標本を、ＯＣＴに包埋し、そして５−７μｍの切片に切断した。
【０１０４】
腫瘍細胞を、Ａｒｃｔｕｒｕｓシステムを用いたレーザーキャプチャー法（ＬＣＭ）によって採取した。全ＲＮＡを、市販の方法（Ａｒｃｔｕｒｕｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて抽出し、そしてオリゴｄＴおよびランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを産生した。リアルタイム定量的ＰＣＲ分析を、サンプルあたり三連行った（７９００ＨＴ、ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。ＲＲＭ１のプローブおよびプライマーは、以前に記載したものであった（Ｂｅｐｌｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００４；２２：１８７８−１８８５）。全ての他の標的遺伝子の発現分析のために、市販で入手可能なプライマーおよびプローブを用いた（表５）。サンプル中のＲＲＭ１およびＴＳ ｍＲＮＡの相対的な量を、記載されたように、標準曲線と閾値サイクルを比較することによって決定した（Ｂｅｐｌｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００４；２２：１８７８−１８８５）。残りの遺伝子に関して、流体カード（ｆｌｕｉｄｉｃ ｃａｒｄ）アッセイにおいて、試験サンプルを単一の較正物質（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）サンプルと比較することによって、相対的な定量を行った。ｃＤＮＡテンプレートを含まないネガティブコントロールを、全ての実験に含めた。
【０１０５】
両方の遺伝子に関して、治療前および後のレベルの間に有意な関連が存在し（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒｈｏ＝０．７８６、ｐ＝０．０２５）、化学療法後の遺伝子発現レベルは、治療前のレベルを表すことを示唆した。しかし、遺伝子発現レベルは、治療によって増加するようである（図５）。全ての続く分析を、３５個の治療後標本に対して行った。１４遺伝子全ての発現の範囲および他のマーカーの特徴を、表５にまとめる。ＲＲＭ１のｍＲＮＡレベルは、疾患反応と有意に関連していた（ｒｈｏ＝０．６４９、ｐ＝＜０．００１）；すなわち、低レベルは腫瘍サイズの抑制を予測し、そして高レベルは腫瘍の増殖を予測した（図３Ｂ）。１．６８のメジアンと同じまたはそれより低いＲＲＭ１発現を有する１８人の患者のうち、１０人はＰＲまたはＣＲを有し、一方高ＲＲＭ１発現を有する１７人のうち２人のみが反応した。ＴＳのｍＲＮＡレベルは、同様に疾患反応と関連していた（ｒｈｏ＝０．４５４、ｐ＝０．００６）（図３Ｄ）；しかし、データ分析の多重度に関してボンフェローニ補正を用いた後、ｐ値は０．００３６のレベルより上であった。３．４０のメジアンと同じまたはそれより低いＴＳ発現を有する１８人の患者のうち、７人がＰＲまたはＣＲを有し、一方高ＴＳ発現を有する１７人のうち５人のみが反応した。
【０１０６】
驚くべきことに、全ての他の遺伝子の発現レベルは、それらも投与された治療の標的と考えられるが、疾患反応と有意に関連していなかった（図３ＣおよびＥ）；表５に列挙した上の７つの遺伝子は、ゲムシタビン代謝経路にあり、一方表５の下の７つはペメトレキセド代謝に関与し、そしてＲＲＭ１およびＴＳのみが有意な関連を示した（表５の一番右側の列を参照のこと）。
【０１０７】
【表５】
結果
非白金ダブレット、すなわちゲムシタビンおよびペメトレキセドの術前有効性を、外科的に切除可能なＮＳＣＬＣを有する患者において調査した。この組み合わせの理論的根拠は、両方の薬剤が比較的周知の作用メカニズムを有する代謝拮抗剤であり、両方とも耐容性が高く、そして両方とも有効であり、そして患者の治療に既に組み込まれていることであった。白金に基づく化学療法を利用した、以前の無作為化第ＩＩＩ相新補助療法試験は、３３％，５、４１％，７、４９％，６、および６４％，４の反応率を報告した。約７５％の患者が予定された全ての化学療法を受け、そして化学療法に関連する死亡率は約２％であった。これらの反応率は、３５％の反応率よりも高く見えるが、この研究の１８／５２人の患者は、ステージＩＩＩの疾患を有しており、一方参照試験のうち２つはステージＩＩＩの患者を含まず、５、７、そして他の２つの試験におけるステージＩＩＩ患者の割合は、それぞれ７％６および４７％４であった。ステージＩＩＩの疾患を有する患者における白金に基づく治療による、２つの以前の無作為化新補助療法試験において、報告された反応率は５３％（１６／３０）１６および３５％（９／２６）であった（Ｒｏｔｈら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １９９４；８６：６７３−６８０）。予測される反応率を、先験的に５０％に設定した；その目的は達成されなかった。従って、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせは、もし切除可能なＮＳＣＬＣを有する患者の選択されないグループに投与された場合、白金含有ダブレット（ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅｔ）を超えそうにない。
【０１０８】
試験において８７％（４５／５２）の患者が、予定された４サイクルの治療を受けた。５人の患者が、治療に関連するグレード３の毒性のために、４サイクルより少なく受け、そしてこのうち４人は、完全切除の手術を受けた。１人の患者が、推定ウイルス性間質性肺炎によって、手術の前に死亡した。従って、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせは耐容性が高く、そして４回の隔週の治療として、白金含有ダブレットを投与し得る患者の割合と少なくとも同じ割合の患者に送達可能である。
【０１０９】
これらの薬理ゲノミクス試験は、ゲムシタビンおよびペメトレキセドに対する腫瘍反応の程度は、遺伝子ＲＲＭ１およびＴＳの腫瘍発現と関連することを示す。その腫瘍がこれらの遺伝子を低レベルで発現する患者は、高レベルの遺伝子発現を有するものと比較して、腫瘍サイズの抑制を経験する可能性が高い。この関連は、遺伝子ＲＲＭ１に関して有意であったが、ＴＳに関しては０．００３６の有意レベルに達しなかった。全部で１４個の遺伝子が、これらの患者において評価されたので、有意性レベルをボンフェローニによって調整した。これは、データ分析の多重性に関して調整するための保守的なアプローチであり、そしてほとんどの相関性調査を、より厳密でない条件下で行う。従って、ＴＳ発現および治療に対する反応の間の関連に関してみられた（−）０．４５４の相関係数は注目すべきであり、そしてさらなる調査を必要とする。
