細胞保護剤を得るための３，５−セコ−４−ノル−コレスタン誘導体の使用
本発明は、神経保護剤、特に心臓保護剤又は肝臓保護剤を除いて、細胞保護薬物を得るための３，５−セコ−４−ノル−コレスタン誘導体の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経保護剤を除いて、細胞保護剤を得るための３，５−セコ−４−ノル−コレスタン誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞変性プロセスは、多くの場合、望ましくない細胞活性及び細胞死を引き起こす細胞の機能障害によって特徴付けられる。
【０００３】
細胞は、ストレスに反応して適応機能を発生させ、それらの寿命を伸ばし、又は細胞死を遅延若しくは阻害する（細胞保護機構）。
【０００４】
しかしながら、これらの細胞保護機構は、ある場合には不十分であり、不適切であり、又は非常に遅くなって誘導されるため、有効でなく、細胞が死滅する。したがって、細胞保護を促進する新規な細胞保護剤を有することに関心が高いことが分かってきた。
【０００５】
用語「細胞保護」は、細胞死、特に病的な細胞死及び／又は細胞死へ導く細胞の機能障害に対して細胞を保護する自然力又は保護しない能力を意味する。これらの細胞の機能障害は、例えば、ＡＴＰを発生させる能力の減少、カルシウムを捕捉及び／又は保持する無能力、又はフリーラジカルの発生などのミトコンドリア起源のものであってもよい。細胞死の主要なメカニズムの中では、壊死、アポトーシス、及びネクロトーシスで本質的に区別がなされている。
【０００６】
壊死は、組織に障害がある場合に起こるいわゆる「偶発的な」細胞死である。細胞のホメオスタシスの変化を引き起こす、大部分に影響を及ぼされるのは、細胞の原形質膜である。細胞は、それらの原形質膜の溶解を引き起こすまで水を吸収する。この細胞溶解は、周囲の培地に細胞質成分の放出をもたらす。壊死は、炎症過程を起源とする。
【０００７】
壊死は、一連の細胞又は組織に影響を及ぼし、他の隣接する部分は生存し続ける。結果としての変形は、細胞又は組織の変化である。換言すれば、壊死は、細胞が、臓器での血液供給の中断又は減少、高熱（温度の有意な上昇）、化合物による中毒、身体的衝撃などの重大な事象の結果としてその生命の終端に到達する場合に起こる形態的変化によって定義される。最も知られている壊死の１つは、冠状動脈の閉塞（妨害）による梗塞（心筋での血流供給の阻害）過程での心筋のものである。
【０００８】
アポトーシスは、生物の正常な生理学の不可欠な部分である。それは、細胞死の非常に制御された生理学的形態であり、例えば細胞生物の生存に不可欠である。アポトーシスは、胚形成過程で根本的な役割を果たすプロセスである。
【０００９】
アポトーシスにある細胞、即ちアポトーシスを起こした細胞は、それ自体、他の細胞から区別される。アポトーシスは、通常、組織中の個々の細胞に関係し、炎症を引き起こさない。アポトーシスの特徴的な形態学的ポイントの１つは、細胞容積の有意な減少を誘導する核及び細胞質の両方の有意な凝縮である。次に、核は断片化し、各断片は、二重エンベロープによって取り囲まれる。その後、アポトーシス小体は（細胞質及び核のエレメント）が放出され、隣接する細胞によるファゴサイトシーシスを介して吸収される。
【００１０】
アポトーシスは、様々な方法で誘導され得る。例えば、放射線、化合物又はホルモンの存在は、細胞におけるアポトーシスイベントのカスケードを誘導し得る刺激物である。細胞内のシグナル、例えば不完全な有糸分裂又はＤＮＡ損傷もアポトーシスを誘導し得る。
【００１１】
アポトーシスはまた、遺伝毒性物質の作用後又は疾患中に起こる。ある種の病原体は、ある種の細胞群の喪失を引き起こす異常なアポトーシス、例えば肝毒性、網膜症、心臓毒性によって特徴付けられる。
【００１２】
したがって、生理学的なアポトーシスと病的なアポトーシスとは区別される。本発明は、病的アポトーシスに焦点が当てられる。
【００１３】
例えば、壊死とアポトーシスの特徴をもつネクロトーシスなどの細胞死の他のメカニズムも存在する。ネクロトーシスによって死にかかっている細胞は、壊死によって死にかかっている細胞と同様の特徴を有するが、このメカニズムの生化学的段階は、アポトーシスとより類似している。細胞死のこのメカニズムは、例えば、虚血において発生する。
【発明の開示】
【００１４】
したがって、本発明の目的の１つはまた、利用可能な新規な薬物を作製することであって、それを用いて、壊死及び／又は病的アポトーシス及び／又はネクロトーシスの予防及び／又は治療を可能にし得る（抗壊死剤及び／又は抗アポトーシス剤及び／又は抗ネクロトーシス剤）。
【００１５】
細胞の変性過程は、とりわけ、変性弛緩又は作用、外傷又は種々の因子への曝露の条件で分類される病的な刺激に起因する場合がある。
【００１６】
これらの外傷及び因子には、例えば、照射（ＵＶ、γ線照射）、低酸素又は酸素欠乏、栄養素の欠如、増殖因子の欠如、毒物、細胞毒素、衰弱、環境毒素、フリーラジカル、反応性酸素又はさらにある種の医療イベント及び／又は処置、例えば細胞、組織及び臓器移植を含む外科的外傷が含まれ得る。また、化合物又は生物薬物が言及され、例えば細胞増殖抑制剤又は抗炎症剤などの医療処置の範囲にある治療薬として用いられる場合がある。
【００１７】
本発明の目的は、細胞死ではるが、実際には病理過程の細胞レベル又は該病原体の細胞レベルでの結果に至る病原体又は変性過程の細胞外の原因を処置すること、特に該結果に対する細胞を保護することではない。
【００１８】
変性過程によって特徴付けられる最も有意な病的状態のうち、本発明が指向していない神経障害又は神経変性障害以外であって、下記の状態が見出される：
骨、関節、結合組織の疾患、軟骨の疾患、例えば、骨粗鬆症、骨髄炎、例えば骨関節炎、関節リウマチ及び乾癬性関節炎を含む関節炎、虚血壊死、進行性骨化性線維形成異常症、くる病、クッシング症候群；
【００１９】
筋疾患、例えば筋ジストロフィー、例えばデュシェーヌ筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、ミオパシー及び筋無力症；
【００２０】
皮膚疾患、例えば皮膚炎、湿疹、乾癬、老化又はさらに瘢痕化の変化；
心臓血管疾患、例えば心虚血及び／又は血管虚血、心筋梗塞、虚血性心臓病、慢性又は急性うっ血性心不全、不整脈、心房細動、心室細動、発作性頻脈、うっ血性心不全、肥大性心臓病、酸素欠乏症、低酸素症、抗癌剤を用いた治療による副次的効果；
【００２１】
循環器疾患、例えばアテローム性動脈硬化症、動脈硬化症及び末梢血管疾患、脳血管発作、動脈瘤；
【００２２】
血液疾患及び血管疾患、例えば貧血、血管アミロイドーシス、出血、鎌形赤血球症、赤血球断片化症候群、神経減少症、白血球減少症、骨髄無形成症、全血球減少症、トロンボ血球減少症、血友病；
【００２３】
肺疾患、例えば肺炎、喘息；例えば慢性気管支炎及び肺気腫などの肺の閉塞性慢性疾患；
胃腸管疾患、例えば潰瘍；
【００２４】
肝臓の疾患、例えば肝炎、特にウイルス起源の肝炎又は原因物質として他の感染物質を有するもの、自己免疫肝炎、劇症肝炎、ある種の遺伝性代謝疾患、ウィルソン病、肝硬変、非アルコール性脂肪肝、毒素及び薬物による肝臓の疾患；
【００２５】
膵臓疾患、例えば急性又は慢性膵炎；
代謝疾患、例えば真性糖尿病及び尿崩症、甲状腺炎；
腎臓疾患、例えば急性腎障害又は糸球体腎炎；
【００２６】
ウイルス性及び細菌性感染、例えば敗血症；
化合物、毒素又は薬物による重篤な中毒；
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と関連した変性疾患；
【００２７】
老化と関連した障害、例えば促進老化の症候群；
炎症性疾患、例えばクローン病、リウマチ様多発性関節炎；
自己免疫疾患、例えば紅斑性狼瘡；
【００２８】
歯科障害、例えば歯周炎などの組織変性に帰着するもの；
眼科疾患又は障害、例えば糖尿病性網膜症、緑内障、黄斑変性症、網膜変性、網膜症、色素変性症、網膜裂孔又は裂傷、網膜剥離、網膜虚血、外傷に関連した急性網膜症、炎症性変性、術後合併症、薬剤性網膜症、白内障；
【００２９】
聴覚管の障害、例えば耳硬化症及び抗生物質によって誘導された難聴；
ミトコンドリアに関連した疾患（ミトコンドリア病）、例えばフリードリッヒ運動失調症、構造的ミトコンドリア異常を伴う先天型筋ジストロフィー症、ある種のミオパシー（ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥＲＦＦ症候群、パーキンソン症候群）、ＭＩＤＤ（ミトコンドリア糖尿病及び難聴）症候群、ウォルフラム症候群、ジストニア。
【００３０】
本発明はまた、移植前、移植中（摘出、輸送及び／又は再移植）又は移植後のいずれかで細胞、組織及び／又は臓器を保護することを対象とする。
【００３１】
薬理学的に活性な化合物は、上述した変性過程を調節するためになお探求される。
本発明は、細胞保護化合物に対するこの要求を満たす。実際に、本出願人は、３，５−セコ−４−ノルコレスタン誘導体、及び、特に３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール及びそのエステルが顕著な細胞保護特性を持って提供される。
【００３２】
これは、本発明の目的が式Ｉ：
【００３３】
【化１】
【００３４】
（式中、
Ｘ及びＹは一緒になって、ケトン基（＝Ｏ）、オキシム貴（＝ＮＯＨ）又はメチルオキシム基（＝ＮＨＯＭｅ）を表すか、又はＸはヒドロキシルを表し、Ｙは水素原子を表し；
Ｂは、ヒドロキシルラジカルを表し、Ｃ及びＤは、同一であるか又は異なっていて、水素原子又は１〜４個の炭素原始を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルラジカルを表し；
又はＢ及びＣは一緒になって、ケトン基を表し、Ｄはメチル、ヒドロキシ若しくはメチルアミンラジカルを表し；
又はＢ及びＣは、水素原子を表し、及びＤはメチルアミンラジカルを表し；
又はＢ及びＣは、一緒になって、オキシム基を表し、Ｄはメチルラジカルを表し；及び
Ｒは、１〜１０個の炭素原子を含む直線状又は分岐状のアルキルラジカルを表す）
で表される化合物の少なくとも１つ、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つの使用であるためであり、神経保護剤は除かれる。
【００３５】
本発明によれば、医薬として許容される酸との付加塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、グリオキシル酸、アスパラギン酸、アルカン・スルホン酸、例えばメタン又はエタンスルホン酸、アリールスルホン酸、例えばベンゼン若しくはパラトルエンスルホン酸又はカルボン酸で形成された塩であってもよい。
【００３６】
本発明によれば、オキシム基は、純粋又は混在したｓｙｎ及びａｎｔｉ異性体を表し、二重結合のＣ＝Ｎに対して、Ｎ−Ｏ結合の配向と関連している。
【００３７】
使用することができる式Ｉで表される化合物のラジカルＲは、優先的には、式ＩＩ：
【００３８】
【化２】
【００３９】
で表されるコレスタンラジカルである。
【００４０】
本発明の他の特定の態様によれば、Ｘ及びＹが一緒になってケトン基を表すか又はオキシム基を表す式Ｉで表される化合物が、優先的に使用される。
【００４１】
本発明のさらに他の特定の態様によれば、Ｂがヒドロキシルラジカルを表し、Ｃ及びＤが同一であるか又は異なっていて、水素原子又は１〜４個の炭素原子を含む直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルを表すか、又はさらにＢ及びＣが一緒になってケトン基を表し、Ｄがメチルラジカルを表す式Ｉで表される化合物が、優先的に使用される。
【００４２】
最も優先的には、式Ｉで表される化合物の少なくとも１つが、
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール、
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアルコール、又は
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−ジメチルアルコール
から選択され、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、あるいはそのエステルの１つ、又は該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つから選択される本発明に従って使用される。
【００４３】
式Ｉで表される化合物の対象とする細胞保護特性は、細胞保護剤を調製するためのそれらの使用を正当化し、特に、壊死、及び／又は病的アポトーシス、及び／又はネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）（抗壊死剤及び／又は抗アポトーシス剤及び／又は抗ネクロトーシス剤）、又は、さらに
【００４４】
骨、関節、結合組織及び軟骨の疾患、
筋肉疾患、
皮膚疾患、
心臓血管疾患、
循環器系疾患、
血液疾患及び血管疾患、
肺疾患、
胃腸管疾患、
肝疾患、
膵臓疾患、
代謝疾患、
【００４５】
腎疾患、
ウイルス感染及び細菌感染、
重篤な中毒、
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連した変性疾患、
老化に関連した障害、
炎症性疾患、
自己免疫疾患、
歯科疾患、
眼科疾患又は障害、
聴覚管の疾患、
ミトコンドリアに関連した疾患（ミトコンドリア病）
などの疾患を治療又は予防するために意図される。
【００４６】
本発明はまた、移植前、移植中（摘出、輸送及び／又は再移植）又は移植後のいずれかで細胞、組織及び／又は臓器を保護することを対象とする。
【００４７】
好都合には、式Ｉで表される化合物は、心臓細胞を保護するため（心臓保護剤）、肝細胞を保護するため（肝臓保護剤）に意図された薬物、又はミトコンドリアに関連した疾患を治療又は予防するために意図された薬物の調製において使用されてもよい。
【００４８】
本発明によれば、式Ｉの化合物は、好都合には、生理学的に有効な服用量で細胞保護剤に存在する；該薬物は、特に、少なくとも１つの、式Ｉで表される化合物の有効な細胞保護服用量を含む。
【００４９】
薬物として、式Ｉで表される化合物、それらのエステル、医薬として許容される酸とのそれらの付加塩、及び該エステルの医薬として許容される酸との付加塩は、消化管経路又は非経口経路溶に製剤化されてもよい。
【００５０】
本発明に係る薬物は、少なくとも１つの他の医薬として有効な成分をさらに含むことができ、それは、特に、前述の病気の１つによって影響される被験者を治療する場合に、同時に、別々の使用、又は時間的に間隔のある使用のために、同一であるか又は異なった病気に活性である。
【００５１】
本発明によれば、式Ｉで表される化合物は、１以上の不活性な、即ち医薬として不活性であり、無毒性な賦形剤又は担体と混合して薬物において用いることができる。言及は、例えば、医薬的な使用で適合可能であり、当業者に既知である食塩水、生理学的、等張、緩衝化された溶液などで作製されてもよい。この組成物は、分散剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤などの１以上の薬物又は担体を含んでもよい。製剤（液体及び／又は注射可能な及び／又は固形製剤）に用いることができる薬物又は担体は、特に、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油又は動物油、アカシアなどである。好ましくは、植物油が使用される。組成物は、注射可能な懸濁液、ゲル、油、錠剤、坐剤、粉末、ゼラチンカプセル、カプセルなどとして、場合により、長期及び／又は遅延放出を提供する剤形又はデバイスの手段で製剤化されてもよい。この種類の製剤については、セルロース、カルボネート又はスターチなどの薬物が好都合に使用される。
【００５２】
投与は、当業者に既知のいずれかの方法によって行うことができ、好ましくは経口又は注射により、典型的には腹腔内、大脳内、髄腔内、静脈内、動脈内又は筋内経路による。経口投与が好ましい。これは、長期間の治療であれば、好ましい投与経路は舌下、経口又は経皮である。
【００５３】
注射用には、化合物は、一般に、液体懸濁液として包装され、例えば、シリンジ又は緩流の手段で注射することができる。流速及び／又は注射される服用量又は一般には投与される量は、患者、病理学、投与法などに依存して当業者によって適応されてもよい。投与が繰り返し行われることは理解され、場合により、他の有効成分又は任意の医薬として許容される担体（バッファー、食塩水、等張液、安定化剤の存在など）と組み合わせられる。
【００５４】
本発明は、動物、特にヒトに用いることができる。
一般に、化合物の毎日の服用量は、所望の治療効果を得るために最小の服用量である。上述される化合物、例えば３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの服用量は、一般に、ヒトに対しては、１日に０．００１〜１００ｍｇ／キログラムで含まれる。
【００５５】
必要に応じて、毎日の服用は、１日当たり２、３、４、５、６回又はそれを超える摂取で投与されてもよく、その日中に適切な間隔をおいて投与される複数回の副投与であってもよい。
【００５６】
選択される量は、複数の因子、特に投与経路、投与期間、投与量、化合物の排出速度、化合物と組み合わせて用いられる種々の製造物、患者の年齢、体重及び身体状態、並びに彼／彼女の病歴、及び医学において知られているいずれかの他の情報に依存する。
【００５７】
医師の処方は、一般に使用されるよりも少ない服用量で開始され、次に、これらの服用量は、可能な副次的効果の発生をより良く調節するために徐々に増加される。
【００５８】
本発明に係る組成物、特に、医薬組成物又は薬物は、前述の式Ｉで表される化合物の少なくとも１つ、あるいは医薬として許容される酸とのその付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つを含む。
【００５９】
本発明に係る医薬組成物は、特に、前述の病原体の１つで影響された患者を治療する際、同時に、別々の使用、又は時間的に間隔のある使用のために、少なくとも１つの他の治療的に有効な成分をさらに含むことができる。
【００６０】
本発明に係る医薬組成物は、好都合には、１以上の不活性な、即ち、医薬として不活性であり、無毒性の賦形剤又は担体を含んでもよい。
【００６１】
式Ｉで表される化合物
本発明に使用される式Ｉで表される化合物は、式ＩＩＩ：
【００６２】
【化３】
【００６３】
（式中、Ｒは、前述に示された意味を有する）
で表される化合物を反応させることによって合成することができ、この化合物は、
−式Ｉ（Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹは一緒になってオキシム基を表し、ＢはＣと一緒になってケトン基を表し、Ｄはメチルアミン基を表す）で表される化合物を得るために、メチルアミン、次にヒドロキシルアミンの作用に置かれるか、又は
−式ＩＶ：
【００６４】
【化４】
【００６５】
（式中、Ｒは、前述に示された意味を有する）
で表される化合物を得るためにメチル化に置かれ、この化合物は、式Ｖ：
【００６６】
【化５】
【００６７】
（式中、Ｒは、前述に示された意味を有する）
で表される化合物を得るために、５位のケトン基を保護する試薬の作用に置かれ、この化合物は、
−式Ｉ（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹはオキシム基を表し、Ｂはヒドロキシル基を表し、Ｃ及びＤは１〜４個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルを表す）で表される化合物を得るために、メチルリチウムと反応させ、次に５位のケトン基を脱保護するための試薬の作用に置かれ、次にヒドロキシルアミンと反応されるか、又は
−式ＶＩ：
【００６８】
【化６】
【００６９】
で表される化合物を得るために、鹸化し、次に式Ｈ３Ｃ−ＮＨ−ＯＣＨ３で表される化合物と反応させ、次にメチルリチウムと反応させ、
【００７０】
この化合物は、式Ｉ（Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹは一緒になってオキシム基を表し、Ｂはヒドロキシル基を表し、Ｃは任意に置換された、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルを表し、Ｄは水素原子を表す）で表される化合物を得るために、ケトン基の還元に置かれ、次に５位のケトン基を脱保護するための試薬の作用に置かれ、次にヒドロキシルアミンと反応されるか、若しくは
−式ＶＩＩ：
【００７１】
【化７】
【００７２】
（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、Ｂはヒドロキシル基を表し、Ｃ及びＤは水素原子を表す）
で表される化合物を得るために還元され、この化合物は、
【００７３】
式ＶＩＩＩ：
【００７４】
【化８】
【００７５】
（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、このシッフ塩基は調製され、次に還元される）
で表される化合物を得るために酸化剤の作用に置かれ、その後、式Ｉ（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹは一緒になってオキシム基を表し、Ｂはメチルアミン基を表し、Ｃ及びＤは水素原子を表す）で表される化合物を得るために、５位のケトン基を脱保護するための試薬の作用に置かれ、次にヒドロキシルアミンと反応させるか、又は
