経口摂取用組成物及び経口摂取用組成物の製造方法
【課題】非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に有用な経口摂取用組成物及びその製造方法を提供する。
【解決手段】ブドウ科ブドウ属植物、特に、ヤマブドウの葉の加工品及び／又は抽出品を有効成分として含む経口摂取用組成物として利用する。主な有効成分としてオリゴメリックプロアントシアニジンを含むことを特徴とし、該組成物はスーパーオキサイドアニオン消去能がＩＣ５０値として２０μｇ以下／ｍｌ及び／又はヒドロキシルラジカル消去能がＩＣ５０値として１０００μｇ以下／ｍｌの時、更に有効な効果を奏する。
【解決手段】ブドウ科ブドウ属植物、特に、ヤマブドウの葉の加工品及び／又は抽出品を有効成分として含む経口摂取用組成物として利用する。主な有効成分としてオリゴメリックプロアントシアニジンを含むことを特徴とし、該組成物はスーパーオキサイドアニオン消去能がＩＣ５０値として２０μｇ以下／ｍｌ及び／又はヒドロキシルラジカル消去能がＩＣ５０値として１０００μｇ以下／ｍｌの時、更に有効な効果を奏する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎(ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ, 以降「ＮＡＳＨ」と呼称する)の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物及び経口摂取用組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝に炎症が加わり、それが持続すると肝硬変まで進行することがある。この病態は非飲酒歴者においてもアルコール性脂肪性肝炎に類似した病状を示すことから、ＮＡＳＨの診断名を与えられ、高血圧、糖尿病、高脂血症と並び新しい生活習慣病として近年俄に注目されているところである。
【０００３】
食生活の欧米化すなわち高脂肪含量の食生活や運動不足による肥満人口の増加と生活習慣病患者の増加に伴い、脂肪肝患者，ＮＡＳＨ患者も増加することが想定される。ゆえに、新たに開発されるＮＡＳＨ治療薬や重症化抑制薬及び／又はＮＡＳＨ発症リスク低減機能食品や重症化リスク低減機能食品の開発及び／又はＮＡＳＨ治療方法や重症化予防法の確立が望まれている。
【０００４】
また、ヒトＮＡＳＨ病態に即した該病態モデル実験動物としてラットを用いた時、肝臓ミトコンドリアからの活性酸素ラジカル産生の亢進が認められることから、ＮＡＳＨと酸化ストレスの関係が強く示唆されている(非特許文献１参照)。
【０００５】
一方、ブドウ科ブドウ属の植物は世界中で約５０００種類が栽培されているとされ、主に醸造用、生食用、乾しブドウ用として果実部分が利用されている。最近、果実部分だけではなく、種子、果皮なども機能性成分としてフラボノイド、アントシアニジン、アントシアニンを含むことから利用されるようになり、特に、ラジカル消去能との関係でリスベラトロールが注目されている(特許文献１、非特許文献２〜４参照)。
【０００６】
ブドウの葉部分は一部が食用に供される他は殆んどが未利用のまま廃棄されている。しかし、ブドウの葉はオリゴメリックプロアントシアニジンをはじめとする多種類のポリフェノール類、リンゴ酸、シュウ酸などの有機酸類、ビタミンＣ、カロチノイド類、フェノール化合物などの機能性成分を含むことから、その加工技術並びに高度利用技術の確立が期待されていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−５２０８５号公報
【０００８】
【非特許文献１】ＴＡＫＡＹＡＭＡ Ｆ． ｅｔ ａｌ: Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉ．,１００(１)，ｐｐ．１６４(２００６)．
【０００９】
【非特許文献２】佐藤充克(１９９８)、成人病予防食品(二木鋭雄他編), ｐｐ.７９−ｐｐ.９０, シーエムシー出版(東京).
【００１０】
【非特許文献３】植木啓司他、Ｊ.ＡＳＥＶ Ｊｐｎ. １３(３),１２３−１２７(２００２).
【００１１】
【非特許文献４】植木啓司他、Ｊ.ＡＳＥＶ Ｊｐｎ. １４(２),７７−８２(２００３).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、その目的は、非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に有用な経口摂取用組成物及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、１)ＮＡＳＨ病態モデル実験動物の作出技術確立、２) ＮＡＳＨ病態モデル実験動物と酸化ストレスの関連解明(非特許文献１)、３)ブドウ科ブドウ属の植物の葉の成分によるラジカル消去活性の発見、並びに、４) ＮＡＳＨ病態モデル実験動物へのブドウ科ブドウ属の植物の葉加工物及び／又は抽出物投与による症状の予防及び／又は改善・治療効果の発見、に基づき本発明に至った。
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物であって、ブドウ科ブドウ属の植物の葉加工物及び／又は抽出物からなることを特徴とする。
【００１５】
上記ブドウ科ブドウ属の植物がヤマブドウ(Vitis coingnetiae Pulliat)であってもよい。
【００１６】
上記ブドウ科ブドウ属の植物の葉が赤く紅葉したものであってもよい。
【００１７】
上記抽出物を抽出する抽出溶媒が水及び／又はエタノール、又は水とエタノールの混合物であってもよい。
【００１８】
上記経口摂取用組成物には、オリゴメリックプロアントシアニジンが含有されている。
【００１９】
また、上記目的を達成するために、本発明の経口摂取用組成物の製造方法は、スーパーオキサイドアニオン消去能がＩＣ５０値として、２０μｇ以下／ｍｌであることを特徴とする上記経口摂取用組成物の製造方法である。
【００２０】
また、本発明の経口摂取用組成物の製造方法は、ヒドロキシルラジカル消去能がＩＣ５０値として、１０００μｇ以下／ｍｌであることを特徴とする上記経口摂取用組成物の製造方法である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療にブドウ科ブドウ属の植物の葉加工物及び／又は抽出物からなる経口摂取用組成物を用いたたことにより、従来廃棄していたブドウの葉部分の有効活用が出来るとともに、非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に有用な経口摂取組成物の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
ヒトにおける非アルコール性脂肪性肝炎は生化学的特徴及び／又は病理組織学的特徴により診断できる。未知の機能性素材評価のためのＮＡＳＨ病態モデル実験動物の作出は、例えばラットを用いた時、該実験動物の血中酸素分圧を低水準に維持することにより達成できる。
【００２３】
ＮＡＳＨ病態モデル実験動物と酸化ストレスの関連解明の詳細は上記非特許文献１に準拠している。即ち、上記ＮＡＳＨ病態モデル実験動物としてラットを用いた時、該実験動物肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル産生は亢進している。このことは、例えば、肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル消去活性を亢進することによるＮＡＳＨの予防、改善・治療への可能性を示唆している。
【００２４】
本発明において利用するブドウ科ブドウ属の品種は限定されないが、白ブドウよりも赤(黒)ブドウが好ましい。原料として利用する葉は、栽培期間中のいかなる時期でも原料として使用可能であるが、若葉よりも成熟した葉の方が望ましく、成長期の緑の葉よりも収穫期前後の紅葉した葉の方が有効である。
【００２５】
収穫された葉は直ちに殺菌及び／又は酵素失活を目的とした加熱処理をしても良い。加熱処理条件は殺菌、酵素失活に充分な温度、時間であると同時に、オリゴメリックプロアントシアニジンの減少が最小限度に収まる条件が望ましく、例えば、１２０℃、５分間の処理が好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
