結核の診断
本発明は、（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；並びに（ｉｉ）前記発現データを、ＴＢ以外の炎症性状態に罹患している患者を含む対照患者の群からの前記マーカーの発現データと比較し、それによって、前記試験対象がＴＢに罹患しているかどうかを判定することを含む、試験対象における結核（ＴＢ）を診断する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核（ＴＢ）の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
潜在性ＴＢは世界の人口の３分の１に存在し、多くの地域で活性ＴＢは、人口１０万人当たり７００例を超えている（ＷＨＯ Ｓｔｏｐ ＴＢ ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｇｒｂ）。この世界的ＴＢ伝染病は、活性ＴＢに罹患しているアフリカの親の４０％〜７０％に見られるＨＩＶとの相乗作用によってさらに勢いを強めている。ＴＢの高罹患率地域では、喀痰スミア顕微鏡検査が、提供され利用できる唯一の試験であることが多いが、得られる感度はせいぜい５０％である。診断の判断基準である結核菌の培養により、感度はさらに２５％増加する。ツベルクリン皮膚試験は、特にＴＢの高罹患率地域では、診断を補助する上で正確さが不十分であることが多い。ＴＢに対する血清学的試験は、ミコバクテリア抗原（１種又は複数）の検出に焦点を当ててきたが、皮膚試験と同様に、非病原性のミコバクテリアとの交差反応性、又はＢＣＧによる以前の免疫化により混同されることが多い。
【０００３】
結核（ＴＢ）による死亡の多くは、早期診断と早期治療によって防止することができる。早期診断はまた、罹患率及び伝染の危険性を最小化するが、一般に、結核菌の顕微鏡による同定に頼られている。しかしながら、顕微鏡検査は感度が低く、生物の培養は治療的決定を助ける上で遅すぎることが多い。最近開発されたＤＮＡ増幅及びインターフェロンガンマに基づく試験は費用がかかり、特定の専門的知識が必要とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＴＢに対する正確で迅速な診断試験は、この疾病の制御に莫大な影響を及ぼすであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、プロテオミックプロフィルに対する監視付き機械学習解析を適用して、活性ＴＢに罹患している患者を、臨床的特徴の重複している対照患者から、識別することに成功した。本発明者は、ＴＢに罹患している患者に対して、９４％の診断的正確性を達成し、これは、民族又はＨＩＶの状態に影響されない。特徴選択によって、プロテオミックプロフィルにおける最も報知的なピークである４種のポリペプチド、血清アミロイドＡタンパク質、トランスシレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）、アポリポタンパク質−Ａ１及び血清アルブミンを同定し、免疫アッセイによって定量化した。これらのポリペプチドのうちの２種、血清アミロイドＡ及びトランスシレチンは、炎症状態を反映するため、本発明者は、ネオプテリン及びＣ反応性タンパク質もまた定量化した。さらに、プロテオミックプロフィルにおけるピークを同定するために用いた２Ｄゲルを分析することにより、アポリポタンパク質−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２を、ＴＢのマーカーとして同定した。サポートベクターマシン選別機をこれらのマーカーの組合せに適用することにより、ＴＢに対して８４％までの診断的正確性が与えられた。
【０００６】
したがって、本発明は、
−（ｉ）試験対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；及び
（ｉｉ）前記発現データを、ＴＢ以外の炎症性状態に罹患している患者を含む対照対象の群からの前記２種以上のマーカーの発現データと比較することによって前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定し、
それによって、前記試験対象がＴＢに罹患しているかどうかを判定すること
を含む、試験対象における結核（ＴＢ）を診断する方法；
