神経筋障害の処置のためのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の使用
本発明は、神経筋障害、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置、予防、及び／又は進行の遅延のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ＩＧＦ−Ｉ変異体の医薬的使用に関する。より具体的には、本発明は、神経筋障害、特にＡＬＳの処置、予防、及び／又は遅延のための医薬組成物の製造のためのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の使用であって、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、それが野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）に由来し、アミノ酸位置２７、６５、及び６８に１つ又は２つのアミノ酸改変を保有し、位置２７、６５、及び６８のアミノ酸の１つ又は２つが極性アミノ酸であるが、しかし、リジンではなく、ＰＥＧが少なくとも１つのリジン残基に付着していることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経筋障害、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置、予防、及び／又は進行の遅延のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ＩＧＦ−Ｉ変異体の医薬的使用に関する。より具体的には、本発明は、神経筋障害、特にＡＬＳの処置、予防、及び／又は遅延のための医薬組成物の製造のためのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の使用であって、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、それが野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）に由来し、アミノ酸位置２７、６５、及び６８に１つ又は２つのアミノ酸改変を保有し、位置２７、６５、及び６８のアミノ酸の１つ又は２つが極性アミノ酸であるが、しかし、リジンではなく、ＰＥＧが少なくとも１つのリジン残基に付着していることを特徴とする。
【０００２】
神経筋障害は、ニューロパチー（後天性又は遺伝性のいずれか）、筋ジストロフィー、ＡＬＳ、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を含む一連の状態、ならびに一連の非常に稀な筋障害を包含する。神経筋障害は、随意筋を制御する神経に影響を及ぼす。ニューロンが不健康になるか、又は死亡した場合、神経系と筋肉の間のコミュニケーションが破綻する。結果として、筋肉が弱り、衰弱する。脱力は、単収縮、痙攣、痛み及び疼痛、ならびに関節及び運動の問題を招きうる。時折、それは、また、心臓機能及び貴方の呼吸能力に影響を及ぼす。進行性の筋脱力には多くの原因があり、それらは乳児期から成人期を通じた任意の時に襲いうる。
【０００３】
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、神経筋障害のサブグループである。ＭＤは、筋肉の遺伝性疾患のファミリーを表す。一部の形態が小児に影響を及ぼし（例、デュシェンヌ型ジストロフィー）、２０〜３０年以内に致死的である。他の形態が成人期に存在し、より遅く進行性である。いくつかのジストロフィーの遺伝子が同定されており、デュシェンヌ型ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子中の突然変異を原因とする）ならびに十代及び成人発症型三好型ジストロフィー又はその変異体、肢帯型ジストロフィー２Ｂ又はＬＧＭＤ−２Ｂ（ジスフェリン遺伝子中の突然変異を原因とする）を含む。これらは、筋肉中の関連タンパク質の発現を妨げ、それにより筋肉機能不全を起こす「機能欠失型」突然変異である。これらの突然変異のマウスモデルが存在し、本質的に自然発生的に生じる、又は関連遺伝子の不活化もしくは欠損により生成される。これらのモデルは、筋肉において欠けるタンパク質を置換し、正常な筋肉機能を回復させうる治療を試験するために有用である。
【０００４】
神経筋障害は、また、中枢神経系の運動ニューロンの破壊及び運動ニューロン経路における変性変化に起因する神経障害の群に属する運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を含み、そして他の神経変性疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、オリーブ橋小脳萎縮症など）とは異なり、それらは運動ニューロン以外のニューロンの破壊を原因とする。米国立神経疾患・脳卒中研究所（ＮＩＮＤＳ）は、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を、身体の上部又は下部における神経に影響を及ぼす進行性の変性障害と呼ぶ。ＮＩＮＤＳによると、一部は遺伝する。一般的に、ＭＮＤは中年期に襲う。症状は、嚥下困難、肢脱力、不明瞭言語、歩行障害、顔面脱力、及び筋痙攣を含みうる。呼吸は、これらの疾患の後期において影響を受けうる。大半のＭＮＤの原因が公知ではないが、しかし、環境、毒性、ウイルス、又は遺伝子の因子が、全て疑われる。ＭＮＤの形態は、成人脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（ルー・ゲーリック病としても公知）、小児進行性脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ１）（ＳＭＡ１型又はウェルドニッヒ・ホフマン病としても公知）、中期脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ２）（ＳＭＡ２型としても公知）、若年性脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ３）（ＳＭＡ３型又はクーゲルバーグ・ウェランダー病としても公知）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）（ケネディ病又はＸ連鎖ＳＢＭＡとしても公知）を含む。運動ニューロン疾患は、運動ニューロンが変性し、死亡する障害である。運動ニューロン（上位運動ニューロン及び下位運動ニューロンを含む）は、随意筋に影響を与えて、それらを刺激して収縮させる。上位運動ニューロンは大脳皮質に由来し、脳幹及び脊髄を通じて線維を送り、下位運動ニューロンの制御に関与する。下位運動ニューロンは脳幹及び脊髄に位置しており、筋肉に線維を送る。下位運動ニューロン疾患は、下位運動ニューロンの変性を含む疾患である。下位運動ニューロンが変性する場合、それが通常活性化する筋線維が連絡切断され、収縮しなくなり、筋脱力及び反射低下の原因となる。いずれかの型のニューロンの喪失は脱力を招き、筋萎縮症（消耗症）及び無痛性脱力がＭＮＤの臨床特徴である。
【０００５】
ＡＬＳは、脊髄、脳幹、及び大脳皮質における運動ニューロンの選択的で進行性の喪失により特徴付けられる致死的な運動ニューロン疾患である。それは、典型的に、進行性の筋脱力及び神経筋呼吸不全を招く。ＡＬＳの約１０%が、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１酵素（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子中の点突然変異に関連付けられる。ＡＬＳでのこの主要な遺伝子的原因の発見によって、種々の治療の可能性を試験するための基礎が提供された。神経栄養因子（ＮＴＦ）の強力な神経保護活性は、神経萎縮症、軸索変性、及び細胞死の予防に及び、９０年代初期にＡＬＳの処置に対する非常に多くの希望を生んだ。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、ＡＬＳ患者において既に評価されている。ＡＬＳ患者においてこれらの因子を試験するための理論的根拠は、発生、外傷性神経損傷中での、又はＡＬＳに似た動物モデル（例えばｐｍｎマウス又はｗｏｂｂｌｅｒマウスなど）における自然発生の細胞死パラダイムに対するそれらの栄養効果に基づいた。ＩＧＦ−Ｉを除き（Lai EC et al. Neurology 1997, 49: 1621-1630）、これらの組換えタンパク質の全身送達は、ＡＬＳ患者において臨床的に有益な効果を導かなかった（Turner MR at al. Semin. Neurol. 2001; 21: 167-175）。望まれていない副作用及び限定的なバイオアベイラビリティによって、それらの潜在的な臨床上の利益の評価が困難になっていた。ニューロトロフィンを適用する際の実際の困難は、これらのタンパク質が全て比較的短い半減期を有しており、神経変性疾患が慢性であり、長期間の処置を必要とすることである。
【０００６】
同時期に、異なるＡＬＳ関連ＳＯＤ１突然変異を過剰発現するいくつかの系統のトランスジェニックマウスが生成されている（Newbery HJ et al. Trends Genet. 2001; 17: S2-S6）。ＡＬＳの臨床的及び神経病理学的な特徴の多くを厳密に模倣することにより、これらのマウスは神経栄養因子の前臨床的な潜在能力を研究するためのより関連する動物モデルを提供してきた。組換え栄養タンパク質の直接投与は、失望させるものであった。運動ニューロンの神経病理に対する有益な効果は、わずか又は無である（Azari MF et al. Brain Res. 2003; 982: 92-97; Feeney SJ et al. Cytokine 2003; 23: 108-118; Dreibelbis JE et al. Muscle Nerve 2002; 25: 122-123）。神経栄養因子（例えばグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＩＧＦ−Ｉ又はカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）など）のウイルスベクター媒介性の送達によって、しかし、行動又は神経病理の改善が明らかになり（Wang LJ et al. J. Neurosci. 2002; 22: 6920-6928; Bordet T et al. Hum. Mol. Genet. 2001; 10: 1925-1933及びKaspar BK et al. Science 2003, 301: 839-842）、適切な適用計画を用いて、有効性を達成することができることを示唆している。
【０００７】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）は、インスリンと構造的に関連する循環タンパク同化ホルモンである。循環中では、ＩＧＦ−Ｉの９９%超がＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合しており、それらはＩＧＦに対して非常に高い親和性を有しており、ＩＧＦ−Ｉ機能を調節する。この因子は、特定のプロテアーゼを介したタンパク質分解によりＩＧＦＢＰから局所的に放出させることができる。血清ＩＧＦ−Ｉ（〜７５%）の主な供給源は肝臓であるが（Sjogren, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (1999) 7088-7092; Yakar, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96 (1999) 7324-7329）、ＩＧＦ−Ｉは身体の全ての細胞において局所的に産生される。その内分泌機能の他、ＩＧＦ−Ｉは、発生中の成熟脳においてパラクリンの役割を有する（Werther, G.A, et al., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778）。インビトロ試験では、ＩＧＦ−Ｉが、ＣＮＳ（Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10 (1990) 558-570; Svrzic, D.、及びSchubert, D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54-60）中のいくつかの型のニューロン（ドーパミンニューロン（Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10 (1990) 558-570）、オリゴデンドロサイト（McMorris, F. A, and Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F. A, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R. L., and McMorris, F. A, J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390）、及び脊髄運動ニューロン（Hughes, R. A, et al., J. Neurosci. Res. 36 (1993) 663-671; Neff, N. T., et al., J. Neurobiol. 24 (1993) 1578-1588; Li, L., et al., J. Neurobiol. 25 (1994) 759-766）を含む）に対する強力で非選択的な栄養物質であることが示されている。脳血液関門（ＢＢＢ）を越えた受容体媒介性輸送を介した脳中への末梢ＩＧＦ−Ｉの侵入が実証されている（Rosenfeld, R. G. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149 (1987) 159-166; Duffy, K. R., et al., Metab. Clin. Exp. 37 (1988) 136-140; Pan, W. and Kastin, AJ.. Neuroendocrinology 72 (2000) 171-178）。主にＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおいて生成された前臨床データによって、ＩＧＦ−Ｉが、髄腔内に、又は、除放デバイス又は遺伝子治療アプローチを介して送達された場合、ＡＬＳ関連パラメーターに対して有効性を示すとの強い証拠が提供されている（Kaspar et al., Science 301: 839, 2003; Boillee and Cleveland, Trends Neurosci 27: 235, 2004; Dobrowolny et al., J Cell Biol168: 193, 2005; Nagano et al., J Neurol Sci 235: 61, 2005; Narai et al., J Neurosci Res 82:452, 2005）。これは、ＩＧＦ−Ｉの一定の送達が必要とされることを示唆する。なぜなら、ヒトでの使用に適したＩＧＦ−Ｉ用量の非経口適用時でのＡＬＳモデルにおける有効性について発表データが存在しないからである。
【０００８】
米国特許第５，０９３，３１７号には、コリン作動性神経細胞の生存がＩＧＦ−Ｉの投与により増強されることが言及されている。ＩＧＦ−Ｉが末梢神経の再生を促進し（Kanje, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398）、オルニチンデカルボキシラーゼ活性を増強する（米国特許第５，０９３，３１７号）ことがさらに公知である。米国特許第５，８６１，３７３号及びＷＯ ９３／０２６９５ Ａ１には、患者の中枢神経系においてＩＧＦ−Ｉ及び／又はそのアナログの活性濃度を増加させることにより主にグリア及び／又は非コリン作動性神経細胞に影響を及ぼす中枢神経系への損傷又はその疾患を処置する方法について言及されている。ＷＯ ０２／３２４４９ Ａ１は、哺乳動物の鼻腔に、治療的有効量のＩＧＦ−Ｉ又はその生物活性変異体を含む医薬組成物を投与することによる、哺乳動物の中枢神経系における虚血性障害を低下又は予防するための方法に関する。ＩＧＦ−Ｉ又はその変異体は、鼻腔を通じて吸収され、虚血性事象に関連する虚血性傷害を低下又は予防するために効果的な量で哺乳動物の中枢神経系に輸送される。ＥＰ ０ ８７４ ６４１ Ａ１では、ＡＩＤＳ関連痴呆、ＡＤ、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病、肝性脳症、皮質‐基底神経節症候群、進行性痴呆症、痙性対麻痺を伴う家族性認知症、進行性核上麻痺、多発性硬化症、シルダーの脳硬化症、又は急性壊死性出血性脳脊髄炎に起因する中枢神経系における神経損傷を処置又は予防するための薬物を製造するためのＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩの使用を主張しており、ここで、この薬物は血液脳関門又は血液脊髄関門の外側で有効量のＩＧＦを非経口投与するための形態である。
【０００９】
臨床使用では、しかし、外来性適用後での末梢におけるＩＧＦ−Ｉの短い半減期が、明らかな不利点であり、重篤な問題を生じる高投与回数を必要とする。ＩＧＦ−Ｉでの急性過負荷に起因する副作用（低血糖症、ＩＧＦ−Ｉでの臨床試験において頻繁に見られる、ＮＤＡレポート２１−８３９（http://www.fda.gov/cder/foi/nda/2005/021839_S000_Increlex_Pharm.pdf）も参照のこと）によって、最大耐量が、持続的有効性にまだ達しないレベルに限定される。この不利点を克服し、より良好な活性のためのより高用量を達成するために、吸収速度が遅く、血中滞留性がより長く安定であるが、しかし、生物活性を保持している修飾ＩＧＦ−Ｉが必要とされうる。前記修飾ＩＧＦ−Ｉが依然としてその神経保護作用を発揮できることを確実にするために、血液脳関門輸送が十分に稼働していることも必要とされる。
【００１０】
前臨床使用において、血液中での大きな化合物変動のない継続的な供給のためのミニポンプ及びミクロスフェアとしての除放デバイス中へのカプセル封入により上記困難の少なくとも一部に対処することが試みられてきた（Carrascosa C et al. Biomaterials 25; 707-714；ＷＯ ０３／０７７９４０ Ａ１）。しかし、このアプローチを使用して、血中ＩＧＦ−Ｉの初期の強い増加が観察されており、ヒトにおいてＩＧＦ−Ｉの皮下注射（s.c.）と同じ急性副作用を生じうる。
【００１１】
驚くべきことに、特異的にＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ（ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ）変異体は、非経口注射されたとき、必要な薬物動態学的プロファイルを有することが見出された。前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、非ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉよりも１０倍高い用量及び／又は血漿中濃度まで急性血糖降下活性を有さない。ＰＥＧ化によってＩＧＦ−Ｉの結合及び受容体媒介性の血液脳関門透過が損なわれることが明らかに期待されてきたであろう。以下で詳細に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、驚くべきことに、動物、即ち、神経筋傷害のマウスモデルにおいて、非ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉで必要とされるよりずっと低用量で神経保護的及び機能的であり、１）血液脳関門輸送が十分に稼働していること、２）分子がインビボでその生物学的活性を十分に保持していること、及び３）低血糖症が、ＩＧＦ−Ｉと比較して、＞１０倍高い用量のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉでだけ見られ、それによってヒトにおけるより良好な有効性のためにさらにより高投与量のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが可能になることを示している。
【００１２】
発明の概要
第１の実施態様において、本発明は、以下に記載される医薬的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、それを必要とする患者に投与することによる神経筋障害の処置のための方法に関する。
【００１３】
好ましい実施態様において、本発明は、以下に記載される医薬的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、それを必要とする患者に投与することによるＭＮＤ、特にＡＬＳの処置のための方法に関する。
【００１４】
別の実施態様において、本発明は、さらに、薬学的に許容しうる担体を伴う、以下に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を含む医薬組成物に関し、ここで前記医薬組成物は、神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、及びさらにより好ましくはＡＬＳの処置、予防、及び／又は進行の遅延において有用である。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、及びさらにより好ましくはＡＬＳの処置のための薬物の製造のための、以下に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の使用に関する。
【００１６】
発明の詳細な説明
別に定義されない場合、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似の又は等価の任意の方法及び材料を、本発明の実行又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料が以下に記載される。
【００１７】
定義
「神経筋障害」という用語は、筋肉の機能を直接的に（内因性の筋病理を介して）又は間接的に（神経病理を介して）損なう疾患及び病気を包含する。神経筋障害の例は、限定はされないが、以下を含む：
運動ニューロン疾患、例えばＡＬＳ（別名、ルー・ゲーリック病）、脊髄性筋萎縮症１型（ＳＭＡ１、ウェルドニッヒ・ホフマン病）、脊髄性筋萎縮症２型（ＳＭＡ２）、脊髄性筋萎縮症３型（ＳＭＡ３、クーゲルベルク・ヴェランダー病）、脊髄延髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ、別名、ケネディ病及びＸ連鎖ＳＢＭＡ）、
筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ、別名、仮性肥大型）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ又はＦＳＨＤ、別名、ランドジー・デジェリーヌ型）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ、別名、シュタイネルト病）、眼球咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ジストロフィー （ＤＤ、三好型）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、
