細胞チップおよび細胞改変方法および細胞制御方法
【課題】細胞機能を研究や細胞を用いる種々物質のバイオアッセイおよびそのための細胞チップを提供する。
【解決手段】細胞の一部を半透膜化するため、細胞外径より小さい穴を開けた隔壁構造のチップを用いる。このチップの一面の細孔のある位置に細胞を固定し、他面から前記細孔を介して細胞の一部に、たとえば、ストレプトリシンＯのような細胞膜毒素を作用させ、細孔部分の細胞膜を半透膜化する。
【解決手段】細胞の一部を半透膜化するため、細胞外径より小さい穴を開けた隔壁構造のチップを用いる。このチップの一面の細孔のある位置に細胞を固定し、他面から前記細孔を介して細胞の一部に、たとえば、ストレプトリシンＯのような細胞膜毒素を作用させ、細孔部分の細胞膜を半透膜化する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞機能を研究や細胞を用いる種々物質のバイオアッセイおよびそのための細胞チップ、細胞を用いる物質生産を目的とした細胞の制御方法および改変方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが頻繁に行われている。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている（非特許文献１あるいは非特許文献２）。あるいは、採取した試料に含まれる特定の配列のｍＲＮＡ（あるいはｃＤＮＡ）をＰＣＲ増幅して得られる産物の量やＰＣＲ産物長、塩基配列を調べる方法が用いられている。
【０００３】
これら分離したｍＲＮＡは単に分析目的で用いられる以外にこれをｃＤＮＡに変換し、ベクターに組み込んだりして色々の目的に利用されている。一例として言えば、採取したｍＲＮＡをベクターに組み込み、クローニングした後、ベクターを鋳型にして部分的に異なる塩基を持つプライマーで相補鎖合成し、任意の遺伝子改変を施す遺伝子組換えに用いられている。
【０００４】
細胞そのものをセンサーに見立てて、極微量物質を検出するバイオアッセイの研究も盛んである。特に、種々の有害物質の影響を調べたり、薬剤の薬効や副作用を調べるのは、現在はマウスなどの哺乳類個体に頼る部分が大きいが、今後、動物愛護の観点からも細胞ベースでのアッセイに移行することは時代の趨勢である。
【０００５】
別の観点からは、細胞を自由に機能制御し、有用物質を生産することや医療治療面へ応用することでもニーズが高い。実際、アンチセンスオリゴヌクレオチドやＲＮＡｉのように細胞外部からの操作により細胞を制御する試みが盛んになされるようになっている。
【０００６】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような、細胞を用いるアッセイや細胞機能制御に関しては、方法論的に万能な手法が存在しない。アッセイのためには、細胞を遺伝子組換えの技術を用いて特定物質を捕捉するレセプラーやトランスポーターを発現させ、これとイオンポンプをカップルさせて、電極を差し込み、細胞膜を流れる電流量として計測する。細胞機能制御に関しても原理は細胞内に制御用の物質を挿入し、細胞の活動をコントロールする。
【０００８】
ところが、細胞は安定な細胞膜で外界と仕切られており、実施者の都合で任意の物質を定量的に細胞に入れたり出したりすることは困難である。もちろん、金微粒子をビークルにして、その表面に、細胞内に挿入したいものをくっつけて、細胞に打ち込む技術など多くの技術が開発されているが、確実性と細胞内に取り込む物質量の再現性にはかなりのばらつきがあると考えてよい。
【０００９】
細胞膜を半透膜にする技術（swmi-contact cell: Molecular Biology of the Cell 11,3073-3087(2000)）、あるいは、ファゴトーシスやエンドサイトーシスを利用するのが有効な方法であると思われる。しかし、細胞膜を半透膜化すると細胞表面全体に穴が開いてしまい、細胞内の物質（細胞質）が細胞外に流れ出てしまう欠点がある。また、ファゴトーシスやエンドサイトーシスを利用する方法は即応性がないために、細胞機能の逐次制御という面では利用が難しい。
【００１０】
本発明のポイントは、細胞の内容物の流失を押さえ、確実に目的物質を細胞内に挿入したり、細胞内の物質を回収したりする技術を確立し、特定物質のアッセイや有用物質の生産をより容易にする技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従来の技術を改良し、細胞の逐次制御やアッセイを安定に行う方法に最も近いのは細胞膜を半透膜化する技術である。本発明では、細胞全体を半透膜化するのではなく、細胞のごく一部に限定することで細胞質の細胞外への流失を防ぎ、安定して細胞を利用できるようにする。
【００１２】
細胞の一部を半透膜化するため、細胞外径より小さい穴を開けた隔壁構造のチップを用いる。このチップの一面の細孔のある位置に細胞を固定し、他面から前記細孔を介して細胞の一部に、たとえば、ストレプトリシンＯのような細胞膜毒素を作用させ、細孔部分の細胞膜を半透膜化する。この半透膜部分を用いて細胞に物質の出し入れを行う。また、隔壁の内外に電極を設けることで、細胞膜を通過するイオンを計測したり、電極に電圧を印加することで細胞への物質の出し入れを強制的に行う。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、細胞膜の一部を半透膜化するに過ぎない。さらに、半透膜化した細胞膜部分は、平常は細胞膜と隔壁で区切られているため、細胞質は隔壁外に拡散しない。細胞を連続的に観測することや、逐次細胞内に物質を注入することもできる。しかも、半透膜における拡散のみで細胞内物質の出し入れが可能となる。外部から種々物質を加えられるので、タンパク質相互作用や遺伝子発現の制御か可能になり、細胞内で起きる生理現象を能動的に解析できる。隔壁の内外に電極を設けることで、細胞膜を通過するイオンを計測したり、物質の出し入れを強制的に行うことができる。パッチクランプによる細胞への物質の出し入れと比較して、格段に、安定な操作である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（実施例１）
図１は、実施例１による細胞チップとその細孔部分に固定される細胞との関係の概要を示す断面図である。
【００１５】
図１において、１００は細胞チップである。２０は細胞である。後述するように、細胞２０は細胞チップ１００の細孔３の部分に固定されている。
【００１６】
１は細胞チップ１００の細胞固定基板であり、例えば、シリコン基板から作られる。大きさは、例えば、図の高さ方向が５ｍｍ、図と垂直方向が５００μｍである。厚さは、例えば、１００μｍである。細胞固定基板１の一端部に突起２を形成する、この高さは、例えば、５μｍであり、突起２の部分の厚さは、例えば、２μｍである。突起２の頂部に細孔３を形成する。この大きさは、例えば、２〜５μｍφである。細胞固定基板１の下部の両面に電極層４，５が形成されている。電極層４，５は絶縁層６，７で大部分が覆われているが、突起２の近辺と細胞固定基板１の端部近辺では露出している。
【００１７】
１０は背面板であり、細胞固定基板１の突起２の背面部にバッファ室８を形成するために、突起２の背面部全体を覆う形で貼り付けられる。背面板１０の厚さは、全体としては、例えば、１００μｍであるが、図に示すように、細胞固定基板１側の面の細孔３に対応する位置に突起１１が形成され、外側面の突起１１の両端に位置に貫通孔を有する突起１２，１３が形成される。突起１２，１３には、キャピラリー１４，１５を取り付けることができ、これに、マイクロシリンジポンプ（図示しない）に連結することができる。このキャピラリー１４，１５を利用して、太い矢印で示すように、バッファ室８内にバッファを循環させ、あるいは、バッファの供給を上回る吸引をすることで、バッファ室８の内部を陰圧状態とすることができる。突起１１は、供給されたバッファの流れを乱し、細孔３の方に流れるようにするために設けられる。
