神経障害性疼痛の代用マーカー
本開示は、神経障害性疼痛ならびに薬物もしくは薬物候補の神経栄養活性あるいは他の活性を評価するための、方法および組成物を提供する。この開示される方法において、皮膚生検試料由来の組織抽出物中のある遺伝子の発現が、関係する最終結果の代理として役立つ。本発明は、皮膚生検試料を非組織学的に、神経障害性疼痛の状態を反映する遺伝子（類）（「神経障害性疼痛代用マーカー」。「損傷・疾患マーカー」とも呼ばれる）の発現に関して評価することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００４年２月２０日に出願された米国特許出願第１０／７８４，００４号の優先権を主張し、この出願は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、神経学および薬理学の分野にある。本発明は、概して、神経障害性疼痛を評価する方法ならびに、神経障害を処置するための薬物あるいは薬物候補の生物学的活性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
疼痛を伴う神経障害は、異痛あるいは痛覚過敏等の、自発的および／または異常な刺激誘発性疼痛によって特徴づけられる。神経障害性疼痛の症状としては、しばしば、自発的痙攣痛、もしくは灼熱痛、伝激痛、または正常であれば無害な刺激によって引き起こされる疼痛が挙げられる。神経障害性疼痛は神経から生じ、即ち、末梢神経系もしくは中枢神経系における一次病変あるいは機能不全から始まる、あるいはこれに起因する（例えば非特許文献１を参照のこと）。神経障害性疼痛は、感染性因子（例えばヘルペスウイルス等）、代謝疾患（例えば糖尿病等）、神経組織変性疾患（例えば多発性硬化症等）、神経損傷（例えば切断もしくは癌による神経圧迫等）等に起因する神経損傷の結果として発生しうる。慢性神経障害性疼痛に対する現在の薬理学的治療ならびに非薬理学的治療は、部分的な緩和を提供するのみであり、その成果は個々の患者において幅広く異なる。
【０００４】
末梢神経系に影響を及ぼす状態によって、知覚細繊維の欠損および／または髄鞘脱落等の病態生理学変化が生じる。当該変化は、皮膚にて組織学的に観察することができる。実際、皮膚生検材料の組織学的評価は、神経障害性疼痛あるいは末梢神経障害を有する患者の末梢神経状態を評価するための認められた方法となっている（非特許文献２）。このアプローチによって、疾患における神経損傷、ならびに治療に伴う神経再生／再支配の進行の評価が可能となる。計数する診断基準としては、表皮神経線維密度、皮膚−表皮接合部を横切る繊維の数等が挙げられる。皮膚生検は、時間経過に応じて複数の部位にて実施することができ、これによって表皮神経支配の空間時間的特性を評価することができる。しかしながら、皮膚生検の組織学的分析は、大きな労力および時間を消費する作業である。
【０００５】
従って、当該分野においては、神経障害性疼痛および末梢神経障害の処置および評価のための新しい方法を開発する必要がある。
【非特許文献１】Ｍｅｒｓｋｅｙ ａｎｄ Ｂｏｇｄｉｋ （１９９４） Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐａｉｎ： Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐａｉｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐａｉｎ Ｔｅｒｍｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｓｅａｔｔｌｅ： ＩＡＳＰ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２】Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．， １４：６５５−６５９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、皮膚生検試料を非組織学的に、神経障害性疼痛の状態を反映する遺伝子（類）（「神経障害性疼痛代用マーカー」。「損傷・疾患マーカー」とも呼ばれる）の発現に関して評価することができるという認識に由来する。当該遺伝子の発現は、迅速且つ定量的な様式で皮膚生検材料ホモジェネートにて測定することができる。皮膚パンチ生検試料におけるこの遺伝子（類）の発現が、神経障害性疼痛あるいは末梢神経障害に対する薬物もしくは薬物候補の有益な効果と相関するのであれば、この読み出した情報（ｒｅａｄ ｏｕｔ）は、神経障害性疼痛および／または末梢神経障害の軽減に関係する薬物活性の代用マーカー（「神経栄養活性の代用マーカー」）を表す。さらに、神経障害性疼痛の状態に拘わらず、皮膚パンチ生検試料中の遺伝子発現を、薬物もしくは薬物候補のインビボでの生物学的活性の読み出した情報（「神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカー」、あるいは短くして「神経栄養因子の生体マーカー」。「神経栄養因子への曝露のマーカー」とも呼ぶ）として使用することができる。
【０００７】
一局面において、本発明は、神経障害性疼痛の代用マーカーを同定する方法を提供する。この神経障害性疼痛の代用マーカーを同定する方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この第１試料およびこの第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。この第１試料の核酸の量または該タンパク質の量と、この第２試料の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、この核酸またはこのタンパク質が神経障害性疼痛の代理マーカーであることを示す。
【０００８】
別の一局面において、本発明は、当該代用マーカーを使用する、神経障害性疼痛のレベルを評価する方法を提供する。神経障害性疼痛の代用マーカーを使用する、神経障害性疼痛のレベルを評価する方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この第１試料およびこの第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、この核酸またはタンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである、工程。第１試料中の核酸の量またはタンパク質の量と、第２試料中の同じ核酸の量またはタンパク質の量の間の差異は、神経障害性疼痛のレベルを示す。
【０００９】
別の一局面において、本発明は、例えば、神経障害性疼痛のレベルに対する化合物または組成物の効果を評価することにおいて、化合物もしくは組成物の神経栄養活性を評価する方法を提供する。この方法は以下を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛を有する哺乳動物にその化合物または組成物を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の核酸またはタンパク質である、神経障害性疼痛の代理マーカーの少なくとも１種の量を決定する工程。
工程（ｄ）において決定された核酸の量またはタンパク質の量と、この化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、神経障害性疼痛に対するこの化合物または該組成物の効力のレベルを示す。
【００１０】
別の一局面において、本発明は、神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーを同定する方法、ならびに当該生体マーカーを使用する、神経栄養因子のインビボでの生物学的活性を評価する方法を提供する。神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーを同定する方法は、以下を包含する：
（ａ）哺乳動物にその因子を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。
工程（ｄ）において決定された核酸の量またはタンパク質の量と、この因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、この核酸またはタンパク質がこの因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーであることを示す。
【００１１】
別の一局面において、本発明は、神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーを使用する、当該因子のインビボでの生物学的活性を評価する方法を提供する。神経栄養因子のインビボでの生物学的活性を評価する方法は、以下を包含する：
（ａ）哺乳動物にその因子を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。
工程（ｄ）において決定された核酸の量またはタンパク質の量と、この因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、この因子が生物学的に活性であることを示す。
【００１２】
例示的実施形態において、評価の対象となる神経栄養因子は、アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）（ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）あるいはエノビン（ｅｎｏｖｉｎ）とも呼ばれる）であり、これはグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーである。
【００１３】
ヒトおよびラットの神経障害性疼痛代用マーカー、神経栄養活性の代用マーカー、および神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーの、例示となるヌクレオチド配列ならびに／またはアミノ酸配列もまた提供する（表１および１ａを参照のこと）。
【００１４】
【表１】
＊ ＳＭＰ−神経障害性疼痛の代用マーカー；
ＳＭＮ−神経栄養活性の代用マーカー；
ＢＭＮ−神経栄養因子の生体マーカー。
＊＊ この表ならびに全ての表において、ＤＮＡは、任意の核酸（例えばｍＲＮＡおよびＤＮＡを含む）を指す。
【００１５】
【表１ａ】
本発明の様々な実施形態は、以下の説明において記載されるか、あるいは、この説明から理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明を導く実験において、ラットを片側脊髄神経結紮（ＳＮＬ）に供して、片側性神経障害性疼痛を誘導した。ＳＮＬの後、一部のラットには、神経障害性疼痛を緩和することが示されている神経栄養因子であるアルテミン（Ｇａｒｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， ９（１１）：１３８３−１３８９）を全身的に投与した。誘発された神経障害性疼痛は、行動試験を用いて評価した。次に、両側から皮膚試料を採取し、組織抽出物を調製した。これらの組織抽出物由来のＲＮＡを、アフィメトリクスＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭで発現分析し、様々な試料中の遺伝子発現プロフィールを測定した。
【００１７】
組織は不均質であるため、通常、組織試料における小規模な転写の変化を検出するのは難しく、特にこの変化が少数の細胞亜集団に限定される場合、あるいは間接的な影響の結果である場合に困難である。こうした難点にも拘わらず、本発明は、一部、皮膚生検試料ホモジェネート中の遺伝子発現の検出可能な変化が、神経障害性疼痛の状態を反映しているという発見ならびに実証に基づく。
【００１８】
特に、本発明の方法を用いて、その発現レベルが神経障害性疼痛に相関する遺伝子（神経障害性疼痛の代用マーカー）を同定することができる。また本発明を用いて、特に、少なくとも部分的にはアルテミン処置によってその発現レベルが正常化されるこれらの遺伝子のサブセット（神経栄養活性の代用マーカー）を同定することもできる。本発明を用いて、神経障害性疼痛の状態に拘わらず、発現レベルが生物学的に活性なアルテミンの存在と相関する遺伝子のさらなるセット（神経栄養活性の生体マーカー）を同定することもできる。
【００１９】
（神経障害性疼痛の代用マーカー）
本発明は、哺乳動物において神経障害性疼痛の代用マーカーを同定する方法を提供し、この方法は以下を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この第１試料およびこの第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。
ここでこの第１試料の核酸の量またはタンパク質の量と、この第２試料の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、この核酸またはこのタンパク質が神経障害性疼痛の代理マーカーであることを示す。いくつかの実施形態において、第１試料中のこの核酸またはタンパク質の量は、第２試料中の同じ核酸あるいはタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、あるいは１００倍以上異なる。この差異（「倍数変化」とも称する）は、関連する遺伝子の下方制御もしくは上方制御と神経障害性疼痛との相関関係を示す。発現の倍数変化がより大きくなるほど、かつ／または神経障害性疼痛との相関性が高くなるほど、その核酸またはタンパク質は、神経障害性疼痛の代用マーカーとしてより好ましい。
【００２０】
第１試料および第２試料は、同一の哺乳動物から得られてもよいし、別々の哺乳動物から得られてもよい。例えば、第１試料および第２試料は、同一の哺乳動物の皮膚の別々の領域から得ることができ、一つは神経障害性疼痛または末梢神経障害に罹患している領域であり、もう一方は、疼痛または神経障害に罹患していない領域である。別の例において第１試料および第２試料は、同一の哺乳動物の皮膚の同じ領域から得られるが、異なるタイミングで得られ得る。例えば、第１試料を、神経障害性疼痛を誘発する前に採取し、第２試料を、神経障害性疼痛を誘発後に得る。さらに別の例において、第１試料を神経障害性疼痛に罹患している領域から採取し、第２試料を、処置後に同じ領域から得ることができる。あるいは、第１試料ならびに第２試料を、別々の哺乳動物から得ることができ、統計分析を用いて共通するコントロールを参照して、核酸あるいはタンパク質の量を比較する。
【００２１】
ラットにて神経障害性疼痛の代用マーカーを同定する例示的方法は、実施例において提供される。３０８のラット核酸（表２）を、これらの例示的方法に従って同定した。続いて対応するタンパク質配列およびヒトオルソログを、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ等の公に利用可能なデータベースを用いて同定した。１６２のラットタンパク質配列（表３）、１６０のヒト核酸配列（表４）、および１６０のヒトタンパク質配列（表５）を、このようにして同定した。
【００２２】
本発明は、哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルを評価する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この第１試料およびこの第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、この核酸またはタンパク質が神経障害性疼痛の代用マーカーである、工程。
ここでこの第１試料の核酸の量またはタンパク質の量と、この第２試料の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、神経障害性疼痛のレベルを示す。いくつかの実施形態において、第１試料中のこの核酸の量またはタンパク質の量は、第２試料中の同じ核酸の量またはタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、または１００倍以上異なる。関連する神経障害性疼痛の代用マーカーの発現レベルにおける差異（「倍数変化」）は、神経障害性疼痛のレベル、すなわち程度と相関する。一般に、神経障害性疼痛の代用マーカーが呈する倍数変化の値が大きければ大きいほど、神経障害性疼痛の程度がより大きいことを示す。
【００２３】
本明細書に記載したように、第１試料および第２試料は、同一の哺乳動物から得てもよいし、別々の哺乳動物から得てもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、神経障害性疼痛の代用マーカーは核酸である。例示的実施形態において、この核酸は、配列番号１〜３０８、好ましくは、配列番号１〜４２のラットヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経障害性疼痛の代用マーカーは、配列番号４７１〜６３０、好ましくは、配列番号４７１〜４９３のヒトヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの非重複部分配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、神経障害性疼痛の代用マーカーはタンパク質である。例示的実施形態において、このタンパク質は、配列番号３０９〜４７０、好ましくは、配列番号３０９〜３３３のラットタンパク質配列のうちのいずれか一つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経障害性疼痛の代用マーカーは、配列番号６３１〜７９０、好ましくは、配列番号６３１〜６５３のヒトタンパク質配列のうちのいずれか一つの非重複部分配列を含む。
【００２６】
神経障害性疼痛が発生する可能性のある状態、ならびにこのため診断または処置の過程において評価を必要とし得る状態としては、外傷的（医原的なものを含む）神経損傷、虚血性神経障害、神経圧迫／エントラップメント、多発性神経障害（遺伝性、代謝性、毒性、炎症性；感染性、腫瘍随伴性、栄養性、アミロイド症ならびに脈管炎におけるもの）、神経叢損傷神経根圧迫、切断手術後の断端痛および幻肢痛、帯状疱疹／帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛および舌咽神経痛、癌関連神経障害（腫瘍の神経浸潤、外科的神経損傷、照射誘発神経損傷、化学療法誘発神経障害に起因する）、脳卒中（梗塞あるいは出血）、多発性硬化症、脊髄損傷、脊髄空洞症／延髄空洞症、癲癇、ならびに空間占拠性病変（ｓｐａｃｅ−ｏｃｃｕｐｙｉｎｇ ｌｅｓｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な傷害の例としては、糖尿病性神経障害、ＡＩＤＳの感覚神経障害ならびに抗レトロウイルス毒性神経障害、特発性細繊維神経障害、らい病、ファブリー病が含まれる。さらに、神経障害性疼痛を評価する方法を用いて、例えば実施例にて記載したラットにおけるＳＮＬ誘発神経障害性疼痛等の、実験動物にて誘発された神経障害性疼痛を評価することができる。
【００２７】
本発明の方法を用いる痛みの評価は、薬理学的処置および／または非薬理学的処置の過程にて実施され得る。神経障害性疼痛の非薬理学的処置としては、経皮的電気神経刺激、脊髄刺激、運動皮質刺激、脳深部刺激、減圧術、神経腫切除、神経切離、グリセリン注入、神経病変／神経根病変の高周波処理、後根入口帯病変、ならびに脊髄神経路切断術が挙げられる。
【００２８】
（神経栄養活性の代用マーカー）
神経障害性疼痛の代用マーカーのサブセットは、神経障害性疼痛を軽減する化合物または組成物を用いる処置の結果として正常化されると予測される。
【００２９】
従って、本発明は、哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルに対する化合物または組成物の影響を評価する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛を有する哺乳動物にその化合物または組成物を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、この核酸またはタンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである工程。
ここで工程（ｄ）において決定された核酸の量またはタンパク質の量と、この化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、神経障害性疼痛に対するこの化合物または組成物の効力のレベルを示す。
【００３０】
この化合物あるいは組成物の非存在下で発現される核酸の量またはタンパク質の量は、任意の適切な方法によって測定することができる。一方法において、その試料中の核酸の量またはタンパク質の量は、化合物または組成物の非存在下での同じ哺乳動物あるいは別の哺乳動物から得られた別の試料中で発現される同じ核酸の量あるいは同じタンパク質の量と比較される。コントロール試料は、分析前、分析中、または分析後に採取され得る。別の方法では、この試料中の核酸の量またはタンパク質の量は、１つ以上の内部基準の量と比較される。内部基準は所定の条件下での発現レベルが既知である核酸またはタンパク質である。最も代表的には、この基準は、ハウスキーピング遺伝子（例えば、アクチンまたはＧＡＰＤＨ）等の様々な条件下で比較的一定のままである遺伝子である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、工程（ｄ）において決定される量は、その化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、または１００倍以上異なる。正常な状態（実質的に神経障害性疼痛のない状態）におけるベースライン発現レベルへ向かって神経障害性疼痛の関連する代用マーカーの発現レベルが「正常する」とは、その化合物または組成物が神経障害性疼痛を軽減することを示す。神経障害性疼痛の条件と「正常化」（「倍数変化が戻る」）条件での発現レベルの差異は、評価の対象である化合物または組成物の神経栄養活性のレベルを示す。一般に、倍数変化が戻る値が大きければ大きいほど、その化合物または組成物が、神経障害性疼痛の処置において、より大きな効力を呈すると予測される。倍数変化が戻る値が大きいほど好ましいが、特定の神経障害性疼痛の代用マーカーに関する倍数変化が戻る値は、対応する、そのマーカーの倍数変化の値を実質的に超えないことが好ましい。
