糖尿病治療におけるラノスタンおよびポリア抽出物の使用
【課題】血液中の不十分なインスリンにより誘発される糖尿病を治療するための薬剤組成物の提供。
【解決手段】マツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の代謝産物、菌核粒子（ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）または発酵産物からのポリア抽出物で、下記に代表されるラノスタン化合物
を有効成分として含むＩ型及びＩＩ型糖尿病治療剤。
【解決手段】マツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の代謝産物、菌核粒子（ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）または発酵産物からのポリア抽出物で、下記に代表されるラノスタン化合物
を有効成分として含むＩ型及びＩＩ型糖尿病治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病の治療におけるポリア抽出物の使用に関する。特に、血液中の不十分なインスリンから誘発される糖尿病の治療におけるポリア抽出化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は富裕国の成人人口（特に高齢人口）に共通に見られる慢性疾患である。糖尿病である患者は主に二つの型に分類されうる。１つ目はＩ型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病と呼ばれ、人体における自己免疫応答により、膵臓のβ−細胞が破壊され、患者の体内にインスリンを生産できなくなる。したがって、これらの患者は、その血液循環にインスリンを有さず、結果的にインスリン注射が必要となる。２つ目の糖尿病はＩＩ型糖尿病または非インスリン依存性糖尿病と呼ばれ、ここでは遺伝因子が重要な役割を担い、例えば肥満などの生活習慣の影響が当該病気の誘発において重大であると考えられているが、その原因は未だ不明である。
【０００３】
紀元約５００年に、「備急千金要方（Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｆｏｒｍｕｌａｓ Ｗｏｒｔｈ ａ Ｔｈｏｕｓａｎｄ ｉｎ Ｇｏｌｄ）」という中国の医学文献が唐時代にまとめられ、糖尿病の治療に使用される多くの医薬の混合物が記録されており、その混合物のいくつかがポリアを含むことが知られている。２００２年に、日本の研究者Ｍ．ＳａｔｏらがＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ．にポリアの皮から得られたデヒドロトラメテノリック酸（ｄｅｈｙｄｒｏｔｒａｍｅｔｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）がＩＩ型糖尿病の治療に応用されうることを示す論文を発表した（非特許文献１）。根本的なメカニズムはインスリンに対する患者の体の感度を増強することであり（すなわち患者のインスリンに対する耐性を低下させることに相当し）、糖尿病の治療目的を達成する。しかしながら、インヴィトロで含脂肪細胞を使用した過去の実験からデヒドロトラメテノリック酸（ｄｅｈｙｄｒｏｔｒａｍｅｔｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）の効果的な濃度は１０−５Ｍであることが明らかであり、マウスを用いたインヴィボの実験はデヒドロトラメテノリック酸の効果的な投与量は１１０ｍｇ／ｋｇであることを示す。結果的に、研究者は人体に使用する有効投与量は少なくとも７００ｍｇより多いという結論に到達した。しかし７００ｍｇの有効投与量は現在採用されている臨床投与量の１０倍以上に相当し、臨床薬開発における現実的な課題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００２，２５（１），８１−８６．
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、必要としている哺乳動物に下記化学式（Ｉ）で示されるラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩を有効な量で投与することを含む、糖尿病の治療方法を開示することであり、前記糖尿病は哺乳動物の血液中の不十分なインスリンから誘発されるものである。
【０００６】
【化１】
【０００７】
式中、Ｒ１は、−Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ２は、−ＯＣＯＣＨ３、＝Ｏまたは−ＯＨであり；Ｒ３は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、−Ｈまたは−ＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）Ｒｂ（この際、Ｒｂは、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５は、−Ｈまたは−ＯＨであり；およびＲ６は、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである。
【０００８】
本発明は、ポリアから抽出された有効な成分が、（１）グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）の遺伝子発現（ｍＲＮＡ発現）を増加し、（２）ＧＬＵＴ４の生産を増加し、（３）脂質細胞または筋細胞の細胞膜上にＧＬＵＴ４タンパク質を細胞内転移し、（４）ＧＬＵＴ４に細胞外のグルコースを細胞に輸送させ、および（５）インスリンが行うように細胞内にトリグリセリドを生産および蓄積することにより、機能的にインスリンの代わりとなることができることを示す。したがって、ポリアの有効成分は機能的にインスリンの代わりとなり、グルコースを血流から細胞内に輸送することができ、血液のグルコースレベルを低下する。結果として、前記成分は不十分な血液インスリンを原因とするＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病の治療に適用される。さらに重要なことに、インヴィトロでの脂質の実験は、前記成分が０．０１μＭの濃度で、日本人研究者Ｓａｔｏの記録した１０−５Ｍの有効濃度より１０００倍小さい値であるグルコース吸収を可能とすることを示した。
【０００９】
前記の本発明の目的および有利な点は添付の図面を参照すればより明確に理解できるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ポリアから抽出され精製されたラノスタン型トリテルペン化合物の構造を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞により糖摂取の促進においてポリア抽出物が有する効果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、インスリン（０．１μＭ）を３０分間作用させ、精製されたトリテルペン化合物（０．０１μＭ）を２時間作用させた時に添加された糖の種類に基づき糖の摂取に与える効果を示すグラフである。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示される。コントロール群（未治療）との比較において、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、パキム酸（ＰＡ）が０．０１μＭで２時間投与された時に最も高い糖の摂取速度をもたらすのに効果的であったことを示す図である。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示される。コントロール群（未治療）との比較において、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＡ投与量の上昇を伴う糖の摂取の増加を示すグラフである。ＰＡは試験のために糖を添加する前２時間作用させ、図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示される。コントロール群（未治療）との比較において、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図４】図４は、ＰＡが異化されおよび成熟した含脂肪細胞において糖の摂取を促進させることのみを示す図である。未成熟および成熟した含脂肪細胞は最初にＰＡと混合されおよび２時間反応し、その後ＰＴを加えられたならば；ＰＡにより糖の摂取が促進されたように、前記細胞の二つの型において糖の摂取は有意に抑制される。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示される。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＡがＧＬＵＴ１の発現の促進には効果がないことを示す図である。図は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＡがＧＬＵＴ４の発現の促進には効果的であることを示すグラフである。異化された成熟した細胞は２４時間異なるＰＡの濃度で治療され、ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４の発現は分析された。図は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図６】図６は、ＰＡがＧＬＵＴ４のｍＲＮＡ発現の促進に効果的であることを示す図である。その際異化されて成熟した細胞がインスリン（０．１μＭ）およびＰＡ（０．０１μＭ）を用いて２４時間別個に治療され、その後ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４のｍＲＮＡ発現が分析された。図は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＧＬＵＴ４の抑制されたｍＲＮＡ発現を伴う含脂肪細胞においてＰＡが糖の摂取の促進に効果的でなかったことを示す図である。成熟した含脂肪細胞およびＧＬＵＴ４（ｓｈＧ４−３０）の抑制されたｍＲＮＡ発現を伴う含脂肪細胞は濃度の異なるＰＡおよびインスリンを用いて治療された。その後前記ＧＬＵＴ４発現（図７Ａ）が分析された。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＧＬＵＴ４の抑制されたｍＲＮＡ発現を伴う含脂肪細胞においてＰＡが糖の摂取の促進に効果的でなかったことを示す図である。成熟した含脂肪細胞およびＧＬＵＴ４（ｓｈＧ４−３０）の抑制されたｍＲＮＡ発現を伴う含脂肪細胞は異なる濃度のＰＡおよびインスリンを用いて治療された。その後前記ＧＬＵＴ４発現の糖の摂取における効果（図７Ｂ）が分析された。図は±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、分析のために遠心分離して得られた細胞膜の異なる層にあるＧＬＵＴ４タンパク質を示す図である。ここでＰＡは細胞内の細胞内小器官から細胞膜へＧＬＵＴ４の転移を促進するのに効果的であることを示す。図は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、蛍光分析により細胞全体における細胞膜の層にあるＧＬＵＴ４の分析を示す図である。ここでＰＡは細胞内の細胞内小器官から細胞膜へＧＬＵＴ４の転移を促進するのに効果的であることを示す。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、含脂肪細胞においてＰＡがトリグリセリドの合成を促進すること、かつ（生成物としてグリセロールを与える）脂質の分解を抑制することに効果があることを示す図である。成熟した含脂肪細胞はインスリン（０．１μＭ）および異なる濃度のＰＡを用いて２４時間別個に治療された。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、含脂肪細胞においてＰＡがトリグリセリドの合成を促進すること、かつ（生成物としてグリセロールを与える）脂質の分解を抑制することに効果があることを示す図である。成熟した含脂肪細胞はインスリン（０．１μＭ）および異なる濃度のＰＡを用いて２４時間別個に治療された。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一形態は、下記式（Ｉ）：
【００１２】
【化２】
【００１３】
ただし、Ｒ１は、−Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ２は、−ＯＣＯＣＨ３、＝Ｏまたは−ＯＨであり；Ｒ３は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、−Ｈまたは−ＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）Ｒｂ（この際、Ｒｂは、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５は、−Ｈまたは−ＯＨであり；およびＲ６は、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである、
で示されるラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩を哺乳動物における糖尿病を治療するのに有効な量を含む、哺乳動物における糖尿病を治療するための薬剤組成物を提供する。本発明によると、ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩または上記ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩を含むポリア抽出物を使用することによって、哺乳動物における糖尿病を治療できる。
【００１４】
本発明において、糖尿病は、哺乳動物の血液中の不十分なインスリンから誘発されるＩ型の糖尿病またはＩＩ型の糖尿病を含む。
【００１５】
本発明の有効成分（活性成分）は、予防または治療するための医療用途のため、注射または経口により安全に投与され、また、当該投与により、糖尿病を予防または治療できる。好ましくは、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の形態で経口投与されうる。ただし、経皮投与や皮下投与の形態で非経口により投与されてもよい。また、従来公知の手法により徐放剤の形態とされてもよい。
【００１６】
本発明で使用される哺乳動物（例えば、ヒト）による哺乳動物における糖尿病を予防または治療するためのラノスタン化合物（Ｉ）は、下記式（Ｉ）で示される。
【００１７】
【化３】
【００１８】
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は、−Ｈまたは−ＣＨ３である。Ｒ２は、−ＯＣＯＣＨ３、＝Ｏまたは−ＯＨである。ここで、Ｒ２が＝Ｏであるとは、Ｒ２の結合している炭素原子に結合する水素原子が脱離し、Ｒ２の結合および前記水素原子の脱離に伴う結合の双方が、Ｃ＝Ｏを形成するための二重結合に関与する。すなわち、Ｒ２が＝Ｏであるときは、ラノスタン化合物（Ｉ）は、下記構造を有する。
【００１９】
【化４】
【００２０】
また、Ｒ３は、−Ｈまたは−ＯＨである。Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、−Ｈまたは−ＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）Ｒｂ（この際、Ｒｂは、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである）である。Ｒ５は、−Ｈまたは−ＯＨである。Ｒ６は、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである。
【００２１】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１は、好ましくはＨであり、Ｒ３は、好ましくはＯＨであり、Ｒ４は、好ましくは−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、好ましくはＨである）であり、Ｒ５は、好ましくはＨであり、Ｒ６は、好ましくはＣＨ３である。すなわち、ラノスタン化合物（Ｉ）は、下記式で表わされる化合物が好ましい。
【００２２】
【化５】
【００２３】
本発明で使用される哺乳動物（例えば、ヒト）による哺乳動物における糖尿病を予防または治療するためのラノスタン化合物（Ｉ）は、下記式で表される化合物が特に好ましい。