【００１８】
図が煩雑になるので、顕微鏡関係の図示は省略したが、顕微鏡の観察ガラス板の上に細胞培養に適したバッファの液滴を滴下し、この液滴中に細胞固定基板１の突起２と細胞２０を対向して配置する。この際、顕微鏡で観察しながら、細胞２０を突起２の細孔３の部分に向き合う形に置く。２１は細胞２０の脂質二重層であり、２２は細胞質を表わす。図１において、細胞固定基板１の突起２と細胞２０を取り囲む破線は液滴に浸漬されている領域のイメージを示す。破線が取り囲む領域にはバッファ室８が含まれた形となっているが、後述するように、細胞２０が細胞固定基板１に固定された状態では、バッファ室８は、液滴とは繋がらないものとなる。一方、液滴の範囲外にある細胞固定基板１の端部で露出している電極層４，５には導線が接続され、引き出されて図示しない計測器、あるいは、計算機に接続される。
【００１９】
顕微鏡で観察しながら、細胞２０を突起２の細孔３に接触させる。このとき、前述した電極層４，５間の電気伝導度を監視していると、細胞２０が突起２の細孔３に接触する前は、バッファ室８内に露出している電極層５と液滴内に露出している電極層４とはバッファにより短絡状態であるのに対して、接触した後は、細孔３が細胞２０の脂質二重層２１で塞がれるので、実質的に絶縁状態になるので、細胞接触を確認できる。細胞接触が確認されたら、突起１２，１３に連結されたキャピラリー１４，１５によるバッファの供給を制御して、バッファの供給を上回る吸引をすることでバッファ室８内を陰圧にすることにより、細胞２０は細孔３にしっかりと固定される。
【００２０】
次に、背面板１０の突起１２，１３に取り付けられたキャピラリー１４，１５に連結されているマイクロシリンジポンプを用いて、バッファ室８内にストレプトリシンＯを注入する。ストレプトリシンＯは細孔３を介して、細胞２０の脂質二重層２１のうち細孔３に接している部分に作用して、この部分のみを半透膜化する。半透膜化とは細胞骨格は残っているが、脂質二重層２１に穴が開いた状態である。ストレプトリシンＯの反応条件は、例えば、Fumi Kano, Y. Sako et al、Reconstraction of Brefeldin A-induced Golgi Tubulation and Fusion with the Endoplasmic Reticulum in Semi-Intact Chinese Hamster, Molecular Biology of the Cell 11,3073-3087(2000)に開示されている技術をベースに細胞の種類に応じて改変する。たとえば、卵巣細胞ではストレプトリシンＯ（６０ｎｇ／ｍｌ）、１１５ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ ＥＧＴＡを含むｐＨ７．４の２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で４℃１０分間である。その後、１１５ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ ＥＧＴＡを含むｐＨ７．４の２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（３２℃）で洗浄する。この間、細胞２０は、液滴のバッファ内にあるので細胞２０へのダメージは少ない。
【００２１】
以下、このようにして構成された、部分的な半透膜を有する細胞を固定した細胞チップ１００の使用法を説明する。
【００２２】
キャピラリー１４から、特定のｍＲＮＡの一部である短鎖のＲＮＡをバッファ室８内に流入させる。このＲＮＡの一部は細孔３から半透膜を通して細胞２０内に取り込まれる。通常、ＲＮＡは、細胞２０内に導入された場合、ＲＮａｓｅの攻撃を受け速やかに消失する。しかし、実施例１の細胞チップ１００では、キャピラリー１４から、連続的に、バッファ室８内に新鮮なＲＮＡが供給されるから、細胞２０内のＲＮＡは細孔３に細い矢印で示すように、半透膜を通して細胞２０とバッファ室８とで平衡状態を形成する。このため、常に一定量のＲＮＡを細胞内に保持することができる。これはＲＮＡに限らず、ＤＮＡないしＲＮＡないしそれらの誘導体でも同様である。
【００２３】
このようにしてＲＮＡを細胞２０内に入れる前と入れた状態で、電極４と５の間の電流値をモニターする。細胞に導入されたＲＮＡが細胞二重膜２１のトランスポーターに影響があるものであれば、細胞二重膜２１に存在するイオンチャンネルがカップルし、イオンの膜輸送に変動が現れ、電極４と５の間に電流が流れる。すなわち、細胞内に物質を導入し、それが細胞に与える影響をモニターできる。これはＲＮＡ以外にも、化学物質や、タンパク質の影響測定にも利用できる。
【００２４】
あるいは、ストレプトリシンＯに晒されない、液滴側の細胞二重膜２１が存在する側で、液滴に種々の化学物質を添加し、トランスポーターを介してこれを細胞２０内に導入させ、それが細胞に影響を与える状況を電極４，５間の電位差などで知ることができる。すなわち、バイオアッセイが可能である。
【００２５】
図２（ａ）−（ｇ）は実施例１の細胞固定基板１を半導体技術を利用して形成する処理の概要を説明する図である。図２（ａ）−（ｇ）は左側に断面図、右側にそれに対応する平面図を示す。
【００２６】
まず、図２（ａ）に示すように、所定の結晶軸を持つシリコン基板１を準備し、その一面にマスク３１を施し、突起３を作成する位置に、マスク３１を除去した窓３２を形成する。図２（ｂ）に示すように、エッチング処理をして、四角錐３３に対応する部分を除去する。次に、図２（ｃ）に示すように、マスク３１を除去し、シリコン基板１の他面にマスク３４を施し、突起３を作成する位置に、マスク３４を除去した窓を形成しこれにより断面三角の凹部３５，３６を形成する。凹部３５，３６は、平面図から分かるように、四角錐３３に対応する連続した凹部である。次に、図２（ｄ）に示すように、凹部３５,３６で囲まれた位置に、マスク３７を設けて、窓３８を開ける。次に、図２（ｅ）に示すように、この窓３８を利用して基板１の対応部分に細孔３を開ける。このとき、併せて、凹部３５,３６の周辺部の基板１にもエッチングを施して突起２を形成する。次に、図２（ｆ）に示すように、基板１の突起２のある面に電極４を形成する。この電極４はアルミの蒸着層とする。次に、図２（ｇ）に示すように、電極４の両端部を除く、ほぼ全面をポリイミドの絶縁層６で覆う。次いで、基板１の他の面に電極５を形成する。この電極５は白金の蒸着層とし、電極５の両端部を除く、ほぼ全面をポリイミドの絶縁層７で覆う。かくして、細胞チップ１００の細胞固定基板１が形成される。ここでは、半導体技術に関する詳細なデータは省略したが、当業者は容易に実施できる。
【００２７】
同様にして、背面板１０も半導体技術によるシリコン基板の加工により形成することができる。そして、細胞固定基板１と背面板１０とを貼り合わせて、細胞チップ１００が構成される。
【００２８】
（実施例２）
実施例１は単一の細胞を細胞チップの細孔部分に固定し、細孔部分の細胞膜のみを半透膜化してバイオアッセイの可能な細胞チップを説明した。しかしながら、多細胞生物においては、細胞は単独で機能しているケースはまれで、周囲の細胞と強調しながら全体として機能している。このような多細胞系はお互いに種々化学物質を用いて情報のやり取りを行っているものと考えられる。多くの場合このような化学物質は微量で、生きた細胞からの逐次解析は困難なのが実情である。実施例２では、周囲の細胞と協調しながら全体として機能している細胞群について、模擬的に、バイオアッセイを可能とする細胞チップを提案する。実施例２でも、細胞を実施例１の細孔部分に固定し、細孔部分の細胞膜のみを半透膜化してバイオアッセイのを可能とするものである点においては、実施例１と同じである。
