発光微生物固定化チップ及びそれを用いる有機汚染、環境測定方法
【課題】 発光微生物アレイ化チップを用いて、簡便で迅速に、かつオンサイトでＢＯＤを測定することができる発光微生物固定化チップ及びそれを用いる河川、湖沼、海洋、排水における有機汚染測定方法を提供すること。
【解決手段】 基板上に微小ホール又は凹凸構造を複数箇穿設するとともに、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ及びこの発光微生物固定化チップを２℃〜５℃の温度域で保存した後、８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を前記発光微生物固定化チップの微小ホール又は凹凸構造に滴下し、２０分間以内の発光量を測定する。
【解決手段】 基板上に微小ホール又は凹凸構造を複数箇穿設するとともに、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ及びこの発光微生物固定化チップを２℃〜５℃の温度域で保存した後、８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を前記発光微生物固定化チップの微小ホール又は凹凸構造に滴下し、２０分間以内の発光量を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光微生物によって水中の生物資化性有機汚染を測定するための発光微生物固定化チップ及びそれを用いる有機汚染、環境測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境汚染の大きな部分として、河川、湖沼、海洋の水質汚染がある。これらの汚染の問題を解決する手段として、物理的な直接除去や化学物質を用いる処理、微生物を用いる浄化処理などがある。これらの浄化処理を行うために、水質汚染の状況を正確かつ簡便に把握する手段が必要となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
水質汚染状況を把握する手段として、クロマトグラフィーやマススペクトログラフィー、分光分析などがある。これらの手段は低濃度の有機成分を高い精度で測定できるけれども、多検体、多項目の検出が難しくまた、分析機器が高価でありさらに、オンサイトでの測定が困難である問題がある。
【０００４】
一方、水の有機汚染測定の公定法として、ＣＯＤ（Chemical Oxygen Demand：化学的酸素要求量）、ＴＯＣ（Total Organic Carbon：全有機炭素量）、ＢＯＤ（Biochemical Oxygen Demand：生物化学的酸素要求量）を測定する方法がある。ＣＯＤは、水中の還元性有機物を一定の酸化条件で反応させ、それに要する酸化剤の量を当量酸素量（Ｏ２ｍｇ／ｄｍ３）に換算して表すものである。通常、酸化剤として過マンガン酸カリウムを、酸化条件としては酸性、１００℃、３０分間の値を用いる。しかしながら、水中の還元性有機物が酸化される速度が、酸化剤や還元性有機物の種類や濃度、反応温度、ｐＨによって差がでることが多い。また、再現性を得るためには、反応初期および反応終了時の酸化剤の濃度、反応温度、反応時間などの測定条件を一定化する必要がある。
【０００５】
ＴＯＣは、被検水中に含まれる有機物の全てを燃焼により酸化させ、主要構成成分である炭素の量で示したものであり、有機物中の炭素の燃焼によって生じた二酸化炭素を赤外吸収法によって定量する方法が一般的である。しかし、この方法によるときは装置が大型かつ高価であり、同時、多試料分析には向いていない。
【０００６】
ＢＯＤは生物化学的酸素消費量または生化学的酸素要求量ともいわれ、水質汚染の指標の１つである。好気性微生物が好気的条件下で一定時間内に水中の有機物を分解するのに消費する溶存酸素量のことであり、排水や河川の水中の生物分解性有機物の量に対応する。水を密閉容器に入れ必要ならば微生物群を添加した後、通常、２０℃で５日間保存してその間の溶存酸素の減少量を測り、これをＯ２ｍｇ／ｄｍ３で表しＢＯＤ５とする。しかしながら、この方法は５日間と長時間を要するため、環境水域の水質や工場廃水或いは水処理施設のような流動的な状況下での管理指標として用いるのは困難である。
【０００７】
そこで、幅広い炭素源に対する資化能を有する微生物（Trichosporon cutaneum
ＩＦＯ１０４６６ ）と酸素電極を用いて溶存酸素量の測定を行うＢＯＤＳ法が開発された。ＢＯＤＳ法はＢＯＤ５法に比し迅速な測定が可能であり、試料水を添加した溶液に微生物固定化膜を装着した酸素電極を入れ、電流変化を読み取るだけでＢＯＤの測定を行える。しかしながら、酸素電極に装着する微生物の固定化方法や固定化した微生物の活性化に高い技術を必要とし、多試料分析やオンサイトでの測定が困難である。
【０００８】
これら従来技術における問題を解決すべく、発明者らの１人は、微生物発光によって水中の生物資化性有機汚染を測定するチップ有機汚染計測システムを提案した（特許文献１参照）。しかしながら、この技術においては、ＢＯＤ測定に耐え得るチップ又はシートの保存期間は４日間であり、４日間以内にあってもチップからの発光は５分間程度で完全に消滅する。また、発光を測定するために化学発光測定装置（ケミイメージャー）を必要とし、この装置で発光を測定、積分する必要があった。而して、オンサイトでの測定にあっては、微生物株、微生物固定化素材、保存期間、チップ又はシートからの発光強度、発光計測装置の諸点で解決すべき課題があった。
【特許文献１】特開２００４−０９３１９６号公報
【０００９】
本発明は、発光微生物アレイ化チップ又はシートを用いて、簡便にオンサイトでＢＯＤを測定することができる発光微生物固定化チップ又はシート及びそれを用いる河川、湖沼、海洋、排水における有機汚染及び環境測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための請求項１に記載の発明は、基板又はシート上に微小ホール又は凹凸構造を複数箇穿設するとともに、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ又はシートである。
【００１１】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発光微生物固定化チップ又はシートを２℃〜５℃の温度域で保存した後、ＢＯＤ測定に臨んで８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を前記発光微生物固定化チップ又はシート上の微小ホール又は凹凸構造に滴下し、２０分間以内の発光量を測定するようにしたことを特徴とする発光微生物固定化チップ又はシートによる有機汚染及び環境測定方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、極微量（約１０μｌ）の試料から容易かつ試料採取、発光微生物の再活性化処理、インキュベート、データ処理時間を合わせて約１時間以内という迅速さで、多試料のＢＯＤ測定ができる。本発明の発光微生物固定化チップ又はシートを用いる簡易測定システムによって、オンサイトでのハイスループットなＢＯＤ測定が可能となった。
【００１３】
また、本発明によるときはきわめて短時間内に測定が可能である処から、藻類の影響を受けることなく海水のＢＯＤ測定を正確に行うことができる。さらに、止水域でのＢＯＤ測定が可能である。一方、発光が減少若しくは阻害されることを検出して毒物の検出ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、基板とはシートを包含するものである。従って、発光微生物固定化チップは発光微生物固定化シートを含む。
本発明は、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルによって基板上の微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ又はシートを得ることならびに、この発光微生物固定化チップ又はシートを２℃〜５℃の温度域で保存した後、ＢＯＤ測定に臨んで８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、試料液を発光微生物固定化チップ又はシートの微小ホール又は凹凸構造に滴下し２０分間以内の発光量を測定することからなる。
以下、本発明をその好ましい実施形態に則して詳細に説明する。
【実施例】
【００１５】
（基板又はシート上への微小ホール又は凹凸構造穿設）
アクリル基板（３ｃｍ×７ｃｍ×０．２ｃｍ厚さ）上に、直径：１０００μｍ、深さ：１０００μｍ、各ホール間：５ｍｍの微小ホールを９箇穿設した。これら微小ホールに発光微生物の包理・固定化を行った。
【００１６】
（基板又はシート上の微小ホール又は凹凸構造への発光微生物の包理・固定化）
先ず、発光微生物として発光細菌Photobacterium phosphoreum ＩＦＯ１３８９６株を用いた。この発光細菌を初発菌体濃度が１０６cells／ｍｌとなるように調節して培養した。培養には、一般的な発光菌培養地である、表１に示すＡＴＣＣculture medium Ｎｏ．１１６３を用い、振盪条件：２５℃、１２０ｒｐｍで培養を行った。また、実験に使用する発光細菌は、培養令を一定化させ発光強度が最大となるよう、対数増殖後期にあたる植菌後約１５時間後の液体培地を採取して使用した。
【００１７】
一方、各濃度のＢＯＤ標準溶液を作製した。表１に示すＡＴＣＣculture medium Ｎｏ．１１６３から炭素源であるPeptone, Yeast extract を除いた培地にグルコース、グルタミン酸をそれぞれ１５０ｍｇ／ｌの濃度で添加し、ｐＨ７．４に調整後、オートクレーブ処理（１２０℃、２ａｔｍ、１０分間）によって滅菌した。得られた溶液のＢＯＤ値を２２０ｐｐｍとした。この濃度を基準として、炭素源を除いた増殖培地を加え希釈することによって各濃度のＢＯＤ標準溶液を作製した。また、標準液として用いる際には、各濃度のＢＯＤ標準溶液をそれぞれ乾熱滅菌処理（１５０℃、３０分間）を行った２０ｍｌバイアル瓶に１０ｍｌずつ分注し、ブチル瓶とアルミシールを用いて密栓後、酸素ガスによるバブリング処理を２分間行った。こうして調整されたＢＯＤ標準溶液を、検量線の作成などに使用した。
【００１８】
【表１】
【００１９】
発明者らは、特開２００４−０９３１９６号にて開示したアルギン酸ナトリウムに代わる発光細菌固定化担体を検討すべく、無機系固定化担体であるシリカゲルを発光細菌固定化担体として検討した。固定化剤として、発光細菌の増殖培地である表１に示すＡＴＣＣculture medium Ｎｏ．１１６３から炭素源であるPeptone, Yeast extract を除いた溶液（固定化溶液）１０ｍｌに１Ｎ塩酸溶液２．９ｍｌとコロイダルシリカ４０ｍｌを添加した後、ドライオーブンで乾燥（５０℃、２４時間）し粉末状としたものを発光菌体固定化用シリカゲルとして用いることとした。シリカゲルは乾燥に強く、無機担体であるため劣化や分解の少ない材料である。また、微生物の保存という観点からも、発光遺伝子組み換え大腸菌（Escherichia coli ）をシリカゲルによって固定化したところ約２ヶ月の保存ができた実例もある。
【００２０】
また、菌体包理用シリカゲルを発光微生物固定化チップに固定化した後、固定化担体に対する保温、固定化菌体の安定化のために寒天ゲルを利用した。固定化溶液１００ｍｌに０．５ｇの細菌培養用寒天（Wako：０１０−０８７２５）を溶かし０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天溶液を作製した。シリカゲルと、この寒天溶液を用いて発光細菌保存用チップを作製した。