筋肉の代謝病、例えばホスホリラーゼ欠損症（ＭＰＤ又はＰＹＧＭ、別名、マッカードル病）、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ、別名、ポンペ病）、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（別名、垂井病）、脱分枝酵素欠損症（ＤＢＤ、別名、コリ病又はフォーブズ病）、ミトコンドリアミオパチー（ＭＩＴＯ）、カルニチン欠損症（ＣＤ）、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、乳酸脱水素酵素欠損症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、パルミチルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、乳酸脱水素酵素欠損症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症；
末梢神経の疾患、例えばシャルコー・マリー・ツース病（ＣＭＴ、別名、遺伝性運動感覚性ニューロパチー（ＨＭＳＮ）又は腓骨筋萎縮症（ＰＭＡ）、フリードライヒ失調症（ＦＡ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳ）、
炎症性ミオパチー、例えば皮膚筋炎（ＤＭ）、多発性筋炎（ＰＭ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、神経筋接合部の疾患、例えば重症筋無力症（ＭＧ）、ランバート・イートン症候群（ＬＥＳ）、先天性筋無力症症候群（ＣＭＳ）、
内分泌異常に起因するミオパチー、例えば甲状腺機能亢進性ミオパチー（ＨＹＰＴＭ）、甲状腺機能低下性ミオパチー（ＨＹＰＯＴＭ）、
他のミオパチー、例えば先天性筋緊張症（ＭＣ、別名、トムゼン病及びベッカー病）、先天性パラミオトニア（ＰＣ）、セントラルコア病（ＣＣＤ）、ネマリンミオパチー（ＮＭ）、
筋細管ミオパチー／中心核ミオパチー（ＭＴＭ又はＣＮＭ）、周期性麻痺（ＰＰ、２つの形態：低カリウム血性及び高カリウム血性）。
【００１８】
「ＭＮＤ」により、運動機能を伴うニューロン、即ち、運動インパルスを運ぶニューロンに影響を及ぼす疾患を意味する。そのようなニューロンは、また、「運動ニューロン」と呼ばれる。これらのニューロンは、限定されないが、以下を含む：前部脊髄のアルファニューロン（骨格筋線維を神経支配するアルファ線維を生じる）；前部脊髄のベータニューロン（錘外及び錘内筋線維を神経支配するベータ線維を生じる）；前部脊髄のガンマニューロン（筋紡錘の錘内線維を神経支配するガンマ（紡錘運動）線維を生じる）；求心性インパルスが起こる筋肉以外の筋肉に供給する異名運動ニューロン；求心性インパルスが起こる筋肉に供給する同名運動ニューロン；細胞体が脊髄の腹側灰白柱中にあり、終末が骨格筋中にある下位末梢ニューロン；介在ニューロンからインパルスを受ける末梢ニューロン；及び、運動皮質から、脳神経の運動核に、又は、脊髄の腹側灰白柱にインパルスを伝導する大脳皮質中の上位ニューロン。
【００１９】
運動ニューロン障害の非限定的な例は、以下を含む：種々の筋萎縮症、例えば遺伝性筋委縮症（遺伝性脊髄性筋萎縮症を含む）、急性乳児脊髄性筋萎縮症、例えばウェルドニッヒ・ホフマン病など、小児における進行性筋萎縮症、例えば近位型、遠位型、及び延髄型など、青年期発症型又は成人発症型の脊髄性筋萎縮症（近位型、肩甲腓骨型、顔面肩甲上腕型、及び遠位型を含む）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び原発性側索硬化症（ＰＬＳ）。また、この用語内には、運動ニューロンの損傷が含まれる。
【００２０】
「筋萎縮性側索硬化症」（「ＡＬＳ」）という用語は、ルー・ゲーリック病とも呼ばれ、皮質、脳幹、及び脊髄の運動ニューロンに影響を及ぼす致死的疾患である。（Hirano, (1996) Neurology, 47(4 Suppl. 2): S63-6）。疾患の病因は未知であるが、１つの理論は、ＡＬＳにおける神経細胞死が、過剰な細胞外グルタミン酸に起因する神経細胞の過剰興奮の結果であるということである。グルタミン酸は、グルタミン酸作動性ニューロンにより放出され、グリア細胞中に取り込まれる神経伝達物質であり、そこで、それは酵素グルタミン合成酵素によりグルタミンに変換され、グルタミンは次にニューロンに再侵入し、グルタミナーゼにより加水分解され、グルタミン酸を形成し、このようにして神経伝達物質プールを補充する。正常な脊髄及び脳幹において、細胞外グルタミン酸レベルは、細胞外液中で低マイクロモルレベルに保たれている。なぜなら、グリア細胞（ニューロンを支持するために部分的に機能する）が、興奮性アミノ酸トランスポーター２型（ＥＡＡＴ２）タンパク質を使用して、グルタミン酸を即時に吸収するからである。ＡＬＳ患者における正常ＥＡＡＴ２タンパク質の欠損は、疾患の病理において重要であるとして同定された｛例、Meyer et al. (1998) J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 65: 594-596; Aoki et al. (1998) Ann. Neurol. 43: 645-653;Bristol et al. (1996) Ann Neurol. 39: 676-679）。ＥＡＡＴ２の低下したレベルについての１つの説明は、ＥＡＡＴ２が異常にスプライシングされていることである（Lin et al. (1998) Neuron, 20: 589-602）。異常スプライシングによって、ＥＡＡＴ２タンパク質のＣ末端領域中に位置付けられる４５〜１０７のアミノ酸の欠失を伴うスプライス変異体が産生される（Meyer et al.(1998) Neurosci Lett. 241: 68-70）。ＥＡＡＴ２の欠如又は欠陥に起因して、細胞外グルタミン酸が蓄積し、ニューロンの持続的な興奮を起こす。グルタミン酸の蓄積は、神経細胞に対して毒性効果を有している。なぜなら、ニューロンの持続的な興奮が早期細胞死を招くからである。ＡＬＳの病理について多くのことが公知であるが、家族性ＡＬＳにおける散発型の病原性及び突然変異ＳＯＤタンパク質の原因特性についてはほとんど公知ではない（Bruijn, et al. (1996) Neuropathol. Appl. Neurobiol, 22: 373-87; Bruijn, et al. (1998) Science 281: 1851-54）。多くのモデルが推測されており、グルタミン酸毒性、低酸素症、酸化ストレス、タンパク質凝集体、ニューロフィラメント、及びミトコンドリア機能障害を含む（Cleveland, et al. (1995) Nature 378: 342-43; Cleveland, et al. Neurology, 47 (4 Suppl. 2): S54-61, discussion S61-20996); Cleveland, (1999) Neuron, 24: 515-20;Cleveland, et al. (2001) Nat. Rev. Neurosci., 2: 806-19; Couillard-Despres, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. ScL USA, 95: 9626-30; Mitsumoto, (1997) Ann. Pharmacother., 31: 779-81; Skene, et al. (2001) Nat. Genet. 28: 107-8; Williamson, et al. (2000) Science, 288: 399）。
【００２１】
現在、ＡＬＳのための療法はなく、疾患の経過を予防又は逆転させるために効果的であることが判明している治療もない。いくつかの薬物が、近年、食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されている。今までに、ＡＬＳを処置するための試みには、細胞保護効果を有する長鎖脂肪アルコールを用いて（米国特許第５，１３５，９５６号を参照のこと）；又はピルビン酸塩を用いて（米国特許第５，３９５，８２２号を参照のこと）；及びグルタミン酸カスタードを遮断するためのグルタミン合成酵素を使用して（米国特許第５，９０６，９７６号を参照のこと）神経変性を処置することが含まれてきた。例えば、リルゾール（グルタミン酸放出阻害剤）が、米国において、ＡＬＳの処置のために承認されており、少なくとも一部のＡＬＳ患者の生存を３ヶ月間だけ延ばすと思われる。しかし、一部のレポートでは、リルゾール治療が生存時間をわずかに延長させるにもかかわらず、それは、患者において筋力の改善を提供するように思われないことが示されてきた。従って、リルゾールの効果は、治療によって患者のクオリティーオブライフが改変されない点で限定される（Borras-Blasco et al. (1998) Rev. Neurol, 27: 1021-1027）。
【００２２】
以下で使用される通り、「分子量」は、ＰＥＧの平均分子量を意味する。
【００２３】
本発明の「ＰＥＧ又はＰＥＧ基」は、ポリ（エチレングリコール）を必須部分として含む残基を意味する。そのようなＰＥＧは、結合反応のために必要であるさらなる化学基を含みうる；それらは分子の化学合成に起因する；又は、それは、互いからの分子の部分の最適な距離のためのスペーサーである。また、そのようなＰＥＧは、一緒に連結される１つ又は複数のＰＥＧ側鎖からなりうる。複数のＰＥＧ鎖を伴うＰＥＧ基は、マルチアームＰＥＧ又は分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧを、例えば、ポリエチレンオキシドの種々のポリオール（グリセロール、ペンタエリスリトール、及びソルビトールを含む）への付加により調製できる。例えば、４アーム分岐ＰＥＧを、ペンタエリスリトール及びエチレンオキシドから調製できる。分岐ＰＥＧは、通常、２〜８のアームを有し、例えば、ＥＰ−Ａ ０ ４７３０８４及び米国特許第５，９３２，４６２号において記載されている。特に好ましくは、リジンの第一級アミノ基を介して連結された２つのＰＥＧ側鎖を伴うＰＥＧ（ＰＥＧ２）である（Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。
【００２４】
本明細書において使用される「実質的に均質な」とは、産生される、含まれる、又は使用されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体分子だけが、付着された１つ又は２つのＰＥＧ基を有するものであることを意味する。この調製物は、少量の未反応（即ち、ＰＥＧ基を欠く）タンパク質を含みうる。ペプチドマッピング及びＮ末端シークエンシングにより確認される通り、以下の１例は、少なくとも９０%のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ変異体抱合体及び多くても５%の未反応タンパク質である調製物を提供する。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体のそのような均質な調製物の単離及び精製は、通常の精製方法、好ましくは分子ふるいクロマトグラフィーにより実施できる。
【００２５】
本明細書において使用される「モノＰＥＧ化」とは、ＩＧＦ−Ｉ変異体が、ＩＧＦ−Ｉ変異体１分子当たり１つのリジンだけでＰＥＧ化されることを意味し、それにより、１つのＰＥＧ基だけがこの部位で共有結合的に付着される。純粋なモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体（Ｎ末端ＰＥＧ化を伴わない）は、調製物の少なくとも８０%、好ましくは９０%、最も好ましくはモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は調製物の９２%又はそれ以上であり、残りは、例えば、未反応（非ＰＥＧ化）ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体である。本発明のモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の調製物は、従って、例えば、医薬的適用において、均質な調製物の利点を呈するだけ十分に均質である。同じことが、ジＰＥＧ化種に適用される。
【００２６】
本明細書において使用される「ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体」又は「アミノ反応性ＰＥＧ化」は、ＩＧＦ−Ｉ変異体が、ＩＧＦ−Ｉ変異体分子の１つ又は２つのリジンへのアミノ反応性共役により１つ又は２つのポリ（エチレングリコール）基に共有結合的に結合することを意味する。ＰＥＧ基は、リジン側鎖の第一級［エプシロン］アミノ基であるＩＧＦ−Ｉ変異体分子の部位に付着している。ＰＥＧ化は、また、Ｎ末端［アルファ］アミノ基で起こることがさらに可能である。使用される合成方法及び変異体に起因して、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、ＩＧＦ−Ｉ変異体の混合物（Ｋ６５、Ｋ６８、及び／又はＫ２７でＰＥＧ化されており、Ｎ末端ＰＥＧ化を伴う、又は伴わない）からなりうるが、それにより、ＰＥＧ化部位は、異なる分子において異なりうる、又は、１分子当たりのポリ（エチレングリコール）側鎖の量及び／又は分子中のＰＥＧ化部位に関して実質的に均質でありうる。好ましくは、ＩＧＦ−Ｉ変異体は、モノ及び／又はジＰＥＧ化されており、特に、Ｎ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体から精製される。
【００２７】
本明細書において使用される「ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）」は、市販されている、又は、当技術分野において周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合により調製できる水溶性ポリマーを意味する（Kodera, Y., et al., Progress in Polymer Science 23 (1998) 1233-1271; Francis, G. E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18）。「ＰＥＧ」という用語を広範に使用して、任意のポリエチレングルコール分子を包含し、ここで、エチレングリコール（ＥＧ）単位の数が、少なくとも４６０、好ましくは４６０〜２３００、特に好ましくは４６０〜１８４０である（２３０ ＥＧ単位は、分子量約１０kDaを指す）。ＥＧ単位の上限数は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の可溶性によってのみ限定される。通常、２３００単位を含むＰＥＧより大きなＰＥＧは使用されない。好ましくは、本発明において使用されるＰＥＧは、一端で、ヒドロキシ又はメトキシ（メトキシＰＥＧ、ｍＰＥＧ）で終結し、他端で、エーテル酸素結合を介してリンカー成分に共有結合的に付着している。ポリマーは直鎖又は分岐のいずれかである。分岐ＰＥＧは、例えば、Veronese, F. M., et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207において記載されている。
【００２８】
本発明の局面は、医薬的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、それを必要とする患者に投与することによる、神経筋障害、好ましくは運動ニューロン疾患、最も好ましくはＡＬＳの処置のための方法に関する。さらにより好ましい実施態様において、処置すべき疾患は、スーパーオキシドジスムターゼ１の突然変異を招く遺伝子欠損を原因とするＡＬＳである。
【００２９】
このＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、ＰＥＧが組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインのリジン残基に付着していることを特徴とし、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸位置２７、６５、及び６８に１つ又は２つのアミノ酸改変を保有し、位置２７、６５、及び６８のアミノ酸の１つ又は２つが極性アミノ酸であるが、しかし、リジンではない。
【００３０】
本明細書において使用される「極性アミノ酸」は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群より選択されるアミノ酸を指す。リジンも極性アミノ酸であるが、しかし、除外される。なぜなら、リジンは本発明により置き換えられるからである。アルギニンは、好ましくは、極性アミノ酸として使用される。
【００３１】
好ましくは、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下：
（ａ）Ｋ６５Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号２）
（ｂ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号３）
（ｃ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）
のアミノ酸改変により特徴付けられるＰＥＧ化形態の組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインである。
【００３２】
特別な優先度が、アミノ酸改変Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）を伴い、Ｋ６８でのモノＰＥＧ化により特徴付けられる、ＰＥＧ化形態の組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインに与えられる。
【００３３】
優先度が、また、上に記載されるリジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体及びＮ末端がＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の組成物に与えられ、ここでＩＧＦ−Ｉ変異体は、一次アミノ酸配列の点で、及び、１つ又は２つのアミノ酸改変を、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸位置２７、６５、及び６８に保有する点で同一であり、位置２７、６５、及び６８の１つ又は２つのアミノ酸は極性アミノ酸であるが、しかし、リジンではない。好ましくは、分子比は９：１〜１：９（比は、リジン‐ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体／Ｎ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を意味する）である。さらに好ましくは、モル比が少なくとも１：１（Ｎ末端がＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の１部分当たり少なくとも１部分のリジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体）、好ましくは少なくとも６：４（Ｎ末端がＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の４部分当たり少なくとも６部分のリジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体）である組成物である。好ましくは、リジン‐ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体及びＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の両方がモノＰＥＧ化されている。好ましくは、この組成物中では、変異体は、リジン‐ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体及びＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の両方において同一である。ＩＧＦ−Ｉ変異体は、好ましくは、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下：
（ａ）Ｋ６５Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号２）
（ｂ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号３）
（ｃ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）
のアミノ酸改変を有するＩＧＦ−Ｉムテインより選択される。
【００３４】
配列番号２〜４の好ましいＰＥＧ化形態の組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインは、リジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ又はリジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の産生のための手順に従った場合に入手可能であり、変異体は、参照により本明細書において完全に組み入れられるＷＯ ２００８／０２５５２８ Ａ１において記載される通りに別の極性アミノ酸により独立的に置換されたリジン２７、６５、及び／又は６８からなる群より選択される１つ又は２つのアミノ酸を含む。ＷＯ ２００８／０２５５２８ Ａ１において記載されるプロセスによって、配列番号２〜４の組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインの調製が可能になり、それらはＮ末端ＰＥＧ化を持たない。
【００３５】
さらに好ましくは、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、Ｎ末端の３つまで（好ましくは３つ全て）のアミノ酸がトランケートされている変異体である。各野生型突然変異体をＤｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉと名付け、Ｎ末端からアミノ酸残基グリシン、プロリン、及びグルタミン酸が欠けている（Kummer, A., et al., Int. J. Exp. Diabesity Res. 4 (2003) 45-57）。
【００３６】
好ましくは、ポリ（エチレングリコール）基は、全体的な分子量、少なくとも２０kDa、より好ましくは約２０〜１００kDa、特に好ましくは２０〜８０kDaを有する。ポリ（エチレングリコール）基は直鎖又は分岐のいずれかである。
【００３７】