【００２９】
図３は、実施例２による細胞チップとその細孔部分に固定される細胞との関係の概要を示す断面図である。
【００３０】
図３において、２００は実施例２による細胞チップであり、細胞固定基板４１と背面板５１および側壁板６１，６２より構成される。なお、側壁板は図示されていない紙面の背後方向および手前方向にも設けられる。これらで囲われた空間は、実施例１と同様、バッファ室７１を形成する。
【００３１】
細胞固定基板４１には細孔４３が形成される。これらは、実施例１の細胞固定基板１、細孔３と対応する。実施例２の細胞固定基板４１は、実施例１の細胞固定基板１と異なり、突起２は形成されておらず、多数の細孔３が形成されている。これは、細胞固定基板４１の面上に、多数の細胞を配列させ、これらの細胞同士で協調しながら全体として機能している細胞群を構成させるためである。図の例では、４個の細孔４３が構成されている例が示されているが、これをもっと多くすることは容易である。細胞固定基板４１は、例えば、全体の大きさは１０×１０ｍｍ程度である。厚さは、例えば、１００μｍである。細孔４３は２ないし５μｍφとし、これを８μｍピッチで配列する。細胞固定基板４１の細孔３の位置には、それぞれ、細胞２０が配列される。すなわち、細胞２０が８μｍピッチで配列される。
【００３２】
背面板５１は、細胞固定基板４１と同一の大きさで、細胞固定基板４１に対向して、例えば、１ｍｍ離して配置される。細胞固定基板４１と背面板５１とは、側壁板６１，６２および図示されていない紙面の背後方向および手前方向の側壁板により、所定の位置関係に保持されるとともに、これらによって囲われた空間をバッファ室７１とする。側壁板６１，６２には、実施例１と同様、貫通孔を有する突起６３，６４が形成される。突起６３，６４には、キャピラリー（図示しない）を取り付けることができ、これを、マイクロシリンジポンプ（図示しない）に連結することができ、バッファ等を供給することができる。背面板５１には、細孔４３に対応する位置に突起５２が形成される。この突起５２は、実施例１の突起１１と同様、バッファ室７１供給されたバッファの流れを乱し、細孔４３の方に流れるようにするために設けられる。また、背面板５１のバッファ室７１内の面には電極５３が設けられる。電極５３の引き出し線５４は絶縁線とされて、バッファ室７１の外部に引き出される。
【００３３】
図４（ａ）−（ｄ）は実施例２の細胞固定基板４１を半導体技術を利用して形成する処理の概要を説明する図である。図４（ａ）−（ｃ）は左側に断面図、右側にそれに対応する平面図を示す。図４（ｄ）の平面図は図４（ｃ）のそれと同じであるので、省略した。
【００３４】
まず、図４（ａ）に示すように、所定の結晶軸を持つシリコン基板１を準備し、その一面にマスク３１を施し、細孔３を作成する位置の凹部に、マスク３１を除去した窓３２を形成する。図４（ｂ）に示すように、エッチング処理をして、四角錐３３に対応する部分を除去する。次に、図４（ｃ）に示すように、マスク３１を除去し、シリコン基板１の他面にマスク３４を施し、細孔４３を作成する位置に、マスク３４を除去した窓３５を形成する。図４（ｄ）に示すように、エッチング処理をして、細孔４３を形成する。かくして、細胞チップ２００の細胞固定基板４１が形成される。ここでは、半導体技術に関する詳細なデータは省略したが、当業者は容易に実施できる。
【００３５】
同様にして、背面板５１、側壁板６１，６２も半導体技術によるシリコン基板の加工により形成することができる。そして、細胞固定基板４１と背面板５１および側壁板６１，６２とを貼り合わせて、細胞チップ２００が構成される。
【００３６】
図２（ｇ）の平面図と図４（ｃ）の平面図とを比較して明らかなように、実施例１の細胞チップ１００は１個の細胞を対象にしてバイオアッセイを行うのに対して、実施例２の細胞チップ２００は４×４個の細胞を配列してバイオアッセイを行うことを可能にしたものである。細胞チップ２００を培養皿に入れ、適当な培養液に浸した状態で、例えば、上皮細胞２０を細胞チップ２００の細胞固定基板４１上で培養すると、必然的に、細胞固定基板４１上に単層の細胞シートが構成される。図３は、破線で細胞チップ２００と培養された細胞シートが培養液の領域にあることをイメージとして示すとともに、細胞チップ２００の細胞固定基板４１上に単層の細胞シートが形成されている状態を断面図で示すものである。図３では、細孔４３を細胞配列のピッチに対応するように設けたものとしたが、細胞間隔（例えば、８μｍ）に比べて十分な密度、たとえば５μｍピッチで細孔４３を設ければ、細胞のサイズに係わらず、細胞固定基板４１上に構成された単層の細胞シートのほぼすべての細胞に細孔が配されることになる。勿論、細胞のサイズに対応した細孔４３が配置された細胞固定基板４１上に、予め、アガロースマイクロチャンバーアレーなどで一定間隔になるように細胞を培養してもよい。さらに、任意の細胞を配列して、細胞シートにしても良い。なお、図３の細胞２０に関して、２１で示すのは細胞二重膜、２２は細胞質、２３は細胞二重膜に存在するトランスポーターである。
【００３７】
まず、実施例２においても、顕微鏡で観察しながら、実施例１と同様に、側壁板６１，６２の突起６３，６４を介してバッファをバッファ室７１に供給する。培養皿の培養液に浸した電極５５とバッファ室７１内の電極５３との間の電気伝導度を監視していると、細胞２０による細胞シートがしっかりと細胞固定基板４１上に固定されていないときには、培養皿の培養液に浸されている電極５５とバッファ室８内に露出している電極５４とはバッファにより比較的電気伝導度が小さい。この状態では、突起６１，６２の貫通孔を介して、太い矢印で示すように、供給されるバッファを制御して、バッファの供給を上回る吸引をすることでバッファ室７１内を陰圧にすることにより、細胞シートは細胞固定基板４１上に固定される。
【００３８】
ここで、実施例１と同様に、バッファ室７１内にストレプトリシンＯを注入する。ストレプトリシンＯは細孔４３を介して、細胞２０の脂質二重層２１のうち細孔４３に接している部分に作用して、この部分のみを半透膜化する。これにより、細孔４３に対応する部分のみが半透膜とされた細胞を有する細胞チップが得られる。
【００３９】
以下、このようにして構成された、部分的な半透膜を有する細胞を固定した細胞チップ２００の使用法を説明する。
【００４０】
突起６１，６２の貫通孔を介して、太い矢印で示すように、特定のｍＲＮＡの一部である短鎖のＲＮＡをバッファ室７１内に流入させる。このＲＮＡの一部は細孔４３から半透膜を通して細胞２０内に取り込まれる。通常、ＲＮＡは、細胞２０内に導入された場合、ＲＮａｓｅの攻撃を受け速やかに消失する。しかし、実施例２の細胞チップ２００では、突起６１，６２の貫通孔から、連続的に、バッファ室７１内に新鮮なＲＮＡが供給されるから、細胞２０内のＲＮＡは細孔４３に細い矢印で示すように、半透膜を通して細胞２０とバッファ室７１とで平衡状態を形成する。このため、常に一定量のＲＮＡを細胞内に保持することができる。
【００４１】
このようにしてＲＮＡを細胞２０内に入れる前と入れた状態で、電極５４と５５の間の電流値をモニターする。細胞シートを構成する細胞に導入されたＲＮＡが細胞二重膜２１のトランスポーター２３に影響があるものであれば、細胞二重膜２１に存在するイオンチャンネルがカップルし、イオンの膜輸送に変動が現れ、電極５４と５５の間に電流が流れる。すなわち、細胞内に物質を導入し、それが細胞に与える影響をモニターできる。これはＲＮＡ以外にも、化学物質や、タンパク質の影響測定にも利用できる。