【００２１】
培養令を調節した発光細菌の培養液を遠心分離して菌体ペレットを作製した。このペレットを洗浄し上澄みを除いて固定化用のシリカゲル２５μｇを加え、滅菌済み木製スティック（爪楊枝）を用いて発光菌体と混合した。溶液が十分ゲル化したことを確認して、この混合ゲルをアクリルチップ上の微小ホールに木製スティック（爪楊枝）を用いて充填した。発光菌体混合シリカゲルを固定化した発光微生物固定化チップに対して、上記０．５％寒天ゲル４００μｌを各微小ホールが覆われるように滴下した。滴下後、直ちにその上からカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ ＧＬＡＳＳ，２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ０．１２ｍｍ〜０．１７ｍｍ）をチップ上のホールが全て覆われるように被せた。
【００２２】
（発光微生物固定化チップ又はシートの保存）
カバーガラスで被覆された発光微生物固定化チップを冷蔵保存（２℃〜５℃）すべくプラスチックシャーレに入れ、パラフィンフィルムで周囲を密閉して冷蔵庫（４℃）で１日から８週間保存した。
【００２３】
（発光微生物固定化チップ又はシートの再活性化および発光測定）
一定期間冷蔵保存（２℃〜５℃、好ましくは４℃±１℃）した発光微生物固定化チップに対してＢＯＤ標準液を用いた発光測定を行うべく、発光微生物固定化チップの再活性化を行った。先ず、発光微生物固定化チップをシャーレから取り出し、カバーガラスを付けたままブロックヒータ（ＴＡＩＴＥＣ，ＣＴＵ−Ｎ）の加熱部位にセットした。然る後、１３℃で２０分間、発光微生物固定化チップをインキュベートして発光微生物を再活性化した。再活性化後、別の同形アクリル板を用いてカバーガラス、寒天ゲルを擦り切るようにして除去した。
【００２４】
その後、予め酸素バブリングを２分間行っておいたＢＯＤ標準溶液（０，８，１６ｐｐｍ）を発光微生物固定化チップにおける微小ホールに１滴ずつ滴下し、図１に示す簡易測定システムを用いて発光の測定を行った（測定条件：ＩＳＯ１６００、露光時間２分間）。撮影したデータをパソコンに転送し、画像解析ソフトウエアScion Image を用いて発光強度を数値化した。
【００２５】
発光微生物固定化チップからの発光の測定を、９×９に配列（アレイ）された微小ホールの任意の１列（３ホール）に同一ＢＯＤ標準溶液を滴下して、この３ホールから得られた３つの発光データの平均値、標準偏差を求める手順で行った。また、発光微生物固定化チップにおけるロット間誤差を考慮するときは、別の発光微生物固定化チップから得られた３つのデータを加えた６つのデータから最大値と最小値を除いた４つのデータの平均値、標準偏差を求めた。
【００２６】
これらの結果から、再活性化時間については、１０分間から本発明の測定方法を用いて検出でき、２０分間で発光が最大となった。２５分間でも２０分間と同等の発光が得られた。従って、再活性化（インキュベート）時間は、好ましくは２０分間以上である。また、発光微生物固定化チップの冷蔵保存温度を常温（２５℃）、冷凍（−２０℃）、極低温（−８０℃）として２４時間保存した結果、どのような再活性化を行っても図１に示す簡易測定システムを用いての生物発光測定はできなかった。
【００２７】
一方、発光微生物固定化チップの冷蔵保存温度を４℃（最適条件）として、再活性化温度を４℃、２５℃、３７℃（時間：各１０分間〜２５分間）として微生物発光を測定した処、微生物発光が極端に遅くなったり、ＢＯＤ標準濃度に依存しない発光が検出されるかまたは、微弱発光しか得られずまた発光が安定せずに直ぐ消光してしまった。而して、本発明においては、発光微生物の再活性化温度は１３℃±５℃である。
【００２８】
（最適発光微生物の探索）
これまでの実験は、発光微生物として発光細菌Photobacterium phosphoreum ＩＦＯ１３８９６株を用いて行った。この発光微生物によってＢＯＤの簡易測定を行う場合、図２に示すように、発光が微弱でありＢＯＤ標準溶液滴下後約４０分間で濃度間の発光差が認められなくなった。また、発光強度とＢＯＤ濃度間の有意差の不足、対応濃度レンジが狭いなどの問題もある。そこで、発明者らは発光細菌Photobacterium phosphoreum ＩＦＯ１３８９６株に代わる長期保存に適した発光微生物を探索することにした。
【００２９】
（海洋魚貝類サンプルからの発光細菌のスクリーニング）
海洋由魚貝類、海水を採取し、実験に用いた。これらを接種試料として目的発光微生物のスクリーニング操作を行った。海洋魚類として、メバル（Sebastes inermis ）、アジ(Trachurus japonicus )、サバ（Scomber japonicus ）、カサゴ（Sebasticus marmoratus ）、クサフグ（Takifugu niphobles）、マダイ（Pagrus major）、キス（Sillago japonica）、キュウセン（Halichoeres poecilopterus）、ホシササノハベラ（Pseudolabrus sieboldii）、クジメ（Hexagrammos agrammus）、アナゴ（Conger myriaster）の合計１１種類の魚類を採取、収集した。また、海洋貝類として、タマキビ（Littorina brevicula）、オオクサズリガイ（Rhyssoplax komaiana）を採取、収集した。加えて、広島県呉市倉橋町鹿老渡の海岸から採取した海水、泥質を実験に供した。
【００３０】
目的微生物の分離培地として、一般的な海洋発光細菌の増殖培地である、表１に示すＡＴＣＣculture medium Ｎｏ．１１６３を用いた。収集した生物試料を分離培地に接種するために、海洋魚貝類の体表、エラ、食道に付着している粘液、内臓の内容物を、オートクレーブ処理（１２０℃、２ａｔｍ、１５分間）した滅菌綿棒を用いて表面を擦るようにして採取した。試料が付着した綿棒を、１０００μｌの分離培地が分注されたエッペンドルフチューブ内で懸濁し、付着物を分離培地溶液に混合した。これらの懸濁、混合液１００μｌを採取し、分離培地の寒天プレート（１．５％agar （ｗｔ／ｖｏｌ））上に塗布した。
【００３１】
その後、このプレートを２５℃で１日〜３日間静置培養し、形成されたコロニーからの発光を暗所で観察した。発光が確認されたコロニーに対して、プレート容器外部表面から油性マジックでマーキングしてプレート上のコロニーの位置を明確にした後、当該コロニーを白金耳で採取して寒天培地（１．５％agar （ｗｔ／ｖｏｌ））に線画した。この線画操作を５回〜６回繰り返し、目的菌株を純化した。なお、コロニー形成が極端に多いプレートについては、採取したコロニーを再度分離培地で１０倍〜１０００倍に希釈してから新しいプレートに植菌（１００μｌ）して、再度コロニーの形成を行った。その後、上記と同様の操作を行って単一株を獲得した。純化されたコロニー株に対して、２０ｍｌの分離培地を分注した５０ｍｌの三角フラスコで好気条件下に液体振盪培養（２５℃、１２０ｒｐｍ）を行い、培養液からの生物発光を観察した。その結果、段落００２９に記載した海洋魚類の体表、食道、内臓の内容物などから表２に示す５５株の発光細菌の純化株を獲得できた。
【００３２】
【表２】
【００３３】
（発光細菌分離株の選抜）
プレート法を用いた海洋試料から新たに分離された発光細菌株（５５株）について、発光能が高い株の選抜を行った。分離株は全て２０ｍｌの分離培地を分注した５０ｍｌの三角フラスコに植菌後、好気条件下に液体振盪培養（２５℃、１２０ｒｐｍ）を行った。この培養液について、植菌から１２時間後の発光の強さを目視で比較し、発光が強いものを選抜し発光微生物固定化チップに供する発光微生物の候補として以後の実験に用いた。
【００３４】
その結果、広島県呉市倉橋町付近の海から得られたアジ(Trachurus japonicus )体表由来のＡＴ−１株、福岡県福岡市西区唐泊港の海から得られたキュウセン（Halichoeres poecilopterus）内蔵由来のＫＮ−５株、広島県呉市倉橋町付近の海から得られたメバル（Sebastes inermis ）内蔵由来のＭＮ−２株の３株について、安定した生育と強い生物発光が観察された。この３株についてシリカゲルによる発光微生物固定化チップを作製することにした。
【００３５】
（選抜菌株を用いた発光微生物固定化チップ又はシートの作製）
選抜された発光細菌（ＡＴ−１株、ＫＮ−５株、ＭＮ−２株）を表１に示す増殖培地に初期菌体濃度が１０６cells／ｍｌとなるように調節して植菌し、好気条件下に液体振盪培養（２５℃、１２０ｒｐｍ）を行った。最大発光条件に相当する対数増殖期後期にあたる、植菌から約１２時間後の培養液をエッペンドルフチューブに採取した。その後、遠心分離（ＴＯＭＹＭＸ−３０１、４℃、１５，０００ｒｐｍ、３分間）を行って菌体と培養液を分離した。上澄みを取り去った後、エッペンドルフチューブに培養液１．５ｍｌを加え、同様に遠心分離して上澄みを取り除いた（合計３ｍｌの培養液の菌体ペレットに相当）。このようにして作製した菌体ペレットに、炭素源を除いた表１に示す増殖培地を１．５ｍｌ加えて菌体を懸濁し、再度同様の遠心分離によって菌体を洗浄した。この洗浄操作を２度行い、エッペンドルフチューブ内に菌体ペレットを得た。
【００３６】
このペレットにシリカゲル２５μｇを加え、滅菌済みの木製スティック（爪楊枝）を用いて菌体をシリカゲルによく混合した。溶液が十分にゲル化したことを確認して、この混合ゲルをアクリル基板に穿孔した微小ホールに滅菌済みの木製スティック（爪楊枝）を用いて菌体を充填した。この発光微生物固定化チップに０．５％寒天ゲル溶液４００μｌを滴下し、微小ホールが全て寒天ゲルで覆われるようにした。次いで、その上からカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ ＧＬＡＳＳ，２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ０．１２ｍｍ〜０．１７ｍｍ）をチップ上のホールが全て覆われるように被せた。
【００３７】
（発光微生物固定化チップ又はシートの保存及び再活性化）
カバーガラスで覆われた発光微生物固定化チップを冷蔵条件（２℃〜５℃）で保存すべくプラスチックシャーレに入れ、パラフィンフィルムで周囲を巻いて７日間保存した。保存した発光微生物固定化チップをシャーレから取り出し、カバーガラスを付けたままブロックインキュベータ（ＨＡＩＴＥＣ，ＣＴＵ−Ｎ）にセットした。発光微生物固定化チップを１３℃、２０分間の条件でインキュベートして、発光細菌を再活性化した。
【００３８】
（微生物の発光及びその測定）
再活性化後、同形のアクリル板を用いてカバーガラスおよび寒天ゲルを擦り切るようにして除去した。次いで、予め酸素ガスで２分間バブリングしておいたＢＯＤ標準溶液（０，８，１６ｐｐｍ）を各微小ホールに１滴ずつ滴下し、図１に示す簡易測定システムを用いて発光の測定を行った（測定条件：ＩＳＯ１６００、露光時間２分間）。撮影したデータをフラッシュメモリーデバイスなどによってノート型パソコンに転送し、画像解析ソフトウエアScion Image を用いて数値化した。
【００３９】