【０１１０】
まとめると、記載された臨床的相関性調査は、以前から公知のＲＲＭ１発現およびゲムシタビン有効性の間の関係を、ゲムシタビンおよびペメトレキセドの組み合わせまで延長する。それらはまた、ＴＳ発現およびこの組み合わせの有効性の間の関連の妥当な証拠を提供する。切除可能なＮＳＣＬＣを有する選択されない患者のグループにおいて、ゲムシタビンおよびペメトレキセドは、耐容性が高く、３５％の客観的なＸ線写真による反応率を提供する。
【０１１１】
さらなる参考文献
【０１１２】
【化１】
他の実施態様
本発明はその詳細な説明に関連して記載されたが、前述の説明は説明することを意図し、そして添付の請求の範囲によって規定される本発明の範囲を制限しないことが理解される。他の局面、利点、および修飾が、以下の請求の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体に適切な化学療法を選択するための方法であって、該方法は：
ａ．該被験体から腫瘍サンプルを取得する工程；
ｂ．該腫瘍サンプルにおいてリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）およびチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子発現のレベルを決定する工程；ならびに、
ｃ．該ＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルに基づいて適切な化学療法を選択する工程であって、該ＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルが参照コホートのメジアンのＲＲＭｌ発現レベル以下である場合、ゲムシタビンおよびペメトレキセドを含む化学療法が選択される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記適切な化学療法を前記被験体に施す工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二の化学療法剤を前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第二の化学療法剤が、抗チューブリンまたは白金を含む薬剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が、上皮の悪性疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部および頸部癌または卵巣癌を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ゲムシタビンおよびペメトレキセドの投与を含む治療に対する被験体の反応を予測するための方法であって、該方法は：
ａ．該被験体から腫瘍サンプルを取得する工程；
ｂ．該腫瘍サンプルにおいてリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）およびチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子発現のレベルを決定する工程；ならびに
ｃ．該腫瘍サンプルにおいてＲＲＭ１およびＴＳ遺伝子発現レベルに基づいて該治療に対する該被験体の反応を予測する工程であって、ＲＲＭ１およびＴＳの低レベルの発現が、該被験体が該治療に対する陽性の反応を有する可能性が高いことを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項９】
前記被験体が、上皮の悪性疾患を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体が、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部および頸部癌または卵巣癌を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
非小細胞肺癌と診断された被験体のための予後を提供する方法であって、該方法は：
ａ．該被験体から腫瘍サンプルを取得する工程；
ｂ．該腫瘍サンプルにおいて細胞質チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）タンパク質のレベルを決定する工程；ならびに
ｃ．該サンプル中の細胞質ＴＳタンパク質のレベルと細胞質ＴＳタンパク質の参照レベルとを比較する工程、
を包含し、ここで、該参照レベルと比較して該サンプル中の細胞質ＴＳタンパク質の高いレベルは、良好な予後を示し、該参照レベルと比較して細胞質ＴＳタンパク質の低いレベルは、不良な予後を示す、方法。
【請求項１３】
前記細胞質ＴＳタンパク質のレベルが、定量的インサイチュ分析方法を使用して決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．患者由来の組織サンプルにおいて、ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬、ならびに
ｂ．説明書、
を含むキット。
【請求項１５】
前記ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬が、オリゴｄＴプライマー、ＲＲＭ１またはＴＳ ｃＤＮＡにハイブリダイズする正方向プライマー、ＲＲＭ１またはＴＳ ｃＤＮＡにハイブリダイズする逆方向プライマー、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ならびにヌクレオチドから選択されるグループから選択された試薬の事前に測定された部分を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬が、ウェスタンブロットまたは免疫組織化学的アッセイを行うための、抗ＲＲＭ１および抗ＴＳ抗体ならびに緩衝液の事前に測定された部分を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
患者由来の組織サンプルを処理するための試薬をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１】
被験体に適切な化学療法を選択するための方法であって、該方法は：