【００４２】
あるいは、ストレプトリシンＯに晒されない、培養皿側の細胞二重膜２１が存在する側で、培養液に種々の化学物質を添加し、トランスポーターを介してこれを細胞２０内に導入させ、それが細胞に影響を与える状況を電極５４，５５間の電位差などで知ることができる。すなわち、バイオアッセイが可能である。
【００４３】
あるいは、培養皿に白抜きの三角で示す化学物質を添加すると、トランスポーター２３を介して細胞内に化学物質が薄い塗りつぶしの三角で示すように取り込まれる。トランスポーター２３を貫く矢印は、化学物質が通過することをイメージするためのものである。取り込まれた化学物質は半透膜化した部分を通過し、細孔４３よりバッファ室７１に黒の塗りつぶしの三角として溶出する。これを突起６２の貫通孔を介して回収することにより、細胞の化学物質に対する反応を評価することができる。
【００４４】
本明細書において、生化学物質というのは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドなどのオリゴペプチド、タンパク質などのポリペプチド、核酸、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、単糖、２単糖やオリゴ糖、多糖類などの糖類、ステロイドなどのホルモン類、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンなどの神経伝達物質、そのほか内分泌攪乱剤、各種薬剤、カリウム、ナトリウム、塩化物イオン、水素イオンなど生命現象にかかわる物質一般を指す。このように生化学物質とは多種多様な性質を持つものである。したがって、これらの細胞に対する影響を、細胞に直接作用させて、評価できるのは、きわめて有用である。
【００４５】
たとえば、トランスポーターであるＳＬＣ６Ａ１を強制発現させた細胞で上記チップを作成するとγ−アミノ酪酸の検出に有用である。ＳＬＣ６Ａ２を強制発現したものはノルアドレナリン、ＳＬＣ６Ａ４ではセロトニン、の測定に利用できる。ＳＬＣＯ３Ａ１ではプロスタグランジン、ＳＬＣ６Ａ５ではグリシンの測定に利用できる。
【００４６】
さらに本発明のチップを用いると、物質を精製することができる。たとえば、ドーパミンのトランスポーターを上記手法により強制発現させた細胞を図３記載のチップ２００のようにチップ上にアレー状に整列させる。各細胞は細孔に接する部分だけ半透膜化している。チップにドーパミンやその誘導体などを含む試料溶液を添加し、電極５４と電極５５に電圧をかける。すると、目的のドーパミンあるいはその類似体が細胞膜を通過して回収される。まったく異なる構造のものは膜を通過しない。もちろん、その他の物質に対するトランスポーターを介して他の物質も回収されるが、関連するトランスポーターの数の差が大きいので実質的に目的物質が回収される。同様な精製をアミノ酸や糖などでも行うことができる。特に、トランスポーターに立体異性を識別できるようなものを強制発言させれば、たとえば、合成アミノ酸（ＤＬ混合物）からＬ体のみを少ないエネルギーで精製できる。
【００４７】
このように、本発明を用いれば、化学物質のアッセイのみならず、化学物質の精製などの物質生産に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１による細胞チップとその細孔部分に固定される細胞との関係の概要を示す断面図である。
【図２】（ａ）−（ｇ）は実施例１の細胞固定基板１を半導体技術を利用して形成する処理の概要を説明する図である。
【図３】実施例２による細胞チップとその細孔部分に固定される細胞との関係の概要を示す断面図である。
【図４】（ａ）−（ｄ）は実施例２の細胞固定基板４１を半導体技術を利用して形成する処理の概要を説明する図である。
【符号の説明】
【００４９】
１，４１…細胞固定基板（シリコン基板）、２…突起、３，４３…細孔、４，５…電極層、６，７…絶縁層、８，７１…バッファ室、１０，５１…背面板、１１，１２，１３，６３，６４…突起、１４，１５…キャピラリー、２０…細胞、２１…細胞の脂質二重層、３１，３４，３７…マスク、３２，３８…窓、３３…四角錐、３５，３６…凹部、５３…電極、５４…引き出し線、６１，６２…側壁板、１００，２００…細胞チップ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞機能を研究や細胞を用いる種々物質のバイオアッセイおよびそのための細胞チップ、細胞を用いる物質生産を目的とした細胞の制御方法および改変方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが頻繁に行われている。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている（非特許文献１あるいは非特許文献２）。あるいは、採取した試料に含まれる特定の配列のｍＲＮＡ（あるいはｃＤＮＡ）をＰＣＲ増幅して得られる産物の量やＰＣＲ産物長、塩基配列を調べる方法が用いられている。
【０００３】
これら分離したｍＲＮＡは単に分析目的で用いられる以外にこれをｃＤＮＡに変換し、ベクターに組み込んだりして色々の目的に利用されている。一例として言えば、採取したｍＲＮＡをベクターに組み込み、クローニングした後、ベクターを鋳型にして部分的に異なる塩基を持つプライマーで相補鎖合成し、任意の遺伝子改変を施す遺伝子組換えに用いられている。
【０００４】
細胞そのものをセンサーに見立てて、極微量物質を検出するバイオアッセイの研究も盛んである。特に、種々の有害物質の影響を調べたり、薬剤の薬効や副作用を調べるのは、現在はマウスなどの哺乳類個体に頼る部分が大きいが、今後、動物愛護の観点からも細胞ベースでのアッセイに移行することは時代の趨勢である。
【０００５】
別の観点からは、細胞を自由に機能制御し、有用物質を生産することや医療治療面へ応用することでもニーズが高い。実際、アンチセンスオリゴヌクレオチドやＲＮＡｉのように細胞外部からの操作により細胞を制御する試みが盛んになされるようになっている。
【０００６】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような、細胞を用いるアッセイや細胞機能制御に関しては、方法論的に万能な手法が存在しない。アッセイのためには、細胞を遺伝子組換えの技術を用いて特定物質を捕捉するレセプラーやトランスポーターを発現させ、これとイオンポンプをカップルさせて、電極を差し込み、細胞膜を流れる電流量として計測する。細胞機能制御に関しても原理は細胞内に制御用の物質を挿入し、細胞の活動をコントロールする。
【０００８】
ところが、細胞は安定な細胞膜で外界と仕切られており、実施者の都合で任意の物質を定量的に細胞に入れたり出したりすることは困難である。もちろん、金微粒子をビークルにして、その表面に、細胞内に挿入したいものをくっつけて、細胞に打ち込む技術など多くの技術が開発されているが、確実性と細胞内に取り込む物質量の再現性にはかなりのばらつきがあると考えてよい。
【０００９】
細胞膜を半透膜にする技術（swmi-contact cell: Molecular Biology of the Cell 11,3073-3087(2000)）、あるいは、ファゴトーシスやエンドサイトーシスを利用するのが有効な方法であると思われる。しかし、細胞膜を半透膜化すると細胞表面全体に穴が開いてしまい、細胞内の物質（細胞質）が細胞外に流れ出てしまう欠点がある。また、ファゴトーシスやエンドサイトーシスを利用する方法は即応性がないために、細胞機能の逐次制御という面では利用が難しい。