続けて、使用前までの期間、マイナス２０℃以下で冷凍保管しても良いし、又は、直ちに乾燥処理品として保管しても良い。乾燥方法は天日乾燥、熱風乾燥(ＡＤ)、真空凍結乾燥(ＦＤ)などが利用できる。長期間保管が必要とされる場合は、乾燥品として低温下にて脱酸素剤と共に光遮断下、ガスバリヤー製の高い包材に入れるとよいが、これに制限されるものではない。
【００２７】
本発明において、収穫された葉はそのままの状態で葉加工物として利用できる。例えば、収穫された葉を刻み、又は、ミンチし、又は、任意の各種素材と混合し、加工し、経口的に摂取するための機能性素材として用いることが可能である。加工手段の中には広義な意味での酵素処理、発酵処理なども含まれる。従って、本発明において葉加工物とは、例えば、葉そのものを食品として用いる場合を想定している。
【００２８】
本発明において、ラジカル消去能を有するオリゴメリックプロアントシアニジンなどの有効成分の濃縮された製品を得るために、ブドウ科ブドウ属の葉の抽出物を製造するに当たっては、抽出溶媒として水、エタノール、ヘキサン、アセトン、メタノール、エーテル、クロロホルム、など各種有機溶媒を単独又は混合して任意に利用できるが、経口的に摂取する組成物として、安全性確保の観点から、水及び／又はエタノールが好ましい。また、更に高いラジカル消去能を有する画分取得のために公知の精製手段で濃縮することを妨げない。
【００２９】
原料葉と抽出溶媒の割合を示す浴比は特には制限されないが、抽出効率、作業性などの観点から見て、例えば原料葉がＦＤ乾燥品の場合、浴比（重量比）は１０〜２０が好ましい範囲である。
【００３０】
上記抽出溶媒はそのまま用いることが出来るが、抽出過程及び抽出後の製品の品質保持の観点から脱酸素済み溶媒を用いることがより好ましい。
【００３１】
抽出温度、濃縮温度は特には制限されないが、有効成分の品質保持の観点から、出来るだけ低温下にて製造されることが望ましい。作業性、収率、品質などの観点から、全工程を５０℃以下、好ましくは、２０℃以下に管理することが望ましい。
【００３２】
本発明においては、抽出、濃縮された製品は使用まで低温下にて保管されることが望ましい。製品は脱酸素処理済みの水、エタノールなどの溶媒に溶解させたまま低温保存することが出来る。また、完全に溶媒を除いた後、粉末化し、このものを脱酸素剤などの共存下、ガスバリヤー製の高い包材に入れて低温保管することが出来る。何れの場合もヘッドスペースは、例えば、窒素などの不活性ガスにて置換することが望ましい。保管温度は４℃以下、望ましくはマイナス２０℃以下が良い。また、光を遮断した状態で保管する方が望ましい。
【００３３】
前述の通り、本発明においては利用するブドウ科ブドウ属の品種は限定されないが、ＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療のためにはヤマブドウ(Ｖｉｔｉｓ ｃｏｉｎｇｎｅｔｉｄａｅ Ｐｕｌｌｉａｎｔ)葉が特に有効である。このものは、原料確保にあたって安価かつ大量に入手可能で、原料のトレイサビリティー確保が容易で、しかも、品質的にはラジカル消去活性がブドウ科ブドウ属の中では相対的に高いと言う特性を有している。
【００３４】
各製品のフリーラジカルおよび活性酸素種消去能の評価は、例えば、電子スピン共鳴分光 (ＥＳＲ)法にて行うことが出来る。さらに具体的に例示すると、ＥＳＲ装置はＸ−Ｂａｎｄ(日本電子株式会社製ＲＸ型)にデジタル高速掃引ユニット(ラジカルリサーチ社)を組込み改良したフリーラジカル検出装置にＥＳＲ装置用ＷＩＮ−ＲＡＤシステムＲＤＡ−０３Ｗ ＥＳＲデータアナライザ(ラジカルリサーチ社)を接続したシステムから構成することが出来る。
【００３５】
ＥＳＲ測定条件は、例えば、掃引磁場領域: ３３６．５±５ｍＴ、磁場変調Ｆｉｅｌｄ Ｍｏｄ:０．０７９、Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ: ０．１０秒、掃引時間:１分、出力:８．０ｍＷで行い、結果はＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯによりトラップされたラジカルのシグナルの相対強度として示す。
【００３６】
一般に、ブドウ科ブドウ属の葉は最強の抗酸化剤と形容されるオリゴメリックプロアントシアニジンを含有しており、ＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療のために必要なラジカル消去活性を有する。
【００３７】
ブドウ科ブドウ属の植物の葉抽出物をラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療用組成物として利用するに当たり、スーパーオキサイドアニオン消去能はＥＳＲで測定した時、ＩＣ５０値として２０μｇ以下／ｍｌ、望ましくは１０μｇ以下／ｍｌ、最も望ましくは５μｇ以下／ｍｌとすることにより有効に目的を達成できる。
【００３８】
ブドウ科ブドウ属の植物の葉抽出物をラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療用組成物として利用するに当たり、ヒドロキシルラジカル消去能はＥＳＲで測定した時、ＩＣ５０値として１０００μｇ以下／ｍｌ、望ましくは５００μｇ以下／ｍｌ、最も望ましくは２００μｇ以下／ｍｌとすることにより有効に目的を達成できる。
【００３９】
以上説明したように、本発明は高いラジカル消去能を有するブドウ科ブドウ属の植物、特にヤマブドウの葉加工物及び／又は抽出物の製造方法を提供し、経口摂取用組成物として用いることにより非アルコール性脂肪性肝炎の有効な予防方法及び／又は治療方法を提供する。
【００４０】
以下、実施例によって本発明をさらに説明する。但し、下記の実施例は発明を例示するためのものであり、本発明をいかなる意味においても限定するものではない。
【００４１】
＜実施例１＞ヤマブドウ葉抽出物の製造方法
２００５年７月中旬に岡山県内にて成熟したヤマブドウ(Ｖｉｔｉｓ ｃｏｉｎｇｎｅｔｉａｅ Ｐｕｌｌｉａｔ)の葉を採集し出発原料とした。葉は緑色を呈し、褐色部分、破損部分の無いものを選別し洗浄した。
【００４２】
上記原料葉１０．０Ｋｇをマイナス８０℃にて冷凍後、棚温度５０℃で真空凍結乾燥(ＦＤ)処理し、乾燥葉２．５Ｋｇを得た。このものは使用するまで、脱酸素剤の共存下、ガスバリヤー性の高いアルミ包剤に入れてマイナス８０℃にて保管した。
【００４３】
ＦＤ処理した葉１００．０ｇに４℃に冷却した脱酸素水２．０ｌを加えて３時間、４℃下浸漬した。続けて、オムニミキサー(ヤマト科学株式会社)を用いて、氷冷下にて最高回転で１０分間破砕処理した。破砕液は氷冷下、Ｎｏ.５Ｂ東洋濾紙を用いて濾過し、濾液と残渣に分けた。濾液は５０℃以下で減圧濃縮し、又は、棚温度５０℃で真空凍結乾燥(ＦＤ)処理し、乾燥物１５．５ｇを得た。製品は脱酸素剤共存下、ガスバリヤー性の高いアルミ包剤は褐色ガラス製容器に入れてマイナス８０℃にて使用時まで水抽出物として保管した。
【００４４】
残渣は４℃に冷却した脱酸素済みエタノール２．０ｌを加えて３時間、４℃下浸漬した。続けて、オムニミキサー(ヤマト科学株式会社)を用いて、氷冷下にて最高回転で１０分間破砕処理した。破砕液は氷冷下、Ｎｏ.５Ｂ東洋濾紙を用いて濾過し、濾液と残渣に分けた。濾液は５０℃以下で減圧濃縮し、又は、棚温度５０℃で真空凍結乾燥(ＦＤ)処理し、乾燥物１１．０ｇを得た。製品は脱酸素剤共存下、ガスバリヤー性の高いアルミ包剤又は褐色ガラス製容器に入れてマイナス８０℃にて使用時までエタノール抽出物として保管した。
【００４５】
＜実施例２＞抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性
ＤＰＰＨ(１,１-ジフェニル-２-ピクリルヒドラジル)ラジカル消去能を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去能は以下の方法により測定した。５０μＭ ＤＰＰＨ溶液(溶媒／エタノール)とヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の水による希釈液を等量混合し、混和４５秒後に掃引開始した。ＤＰＰＨラジカルによるＥＳＲ信号と、Ｍｎによる６本のＥＳＲ信号の低磁場から３番目のＥＳＲ信号を比較し、ＤＰＰＨ／ＭｎのESR信号の相対強度により定量化した（非特許文献５：Ｔａｋａｙａｍａ Ｆ. ｅｔ ａｌ: Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ, ６４, ７１−７８(１９９４)参照）。