その結果、ＡＴ−１株、ＫＮ−５株、ＭＮ−２株の発光微生物固定化チップ全てにおいて、発光が観察された。ＡＴ−１株、ＭＮ−２株の発光微生物固定化チップについて、再活性化後ＢＯＤ標準液を滴下してからの発光強度の経時変化を観察した処、図３に示すように、滴下後約１５分間から２０分間で発光微生物固定化チップからの発光が最大に達し、以後、ほぼ一定化しながら徐々に減衰していくことが確認できた。また、その最大値は、図３に示すように、１６ｐｐｍのＢＯＤ標準液を滴下した場合、グレースケール値にして約７５であり、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間の濃度に対する発光レンジはグレースケール値にして約４５から３０であった。
【００４０】
ＫＮ−５株においても、前記２株と同様に、ＢＯＤ標準液の滴下後から発光強度の上昇が観察され約１０分間で最大に達し、その後一定化して徐々に消光していった。発光強度の最大値は、１６ｐｐｍのＢＯＤ標準液を滴下した場合、図４に示すように、グレースケール値にして約１２５に達し、他の２株に比し強い生物発光が認められた。
【００４１】
しかしながら、ＫＮ−５株において、ＢＯＤ０ｐｐｍでの発光量が多いこと、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間の濃度に対する発光レンジがグレースケール値にして約２５〜３０であり、測定レンジが狭いという問題が判明した。
【００４２】
一方、上記と同条件で作製した発光微生物固定化チップを２，３，４，８週間、冷蔵条件４℃で保存し、上記と同条件で再活性化してＢＯＤ標準溶液を用いた発光を行うとともにその測定を行って、３株の長期間保存について検討した。なお、ＢＯＤ標準液滴下後の発光微生物固定化チップからの発光の経時変化の観察を、５分間隔でＢＯＤ標準溶液滴下後４０分間の発光を測定し、各測定点についてＩＳＯ１６００、露光時間２分間の条件で発光微生物固定化チップからの発光を撮影した。その結果、ＫＮ−５株において、２，３，４，８週間の保存後においても、図５および図６に示すように、発光を観察できた。ＡＴ−１株、ＭＮ−２株においては、２週間〜８週間保存した発光微生物固定化チップからの発光は認められなかった。
【００４３】
（レスティング法で処理した発光細菌を用いた発光微生物固定化チップ又はシートの作製）
ＫＮ−５株において、ＢＯＤ０ｐｐｍでの発光量が多いこと、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間の濃度に対する発光レンジがグレースケール値にして約２５〜３０であり、測定レンジが狭いという問題が判明した。そこで発明者らは、有機物を含まない（０ｐｐｍ）条件での微生物発光の抑制、発光強度と各ＢＯＤ濃度間の有意差の拡大、濃度レンジの拡大を目的として、有機物質を含まない培地溶液で一定時間、菌体をインキュベートするレスティング処理を発光微生物固定化に供する菌体に施した。最終選抜菌株を段落００３３において述べた条件で培養、遠心分離による集菌、洗浄を行い、次いでレスティング処理を行った。処理後、段落００３４において述べた操作で菌体をシリカゲルで発光微生物固定化チップに固定化した。
【００４４】
この発光微生物固定化チップを４℃で７日間保存し、その発光を観察した。その結果、図７に示すように、レスティング処理を行う時間が長いほど、ＢＯＤ０ｐｐｍでの発光を抑制できることが判明した。また、ＢＯＤ濃度間に対する発光レンジが拡がり、濃度に対する発光対応範囲を拡大できる効果を確認できた。レスティング処理を施さなかった場合に比し、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間の濃度に対する発光レンジが１．５倍〜２．５倍に拡大した。一方、最大発光強度については、１，３，６時間のレスティング処理を施した発光微生物固定化チップに１６ｐｐｍのＢＯＤ標準液を滴下した場合、図７，図８に示すように、グレースケールにして１３０〜１４０の発光が安定して観察された。レスティング処理後の発光微生物固定化チップからの生物発光は、試料滴下後すぐに上昇し、約１０分間から１５分間で飽和に達し、その後、安定してゆっくり減衰していく。これらのことから、発光が安定する試料液滴下後２０分間の発光値をＢＯＤ測定に用いることが好ましい。
【００４５】
次に、最適レスティング処理時間については、１２時間のレスティング処理を施した発光微生物固定化チップにおいて、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間のＢＯＤ濃度に対する発光レンジが、レスティング処理を施さない場合に比し約２．５倍に拡大していた。また、試料液滴下後２０分間の場合、図４および図８に示すように、グレースケール値にしてその幅は２０（レスティング処理を施さない場合）から６５にまで拡大していた。また、測定誤差も縮小した。これらの結果から、レスティング処理時間は１２時間が最も好ましいと考えられる。
【００４６】
菌体に対するレスティング処理は、遠心分離による集菌、遠心分離による洗浄後の菌体ペレットに対して、炭素源を除いた培地溶液１．５ｍｌを添加して懸濁し、有機物質を含まない２０ｍｌの培地溶液が分注された５０ｍｌ三角フラスコに接種する処理である。この菌体溶液を、有機物質を含まない状態下に種々の時間（１，３，６，１２時間）好気条件の下での振盪（２５℃、１２０ｒｐｍ）によってインキュベートして、遠心分離（４℃、１５，０００ｒｐｍ）による集菌後菌体をシリカゲルで発光微生物固定化チップに固定化した。
【００４７】
（発光微生物固定化チップ又はシートの保存および発光の測定）
１２時間のレスティング処理を施した発光微生物固定化チップを１日〜７日間、４℃で保存し、経過１日毎の生物発光の変化を観察して発光微生物固定化チップの安定性を調べた。その際、発光微生物の再活性化条件は、これまでに述べたと同様の条件である。その結果、保存日数７日間を通して安定な生物発光が観察された。また、発光強度とＢＯＤ濃度の相関性を確認でき、図９乃至図１２に示すように、ＢＯＤ濃度に対する発光レンジも測定に十分な範囲を確保できていることが明らかとなった。保存７日間を通して、グレースケール値にして４０〜６０の発光レンジが維持されていた。しかしながら、図９に示すように、発光強度の値は保存日数が増すにつれて低下する傾向が見られ、１６ｐｐｍのＢＯＤ標準液を滴下して２０分後の発光を比較すると、図９に示すように、１日間および２日間保存した発光微生物固定化チップからはグレースケール値にして約２４５の発光強度が確認されたが、図１０に示すように、３日目においてはグレースケール値にして約２３５、４日目においてはグレースケール値にして約１７５にまで低下した。さらに、図１２および図１３に示すように、５日目では１４５、６日目７日目では１２５にまで発光強度が低下した。
【００４８】
しかし、このとき、他のＢＯＤ濃度試料における発光微生物固定化チップの発光強度も同様のパターンで低下していく処から、何れの発光微生物固定化チップもＢＯＤ測定に適用し得る発光強度、ＢＯＤ濃度に対して十分な発光レンジを有していることが判明した。
【００４９】
このことは、保存日数の異なる発光微生物固定化チップに対しては異なる検量線が必要であることを意味している。発光微生物固定化チップにおける菌体の培養時間、発光微生物固定化材料、測定プロセスを一定化させることで保存時間が同じ発光微生物固定化チップにおけるチップロット間誤差は小さく、ＢＯＤの測定に支障を来さない。しかし、保存時間が異なる発光微生物固定化チップにおいては、ロット間誤差を無視できない。而して、実際のＢＯＤ測定に際しては、発光微生物固定化チップ保存開始時間を明記し、保存日数（時間）を明らかにして、保存日数（時間）毎に検量線を作成する。
【００５０】
（検量線の作成）
７日間保存した発光微生物固定化チップを用いて、ＢＯＤ測定用の検量線を作成した。ＢＯＤ標準溶液の濃度と生物発光との間に直線的な相関性を示す検量線が得られ、図１３に示すように、発光強度（Ｙ）に対してＢＯＤ濃度（Ｘ）とするとき、Ｙ＝３．０４０５Ｘ＋７７０７０９（Ｒ２＝０．９９９６）の相関式（近似式）が得られた。実際のＢＯＤ測定にあっては、この逆関数を用いた。
【００５１】
（実試料によるＢＯＤ測定および公定法（ＢＯＤ５）との比較）
実試料として、広島県三次市の馬洗川、広島県庄原市の国兼川、太刀洗川、はげら池から採取した水、および県立広島大学の排水処理場から原水、沈澱池の水、滅菌前の水、滅菌後の水を採取し、実験に供した。７日間保存した発光微生物固定化チップを用いて本発明の有機汚染測定方法によって、ラボ内で疑似オンサイト的にＢＯＤ測定を行い測定データを得た。このデータを図１３に示す検量線に当てはめ、ＢＯＤ値を求めた。一方、公定法（ＢＯＤ５）を用いて、同一試料のＢＯＤ測定を行った。
【００５２】
その結果、公定法（ＢＯＤ５）によって得られたＢＯＤ測定値は、表３に示すように、馬洗川：２．５３ｐｐｍ、国兼川：６．１３ｐｐｍ、太刀洗川：５．１７ｐｐｍ、はげら池：４．６７ｐｐｍであった。これに対し本発明の有機汚染測定方法によって得られたＢＯＤ測定値は、表３に示すように、馬洗川：３．４５±１．２５ｐｐｍ、国兼川：５．６１±０．９９ｐｐｍ、太刀洗川：４．８６±１．０１ｐｐｍ、はげら池：４．１３±０．６１ｐｐｍであった。両方法における誤差は、６％〜１３％であることが確認された。
【００５３】
【表３】
【００５４】
このように、河川や湖沼のように比較的汚染の程度が軽くＢＯＤ値が低い場所では、公定法とほぼ同等の測定結果であった。これに対して、県立広島大学の排水処理場の各排水処理段階における有機汚染の測定結果は、公定法（ＢＯＤ５）によって得られたＢＯＤ測定値は、表４に示すように、原水：４８７．１２ｐｐｍ、沈澱池：６２．６７ｐｐｍ、滅菌前の水：７．１３ｐｐｍ、滅菌後の水：６．５３ｐｐｍであった。これに対し本発明の有機汚染測定方法によって得られたＢＯＤ測定値は、表４に示すように、原水：３７８．２８±７０．１４ｐｐｍ、沈澱池：９０．３９ｐｐｍ、滅菌前の水：８．８７±１．８３ｐｐｍ、滅菌後の水：７．３３±１．６１ｐｐｍであった。
【００５５】
【表４】
【００５６】
このように、有機汚染が進んだ環境水の場合、両方法間のＢＯＤ値に差異がある。しかしながら、総じて両方法間の誤差は±３０％以内に止まり、極端な差異は認められなかった。また、表４に示すように、排水処理施設における各処理排水の汚染傾向の把握は可能であり、本発明による発光微生物固定化チップ又はシートを用いる有機汚染測定方法での実試料のＢＯＤ測定が可能であることが明らかとなった。
【００５７】
これまで述べてきた実施例によって、アクリル基板又はシート上に穿設した微小ホール又は凹凸構造に、有機物を除いた培養液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物、好ましくはアジ(Trachurus japonicus )体表由来のＡＴ−１株、福岡県福岡市西区唐泊港の海から得られたキュウセン（Halichoeres poecilopterus）内蔵由来のＫＮ−５株、広島県呉市倉橋町付近の海から得られたメバル（Sebastes inermis ）内蔵由来のＭＮ−２株の３株、さらに好ましくは、福岡県福岡市西区唐泊港の海から得られたキュウセン（Halichoeres poecilopterus）内蔵由来のＫＮ−５株にレスティング処理を施してシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ又はシートを用いて、これを２℃〜５℃の温度域で保存した後、ＢＯＤ測定に臨んで８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を発光微生物固定化チップ又はシートの微小ホール又は凹凸構造に滴下し、２０分間以内の発光量をたとえばデジタルカメラで撮影し、このデータをパソコンに転送し、たとえば画像解析ソフトウエアScion Image を用いて発光強度を数値化測定する本発明の実施形態が明らかとなった。