【００１０】
本発明のポイントは、細胞の内容物の流失を押さえ、確実に目的物質を細胞内に挿入したり、細胞内の物質を回収したりする技術を確立し、特定物質のアッセイや有用物質の生産をより容易にする技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従来の技術を改良し、細胞の逐次制御やアッセイを安定に行う方法に最も近いのは細胞膜を半透膜化する技術である。本発明では、細胞全体を半透膜化するのではなく、細胞のごく一部に限定することで細胞質の細胞外への流失を防ぎ、安定して細胞を利用できるようにする。
【００１２】
細胞の一部を半透膜化するため、細胞外径より小さい穴を開けた隔壁構造のチップを用いる。このチップの一面の細孔のある位置に細胞を固定し、他面から前記細孔を介して細胞の一部に、たとえば、ストレプトリシンＯのような細胞膜毒素を作用させ、細孔部分の細胞膜を半透膜化する。この半透膜部分を用いて細胞に物質の出し入れを行う。また、隔壁の内外に電極を設けることで、細胞膜を通過するイオンを計測したり、電極に電圧を印加することで細胞への物質の出し入れを強制的に行う。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、細胞膜の一部を半透膜化するに過ぎない。さらに、半透膜化した細胞膜部分は、平常は細胞膜と隔壁で区切られているため、細胞質は隔壁外に拡散しない。細胞を連続的に観測することや、逐次細胞内に物質を注入することもできる。しかも、半透膜における拡散のみで細胞内物質の出し入れが可能となる。外部から種々物質を加えられるので、タンパク質相互作用や遺伝子発現の制御か可能になり、細胞内で起きる生理現象を能動的に解析できる。隔壁の内外に電極を設けることで、細胞膜を通過するイオンを計測したり、物質の出し入れを強制的に行うことができる。パッチクランプによる細胞への物質の出し入れと比較して、格段に、安定な操作である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（実施例１）
図１は、実施例１による細胞チップとその細孔部分に固定される細胞との関係の概要を示す断面図である。
【００１５】
図１において、１００は細胞チップである。２０は細胞である。後述するように、細胞２０は細胞チップ１００の細孔３の部分に固定されている。
【００１６】
１は細胞チップ１００の細胞固定基板であり、例えば、シリコン基板から作られる。大きさは、例えば、図の高さ方向が５ｍｍ、図と垂直方向が５００μｍである。厚さは、例えば、１００μｍである。細胞固定基板１の一端部に突起２を形成する、この高さは、例えば、５μｍであり、突起２の部分の厚さは、例えば、２μｍである。突起２の頂部に細孔３を形成する。この大きさは、例えば、２〜５μｍφである。細胞固定基板１の下部の両面に電極層４，５が形成されている。電極層４，５は絶縁層６，７で大部分が覆われているが、突起２の近辺と細胞固定基板１の端部近辺では露出している。
【００１７】
１０は背面板であり、細胞固定基板１の突起２の背面部にバッファ室８を形成するために、突起２の背面部全体を覆う形で貼り付けられる。背面板１０の厚さは、全体としては、例えば、１００μｍであるが、図に示すように、細胞固定基板１側の面の細孔３に対応する位置に突起１１が形成され、外側面の突起１１の両端に位置に貫通孔を有する突起１２，１３が形成される。突起１２，１３には、キャピラリー１４，１５を取り付けることができ、これに、マイクロシリンジポンプ（図示しない）に連結することができる。このキャピラリー１４，１５を利用して、太い矢印で示すように、バッファ室８内にバッファを循環させ、あるいは、バッファの供給を上回る吸引をすることで、バッファ室８の内部を陰圧状態とすることができる。突起１１は、供給されたバッファの流れを乱し、細孔３の方に流れるようにするために設けられる。
【００１８】
図が煩雑になるので、顕微鏡関係の図示は省略したが、顕微鏡の観察ガラス板の上に細胞培養に適したバッファの液滴を滴下し、この液滴中に細胞固定基板１の突起２と細胞２０を対向して配置する。この際、顕微鏡で観察しながら、細胞２０を突起２の細孔３の部分に向き合う形に置く。２１は細胞２０の脂質二重層であり、２２は細胞質を表わす。図１において、細胞固定基板１の突起２と細胞２０を取り囲む破線は液滴に浸漬されている領域のイメージを示す。破線が取り囲む領域にはバッファ室８が含まれた形となっているが、後述するように、細胞２０が細胞固定基板１に固定された状態では、バッファ室８は、液滴とは繋がらないものとなる。一方、液滴の範囲外にある細胞固定基板１の端部で露出している電極層４，５には導線が接続され、引き出されて図示しない計測器、あるいは、計算機に接続される。
【００１９】
顕微鏡で観察しながら、細胞２０を突起２の細孔３に接触させる。このとき、前述した電極層４，５間の電気伝導度を監視していると、細胞２０が突起２の細孔３に接触する前は、バッファ室８内に露出している電極層５と液滴内に露出している電極層４とはバッファにより短絡状態であるのに対して、接触した後は、細孔３が細胞２０の脂質二重層２１で塞がれるので、実質的に絶縁状態になるので、細胞接触を確認できる。細胞接触が確認されたら、突起１２，１３に連結されたキャピラリー１４，１５によるバッファの供給を制御して、バッファの供給を上回る吸引をすることでバッファ室８内を陰圧にすることにより、細胞２０は細孔３にしっかりと固定される。
【００２０】
次に、背面板１０の突起１２，１３に取り付けられたキャピラリー１４，１５に連結されているマイクロシリンジポンプを用いて、バッファ室８内にストレプトリシンＯを注入する。ストレプトリシンＯは細孔３を介して、細胞２０の脂質二重層２１のうち細孔３に接している部分に作用して、この部分のみを半透膜化する。半透膜化とは細胞骨格は残っているが、脂質二重層２１に穴が開いた状態である。ストレプトリシンＯの反応条件は、例えば、Fumi Kano, Y. Sako et al、Reconstraction of Brefeldin A-induced Golgi Tubulation and Fusion with the Endoplasmic Reticulum in Semi-Intact Chinese Hamster, Molecular Biology of the Cell 11,3073-3087(2000)に開示されている技術をベースに細胞の種類に応じて改変する。たとえば、卵巣細胞ではストレプトリシンＯ（６０ｎｇ／ｍｌ）、１１５ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ ＥＧＴＡを含むｐＨ７．４の２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で４℃１０分間である。その後、１１５ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ ＥＧＴＡを含むｐＨ７．４の２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（３２℃）で洗浄する。この間、細胞２０は、液滴のバッファ内にあるので細胞２０へのダメージは少ない。
【００２１】
以下、このようにして構成された、部分的な半透膜を有する細胞を固定した細胞チップ１００の使用法を説明する。
【００２２】