【００２４】
【化６】
【００２５】
本発明の他の形態である薬剤または薬剤組成物は、有効成分（活性成分）として、ラノスタン化合物（Ｉ）を含む。適当なラノスタン化合物（Ｉ）源としては、ポリア抽出物がある。または、当該ラノスタン化合物（Ｉ）は、冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、樟芝（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）またはマンネンタケ（Ｇｒａｎｏｄｅｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）から得てもよい。以下では、本発明に係るラノスタン化合物（Ｉ）をポリア抽出物から得る方法について説明する。しかし、本発明は、下記形態に限定されない。
【００２６】
本発明のラノスタン化合物（Ｉ）は、粗抽出物を得る、従来の抽出工程を利用することにより、ポリア（例えば、マツホド）から得られる。すなわち、ラノスタン化合物（Ｉ）の供給源として、ポリア抽出物（Ｐｏｒｉａ ｅｘｔｒａｃｔ）が使用されることが好ましい。この際、哺乳動物（例えばヒト）による栄養の摂取を促進するための本発明において開示されるポリア抽出物は、例えばＵＳ ２００４／０２２９８５２Ａ１に開示されている方法と同様の方法で調製することができる。前記明細書のプロセスは、具体的には、マツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ （Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆ）を従来の抽出方法により抽出して粗抽出物を得ることができる。前記粗抽出物は、クロマトグラフィーによってラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）の低極性留分（ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比））およびセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）の高極性留分（ジクロロメタン：メタノールが体積比９０：１０または０：１００の溶離液使用）に分離する。ここで、ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比）の混合溶媒によって薄層クロマトグラフィーで展開したときに、ラノスタン留分はクロマトグラフィー値（Ｒｆ）が０．１以上のところで検出され、また、セコラノスタン留分はＲｆが０．１未満のところで検出される。いくつかのラノスタンはラノスタン留分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより溶出することで分離される。ここで前記溶出はジクロロメタン：メタノール＝９７：３〜９５：５の体積比（より好ましくは９７：３〜９６：４、特に好ましくは９６．５：３．５の体積比）である極性の低い溶離液を使用し、ラノスタン画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで溶出することにより、いくつかのラノスタンをラノスタン画分から分離する。
【００２７】
すなわち、ラノスタン化合物（Ｉ）またはポリア抽出物の調製方法の好ましい実施形態は、ａ）水、メタノール、エタノールまたはこれらの混合溶媒によって、マツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の代謝産物、発酵産物または菌核粒子（ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）を抽出し；ｂ）前記ａ）工程から得られた液体抽出物を濃縮し；ｃ）前記ｂ）工程から得られた濃縮物をシリカゲルカラムに導入し；ｄ）極性の低い溶離液で前記シリカゲルカラムを溶出し、溶出液を集め；ｅ）前記溶出液を濃縮して、溶出濃縮物を形成することを含む。
【００２８】
ここで、上記ｅ）工程で得られた溶出濃縮物は、薄層クロマトグラフィーのＲｆ値が少なくとも０．１（Ｒｆ値＝０．１以上）であり、この際、薄層クロマトグラフィーは、ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比）の混合溶媒で展開し、紫外線ランプとヨード蒸気で検出することが好ましい。
【００２９】
前記ａ）工程における抽出は９５％エタノールを用いることによって行われることが好ましい。また、前記ａ）工程における抽出は、Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ （Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を熱湯または沸騰水で抽出して抽出物水溶液を得、ｐＨが９〜１１になるまで、得られた抽出物水溶液に塩基を添加して塩基性水溶液を得、かかる塩基性水溶液を回収し、ｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４〜６になるまで、この塩基性水溶液に酸を添加して沈殿物を形成し、かかる沈殿物を回収して、エタノールで沈殿物を抽出し、抽出物溶液を回収することを有することが好ましい。
【００３０】
前記ｂ）工程で得られる濃縮物は、メタノールとｎ−ヘキサンを体積比１：１で含む二相の溶媒でさらに抽出し、メタノール層を二相の溶媒による抽出混合物から分離し、メタノール層を濃縮することによって濃縮物を形成し、当該濃縮物を前記ｃ）工程におけるシリカゲルカラムにフィードとして用いることが好ましい。
【００３１】
上記方法によって得られるポリア抽出物中のラノスタン化合物（Ｉ）の含有量は、糖尿病の予防・治療効果を達成できる程度であれば特に制限されないが、ポリア抽出物が、ポリア抽出物の重量に対して、１〜６０重量％、好ましくは５〜３５重量％のラノスタン化合物（Ｉ）を含むことが好ましい。
【００３２】
また、上記方法によって得られるポリア抽出物は、実質的にセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を含まないことが好ましい。ここで、「実質的にセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を含まない」とは、本発明の薬剤または薬剤組成物が、ラノスタン化合物（Ｉ）またはポリア抽出物による糖尿病の予防・治療効果を損なわない程度であることを意味し、具体的には、セコラノスタンの含有量は、ラノスタン化合物（Ｉ）の含有量の５重量％未満であることが好ましく、より好ましくは、ポリア抽出物は、セコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を全く含まないのが好ましい。
【００３３】
本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、上記ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩、または当該ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩を含むポリア抽出物を含む。好ましくは、本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、有効成分（活性成分）として、単離されたラノスタン化合物（Ｉ）またはその薬理上許容される塩を含む。ここで、ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物として使用されてもよい。
【００３４】
本発明において、ラノスタン化合物（Ｉ）の薬理上許容される塩の形態は、糖尿病の予防・治療効果を発揮でき、また、哺乳動物に悪影響を与えない形態であれば特に制限されない。具体的には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ソルビン酸、アコニット酸、サリチル酸、フタル酸、エンボニックアシッド（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、エナント酸などの有機および無機酸から誘導される塩；ナトリウム塩、カリウム塩、アルミニウム塩などの塩基から誘導される塩などの、生理学的に許容できる無毒な塩が挙げられる。
【００３５】
また、本発明に係る薬剤または薬剤組成物中の、上記ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩、または当該ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩を含むポリア抽出物の含有量は、糖尿病の予防・治療効果を発揮でき、また、哺乳動物に悪影響を与えない程度であれば特に制限されない。好ましくは、本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、薬剤または薬剤組成物の全量に対して、前記ラノスタン化合物（Ｉ）またはその薬理上許容される塩を、１〜６０重量％、好ましくは５〜３５重量％で含有する。また、本発明の薬剤または薬剤組成物において、好ましくは、セコラノスタンは含まれない。かような形態によれば、毒性を示すおそれのあるセコラノスタンの含有量が低減されているため、ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩による糖尿病の予防・治療効果がより一層向上しうる。
【００３６】
本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、上記ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩、または当該ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩を含むポリア抽出物に加えて、薬理上許容される賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。ここで、薬理上許容される賦形剤または希釈剤は、特に制限されず、従来公知の形態が適宜採用されうる。担体としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等）、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等が挙げられる。また、希釈剤としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。なお、これらの担体および希釈剤はあくまでも例示であり、これらには全く制限されない。
【００３７】
また、本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、着色剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、ゲル化剤、界面活性剤、コーティング剤等、医薬の製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製剤化されうる。また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の医薬等と混合されてもよい。
【００３８】
本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、ヒトを含む哺乳動物に対し、注射または経口により安全に投与され、また、当該投与により、糖尿病を予防または治療できる。好ましくは、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の形態で経口投与されうる。ただし、経皮投与や皮下投与の形態で非経口により投与されてもよい。また、従来公知の手法により徐放剤の形態とされてもよい。
【００３９】
本発明において、「哺乳動物」としては、特に制限されず、例えばヒト、サル、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギおよびラット等が例示される。なかでも、ヒト、サル並びに、イヌおよびネコ等の愛玩動物、モルモット、ウサギおよびラット等の実験動物がより好ましく、ヒトが特に好ましい。
【００４０】
後述する実施例は、本発明をさらに詳細に説明するために提供するものであり、本発明
の範囲を限定するために使用してはならない。
【００４１】
本明細書においてパーセンテージおよびその他の量は、特に指摘しない限り重量基準である。パーセンテージは全体が１００％となる任意の範囲から選択される。
【実施例】
【００４２】
実施例１
雲南で成長させたポリア２６ｋｇを、加熱しながら７５％水性アルコール（エタノール）溶液２６０リットルで抽出した。抽出は３回繰り返し、得られた３つの抽出溶液を合わせて、真空濃縮して、抽出物２２５．２ｇを得た。続いて、その抽出物について定量分析を行い、その１グラムあたりにラノスタン７６．２７ｍｇが含まれていた。ここで、Ｋ１（パキム酸（ｐａｃｈｙｍｉｃ ａｃｉｄ））は３３．４ｍｇ、Ｋ１−１（デヒドロパキム酸（ｄｅｈｙｄｒｏｐａｃｈｙｍｉｃ ａｃｉｄ））は９．５９ｍｇ、Ｋ２−１（ツムロス酸（ｔｕｍｕｌｏｓｉｃ ａｃｉｄ））は１９．０１ｍｇ、Ｋ２−２（デヒドロツムロス酸（ｄｅｈｙｄｒｏｔｕｍｕｌｏｓｉｃ ａｃｉｄ））は６．７５ｍｇ、Ｋ３（ポリポレン酸Ｃ（ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ））は５．０６ｍｇ、およびＫ４（３−エピデヒドロツムロス酸（３−ｅｐｉｄｅｈｙｄｒｏｔｕｍｕｌｏｓｉｃ ａｃｉｄ））は２．４６ｍｇを占めた。
【００４３】
実施例２
実施例１で得られたアルコール抽出物１２５ｇを、さらに１．３リットルのジクロロメタンで６回抽出し、得られた６つの抽出溶液を合わせて濃縮して、抽出物２２．２６ｇを得た。このジクロロメタン抽出物を、加熱した９５％アルコール溶液に溶解し、放置して冷却し、次いでろ過し、不溶物を廃棄した。ろ液中のアルコール濃度が４５％になるまで少量の水をろ液に加えて、沈殿させ、遠心分離により沈殿物１７．４ｇを得た。続いて、この沈殿物を定量分析したところ、沈殿物１グラムあたり、ラノスタン２６４．７８ｍｇが含まれることが分かった。ここで、Ｋ１−１は１５９．７ｍｇ、Ｋ１−２は５６．９６ｍｇ、Ｋ２−１は２４．４３ｍｇ、Ｋ２−２は８．８ｍｇ、Ｋ３は９．８４ｍｇ、およびＫ４は５．０５ｍｇを占めた。シリカゲルの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法により、前記沈殿物はセコラノスタンを全く含まないことを確認した。
【００４４】
実施例３
ポリア１００ｋｇを水８００ｋｇ中で３時間煮沸し、その後放置して５０℃になるまで冷却し、５Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨ値を１１になるように調整し、次いでその溶液を３時間攪拌した。遠心分離機を使用して、固形物から液体を分離し、分離した固形物にさらに水８００ｋｇを加えた。ｐＨ値をＮａＯＨで１１に調整し、攪拌し、遠心分離により固形物を除くことを含む、上記の手順を繰り返した。得られた２つの液体を合わせて、５０℃で真空濃縮して１００ｋｇの溶液とし、次いで、３Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ値を６．５になるように調整して、沈殿物を生成した。前記沈殿物を溶液から分離し、続いてＨ２Ｏ ４０Ｌで洗浄し、沈殿物を回収するために遠心分離した。沈殿物は水８Ｌを用いて噴霧乾燥し、３８０ｇの粉末を得た。その後、前記粉末を４Ｌのアルコールを用いて３回抽出し、抽出溶液を合わせて濃縮し、アルコール抽出物２３８．９ｇを得た。この２３８．９ｇのアルコール抽出物は、ＴＬＣ分析によりセコラノスタン化合物を全く含まないことが証明された。次いで、この２３８．９ｇのアルコール抽出物を、ＨＰＬＣにより分離し、抽出物１グラムにつき、Ｋ２を２１４ｍｇ、Ｋ３を２３ｍｇ、Ｋ４を２４ｍｇおよびＫ１を４．５２ｍｇ得た。言い換えれば、抽出物１グラムは約２６５ｍｇのラノスタン化合物を含む。
【００４５】
また、粉末を５０％水性アルコール（エタノール）溶液４Ｌを用いて抽出し、その５０％水性アルコール（エタノール）溶液を除き、不溶性粉末を得た。抽出は三回繰り返し、５０％水性アルコール（エタノール）溶液に不溶性の物質２４５．７ｇを得た。この不溶性物質はＴＬＣ分析によりセコラノスタン化合物を全く含まないことが確認された。その後、ＨＰＬＣによる分離および精製プロセスを行い、抽出物１グラムにつき、Ｋ２を２１４ｍｇ、Ｋ３を２３ｍｇ、Ｋ４を２４ｍｇおよびＫ１を４．５２ｍｇ得た。これは、抽出物１グラムにつきラノスタン化合物約が２６１ｍｇ得られたことと同等である。
【００４６】
実施例４