−（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ（ＬＲＧ１））及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；及び
（ｉｉ）前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること
を含む、結核（ＴＢ）を診断する方法；
−（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；及び
（ｉｉ）訓練された機械学習選別機によってプログラムされたコンピュータシステムを用いて実施される、前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること
を含む、結核（ＴＢ）を診断する方法；
−（ｉ）対象における２種以上のマーカーの発現データを入力すること；及び
（ｉｉ）訓練されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）によってプログラムされたコンピュータシステムを用いて前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること
を含み、それによって、前記患者がＴＢに罹患しているかどうかを診断する、コンピュータにより実施されるＴＢを診断する方法；
−（ｉ）（ａ）結核（ＴＢ）患者の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ；及び
（ｂ）対照対象の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ
を含む訓練データを提供すること；
（ｉｉ）ＴＢ患者の訓練データを、対照対象の訓練データから識別するためにサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用すること
を含み、そのことにより、ＴＢを診断するためにＳＶＭを訓練する、ＴＢを診断するためにＳＶＭ選別機を訓練する方法；
−（ｉ）対象のサンプル中の２種以上のマーカーの発現データを受け入れる手段；
（ｉｉ）前記データがＴＢを示しているかどうかを判定するモジュールであって、ＴＢ患者のデータを、対照対象のデータから識別することのできる訓練された機械学習選別機を含むモジュール；及び
（ｉｉｉ）前記判定の結果を表示する手段
を含む、本発明による方法を実施するように構成された装置；
− コンピュータシステムによって実行可能なコンピュータプログラムであって、コンピュータシステムによる実行の際、コンピュータシステムに、本発明による方法を実施させることのできるコンピュータプログラム；
− 本発明によるコンピュータプログラムを有するコンピュータシステムによって読取り可能な形態において保存する保存媒体；
−（ｉ）２種以上のマーカーを検出するための手段；及び
（ｉｉ）本発明による保存媒体
を含む、ＴＢを診断するためのキット；
−（ｉ）２種以上のマーカーを検出するための手段；
（ｉｉ）本発明による装置に、前記マーカーの検出に関連するデータを入力するための使用説明書
を含む、ＴＢを診断するためのキット；
−（ｉ）トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される２種以上のマーカーを検出するための手段を含む、ＴＢを診断するためのキット；
−（ｉ）試験薬剤を、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミンＡｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質及びＡ２ＧＬから選択されるＴＢマーカーに接触させること；及び
（ｉｉ）前記試験薬剤が、前記マーカーの活性又は発現を調節するかどうかを判定すること
を含み、それによって、前記試験薬剤がＴＢの治療における使用に好適であるかどうかを判定する、ＴＢを治療するための薬剤を同定する方法；及び
−（ｉ）エクスビボ又はインビボで、細胞を結核菌及び試験薬剤に接触させること；
（ｉ）トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質及びＡ２ＧＬから選択される１種以上のＴＢマーカーの発現をモニターすること；及び
（ｉｉ）試験薬剤が前記１種以上の試験マーカーの発現を調節するかどうかを判定すること