【００３２】
ラットにおける神経障害性疼痛のレベルに対する化合物または組成物の影響を評価する例示的方法を、実施例において提供する。１０７のラット核酸（表６）を、これらの方法に従って同定した。続いて対応するタンパク質配列およびヒトオルソログを、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ等の公に利用可能なデータベースを用いて同定した。６５のラットタンパク質配列（表７）、７６のヒト核酸（表８）、ならびに７６のヒトタンパク質配列（表９）をこの方法で同定した。
【００３３】
いくつかの実施形態において、神経栄養活性の代用マーカーは核酸である。例示的実施形態において、この核酸は、配列番号７９１〜８９７、好ましくは、配列番号７９１〜８１４のラットヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態では、神経栄養活性の代用マーカーは、配列番号９６３〜１０３８、好ましくは、配列番号９６３〜９７９のヒトヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む核酸である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、神経栄養活性の代用マーカーはタンパク質である。例示的実施形態において、このタンパク質は、配列番号８９８〜９６２、好ましくは、配列番号８９８〜９１４のラットタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態では、神経栄養活性の代用マーカーは、配列番号１０３９〜ＮＯ：１１１４、好ましくは、配列番号１０３９〜１０５５のヒトタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含むタンパク質である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、評価の対象となる化合物または組成物は、神経栄養因子である、あるいは神経栄養因子を含む。「神経栄養因子」は、神経栄養活性を持つ化合物であり、例えば生殖、生存、成長、または神経の正常な生理学的機能の維持に影響を及ぼす化合物である。神経栄養活性は、当該分野で公知である１つ以上の方法によって評価／測定することができ、例えば以下の方法がある：
（１）ＲＥＴキナーゼ受容体活性化ＥＬＩＳＡ（ＫＩＲＡ）（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎｅｕｒｏｎ， ２０：２４５；Ｓａｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ． １９９６， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９６． ２３５（２）：２０７）；
（２）コリンアセチルトランスフェラーゼ酵素アッセイ（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ， ３４１：１４９）；
（３）ドーパミン作動性ニューロンを用いる３Ｈ−ドーパミン取り込みアッセイ（Ｌｅｖ−Ｆｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６０：１１３０）；あるいは、
（４）ラットクロム親和性細胞腫由来細胞系ＰＣ１２アッセイ（Ｅｒｎｆｏｒｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ， ３５０：１７５６；Ｄａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓａｙ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ”， Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ４ （Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．編），ｐｐ．７９−８３， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｒａｄｓｈａｗ （１９７８） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， ４７：１９１）。
【００３６】
例示的実施形態において、評価される神経栄養因子はアルテミンである。神経栄養因子の他の例としては、ＧＤＮＦファミリーの他のメンバー（例えばＧＤＮＦ、ニューチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ））、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−３（ＮＴ−３）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、インターロイキン６（ＩＬ６）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ミッドカイン、ニューロトロフィン（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−４（ＮＴ−４）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、プレイオトロフィン、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ならびにインスリン様成長因子１型（ＩＧＦ−１）が挙げられる。さらに別の神経栄養因子の例としては、これらの神経栄養因子あるいはそれらの各々の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストが挙げられる。アゴニストおよび／またはアンタゴニストの例としては、神経栄養因子に対する抗体、あるいは、それらの受容体およびその受容体の可溶性形態（例えば、ＧＦＲ−α（ニューチュリンに対する受容体）；ＲＥＴα４（パーセフィンに対する受容体）；ＧＦＲα３（アルテミンに対する受容体）；ＴｒｋＡ（ＮＧＦに対する受容体）；ＴｒｋＢ（ＢＤＮＦに対する受容体；ＴｒｋＣ（ＮＴ−３に対する受容体）；ｇｐ１３０／ＬＩＦＲβ（ＬＩＦに対する受容体）；およびｇｐ１３０（ＩＬ６に対する受容体））が挙げられる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、評価の対象となる化合物または組成物は、神経障害を処置するための薬物もしくは薬物候補であり、これには本明細書にて記載される神経栄養因子が含まれる。現在、神経障害性疼痛の処置のために使用され、よって、神経栄養活性に関して評価され得るる薬物の例としては、抗鬱薬（アミトリプチリン、マプロチリン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤）、抗癲癇剤（ガバペンチン、カルバマゼピン、クロナゼパン、ラモトリジン、トピラメート、フェニトイン）、局所麻酔薬、メキシレチン、バクロフェン、クロニジン、ケタミン、デキストロファン、トラマドール、グアネチジン、ならびにオピオイド類（モルヒネ、メタドン、ケトベミドン、フェンタニル）が挙げられる。
【００３８】
（神経栄養因子の生体マーカー）
本発明は、「神経栄養因子（本明細書で記載されているもの）」の生物学的活性の生体マーカーを同定する方法を提供する。この方法は以下を包含する：
（ａ）哺乳動物に、この因子を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。
ここで工程（ｄ）において決定されたこの核酸の量またはタンパク質の量と、この因子の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量との差異は、この核酸またはタンパク質が、この因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーであることを示す。いくつかの実施形態において、工程（ｄ）で決定された量は、その因子の非存在下で発現される同じの核酸の量または同じタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、または１００倍以上異なる。生物学的に活性な神経栄養因子の存在に起因する発現レベルの差異を、「生体マーカー倍数変化」と名付ける。生体マーカー倍数変化の値が大きければ大きいほど、その核酸あるいはタンパク質は神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーとしてより好ましい。いくつかの生体マーカー（例えば配列番号１１２０および配列番号１１２６）は、疼痛の代用マーカーともなる。すなわち、これらマーカーは、神経障害性疼痛および生物学的に活性な神経栄養活性の存在の双方に相関する。さらに、これら生体マーカーのいくらか（例えば配列番号１１２０および配列番号１１２６）は、神経栄養活性の代用マーカーとして役立ち得る。
【００３９】
化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量は、任意の適切な方法によって測定され得る。皮膚生検試料は、同一の哺乳動物から得られてもよいし、別個の哺乳動物から得られてもよい。
【００４０】
ラットにおける「神経栄養因子」の生物学的活性の生体マーカーを同定する例示的方法を、以下の実施例において提供する。４９のラットの核酸（表１０）を、以下の方法に従って同定した。さらに１３のラット核酸（表１６）を、実施例２に従って同定した。次に、対応するタンパク質配列およびヒトオルソログを、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ等の公に利用可能なデータベースを用いて同定した。１５のラットタンパク質配列（表１１）、２９のヒト核酸配列（表１２）、および２９のヒトタンパク質配列（表１３）を同じように同定した。さらに、１１のラットタンパク質配列（表１７）、１２のヒト核酸配列（表１８）、および１２のヒトタンパク質配列（表１９）が、表１６にある配列に対応すると同定された。
【００４１】
本発明は神経栄養因子の生物学的活性を評価するための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
（ａ）哺乳動物に、この因子を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、この核酸またはタンパク質は、この神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーである工程。
ここで工程（ｄ）において決定されたこの核酸の量またはタンパク質の量と、この因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、この因子が生物学的に活性であることを示す。いくつかの実施形態において、工程（ｄ）で決定される量は、その因子の非存在下で発現される同じの核酸の量または同じタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、または１００倍以上異なる。
【００４２】
化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量は、任意の適切な方法で測定することができる。皮膚生検試料は、同一の哺乳動物から得手もよいし、別個の哺乳動物から得てもよい。
【００４３】
例示的実施形態において、評価の対象となる神経栄養因子は、ＧＤＮＦファミリーのメンバーであるアルテミンである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは核酸である。例示的実施形態（例１を参照のこと）において、この核酸は、配列番号１１１５〜１１６３、好ましくは、配列番号１１１５〜１１２０のラットヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは、配列番号１１７９〜１２０７、好ましくは、配列番号１１７９〜１１８２のヒトヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。
【００４５】
さらに別の例示的実施形態（例２を参照のこと）において、この核酸は、配列番号１２５２〜１２６４、好ましくは、配列番号１２５２〜１２５６のラットヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは、配列番号１２７６〜１２８７、好ましくは、配列番号１２７６〜１２８０のヒトヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーはタンパク質である。例示的実施形態（例１に関連する）において、このタンパク質は、配列番号１１６４〜１１７８、好ましくは、配列番号１１６４〜１１６６のラットタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは、配列番号１２０８〜１２３６、好ましくは、配列番号１２０８〜１２１１のヒトタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。
【００４７】
さらに別の例示的実施形態（例２に関連する）において、このタンパク質は、配列番号１２６５〜１２７４、好ましくは、配列番号１２６５〜１２６９のラットタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは、配列番号１２８８〜１２９９、好ましくは、配列番号１２８８〜１２９２のヒトタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。
【００４８】
（その他一般的な方法）
皮膚生検を得るための様々な方法が利用できる。侵襲を最小にするには、吸引カプセルを３０〜９０分間皮膚上に置いて水疱を発症させることによって表皮を除去することである。真皮−表皮結合部にてこの表皮を清潔に分離する（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ， ９８：３２３−３２９；米国特許第６，０７１，２４７号）。このアプローチは痛みがなく、また全ての血管は真皮乳頭内の表皮の下にて終末しているので、出血することなく行うことができる。こうした理由のため、この方法は、例えば糖尿病患者の脚等に対して特に安全であり得る。別のアプローチは、単純な皮膚パンチ生検である。この手順もまた、よく許容される。生検の直径が３ｍｍ以下に限られる場合、縫合の必要がない。生検部位は肉芽形成によって治癒し、小円形の瘢痕が残るが徐々に消散する。
【００４９】
ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでの発現レベルは、従来の方法を用いて測定し得る。発現レベルは通常、試料および／またはコントロール中の総ＲＮＡ量もしくは総タンパク質量に対して評価および／または標準化され、代表的には、アクチンあるいはＧＡＰＤＨ等のハウスキーピング遺伝子である。ＲＮＡレベルは、例えば定量的ＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎＴＭ ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ等）、ノーザンブロット、またはＲＮＡレベルを測定するための他の任意の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （編） Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９、またはＬｏｄｉｅ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．， ８（５）：７３９−７５１）、あるいはこの実施例において記載されるもの等によって決定されうる。タンパク質レベルは、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ法、あるいはタンパク質レベルを決定するための他の任意の方法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （編） Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９８９）に記載されている）によって決定されうる。
【００５０】
本発明の方法では、同一の型あるいは異なる型の１つ以上のマーカーを使用することができる。例えば、１種類、２種類、３種類、４種類、５種類あるいは５種類以上の核酸および／または１種類、２種類、３種類、４種類、５種類あるいは５種類以上のタンパク質を、（ａ）神経障害性疼痛、（ｂ）神経障害性疼痛に対する化合物または組成物の影響、ならびに／あるいは（ｃ）神経栄養因子の生物学的活性の評価に関する読み出した情報のために使用することができる。
【００５１】
この実施例にて示される代表的な方法は、齧歯類を使用して実施されているが、当業者は、このような手順が、他の哺乳動物で、またヒト患者において臨床的に利用可能な変数の範囲内で首尾よく実施され得ることを認識する。例えば、神経障害性疼痛を有するヒト患者から皮膚生検が得られ、本明細書で記載したものと同様の検査に供される。ヒト試料に関しては、市販されているか、または特注のヒト遺伝子アレイを使用することができる（例えばアフィメトリクスＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｔ Ｕ１３３、Ｕ１３３Ａ、ならびにＵ９５）。
【００５２】
本明細書で使用される「非重複部分配列」という用語は、その部分配列が存在する配列に特有である部分配列を指す。いくつかの実施形態において、非重複部分配列は少なくとも、例えば１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、あるいは１５００ヌクレオチドの長さである。
【００５３】
以下の配列ならびにこれらの非重複部分配列の全部あるいは一部は、特定の実施形態から除外され得る：（ａ）配列番号８、１５、１００、１７１、１９９、２４４にて示されるラットＤＮＡ ＳＭＰ；（ｂ）配列番号３１５、３１８、４０８、４２０にて示されるラットタンパク質ＳＭＰ；（ｃ）配列番号４７６、 ４７８、５６８、５７８にて示されるヒトＤＮＡ ＳＭＰ；（ｄ）配列番号６３６、６３８、７２８、７３８にて示されるヒトタンパク質ＳＭＰ；（ｅ）配列番号７９８および８３４にて示されるラットＤＮＡ ＳＭＮ；（ｆ）配列番号９０３にて示されるラットタンパク質ＳＭＮ；（ｇ）配列番号９６７にて示されるヒトＤＮＡ ＳＭＮ；（ｈ）配列番号１０４３にて示されるヒトタンパク質ＳＭＮ；ならびに（ｉ）米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２１６３４１号にて開示されている配列。
【００５４】
【表２−１】
【００５５】
【表２−２】
【００５６】
【表２−３】
【００５７】
【表２−４】
【００５８】
【表２−５】
【００５９】
【表２−６】
【００６０】
【表２−７】
【００６１】
【表２−８】
【００６２】
【表２−９】
【００６３】
【表２−１０】
【００６４】
【表２−１１】
【００６５】
【表２−１２】
【００６６】
【表２−１３】
【００６７】
【表３−１】
【００６８】
【表３−２】
【００６９】
【表３−３】
【００７０】
【表３−４】
【００７１】
【表３−５】
【００７２】
【表３−６】
【００７３】
【表３−７】
【００７４】
【表４−１】
【００７５】
【表４−２】
【００７６】
【表４−３】
【００７７】
【表４−４】
【００７８】
【表４−５】
【００７９】
【表４−６】
【００８０】
【表４−７】
【００８１】
【表５−１】
【００８２】
【表５−２】
【００８３】
【表５−３】
【００８４】
【表５−４】
【００８５】
【表５−５】
【００８６】
【表５−６】
【００８７】
【表５−７】
【００８８】
【表６−１】
【００８９】
【表６−２】
【００９０】
【表６−３】
【００９１】
【表６−４】
【００９２】
【表６−５】
【００９３】
【表７−１】
【００９４】
【表７−２】
【００９５】
【表８−１】
【００９６】
【表８−２】
【００９７】
【表８−３】
【００９８】
【表９−１】
【００９９】
【表９−２】
【０１００】
【表９−３】
【０１０１】
【表１０−１】
【０１０２】
【表１０−２】
【０１０３】
【表１１】
【０１０４】
【表１２】
【０１０５】
【表１３】
【０１０６】
【表１６】
【０１０７】
【表１７】
【０１０８】
【表１８】
【０１０９】
【表１９】
【実施例】
【０１１０】
（実施例１）
（脊髄神経結紮とアルテミン処置）
Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ （１９９２） Ｐａｉｎ， ５０：３５５−３６５の手順に従って、オスのＳｐｒａｇｕｅ（Ｓｒａｇｕｅ）−Ｄａｗｌｅｙラットに片側脊髄神経結紮（ＳＮＬ）を施した。運動機能不全のラットは除外した。麻酔したラットのＬ５脊髄神経およびＬ６脊髄神経を露出させ、４−０シルク縫合糸で堅く結紮した。実際に結紮を行わない擬似手術を同様に行った。
【０１１１】