【００５８】
（発光細菌のキャラクタリゼーション）
本発明の実施例で用いた発光細菌ＫＮ−５株に対して、グラム染色（Hucker法）、アピテスト（日本ビオメリューＡＰＩ２０ＮＥ）を用いた簡易生化学同定試験を行った。先ず、グラム染色（Hucker法）では、培養液の１００μｌを９００μｌの滅菌蒸留水に懸濁し、希釈した菌体をスライドガラスに滴下後自然乾燥し、ガスバーナで軽く焙り固定化を行った。これにクリスタルバイオレット（溶液１）クリスタルバイオレット：１．０ｇ、９５％エタノール１０ｍｌ 溶液２）蓚酸アンモニウム：０．４ｇ、蒸留水：４０ｍｌ 使用時に溶液１）、２）を混合）で菌体塗布面を覆い、１分間放置した後、流水で流した。次いで、ルゴール溶液で塗布面を覆い、１分間放置し、流水で流した後、脱色液（９５％エタノールとアセトンを７：３の割合で混合）を用いて脱色を行った。その後、サフラニン液で塗布面を覆い、３０秒間放置後、流水で洗浄した。スライドガラスを自然乾燥した後、位相差顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ５０）を用いて確認を行い、紫に染まった場合は陰性と判断した。また、コントロールとして、グラム陽性菌に納豆菌（Bacillus subtilis ）、グラム陰性菌に大腸菌（Ecsherichia coli）を用いた。
【００５９】
また、市販の簡易生化学同定キットであるアピテスト（日本ビオメリューＡＰＩ２０ＮＥ）による発光細菌ＫＮ−５の株簡易生化学同定試験を行った。培養菌液を遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間）による集菌後、菌体ペレットにオートクレーブ処理（１２０℃、２ａｔｍ、１０分間）を施し、滅菌済み生理食塩水４．０ｍｌを添加して菌体懸濁液を作製した。このストリップを３０℃のインキュベータ内で４８時間反応させ、判定を読み取った。また、プロファイルインデックスから菌体の同定について検討した。
【００６０】
（発光細菌ＫＮ−５株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく系統分類）
発光細菌ＫＮ−５株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく系統分類を行うために、発光細菌ＫＮ−５株からゲノムＤＮＡの抽出を行った。先ず、培養菌液１ｍｌをエッペンドルフチューブに採取し、遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、２５℃、１８，０００ｒｐｍ、３分間）を行って、上澄みを除き、菌体ペレットに５５７μｌのＴＥバッファーを加えて懸濁した。この懸濁液に３０μｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液、３μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫを加え、数回アジテーションを行って混合した後、３７℃で１時間インキュベート（ＴＡＩＴＥＣ ＣＴＵ−Ｎ）した。１時間後、１００μｌの５ＭＮａＣｌ溶液、８０μｌのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えよく懸濁した後、６５℃で１０分間インキュベートした。１０分後、７５０μｌのＣｌ（クロロホルム：イソアミルアルコール＝１：１）を加えてよく懸濁し、遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、２５℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間）を行った。
【００６１】
得られた上澄みを新しいエッペンドルフチューブに移し、そこに７００μｌのＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加えて懸濁し、再度遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、２５℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間）を行った。その後、上澄みをエッペンドルフチューブに移し、４５０μｌのイソプロパノールを加え、数回アジテーションを行った。然る後、室温で１５分間放置した後、遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、４℃、１４，０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。上澄みを除き７０％エタノール１ｍｌを加え、再度遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、４℃、１４，０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。
【００６２】
遠心分離後上澄みを除き、エッペンドルフチューブのまま水流式真空デシケータで乾燥し、５０μｌのＴＥバッファーに速やかに溶解し、４℃で保存した。さらに、抽出したゲノムＤＮＡに対してＲＮａｓｅ処理を行った。処理後、ＴＥバッファーに溶解し、アガロース電気泳動（１００Ｖ、８０分間、１％Agarose ＭＥ）で抽出ゲノムＤＮＡの有無、分子量の確認を行うとともに、２６０ｎｍの吸光℃を測定してゲノムＤＮＡの濃度決定を行った。
【００６３】
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列のシーケンスは以下の手順で行った。抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プログラムインキュベータ（Applied Biosystems GeneAmp ＰＣＲ Systems ２７００）を用いてＰＣＲ反応を生ぜしめ、１６ＳｒＤＮＡをコードするＤＮＡ塩基配列を増幅した。このとき、目的遺伝子の増幅のためのプライマーとして、大腸菌１６ＳｒＤＮＡのポジション８−２７に相当する５‘ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’および１５２５−１５４３に相当する５‘ＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’がデザインされ、ＰＣＲ反応に利用された。その後、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動（１００Ｖ、８０分間、１％Agarose ＭＥ）によって検出、確認した。
【００６４】
約１５００ｂｐである１６ＳｒＤＮＡ領域の増幅が確認された試料をＳＵＰＲＥＣＴＭ−ＰＣＲ（ＴａＫａＲａ社）により精製後、Big DyeＴＭTerminator ｖ１．１Cycle Sequencing Kit （Applied Biosystems ）を用いてサイクルシーケンス反応を生ぜしめた。サイクルシーケンス済みのサンプルをエタノール／ＥＤＴＡ／酢酸ナトリウム法で精製した後、２５μｌのHi-Di Formamide に溶解し、ＡＢＩ Prism ３１０ Genetic Analyzer (Applied Biosystems 社製)を用いてダイターミネータ法に基づくシーケンスを行った。
【００６５】
増幅遺伝子全体のシーケンスを行うために、必要に応じて２０mer程度の内部プライマーを合成し、同様の工程でＡＢＩ Prism ３１０ Genetic Analyzer (Applied Biosystems 社製)を用いてダイターミネータ法に基づくシーケンスを行った。また、遺伝子領域については、ＦＡＳＴＡなどの遺伝子データベースへの照会、ＤＮＡＳＩＳ Pro Version ０２−０７(Hitachi)などの解析ソフトウエアを用いた解析によって近縁種との相同生を探索、調査を行った。その結果、海洋微生物であるPhotobacterium 属 の発光微生物と高い相同性が確認された。特に、発光細菌Photobacterium phosphoreum と９９％以上の相同性が明らかとなった。また、ＩＦＯ１３８９６株との間には９９．７０１％の相同性が見られ、ＫＮ−５株は、発光細菌Photobacterium phosphoreum を構成する株の１つではないかと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の一実施例に係るオンサイト対応方ＢＯＤ簡易測定システムを示す模式図
【図２】本発明の一実施例に係るシリカゲル、寒天ゲルで発光微生物を固定した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を示すグラフ
【図３】本発明の一実施例に係るＡＴ−１株、ＭＮ−２株をシリカゲルで固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を示すグラフ
【図４】本発明の一実施例に係るＫＮ−５株をシリカゲルで固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を示すグラフ
【図５】本発明の一実施例に係るＫＮ−５株をシリカゲルで固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存期間（１４日間、２１日間）をパラメータとして示すグラフ
【図６】本発明の一実施例に係るＫＮ−５株をシリカゲルで固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存期間（２８日間、５６日間）をパラメータとして示すグラフ
【図７】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化をレスティング処理時間（１時間、３時間）をパラメータとして示すグラフ
【図８】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化をレスティング処理時間（６時間、１２時間）をパラメータとして示すグラフ
【図９】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存時間（１２時間、４８時間）をパラメータとして示すグラフ
【図１０】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存時間（７２時間、９６時間）をパラメータとして示すグラフ
【図１１】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存時間（１２０時間、１４４時間）をパラメータとして示すグラフ
【図１２】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートを１６８時間保存したときの発光強度変化を示すグラフ
【図１３】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって１２時間処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートを１６８時間保存したものを用いて作成された検量線を示すグラフ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光微生物によって水中の生物資化性有機汚染を測定するための発光微生物固定化チップ及びそれを用いる有機汚染、環境測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境汚染の大きな部分として、河川、湖沼、海洋の水質汚染がある。これらの汚染の問題を解決する手段として、物理的な直接除去や化学物質を用いる処理、微生物を用いる浄化処理などがある。これらの浄化処理を行うために、水質汚染の状況を正確かつ簡便に把握する手段が必要となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