を含み、それによって、前記試験薬剤がＴＢの治療における使用に好適であるかどうかを判定する、ＴＢを治療するための薬剤を同定する方法
を提供する。
【０００７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒト血清アミロイドＡ１のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒトＣ反応性タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトトランスシレチンのアミノ酸配列である。
配列番号４は、ヒト血清アルブミン前駆体のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ヒトアポリポタンパク質−Ａ１のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ヒトロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ヒトヘモグロビンベータのアミノ酸配列である。
配列番号８は、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列である。
配列番号９は、ヒトアポリポタンパク質−Ａ２のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ヒトＤＥＰドメインタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ヒト仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、試験対象における結核（ＴＢ）を診断するエクスビボ方法を提供し、前記方法は本質的に、以下のステップを含む：
（ｉ）試験対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；及び
（ｉｉ）前記発現データを、ＴＢ以外の炎症性状態に罹患している患者を含む対照患者の群からの前記マーカーの発現データと比較することによって、前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定し、
それによって、前記試験対象がＴＢに罹患しているかどうかを判定すること。
【０００９】
対照対象の群は、呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象の１種以上から選択できる。
【００１０】
本発明は、結核（ＴＢ）を診断するエクスビボ方法を提供し、前記方法は本質的に、以下のステップを含む：
（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；並びに
（ｉｉ）前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定し、それによって、患者が結核（ＴＢ）に罹患しているかどうかを診断すること。
【００１１】
マーカーは、ＴＢに罹患していない１種以上の対照対象から採取した等価なサンプル（１つ又は複数）に比較して、ＴＢ患者から採取したサンプルにおいて差異的に発現するタンパク質又はペプチドなどの分子である。該発現データは典型的に、対象からのサンプルに存在するマーカーの量の表示を提供する。マーカーは、対照サンプルに比較してＴＢサンプルにおいて、増加したレベルで（陽性マーカー）又は減少したレベルで（陰性マーカー）存在する場合、ＴＢ患者から採取したサンプル及び対照対象から採取したサンプルにおいて差異的に存在する。マーカーの量の増加又は減少は、統計的に有意な差異であることが好ましい。
【００１２】
用語の「感受性」は、本明細書において、真の陽性の条件的確率として定義される。用語の「特異性」は、本明細書において、真の陰性の条件的確率として定義される。用語の「正確さ」は、本明細書において、正しい分類の比率として定義される。したがって、正確さは、ＴＢの診断に関する特異的マーカー対又はマーカー集団の再現性を示し；感受性は、真の陽性診断を達成する結合可能性の程度を示し；特異性は、ＴＢ感染に関する真の陰性としてのサンプル同定において、各マーカーの結合の良好性の程度を示す。
【００１３】
トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ及びＳＡＡは、ＴＢにおける病態生理学的過程に関連していることが知られている。しかし、これらのタンパク質のいずれも、ＴＢの診断におけるマーカーとして使用できることが以前示唆されたことはない。本発明者は、ＳＡＡ、ネオプテリン、ＣＲＰ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａ２ＧＬ及びＤＥＰドメインタンパク質を、ＴＢの陽性マーカーとして、並びに、トランスシレチン、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２をＴＢの陰性マーカーとして同定した。種々の組合せで用いられた場合、これらのマーカー、特に、ＳＡＡ、ネオプテリン、ＣＲＰ及びトランスシレチンは、高程度の感受性、特異性及び正確さでＴＢの診断に使用できることを、本発明者は見出した。本発明の方法は典型的に、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の正確さ、特異性及び／又は感受性でのＴＢの診断を可能にする。
【００１４】
したがって、本発明は、対象が結核菌に感染しているかどうかを、前記対象のサンプルにおける結核菌を培養する必要なしに、迅速に容易に判定することを可能にする。本発明の方法は、ＴＢを、ＴＢ以外のウィルス及び細菌の感染症などの他の感染症及び炎症性疾患から識別することを可能にする。ＴＢから識別できる感染症及び炎症性疾患の例としては、他の呼吸器感染症、サルコイドーシス、炎症性腸疾患、マラリア、ヒトアフリカトリパノソーマ症、神経系疾患、自己免疫疾患及び骨髄腫が挙げられる。
【００１５】
本発明の一方法において、対象からの発現データが典型的に、ＴＢ患者における同じマーカーの発現データと比較される。ＴＢ患者は、該患者からのサンプルの結核菌を培養することにより、ＴＢに罹患しているとして診断できたことがあり得る。該発現データを、１種以上の対照対象における同じマーカーの発現データと比較することもできる。該対照対象は、ＴＢ以外の炎症性疾患に罹患している患者かも知れない。炎症性疾患は、病原性の感染、例えば、細菌、ウィルス又は真菌の感染によって引き起こされ得る。該対照対象は、本明細書に記載された、ＴＢ以外の疾患のいずれかに罹患していることがあり得る。或いは、又はそれに加えて、１種以上の対照対象は健康な個体であり得る。健康な個体は、炎症性疾患に罹患していない個体である。
【００１６】
２種以上のマーカーの発現データを用いることによって、診断の正確さが増強する。３種以上のマーカーなど、２種超のマーカーを組み合わせて用いることによって、診断の正確さをさらに増強できる。したがって、本発明において、２種以上のマーカー、好ましくは３種以上のマーカー、例えば、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種又はそれ以上のマーカーなど、４種以上のマーカーの発現データが用いられる。診断の方法に用いられるこれらのマーカーのうちの１種はトランスシレチンであることが好ましい。好ましい組合せとしては、（ｉ）トランスシレチン、ＳＡＡ及びＣＲＰ、（ｉｉ）トランスシレチン及びネオプテリン及び（ｉｉｉ）トランスシレチン、ネオプテリン及びＣＲＰが挙げられる。トランスシレチン、ネオプテリン、ＳＡＡ及びＣＲＰ以外の血清アルブミン及び／又はＡｐｏ−Ａ１などの追加マーカーを該分析に含めることができる。さらなる追加マーカーとしては、アポリポタンパク質−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２が挙げられる。
【００１７】
さらなる追加マーカーは、対照サンプルに比較して、ＴＢサンプル中に増加又は減少したレベルで存在するタンパク質又はペプチドであり得る。さらなるマーカー（１種又は複数）は、例えば、質量分析によって判定される、見かけの分子量又は質量対電荷比（ｍ／ｚ値）によって特徴づけることができる。
【００１８】
このような追加の生体マーカーは、本発明者によって、ＳＡＡ、血清アルブミン及びＡｐｏ−Ａ１がＴＢの陽性マーカーであり、トランスシレチンがＴＢの陰性マーカーであると判定するために使用される方法によって同定できる。他の陽性及び陰性関連マーカーは、表面増強レーザー脱離及びイオン化（ＳＥＬＤＩ）技法及び監視付き機械学習分類法により同定できる。
【００１９】