ラットアルテミン（１１３アミノ酸；配列番号１２３７）を単離して、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から再折りたたみし、精製して＞９８％の均一性とした（Ｇａｒｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， ９（１１）：１３８３−１３８９）。（ヒトアルテミンのアミノ酸配列は、配列番号１２３８にて示されている）。精製したアルテミンはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって還元二量体として移動し、サイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣによって、単一のピーク（２４ｋＤａ）として溶出された。受容体結合性、細胞ベースのｃ−ＲＥＴキナーゼ活性化（Ｓａｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：６２３８−６２４３）、ならびに感覚神経の生存を評価することによって、この精製生成物が、ＧＤＮＦに特徴的なシステインノットジスルフィドパターンを含有し、且つインビトロにおいて十分に活性であることを確認した。脊髄神経結紮術後３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目、および１４日目に、アルテミン（１ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。
【０１１２】
（行動アッセイ）
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐａｉｎ， ３２：７７−８８によって記載されているように、熱刺激に対する痛覚過敏性を評価した。有害な放射熱に反応して後足を引っ込める潜伏時間を測定した。４０秒の最大カットオフによって組織損傷は防がれた。
【０１１３】
触覚引っ込め（ｔａｃｔｉｌｅ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）閾値は、８つの較正済みｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｒｏｅｌｔｉｎｇ， Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）（０．４１ ｇから１５ ｇ。）を使用して後足を探針することによって測定した。各フィラメントは、Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５３， ５５−６３によって記載されているアップダウン法を用いて後足底表面へ当てた。刺激強度を連続して増減させることによって、引っ込め閾値を決定し、ディクソン非パラメーター検定を用いて算出した（Ｄｉｘｏｎ （１９８０） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ２０：４４１−４６２）。
【０１１４】
神経結紮誘発触覚および熱痛覚過敏、ならびに神経障害性疼痛行動に対するアルテミンの効果の行動確認の後、続く遺伝子発現プロファイリングのために、脊髄神経結紮後１４日目（アルテミン注射ならびに行動試験の後）に、Ｌ４真皮節から皮膚試料を採取した。できるだけ多くの体毛を除去するよう皮膚を剃り、全部で１２の皮膚試料を採取して瞬間凍結した。４つのグループの各ラットから３つずつ得た：（１）ビヒクル処置＋ＳＮＬ損傷（損傷の同側）、（２）ビヒクル処置＋ＳＮＬ損傷（損傷の反対側）、（３）アルテミン処置＋ＳＮＬ損傷（損傷の同側）、ならびに（４）アルテミン処置＋ＳＮＬ損傷（損傷の反対側）。
【０１１５】
（総ＲＮＡの精製）
ＴＲＩｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中でＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ８（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ， Ｓｔａｕｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の手順書に従って使用して、瞬間凍結した皮膚試料をホモジェナイズした。ＲＮｅａｓｙＴＭ Ｍｉｎｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を製造者の手順書に従って使用して、１００μｇの総ＲＮＡをさらに精製した。
【０１１６】
（プローブ標識、ハイブリダイゼーション、ならびにスキャニング）
皮膚生検試料に由来するｍＲＮＡを、アフィメトリクス Ｒａｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ３４Ａ、Ｕ３４Ｂ、ならびにＵ３４Ｃ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓＴＭプローブアレイ上でプロファイリングした。これらのアレイは、２４，０００を超えるｍＲＮＡ遺伝子転写物、ならびにＵｎｉＧｅｎｅＴＭデータベースのＢｕｉｌｄ ３４にあるＥＳＴ配列、加えてＧｅｎｅＢａｎｋＴＭ１１０の全長配列を含有する。ＧｅｎｅＣｈｉｐｓＴＭプローブアレイは、オリゴヌクレオチドプローブをガラス表面上で直接合成することによって作製されている。各２５ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブは、１つの遺伝子に対して一意に相補的であり、約１６対のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、アレイ中に示される遺伝子各々の転写レベルを測定する。
【０１１７】
試料の標識、ハイブリダイゼーション、ならびに染色は、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＴＭ Ｔｅｃｈｉｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ （７０１０２１ ｒｅｖ １）内の、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）用Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎのプロトコルに従って実行した。概略を述べると、４２℃で１時間のインキュベーションにて、１倍の第１鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で、５μｇの精製した総ＲＮＡを、２００ Ｕ のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）および０．５μｇの（ｄＴ）−Ｔ７プライマー（配列番号１２３９）と共に２０μＬの第１鎖反応に使用した。第２鎖合成は、１倍の第２鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にて、４０ ＵのＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、２ ＵのＥ． ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＨ、１０ ＵのＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼを添加し、その後１６℃で２時間のインキュベーションすることによって行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｓａｍｐｌｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｏｄｕｌｅを製造者の手順書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従って使用し、この第２鎖合成反応物を精製した。精製したｃＤＮＡは、ＢｉｏＡｒｒａｙＴＭ高収量ＲＮＡ転写標識キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐａｒｍｉｎｇｄａｌｅ， ＮＹ）を製造者の手順書に従って使用して増幅し、７０〜１２０μｇのビオチン標識ｃＲＮＡ（相補ＲＮＡ）を作製した。ラットゲノムＵ３４ Ａ、Ｂ、ならびにＣ のＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭプローブアレイを、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｈｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ６４０ （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にて、製造者の手順書に従って前もってハイブリダイズさせた。３０μＬの１倍の断片化緩衝液１００ ｍＭ ＫＯＡｃ、３０ ｍＭ ＭｇＯＡｃ中にて、１５μｇの標識ｃＲＮＡを９５℃で３５分間断片化した。断片化した標識ｃＲＮＡは、１００ ｍＭ ＭＥＳ、１ Ｍ Ｎａ＋、２０ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＴｗｅｅｎＴＭ２０、０．５ ｍｇ／ｍＬアセチル化ＢＳＡ、０．１ ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ、コントロールオリゴＢ２、およびコントロール転写物ｂｉｏＢ １．５ ｐＭ、ｂｉｏＣ ５ ｐＭ、ｂｉｏＤ ２５ ｐＭ、ならびにｃｒｅ １００ ｐＭを含有する１倍ハイブリダイゼーション緩衝液３００μＬ中に再び懸濁し、製造者の手順書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭプローブアレイにハイブリダイズさせた。このハイブリダイズしたＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイを洗浄して、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎｉｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を用いて染色し、抗体増殖の手順書を用いて、ビオチン化抗ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）（Ｓｉｇｍａ， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で増殖させた。ＧｅｎｅＡｒｒａｙＴＭスキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ， Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ， ＯＲ）を使用して、このＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭプローブアレイをスキャニングした。
【０１１８】
（データの解析）
２つの独立した解析アプローチ（Ｒｏｓｅｔｔａ ＲｅｓｏｌｖｅｒＴＭおよび、独自の順列ベースのベイズ統計モデル）を使用して、生体マーカーならびに代用マーカーを同定した。
【０１１９】
Ｒｏｓｅｔｔａ ＲｅｓｏｌｖｅｒＴＭソフトウエア（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｋｉｒｋｌａｎｄ， ＷＡ）を使用して、以下の分析技術を行った。
【０１２０】
ＡＮＯＶＡ分析のため、三連の試料を、１つのグループと見なした。目的の比較は、以下を包含する：
１）ビヒクル処置対アルテミン処置、反対側真皮節
２）ビヒクル処置対アルテミン処置、同側真皮節
３）反対側対同側、ビヒクル処置真皮節
４）反対側対同側、アルテミン処置真皮節。
【０１２１】
発現レベルがグループ間で有意に異なる（ｐ≦０．０１）ことが分かった遺伝子に基づいて、遺伝子リストを作成した。続いてこれらの遺伝子を、倍数変化値の有意性（ｐ≦０．０１）に関して検定した。４つの比較事項の各々ついての最終遺伝子リストには、双方の判定基準を通過した遺伝子を含めた。凝集型階層的クラスター法（ヒューリスティク・クライテリア＝平均連鎖（ａｖｅｒａｇｅ ｌｉｎｋ）、類似性尺度＝ユークリッド距離、クラスタリングに使用する強度／Ｚ値）によって、互いからの各比較において、この最終遺伝子リストが２つの群によく分離していることを確認した。
【０１２２】
順列ベースのベイズ分析を以下のように行った。全ての遺伝子について、順列に基づいたアプローチを使用して、グループ内（同一処置動物間）および試料グループ比較間の、全ての可能性のあるペアワイズに関して発現強度値の対数比の分布を作製した。
【０１２３】
例えば、３匹の同一処置ラットから、上記に概説した４種の処置状況の各々に関して、３つのグループ内ペアワイズ比較を得た。このように、計１２のグループ内対数比と、６つの可能なグループ間比較に関する９のグループ間対数比を得た（表１４）。これは、チップＡ、Ｂ、およびＣについて行った。
【０１２４】
【表１４】
比率計算は全て、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＴＭ ＭＡＳ５アプリケーションを使用して行った。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＴＭ ＭＡＳ５アプリケーションは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ （２００１）に記載されているアフィメトリクスＴＭ独自のエラーモデルを使用して、バックグラウンド補正強度（完全一致シグナル強度とミスマッチシグナル強度との差）の比を要約している。デフォルトパラメーターを使用してシグナル強度を定量した（アルファ １＝０．０４；アルファ ２＝０．０６；タウ＝０．０１５；ノイズ（ＲａｗＱ）＝２．８００；スケール因子（ＳＦ）＝１．０００ ；標準化因子（ＮＦ）＝１．０００；ガンマ１Ｌ＝０．００２５；ガンマ１Ｈ＝０．００２５；ガンマ２Ｌ＝０．００３；ガンマ２Ｈ＝０．００３；揺らぎ（Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）＝１．１）。要約されたシグナル対数比を関連づけられたＰ値と共に統計分析用に出力した。
【０１２５】
先の対数比の分布を使用して、グループ間比較対数比のＰ値（事後確立）を更新した。グループ内対数比分布が有意に異なる（ｐ＜０．０５）グループ間の対数比分布を伴う遺伝子を、識別的に発現される（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）遺伝子として選択した。任意の比較についての要約した対数比を、そのグループの全順列対数比の誤差重み付け平均として予測した。
【０１２６】
脊髄神経結紮損傷が影響を及ぼし（ビヒクル処置の同側真皮節対反対側真皮節）、よって神経障害性疼痛行動と相関する３０８の遺伝子を、表２に列挙する。
【０１２７】
アルテミン神経栄養活性の代用マーカーを同定するために、目的の特異的プロフィールを有する遺伝子（例えば、損傷後に上方制御され、次にアルテミン投与に伴い通常レベルまで下方制御される遺伝子）を、反対側ビヒクル処置真皮節対同側ビヒクル処置真皮節ならびに、同側ビヒクル処置真皮節対同側アルテミン処置真皮節を比較する遺伝子リストを交差することによって見出した。このように同定した１０７のアルテミン神経栄養活性の代用マーカーを表６に列挙する。
【０１２８】
アルテミンのインビボでの生物学的活性の生体マーカーを同定するため、反対側ビヒクル処置真皮節対反対側アルテミン処置真皮節、ならびに同側ビヒクル処置真皮節対同側アルテミン処置真皮節を比較するリストに共通する遺伝子を同定した。続いて反対側真皮節および同側真皮節において、アルテミンによって同じ方向に制御される遺伝子を同定した。このように、４９のアルテミンの生物学的活性の生体マーカーを同定し、これらを表１０に列挙する。図７は、ＴａｑＭａｎＴＭ分析で未確認のＢＭＮの例を示す。
【０１２９】
代用マーカーならびに生体マーカーの有効性を確認するために、好ましい神経栄養活性の２５の代用マーカーおよび、５つの好ましい生体マーカーを、転写物の存在を確認するための配列分析に使用した。配列分析には、ラットゲノム配列に対するアフィメトリクスＴＭターゲット配列のＢＬＡＳＴＴＭ検索が含まれる。次に、エキソン、ＥＳＴ、ならびに推定転写物の有無に関してゲノムの座を調べた。転写の証拠に基づいて遺伝子の優先順位を決定し、以下に記載されるようにＴａｑＭａｎＴＭ検証を行った（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：７２７６−７２８０も参照）。
【０１３０】
（ＴａｑＭａｎＴＭ分析）
ＴｒｉｚｏｌｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）精製ラット皮膚ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙＴＭ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の手順書に従って使用して、さらに精製した。Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ １（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてこのＲＮＡを処理し、あらゆる夾雑ＤＮＡを除去した。続いてこのＲＮＡをＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した。その結果得られるｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎＴＭ分析のためのＰＣＲ鋳型として使用した。
【０１３１】
Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ １．５ ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の「ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ ａｎｄ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ」機能を使用して、アフィメトリクス・ターゲット配列のためのプライマーならびにプローブ配列を作製した（例えば、ｒｃ＿ＡＡ８１８８０４＿ａｔ ＲＧ−Ｕ３４Ｃ、ｒｃ＿ａａ８１８１２０＿ａｔ ＲＧ−Ｕ３４Ｃ、ならびにＸ１４８１２＿ａｔ ＲＧ−Ｕ３４Ａについては表１５を参照）。
【０１３２】
【表１５】
また、ＰＣＲアンプリコン、加えて各遺伝子の５’および３’末端に１０ ｂｐを追加したものに及ぶオリゴマーを合成した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによってプライマーならびに６ＦＡＭ標識プローブを合成し、標準法に従いｃＤＮＡ鋳型との反応にて始動させた。反応はデフォルト条件を使用したＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにて実行し、データはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．９．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。アンプリコンオリゴマーの１０倍稀釈シリーズを使用して同時ＰＣＲ反応を実行し、各プライマーとプローブの組み合わせに関して標準曲線を作製した。各試験反応についてのサイクル閾値（Ｃｔ）をアンプリコン標準曲線と比較し、ｍＲＮＡの相対量を決定した。また、ＴａｑＭａｎＴＭ Ｒｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡ試料を解析し、各試料中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの量を決定した。各代用マーカー遺伝子のシグナルをＧＡＰＤＨコントロールで得られたシグナルで割って、試料を標準化した。この結果を図１〜６に示す。
【０１３３】
図１〜６に示す遺伝子発現パターンは、アフィメトリクス解析の結果と相応する。これらの遺伝子は全て、非損傷状態（ビヒクル／反対側、ならびにアルテミ／同側）では低レベルで発現され、損傷状態（ビヒクル／同側）においては上方制御され、アルテミン処置後（アルテミン／同側）に少なくとも部分的に正常化される。この発現プロフィールは、ラット脊髄神経結紮モデルにおいてこれらの遺伝子が、アルテミン活性の代用マーカーとして作用することに一致する。
【０１３４】
（実施例２：アルテミン曝露生体マーカーの測定）
（曝露生体マーカーの試料）
損傷されていないオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、アルテミンまたはビヒクルを投与し、続いて実施例１のように真皮節Ｌ４を処理した。以下のグループの内の３匹ずつから左右の真皮節Ｌ４に対応する１８個の試料を作製した：（１）非損傷＋アルテミン処置、（２）非損傷＋ビヒクル処置、（３）未処置。
【０１３５】
（データの解析）
２つの独立した解析アプローチ（Ｒｏｓｅｔｔａ ＲｅｓｏｌｖｅｒＴＭならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＭＡＳ５．０ＴＭ）を用いて、アルテミン曝露生体マーカーを同定した。
【０１３６】
Ｒｏｓｅｔｔａ ＲｅｓｏｌｖｅｒＴＭソフトウエア（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｋｉｒｋｌａｎｄ， ＷＡ）を使用して、以下の解析法を実行した。左右３つずつの試料を、ＡＮＯＶＡ分析のための１つのグループと見なした。目的の比較には以下が含まれる：
１）未処置対ビヒクル処置非損傷真皮節；
２）未処置対アルテミン処置非損傷真皮節；ならびに、
３）ビヒクル処置対アルテミン処置非損傷真皮節。
【０１３７】
発現レベルがグループ間で有意に異なる（ｐ≦０．０１）ことが分かった遺伝子に基づき、遺伝子リストを作成した。続いてこれらの遺伝子を、倍数変化値および倍数変化の程度における有意性（ｐ≦０．０５）について検定した（−２≧Ｚ値≧２）。各比較についての最終遺伝子リストには、３つの判定基準を全て通過した遺伝子を含めた。
【０１３８】
アルテミンのインビボでの生物学的活性の生体マーカーを同定するため、未処置対アルテミン処置真皮節ならびにビヒクル処置対アルテミン処置真皮節を比較するリストに共通する遺伝子を同定した。次に、未処置とビヒクル処置との間で変化しない、これらの遺伝子のセットをアルテミン曝露の生体マーカーとして同定した（ＢＭＮ）。