ポリア粉末を中国で成長したマツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆ）３０ｋｇから製造した。このポリア粉末は、９５％アルコール１２０Ｌを用いて２４時間かけて抽出された。この混合物をろ過し、ろ液を得た。残渣は３回抽出して、ろ過した。ろ液を合わせて濃縮し、２６５．２ｇの量の乾燥抽出物を得た。乾燥抽出物は、二相抽出剤（ｎ−ヘキサン：９５％メタノール＝１：１（体積比））を用いた分配抽出を行い、そこからメタノール相を除き、その後、濃縮して２４６．９ｇの量の乾燥した固形物を得た。乾燥固形物は、乾燥固形物の１０〜４０倍の重量のシリカゲルを充填したシリカゲルカラムを用いて分離した。７０〜２３０メッシュの直径を有する前記シリカゲルは、Ｍｅｒｃｋ社製シリカゲル６０を用いて準備した。前記カラムは次の溶離液を順に用いて溶出した：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比）の混合溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０（体積比）の混合溶媒；および純粋メタノール。溶離液は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって試験した。ここで、検出には紫外線ランプおよびヨウ素蒸気を用い、ジクロロメタン：メタン＝９６：４（体積比）の混合溶媒を展開液として使用した。ＴＬＣにおいて類似の組成を有する溶出液は混合した。
【００４７】
ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比）の混合溶媒を用いて溶離し、７８ｇの量のＰＣＭ部分を得た。前記ＰＣＭは薄層クロマトグラフィーにおいて６つのスポット跡を示した。ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０（体積比）および純粋メタノールの溶離液を用いた溶出により得られた溶出液を混合し、１６８ｇの量のＰＣＷ部分を得た。
【００４８】
前記ＰＣＭ部分は、ジクロロメタン：メタノール＝９６．５：３．５（体積比）の溶離液および同様のシリカゲルカラムを使用してさらに分離し、Ｋ１（Ｋ１−１およびＫ１−２）、Ｋ２（Ｋ２−１およびＫ２−２）、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ４ａ、Ｋ４ｂ、Ｋ５、Ｋ６ａおよびＫ６ｂの精製ラノスタン成分を得た。なお、前記分離工程および同定分析データの詳細については、ＵＳ２００４／０２２９８５２Ａ１公報に記載されるのと同様である。
【００４９】
前記Ｋ１〜Ｋ６ｂ化合物は下記の構造を有する：
【００５０】
【化７】
【００５１】
ＰＣＭ部分から分離されたラノスタン化合物Ｋ１〜Ｋ６ｂの量は下記表１に列記される。ＰＣＭ部分は、ラノスタン化合物Ｋ１〜Ｋ６ｂを約１５ｗｔ％含む。
【００５２】
【表１】
【００５３】
実施例５
実施例４で調製されたＰＣＭ部分を有するカプセルを下記表２に示される組成に基づいて調製した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
ＰＣＭ部分およびケイアルミン酸ナトリウムは、＃８０メッシュを使用してふるい分けし、ジャガイモデンプンは＃６０メッシュを使用してふるい分けし、ステアリン酸マグネシウムは＃４０メッシュを使用してふるい分けした。続いて、上記成分はミキサーで均一に混合し、次いで得られた混合物はＮｏ．１の空カプセルに充填した。各カプセルは、有効成分Ｋ１〜Ｋ６を約１．６８ｍｇ（０．４２ｗｔ％）含んでいる。
【００５６】
実施例６
トリテルペン化合物のＩ型糖尿病を予防および治療するための使用を調査する実験
下記の細胞実験のために使用された前記ポリア抽出物は実施例２で製造された沈殿または図１に示された精製された化合物であった。前記抽出物はアルコール：ＤＭＳＯ（９：１（体積比））の溶媒に溶解され、得られた溶液は培養皿に加えられ、最終体積の１０００分のＩまで各ウェルに加えられた。
【００５７】
１．含脂肪細胞の細胞培養
３Ｔ３−Ｌ１ははじめ紡鐘型細胞に見られるげっ歯類の前含脂肪細胞の一種である。細胞は誘導剤とともに加えられ２−３日間培養された際、細胞は変形し、より丸い形態になる。数日後、前記細胞は異化し、より特別な細胞になる。異化の進行していない細胞における主なグルコース輸送体はＧＬＵＴ１であり、異化した細胞においては主に活性なグルコース輸送体はＧＬＵＴ４である。さらに、細胞膜上においてＧＵＬＴ４が多ければ多いほど、血液グルコースがより早く、より大量に細胞膜へ転移し、細胞に吸収され、血液グルコースはより急速に少なくなる。前記３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞はインスリンにより活性化されるグルコース吸収の包括的なシステムを有し、脂質の生産および調整の完全な過程を観察すると同様、グルコース代謝およびインスリン信号化過程の調査に十分である。したがって、全体が異性化した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は広く利用される代表的な細胞株であり、ヒト組織からの真性の含脂肪細胞の連続的な培養をするのが困難であるため、研究者は一般的にこの特別な細胞株を関連実験および評価をするために使用する。
【００５８】
（ａ）含脂肪細胞の細胞培養
３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞は３７℃でＣＯ２５％および空気９５％中、ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）１００ｇ／ｍＬ、１％の非必須アミノ酸（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）および１０％の子牛血清（ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）を補われているＤｕｌｂｅｃｃｏ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で培養された。一度細胞は完全に成長し、異化は異化誘導剤（３−イソブチルー１−メチルキサンタン（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈａｎｅ）（ＩＢＭＸ）０．５ｍＭ、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）１Ｍ、インスリン１０ｇ／ｍＬおよびウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）１０％を含むＤＭＥＭ）を用いて細胞を２日間処理させた。前記細胞は１０ｇ／ｍＬインスリンおよび１０％ＦＢＳで補われているＤＭＥＭを用いてさらに２日間再培養され、その後インスリンを含まない１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭに２日おきに変更して４−６日間培養された。この時点で、約９０％の細胞が含脂肪細胞表現型を発現し、実験の準備が整っていた。実験を開始する前に、前記３Ｔ３−Ｌ１細胞ははじめＰＢＳ溶液で洗浄し、血清およびインスリンの両方からの阻害を除くため、血清およびインスリンを含まない０．２％ＢＳＡ／ＤＭＥＭ培地中一晩培養された。
【００５９】
（ｂ）ＧＬＵＴ４実験の阻害されるｍＲＮＡ発現のために使用される含脂肪細胞の培養
ＧＬＵＴ４を阻害するＲＮＡを運送するウィルス性担体（ＴＲＣＮ０００００４３６３０ ｓｈＲＮＡ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ， Ｒ．Ｏ．Ｃ．）は、ＧＬＵＴ４発現を着実に阻害する遺伝子を発現させるため、３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞（ｓｈＧ４−３０）を感染するために使用され、細胞株は異化された含脂肪細胞を実験で使用するた、異化された。
【００６０】
（ｃ）ＧＬＵＴ４タンパク質の転移を試験するために使用される含脂肪細胞の培養：
インフルエンザウィルスタンパク質ＨＡマークされたＧＬＵＴ４担体（ＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ， Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｅ． ＭｃＧｒａｗ， Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅより提供）がリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ））により３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞に核酸を導入するために使用され、ＨＡマーキングしているインフルエンザウィルスタンパク質により着実に発現されたＧＬＵＴ４タンパク質がＧ４１８を用いて映し出された。前記細胞は含脂肪細胞に異化されＧＬＵＴ４タンパク質の転移を評価するのに使用された。
【００６１】
２．２−デオキシグルコース摂取の評価
３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞によるグルコース摂取の促進におけるトリテルペン化合物の効果を試験する実験のために、３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞は６つのウェルを有する培養皿で培養され、異化誘導試薬を用いて異化される前に十分に成長させた。３Ｔ３−Ｌ１細胞は成熟し７−１２日後に含脂肪細胞に異化されると、その細胞はグルコース摂取試験に使用された。前記含脂肪細胞ははじめ血清を含まない培地（０．２％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭ）中に一晩置かれ、次いで２−６時間トリテルペン化合物を異なる濃度で含む血清を含まない細胞培地中で培養し、ＫＲＰ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，１３７ｍＭのＮａＣｌ，４．７ｍＭのＫＣｌ，１．２ｍＭのＭｇＳＯ４，１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，２．５ｍＭのＣａＣｌ２，および２ｍＭのピルビン酸塩，ｐＨ７．４および０．２％のＢＳＡ）中、３７℃で３時間培養する前にＰＢＳ溶液で１回洗浄した。最後に０．２ μＣｉ／ｍＬの２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］−グルコース（２−ＤＧ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｓ，英国）と０．１ｍＭの２−ＤＧ由来の０．２ｍｌの非放射性グルコース緩衝溶液がグルコース摂取の実験を開始するためにＫＲＰ緩衝溶液の代替として使用された。５分間実験を行った後、グルコースの摂取を停止するために細胞は除去されＰＢＳ溶液で洗浄された。続いて、前記細胞は０．２ｍｌの０．２％ＳＤＳ中に溶解され、細胞を溶解した１０μＬの溶液はろ過基盤の付属したＵｎｉＦｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｍ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）に移され、３７℃で真空炉中乾燥され、それぞれのウェルに３０ｍＬの計数溶液を加え、それからマイクロディスク液体シンチレーション分析装置（ＴｏｐＣｏｕｎｔ，Ｐａｃｋａｒｄ ＮＸＴ，Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，米国）により分析された。細胞中に蓄積されたグルコースの濃度は計算され、タンパク質濃度で除算することで、毎分の細胞タンパク質のマイクログラム毎のナノモル量（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）として示されるグルコース摂取速度を得た。前記タンパク質濃度は標準ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質分析装置（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）を用いて決定された。非特異性のグルコースの摂取は０．２μＣｉのＬ−［１４Ｃ］−グルコースを加えて決定され、特異的なグルコースの摂取量を得るために分析して得られた値から減算するために使用された。したがって、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞によるグルコース摂取における異なる濃度のトリテルペン化合物の影響を決定することができる。
【００６２】
３．ＧＬＵＴ１および４タンパク質の評価
３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中ＧＬＵＴタンパク質発現の促進におけるトリテルペン化合物の効果を調査する実験に、前述した異化され成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は血清を含まない培地中一晩培養され、それから異なる濃度のトリテルペン化合物を含む血清を含まない細胞培地中で２４時間さらに培養された。その後、ＰＢＳ溶液でその細胞を洗浄し、０．２ｍＬの溶解緩衝液（１％のＮＰ−４０，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．１％のＳＤＳ，５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．６，１０ｍＭのＥＤＴＡ，０．５％のデオキシコール酸塩（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ），１ｍＭのＰＭＳＦ，１ｍＭのＮａ３ＶＯ４，１０ｍＭのＮａＦ，１０ｍＭのβ−グリセロリン酸エステル（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），１０ｇ／ｍＬプロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）およびフォスフォターゼ阻害剤カクテル（ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ））中、３０分間４℃で前記細胞を溶解した。それぞれのサンプルからドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により等量のタンパク質を分けとり、二弗化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，米国）上にブロットされた（ｔｒａｎｓｂｌｏｔｔｅｄ）。続いて、ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）をＧＬＵＴ１（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＧＬＵＴ４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および（β−Ａｃｔｉｎ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対してモノクローナル抗体を用いて行い、トリテルペン化合物の異なる濃度の下では３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中ＧＬＵＴタンパク質発現に影響があるか否かを決定した。それぞれのタンパク質のサンプルはＸ線に露光される前に化学発光セット（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）を用いて処理され、コンピュータソフトを用いて定量的に分析された。
【００６３】
４．ＧＬＵＴ１および４の遺伝子発現の評価