水質汚染状況を把握する手段として、クロマトグラフィーやマススペクトログラフィー、分光分析などがある。これらの手段は低濃度の有機成分を高い精度で測定できるけれども、多検体、多項目の検出が難しくまた、分析機器が高価でありさらに、オンサイトでの測定が困難である問題がある。
【０００４】
一方、水の有機汚染測定の公定法として、ＣＯＤ（Chemical Oxygen Demand：化学的酸素要求量）、ＴＯＣ（Total Organic Carbon：全有機炭素量）、ＢＯＤ（Biochemical Oxygen Demand：生物化学的酸素要求量）を測定する方法がある。ＣＯＤは、水中の還元性有機物を一定の酸化条件で反応させ、それに要する酸化剤の量を当量酸素量（Ｏ２ｍｇ／ｄｍ３）に換算して表すものである。通常、酸化剤として過マンガン酸カリウムを、酸化条件としては酸性、１００℃、３０分間の値を用いる。しかしながら、水中の還元性有機物が酸化される速度が、酸化剤や還元性有機物の種類や濃度、反応温度、ｐＨによって差がでることが多い。また、再現性を得るためには、反応初期および反応終了時の酸化剤の濃度、反応温度、反応時間などの測定条件を一定化する必要がある。
【０００５】
ＴＯＣは、被検水中に含まれる有機物の全てを燃焼により酸化させ、主要構成成分である炭素の量で示したものであり、有機物中の炭素の燃焼によって生じた二酸化炭素を赤外吸収法によって定量する方法が一般的である。しかし、この方法によるときは装置が大型かつ高価であり、同時、多試料分析には向いていない。
【０００６】
ＢＯＤは生物化学的酸素消費量または生化学的酸素要求量ともいわれ、水質汚染の指標の１つである。好気性微生物が好気的条件下で一定時間内に水中の有機物を分解するのに消費する溶存酸素量のことであり、排水や河川の水中の生物分解性有機物の量に対応する。水を密閉容器に入れ必要ならば微生物群を添加した後、通常、２０℃で５日間保存してその間の溶存酸素の減少量を測り、これをＯ２ｍｇ／ｄｍ３で表しＢＯＤ５とする。しかしながら、この方法は５日間と長時間を要するため、環境水域の水質や工場廃水或いは水処理施設のような流動的な状況下での管理指標として用いるのは困難である。
【０００７】
そこで、幅広い炭素源に対する資化能を有する微生物（Trichosporon cutaneum
ＩＦＯ１０４６６ ）と酸素電極を用いて溶存酸素量の測定を行うＢＯＤＳ法が開発された。ＢＯＤＳ法はＢＯＤ５法に比し迅速な測定が可能であり、試料水を添加した溶液に微生物固定化膜を装着した酸素電極を入れ、電流変化を読み取るだけでＢＯＤの測定を行える。しかしながら、酸素電極に装着する微生物の固定化方法や固定化した微生物の活性化に高い技術を必要とし、多試料分析やオンサイトでの測定が困難である。
【０００８】
これら従来技術における問題を解決すべく、発明者らの１人は、微生物発光によって水中の生物資化性有機汚染を測定するチップ有機汚染計測システムを提案した（特許文献１参照）。しかしながら、この技術においては、ＢＯＤ測定に耐え得るチップ又はシートの保存期間は４日間であり、４日間以内にあってもチップからの発光は５分間程度で完全に消滅する。また、発光を測定するために化学発光測定装置（ケミイメージャー）を必要とし、この装置で発光を測定、積分する必要があった。而して、オンサイトでの測定にあっては、微生物株、微生物固定化素材、保存期間、チップ又はシートからの発光強度、発光計測装置の諸点で解決すべき課題があった。
【特許文献１】特開２００４−０９３１９６号公報
【０００９】
本発明は、発光微生物アレイ化チップ又はシートを用いて、簡便にオンサイトでＢＯＤを測定することができる発光微生物固定化チップ又はシート及びそれを用いる河川、湖沼、海洋、排水における有機汚染及び環境測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための請求項１に記載の発明は、基板又はシート上に微小ホール又は凹凸構造を複数箇穿設するとともに、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ又はシートである。
【００１１】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発光微生物固定化チップ又はシートを２℃〜５℃の温度域で保存した後、ＢＯＤ測定に臨んで８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を前記発光微生物固定化チップ又はシート上の微小ホール又は凹凸構造に滴下し、２０分間以内の発光量を測定するようにしたことを特徴とする発光微生物固定化チップ又はシートによる有機汚染及び環境測定方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、極微量（約１０μｌ）の試料から容易かつ試料採取、発光微生物の再活性化処理、インキュベート、データ処理時間を合わせて約１時間以内という迅速さで、多試料のＢＯＤ測定ができる。本発明の発光微生物固定化チップ又はシートを用いる簡易測定システムによって、オンサイトでのハイスループットなＢＯＤ測定が可能となった。
【００１３】
また、本発明によるときはきわめて短時間内に測定が可能である処から、藻類の影響を受けることなく海水のＢＯＤ測定を正確に行うことができる。さらに、止水域でのＢＯＤ測定が可能である。一方、発光が減少若しくは阻害されることを検出して毒物の検出ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、基板とはシートを包含するものである。従って、発光微生物固定化チップは発光微生物固定化シートを含む。
本発明は、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルによって基板上の微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ又はシートを得ることならびに、この発光微生物固定化チップ又はシートを２℃〜５℃の温度域で保存した後、ＢＯＤ測定に臨んで８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、試料液を発光微生物固定化チップ又はシートの微小ホール又は凹凸構造に滴下し２０分間以内の発光量を測定することからなる。
以下、本発明をその好ましい実施形態に則して詳細に説明する。
【実施例】
【００１５】
（基板又はシート上への微小ホール又は凹凸構造穿設）
アクリル基板（３ｃｍ×７ｃｍ×０．２ｃｍ厚さ）上に、直径：１０００μｍ、深さ：１０００μｍ、各ホール間：５ｍｍの微小ホールを９箇穿設した。これら微小ホールに発光微生物の包理・固定化を行った。
【００１６】
（基板又はシート上の微小ホール又は凹凸構造への発光微生物の包理・固定化）
先ず、発光微生物として発光細菌Photobacterium phosphoreum ＩＦＯ１３８９６株を用いた。この発光細菌を初発菌体濃度が１０６cells／ｍｌとなるように調節して培養した。培養には、一般的な発光菌培養地である、表１に示すＡＴＣＣculture medium Ｎｏ．１１６３を用い、振盪条件：２５℃、１２０ｒｐｍで培養を行った。また、実験に使用する発光細菌は、培養令を一定化させ発光強度が最大となるよう、対数増殖後期にあたる植菌後約１５時間後の液体培地を採取して使用した。
【００１７】
一方、各濃度のＢＯＤ標準溶液を作製した。表１に示すＡＴＣＣculture medium Ｎｏ．１１６３から炭素源であるPeptone, Yeast extract を除いた培地にグルコース、グルタミン酸をそれぞれ１５０ｍｇ／ｌの濃度で添加し、ｐＨ７．４に調整後、オートクレーブ処理（１２０℃、２ａｔｍ、１０分間）によって滅菌した。得られた溶液のＢＯＤ値を２２０ｐｐｍとした。この濃度を基準として、炭素源を除いた増殖培地を加え希釈することによって各濃度のＢＯＤ標準溶液を作製した。また、標準液として用いる際には、各濃度のＢＯＤ標準溶液をそれぞれ乾熱滅菌処理（１５０℃、３０分間）を行った２０ｍｌバイアル瓶に１０ｍｌずつ分注し、ブチル瓶とアルミシールを用いて密栓後、酸素ガスによるバブリング処理を２分間行った。こうして調整されたＢＯＤ標準溶液を、検量線の作成などに使用した。
【００１８】
【表１】
【００１９】
発明者らは、特開２００４−０９３１９６号にて開示したアルギン酸ナトリウムに代わる発光細菌固定化担体を検討すべく、無機系固定化担体であるシリカゲルを発光細菌固定化担体として検討した。固定化剤として、発光細菌の増殖培地である表１に示すＡＴＣＣculture medium Ｎｏ．１１６３から炭素源であるPeptone, Yeast extract を除いた溶液（固定化溶液）１０ｍｌに１Ｎ塩酸溶液２．９ｍｌとコロイダルシリカ４０ｍｌを添加した後、ドライオーブンで乾燥（５０℃、２４時間）し粉末状としたものを発光菌体固定化用シリカゲルとして用いることとした。シリカゲルは乾燥に強く、無機担体であるため劣化や分解の少ない材料である。また、微生物の保存という観点からも、発光遺伝子組み換え大腸菌（Escherichia coli ）をシリカゲルによって固定化したところ約２ヶ月の保存ができた実例もある。
【００２０】
また、菌体包理用シリカゲルを発光微生物固定化チップに固定化した後、固定化担体に対する保温、固定化菌体の安定化のために寒天ゲルを利用した。固定化溶液１００ｍｌに０．５ｇの細菌培養用寒天（Wako：０１０−０８７２５）を溶かし０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天溶液を作製した。シリカゲルと、この寒天溶液を用いて発光細菌保存用チップを作製した。
【００２１】
培養令を調節した発光細菌の培養液を遠心分離して菌体ペレットを作製した。このペレットを洗浄し上澄みを除いて固定化用のシリカゲル２５μｇを加え、滅菌済み木製スティック（爪楊枝）を用いて発光菌体と混合した。溶液が十分ゲル化したことを確認して、この混合ゲルをアクリルチップ上の微小ホールに木製スティック（爪楊枝）を用いて充填した。発光菌体混合シリカゲルを固定化した発光微生物固定化チップに対して、上記０．５％寒天ゲル４００μｌを各微小ホールが覆われるように滴下した。滴下後、直ちにその上からカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ ＧＬＡＳＳ，２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ０．１２ｍｍ〜０．１７ｍｍ）をチップ上のホールが全て覆われるように被せた。
【００２２】
（発光微生物固定化チップ又はシートの保存）
カバーガラスで被覆された発光微生物固定化チップを冷蔵保存（２℃〜５℃）すべくプラスチックシャーレに入れ、パラフィンフィルムで周囲を密閉して冷蔵庫（４℃）で１日から８週間保存した。
【００２３】
（発光微生物固定化チップ又はシートの再活性化および発光測定）
一定期間冷蔵保存（２℃〜５℃、好ましくは４℃±１℃）した発光微生物固定化チップに対してＢＯＤ標準液を用いた発光測定を行うべく、発光微生物固定化チップの再活性化を行った。先ず、発光微生物固定化チップをシャーレから取り出し、カバーガラスを付けたままブロックヒータ（ＴＡＩＴＥＣ，ＣＴＵ−Ｎ）の加熱部位にセットした。然る後、１３℃で２０分間、発光微生物固定化チップをインキュベートして発光微生物を再活性化した。再活性化後、別の同形アクリル板を用いてカバーガラス、寒天ゲルを擦り切るようにして除去した。
