細胞給排・捕捉装置及び細胞給排・捕捉方法
【課題】 細胞給排・捕捉装置及び細胞給排・捕捉方法に関し、多量の細胞を短時間で保持し、保持後に保持されていた細胞を効率的に回収する。
【解決手段】 細胞懸濁液２を供給する細胞供給機構１、細胞を含まない液体４を供給する送液機構３、細胞懸濁液２及び液体４を流す流路６と細胞懸濁液２中の細胞を捕捉する貫通孔７を備えた捕捉チップ５、捕捉チップ５に接続されて貫通孔７からの吸引量を制御する吸引機構８、貫通孔７で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構９、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構１０とを少なくとも設ける。
【解決手段】 細胞懸濁液２を供給する細胞供給機構１、細胞を含まない液体４を供給する送液機構３、細胞懸濁液２及び液体４を流す流路６と細胞懸濁液２中の細胞を捕捉する貫通孔７を備えた捕捉チップ５、捕捉チップ５に接続されて貫通孔７からの吸引量を制御する吸引機構８、貫通孔７で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構９、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構１０とを少なくとも設ける。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞給排・捕捉装置及び細胞給排・捕捉方法に関するものであり、主にライフサイエンス分野、特に、再生医療及びゲノム創薬に関連する分野における細胞内への物質導入或いは細胞の経過観察に際し、流路上で複数個の細胞を搬送・捕捉し、捕捉されていない細胞と捕捉されている細胞を別々に回収するため構成に特徴のある細胞給排・捕捉装置及び細胞給排・捕捉方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療およびゲノム創薬等の分野において、遺伝子および薬剤を導入した細胞を利用する機会が増加しており、研究用途において多くの物質導入技術が用いられているが、医療用途においては、研究用途とは異なる要求が存在する。
【０００３】
特に、医療用途特有の主な要求としては、細胞の種類および導入物質の種類を問わないこと、導入効率が高いこと、及び、物質導入細胞を大量に供給できることが求められており、このうち、物質導入済細胞の大量供給は特に重要であり、再生医療では一度に１０5 〜１０6 個の細胞が必要であるといわれている。
【０００４】
また、物質導入の方法としては、各種の方法があるが、そのうちでもマイクロインジェクション法（例えば、特許文献１，２参照）は、物質導入の成功率が高く、細胞と導入物質の組合せを選ばないことから、物質導入方法として最も確実であると考えられる。
【０００５】
この様なマイクロインジュクション法を用いて物質導入済細胞を作製する場合に、細胞を所定箇所に保持する必要があり、そのために各種の方法が提案されており、例えば、シリコン基板に逆四角錐状孔を二次元マトリクス状に配置し、個々の逆四角錐状孔内に一個の細胞を隔離して保持することが提案されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００６】
また、上記の特許文献３においては、逆四角錐状孔の底部に水抜き用のスリットを設けることも提案されている。
【特許文献１】特開平０５−１９２１７１号公報
【特許文献２】特開平０６−３４３４７８号公報
【特許文献３】特開昭６３−１２９９８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記の特許文献３に示された細胞保持装置を用いてマイクロインジェクション、細胞電気整理実験等を行う場合、細胞の保持は可能だが、各逆四角錐状孔に確実に１個の細胞を効率良く収容するための具体的手法が確立されていないという問題がある。
【０００８】
また、個々の細胞が隔離されているため、実験後に細胞を回収し培養等を行う必要があるとき、細胞を回収することが困難であるという問題があり、スループットの点で再生医療やゲノム創薬などの産業応用には直接適用できないという問題がある。
【０００９】
一方、ポリ−Ｌ−リジンや、レクチン等を用いた細胞接着による固定法もあるが、細胞に対する毒性が懸念されており、加えて、固定後に細胞を剥離させ回収することが困難であるという問題がある。
【００１０】
したがって、本発明は、多量の細胞を短時間で保持し、保持後に保持されていた細胞を効率的に回収することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
図１は本発明の原理的構成図であり、ここで図１を参照して、本発明における課題を解決するための手段を説明する。
図１参照
上記課題を解決するために、本発明は、細胞給排・捕捉装置において、細胞懸濁液２を供給する細胞供給機構１、細胞を含まない液体４を供給する送液機構３、細胞懸濁液２及び液体４を流す流路６と細胞懸濁液２中の細胞を捕捉する貫通孔７を備えた捕捉チップ５、捕捉チップ５に接続されて貫通孔７からの吸引量を制御する吸引機構８、貫通孔７で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構９、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構１０とを少なくとも備えたことを特徴とする。
【００１２】
以上の構成を採用することによって、捕捉された細胞と捕捉されていない細胞を別々に回収することが可能となり、回収後の解析作業の効率を向上することができる。
また、吸引により細胞を捕捉しているので、捕捉手段自体が細胞に化学的な悪影響を与えることがなく、さらに、装置構成が全体として小型であるのでサンプル数が少ない場合にも確実な捕捉を行うことができる。
【００１３】
この場合、捕捉チップ５に、流路６の一方の端部に流路６に細胞懸濁液２及び液体４を流す流入部と、流路６の他方の端部に流路６から細胞懸濁液２及び液体４を回収する回収部とを設けるとともに、細胞懸濁液２中の細胞が通過できない径の複数の貫通孔７を流路６に沿うように設けることが望ましく、それによって、多数の細胞を捕捉チップ５に短時間で捕捉することが可能になる。
なお、貫通孔７の径を細胞の通過できない大きさにすることで、細胞が貫通孔７を通過することなく、細胞の捕捉が可能となる。
【００１４】
また、捕捉チップ５に設ける流路６は蛇行した一本の流路６として良いし、或いは、複数の平行に配置された流路６からなるとともに、各流路６の一端で共通の流入部に接続する接続流路を有するとともに、前記各流路６の他端で共通の回収部に接続する接続流路を有する分岐型の流路６としても良く、流路６を一本にした場合には細胞を順番に回収することが可能になり、一方、分岐型の流路６とした場合には細胞の搬送を並列で処理することで短時間で捕捉することが可能になる。
【００１５】
また、捕捉チップ５に設けた流路６の内壁を捕捉チップ５の基材より親水性にするとともに、捕捉チップ５の流路６の内壁以外の面を基材より疎水性にすることが望ましく、それによって、流路６を密閉することなく、流路６のみに細胞懸濁液２を流すことができる。
【００１６】
この場合、流路６の内壁を捕捉チップ５の基材より親水性の樹脂でコートするとともに、捕捉チップ５の流路６の内壁以外の面を基材より疎水性の樹脂でコートすれば良い。
【００１７】
また、細胞を含まない液体４を、細胞より比重の重い液体４とすることが望ましく、それによって、流路６の底に沈降している細胞を浮上させ、搬送を容易にすることができる。
【００１８】
この様な細胞を含まない液体４としては、細胞懸濁液２を構成する培地と同じ成分からなるとともに、培地より塩分濃度を高めた液体４であることが望ましく、基本的成分が同じであるので、捕捉細胞に悪影響を与えることがない。