リアルタイムのＱ−ＰＣＲは異なるトリテルペン化合物濃度において３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中のＧＬＵＴタンパク質のｍＲＮＡ発現を評価するために使用された。はじめ十分に異化された３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は異なる濃度のトリテルペン化合物と混合され、細胞培地を除去しトリゾール緩衝液（Ｔｒｉｚｏｌ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，米国））を使用してＲＮＡ全体を細胞から得るために、使用する前に２４時間放置された。後に１μｇのＲＮＡサンプルがそこから取上げられ、高解像ｃＤＮＡ転写キット（Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，独国））が使用されサンプル中のｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させた。プライマーは特にＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４およびβアクチン用にデザインされ、相対的な遺伝子発現値がＳｔｅｐＯｎｅ ｖ２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたΔΔＣＴ方法により計算される前に、検出遺伝子（Ｇｌｕｔ１＆Ｇｌｕｔ４）および参照遺伝子（β−ａｃｔｉｎ）の検出のためそれらの遺伝子を増幅するためにＹＢＲグリーンＱ−ＰＣＲ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）が使用された。
【００６４】
５．ＧＬＵＴ４タンパク質の転移の評価
（１）ＧＬＵＴ４タンパク質の転移の分析
含脂肪細胞または筋細胞によるグルコース摂取を促進させるインスリンの機構において、細胞内小器官から原形質膜（ＰＭ）へのＧＬＵＴ４の転移は実際に極めて重要であり、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中におけるＧＬＵＴ４の原形質膜への転移の促進においてトリテルペン化合物の効果がここで調査された。異化され成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は血清を含まない細胞培地中で一晩培養され、それからトリテルペン化合物を異なる濃度で含む血清を含まない細胞培地中さらに２時間培養された。次いで、細胞原形質膜部位を低密度ミクロソーム（ＬＤＭ）から分離するために、これを高速遠心分離した［Ｌｉｕ，Ｌ．Ｚ．ｅｔ．ａｌ．；Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ １７，（５），２３２２−２３３０，２００６］。ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中、細胞内ＬＤＭからＰＭにＧＬＵＴ４が転移する際にトリテルペン化合物の異なる濃度が与える影響があるか否かを観察するためにＧＬＵＴ４のためのモノクローナル抗体を用いて行われた。
【００６５】
（２）ＧＬＵＴ４タンパク質の転移の分析
安定にＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰを発現する３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞は９６−ウェル培地皿で培養させられ、それから十分に培養された後に誘導試薬により異化された（Ｇｏｖｅｒｓ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２４（１４），６４５６−６４６６，２００４）。十分に異化された３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は異なる濃度のトリテルペン化合物を添加し、２時間放置され、細胞培地を除き氷冷したＰＢＳ溶液でその細胞を洗浄した。続いて、細胞は１５分間室温で４％のパラホルムアルデヒド中に固定され、細胞を氷冷したＰＢＳ溶液で２，３回洗浄した後に初期の赤血球凝集索（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉ−ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＨＡ）抗体（１２ＣＡ５）を用いて２時間培養され、この後に細胞は再度氷冷したＰＢＳ溶液で２，３回洗浄され、ローダミン共役第２抗体（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と共に１時間培養された（Ｌｅｉｎｃｏ，Ｂａｌｌｗｉｎ，ＭＯ）。細胞は、蛍光マイクロタイタープレートリーダー（ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ；ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，独国）を使用してローダミンおよびＧＦＰから励起された蛍光波長（Ｅｍ．４８０／Ｅｘ．４２５ｎｍ および Ｅｍ．５７６ｎｍ／Ｅｘ．５５０ｎｍ）を測定する前に再度氷冷したＰＢＳ溶液で洗浄された。ＧＦＰ蛍光に対するローダミン蛍光の割合は計算され、原形質膜へ転移されたＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰの相対量を評価するために使用された。ＨＡタグ化されたＧＬＵＴ４は原形質膜に転移した後にローダミンでラベルされうるので、その割合は原形質膜へのＧＬＵＴ４転移の評価に有益であった。
【００６６】
６．トリグリセリドの蓄積およびグリセロールの遊離の効果
トリグリセリドの堆積と３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞内のグリセロールの遊離においてトリテルペン化合物の効果を調査する実験のために、異化して成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞が血清を含まない細胞培地中一晩培養され、トリテルペン化合物を異なる濃度で含む血清を含まない細胞培地中でさらに２４時間培養された。その培地は集められグリセロールアッセイキット（Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎｔｒｉｍ，英国）を用いて異なる濃度のトリテルペン化合物が３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中脂質分解からグリセロールの遊離において効果があるかどうかを決定するためグリセロールの遊離について調査された。含脂肪細胞においてトリグリセリドのレベルはオイルレッドＯ染色により決定された（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｚａｃａｒｉａｓ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．；Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９７，（６），４９３−４９７，１９９２）。細胞内で脂質の堆積により形成された油滴が染色され、６０％イソプロパノールで２回洗浄され、そして１００％イソプロパノールで抽出され４９０ｎｍの吸収で定量された。その測定値は、含脂肪細胞において異なる濃度のテルペン化合物がトリグリセリドの蓄積に与える効果を評価するために、トリテルペン化合物が与えられなかった含脂肪細胞からの測定値と比較された。
【００６７】
実験結果はインスリンのような結果を示し、すなわちトリテルペン化合物は次の４つの性質を有し、Ｉ型糖尿病の治療に効果的である。
【００６８】
（１）含脂肪細胞モデルにおいて、ポリアの成分または抽出物は細胞外のグルコースの細胞内への吸収を促進するのに効果的であった：
成熟した含脂肪細胞においてポリア抽出物の効果の評価（実施例２）から、図２Ａに示されるように；ポリア抽出物はグルコース摂取の増加に明らかに効果的であり、グルコース摂取の増加の効果は細胞に与えられる投与量の増加に正の相関がある。一方、インスリン１００ｎＭの添加もまたグルコース摂取量の増加に効果的であった。実施例２の純粋な化合物はさらに実験に使用された。図２Ｂは０．０１μＭの純粋な化合物を含脂肪細胞に投与後２時間後に、ＰＡ、ＴＡおよびＰＰＡの３つの化合物はグルコース摂取量を１６５．８９％、１４２．５％、および１４７．９％に有意に増加した。ＰＡにより誘導される増加が最も顕著であり、以下における評価はＰＡを基準にして行った。
【００６９】
図３Ａによれば、グルコース摂取量の増加におけるＰＡの効果は時間の経過に連れて増加し、投与後２時間において最も著しかった（１６５．８９％に増加した）。加えて、ＰＡ濃度の増加はグルコース摂取量を増加させた。図３Ｂにおいて見られるように、ＰＡが１μＭで与えられた際に、グルコース摂取量は２０９．８４％に増加した。
【００７０】
図４によると、ＰＡは異化された含脂肪細胞におけるグルコース摂取の促進に効果的であるのみで、前含脂肪細胞においては効果的ではなかった。プロレチン（ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ（ＰＴ））が前含脂肪細胞および含脂肪細胞の両方に投与されたとき、両方の細胞の種類においてグルコース摂取量は有意に阻害された。過去の調査文献によると、前含脂肪細胞はＧＬＵＴ１を有するのみであり、含脂肪細胞はＧＬＵＴ４を有する。したがって、ＰＡはＧＬＵＴ４の増加によりグルコース摂取量を増加すると考えられる。
【００７１】
（２）ＰＡの効果、トリテルペン化合物；成熟した含脂肪細胞におけるＧＬＵＴ４のタンパク質およびｍＲＮＡ発現の促進における
図５はＰＡの異なる投与量を２４時間成熟した含脂肪細胞に投与し、続いてＧＬＵＴ１および４のタンパク質発現におけるＰＡの効果を評価するためにＧＬＵＴ１および４のウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）行った。その結果は、ＰＡはＧＬＵＴ４のタンパク質発現の促進に効果的である（図５Ａ）がＧＬＵＴ１のタンパク質発現を促進には効果的でない（図５Ｂ）ことを示した。
【００７２】
Ｑ−ＰＣＲおよび成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞におけるＧＬＵＴタンパク質のｍＲＮＡ発現におけるＰＡの異なる濃度の効果を調査するため、特別なプローブを使用した結果は図６に示され、１μＭのＰＡがＧＬＵＴ４の遺伝子発現を２２８％に高めることを明らかにし、これは推奨されているＰＡはＧＬＵＴ４の遺伝子およびタンパク質発現を調整しうることを示す。さらに、ｍＲＮＡ阻害方法（ｍＲＮＡ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）はＧＬＵＴ４の発現が一貫して低い３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞の生産に使用され（図７Ａ）、含脂肪細胞がさらにグルコース摂取を評価するために使用され、それは図７Ｂにおいて示され、ＰＡの異なる摂取量が含脂肪細胞においてグルコース摂取をあまり促進させなかったことを示し、それにより、ＰＡはＧＬＵＴ４発現に直接的に影響することによりグルコース摂取を促進することを明らかにした。
【００７３】
（３）成熟した含脂肪細胞内の細胞内小器官から原形質膜へのＧＬＵＴ４の転移の促進におけるＰＡの効果
グルコース摂取を促進するインスリンのメカニズムの一つはグルコース摂取を実行するために細胞内小器官から原形質膜への大量のＧＬＵＴ４の転移を促進することである。したがって、インスリンにより活性化されるグルコース摂取のインスリン活性の包括的なシステムを有する成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞がＧＬＵＴ４タンパク質の転移を評価するために用いられた。図８Ａは高速遠心分離器を使用して分離された原形質膜におけるウェスタンブロット分析の結果を図示しており、０．０１μＭのＰＡが原形質膜内のＧＬＵＴ４の量を１４１％に有意に増加し、ＰＡ投与量が１μＭに高められたときＧＬＵＴ４の量は３２８％にまで増加することを明らかにした。ＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰタンパク質を安定的に発現する３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞の使用および蛍光測定法はＧＬＵＴ４の原形質膜への転移を増加することによりＰＡがグルコース摂取を促進することをさらに確認した。図８Ｂでは、ＰＡの投与が１．０μＭに増加されたとき、ＧＬＵＴ４の原形質膜への転移が２．７１倍に高められたことが分かる。前述の結果はＰＡがＧＬＵＴ４タンパク質の原形質膜への転移に効果的であることを裏付けた。
【００７４】
（４）含脂肪細胞においてトリグリセリドの蓄積の促進およびグリセロールの培地への放出の減少におけるＰＡの効果
含脂肪細胞におけるグルコース摂取へのＰＡの効果の観察に加えて、含脂肪細胞中でのトリグリセリドの合成（蓄積）および脂質分解（グリセロールの遊離）もまた評価された。図９は異なる投与量でＰＡを投与した後２４時間後の結果を示し、トリグリセリドの蓄積はオイルレッドＯ染色により測定された。ＰＡの投与により、トリグリセリドの蓄積は元のレベルの１３７％に増加し、グリセロールの遊離はおよそ元のレベルの７０％に低下した。この結果は、ＰＡが脂質の合成の促進および脂質の分解の防止に効果的であることを示した。
【００７５】
本発明は好ましい例により記載されており、記載される例の変更や修正は添付される請求項によってのみ限定される本発明の範囲および思想から離れることなく実施されうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病の治療におけるポリア抽出物の使用に関する。特に、血液中の不十分なインスリンから誘発される糖尿病の治療におけるポリア抽出化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は富裕国の成人人口（特に高齢人口）に共通に見られる慢性疾患である。糖尿病である患者は主に二つの型に分類されうる。１つ目はＩ型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病と呼ばれ、人体における自己免疫応答により、膵臓のβ−細胞が破壊され、患者の体内にインスリンを生産できなくなる。したがって、これらの患者は、その血液循環にインスリンを有さず、結果的にインスリン注射が必要となる。２つ目の糖尿病はＩＩ型糖尿病または非インスリン依存性糖尿病と呼ばれ、ここでは遺伝因子が重要な役割を担い、例えば肥満などの生活習慣の影響が当該病気の誘発において重大であると考えられているが、その原因は未だ不明である。
【０００３】
紀元約５００年に、「備急千金要方（Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｆｏｒｍｕｌａｓ Ｗｏｒｔｈ ａ Ｔｈｏｕｓａｎｄ ｉｎ Ｇｏｌｄ）」という中国の医学文献が唐時代にまとめられ、糖尿病の治療に使用される多くの医薬の混合物が記録されており、その混合物のいくつかがポリアを含むことが知られている。２００２年に、日本の研究者Ｍ．ＳａｔｏらがＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ．にポリアの皮から得られたデヒドロトラメテノリック酸（ｄｅｈｙｄｒｏｔｒａｍｅｔｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）がＩＩ型糖尿病の治療に応用されうることを示す論文を発表した（非特許文献１）。根本的なメカニズムはインスリンに対する患者の体の感度を増強することであり（すなわち患者のインスリンに対する耐性を低下させることに相当し）、糖尿病の治療目的を達成する。しかしながら、インヴィトロで含脂肪細胞を使用した過去の実験からデヒドロトラメテノリック酸（ｄｅｈｙｄｒｏｔｒａｍｅｔｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）の効果的な濃度は１０−５Ｍであることが明らかであり、マウスを用いたインヴィボの実験はデヒドロトラメテノリック酸の効果的な投与量は１１０ｍｇ／ｋｇであることを示す。結果的に、研究者は人体に使用する有効投与量は少なくとも７００ｍｇより多いという結論に到達した。しかし７００ｍｇの有効投与量は現在採用されている臨床投与量の１０倍以上に相当し、臨床薬開発における現実的な課題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００２，２５（１），８１−８６．
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、必要としている哺乳動物に下記化学式（Ｉ）で示されるラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩を有効な量で投与することを含む、糖尿病の治療方法を開示することであり、前記糖尿病は哺乳動物の血液中の不十分なインスリンから誘発されるものである。
【０００６】
【化１】
【０００７】