【０１３９】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＭＡＳ５ＴＭ分析は、以下のように行った。この方策には、（ｉ）動物の左側と右側の間、あるいは（ｉｉ）動物の反対側での同一の処理、において識別的に発現されたＡｆｆｙＩＤを最初に同定し、これによって動物内における不均一性を示す工程を含んだ。次に、皮膚における、遺伝子発現に対する全身性アルテミン投与の影響を理解するために、全ての処置を比較した。上記（ｉ）もしくは（ｉｉ）にて見出されるか、またはビヒクルのみの処置によって変化したと判定されたＡｆｆｙＩＤＴＭは、最終的な考察から除いた。
【０１４０】
アフィメトリクス（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ Ｕｓｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ ２００１に記載されているアフィメトリクス（登録商標）独自のエラーモデルを使用してバックグラウンド補正強度（完全一致シグナル強度とミスマッチシグナル強度との差）を用いるアフィメトリクス（登録商標）ＭＡＳ５ソフトウエアを使用して、発現強度値の全ての可能性のあるペアワイズ比を作出した。ペアワイズ比のため、ＭＡＳ５はウィルコクソンの符号付順位検定を用いて、どのＡｆｆｙＩＤが変化し（増加あるいは減少「Ｉ／Ｄ」。）、どれが変化していないか（「ＮＣ」）を判定した。
【０１４１】
上記（ｉ）および（ｉｉ）の比較を示す比の半数より多くが「ＮＣ」を呈する必要があり；そうでなければ、ＡｆｆｙＩＤを考察から除いた。左対右の比較に関して、３つの全てのチップに渡って２３の全比率を考察し、３５８のＡｆｆｙＩＤＴＭを落とした。動物観比較については、全てのチップに対して２７個の全比率を考察し、１，３７５個のＡｆｆｙＩＤＴＭを落とした。
【０１４２】
処理間の比較については、２７の比を作出し、各比較について考察した（１チップ当たり９）。９つの比のうち少なくとも８つが、さらなる分析のための考察されるように一定して増加あるいは減少していなければならない。
【０１４３】
アルテミン処置と未処置ならびにビヒクル処置とを比較する遺伝子リストを交差させると、１０個のＡｆｆｙＩＤＴＭがアルテミン曝露マーカーの候補であることが分かった。
【０１４４】
これら２つの解析を交差させた際に、２つのＡｆｆｙＩＤＴＭを共通して見出した。これら２つの解析を統合することによって得られる１３の遺伝子を、アルテミン曝露の生体マーカーとして表１６に列挙する。
【０１４５】
ヌクレオチド配列に対する全ての言及は、所定の配列に相補的な配列を包含すると理解すべきである。全ての刊行物および特許、ならびにアクセッション番号によって本開示に引用された配列は全て、本明細書にその全体が参考として援用される。参考として援用される資料が本明細書と矛盾するか、あるいは相反する場合、本明細書が全てのこのような資料に取って代わる。
【０１４６】
ｓｕｒｒｍａｒｋｅｒｓ０２１７０５．ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズが４，６８９，９２０バイトの２００４年２月１７日作製のファイルを含む、「神経障害性疼痛の代用マーカー（「Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｉｎ」）と表題されたＣＤ−ＲＯＭにて本明細書と共に提出する資料は、本明細書に参考として援用される。
【０１４７】
本明細書に記載された具体的な実施形態は、例示のみのために提供されるものであり、あらゆる面において、限定することを意図するものではない。本明細書および実施例は例示としてのみみなされ、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の請求項によって示すことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、脊髄神経結紮損傷（ＳＮＬ）およびアルテミン治療を受けたラットのＬ４真皮節における、ｒｃ＿ＡＡ８１８８０４＿ａｔ（配列番号１８および配列番号７９９）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図２】図２は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、Ｘ１４８１２＿ａｔ（配列番号３７および配列番号８１３）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図３】図３は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、ｒｃ＿ＡＡ８１８１２０＿ａｔ（配列番号３１および配列番号８０８）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図４】図４は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、ｒｃ＿ＡＡ９４６０９４＿ａｔ（配列番号２および配列番号７９１）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図５】図５は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、Ｘ０７３１４ｃｄｓ＿ａｔ（配列番号１１および配列番号７９６）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図６】図６は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、Ｍ２７１５１＿ａｔ（配列番号２２および配列番号８０１）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図７】図７は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、ｒｃ＿ＡＩ０７２７１２＿ａｔ（配列番号１１１８）の遺伝子発現のアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ）分析の結果を示す。損傷の状態に拘わらず、この遺伝子は、ビヒクル処理試料にて比較的高レベル得で発現し、アルテミン処置後に遙かに低いレベルで発現する。
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００４年２月２０日に出願された米国特許出願第１０／７８４，００４号の優先権を主張し、この出願は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、神経学および薬理学の分野にある。本発明は、概して、神経障害性疼痛を評価する方法ならびに、神経障害を処置するための薬物あるいは薬物候補の生物学的活性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
疼痛を伴う神経障害は、異痛あるいは痛覚過敏等の、自発的および／または異常な刺激誘発性疼痛によって特徴づけられる。神経障害性疼痛の症状としては、しばしば、自発的痙攣痛、もしくは灼熱痛、伝激痛、または正常であれば無害な刺激によって引き起こされる疼痛が挙げられる。神経障害性疼痛は神経から生じ、即ち、末梢神経系もしくは中枢神経系における一次病変あるいは機能不全から始まる、あるいはこれに起因する（例えば非特許文献１を参照のこと）。神経障害性疼痛は、感染性因子（例えばヘルペスウイルス等）、代謝疾患（例えば糖尿病等）、神経組織変性疾患（例えば多発性硬化症等）、神経損傷（例えば切断もしくは癌による神経圧迫等）等に起因する神経損傷の結果として発生しうる。慢性神経障害性疼痛に対する現在の薬理学的治療ならびに非薬理学的治療は、部分的な緩和を提供するのみであり、その成果は個々の患者において幅広く異なる。
【０００４】
末梢神経系に影響を及ぼす状態によって、知覚細繊維の欠損および／または髄鞘脱落等の病態生理学変化が生じる。当該変化は、皮膚にて組織学的に観察することができる。実際、皮膚生検材料の組織学的評価は、神経障害性疼痛あるいは末梢神経障害を有する患者の末梢神経状態を評価するための認められた方法となっている（非特許文献２）。このアプローチによって、疾患における神経損傷、ならびに治療に伴う神経再生／再支配の進行の評価が可能となる。計数する診断基準としては、表皮神経線維密度、皮膚−表皮接合部を横切る繊維の数等が挙げられる。皮膚生検は、時間経過に応じて複数の部位にて実施することができ、これによって表皮神経支配の空間時間的特性を評価することができる。しかしながら、皮膚生検の組織学的分析は、大きな労力および時間を消費する作業である。
【０００５】
従って、当該分野においては、神経障害性疼痛および末梢神経障害の処置および評価のための新しい方法を開発する必要がある。
【非特許文献１】Ｍｅｒｓｋｅｙ ａｎｄ Ｂｏｇｄｉｋ （１９９４） Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐａｉｎ： Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐａｉｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐａｉｎ Ｔｅｒｍｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｓｅａｔｔｌｅ： ＩＡＳＰ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２】Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．， １４：６５５−６５９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、皮膚生検試料を非組織学的に、神経障害性疼痛の状態を反映する遺伝子（類）（「神経障害性疼痛代用マーカー」。「損傷・疾患マーカー」とも呼ばれる）の発現に関して評価することができるという認識に由来する。当該遺伝子の発現は、迅速且つ定量的な様式で皮膚生検材料ホモジェネートにて測定することができる。皮膚パンチ生検試料におけるこの遺伝子（類）の発現が、神経障害性疼痛あるいは末梢神経障害に対する薬物もしくは薬物候補の有益な効果と相関するのであれば、この読み出した情報（ｒｅａｄ ｏｕｔ）は、神経障害性疼痛および／または末梢神経障害の軽減に関係する薬物活性の代用マーカー（「神経栄養活性の代用マーカー」）を表す。さらに、神経障害性疼痛の状態に拘わらず、皮膚パンチ生検試料中の遺伝子発現を、薬物もしくは薬物候補のインビボでの生物学的活性の読み出した情報（「神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカー」、あるいは短くして「神経栄養因子の生体マーカー」。「神経栄養因子への曝露のマーカー」とも呼ぶ）として使用することができる。
【０００７】
一局面において、本発明は、神経障害性疼痛の代用マーカーを同定する方法を提供する。この神経障害性疼痛の代用マーカーを同定する方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この第１試料およびこの第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。この第１試料の核酸の量または該タンパク質の量と、この第２試料の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、この核酸またはこのタンパク質が神経障害性疼痛の代理マーカーであることを示す。
【０００８】
別の一局面において、本発明は、当該代用マーカーを使用する、神経障害性疼痛のレベルを評価する方法を提供する。神経障害性疼痛の代用マーカーを使用する、神経障害性疼痛のレベルを評価する方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この第１試料およびこの第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、この核酸またはタンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである、工程。第１試料中の核酸の量またはタンパク質の量と、第２試料中の同じ核酸の量またはタンパク質の量の間の差異は、神経障害性疼痛のレベルを示す。
【０００９】
別の一局面において、本発明は、例えば、神経障害性疼痛のレベルに対する化合物または組成物の効果を評価することにおいて、化合物もしくは組成物の神経栄養活性を評価する方法を提供する。この方法は以下を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛を有する哺乳動物にその化合物または組成物を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の核酸またはタンパク質である、神経障害性疼痛の代理マーカーの少なくとも１種の量を決定する工程。
工程（ｄ）において決定された核酸の量またはタンパク質の量と、この化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、神経障害性疼痛に対するこの化合物または該組成物の効力のレベルを示す。
【００１０】
別の一局面において、本発明は、神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーを同定する方法、ならびに当該生体マーカーを使用する、神経栄養因子のインビボでの生物学的活性を評価する方法を提供する。神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーを同定する方法は、以下を包含する：
（ａ）哺乳動物にその因子を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。
工程（ｄ）において決定された核酸の量またはタンパク質の量と、この因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、この核酸またはタンパク質がこの因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーであることを示す。
【００１１】
別の一局面において、本発明は、神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーを使用する、当該因子のインビボでの生物学的活性を評価する方法を提供する。神経栄養因子のインビボでの生物学的活性を評価する方法は、以下を包含する：
（ａ）哺乳動物にその因子を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。
工程（ｄ）において決定された核酸の量またはタンパク質の量と、この因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、この因子が生物学的に活性であることを示す。
【００１２】
例示的実施形態において、評価の対象となる神経栄養因子は、アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）（ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）あるいはエノビン（ｅｎｏｖｉｎ）とも呼ばれる）であり、これはグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーである。
【００１３】
ヒトおよびラットの神経障害性疼痛代用マーカー、神経栄養活性の代用マーカー、および神経栄養因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーの、例示となるヌクレオチド配列ならびに／またはアミノ酸配列もまた提供する（表１および１ａを参照のこと）。
【００１４】
【表１】
＊ ＳＭＰ−神経障害性疼痛の代用マーカー；
ＳＭＮ−神経栄養活性の代用マーカー；
ＢＭＮ−神経栄養因子の生体マーカー。
＊＊ この表ならびに全ての表において、ＤＮＡは、任意の核酸（例えばｍＲＮＡおよびＤＮＡを含む）を指す。
【００１５】
【表１ａ】
本発明の様々な実施形態は、以下の説明において記載されるか、あるいは、この説明から理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明を導く実験において、ラットを片側脊髄神経結紮（ＳＮＬ）に供して、片側性神経障害性疼痛を誘導した。ＳＮＬの後、一部のラットには、神経障害性疼痛を緩和することが示されている神経栄養因子であるアルテミン（Ｇａｒｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， ９（１１）：１３８３−１３８９）を全身的に投与した。誘発された神経障害性疼痛は、行動試験を用いて評価した。次に、両側から皮膚試料を採取し、組織抽出物を調製した。これらの組織抽出物由来のＲＮＡを、アフィメトリクスＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭで発現分析し、様々な試料中の遺伝子発現プロフィールを測定した。
【００１７】
組織は不均質であるため、通常、組織試料における小規模な転写の変化を検出するのは難しく、特にこの変化が少数の細胞亜集団に限定される場合、あるいは間接的な影響の結果である場合に困難である。こうした難点にも拘わらず、本発明は、一部、皮膚生検試料ホモジェネート中の遺伝子発現の検出可能な変化が、神経障害性疼痛の状態を反映しているという発見ならびに実証に基づく。
【００１８】
特に、本発明の方法を用いて、その発現レベルが神経障害性疼痛に相関する遺伝子（神経障害性疼痛の代用マーカー）を同定することができる。また本発明を用いて、特に、少なくとも部分的にはアルテミン処置によってその発現レベルが正常化されるこれらの遺伝子のサブセット（神経栄養活性の代用マーカー）を同定することもできる。本発明を用いて、神経障害性疼痛の状態に拘わらず、発現レベルが生物学的に活性なアルテミンの存在と相関する遺伝子のさらなるセット（神経栄養活性の生体マーカー）を同定することもできる。
【００１９】
（神経障害性疼痛の代用マーカー）
本発明は、哺乳動物において神経障害性疼痛の代用マーカーを同定する方法を提供し、この方法は以下を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この第１試料およびこの第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。
ここでこの第１試料の核酸の量またはタンパク質の量と、この第２試料の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、この核酸またはこのタンパク質が神経障害性疼痛の代理マーカーであることを示す。いくつかの実施形態において、第１試料中のこの核酸またはタンパク質の量は、第２試料中の同じ核酸あるいはタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、あるいは１００倍以上異なる。この差異（「倍数変化」とも称する）は、関連する遺伝子の下方制御もしくは上方制御と神経障害性疼痛との相関関係を示す。発現の倍数変化がより大きくなるほど、かつ／または神経障害性疼痛との相関性が高くなるほど、その核酸またはタンパク質は、神経障害性疼痛の代用マーカーとしてより好ましい。
【００２０】
第１試料および第２試料は、同一の哺乳動物から得られてもよいし、別々の哺乳動物から得られてもよい。例えば、第１試料および第２試料は、同一の哺乳動物の皮膚の別々の領域から得ることができ、一つは神経障害性疼痛または末梢神経障害に罹患している領域であり、もう一方は、疼痛または神経障害に罹患していない領域である。別の例において第１試料および第２試料は、同一の哺乳動物の皮膚の同じ領域から得られるが、異なるタイミングで得られ得る。例えば、第１試料を、神経障害性疼痛を誘発する前に採取し、第２試料を、神経障害性疼痛を誘発後に得る。さらに別の例において、第１試料を神経障害性疼痛に罹患している領域から採取し、第２試料を、処置後に同じ領域から得ることができる。あるいは、第１試料ならびに第２試料を、別々の哺乳動物から得ることができ、統計分析を用いて共通するコントロールを参照して、核酸あるいはタンパク質の量を比較する。
【００２１】
ラットにて神経障害性疼痛の代用マーカーを同定する例示的方法は、実施例において提供される。３０８のラット核酸（表２）を、これらの例示的方法に従って同定した。続いて対応するタンパク質配列およびヒトオルソログを、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ等の公に利用可能なデータベースを用いて同定した。１６２のラットタンパク質配列（表３）、１６０のヒト核酸配列（表４）、および１６０のヒトタンパク質配列（表５）を、このようにして同定した。
【００２２】
本発明は、哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルを評価する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この第１試料およびこの第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、この核酸またはタンパク質が神経障害性疼痛の代用マーカーである、工程。
ここでこの第１試料の核酸の量またはタンパク質の量と、この第２試料の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、神経障害性疼痛のレベルを示す。いくつかの実施形態において、第１試料中のこの核酸の量またはタンパク質の量は、第２試料中の同じ核酸の量またはタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、または１００倍以上異なる。関連する神経障害性疼痛の代用マーカーの発現レベルにおける差異（「倍数変化」）は、神経障害性疼痛のレベル、すなわち程度と相関する。一般に、神経障害性疼痛の代用マーカーが呈する倍数変化の値が大きければ大きいほど、神経障害性疼痛の程度がより大きいことを示す。