【００１９】
また、この様な細胞給排・捕捉装置に、捕捉した細胞に物質を注入する注入機構を備えることによって、物質導入済み細胞を培養する際の回収を効率的に行うことができる。
【００２０】
また、上述の細胞の給排・捕捉を行う場合には、細胞懸濁液２を複数の貫通孔７を備えた流路６の一端から流し細胞懸濁液２中の細胞を貫通孔７で吸引により捕捉する工程、流路６の一端から細胞より比重の重い液体４を流し捕捉しきれなかった細胞を浮上させて流路６の他端で回収する工程、捕捉した細胞に物質を注入するインジェクション或いは経過観察のいずれかを行う工程、インジェクション或いは経過観察後に吸引を解除するとともに流路６の一端から細胞より比重の重い液体４を流し細胞を浮上させて流路６の他端で回収する工程とを順次行えば良い。
【発明の効果】
【００２１】
以上説明したように、本発明によれば、細胞を高スループットで捕捉し、また、捕捉細胞と捕捉されていない細胞を別々に、かつ、高効率に回収することができ、それによって、再生医療やゲノム創薬などの産業応用におけるマイクロインジェクション装置等への適用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、まず、
（１）細胞供給機構より、捕捉チップの流入部に細胞懸濁液を供給する。
流入部への供給方法は、細胞供給機構にピペット状の細管を接続して、細胞懸濁液を流入部へ滴下しても、チューブを介して細胞供給機構を捕捉チップに接続して、細胞懸濁液を供給しても良い。
このとき、捕捉チップの流路を親水性、流路以外の部分を疎水性にすることにより、流路を密閉することなく、流路のみに細胞懸濁液を流すことができる。
【００２３】
次いで、
（２）吸引機構を用いて、流路内の貫通孔に細胞を捕捉する。
貫通孔の出口は、吸引機構に接続されており、貫通孔からの吸引圧により細胞を捕捉するものであり、この場合、貫通孔の径を、細胞の通過できない大きさにすることで、細胞が貫通孔を通過することなく、細胞の捕捉が可能となる。
【００２４】
次いで、
（３）送液機構を用いて、捕捉チップより、捕捉されていない細胞を除去する。
このとき、細胞と比重の異なる液体を送液機構より流入部へ供給し、捕捉されていない細胞を浮上させ捕捉チップの流出部まで搬送し、
（４）不要細胞回収機構を用いて、流出部まで流れてきた、捕捉されていない細胞を回収する。
【００２５】
次いで、
（５）捕捉細胞に対して、インジェクション、経過観察等の作業を行い、作業が終わった後は、吸引機構を用いて、吸引圧を解除し、捕捉細胞を解放する。
【００２６】
次いで、
（６）再び、送液機構を用いて、開放された細胞を捕捉チップの流出部へと搬送する。 このときも、細胞と比重の異なる液体を送液機構より流入部へ供給し、捕捉されていた細胞を浮上させ捕捉チップの流出部まで搬送し、
（７）捕捉細胞回収機構を用いて、搬送されてきた捕捉細胞を回収する。
【実施例１】
【００２７】
ここで、図２及び図７を参照して、本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置を説明する。
図２参照
図２は、本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置の概念的構成図であり、ピペット状の細管１２を備えるとともに細管１２から培地１４に細胞１５を懸濁した細胞懸濁液１３を捕捉チップ３０に供給する細胞供給装置１１、ピペット状の細管１７を備えるとともに細管１７から培地より比重の重いキャリア液１８を捕捉チップ３０に供給する送液装置１６、供給された細胞懸濁液１３中の細胞１５を吸引装置２３によって吸引して捕捉する捕捉チップ３０、捕捉チップを収容するとともに吸引用の開口部２０を有する容器１９、容器１９を保持するとともに吸引装置２３との接続部２２を有するチップ保持具２１、細胞１５を捕捉するための吸引装置２３、捕捉した細胞１５を観察する細胞観察装置４０、捕捉されなかった細胞１５を細管２５を介して回収する不要細胞回収装置２４、インジェクション等の作業を行った処置済み細胞１５を細管２７を介して回収する捕捉細胞回収装置２６から基本構成が構成される。
【００２８】
この場合の細胞観察装置４０は、光源４１及び対物レンズ４２を備えた画像処理装置４３からなり、細胞観察装置４０は、捕捉チップ３０を常時観察し、細胞１５の捕捉状態を検出するとともに、細胞分裂等の経過観察を行う。
【００２９】
図３参照及び図４参照
図３は捕捉チップ３０の概略的平面図であり、また、図４は捕捉チップ３０の概略的断面図であり、通常のフォトリソグラフィー工程を利用してシリコン基板３１の一端に流入部３２、他端に流出部３４を形成するとともに、流入部３２と流出部３４を結ぶ蛇行した流路３３を形成する。
【００３０】
また、この流路３３の底部に吸引用の貫通孔３５を設けるとともに、シリコン基板３１の裏面に貫通孔３５に繋がる開口部３６を形成し、開口部３６を介して貫通孔３５から細胞を吸引する。
【００３１】
また、流路３３の側壁及び底面には親水性の樹脂３７、例えば、ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ（セルシード製商品名）をコートして親水性処理するとともに、流路３３以外のシリコン基板３１の表面には疎水性の樹脂３８、例えば、アクリル系樹脂をコートして疎水性処理する。
なお、この時、貫通孔３５が樹脂で塞がれないように注意する必要がある。
【００３２】
この流路３３の幅は、捕捉する細胞のサイズにもよるが細胞のサイズが１０〜１５μｍ程度の場合には、例えば、５０μｍの幅で５０μｍの深さとし、直線部の長さは５００μｍ程度とする。
また、この流路３３の底部に設ける貫通孔３５は、直径が例えば２μｍであり、この貫通孔３５を例えば、５０μｍの間隔で配置する。
【００３３】
図５参照
図５は、捕捉チップ乃至チップ保持具の配置構成の説明図であり、捕捉チップ３０は、例えば、容器１９に対して開口部３６が容器１９に設けた開口部２０と整合するように配置・固定する。
なお、この場合の容器１９は、周囲への液の飛散を防ぐとともに取り回しを簡便にするためのものであり、また、培養に使用するシャーレと同様に耐薬品性に優れたポリスチレン製とする。
【００３４】
また、容器１９は、チップ保持具２１に対して開口部２０が吸引装置２３との接続部２２に整合するように配置・固定し、この接続部２２に対しては吸引装置２３の先端部に設けた接続部材２８が接続される。
【００３５】
図６及び図７参照
図６は、本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置の動作フロー図であり、また、図７は細胞の捕捉・搬送、開放・搬送状態の説明図であり、まず、
Ａ．細胞供給装置１１より、捕捉チップ３０に設けた流入部３２に細胞懸濁液１３を供給する。
この場合、細胞供給装置１１により細胞懸濁液１３の送液量及び液圧を制御してピペット状の細管１２から滴下させる。
【００３６】
次いで、
Ｂ．吸引装置２３を用いて、流路３３内に設けた複数の貫通孔３５において細胞１５を捕捉する。
この場合、貫通孔３５の径は例えば、２μｍであり、細胞の径１０〜１５μｍに対して十分小さいの貫通孔３５から外に排出されることはない。
【００３７】
次いで、
Ｃ．送液装置１６を用いて、細管１７から捕捉チップ３０の流入部３２にキャリア液１８を供給して、捕捉されていない細胞１５を浮上させて流出部３４まで搬送する。
なお、ここでは、キャリア液１８として培地１４として用いる平衡塩類溶液（ＢＢＳ）の塩分濃度を高めて細胞１５の比重より重くした液体を用いる。
【００３８】
次いで、
Ｄ．流出部３４まで搬送された細胞１５を不要細胞回収装置２４を用いて細管２５から回収する。
【００３９】
次いで、
Ｅ．捕捉した細胞１５に対して、細胞分裂の状態等の経過観察を行ったのち、吸引装置２３による吸引圧を解除し、捕捉した細胞１５を解放する。
【００４０】
次いで、