式中、Ｒ１は、−Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ２は、−ＯＣＯＣＨ３、＝Ｏまたは−ＯＨであり；Ｒ３は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、−Ｈまたは−ＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）Ｒｂ（この際、Ｒｂは、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５は、−Ｈまたは−ＯＨであり；およびＲ６は、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである。
【０００８】
本発明は、ポリアから抽出された有効な成分が、（１）グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）の遺伝子発現（ｍＲＮＡ発現）を増加し、（２）ＧＬＵＴ４の生産を増加し、（３）脂質細胞または筋細胞の細胞膜上にＧＬＵＴ４タンパク質を細胞内転移し、（４）ＧＬＵＴ４に細胞外のグルコースを細胞に輸送させ、および（５）インスリンが行うように細胞内にトリグリセリドを生産および蓄積することにより、機能的にインスリンの代わりとなることができることを示す。したがって、ポリアの有効成分は機能的にインスリンの代わりとなり、グルコースを血流から細胞内に輸送することができ、血液のグルコースレベルを低下する。結果として、前記成分は不十分な血液インスリンを原因とするＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病の治療に適用される。さらに重要なことに、インヴィトロでの脂質の実験は、前記成分が０．０１μＭの濃度で、日本人研究者Ｓａｔｏの記録した１０−５Ｍの有効濃度より１０００倍小さい値であるグルコース吸収を可能とすることを示した。
【０００９】
前記の本発明の目的および有利な点は添付の図面を参照すればより明確に理解できるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ポリアから抽出され精製されたラノスタン型トリテルペン化合物の構造を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞により糖摂取の促進においてポリア抽出物が有する効果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、インスリン（０．１μＭ）を３０分間作用させ、精製されたトリテルペン化合物（０．０１μＭ）を２時間作用させた時に添加された糖の種類に基づき糖の摂取に与える効果を示すグラフである。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示される。コントロール群（未治療）との比較において、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、パキム酸（ＰＡ）が０．０１μＭで２時間投与された時に最も高い糖の摂取速度をもたらすのに効果的であったことを示す図である。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示される。コントロール群（未治療）との比較において、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＡ投与量の上昇を伴う糖の摂取の増加を示すグラフである。ＰＡは試験のために糖を添加する前２時間作用させ、図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示される。コントロール群（未治療）との比較において、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図４】図４は、ＰＡが異化されおよび成熟した含脂肪細胞において糖の摂取を促進させることのみを示す図である。未成熟および成熟した含脂肪細胞は最初にＰＡと混合されおよび２時間反応し、その後ＰＴを加えられたならば；ＰＡにより糖の摂取が促進されたように、前記細胞の二つの型において糖の摂取は有意に抑制される。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示される。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＡがＧＬＵＴ１の発現の促進には効果がないことを示す図である。図は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＡがＧＬＵＴ４の発現の促進には効果的であることを示すグラフである。異化された成熟した細胞は２４時間異なるＰＡの濃度で治療され、ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４の発現は分析された。図は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図６】図６は、ＰＡがＧＬＵＴ４のｍＲＮＡ発現の促進に効果的であることを示す図である。その際異化されて成熟した細胞がインスリン（０．１μＭ）およびＰＡ（０．０１μＭ）を用いて２４時間別個に治療され、その後ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４のｍＲＮＡ発現が分析された。図は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＧＬＵＴ４の抑制されたｍＲＮＡ発現を伴う含脂肪細胞においてＰＡが糖の摂取の促進に効果的でなかったことを示す図である。成熟した含脂肪細胞およびＧＬＵＴ４（ｓｈＧ４−３０）の抑制されたｍＲＮＡ発現を伴う含脂肪細胞は濃度の異なるＰＡおよびインスリンを用いて治療された。その後前記ＧＬＵＴ４発現（図７Ａ）が分析された。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＧＬＵＴ４の抑制されたｍＲＮＡ発現を伴う含脂肪細胞においてＰＡが糖の摂取の促進に効果的でなかったことを示す図である。成熟した含脂肪細胞およびＧＬＵＴ４（ｓｈＧ４−３０）の抑制されたｍＲＮＡ発現を伴う含脂肪細胞は異なる濃度のＰＡおよびインスリンを用いて治療された。その後前記ＧＬＵＴ４発現の糖の摂取における効果（図７Ｂ）が分析された。図は±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、分析のために遠心分離して得られた細胞膜の異なる層にあるＧＬＵＴ４タンパク質を示す図である。ここでＰＡは細胞内の細胞内小器官から細胞膜へＧＬＵＴ４の転移を促進するのに効果的であることを示す。図は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、蛍光分析により細胞全体における細胞膜の層にあるＧＬＵＴ４の分析を示す図である。ここでＰＡは細胞内の細胞内小器官から細胞膜へＧＬＵＴ４の転移を促進するのに効果的であることを示す。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、含脂肪細胞においてＰＡがトリグリセリドの合成を促進すること、かつ（生成物としてグリセロールを与える）脂質の分解を抑制することに効果があることを示す図である。成熟した含脂肪細胞はインスリン（０．１μＭ）および異なる濃度のＰＡを用いて２４時間別個に治療された。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、含脂肪細胞においてＰＡがトリグリセリドの合成を促進すること、かつ（生成物としてグリセロールを与える）脂質の分解を抑制することに効果があることを示す図である。成熟した含脂肪細胞はインスリン（０．１μＭ）および異なる濃度のＰＡを用いて２４時間別個に治療された。図は平均±ＳＤ（ｎ＝６）を用いて示す。コントロール群（未治療）との比較において、記号＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一形態は、下記式（Ｉ）：
【００１２】
【化２】
【００１３】
ただし、Ｒ１は、−Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ２は、−ＯＣＯＣＨ３、＝Ｏまたは−ＯＨであり；Ｒ３は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、−Ｈまたは−ＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）Ｒｂ（この際、Ｒｂは、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５は、−Ｈまたは−ＯＨであり；およびＲ６は、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである、
で示されるラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩を哺乳動物における糖尿病を治療するのに有効な量を含む、哺乳動物における糖尿病を治療するための薬剤組成物を提供する。本発明によると、ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩または上記ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩を含むポリア抽出物を使用することによって、哺乳動物における糖尿病を治療できる。
【００１４】
本発明において、糖尿病は、哺乳動物の血液中の不十分なインスリンから誘発されるＩ型の糖尿病またはＩＩ型の糖尿病を含む。
【００１５】
本発明の有効成分（活性成分）は、予防または治療するための医療用途のため、注射または経口により安全に投与され、また、当該投与により、糖尿病を予防または治療できる。好ましくは、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の形態で経口投与されうる。ただし、経皮投与や皮下投与の形態で非経口により投与されてもよい。また、従来公知の手法により徐放剤の形態とされてもよい。
【００１６】
本発明で使用される哺乳動物（例えば、ヒト）による哺乳動物における糖尿病を予防または治療するためのラノスタン化合物（Ｉ）は、下記式（Ｉ）で示される。
【００１７】
【化３】
【００１８】
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は、−Ｈまたは−ＣＨ３である。Ｒ２は、−ＯＣＯＣＨ３、＝Ｏまたは−ＯＨである。ここで、Ｒ２が＝Ｏであるとは、Ｒ２の結合している炭素原子に結合する水素原子が脱離し、Ｒ２の結合および前記水素原子の脱離に伴う結合の双方が、Ｃ＝Ｏを形成するための二重結合に関与する。すなわち、Ｒ２が＝Ｏであるときは、ラノスタン化合物（Ｉ）は、下記構造を有する。
【００１９】
【化４】
【００２０】
また、Ｒ３は、−Ｈまたは−ＯＨである。Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、−Ｈまたは−ＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）Ｒｂ（この際、Ｒｂは、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである）である。Ｒ５は、−Ｈまたは−ＯＨである。Ｒ６は、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである。
【００２１】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１は、好ましくはＨであり、Ｒ３は、好ましくはＯＨであり、Ｒ４は、好ましくは−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、好ましくはＨである）であり、Ｒ５は、好ましくはＨであり、Ｒ６は、好ましくはＣＨ３である。すなわち、ラノスタン化合物（Ｉ）は、下記式で表わされる化合物が好ましい。
【００２２】
【化５】
【００２３】
本発明で使用される哺乳動物（例えば、ヒト）による哺乳動物における糖尿病を予防または治療するためのラノスタン化合物（Ｉ）は、下記式で表される化合物が特に好ましい。
【００２４】
【化６】
【００２５】
本発明の他の形態である薬剤または薬剤組成物は、有効成分（活性成分）として、ラノスタン化合物（Ｉ）を含む。適当なラノスタン化合物（Ｉ）源としては、ポリア抽出物がある。または、当該ラノスタン化合物（Ｉ）は、冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、樟芝（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）またはマンネンタケ（Ｇｒａｎｏｄｅｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）から得てもよい。以下では、本発明に係るラノスタン化合物（Ｉ）をポリア抽出物から得る方法について説明する。しかし、本発明は、下記形態に限定されない。
【００２６】
本発明のラノスタン化合物（Ｉ）は、粗抽出物を得る、従来の抽出工程を利用することにより、ポリア（例えば、マツホド）から得られる。すなわち、ラノスタン化合物（Ｉ）の供給源として、ポリア抽出物（Ｐｏｒｉａ ｅｘｔｒａｃｔ）が使用されることが好ましい。この際、哺乳動物（例えばヒト）による栄養の摂取を促進するための本発明において開示されるポリア抽出物は、例えばＵＳ ２００４／０２２９８５２Ａ１に開示されている方法と同様の方法で調製することができる。前記明細書のプロセスは、具体的には、マツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ （Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆ）を従来の抽出方法により抽出して粗抽出物を得ることができる。前記粗抽出物は、クロマトグラフィーによってラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）の低極性留分（ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比））およびセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）の高極性留分（ジクロロメタン：メタノールが体積比９０：１０または０：１００の溶離液使用）に分離する。ここで、ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比）の混合溶媒によって薄層クロマトグラフィーで展開したときに、ラノスタン留分はクロマトグラフィー値（Ｒｆ）が０．１以上のところで検出され、また、セコラノスタン留分はＲｆが０．１未満のところで検出される。いくつかのラノスタンはラノスタン留分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより溶出することで分離される。ここで前記溶出はジクロロメタン：メタノール＝９７：３〜９５：５の体積比（より好ましくは９７：３〜９６：４、特に好ましくは９６．５：３．５の体積比）である極性の低い溶離液を使用し、ラノスタン画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで溶出することにより、いくつかのラノスタンをラノスタン画分から分離する。
【００２７】
すなわち、ラノスタン化合物（Ｉ）またはポリア抽出物の調製方法の好ましい実施形態は、ａ）水、メタノール、エタノールまたはこれらの混合溶媒によって、マツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の代謝産物、発酵産物または菌核粒子（ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）を抽出し；ｂ）前記ａ）工程から得られた液体抽出物を濃縮し；ｃ）前記ｂ）工程から得られた濃縮物をシリカゲルカラムに導入し；ｄ）極性の低い溶離液で前記シリカゲルカラムを溶出し、溶出液を集め；ｅ）前記溶出液を濃縮して、溶出濃縮物を形成することを含む。
【００２８】
ここで、上記ｅ）工程で得られた溶出濃縮物は、薄層クロマトグラフィーのＲｆ値が少なくとも０．１（Ｒｆ値＝０．１以上）であり、この際、薄層クロマトグラフィーは、ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比）の混合溶媒で展開し、紫外線ランプとヨード蒸気で検出することが好ましい。
【００２９】