−式Ｉ（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹは一緒になって、オキシム、メチルオキシム及びカルボキシメチルオキシム基を表し、Ｂはヒドロキシル基を表し、Ｃ及びＤは水素原子を表す）で表される化合物を得るために、５位のケトン基を脱保護するための試薬の作用に置かれ、次に、それぞれ、ヒドロキシルアミン、メチルヒドロキシルアミン及びカルボキシメチルヒドロキシルアミンから選択されるアミンと反応させることによって合成され、
そして、式Ｉで表される化合物が単離され、所望により加塩又はエステル化されて単離され、次に所望により加塩される。
【００７６】
上述した方法を適用するための優先的な条件下で、
−式ＩＩＩで表される化合物とメチルアミンとの反応は、特にジクロロメタン又はジメチルホルムアミドなどの適切な溶媒中で、好都合にはＮ−メチルモルホリンなどの塩基の存在下で、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）又はＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニム・テトラフルオロボレート）などの酸性基を活性化するカップリング試薬の存在下で実行される。好ましくは、ジクロロメタン中の４−ジメルアミノピリジンと関連付けられたＥＤＣＩ（１−エチル−３−（３’−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）の存在下で実行され、混合物は室温で２４時間撹拌に供される。次に、この製造物は、溶液、好ましくはピリジン中に設置され、次に、５〜７、特に６当量のヒドロキシルアミン塩酸塩が添加される。
【００７７】
−式ＩＩＩで表される化合物のメチル化は、塩化チオニルの存在下でメタノールとの反応によって、好ましくは７０％メタノールと３０％ジクロロメタンの混合物の適切な容積で式ＩＩで表される酸を可溶化することによって達成される。０℃に冷却後、３当量の塩化チオニルを滴下して添加する。次に、２時間室温で撹拌する。この化合物に関して、ケトン基の保護は、好ましくは、過剰の、例えば１０当量のトリメチルオルトホルメートと適切な容積のエチレングリコール中で該製造物を溶解し、次に無水ｐ−トルエン−スルホン酸を添加することによって行われる。
【００７８】
−式Ｖで表される化合物とメチルリチウムとの反応は、好ましくは、無水ＴＨＦ中で行われ、次に、約−４５℃まで冷却し、過剰のメチルリチウムを滴下して添加することによって行われる。５位のケトン基をブロックするジオキソランの脱保護は、硫酸の存在下でアセトン中で達成される。好ましくは、これは、１／１の水／酢酸混合物の存在下でジオキサン中で実行される。ケトンのオキシムは、好都合には上記のように作製される。
【００７９】
−式Ｖで表される化合物の鹸化は、ソーダを用いて、好ましくはジオキサン中で達成される。特に、約２当量のソーダ水が添加される。この製造物は、例えば、ジクロロメタン又はジメチルホルムアミドなどの適切な溶媒中で、Ｎ−メチルモルホリンなどの塩基の存在下でＢＯＰ又はＴＢＴＵなどの酸性基を活性化するカップリング試薬の存在下で、式Ｈ３Ｃ−ＮＨ−ＯＣＨ３で表される化合物と反応される。好ましくは、これは、ヒドキシベンゾトリアゾールと関連付けられたＥＤＣＩの存在下で行われ、トリエチルアミンが溶媒中に滴下して添加される。この製造物は、上述した手順に従って、アルゴン雰囲気下でメチルリチウムと反応させ、次に、３位のケトン基を水素化ホウ素ナトリウムによって還元される。その後、得られた製造物は、５位のケトン基の脱保護に供し、上述したように同じ手順に従ってヒドロキシルアミンと反応させる。
【００８０】
−式ＶＩＩで表される化合物を得るために、式Ｖで表される化合物の還元が、好ましくは、リチウムアルミニウム水素化物を用いて、特にテトラヒドロフランの懸濁液中に設置することによって達成される。それは、硫酸ナトリウム溶液を注意深く添加することによって加水分解される。
【００８１】
−式ＶＩＩで表される化合物の酸化は、ピリジニウム・クロロクロム酸塩を用いて達成される。この製造物に関して、シッフ塩基が得られ、瞬時に、特に、トリエチルアミン、メチルアミン塩酸塩とチタニウム・テトラ−イソプロポキシドの存在下で、好ましくはエタノール中、アルゴン下で可溶化することによって、次に、水素化ホウ素ナトリウムを添加することによって還元される。５位のケトン基の脱保護及びヒドロキシルアミンとの反応は、前述の条件下で実行される。
【００８２】
下記の実施例は、本出願を例示するが、それを限定するものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例
以下の反応時間は、分＋分の百分のいくつかで表される。
【００８４】
全製造物に用いられる液体クロマトグラフィー法は、下記の通りである：
カラム：Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ−Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ（登録商標）３００−６ Ｃ４−１５０×４．６ｍｍ
勾配；水（＋０．０５％のトリフルオロ酢酸）／アセトニトリル（＋０．０５％のトリフルオロ酢酸）
【００８５】
ｔ＝０分；６０％アセトニトリル、４０％Ｈ２Ｏ
ｔ＝６分；１００％アセトニトリル、０％Ｈ２Ｏ
ｔ＝１１分；１００％アセトニトリル、０％Ｈ２Ｏ
ｔ＝１３分；６０％アセトニトリル、４０％Ｈ２Ｏ
ｔ＝１５分；６０％アセトニトリル、４０％Ｈ２Ｏ
【００８６】
質量分析器のイオン化条件は下記の通りである：
ソース温度：２５０℃
円錐電圧：５０Ｖ
キャピラリー電圧：３ｋＶ
Ｒｆレンズ：０．３Ｖ
【００８７】
実施例１：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミドの合成
工程Ａ：第１段階では、２５０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−酸、３８ｍｇのメチルアミン塩酸塩、２５０ｍｇのＥＤＣＩ、１００ｍｇのＤＭＡＰ及び２．５ｍＬのジクロロメタンをフラスコに導入される。この溶液を２４時間室温で撹拌し、次に、反応媒体をジクロロメタンを添加することによって希釈し、１０％重炭酸ナトリウムで洗浄する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９５／５）によって精製する。１７６ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミドを収率６８％で回収する。
【００８８】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．４２分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１８；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝８３５
【００８９】
工程Ｂ：次に、１ｍＬ中のピリジン中の５０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルアミド、５０ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。反応媒体を１６時間室温で撹拌し、次に、減圧下で濃縮する。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物中に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。４０．６ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミドを収率７８％で回収する。
【００９０】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．７０分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３３；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝８６５
【００９１】
実施例２：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−ジメチルアルコールの合成
工程Ａ：フラスコにおいて、１０．５ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−酸を３７８ｍＬのメタノールと１４６ｍＬのジクロロメタンに溶解させる。混合物を０℃に冷却し、５．７ｍＬの塩化チオニルを滴下して添加する。次に、２時間室温で撹拌する。反応媒体を減圧下で濃縮し、トルエン、次にジクロロメタンとの同時蒸発させある。１０．３ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルエステルは、収率９４％で得られる。この製造物は、いずれの精製なしにそのまま用いる。
【００９２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．６９分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１９；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝７８５
【００９３】
工程Ｂ：フラスコにおいて、９．６２ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルエステルを２５ｍＬのトリメチルオルトホルメート及び５３ｍＬのエチレングリコールの溶液に置かれる。４００ｍｇ（２．３ｍｍｏｌ）の無水ｐ−トルエン−スルホン酸を添加し、次に、一晩室温で撹拌する。酢酸エチルを反応媒体に添加する；洗浄は１０％炭酸水素ナトリウム溶液を用いて行う。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。９．９５ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５−（エチレンジオキシ）−３−メチルエステルを収率９３％で得た。この製造物はいずれの精製なしに用いられる。
【００９４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．７６分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６３
【００９５】
工程Ｃ：フラスコにおいて、３００ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５−（エチレンジオキシ）−３−メチルエステルを５ｍＬの無水ＴＨＦに溶解させる。媒体を−４５℃まで冷却し、次に、エーテル中の１．３６ｍＬの１．６Ｍメチルリチウムを滴下して添加する。−４５℃で３０分の撹拌後、数滴のメタノールを反応媒体に添加し、後者を室温に戻す。２０ｍＬのジエチルエーテルを採取し、重炭酸ナトリウムで飽和した溶液で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に、減圧下で濃縮する。２９５ｍｇの３，５−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−ジメチルアルコール（ＭＷ＝４６２）を収率９８％で得る。
【００９６】
保持時間：５．５６分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ−（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ）＋Ｈ］＋＝４０１
【００９７】
工程Ｄ：フラスコにおいて、６ｍＬの水／酢酸（１／１）混合物及び２９５ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−ジメチルアルコールを添加し、１時間３０分間還流する。冷却後、反応媒体を酢酸エチルで希釈し、塩化ナトリウムで飽和した溶液で洗浄し、次に、重炭酸ナトリウムで飽和した溶液で洗浄する。最後に、有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮させる。得られた原産物は、フラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル（８／２））によって精製する。１８０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−ジメチルアルコールを収率６８％で得る。
【００９８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．０８分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１９；［Ｍ−Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋＝４０１；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝８３７
【００９９】
実施例３：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−ジメチルアルコールの合成
５３ｍＬのピリジン及びケトンを溶解させるための数ｍＬのジクロロメタン中の１ｇの実施例２の化合物、１ｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。反応媒体を室温で１６時間撹拌し、次に、減圧下で濃縮する。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物中に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。８１４ｍｇの３，５−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−ジメチルアルコールを収率７８％で得る。
【０１００】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．０９分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３４；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝８６７
【０１０１】
実施例４：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアルコールの合成
工程Ａ：２６ｍＬのジオキシ中の３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルエステルをフラスコに設置する。８．６ｍＬの１Ｎソーダ溶液を添加する。反応媒体を１時間３０分還流し、ジオキシを減圧下で蒸発させる。得られた溶液をｐＨ＝１になるまで１Ｎ塩酸溶液を添加することによって酸性にし、トルエンで２回抽出する。有機層を回収し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。１．９２ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−酸を収率９９％で回収し、いずれかの追加の処置なしに次の工程で用いる。
【０１０２】
工程Ｂ：３０ｍＬのジクロロメタン中の１．９ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−酸をフラスコに設置する。この溶液に、１．６ｇのＥＤＣＩ、７４３ｍｇのＨＯＢＴ、５３７ｍｇのＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩、及び、次に１．３７ｍＬのトリエチルアミンを滴下して添加する。室温で１６時間撹拌する。ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物を反応媒体に添加し、後者をジクロロメタンで３回抽出する。有機層を回収し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル（８／２））によって精製する。１．４６ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−（Ｎ，Ｎ−メトキシ−メチル）アミドを収率７０％で回収する。
【０１０３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．３１分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４９２
【０１０４】
工程Ｃ：２０ｍＬの無水テトラヒドロフラン中の１．４ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−（Ｎ，Ｎ−メトキシ−メチル）アミドをアルゴン下で導入し、０℃まで冷却する。次に、エタノール中の３．３８ｍＬの１．６Ｍのメチルリチウム溶液を滴下して添加する。反応媒体を３時間４０分間、０℃で撹拌し、その後、７．２８ｍＬの水中の０．７２ｍＬの濃塩酸の溶液を滴下して添加する。テトラヒドロフランを減圧下で蒸発させる；得られた水溶液をｐＨ＝１０になるまで１Ｎソーダを添加することによって塩基性にする。ジエチルエーテルで抽出する；有機層を回収し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル（９／１））によって精製する。９３０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルケトンを収率７３％で回収する。
【０１０５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．６５分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４０３
【０１０６】
工程Ｄ：１．５ｍＬのメタノール中の１１９ｍｇの工程Ｃの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルケトンをフラスコに設置する。混合物を０℃に冷却し、１０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを添加する。反応媒体を１時間、０℃で撹拌し、次に、減圧下で濃縮する。残渣を水中に採取し、ジクロロメタンで抽出する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。９４ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルアルコールを収率７８％で回収し、この製造物をそのまま用いる。
【０１０７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．２２分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝３８７
【０１０８】
工程Ｅ：５位のケトン基を脱保護するために、実施例２の工程Ｄとように操作を行う。
【０１０９】
工程Ｆ：１２１ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルアルコール、１．５ｍＬのピリジン、及び１２１ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。この溶液を２日間室温で撹拌する。反応媒体を減圧下で濃縮し、水中に採取し、ジクロロメタンで抽出する。次に、有機層を水で洗浄し、その後、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。それによって得られた製造物は、フラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル（９／１））によって精製する。６６ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアルコールを収率５３％で得る。
【０１１０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．９１分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４２０
【０１１１】
実施例５：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミンの合成
工程Ａ：６１５ｍｇのＬｉＡｌＨ４をフラスコにおいて５７ｍＬのＴＨＦに懸濁させる。懸濁液を０℃に冷却し、５７ｍＬのテトラヒドロフラン中の３．０ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルエステルの溶液を滴下して添加する。次に、０℃で５時間撹拌する。加水分解は、硫酸ナトリウム溶液を注意深く添加することによって行う；得られた白色の溶液を３０分間撹拌し、次に濾過する。濾過物を減圧下で濃縮し、水中に採取し、酢酸エチルで抽出する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。２．５５ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−オールを収率８５％で得て、製造物をそのまま用いる。
【０１１２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．８２分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ−（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ）＋Ｈ］＋＝３７３
【０１１３】