【００２４】
その後、予め酸素バブリングを２分間行っておいたＢＯＤ標準溶液（０，８，１６ｐｐｍ）を発光微生物固定化チップにおける微小ホールに１滴ずつ滴下し、図１に示す簡易測定システムを用いて発光の測定を行った（測定条件：ＩＳＯ１６００、露光時間２分間）。撮影したデータをパソコンに転送し、画像解析ソフトウエアScion Image を用いて発光強度を数値化した。
【００２５】
発光微生物固定化チップからの発光の測定を、９×９に配列（アレイ）された微小ホールの任意の１列（３ホール）に同一ＢＯＤ標準溶液を滴下して、この３ホールから得られた３つの発光データの平均値、標準偏差を求める手順で行った。また、発光微生物固定化チップにおけるロット間誤差を考慮するときは、別の発光微生物固定化チップから得られた３つのデータを加えた６つのデータから最大値と最小値を除いた４つのデータの平均値、標準偏差を求めた。
【００２６】
これらの結果から、再活性化時間については、１０分間から本発明の測定方法を用いて検出でき、２０分間で発光が最大となった。２５分間でも２０分間と同等の発光が得られた。従って、再活性化（インキュベート）時間は、好ましくは２０分間以上である。また、発光微生物固定化チップの冷蔵保存温度を常温（２５℃）、冷凍（−２０℃）、極低温（−８０℃）として２４時間保存した結果、どのような再活性化を行っても図１に示す簡易測定システムを用いての生物発光測定はできなかった。
【００２７】
一方、発光微生物固定化チップの冷蔵保存温度を４℃（最適条件）として、再活性化温度を４℃、２５℃、３７℃（時間：各１０分間〜２５分間）として微生物発光を測定した処、微生物発光が極端に遅くなったり、ＢＯＤ標準濃度に依存しない発光が検出されるかまたは、微弱発光しか得られずまた発光が安定せずに直ぐ消光してしまった。而して、本発明においては、発光微生物の再活性化温度は１３℃±５℃である。
【００２８】
（最適発光微生物の探索）
これまでの実験は、発光微生物として発光細菌Photobacterium phosphoreum ＩＦＯ１３８９６株を用いて行った。この発光微生物によってＢＯＤの簡易測定を行う場合、図２に示すように、発光が微弱でありＢＯＤ標準溶液滴下後約４０分間で濃度間の発光差が認められなくなった。また、発光強度とＢＯＤ濃度間の有意差の不足、対応濃度レンジが狭いなどの問題もある。そこで、発明者らは発光細菌Photobacterium phosphoreum ＩＦＯ１３８９６株に代わる長期保存に適した発光微生物を探索することにした。
【００２９】
（海洋魚貝類サンプルからの発光細菌のスクリーニング）
海洋由魚貝類、海水を採取し、実験に用いた。これらを接種試料として目的発光微生物のスクリーニング操作を行った。海洋魚類として、メバル（Sebastes inermis ）、アジ(Trachurus japonicus )、サバ（Scomber japonicus ）、カサゴ（Sebasticus marmoratus ）、クサフグ（Takifugu niphobles）、マダイ（Pagrus major）、キス（Sillago japonica）、キュウセン（Halichoeres poecilopterus）、ホシササノハベラ（Pseudolabrus sieboldii）、クジメ（Hexagrammos agrammus）、アナゴ（Conger myriaster）の合計１１種類の魚類を採取、収集した。また、海洋貝類として、タマキビ（Littorina brevicula）、オオクサズリガイ（Rhyssoplax komaiana）を採取、収集した。加えて、広島県呉市倉橋町鹿老渡の海岸から採取した海水、泥質を実験に供した。
【００３０】
目的微生物の分離培地として、一般的な海洋発光細菌の増殖培地である、表１に示すＡＴＣＣculture medium Ｎｏ．１１６３を用いた。収集した生物試料を分離培地に接種するために、海洋魚貝類の体表、エラ、食道に付着している粘液、内臓の内容物を、オートクレーブ処理（１２０℃、２ａｔｍ、１５分間）した滅菌綿棒を用いて表面を擦るようにして採取した。試料が付着した綿棒を、１０００μｌの分離培地が分注されたエッペンドルフチューブ内で懸濁し、付着物を分離培地溶液に混合した。これらの懸濁、混合液１００μｌを採取し、分離培地の寒天プレート（１．５％agar （ｗｔ／ｖｏｌ））上に塗布した。
【００３１】
その後、このプレートを２５℃で１日〜３日間静置培養し、形成されたコロニーからの発光を暗所で観察した。発光が確認されたコロニーに対して、プレート容器外部表面から油性マジックでマーキングしてプレート上のコロニーの位置を明確にした後、当該コロニーを白金耳で採取して寒天培地（１．５％agar （ｗｔ／ｖｏｌ））に線画した。この線画操作を５回〜６回繰り返し、目的菌株を純化した。なお、コロニー形成が極端に多いプレートについては、採取したコロニーを再度分離培地で１０倍〜１０００倍に希釈してから新しいプレートに植菌（１００μｌ）して、再度コロニーの形成を行った。その後、上記と同様の操作を行って単一株を獲得した。純化されたコロニー株に対して、２０ｍｌの分離培地を分注した５０ｍｌの三角フラスコで好気条件下に液体振盪培養（２５℃、１２０ｒｐｍ）を行い、培養液からの生物発光を観察した。その結果、段落００２９に記載した海洋魚類の体表、食道、内臓の内容物などから表２に示す５５株の発光細菌の純化株を獲得できた。
【００３２】
【表２】
【００３３】
（発光細菌分離株の選抜）
プレート法を用いた海洋試料から新たに分離された発光細菌株（５５株）について、発光能が高い株の選抜を行った。分離株は全て２０ｍｌの分離培地を分注した５０ｍｌの三角フラスコに植菌後、好気条件下に液体振盪培養（２５℃、１２０ｒｐｍ）を行った。この培養液について、植菌から１２時間後の発光の強さを目視で比較し、発光が強いものを選抜し発光微生物固定化チップに供する発光微生物の候補として以後の実験に用いた。
【００３４】
その結果、広島県呉市倉橋町付近の海から得られたアジ(Trachurus japonicus )体表由来のＡＴ−１株、福岡県福岡市西区唐泊港の海から得られたキュウセン（Halichoeres poecilopterus）内蔵由来のＫＮ−５株、広島県呉市倉橋町付近の海から得られたメバル（Sebastes inermis ）内蔵由来のＭＮ−２株の３株について、安定した生育と強い生物発光が観察された。この３株についてシリカゲルによる発光微生物固定化チップを作製することにした。
【００３５】
（選抜菌株を用いた発光微生物固定化チップ又はシートの作製）
選抜された発光細菌（ＡＴ−１株、ＫＮ−５株、ＭＮ−２株）を表１に示す増殖培地に初期菌体濃度が１０６cells／ｍｌとなるように調節して植菌し、好気条件下に液体振盪培養（２５℃、１２０ｒｐｍ）を行った。最大発光条件に相当する対数増殖期後期にあたる、植菌から約１２時間後の培養液をエッペンドルフチューブに採取した。その後、遠心分離（ＴＯＭＹＭＸ−３０１、４℃、１５，０００ｒｐｍ、３分間）を行って菌体と培養液を分離した。上澄みを取り去った後、エッペンドルフチューブに培養液１．５ｍｌを加え、同様に遠心分離して上澄みを取り除いた（合計３ｍｌの培養液の菌体ペレットに相当）。このようにして作製した菌体ペレットに、炭素源を除いた表１に示す増殖培地を１．５ｍｌ加えて菌体を懸濁し、再度同様の遠心分離によって菌体を洗浄した。この洗浄操作を２度行い、エッペンドルフチューブ内に菌体ペレットを得た。
【００３６】
このペレットにシリカゲル２５μｇを加え、滅菌済みの木製スティック（爪楊枝）を用いて菌体をシリカゲルによく混合した。溶液が十分にゲル化したことを確認して、この混合ゲルをアクリル基板に穿孔した微小ホールに滅菌済みの木製スティック（爪楊枝）を用いて菌体を充填した。この発光微生物固定化チップに０．５％寒天ゲル溶液４００μｌを滴下し、微小ホールが全て寒天ゲルで覆われるようにした。次いで、その上からカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ ＧＬＡＳＳ，２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ０．１２ｍｍ〜０．１７ｍｍ）をチップ上のホールが全て覆われるように被せた。
【００３７】
（発光微生物固定化チップ又はシートの保存及び再活性化）
カバーガラスで覆われた発光微生物固定化チップを冷蔵条件（２℃〜５℃）で保存すべくプラスチックシャーレに入れ、パラフィンフィルムで周囲を巻いて７日間保存した。保存した発光微生物固定化チップをシャーレから取り出し、カバーガラスを付けたままブロックインキュベータ（ＨＡＩＴＥＣ，ＣＴＵ−Ｎ）にセットした。発光微生物固定化チップを１３℃、２０分間の条件でインキュベートして、発光細菌を再活性化した。
【００３８】
（微生物の発光及びその測定）
再活性化後、同形のアクリル板を用いてカバーガラスおよび寒天ゲルを擦り切るようにして除去した。次いで、予め酸素ガスで２分間バブリングしておいたＢＯＤ標準溶液（０，８，１６ｐｐｍ）を各微小ホールに１滴ずつ滴下し、図１に示す簡易測定システムを用いて発光の測定を行った（測定条件：ＩＳＯ１６００、露光時間２分間）。撮影したデータをフラッシュメモリーデバイスなどによってノート型パソコンに転送し、画像解析ソフトウエアScion Image を用いて数値化した。
【００３９】
その結果、ＡＴ−１株、ＫＮ−５株、ＭＮ−２株の発光微生物固定化チップ全てにおいて、発光が観察された。ＡＴ−１株、ＭＮ−２株の発光微生物固定化チップについて、再活性化後ＢＯＤ標準液を滴下してからの発光強度の経時変化を観察した処、図３に示すように、滴下後約１５分間から２０分間で発光微生物固定化チップからの発光が最大に達し、以後、ほぼ一定化しながら徐々に減衰していくことが確認できた。また、その最大値は、図３に示すように、１６ｐｐｍのＢＯＤ標準液を滴下した場合、グレースケール値にして約７５であり、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間の濃度に対する発光レンジはグレースケール値にして約４５から３０であった。
【００４０】
ＫＮ−５株においても、前記２株と同様に、ＢＯＤ標準液の滴下後から発光強度の上昇が観察され約１０分間で最大に達し、その後一定化して徐々に消光していった。発光強度の最大値は、１６ｐｐｍのＢＯＤ標準液を滴下した場合、図４に示すように、グレースケール値にして約１２５に達し、他の２株に比し強い生物発光が認められた。
【００４１】
しかしながら、ＫＮ−５株において、ＢＯＤ０ｐｐｍでの発光量が多いこと、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間の濃度に対する発光レンジがグレースケール値にして約２５〜３０であり、測定レンジが狭いという問題が判明した。
【００４２】
一方、上記と同条件で作製した発光微生物固定化チップを２，３，４，８週間、冷蔵条件４℃で保存し、上記と同条件で再活性化してＢＯＤ標準溶液を用いた発光を行うとともにその測定を行って、３株の長期間保存について検討した。なお、ＢＯＤ標準液滴下後の発光微生物固定化チップからの発光の経時変化の観察を、５分間隔でＢＯＤ標準溶液滴下後４０分間の発光を測定し、各測定点についてＩＳＯ１６００、露光時間２分間の条件で発光微生物固定化チップからの発光を撮影した。その結果、ＫＮ−５株において、２，３，４，８週間の保存後においても、図５および図６に示すように、発光を観察できた。ＡＴ−１株、ＭＮ−２株においては、２週間〜８週間保存した発光微生物固定化チップからの発光は認められなかった。