【００２３】
本明細書に記載したように、第１試料および第２試料は、同一の哺乳動物から得てもよいし、別々の哺乳動物から得てもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、神経障害性疼痛の代用マーカーは核酸である。例示的実施形態において、この核酸は、配列番号１〜３０８、好ましくは、配列番号１〜４２のラットヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経障害性疼痛の代用マーカーは、配列番号４７１〜６３０、好ましくは、配列番号４７１〜４９３のヒトヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの非重複部分配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、神経障害性疼痛の代用マーカーはタンパク質である。例示的実施形態において、このタンパク質は、配列番号３０９〜４７０、好ましくは、配列番号３０９〜３３３のラットタンパク質配列のうちのいずれか一つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経障害性疼痛の代用マーカーは、配列番号６３１〜７９０、好ましくは、配列番号６３１〜６５３のヒトタンパク質配列のうちのいずれか一つの非重複部分配列を含む。
【００２６】
神経障害性疼痛が発生する可能性のある状態、ならびにこのため診断または処置の過程において評価を必要とし得る状態としては、外傷的（医原的なものを含む）神経損傷、虚血性神経障害、神経圧迫／エントラップメント、多発性神経障害（遺伝性、代謝性、毒性、炎症性；感染性、腫瘍随伴性、栄養性、アミロイド症ならびに脈管炎におけるもの）、神経叢損傷神経根圧迫、切断手術後の断端痛および幻肢痛、帯状疱疹／帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛および舌咽神経痛、癌関連神経障害（腫瘍の神経浸潤、外科的神経損傷、照射誘発神経損傷、化学療法誘発神経障害に起因する）、脳卒中（梗塞あるいは出血）、多発性硬化症、脊髄損傷、脊髄空洞症／延髄空洞症、癲癇、ならびに空間占拠性病変（ｓｐａｃｅ−ｏｃｃｕｐｙｉｎｇ ｌｅｓｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な傷害の例としては、糖尿病性神経障害、ＡＩＤＳの感覚神経障害ならびに抗レトロウイルス毒性神経障害、特発性細繊維神経障害、らい病、ファブリー病が含まれる。さらに、神経障害性疼痛を評価する方法を用いて、例えば実施例にて記載したラットにおけるＳＮＬ誘発神経障害性疼痛等の、実験動物にて誘発された神経障害性疼痛を評価することができる。
【００２７】
本発明の方法を用いる痛みの評価は、薬理学的処置および／または非薬理学的処置の過程にて実施され得る。神経障害性疼痛の非薬理学的処置としては、経皮的電気神経刺激、脊髄刺激、運動皮質刺激、脳深部刺激、減圧術、神経腫切除、神経切離、グリセリン注入、神経病変／神経根病変の高周波処理、後根入口帯病変、ならびに脊髄神経路切断術が挙げられる。
【００２８】
（神経栄養活性の代用マーカー）
神経障害性疼痛の代用マーカーのサブセットは、神経障害性疼痛を軽減する化合物または組成物を用いる処置の結果として正常化されると予測される。
【００２９】
従って、本発明は、哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルに対する化合物または組成物の影響を評価する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）神経障害性疼痛を有する哺乳動物にその化合物または組成物を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、この核酸またはタンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである工程。
ここで工程（ｄ）において決定された核酸の量またはタンパク質の量と、この化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、神経障害性疼痛に対するこの化合物または組成物の効力のレベルを示す。
【００３０】
この化合物あるいは組成物の非存在下で発現される核酸の量またはタンパク質の量は、任意の適切な方法によって測定することができる。一方法において、その試料中の核酸の量またはタンパク質の量は、化合物または組成物の非存在下での同じ哺乳動物あるいは別の哺乳動物から得られた別の試料中で発現される同じ核酸の量あるいは同じタンパク質の量と比較される。コントロール試料は、分析前、分析中、または分析後に採取され得る。別の方法では、この試料中の核酸の量またはタンパク質の量は、１つ以上の内部基準の量と比較される。内部基準は所定の条件下での発現レベルが既知である核酸またはタンパク質である。最も代表的には、この基準は、ハウスキーピング遺伝子（例えば、アクチンまたはＧＡＰＤＨ）等の様々な条件下で比較的一定のままである遺伝子である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、工程（ｄ）において決定される量は、その化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、または１００倍以上異なる。正常な状態（実質的に神経障害性疼痛のない状態）におけるベースライン発現レベルへ向かって神経障害性疼痛の関連する代用マーカーの発現レベルが「正常する」とは、その化合物または組成物が神経障害性疼痛を軽減することを示す。神経障害性疼痛の条件と「正常化」（「倍数変化が戻る」）条件での発現レベルの差異は、評価の対象である化合物または組成物の神経栄養活性のレベルを示す。一般に、倍数変化が戻る値が大きければ大きいほど、その化合物または組成物が、神経障害性疼痛の処置において、より大きな効力を呈すると予測される。倍数変化が戻る値が大きいほど好ましいが、特定の神経障害性疼痛の代用マーカーに関する倍数変化が戻る値は、対応する、そのマーカーの倍数変化の値を実質的に超えないことが好ましい。
【００３２】
ラットにおける神経障害性疼痛のレベルに対する化合物または組成物の影響を評価する例示的方法を、実施例において提供する。１０７のラット核酸（表６）を、これらの方法に従って同定した。続いて対応するタンパク質配列およびヒトオルソログを、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ等の公に利用可能なデータベースを用いて同定した。６５のラットタンパク質配列（表７）、７６のヒト核酸（表８）、ならびに７６のヒトタンパク質配列（表９）をこの方法で同定した。
【００３３】
いくつかの実施形態において、神経栄養活性の代用マーカーは核酸である。例示的実施形態において、この核酸は、配列番号７９１〜８９７、好ましくは、配列番号７９１〜８１４のラットヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態では、神経栄養活性の代用マーカーは、配列番号９６３〜１０３８、好ましくは、配列番号９６３〜９７９のヒトヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む核酸である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、神経栄養活性の代用マーカーはタンパク質である。例示的実施形態において、このタンパク質は、配列番号８９８〜９６２、好ましくは、配列番号８９８〜９１４のラットタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態では、神経栄養活性の代用マーカーは、配列番号１０３９〜ＮＯ：１１１４、好ましくは、配列番号１０３９〜１０５５のヒトタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含むタンパク質である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、評価の対象となる化合物または組成物は、神経栄養因子である、あるいは神経栄養因子を含む。「神経栄養因子」は、神経栄養活性を持つ化合物であり、例えば生殖、生存、成長、または神経の正常な生理学的機能の維持に影響を及ぼす化合物である。神経栄養活性は、当該分野で公知である１つ以上の方法によって評価／測定することができ、例えば以下の方法がある：
（１）ＲＥＴキナーゼ受容体活性化ＥＬＩＳＡ（ＫＩＲＡ）（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎｅｕｒｏｎ， ２０：２４５；Ｓａｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ． １９９６， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９６． ２３５（２）：２０７）；
（２）コリンアセチルトランスフェラーゼ酵素アッセイ（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ， ３４１：１４９）；
（３）ドーパミン作動性ニューロンを用いる３Ｈ−ドーパミン取り込みアッセイ（Ｌｅｖ−Ｆｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６０：１１３０）；あるいは、
（４）ラットクロム親和性細胞腫由来細胞系ＰＣ１２アッセイ（Ｅｒｎｆｏｒｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ， ３５０：１７５６；Ｄａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓａｙ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ”， Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ４ （Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．編），ｐｐ．７９−８３， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｒａｄｓｈａｗ （１９７８） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， ４７：１９１）。
【００３６】
例示的実施形態において、評価される神経栄養因子はアルテミンである。神経栄養因子の他の例としては、ＧＤＮＦファミリーの他のメンバー（例えばＧＤＮＦ、ニューチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ））、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−３（ＮＴ−３）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、インターロイキン６（ＩＬ６）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ミッドカイン、ニューロトロフィン（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−４（ＮＴ−４）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、プレイオトロフィン、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ならびにインスリン様成長因子１型（ＩＧＦ−１）が挙げられる。さらに別の神経栄養因子の例としては、これらの神経栄養因子あるいはそれらの各々の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストが挙げられる。アゴニストおよび／またはアンタゴニストの例としては、神経栄養因子に対する抗体、あるいは、それらの受容体およびその受容体の可溶性形態（例えば、ＧＦＲ−α（ニューチュリンに対する受容体）；ＲＥＴα４（パーセフィンに対する受容体）；ＧＦＲα３（アルテミンに対する受容体）；ＴｒｋＡ（ＮＧＦに対する受容体）；ＴｒｋＢ（ＢＤＮＦに対する受容体；ＴｒｋＣ（ＮＴ−３に対する受容体）；ｇｐ１３０／ＬＩＦＲβ（ＬＩＦに対する受容体）；およびｇｐ１３０（ＩＬ６に対する受容体））が挙げられる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、評価の対象となる化合物または組成物は、神経障害を処置するための薬物もしくは薬物候補であり、これには本明細書にて記載される神経栄養因子が含まれる。現在、神経障害性疼痛の処置のために使用され、よって、神経栄養活性に関して評価され得るる薬物の例としては、抗鬱薬（アミトリプチリン、マプロチリン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤）、抗癲癇剤（ガバペンチン、カルバマゼピン、クロナゼパン、ラモトリジン、トピラメート、フェニトイン）、局所麻酔薬、メキシレチン、バクロフェン、クロニジン、ケタミン、デキストロファン、トラマドール、グアネチジン、ならびにオピオイド類（モルヒネ、メタドン、ケトベミドン、フェンタニル）が挙げられる。
【００３８】
（神経栄養因子の生体マーカー）
本発明は、「神経栄養因子（本明細書で記載されているもの）」の生物学的活性の生体マーカーを同定する方法を提供する。この方法は以下を包含する：
（ａ）哺乳動物に、この因子を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程。
ここで工程（ｄ）において決定されたこの核酸の量またはタンパク質の量と、この因子の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量との差異は、この核酸またはタンパク質が、この因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーであることを示す。いくつかの実施形態において、工程（ｄ）で決定された量は、その因子の非存在下で発現される同じの核酸の量または同じタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、または１００倍以上異なる。生物学的に活性な神経栄養因子の存在に起因する発現レベルの差異を、「生体マーカー倍数変化」と名付ける。生体マーカー倍数変化の値が大きければ大きいほど、その核酸あるいはタンパク質は神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーとしてより好ましい。いくつかの生体マーカー（例えば配列番号１１２０および配列番号１１２６）は、疼痛の代用マーカーともなる。すなわち、これらマーカーは、神経障害性疼痛および生物学的に活性な神経栄養活性の存在の双方に相関する。さらに、これら生体マーカーのいくらか（例えば配列番号１１２０および配列番号１１２６）は、神経栄養活性の代用マーカーとして役立ち得る。
【００３９】
化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量は、任意の適切な方法によって測定され得る。皮膚生検試料は、同一の哺乳動物から得られてもよいし、別個の哺乳動物から得られてもよい。
【００４０】
ラットにおける「神経栄養因子」の生物学的活性の生体マーカーを同定する例示的方法を、以下の実施例において提供する。４９のラットの核酸（表１０）を、以下の方法に従って同定した。さらに１３のラット核酸（表１６）を、実施例２に従って同定した。次に、対応するタンパク質配列およびヒトオルソログを、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ等の公に利用可能なデータベースを用いて同定した。１５のラットタンパク質配列（表１１）、２９のヒト核酸配列（表１２）、および２９のヒトタンパク質配列（表１３）を同じように同定した。さらに、１１のラットタンパク質配列（表１７）、１２のヒト核酸配列（表１８）、および１２のヒトタンパク質配列（表１９）が、表１６にある配列に対応すると同定された。
【００４１】
本発明は神経栄養因子の生物学的活性を評価するための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
（ａ）哺乳動物に、この因子を投与する工程；
（ｂ）この哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）この皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）この組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、この核酸またはタンパク質は、この神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーである工程。
ここで工程（ｄ）において決定されたこの核酸の量またはタンパク質の量と、この因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、この因子が生物学的に活性であることを示す。いくつかの実施形態において、工程（ｄ）で決定される量は、その因子の非存在下で発現される同じの核酸の量または同じタンパク質の量と、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、８０倍、１００倍、または１００倍以上異なる。
【００４２】
化合物または組成物の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量は、任意の適切な方法で測定することができる。皮膚生検試料は、同一の哺乳動物から得手もよいし、別個の哺乳動物から得てもよい。
【００４３】
例示的実施形態において、評価の対象となる神経栄養因子は、ＧＤＮＦファミリーのメンバーであるアルテミンである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは核酸である。例示的実施形態（例１を参照のこと）において、この核酸は、配列番号１１１５〜１１６３、好ましくは、配列番号１１１５〜１１２０のラットヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは、配列番号１１７９〜１２０７、好ましくは、配列番号１１７９〜１１８２のヒトヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。
【００４５】
さらに別の例示的実施形態（例２を参照のこと）において、この核酸は、配列番号１２５２〜１２６４、好ましくは、配列番号１２５２〜１２５６のラットヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは、配列番号１２７６〜１２８７、好ましくは、配列番号１２７６〜１２８０のヒトヌクレオチド配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーはタンパク質である。例示的実施形態（例１に関連する）において、このタンパク質は、配列番号１１６４〜１１７８、好ましくは、配列番号１１６４〜１１６６のラットタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは、配列番号１２０８〜１２３６、好ましくは、配列番号１２０８〜１２１１のヒトタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。
【００４７】
さらに別の例示的実施形態（例２に関連する）において、このタンパク質は、配列番号１２６５〜１２７４、好ましくは、配列番号１２６５〜１２６９のラットタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。別の例示的実施形態において、神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーは、配列番号１２８８〜１２９９、好ましくは、配列番号１２８８〜１２９２のヒトタンパク質配列の内のいずれか１つの非重複部分配列を含む。
【００４８】
（その他一般的な方法）
皮膚生検を得るための様々な方法が利用できる。侵襲を最小にするには、吸引カプセルを３０〜９０分間皮膚上に置いて水疱を発症させることによって表皮を除去することである。真皮−表皮結合部にてこの表皮を清潔に分離する（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ， ９８：３２３−３２９；米国特許第６，０７１，２４７号）。このアプローチは痛みがなく、また全ての血管は真皮乳頭内の表皮の下にて終末しているので、出血することなく行うことができる。こうした理由のため、この方法は、例えば糖尿病患者の脚等に対して特に安全であり得る。別のアプローチは、単純な皮膚パンチ生検である。この手順もまた、よく許容される。生検の直径が３ｍｍ以下に限られる場合、縫合の必要がない。生検部位は肉芽形成によって治癒し、小円形の瘢痕が残るが徐々に消散する。
【００４９】
ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでの発現レベルは、従来の方法を用いて測定し得る。発現レベルは通常、試料および／またはコントロール中の総ＲＮＡ量もしくは総タンパク質量に対して評価および／または標準化され、代表的には、アクチンあるいはＧＡＰＤＨ等のハウスキーピング遺伝子である。ＲＮＡレベルは、例えば定量的ＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎＴＭ ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ等）、ノーザンブロット、またはＲＮＡレベルを測定するための他の任意の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （編） Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９、またはＬｏｄｉｅ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．， ８（５）：７３９−７５１）、あるいはこの実施例において記載されるもの等によって決定されうる。タンパク質レベルは、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ法、あるいはタンパク質レベルを決定するための他の任意の方法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （編） Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９８９）に記載されている）によって決定されうる。
【００５０】
本発明の方法では、同一の型あるいは異なる型の１つ以上のマーカーを使用することができる。例えば、１種類、２種類、３種類、４種類、５種類あるいは５種類以上の核酸および／または１種類、２種類、３種類、４種類、５種類あるいは５種類以上のタンパク質を、（ａ）神経障害性疼痛、（ｂ）神経障害性疼痛に対する化合物または組成物の影響、ならびに／あるいは（ｃ）神経栄養因子の生物学的活性の評価に関する読み出した情報のために使用することができる。
【００５１】
この実施例にて示される代表的な方法は、齧歯類を使用して実施されているが、当業者は、このような手順が、他の哺乳動物で、またヒト患者において臨床的に利用可能な変数の範囲内で首尾よく実施され得ることを認識する。例えば、神経障害性疼痛を有するヒト患者から皮膚生検が得られ、本明細書で記載したものと同様の検査に供される。ヒト試料に関しては、市販されているか、または特注のヒト遺伝子アレイを使用することができる（例えばアフィメトリクスＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｔ Ｕ１３３、Ｕ１３３Ａ、ならびにＵ９５）。
【００５２】
本明細書で使用される「非重複部分配列」という用語は、その部分配列が存在する配列に特有である部分配列を指す。いくつかの実施形態において、非重複部分配列は少なくとも、例えば１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、あるいは１５００ヌクレオチドの長さである。
【００５３】
以下の配列ならびにこれらの非重複部分配列の全部あるいは一部は、特定の実施形態から除外され得る：（ａ）配列番号８、１５、１００、１７１、１９９、２４４にて示されるラットＤＮＡ ＳＭＰ；（ｂ）配列番号３１５、３１８、４０８、４２０にて示されるラットタンパク質ＳＭＰ；（ｃ）配列番号４７６、 ４７８、５６８、５７８にて示されるヒトＤＮＡ ＳＭＰ；（ｄ）配列番号６３６、６３８、７２８、７３８にて示されるヒトタンパク質ＳＭＰ；（ｅ）配列番号７９８および８３４にて示されるラットＤＮＡ ＳＭＮ；（ｆ）配列番号９０３にて示されるラットタンパク質ＳＭＮ；（ｇ）配列番号９６７にて示されるヒトＤＮＡ ＳＭＮ；（ｈ）配列番号１０４３にて示されるヒトタンパク質ＳＭＮ；ならびに（ｉ）米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２１６３４１号にて開示されている配列。
【００５４】
【表２−１】
【００５５】
【表２−２】
【００５６】
【表２−３】
【００５７】
【表２−４】
【００５８】
【表２−５】
【００５９】
【表２−６】
【００６０】
【表２−７】
【００６１】
【表２−８】
【００６２】
【表２−９】
【００６３】
【表２−１０】
【００６４】
【表２−１１】
【００６５】
【表２−１２】
【００６６】
【表２−１３】
【００６７】
【表３−１】
【００６８】
【表３−２】
【００６９】
【表３−３】
【００７０】
【表３−４】
【００７１】
【表３−５】
【００７２】
【表３−６】
【００７３】
【表３−７】
【００７４】
【表４−１】
【００７５】
【表４−２】
【００７６】
【表４−３】
【００７７】
【表４−４】
【００７８】
【表４−５】
【００７９】
【表４−６】
【００８０】
【表４−７】
【００８１】
【表５−１】
【００８２】
【表５−２】
【００８３】
【表５−３】
【００８４】
【表５−４】
【００８５】
【表５−５】
【００８６】
【表５−６】
【００８７】
【表５−７】
【００８８】
【表６−１】
【００８９】
【表６−２】
【００９０】
【表６−３】
【００９１】
【表６−４】
【００９２】
【表６−５】
【００９３】
【表７−１】
【００９４】
【表７−２】
【００９５】
【表８−１】
【００９６】
【表８−２】
【００９７】
【表８−３】
【００９８】
【表９−１】
【００９９】
【表９−２】
【０１００】
【表９−３】
【０１０１】
【表１０−１】
【０１０２】
【表１０−２】
【０１０３】
【表１１】
【０１０４】
【表１２】
【０１０５】
【表１３】
【０１０６】
【表１６】
【０１０７】
【表１７】
【０１０８】
【表１８】
【０１０９】
【表１９】
【実施例】
【０１１０】
（実施例１）
（脊髄神経結紮とアルテミン処置）
Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ （１９９２） Ｐａｉｎ， ５０：３５５−３６５の手順に従って、オスのＳｐｒａｇｕｅ（Ｓｒａｇｕｅ）−Ｄａｗｌｅｙラットに片側脊髄神経結紮（ＳＮＬ）を施した。運動機能不全のラットは除外した。麻酔したラットのＬ５脊髄神経およびＬ６脊髄神経を露出させ、４−０シルク縫合糸で堅く結紮した。実際に結紮を行わない擬似手術を同様に行った。
【０１１１】
ラットアルテミン（１１３アミノ酸；配列番号１２３７）を単離して、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から再折りたたみし、精製して＞９８％の均一性とした（Ｇａｒｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， ９（１１）：１３８３−１３８９）。（ヒトアルテミンのアミノ酸配列は、配列番号１２３８にて示されている）。精製したアルテミンはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって還元二量体として移動し、サイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣによって、単一のピーク（２４ｋＤａ）として溶出された。受容体結合性、細胞ベースのｃ−ＲＥＴキナーゼ活性化（Ｓａｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：６２３８−６２４３）、ならびに感覚神経の生存を評価することによって、この精製生成物が、ＧＤＮＦに特徴的なシステインノットジスルフィドパターンを含有し、且つインビトロにおいて十分に活性であることを確認した。脊髄神経結紮術後３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目、および１４日目に、アルテミン（１ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。
【０１１２】
（行動アッセイ）
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐａｉｎ， ３２：７７−８８によって記載されているように、熱刺激に対する痛覚過敏性を評価した。有害な放射熱に反応して後足を引っ込める潜伏時間を測定した。４０秒の最大カットオフによって組織損傷は防がれた。
【０１１３】
触覚引っ込め（ｔａｃｔｉｌｅ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）閾値は、８つの較正済みｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｒｏｅｌｔｉｎｇ， Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）（０．４１ ｇから１５ ｇ。）を使用して後足を探針することによって測定した。各フィラメントは、Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５３， ５５−６３によって記載されているアップダウン法を用いて後足底表面へ当てた。刺激強度を連続して増減させることによって、引っ込め閾値を決定し、ディクソン非パラメーター検定を用いて算出した（Ｄｉｘｏｎ （１９８０） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ２０：４４１−４６２）。
【０１１４】
神経結紮誘発触覚および熱痛覚過敏、ならびに神経障害性疼痛行動に対するアルテミンの効果の行動確認の後、続く遺伝子発現プロファイリングのために、脊髄神経結紮後１４日目（アルテミン注射ならびに行動試験の後）に、Ｌ４真皮節から皮膚試料を採取した。できるだけ多くの体毛を除去するよう皮膚を剃り、全部で１２の皮膚試料を採取して瞬間凍結した。４つのグループの各ラットから３つずつ得た：（１）ビヒクル処置＋ＳＮＬ損傷（損傷の同側）、（２）ビヒクル処置＋ＳＮＬ損傷（損傷の反対側）、（３）アルテミン処置＋ＳＮＬ損傷（損傷の同側）、ならびに（４）アルテミン処置＋ＳＮＬ損傷（損傷の反対側）。
【０１１５】
（総ＲＮＡの精製）
ＴＲＩｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中でＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ８（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ， Ｓｔａｕｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の手順書に従って使用して、瞬間凍結した皮膚試料をホモジェナイズした。ＲＮｅａｓｙＴＭ Ｍｉｎｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を製造者の手順書に従って使用して、１００μｇの総ＲＮＡをさらに精製した。
【０１１６】
（プローブ標識、ハイブリダイゼーション、ならびにスキャニング）
皮膚生検試料に由来するｍＲＮＡを、アフィメトリクス Ｒａｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ３４Ａ、Ｕ３４Ｂ、ならびにＵ３４Ｃ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓＴＭプローブアレイ上でプロファイリングした。これらのアレイは、２４，０００を超えるｍＲＮＡ遺伝子転写物、ならびにＵｎｉＧｅｎｅＴＭデータベースのＢｕｉｌｄ ３４にあるＥＳＴ配列、加えてＧｅｎｅＢａｎｋＴＭ１１０の全長配列を含有する。ＧｅｎｅＣｈｉｐｓＴＭプローブアレイは、オリゴヌクレオチドプローブをガラス表面上で直接合成することによって作製されている。各２５ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブは、１つの遺伝子に対して一意に相補的であり、約１６対のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、アレイ中に示される遺伝子各々の転写レベルを測定する。
【０１１７】
試料の標識、ハイブリダイゼーション、ならびに染色は、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＴＭ Ｔｅｃｈｉｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ （７０１０２１ ｒｅｖ １）内の、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）用Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎのプロトコルに従って実行した。概略を述べると、４２℃で１時間のインキュベーションにて、１倍の第１鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で、５μｇの精製した総ＲＮＡを、２００ Ｕ のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）および０．５μｇの（ｄＴ）−Ｔ７プライマー（配列番号１２３９）と共に２０μＬの第１鎖反応に使用した。第２鎖合成は、１倍の第２鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にて、４０ ＵのＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、２ ＵのＥ． ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＨ、１０ ＵのＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼを添加し、その後１６℃で２時間のインキュベーションすることによって行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｓａｍｐｌｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｏｄｕｌｅを製造者の手順書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従って使用し、この第２鎖合成反応物を精製した。精製したｃＤＮＡは、ＢｉｏＡｒｒａｙＴＭ高収量ＲＮＡ転写標識キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐａｒｍｉｎｇｄａｌｅ， ＮＹ）を製造者の手順書に従って使用して増幅し、７０〜１２０μｇのビオチン標識ｃＲＮＡ（相補ＲＮＡ）を作製した。ラットゲノムＵ３４ Ａ、Ｂ、ならびにＣ のＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭプローブアレイを、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｈｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ６４０ （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にて、製造者の手順書に従って前もってハイブリダイズさせた。３０μＬの１倍の断片化緩衝液１００ ｍＭ ＫＯＡｃ、３０ ｍＭ ＭｇＯＡｃ中にて、１５μｇの標識ｃＲＮＡを９５℃で３５分間断片化した。断片化した標識ｃＲＮＡは、１００ ｍＭ ＭＥＳ、１ Ｍ Ｎａ＋、２０ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＴｗｅｅｎＴＭ２０、０．５ ｍｇ／ｍＬアセチル化ＢＳＡ、０．１ ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ、コントロールオリゴＢ２、およびコントロール転写物ｂｉｏＢ １．５ ｐＭ、ｂｉｏＣ ５ ｐＭ、ｂｉｏＤ ２５ ｐＭ、ならびにｃｒｅ １００ ｐＭを含有する１倍ハイブリダイゼーション緩衝液３００μＬ中に再び懸濁し、製造者の手順書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭプローブアレイにハイブリダイズさせた。このハイブリダイズしたＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイを洗浄して、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎｉｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を用いて染色し、抗体増殖の手順書を用いて、ビオチン化抗ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）（Ｓｉｇｍａ， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で増殖させた。ＧｅｎｅＡｒｒａｙＴＭスキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ， Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ， ＯＲ）を使用して、このＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭプローブアレイをスキャニングした。
【０１１８】
（データの解析）
２つの独立した解析アプローチ（Ｒｏｓｅｔｔａ ＲｅｓｏｌｖｅｒＴＭおよび、独自の順列ベースのベイズ統計モデル）を使用して、生体マーカーならびに代用マーカーを同定した。
【０１１９】
Ｒｏｓｅｔｔａ ＲｅｓｏｌｖｅｒＴＭソフトウエア（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｋｉｒｋｌａｎｄ， ＷＡ）を使用して、以下の分析技術を行った。
【０１２０】
ＡＮＯＶＡ分析のため、三連の試料を、１つのグループと見なした。目的の比較は、以下を包含する：
１）ビヒクル処置対アルテミン処置、反対側真皮節
２）ビヒクル処置対アルテミン処置、同側真皮節
３）反対側対同側、ビヒクル処置真皮節
４）反対側対同側、アルテミン処置真皮節。
【０１２１】
発現レベルがグループ間で有意に異なる（ｐ≦０．０１）ことが分かった遺伝子に基づいて、遺伝子リストを作成した。続いてこれらの遺伝子を、倍数変化値の有意性（ｐ≦０．０１）に関して検定した。４つの比較事項の各々ついての最終遺伝子リストには、双方の判定基準を通過した遺伝子を含めた。凝集型階層的クラスター法（ヒューリスティク・クライテリア＝平均連鎖（ａｖｅｒａｇｅ ｌｉｎｋ）、類似性尺度＝ユークリッド距離、クラスタリングに使用する強度／Ｚ値）によって、互いからの各比較において、この最終遺伝子リストが２つの群によく分離していることを確認した。
【０１２２】
順列ベースのベイズ分析を以下のように行った。全ての遺伝子について、順列に基づいたアプローチを使用して、グループ内（同一処置動物間）および試料グループ比較間の、全ての可能性のあるペアワイズに関して発現強度値の対数比の分布を作製した。
【０１２３】
例えば、３匹の同一処置ラットから、上記に概説した４種の処置状況の各々に関して、３つのグループ内ペアワイズ比較を得た。このように、計１２のグループ内対数比と、６つの可能なグループ間比較に関する９のグループ間対数比を得た（表１４）。これは、チップＡ、Ｂ、およびＣについて行った。
【０１２４】
【表１４】
比率計算は全て、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＴＭ ＭＡＳ５アプリケーションを使用して行った。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＴＭ ＭＡＳ５アプリケーションは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ （２００１）に記載されているアフィメトリクスＴＭ独自のエラーモデルを使用して、バックグラウンド補正強度（完全一致シグナル強度とミスマッチシグナル強度との差）の比を要約している。デフォルトパラメーターを使用してシグナル強度を定量した（アルファ １＝０．０４；アルファ ２＝０．０６；タウ＝０．０１５；ノイズ（ＲａｗＱ）＝２．８００；スケール因子（ＳＦ）＝１．０００ ；標準化因子（ＮＦ）＝１．０００；ガンマ１Ｌ＝０．００２５；ガンマ１Ｈ＝０．００２５；ガンマ２Ｌ＝０．００３；ガンマ２Ｈ＝０．００３；揺らぎ（Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）＝１．１）。要約されたシグナル対数比を関連づけられたＰ値と共に統計分析用に出力した。
【０１２５】
先の対数比の分布を使用して、グループ間比較対数比のＰ値（事後確立）を更新した。グループ内対数比分布が有意に異なる（ｐ＜０．０５）グループ間の対数比分布を伴う遺伝子を、識別的に発現される（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）遺伝子として選択した。任意の比較についての要約した対数比を、そのグループの全順列対数比の誤差重み付け平均として予測した。
【０１２６】
脊髄神経結紮損傷が影響を及ぼし（ビヒクル処置の同側真皮節対反対側真皮節）、よって神経障害性疼痛行動と相関する３０８の遺伝子を、表２に列挙する。
【０１２７】
アルテミン神経栄養活性の代用マーカーを同定するために、目的の特異的プロフィールを有する遺伝子（例えば、損傷後に上方制御され、次にアルテミン投与に伴い通常レベルまで下方制御される遺伝子）を、反対側ビヒクル処置真皮節対同側ビヒクル処置真皮節ならびに、同側ビヒクル処置真皮節対同側アルテミン処置真皮節を比較する遺伝子リストを交差することによって見出した。このように同定した１０７のアルテミン神経栄養活性の代用マーカーを表６に列挙する。
【０１２８】
アルテミンのインビボでの生物学的活性の生体マーカーを同定するため、反対側ビヒクル処置真皮節対反対側アルテミン処置真皮節、ならびに同側ビヒクル処置真皮節対同側アルテミン処置真皮節を比較するリストに共通する遺伝子を同定した。続いて反対側真皮節および同側真皮節において、アルテミンによって同じ方向に制御される遺伝子を同定した。このように、４９のアルテミンの生物学的活性の生体マーカーを同定し、これらを表１０に列挙する。図７は、ＴａｑＭａｎＴＭ分析で未確認のＢＭＮの例を示す。
【０１２９】
代用マーカーならびに生体マーカーの有効性を確認するために、好ましい神経栄養活性の２５の代用マーカーおよび、５つの好ましい生体マーカーを、転写物の存在を確認するための配列分析に使用した。配列分析には、ラットゲノム配列に対するアフィメトリクスＴＭターゲット配列のＢＬＡＳＴＴＭ検索が含まれる。次に、エキソン、ＥＳＴ、ならびに推定転写物の有無に関してゲノムの座を調べた。転写の証拠に基づいて遺伝子の優先順位を決定し、以下に記載されるようにＴａｑＭａｎＴＭ検証を行った（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：７２７６−７２８０も参照）。