本明細書において使用されるアミノ反応性ＰＥＧ化は、反応性（活性化）ポリ（エチレングリコール）の使用により、好ましくは、好ましくはメトキシポリ（エチレングリコール）のＮヒドロキシスクシンイミジルエステルの使用により、ポリ（エチレングリコール）鎖をＩＧＦ−Ｉ変異体の第一級リジンアミノ基に無作為に付着させる方法を指定する。共役反応によって、ポリ（エチレングリコール）が、リジン残基の反応性第一級［エプシロン］アミノ基及び場合によりＩＧＦ−ＩのＮ末端アミノ酸の［アルファ］アミノ基に付着される。タンパク質へのＰＥＧのそのようなアミノ基の抱合は、当技術分野において周知である。例えば、そのような方法の概説が、Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417により与えられる。Veroneseによると、タンパク質の第一級アミノ基へのＰＥＧの抱合は、第一級アミノ基のアルキル化を実施する活性化ＰＥＧを使用することにより実施できる。そのような反応では、活性化アルキル化ＰＥＧ、例えばＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧトレシルクロリド、又はＰＥＧエポキシドを使用できる。さらなる有用な試薬は、アシル化ＰＥＧ、例えば、カルボキシル化されたＰＥＧ又は末端ヒドロキシ基がクロロホルメート又はカルボニルイミダゾールにより活性化されたＰＥＧのヒドロキシスクシンイミジルエステルなどである。さらなる有用なＰＥＧ試薬は、アミノ酸アームを伴うＰＥＧである。そのような試薬はいわゆる分岐ＰＥＧを含みうる。それにより、少なくとも２つの同一の又は異なるＰＥＧ分子が、ペプチドスペーサー（好ましくはリジン）により一緒に連結され、例えば、リジンスペーサーの活性化カルボン酸としてＩＧＦ−Ｉ変異体に結合する。モノＮ末端共役は、また、Kinstler, O., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 477-485により記載されている。
【００３８】
有用なＰＥＧ試薬は、例えば、Nektar Therapeutics Inc.から入手可能である。
【００３９】
ＰＥＧでの任意の分子量（例、約２０kDa〜１００kDa）を、実際的に望ましいとして使用できる（ｎは４６０〜２３００である）。ＰＥＧ中の反復単位の数「ｎ」は、ダルトンで記載される分子量について概算される。例えば、２つのＰＥＧ分子がリンカーに付着されている場合、ここで、各ＰＥＧ分子が同じ分子量１０kDaを有し（各ｎは約２３０である）、リンカー上のＰＥＧの総分子量は約２０kDaである。リンカーに付着したＰＥＧの分子量も異なりうる。例えば、リンカー上の２つの分子の内、１つのＰＥＧ分子が５kDaであり、１つのＰＥＧ分子が１５kDaでありうる。分子量は常に平均分子量を意味する。
【００４０】
アミノ反応性ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の産生のための適したプロセス及び好ましい試薬が、ＷＯ ２００６／０６６８９１において記載されている。改変は、例えば、Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417により記載される方法に基づいており、プロセスが上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体をもたらす限り施すことができることが理解される。本発明のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の調製のための特に好ましいプロセスが、ＷＯ ２００８／０２５５２８ Ａ１において記載されており、それは、参照により本明細書において完全に組み入れられる。
【００４１】
標的タンパク質中の３つまでの潜在的に反応性の第一級アミノ基（２つまでのリジン及び１つの末端アミノ酸）の出現は、ポリ（エチレングリコール）鎖の付着点において異なる一連のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の異性体をもたらす。
【００４２】
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、１つ又は２つのＰＥＧ基（直鎖又は分岐であり、それに無作為に付着している）を含み、それにより、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体中の全てのＰＥＧ基の全体的な分子量は、好ましくは、約２０〜８０kDaである。この範囲の分子量からの小さな逸脱が可能である。しかし、活性が、低下したＩＧＦ−Ｉ受容体の活性化及び血液脳関門輸送に起因して、分子量の増加にともない減少することが予測される。従って、ＰＥＧの分子量についての範囲２０〜１００kDaが、ＰＥＧの抱合体及びＭＮＤ、特にＡＬＳの効率的な処置のために有用なＩＧＦ−Ｉ変異体についての最適化された範囲として理解されるべきである。
【００４３】
医薬製剤
以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、循環中での改善された安定性により特徴付けられ、低い適用間隔、即ち、長期間隔を用いて、全身にわたるＩＧＦ−Ｉ受容体への持続的な接近を可能にする。
【００４４】
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、方法が当業者に公知である医薬組成物の調製のための方法に従って製剤化できる。そのような組成物の産生のために、本発明のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、好ましくは、医薬組成物の所望の成分を含む水溶液に対する透析により、薬学的に許容しうる担体との混合物中で組み合わされる。
【００４５】
そのような許容しうる担体が、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company（Oslo et al.による編集）（例、ｐｐ．１４３５−１７１２）において記載されている。典型的な組成物は、有効量の本発明の物質（例えば、約０．１〜１００mg/ml）を、適した量の担体と一緒に含む。組成物は非経口的に投与してよい。本発明のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉは、好ましくは、腹腔内、皮下、静脈内、又は鼻腔内適用を介して投与される。
【００４６】
本発明の医薬的製剤は、当技術分野において公知の方法に従って調製できる。通常、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の溶液は、医薬組成物中での使用が意図される緩衝液に対して透析され、所望の最終タンパク質濃度は濃縮又は希釈により調整される。
【００４７】
そのような医薬組成物は、好ましくは腹腔内、皮下、静脈内、又は鼻腔内適用を介した注射又は注入での投与のために使用でき、薬学的に許容しうる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／又は担体と一緒に有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を含んでよい。そのような組成物は、種々の緩衝液含有物（例、アルギニン、酢酸、リン酸）、ｐＨ、及びイオン強度の希釈剤、添加剤、例えば界面活性剤及び可溶化剤（例、Tween（商標）８０／ポリソルベート、プルロニック（商標）Ｆ６８）、抗酸化剤（例、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、保存剤（Timersol（商標）、ベンジルアルコール）及び増量物質（例、サッカロース、マンニトール）を含み、物質は、ポリマー化合物、例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸などの粒状調製物中に又はリポソーム中に組込まれる。そのような組成物は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の放出及びクリアランスの物理的状態の安定化率に影響を及ぼしうる。
【００４８】
投与量及び薬物濃度
典型的に、標準的な処置計画において、患者を、特定の期間にわたり、１kg当たり、１週間当たり、０．００１〜２０mg、好ましくは０．０１〜８mgの範囲のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の投与量で処置し、１週間から約３ヶ月間又はそれより長く持続する。薬物は、１ml当たり、以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体０．１〜１００mgを含む医薬的製剤の週１回皮下、静脈内、又は腹腔内ボーラス注射又は注入として適用される。この処置は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉを、標準的な処置の前、中、又は後に適用することにより、任意の標準的（例、化学療法）処置と組み合わせることができる。これは、標準的処置だけと比較し、改善された転帰をもたらす。
【００４９】
以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、処置の成功のために週１又は２回だけ投与できることが見出された。神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、さらにより好ましくはＡＬＳの処置のための方法は、従って、それを必要とする患者へ、以上に記載される治療的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、１kg当たり、及び３〜８日当たり、好ましくは７日当たり０．００１〜３mg、好ましくは０．０１〜３mgの範囲のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の各々１つの投与量で投与することを含むべきである。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体として、好ましくは、モノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が使用される。
【００５０】
以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、さらにより好ましくはＡＬＳの処置のための薬物の調製のために使用でき、それは、それを必要とする患者に治療的有効量で、及び、１kg当たり、及び６〜８日当たり、好ましくは７日当たり０．００１〜３mg、好ましくは０．０１〜３mgの範囲のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の１つ又は２つの投与量で投与される。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体として、好ましくは、モノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が使用される。
【００５１】
以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、さらにより好ましくはＡＬＳの処置のための第２の薬理学的に活性な化合物と組み合わせた組み合わせで、別々に、連続的に、又は同時に使用することもできる。好ましくは、組み合わせの第２の薬理学的に活性な化合物が、グルタミン酸放出に対する阻害効果又は電位依存性ナトリウムチャネルの不活化の効果又は興奮性アミノ酸受容体での伝達物質の結合に続く細胞内事象に干渉する能力を有する少なくとも１つの神経保護薬である。
【００５２】
第２の薬理学的に活性な化合物は、好ましくは、リルゾールである。リルゾールによってＴＴＸ−Ｓナトリウムチャネルが遮断され、それは損傷したニューロンに関連する（Song JH, Huang CS, Nagata K, Yeh JZ, Narahashi T. Differential action of riluzole on tetrodotoxin-sensitive and tetrodotoxin-resistant sodium channels J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997; 282: 707-14）。これによってカルシウムイオンの流入が低下し、グルタミン酸受容体の刺激が間接的に妨げられる。直接的なグルタミン酸受容体の遮断と一緒に、運動ニューロンに対する神経伝達物質グルタミン酸の効果が低下する。
【００５３】
本明細書において使用される「リルゾール」という用語は、２−アミノ−６−（トリフルオロメトキシ）ベンゾチアゾール、６−（トリフルオロメトキシ）ベンゾチアゾール−２−アミン又はＣＡＳ−１７４４−２２−５を指す。この実施態様のより広い意味において、「リルゾール」という用語は、また、グルタミン酸放出に対する阻害効果、電圧依存性ナトリウムチャネルの不活化、及び、興奮性アミノ酸受容体での伝達物質の結合に続く細胞内事象に干渉する能力より選択される、やはりリルゾールを用いて観察される少なくとも１つの薬理学的特性を有する活性成分を含む。ＡＬＳにおけるリルゾールの使用がＵＳ ５，５２７，８１４において記載されており、化合物及びその調製がＥＰ ０５０ ５５１において開示されている。他の神経保護化合物が、例えば、Yagupolskii et al., Zhurnal Obschei Khimii 33 (7), 2301-7 (1963)により記載されている通りに調製できる。
【００５４】
以下の実施例、参考文献、及び図面を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲が添付の特許請求の範囲において記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載されている手順に改変を行うことができることが理解される。
【００５５】
配列リスト
配列番号１
野生型ヒトＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０１３４３に従ったＩＧＦ−Ｉ前駆体タンパク質のアミノ酸１〜７０）。
配列番号２
アミノ酸置換Ｋ６５Ｒ及びＫ６８Ｒを保有するヒトＩＧＦ−Ｉムテインのアミノ酸配列。
配列番号３
アミノ酸置換Ｋ２７Ｒ及びＫ６８Ｒを保有するヒトＩＧＦ−Ｉムテインのアミノ酸配列。
配列番号４
アミノ酸置換Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒを保有するヒトＩＧＦ−Ｉムテインのアミノ酸配列。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、マウスにおける１００μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの皮下注射後での血清検出を示す。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ又はｒｈＩＧＦ−Ｉの血清レベルは、示した時間点でＥＬＩＳＡ技術により検出された。
【図２】図２は、マウスにおけるｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１００μg/kg）の皮下注射後での海馬のＣＡ１ニューロンにおけるＩＧＦ−Ｉ免疫反応性を示す。示した時間点で、脳を除去し、ｈＩＧＦ−Ｉについて免疫染色した。海馬のＣＡ１領域からのデジタル画像を、ニューロン内の染色強度について分析した。
【図３】図３は、ビーグル犬におけるＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（２００−５０００μg/kg）の皮下注射後での血漿グルコースレベルを示す。グルコースレベルは、Ｒｏｃｈｅ ＡｋｋｕＣｈｅｃｋデバイスを使用して、各時間点で、血液滴から推定した。矢印は、５０００μg/kg用量での、雄イヌにおける重篤な低血糖症の有意な発生だけを示す。
【図４】図４は、ｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉを用いた５日間の処置後でのマウス初代運動ニューロンのインビトロでの生存を示す。Ｃ５７Ｂ１／６マウスからの初代運動ニューロンを、異なる濃度のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ又はｒｈＩＧＦ−Ｉの存在又は非存在において培養し、生存を、インビトロで５日目に位相差顕微鏡法により推定した。
【図５】図５は、賦形剤又は１５０μg/kgのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ s.c. ２日に１回（ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの握力を示す。動物を、前肢の筋力について週１回試験した。番号は、時間点当たりで分析された動物を示す（＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図６】図６は、賦形剤又は１５０μg/kgのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ s.c. ｑ２ｄで処置されたｐｍｎマウスでのロータロッド成績を示す。動物を、運動協調性について週１回試験した。番号は、時間点当たりの動物を示す（＊＊，ｐ＜０．０５）。
【図７】図７は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの顔面神経核中での運動ニューロンの生存を示す。動物を出生後３４日目に殺し、組織を組織学的検査のために処理した。運動ニューロン数の立体解析学的検査を盲検で実施し、値はマウス１匹当たりの総数を表わす（＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図８】図８は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの腰髄での運動ニューロンの生存を示す。動物を出生後３４日目に殺し、組織を組織学的検査のために処理した。運動ニューロン数の立体解析学的検査を盲検で実施し、値はマウス１匹当たりの総数を表わす（＊＊＊，ｐ＜０．００１）。
【図９】図９は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの近位横隔神経での有髄軸索数を示す。動物を出生後３４日目に殺し、組織を組織学的検査のために処理した。有髄軸索数の立体解析学的検査を盲検で実施し、値は横隔神経１つ当たりの総数を表わす（＊，ｐ＜０．０５）。
【図１０】図１０は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの遠位横隔神経での有髄軸索数を示す。動物を出生後３４日目に殺し、組織を組織学的検査のために処理した。有髄軸索数の立体解析学的検査を盲検で実施し、値は横隔神経１つ当たりの総数を表わす（＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図１１】図１１は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ３．５日に１回（ｑ３．５ｄ））で処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスの体重分析を示す。体重を週１回評価し、値を、１００%に設定された最初の検査での体重について正規化した（＊，ｐ＜０．０５）。
【図１２】図１２は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ３．５ｄ）で処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスの疾患発症を示す。動物を週１回検査し、疾患発症を後肢脱力、異常歩行、及び逆ワイヤーメッシュ上に握る困難により定義した。カプラン・マイヤープロットは、出生後３４週目から処置された個々のマウスにおける疾患発症を示す。棒グラフは、両群についての疾患発症時での平均週齢を示す（ｐ＜０．０５）。
【図１３】図１３は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ３．５ｄ）で処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスの握力を示す。動物は、週１回、前肢の筋力について試験した。時間経過中に死亡する動物のＬＯＣＦ分析を、最後の測定値をさらなるデータに含めることにより実施した（＊，ｐ＜０．０５； ＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図１４】図１４は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ３．５ｄ）で処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスでのロータロッド成績を示す。動物は、週１回、運動協調性について試験した。時間経過中に死亡する動物のＬＯＣＦ分析を、最後の測定値をさらなるデータに含めることにより実施した（＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図１５】図１５は、神経筋単位に関連するＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのインビボでの作用を示し、ＡＬＳマウスモデルで実証された通りである。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、神経筋機能も改善させ、脳幹及び脊髄中の運動性軸索及び運動ニューロンを保護することが示された。従って、神経筋接合部の保持に関与する全ての部位に作用することが示唆されている。
【００５７】
方法：
マウス胎児運動ニューロンの培養
胎生期１２．５日のマウスからの脊髄運動ニューロンの培養を、モノクローナルラット抗ｐ７５抗体（Chemicon, Hofheim, Germany）を使用したパニング技術により調製した。個々の腰髄の腹外側部を切開し、１０μM ２−メルカプトエタノールを含むＨＢＳＳに移した。トリプシンでの処理後（０．０５%、１０分間）、単一細胞浮遊物を粉砕により生じさせた。細胞を、ラット抗体ｐ７５コーティング済み培養ディッシュ（Greiner, Nurtingen, Germany）上にプレーティングし、室温で３０分間静置した。個々のウェルを、その後、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；３回）を用いて洗浄し、付着細胞を、次に、脱分極生理食塩水（０．８% ＮａＣｌ、３５mM ＫＣｌ、及び１μM ２−メルカプトエタノール）を用いてプレートから単離した。細胞を、記載の通りにポリオルニチン及びラミニンでプレコーティングされた４ウェル培養ディッシュ（Greiner）中に密度３０００個細胞／ウェルでプレーティングした（Miller, T. M. et al., J. Biol. Chem. 272, 9847-9853, 1997）。細胞を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Life Technologies, Karlsruhe, Germany）、Ｂ２７サプリメント、１０%ウマ血清、５００μMグルタマックス、及び５０μg/mlアポトランスフェリン中で、３７℃で、５% ＣＯ２大気において増殖させた。培地の５０%を、最初に、１日目に、そして次に隔日で交換した。プレーティングされた細胞の初回カウントを、全ての細胞が培養ディッシュに付着した４時間後に行った。明るい相の細胞を、次に、追加で５日目にカウントした。１０の視野（１．１６mm２/視野）を、各ウェルにおいて、各時間点でカウントした。
【００５８】