【００４３】
（レスティング法で処理した発光細菌を用いた発光微生物固定化チップ又はシートの作製）
ＫＮ−５株において、ＢＯＤ０ｐｐｍでの発光量が多いこと、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間の濃度に対する発光レンジがグレースケール値にして約２５〜３０であり、測定レンジが狭いという問題が判明した。そこで発明者らは、有機物を含まない（０ｐｐｍ）条件での微生物発光の抑制、発光強度と各ＢＯＤ濃度間の有意差の拡大、濃度レンジの拡大を目的として、有機物質を含まない培地溶液で一定時間、菌体をインキュベートするレスティング処理を発光微生物固定化に供する菌体に施した。最終選抜菌株を段落００３３において述べた条件で培養、遠心分離による集菌、洗浄を行い、次いでレスティング処理を行った。処理後、段落００３４において述べた操作で菌体をシリカゲルで発光微生物固定化チップに固定化した。
【００４４】
この発光微生物固定化チップを４℃で７日間保存し、その発光を観察した。その結果、図７に示すように、レスティング処理を行う時間が長いほど、ＢＯＤ０ｐｐｍでの発光を抑制できることが判明した。また、ＢＯＤ濃度間に対する発光レンジが拡がり、濃度に対する発光対応範囲を拡大できる効果を確認できた。レスティング処理を施さなかった場合に比し、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間の濃度に対する発光レンジが１．５倍〜２．５倍に拡大した。一方、最大発光強度については、１，３，６時間のレスティング処理を施した発光微生物固定化チップに１６ｐｐｍのＢＯＤ標準液を滴下した場合、図７，図８に示すように、グレースケールにして１３０〜１４０の発光が安定して観察された。レスティング処理後の発光微生物固定化チップからの生物発光は、試料滴下後すぐに上昇し、約１０分間から１５分間で飽和に達し、その後、安定してゆっくり減衰していく。これらのことから、発光が安定する試料液滴下後２０分間の発光値をＢＯＤ測定に用いることが好ましい。
【００４５】
次に、最適レスティング処理時間については、１２時間のレスティング処理を施した発光微生物固定化チップにおいて、０ｐｐｍと１６ｐｐｍ間のＢＯＤ濃度に対する発光レンジが、レスティング処理を施さない場合に比し約２．５倍に拡大していた。また、試料液滴下後２０分間の場合、図４および図８に示すように、グレースケール値にしてその幅は２０（レスティング処理を施さない場合）から６５にまで拡大していた。また、測定誤差も縮小した。これらの結果から、レスティング処理時間は１２時間が最も好ましいと考えられる。
【００４６】
菌体に対するレスティング処理は、遠心分離による集菌、遠心分離による洗浄後の菌体ペレットに対して、炭素源を除いた培地溶液１．５ｍｌを添加して懸濁し、有機物質を含まない２０ｍｌの培地溶液が分注された５０ｍｌ三角フラスコに接種する処理である。この菌体溶液を、有機物質を含まない状態下に種々の時間（１，３，６，１２時間）好気条件の下での振盪（２５℃、１２０ｒｐｍ）によってインキュベートして、遠心分離（４℃、１５，０００ｒｐｍ）による集菌後菌体をシリカゲルで発光微生物固定化チップに固定化した。
【００４７】
（発光微生物固定化チップ又はシートの保存および発光の測定）
１２時間のレスティング処理を施した発光微生物固定化チップを１日〜７日間、４℃で保存し、経過１日毎の生物発光の変化を観察して発光微生物固定化チップの安定性を調べた。その際、発光微生物の再活性化条件は、これまでに述べたと同様の条件である。その結果、保存日数７日間を通して安定な生物発光が観察された。また、発光強度とＢＯＤ濃度の相関性を確認でき、図９乃至図１２に示すように、ＢＯＤ濃度に対する発光レンジも測定に十分な範囲を確保できていることが明らかとなった。保存７日間を通して、グレースケール値にして４０〜６０の発光レンジが維持されていた。しかしながら、図９に示すように、発光強度の値は保存日数が増すにつれて低下する傾向が見られ、１６ｐｐｍのＢＯＤ標準液を滴下して２０分後の発光を比較すると、図９に示すように、１日間および２日間保存した発光微生物固定化チップからはグレースケール値にして約２４５の発光強度が確認されたが、図１０に示すように、３日目においてはグレースケール値にして約２３５、４日目においてはグレースケール値にして約１７５にまで低下した。さらに、図１２および図１３に示すように、５日目では１４５、６日目７日目では１２５にまで発光強度が低下した。
【００４８】
しかし、このとき、他のＢＯＤ濃度試料における発光微生物固定化チップの発光強度も同様のパターンで低下していく処から、何れの発光微生物固定化チップもＢＯＤ測定に適用し得る発光強度、ＢＯＤ濃度に対して十分な発光レンジを有していることが判明した。
【００４９】
このことは、保存日数の異なる発光微生物固定化チップに対しては異なる検量線が必要であることを意味している。発光微生物固定化チップにおける菌体の培養時間、発光微生物固定化材料、測定プロセスを一定化させることで保存時間が同じ発光微生物固定化チップにおけるチップロット間誤差は小さく、ＢＯＤの測定に支障を来さない。しかし、保存時間が異なる発光微生物固定化チップにおいては、ロット間誤差を無視できない。而して、実際のＢＯＤ測定に際しては、発光微生物固定化チップ保存開始時間を明記し、保存日数（時間）を明らかにして、保存日数（時間）毎に検量線を作成する。
【００５０】
（検量線の作成）
７日間保存した発光微生物固定化チップを用いて、ＢＯＤ測定用の検量線を作成した。ＢＯＤ標準溶液の濃度と生物発光との間に直線的な相関性を示す検量線が得られ、図１３に示すように、発光強度（Ｙ）に対してＢＯＤ濃度（Ｘ）とするとき、Ｙ＝３．０４０５Ｘ＋７７０７０９（Ｒ２＝０．９９９６）の相関式（近似式）が得られた。実際のＢＯＤ測定にあっては、この逆関数を用いた。
【００５１】
（実試料によるＢＯＤ測定および公定法（ＢＯＤ５）との比較）
実試料として、広島県三次市の馬洗川、広島県庄原市の国兼川、太刀洗川、はげら池から採取した水、および県立広島大学の排水処理場から原水、沈澱池の水、滅菌前の水、滅菌後の水を採取し、実験に供した。７日間保存した発光微生物固定化チップを用いて本発明の有機汚染測定方法によって、ラボ内で疑似オンサイト的にＢＯＤ測定を行い測定データを得た。このデータを図１３に示す検量線に当てはめ、ＢＯＤ値を求めた。一方、公定法（ＢＯＤ５）を用いて、同一試料のＢＯＤ測定を行った。
【００５２】
その結果、公定法（ＢＯＤ５）によって得られたＢＯＤ測定値は、表３に示すように、馬洗川：２．５３ｐｐｍ、国兼川：６．１３ｐｐｍ、太刀洗川：５．１７ｐｐｍ、はげら池：４．６７ｐｐｍであった。これに対し本発明の有機汚染測定方法によって得られたＢＯＤ測定値は、表３に示すように、馬洗川：３．４５±１．２５ｐｐｍ、国兼川：５．６１±０．９９ｐｐｍ、太刀洗川：４．８６±１．０１ｐｐｍ、はげら池：４．１３±０．６１ｐｐｍであった。両方法における誤差は、６％〜１３％であることが確認された。
【００５３】
【表３】
【００５４】
このように、河川や湖沼のように比較的汚染の程度が軽くＢＯＤ値が低い場所では、公定法とほぼ同等の測定結果であった。これに対して、県立広島大学の排水処理場の各排水処理段階における有機汚染の測定結果は、公定法（ＢＯＤ５）によって得られたＢＯＤ測定値は、表４に示すように、原水：４８７．１２ｐｐｍ、沈澱池：６２．６７ｐｐｍ、滅菌前の水：７．１３ｐｐｍ、滅菌後の水：６．５３ｐｐｍであった。これに対し本発明の有機汚染測定方法によって得られたＢＯＤ測定値は、表４に示すように、原水：３７８．２８±７０．１４ｐｐｍ、沈澱池：９０．３９ｐｐｍ、滅菌前の水：８．８７±１．８３ｐｐｍ、滅菌後の水：７．３３±１．６１ｐｐｍであった。
【００５５】
【表４】
【００５６】
このように、有機汚染が進んだ環境水の場合、両方法間のＢＯＤ値に差異がある。しかしながら、総じて両方法間の誤差は±３０％以内に止まり、極端な差異は認められなかった。また、表４に示すように、排水処理施設における各処理排水の汚染傾向の把握は可能であり、本発明による発光微生物固定化チップ又はシートを用いる有機汚染測定方法での実試料のＢＯＤ測定が可能であることが明らかとなった。
【００５７】
これまで述べてきた実施例によって、アクリル基板又はシート上に穿設した微小ホール又は凹凸構造に、有機物を除いた培養液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物、好ましくはアジ(Trachurus japonicus )体表由来のＡＴ−１株、福岡県福岡市西区唐泊港の海から得られたキュウセン（Halichoeres poecilopterus）内蔵由来のＫＮ−５株、広島県呉市倉橋町付近の海から得られたメバル（Sebastes inermis ）内蔵由来のＭＮ−２株の３株、さらに好ましくは、福岡県福岡市西区唐泊港の海から得られたキュウセン（Halichoeres poecilopterus）内蔵由来のＫＮ−５株にレスティング処理を施してシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ又はシートを用いて、これを２℃〜５℃の温度域で保存した後、ＢＯＤ測定に臨んで８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を発光微生物固定化チップ又はシートの微小ホール又は凹凸構造に滴下し、２０分間以内の発光量をたとえばデジタルカメラで撮影し、このデータをパソコンに転送し、たとえば画像解析ソフトウエアScion Image を用いて発光強度を数値化測定する本発明の実施形態が明らかとなった。
【００５８】
（発光細菌のキャラクタリゼーション）
本発明の実施例で用いた発光細菌ＫＮ−５株に対して、グラム染色（Hucker法）、アピテスト（日本ビオメリューＡＰＩ２０ＮＥ）を用いた簡易生化学同定試験を行った。先ず、グラム染色（Hucker法）では、培養液の１００μｌを９００μｌの滅菌蒸留水に懸濁し、希釈した菌体をスライドガラスに滴下後自然乾燥し、ガスバーナで軽く焙り固定化を行った。これにクリスタルバイオレット（溶液１）クリスタルバイオレット：１．０ｇ、９５％エタノール１０ｍｌ 溶液２）蓚酸アンモニウム：０．４ｇ、蒸留水：４０ｍｌ 使用時に溶液１）、２）を混合）で菌体塗布面を覆い、１分間放置した後、流水で流した。次いで、ルゴール溶液で塗布面を覆い、１分間放置し、流水で流した後、脱色液（９５％エタノールとアセトンを７：３の割合で混合）を用いて脱色を行った。その後、サフラニン液で塗布面を覆い、３０秒間放置後、流水で洗浄した。スライドガラスを自然乾燥した後、位相差顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ５０）を用いて確認を行い、紫に染まった場合は陰性と判断した。また、コントロールとして、グラム陽性菌に納豆菌（Bacillus subtilis ）、グラム陰性菌に大腸菌（Ecsherichia coli）を用いた。
【００５９】
また、市販の簡易生化学同定キットであるアピテスト（日本ビオメリューＡＰＩ２０ＮＥ）による発光細菌ＫＮ−５の株簡易生化学同定試験を行った。培養菌液を遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間）による集菌後、菌体ペレットにオートクレーブ処理（１２０℃、２ａｔｍ、１０分間）を施し、滅菌済み生理食塩水４．０ｍｌを添加して菌体懸濁液を作製した。このストリップを３０℃のインキュベータ内で４８時間反応させ、判定を読み取った。また、プロファイルインデックスから菌体の同定について検討した。