キャピラリー１４から、特定のｍＲＮＡの一部である短鎖のＲＮＡをバッファ室８内に流入させる。このＲＮＡの一部は細孔３から半透膜を通して細胞２０内に取り込まれる。通常、ＲＮＡは、細胞２０内に導入された場合、ＲＮａｓｅの攻撃を受け速やかに消失する。しかし、実施例１の細胞チップ１００では、キャピラリー１４から、連続的に、バッファ室８内に新鮮なＲＮＡが供給されるから、細胞２０内のＲＮＡは細孔３に細い矢印で示すように、半透膜を通して細胞２０とバッファ室８とで平衡状態を形成する。このため、常に一定量のＲＮＡを細胞内に保持することができる。これはＲＮＡに限らず、ＤＮＡないしＲＮＡないしそれらの誘導体でも同様である。
【００２３】
このようにしてＲＮＡを細胞２０内に入れる前と入れた状態で、電極４と５の間の電流値をモニターする。細胞に導入されたＲＮＡが細胞二重膜２１のトランスポーターに影響があるものであれば、細胞二重膜２１に存在するイオンチャンネルがカップルし、イオンの膜輸送に変動が現れ、電極４と５の間に電流が流れる。すなわち、細胞内に物質を導入し、それが細胞に与える影響をモニターできる。これはＲＮＡ以外にも、化学物質や、タンパク質の影響測定にも利用できる。
【００２４】
あるいは、ストレプトリシンＯに晒されない、液滴側の細胞二重膜２１が存在する側で、液滴に種々の化学物質を添加し、トランスポーターを介してこれを細胞２０内に導入させ、それが細胞に影響を与える状況を電極４，５間の電位差などで知ることができる。すなわち、バイオアッセイが可能である。
【００２５】
図２（ａ）−（ｇ）は実施例１の細胞固定基板１を半導体技術を利用して形成する処理の概要を説明する図である。図２（ａ）−（ｇ）は左側に断面図、右側にそれに対応する平面図を示す。
【００２６】
まず、図２（ａ）に示すように、所定の結晶軸を持つシリコン基板１を準備し、その一面にマスク３１を施し、突起３を作成する位置に、マスク３１を除去した窓３２を形成する。図２（ｂ）に示すように、エッチング処理をして、四角錐３３に対応する部分を除去する。次に、図２（ｃ）に示すように、マスク３１を除去し、シリコン基板１の他面にマスク３４を施し、突起３を作成する位置に、マスク３４を除去した窓を形成しこれにより断面三角の凹部３５，３６を形成する。凹部３５，３６は、平面図から分かるように、四角錐３３に対応する連続した凹部である。次に、図２（ｄ）に示すように、凹部３５,３６で囲まれた位置に、マスク３７を設けて、窓３８を開ける。次に、図２（ｅ）に示すように、この窓３８を利用して基板１の対応部分に細孔３を開ける。このとき、併せて、凹部３５,３６の周辺部の基板１にもエッチングを施して突起２を形成する。次に、図２（ｆ）に示すように、基板１の突起２のある面に電極４を形成する。この電極４はアルミの蒸着層とする。次に、図２（ｇ）に示すように、電極４の両端部を除く、ほぼ全面をポリイミドの絶縁層６で覆う。次いで、基板１の他の面に電極５を形成する。この電極５は白金の蒸着層とし、電極５の両端部を除く、ほぼ全面をポリイミドの絶縁層７で覆う。かくして、細胞チップ１００の細胞固定基板１が形成される。ここでは、半導体技術に関する詳細なデータは省略したが、当業者は容易に実施できる。
【００２７】
同様にして、背面板１０も半導体技術によるシリコン基板の加工により形成することができる。そして、細胞固定基板１と背面板１０とを貼り合わせて、細胞チップ１００が構成される。
【００２８】
（実施例２）
実施例１は単一の細胞を細胞チップの細孔部分に固定し、細孔部分の細胞膜のみを半透膜化してバイオアッセイの可能な細胞チップを説明した。しかしながら、多細胞生物においては、細胞は単独で機能しているケースはまれで、周囲の細胞と強調しながら全体として機能している。このような多細胞系はお互いに種々化学物質を用いて情報のやり取りを行っているものと考えられる。多くの場合このような化学物質は微量で、生きた細胞からの逐次解析は困難なのが実情である。実施例２では、周囲の細胞と協調しながら全体として機能している細胞群について、模擬的に、バイオアッセイを可能とする細胞チップを提案する。実施例２でも、細胞を実施例１の細孔部分に固定し、細孔部分の細胞膜のみを半透膜化してバイオアッセイのを可能とするものである点においては、実施例１と同じである。
【００２９】
図３は、実施例２による細胞チップとその細孔部分に固定される細胞との関係の概要を示す断面図である。
【００３０】
図３において、２００は実施例２による細胞チップであり、細胞固定基板４１と背面板５１および側壁板６１，６２より構成される。なお、側壁板は図示されていない紙面の背後方向および手前方向にも設けられる。これらで囲われた空間は、実施例１と同様、バッファ室７１を形成する。
【００３１】
細胞固定基板４１には細孔４３が形成される。これらは、実施例１の細胞固定基板１、細孔３と対応する。実施例２の細胞固定基板４１は、実施例１の細胞固定基板１と異なり、突起２は形成されておらず、多数の細孔３が形成されている。これは、細胞固定基板４１の面上に、多数の細胞を配列させ、これらの細胞同士で協調しながら全体として機能している細胞群を構成させるためである。図の例では、４個の細孔４３が構成されている例が示されているが、これをもっと多くすることは容易である。細胞固定基板４１は、例えば、全体の大きさは１０×１０ｍｍ程度である。厚さは、例えば、１００μｍである。細孔４３は２ないし５μｍφとし、これを８μｍピッチで配列する。細胞固定基板４１の細孔３の位置には、それぞれ、細胞２０が配列される。すなわち、細胞２０が８μｍピッチで配列される。
【００３２】
背面板５１は、細胞固定基板４１と同一の大きさで、細胞固定基板４１に対向して、例えば、１ｍｍ離して配置される。細胞固定基板４１と背面板５１とは、側壁板６１，６２および図示されていない紙面の背後方向および手前方向の側壁板により、所定の位置関係に保持されるとともに、これらによって囲われた空間をバッファ室７１とする。側壁板６１，６２には、実施例１と同様、貫通孔を有する突起６３，６４が形成される。突起６３，６４には、キャピラリー（図示しない）を取り付けることができ、これを、マイクロシリンジポンプ（図示しない）に連結することができ、バッファ等を供給することができる。背面板５１には、細孔４３に対応する位置に突起５２が形成される。この突起５２は、実施例１の突起１１と同様、バッファ室７１供給されたバッファの流れを乱し、細孔４３の方に流れるようにするために設けられる。また、背面板５１のバッファ室７１内の面には電極５３が設けられる。電極５３の引き出し線５４は絶縁線とされて、バッファ室７１の外部に引き出される。
【００３３】
図４（ａ）−（ｄ）は実施例２の細胞固定基板４１を半導体技術を利用して形成する処理の概要を説明する図である。図４（ａ）−（ｃ）は左側に断面図、右側にそれに対応する平面図を示す。図４（ｄ）の平面図は図４（ｃ）のそれと同じであるので、省略した。
【００３４】
まず、図４（ａ）に示すように、所定の結晶軸を持つシリコン基板１を準備し、その一面にマスク３１を施し、細孔３を作成する位置の凹部に、マスク３１を除去した窓３２を形成する。図４（ｂ）に示すように、エッチング処理をして、四角錐３３に対応する部分を除去する。次に、図４（ｃ）に示すように、マスク３１を除去し、シリコン基板１の他面にマスク３４を施し、細孔４３を作成する位置に、マスク３４を除去した窓３５を形成する。図４（ｄ）に示すように、エッチング処理をして、細孔４３を形成する。かくして、細胞チップ２００の細胞固定基板４１が形成される。ここでは、半導体技術に関する詳細なデータは省略したが、当業者は容易に実施できる。
【００３５】
同様にして、背面板５１、側壁板６１，６２も半導体技術によるシリコン基板の加工により形成することができる。そして、細胞固定基板４１と背面板５１および側壁板６１，６２とを貼り合わせて、細胞チップ２００が構成される。
【００３６】