血清ｒｈＩＧＦ−Ｉレベル又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉレベル及びＣＡ１ニューロン中でのニューロン内ＩＧＦ−Ｉ染色
血清ｒｈＩＧＦ−Ｉレベル又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉレベルの推定のために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの血液サンプルを、１００μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの単回皮下注射後に異なる時間点（１つの時間点当たりｎ＝４）で採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡアッセイにより処理した。ｒｈＩＧＦ−Ｉの検出のために、市販のｒｈＩＧＦ−Ｉアッセイ（ＤＳＬ）を使用した。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの検出のために、ストレプトアビジンコーティング済みアッセイマイクロプレートを、ビオチン化抗ＰＥＧ（ＩｇＭ）捕捉抗体でコーティングした。血清サンプルを、ジゴキシゲニン化ＩＧＦＢＰ−４を用いて１５時間にわたりインキュベートし、内因性ＩＧＦＢＰにより結合された任意のＩＧＦ−ＩをＩＧＦＢＰ−４により置換した。洗浄後、プレートを抗Ｄｉｇ−ＰＯＤ（Ｆａｂ）とインキュベートし、ＡＢＴＳ呈色反応により検出した。吸光シグナルを、SpectraMax M2ｅリーダーを用いて、４０５nm及び４９０nmで定量化した。
【００５９】
１００μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのいずれかの単回皮下注射後の異なる時間点で、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、イソフルラン麻酔下で断頭し、脳を除去した。半球をドライアイス中で急速凍結し、パラホルムアルデヒド（４%リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）中で後固定した。その後、４０μmの矢状スライス（sagittal slice）を、ビブラトーム（Zeiss）を用いて切った。免疫反応性の半定量的分析のために、２４枚のスライスを、外側縁から２ｍｍで開始して切った。４枚目ごとにスライスをカウントのために使用し、マウス１匹当たり合計６枚のスライスを明らかにした。スライスをヤギ抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体（R&D Systems）を用いて免疫染色し、核色素で対比染色した。二次検出を、ロバ抗ヤギＣｙ３（Jackson）を用いた標識により実施した。ＣＡ１ニューロンのデジタル画像を、十分に盲検で、ImagePro 4.5ソフトウェア（Media Cybernetics）を使用して半自動的に取得したＣＡ１細胞層にわたり、PixelFlyカメラ（Klughammer）を使用し、同じ強度及び染色強度で評価した。マウス１匹当たり６枚のスライスからの強度値を平均した。
【００６０】
血中グルコースの推定
ビーグル犬をＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（２００〜５０００μg/kg s.c.）で処置し、血液サンプルを６日間（１４４時間）までの異なる時間間隔後に採取した。血液グルコースを、血液滴から、AkkuCheckデバイス（Roche）を使用して評価した。
【００６１】
機能評価
マウスを定期的にモニターし、マウスが、後肢脱力、異常歩行、及び逆ワイヤーメッシュ上に握る困難を呈した場合に定義された疾患発症を評価した。ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）トランスジェニックマウスにおける疾患発症はばらつき（Gurney et al., Science 264 (5166): 1772-1775, 1994）、それは出生後第３週中にｐｍｎマウスにおいて生じる（Schmalbruch et al., J Neuropathol Exp Neurol 50(3): 192-204, 1991）。発生する脱力を評価するために、突然変異マウスを、出生後２４日目（ｐｍｎ突然変異マウス）又は出生後３４週目（ＳＯＤ Ｇ９３Ａ突然変異マウス）に開始する機能運動試験に週１回供した。前肢の握力（ニュートン）を、電子握力メーター（Columbus Instruments, Columbus, Ohio）での５回の試行を平均することにより記録した。また、マウスを、ロータロッド装置（Hugo Basile Bio. Res. App.）上でバランスを保持するそれらの能力について試験し、ロッドは、直線加速度４〜４０rpm（回転毎分）を受けた。各マウスによりロッド上に保持される時間（秒）（潜伏期）を、１セッション当たり３回記録した。出生後２４日目（ｐｍｎマウス）又は出生後３４週目（ＳＯＤ１マウス）での平均値を１００%と見なし、その後の分析からの結果を、この値に対して正規化した。
【００６２】
組織学的分析
ＰＥＧ ＩＧＦ−Ｉ及び賦形剤（即ち、ＰＥＧ ＩＧＦ−Ｉを伴わない各緩衝液）で処置したｐｍｎマウスの顔面神経核及び腰髄における運動ニューロン細胞体の数を、出生後３４日目に決定した。また、横隔神経の近位部及び遠位部中での有髄軸索の数を、これらのマウス突然変異体においてカウントした。動物を、ｐＨ７．４での０．１Mリン酸緩衝液中の４%パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流し、脳幹及び腰髄（Ｌ１−Ｌ６）を切開した。連続切片を、顔面神経核を含む脳幹領域から（７μm）及び腰髄から（１２．５μm）切った。ニッスル染色後、運動ニューロンを、５番目（顔面神経核）又は１０番目（脊髄）毎の切片においてカウントし、生カウント（raw count）を、分割核（split nuclei）について補正した（Masu et al., Nature 365: 27-32, 1993）。横隔神経を、４%パラホルムアルデヒド及び２%グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸緩衝液中で一晩後固定した。オスミウム酸染色及び脱水後、全てのサンプルをＳｐｕｒｒ媒質中に包埋した。光学顕微鏡検査のための半薄（０．５μm）断面を、ガラスナイフを用いて切って、アズールメチレンブルーで染色した。無傷の有髄線維の数を、デジタルカメラ（ActionCam; Agfa, Mortsel,Belgium）を備えたLeica（Nussloch, Germany）光学顕微鏡下で神経断片から撮影された写真から決定した。
【００６３】
実施例
実施例１：
ｒｈＩＧＦ−Ｉ及びＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの全身暴露を推定するために、１００μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの単回皮下注射後での薬物レベルを、特異的検出アッセイを使用してＣ５７Ｂ１／６マウスにおいて推定した。それにより、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、ｒｈＩＧＦ−１と比較し、強く長期化された半減期ならびにより高い血清暴露の両方を示した（図１）。この増加した末梢暴露が脳についても言えるか否かをさらに研究するために、これらのマウスの脳切片を、ヒトＩＧＦ−Ｉを認識する抗体を用いて免疫染色し、ＣＡ１領域中のニューロン内染色を評価した。ＣＡ１ニューロンのＩＧＦ−Ｉ染色が、ｒｈＩＧＦ−Ｉの皮下注射後２及び６時間目に増加し、しかし、２４時間後にベースラインのレベルに戻る（図２）。対称的に、増加したＩＧＦ−Ｉ染色が、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ注射後２４及び４８時間目に観察され、４８時間目により高いレベルに達した（図２）。これらのデータによって、ｒｈＩＧＦＩ及びＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの両方の脳侵入が、末梢暴露と類似の動態を示し、ｒｈＩＧＦ−Ｉと比較してＰＥＧ−ＩＧＦ−１のずっと高い末梢暴露が、ｒｈＩＧＦ−Ｉと比較して、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのより良好でより持続性の脳侵入についても言えることを示すことが示される。
【００６４】
実施例２：
ビーグル犬における毒性試験において、ｒｈＩＧＦ−Ｉでは、皮下注射で与えられた１５０μg/kgの比較的低用量でさえ低血糖症を急性的に誘導する大きな潜在能力が示されている（ＮＤＡレポート２１−８３９）。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの血糖降下能を分析するために、雄雌のビーグル犬を、２００〜５０００μg/kgの範囲での単回用量のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの皮下注射で処置した。図３において示す通り、最高２０００μg/kgまで、一貫した低血糖症は観察されなかった。しかし、５０００μg/kgの用量では、２匹の犬のうち１匹が重篤な低血糖症を受け（図２中の矢印を参照のこと）、グルコース注入により回復されなければならなかった；結果的に、グルコース試験はこの時間点で中止された。まとめると、これらのデータによって、２０００μg/kg s.c.までのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが、１５０μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉで観察される低血糖症と類似の血糖降下能を有さないことが実証される（ＮＤＡレポート２１−８３９）。
【００６５】
実施例３：
ｒｈＩＧＦ−Ｉに関連するＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのインビトロでの活性を研究するために、両方の化合物を、運動ニューロンの生存に対するそれらの有効性について比較した。Ｅ １２．５齢のＣ５７Ｂ１／６マウス胚からの初代運動ニューロンを、異なる濃度のｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの非存在又は存在において培養し、生存している運動ニューロンを５日後に位相差顕微鏡法によりカウントした。図４において示す通り、両方の化合物は、運動ニューロンの保護に対する同じ有効性を示した。データは、ｒｈＩＧＦ−Ｉ及びＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが同じ生物学的活性を有することを示す。
【００６６】
実施例４：
ｒｈＩＧＦ−Ｉについて、いくつかの局所的又は持続的な投与計画が、ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウス（ＡＬＳについて広く使用される動物モデル）において有効性を示している（Kaspar et al., Science 301: 839, 2003; Dobrowolny et al., J Cell Biol 168: 193, 2005; Nagano et al., J Neurol Sci 235: 61, 2005; Narai et al., J Neurosci Res 82: 452, 2005）。本発明者らは、従って、疾患の臨床発症の少し前に１５０μg/kgでの皮下注射で適用されたＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのインビボでの有効性を、ＡＬＳのための２つの独立モデル、ｐｍｎマウス及びＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）において研究した。
散発性ＡＬＳのモデルにおけるＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの試験のために、ｐｍｎマウスを使用した（Bommel et al., J Cell Biol 159: 563, 2002）。このＡＬＳモデルは、出生後２週間までに機能障害の最初の症状を発生し、出生後５〜６週目に死亡を招く。ｐｍｎマウスを、従って、２日ごとに（ｑ２ｄ）、賦形剤（ｎ＝１２）又は１５０μg/kgのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（ｎ＝１３） s.c.で、出生後１３日目から、即ち、疾患が始まったばかりの時に処置した。握力を分析することによる前肢の筋力の週１回の評価を使用し、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの明らかな効果が出生後４５日目に観察され、ここで、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉで処置された生存しているｐｍｎマウスが、賦形剤で処置された動物と比較し、有意に高い成績を示した（ｐ＜０．０５、ｎ＝４−５、図５）。ロータロッド上で費やされた時間を試験することによる運動協調性の分析によって、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉで処置されたｐｍｎマウスは、賦形剤で処置されたマウスよりも良好に行うことが明らかになり、出生後３８日目に有意であった（ｐ＜０．０５、ｎ＝８−１２、図６）。さらに、組織学的分析を、出生後１３日目から賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c.）で処置されたｐｍｎマウスから実施し、出生後３４日目に灌流した。顔面運動ニューロンの立体解析学的カウントによって、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ処理群において有意に高い数の生存している運動ニューロンが明らかになった（ｐ＜０．０１、ｎ＝６−１２、図７）。同様に、腰髄中の運動ニューロンの生存が有意に増加した（ｐ＜０．００１、ｎ＝５−６、図８）。最後に、横隔神経中の有髄軸索数の分析によって、賦形剤対ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ処置済みｐｍｎマウスを比較した場合に、近位横隔神経（ｐ＜０．０５、ｎ＝４−５、図９）ならびに遠位横隔神経（ｐ＜０．０１、ｎ＝５−６、図１０）中の有意に高い有髄軸索数が明らかになった。
【００６７】
家族性ＡＬＳについて最も広く使用されるモデルにおけるＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの試験のために、ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウス（低コピー）を使用した。これらのマウスは、出生後３４〜３５週目までに疾患の最初の症状を、その後４〜５週辺りで死亡を発生した。ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスは、従って、週に２回（ｑ３．５ｄ）、賦形剤（ｎ＝６）又は１５０μg/kgのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（ｎ＝７） s.c.で、出生後３４週目から、即ち、疾患が始まったばかりの時に処置した。実験の経過を通して統計的検出力を確実にするために、ＬＯＣＦ（最終観察の引き延ばし補完法（last observation carried forward））分析を実施した。この方法（臨床試験においても使用される）では、全てのその後の時間点について、死亡前での動物の最後の測定が保持されている。体重変化の分析によって、疾患の初期段階（３７週目辺り）における体重の降下が、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ処置されたマウスにおいて有意に遅延されることが明らかになった（３７、３８、及び３９週目についてｐ＜０．０５、ｎ＝６−７ ＬＯＣＦ、図１１）。後肢脱力、異常歩行、及び逆ワイヤーメッシュ上に握る困難の最初の兆候により測定される疾患発症自体が、平均して、出生後３８．５週目〜４２．５週目までの４週間だけ遅延された（ｐ＜０．０５、ｎ＝６−７、図１２）。握力を分析することによる前肢の筋力の週１回の評価を使用し、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの有意な保護効果が、出生後３５週目から、継続的に、全ての動物の死亡まで観察された（３５、３８、４２、及び４３週目についてｐ＜０．０５、３６、３９、４０、及び４１週目についてｐ＜０．０１、ｎ＝６−７ ＬＯＣＦ、図１３）。ロータロッド上で費やされた時間を試験することによる運動協調性の分析によって、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉで処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスが、賦形剤で処置されたマウスよりも有意に良好に行うことが明らかになった（３７、３８、３９、及び４１週目についてｐ＜０．０５、４０、４２、及び４３週目についてｐ＜０．０１、ｎ＝６−７ ＬＯＣＦ、図１４）。
【００６８】
ｐｍｎマウス及びＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスからの全てのインビボでのデータをまとめると、試験によって、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが、ＡＬＳモデルにおいて全ての関連標的で神経筋機能に干渉し、疾患の全ての段階で作用する潜在能力を有することが示されている。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが、筋力及び機能を保存していることが示されており、恐らくは神経筋接合部及び接合性を保護することにより、筋肉に対する同化効果を示唆している。それに加えて、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、脊髄及び顔面神経核において運動性軸索及び運動ニューロン細胞体を救出することが示されており、運動ニューロンに対する直接的な保護効果を示唆している（図１５）。これらの変性がＡＬＳの後期で起こるため、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、恐らくは、初期及び後期の両方で疾患の経過に影響を及ぼしうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経筋障害、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置、予防、及び／又は進行の遅延のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ＩＧＦ−Ｉ変異体の医薬的使用に関する。より具体的には、本発明は、神経筋障害、特にＡＬＳの処置、予防、及び／又は遅延のための医薬組成物の製造のためのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の使用であって、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、それが野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）に由来し、アミノ酸位置２７、６５、及び６８に１つ又は２つのアミノ酸改変を保有し、位置２７、６５、及び６８のアミノ酸の１つ又は２つが極性アミノ酸であるが、しかし、リジンではなく、ＰＥＧが少なくとも１つのリジン残基に付着していることを特徴とする。
【０００２】
神経筋障害は、ニューロパチー（後天性又は遺伝性のいずれか）、筋ジストロフィー、ＡＬＳ、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を含む一連の状態、ならびに一連の非常に稀な筋障害を包含する。神経筋障害は、随意筋を制御する神経に影響を及ぼす。ニューロンが不健康になるか、又は死亡した場合、神経系と筋肉の間のコミュニケーションが破綻する。結果として、筋肉が弱り、衰弱する。脱力は、単収縮、痙攣、痛み及び疼痛、ならびに関節及び運動の問題を招きうる。時折、それは、また、心臓機能及び貴方の呼吸能力に影響を及ぼす。進行性の筋脱力には多くの原因があり、それらは乳児期から成人期を通じた任意の時に襲いうる。
【０００３】
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、神経筋障害のサブグループである。ＭＤは、筋肉の遺伝性疾患のファミリーを表す。一部の形態が小児に影響を及ぼし（例、デュシェンヌ型ジストロフィー）、２０〜３０年以内に致死的である。他の形態が成人期に存在し、より遅く進行性である。いくつかのジストロフィーの遺伝子が同定されており、デュシェンヌ型ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子中の突然変異を原因とする）ならびに十代及び成人発症型三好型ジストロフィー又はその変異体、肢帯型ジストロフィー２Ｂ又はＬＧＭＤ−２Ｂ（ジスフェリン遺伝子中の突然変異を原因とする）を含む。これらは、筋肉中の関連タンパク質の発現を妨げ、それにより筋肉機能不全を起こす「機能欠失型」突然変異である。これらの突然変異のマウスモデルが存在し、本質的に自然発生的に生じる、又は関連遺伝子の不活化もしくは欠損により生成される。これらのモデルは、筋肉において欠けるタンパク質を置換し、正常な筋肉機能を回復させうる治療を試験するために有用である。
【０００４】
神経筋障害は、また、中枢神経系の運動ニューロンの破壊及び運動ニューロン経路における変性変化に起因する神経障害の群に属する運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を含み、そして他の神経変性疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、オリーブ橋小脳萎縮症など）とは異なり、それらは運動ニューロン以外のニューロンの破壊を原因とする。米国立神経疾患・脳卒中研究所（ＮＩＮＤＳ）は、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を、身体の上部又は下部における神経に影響を及ぼす進行性の変性障害と呼ぶ。ＮＩＮＤＳによると、一部は遺伝する。一般的に、ＭＮＤは中年期に襲う。症状は、嚥下困難、肢脱力、不明瞭言語、歩行障害、顔面脱力、及び筋痙攣を含みうる。呼吸は、これらの疾患の後期において影響を受けうる。大半のＭＮＤの原因が公知ではないが、しかし、環境、毒性、ウイルス、又は遺伝子の因子が、全て疑われる。ＭＮＤの形態は、成人脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（ルー・ゲーリック病としても公知）、小児進行性脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ１）（ＳＭＡ１型又はウェルドニッヒ・ホフマン病としても公知）、中期脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ２）（ＳＭＡ２型としても公知）、若年性脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ３）（ＳＭＡ３型又はクーゲルバーグ・ウェランダー病としても公知）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）（ケネディ病又はＸ連鎖ＳＢＭＡとしても公知）を含む。運動ニューロン疾患は、運動ニューロンが変性し、死亡する障害である。運動ニューロン（上位運動ニューロン及び下位運動ニューロンを含む）は、随意筋に影響を与えて、それらを刺激して収縮させる。上位運動ニューロンは大脳皮質に由来し、脳幹及び脊髄を通じて線維を送り、下位運動ニューロンの制御に関与する。下位運動ニューロンは脳幹及び脊髄に位置しており、筋肉に線維を送る。下位運動ニューロン疾患は、下位運動ニューロンの変性を含む疾患である。下位運動ニューロンが変性する場合、それが通常活性化する筋線維が連絡切断され、収縮しなくなり、筋脱力及び反射低下の原因となる。いずれかの型のニューロンの喪失は脱力を招き、筋萎縮症（消耗症）及び無痛性脱力がＭＮＤの臨床特徴である。