Ｆ．再び、送液装置１６を用いて、細管１７から捕捉チップ３０の流入部３２にキャリア液１８を供給して、開放された細胞１５を流出部３４まで搬送する。
【００４１】
次いで、
Ｇ．流出部３４まで搬送された観察済みの細胞１５を捕捉細胞回収装置２６を用いて細管２７から回収することで、一連のフローが終了する。
以降は、回収した観察済みの細胞１５を、例えば、ポリカーボネート製の基板に９６個の凹部を二次元マトリクス状に設けた９６穴プレートに分注して少量ずつの保管・培養を行う。
【００４２】
このように、本発明の実施例１においては、流路３３に沿って複数の捕捉用の貫通孔３５を設けた捕捉チップ３０を利用しているので、不要細胞と捕捉細胞の回収を別個に短時間で行うことが可能になり、研究室用のみならず再生医療やゲノム創薬などの産業応用におけるマイクロインジェクション装置等への適用が可能となる。
【００４３】
また、捕捉チップ３０の流路３３を親水性、流路３３以外の部分を疎水性にすることにより、流路３３を密閉することなく、大気中に開放した状態で流路３３のみに細胞懸濁液１３を流すことができ、使い勝手が良好になる。
【００４４】
また、捕捉チップ３０に設けた流路３３を蛇行した一本の流路で構成しているので、捕捉した細胞を一個ずつ順番に回収することが可能となる。
【実施例２】
【００４５】
次に、図８を参照して、本発明の実施例２の細胞給排・捕捉装置を説明するが、捕捉チップに設ける流路の構成が異なるだけで、他の構成は同じであるので、捕捉チップのみを説明する。
図８参照
図８は、本発明の実施例２の細胞給排・捕捉装置に用いる捕捉チップ５０の概略的平面図であり、通常のフォトリソグラフィー工程を利用してシリコン基板５１の一端の中央部に流入部５２、他端の中央部に流出部５６を形成するとともに、流入部５２と流出部５６との間に複数本の平行に走る流路５４を形成し、流入部５２と複数の流路５４を分岐流路５３で接続するとともに、複数の流路５４と流出部５６を合流流路５５で接続する。
【００４６】
また、この流路５４の底部に吸引用の貫通孔５７を設けるとともに、シリコン基板５１の裏面に貫通孔５７に繋がる開口部５８を形成し、開口部５８を介して貫通孔５７から細胞を吸引する。
【００４７】
また、図示は省略するものの、この場合も流路４４の側壁及び底面には親水性の樹脂、例えば、ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ（セルシード製商品名）をコートして親水性処理するとともに、流路３３以外のシリコン基板３１の表面には疎水性の樹脂、例えば、アクリル系樹脂をコートして疎水性処理する。
【００４８】
また、この場合も、流路５４の幅は、捕捉する細胞のサイズにもよるが細胞のサイズが１０〜１５μｍ程度の場合には、例えば、５０μｍの幅で５０μｍの深さとし、直線部の長さは５００μｍ程度とする。
また、この流路５４の底部に設ける貫通孔５７は、直径が例えば２μｍであり、この貫通孔５７を例えば、５０μｍの間隔で配置する。
【００４９】
この様に、本発明の実施例２においては、流路５４を複数本に分岐しているので、細胞１５の搬送を並列で処理することができ、回収の効率が向上することができる。
【実施例３】
【００５０】
次に、図９を参照して、上記実施例１或いは２の細胞給排・捕捉装置を利用したマイクロインジェクション装置を説明するが、捕捉チップに対向した位置に注入装置６０を設けた以外は、上記の実施例１或いは２の細胞給排・捕捉装置と同じ構成である。
【００５１】
図９参照
図９は、本発明の実施例３のマイクロインジェクション装置の概念的構成図であり、ピペット状の細管１２を備えるとともに細管１２から培地１４に細胞１５を懸濁した細胞懸濁液１３を捕捉チップ３０に供給する細胞供給装置１１、ピペット状の細管１７を備えるとともに細管１７から培地より比重の重いキャリア液１８を捕捉チップ３０に供給するで送液装置１６、供給された細胞懸濁液１３中の細胞１５を吸引装置２３によって吸引して捕捉する捕捉チップ３０、捕捉チップを収容するとともに吸引用の開口部２０を有する容器１９、容器１９を保持するとともに吸引装置との接続部２２を有するチップ保持具２１、細胞１５を捕捉するための吸引装置２３、捕捉した細胞１５を観察する細胞観察装置４０、捕捉した細胞１５に対して薬液或いは遺伝子を注入する注入装置６０、捕捉されなかった細胞１５を細管２５を介して回収する不要細胞回収装置２４、インジェクション作業を行った物質注入済み細胞を細管２７を介して回収する捕捉細胞回収装置２６から基本構成が構成される。
【００５２】
この場合の注入装置６０は、物質導入用針６１と、この物質導入用針６１を制御する物質導入用針制御装置６２とにより構成され、捕捉チップ３０に設けた貫通孔に捕捉された細胞１５に対して物質導入用針５１によって遺伝子或いは薬液等の物質導入を順次行う。
【００５３】
このように、本発明の実施例３においては、実施例１或いは２の細胞給排・捕捉装置を用いてマイクロインジェクション装置を構成しているので、物質導入済み細胞の回収が用になる。
【００５４】
以上、本発明の各実施例を説明してきたが、本発明は各実施例に記載した条件・構成に限られるものではなく、各種の変更が可能であり、例えば、各実施例に記載した捕捉チップに設けた流路の形状、幅、深さ、長さは、任意なものであり、貫通孔の径とともに細胞のサイズに応じて適宜決定すれば良い。
【００５５】
また、上記の各実施例においては、疎水処理のためにアクリル系樹脂を用いているが、アクリル系樹脂に限られるものではなく、通常の樹脂は疎水性を有するため、このような通常の樹脂について疎水性を有するか否かを確認した上で用いても良いし、さらには、シリコン自体が疎水性を有するので疎水処理は必須ではない。
【００５６】
また、上記の各実施例においては、開放状態において流路のみに細胞懸濁液或いは液体が流れやすいように、流路の側壁及び底面を親水性にし、流路以外のシリコン基板の表面を疎水性にしているが、このような親水処理・疎水処理は必須ではない。
【００５７】
例えば、流路の側壁及び底面を親水性にして、流路以外のシリコン基板の表面はそのままの状態にしておいても良いし、あるいは、流路以外のシリコン基板の表面を疎水性にして、流路の側壁及び底面はそのままにしても良いし、さらには、何方にも処理を施さなくても良い。
【００５８】
また、上記の各実施例においては、捕捉チップを半導体集積回路分野やマイクロマシーン技術分野において微細加工技術が確立しているシリコン基板を用いているが、シリコン基板に限られるものではなく、ポリカーボネートやアクリル樹脂を用いても良いものである。
【００５９】
また、上記に実施例３においては、注入装置６０に一本の物質導入用針６１を設けて細胞に順々に遺伝子或いは薬液等を注入しているが、注入装置６０に流路の直線部の数に応じた本数の物質導入用針を一次元アレイ状に設けても良いものであり、それによって、注入効率を高めることができる。
【００６０】
また、上記の各実施例においては、細胞供給装置にピペット状の細管を接続して、細胞懸濁液を流入部へ滴下しているが、この様な構成に限られるものではなく、チューブを介して細胞供給装置を捕捉チップに接続して細胞懸濁液を供給するようにしても良い。
この様な構成は、送液装置における溶液の供給装置に関しても同様である。
【００６１】
また、上記の各実施例においては、捕捉チップを収容する容器をシャーレと同じ材質のポリスチレンで構成しているが、ポリスチレンに限られるものではなく、ポリカーボネート、アクリル樹脂、或いは、ガラス等の耐薬液性の高い物質で構成すれば良い。
【００６２】
また、上記の実施例１においては、流路に設けた貫通孔で細胞を捕捉して細胞分裂の観察を行っているが、この様な場合に限られるものではなく、他の薬液供給装置を設け細胞を捕捉した状態で流路に薬液を流して細胞の薬液反応を観察する場合等にも適用されるものである。
【００６３】
ここで再び図１を参照して、本発明の詳細な特徴を改めて説明する。
再び図１参照