図２（ｇ）の平面図と図４（ｃ）の平面図とを比較して明らかなように、実施例１の細胞チップ１００は１個の細胞を対象にしてバイオアッセイを行うのに対して、実施例２の細胞チップ２００は４×４個の細胞を配列してバイオアッセイを行うことを可能にしたものである。細胞チップ２００を培養皿に入れ、適当な培養液に浸した状態で、例えば、上皮細胞２０を細胞チップ２００の細胞固定基板４１上で培養すると、必然的に、細胞固定基板４１上に単層の細胞シートが構成される。図３は、破線で細胞チップ２００と培養された細胞シートが培養液の領域にあることをイメージとして示すとともに、細胞チップ２００の細胞固定基板４１上に単層の細胞シートが形成されている状態を断面図で示すものである。図３では、細孔４３を細胞配列のピッチに対応するように設けたものとしたが、細胞間隔（例えば、８μｍ）に比べて十分な密度、たとえば５μｍピッチで細孔４３を設ければ、細胞のサイズに係わらず、細胞固定基板４１上に構成された単層の細胞シートのほぼすべての細胞に細孔が配されることになる。勿論、細胞のサイズに対応した細孔４３が配置された細胞固定基板４１上に、予め、アガロースマイクロチャンバーアレーなどで一定間隔になるように細胞を培養してもよい。さらに、任意の細胞を配列して、細胞シートにしても良い。なお、図３の細胞２０に関して、２１で示すのは細胞二重膜、２２は細胞質、２３は細胞二重膜に存在するトランスポーターである。
【００３７】
まず、実施例２においても、顕微鏡で観察しながら、実施例１と同様に、側壁板６１，６２の突起６３，６４を介してバッファをバッファ室７１に供給する。培養皿の培養液に浸した電極５５とバッファ室７１内の電極５３との間の電気伝導度を監視していると、細胞２０による細胞シートがしっかりと細胞固定基板４１上に固定されていないときには、培養皿の培養液に浸されている電極５５とバッファ室８内に露出している電極５４とはバッファにより比較的電気伝導度が小さい。この状態では、突起６１，６２の貫通孔を介して、太い矢印で示すように、供給されるバッファを制御して、バッファの供給を上回る吸引をすることでバッファ室７１内を陰圧にすることにより、細胞シートは細胞固定基板４１上に固定される。
【００３８】
ここで、実施例１と同様に、バッファ室７１内にストレプトリシンＯを注入する。ストレプトリシンＯは細孔４３を介して、細胞２０の脂質二重層２１のうち細孔４３に接している部分に作用して、この部分のみを半透膜化する。これにより、細孔４３に対応する部分のみが半透膜とされた細胞を有する細胞チップが得られる。
【００３９】
以下、このようにして構成された、部分的な半透膜を有する細胞を固定した細胞チップ２００の使用法を説明する。
【００４０】
突起６１，６２の貫通孔を介して、太い矢印で示すように、特定のｍＲＮＡの一部である短鎖のＲＮＡをバッファ室７１内に流入させる。このＲＮＡの一部は細孔４３から半透膜を通して細胞２０内に取り込まれる。通常、ＲＮＡは、細胞２０内に導入された場合、ＲＮａｓｅの攻撃を受け速やかに消失する。しかし、実施例２の細胞チップ２００では、突起６１，６２の貫通孔から、連続的に、バッファ室７１内に新鮮なＲＮＡが供給されるから、細胞２０内のＲＮＡは細孔４３に細い矢印で示すように、半透膜を通して細胞２０とバッファ室７１とで平衡状態を形成する。このため、常に一定量のＲＮＡを細胞内に保持することができる。
【００４１】
このようにしてＲＮＡを細胞２０内に入れる前と入れた状態で、電極５４と５５の間の電流値をモニターする。細胞シートを構成する細胞に導入されたＲＮＡが細胞二重膜２１のトランスポーター２３に影響があるものであれば、細胞二重膜２１に存在するイオンチャンネルがカップルし、イオンの膜輸送に変動が現れ、電極５４と５５の間に電流が流れる。すなわち、細胞内に物質を導入し、それが細胞に与える影響をモニターできる。これはＲＮＡ以外にも、化学物質や、タンパク質の影響測定にも利用できる。
【００４２】
あるいは、ストレプトリシンＯに晒されない、培養皿側の細胞二重膜２１が存在する側で、培養液に種々の化学物質を添加し、トランスポーターを介してこれを細胞２０内に導入させ、それが細胞に影響を与える状況を電極５４，５５間の電位差などで知ることができる。すなわち、バイオアッセイが可能である。
【００４３】
あるいは、培養皿に白抜きの三角で示す化学物質を添加すると、トランスポーター２３を介して細胞内に化学物質が薄い塗りつぶしの三角で示すように取り込まれる。トランスポーター２３を貫く矢印は、化学物質が通過することをイメージするためのものである。取り込まれた化学物質は半透膜化した部分を通過し、細孔４３よりバッファ室７１に黒の塗りつぶしの三角として溶出する。これを突起６２の貫通孔を介して回収することにより、細胞の化学物質に対する反応を評価することができる。
【００４４】
本明細書において、生化学物質というのは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドなどのオリゴペプチド、タンパク質などのポリペプチド、核酸、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、単糖、２単糖やオリゴ糖、多糖類などの糖類、ステロイドなどのホルモン類、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンなどの神経伝達物質、そのほか内分泌攪乱剤、各種薬剤、カリウム、ナトリウム、塩化物イオン、水素イオンなど生命現象にかかわる物質一般を指す。このように生化学物質とは多種多様な性質を持つものである。したがって、これらの細胞に対する影響を、細胞に直接作用させて、評価できるのは、きわめて有用である。
【００４５】
たとえば、トランスポーターであるＳＬＣ６Ａ１を強制発現させた細胞で上記チップを作成するとγ−アミノ酪酸の検出に有用である。ＳＬＣ６Ａ２を強制発現したものはノルアドレナリン、ＳＬＣ６Ａ４ではセロトニン、の測定に利用できる。ＳＬＣＯ３Ａ１ではプロスタグランジン、ＳＬＣ６Ａ５ではグリシンの測定に利用できる。
【００４６】
さらに本発明のチップを用いると、物質を精製することができる。たとえば、ドーパミンのトランスポーターを上記手法により強制発現させた細胞を図３記載のチップ２００のようにチップ上にアレー状に整列させる。各細胞は細孔に接する部分だけ半透膜化している。チップにドーパミンやその誘導体などを含む試料溶液を添加し、電極５４と電極５５に電圧をかける。すると、目的のドーパミンあるいはその類似体が細胞膜を通過して回収される。まったく異なる構造のものは膜を通過しない。もちろん、その他の物質に対するトランスポーターを介して他の物質も回収されるが、関連するトランスポーターの数の差が大きいので実質的に目的物質が回収される。同様な精製をアミノ酸や糖などでも行うことができる。特に、トランスポーターに立体異性を識別できるようなものを強制発言させれば、たとえば、合成アミノ酸（ＤＬ混合物）からＬ体のみを少ないエネルギーで精製できる。
【００４７】
このように、本発明を用いれば、化学物質のアッセイのみならず、化学物質の精製などの物質生産に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１による細胞チップとその細孔部分に固定される細胞との関係の概要を示す断面図である。
【図２】（ａ）−（ｇ）は実施例１の細胞固定基板１を半導体技術を利用して形成する処理の概要を説明する図である。
【図３】実施例２による細胞チップとその細孔部分に固定される細胞との関係の概要を示す断面図である。
【図４】（ａ）−（ｄ）は実施例２の細胞固定基板４１を半導体技術を利用して形成する処理の概要を説明する図である。
【符号の説明】
【００４９】