【０００５】
ＡＬＳは、脊髄、脳幹、及び大脳皮質における運動ニューロンの選択的で進行性の喪失により特徴付けられる致死的な運動ニューロン疾患である。それは、典型的に、進行性の筋脱力及び神経筋呼吸不全を招く。ＡＬＳの約１０%が、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１酵素（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子中の点突然変異に関連付けられる。ＡＬＳでのこの主要な遺伝子的原因の発見によって、種々の治療の可能性を試験するための基礎が提供された。神経栄養因子（ＮＴＦ）の強力な神経保護活性は、神経萎縮症、軸索変性、及び細胞死の予防に及び、９０年代初期にＡＬＳの処置に対する非常に多くの希望を生んだ。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、ＡＬＳ患者において既に評価されている。ＡＬＳ患者においてこれらの因子を試験するための理論的根拠は、発生、外傷性神経損傷中での、又はＡＬＳに似た動物モデル（例えばｐｍｎマウス又はｗｏｂｂｌｅｒマウスなど）における自然発生の細胞死パラダイムに対するそれらの栄養効果に基づいた。ＩＧＦ−Ｉを除き（Lai EC et al. Neurology 1997, 49: 1621-1630）、これらの組換えタンパク質の全身送達は、ＡＬＳ患者において臨床的に有益な効果を導かなかった（Turner MR at al. Semin. Neurol. 2001; 21: 167-175）。望まれていない副作用及び限定的なバイオアベイラビリティによって、それらの潜在的な臨床上の利益の評価が困難になっていた。ニューロトロフィンを適用する際の実際の困難は、これらのタンパク質が全て比較的短い半減期を有しており、神経変性疾患が慢性であり、長期間の処置を必要とすることである。
【０００６】
同時期に、異なるＡＬＳ関連ＳＯＤ１突然変異を過剰発現するいくつかの系統のトランスジェニックマウスが生成されている（Newbery HJ et al. Trends Genet. 2001; 17: S2-S6）。ＡＬＳの臨床的及び神経病理学的な特徴の多くを厳密に模倣することにより、これらのマウスは神経栄養因子の前臨床的な潜在能力を研究するためのより関連する動物モデルを提供してきた。組換え栄養タンパク質の直接投与は、失望させるものであった。運動ニューロンの神経病理に対する有益な効果は、わずか又は無である（Azari MF et al. Brain Res. 2003; 982: 92-97; Feeney SJ et al. Cytokine 2003; 23: 108-118; Dreibelbis JE et al. Muscle Nerve 2002; 25: 122-123）。神経栄養因子（例えばグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＩＧＦ−Ｉ又はカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）など）のウイルスベクター媒介性の送達によって、しかし、行動又は神経病理の改善が明らかになり（Wang LJ et al. J. Neurosci. 2002; 22: 6920-6928; Bordet T et al. Hum. Mol. Genet. 2001; 10: 1925-1933及びKaspar BK et al. Science 2003, 301: 839-842）、適切な適用計画を用いて、有効性を達成することができることを示唆している。
【０００７】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）は、インスリンと構造的に関連する循環タンパク同化ホルモンである。循環中では、ＩＧＦ−Ｉの９９%超がＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合しており、それらはＩＧＦに対して非常に高い親和性を有しており、ＩＧＦ−Ｉ機能を調節する。この因子は、特定のプロテアーゼを介したタンパク質分解によりＩＧＦＢＰから局所的に放出させることができる。血清ＩＧＦ−Ｉ（〜７５%）の主な供給源は肝臓であるが（Sjogren, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (1999) 7088-7092; Yakar, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96 (1999) 7324-7329）、ＩＧＦ−Ｉは身体の全ての細胞において局所的に産生される。その内分泌機能の他、ＩＧＦ−Ｉは、発生中の成熟脳においてパラクリンの役割を有する（Werther, G.A, et al., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778）。インビトロ試験では、ＩＧＦ−Ｉが、ＣＮＳ（Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10 (1990) 558-570; Svrzic, D.、及びSchubert, D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54-60）中のいくつかの型のニューロン（ドーパミンニューロン（Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10 (1990) 558-570）、オリゴデンドロサイト（McMorris, F. A, and Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F. A, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R. L., and McMorris, F. A, J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390）、及び脊髄運動ニューロン（Hughes, R. A, et al., J. Neurosci. Res. 36 (1993) 663-671; Neff, N. T., et al., J. Neurobiol. 24 (1993) 1578-1588; Li, L., et al., J. Neurobiol. 25 (1994) 759-766）を含む）に対する強力で非選択的な栄養物質であることが示されている。脳血液関門（ＢＢＢ）を越えた受容体媒介性輸送を介した脳中への末梢ＩＧＦ−Ｉの侵入が実証されている（Rosenfeld, R. G. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149 (1987) 159-166; Duffy, K. R., et al., Metab. Clin. Exp. 37 (1988) 136-140; Pan, W. and Kastin, AJ.. Neuroendocrinology 72 (2000) 171-178）。主にＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおいて生成された前臨床データによって、ＩＧＦ−Ｉが、髄腔内に、又は、除放デバイス又は遺伝子治療アプローチを介して送達された場合、ＡＬＳ関連パラメーターに対して有効性を示すとの強い証拠が提供されている（Kaspar et al., Science 301: 839, 2003; Boillee and Cleveland, Trends Neurosci 27: 235, 2004; Dobrowolny et al., J Cell Biol168: 193, 2005; Nagano et al., J Neurol Sci 235: 61, 2005; Narai et al., J Neurosci Res 82:452, 2005）。これは、ＩＧＦ−Ｉの一定の送達が必要とされることを示唆する。なぜなら、ヒトでの使用に適したＩＧＦ−Ｉ用量の非経口適用時でのＡＬＳモデルにおける有効性について発表データが存在しないからである。
【０００８】
米国特許第５，０９３，３１７号には、コリン作動性神経細胞の生存がＩＧＦ−Ｉの投与により増強されることが言及されている。ＩＧＦ−Ｉが末梢神経の再生を促進し（Kanje, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398）、オルニチンデカルボキシラーゼ活性を増強する（米国特許第５，０９３，３１７号）ことがさらに公知である。米国特許第５，８６１，３７３号及びＷＯ ９３／０２６９５ Ａ１には、患者の中枢神経系においてＩＧＦ−Ｉ及び／又はそのアナログの活性濃度を増加させることにより主にグリア及び／又は非コリン作動性神経細胞に影響を及ぼす中枢神経系への損傷又はその疾患を処置する方法について言及されている。ＷＯ ０２／３２４４９ Ａ１は、哺乳動物の鼻腔に、治療的有効量のＩＧＦ−Ｉ又はその生物活性変異体を含む医薬組成物を投与することによる、哺乳動物の中枢神経系における虚血性障害を低下又は予防するための方法に関する。ＩＧＦ−Ｉ又はその変異体は、鼻腔を通じて吸収され、虚血性事象に関連する虚血性傷害を低下又は予防するために効果的な量で哺乳動物の中枢神経系に輸送される。ＥＰ ０ ８７４ ６４１ Ａ１では、ＡＩＤＳ関連痴呆、ＡＤ、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病、肝性脳症、皮質‐基底神経節症候群、進行性痴呆症、痙性対麻痺を伴う家族性認知症、進行性核上麻痺、多発性硬化症、シルダーの脳硬化症、又は急性壊死性出血性脳脊髄炎に起因する中枢神経系における神経損傷を処置又は予防するための薬物を製造するためのＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩの使用を主張しており、ここで、この薬物は血液脳関門又は血液脊髄関門の外側で有効量のＩＧＦを非経口投与するための形態である。
【０００９】
臨床使用では、しかし、外来性適用後での末梢におけるＩＧＦ−Ｉの短い半減期が、明らかな不利点であり、重篤な問題を生じる高投与回数を必要とする。ＩＧＦ−Ｉでの急性過負荷に起因する副作用（低血糖症、ＩＧＦ−Ｉでの臨床試験において頻繁に見られる、ＮＤＡレポート２１−８３９（http://www.fda.gov/cder/foi/nda/2005/021839_S000_Increlex_Pharm.pdf）も参照のこと）によって、最大耐量が、持続的有効性にまだ達しないレベルに限定される。この不利点を克服し、より良好な活性のためのより高用量を達成するために、吸収速度が遅く、血中滞留性がより長く安定であるが、しかし、生物活性を保持している修飾ＩＧＦ−Ｉが必要とされうる。前記修飾ＩＧＦ−Ｉが依然としてその神経保護作用を発揮できることを確実にするために、血液脳関門輸送が十分に稼働していることも必要とされる。
【００１０】
前臨床使用において、血液中での大きな化合物変動のない継続的な供給のためのミニポンプ及びミクロスフェアとしての除放デバイス中へのカプセル封入により上記困難の少なくとも一部に対処することが試みられてきた（Carrascosa C et al. Biomaterials 25; 707-714；ＷＯ ０３／０７７９４０ Ａ１）。しかし、このアプローチを使用して、血中ＩＧＦ−Ｉの初期の強い増加が観察されており、ヒトにおいてＩＧＦ−Ｉの皮下注射（s.c.）と同じ急性副作用を生じうる。
【００１１】
驚くべきことに、特異的にＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ（ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ）変異体は、非経口注射されたとき、必要な薬物動態学的プロファイルを有することが見出された。前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、非ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉよりも１０倍高い用量及び／又は血漿中濃度まで急性血糖降下活性を有さない。ＰＥＧ化によってＩＧＦ−Ｉの結合及び受容体媒介性の血液脳関門透過が損なわれることが明らかに期待されてきたであろう。以下で詳細に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、驚くべきことに、動物、即ち、神経筋傷害のマウスモデルにおいて、非ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉで必要とされるよりずっと低用量で神経保護的及び機能的であり、１）血液脳関門輸送が十分に稼働していること、２）分子がインビボでその生物学的活性を十分に保持していること、及び３）低血糖症が、ＩＧＦ−Ｉと比較して、＞１０倍高い用量のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉでだけ見られ、それによってヒトにおけるより良好な有効性のためにさらにより高投与量のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが可能になることを示している。
【００１２】
発明の概要
第１の実施態様において、本発明は、以下に記載される医薬的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、それを必要とする患者に投与することによる神経筋障害の処置のための方法に関する。
【００１３】
好ましい実施態様において、本発明は、以下に記載される医薬的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、それを必要とする患者に投与することによるＭＮＤ、特にＡＬＳの処置のための方法に関する。
【００１４】
別の実施態様において、本発明は、さらに、薬学的に許容しうる担体を伴う、以下に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を含む医薬組成物に関し、ここで前記医薬組成物は、神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、及びさらにより好ましくはＡＬＳの処置、予防、及び／又は進行の遅延において有用である。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、及びさらにより好ましくはＡＬＳの処置のための薬物の製造のための、以下に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の使用に関する。
【００１６】
発明の詳細な説明
別に定義されない場合、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似の又は等価の任意の方法及び材料を、本発明の実行又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料が以下に記載される。
【００１７】
定義
「神経筋障害」という用語は、筋肉の機能を直接的に（内因性の筋病理を介して）又は間接的に（神経病理を介して）損なう疾患及び病気を包含する。神経筋障害の例は、限定はされないが、以下を含む：
運動ニューロン疾患、例えばＡＬＳ（別名、ルー・ゲーリック病）、脊髄性筋萎縮症１型（ＳＭＡ１、ウェルドニッヒ・ホフマン病）、脊髄性筋萎縮症２型（ＳＭＡ２）、脊髄性筋萎縮症３型（ＳＭＡ３、クーゲルベルク・ヴェランダー病）、脊髄延髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ、別名、ケネディ病及びＸ連鎖ＳＢＭＡ）、
筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ、別名、仮性肥大型）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ又はＦＳＨＤ、別名、ランドジー・デジェリーヌ型）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ、別名、シュタイネルト病）、眼球咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ジストロフィー （ＤＤ、三好型）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、
筋肉の代謝病、例えばホスホリラーゼ欠損症（ＭＰＤ又はＰＹＧＭ、別名、マッカードル病）、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ、別名、ポンペ病）、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（別名、垂井病）、脱分枝酵素欠損症（ＤＢＤ、別名、コリ病又はフォーブズ病）、ミトコンドリアミオパチー（ＭＩＴＯ）、カルニチン欠損症（ＣＤ）、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、乳酸脱水素酵素欠損症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、パルミチルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、乳酸脱水素酵素欠損症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症；
末梢神経の疾患、例えばシャルコー・マリー・ツース病（ＣＭＴ、別名、遺伝性運動感覚性ニューロパチー（ＨＭＳＮ）又は腓骨筋萎縮症（ＰＭＡ）、フリードライヒ失調症（ＦＡ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳ）、
炎症性ミオパチー、例えば皮膚筋炎（ＤＭ）、多発性筋炎（ＰＭ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、神経筋接合部の疾患、例えば重症筋無力症（ＭＧ）、ランバート・イートン症候群（ＬＥＳ）、先天性筋無力症症候群（ＣＭＳ）、
内分泌異常に起因するミオパチー、例えば甲状腺機能亢進性ミオパチー（ＨＹＰＴＭ）、甲状腺機能低下性ミオパチー（ＨＹＰＯＴＭ）、
他のミオパチー、例えば先天性筋緊張症（ＭＣ、別名、トムゼン病及びベッカー病）、先天性パラミオトニア（ＰＣ）、セントラルコア病（ＣＣＤ）、ネマリンミオパチー（ＮＭ）、
筋細管ミオパチー／中心核ミオパチー（ＭＴＭ又はＣＮＭ）、周期性麻痺（ＰＰ、２つの形態：低カリウム血性及び高カリウム血性）。
【００１８】
「ＭＮＤ」により、運動機能を伴うニューロン、即ち、運動インパルスを運ぶニューロンに影響を及ぼす疾患を意味する。そのようなニューロンは、また、「運動ニューロン」と呼ばれる。これらのニューロンは、限定されないが、以下を含む：前部脊髄のアルファニューロン（骨格筋線維を神経支配するアルファ線維を生じる）；前部脊髄のベータニューロン（錘外及び錘内筋線維を神経支配するベータ線維を生じる）；前部脊髄のガンマニューロン（筋紡錘の錘内線維を神経支配するガンマ（紡錘運動）線維を生じる）；求心性インパルスが起こる筋肉以外の筋肉に供給する異名運動ニューロン；求心性インパルスが起こる筋肉に供給する同名運動ニューロン；細胞体が脊髄の腹側灰白柱中にあり、終末が骨格筋中にある下位末梢ニューロン；介在ニューロンからインパルスを受ける末梢ニューロン；及び、運動皮質から、脳神経の運動核に、又は、脊髄の腹側灰白柱にインパルスを伝導する大脳皮質中の上位ニューロン。
【００１９】
運動ニューロン障害の非限定的な例は、以下を含む：種々の筋萎縮症、例えば遺伝性筋委縮症（遺伝性脊髄性筋萎縮症を含む）、急性乳児脊髄性筋萎縮症、例えばウェルドニッヒ・ホフマン病など、小児における進行性筋萎縮症、例えば近位型、遠位型、及び延髄型など、青年期発症型又は成人発症型の脊髄性筋萎縮症（近位型、肩甲腓骨型、顔面肩甲上腕型、及び遠位型を含む）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び原発性側索硬化症（ＰＬＳ）。また、この用語内には、運動ニューロンの損傷が含まれる。
【００２０】
「筋萎縮性側索硬化症」（「ＡＬＳ」）という用語は、ルー・ゲーリック病とも呼ばれ、皮質、脳幹、及び脊髄の運動ニューロンに影響を及ぼす致死的疾患である。（Hirano, (1996) Neurology, 47(4 Suppl. 2): S63-6）。疾患の病因は未知であるが、１つの理論は、ＡＬＳにおける神経細胞死が、過剰な細胞外グルタミン酸に起因する神経細胞の過剰興奮の結果であるということである。グルタミン酸は、グルタミン酸作動性ニューロンにより放出され、グリア細胞中に取り込まれる神経伝達物質であり、そこで、それは酵素グルタミン合成酵素によりグルタミンに変換され、グルタミンは次にニューロンに再侵入し、グルタミナーゼにより加水分解され、グルタミン酸を形成し、このようにして神経伝達物質プールを補充する。正常な脊髄及び脳幹において、細胞外グルタミン酸レベルは、細胞外液中で低マイクロモルレベルに保たれている。なぜなら、グリア細胞（ニューロンを支持するために部分的に機能する）が、興奮性アミノ酸トランスポーター２型（ＥＡＡＴ２）タンパク質を使用して、グルタミン酸を即時に吸収するからである。ＡＬＳ患者における正常ＥＡＡＴ２タンパク質の欠損は、疾患の病理において重要であるとして同定された｛例、Meyer et al. (1998) J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 65: 594-596; Aoki et al. (1998) Ann. Neurol. 43: 645-653;Bristol et al. (1996) Ann Neurol. 39: 676-679）。ＥＡＡＴ２の低下したレベルについての１つの説明は、ＥＡＡＴ２が異常にスプライシングされていることである（Lin et al. (1998) Neuron, 20: 589-602）。異常スプライシングによって、ＥＡＡＴ２タンパク質のＣ末端領域中に位置付けられる４５〜１０７のアミノ酸の欠失を伴うスプライス変異体が産生される（Meyer et al.(1998) Neurosci Lett. 241: 68-70）。ＥＡＡＴ２の欠如又は欠陥に起因して、細胞外グルタミン酸が蓄積し、ニューロンの持続的な興奮を起こす。グルタミン酸の蓄積は、神経細胞に対して毒性効果を有している。なぜなら、ニューロンの持続的な興奮が早期細胞死を招くからである。ＡＬＳの病理について多くのことが公知であるが、家族性ＡＬＳにおける散発型の病原性及び突然変異ＳＯＤタンパク質の原因特性についてはほとんど公知ではない（Bruijn, et al. (1996) Neuropathol. Appl. Neurobiol, 22: 373-87; Bruijn, et al. (1998) Science 281: 1851-54）。多くのモデルが推測されており、グルタミン酸毒性、低酸素症、酸化ストレス、タンパク質凝集体、ニューロフィラメント、及びミトコンドリア機能障害を含む（Cleveland, et al. (1995) Nature 378: 342-43; Cleveland, et al. Neurology, 47 (4 Suppl. 2): S54-61, discussion S61-20996); Cleveland, (1999) Neuron, 24: 515-20;Cleveland, et al. (2001) Nat. Rev. Neurosci., 2: 806-19; Couillard-Despres, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. ScL USA, 95: 9626-30; Mitsumoto, (1997) Ann. Pharmacother., 31: 779-81; Skene, et al. (2001) Nat. Genet. 28: 107-8; Williamson, et al. (2000) Science, 288: 399）。