【０１３０】
（ＴａｑＭａｎＴＭ分析）
ＴｒｉｚｏｌｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）精製ラット皮膚ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙＴＭ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の手順書に従って使用して、さらに精製した。Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ １（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてこのＲＮＡを処理し、あらゆる夾雑ＤＮＡを除去した。続いてこのＲＮＡをＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した。その結果得られるｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎＴＭ分析のためのＰＣＲ鋳型として使用した。
【０１３１】
Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ １．５ ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の「ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ ａｎｄ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ」機能を使用して、アフィメトリクス・ターゲット配列のためのプライマーならびにプローブ配列を作製した（例えば、ｒｃ＿ＡＡ８１８８０４＿ａｔ ＲＧ−Ｕ３４Ｃ、ｒｃ＿ａａ８１８１２０＿ａｔ ＲＧ−Ｕ３４Ｃ、ならびにＸ１４８１２＿ａｔ ＲＧ−Ｕ３４Ａについては表１５を参照）。
【０１３２】
【表１５】
また、ＰＣＲアンプリコン、加えて各遺伝子の５’および３’末端に１０ ｂｐを追加したものに及ぶオリゴマーを合成した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによってプライマーならびに６ＦＡＭ標識プローブを合成し、標準法に従いｃＤＮＡ鋳型との反応にて始動させた。反応はデフォルト条件を使用したＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにて実行し、データはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．９．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。アンプリコンオリゴマーの１０倍稀釈シリーズを使用して同時ＰＣＲ反応を実行し、各プライマーとプローブの組み合わせに関して標準曲線を作製した。各試験反応についてのサイクル閾値（Ｃｔ）をアンプリコン標準曲線と比較し、ｍＲＮＡの相対量を決定した。また、ＴａｑＭａｎＴＭ Ｒｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡ試料を解析し、各試料中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの量を決定した。各代用マーカー遺伝子のシグナルをＧＡＰＤＨコントロールで得られたシグナルで割って、試料を標準化した。この結果を図１〜６に示す。
【０１３３】
図１〜６に示す遺伝子発現パターンは、アフィメトリクス解析の結果と相応する。これらの遺伝子は全て、非損傷状態（ビヒクル／反対側、ならびにアルテミ／同側）では低レベルで発現され、損傷状態（ビヒクル／同側）においては上方制御され、アルテミン処置後（アルテミン／同側）に少なくとも部分的に正常化される。この発現プロフィールは、ラット脊髄神経結紮モデルにおいてこれらの遺伝子が、アルテミン活性の代用マーカーとして作用することに一致する。
【０１３４】
（実施例２：アルテミン曝露生体マーカーの測定）
（曝露生体マーカーの試料）
損傷されていないオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、アルテミンまたはビヒクルを投与し、続いて実施例１のように真皮節Ｌ４を処理した。以下のグループの内の３匹ずつから左右の真皮節Ｌ４に対応する１８個の試料を作製した：（１）非損傷＋アルテミン処置、（２）非損傷＋ビヒクル処置、（３）未処置。
【０１３５】
（データの解析）
２つの独立した解析アプローチ（Ｒｏｓｅｔｔａ ＲｅｓｏｌｖｅｒＴＭならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＭＡＳ５．０ＴＭ）を用いて、アルテミン曝露生体マーカーを同定した。
【０１３６】
Ｒｏｓｅｔｔａ ＲｅｓｏｌｖｅｒＴＭソフトウエア（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｋｉｒｋｌａｎｄ， ＷＡ）を使用して、以下の解析法を実行した。左右３つずつの試料を、ＡＮＯＶＡ分析のための１つのグループと見なした。目的の比較には以下が含まれる：
１）未処置対ビヒクル処置非損傷真皮節；
２）未処置対アルテミン処置非損傷真皮節；ならびに、
３）ビヒクル処置対アルテミン処置非損傷真皮節。
【０１３７】
発現レベルがグループ間で有意に異なる（ｐ≦０．０１）ことが分かった遺伝子に基づき、遺伝子リストを作成した。続いてこれらの遺伝子を、倍数変化値および倍数変化の程度における有意性（ｐ≦０．０５）について検定した（−２≧Ｚ値≧２）。各比較についての最終遺伝子リストには、３つの判定基準を全て通過した遺伝子を含めた。
【０１３８】
アルテミンのインビボでの生物学的活性の生体マーカーを同定するため、未処置対アルテミン処置真皮節ならびにビヒクル処置対アルテミン処置真皮節を比較するリストに共通する遺伝子を同定した。次に、未処置とビヒクル処置との間で変化しない、これらの遺伝子のセットをアルテミン曝露の生体マーカーとして同定した（ＢＭＮ）。
【０１３９】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＭＡＳ５ＴＭ分析は、以下のように行った。この方策には、（ｉ）動物の左側と右側の間、あるいは（ｉｉ）動物の反対側での同一の処理、において識別的に発現されたＡｆｆｙＩＤを最初に同定し、これによって動物内における不均一性を示す工程を含んだ。次に、皮膚における、遺伝子発現に対する全身性アルテミン投与の影響を理解するために、全ての処置を比較した。上記（ｉ）もしくは（ｉｉ）にて見出されるか、またはビヒクルのみの処置によって変化したと判定されたＡｆｆｙＩＤＴＭは、最終的な考察から除いた。
【０１４０】
アフィメトリクス（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ Ｕｓｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ ２００１に記載されているアフィメトリクス（登録商標）独自のエラーモデルを使用してバックグラウンド補正強度（完全一致シグナル強度とミスマッチシグナル強度との差）を用いるアフィメトリクス（登録商標）ＭＡＳ５ソフトウエアを使用して、発現強度値の全ての可能性のあるペアワイズ比を作出した。ペアワイズ比のため、ＭＡＳ５はウィルコクソンの符号付順位検定を用いて、どのＡｆｆｙＩＤが変化し（増加あるいは減少「Ｉ／Ｄ」。）、どれが変化していないか（「ＮＣ」）を判定した。
【０１４１】
上記（ｉ）および（ｉｉ）の比較を示す比の半数より多くが「ＮＣ」を呈する必要があり；そうでなければ、ＡｆｆｙＩＤを考察から除いた。左対右の比較に関して、３つの全てのチップに渡って２３の全比率を考察し、３５８のＡｆｆｙＩＤＴＭを落とした。動物観比較については、全てのチップに対して２７個の全比率を考察し、１，３７５個のＡｆｆｙＩＤＴＭを落とした。
【０１４２】
処理間の比較については、２７の比を作出し、各比較について考察した（１チップ当たり９）。９つの比のうち少なくとも８つが、さらなる分析のための考察されるように一定して増加あるいは減少していなければならない。
【０１４３】
アルテミン処置と未処置ならびにビヒクル処置とを比較する遺伝子リストを交差させると、１０個のＡｆｆｙＩＤＴＭがアルテミン曝露マーカーの候補であることが分かった。
【０１４４】
これら２つの解析を交差させた際に、２つのＡｆｆｙＩＤＴＭを共通して見出した。これら２つの解析を統合することによって得られる１３の遺伝子を、アルテミン曝露の生体マーカーとして表１６に列挙する。
【０１４５】
ヌクレオチド配列に対する全ての言及は、所定の配列に相補的な配列を包含すると理解すべきである。全ての刊行物および特許、ならびにアクセッション番号によって本開示に引用された配列は全て、本明細書にその全体が参考として援用される。参考として援用される資料が本明細書と矛盾するか、あるいは相反する場合、本明細書が全てのこのような資料に取って代わる。
【０１４６】
ｓｕｒｒｍａｒｋｅｒｓ０２１７０５．ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズが４，６８９，９２０バイトの２００４年２月１７日作製のファイルを含む、「神経障害性疼痛の代用マーカー（「Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｉｎ」）と表題されたＣＤ−ＲＯＭにて本明細書と共に提出する資料は、本明細書に参考として援用される。
【０１４７】
本明細書に記載された具体的な実施形態は、例示のみのために提供されるものであり、あらゆる面において、限定することを意図するものではない。本明細書および実施例は例示としてのみみなされ、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の請求項によって示すことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、脊髄神経結紮損傷（ＳＮＬ）およびアルテミン治療を受けたラットのＬ４真皮節における、ｒｃ＿ＡＡ８１８８０４＿ａｔ（配列番号１８および配列番号７９９）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図２】図２は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、Ｘ１４８１２＿ａｔ（配列番号３７および配列番号８１３）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図３】図３は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、ｒｃ＿ＡＡ８１８１２０＿ａｔ（配列番号３１および配列番号８０８）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図４】図４は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、ｒｃ＿ＡＡ９４６０９４＿ａｔ（配列番号２および配列番号７９１）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図５】図５は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、Ｘ０７３１４ｃｄｓ＿ａｔ（配列番号１１および配列番号７９６）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図６】図６は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、Ｍ２７１５１＿ａｔ（配列番号２２および配列番号８０１）の遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析の結果を示す。この遺伝子は、損傷を受ける前は低レベルで、損傷後はより高レベルで、損傷後にアルテミン処置を行った後は正常に近いレベルで発現する。
【図７】図７は、ＳＮＬおよびアルテミン処置を受けたラットのＬ４真皮節における、ｒｃ＿ＡＩ０７２７１２＿ａｔ（配列番号１１１８）の遺伝子発現のアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ）分析の結果を示す。損傷の状態に拘わらず、この遺伝子は、ビヒクル処理試料にて比較的高レベル得で発現し、アルテミン処置後に遙かに低いレベルで発現する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における神経障害性疼痛の代理マーカーを同定する方法であって、該方法は：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該第１試料および該第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織抽出物中の少なくとも１種の核酸またはタンパク質の量を決定する工程；
を包含し、ここで該第１試料の該核酸の量または該タンパク質の量と、該第２試料の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、該核酸または該タンパク質が神経障害性疼痛の代理マーカーであることを示す、方法。
【請求項２】
前記第１試料中の前記核酸または前記タンパク質の量は、前記第２試料中の同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１試料および前記第２試料は、同じ哺乳動物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸または前記タンパク質は、筋特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルを評価する方法であって、該方法は：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）実質的に神経障害性疼痛がない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該第１試料および該第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、該核酸または該タンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである、工程；
を包含し、ここで該第１試料中の該核酸の量または該タンパク質の量と、該第２試料中の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、神経障害性疼痛のレベルを示す、方法。
【請求項８】
前記第１試料中の前記核酸の量または前記タンパク質の量は、前記第２試料中の同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１試料および前記第２試料は、同じ哺乳動物から得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸は、配列番号１〜３０８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸は、配列番号１〜４２のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質は、配列番号３０９〜４７０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質は、配列番号３０９〜３３３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物はヒトである、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸は、配列番号４７１〜６３０のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸は、配列番号４７１〜４９３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質は、配列番号６３１〜７９０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質は、配列番号６３１〜６５３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
前記代理マーカーは筋特異的である、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルに対する化合物または組成物の効果を評価する方法であって、該方法は：
（ａ）神経障害性疼痛を有する該哺乳動物に該化合物または該組成物を投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、該核酸または該タンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである、工程；
を包含し、ここで工程（ｄ）において決定された該核酸の量または該タンパク質の量と、該化合物または該組成物の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、神経障害性疼痛に対する該化合物または該組成物の効力のレベルを示す、方法。
【請求項２２】
前記工程（ｄ）において決定された量は、前記化合物または前記組成物の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項２１に記載に方法。
【請求項２３】
前記化合物または前記組成物は、神経栄養因子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経栄養因子は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーに属する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経栄養因子はアルテミンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸は、配列番号７９１〜８９７のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸は、配列番号７９１〜８１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、 請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質は、配列番号８９８〜９６２のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質は、配列番号８９８〜９１４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸は、配列番号９６３〜１０３８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸は、配列番号９６３〜９７９のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質は、配列番号１０３９〜１１１４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質は、配列番号１０３９〜１０５５のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸またはタンパク質は筋特異的である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーを同定する方法であって、該方法は：
（ａ）哺乳動物に、該因子を投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織中の少なくとも１種の核酸またはタンパク質の量を決定する工程；
を包含し、ここで工程（ｄ）において決定された該核酸の量または該タンパク質の量と、該因子の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量との差異は、該核酸または該タンパク質が、該因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーであることを示す、方法。
【請求項３８】
前記工程（ｄ）において決定された量は、前記因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくともお２倍異なる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記神経栄養因子は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーに属する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記神経栄養因子はアルテミンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸または前記タンパク質は筋特異的である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
神経栄養因子のインビボでの生物学的活性を評価する方法であって、該方法は：
（ａ）哺乳動物に該因子を投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程；
を包含し、ここで工程（ｄ）において決定された該核酸の量または該タンパク質の量と、該因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、該因子が生物学的に活性であることを示す、方法。
【請求項４３】