（付記１） 細胞懸濁液２を供給する細胞供給機構１、細胞を含まない液体４を供給する送液機構３、前記細胞懸濁液２及び液体４を流す流路６と前記細胞懸濁液２中の細胞を捕捉する貫通孔７を備えた捕捉チップ５、前記捕捉チップ５に接続されて前記貫通孔７からの吸引量を制御する吸引機構８、前記貫通孔７で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構９、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構１０とを少なくとも備えたことを特徴とする細胞給排・捕捉装置。
（付記２） 上記捕捉チップ５が、上記流路６の一方の端部に前記流路６に上記細胞懸濁液２及び液体４を流す流入部と、前記流路６の他方の端部に前記流路６から前記細胞懸濁液２及び液体４を回収する回収部とを有し、且つ、上記貫通孔７が上記細胞懸濁液２中の細胞が通過できない径の複数の貫通孔７からなるとともに、前記流路６に沿うように設けられたことを特徴とする付記１記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記３） 上記流路６が蛇行した一本の流路６からなることを特徴とする付記２記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記４） 上記流路６が複数の平行に配置された流路６からなるとともに、各流路６の一端で共通の流入部に接続する接続流路６を有するとともに、前記各流路６の他端で共通の回収部に接続する接続流路６を有することを特徴とする付記２記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記５） 上記捕捉チップ５に設けた上記流路６の内壁を前記捕捉チップ５の基材より親水性にするとともに、前記捕捉チップ５の流路６の内壁以外の面を前記基材より疎水性にすることを特徴とする付記１乃至４のいずれか１に記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記６） 上記流路６の内壁を上記捕捉チップ５の基材より親水性の樹脂でコートするとともに、前記捕捉チップ５の流路６の内壁以外の面を前記基材より疎水性の樹脂でコートしたことを特徴とする付記５記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記７） 上記細胞を含まない液体４を、前記細胞より比重の重い液体４としたことを特徴とする付記１乃至６のいずれか１に記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記８） 上記細胞を含まない液体４が、上記細胞懸濁液２を構成する培地と同じ成分からなるとともに、前記培地より塩分濃度を高めた液体４であることを特徴とする付記８記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記９） 上記捕捉した細胞に物質を注入する注入機構を備えたことを特徴とする付記１乃至８のいずれか１に記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記１０） 細胞懸濁液２を複数の貫通孔７を備えた流路６の一端から流し前記細胞懸濁液２中の細胞を前記貫通孔７で吸引により捕捉する工程、前記流路６の一端から前記細胞より比重の重い液体４を流し捕捉しきれなかった細胞を浮上させて前記流路６の他端で回収する工程、前記捕捉した細胞に物質を注入するインジェクション或いは経過観察のいずれかを行う工程、前記インジェクション或いは経過観察後に吸引を解除するとともに前記流路６の一端から前記細胞より比重の重い液体４を流し細胞を浮上させて前記流路６の他端で回収する工程とを順次行うことを特徴とする供給する細胞給排・捕捉方法。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の活用例としては、再生医療・ゲノム創薬等の事業における細胞への遺伝子或いは薬液の導入が典型的であるが、細胞分裂の観察や、細胞を捕捉した状態で流路に薬液を流して薬液反応を観察する場合等にも適用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の原理的構成の説明図である。
【図２】本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置の概念的構成図である。
【図３】本発明の実施例１の捕捉チップの概略的平面図である。
【図４】本発明の実施例１の捕捉チップの概略的断面図である。
【図５】本発明の実施例１の捕捉チップ乃至チップ保持具の配置構成の説明図である。
【図６】本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置の動作フロー図である。
【図７】本発明の実施例１における細胞の捕捉・搬送、開放・搬送状態の説明図である。
【図８】本発明の実施例２の細胞給排・捕捉装置に用いる捕捉チップの概略的平面図である。
【図９】本発明の実施例３のマイクロインジェクション装置の概念的構成図である。
【符号の説明】
【００６６】
１ 細胞供給機構
２ 細胞懸濁液
３ 送液機構
４ 液体
５ 捕捉チップ
６ 流路
７ 貫通孔
８ 吸引機構
９ 不要細胞回収機構
１０ 捕捉細胞回収機構
１１ 細胞供給装置
１２ 細管
１３ 細胞懸濁液
１４ 培地
１５ 細胞
１６ 送液装置
１７ 細管
１８ キャリア液
１９ 容器
２０ 開口部
２１ チップ保持具
２２ 接続部
２３ 吸引装置
２４ 不要細胞回収装置
２５ 細管
２６ 捕捉細胞回収装置
２７ 細管
２８ 接続部材
３０ 捕捉チップ
３１ シリコン基板
３２ 流入部
３３ 流路
３４ 流出部
３５ 貫通孔
３６ 開口部
３７ 親水性の樹脂
３８ 疎水性の樹脂
４０ 細胞観察装置
４１ 光源
４２ 対物レンズ
４３ 画像処理装置
５０ 捕捉チップ
５１ シリコン基板
５２ 流入部
５３ 分岐流路
５４ 流路
５５ 合流流路
５６ 流出部
５７ 貫通孔
５８ 開口部
６０ 注入装置
６１ 物質導入用針
６２ 物質導入用針制御装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞給排・捕捉装置及び細胞給排・捕捉方法に関するものであり、主にライフサイエンス分野、特に、再生医療及びゲノム創薬に関連する分野における細胞内への物質導入或いは細胞の経過観察に際し、流路上で複数個の細胞を搬送・捕捉し、捕捉されていない細胞と捕捉されている細胞を別々に回収するため構成に特徴のある細胞給排・捕捉装置及び細胞給排・捕捉方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療およびゲノム創薬等の分野において、遺伝子および薬剤を導入した細胞を利用する機会が増加しており、研究用途において多くの物質導入技術が用いられているが、医療用途においては、研究用途とは異なる要求が存在する。
【０００３】
特に、医療用途特有の主な要求としては、細胞の種類および導入物質の種類を問わないこと、導入効率が高いこと、及び、物質導入細胞を大量に供給できることが求められており、このうち、物質導入済細胞の大量供給は特に重要であり、再生医療では一度に１０5 〜１０6 個の細胞が必要であるといわれている。
【０００４】
また、物質導入の方法としては、各種の方法があるが、そのうちでもマイクロインジェクション法（例えば、特許文献１，２参照）は、物質導入の成功率が高く、細胞と導入物質の組合せを選ばないことから、物質導入方法として最も確実であると考えられる。
【０００５】
この様なマイクロインジュクション法を用いて物質導入済細胞を作製する場合に、細胞を所定箇所に保持する必要があり、そのために各種の方法が提案されており、例えば、シリコン基板に逆四角錐状孔を二次元マトリクス状に配置し、個々の逆四角錐状孔内に一個の細胞を隔離して保持することが提案されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００６】