【００２１】
現在、ＡＬＳのための療法はなく、疾患の経過を予防又は逆転させるために効果的であることが判明している治療もない。いくつかの薬物が、近年、食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されている。今までに、ＡＬＳを処置するための試みには、細胞保護効果を有する長鎖脂肪アルコールを用いて（米国特許第５，１３５，９５６号を参照のこと）；又はピルビン酸塩を用いて（米国特許第５，３９５，８２２号を参照のこと）；及びグルタミン酸カスタードを遮断するためのグルタミン合成酵素を使用して（米国特許第５，９０６，９７６号を参照のこと）神経変性を処置することが含まれてきた。例えば、リルゾール（グルタミン酸放出阻害剤）が、米国において、ＡＬＳの処置のために承認されており、少なくとも一部のＡＬＳ患者の生存を３ヶ月間だけ延ばすと思われる。しかし、一部のレポートでは、リルゾール治療が生存時間をわずかに延長させるにもかかわらず、それは、患者において筋力の改善を提供するように思われないことが示されてきた。従って、リルゾールの効果は、治療によって患者のクオリティーオブライフが改変されない点で限定される（Borras-Blasco et al. (1998) Rev. Neurol, 27: 1021-1027）。
【００２２】
以下で使用される通り、「分子量」は、ＰＥＧの平均分子量を意味する。
【００２３】
本発明の「ＰＥＧ又はＰＥＧ基」は、ポリ（エチレングリコール）を必須部分として含む残基を意味する。そのようなＰＥＧは、結合反応のために必要であるさらなる化学基を含みうる；それらは分子の化学合成に起因する；又は、それは、互いからの分子の部分の最適な距離のためのスペーサーである。また、そのようなＰＥＧは、一緒に連結される１つ又は複数のＰＥＧ側鎖からなりうる。複数のＰＥＧ鎖を伴うＰＥＧ基は、マルチアームＰＥＧ又は分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧを、例えば、ポリエチレンオキシドの種々のポリオール（グリセロール、ペンタエリスリトール、及びソルビトールを含む）への付加により調製できる。例えば、４アーム分岐ＰＥＧを、ペンタエリスリトール及びエチレンオキシドから調製できる。分岐ＰＥＧは、通常、２〜８のアームを有し、例えば、ＥＰ−Ａ ０ ４７３０８４及び米国特許第５，９３２，４６２号において記載されている。特に好ましくは、リジンの第一級アミノ基を介して連結された２つのＰＥＧ側鎖を伴うＰＥＧ（ＰＥＧ２）である（Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。
【００２４】
本明細書において使用される「実質的に均質な」とは、産生される、含まれる、又は使用されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体分子だけが、付着された１つ又は２つのＰＥＧ基を有するものであることを意味する。この調製物は、少量の未反応（即ち、ＰＥＧ基を欠く）タンパク質を含みうる。ペプチドマッピング及びＮ末端シークエンシングにより確認される通り、以下の１例は、少なくとも９０%のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ変異体抱合体及び多くても５%の未反応タンパク質である調製物を提供する。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体のそのような均質な調製物の単離及び精製は、通常の精製方法、好ましくは分子ふるいクロマトグラフィーにより実施できる。
【００２５】
本明細書において使用される「モノＰＥＧ化」とは、ＩＧＦ−Ｉ変異体が、ＩＧＦ−Ｉ変異体１分子当たり１つのリジンだけでＰＥＧ化されることを意味し、それにより、１つのＰＥＧ基だけがこの部位で共有結合的に付着される。純粋なモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体（Ｎ末端ＰＥＧ化を伴わない）は、調製物の少なくとも８０%、好ましくは９０%、最も好ましくはモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は調製物の９２%又はそれ以上であり、残りは、例えば、未反応（非ＰＥＧ化）ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体である。本発明のモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の調製物は、従って、例えば、医薬的適用において、均質な調製物の利点を呈するだけ十分に均質である。同じことが、ジＰＥＧ化種に適用される。
【００２６】
本明細書において使用される「ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体」又は「アミノ反応性ＰＥＧ化」は、ＩＧＦ−Ｉ変異体が、ＩＧＦ−Ｉ変異体分子の１つ又は２つのリジンへのアミノ反応性共役により１つ又は２つのポリ（エチレングリコール）基に共有結合的に結合することを意味する。ＰＥＧ基は、リジン側鎖の第一級［エプシロン］アミノ基であるＩＧＦ−Ｉ変異体分子の部位に付着している。ＰＥＧ化は、また、Ｎ末端［アルファ］アミノ基で起こることがさらに可能である。使用される合成方法及び変異体に起因して、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、ＩＧＦ−Ｉ変異体の混合物（Ｋ６５、Ｋ６８、及び／又はＫ２７でＰＥＧ化されており、Ｎ末端ＰＥＧ化を伴う、又は伴わない）からなりうるが、それにより、ＰＥＧ化部位は、異なる分子において異なりうる、又は、１分子当たりのポリ（エチレングリコール）側鎖の量及び／又は分子中のＰＥＧ化部位に関して実質的に均質でありうる。好ましくは、ＩＧＦ−Ｉ変異体は、モノ及び／又はジＰＥＧ化されており、特に、Ｎ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体から精製される。
【００２７】
本明細書において使用される「ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）」は、市販されている、又は、当技術分野において周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合により調製できる水溶性ポリマーを意味する（Kodera, Y., et al., Progress in Polymer Science 23 (1998) 1233-1271; Francis, G. E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18）。「ＰＥＧ」という用語を広範に使用して、任意のポリエチレングルコール分子を包含し、ここで、エチレングリコール（ＥＧ）単位の数が、少なくとも４６０、好ましくは４６０〜２３００、特に好ましくは４６０〜１８４０である（２３０ ＥＧ単位は、分子量約１０kDaを指す）。ＥＧ単位の上限数は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の可溶性によってのみ限定される。通常、２３００単位を含むＰＥＧより大きなＰＥＧは使用されない。好ましくは、本発明において使用されるＰＥＧは、一端で、ヒドロキシ又はメトキシ（メトキシＰＥＧ、ｍＰＥＧ）で終結し、他端で、エーテル酸素結合を介してリンカー成分に共有結合的に付着している。ポリマーは直鎖又は分岐のいずれかである。分岐ＰＥＧは、例えば、Veronese, F. M., et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207において記載されている。
【００２８】
本発明の局面は、医薬的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、それを必要とする患者に投与することによる、神経筋障害、好ましくは運動ニューロン疾患、最も好ましくはＡＬＳの処置のための方法に関する。さらにより好ましい実施態様において、処置すべき疾患は、スーパーオキシドジスムターゼ１の突然変異を招く遺伝子欠損を原因とするＡＬＳである。
【００２９】
このＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、ＰＥＧが組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインのリジン残基に付着していることを特徴とし、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸位置２７、６５、及び６８に１つ又は２つのアミノ酸改変を保有し、位置２７、６５、及び６８のアミノ酸の１つ又は２つが極性アミノ酸であるが、しかし、リジンではない。
【００３０】
本明細書において使用される「極性アミノ酸」は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群より選択されるアミノ酸を指す。リジンも極性アミノ酸であるが、しかし、除外される。なぜなら、リジンは本発明により置き換えられるからである。アルギニンは、好ましくは、極性アミノ酸として使用される。
【００３１】
好ましくは、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下：
（ａ）Ｋ６５Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号２）
（ｂ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号３）
（ｃ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）
のアミノ酸改変により特徴付けられるＰＥＧ化形態の組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインである。
【００３２】
特別な優先度が、アミノ酸改変Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）を伴い、Ｋ６８でのモノＰＥＧ化により特徴付けられる、ＰＥＧ化形態の組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインに与えられる。
【００３３】
優先度が、また、上に記載されるリジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体及びＮ末端がＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の組成物に与えられ、ここでＩＧＦ−Ｉ変異体は、一次アミノ酸配列の点で、及び、１つ又は２つのアミノ酸改変を、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸位置２７、６５、及び６８に保有する点で同一であり、位置２７、６５、及び６８の１つ又は２つのアミノ酸は極性アミノ酸であるが、しかし、リジンではない。好ましくは、分子比は９：１〜１：９（比は、リジン‐ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体／Ｎ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を意味する）である。さらに好ましくは、モル比が少なくとも１：１（Ｎ末端がＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の１部分当たり少なくとも１部分のリジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体）、好ましくは少なくとも６：４（Ｎ末端がＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の４部分当たり少なくとも６部分のリジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体）である組成物である。好ましくは、リジン‐ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体及びＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の両方がモノＰＥＧ化されている。好ましくは、この組成物中では、変異体は、リジン‐ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体及びＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の両方において同一である。ＩＧＦ−Ｉ変異体は、好ましくは、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下：
（ａ）Ｋ６５Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号２）
（ｂ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号３）
（ｃ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）
のアミノ酸改変を有するＩＧＦ−Ｉムテインより選択される。
【００３４】
配列番号２〜４の好ましいＰＥＧ化形態の組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインは、リジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ又はリジンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の産生のための手順に従った場合に入手可能であり、変異体は、参照により本明細書において完全に組み入れられるＷＯ ２００８／０２５５２８ Ａ１において記載される通りに別の極性アミノ酸により独立的に置換されたリジン２７、６５、及び／又は６８からなる群より選択される１つ又は２つのアミノ酸を含む。ＷＯ ２００８／０２５５２８ Ａ１において記載されるプロセスによって、配列番号２〜４の組換えヒトＩＧＦ−Ｉムテインの調製が可能になり、それらはＮ末端ＰＥＧ化を持たない。
【００３５】
さらに好ましくは、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、Ｎ末端の３つまで（好ましくは３つ全て）のアミノ酸がトランケートされている変異体である。各野生型突然変異体をＤｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉと名付け、Ｎ末端からアミノ酸残基グリシン、プロリン、及びグルタミン酸が欠けている（Kummer, A., et al., Int. J. Exp. Diabesity Res. 4 (2003) 45-57）。
【００３６】
好ましくは、ポリ（エチレングリコール）基は、全体的な分子量、少なくとも２０kDa、より好ましくは約２０〜１００kDa、特に好ましくは２０〜８０kDaを有する。ポリ（エチレングリコール）基は直鎖又は分岐のいずれかである。
【００３７】
本明細書において使用されるアミノ反応性ＰＥＧ化は、反応性（活性化）ポリ（エチレングリコール）の使用により、好ましくは、好ましくはメトキシポリ（エチレングリコール）のＮヒドロキシスクシンイミジルエステルの使用により、ポリ（エチレングリコール）鎖をＩＧＦ−Ｉ変異体の第一級リジンアミノ基に無作為に付着させる方法を指定する。共役反応によって、ポリ（エチレングリコール）が、リジン残基の反応性第一級［エプシロン］アミノ基及び場合によりＩＧＦ−ＩのＮ末端アミノ酸の［アルファ］アミノ基に付着される。タンパク質へのＰＥＧのそのようなアミノ基の抱合は、当技術分野において周知である。例えば、そのような方法の概説が、Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417により与えられる。Veroneseによると、タンパク質の第一級アミノ基へのＰＥＧの抱合は、第一級アミノ基のアルキル化を実施する活性化ＰＥＧを使用することにより実施できる。そのような反応では、活性化アルキル化ＰＥＧ、例えばＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧトレシルクロリド、又はＰＥＧエポキシドを使用できる。さらなる有用な試薬は、アシル化ＰＥＧ、例えば、カルボキシル化されたＰＥＧ又は末端ヒドロキシ基がクロロホルメート又はカルボニルイミダゾールにより活性化されたＰＥＧのヒドロキシスクシンイミジルエステルなどである。さらなる有用なＰＥＧ試薬は、アミノ酸アームを伴うＰＥＧである。そのような試薬はいわゆる分岐ＰＥＧを含みうる。それにより、少なくとも２つの同一の又は異なるＰＥＧ分子が、ペプチドスペーサー（好ましくはリジン）により一緒に連結され、例えば、リジンスペーサーの活性化カルボン酸としてＩＧＦ−Ｉ変異体に結合する。モノＮ末端共役は、また、Kinstler, O., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 477-485により記載されている。
【００３８】
有用なＰＥＧ試薬は、例えば、Nektar Therapeutics Inc.から入手可能である。
【００３９】
ＰＥＧでの任意の分子量（例、約２０kDa〜１００kDa）を、実際的に望ましいとして使用できる（ｎは４６０〜２３００である）。ＰＥＧ中の反復単位の数「ｎ」は、ダルトンで記載される分子量について概算される。例えば、２つのＰＥＧ分子がリンカーに付着されている場合、ここで、各ＰＥＧ分子が同じ分子量１０kDaを有し（各ｎは約２３０である）、リンカー上のＰＥＧの総分子量は約２０kDaである。リンカーに付着したＰＥＧの分子量も異なりうる。例えば、リンカー上の２つの分子の内、１つのＰＥＧ分子が５kDaであり、１つのＰＥＧ分子が１５kDaでありうる。分子量は常に平均分子量を意味する。
【００４０】
アミノ反応性ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の産生のための適したプロセス及び好ましい試薬が、ＷＯ ２００６／０６６８９１において記載されている。改変は、例えば、Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417により記載される方法に基づいており、プロセスが上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体をもたらす限り施すことができることが理解される。本発明のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の調製のための特に好ましいプロセスが、ＷＯ ２００８／０２５５２８ Ａ１において記載されており、それは、参照により本明細書において完全に組み入れられる。
【００４１】
標的タンパク質中の３つまでの潜在的に反応性の第一級アミノ基（２つまでのリジン及び１つの末端アミノ酸）の出現は、ポリ（エチレングリコール）鎖の付着点において異なる一連のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の異性体をもたらす。
【００４２】
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、１つ又は２つのＰＥＧ基（直鎖又は分岐であり、それに無作為に付着している）を含み、それにより、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体中の全てのＰＥＧ基の全体的な分子量は、好ましくは、約２０〜８０kDaである。この範囲の分子量からの小さな逸脱が可能である。しかし、活性が、低下したＩＧＦ−Ｉ受容体の活性化及び血液脳関門輸送に起因して、分子量の増加にともない減少することが予測される。従って、ＰＥＧの分子量についての範囲２０〜１００kDaが、ＰＥＧの抱合体及びＭＮＤ、特にＡＬＳの効率的な処置のために有用なＩＧＦ−Ｉ変異体についての最適化された範囲として理解されるべきである。
【００４３】
医薬製剤
以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、循環中での改善された安定性により特徴付けられ、低い適用間隔、即ち、長期間隔を用いて、全身にわたるＩＧＦ−Ｉ受容体への持続的な接近を可能にする。
【００４４】
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、方法が当業者に公知である医薬組成物の調製のための方法に従って製剤化できる。そのような組成物の産生のために、本発明のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、好ましくは、医薬組成物の所望の成分を含む水溶液に対する透析により、薬学的に許容しうる担体との混合物中で組み合わされる。
【００４５】
そのような許容しうる担体が、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company（Oslo et al.による編集）（例、ｐｐ．１４３５−１７１２）において記載されている。典型的な組成物は、有効量の本発明の物質（例えば、約０．１〜１００mg/ml）を、適した量の担体と一緒に含む。組成物は非経口的に投与してよい。本発明のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉは、好ましくは、腹腔内、皮下、静脈内、又は鼻腔内適用を介して投与される。
【００４６】
本発明の医薬的製剤は、当技術分野において公知の方法に従って調製できる。通常、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の溶液は、医薬組成物中での使用が意図される緩衝液に対して透析され、所望の最終タンパク質濃度は濃縮又は希釈により調整される。