工程Ｂ：アルゴン下のフラスコにおいて、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−オールを７ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、次に、１８９ｍｇの中和アルミナ及び３９９ｍｇのピリジニム・クロロクロム酸塩を添加する；室温で３時間３０分撹拌する。反応媒体は、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）上でろ過する；ろ過物を減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル ９／１及び次に８／２）によって精製する。３２８ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−アールを収率６９％で得る。
【０１１４】
保持時間：５．５７分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３３
【０１１５】
工程Ｃ：アルゴン下のフラスコにおいて、３２３ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−アールを３ｍＬのエタノールに溶解させ、次に、２０９μＬのトリエチルアミン、１００ｍｇのメチルアミン塩酸塩及び４４４μＬのチタニウム・テトライソプロポキシドを添加する。反応媒体を６時間室温で撹拌し、次に、４２．５ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを添加する。１６時間室温で撹拌する。反応媒体をろ過し、ジクロロメタンで洗浄する。ろ過物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られる残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール ９／１〜５／５）によって精製する。８４ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−オキシム−３−メチルアミンを収率２５％で得る。
【０１１６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．９３分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４４８
【０１１７】
工程Ｄ：５０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルアミン及び９７６μＬの水／酢酸 １／１混合物をフラスコに添加する。混合物を６時間還流する。冷却後、反応媒体を酢酸エチルで希釈し、塩化ナトリムで飽和した溶液で洗浄し、次に、５％重炭酸ナトリム溶液で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた製造物をフラッシュ・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール（９５／５））によって精製する；５ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルアミンを収率１１％で得る。
【０１１８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．６８分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４０４
【０１１９】
工程Ｅ：５ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルアミン、５ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩及び２８７μＬのピリジンをフラスコに導入する。混合物を１６時間室温で撹拌する。それをジクロロメタンに採取し、水で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。５ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミンを収率９１％で得る。
【０１２０】
保持時間：３．６６分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１９
【０１２１】
実施例６：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンメチルオキシム−３−オールの合成
１ｍＬのピリジン中の２０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−オール、２０ｍｇのＯ−メチル−ヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。３６時間室温で撹拌し、１０ｍｇのＯ−メチル−ヒドロキシルアミン塩酸塩を再び添加する。１６時間室温で撹拌し、反応媒体を減圧下で濃縮する。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物中に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。フラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル（９／１））によって精製し、１８ｍｇの黄色油状物を得る。５．８ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンメチルオキシム−３−オールを収率７２％で得る。
【０１２２】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．５０分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４２０
【０１２３】
実施例７：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンカルボキシ−メチルオキシム−３−オールの合成
０．５ｍＬのピリジン中の５２ｍｇのケトン、２５ｍｇのカルボキシメチルヒドロキシルアミン・半塩酸塩をフラスコに導入する。２日間、室温で撹拌し、次に、反応混合物を減圧下で濃縮する。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２／水混合物に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、その後、２％塩酸溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸（８／２））によって精製する。２４ｍｇは、カルボキシメチルオキシから収率３９％で得られる。
【０１２４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．４０分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６４；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝９２７
【０１２５】
実施例８
懸濁液を調製し、式３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールを２０ｍｇ／ｍｌに合わせる。
賦形剤：油性エマルジョン
【０１２６】
実施例９
乾燥型を調製し、式３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステル・塩酸塩 ２５０ｍｇを合わせる。
賦形剤：ｑｓｐ ７５０ｍｇに終了させたゲル化カプセル
【０１２７】
実施例１０：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステルの合成：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールのプロドラッグ
【０１２８】
１０〜１５ｍＬのジクロロメタン中の５０９ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−オール、１８２ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルグリシン・塩酸塩、２７５ｍｇのＥＤＣＩ及び２０７ｍｇのＤＭＡＰをフラスコに置く。室温で１６時間撹拌する。５％重炭酸ナトリウム溶液を反応媒体に添加し、後者をジクロロメタンで抽出する。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル（８／２））によって精製する。４８８ｍｇは、収率７８％で回収される。
【０１２９】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．７７分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４７６
【０１３０】
次に、製造物は、下記の反応に使用される：
２３ｍＬのピリジン中の４８８ｍｇの得られた製造物及び４８８ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。１６時間、室温で撹拌し、次に、反応媒体をＣＨ２Ｃｌ２／水混合物に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。３７８ｍｇのオキシムを収率７５％で回収する。次に、製造物は、塩酸塩として製造物を得るために、ＨＣｌ溶液によって酸性にしたエーテル溶液の存在下で加塩される。
【０１３１】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．４３分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４９１
【０１３２】
実施例１１：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−（４−メチル−１−ピペラジン）プロパン酸エステルの合成：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールのプロドラッグ
２〜３ｍＬのジクロロメタン中の２６４ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−オール、リチウム塩として１２１ｍｇの４−メチル−１−ピペラジン−プロパン酸、１４．２５ｍｇのＥＤＣＩ及び１０６ｍｇのＤＭＡＰをフラスコに置く。室温で一晩撹拌する。水を反応媒体に添加し、媒体をジクロロメタンで抽出する。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル（９８／２））によって精製する。所望の製造物の５４ｍｇは、収率１５％で回収される。
【０１３３】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．６６分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５４５
【０１３４】
次に、製造物を下記の反応に関与させる：
１．２ｍＬピリジン中の３０ｍｇの得られた製造物及び３０ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。５時間３０分室温で撹拌し、次に、反応媒体をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。１９ｍｇのオキシムを収率１３％で回収する。
【０１３５】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．６２分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５６０
【０１３６】
次に、製造物を二塩酸塩として製造物を得るために、塩酸水溶液によって酸性にしたエーテル溶液の存在下で加塩される。
【０１３７】
実施例１２：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの抗アポトーシス効果：ウサギ心室心筋細胞の収縮性及びアポトーシス
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの抗アポトーシス効果（アザステロイダル・アルカロイド。Ａ−ノル−Ｂ−ホモ−５−アザコレスタンの合成。Ｒｏｄｅｗａｌｄ，Ｗ．Ｊ．；Ｗｉｃｈａ，Ｊ．Ｕｎｉｖ．Ｗａｒｓａｗ，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｉｓｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｃａｄｅｍｙ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ（１９９３），１１（８），ｐｐ．４３７−４４１）をドキソルビシンによって誘導された収縮不全試験によって、心筋細胞で分析した。
【０１３８】
材料及び方法
試験される化合物
１００％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭの濃度で、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールのストック溶液を用いた。
ＤＭＳＯ中の最終濃度は、使用さえるモル濃度とは独立して、全ての実験点に関して同じであった。
【０１３９】
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールは、Ｔｙｒｏｄｅ溶液（組成（ｍｍｏｌ／Ｌ）：ＮａＣｌ １３５，ＫＣｌ ５．４，ＮａＨ２ＰＯ４ ０．３３，ＣａＣｌ２ １．２，ＭｇＣｌ２ １．０，ＨＥＰＥＳ １０；ＮａＯＨで７．４に調整されたｐＨ）に希釈された、０．１及び０．３μＭの濃度で試験された。
【０１４０】
ウサギ心室心筋細胞の単離された細胞を得ること
単離された心室細胞は、Ａ．ｄ’Ａｎｇｌｅｍｏｎｔ ｄｅ Ｔａｓｓｉｇｎｙら，Ｆｕｎｄ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１８：５３１−３８，２００４に記載される雄性Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄウサギの心臓から得た。要約すると、ウサギ（２．０〜２．５ｋｇ）をペントバルビタール溶液（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、次に、ヘパリン（２００ＩＵ／ｋｇ）を摂取する。心臓を摘出し、即座に、酸素化Ｔｙｒｏｄｅ（カルシウム不含）等張溶液（９５％、２〜５％ＣＯ２）（ｍＭ：ＮａＣｌ １３５，ＫＣｌ ５．４，Ｎａ２ＰＯ４ ０．３３，ＭｇＣｌ２ １．０，ＨＥＰＥＳ １０，１Ｎ ＮａＯＨで７．４に調整されたｐＨ、３７℃、２８０〜３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏ）を用いて、再還流なしに、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置の手段により１０〜１５分間緩流させる。次に、心臓全てを１ｍｇ／ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ及び０．２８ｍｇ／ｍＬのＸＩＶ型プロテアーゼを添加した同じカルシウム不含のＴｙｒｏｄｅ溶液（冠血流速度、１０〜１５ｍＬ／分）である「再緩流」モードで３分間緩流する。最後に、全ての心臓は、０．３ｍＭのＣａＣｌ２を補足したＴｙｒｏｄｅ溶液の同溶液を用いて、いずれの再緩流がないモードで１０分間緩流される。左心室を取り出し、小片に切断する；細胞分離は、穏やかな機械的撹拌によって達成される。細胞外カルシウムは、１．０ｍＭの生理的濃度を達するために、１５分毎の増加によって添加される。単離された筋細胞は、実験前の最大１時間３０分に至るまで、ＮａＣｌ １１０，ＫＣｌ ５．４，Ｎａ２ＰＯ４ ０．３３，ＮａＨＣＯ３ ２５，グルコース ５，ＭｇＣｌ２ ０．８，ＣａＣｌ２ １（ｍＭ），７．４に調整されたｐＨを含む血清不含培地中で維持される。全ての細胞は棒状であり、蒼く交差した横紋があり、光学顕微鏡下で表面にはいずれのビヒクルはない。
【０１４１】
アネキシンＸによるマーキング
ホスファチジルセリンのアネキシンＸによるマーキングは、ＭｉｎｉＭａｃｓ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって、アポトーシスを測定するための定量的な方法として用いた。要約すると、ホスファチジルセリンに晒されている細胞は、アネキシンＸ微粒子を用いて磁気的にマークされ、次に、磁場に置かれたカラムに通過される。マークされた細胞（磁気的にマークされたホスファチジルセリンを有する）はカラムに保持され、マークされていない細胞（壊死及び非アポトーシス細胞）は、保持されない。カラムを磁場から外され、磁気的に保持されたホスファチジルセリンに晒されている細胞は、正の分画として溶出され、Ｍａｌｌａｓｓｅｚセルカウンターでカウントされる。次に、アポトーシス細胞の割合は、初期の細胞数に参照される。
【０１４２】
カスパーゼ−３活性の測定
カスパーゼ−３活性は、アポトーシスを測定するための定量的な方法として使用される。要約すると、細胞を溶解し、上清を用い、ＡＫ−００５キット（Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いることによってカスパーゼ−３活性を測定する。カスパーゼ−３活性を測定するための蛍光基質（ＤＥＶＤ）は、蛍光色素である７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）でマークされ、これは、３６０／４６０ｎｍで２１０分間、ＵＶ光で検出可能な黄色−緑色蛍光を生じる。ＡＭＣは、カスパーゼ−３による開裂によって基質から放出され、酵素発現がｆｍｏｌ／分で表される。
【０１４３】
収縮性の測定
筋細胞は、３７℃で連続的に緩流したチャンバーに移し、倒立顕微鏡のステージ上で配置される。チャンバーは、ＮａＣｌ １４０，ＫＣｌ ５．４，ＣａＣｌ２ １；ＭｇＣｌ２ ０．８；ＨＥＰＥＳ １０（ｅＭ）及びグルコース５．６（ｐＨ＝７．４；２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏ）を含む生理学的バッファーを用いて緩流される。
【０１４４】
筋細胞の収縮は、チャンバーに設置され、刺激機に接続された白金電界電極で１秒間に１回（１Ｈｚ）で誘導される。画像は、ａ×２０の対象で連続的に捕捉され、２４０試料／秒の速度でＣＣＤカメラに送信される。ＣＣＤカメラの画像は、ビデオスクリーン上に投影される。
【０１４５】
筋細胞は、下記の基準に従って、試験のために選択される：非常にはっきりとした横紋を有し、液胞のない棒状の様相であって、１ｍＭ Ｃａ２＋で刺激した場合に自発収縮がなく、一定の静止長及び収縮振幅を有する様相。筋節の長さは、ビデオ画像分析プログラムによって測定され、データは、２４０試料／秒の速度で獲得された。カメラ画像は、筋節長の測定に変換した。収縮率は、筋節の長さに基づくこれらのデータから計算される。
【０１４６】
データ分析
全てのデータは、平均±標準偏差として表された。種々のグループ間のデータの比較は、ＡＮＯＶＡ、続くスチューデント試験によって実行され、有意差はｐ＜０．０５であった。
【０１４７】
実験手順
アポトーシスは、ＮａＣｌ １１０，ＫＣｌ ５．４，Ｎａ２ＰＯ４ ０．３３，ＮａＨＣＯ３ ２５，グルコース ５，ＭｇＣｌ２ ０．８，ＣａＣｌ２ １（ｍＭ），７．４に調整されたｐＨを含む等張溶液に添加された１μＭのドキソルビシンへの３〜８時間の暴露によって単離された心筋細胞において誘導される。アネキシンＸによるマーキングは、ドキソルビシンの暴露開始の３時間後に達成された。これは、この化粧は、アポトーシスのカスパーゼの非常に初期に見られるためである。カスパーゼ−３活性の測定は、ドキソルビシンの暴露開始の８時間後に実行される。これは、この現象は、アポトーシス現象の後期に起こるためである。全ての処理後、細胞は、ドキソルビシンに暴露されていない対照の心筋細胞と比較した。
【０１４８】
心筋細胞は、ドキソルビシンによる暴露前の１５分間３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール化合物で前処理された。２つの濃度のこの化合物は、この実験中に試験された：０．１及び０．３μＭ。
【０１４９】
結果
この実験で使用される細胞の筋節の平均長は、これらのグループの間であまり相違していなかった。
【０１５０】
○心筋細胞の収縮性及びアポトーシスにおけるドキソルビシンの効果
ドキソルビシンの暴露は、筋節の短縮の経過時間の減少をもたらした。ドキソルビシン下でのピークの短縮は、最初の３時間、対照と同じであり、次に、暴露の４時間後に有意に減少した（ドキソルビシンのベースラインと対照のベースラインを比較して、それぞれ−５３．２０±７．７０％対−１９．４９±２．０６％（ｐ＜０．０５，ｎ＝５））。
【０１５１】
１μＭのドキソルビシンの処理は、アポトーシスを誘導し、アネキシンＸによるマーキング及びカスパーゼ−３活性において有為な増加を伴った。
【０１５２】
○ドキソルビシンによって誘導された収縮性のレベルでの機能障害及びアポトーシスにおける３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの効果
１μＭのドキソルビシンの処理は、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール（０．１及び０．３μＭ）の存在下で止められる心室心筋細胞ピークの短縮の有意な減少をもたらした。実際に、暴露４時間後、ドキソルビシン下でのピークの短縮（−５３．２０±７．７０％）は、ベースラインと比較して、０．１μＭ（１８．９±５．４％）及び０．３μＭ（−８．１±９．６％）の化合物で有意に減少した。
【０１５３】
さらに、ドキソルビシンによるアネキシンＸによるマーキング及びカスパーゼ−３活性増加は、０．１μＭ及び０．３μＭの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールによってブロックされた。