前記ａ）工程における抽出は９５％エタノールを用いることによって行われることが好ましい。また、前記ａ）工程における抽出は、Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ （Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を熱湯または沸騰水で抽出して抽出物水溶液を得、ｐＨが９〜１１になるまで、得られた抽出物水溶液に塩基を添加して塩基性水溶液を得、かかる塩基性水溶液を回収し、ｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４〜６になるまで、この塩基性水溶液に酸を添加して沈殿物を形成し、かかる沈殿物を回収して、エタノールで沈殿物を抽出し、抽出物溶液を回収することを有することが好ましい。
【００３０】
前記ｂ）工程で得られる濃縮物は、メタノールとｎ−ヘキサンを体積比１：１で含む二相の溶媒でさらに抽出し、メタノール層を二相の溶媒による抽出混合物から分離し、メタノール層を濃縮することによって濃縮物を形成し、当該濃縮物を前記ｃ）工程におけるシリカゲルカラムにフィードとして用いることが好ましい。
【００３１】
上記方法によって得られるポリア抽出物中のラノスタン化合物（Ｉ）の含有量は、糖尿病の予防・治療効果を達成できる程度であれば特に制限されないが、ポリア抽出物が、ポリア抽出物の重量に対して、１〜６０重量％、好ましくは５〜３５重量％のラノスタン化合物（Ｉ）を含むことが好ましい。
【００３２】
また、上記方法によって得られるポリア抽出物は、実質的にセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を含まないことが好ましい。ここで、「実質的にセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を含まない」とは、本発明の薬剤または薬剤組成物が、ラノスタン化合物（Ｉ）またはポリア抽出物による糖尿病の予防・治療効果を損なわない程度であることを意味し、具体的には、セコラノスタンの含有量は、ラノスタン化合物（Ｉ）の含有量の５重量％未満であることが好ましく、より好ましくは、ポリア抽出物は、セコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を全く含まないのが好ましい。
【００３３】
本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、上記ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩、または当該ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩を含むポリア抽出物を含む。好ましくは、本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、有効成分（活性成分）として、単離されたラノスタン化合物（Ｉ）またはその薬理上許容される塩を含む。ここで、ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物として使用されてもよい。
【００３４】
本発明において、ラノスタン化合物（Ｉ）の薬理上許容される塩の形態は、糖尿病の予防・治療効果を発揮でき、また、哺乳動物に悪影響を与えない形態であれば特に制限されない。具体的には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ソルビン酸、アコニット酸、サリチル酸、フタル酸、エンボニックアシッド（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、エナント酸などの有機および無機酸から誘導される塩；ナトリウム塩、カリウム塩、アルミニウム塩などの塩基から誘導される塩などの、生理学的に許容できる無毒な塩が挙げられる。
【００３５】
また、本発明に係る薬剤または薬剤組成物中の、上記ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩、または当該ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩を含むポリア抽出物の含有量は、糖尿病の予防・治療効果を発揮でき、また、哺乳動物に悪影響を与えない程度であれば特に制限されない。好ましくは、本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、薬剤または薬剤組成物の全量に対して、前記ラノスタン化合物（Ｉ）またはその薬理上許容される塩を、１〜６０重量％、好ましくは５〜３５重量％で含有する。また、本発明の薬剤または薬剤組成物において、好ましくは、セコラノスタンは含まれない。かような形態によれば、毒性を示すおそれのあるセコラノスタンの含有量が低減されているため、ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩による糖尿病の予防・治療効果がより一層向上しうる。
【００３６】
本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、上記ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩、または当該ラノスタン化合物（Ｉ）もしくはその薬理上許容される塩を含むポリア抽出物に加えて、薬理上許容される賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。ここで、薬理上許容される賦形剤または希釈剤は、特に制限されず、従来公知の形態が適宜採用されうる。担体としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等）、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等が挙げられる。また、希釈剤としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。なお、これらの担体および希釈剤はあくまでも例示であり、これらには全く制限されない。
【００３７】
また、本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、着色剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、ゲル化剤、界面活性剤、コーティング剤等、医薬の製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製剤化されうる。また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の医薬等と混合されてもよい。
【００３８】
本発明に係る薬剤または薬剤組成物は、ヒトを含む哺乳動物に対し、注射または経口により安全に投与され、また、当該投与により、糖尿病を予防または治療できる。好ましくは、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の形態で経口投与されうる。ただし、経皮投与や皮下投与の形態で非経口により投与されてもよい。また、従来公知の手法により徐放剤の形態とされてもよい。
【００３９】
本発明において、「哺乳動物」としては、特に制限されず、例えばヒト、サル、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギおよびラット等が例示される。なかでも、ヒト、サル並びに、イヌおよびネコ等の愛玩動物、モルモット、ウサギおよびラット等の実験動物がより好ましく、ヒトが特に好ましい。
【００４０】
後述する実施例は、本発明をさらに詳細に説明するために提供するものであり、本発明
の範囲を限定するために使用してはならない。
【００４１】
本明細書においてパーセンテージおよびその他の量は、特に指摘しない限り重量基準である。パーセンテージは全体が１００％となる任意の範囲から選択される。
【実施例】
【００４２】
実施例１
雲南で成長させたポリア２６ｋｇを、加熱しながら７５％水性アルコール（エタノール）溶液２６０リットルで抽出した。抽出は３回繰り返し、得られた３つの抽出溶液を合わせて、真空濃縮して、抽出物２２５．２ｇを得た。続いて、その抽出物について定量分析を行い、その１グラムあたりにラノスタン７６．２７ｍｇが含まれていた。ここで、Ｋ１（パキム酸（ｐａｃｈｙｍｉｃ ａｃｉｄ））は３３．４ｍｇ、Ｋ１−１（デヒドロパキム酸（ｄｅｈｙｄｒｏｐａｃｈｙｍｉｃ ａｃｉｄ））は９．５９ｍｇ、Ｋ２−１（ツムロス酸（ｔｕｍｕｌｏｓｉｃ ａｃｉｄ））は１９．０１ｍｇ、Ｋ２−２（デヒドロツムロス酸（ｄｅｈｙｄｒｏｔｕｍｕｌｏｓｉｃ ａｃｉｄ））は６．７５ｍｇ、Ｋ３（ポリポレン酸Ｃ（ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ））は５．０６ｍｇ、およびＫ４（３−エピデヒドロツムロス酸（３−ｅｐｉｄｅｈｙｄｒｏｔｕｍｕｌｏｓｉｃ ａｃｉｄ））は２．４６ｍｇを占めた。
【００４３】
実施例２
実施例１で得られたアルコール抽出物１２５ｇを、さらに１．３リットルのジクロロメタンで６回抽出し、得られた６つの抽出溶液を合わせて濃縮して、抽出物２２．２６ｇを得た。このジクロロメタン抽出物を、加熱した９５％アルコール溶液に溶解し、放置して冷却し、次いでろ過し、不溶物を廃棄した。ろ液中のアルコール濃度が４５％になるまで少量の水をろ液に加えて、沈殿させ、遠心分離により沈殿物１７．４ｇを得た。続いて、この沈殿物を定量分析したところ、沈殿物１グラムあたり、ラノスタン２６４．７８ｍｇが含まれることが分かった。ここで、Ｋ１−１は１５９．７ｍｇ、Ｋ１−２は５６．９６ｍｇ、Ｋ２−１は２４．４３ｍｇ、Ｋ２−２は８．８ｍｇ、Ｋ３は９．８４ｍｇ、およびＫ４は５．０５ｍｇを占めた。シリカゲルの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法により、前記沈殿物はセコラノスタンを全く含まないことを確認した。
【００４４】
実施例３
ポリア１００ｋｇを水８００ｋｇ中で３時間煮沸し、その後放置して５０℃になるまで冷却し、５Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨ値を１１になるように調整し、次いでその溶液を３時間攪拌した。遠心分離機を使用して、固形物から液体を分離し、分離した固形物にさらに水８００ｋｇを加えた。ｐＨ値をＮａＯＨで１１に調整し、攪拌し、遠心分離により固形物を除くことを含む、上記の手順を繰り返した。得られた２つの液体を合わせて、５０℃で真空濃縮して１００ｋｇの溶液とし、次いで、３Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ値を６．５になるように調整して、沈殿物を生成した。前記沈殿物を溶液から分離し、続いてＨ２Ｏ ４０Ｌで洗浄し、沈殿物を回収するために遠心分離した。沈殿物は水８Ｌを用いて噴霧乾燥し、３８０ｇの粉末を得た。その後、前記粉末を４Ｌのアルコールを用いて３回抽出し、抽出溶液を合わせて濃縮し、アルコール抽出物２３８．９ｇを得た。この２３８．９ｇのアルコール抽出物は、ＴＬＣ分析によりセコラノスタン化合物を全く含まないことが証明された。次いで、この２３８．９ｇのアルコール抽出物を、ＨＰＬＣにより分離し、抽出物１グラムにつき、Ｋ２を２１４ｍｇ、Ｋ３を２３ｍｇ、Ｋ４を２４ｍｇおよびＫ１を４．５２ｍｇ得た。言い換えれば、抽出物１グラムは約２６５ｍｇのラノスタン化合物を含む。
【００４５】
また、粉末を５０％水性アルコール（エタノール）溶液４Ｌを用いて抽出し、その５０％水性アルコール（エタノール）溶液を除き、不溶性粉末を得た。抽出は三回繰り返し、５０％水性アルコール（エタノール）溶液に不溶性の物質２４５．７ｇを得た。この不溶性物質はＴＬＣ分析によりセコラノスタン化合物を全く含まないことが確認された。その後、ＨＰＬＣによる分離および精製プロセスを行い、抽出物１グラムにつき、Ｋ２を２１４ｍｇ、Ｋ３を２３ｍｇ、Ｋ４を２４ｍｇおよびＫ１を４．５２ｍｇ得た。これは、抽出物１グラムにつきラノスタン化合物約が２６１ｍｇ得られたことと同等である。
【００４６】
実施例４
ポリア粉末を中国で成長したマツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆ）３０ｋｇから製造した。このポリア粉末は、９５％アルコール１２０Ｌを用いて２４時間かけて抽出された。この混合物をろ過し、ろ液を得た。残渣は３回抽出して、ろ過した。ろ液を合わせて濃縮し、２６５．２ｇの量の乾燥抽出物を得た。乾燥抽出物は、二相抽出剤（ｎ−ヘキサン：９５％メタノール＝１：１（体積比））を用いた分配抽出を行い、そこからメタノール相を除き、その後、濃縮して２４６．９ｇの量の乾燥した固形物を得た。乾燥固形物は、乾燥固形物の１０〜４０倍の重量のシリカゲルを充填したシリカゲルカラムを用いて分離した。７０〜２３０メッシュの直径を有する前記シリカゲルは、Ｍｅｒｃｋ社製シリカゲル６０を用いて準備した。前記カラムは次の溶離液を順に用いて溶出した：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比）の混合溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０（体積比）の混合溶媒；および純粋メタノール。溶離液は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって試験した。ここで、検出には紫外線ランプおよびヨウ素蒸気を用い、ジクロロメタン：メタン＝９６：４（体積比）の混合溶媒を展開液として使用した。ＴＬＣにおいて類似の組成を有する溶出液は混合した。
【００４７】
ジクロロメタン：メタノール＝９６：４（体積比）の混合溶媒を用いて溶離し、７８ｇの量のＰＣＭ部分を得た。前記ＰＣＭは薄層クロマトグラフィーにおいて６つのスポット跡を示した。ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０（体積比）および純粋メタノールの溶離液を用いた溶出により得られた溶出液を混合し、１６８ｇの量のＰＣＷ部分を得た。
【００４８】
前記ＰＣＭ部分は、ジクロロメタン：メタノール＝９６．５：３．５（体積比）の溶離液および同様のシリカゲルカラムを使用してさらに分離し、Ｋ１（Ｋ１−１およびＫ１−２）、Ｋ２（Ｋ２−１およびＫ２−２）、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ４ａ、Ｋ４ｂ、Ｋ５、Ｋ６ａおよびＫ６ｂの精製ラノスタン成分を得た。なお、前記分離工程および同定分析データの詳細については、ＵＳ２００４／０２２９８５２Ａ１公報に記載されるのと同様である。
【００４９】
前記Ｋ１〜Ｋ６ｂ化合物は下記の構造を有する：
【００５０】
【化７】
【００５１】
ＰＣＭ部分から分離されたラノスタン化合物Ｋ１〜Ｋ６ｂの量は下記表１に列記される。ＰＣＭ部分は、ラノスタン化合物Ｋ１〜Ｋ６ｂを約１５ｗｔ％含む。
【００５２】
【表１】
【００５３】
実施例５
実施例４で調製されたＰＣＭ部分を有するカプセルを下記表２に示される組成に基づいて調製した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
ＰＣＭ部分およびケイアルミン酸ナトリウムは、＃８０メッシュを使用してふるい分けし、ジャガイモデンプンは＃６０メッシュを使用してふるい分けし、ステアリン酸マグネシウムは＃４０メッシュを使用してふるい分けした。続いて、上記成分はミキサーで均一に混合し、次いで得られた混合物はＮｏ．１の空カプセルに充填した。各カプセルは、有効成分Ｋ１〜Ｋ６を約１．６８ｍｇ（０．４２ｗｔ％）含んでいる。
【００５６】
実施例６
トリテルペン化合物のＩ型糖尿病を予防および治療するための使用を調査する実験
下記の細胞実験のために使用された前記ポリア抽出物は実施例２で製造された沈殿または図１に示された精製された化合物であった。前記抽出物はアルコール：ＤＭＳＯ（９：１（体積比））の溶媒に溶解され、得られた溶液は培養皿に加えられ、最終体積の１０００分のＩまで各ウェルに加えられた。
【００５７】
１．含脂肪細胞の細胞培養
３Ｔ３−Ｌ１ははじめ紡鐘型細胞に見られるげっ歯類の前含脂肪細胞の一種である。細胞は誘導剤とともに加えられ２−３日間培養された際、細胞は変形し、より丸い形態になる。数日後、前記細胞は異化し、より特別な細胞になる。異化の進行していない細胞における主なグルコース輸送体はＧＬＵＴ１であり、異化した細胞においては主に活性なグルコース輸送体はＧＬＵＴ４である。さらに、細胞膜上においてＧＵＬＴ４が多ければ多いほど、血液グルコースがより早く、より大量に細胞膜へ転移し、細胞に吸収され、血液グルコースはより急速に少なくなる。前記３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞はインスリンにより活性化されるグルコース吸収の包括的なシステムを有し、脂質の生産および調整の完全な過程を観察すると同様、グルコース代謝およびインスリン信号化過程の調査に十分である。したがって、全体が異性化した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は広く利用される代表的な細胞株であり、ヒト組織からの真性の含脂肪細胞の連続的な培養をするのが困難であるため、研究者は一般的にこの特別な細胞株を関連実験および評価をするために使用する。