【００４７】
そのような医薬組成物は、好ましくは腹腔内、皮下、静脈内、又は鼻腔内適用を介した注射又は注入での投与のために使用でき、薬学的に許容しうる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／又は担体と一緒に有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を含んでよい。そのような組成物は、種々の緩衝液含有物（例、アルギニン、酢酸、リン酸）、ｐＨ、及びイオン強度の希釈剤、添加剤、例えば界面活性剤及び可溶化剤（例、Tween（商標）８０／ポリソルベート、プルロニック（商標）Ｆ６８）、抗酸化剤（例、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、保存剤（Timersol（商標）、ベンジルアルコール）及び増量物質（例、サッカロース、マンニトール）を含み、物質は、ポリマー化合物、例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸などの粒状調製物中に又はリポソーム中に組込まれる。そのような組成物は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の放出及びクリアランスの物理的状態の安定化率に影響を及ぼしうる。
【００４８】
投与量及び薬物濃度
典型的に、標準的な処置計画において、患者を、特定の期間にわたり、１kg当たり、１週間当たり、０．００１〜２０mg、好ましくは０．０１〜８mgの範囲のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の投与量で処置し、１週間から約３ヶ月間又はそれより長く持続する。薬物は、１ml当たり、以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体０．１〜１００mgを含む医薬的製剤の週１回皮下、静脈内、又は腹腔内ボーラス注射又は注入として適用される。この処置は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉを、標準的な処置の前、中、又は後に適用することにより、任意の標準的（例、化学療法）処置と組み合わせることができる。これは、標準的処置だけと比較し、改善された転帰をもたらす。
【００４９】
以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、処置の成功のために週１又は２回だけ投与できることが見出された。神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、さらにより好ましくはＡＬＳの処置のための方法は、従って、それを必要とする患者へ、以上に記載される治療的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、１kg当たり、及び３〜８日当たり、好ましくは７日当たり０．００１〜３mg、好ましくは０．０１〜３mgの範囲のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の各々１つの投与量で投与することを含むべきである。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体として、好ましくは、モノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が使用される。
【００５０】
以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、さらにより好ましくはＡＬＳの処置のための薬物の調製のために使用でき、それは、それを必要とする患者に治療的有効量で、及び、１kg当たり、及び６〜８日当たり、好ましくは７日当たり０．００１〜３mg、好ましくは０．０１〜３mgの範囲のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の１つ又は２つの投与量で投与される。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体として、好ましくは、モノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が使用される。
【００５１】
以上に記載されるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を、神経筋障害、好ましくはＭＮＤ、さらにより好ましくはＡＬＳの処置のための第２の薬理学的に活性な化合物と組み合わせた組み合わせで、別々に、連続的に、又は同時に使用することもできる。好ましくは、組み合わせの第２の薬理学的に活性な化合物が、グルタミン酸放出に対する阻害効果又は電位依存性ナトリウムチャネルの不活化の効果又は興奮性アミノ酸受容体での伝達物質の結合に続く細胞内事象に干渉する能力を有する少なくとも１つの神経保護薬である。
【００５２】
第２の薬理学的に活性な化合物は、好ましくは、リルゾールである。リルゾールによってＴＴＸ−Ｓナトリウムチャネルが遮断され、それは損傷したニューロンに関連する（Song JH, Huang CS, Nagata K, Yeh JZ, Narahashi T. Differential action of riluzole on tetrodotoxin-sensitive and tetrodotoxin-resistant sodium channels J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997; 282: 707-14）。これによってカルシウムイオンの流入が低下し、グルタミン酸受容体の刺激が間接的に妨げられる。直接的なグルタミン酸受容体の遮断と一緒に、運動ニューロンに対する神経伝達物質グルタミン酸の効果が低下する。
【００５３】
本明細書において使用される「リルゾール」という用語は、２−アミノ−６−（トリフルオロメトキシ）ベンゾチアゾール、６−（トリフルオロメトキシ）ベンゾチアゾール−２−アミン又はＣＡＳ−１７４４−２２−５を指す。この実施態様のより広い意味において、「リルゾール」という用語は、また、グルタミン酸放出に対する阻害効果、電圧依存性ナトリウムチャネルの不活化、及び、興奮性アミノ酸受容体での伝達物質の結合に続く細胞内事象に干渉する能力より選択される、やはりリルゾールを用いて観察される少なくとも１つの薬理学的特性を有する活性成分を含む。ＡＬＳにおけるリルゾールの使用がＵＳ ５，５２７，８１４において記載されており、化合物及びその調製がＥＰ ０５０ ５５１において開示されている。他の神経保護化合物が、例えば、Yagupolskii et al., Zhurnal Obschei Khimii 33 (7), 2301-7 (1963)により記載されている通りに調製できる。
【００５４】
以下の実施例、参考文献、及び図面を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲が添付の特許請求の範囲において記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載されている手順に改変を行うことができることが理解される。
【００５５】
配列リスト
配列番号１
野生型ヒトＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０１３４３に従ったＩＧＦ−Ｉ前駆体タンパク質のアミノ酸１〜７０）。
配列番号２
アミノ酸置換Ｋ６５Ｒ及びＫ６８Ｒを保有するヒトＩＧＦ−Ｉムテインのアミノ酸配列。
配列番号３
アミノ酸置換Ｋ２７Ｒ及びＫ６８Ｒを保有するヒトＩＧＦ−Ｉムテインのアミノ酸配列。
配列番号４
アミノ酸置換Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒを保有するヒトＩＧＦ−Ｉムテインのアミノ酸配列。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、マウスにおける１００μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの皮下注射後での血清検出を示す。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ又はｒｈＩＧＦ−Ｉの血清レベルは、示した時間点でＥＬＩＳＡ技術により検出された。
【図２】図２は、マウスにおけるｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１００μg/kg）の皮下注射後での海馬のＣＡ１ニューロンにおけるＩＧＦ−Ｉ免疫反応性を示す。示した時間点で、脳を除去し、ｈＩＧＦ−Ｉについて免疫染色した。海馬のＣＡ１領域からのデジタル画像を、ニューロン内の染色強度について分析した。
【図３】図３は、ビーグル犬におけるＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（２００−５０００μg/kg）の皮下注射後での血漿グルコースレベルを示す。グルコースレベルは、Ｒｏｃｈｅ ＡｋｋｕＣｈｅｃｋデバイスを使用して、各時間点で、血液滴から推定した。矢印は、５０００μg/kg用量での、雄イヌにおける重篤な低血糖症の有意な発生だけを示す。
【図４】図４は、ｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉを用いた５日間の処置後でのマウス初代運動ニューロンのインビトロでの生存を示す。Ｃ５７Ｂ１／６マウスからの初代運動ニューロンを、異なる濃度のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ又はｒｈＩＧＦ−Ｉの存在又は非存在において培養し、生存を、インビトロで５日目に位相差顕微鏡法により推定した。
【図５】図５は、賦形剤又は１５０μg/kgのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ s.c. ２日に１回（ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの握力を示す。動物を、前肢の筋力について週１回試験した。番号は、時間点当たりで分析された動物を示す（＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図６】図６は、賦形剤又は１５０μg/kgのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ s.c. ｑ２ｄで処置されたｐｍｎマウスでのロータロッド成績を示す。動物を、運動協調性について週１回試験した。番号は、時間点当たりの動物を示す（＊＊，ｐ＜０．０５）。
【図７】図７は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの顔面神経核中での運動ニューロンの生存を示す。動物を出生後３４日目に殺し、組織を組織学的検査のために処理した。運動ニューロン数の立体解析学的検査を盲検で実施し、値はマウス１匹当たりの総数を表わす（＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図８】図８は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの腰髄での運動ニューロンの生存を示す。動物を出生後３４日目に殺し、組織を組織学的検査のために処理した。運動ニューロン数の立体解析学的検査を盲検で実施し、値はマウス１匹当たりの総数を表わす（＊＊＊，ｐ＜０．００１）。
【図９】図９は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの近位横隔神経での有髄軸索数を示す。動物を出生後３４日目に殺し、組織を組織学的検査のために処理した。有髄軸索数の立体解析学的検査を盲検で実施し、値は横隔神経１つ当たりの総数を表わす（＊，ｐ＜０．０５）。
【図１０】図１０は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ２ｄ）で処置されたｐｍｎマウスの遠位横隔神経での有髄軸索数を示す。動物を出生後３４日目に殺し、組織を組織学的検査のために処理した。有髄軸索数の立体解析学的検査を盲検で実施し、値は横隔神経１つ当たりの総数を表わす（＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図１１】図１１は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ３．５日に１回（ｑ３．５ｄ））で処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスの体重分析を示す。体重を週１回評価し、値を、１００%に設定された最初の検査での体重について正規化した（＊，ｐ＜０．０５）。
【図１２】図１２は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ３．５ｄ）で処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスの疾患発症を示す。動物を週１回検査し、疾患発症を後肢脱力、異常歩行、及び逆ワイヤーメッシュ上に握る困難により定義した。カプラン・マイヤープロットは、出生後３４週目から処置された個々のマウスにおける疾患発症を示す。棒グラフは、両群についての疾患発症時での平均週齢を示す（ｐ＜０．０５）。
【図１３】図１３は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ３．５ｄ）で処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスの握力を示す。動物は、週１回、前肢の筋力について試験した。時間経過中に死亡する動物のＬＯＣＦ分析を、最後の測定値をさらなるデータに含めることにより実施した（＊，ｐ＜０．０５； ＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図１４】図１４は、賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c. ｑ３．５ｄ）で処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスでのロータロッド成績を示す。動物は、週１回、運動協調性について試験した。時間経過中に死亡する動物のＬＯＣＦ分析を、最後の測定値をさらなるデータに含めることにより実施した（＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１）。
【図１５】図１５は、神経筋単位に関連するＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのインビボでの作用を示し、ＡＬＳマウスモデルで実証された通りである。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、神経筋機能も改善させ、脳幹及び脊髄中の運動性軸索及び運動ニューロンを保護することが示された。従って、神経筋接合部の保持に関与する全ての部位に作用することが示唆されている。
【００５７】
方法：
マウス胎児運動ニューロンの培養
胎生期１２．５日のマウスからの脊髄運動ニューロンの培養を、モノクローナルラット抗ｐ７５抗体（Chemicon, Hofheim, Germany）を使用したパニング技術により調製した。個々の腰髄の腹外側部を切開し、１０μM ２−メルカプトエタノールを含むＨＢＳＳに移した。トリプシンでの処理後（０．０５%、１０分間）、単一細胞浮遊物を粉砕により生じさせた。細胞を、ラット抗体ｐ７５コーティング済み培養ディッシュ（Greiner, Nurtingen, Germany）上にプレーティングし、室温で３０分間静置した。個々のウェルを、その後、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；３回）を用いて洗浄し、付着細胞を、次に、脱分極生理食塩水（０．８% ＮａＣｌ、３５mM ＫＣｌ、及び１μM ２−メルカプトエタノール）を用いてプレートから単離した。細胞を、記載の通りにポリオルニチン及びラミニンでプレコーティングされた４ウェル培養ディッシュ（Greiner）中に密度３０００個細胞／ウェルでプレーティングした（Miller, T. M. et al., J. Biol. Chem. 272, 9847-9853, 1997）。細胞を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Life Technologies, Karlsruhe, Germany）、Ｂ２７サプリメント、１０%ウマ血清、５００μMグルタマックス、及び５０μg/mlアポトランスフェリン中で、３７℃で、５% ＣＯ２大気において増殖させた。培地の５０%を、最初に、１日目に、そして次に隔日で交換した。プレーティングされた細胞の初回カウントを、全ての細胞が培養ディッシュに付着した４時間後に行った。明るい相の細胞を、次に、追加で５日目にカウントした。１０の視野（１．１６mm２/視野）を、各ウェルにおいて、各時間点でカウントした。
【００５８】
血清ｒｈＩＧＦ−Ｉレベル又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉレベル及びＣＡ１ニューロン中でのニューロン内ＩＧＦ−Ｉ染色
血清ｒｈＩＧＦ−Ｉレベル又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉレベルの推定のために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの血液サンプルを、１００μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの単回皮下注射後に異なる時間点（１つの時間点当たりｎ＝４）で採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡアッセイにより処理した。ｒｈＩＧＦ−Ｉの検出のために、市販のｒｈＩＧＦ−Ｉアッセイ（ＤＳＬ）を使用した。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの検出のために、ストレプトアビジンコーティング済みアッセイマイクロプレートを、ビオチン化抗ＰＥＧ（ＩｇＭ）捕捉抗体でコーティングした。血清サンプルを、ジゴキシゲニン化ＩＧＦＢＰ−４を用いて１５時間にわたりインキュベートし、内因性ＩＧＦＢＰにより結合された任意のＩＧＦ−ＩをＩＧＦＢＰ−４により置換した。洗浄後、プレートを抗Ｄｉｇ−ＰＯＤ（Ｆａｂ）とインキュベートし、ＡＢＴＳ呈色反応により検出した。吸光シグナルを、SpectraMax M2ｅリーダーを用いて、４０５nm及び４９０nmで定量化した。
【００５９】
１００μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのいずれかの単回皮下注射後の異なる時間点で、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、イソフルラン麻酔下で断頭し、脳を除去した。半球をドライアイス中で急速凍結し、パラホルムアルデヒド（４%リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）中で後固定した。その後、４０μmの矢状スライス（sagittal slice）を、ビブラトーム（Zeiss）を用いて切った。免疫反応性の半定量的分析のために、２４枚のスライスを、外側縁から２ｍｍで開始して切った。４枚目ごとにスライスをカウントのために使用し、マウス１匹当たり合計６枚のスライスを明らかにした。スライスをヤギ抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体（R&D Systems）を用いて免疫染色し、核色素で対比染色した。二次検出を、ロバ抗ヤギＣｙ３（Jackson）を用いた標識により実施した。ＣＡ１ニューロンのデジタル画像を、十分に盲検で、ImagePro 4.5ソフトウェア（Media Cybernetics）を使用して半自動的に取得したＣＡ１細胞層にわたり、PixelFlyカメラ（Klughammer）を使用し、同じ強度及び染色強度で評価した。マウス１匹当たり６枚のスライスからの強度値を平均した。
【００６０】
血中グルコースの推定
ビーグル犬をＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（２００〜５０００μg/kg s.c.）で処置し、血液サンプルを６日間（１４４時間）までの異なる時間間隔後に採取した。血液グルコースを、血液滴から、AkkuCheckデバイス（Roche）を使用して評価した。
【００６１】
機能評価
マウスを定期的にモニターし、マウスが、後肢脱力、異常歩行、及び逆ワイヤーメッシュ上に握る困難を呈した場合に定義された疾患発症を評価した。ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）トランスジェニックマウスにおける疾患発症はばらつき（Gurney et al., Science 264 (5166): 1772-1775, 1994）、それは出生後第３週中にｐｍｎマウスにおいて生じる（Schmalbruch et al., J Neuropathol Exp Neurol 50(3): 192-204, 1991）。発生する脱力を評価するために、突然変異マウスを、出生後２４日目（ｐｍｎ突然変異マウス）又は出生後３４週目（ＳＯＤ Ｇ９３Ａ突然変異マウス）に開始する機能運動試験に週１回供した。前肢の握力（ニュートン）を、電子握力メーター（Columbus Instruments, Columbus, Ohio）での５回の試行を平均することにより記録した。また、マウスを、ロータロッド装置（Hugo Basile Bio. Res. App.）上でバランスを保持するそれらの能力について試験し、ロッドは、直線加速度４〜４０rpm（回転毎分）を受けた。各マウスによりロッド上に保持される時間（秒）（潜伏期）を、１セッション当たり３回記録した。出生後２４日目（ｐｍｎマウス）又は出生後３４週目（ＳＯＤ１マウス）での平均値を１００%と見なし、その後の分析からの結果を、この値に対して正規化した。
【００６２】
組織学的分析
ＰＥＧ ＩＧＦ−Ｉ及び賦形剤（即ち、ＰＥＧ ＩＧＦ−Ｉを伴わない各緩衝液）で処置したｐｍｎマウスの顔面神経核及び腰髄における運動ニューロン細胞体の数を、出生後３４日目に決定した。また、横隔神経の近位部及び遠位部中での有髄軸索の数を、これらのマウス突然変異体においてカウントした。動物を、ｐＨ７．４での０．１Mリン酸緩衝液中の４%パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流し、脳幹及び腰髄（Ｌ１−Ｌ６）を切開した。連続切片を、顔面神経核を含む脳幹領域から（７μm）及び腰髄から（１２．５μm）切った。ニッスル染色後、運動ニューロンを、５番目（顔面神経核）又は１０番目（脊髄）毎の切片においてカウントし、生カウント（raw count）を、分割核（split nuclei）について補正した（Masu et al., Nature 365: 27-32, 1993）。横隔神経を、４%パラホルムアルデヒド及び２%グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸緩衝液中で一晩後固定した。オスミウム酸染色及び脱水後、全てのサンプルをＳｐｕｒｒ媒質中に包埋した。光学顕微鏡検査のための半薄（０．５μm）断面を、ガラスナイフを用いて切って、アズールメチレンブルーで染色した。無傷の有髄線維の数を、デジタルカメラ（ActionCam; Agfa, Mortsel,Belgium）を備えたLeica（Nussloch, Germany）光学顕微鏡下で神経断片から撮影された写真から決定した。