【０１５４】
ドキソルビシンの３時間後のアネキシンＸによるマーキングのａ％変化として評価されたアポトーシスは、下記の結果を与えた：対照：１００％；ドキソルビシン：３２０％±４８．７；ドキソルビシン＋０．１μＭ３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール：１１６．３％±１５．１；ドキソルビシン＋０．３μＭ３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール：１３７．３％±１９．３。カスパーゼ−３活性測定に関する結果は、下記のとおりである：対照：１９±９ｆｍｏｌ／分；ドキソルビシン：１２０±１５ｆｍｏｌ／分；ドキソルビシン＋０．１μＭ ３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール：２７±２０ｆｍｏｌ／分；ドキソルビシン＋０．３μＭ ３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール：１５±７ｆｍｏｌ／分。
【０１５５】
コメント及び結論
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール化合物は、単離されたウサギ心室細胞における、ドキソルビシンによって誘導された収縮障害及びアポトーシスの心臓保護効果を示す。この分子は、適切な服用量で用いた場合、実際には、このアントラサイクリンで癌患者の治療において制限因子となることが知られているドキソルビシンによって誘導される心臓毒性に対して保護を提供することができる。したがって、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール化合物は、これらの患者におけるドキソルビシン心臓毒性を制限するために用いることができる。
【０１５６】
実施例１３：マウスの心筋梗塞のインビボモデルにおける化合物３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール及び３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステルの効果
この実験の目的は、インビボにおいて、マウスの冠動脈閉塞再緩流モデルにおける、化合物３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール及び３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステルの心臓保護特性を試験することである。
【０１５７】
試験される化合物は、予め虚血にした心筋の再緩流５分後、マウスにおいて静脈投与される。対照として、それぞれ化合物β−シクロデキストリン（以下、βＣＤと呼ぶ）及び水の担体は、前記化合物と同じ条件下で投与された。
【０１５８】
試験化合物の効果を測定するために、梗塞の大きさを２４時間の再緩流後に測定される。
【０１５９】
動物のための外科器具
６〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６マウスは、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で麻酔され、実験を通じて、Ｏ２／ＣＯ２（９５％／５％）で挿管後、酸素を供給する。表面の心電図（ＥＣＧ）は、全ての外科処理を通じて記録され、オシロスコープ上で視察される。厳格な無菌条件下で、頸静脈は、化合物の静脈投与のためにカテーテルを挿入される。左側面開胸術を行い、心膜切開術後、左冠状動脈の主要なブランチは、左心室の側面後部領域に位置される。プロレン８番縫合糸は、一時的な冠動脈閉塞を作るための移動ループを形成するためにこの動脈周辺に配置される。
【０１６０】
実験手順
全てのマウスは、３０分の一時的な冠動脈閉塞に供した。心筋領域の虚血は、心筋表面のチアノーゼ及び心電図のＳＴセグメントの逸脱によって確かめられる。
【０１６１】
化合物（処置群、ｎ＝１０）又はその溶媒和物（対照群、ｎ＝１０）の各々は、３０分の冠動脈閉塞を解除する５分前に、静脈投与された。
【０１６２】
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールは、飽和し、遠心分離によって調製されたリン酸バッファーの３０％βＣＤ溶液中の０．４６ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように予め溶解させ、１ｍｇ／ｋｇの服用量で投与される。
【０１６３】
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステルは、撹拌及び超音波処理によって無菌水中で１．５６ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように予め溶解させ、３．９ｍｇ／ｋｇの服用量で投与される。
【０１６４】
同容積の担体が、対応する対照群において投与される。
再緩流は、心電図のＱＲＳセグメントの様相によって確かめた。
【０１６５】
面ごとに（ｐｌａｎｅ ｂｙ ｐｌａｎｅ）胸部を閉じ、ドレインによる吸引によって気胸を排出した後、マウスを徐々に覚醒させ、正常な自然呼吸を再開するまで、呼吸支援を取り上げる。必要に応じて、ブプレノルフィン（１ｍｇ／ｋｇ）は、効果的な鎮痛適用を提供するために腹腔内に投与される。
【０１６６】
冠動脈閉塞の終了の２４時間後、マウスを再度、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で麻酔させ、ヘパリンを静脈投与する（Ｃｈｏａｙ（著作権）ヘパリン １，０００ＩＵ／ｋｇ）。冠状動脈の結紮は、以前の最初の閉塞２４時間に供されたのと同じ位置で達成される。次に、マウスは、塩化カリウムの致死的に飽和した服用量で安楽死させ、心臓を迅速に摘出し、その後、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ型の逆行性緩流システムで大動脈を通じて開始する。
【０１６７】
５％のエヴァンズ・ブルー溶液は、健常な心筋を青色に着色するために、逆に緩流させる；冠動脈閉塞中の虚血された部分、即ち「危険性のあるＡＲの領域」は、デフォルトによって着色されないままである。
【０１６８】
次に、左心室は、マウスの心臓用に特別に設計されたスライサー（Ｌｅｓ Ｉｓｏｌａｎｔｓ ｄｅ Ｐａｒｉｓ，Ｐａｌａｉｓｅａｕ）によって等しい厚さ（１ｍｍ）の５スライスに切断され、その後、計量される。
【０１６９】
これらのスライスは、ｐＨ７．４、２０分間、３７℃で１％の塩化トリフェニルテトラゾリウム溶液（ＴＴＣ，Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）中でインキュベートされ、次に、４％ホルモルに置かれる。ＴＴＣは、梗塞していない心筋を赤色に着色する性質を有し、そのため、梗塞された領域を白色で示す。各心臓スライスは、高解像度写真を撮影するために立体顕微鏡下に置かれる。
【０１７０】
梗塞及び危険領域の定量化は、面積測定によって実行され（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ，Ｓｃｉｏｎ，Ｆｅｄｅｒｉｃｋ ＭＤ，ＵＳＡ）、各スライスの重量を意味する。
【０１７１】
危険領域（青色でない領域）は、左心室の重量率として表される。梗塞サイズは、危険領域の重量率として表される。
【０１７２】
梗塞サイズ及び危険領域の全ては、平均±ＳＥＭとして表される。１因子のＡＮＯＶＡ、続く、Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ補正を伴う非対のスチューデントｔ試験は、実験群の間で、危険領域及び梗塞サイズを比較するために使用され、有意な閾値は、ｐ＜０．０５になっている。
【０１７３】
結果及び結論
前記化合物で処理されたマウスの梗塞サイズは、担体で処理されたマウスのものとは有意に相違している。
【０１７４】
下記の表に示される結果は、一方で危険領域、他方で梗塞サイズによって表される。
【０１７５】
【表１】
【０１７６】
使用された実験モデルでは、試験された両方の化合物は、梗塞サイズを減少させる。さらに、結果は、該化合物が危険領域の拡張にかかわらず、梗塞サイズを減少させる。
【０１７７】
したがって、これらの結果は、これらの化合物の両方がインビボにおいて心臓保護効果を有することを示す。
【０１７８】
実施例１４：急性肝毒性のインビボモデルにおける３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの効果
この実験では、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール化合物の肝細胞の保護能力が試験される。
【０１７９】
多くの他の細胞のように肝細胞は、細胞質膜上にＦａｓ／ＣＤ９５受容体を担持する。Ｆａｓルートの刺激は、カスパーゼのカスケードを活性化することによって、細胞死を誘導する。
【０１８０】
肝障害の急性モデルは、Ｊｏ２抗Ｆａｓ抗体の１回注射によって誘導することができ（Ｏｇａｓａｗａｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，Ａｕｇｕｓｔ １９９３）、重篤な肝障害を生じさせ、ウイルス性、自己免疫性又は薬物誘導の肝炎と似ている。
【０１８１】
血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）とも呼ばれるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）は、肝細胞に存在する酵素である。その活性は、肝溶解後の血漿中に有意に増加し、したがって、肝障害を評価するための良好なマーカーである。
【０１８２】
材料及び方法
動物
ブリーダー「Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ」（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ−Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から雄性成体ＣＤ１マウスを用いた。動物は、個別に隔離され、水及び餌に自由な接近とした。
【０１８３】
設置は、光の調節サイクル（７：００ａｍ−７：００ｐｍ）、２０±２℃の温度、５０±２０％の湿度で維持された。
【０１８４】
Ｊｏ２抗体の調製
モノクローナル・ハムスター抗マウスＣＤ９５（Ｆａｓ）抗体のストック溶液は、Ｊｏ２と呼ばれ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｒｅｆ．５５４２５４、バッチ３２６９９）からのものであり、水で１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製される。使用された希釈は、水中の０．９％塩化ナトリウムで行った。
【０１８５】
試験されるべき化合物の調製
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの所望の量を計量し、微粉末に粉砕し、次に、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ ＥＬ（Ｓｉｇｍａ Ｃ５１３５）及び無水エタノール（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ ＲＰＥ ４１５７１）（それぞれ、最終容積の５％及び１０％）と混合した。完全な溶解後、水中の０．９％塩化ナトリウムを即座に添加する（最終容積の８５％）。
【０１８６】
２種類の実験を行う：Ｊｏ２による中毒と続くＡＬＡＴ評価、及びＪｏ２による致死的な中毒。
【０１８７】
−Ｊｏ２による中毒及びＡＬＡＴ評価：
手順
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールでの前処理は、Ｊｏ２抗体を投与する１時間前に、腹腔内投与による１０及び３０ｍｇ／ｋｇの服用量で実行される。Ｊｏ２抗体は、体重１ｋｇ当たり５ｍＬの容積で１２５μｇ／ｋｇの服用量を腹腔内に注射することによって投与される。
【０１８８】
対照は、化合物なしで、試験されるべき化合物を調製するために使用したのと同一の容積の抗体を投与する１時間前に、腹腔内投与による前処理を受ける動物を用いて得られる。
【０１８９】
ＡＬＡＴ評価
Ｊｏ２を投与して２４時間後、麻酔したマウスから血液を採取する。ＡＬＡＴアッセイは、ＩＦＣＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって標準化された方法に従って、分光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｍｏｄｕｌａｒ）を用いて、キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の使用によって行った。
【０１９０】
結果及び結論
１２５μｇ／ｋｇ服用量でのＪｏ２の腹腔内投与は、注射後の２４時間以内にマウスのいずれの死亡を誘導しない。
【０１９１】
ＡＬＡＴ活性は、１０及び３０ｍｇ／ｋｇで化合物３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールによって有意に減少させる。
【０１９２】
【表２】
【０１９３】
Ｊｏ２投与の１時間前に１０及び３０ｍｇ／ｋｇで投与された３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールにより、致死下の抗体服用量によって誘導される細胞死は制限され得る。
【０１９４】
ＡＬＡＴ活性は、血漿中の肝細胞崩壊のバイオマーカーであり、未処理の対照マウスよりも、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールで処理されたマウスにおいて有意に低い。
【０１９５】
−Ｊｏ２抗体による致死的な中毒
この実験では、致死的服用量のＪｏ２抗体を投与後の動物の生存における３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの効果を評価する。
【０１９６】
手順
Ｊｏ２抗体は、５ｍＬ／ｋｇ体重の容積で２００又は２５０μｇ／ｋｇの服用量で腹腔内注射によって投与される。
【０１９７】
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールは、前処理として、Ｊｏ２投与の１時間前、後処理として、Ｊｏ２投与の１時間後に１０及び３０ｍｇ／ｋｇで試験される。
【０１９８】
対照は、化合物なしで、試験されるべき化合物を調製するために用いられた溶液と同一の容積である、抗体投与の１時間前又は１時間後に腹腔内投与によって前処理を受ける動物を用いて得られる。
【０１９９】
結果及び結論
【０２００】
【表３】
【０２０１】
投与される服用量で、Ｊｏ２抗体は、対照群における２４時間以内の実質的な致死率（動物の７０〜１００％）を誘導する。
【０２０２】
投与された服用量で３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールでの前処理及び／又は後処理は、動物の生存率の増加を誘導する。
【０２０３】
したがって、抗体の致死的服用量（２００又は２５０μｇ／ｋｇ）が使用される場合、抗体の１時間前又は後、１０及び３０ｍｇ／ｋｇで投与された３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールは、２４時間でマウスの生存率を増加させる。
【０２０４】
結論
抗Ｆａｓ（Ｊｏ２）抗体によってマウスにおいて誘導された急性肝毒性のモデルを用いて、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの肝臓保護特性を示すことができた。
【０２０５】
これらの顕著な効果を用いて、式Ｉで表される化合物の使用は、一般的な細胞保護薬物の調製に意図され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経保護剤を除いて、細胞保護剤を得るための３，５−セコ−４−ノル−コレスタン誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞変性プロセスは、多くの場合、望ましくない細胞活性及び細胞死を引き起こす細胞の機能障害によって特徴付けられる。
【０００３】
細胞は、ストレスに反応して適応機能を発生させ、それらの寿命を伸ばし、又は細胞死を遅延若しくは阻害する（細胞保護機構）。
【０００４】
しかしながら、これらの細胞保護機構は、ある場合には不十分であり、不適切であり、又は非常に遅くなって誘導されるため、有効でなく、細胞が死滅する。したがって、細胞保護を促進する新規な細胞保護剤を有することに関心が高いことが分かってきた。
【０００５】
用語「細胞保護」は、細胞死、特に病的な細胞死及び／又は細胞死へ導く細胞の機能障害に対して細胞を保護する自然力又は保護しない能力を意味する。これらの細胞の機能障害は、例えば、ＡＴＰを発生させる能力の減少、カルシウムを捕捉及び／又は保持する無能力、又はフリーラジカルの発生などのミトコンドリア起源のものであってもよい。細胞死の主要なメカニズムの中では、壊死、アポトーシス、及びネクロトーシスで本質的に区別がなされている。
【０００６】
壊死は、組織に障害がある場合に起こるいわゆる「偶発的な」細胞死である。細胞のホメオスタシスの変化を引き起こす、大部分に影響を及ぼされるのは、細胞の原形質膜である。細胞は、それらの原形質膜の溶解を引き起こすまで水を吸収する。この細胞溶解は、周囲の培地に細胞質成分の放出をもたらす。壊死は、炎症過程を起源とする。
【０００７】
壊死は、一連の細胞又は組織に影響を及ぼし、他の隣接する部分は生存し続ける。結果としての変形は、細胞又は組織の変化である。換言すれば、壊死は、細胞が、臓器での血液供給の中断又は減少、高熱（温度の有意な上昇）、化合物による中毒、身体的衝撃などの重大な事象の結果としてその生命の終端に到達する場合に起こる形態的変化によって定義される。最も知られている壊死の１つは、冠状動脈の閉塞（妨害）による梗塞（心筋での血流供給の阻害）過程での心筋のものである。
【０００８】
アポトーシスは、生物の正常な生理学の不可欠な部分である。それは、細胞死の非常に制御された生理学的形態であり、例えば細胞生物の生存に不可欠である。アポトーシスは、胚形成過程で根本的な役割を果たすプロセスである。
【０００９】
アポトーシスにある細胞、即ちアポトーシスを起こした細胞は、それ自体、他の細胞から区別される。アポトーシスは、通常、組織中の個々の細胞に関係し、炎症を引き起こさない。アポトーシスの特徴的な形態学的ポイントの１つは、細胞容積の有意な減少を誘導する核及び細胞質の両方の有意な凝縮である。次に、核は断片化し、各断片は、二重エンベロープによって取り囲まれる。その後、アポトーシス小体は（細胞質及び核のエレメント）が放出され、隣接する細胞によるファゴサイトシーシスを介して吸収される。
【００１０】
アポトーシスは、様々な方法で誘導され得る。例えば、放射線、化合物又はホルモンの存在は、細胞におけるアポトーシスイベントのカスケードを誘導し得る刺激物である。細胞内のシグナル、例えば不完全な有糸分裂又はＤＮＡ損傷もアポトーシスを誘導し得る。
【００１１】
アポトーシスはまた、遺伝毒性物質の作用後又は疾患中に起こる。ある種の病原体は、ある種の細胞群の喪失を引き起こす異常なアポトーシス、例えば肝毒性、網膜症、心臓毒性によって特徴付けられる。
【００１２】
したがって、生理学的なアポトーシスと病的なアポトーシスとは区別される。本発明は、病的アポトーシスに焦点が当てられる。
【００１３】
例えば、壊死とアポトーシスの特徴をもつネクロトーシスなどの細胞死の他のメカニズムも存在する。ネクロトーシスによって死にかかっている細胞は、壊死によって死にかかっている細胞と同様の特徴を有するが、このメカニズムの生化学的段階は、アポトーシスとより類似している。細胞死のこのメカニズムは、例えば、虚血において発生する。
【発明の開示】
【００１４】
したがって、本発明の目的の１つはまた、利用可能な新規な薬物を作製することであって、それを用いて、壊死及び／又は病的アポトーシス及び／又はネクロトーシスの予防及び／又は治療を可能にし得る（抗壊死剤及び／又は抗アポトーシス剤及び／又は抗ネクロトーシス剤）。
【００１５】
細胞の変性過程は、とりわけ、変性弛緩又は作用、外傷又は種々の因子への曝露の条件で分類される病的な刺激に起因する場合がある。
【００１６】
これらの外傷及び因子には、例えば、照射（ＵＶ、γ線照射）、低酸素又は酸素欠乏、栄養素の欠如、増殖因子の欠如、毒物、細胞毒素、衰弱、環境毒素、フリーラジカル、反応性酸素又はさらにある種の医療イベント及び／又は処置、例えば細胞、組織及び臓器移植を含む外科的外傷が含まれ得る。また、化合物又は生物薬物が言及され、例えば細胞増殖抑制剤又は抗炎症剤などの医療処置の範囲にある治療薬として用いられる場合がある。
【００１７】
本発明の目的は、細胞死ではるが、実際には病理過程の細胞レベル又は該病原体の細胞レベルでの結果に至る病原体又は変性過程の細胞外の原因を処置すること、特に該結果に対する細胞を保護することではない。
【００１８】
変性過程によって特徴付けられる最も有意な病的状態のうち、本発明が指向していない神経障害又は神経変性障害以外であって、下記の状態が見出される：
骨、関節、結合組織の疾患、軟骨の疾患、例えば、骨粗鬆症、骨髄炎、例えば骨関節炎、関節リウマチ及び乾癬性関節炎を含む関節炎、虚血壊死、進行性骨化性線維形成異常症、くる病、クッシング症候群；
【００１９】
筋疾患、例えば筋ジストロフィー、例えばデュシェーヌ筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、ミオパシー及び筋無力症；