また、上記の特許文献３においては、逆四角錐状孔の底部に水抜き用のスリットを設けることも提案されている。
【特許文献１】特開平０５−１９２１７１号公報
【特許文献２】特開平０６−３４３４７８号公報
【特許文献３】特開昭６３−１２９９８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記の特許文献３に示された細胞保持装置を用いてマイクロインジェクション、細胞電気整理実験等を行う場合、細胞の保持は可能だが、各逆四角錐状孔に確実に１個の細胞を効率良く収容するための具体的手法が確立されていないという問題がある。
【０００８】
また、個々の細胞が隔離されているため、実験後に細胞を回収し培養等を行う必要があるとき、細胞を回収することが困難であるという問題があり、スループットの点で再生医療やゲノム創薬などの産業応用には直接適用できないという問題がある。
【０００９】
一方、ポリ−Ｌ−リジンや、レクチン等を用いた細胞接着による固定法もあるが、細胞に対する毒性が懸念されており、加えて、固定後に細胞を剥離させ回収することが困難であるという問題がある。
【００１０】
したがって、本発明は、多量の細胞を短時間で保持し、保持後に保持されていた細胞を効率的に回収することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
図１は本発明の原理的構成図であり、ここで図１を参照して、本発明における課題を解決するための手段を説明する。
図１参照
上記課題を解決するために、本発明は、細胞給排・捕捉装置において、細胞懸濁液２を供給する細胞供給機構１、細胞を含まない液体４を供給する送液機構３、細胞懸濁液２及び液体４を流す流路６と細胞懸濁液２中の細胞を捕捉する貫通孔７を備えた捕捉チップ５、捕捉チップ５に接続されて貫通孔７からの吸引量を制御する吸引機構８、貫通孔７で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構９、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構１０とを少なくとも備えたことを特徴とする。
【００１２】
以上の構成を採用することによって、捕捉された細胞と捕捉されていない細胞を別々に回収することが可能となり、回収後の解析作業の効率を向上することができる。
また、吸引により細胞を捕捉しているので、捕捉手段自体が細胞に化学的な悪影響を与えることがなく、さらに、装置構成が全体として小型であるのでサンプル数が少ない場合にも確実な捕捉を行うことができる。
【００１３】
この場合、捕捉チップ５に、流路６の一方の端部に流路６に細胞懸濁液２及び液体４を流す流入部と、流路６の他方の端部に流路６から細胞懸濁液２及び液体４を回収する回収部とを設けるとともに、細胞懸濁液２中の細胞が通過できない径の複数の貫通孔７を流路６に沿うように設けることが望ましく、それによって、多数の細胞を捕捉チップ５に短時間で捕捉することが可能になる。
なお、貫通孔７の径を細胞の通過できない大きさにすることで、細胞が貫通孔７を通過することなく、細胞の捕捉が可能となる。
【００１４】
また、捕捉チップ５に設ける流路６は蛇行した一本の流路６として良いし、或いは、複数の平行に配置された流路６からなるとともに、各流路６の一端で共通の流入部に接続する接続流路を有するとともに、前記各流路６の他端で共通の回収部に接続する接続流路を有する分岐型の流路６としても良く、流路６を一本にした場合には細胞を順番に回収することが可能になり、一方、分岐型の流路６とした場合には細胞の搬送を並列で処理することで短時間で捕捉することが可能になる。
【００１５】
また、捕捉チップ５に設けた流路６の内壁を捕捉チップ５の基材より親水性にするとともに、捕捉チップ５の流路６の内壁以外の面を基材より疎水性にすることが望ましく、それによって、流路６を密閉することなく、流路６のみに細胞懸濁液２を流すことができる。
【００１６】
この場合、流路６の内壁を捕捉チップ５の基材より親水性の樹脂でコートするとともに、捕捉チップ５の流路６の内壁以外の面を基材より疎水性の樹脂でコートすれば良い。
【００１７】
また、細胞を含まない液体４を、細胞より比重の重い液体４とすることが望ましく、それによって、流路６の底に沈降している細胞を浮上させ、搬送を容易にすることができる。
【００１８】
この様な細胞を含まない液体４としては、細胞懸濁液２を構成する培地と同じ成分からなるとともに、培地より塩分濃度を高めた液体４であることが望ましく、基本的成分が同じであるので、捕捉細胞に悪影響を与えることがない。
【００１９】
また、この様な細胞給排・捕捉装置に、捕捉した細胞に物質を注入する注入機構を備えることによって、物質導入済み細胞を培養する際の回収を効率的に行うことができる。
【００２０】
また、上述の細胞の給排・捕捉を行う場合には、細胞懸濁液２を複数の貫通孔７を備えた流路６の一端から流し細胞懸濁液２中の細胞を貫通孔７で吸引により捕捉する工程、流路６の一端から細胞より比重の重い液体４を流し捕捉しきれなかった細胞を浮上させて流路６の他端で回収する工程、捕捉した細胞に物質を注入するインジェクション或いは経過観察のいずれかを行う工程、インジェクション或いは経過観察後に吸引を解除するとともに流路６の一端から細胞より比重の重い液体４を流し細胞を浮上させて流路６の他端で回収する工程とを順次行えば良い。
【発明の効果】
【００２１】
以上説明したように、本発明によれば、細胞を高スループットで捕捉し、また、捕捉細胞と捕捉されていない細胞を別々に、かつ、高効率に回収することができ、それによって、再生医療やゲノム創薬などの産業応用におけるマイクロインジェクション装置等への適用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、まず、
（１）細胞供給機構より、捕捉チップの流入部に細胞懸濁液を供給する。
流入部への供給方法は、細胞供給機構にピペット状の細管を接続して、細胞懸濁液を流入部へ滴下しても、チューブを介して細胞供給機構を捕捉チップに接続して、細胞懸濁液を供給しても良い。
このとき、捕捉チップの流路を親水性、流路以外の部分を疎水性にすることにより、流路を密閉することなく、流路のみに細胞懸濁液を流すことができる。
【００２３】
次いで、
（２）吸引機構を用いて、流路内の貫通孔に細胞を捕捉する。
貫通孔の出口は、吸引機構に接続されており、貫通孔からの吸引圧により細胞を捕捉するものであり、この場合、貫通孔の径を、細胞の通過できない大きさにすることで、細胞が貫通孔を通過することなく、細胞の捕捉が可能となる。
【００２４】
次いで、
（３）送液機構を用いて、捕捉チップより、捕捉されていない細胞を除去する。
このとき、細胞と比重の異なる液体を送液機構より流入部へ供給し、捕捉されていない細胞を浮上させ捕捉チップの流出部まで搬送し、
（４）不要細胞回収機構を用いて、流出部まで流れてきた、捕捉されていない細胞を回収する。
【００２５】
次いで、
（５）捕捉細胞に対して、インジェクション、経過観察等の作業を行い、作業が終わった後は、吸引機構を用いて、吸引圧を解除し、捕捉細胞を解放する。
【００２６】
次いで、
（６）再び、送液機構を用いて、開放された細胞を捕捉チップの流出部へと搬送する。 このときも、細胞と比重の異なる液体を送液機構より流入部へ供給し、捕捉されていた細胞を浮上させ捕捉チップの流出部まで搬送し、
（７）捕捉細胞回収機構を用いて、搬送されてきた捕捉細胞を回収する。
【実施例１】
【００２７】
ここで、図２及び図７を参照して、本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置を説明する。
図２参照