【００４６】
（Ａ）５０μＭ ＤＰＰＨエタノール溶液と （Ｂ）水の等量混合液を対照ＥＳＲ測定試料とし、ＥＳＲ測定で観察されたＤＰＰＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度を１００％とした。(Ｂ)をヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の水による希釈液に替え実施したＥＳＲ測定時のＤＰＰＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で、各抽出エキス成分のＤＰＰＨラジカルに対する消去活性を検討した。その結果、対照ＥＳＲ測定時のＤＰＰＨラジカル信号を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値(μｇ／ｍｌ)としてみた時、固形分換算されたヤマブドウ葉水抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能は２８．０、同じくエタノール抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能は４．１であった。
【００４７】
同様にして、上記水抽出物に関し、Ｔｒｏｌｏｘ((±)−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２,５,７,８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ、アルドリッチ社)のＤＰＰＨラジカル消去能を測定したところ、ＩＣ５０値(μｇ／ｍｌ)としてみた時、ＤＰＰＨラジカル消去能は１．６、同じくアスコルビン酸ナトリウムのヒドロキシルラジカル消去能は２４．１であった。
【００４８】
以上の結果から、ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の高いラジカル消去能が証明された。
【００４９】
＜実施例３＞抽出物のスーパーオキサイドアニオンラジカル消去活性
実施例１で調整されたヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物に関し、酵素反応で発生させたスーパーオキサイドアニオンラジカルに対する消去活性を評価した。スピントラップ剤 ＣＹＰＭＰＯ (２−(５,５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−２−λ５−[１,３,２]ｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｉｎａｎ−２−ｙｌ)−２−ｍｅｔｈｙｌ−３,４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−１−ｏｘｉｄｅ、ラジカルリサーチ社)を用いたＥＳＲ測定により、ＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオンのアダクトとして活性酸素を検出し、ＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオン／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度により定量化した。
【００５０】
即ち、２００ｍＭリン酸緩衝液, ｐＨ７．８中に２５０ μＭ Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ (シグマ社)、４６５μＭ ＤＥＴＡＰＡＣ (ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、和光純薬) 、５ｍＭ ＣＹＰＭＰＯ、各濃度のＳＯＤ (ウシ赤血球製、シグマ社)又はヤマブドウ葉の抽出物、０．０５Ｕ／ｍｌ Ｘａｎｔｈｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅ(ウシミルク製、生化学用、和光純薬)の混液を測定試料としてＥＳＲ分析を行った。
【００５１】
なお、Ｘａｎｔｈｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅ添加１分後に掃引を開始することで一定量発生させたスーパーオキサイドアニオンラジカル（非特許文献５参照）とＣＹＰＭＰＯのアダクトによるＥＳＲ信号と、Ｍｎによる６本のＥＳＲ信号の低磁場から３番目のＥＳＲ信号を比較し、ＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオンラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度によりスーパーオキサイドアニオンラジカルを定量化した。被験素材およびＴｒｏｌｏｘを添加せず実施した対照ＥＳＲ測定で観察されたＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオンラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度を１００％とした。
【００５２】
ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物をＥＳＲ測定試料に添加し、ＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオンラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で、各抽出エキス成分のスーパーオキサイドアニオンラジカルに対する消去活性を検討した。その結果、対照ＥＳＲ測定時の相対信号強度を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値 (μｇ／ｍｌ)として示してある。
【００５３】
その結果、固形分換算されたヤマブドウ葉水抽出物のスーパーオキサイドアニオン消去能は２．３、同じくエタノール抽出物のスーパーオキサイドアニオン消去能は１．０であった。
【００５４】
同様にして、上記水抽出物に関し、Ｔｒｏｌｏｘ(実施例２参照)のスーパーオキサイドアニオン消去能を測定したところ、ＩＣ５０値(μｇ／ｍｌ)としてみた時、スーパーオキサイドアニオン消去能は４１．９、同じくアスコルビン酸ナトリウムのスーパーオキサイドアニオン消去能は３．４であった。
【００５５】
以上の結果から、ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の高いラジカル消去能が証明された。
【００５６】
＜実施例４＞抽出物のヒドロキシルラジカル消去活性
実施例１で調整されたヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物に関し、ラジカル消去能を評価するためＥＳＲを用いてヒドロキシルラジカル消去能を測定した。ラジカルトラップ剤およびＥＳＲ装置は実施例３と同様である。
【００５７】
即ち、充分に窒素置換された２００ ｍＭリン酸緩衝液, ｐＨ７．８中に１００μＭ硫酸第一鉄、１００μＭＤＥＴＡＰＡＣ、５ｍＭＣＹＰＭＰＯ、各濃度のＴｒｏｌｏｘ又はヤマブドウ葉の抽出物、１００μＭ過酸化水素の混液を測定試料としてＥＳＲ分析を行った。
【００５８】
なお、過酸化水素添加１分後に掃引を開始することで一定量発生させたヒドロキシルラジカル（非特許文献５参照）とＣＹＰＭＰＯのアダクトによるＥＳＲ信号と、Ｍｎによる６本のＥＳＲ信号の低磁場から３番目のＥＳＲ信号を比較し、ＣＹＰＭＰＯ−ヒドロキシルラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度によりヒドロキシルラジカルを定量化した。被験素材およびＴｒｏｌｏｘを添加せず実施した対照ＥＳＲ測定で観察されたＣＹＰＭＰＯ−ヒドロキシルラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度を１００％とした。
【００５９】
ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物をＥＳＲ測定試料に添加し、ＣＹＰＭＰＯ−ヒドロキシルラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で、各抽出エキス成分のヒドロキシルラジカルに対する消去活性を検討した。その結果、対照ＥＳＲ測定時の相対信号強度を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値 (μｇ／ｍｌ)として示してある。