例えば、本発明者は、サポートベクターマシン選別機を用いて、ＴＢ患者のプロテオミックな識別特性を、対照対象のプロテオミックな識別特性と比較することによって１０種の陽性マーカー及び１０種の陰性マーカーを同定した。該陽性マーカーは、約Ｍ１８３９４＿９、約Ｍ８９５２＿７５、約Ｍ１１７２０＿０、約Ｍ１１４５４＿１、約Ｍ１８５９１＿２、約Ｍ１１４８８＿１、約Ｍ９０７６＿６８、約Ｍ８８９５＿１３、約Ｍ１０８５６＿８及び約Ｍ１１５４１＿５のｍ／ｚ値を有し、負に相関したマーカーは、約Ｍ４１００＿０３、約Ｍ３８９８＿５２、約Ｍ１３９７２＿１、約Ｍ３３２２＿０１、約Ｍ２９５６＿４５、約Ｍ５６４４＿９６、約Ｍ３９３９＿６３、約Ｍ４０５６＿３９、約Ｍ６６４９＿７４及び約Ｍ１３７７４＿３のｍ／ｚ値有する。約Ｍ１１５４１＿５のｍ／ｚ値を有するマーカーはＳＡＡである。約Ｍ１８３９４＿９のｍ／ｚ値を有するマーカーは血清アルブミンである。約Ｍ１１４５４＿１のｍ／ｚ値を有するマーカーはＡｐｏ−Ａ１である。約Ｍ１３７７４＿３のｍ／ｚ値を有するマーカーはトランスシレチンである。ｍ／ｚ値にはいくらか変動があり得る。例えば、ｍ／ｚ値の決定に用いる機械の分解能、又は該マーカーの翻訳後修飾に依存する変動があり得る。したがって、上記に挙げたマーカーは、指定されたｍ／ｚ値プラス又はマイナス約１０％、約５％、約１％、約０．５％又は約０．２％を有し得る。
【００２０】
ＳＥＬＤＩ分析によって同定された追加マーカーの同定は、トリプシン消化及びペプチド質量フィンガープリントのＭａｔｒｉｘ補助レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）質量分析、並びにＭＡＳＣＯＴデータベースなどのタンパク質データベースとの比較によって決定できる。ＳＡＡ１はＭ１１５４１＿５のｍ／ｚ値を有し、トランスシレチンは、Ｍ１３７７４＿３のｍ／ｚ値を有するが、このような方法によって同定された。
【００２１】
該マーカーはまた、２次元（２Ｄ）ゲル上のｍ／ｚ値に対応するタンパク質のスポットを同定し、切り出し、該スポットに存在するタンパク質を同定することによって同定できる。該２Ｄゲルは、約１０、約２０又はそれ以上などの数のＴＢ患者、又は約１０、約２０又はそれ以上などの数の対照対象のプールされた血清から得ることができる。ｍ／ｚ値は一般に、受動的溶出（ＰＥ）質量よりもわずかに小さい。ｍ／ｚ値以上のＰＥ質量の増加は、受動的溶出を行うのに用いられた時間に比例する。したがって、この方法が用いる場合、ｍ／ｚ値とＰＥ質量との間の関連は近似的であることに注意することが重要である。しかし、該マーカーの同定は、元のサンプルの免疫減少及びＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ分析の反復によって確認できる。対象となっているｍ／ｚ値を有するピークサイズの減少は、正しい同定がなされたことを示している。しかし、本発明の方法にマーカーとして質量使用されるタンパク質にとって、さらなる同定は必須ではない。この方法を用いて、Ｍ１８３９４＿９及びＭ１１４５４＿１のｍ／ｚ値を有する陽性マーカーは、血清アルブミン前駆体並びにアポリポタンパク質Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）として同定された。したがって、血清アルブミン及び／又はＡｐｏ−Ａ１など、それらのｍ／ｚ値によって同定されたマーカーの１種以上を、本発明の方法におけるマーカーとして用いることができる。
【００２２】
ＴＢのさらなるマーカーは、ＴＢ患者及び対照対象からの血清タンパク質を含有する２Ｄゲルに差異的に存在するポリペプチドを同定することによって同定したものであり得る。この方法で同定されたマーカーは、アポリポタンパク質Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質及び仮想タンパク質（ＤＦＫＺｐ６６Ｉ０３２）並びにロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ（ＬＲＧ１））である。
【００２３】
ＴＢ患者と対照対象からのプロテオミックな識別特性の監視機械学習分析後、ＴＢのマーカーとしての使用に好適なタンパク質集団を、ＴＢ患者と対照対象との間を識別する能力を有するタンパク質集団の選択を可能にする任意の方法により同定できる。典型的には、相関フィルター法を用いて、独立して情報を与えるピークを検出する。例えば、ピヤソン相関係数を使用して、ピークをそれらの識別力に関して等級づけることができる。ピヤソン相関係数は、