図２は、本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置の概念的構成図であり、ピペット状の細管１２を備えるとともに細管１２から培地１４に細胞１５を懸濁した細胞懸濁液１３を捕捉チップ３０に供給する細胞供給装置１１、ピペット状の細管１７を備えるとともに細管１７から培地より比重の重いキャリア液１８を捕捉チップ３０に供給する送液装置１６、供給された細胞懸濁液１３中の細胞１５を吸引装置２３によって吸引して捕捉する捕捉チップ３０、捕捉チップを収容するとともに吸引用の開口部２０を有する容器１９、容器１９を保持するとともに吸引装置２３との接続部２２を有するチップ保持具２１、細胞１５を捕捉するための吸引装置２３、捕捉した細胞１５を観察する細胞観察装置４０、捕捉されなかった細胞１５を細管２５を介して回収する不要細胞回収装置２４、インジェクション等の作業を行った処置済み細胞１５を細管２７を介して回収する捕捉細胞回収装置２６から基本構成が構成される。
【００２８】
この場合の細胞観察装置４０は、光源４１及び対物レンズ４２を備えた画像処理装置４３からなり、細胞観察装置４０は、捕捉チップ３０を常時観察し、細胞１５の捕捉状態を検出するとともに、細胞分裂等の経過観察を行う。
【００２９】
図３参照及び図４参照
図３は捕捉チップ３０の概略的平面図であり、また、図４は捕捉チップ３０の概略的断面図であり、通常のフォトリソグラフィー工程を利用してシリコン基板３１の一端に流入部３２、他端に流出部３４を形成するとともに、流入部３２と流出部３４を結ぶ蛇行した流路３３を形成する。
【００３０】
また、この流路３３の底部に吸引用の貫通孔３５を設けるとともに、シリコン基板３１の裏面に貫通孔３５に繋がる開口部３６を形成し、開口部３６を介して貫通孔３５から細胞を吸引する。
【００３１】
また、流路３３の側壁及び底面には親水性の樹脂３７、例えば、ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ（セルシード製商品名）をコートして親水性処理するとともに、流路３３以外のシリコン基板３１の表面には疎水性の樹脂３８、例えば、アクリル系樹脂をコートして疎水性処理する。
なお、この時、貫通孔３５が樹脂で塞がれないように注意する必要がある。
【００３２】
この流路３３の幅は、捕捉する細胞のサイズにもよるが細胞のサイズが１０〜１５μｍ程度の場合には、例えば、５０μｍの幅で５０μｍの深さとし、直線部の長さは５００μｍ程度とする。
また、この流路３３の底部に設ける貫通孔３５は、直径が例えば２μｍであり、この貫通孔３５を例えば、５０μｍの間隔で配置する。
【００３３】
図５参照
図５は、捕捉チップ乃至チップ保持具の配置構成の説明図であり、捕捉チップ３０は、例えば、容器１９に対して開口部３６が容器１９に設けた開口部２０と整合するように配置・固定する。
なお、この場合の容器１９は、周囲への液の飛散を防ぐとともに取り回しを簡便にするためのものであり、また、培養に使用するシャーレと同様に耐薬品性に優れたポリスチレン製とする。
【００３４】
また、容器１９は、チップ保持具２１に対して開口部２０が吸引装置２３との接続部２２に整合するように配置・固定し、この接続部２２に対しては吸引装置２３の先端部に設けた接続部材２８が接続される。
【００３５】
図６及び図７参照
図６は、本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置の動作フロー図であり、また、図７は細胞の捕捉・搬送、開放・搬送状態の説明図であり、まず、
Ａ．細胞供給装置１１より、捕捉チップ３０に設けた流入部３２に細胞懸濁液１３を供給する。
この場合、細胞供給装置１１により細胞懸濁液１３の送液量及び液圧を制御してピペット状の細管１２から滴下させる。
【００３６】
次いで、
Ｂ．吸引装置２３を用いて、流路３３内に設けた複数の貫通孔３５において細胞１５を捕捉する。
この場合、貫通孔３５の径は例えば、２μｍであり、細胞の径１０〜１５μｍに対して十分小さいの貫通孔３５から外に排出されることはない。
【００３７】
次いで、
Ｃ．送液装置１６を用いて、細管１７から捕捉チップ３０の流入部３２にキャリア液１８を供給して、捕捉されていない細胞１５を浮上させて流出部３４まで搬送する。
なお、ここでは、キャリア液１８として培地１４として用いる平衡塩類溶液（ＢＢＳ）の塩分濃度を高めて細胞１５の比重より重くした液体を用いる。
【００３８】
次いで、
Ｄ．流出部３４まで搬送された細胞１５を不要細胞回収装置２４を用いて細管２５から回収する。
【００３９】
次いで、
Ｅ．捕捉した細胞１５に対して、細胞分裂の状態等の経過観察を行ったのち、吸引装置２３による吸引圧を解除し、捕捉した細胞１５を解放する。
【００４０】
次いで、
Ｆ．再び、送液装置１６を用いて、細管１７から捕捉チップ３０の流入部３２にキャリア液１８を供給して、開放された細胞１５を流出部３４まで搬送する。
【００４１】
次いで、
Ｇ．流出部３４まで搬送された観察済みの細胞１５を捕捉細胞回収装置２６を用いて細管２７から回収することで、一連のフローが終了する。
以降は、回収した観察済みの細胞１５を、例えば、ポリカーボネート製の基板に９６個の凹部を二次元マトリクス状に設けた９６穴プレートに分注して少量ずつの保管・培養を行う。
【００４２】
このように、本発明の実施例１においては、流路３３に沿って複数の捕捉用の貫通孔３５を設けた捕捉チップ３０を利用しているので、不要細胞と捕捉細胞の回収を別個に短時間で行うことが可能になり、研究室用のみならず再生医療やゲノム創薬などの産業応用におけるマイクロインジェクション装置等への適用が可能となる。
【００４３】
また、捕捉チップ３０の流路３３を親水性、流路３３以外の部分を疎水性にすることにより、流路３３を密閉することなく、大気中に開放した状態で流路３３のみに細胞懸濁液１３を流すことができ、使い勝手が良好になる。
【００４４】
また、捕捉チップ３０に設けた流路３３を蛇行した一本の流路で構成しているので、捕捉した細胞を一個ずつ順番に回収することが可能となる。
【実施例２】
【００４５】
次に、図８を参照して、本発明の実施例２の細胞給排・捕捉装置を説明するが、捕捉チップに設ける流路の構成が異なるだけで、他の構成は同じであるので、捕捉チップのみを説明する。
図８参照
図８は、本発明の実施例２の細胞給排・捕捉装置に用いる捕捉チップ５０の概略的平面図であり、通常のフォトリソグラフィー工程を利用してシリコン基板５１の一端の中央部に流入部５２、他端の中央部に流出部５６を形成するとともに、流入部５２と流出部５６との間に複数本の平行に走る流路５４を形成し、流入部５２と複数の流路５４を分岐流路５３で接続するとともに、複数の流路５４と流出部５６を合流流路５５で接続する。
【００４６】
また、この流路５４の底部に吸引用の貫通孔５７を設けるとともに、シリコン基板５１の裏面に貫通孔５７に繋がる開口部５８を形成し、開口部５８を介して貫通孔５７から細胞を吸引する。
【００４７】
また、図示は省略するものの、この場合も流路４４の側壁及び底面には親水性の樹脂、例えば、ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ（セルシード製商品名）をコートして親水性処理するとともに、流路３３以外のシリコン基板３１の表面には疎水性の樹脂、例えば、アクリル系樹脂をコートして疎水性処理する。
【００４８】
また、この場合も、流路５４の幅は、捕捉する細胞のサイズにもよるが細胞のサイズが１０〜１５μｍ程度の場合には、例えば、５０μｍの幅で５０μｍの深さとし、直線部の長さは５００μｍ程度とする。
また、この流路５４の底部に設ける貫通孔５７は、直径が例えば２μｍであり、この貫通孔５７を例えば、５０μｍの間隔で配置する。
【００４９】
この様に、本発明の実施例２においては、流路５４を複数本に分岐しているので、細胞１５の搬送を並列で処理することができ、回収の効率が向上することができる。