【００６３】
実施例
実施例１：
ｒｈＩＧＦ−Ｉ及びＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの全身暴露を推定するために、１００μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの単回皮下注射後での薬物レベルを、特異的検出アッセイを使用してＣ５７Ｂ１／６マウスにおいて推定した。それにより、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、ｒｈＩＧＦ−１と比較し、強く長期化された半減期ならびにより高い血清暴露の両方を示した（図１）。この増加した末梢暴露が脳についても言えるか否かをさらに研究するために、これらのマウスの脳切片を、ヒトＩＧＦ−Ｉを認識する抗体を用いて免疫染色し、ＣＡ１領域中のニューロン内染色を評価した。ＣＡ１ニューロンのＩＧＦ−Ｉ染色が、ｒｈＩＧＦ−Ｉの皮下注射後２及び６時間目に増加し、しかし、２４時間後にベースラインのレベルに戻る（図２）。対称的に、増加したＩＧＦ−Ｉ染色が、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ注射後２４及び４８時間目に観察され、４８時間目により高いレベルに達した（図２）。これらのデータによって、ｒｈＩＧＦＩ及びＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの両方の脳侵入が、末梢暴露と類似の動態を示し、ｒｈＩＧＦ−Ｉと比較してＰＥＧ−ＩＧＦ−１のずっと高い末梢暴露が、ｒｈＩＧＦ−Ｉと比較して、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのより良好でより持続性の脳侵入についても言えることを示すことが示される。
【００６４】
実施例２：
ビーグル犬における毒性試験において、ｒｈＩＧＦ−Ｉでは、皮下注射で与えられた１５０μg/kgの比較的低用量でさえ低血糖症を急性的に誘導する大きな潜在能力が示されている（ＮＤＡレポート２１−８３９）。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの血糖降下能を分析するために、雄雌のビーグル犬を、２００〜５０００μg/kgの範囲での単回用量のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの皮下注射で処置した。図３において示す通り、最高２０００μg/kgまで、一貫した低血糖症は観察されなかった。しかし、５０００μg/kgの用量では、２匹の犬のうち１匹が重篤な低血糖症を受け（図２中の矢印を参照のこと）、グルコース注入により回復されなければならなかった；結果的に、グルコース試験はこの時間点で中止された。まとめると、これらのデータによって、２０００μg/kg s.c.までのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが、１５０μg/kgのｒｈＩＧＦ−Ｉで観察される低血糖症と類似の血糖降下能を有さないことが実証される（ＮＤＡレポート２１−８３９）。
【００６５】
実施例３：
ｒｈＩＧＦ−Ｉに関連するＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのインビトロでの活性を研究するために、両方の化合物を、運動ニューロンの生存に対するそれらの有効性について比較した。Ｅ １２．５齢のＣ５７Ｂ１／６マウス胚からの初代運動ニューロンを、異なる濃度のｒｈＩＧＦ−Ｉ又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの非存在又は存在において培養し、生存している運動ニューロンを５日後に位相差顕微鏡法によりカウントした。図４において示す通り、両方の化合物は、運動ニューロンの保護に対する同じ有効性を示した。データは、ｒｈＩＧＦ−Ｉ及びＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが同じ生物学的活性を有することを示す。
【００６６】
実施例４：
ｒｈＩＧＦ−Ｉについて、いくつかの局所的又は持続的な投与計画が、ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウス（ＡＬＳについて広く使用される動物モデル）において有効性を示している（Kaspar et al., Science 301: 839, 2003; Dobrowolny et al., J Cell Biol 168: 193, 2005; Nagano et al., J Neurol Sci 235: 61, 2005; Narai et al., J Neurosci Res 82: 452, 2005）。本発明者らは、従って、疾患の臨床発症の少し前に１５０μg/kgでの皮下注射で適用されたＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのインビボでの有効性を、ＡＬＳのための２つの独立モデル、ｐｍｎマウス及びＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）において研究した。
散発性ＡＬＳのモデルにおけるＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの試験のために、ｐｍｎマウスを使用した（Bommel et al., J Cell Biol 159: 563, 2002）。このＡＬＳモデルは、出生後２週間までに機能障害の最初の症状を発生し、出生後５〜６週目に死亡を招く。ｐｍｎマウスを、従って、２日ごとに（ｑ２ｄ）、賦形剤（ｎ＝１２）又は１５０μg/kgのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（ｎ＝１３） s.c.で、出生後１３日目から、即ち、疾患が始まったばかりの時に処置した。握力を分析することによる前肢の筋力の週１回の評価を使用し、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの明らかな効果が出生後４５日目に観察され、ここで、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉで処置された生存しているｐｍｎマウスが、賦形剤で処置された動物と比較し、有意に高い成績を示した（ｐ＜０．０５、ｎ＝４−５、図５）。ロータロッド上で費やされた時間を試験することによる運動協調性の分析によって、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉで処置されたｐｍｎマウスは、賦形剤で処置されたマウスよりも良好に行うことが明らかになり、出生後３８日目に有意であった（ｐ＜０．０５、ｎ＝８−１２、図６）。さらに、組織学的分析を、出生後１３日目から賦形剤又はＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（１５０μg/kg s.c.）で処置されたｐｍｎマウスから実施し、出生後３４日目に灌流した。顔面運動ニューロンの立体解析学的カウントによって、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ処理群において有意に高い数の生存している運動ニューロンが明らかになった（ｐ＜０．０１、ｎ＝６−１２、図７）。同様に、腰髄中の運動ニューロンの生存が有意に増加した（ｐ＜０．００１、ｎ＝５−６、図８）。最後に、横隔神経中の有髄軸索数の分析によって、賦形剤対ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ処置済みｐｍｎマウスを比較した場合に、近位横隔神経（ｐ＜０．０５、ｎ＝４−５、図９）ならびに遠位横隔神経（ｐ＜０．０１、ｎ＝５−６、図１０）中の有意に高い有髄軸索数が明らかになった。
【００６７】
家族性ＡＬＳについて最も広く使用されるモデルにおけるＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの試験のために、ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウス（低コピー）を使用した。これらのマウスは、出生後３４〜３５週目までに疾患の最初の症状を、その後４〜５週辺りで死亡を発生した。ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスは、従って、週に２回（ｑ３．５ｄ）、賦形剤（ｎ＝６）又は１５０μg/kgのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ（ｎ＝７） s.c.で、出生後３４週目から、即ち、疾患が始まったばかりの時に処置した。実験の経過を通して統計的検出力を確実にするために、ＬＯＣＦ（最終観察の引き延ばし補完法（last observation carried forward））分析を実施した。この方法（臨床試験においても使用される）では、全てのその後の時間点について、死亡前での動物の最後の測定が保持されている。体重変化の分析によって、疾患の初期段階（３７週目辺り）における体重の降下が、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ処置されたマウスにおいて有意に遅延されることが明らかになった（３７、３８、及び３９週目についてｐ＜０．０５、ｎ＝６−７ ＬＯＣＦ、図１１）。後肢脱力、異常歩行、及び逆ワイヤーメッシュ上に握る困難の最初の兆候により測定される疾患発症自体が、平均して、出生後３８．５週目〜４２．５週目までの４週間だけ遅延された（ｐ＜０．０５、ｎ＝６−７、図１２）。握力を分析することによる前肢の筋力の週１回の評価を使用し、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの有意な保護効果が、出生後３５週目から、継続的に、全ての動物の死亡まで観察された（３５、３８、４２、及び４３週目についてｐ＜０．０５、３６、３９、４０、及び４１週目についてｐ＜０．０１、ｎ＝６−７ ＬＯＣＦ、図１３）。ロータロッド上で費やされた時間を試験することによる運動協調性の分析によって、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉで処置されたＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスが、賦形剤で処置されたマウスよりも有意に良好に行うことが明らかになった（３７、３８、３９、及び４１週目についてｐ＜０．０５、４０、４２、及び４３週目についてｐ＜０．０１、ｎ＝６−７ ＬＯＣＦ、図１４）。
【００６８】
ｐｍｎマウス及びＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウスからの全てのインビボでのデータをまとめると、試験によって、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが、ＡＬＳモデルにおいて全ての関連標的で神経筋機能に干渉し、疾患の全ての段階で作用する潜在能力を有することが示されている。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉが、筋力及び機能を保存していることが示されており、恐らくは神経筋接合部及び接合性を保護することにより、筋肉に対する同化効果を示唆している。それに加えて、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、脊髄及び顔面神経核において運動性軸索及び運動ニューロン細胞体を救出することが示されており、運動ニューロンに対する直接的な保護効果を示唆している（図１５）。これらの変性がＡＬＳの後期で起こるため、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、恐らくは、初期及び後期の両方で疾患の経過に影響を及ぼしうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経筋障害の処置、予防、及び／又は遅延のための医薬組成物の製造のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ＩＧＦ−Ｉ変異体の使用であって、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、それが野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）に由来し、アミノ酸位置２７、６５、及び６８に１つ又は２つのアミノ酸改変を保有し、位置２７、６５、及び６８のアミノ酸の１つ又は２つが極性アミノ酸であるが、しかし、リジンではなく、ＰＥＧが少なくとも１つのリジン残基に付着していることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下：
（ａ）Ｋ６５Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号２）
（ｂ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号３）、又は
（ｃ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）
のアミノ酸改変により特徴付けられる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体がＫ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下：
Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）
のアミノ酸改変により特徴付けられる、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
前記ＰＥＧが全体的な分子量２０〜１００kDaを有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、Ｎ末端アミノ酸でさらにＰＥＧ化されている、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、Ｋ６５又はＫ６８のいずれかでモノＰＥＧ化されているか、又は、Ｋ６５及びＫ６８でジＰＥＧ化されている、請求項１〜５のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、３つまでのＮ末端アミノ酸がトランケートされていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、ポリ（エチレングリコール）基が分岐ポリ（エチレングリコール）基であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
前記神経筋障害が運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
前記ＭＮＤが筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、第２の薬理学的に活性な化合物と組み合わせた組み合わせにおいて、別々に、連続的に、又は同時に使用される、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
組み合わせの第２の薬理学的に活性な化合物が、グルタミン酸放出に対する阻害効果又は電位依存性ナトリウムチャネルの不活化の効果又は興奮性アミノ酸受容体での伝達物質の結合に続く細胞内事象に干渉する能力を有する少なくとも１つの神経保護薬である、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
第２の薬理学的に活性な化合物がリルゾールである、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
処置を必要とする被験者における神経筋障害の処置、予防、及び／又は進行の遅延のための方法であって、前記被験者に、請求項１〜８のいずれか一項記載の治療的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉを、薬学的に許容しうる形態で投与することを含む方法。
【請求項１５】
前記神経筋障害がＭＮＤ、好ましくはＡＬＳである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記神経筋障害の処置、予防、及び／又は進行の遅延のための薬学的に許容しうる形態の、請求項１〜８のいずれか一項記載のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
前記神経筋障害がＭＮＤ、好ましくはＡＬＳである、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１８】
本明細書に記載される発明。
【請求項１】
神経筋障害の処置、予防、及び／又は遅延のための医薬組成物の製造のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ＩＧＦ−Ｉ変異体の使用であって、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、それが野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）に由来し、アミノ酸位置２７、６５、及び６８に１つ又は２つのアミノ酸改変を保有し、位置２７、６５、及び６８のアミノ酸の１つ又は２つが極性アミノ酸であるが、しかし、リジンではなく、ＰＥＧが少なくとも１つのリジン残基に付着していることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下：
（ａ）Ｋ６５Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号２）
（ｂ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６８Ｒ（配列番号３）、又は
（ｃ）Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）
のアミノ酸改変により特徴付けられる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体がＫ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下：
Ｋ２７Ｒ及びＫ６５Ｒ（配列番号４）
のアミノ酸改変により特徴付けられる、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
前記ＰＥＧが全体的な分子量２０〜１００kDaを有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、Ｎ末端アミノ酸でさらにＰＥＧ化されている、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、Ｋ６５又はＫ６８のいずれかでモノＰＥＧ化されているか、又は、Ｋ６５及びＫ６８でジＰＥＧ化されている、請求項１〜５のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、３つまでのＮ末端アミノ酸がトランケートされていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、ポリ（エチレングリコール）基が分岐ポリ（エチレングリコール）基であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
前記神経筋障害が運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
前記ＭＮＤが筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、第２の薬理学的に活性な化合物と組み合わせた組み合わせにおいて、別々に、連続的に、又は同時に使用される、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
組み合わせの第２の薬理学的に活性な化合物が、グルタミン酸放出に対する阻害効果又は電位依存性ナトリウムチャネルの不活化の効果又は興奮性アミノ酸受容体での伝達物質の結合に続く細胞内事象に干渉する能力を有する少なくとも１つの神経保護薬である、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
第２の薬理学的に活性な化合物がリルゾールである、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
処置を必要とする被験者における神経筋障害の処置、予防、及び／又は進行の遅延のための方法であって、前記被験者に、請求項１〜８のいずれか一項記載の治療的有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉを、薬学的に許容しうる形態で投与することを含む方法。
【請求項１５】
前記神経筋障害がＭＮＤ、好ましくはＡＬＳである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記神経筋障害の処置、予防、及び／又は進行の遅延のための薬学的に許容しうる形態の、請求項１〜８のいずれか一項記載のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
前記神経筋障害がＭＮＤ、好ましくはＡＬＳである、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１８】
本明細書に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１１−５１８７７８（Ｐ２０１１−５１８７７８Ａ）
【公表日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２３４１（Ｐ２０１１−５０２３４１）
【出願日】平成２１年３月２４日（２００９．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３４６５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２１７５９
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２４日（２００９．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３４６５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２１７５９
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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