【００２０】
皮膚疾患、例えば皮膚炎、湿疹、乾癬、老化又はさらに瘢痕化の変化；
心臓血管疾患、例えば心虚血及び／又は血管虚血、心筋梗塞、虚血性心臓病、慢性又は急性うっ血性心不全、不整脈、心房細動、心室細動、発作性頻脈、うっ血性心不全、肥大性心臓病、酸素欠乏症、低酸素症、抗癌剤を用いた治療による副次的効果；
【００２１】
循環器疾患、例えばアテローム性動脈硬化症、動脈硬化症及び末梢血管疾患、脳血管発作、動脈瘤；
【００２２】
血液疾患及び血管疾患、例えば貧血、血管アミロイドーシス、出血、鎌形赤血球症、赤血球断片化症候群、神経減少症、白血球減少症、骨髄無形成症、全血球減少症、トロンボ血球減少症、血友病；
【００２３】
肺疾患、例えば肺炎、喘息；例えば慢性気管支炎及び肺気腫などの肺の閉塞性慢性疾患；
胃腸管疾患、例えば潰瘍；
【００２４】
肝臓の疾患、例えば肝炎、特にウイルス起源の肝炎又は原因物質として他の感染物質を有するもの、自己免疫肝炎、劇症肝炎、ある種の遺伝性代謝疾患、ウィルソン病、肝硬変、非アルコール性脂肪肝、毒素及び薬物による肝臓の疾患；
【００２５】
膵臓疾患、例えば急性又は慢性膵炎；
代謝疾患、例えば真性糖尿病及び尿崩症、甲状腺炎；
腎臓疾患、例えば急性腎障害又は糸球体腎炎；
【００２６】
ウイルス性及び細菌性感染、例えば敗血症；
化合物、毒素又は薬物による重篤な中毒；
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と関連した変性疾患；
【００２７】
老化と関連した障害、例えば促進老化の症候群；
炎症性疾患、例えばクローン病、リウマチ様多発性関節炎；
自己免疫疾患、例えば紅斑性狼瘡；
【００２８】
歯科障害、例えば歯周炎などの組織変性に帰着するもの；
眼科疾患又は障害、例えば糖尿病性網膜症、緑内障、黄斑変性症、網膜変性、網膜症、色素変性症、網膜裂孔又は裂傷、網膜剥離、網膜虚血、外傷に関連した急性網膜症、炎症性変性、術後合併症、薬剤性網膜症、白内障；
【００２９】
聴覚管の障害、例えば耳硬化症及び抗生物質によって誘導された難聴；
ミトコンドリアに関連した疾患（ミトコンドリア病）、例えばフリードリッヒ運動失調症、構造的ミトコンドリア異常を伴う先天型筋ジストロフィー症、ある種のミオパシー（ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥＲＦＦ症候群、パーキンソン症候群）、ＭＩＤＤ（ミトコンドリア糖尿病及び難聴）症候群、ウォルフラム症候群、ジストニア。
【００３０】
本発明はまた、移植前、移植中（摘出、輸送及び／又は再移植）又は移植後のいずれかで細胞、組織及び／又は臓器を保護することを対象とする。
【００３１】
薬理学的に活性な化合物は、上述した変性過程を調節するためになお探求される。
本発明は、細胞保護化合物に対するこの要求を満たす。実際に、本出願人は、３，５−セコ−４−ノルコレスタン誘導体、及び、特に３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール及びそのエステルが顕著な細胞保護特性を持って提供される。
【００３２】
これは、本発明の目的が式Ｉ：
【００３３】
【化１】
【００３４】
（式中、
Ｘ及びＹは一緒になって、ケトン基（＝Ｏ）、オキシム貴（＝ＮＯＨ）又はメチルオキシム基（＝ＮＨＯＭｅ）を表すか、又はＸはヒドロキシルを表し、Ｙは水素原子を表し；
Ｂは、ヒドロキシルラジカルを表し、Ｃ及びＤは、同一であるか又は異なっていて、水素原子又は１〜４個の炭素原始を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルラジカルを表し；
又はＢ及びＣは一緒になって、ケトン基を表し、Ｄはメチル、ヒドロキシ若しくはメチルアミンラジカルを表し；
又はＢ及びＣは、水素原子を表し、及びＤはメチルアミンラジカルを表し；
又はＢ及びＣは、一緒になって、オキシム基を表し、Ｄはメチルラジカルを表し；及び
Ｒは、１〜１０個の炭素原子を含む直線状又は分岐状のアルキルラジカルを表す）
で表される化合物の少なくとも１つ、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つの使用であるためであり、神経保護剤は除かれる。
【００３５】
本発明によれば、医薬として許容される酸との付加塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、グリオキシル酸、アスパラギン酸、アルカン・スルホン酸、例えばメタン又はエタンスルホン酸、アリールスルホン酸、例えばベンゼン若しくはパラトルエンスルホン酸又はカルボン酸で形成された塩であってもよい。
【００３６】
本発明によれば、オキシム基は、純粋又は混在したｓｙｎ及びａｎｔｉ異性体を表し、二重結合のＣ＝Ｎに対して、Ｎ−Ｏ結合の配向と関連している。
【００３７】
使用することができる式Ｉで表される化合物のラジカルＲは、優先的には、式ＩＩ：
【００３８】
【化２】
【００３９】
で表されるコレスタンラジカルである。
【００４０】
本発明の他の特定の態様によれば、Ｘ及びＹが一緒になってケトン基を表すか又はオキシム基を表す式Ｉで表される化合物が、優先的に使用される。
【００４１】
本発明のさらに他の特定の態様によれば、Ｂがヒドロキシルラジカルを表し、Ｃ及びＤが同一であるか又は異なっていて、水素原子又は１〜４個の炭素原子を含む直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルを表すか、又はさらにＢ及びＣが一緒になってケトン基を表し、Ｄがメチルラジカルを表す式Ｉで表される化合物が、優先的に使用される。
【００４２】
最も優先的には、式Ｉで表される化合物の少なくとも１つが、
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール、
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアルコール、又は
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−ジメチルアルコール
から選択され、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、あるいはそのエステルの１つ、又は該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つから選択される本発明に従って使用される。
【００４３】
式Ｉで表される化合物の対象とする細胞保護特性は、細胞保護剤を調製するためのそれらの使用を正当化し、特に、壊死、及び／又は病的アポトーシス、及び／又はネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）（抗壊死剤及び／又は抗アポトーシス剤及び／又は抗ネクロトーシス剤）、又は、さらに
【００４４】
骨、関節、結合組織及び軟骨の疾患、
筋肉疾患、
皮膚疾患、
心臓血管疾患、
循環器系疾患、
血液疾患及び血管疾患、
肺疾患、
胃腸管疾患、
肝疾患、
膵臓疾患、
代謝疾患、
【００４５】
腎疾患、
ウイルス感染及び細菌感染、
重篤な中毒、
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連した変性疾患、
老化に関連した障害、
炎症性疾患、
自己免疫疾患、
歯科疾患、
眼科疾患又は障害、
聴覚管の疾患、
ミトコンドリアに関連した疾患（ミトコンドリア病）
などの疾患を治療又は予防するために意図される。
【００４６】
本発明はまた、移植前、移植中（摘出、輸送及び／又は再移植）又は移植後のいずれかで細胞、組織及び／又は臓器を保護することを対象とする。
【００４７】
好都合には、式Ｉで表される化合物は、心臓細胞を保護するため（心臓保護剤）、肝細胞を保護するため（肝臓保護剤）に意図された薬物、又はミトコンドリアに関連した疾患を治療又は予防するために意図された薬物の調製において使用されてもよい。
【００４８】
本発明によれば、式Ｉの化合物は、好都合には、生理学的に有効な服用量で細胞保護剤に存在する；該薬物は、特に、少なくとも１つの、式Ｉで表される化合物の有効な細胞保護服用量を含む。
【００４９】
薬物として、式Ｉで表される化合物、それらのエステル、医薬として許容される酸とのそれらの付加塩、及び該エステルの医薬として許容される酸との付加塩は、消化管経路又は非経口経路溶に製剤化されてもよい。
【００５０】
本発明に係る薬物は、少なくとも１つの他の医薬として有効な成分をさらに含むことができ、それは、特に、前述の病気の１つによって影響される被験者を治療する場合に、同時に、別々の使用、又は時間的に間隔のある使用のために、同一であるか又は異なった病気に活性である。
【００５１】
本発明によれば、式Ｉで表される化合物は、１以上の不活性な、即ち医薬として不活性であり、無毒性な賦形剤又は担体と混合して薬物において用いることができる。言及は、例えば、医薬的な使用で適合可能であり、当業者に既知である食塩水、生理学的、等張、緩衝化された溶液などで作製されてもよい。この組成物は、分散剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤などの１以上の薬物又は担体を含んでもよい。製剤（液体及び／又は注射可能な及び／又は固形製剤）に用いることができる薬物又は担体は、特に、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油又は動物油、アカシアなどである。好ましくは、植物油が使用される。組成物は、注射可能な懸濁液、ゲル、油、錠剤、坐剤、粉末、ゼラチンカプセル、カプセルなどとして、場合により、長期及び／又は遅延放出を提供する剤形又はデバイスの手段で製剤化されてもよい。この種類の製剤については、セルロース、カルボネート又はスターチなどの薬物が好都合に使用される。
【００５２】
投与は、当業者に既知のいずれかの方法によって行うことができ、好ましくは経口又は注射により、典型的には腹腔内、大脳内、髄腔内、静脈内、動脈内又は筋内経路による。経口投与が好ましい。これは、長期間の治療であれば、好ましい投与経路は舌下、経口又は経皮である。
【００５３】
注射用には、化合物は、一般に、液体懸濁液として包装され、例えば、シリンジ又は緩流の手段で注射することができる。流速及び／又は注射される服用量又は一般には投与される量は、患者、病理学、投与法などに依存して当業者によって適応されてもよい。投与が繰り返し行われることは理解され、場合により、他の有効成分又は任意の医薬として許容される担体（バッファー、食塩水、等張液、安定化剤の存在など）と組み合わせられる。
【００５４】
本発明は、動物、特にヒトに用いることができる。
一般に、化合物の毎日の服用量は、所望の治療効果を得るために最小の服用量である。上述される化合物、例えば３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの服用量は、一般に、ヒトに対しては、１日に０．００１〜１００ｍｇ／キログラムで含まれる。
【００５５】
必要に応じて、毎日の服用は、１日当たり２、３、４、５、６回又はそれを超える摂取で投与されてもよく、その日中に適切な間隔をおいて投与される複数回の副投与であってもよい。
【００５６】
選択される量は、複数の因子、特に投与経路、投与期間、投与量、化合物の排出速度、化合物と組み合わせて用いられる種々の製造物、患者の年齢、体重及び身体状態、並びに彼／彼女の病歴、及び医学において知られているいずれかの他の情報に依存する。
【００５７】
医師の処方は、一般に使用されるよりも少ない服用量で開始され、次に、これらの服用量は、可能な副次的効果の発生をより良く調節するために徐々に増加される。
【００５８】
本発明に係る組成物、特に、医薬組成物又は薬物は、前述の式Ｉで表される化合物の少なくとも１つ、あるいは医薬として許容される酸とのその付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つを含む。
【００５９】
本発明に係る医薬組成物は、特に、前述の病原体の１つで影響された患者を治療する際、同時に、別々の使用、又は時間的に間隔のある使用のために、少なくとも１つの他の治療的に有効な成分をさらに含むことができる。
【００６０】
本発明に係る医薬組成物は、好都合には、１以上の不活性な、即ち、医薬として不活性であり、無毒性の賦形剤又は担体を含んでもよい。
【００６１】
式Ｉで表される化合物
本発明に使用される式Ｉで表される化合物は、式ＩＩＩ：
【００６２】
【化３】
【００６３】
（式中、Ｒは、前述に示された意味を有する）
で表される化合物を反応させることによって合成することができ、この化合物は、
−式Ｉ（Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹは一緒になってオキシム基を表し、ＢはＣと一緒になってケトン基を表し、Ｄはメチルアミン基を表す）で表される化合物を得るために、メチルアミン、次にヒドロキシルアミンの作用に置かれるか、又は
−式ＩＶ：
【００６４】
【化４】
【００６５】
（式中、Ｒは、前述に示された意味を有する）
で表される化合物を得るためにメチル化に置かれ、この化合物は、式Ｖ：
【００６６】
【化５】
【００６７】
（式中、Ｒは、前述に示された意味を有する）
で表される化合物を得るために、５位のケトン基を保護する試薬の作用に置かれ、この化合物は、
−式Ｉ（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹはオキシム基を表し、Ｂはヒドロキシル基を表し、Ｃ及びＤは１〜４個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルを表す）で表される化合物を得るために、メチルリチウムと反応させ、次に５位のケトン基を脱保護するための試薬の作用に置かれ、次にヒドロキシルアミンと反応されるか、又は
−式ＶＩ：
【００６８】
【化６】
【００６９】
で表される化合物を得るために、鹸化し、次に式Ｈ３Ｃ−ＮＨ−ＯＣＨ３で表される化合物と反応させ、次にメチルリチウムと反応させ、
【００７０】
この化合物は、式Ｉ（Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹは一緒になってオキシム基を表し、Ｂはヒドロキシル基を表し、Ｃは任意に置換された、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルを表し、Ｄは水素原子を表す）で表される化合物を得るために、ケトン基の還元に置かれ、次に５位のケトン基を脱保護するための試薬の作用に置かれ、次にヒドロキシルアミンと反応されるか、若しくは
−式ＶＩＩ：
【００７１】
【化７】
【００７２】
（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、Ｂはヒドロキシル基を表し、Ｃ及びＤは水素原子を表す）
で表される化合物を得るために還元され、この化合物は、
【００７３】
式ＶＩＩＩ：
【００７４】
【化８】
【００７５】
（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、このシッフ塩基は調製され、次に還元される）
で表される化合物を得るために酸化剤の作用に置かれ、その後、式Ｉ（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹは一緒になってオキシム基を表し、Ｂはメチルアミン基を表し、Ｃ及びＤは水素原子を表す）で表される化合物を得るために、５位のケトン基を脱保護するための試薬の作用に置かれ、次にヒドロキシルアミンと反応させるか、又は
−式Ｉ（式中、Ｒは前述に示された意味を有し、Ｘ及びＹは一緒になって、オキシム、メチルオキシム及びカルボキシメチルオキシム基を表し、Ｂはヒドロキシル基を表し、Ｃ及びＤは水素原子を表す）で表される化合物を得るために、５位のケトン基を脱保護するための試薬の作用に置かれ、次に、それぞれ、ヒドロキシルアミン、メチルヒドロキシルアミン及びカルボキシメチルヒドロキシルアミンから選択されるアミンと反応させることによって合成され、
そして、式Ｉで表される化合物が単離され、所望により加塩又はエステル化されて単離され、次に所望により加塩される。
【００７６】
上述した方法を適用するための優先的な条件下で、
−式ＩＩＩで表される化合物とメチルアミンとの反応は、特にジクロロメタン又はジメチルホルムアミドなどの適切な溶媒中で、好都合にはＮ−メチルモルホリンなどの塩基の存在下で、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）又はＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニム・テトラフルオロボレート）などの酸性基を活性化するカップリング試薬の存在下で実行される。好ましくは、ジクロロメタン中の４−ジメルアミノピリジンと関連付けられたＥＤＣＩ（１−エチル−３−（３’−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）の存在下で実行され、混合物は室温で２４時間撹拌に供される。次に、この製造物は、溶液、好ましくはピリジン中に設置され、次に、５〜７、特に６当量のヒドロキシルアミン塩酸塩が添加される。
【００７７】
−式ＩＩＩで表される化合物のメチル化は、塩化チオニルの存在下でメタノールとの反応によって、好ましくは７０％メタノールと３０％ジクロロメタンの混合物の適切な容積で式ＩＩで表される酸を可溶化することによって達成される。０℃に冷却後、３当量の塩化チオニルを滴下して添加する。次に、２時間室温で撹拌する。この化合物に関して、ケトン基の保護は、好ましくは、過剰の、例えば１０当量のトリメチルオルトホルメートと適切な容積のエチレングリコール中で該製造物を溶解し、次に無水ｐ−トルエン−スルホン酸を添加することによって行われる。
【００７８】
−式Ｖで表される化合物とメチルリチウムとの反応は、好ましくは、無水ＴＨＦ中で行われ、次に、約−４５℃まで冷却し、過剰のメチルリチウムを滴下して添加することによって行われる。５位のケトン基をブロックするジオキソランの脱保護は、硫酸の存在下でアセトン中で達成される。好ましくは、これは、１／１の水／酢酸混合物の存在下でジオキサン中で実行される。ケトンのオキシムは、好都合には上記のように作製される。
【００７９】
−式Ｖで表される化合物の鹸化は、ソーダを用いて、好ましくはジオキサン中で達成される。特に、約２当量のソーダ水が添加される。この製造物は、例えば、ジクロロメタン又はジメチルホルムアミドなどの適切な溶媒中で、Ｎ−メチルモルホリンなどの塩基の存在下でＢＯＰ又はＴＢＴＵなどの酸性基を活性化するカップリング試薬の存在下で、式Ｈ３Ｃ−ＮＨ−ＯＣＨ３で表される化合物と反応される。好ましくは、これは、ヒドキシベンゾトリアゾールと関連付けられたＥＤＣＩの存在下で行われ、トリエチルアミンが溶媒中に滴下して添加される。この製造物は、上述した手順に従って、アルゴン雰囲気下でメチルリチウムと反応させ、次に、３位のケトン基を水素化ホウ素ナトリウムによって還元される。その後、得られた製造物は、５位のケトン基の脱保護に供し、上述したように同じ手順に従ってヒドロキシルアミンと反応させる。
【００８０】
−式ＶＩＩで表される化合物を得るために、式Ｖで表される化合物の還元が、好ましくは、リチウムアルミニウム水素化物を用いて、特にテトラヒドロフランの懸濁液中に設置することによって達成される。それは、硫酸ナトリウム溶液を注意深く添加することによって加水分解される。
【００８１】
−式ＶＩＩで表される化合物の酸化は、ピリジニウム・クロロクロム酸塩を用いて達成される。この製造物に関して、シッフ塩基が得られ、瞬時に、特に、トリエチルアミン、メチルアミン塩酸塩とチタニウム・テトラ−イソプロポキシドの存在下で、好ましくはエタノール中、アルゴン下で可溶化することによって、次に、水素化ホウ素ナトリウムを添加することによって還元される。５位のケトン基の脱保護及びヒドロキシルアミンとの反応は、前述の条件下で実行される。
【００８２】
下記の実施例は、本出願を例示するが、それを限定するものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例
以下の反応時間は、分＋分の百分のいくつかで表される。
【００８４】
全製造物に用いられる液体クロマトグラフィー法は、下記の通りである：
カラム：Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ−Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ（登録商標）３００−６ Ｃ４−１５０×４．６ｍｍ
勾配；水（＋０．０５％のトリフルオロ酢酸）／アセトニトリル（＋０．０５％のトリフルオロ酢酸）
【００８５】
ｔ＝０分；６０％アセトニトリル、４０％Ｈ２Ｏ
ｔ＝６分；１００％アセトニトリル、０％Ｈ２Ｏ
ｔ＝１１分；１００％アセトニトリル、０％Ｈ２Ｏ
ｔ＝１３分；６０％アセトニトリル、４０％Ｈ２Ｏ
ｔ＝１５分；６０％アセトニトリル、４０％Ｈ２Ｏ
【００８６】
質量分析器のイオン化条件は下記の通りである：
ソース温度：２５０℃
円錐電圧：５０Ｖ
キャピラリー電圧：３ｋＶ
Ｒｆレンズ：０．３Ｖ
【００８７】
実施例１：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミドの合成
工程Ａ：第１段階では、２５０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−酸、３８ｍｇのメチルアミン塩酸塩、２５０ｍｇのＥＤＣＩ、１００ｍｇのＤＭＡＰ及び２．５ｍＬのジクロロメタンをフラスコに導入される。この溶液を２４時間室温で撹拌し、次に、反応媒体をジクロロメタンを添加することによって希釈し、１０％重炭酸ナトリウムで洗浄する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９５／５）によって精製する。１７６ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミドを収率６８％で回収する。