【００６０】
その結果、ＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ)としてみた時、固形分換算されたヤマブドウ葉水抽出物のヒドロキシルラジカル消去能は４１２．０、同じくエタノール抽出物のヒドロキシルラジカル消去能は６１．９であった。
【００６１】
同様にして、上記水抽出物に関し、Ｔｒｏｌｏｘ(実施例２参照)のヒドロキシルラジカル消去能を測定したところ、ＩＣ５０値(μｇ／ｍｌ)としてみた時、固形分換算されたヒドロキシルラジカル消去能は１０２．３、同じくアスコルビン酸ナトリウムのヒドロキシルラジカル消去能は２４．１であった。
【００６２】
以上の結果から、ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の高いラジカル消去能が証明された。
【００６３】
＜実施例５＞抽出物のＮＡＳＨへの効果
ヤマブドウ葉水抽出物によるＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアからのフリーラジカル産生抑制効果をみるため、下記試験を実施した。
【００６４】
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを、正常対照群(未処理)、ＮＡＳＨ病態群２群に分けた。ＮＡＳＨ病態モデルは高山らの方法(非特許文献１参照)に準拠して作成した。
【００６５】
各群のラットから、肝臓ミトコンドリアを分画(非特許文献６：Ｅｇａｓｈｉｒａ Ｔ. ｅｔ ａｌ:Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ, １１７, １１５−１１９(２０００)参照)し、下記アッセイ系 (非特許文献７：Ｙｕｄｏｎｇ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ:Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ, ３６(１１),１４３４−１４４３(２００４)参照)にて各群ミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種とスピントラップ剤ＤＭＰＯ (５,５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−１−ｏｘｉｄｅ、ラボッテク社)とで形成させたスピンアダクトをＥＳＲ−分光法にて検出した。
【００６６】
ヤマブドウ葉抽出物をミトコンドリア試料に添加し、ＤＭＰＯ−活性酸素・フリーラジカルアダクトのＥＳＲ信号強度の減弱効果により、ラジカル産生抑制効果を検討した(非特許文献８：Ｔａｋａｙａｍａ Ｆ. ｅｔ ａｌ:Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ, ８５, ２２７−２３３(２００１)参照)。各群のミトコンドリア画分は０．０３Ｍトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュクロース、０．１Ｍ塩化カリウムを含む)で縣濁し、ＥＳＲ測定時間で冷凍保存(−８０℃)した。
【００６７】
ＤＭＰＯ、ミトコンドリア及びＮＡＤＨは氷冷、これら以外は予め３７℃に温めておいたものを用いた。アッセイ系は、１２．５ ｍＭリン酸カリウム, １０．５ ｍＭトリス, ８７．５ ｍＭ シュクロース, ３５ｍＭ 塩化カリウム, ｐＨ ７．４緩衝液中に、５ｍｇ蛋白量／ｍｌミトコンドリア、９２０ ＤＭＰＯ (５,５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−１−ｏｘｉｄｅ、ラボテック社)、０．１％ドデシルマルトシド, １０ ｍＭ Ｌ−グルタミン酸カリウム, １０ ｍＭ Ｌ(−)-リンゴ酸ナトリウム, ２００ ｍＭ コハク酸二ナトリウム, １００μＭ ＮＡＤＨから構成されるよう、試料および試薬溶液を混液し、３７℃, ５分間インキュベーション後ＥＳＲ分析を行った。
【００６８】
その結果、検出されたＤＭＰＯとヒドロキシルラジカルとのアダクト(ＤＭＰＯ−ＯＨ)に特徴的なｇ値と微細定数を持つＥＳＲスペクトル(ＤＭＰＯ−ＯＨ)の信号強度でミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種を測定した。ヤマブドウ葉の水抽出物をＮＡＳＨ病態ミトコンドリアによるアッセイ系に添加し、ＤＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で、ＮＡＳＨ病態エネルギー代謝から派生する活性酸素・フリーラジカル種の発生増大への制御能を検討した。その結果、ＮＡＳＨポジティブアッセイＥＳＲ測定時の相対信号強度を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値 (μｇ／ｍｌ)として示してある。
【００６９】
すなわち、正常対象群(未処理)を１．０とした時、ＮＡＳＨ病態群は２．６、ＮＡＳＨ群にヤマブドウ葉水抽出物を添加した群は０．９となった。これにより、ヤマブドウ葉水抽出物はＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアからのラジカル産生を抑制制御することが実証された。従って、ヤマブドウ葉水抽出物は、経口的に摂取することによりＮＡＳＨの予防及び／又は改善・治療に有効であることが強く示唆された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎(ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ, 以降「ＮＡＳＨ」と呼称する)の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物及び経口摂取用組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝に炎症が加わり、それが持続すると肝硬変まで進行することがある。この病態は非飲酒歴者においてもアルコール性脂肪性肝炎に類似した病状を示すことから、ＮＡＳＨの診断名を与えられ、高血圧、糖尿病、高脂血症と並び新しい生活習慣病として近年俄に注目されているところである。
【０００３】
食生活の欧米化すなわち高脂肪含量の食生活や運動不足による肥満人口の増加と生活習慣病患者の増加に伴い、脂肪肝患者，ＮＡＳＨ患者も増加することが想定される。ゆえに、新たに開発されるＮＡＳＨ治療薬や重症化抑制薬及び／又はＮＡＳＨ発症リスク低減機能食品や重症化リスク低減機能食品の開発及び／又はＮＡＳＨ治療方法や重症化予防法の確立が望まれている。
【０００４】
また、ヒトＮＡＳＨ病態に即した該病態モデル実験動物としてラットを用いた時、肝臓ミトコンドリアからの活性酸素ラジカル産生の亢進が認められることから、ＮＡＳＨと酸化ストレスの関係が強く示唆されている(非特許文献１参照)。
【０００５】
一方、ブドウ科ブドウ属の植物は世界中で約５０００種類が栽培されているとされ、主に醸造用、生食用、乾しブドウ用として果実部分が利用されている。最近、果実部分だけではなく、種子、果皮なども機能性成分としてフラボノイド、アントシアニジン、アントシアニンを含むことから利用されるようになり、特に、ラジカル消去能との関係でリスベラトロールが注目されている(特許文献１、非特許文献２〜４参照)。
【０００６】
ブドウの葉部分は一部が食用に供される他は殆んどが未利用のまま廃棄されている。しかし、ブドウの葉はオリゴメリックプロアントシアニジンをはじめとする多種類のポリフェノール類、リンゴ酸、シュウ酸などの有機酸類、ビタミンＣ、カロチノイド類、フェノール化合物などの機能性成分を含むことから、その加工技術並びに高度利用技術の確立が期待されていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−５２０８５号公報
【０００８】
【非特許文献１】ＴＡＫＡＹＡＭＡ Ｆ． ｅｔ ａｌ: Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉ．,１００(１)，ｐｐ．１６４(２００６)．
【０００９】
【非特許文献２】佐藤充克(１９９８)、成人病予防食品(二木鋭雄他編), ｐｐ.７９−ｐｐ.９０, シーエムシー出版(東京).