【００６０】
（発光細菌ＫＮ−５株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく系統分類）
発光細菌ＫＮ−５株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく系統分類を行うために、発光細菌ＫＮ−５株からゲノムＤＮＡの抽出を行った。先ず、培養菌液１ｍｌをエッペンドルフチューブに採取し、遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、２５℃、１８，０００ｒｐｍ、３分間）を行って、上澄みを除き、菌体ペレットに５５７μｌのＴＥバッファーを加えて懸濁した。この懸濁液に３０μｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液、３μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫを加え、数回アジテーションを行って混合した後、３７℃で１時間インキュベート（ＴＡＩＴＥＣ ＣＴＵ−Ｎ）した。１時間後、１００μｌの５ＭＮａＣｌ溶液、８０μｌのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えよく懸濁した後、６５℃で１０分間インキュベートした。１０分後、７５０μｌのＣｌ（クロロホルム：イソアミルアルコール＝１：１）を加えてよく懸濁し、遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、２５℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間）を行った。
【００６１】
得られた上澄みを新しいエッペンドルフチューブに移し、そこに７００μｌのＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加えて懸濁し、再度遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、２５℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間）を行った。その後、上澄みをエッペンドルフチューブに移し、４５０μｌのイソプロパノールを加え、数回アジテーションを行った。然る後、室温で１５分間放置した後、遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、４℃、１４，０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。上澄みを除き７０％エタノール１ｍｌを加え、再度遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１、４℃、１４，０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。
【００６２】
遠心分離後上澄みを除き、エッペンドルフチューブのまま水流式真空デシケータで乾燥し、５０μｌのＴＥバッファーに速やかに溶解し、４℃で保存した。さらに、抽出したゲノムＤＮＡに対してＲＮａｓｅ処理を行った。処理後、ＴＥバッファーに溶解し、アガロース電気泳動（１００Ｖ、８０分間、１％Agarose ＭＥ）で抽出ゲノムＤＮＡの有無、分子量の確認を行うとともに、２６０ｎｍの吸光℃を測定してゲノムＤＮＡの濃度決定を行った。
【００６３】
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列のシーケンスは以下の手順で行った。抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プログラムインキュベータ（Applied Biosystems GeneAmp ＰＣＲ Systems ２７００）を用いてＰＣＲ反応を生ぜしめ、１６ＳｒＤＮＡをコードするＤＮＡ塩基配列を増幅した。このとき、目的遺伝子の増幅のためのプライマーとして、大腸菌１６ＳｒＤＮＡのポジション８−２７に相当する５‘ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’および１５２５−１５４３に相当する５‘ＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’がデザインされ、ＰＣＲ反応に利用された。その後、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動（１００Ｖ、８０分間、１％Agarose ＭＥ）によって検出、確認した。
【００６４】
約１５００ｂｐである１６ＳｒＤＮＡ領域の増幅が確認された試料をＳＵＰＲＥＣＴＭ−ＰＣＲ（ＴａＫａＲａ社）により精製後、Big DyeＴＭTerminator ｖ１．１Cycle Sequencing Kit （Applied Biosystems ）を用いてサイクルシーケンス反応を生ぜしめた。サイクルシーケンス済みのサンプルをエタノール／ＥＤＴＡ／酢酸ナトリウム法で精製した後、２５μｌのHi-Di Formamide に溶解し、ＡＢＩ Prism ３１０ Genetic Analyzer (Applied Biosystems 社製)を用いてダイターミネータ法に基づくシーケンスを行った。
【００６５】
増幅遺伝子全体のシーケンスを行うために、必要に応じて２０mer程度の内部プライマーを合成し、同様の工程でＡＢＩ Prism ３１０ Genetic Analyzer (Applied Biosystems 社製)を用いてダイターミネータ法に基づくシーケンスを行った。また、遺伝子領域については、ＦＡＳＴＡなどの遺伝子データベースへの照会、ＤＮＡＳＩＳ Pro Version ０２−０７(Hitachi)などの解析ソフトウエアを用いた解析によって近縁種との相同生を探索、調査を行った。その結果、海洋微生物であるPhotobacterium 属 の発光微生物と高い相同性が確認された。特に、発光細菌Photobacterium phosphoreum と９９％以上の相同性が明らかとなった。また、ＩＦＯ１３８９６株との間には９９．７０１％の相同性が見られ、ＫＮ−５株は、発光細菌Photobacterium phosphoreum を構成する株の１つではないかと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の一実施例に係るオンサイト対応方ＢＯＤ簡易測定システムを示す模式図
【図２】本発明の一実施例に係るシリカゲル、寒天ゲルで発光微生物を固定した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を示すグラフ
【図３】本発明の一実施例に係るＡＴ−１株、ＭＮ−２株をシリカゲルで固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を示すグラフ
【図４】本発明の一実施例に係るＫＮ−５株をシリカゲルで固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を示すグラフ
【図５】本発明の一実施例に係るＫＮ−５株をシリカゲルで固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存期間（１４日間、２１日間）をパラメータとして示すグラフ
【図６】本発明の一実施例に係るＫＮ−５株をシリカゲルで固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存期間（２８日間、５６日間）をパラメータとして示すグラフ
【図７】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化をレスティング処理時間（１時間、３時間）をパラメータとして示すグラフ
【図８】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化をレスティング処理時間（６時間、１２時間）をパラメータとして示すグラフ
【図９】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存時間（１２時間、４８時間）をパラメータとして示すグラフ
【図１０】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存時間（７２時間、９６時間）をパラメータとして示すグラフ
【図１１】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートの発光強度変化を保存時間（１２０時間、１４４時間）をパラメータとして示すグラフ
【図１２】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートを１６８時間保存したときの発光強度変化を示すグラフ
【図１３】本発明の一実施例に係る、レスティング法によって１２時間処理した菌体を固定化した発光微生物固定化チップ又はシートを１６８時間保存したものを用いて作成された検量線を示すグラフ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に微小ホール又は凹凸構造を複数箇穿設するとともに、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ。
【請求項２】
請求項１に記載の発光微生物固定化チップを２℃〜５℃の温度域で保存した後、ＢＯＤ測定に臨んで８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を前記発光微生物固定化チップの微小ホール又は凹凸構造に滴下し、２０分間以内の発光量を測定するようにしたことを特徴とする発光微生物固定化チップによる有機汚染、環境測定方法。
【請求項１】
基板上に微小ホール又は凹凸構造を複数箇穿設するとともに、有機物を除いた培養溶液中でレスティング処理を施した海洋性Photobacterium species の発光微生物をシリカゲルと混合した後、前記微小ホール又は凹凸構造に包理・固定化してなる発光微生物固定化チップ。
【請求項２】
請求項１に記載の発光微生物固定化チップを２℃〜５℃の温度域で保存した後、ＢＯＤ測定に臨んで８℃〜１８℃の温度域で２時間以内の微生物再活性化処理を施し、然る後、試料液を前記発光微生物固定化チップの微小ホール又は凹凸構造に滴下し、２０分間以内の発光量を測定するようにしたことを特徴とする発光微生物固定化チップによる有機汚染、環境測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１０−５７４５０（Ｐ２０１０−５７４５０Ａ）
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２８７００（Ｐ２００８−２２８７００）
【出願日】平成２０年９月５日（２００８．９．５）
【出願人】（８０２００００３１）財団法人北九州産業学術推進機構 (187)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月５日（２００８．９．５）
【出願人】（８０２００００３１）財団法人北九州産業学術推進機構 (187)
【Ｆターム（参考）】
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