【００８８】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．４２分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１８；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝８３５
【００８９】
工程Ｂ：次に、１ｍＬ中のピリジン中の５０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルアミド、５０ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。反応媒体を１６時間室温で撹拌し、次に、減圧下で濃縮する。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物中に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。４０．６ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミドを収率７８％で回収する。
【００９０】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．７０分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３３；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝８６５
【００９１】
実施例２：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−ジメチルアルコールの合成
工程Ａ：フラスコにおいて、１０．５ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−酸を３７８ｍＬのメタノールと１４６ｍＬのジクロロメタンに溶解させる。混合物を０℃に冷却し、５．７ｍＬの塩化チオニルを滴下して添加する。次に、２時間室温で撹拌する。反応媒体を減圧下で濃縮し、トルエン、次にジクロロメタンとの同時蒸発させある。１０．３ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルエステルは、収率９４％で得られる。この製造物は、いずれの精製なしにそのまま用いる。
【００９２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．６９分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１９；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝７８５
【００９３】
工程Ｂ：フラスコにおいて、９．６２ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルエステルを２５ｍＬのトリメチルオルトホルメート及び５３ｍＬのエチレングリコールの溶液に置かれる。４００ｍｇ（２．３ｍｍｏｌ）の無水ｐ−トルエン−スルホン酸を添加し、次に、一晩室温で撹拌する。酢酸エチルを反応媒体に添加する；洗浄は１０％炭酸水素ナトリウム溶液を用いて行う。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。９．９５ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５−（エチレンジオキシ）−３−メチルエステルを収率９３％で得た。この製造物はいずれの精製なしに用いられる。
【００９４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．７６分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６３
【００９５】
工程Ｃ：フラスコにおいて、３００ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５−（エチレンジオキシ）−３−メチルエステルを５ｍＬの無水ＴＨＦに溶解させる。媒体を−４５℃まで冷却し、次に、エーテル中の１．３６ｍＬの１．６Ｍメチルリチウムを滴下して添加する。−４５℃で３０分の撹拌後、数滴のメタノールを反応媒体に添加し、後者を室温に戻す。２０ｍＬのジエチルエーテルを採取し、重炭酸ナトリウムで飽和した溶液で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に、減圧下で濃縮する。２９５ｍｇの３，５−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−ジメチルアルコール（ＭＷ＝４６２）を収率９８％で得る。
【００９６】
保持時間：５．５６分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ−（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ）＋Ｈ］＋＝４０１
【００９７】
工程Ｄ：フラスコにおいて、６ｍＬの水／酢酸（１／１）混合物及び２９５ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−ジメチルアルコールを添加し、１時間３０分間還流する。冷却後、反応媒体を酢酸エチルで希釈し、塩化ナトリウムで飽和した溶液で洗浄し、次に、重炭酸ナトリウムで飽和した溶液で洗浄する。最後に、有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮させる。得られた原産物は、フラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル（８／２））によって精製する。１８０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−ジメチルアルコールを収率６８％で得る。
【００９８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．０８分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１９；［Ｍ−Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋＝４０１；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝８３７
【００９９】
実施例３：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−ジメチルアルコールの合成
５３ｍＬのピリジン及びケトンを溶解させるための数ｍＬのジクロロメタン中の１ｇの実施例２の化合物、１ｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。反応媒体を室温で１６時間撹拌し、次に、減圧下で濃縮する。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物中に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。８１４ｍｇの３，５−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−ジメチルアルコールを収率７８％で得る。
【０１００】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．０９分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３４；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝８６７
【０１０１】
実施例４：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアルコールの合成
工程Ａ：２６ｍＬのジオキシ中の３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルエステルをフラスコに設置する。８．６ｍＬの１Ｎソーダ溶液を添加する。反応媒体を１時間３０分還流し、ジオキシを減圧下で蒸発させる。得られた溶液をｐＨ＝１になるまで１Ｎ塩酸溶液を添加することによって酸性にし、トルエンで２回抽出する。有機層を回収し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。１．９２ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−酸を収率９９％で回収し、いずれかの追加の処置なしに次の工程で用いる。
【０１０２】
工程Ｂ：３０ｍＬのジクロロメタン中の１．９ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−酸をフラスコに設置する。この溶液に、１．６ｇのＥＤＣＩ、７４３ｍｇのＨＯＢＴ、５３７ｍｇのＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩、及び、次に１．３７ｍＬのトリエチルアミンを滴下して添加する。室温で１６時間撹拌する。ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物を反応媒体に添加し、後者をジクロロメタンで３回抽出する。有機層を回収し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル（８／２））によって精製する。１．４６ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−（Ｎ，Ｎ−メトキシ−メチル）アミドを収率７０％で回収する。
【０１０３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．３１分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４９２
【０１０４】
工程Ｃ：２０ｍＬの無水テトラヒドロフラン中の１．４ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−（Ｎ，Ｎ−メトキシ−メチル）アミドをアルゴン下で導入し、０℃まで冷却する。次に、エタノール中の３．３８ｍＬの１．６Ｍのメチルリチウム溶液を滴下して添加する。反応媒体を３時間４０分間、０℃で撹拌し、その後、７．２８ｍＬの水中の０．７２ｍＬの濃塩酸の溶液を滴下して添加する。テトラヒドロフランを減圧下で蒸発させる；得られた水溶液をｐＨ＝１０になるまで１Ｎソーダを添加することによって塩基性にする。ジエチルエーテルで抽出する；有機層を回収し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル（９／１））によって精製する。９３０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルケトンを収率７３％で回収する。
【０１０５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．６５分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４０３
【０１０６】
工程Ｄ：１．５ｍＬのメタノール中の１１９ｍｇの工程Ｃの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルケトンをフラスコに設置する。混合物を０℃に冷却し、１０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを添加する。反応媒体を１時間、０℃で撹拌し、次に、減圧下で濃縮する。残渣を水中に採取し、ジクロロメタンで抽出する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。９４ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルアルコールを収率７８％で回収し、この製造物をそのまま用いる。
【０１０７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．２２分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝３８７
【０１０８】
工程Ｅ：５位のケトン基を脱保護するために、実施例２の工程Ｄとように操作を行う。
【０１０９】
工程Ｆ：１２１ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルアルコール、１．５ｍＬのピリジン、及び１２１ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。この溶液を２日間室温で撹拌する。反応媒体を減圧下で濃縮し、水中に採取し、ジクロロメタンで抽出する。次に、有機層を水で洗浄し、その後、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。それによって得られた製造物は、フラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル（９／１））によって精製する。６６ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアルコールを収率５３％で得る。
【０１１０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．９１分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４２０
【０１１１】
実施例５：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミンの合成
工程Ａ：６１５ｍｇのＬｉＡｌＨ４をフラスコにおいて５７ｍＬのＴＨＦに懸濁させる。懸濁液を０℃に冷却し、５７ｍＬのテトラヒドロフラン中の３．０ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルエステルの溶液を滴下して添加する。次に、０℃で５時間撹拌する。加水分解は、硫酸ナトリウム溶液を注意深く添加することによって行う；得られた白色の溶液を３０分間撹拌し、次に濾過する。濾過物を減圧下で濃縮し、水中に採取し、酢酸エチルで抽出する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。２．５５ｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−オールを収率８５％で得て、製造物をそのまま用いる。
【０１１２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．８２分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ−（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ）＋Ｈ］＋＝３７３
【０１１３】
工程Ｂ：アルゴン下のフラスコにおいて、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−オールを７ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、次に、１８９ｍｇの中和アルミナ及び３９９ｍｇのピリジニム・クロロクロム酸塩を添加する；室温で３時間３０分撹拌する。反応媒体は、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）上でろ過する；ろ過物を減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル ９／１及び次に８／２）によって精製する。３２８ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−アールを収率６９％で得る。
【０１１４】
保持時間：５．５７分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３３
【０１１５】
工程Ｃ：アルゴン下のフラスコにおいて、３２３ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−アールを３ｍＬのエタノールに溶解させ、次に、２０９μＬのトリエチルアミン、１００ｍｇのメチルアミン塩酸塩及び４４４μＬのチタニウム・テトライソプロポキシドを添加する。反応媒体を６時間室温で撹拌し、次に、４２．５ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを添加する。１６時間室温で撹拌する。反応媒体をろ過し、ジクロロメタンで洗浄する。ろ過物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られる残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール ９／１〜５／５）によって精製する。８４ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−オキシム−３−メチルアミンを収率２５％で得る。
【０１１６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．９３分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４４８
【０１１７】
工程Ｄ：５０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５，５（エチレンジオキシ）−３−メチルアミン及び９７６μＬの水／酢酸 １／１混合物をフラスコに添加する。混合物を６時間還流する。冷却後、反応媒体を酢酸エチルで希釈し、塩化ナトリムで飽和した溶液で洗浄し、次に、５％重炭酸ナトリム溶液で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた製造物をフラッシュ・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール（９５／５））によって精製する；５ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルアミンを収率１１％で得る。
【０１１８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．６８分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４０４
【０１１９】
工程Ｅ：５ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−メチルアミン、５ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩及び２８７μＬのピリジンをフラスコに導入する。混合物を１６時間室温で撹拌する。それをジクロロメタンに採取し、水で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。５ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアミンを収率９１％で得る。
【０１２０】
保持時間：３．６６分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１９
【０１２１】
実施例６：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンメチルオキシム−３−オールの合成
１ｍＬのピリジン中の２０ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−オール、２０ｍｇのＯ−メチル−ヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。３６時間室温で撹拌し、１０ｍｇのＯ−メチル−ヒドロキシルアミン塩酸塩を再び添加する。１６時間室温で撹拌し、反応媒体を減圧下で濃縮する。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物中に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。フラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル（９／１））によって精製し、１８ｍｇの黄色油状物を得る。５．８ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンメチルオキシム−３−オールを収率７２％で得る。
【０１２２】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：５．５０分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４２０
【０１２３】
実施例７：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンカルボキシ−メチルオキシム−３−オールの合成