ａ．該被験体から腫瘍サンプルを取得する工程；
ｂ．該腫瘍サンプルにおいてリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）およびチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子発現のレベルを決定する工程；ならびに、
ｃ．該ＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルに基づいて適切な化学療法を選択する工程であって、該ＲＲＭ１およびＴＳ発現レベルが参照コホートのメジアンのＲＲＭｌ発現レベル以下である場合、ゲムシタビンおよびペメトレキセドを含む化学療法が選択される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記適切な化学療法を前記被験体に施す工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二の化学療法剤を前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第二の化学療法剤が、抗チューブリンまたは白金を含む薬剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が、上皮の悪性疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部および頸部癌または卵巣癌を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ゲムシタビンおよびペメトレキセドの投与を含む治療に対する被験体の反応を予測するための方法であって、該方法は：
ａ．該被験体から腫瘍サンプルを取得する工程；
ｂ．該腫瘍サンプルにおいてリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１（ＲＲＭ１）およびチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子発現のレベルを決定する工程；ならびに
ｃ．該腫瘍サンプルにおいてＲＲＭ１およびＴＳ遺伝子発現レベルに基づいて該治療に対する該被験体の反応を予測する工程であって、ＲＲＭ１およびＴＳの低レベルの発現が、該被験体が該治療に対する陽性の反応を有する可能性が高いことを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項９】
前記被験体が、上皮の悪性疾患を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体が、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部および頸部癌または卵巣癌を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
非小細胞肺癌と診断された被験体のための予後を提供する方法であって、該方法は：
ａ．該被験体から腫瘍サンプルを取得する工程；
ｂ．該腫瘍サンプルにおいて細胞質チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）タンパク質のレベルを決定する工程；ならびに
ｃ．該サンプル中の細胞質ＴＳタンパク質のレベルと細胞質ＴＳタンパク質の参照レベルとを比較する工程、
を包含し、ここで、該参照レベルと比較して該サンプル中の細胞質ＴＳタンパク質の高いレベルは、良好な予後を示し、該参照レベルと比較して細胞質ＴＳタンパク質の低いレベルは、不良な予後を示す、方法。
【請求項１３】
前記細胞質ＴＳタンパク質のレベルが、定量的インサイチュ分析方法を使用して決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．患者由来の組織サンプルにおいて、ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬、ならびに
ｂ．説明書、
を含むキット。
【請求項１５】
前記ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬が、オリゴｄＴプライマー、ＲＲＭ１またはＴＳ ｃＤＮＡにハイブリダイズする正方向プライマー、ＲＲＭ１またはＴＳ ｃＤＮＡにハイブリダイズする逆方向プライマー、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ならびにヌクレオチドから選択されるグループから選択された試薬の事前に測定された部分を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記ＲＲＭ１およびＴＳ発現をアッセイするための試薬が、ウェスタンブロットまたは免疫組織化学的アッセイを行うための、抗ＲＲＭ１および抗ＴＳ抗体ならびに緩衝液の事前に測定された部分を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
患者由来の組織サンプルを処理するための試薬をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図４】
【図５】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５３０７４６（Ｐ２０１０−５３０７４６Ａ）
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１２３８４（Ｐ２０１０−５１２３８４）
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６９１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５７３５３
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（３９８０１４３３３）ユニヴァーシティ オブ サウス フロリダ (17)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６９１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５７３５３
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（３９８０１４３３３）ユニヴァーシティ オブ サウス フロリダ (17)
【Ｆターム（参考）】
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