【００１０】
【非特許文献３】植木啓司他、Ｊ.ＡＳＥＶ Ｊｐｎ. １３(３),１２３−１２７(２００２).
【００１１】
【非特許文献４】植木啓司他、Ｊ.ＡＳＥＶ Ｊｐｎ. １４(２),７７−８２(２００３).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、その目的は、非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に有用な経口摂取用組成物及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、１)ＮＡＳＨ病態モデル実験動物の作出技術確立、２) ＮＡＳＨ病態モデル実験動物と酸化ストレスの関連解明(非特許文献１)、３)ブドウ科ブドウ属の植物の葉の成分によるラジカル消去活性の発見、並びに、４) ＮＡＳＨ病態モデル実験動物へのブドウ科ブドウ属の植物の葉加工物及び／又は抽出物投与による症状の予防及び／又は改善・治療効果の発見、に基づき本発明に至った。
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物であって、ブドウ科ブドウ属の植物の葉加工物及び／又は抽出物からなることを特徴とする。
【００１５】
上記ブドウ科ブドウ属の植物がヤマブドウ(Vitis coingnetiae Pulliat)であってもよい。
【００１６】
上記ブドウ科ブドウ属の植物の葉が赤く紅葉したものであってもよい。
【００１７】
上記抽出物を抽出する抽出溶媒が水及び／又はエタノール、又は水とエタノールの混合物であってもよい。
【００１８】
上記経口摂取用組成物には、オリゴメリックプロアントシアニジンが含有されている。
【００１９】
また、上記目的を達成するために、本発明の経口摂取用組成物の製造方法は、スーパーオキサイドアニオン消去能がＩＣ５０値として、２０μｇ以下／ｍｌであることを特徴とする上記経口摂取用組成物の製造方法である。
【００２０】
また、本発明の経口摂取用組成物の製造方法は、ヒドロキシルラジカル消去能がＩＣ５０値として、１０００μｇ以下／ｍｌであることを特徴とする上記経口摂取用組成物の製造方法である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療にブドウ科ブドウ属の植物の葉加工物及び／又は抽出物からなる経口摂取用組成物を用いたたことにより、従来廃棄していたブドウの葉部分の有効活用が出来るとともに、非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に有用な経口摂取組成物の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
ヒトにおける非アルコール性脂肪性肝炎は生化学的特徴及び／又は病理組織学的特徴により診断できる。未知の機能性素材評価のためのＮＡＳＨ病態モデル実験動物の作出は、例えばラットを用いた時、該実験動物の血中酸素分圧を低水準に維持することにより達成できる。
【００２３】
ＮＡＳＨ病態モデル実験動物と酸化ストレスの関連解明の詳細は上記非特許文献１に準拠している。即ち、上記ＮＡＳＨ病態モデル実験動物としてラットを用いた時、該実験動物肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル産生は亢進している。このことは、例えば、肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル消去活性を亢進することによるＮＡＳＨの予防、改善・治療への可能性を示唆している。
【００２４】
本発明において利用するブドウ科ブドウ属の品種は限定されないが、白ブドウよりも赤(黒)ブドウが好ましい。原料として利用する葉は、栽培期間中のいかなる時期でも原料として使用可能であるが、若葉よりも成熟した葉の方が望ましく、成長期の緑の葉よりも収穫期前後の紅葉した葉の方が有効である。
【００２５】
収穫された葉は直ちに殺菌及び／又は酵素失活を目的とした加熱処理をしても良い。加熱処理条件は殺菌、酵素失活に充分な温度、時間であると同時に、オリゴメリックプロアントシアニジンの減少が最小限度に収まる条件が望ましく、例えば、１２０℃、５分間の処理が好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
続けて、使用前までの期間、マイナス２０℃以下で冷凍保管しても良いし、又は、直ちに乾燥処理品として保管しても良い。乾燥方法は天日乾燥、熱風乾燥(ＡＤ)、真空凍結乾燥(ＦＤ)などが利用できる。長期間保管が必要とされる場合は、乾燥品として低温下にて脱酸素剤と共に光遮断下、ガスバリヤー製の高い包材に入れるとよいが、これに制限されるものではない。
【００２７】
本発明において、収穫された葉はそのままの状態で葉加工物として利用できる。例えば、収穫された葉を刻み、又は、ミンチし、又は、任意の各種素材と混合し、加工し、経口的に摂取するための機能性素材として用いることが可能である。加工手段の中には広義な意味での酵素処理、発酵処理なども含まれる。従って、本発明において葉加工物とは、例えば、葉そのものを食品として用いる場合を想定している。
【００２８】
本発明において、ラジカル消去能を有するオリゴメリックプロアントシアニジンなどの有効成分の濃縮された製品を得るために、ブドウ科ブドウ属の葉の抽出物を製造するに当たっては、抽出溶媒として水、エタノール、ヘキサン、アセトン、メタノール、エーテル、クロロホルム、など各種有機溶媒を単独又は混合して任意に利用できるが、経口的に摂取する組成物として、安全性確保の観点から、水及び／又はエタノールが好ましい。また、更に高いラジカル消去能を有する画分取得のために公知の精製手段で濃縮することを妨げない。
【００２９】
原料葉と抽出溶媒の割合を示す浴比は特には制限されないが、抽出効率、作業性などの観点から見て、例えば原料葉がＦＤ乾燥品の場合、浴比（重量比）は１０〜２０が好ましい範囲である。
【００３０】
上記抽出溶媒はそのまま用いることが出来るが、抽出過程及び抽出後の製品の品質保持の観点から脱酸素済み溶媒を用いることがより好ましい。
【００３１】
抽出温度、濃縮温度は特には制限されないが、有効成分の品質保持の観点から、出来るだけ低温下にて製造されることが望ましい。作業性、収率、品質などの観点から、全工程を５０℃以下、好ましくは、２０℃以下に管理することが望ましい。
【００３２】
本発明においては、抽出、濃縮された製品は使用まで低温下にて保管されることが望ましい。製品は脱酸素処理済みの水、エタノールなどの溶媒に溶解させたまま低温保存することが出来る。また、完全に溶媒を除いた後、粉末化し、このものを脱酸素剤などの共存下、ガスバリヤー製の高い包材に入れて低温保管することが出来る。何れの場合もヘッドスペースは、例えば、窒素などの不活性ガスにて置換することが望ましい。保管温度は４℃以下、望ましくはマイナス２０℃以下が良い。また、光を遮断した状態で保管する方が望ましい。
【００３３】
前述の通り、本発明においては利用するブドウ科ブドウ属の品種は限定されないが、ＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療のためにはヤマブドウ(Ｖｉｔｉｓ ｃｏｉｎｇｎｅｔｉｄａｅ Ｐｕｌｌｉａｎｔ)葉が特に有効である。このものは、原料確保にあたって安価かつ大量に入手可能で、原料のトレイサビリティー確保が容易で、しかも、品質的にはラジカル消去活性がブドウ科ブドウ属の中では相対的に高いと言う特性を有している。
【００３４】