０．５ｍＬのピリジン中の５２ｍｇのケトン、２５ｍｇのカルボキシメチルヒドロキシルアミン・半塩酸塩をフラスコに導入する。２日間、室温で撹拌し、次に、反応混合物を減圧下で濃縮する。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２／水混合物に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、その後、２％塩酸溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸（８／２））によって精製する。２４ｍｇは、カルボキシメチルオキシから収率３９％で得られる。
【０１２４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：４．４０分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６４；［２Ｍ＋Ｈ］＋＝９２７
【０１２５】
実施例８
懸濁液を調製し、式３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールを２０ｍｇ／ｍｌに合わせる。
賦形剤：油性エマルジョン
【０１２６】
実施例９
乾燥型を調製し、式３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステル・塩酸塩 ２５０ｍｇを合わせる。
賦形剤：ｑｓｐ ７５０ｍｇに終了させたゲル化カプセル
【０１２７】
実施例１０：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステルの合成：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールのプロドラッグ
【０１２８】
１０〜１５ｍＬのジクロロメタン中の５０９ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−オール、１８２ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルグリシン・塩酸塩、２７５ｍｇのＥＤＣＩ及び２０７ｍｇのＤＭＡＰをフラスコに置く。室温で１６時間撹拌する。５％重炭酸ナトリウム溶液を反応媒体に添加し、後者をジクロロメタンで抽出する。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル（８／２））によって精製する。４８８ｍｇは、収率７８％で回収される。
【０１２９】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．７７分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４７６
【０１３０】
次に、製造物は、下記の反応に使用される：
２３ｍＬのピリジン中の４８８ｍｇの得られた製造物及び４８８ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。１６時間、室温で撹拌し、次に、反応媒体をＣＨ２Ｃｌ２／水混合物に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。３７８ｍｇのオキシムを収率７５％で回収する。次に、製造物は、塩酸塩として製造物を得るために、ＨＣｌ溶液によって酸性にしたエーテル溶液の存在下で加塩される。
【０１３１】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．４３分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４９１
【０１３２】
実施例１１：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−（４−メチル−１−ピペラジン）プロパン酸エステルの合成：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールのプロドラッグ
２〜３ｍＬのジクロロメタン中の２６４ｍｇの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オン−３−オール、リチウム塩として１２１ｍｇの４−メチル−１−ピペラジン−プロパン酸、１４．２５ｍｇのＥＤＣＩ及び１０６ｍｇのＤＭＡＰをフラスコに置く。室温で一晩撹拌する。水を反応媒体に添加し、媒体をジクロロメタンで抽出する。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュ・クロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル（９８／２））によって精製する。所望の製造物の５４ｍｇは、収率１５％で回収される。
【０１３３】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．６６分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５４５
【０１３４】
次に、製造物を下記の反応に関与させる：
１．２ｍＬピリジン中の３０ｍｇの得られた製造物及び３０ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩をフラスコに導入する。５時間３０分室温で撹拌し、次に、反応媒体をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ混合物に採取する；有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。１９ｍｇのオキシムを収率１３％で回収する。
【０１３５】
分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：共通
保持時間：３．６２分
質量分析の検出ピーク：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５６０
【０１３６】
次に、製造物を二塩酸塩として製造物を得るために、塩酸水溶液によって酸性にしたエーテル溶液の存在下で加塩される。
【０１３７】
実施例１２：３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの抗アポトーシス効果：ウサギ心室心筋細胞の収縮性及びアポトーシス
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの抗アポトーシス効果（アザステロイダル・アルカロイド。Ａ−ノル−Ｂ−ホモ−５−アザコレスタンの合成。Ｒｏｄｅｗａｌｄ，Ｗ．Ｊ．；Ｗｉｃｈａ，Ｊ．Ｕｎｉｖ．Ｗａｒｓａｗ，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｉｓｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｃａｄｅｍｙ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ（１９９３），１１（８），ｐｐ．４３７−４４１）をドキソルビシンによって誘導された収縮不全試験によって、心筋細胞で分析した。
【０１３８】
材料及び方法
試験される化合物
１００％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭの濃度で、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールのストック溶液を用いた。
ＤＭＳＯ中の最終濃度は、使用さえるモル濃度とは独立して、全ての実験点に関して同じであった。
【０１３９】
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールは、Ｔｙｒｏｄｅ溶液（組成（ｍｍｏｌ／Ｌ）：ＮａＣｌ １３５，ＫＣｌ ５．４，ＮａＨ２ＰＯ４ ０．３３，ＣａＣｌ２ １．２，ＭｇＣｌ２ １．０，ＨＥＰＥＳ １０；ＮａＯＨで７．４に調整されたｐＨ）に希釈された、０．１及び０．３μＭの濃度で試験された。
【０１４０】
ウサギ心室心筋細胞の単離された細胞を得ること
単離された心室細胞は、Ａ．ｄ’Ａｎｇｌｅｍｏｎｔ ｄｅ Ｔａｓｓｉｇｎｙら，Ｆｕｎｄ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１８：５３１−３８，２００４に記載される雄性Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄウサギの心臓から得た。要約すると、ウサギ（２．０〜２．５ｋｇ）をペントバルビタール溶液（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、次に、ヘパリン（２００ＩＵ／ｋｇ）を摂取する。心臓を摘出し、即座に、酸素化Ｔｙｒｏｄｅ（カルシウム不含）等張溶液（９５％、２〜５％ＣＯ２）（ｍＭ：ＮａＣｌ １３５，ＫＣｌ ５．４，Ｎａ２ＰＯ４ ０．３３，ＭｇＣｌ２ １．０，ＨＥＰＥＳ １０，１Ｎ ＮａＯＨで７．４に調整されたｐＨ、３７℃、２８０〜３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏ）を用いて、再還流なしに、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置の手段により１０〜１５分間緩流させる。次に、心臓全てを１ｍｇ／ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ及び０．２８ｍｇ／ｍＬのＸＩＶ型プロテアーゼを添加した同じカルシウム不含のＴｙｒｏｄｅ溶液（冠血流速度、１０〜１５ｍＬ／分）である「再緩流」モードで３分間緩流する。最後に、全ての心臓は、０．３ｍＭのＣａＣｌ２を補足したＴｙｒｏｄｅ溶液の同溶液を用いて、いずれの再緩流がないモードで１０分間緩流される。左心室を取り出し、小片に切断する；細胞分離は、穏やかな機械的撹拌によって達成される。細胞外カルシウムは、１．０ｍＭの生理的濃度を達するために、１５分毎の増加によって添加される。単離された筋細胞は、実験前の最大１時間３０分に至るまで、ＮａＣｌ １１０，ＫＣｌ ５．４，Ｎａ２ＰＯ４ ０．３３，ＮａＨＣＯ３ ２５，グルコース ５，ＭｇＣｌ２ ０．８，ＣａＣｌ２ １（ｍＭ），７．４に調整されたｐＨを含む血清不含培地中で維持される。全ての細胞は棒状であり、蒼く交差した横紋があり、光学顕微鏡下で表面にはいずれのビヒクルはない。
【０１４１】
アネキシンＸによるマーキング
ホスファチジルセリンのアネキシンＸによるマーキングは、ＭｉｎｉＭａｃｓ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって、アポトーシスを測定するための定量的な方法として用いた。要約すると、ホスファチジルセリンに晒されている細胞は、アネキシンＸ微粒子を用いて磁気的にマークされ、次に、磁場に置かれたカラムに通過される。マークされた細胞（磁気的にマークされたホスファチジルセリンを有する）はカラムに保持され、マークされていない細胞（壊死及び非アポトーシス細胞）は、保持されない。カラムを磁場から外され、磁気的に保持されたホスファチジルセリンに晒されている細胞は、正の分画として溶出され、Ｍａｌｌａｓｓｅｚセルカウンターでカウントされる。次に、アポトーシス細胞の割合は、初期の細胞数に参照される。
【０１４２】
カスパーゼ−３活性の測定
カスパーゼ−３活性は、アポトーシスを測定するための定量的な方法として使用される。要約すると、細胞を溶解し、上清を用い、ＡＫ−００５キット（Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いることによってカスパーゼ−３活性を測定する。カスパーゼ−３活性を測定するための蛍光基質（ＤＥＶＤ）は、蛍光色素である７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）でマークされ、これは、３６０／４６０ｎｍで２１０分間、ＵＶ光で検出可能な黄色−緑色蛍光を生じる。ＡＭＣは、カスパーゼ−３による開裂によって基質から放出され、酵素発現がｆｍｏｌ／分で表される。
【０１４３】
収縮性の測定
筋細胞は、３７℃で連続的に緩流したチャンバーに移し、倒立顕微鏡のステージ上で配置される。チャンバーは、ＮａＣｌ １４０，ＫＣｌ ５．４，ＣａＣｌ２ １；ＭｇＣｌ２ ０．８；ＨＥＰＥＳ １０（ｅＭ）及びグルコース５．６（ｐＨ＝７．４；２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏ）を含む生理学的バッファーを用いて緩流される。
【０１４４】
筋細胞の収縮は、チャンバーに設置され、刺激機に接続された白金電界電極で１秒間に１回（１Ｈｚ）で誘導される。画像は、ａ×２０の対象で連続的に捕捉され、２４０試料／秒の速度でＣＣＤカメラに送信される。ＣＣＤカメラの画像は、ビデオスクリーン上に投影される。
【０１４５】
筋細胞は、下記の基準に従って、試験のために選択される：非常にはっきりとした横紋を有し、液胞のない棒状の様相であって、１ｍＭ Ｃａ２＋で刺激した場合に自発収縮がなく、一定の静止長及び収縮振幅を有する様相。筋節の長さは、ビデオ画像分析プログラムによって測定され、データは、２４０試料／秒の速度で獲得された。カメラ画像は、筋節長の測定に変換した。収縮率は、筋節の長さに基づくこれらのデータから計算される。
【０１４６】
データ分析
全てのデータは、平均±標準偏差として表された。種々のグループ間のデータの比較は、ＡＮＯＶＡ、続くスチューデント試験によって実行され、有意差はｐ＜０．０５であった。
【０１４７】
実験手順
アポトーシスは、ＮａＣｌ １１０，ＫＣｌ ５．４，Ｎａ２ＰＯ４ ０．３３，ＮａＨＣＯ３ ２５，グルコース ５，ＭｇＣｌ２ ０．８，ＣａＣｌ２ １（ｍＭ），７．４に調整されたｐＨを含む等張溶液に添加された１μＭのドキソルビシンへの３〜８時間の暴露によって単離された心筋細胞において誘導される。アネキシンＸによるマーキングは、ドキソルビシンの暴露開始の３時間後に達成された。これは、この化粧は、アポトーシスのカスパーゼの非常に初期に見られるためである。カスパーゼ−３活性の測定は、ドキソルビシンの暴露開始の８時間後に実行される。これは、この現象は、アポトーシス現象の後期に起こるためである。全ての処理後、細胞は、ドキソルビシンに暴露されていない対照の心筋細胞と比較した。
【０１４８】
心筋細胞は、ドキソルビシンによる暴露前の１５分間３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール化合物で前処理された。２つの濃度のこの化合物は、この実験中に試験された：０．１及び０．３μＭ。
【０１４９】
結果
この実験で使用される細胞の筋節の平均長は、これらのグループの間であまり相違していなかった。
【０１５０】
○心筋細胞の収縮性及びアポトーシスにおけるドキソルビシンの効果
ドキソルビシンの暴露は、筋節の短縮の経過時間の減少をもたらした。ドキソルビシン下でのピークの短縮は、最初の３時間、対照と同じであり、次に、暴露の４時間後に有意に減少した（ドキソルビシンのベースラインと対照のベースラインを比較して、それぞれ−５３．２０±７．７０％対−１９．４９±２．０６％（ｐ＜０．０５，ｎ＝５））。
【０１５１】
１μＭのドキソルビシンの処理は、アポトーシスを誘導し、アネキシンＸによるマーキング及びカスパーゼ−３活性において有為な増加を伴った。
【０１５２】
○ドキソルビシンによって誘導された収縮性のレベルでの機能障害及びアポトーシスにおける３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの効果
１μＭのドキソルビシンの処理は、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール（０．１及び０．３μＭ）の存在下で止められる心室心筋細胞ピークの短縮の有意な減少をもたらした。実際に、暴露４時間後、ドキソルビシン下でのピークの短縮（−５３．２０±７．７０％）は、ベースラインと比較して、０．１μＭ（１８．９±５．４％）及び０．３μＭ（−８．１±９．６％）の化合物で有意に減少した。
【０１５３】
さらに、ドキソルビシンによるアネキシンＸによるマーキング及びカスパーゼ−３活性増加は、０．１μＭ及び０．３μＭの３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールによってブロックされた。
【０１５４】
ドキソルビシンの３時間後のアネキシンＸによるマーキングのａ％変化として評価されたアポトーシスは、下記の結果を与えた：対照：１００％；ドキソルビシン：３２０％±４８．７；ドキソルビシン＋０．１μＭ３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール：１１６．３％±１５．１；ドキソルビシン＋０．３μＭ３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール：１３７．３％±１９．３。カスパーゼ−３活性測定に関する結果は、下記のとおりである：対照：１９±９ｆｍｏｌ／分；ドキソルビシン：１２０±１５ｆｍｏｌ／分；ドキソルビシン＋０．１μＭ ３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール：２７±２０ｆｍｏｌ／分；ドキソルビシン＋０．３μＭ ３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール：１５±７ｆｍｏｌ／分。
【０１５５】
コメント及び結論
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール化合物は、単離されたウサギ心室細胞における、ドキソルビシンによって誘導された収縮障害及びアポトーシスの心臓保護効果を示す。この分子は、適切な服用量で用いた場合、実際には、このアントラサイクリンで癌患者の治療において制限因子となることが知られているドキソルビシンによって誘導される心臓毒性に対して保護を提供することができる。したがって、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール化合物は、これらの患者におけるドキソルビシン心臓毒性を制限するために用いることができる。
【０１５６】
実施例１３：マウスの心筋梗塞のインビボモデルにおける化合物３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール及び３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステルの効果
この実験の目的は、インビボにおいて、マウスの冠動脈閉塞再緩流モデルにおける、化合物３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール及び３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステルの心臓保護特性を試験することである。
【０１５７】
試験される化合物は、予め虚血にした心筋の再緩流５分後、マウスにおいて静脈投与される。対照として、それぞれ化合物β−シクロデキストリン（以下、βＣＤと呼ぶ）及び水の担体は、前記化合物と同じ条件下で投与された。
【０１５８】
試験化合物の効果を測定するために、梗塞の大きさを２４時間の再緩流後に測定される。
【０１５９】
動物のための外科器具
６〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６マウスは、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で麻酔され、実験を通じて、Ｏ２／ＣＯ２（９５％／５％）で挿管後、酸素を供給する。表面の心電図（ＥＣＧ）は、全ての外科処理を通じて記録され、オシロスコープ上で視察される。厳格な無菌条件下で、頸静脈は、化合物の静脈投与のためにカテーテルを挿入される。左側面開胸術を行い、心膜切開術後、左冠状動脈の主要なブランチは、左心室の側面後部領域に位置される。プロレン８番縫合糸は、一時的な冠動脈閉塞を作るための移動ループを形成するためにこの動脈周辺に配置される。
【０１６０】
実験手順
全てのマウスは、３０分の一時的な冠動脈閉塞に供した。心筋領域の虚血は、心筋表面のチアノーゼ及び心電図のＳＴセグメントの逸脱によって確かめられる。
【０１６１】
化合物（処置群、ｎ＝１０）又はその溶媒和物（対照群、ｎ＝１０）の各々は、３０分の冠動脈閉塞を解除する５分前に、静脈投与された。
【０１６２】
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールは、飽和し、遠心分離によって調製されたリン酸バッファーの３０％βＣＤ溶液中の０．４６ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように予め溶解させ、１ｍｇ／ｋｇの服用量で投与される。
【０１６３】
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステルは、撹拌及び超音波処理によって無菌水中で１．５６ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように予め溶解させ、３．９ｍｇ／ｋｇの服用量で投与される。
【０１６４】
同容積の担体が、対応する対照群において投与される。
再緩流は、心電図のＱＲＳセグメントの様相によって確かめた。
【０１６５】
面ごとに（ｐｌａｎｅ ｂｙ ｐｌａｎｅ）胸部を閉じ、ドレインによる吸引によって気胸を排出した後、マウスを徐々に覚醒させ、正常な自然呼吸を再開するまで、呼吸支援を取り上げる。必要に応じて、ブプレノルフィン（１ｍｇ／ｋｇ）は、効果的な鎮痛適用を提供するために腹腔内に投与される。
【０１６６】
冠動脈閉塞の終了の２４時間後、マウスを再度、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で麻酔させ、ヘパリンを静脈投与する（Ｃｈｏａｙ（著作権）ヘパリン １，０００ＩＵ／ｋｇ）。冠状動脈の結紮は、以前の最初の閉塞２４時間に供されたのと同じ位置で達成される。次に、マウスは、塩化カリウムの致死的に飽和した服用量で安楽死させ、心臓を迅速に摘出し、その後、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ型の逆行性緩流システムで大動脈を通じて開始する。