【数１】
として定義され、式中、Ｘｋは、サンプル入力ベクトルＸのｋ番目の成分に対応するランダムな変数であり、Ｙは、出力ラベルのランダムな変数である。Ｒ（ｋ）の推定値は、
【数２】
により与えられ、式中、ｘｉ，ｋは、サンプルｉの質量集団ｋのｍ／ｚ値に対応し、ｙｉは、サンプルｉのクラスラベルであり、ｍはサンプルの数である。Ｒ（ｉ）は、変数の有意性を評価するための検定統計値として使用でき、ｔ検定に関連している。
【数３】
は、訓練セットにわたって各質量集団の値と対応するクラスラベルとの間で算出できる。次いで、
【数４】
を用いて、正及び負に相関した質量集団を等級づけることができる。最高の正及び／又は最高の負の相関係数を有する質量集団を選択できる。
【００２４】
タンパク質はしばしば、異なって検出できる分子質量によって特徴づけられる複数の異なる形態において生物学的材料に存在する。したがって、ＳＥＬＤＩなどの方法による生物学的サンプル中の発現タンパク質の分析では、タンパク質集団として、種々の形態のタンパク質が検出される。種々の形態は、翻訳前及び／又は翻訳後修飾から生じ得る。例えば、トランスシレチンマーカーは、トランスシレチン前駆体又は成熟トランスシレチンであり得る。さらなる例として、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１及びＡｐｏ−Ａ２マーカーの各々もまた、該タンパク質の前駆体形態又は成熟形態であり得、好ましくは、前駆体形態である。対立形質変異、スプライス変異体の生成及びＲＮＡ編集は、翻訳前修飾を増加させる。翻訳後修飾としては、タンパク質分解的開裂、グリコシル化、リン酸化、脂質化、酸化、メチル化、シスチニル化、スルフォン化及びアセチル化が挙げられる。発現データは、該タンパク質の１つ又は複数の形態のいずれかに関するものであり得る。翻訳前及び／又は翻訳後修飾は、ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦにおけるマーカーのｍ／ｚ値における変動を増加させ得る。
【００２５】
本発明の一実施形態において、該発現データは、前記マーカーに由来する１種又は複数のペプチドに関するものであり得る。例えば、ＳＡＡの発現データは、ＳＡＡのＮ末端アルギニンの欠失から生じるペプチドの発現に関するものであり得る。ＳＡＡ１の完全配列は、配列番号１に示されている。
【００２６】
一実施形態において、発現データは、該マーカーの特定の形態に関するものであり得る。例えば、陽性マーカー、Ａｐｏ−Ａ１は、約１１４００から約１１６００ダルトン（Ｄａ）の分子質量を有する形態であり得、及び／又は陽性マーカー、血清アルブミンは、約１８３００から約１８５００ダルトンの分子質量を有する形態であり得る。
【００２７】
発現データは任意の好適な方法によって得ることができる。一実施形態において、該発現データは、対象となっている各マーカーの存在又は不在を示す。該発現データが対象のサンプルに存在する各マーカーの量の表示を提供する、即ち、該データが定量的であることが好ましい。該発現データはさらに、各マーカーの形態、例えば、存在するタンパク質の形態を限定し得る。
【００２８】
典型的に発現データは、固相、又は表面上へのマーカーの捕捉、及び捕捉されたマーカーの検出によって得られる。該表面は、サンプルからのマーカータンパク質を、使用されているマーカーの一般的な性質に従って、又は種々のタンパク質マーカーの特定の性質に従って選択するようにデザインされる。該表面は典型的に、１つ又は複数の捕捉試薬が結合するビーズ、プレート、膜又はチップである。該捕捉試薬は、特定のクロマトグラフィー表面であり得る。該クロマトグラフィー表面は、化学的又は生化学的に処理され得る。化学処理された表面は、アニオン性、カチオン性、疎水性、親水性又は金属であり得る。このような化学処理された表面は、特定の化学的性質を有するタンパク質を捕捉することができる。このような化学処理された表面は、例えば、イオン交換材料、ニトリロ酢酸又はイミノ二酢酸などの金属キレート化剤、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、染料、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖及び脂肪酸などの単純な生体分子、並びに、疎水性の吸引／静電斥力吸着剤などの混合様式吸着剤を含み得る。
【００２９】