各製品のフリーラジカルおよび活性酸素種消去能の評価は、例えば、電子スピン共鳴分光 (ＥＳＲ)法にて行うことが出来る。さらに具体的に例示すると、ＥＳＲ装置はＸ−Ｂａｎｄ(日本電子株式会社製ＲＸ型)にデジタル高速掃引ユニット(ラジカルリサーチ社)を組込み改良したフリーラジカル検出装置にＥＳＲ装置用ＷＩＮ−ＲＡＤシステムＲＤＡ−０３Ｗ ＥＳＲデータアナライザ(ラジカルリサーチ社)を接続したシステムから構成することが出来る。
【００３５】
ＥＳＲ測定条件は、例えば、掃引磁場領域: ３３６．５±５ｍＴ、磁場変調Ｆｉｅｌｄ Ｍｏｄ:０．０７９、Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ: ０．１０秒、掃引時間:１分、出力:８．０ｍＷで行い、結果はＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯによりトラップされたラジカルのシグナルの相対強度として示す。
【００３６】
一般に、ブドウ科ブドウ属の葉は最強の抗酸化剤と形容されるオリゴメリックプロアントシアニジンを含有しており、ＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療のために必要なラジカル消去活性を有する。
【００３７】
ブドウ科ブドウ属の植物の葉抽出物をラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療用組成物として利用するに当たり、スーパーオキサイドアニオン消去能はＥＳＲで測定した時、ＩＣ５０値として２０μｇ以下／ｍｌ、望ましくは１０μｇ以下／ｍｌ、最も望ましくは５μｇ以下／ｍｌとすることにより有効に目的を達成できる。
【００３８】
ブドウ科ブドウ属の植物の葉抽出物をラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療用組成物として利用するに当たり、ヒドロキシルラジカル消去能はＥＳＲで測定した時、ＩＣ５０値として１０００μｇ以下／ｍｌ、望ましくは５００μｇ以下／ｍｌ、最も望ましくは２００μｇ以下／ｍｌとすることにより有効に目的を達成できる。
【００３９】
以上説明したように、本発明は高いラジカル消去能を有するブドウ科ブドウ属の植物、特にヤマブドウの葉加工物及び／又は抽出物の製造方法を提供し、経口摂取用組成物として用いることにより非アルコール性脂肪性肝炎の有効な予防方法及び／又は治療方法を提供する。
【００４０】
以下、実施例によって本発明をさらに説明する。但し、下記の実施例は発明を例示するためのものであり、本発明をいかなる意味においても限定するものではない。
【００４１】
＜実施例１＞ヤマブドウ葉抽出物の製造方法
２００５年７月中旬に岡山県内にて成熟したヤマブドウ(Ｖｉｔｉｓ ｃｏｉｎｇｎｅｔｉａｅ Ｐｕｌｌｉａｔ)の葉を採集し出発原料とした。葉は緑色を呈し、褐色部分、破損部分の無いものを選別し洗浄した。
【００４２】
上記原料葉１０．０Ｋｇをマイナス８０℃にて冷凍後、棚温度５０℃で真空凍結乾燥(ＦＤ)処理し、乾燥葉２．５Ｋｇを得た。このものは使用するまで、脱酸素剤の共存下、ガスバリヤー性の高いアルミ包剤に入れてマイナス８０℃にて保管した。
【００４３】
ＦＤ処理した葉１００．０ｇに４℃に冷却した脱酸素水２．０ｌを加えて３時間、４℃下浸漬した。続けて、オムニミキサー(ヤマト科学株式会社)を用いて、氷冷下にて最高回転で１０分間破砕処理した。破砕液は氷冷下、Ｎｏ.５Ｂ東洋濾紙を用いて濾過し、濾液と残渣に分けた。濾液は５０℃以下で減圧濃縮し、又は、棚温度５０℃で真空凍結乾燥(ＦＤ)処理し、乾燥物１５．５ｇを得た。製品は脱酸素剤共存下、ガスバリヤー性の高いアルミ包剤は褐色ガラス製容器に入れてマイナス８０℃にて使用時まで水抽出物として保管した。
【００４４】
残渣は４℃に冷却した脱酸素済みエタノール２．０ｌを加えて３時間、４℃下浸漬した。続けて、オムニミキサー(ヤマト科学株式会社)を用いて、氷冷下にて最高回転で１０分間破砕処理した。破砕液は氷冷下、Ｎｏ.５Ｂ東洋濾紙を用いて濾過し、濾液と残渣に分けた。濾液は５０℃以下で減圧濃縮し、又は、棚温度５０℃で真空凍結乾燥(ＦＤ)処理し、乾燥物１１．０ｇを得た。製品は脱酸素剤共存下、ガスバリヤー性の高いアルミ包剤又は褐色ガラス製容器に入れてマイナス８０℃にて使用時までエタノール抽出物として保管した。
【００４５】
＜実施例２＞抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性
ＤＰＰＨ(１,１-ジフェニル-２-ピクリルヒドラジル)ラジカル消去能を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去能は以下の方法により測定した。５０μＭ ＤＰＰＨ溶液(溶媒／エタノール)とヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の水による希釈液を等量混合し、混和４５秒後に掃引開始した。ＤＰＰＨラジカルによるＥＳＲ信号と、Ｍｎによる６本のＥＳＲ信号の低磁場から３番目のＥＳＲ信号を比較し、ＤＰＰＨ／ＭｎのESR信号の相対強度により定量化した（非特許文献５：Ｔａｋａｙａｍａ Ｆ. ｅｔ ａｌ: Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ, ６４, ７１−７８(１９９４)参照）。
【００４６】
（Ａ）５０μＭ ＤＰＰＨエタノール溶液と （Ｂ）水の等量混合液を対照ＥＳＲ測定試料とし、ＥＳＲ測定で観察されたＤＰＰＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度を１００％とした。(Ｂ)をヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の水による希釈液に替え実施したＥＳＲ測定時のＤＰＰＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で、各抽出エキス成分のＤＰＰＨラジカルに対する消去活性を検討した。その結果、対照ＥＳＲ測定時のＤＰＰＨラジカル信号を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値(μｇ／ｍｌ)としてみた時、固形分換算されたヤマブドウ葉水抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能は２８．０、同じくエタノール抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能は４．１であった。
【００４７】
同様にして、上記水抽出物に関し、Ｔｒｏｌｏｘ((±)−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２,５,７,８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ、アルドリッチ社)のＤＰＰＨラジカル消去能を測定したところ、ＩＣ５０値(μｇ／ｍｌ)としてみた時、ＤＰＰＨラジカル消去能は１．６、同じくアスコルビン酸ナトリウムのヒドロキシルラジカル消去能は２４．１であった。
【００４８】
以上の結果から、ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の高いラジカル消去能が証明された。
【００４９】
＜実施例３＞抽出物のスーパーオキサイドアニオンラジカル消去活性