【０１６７】
５％のエヴァンズ・ブルー溶液は、健常な心筋を青色に着色するために、逆に緩流させる；冠動脈閉塞中の虚血された部分、即ち「危険性のあるＡＲの領域」は、デフォルトによって着色されないままである。
【０１６８】
次に、左心室は、マウスの心臓用に特別に設計されたスライサー（Ｌｅｓ Ｉｓｏｌａｎｔｓ ｄｅ Ｐａｒｉｓ，Ｐａｌａｉｓｅａｕ）によって等しい厚さ（１ｍｍ）の５スライスに切断され、その後、計量される。
【０１６９】
これらのスライスは、ｐＨ７．４、２０分間、３７℃で１％の塩化トリフェニルテトラゾリウム溶液（ＴＴＣ，Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）中でインキュベートされ、次に、４％ホルモルに置かれる。ＴＴＣは、梗塞していない心筋を赤色に着色する性質を有し、そのため、梗塞された領域を白色で示す。各心臓スライスは、高解像度写真を撮影するために立体顕微鏡下に置かれる。
【０１７０】
梗塞及び危険領域の定量化は、面積測定によって実行され（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ，Ｓｃｉｏｎ，Ｆｅｄｅｒｉｃｋ ＭＤ，ＵＳＡ）、各スライスの重量を意味する。
【０１７１】
危険領域（青色でない領域）は、左心室の重量率として表される。梗塞サイズは、危険領域の重量率として表される。
【０１７２】
梗塞サイズ及び危険領域の全ては、平均±ＳＥＭとして表される。１因子のＡＮＯＶＡ、続く、Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ補正を伴う非対のスチューデントｔ試験は、実験群の間で、危険領域及び梗塞サイズを比較するために使用され、有意な閾値は、ｐ＜０．０５になっている。
【０１７３】
結果及び結論
前記化合物で処理されたマウスの梗塞サイズは、担体で処理されたマウスのものとは有意に相違している。
【０１７４】
下記の表に示される結果は、一方で危険領域、他方で梗塞サイズによって表される。
【０１７５】
【表１】
【０１７６】
使用された実験モデルでは、試験された両方の化合物は、梗塞サイズを減少させる。さらに、結果は、該化合物が危険領域の拡張にかかわらず、梗塞サイズを減少させる。
【０１７７】
したがって、これらの結果は、これらの化合物の両方がインビボにおいて心臓保護効果を有することを示す。
【０１７８】
実施例１４：急性肝毒性のインビボモデルにおける３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの効果
この実験では、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール化合物の肝細胞の保護能力が試験される。
【０１７９】
多くの他の細胞のように肝細胞は、細胞質膜上にＦａｓ／ＣＤ９５受容体を担持する。Ｆａｓルートの刺激は、カスパーゼのカスケードを活性化することによって、細胞死を誘導する。
【０１８０】
肝障害の急性モデルは、Ｊｏ２抗Ｆａｓ抗体の１回注射によって誘導することができ（Ｏｇａｓａｗａｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，Ａｕｇｕｓｔ １９９３）、重篤な肝障害を生じさせ、ウイルス性、自己免疫性又は薬物誘導の肝炎と似ている。
【０１８１】
血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）とも呼ばれるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）は、肝細胞に存在する酵素である。その活性は、肝溶解後の血漿中に有意に増加し、したがって、肝障害を評価するための良好なマーカーである。
【０１８２】
材料及び方法
動物
ブリーダー「Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ」（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ−Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から雄性成体ＣＤ１マウスを用いた。動物は、個別に隔離され、水及び餌に自由な接近とした。
【０１８３】
設置は、光の調節サイクル（７：００ａｍ−７：００ｐｍ）、２０±２℃の温度、５０±２０％の湿度で維持された。
【０１８４】
Ｊｏ２抗体の調製
モノクローナル・ハムスター抗マウスＣＤ９５（Ｆａｓ）抗体のストック溶液は、Ｊｏ２と呼ばれ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｒｅｆ．５５４２５４、バッチ３２６９９）からのものであり、水で１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製される。使用された希釈は、水中の０．９％塩化ナトリウムで行った。
【０１８５】
試験されるべき化合物の調製
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの所望の量を計量し、微粉末に粉砕し、次に、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ ＥＬ（Ｓｉｇｍａ Ｃ５１３５）及び無水エタノール（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ ＲＰＥ ４１５７１）（それぞれ、最終容積の５％及び１０％）と混合した。完全な溶解後、水中の０．９％塩化ナトリウムを即座に添加する（最終容積の８５％）。
【０１８６】
２種類の実験を行う：Ｊｏ２による中毒と続くＡＬＡＴ評価、及びＪｏ２による致死的な中毒。
【０１８７】
−Ｊｏ２による中毒及びＡＬＡＴ評価：
手順
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールでの前処理は、Ｊｏ２抗体を投与する１時間前に、腹腔内投与による１０及び３０ｍｇ／ｋｇの服用量で実行される。Ｊｏ２抗体は、体重１ｋｇ当たり５ｍＬの容積で１２５μｇ／ｋｇの服用量を腹腔内に注射することによって投与される。
【０１８８】
対照は、化合物なしで、試験されるべき化合物を調製するために使用したのと同一の容積の抗体を投与する１時間前に、腹腔内投与による前処理を受ける動物を用いて得られる。
【０１８９】
ＡＬＡＴ評価
Ｊｏ２を投与して２４時間後、麻酔したマウスから血液を採取する。ＡＬＡＴアッセイは、ＩＦＣＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって標準化された方法に従って、分光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｍｏｄｕｌａｒ）を用いて、キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の使用によって行った。
【０１９０】
結果及び結論
１２５μｇ／ｋｇ服用量でのＪｏ２の腹腔内投与は、注射後の２４時間以内にマウスのいずれの死亡を誘導しない。
【０１９１】
ＡＬＡＴ活性は、１０及び３０ｍｇ／ｋｇで化合物３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールによって有意に減少させる。
【０１９２】
【表２】
【０１９３】
Ｊｏ２投与の１時間前に１０及び３０ｍｇ／ｋｇで投与された３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールにより、致死下の抗体服用量によって誘導される細胞死は制限され得る。
【０１９４】
ＡＬＡＴ活性は、血漿中の肝細胞崩壊のバイオマーカーであり、未処理の対照マウスよりも、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールで処理されたマウスにおいて有意に低い。
【０１９５】
−Ｊｏ２抗体による致死的な中毒
この実験では、致死的服用量のＪｏ２抗体を投与後の動物の生存における３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの効果を評価する。
【０１９６】
手順
Ｊｏ２抗体は、５ｍＬ／ｋｇ体重の容積で２００又は２５０μｇ／ｋｇの服用量で腹腔内注射によって投与される。
【０１９７】
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールは、前処理として、Ｊｏ２投与の１時間前、後処理として、Ｊｏ２投与の１時間後に１０及び３０ｍｇ／ｋｇで試験される。
【０１９８】
対照は、化合物なしで、試験されるべき化合物を調製するために用いられた溶液と同一の容積である、抗体投与の１時間前又は１時間後に腹腔内投与によって前処理を受ける動物を用いて得られる。
【０１９９】
結果及び結論
【０２００】
【表３】
【０２０１】
投与される服用量で、Ｊｏ２抗体は、対照群における２４時間以内の実質的な致死率（動物の７０〜１００％）を誘導する。
【０２０２】
投与された服用量で３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールでの前処理及び／又は後処理は、動物の生存率の増加を誘導する。
【０２０３】
したがって、抗体の致死的服用量（２００又は２５０μｇ／ｋｇ）が使用される場合、抗体の１時間前又は後、１０及び３０ｍｇ／ｋｇで投与された３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールは、２４時間でマウスの生存率を増加させる。
【０２０４】
結論
抗Ｆａｓ（Ｊｏ２）抗体によってマウスにおいて誘導された急性肝毒性のモデルを用いて、３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オールの肝臓保護特性を示すことができた。
【０２０５】
これらの顕著な効果を用いて、式Ｉで表される化合物の使用は、一般的な細胞保護薬物の調製に意図され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経保護剤を除く細胞保護剤を得るための、式Ｉ：
【化１】
（式中、
Ｘ及びＹは一緒になって、ケトン基（＝Ｏ）、オキシム基（＝ＮＯＨ）又はメチルオキシム基（＝ＮＨＯＭｅ）を表すか、又はＸはヒドロキシルを表し、Ｙは水素原子を表し；
Ｂは、ヒドロキシルラジカルを表し、Ｃ及びＤは、同一であるか又は異なっていて、水素原子又は１〜４個の炭素原始を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルラジカルを表し；
又はＢ及びＣは一緒になって、ケトン基を表し、Ｄはメチル、ヒドロキシル若しくはメチルアミンラジカルを表し；
又はＢ及びＣは、水素原子を表し、及びＤはメチルアミンラジカルを表し；
又はＢ及びＣは一緒になって、オキシム基を表し、Ｄはメチルラジカルを表し；及び
Ｒは、１〜１０個の炭素原子を含む直線状又は分岐状のアルキルラジカルを表す）
で表される化合物の少なくとも１つ、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つの使用。
【請求項２】
式Ｉにおいて、Ｒが、式ＩＩ：
【化２】
で表されるコレスタン（ｃｈｏｌｅｓｔａｎｅ）ラジカルを表すことによって特徴付けられる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
式Ｉにおいて、Ｘ及びＹが一緒になって、ケトン基を表すことによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
式Ｉにおいて、Ｂがヒドロキシルラジカルを表し、Ｃ及びＤが同一であるか又は異なっていて、水素原子又は１〜４個の炭素原子を含む直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルを表すことによって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
式Ｉにおいて、Ｂ及びＣが一緒になって、ケトン基を表し、Ｄがメチルラジカルを表すことによって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
式Ｉにおいて、Ｘ及びＹが一緒になって、オキシム基を表すことによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項７】
式Ｉで表される化合物が、
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール、
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアルコール、又は
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−ジメチルアルコール
から選択され、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つであることによって特徴付けられる、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記薬物が、壊死、及び／又は病的アポトーシス、及び／又はネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を治療又は予防するために意図され（抗壊死剤及び／又は抗アポトーシス剤及び／又は抗ネクロトーシス剤）、又は
骨、関節、結合組織及び軟骨の疾患、
筋肉疾患、
皮膚疾患、
心臓血管疾患、
循環器系疾患、
血液疾患及び血管疾患、
肺疾患、
胃腸管疾患、
肝疾患、
膵臓疾患、
代謝疾患、
腎疾患、
ウイルス感染及び細菌感染、
重篤な中毒、
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連した変性疾患、
老化に関連した障害、
炎症性疾患、
自己免疫疾患、
歯科疾患、
眼科疾患又は障害、
聴覚管の疾患、
ミトコンドリアに関連した疾患
などの更なる疾患を治療又は予防するために意図されることによって特徴付けられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記薬物が、心臓細胞を保護するために意図される（心臓保護剤）ことによって特徴付けられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬物が、肝細胞を保護するために意図される（肝臓保護剤）ことによって特徴付けられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記薬物が、ミトコンドリアに関連した疾患を治療又は予防することによって特徴付けられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記薬物が、移植前、移植中若しくは移植後の組織又は器官の細胞を保護するために意図されることによって特徴付けられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１に記載の式Ｉで表される化合物の１つ、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つを含む組成物、特に医薬組成物又は薬物。
【請求項１】
神経保護剤を除く細胞保護剤を得るための、式Ｉ：
【化１】
（式中、
Ｘ及びＹは一緒になって、ケトン基（＝Ｏ）、オキシム基（＝ＮＯＨ）又はメチルオキシム基（＝ＮＨＯＭｅ）を表すか、又はＸはヒドロキシルを表し、Ｙは水素原子を表し；
Ｂは、ヒドロキシルラジカルを表し、Ｃ及びＤは、同一であるか又は異なっていて、水素原子又は１〜４個の炭素原始を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルラジカルを表し；
又はＢ及びＣは一緒になって、ケトン基を表し、Ｄはメチル、ヒドロキシル若しくはメチルアミンラジカルを表し；
又はＢ及びＣは、水素原子を表し、及びＤはメチルアミンラジカルを表し；
又はＢ及びＣは一緒になって、オキシム基を表し、Ｄはメチルラジカルを表し；及び
Ｒは、１〜１０個の炭素原子を含む直線状又は分岐状のアルキルラジカルを表す）
で表される化合物の少なくとも１つ、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つの使用。
【請求項２】
式Ｉにおいて、Ｒが、式ＩＩ：
【化２】
で表されるコレスタン（ｃｈｏｌｅｓｔａｎｅ）ラジカルを表すことによって特徴付けられる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
式Ｉにおいて、Ｘ及びＹが一緒になって、ケトン基を表すことによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
式Ｉにおいて、Ｂがヒドロキシルラジカルを表し、Ｃ及びＤが同一であるか又は異なっていて、水素原子又は１〜４個の炭素原子を含む直鎖状又は分岐状のアルキルラジカルを表すことによって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
式Ｉにおいて、Ｂ及びＣが一緒になって、ケトン基を表し、Ｄがメチルラジカルを表すことによって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
式Ｉにおいて、Ｘ及びＹが一緒になって、オキシム基を表すことによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項７】
式Ｉで表される化合物が、
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−オール、
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−メチルアルコール、又は
３，５−セコ−４−ノル−コレスタン−５−オンオキシム−３−ジメチルアルコール
から選択され、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つであることによって特徴付けられる、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記薬物が、壊死、及び／又は病的アポトーシス、及び／又はネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を治療又は予防するために意図され（抗壊死剤及び／又は抗アポトーシス剤及び／又は抗ネクロトーシス剤）、又は
骨、関節、結合組織及び軟骨の疾患、
筋肉疾患、
皮膚疾患、
心臓血管疾患、
循環器系疾患、
血液疾患及び血管疾患、
肺疾患、
胃腸管疾患、
肝疾患、
膵臓疾患、
代謝疾患、
腎疾患、
ウイルス感染及び細菌感染、
重篤な中毒、
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連した変性疾患、
老化に関連した障害、
炎症性疾患、
自己免疫疾患、
歯科疾患、
眼科疾患又は障害、
聴覚管の疾患、
ミトコンドリアに関連した疾患
などの更なる疾患を治療又は予防するために意図されることによって特徴付けられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記薬物が、心臓細胞を保護するために意図される（心臓保護剤）ことによって特徴付けられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬物が、肝細胞を保護するために意図される（肝臓保護剤）ことによって特徴付けられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記薬物が、ミトコンドリアに関連した疾患を治療又は予防することによって特徴付けられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記薬物が、移植前、移植中若しくは移植後の組織又は器官の細胞を保護するために意図されることによって特徴付けられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１に記載の式Ｉで表される化合物の１つ、あるいは医薬として許容される酸との付加塩の１つ、又はそのエステルの１つ若しくは該エステルの医薬として許容される酸との付加塩の１つを含む組成物、特に医薬組成物又は薬物。
【公表番号】特表２００９−５２９５１７（Ｐ２００９−５２９５１７Ａ）
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５７７８８（Ｐ２００８−５５７７８８）
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００３３０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０１９２５
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５０５３４２０５８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００３３０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０１９２５
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５０５３４２０５８）
【Ｆターム（参考）】
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