【実施例３】
【００５０】
次に、図９を参照して、上記実施例１或いは２の細胞給排・捕捉装置を利用したマイクロインジェクション装置を説明するが、捕捉チップに対向した位置に注入装置６０を設けた以外は、上記の実施例１或いは２の細胞給排・捕捉装置と同じ構成である。
【００５１】
図９参照
図９は、本発明の実施例３のマイクロインジェクション装置の概念的構成図であり、ピペット状の細管１２を備えるとともに細管１２から培地１４に細胞１５を懸濁した細胞懸濁液１３を捕捉チップ３０に供給する細胞供給装置１１、ピペット状の細管１７を備えるとともに細管１７から培地より比重の重いキャリア液１８を捕捉チップ３０に供給するで送液装置１６、供給された細胞懸濁液１３中の細胞１５を吸引装置２３によって吸引して捕捉する捕捉チップ３０、捕捉チップを収容するとともに吸引用の開口部２０を有する容器１９、容器１９を保持するとともに吸引装置との接続部２２を有するチップ保持具２１、細胞１５を捕捉するための吸引装置２３、捕捉した細胞１５を観察する細胞観察装置４０、捕捉した細胞１５に対して薬液或いは遺伝子を注入する注入装置６０、捕捉されなかった細胞１５を細管２５を介して回収する不要細胞回収装置２４、インジェクション作業を行った物質注入済み細胞を細管２７を介して回収する捕捉細胞回収装置２６から基本構成が構成される。
【００５２】
この場合の注入装置６０は、物質導入用針６１と、この物質導入用針６１を制御する物質導入用針制御装置６２とにより構成され、捕捉チップ３０に設けた貫通孔に捕捉された細胞１５に対して物質導入用針５１によって遺伝子或いは薬液等の物質導入を順次行う。
【００５３】
このように、本発明の実施例３においては、実施例１或いは２の細胞給排・捕捉装置を用いてマイクロインジェクション装置を構成しているので、物質導入済み細胞の回収が用になる。
【００５４】
以上、本発明の各実施例を説明してきたが、本発明は各実施例に記載した条件・構成に限られるものではなく、各種の変更が可能であり、例えば、各実施例に記載した捕捉チップに設けた流路の形状、幅、深さ、長さは、任意なものであり、貫通孔の径とともに細胞のサイズに応じて適宜決定すれば良い。
【００５５】
また、上記の各実施例においては、疎水処理のためにアクリル系樹脂を用いているが、アクリル系樹脂に限られるものではなく、通常の樹脂は疎水性を有するため、このような通常の樹脂について疎水性を有するか否かを確認した上で用いても良いし、さらには、シリコン自体が疎水性を有するので疎水処理は必須ではない。
【００５６】
また、上記の各実施例においては、開放状態において流路のみに細胞懸濁液或いは液体が流れやすいように、流路の側壁及び底面を親水性にし、流路以外のシリコン基板の表面を疎水性にしているが、このような親水処理・疎水処理は必須ではない。
【００５７】
例えば、流路の側壁及び底面を親水性にして、流路以外のシリコン基板の表面はそのままの状態にしておいても良いし、あるいは、流路以外のシリコン基板の表面を疎水性にして、流路の側壁及び底面はそのままにしても良いし、さらには、何方にも処理を施さなくても良い。
【００５８】
また、上記の各実施例においては、捕捉チップを半導体集積回路分野やマイクロマシーン技術分野において微細加工技術が確立しているシリコン基板を用いているが、シリコン基板に限られるものではなく、ポリカーボネートやアクリル樹脂を用いても良いものである。
【００５９】
また、上記に実施例３においては、注入装置６０に一本の物質導入用針６１を設けて細胞に順々に遺伝子或いは薬液等を注入しているが、注入装置６０に流路の直線部の数に応じた本数の物質導入用針を一次元アレイ状に設けても良いものであり、それによって、注入効率を高めることができる。
【００６０】
また、上記の各実施例においては、細胞供給装置にピペット状の細管を接続して、細胞懸濁液を流入部へ滴下しているが、この様な構成に限られるものではなく、チューブを介して細胞供給装置を捕捉チップに接続して細胞懸濁液を供給するようにしても良い。
この様な構成は、送液装置における溶液の供給装置に関しても同様である。
【００６１】
また、上記の各実施例においては、捕捉チップを収容する容器をシャーレと同じ材質のポリスチレンで構成しているが、ポリスチレンに限られるものではなく、ポリカーボネート、アクリル樹脂、或いは、ガラス等の耐薬液性の高い物質で構成すれば良い。
【００６２】
また、上記の実施例１においては、流路に設けた貫通孔で細胞を捕捉して細胞分裂の観察を行っているが、この様な場合に限られるものではなく、他の薬液供給装置を設け細胞を捕捉した状態で流路に薬液を流して細胞の薬液反応を観察する場合等にも適用されるものである。
【００６３】
ここで再び図１を参照して、本発明の詳細な特徴を改めて説明する。
再び図１参照
（付記１） 細胞懸濁液２を供給する細胞供給機構１、細胞を含まない液体４を供給する送液機構３、前記細胞懸濁液２及び液体４を流す流路６と前記細胞懸濁液２中の細胞を捕捉する貫通孔７を備えた捕捉チップ５、前記捕捉チップ５に接続されて前記貫通孔７からの吸引量を制御する吸引機構８、前記貫通孔７で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構９、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構１０とを少なくとも備えたことを特徴とする細胞給排・捕捉装置。
（付記２） 上記捕捉チップ５が、上記流路６の一方の端部に前記流路６に上記細胞懸濁液２及び液体４を流す流入部と、前記流路６の他方の端部に前記流路６から前記細胞懸濁液２及び液体４を回収する回収部とを有し、且つ、上記貫通孔７が上記細胞懸濁液２中の細胞が通過できない径の複数の貫通孔７からなるとともに、前記流路６に沿うように設けられたことを特徴とする付記１記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記３） 上記流路６が蛇行した一本の流路６からなることを特徴とする付記２記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記４） 上記流路６が複数の平行に配置された流路６からなるとともに、各流路６の一端で共通の流入部に接続する接続流路６を有するとともに、前記各流路６の他端で共通の回収部に接続する接続流路６を有することを特徴とする付記２記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記５） 上記捕捉チップ５に設けた上記流路６の内壁を前記捕捉チップ５の基材より親水性にするとともに、前記捕捉チップ５の流路６の内壁以外の面を前記基材より疎水性にすることを特徴とする付記１乃至４のいずれか１に記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記６） 上記流路６の内壁を上記捕捉チップ５の基材より親水性の樹脂でコートするとともに、前記捕捉チップ５の流路６の内壁以外の面を前記基材より疎水性の樹脂でコートしたことを特徴とする付記５記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記７） 上記細胞を含まない液体４を、前記細胞より比重の重い液体４としたことを特徴とする付記１乃至６のいずれか１に記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記８） 上記細胞を含まない液体４が、上記細胞懸濁液２を構成する培地と同じ成分からなるとともに、前記培地より塩分濃度を高めた液体４であることを特徴とする付記８記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記９） 上記捕捉した細胞に物質を注入する注入機構を備えたことを特徴とする付記１乃至８のいずれか１に記載の細胞給排・捕捉装置。