実施例１で調整されたヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物に関し、酵素反応で発生させたスーパーオキサイドアニオンラジカルに対する消去活性を評価した。スピントラップ剤 ＣＹＰＭＰＯ (２−(５,５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−２−λ５−[１,３,２]ｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｉｎａｎ−２−ｙｌ)−２−ｍｅｔｈｙｌ−３,４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−１−ｏｘｉｄｅ、ラジカルリサーチ社)を用いたＥＳＲ測定により、ＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオンのアダクトとして活性酸素を検出し、ＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオン／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度により定量化した。
【００５０】
即ち、２００ｍＭリン酸緩衝液, ｐＨ７．８中に２５０ μＭ Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ (シグマ社)、４６５μＭ ＤＥＴＡＰＡＣ (ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、和光純薬) 、５ｍＭ ＣＹＰＭＰＯ、各濃度のＳＯＤ (ウシ赤血球製、シグマ社)又はヤマブドウ葉の抽出物、０．０５Ｕ／ｍｌ Ｘａｎｔｈｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅ(ウシミルク製、生化学用、和光純薬)の混液を測定試料としてＥＳＲ分析を行った。
【００５１】
なお、Ｘａｎｔｈｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅ添加１分後に掃引を開始することで一定量発生させたスーパーオキサイドアニオンラジカル（非特許文献５参照）とＣＹＰＭＰＯのアダクトによるＥＳＲ信号と、Ｍｎによる６本のＥＳＲ信号の低磁場から３番目のＥＳＲ信号を比較し、ＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオンラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度によりスーパーオキサイドアニオンラジカルを定量化した。被験素材およびＴｒｏｌｏｘを添加せず実施した対照ＥＳＲ測定で観察されたＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオンラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度を１００％とした。
【００５２】
ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物をＥＳＲ測定試料に添加し、ＣＹＰＭＰＯ−スーパーオキサイドアニオンラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で、各抽出エキス成分のスーパーオキサイドアニオンラジカルに対する消去活性を検討した。その結果、対照ＥＳＲ測定時の相対信号強度を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値 (μｇ／ｍｌ)として示してある。
【００５３】
その結果、固形分換算されたヤマブドウ葉水抽出物のスーパーオキサイドアニオン消去能は２．３、同じくエタノール抽出物のスーパーオキサイドアニオン消去能は１．０であった。
【００５４】
同様にして、上記水抽出物に関し、Ｔｒｏｌｏｘ(実施例２参照)のスーパーオキサイドアニオン消去能を測定したところ、ＩＣ５０値(μｇ／ｍｌ)としてみた時、スーパーオキサイドアニオン消去能は４１．９、同じくアスコルビン酸ナトリウムのスーパーオキサイドアニオン消去能は３．４であった。
【００５５】
以上の結果から、ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の高いラジカル消去能が証明された。
【００５６】
＜実施例４＞抽出物のヒドロキシルラジカル消去活性
実施例１で調整されたヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物に関し、ラジカル消去能を評価するためＥＳＲを用いてヒドロキシルラジカル消去能を測定した。ラジカルトラップ剤およびＥＳＲ装置は実施例３と同様である。
【００５７】
即ち、充分に窒素置換された２００ ｍＭリン酸緩衝液, ｐＨ７．８中に１００μＭ硫酸第一鉄、１００μＭＤＥＴＡＰＡＣ、５ｍＭＣＹＰＭＰＯ、各濃度のＴｒｏｌｏｘ又はヤマブドウ葉の抽出物、１００μＭ過酸化水素の混液を測定試料としてＥＳＲ分析を行った。
【００５８】
なお、過酸化水素添加１分後に掃引を開始することで一定量発生させたヒドロキシルラジカル（非特許文献５参照）とＣＹＰＭＰＯのアダクトによるＥＳＲ信号と、Ｍｎによる６本のＥＳＲ信号の低磁場から３番目のＥＳＲ信号を比較し、ＣＹＰＭＰＯ−ヒドロキシルラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度によりヒドロキシルラジカルを定量化した。被験素材およびＴｒｏｌｏｘを添加せず実施した対照ＥＳＲ測定で観察されたＣＹＰＭＰＯ−ヒドロキシルラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度を１００％とした。
【００５９】
ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物をＥＳＲ測定試料に添加し、ＣＹＰＭＰＯ−ヒドロキシルラジカル／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で、各抽出エキス成分のヒドロキシルラジカルに対する消去活性を検討した。その結果、対照ＥＳＲ測定時の相対信号強度を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値 (μｇ／ｍｌ)として示してある。
【００６０】
その結果、ＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ)としてみた時、固形分換算されたヤマブドウ葉水抽出物のヒドロキシルラジカル消去能は４１２．０、同じくエタノール抽出物のヒドロキシルラジカル消去能は６１．９であった。
【００６１】
同様にして、上記水抽出物に関し、Ｔｒｏｌｏｘ(実施例２参照)のヒドロキシルラジカル消去能を測定したところ、ＩＣ５０値(μｇ／ｍｌ)としてみた時、固形分換算されたヒドロキシルラジカル消去能は１０２．３、同じくアスコルビン酸ナトリウムのヒドロキシルラジカル消去能は２４．１であった。
【００６２】
以上の結果から、ヤマブドウ葉の水抽出物及びエタノール抽出物の高いラジカル消去能が証明された。
【００６３】
＜実施例５＞抽出物のＮＡＳＨへの効果
ヤマブドウ葉水抽出物によるＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアからのフリーラジカル産生抑制効果をみるため、下記試験を実施した。
【００６４】
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを、正常対照群(未処理)、ＮＡＳＨ病態群２群に分けた。ＮＡＳＨ病態モデルは高山らの方法(非特許文献１参照)に準拠して作成した。
【００６５】