１，４１…細胞固定基板（シリコン基板）、２…突起、３，４３…細孔、４，５…電極層、６，７…絶縁層、８，７１…バッファ室、１０，５１…背面板、１１，１２，１３，６３，６４…突起、１４，１５…キャピラリー、２０…細胞、２１…細胞の脂質二重層、３１，３４，３７…マスク、３２，３８…窓、３３…四角錐、３５，３６…凹部、５３…電極、５４…引き出し線、６１，６２…側壁板、１００，２００…細胞チップ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能としたことを特徴とする細胞チップ。
【請求項２】
前記細胞固定基板の細胞を固定するための面の前記細孔の位置に液滴を付加して細胞を固定した場合に、前記液滴と前記バッファ室との間の電気伝導度あるいは流れる電流を計測するための電極を備える請求項１記載の細胞チップ。
【請求項３】
前記電極が前記細胞固定基板の両面に形成されている請求項２記載の細胞チップ。
【請求項４】
前記細孔を複数個有し、細孔間の間隔が前記細胞固定基板に固定される細胞の間隔より小さいものとされた請求項１または２記載の細胞チップ。
【請求項５】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能とされた細胞チップの前記細胞固定基板に固定された細胞をバッファ液中に置き、前記バッファ室にストレプトリシンＯを供給して前記細孔の位置の細胞の脂質二重膜を半透膜化することを特徴とする細胞改変方法。
【請求項６】
前記ストレプトリシンＯの供給後、前記バッファ室に任意のＤＮＡないしＲＮＡないしそれらの誘導体を添加する請求項５記載の細胞改変方法。
【請求項７】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能とされた細胞チップの前記細胞固定基板に固定された細胞をバッファ液中に置き、前記バッファ室にストレプトリシンＯを供給して前記細孔の位置の細胞の脂質二重膜を半透膜化して細胞を改変し、該改変された細胞の周囲のバッファに任意の化学物質を添加し、前記細胞の脂質二重膜を通り抜ける化学物質を前記半透膜化している脂質二重膜より前記バッファ室に取り出すことを特徴とする化学物質取り出し方法。
【請求項８】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室中と前記細胞を固定するための面側に電極が設けられ、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能とされた細胞チップの前記細胞固定基板に固定された細胞をバッファ液中に置き、前記バッファ室にストレプトリシンＯを供給して前記細孔の位置の細胞の脂質二重膜を半透膜化して細胞を改変し、バッファ室より任意の膜タンパク質をコードするｍＲＮＡないし前記ｍＲＮＡ配列をコードしたベクターを細胞内に添加することで任意のペプチドを発現させた細胞チップを準備し、該改変された細胞の周囲のバッファに任意の化学物質を添加し、前記膜タンパク質に親和する化学物質を前記電極で検出することを特徴とする細胞チップ。
【請求項９】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室中と前記細胞を固定するための面側に電極が設けられ、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能とされた細胞チップの前記細胞固定基板に固定された細胞をバッファ液中に置き、前記バッファ室にストレプトリシンＯを供給して前記細孔の位置の細胞の脂質二重膜を半透膜化して細胞を改変し、前記電極間に電圧を印加し、前記固定された細胞を通過する化学物質を前記バッファ室から連続して回収する構造の細胞チップ。
【請求項１】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能としたことを特徴とする細胞チップ。
【請求項２】
前記細胞固定基板の細胞を固定するための面の前記細孔の位置に液滴を付加して細胞を固定した場合に、前記液滴と前記バッファ室との間の電気伝導度あるいは流れる電流を計測するための電極を備える請求項１記載の細胞チップ。
【請求項３】
前記電極が前記細胞固定基板の両面に形成されている請求項２記載の細胞チップ。
【請求項４】
前記細孔を複数個有し、細孔間の間隔が前記細胞固定基板に固定される細胞の間隔より小さいものとされた請求項１または２記載の細胞チップ。
【請求項５】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能とされた細胞チップの前記細胞固定基板に固定された細胞をバッファ液中に置き、前記バッファ室にストレプトリシンＯを供給して前記細孔の位置の細胞の脂質二重膜を半透膜化することを特徴とする細胞改変方法。
【請求項６】
前記ストレプトリシンＯの供給後、前記バッファ室に任意のＤＮＡないしＲＮＡないしそれらの誘導体を添加する請求項５記載の細胞改変方法。
【請求項７】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能とされた細胞チップの前記細胞固定基板に固定された細胞をバッファ液中に置き、前記バッファ室にストレプトリシンＯを供給して前記細孔の位置の細胞の脂質二重膜を半透膜化して細胞を改変し、該改変された細胞の周囲のバッファに任意の化学物質を添加し、前記細胞の脂質二重膜を通り抜ける化学物質を前記半透膜化している脂質二重膜より前記バッファ室に取り出すことを特徴とする化学物質取り出し方法。
【請求項８】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室中と前記細胞を固定するための面側に電極が設けられ、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能とされた細胞チップの前記細胞固定基板に固定された細胞をバッファ液中に置き、前記バッファ室にストレプトリシンＯを供給して前記細孔の位置の細胞の脂質二重膜を半透膜化して細胞を改変し、バッファ室より任意の膜タンパク質をコードするｍＲＮＡないし前記ｍＲＮＡ配列をコードしたベクターを細胞内に添加することで任意のペプチドを発現させた細胞チップを準備し、該改変された細胞の周囲のバッファに任意の化学物質を添加し、前記膜タンパク質に親和する化学物質を前記電極で検出することを特徴とする細胞チップ。
【請求項９】
一つの面を細胞を固定するための面とした細胞固定基板、該基板の細胞固定部分に設けられた細胞より小さい径の細孔、前記細胞固定基板の前記細孔の位置で細胞を固定するための面の裏面に構成されたバッファ室を備え、前記バッファ室中と前記細胞を固定するための面側に電極が設けられ、前記バッファ室にはバッファ等の液体を連続的に供給可能とされた細胞チップの前記細胞固定基板に固定された細胞をバッファ液中に置き、前記バッファ室にストレプトリシンＯを供給して前記細孔の位置の細胞の脂質二重膜を半透膜化して細胞を改変し、前記電極間に電圧を印加し、前記固定された細胞を通過する化学物質を前記バッファ室から連続して回収する構造の細胞チップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１２９７９８（Ｐ２００６−１２９７９８Ａ）
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３２３３９５（Ｐ２００４−３２３３９５）
【出願日】平成１６年１１月８日（２００４．１１．８）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月８日（２００４．１１．８）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
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