【００５８】
（ａ）含脂肪細胞の細胞培養
３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞は３７℃でＣＯ２５％および空気９５％中、ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）１００ｇ／ｍＬ、１％の非必須アミノ酸（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）および１０％の子牛血清（ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）を補われているＤｕｌｂｅｃｃｏ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で培養された。一度細胞は完全に成長し、異化は異化誘導剤（３−イソブチルー１−メチルキサンタン（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈａｎｅ）（ＩＢＭＸ）０．５ｍＭ、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）１Ｍ、インスリン１０ｇ／ｍＬおよびウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）１０％を含むＤＭＥＭ）を用いて細胞を２日間処理させた。前記細胞は１０ｇ／ｍＬインスリンおよび１０％ＦＢＳで補われているＤＭＥＭを用いてさらに２日間再培養され、その後インスリンを含まない１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭに２日おきに変更して４−６日間培養された。この時点で、約９０％の細胞が含脂肪細胞表現型を発現し、実験の準備が整っていた。実験を開始する前に、前記３Ｔ３−Ｌ１細胞ははじめＰＢＳ溶液で洗浄し、血清およびインスリンの両方からの阻害を除くため、血清およびインスリンを含まない０．２％ＢＳＡ／ＤＭＥＭ培地中一晩培養された。
【００５９】
（ｂ）ＧＬＵＴ４実験の阻害されるｍＲＮＡ発現のために使用される含脂肪細胞の培養
ＧＬＵＴ４を阻害するＲＮＡを運送するウィルス性担体（ＴＲＣＮ０００００４３６３０ ｓｈＲＮＡ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ， Ｒ．Ｏ．Ｃ．）は、ＧＬＵＴ４発現を着実に阻害する遺伝子を発現させるため、３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞（ｓｈＧ４−３０）を感染するために使用され、細胞株は異化された含脂肪細胞を実験で使用するた、異化された。
【００６０】
（ｃ）ＧＬＵＴ４タンパク質の転移を試験するために使用される含脂肪細胞の培養：
インフルエンザウィルスタンパク質ＨＡマークされたＧＬＵＴ４担体（ＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ， Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｅ． ＭｃＧｒａｗ， Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅより提供）がリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ））により３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞に核酸を導入するために使用され、ＨＡマーキングしているインフルエンザウィルスタンパク質により着実に発現されたＧＬＵＴ４タンパク質がＧ４１８を用いて映し出された。前記細胞は含脂肪細胞に異化されＧＬＵＴ４タンパク質の転移を評価するのに使用された。
【００６１】
２．２−デオキシグルコース摂取の評価
３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞によるグルコース摂取の促進におけるトリテルペン化合物の効果を試験する実験のために、３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞は６つのウェルを有する培養皿で培養され、異化誘導試薬を用いて異化される前に十分に成長させた。３Ｔ３−Ｌ１細胞は成熟し７−１２日後に含脂肪細胞に異化されると、その細胞はグルコース摂取試験に使用された。前記含脂肪細胞ははじめ血清を含まない培地（０．２％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭ）中に一晩置かれ、次いで２−６時間トリテルペン化合物を異なる濃度で含む血清を含まない細胞培地中で培養し、ＫＲＰ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，１３７ｍＭのＮａＣｌ，４．７ｍＭのＫＣｌ，１．２ｍＭのＭｇＳＯ４，１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，２．５ｍＭのＣａＣｌ２，および２ｍＭのピルビン酸塩，ｐＨ７．４および０．２％のＢＳＡ）中、３７℃で３時間培養する前にＰＢＳ溶液で１回洗浄した。最後に０．２ μＣｉ／ｍＬの２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］−グルコース（２−ＤＧ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｓ，英国）と０．１ｍＭの２−ＤＧ由来の０．２ｍｌの非放射性グルコース緩衝溶液がグルコース摂取の実験を開始するためにＫＲＰ緩衝溶液の代替として使用された。５分間実験を行った後、グルコースの摂取を停止するために細胞は除去されＰＢＳ溶液で洗浄された。続いて、前記細胞は０．２ｍｌの０．２％ＳＤＳ中に溶解され、細胞を溶解した１０μＬの溶液はろ過基盤の付属したＵｎｉＦｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｍ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）に移され、３７℃で真空炉中乾燥され、それぞれのウェルに３０ｍＬの計数溶液を加え、それからマイクロディスク液体シンチレーション分析装置（ＴｏｐＣｏｕｎｔ，Ｐａｃｋａｒｄ ＮＸＴ，Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，米国）により分析された。細胞中に蓄積されたグルコースの濃度は計算され、タンパク質濃度で除算することで、毎分の細胞タンパク質のマイクログラム毎のナノモル量（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）として示されるグルコース摂取速度を得た。前記タンパク質濃度は標準ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質分析装置（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）を用いて決定された。非特異性のグルコースの摂取は０．２μＣｉのＬ−［１４Ｃ］−グルコースを加えて決定され、特異的なグルコースの摂取量を得るために分析して得られた値から減算するために使用された。したがって、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞によるグルコース摂取における異なる濃度のトリテルペン化合物の影響を決定することができる。
【００６２】
３．ＧＬＵＴ１および４タンパク質の評価
３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中ＧＬＵＴタンパク質発現の促進におけるトリテルペン化合物の効果を調査する実験に、前述した異化され成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は血清を含まない培地中一晩培養され、それから異なる濃度のトリテルペン化合物を含む血清を含まない細胞培地中で２４時間さらに培養された。その後、ＰＢＳ溶液でその細胞を洗浄し、０．２ｍＬの溶解緩衝液（１％のＮＰ−４０，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．１％のＳＤＳ，５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．６，１０ｍＭのＥＤＴＡ，０．５％のデオキシコール酸塩（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ），１ｍＭのＰＭＳＦ，１ｍＭのＮａ３ＶＯ４，１０ｍＭのＮａＦ，１０ｍＭのβ−グリセロリン酸エステル（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），１０ｇ／ｍＬプロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）およびフォスフォターゼ阻害剤カクテル（ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ））中、３０分間４℃で前記細胞を溶解した。それぞれのサンプルからドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により等量のタンパク質を分けとり、二弗化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，米国）上にブロットされた（ｔｒａｎｓｂｌｏｔｔｅｄ）。続いて、ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）をＧＬＵＴ１（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＧＬＵＴ４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および（β−Ａｃｔｉｎ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対してモノクローナル抗体を用いて行い、トリテルペン化合物の異なる濃度の下では３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中ＧＬＵＴタンパク質発現に影響があるか否かを決定した。それぞれのタンパク質のサンプルはＸ線に露光される前に化学発光セット（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）を用いて処理され、コンピュータソフトを用いて定量的に分析された。
【００６３】
４．ＧＬＵＴ１および４の遺伝子発現の評価
リアルタイムのＱ−ＰＣＲは異なるトリテルペン化合物濃度において３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中のＧＬＵＴタンパク質のｍＲＮＡ発現を評価するために使用された。はじめ十分に異化された３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は異なる濃度のトリテルペン化合物と混合され、細胞培地を除去しトリゾール緩衝液（Ｔｒｉｚｏｌ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，米国））を使用してＲＮＡ全体を細胞から得るために、使用する前に２４時間放置された。後に１μｇのＲＮＡサンプルがそこから取上げられ、高解像ｃＤＮＡ転写キット（Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，独国））が使用されサンプル中のｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させた。プライマーは特にＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４およびβアクチン用にデザインされ、相対的な遺伝子発現値がＳｔｅｐＯｎｅ ｖ２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたΔΔＣＴ方法により計算される前に、検出遺伝子（Ｇｌｕｔ１＆Ｇｌｕｔ４）および参照遺伝子（β−ａｃｔｉｎ）の検出のためそれらの遺伝子を増幅するためにＹＢＲグリーンＱ−ＰＣＲ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）が使用された。
【００６４】
５．ＧＬＵＴ４タンパク質の転移の評価
（１）ＧＬＵＴ４タンパク質の転移の分析
含脂肪細胞または筋細胞によるグルコース摂取を促進させるインスリンの機構において、細胞内小器官から原形質膜（ＰＭ）へのＧＬＵＴ４の転移は実際に極めて重要であり、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中におけるＧＬＵＴ４の原形質膜への転移の促進においてトリテルペン化合物の効果がここで調査された。異化され成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は血清を含まない細胞培地中で一晩培養され、それからトリテルペン化合物を異なる濃度で含む血清を含まない細胞培地中さらに２時間培養された。次いで、細胞原形質膜部位を低密度ミクロソーム（ＬＤＭ）から分離するために、これを高速遠心分離した［Ｌｉｕ，Ｌ．Ｚ．ｅｔ．ａｌ．；Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ １７，（５），２３２２−２３３０，２００６］。ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中、細胞内ＬＤＭからＰＭにＧＬＵＴ４が転移する際にトリテルペン化合物の異なる濃度が与える影響があるか否かを観察するためにＧＬＵＴ４のためのモノクローナル抗体を用いて行われた。
【００６５】
（２）ＧＬＵＴ４タンパク質の転移の分析
安定にＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰを発現する３Ｔ３−Ｌ１前含脂肪細胞は９６−ウェル培地皿で培養させられ、それから十分に培養された後に誘導試薬により異化された（Ｇｏｖｅｒｓ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２４（１４），６４５６−６４６６，２００４）。十分に異化された３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞は異なる濃度のトリテルペン化合物を添加し、２時間放置され、細胞培地を除き氷冷したＰＢＳ溶液でその細胞を洗浄した。続いて、細胞は１５分間室温で４％のパラホルムアルデヒド中に固定され、細胞を氷冷したＰＢＳ溶液で２，３回洗浄した後に初期の赤血球凝集索（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉ−ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＨＡ）抗体（１２ＣＡ５）を用いて２時間培養され、この後に細胞は再度氷冷したＰＢＳ溶液で２，３回洗浄され、ローダミン共役第２抗体（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と共に１時間培養された（Ｌｅｉｎｃｏ，Ｂａｌｌｗｉｎ，ＭＯ）。細胞は、蛍光マイクロタイタープレートリーダー（ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ；ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，独国）を使用してローダミンおよびＧＦＰから励起された蛍光波長（Ｅｍ．４８０／Ｅｘ．４２５ｎｍ および Ｅｍ．５７６ｎｍ／Ｅｘ．５５０ｎｍ）を測定する前に再度氷冷したＰＢＳ溶液で洗浄された。ＧＦＰ蛍光に対するローダミン蛍光の割合は計算され、原形質膜へ転移されたＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰの相対量を評価するために使用された。ＨＡタグ化されたＧＬＵＴ４は原形質膜に転移した後にローダミンでラベルされうるので、その割合は原形質膜へのＧＬＵＴ４転移の評価に有益であった。