各群のラットから、肝臓ミトコンドリアを分画(非特許文献６：Ｅｇａｓｈｉｒａ Ｔ. ｅｔ ａｌ:Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ, １１７, １１５−１１９(２０００)参照)し、下記アッセイ系 (非特許文献７：Ｙｕｄｏｎｇ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ:Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ, ３６(１１),１４３４−１４４３(２００４)参照)にて各群ミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種とスピントラップ剤ＤＭＰＯ (５,５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−１−ｏｘｉｄｅ、ラボッテク社)とで形成させたスピンアダクトをＥＳＲ−分光法にて検出した。
【００６６】
ヤマブドウ葉抽出物をミトコンドリア試料に添加し、ＤＭＰＯ−活性酸素・フリーラジカルアダクトのＥＳＲ信号強度の減弱効果により、ラジカル産生抑制効果を検討した(非特許文献８：Ｔａｋａｙａｍａ Ｆ. ｅｔ ａｌ:Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ, ８５, ２２７−２３３(２００１)参照)。各群のミトコンドリア画分は０．０３Ｍトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュクロース、０．１Ｍ塩化カリウムを含む)で縣濁し、ＥＳＲ測定時間で冷凍保存(−８０℃)した。
【００６７】
ＤＭＰＯ、ミトコンドリア及びＮＡＤＨは氷冷、これら以外は予め３７℃に温めておいたものを用いた。アッセイ系は、１２．５ ｍＭリン酸カリウム, １０．５ ｍＭトリス, ８７．５ ｍＭ シュクロース, ３５ｍＭ 塩化カリウム, ｐＨ ７．４緩衝液中に、５ｍｇ蛋白量／ｍｌミトコンドリア、９２０ ＤＭＰＯ (５,５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−１−ｏｘｉｄｅ、ラボテック社)、０．１％ドデシルマルトシド, １０ ｍＭ Ｌ−グルタミン酸カリウム, １０ ｍＭ Ｌ(−)-リンゴ酸ナトリウム, ２００ ｍＭ コハク酸二ナトリウム, １００μＭ ＮＡＤＨから構成されるよう、試料および試薬溶液を混液し、３７℃, ５分間インキュベーション後ＥＳＲ分析を行った。
【００６８】
その結果、検出されたＤＭＰＯとヒドロキシルラジカルとのアダクト(ＤＭＰＯ−ＯＨ)に特徴的なｇ値と微細定数を持つＥＳＲスペクトル(ＤＭＰＯ−ＯＨ)の信号強度でミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種を測定した。ヤマブドウ葉の水抽出物をＮＡＳＨ病態ミトコンドリアによるアッセイ系に添加し、ＤＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で、ＮＡＳＨ病態エネルギー代謝から派生する活性酸素・フリーラジカル種の発生増大への制御能を検討した。その結果、ＮＡＳＨポジティブアッセイＥＳＲ測定時の相対信号強度を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値 (μｇ／ｍｌ)として示してある。
【００６９】
すなわち、正常対象群(未処理)を１．０とした時、ＮＡＳＨ病態群は２．６、ＮＡＳＨ群にヤマブドウ葉水抽出物を添加した群は０．９となった。これにより、ヤマブドウ葉水抽出物はＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアからのラジカル産生を抑制制御することが実証された。従って、ヤマブドウ葉水抽出物は、経口的に摂取することによりＮＡＳＨの予防及び／又は改善・治療に有効であることが強く示唆された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物であって、ブドウ科ブドウ属の植物の葉加工物及び／又は抽出物からなること
を特徴とする経口摂取用組成物。
【請求項２】
上記ブドウ科ブドウ属の植物がヤマブドウであることを特徴とする請求項１記載の経口摂取用組成物。
【請求項３】
上記ブドウ科ブドウ属の植物の葉が赤く紅葉したものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の経口摂取用組成物。
【請求項４】
上記抽出物を抽出する抽出溶媒が水及び／又はエタノール、又は水とエタノールの混合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の経口摂取用組成物。
【請求項５】
オリゴメリックプロアントシアニジンを含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口摂取用組成物。
【請求項６】
スーパーオキサイドアニオン消去能がＩＣ５０値として、２０μｇ以下／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の経口摂取用組成物の製造方法。
【請求項７】
ヒドロキシルラジカル消去能がＩＣ５０値として、１０００μｇ以下／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の経口摂取用組成物の製造方法。
【請求項１】
非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物であって、ブドウ科ブドウ属の植物の葉加工物及び／又は抽出物からなること
を特徴とする経口摂取用組成物。
【請求項２】
上記ブドウ科ブドウ属の植物がヤマブドウであることを特徴とする請求項１記載の経口摂取用組成物。
【請求項３】
上記ブドウ科ブドウ属の植物の葉が赤く紅葉したものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の経口摂取用組成物。
【請求項４】
上記抽出物を抽出する抽出溶媒が水及び／又はエタノール、又は水とエタノールの混合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の経口摂取用組成物。
【請求項５】
オリゴメリックプロアントシアニジンを含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口摂取用組成物。
【請求項６】
スーパーオキサイドアニオン消去能がＩＣ５０値として、２０μｇ以下／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の経口摂取用組成物の製造方法。
【請求項７】
ヒドロキシルラジカル消去能がＩＣ５０値として、１０００μｇ以下／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の経口摂取用組成物の製造方法。
【公開番号】特開２００８−１９５６７２（Ｐ２００８−１９５６７２Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３９９７（Ｐ２００７−３３９９７）
【出願日】平成１９年２月１４日（２００７．２．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１０月２９日 社団法人 日本薬学会主催の「第４５回日本薬学会・日本病院薬剤師会中国支部学術大会」に文書をもって発表
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１４日（２００７．２．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１０月２９日 社団法人 日本薬学会主催の「第４５回日本薬学会・日本病院薬剤師会中国支部学術大会」に文書をもって発表
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
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