（付記１０） 細胞懸濁液２を複数の貫通孔７を備えた流路６の一端から流し前記細胞懸濁液２中の細胞を前記貫通孔７で吸引により捕捉する工程、前記流路６の一端から前記細胞より比重の重い液体４を流し捕捉しきれなかった細胞を浮上させて前記流路６の他端で回収する工程、前記捕捉した細胞に物質を注入するインジェクション或いは経過観察のいずれかを行う工程、前記インジェクション或いは経過観察後に吸引を解除するとともに前記流路６の一端から前記細胞より比重の重い液体４を流し細胞を浮上させて前記流路６の他端で回収する工程とを順次行うことを特徴とする供給する細胞給排・捕捉方法。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の活用例としては、再生医療・ゲノム創薬等の事業における細胞への遺伝子或いは薬液の導入が典型的であるが、細胞分裂の観察や、細胞を捕捉した状態で流路に薬液を流して薬液反応を観察する場合等にも適用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の原理的構成の説明図である。
【図２】本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置の概念的構成図である。
【図３】本発明の実施例１の捕捉チップの概略的平面図である。
【図４】本発明の実施例１の捕捉チップの概略的断面図である。
【図５】本発明の実施例１の捕捉チップ乃至チップ保持具の配置構成の説明図である。
【図６】本発明の実施例１の細胞給排・捕捉装置の動作フロー図である。
【図７】本発明の実施例１における細胞の捕捉・搬送、開放・搬送状態の説明図である。
【図８】本発明の実施例２の細胞給排・捕捉装置に用いる捕捉チップの概略的平面図である。
【図９】本発明の実施例３のマイクロインジェクション装置の概念的構成図である。
【符号の説明】
【００６６】
１ 細胞供給機構
２ 細胞懸濁液
３ 送液機構
４ 液体
５ 捕捉チップ
６ 流路
７ 貫通孔
８ 吸引機構
９ 不要細胞回収機構
１０ 捕捉細胞回収機構
１１ 細胞供給装置
１２ 細管
１３ 細胞懸濁液
１４ 培地
１５ 細胞
１６ 送液装置
１７ 細管
１８ キャリア液
１９ 容器
２０ 開口部
２１ チップ保持具
２２ 接続部
２３ 吸引装置
２４ 不要細胞回収装置
２５ 細管
２６ 捕捉細胞回収装置
２７ 細管
２８ 接続部材
３０ 捕捉チップ
３１ シリコン基板
３２ 流入部
３３ 流路
３４ 流出部
３５ 貫通孔
３６ 開口部
３７ 親水性の樹脂
３８ 疎水性の樹脂
４０ 細胞観察装置
４１ 光源
４２ 対物レンズ
４３ 画像処理装置
５０ 捕捉チップ
５１ シリコン基板
５２ 流入部
５３ 分岐流路
５４ 流路
５５ 合流流路
５６ 流出部
５７ 貫通孔
５８ 開口部
６０ 注入装置
６１ 物質導入用針
６２ 物質導入用針制御装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液を供給する細胞供給機構、細胞を含まない液体を供給する送液機構、前記細胞懸濁液及び液体を流す流路と前記細胞懸濁液中の細胞を捕捉する貫通孔を備えた捕捉チップ、前記捕捉チップに接続されて前記貫通孔からの吸引量を制御する吸引機構、前記貫通孔で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構とを少なくとも備えたことを特徴とする細胞給排・捕捉装置。
【請求項２】
上記捕捉チップが、上記流路の一方の端部に前記流路に上記前記細胞懸濁液及び液体を流す流入部と、前記流路の他方の端部に前記流路から前記細胞懸濁液及び液体を回収する回収部とを有し、且つ、上記貫通孔が上記細胞懸濁液中の細胞が通過できない径の複数の貫通孔からなるとともに、前記流路に沿うように設けられたことを特徴とする請求項１記載の細胞給排・捕捉装置。
【請求項３】
上記捕捉チップに設けた上記流路の内壁を前記捕捉チップの基材より親水性にするとともに、前記捕捉チップの流路の内壁以外の面を前記基材より疎水性にすることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞給排・捕捉装置。
【請求項４】
上記細胞を含まない液体を、前記細胞より比重の重い液体としたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞給排・捕捉装置。
【請求項５】
細胞懸濁液を複数の貫通孔を備えた流路の一端から流し前記細胞懸濁液中の細胞を前記貫通孔で吸引により捕捉する工程、前記流路の一端から前記細胞より比重の重い液体を流し捕捉しきれなかった細胞を浮上させて前記流路の他端で回収する工程、前記捕捉した細胞に物質を注入するインジェクション或いは経過観察のいずれかを行う工程、前記インジェクション或いは経過観察後に吸引を解除するとともに前記流路の一端から前記細胞より比重の重い液体を流し細胞を浮上させて前記流路の他端で回収する工程とを順次行うことを特徴とする供給する細胞給排・捕捉方法。
【請求項１】
細胞懸濁液を供給する細胞供給機構、細胞を含まない液体を供給する送液機構、前記細胞懸濁液及び液体を流す流路と前記細胞懸濁液中の細胞を捕捉する貫通孔を備えた捕捉チップ、前記捕捉チップに接続されて前記貫通孔からの吸引量を制御する吸引機構、前記貫通孔で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構とを少なくとも備えたことを特徴とする細胞給排・捕捉装置。
【請求項２】
上記捕捉チップが、上記流路の一方の端部に前記流路に上記前記細胞懸濁液及び液体を流す流入部と、前記流路の他方の端部に前記流路から前記細胞懸濁液及び液体を回収する回収部とを有し、且つ、上記貫通孔が上記細胞懸濁液中の細胞が通過できない径の複数の貫通孔からなるとともに、前記流路に沿うように設けられたことを特徴とする請求項１記載の細胞給排・捕捉装置。
【請求項３】
上記捕捉チップに設けた上記流路の内壁を前記捕捉チップの基材より親水性にするとともに、前記捕捉チップの流路の内壁以外の面を前記基材より疎水性にすることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞給排・捕捉装置。
【請求項４】
上記細胞を含まない液体を、前記細胞より比重の重い液体としたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞給排・捕捉装置。
【請求項５】
細胞懸濁液を複数の貫通孔を備えた流路の一端から流し前記細胞懸濁液中の細胞を前記貫通孔で吸引により捕捉する工程、前記流路の一端から前記細胞より比重の重い液体を流し捕捉しきれなかった細胞を浮上させて前記流路の他端で回収する工程、前記捕捉した細胞に物質を注入するインジェクション或いは経過観察のいずれかを行う工程、前記インジェクション或いは経過観察後に吸引を解除するとともに前記流路の一端から前記細胞より比重の重い液体を流し細胞を浮上させて前記流路の他端で回収する工程とを順次行うことを特徴とする供給する細胞給排・捕捉方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−９４７８３（Ｐ２００６−９４７８３Ａ）
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２８４７５６（Ｐ２００４−２８４７５６）
【出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（０００００５２２３）富士通株式会社 (25,993)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（０００００５２２３）富士通株式会社 (25,993)
【Ｆターム（参考）】
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