前記工程（ｄ）において決定された量は、前記因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸または前記タンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸または前記タンパク質は、前記因子の神経栄養活性の代理マーカーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記神経栄養因子は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーに属する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記神経栄養因子はアルテミンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸は、配列番号１１１５〜１１６３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸は、配列番号１２５２〜１２６４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸は、配列番号１１１５〜１１２０のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸は、配列番号１２５２〜１２５６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記タンパク質は、配列番号１１６４〜１１７８のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
前記タンパク質は、配列番号１２６５〜１２７４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記タンパク質は、配列番号１１６４〜１１６６のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
前記タンパク質は、配列番号１２６５〜１２６９のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳動物はヒトである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸は、配列番号１１７９〜１２０７のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸は、配列番号１２７６〜１２８７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸は、配列番号１１７９〜１１８２のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸は、配列番号１２７６〜１２８０のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６２】
前記タンパク質は、配列番号１２０８〜１２３６のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６３】
前記タンパク質は、配列番号１２８８〜１２９９のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６４】
前記タンパク質は、配列番号１２０８〜１２１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６５】
前記タンパク質は、配列番号１２８８〜１２９２のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸またはタンパク質は筋特異的である、請求項４２に記載の方法。
【請求項６７】
哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルに対するアルテミンの効果を評価する方法であって、該方法は：
（ａ）神経障害性疼痛を有する哺乳動物にアルテミンを投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量を決定する工程であって、該核酸は、配列番号７９１〜８１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、工程；
を包含し、ここで工程（ｄ）において決定された該核酸または該タンパク質の量と、該化合物または該組成物の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量との差異は、神経障害性疼痛に対する該化合物または該組成物の効力のレベルを示す、方法。
【請求項６８】
前記工程（ｄ）において決定された量は、前記アルテミンの非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
神経障害性疼痛は、脊髄神経損傷により引き起こされる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
実質的に神経障害性疼痛がない条件にある第２の皮膚生検試料を得る工程を包含する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１試料および前記第２試料は、同じ哺乳動物から得られる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１皮膚生検試料は、前記脊髄神経損傷に対して対側性の第１部位から得られ、前記第２皮膚生検試料は、前記脊髄神経損傷に対して同側性の第２部位から得られる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記核酸またはタンパク質は筋特異的である、請求項６７に記載の方法。
【請求項１】
哺乳動物における神経障害性疼痛の代理マーカーを同定する方法であって、該方法は：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）神経障害性疼痛が実質的にない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該第１試料および該第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織抽出物中の少なくとも１種の核酸またはタンパク質の量を決定する工程；
を包含し、ここで該第１試料の該核酸の量または該タンパク質の量と、該第２試料の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、該核酸または該タンパク質が神経障害性疼痛の代理マーカーであることを示す、方法。
【請求項２】
前記第１試料中の前記核酸または前記タンパク質の量は、前記第２試料中の同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１試料および前記第２試料は、同じ哺乳動物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸または前記タンパク質は、筋特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルを評価する方法であって、該方法は：
（ａ）神経障害性疼痛の条件下にある第１皮膚生検試料を得る工程；
（ｂ）実質的に神経障害性疼痛がない条件下にある第２皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該第１試料および該第２試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、該核酸または該タンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである、工程；
を包含し、ここで該第１試料中の該核酸の量または該タンパク質の量と、該第２試料中の同じ核酸の量または同じタンパク質の量との間の差異は、神経障害性疼痛のレベルを示す、方法。
【請求項８】
前記第１試料中の前記核酸の量または前記タンパク質の量は、前記第２試料中の同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１試料および前記第２試料は、同じ哺乳動物から得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸は、配列番号１〜３０８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸は、配列番号１〜４２のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質は、配列番号３０９〜４７０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質は、配列番号３０９〜３３３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物はヒトである、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸は、配列番号４７１〜６３０のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸は、配列番号４７１〜４９３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質は、配列番号６３１〜７９０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質は、配列番号６３１〜６５３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
前記代理マーカーは筋特異的である、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルに対する化合物または組成物の効果を評価する方法であって、該方法は：
（ａ）神経障害性疼痛を有する該哺乳動物に該化合物または該組成物を投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程であって、該核酸または該タンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである、工程；
を包含し、ここで工程（ｄ）において決定された該核酸の量または該タンパク質の量と、該化合物または該組成物の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、神経障害性疼痛に対する該化合物または該組成物の効力のレベルを示す、方法。
【請求項２２】
前記工程（ｄ）において決定された量は、前記化合物または前記組成物の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項２１に記載に方法。
【請求項２３】
前記化合物または前記組成物は、神経栄養因子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経栄養因子は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーに属する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経栄養因子はアルテミンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸は、配列番号７９１〜８９７のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸は、配列番号７９１〜８１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、 請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質は、配列番号８９８〜９６２のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質は、配列番号８９８〜９１４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸は、配列番号９６３〜１０３８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸は、配列番号９６３〜９７９のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質は、配列番号１０３９〜１１１４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質は、配列番号１０３９〜１０５５のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸またはタンパク質は筋特異的である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
神経栄養因子の生物学的活性の生体マーカーを同定する方法であって、該方法は：
（ａ）哺乳動物に、該因子を投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織中の少なくとも１種の核酸またはタンパク質の量を決定する工程；
を包含し、ここで工程（ｄ）において決定された該核酸の量または該タンパク質の量と、該因子の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量との差異は、該核酸または該タンパク質が、該因子のインビボでの生物学的活性の生体マーカーであることを示す、方法。
【請求項３８】
前記工程（ｄ）において決定された量は、前記因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくともお２倍異なる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記神経栄養因子は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーに属する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記神経栄養因子はアルテミンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸または前記タンパク質は筋特異的である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
神経栄養因子のインビボでの生物学的活性を評価する方法であって、該方法は：
（ａ）哺乳動物に該因子を投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量またはタンパク質の量を決定する工程；
を包含し、ここで工程（ｄ）において決定された該核酸の量または該タンパク質の量と、該因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量との差異は、該因子が生物学的に活性であることを示す、方法。
【請求項４３】
前記工程（ｄ）において決定された量は、前記因子の非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸または前記タンパク質は、神経障害性疼痛の代理マーカーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸または前記タンパク質は、前記因子の神経栄養活性の代理マーカーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記神経栄養因子は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーに属する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記神経栄養因子はアルテミンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸は、配列番号１１１５〜１１６３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸は、配列番号１２５２〜１２６４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸は、配列番号１１１５〜１１２０のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸は、配列番号１２５２〜１２５６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記タンパク質は、配列番号１１６４〜１１７８のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
前記タンパク質は、配列番号１２６５〜１２７４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記タンパク質は、配列番号１１６４〜１１６６のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
前記タンパク質は、配列番号１２６５〜１２６９のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳動物はヒトである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸は、配列番号１１７９〜１２０７のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸は、配列番号１２７６〜１２８７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸は、配列番号１１７９〜１１８２のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸は、配列番号１２７６〜１２８０のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６２】
前記タンパク質は、配列番号１２０８〜１２３６のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６３】
前記タンパク質は、配列番号１２８８〜１２９９のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６４】
前記タンパク質は、配列番号１２０８〜１２１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６５】
前記タンパク質は、配列番号１２８８〜１２９２のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸またはタンパク質は筋特異的である、請求項４２に記載の方法。
【請求項６７】
哺乳動物における神経障害性疼痛のレベルに対するアルテミンの効果を評価する方法であって、該方法は：
（ａ）神経障害性疼痛を有する哺乳動物にアルテミンを投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物から少なくとも１つの皮膚生検試料を得る工程；
（ｃ）該皮膚生検試料から組織抽出物を調製する工程；ならびに
（ｄ）該組織抽出物中の少なくとも１種の核酸の量を決定する工程であって、該核酸は、配列番号７９１〜８１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの非重複部分配列を含む、工程；
を包含し、ここで工程（ｄ）において決定された該核酸または該タンパク質の量と、該化合物または該組成物の非存在下で発現される同じ核酸または同じタンパク質の量との差異は、神経障害性疼痛に対する該化合物または該組成物の効力のレベルを示す、方法。
【請求項６８】
前記工程（ｄ）において決定された量は、前記アルテミンの非存在下で発現される同じ核酸の量または同じタンパク質の量とは少なくとも２倍異なる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記哺乳動物は齧歯類である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
神経障害性疼痛は、脊髄神経損傷により引き起こされる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
実質的に神経障害性疼痛がない条件にある第２の皮膚生検試料を得る工程を包含する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１試料および前記第２試料は、同じ哺乳動物から得られる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１皮膚生検試料は、前記脊髄神経損傷に対して対側性の第１部位から得られ、前記第２皮膚生検試料は、前記脊髄神経損傷に対して同側性の第２部位から得られる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記核酸またはタンパク質は筋特異的である、請求項６７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５３６９１３（Ｐ２００７−５３６９１３Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５４２４１（Ｐ２００６−５５４２４１）
【出願日】平成１７年２月１８日（２００５．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００５２５０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８３１２５
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１８日（２００５．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００５２５０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８３１２５
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]