【００６６】
６．トリグリセリドの蓄積およびグリセロールの遊離の効果
トリグリセリドの堆積と３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞内のグリセロールの遊離においてトリテルペン化合物の効果を調査する実験のために、異化して成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞が血清を含まない細胞培地中一晩培養され、トリテルペン化合物を異なる濃度で含む血清を含まない細胞培地中でさらに２４時間培養された。その培地は集められグリセロールアッセイキット（Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎｔｒｉｍ，英国）を用いて異なる濃度のトリテルペン化合物が３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中脂質分解からグリセロールの遊離において効果があるかどうかを決定するためグリセロールの遊離について調査された。含脂肪細胞においてトリグリセリドのレベルはオイルレッドＯ染色により決定された（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｚａｃａｒｉａｓ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．；Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９７，（６），４９３−４９７，１９９２）。細胞内で脂質の堆積により形成された油滴が染色され、６０％イソプロパノールで２回洗浄され、そして１００％イソプロパノールで抽出され４９０ｎｍの吸収で定量された。その測定値は、含脂肪細胞において異なる濃度のテルペン化合物がトリグリセリドの蓄積に与える効果を評価するために、トリテルペン化合物が与えられなかった含脂肪細胞からの測定値と比較された。
【００６７】
実験結果はインスリンのような結果を示し、すなわちトリテルペン化合物は次の４つの性質を有し、Ｉ型糖尿病の治療に効果的である。
【００６８】
（１）含脂肪細胞モデルにおいて、ポリアの成分または抽出物は細胞外のグルコースの細胞内への吸収を促進するのに効果的であった：
成熟した含脂肪細胞においてポリア抽出物の効果の評価（実施例２）から、図２Ａに示されるように；ポリア抽出物はグルコース摂取の増加に明らかに効果的であり、グルコース摂取の増加の効果は細胞に与えられる投与量の増加に正の相関がある。一方、インスリン１００ｎＭの添加もまたグルコース摂取量の増加に効果的であった。実施例２の純粋な化合物はさらに実験に使用された。図２Ｂは０．０１μＭの純粋な化合物を含脂肪細胞に投与後２時間後に、ＰＡ、ＴＡおよびＰＰＡの３つの化合物はグルコース摂取量を１６５．８９％、１４２．５％、および１４７．９％に有意に増加した。ＰＡにより誘導される増加が最も顕著であり、以下における評価はＰＡを基準にして行った。
【００６９】
図３Ａによれば、グルコース摂取量の増加におけるＰＡの効果は時間の経過に連れて増加し、投与後２時間において最も著しかった（１６５．８９％に増加した）。加えて、ＰＡ濃度の増加はグルコース摂取量を増加させた。図３Ｂにおいて見られるように、ＰＡが１μＭで与えられた際に、グルコース摂取量は２０９．８４％に増加した。
【００７０】
図４によると、ＰＡは異化された含脂肪細胞におけるグルコース摂取の促進に効果的であるのみで、前含脂肪細胞においては効果的ではなかった。プロレチン（ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ（ＰＴ））が前含脂肪細胞および含脂肪細胞の両方に投与されたとき、両方の細胞の種類においてグルコース摂取量は有意に阻害された。過去の調査文献によると、前含脂肪細胞はＧＬＵＴ１を有するのみであり、含脂肪細胞はＧＬＵＴ４を有する。したがって、ＰＡはＧＬＵＴ４の増加によりグルコース摂取量を増加すると考えられる。
【００７１】
（２）ＰＡの効果、トリテルペン化合物；成熟した含脂肪細胞におけるＧＬＵＴ４のタンパク質およびｍＲＮＡ発現の促進における
図５はＰＡの異なる投与量を２４時間成熟した含脂肪細胞に投与し、続いてＧＬＵＴ１および４のタンパク質発現におけるＰＡの効果を評価するためにＧＬＵＴ１および４のウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）行った。その結果は、ＰＡはＧＬＵＴ４のタンパク質発現の促進に効果的である（図５Ａ）がＧＬＵＴ１のタンパク質発現を促進には効果的でない（図５Ｂ）ことを示した。
【００７２】
Ｑ−ＰＣＲおよび成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞におけるＧＬＵＴタンパク質のｍＲＮＡ発現におけるＰＡの異なる濃度の効果を調査するため、特別なプローブを使用した結果は図６に示され、１μＭのＰＡがＧＬＵＴ４の遺伝子発現を２２８％に高めることを明らかにし、これは推奨されているＰＡはＧＬＵＴ４の遺伝子およびタンパク質発現を調整しうることを示す。さらに、ｍＲＮＡ阻害方法（ｍＲＮＡ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）はＧＬＵＴ４の発現が一貫して低い３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞の生産に使用され（図７Ａ）、含脂肪細胞がさらにグルコース摂取を評価するために使用され、それは図７Ｂにおいて示され、ＰＡの異なる摂取量が含脂肪細胞においてグルコース摂取をあまり促進させなかったことを示し、それにより、ＰＡはＧＬＵＴ４発現に直接的に影響することによりグルコース摂取を促進することを明らかにした。
【００７３】
（３）成熟した含脂肪細胞内の細胞内小器官から原形質膜へのＧＬＵＴ４の転移の促進におけるＰＡの効果
グルコース摂取を促進するインスリンのメカニズムの一つはグルコース摂取を実行するために細胞内小器官から原形質膜への大量のＧＬＵＴ４の転移を促進することである。したがって、インスリンにより活性化されるグルコース摂取のインスリン活性の包括的なシステムを有する成熟した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞がＧＬＵＴ４タンパク質の転移を評価するために用いられた。図８Ａは高速遠心分離器を使用して分離された原形質膜におけるウェスタンブロット分析の結果を図示しており、０．０１μＭのＰＡが原形質膜内のＧＬＵＴ４の量を１４１％に有意に増加し、ＰＡ投与量が１μＭに高められたときＧＬＵＴ４の量は３２８％にまで増加することを明らかにした。ＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰタンパク質を安定的に発現する３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞の使用および蛍光測定法はＧＬＵＴ４の原形質膜への転移を増加することによりＰＡがグルコース摂取を促進することをさらに確認した。図８Ｂでは、ＰＡの投与が１．０μＭに増加されたとき、ＧＬＵＴ４の原形質膜への転移が２．７１倍に高められたことが分かる。前述の結果はＰＡがＧＬＵＴ４タンパク質の原形質膜への転移に効果的であることを裏付けた。
【００７４】
（４）含脂肪細胞においてトリグリセリドの蓄積の促進およびグリセロールの培地への放出の減少におけるＰＡの効果
含脂肪細胞におけるグルコース摂取へのＰＡの効果の観察に加えて、含脂肪細胞中でのトリグリセリドの合成（蓄積）および脂質分解（グリセロールの遊離）もまた評価された。図９は異なる投与量でＰＡを投与した後２４時間後の結果を示し、トリグリセリドの蓄積はオイルレッドＯ染色により測定された。ＰＡの投与により、トリグリセリドの蓄積は元のレベルの１３７％に増加し、グリセロールの遊離はおよそ元のレベルの７０％に低下した。この結果は、ＰＡが脂質の合成の促進および脂質の分解の防止に効果的であることを示した。
【００７５】
本発明は好ましい例により記載されており、記載される例の変更や修正は添付される請求項によってのみ限定される本発明の範囲および思想から離れることなく実施されうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、下記式（Ｉ）：
【化１】
ただし、Ｒ１は、−Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ２は、−ＯＣＯＣＨ３、＝Ｏまたは−ＯＨであり；Ｒ３は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、−Ｈまたは−ＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）Ｒｂ（この際、Ｒｂは、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５は、−Ｈまたは−ＯＨであり；およびＲ６は、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである、
で示されるラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩を哺乳動物における糖尿病を治療するのに有効な量を含み、前記糖尿病は、前記哺乳動物の血液中の不十分なインスリンにより誘発されるものである、哺乳動物における糖尿病を治療するための薬剤組成物。
【請求項２】
前記式（Ｉ）のラノスタン化合物が、下記化学式：
【化２】
を有する、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記式（Ｉ）のラノスタン化合物が、下記化学式：
【化３】
を有する、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記薬剤組成物が注射のためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記薬剤が経口摂取のためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬組成物。
【請求項６】
前記糖尿病がＩ型の糖尿病である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
前記糖尿病がＩＩ型の糖尿病である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
前記薬剤組成物が有効成分として前記式（１）を有する単離されたラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩および薬理上許容される賦形剤または希釈剤を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
ポリア抽出物を有効成分として有効な量含み、前記ポリア抽出物の重量に対して、１〜６０重量％の請求項１に定義される前記化学式（Ｉ）を有するラノスタン化合物を含み、前記ポリア抽出物がセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を実質的に含まず、前記糖尿病が前記哺乳動物の血液中の不十分なインスリンに誘発されるものである、哺乳動物における糖尿病の治療のための薬剤組成物。
【請求項１１】
前記ポリア抽出物が、前記ポリア抽出物の重量に対して、５〜３５重量％のラノスタン化合物（Ｉ）を含む、請求項１０に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記ラノスタン化合物（Ｉ）が、下記化学式：
【化４】
を有する、請求項１０または１１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記薬剤組成物が経口摂取のためのものである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記糖尿病がＩ型糖尿病である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１】
有効成分として、下記式（Ｉ）：
【化１】
ただし、Ｒ１は、−Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ２は、−ＯＣＯＣＨ３、＝Ｏまたは−ＯＨであり；Ｒ３は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、−Ｈまたは−ＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）Ｒｂ（この際、Ｒｂは、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５は、−Ｈまたは−ＯＨであり；およびＲ６は、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＨである、
で示されるラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩を哺乳動物における糖尿病を治療するのに有効な量を含み、前記糖尿病は、前記哺乳動物の血液中の不十分なインスリンにより誘発されるものである、哺乳動物における糖尿病を治療するための薬剤組成物。
【請求項２】
前記式（Ｉ）のラノスタン化合物が、下記化学式：
【化２】
を有する、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記式（Ｉ）のラノスタン化合物が、下記化学式：
【化３】
を有する、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記薬剤組成物が注射のためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記薬剤が経口摂取のためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬組成物。
【請求項６】
前記糖尿病がＩ型の糖尿病である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
前記糖尿病がＩＩ型の糖尿病である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
前記薬剤組成物が有効成分として前記式（１）を有する単離されたラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩および薬理上許容される賦形剤または希釈剤を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
ポリア抽出物を有効成分として有効な量含み、前記ポリア抽出物の重量に対して、１〜６０重量％の請求項１に定義される前記化学式（Ｉ）を有するラノスタン化合物を含み、前記ポリア抽出物がセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を実質的に含まず、前記糖尿病が前記哺乳動物の血液中の不十分なインスリンに誘発されるものである、哺乳動物における糖尿病の治療のための薬剤組成物。
【請求項１１】
前記ポリア抽出物が、前記ポリア抽出物の重量に対して、５〜３５重量％のラノスタン化合物（Ｉ）を含む、請求項１０に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記ラノスタン化合物（Ｉ）が、下記化学式：
【化４】
を有する、請求項１０または１１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記薬剤組成物が経口摂取のためのものである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記糖尿病がＩ型糖尿病である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【公開番号】特開２０１１−４６７０８（Ｐ２０１１−４６７０８Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９０４３７（Ｐ２０１０−１９０４３７）
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【出願人】（５１０１１８１４５）杏輝天力（杭州）藥業有限公司 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【出願人】（５１０１１８１４５）杏輝天力（杭州）藥業有限公司 (4)
【Ｆターム（参考）】
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