表面が生化学処理されている一実施形態において、該捕捉試薬は典型的に、特定のマーカーに対する特異的結合試薬である。この実施形態において、該表面は典型的に、使用されている各マーカーに対する特異的結合試薬を含む。タンパク質が、それに対して特異的なマーカーに優先的に、又は高親和性で結合するが、他の物質には、結合しないか、実質的に結合しないか、又は低親和性でしか結合しない場合、該タンパク質は該マーカーに「特異的に結合」する。タンパク質の特異的結合能力は、任意の好適な方法により判定できる。競合的結合に関する種々のプロトコルが当業界によく知られている（例えば、Ｍａｄｄｏｘら、（１９９３）を参照）。
【００３０】
特異的結合剤は、該マーカーに特異的な抗体又は抗体断片であり得る。好適な抗体が当業界で入手できる。抗体及び抗体断片はまた、当業界に知られた標準的操作を用いて作出することもできる。
【００３１】
該抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体が好ましい。結合タンパク質はまた、親和性リガンド又は該マーカーに結合できる抗体断片であり得るか、又はそれを含み得る。このような抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２断片、並びに一本鎖抗体が挙げられる。アプタマー、抗体及び相互作用する融合タンパク質もまた、特異的結合剤として使用できる。該特異的結合剤は、対象となっているマーカーの１つ又は複数の形態を認識し得る。
【００３２】
他の生化学処理された表面は、ポリペプチドなどの核酸分子、多糖、脂質、ステロイド又は糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質又は核酸などの結合分子（例えば、ＤＮＡ−タンパク質結合体）によってコーティングされ得る。
【００３３】
抗体などの特異的結合剤を表面に結合させる方法は、当業界によく知られている。
【００３４】
該表面はタンパク質チップアレイであり得る。タンパク質チップアレイは、捕捉試薬の、典型的には２ｍｍの直径の個別のスポットを含む。該アレイ上の各スポットにおける捕捉試薬は、同一でもよいし異なっていてもよい。本発明の使用に好適なタンパク質チップアレイは当業界によく知られている。例えば、好適なチップはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手でき、ＣＭ１０、ＩＭＡＣ−３、ＣＭ１６、ＳＡＸ２、Ｈ４、ＮＰ２０、Ｈ５０、Ｑ−１０、ＷＣＸ−２、ＩＭＡＣ−３０、ＬＳＡＸ−３０、ＬＷＣＸ−３０、ＩＭＡＣ−４０、ＰＳ１０、ＰＳ−２０及びＰＧ−２０のタンパク質チップアレイが含まれる。
【００３５】
これらのタンパク質バイオチップは典型的に、ストリップの形態におけるアルミニウム基質を含む。該ストリップの表面は、二酸化ケイ素でコーティングされている。ＮＰ−２０バイオチップの場合、二酸化ケイ素は、親水性タンパク質を捕捉するための親水性吸着剤として機能する。Ｈ４、Ｈ５０、ＳＡＸ−２、Ｑ−１０、ＷＣＸ−２、ＣＭ−１０、ＩＭＡＣ−３、ＩＭＡＣ−３０、ＰＳ−１０及びＰＳ−２０バイオチップは、バイオチップの表面に物理的に結合した、又はバイオチップの表面にシランを介して共有結合したヒドロゲルの形態における機能化された架橋ポリマーをさらに含む。Ｈ４バイオチップは、親水性結合のためのイソプロピル機能性を有する。Ｈ５０バイオチップは、疎水性結合のためのノニルフェノキシルポリ（エチレングリコール）メタクリレートを有する。ＳＡＸ−２及びＱ−１０バイオチップは、アニオン交換のための四級アンモニウム機能性を有する。ＷＣＸ−２及びＣＭ−１０バイオチップは、カチオン交換のためのカルボキシレート機能性を有する。ＩＭＡＣ−３及びＩＭＡＣ−３０バイオチップは、キレート化によりＣｕ２＋及びＮｉ２＋などの遷移金属イオンを吸着するニトリロ酢酸機能性を有する。これらの固定化金属イオンは、配位結合によりペプチド及びタンパク質の吸着を可能にする。ＰＳ−１０バイオチップは、共有結合のたにタンパク質上の基と反応できるカルボイミジゾール官能基を有する。ＰＳ−２０バイオチップは、タンパク質との共有結合のためにエポキシド官能基を有する。ＰＳ系のバイオチップは、サンプルからの検体を特異的に捕捉するために機能するチップ表面に、抗体、受容体、レクチン、ヘパリン、タンパク質Ａ、ビオチン／ストレプトアビジンなどの生体特異的吸着剤を結合させる上で有用である。ＰＧ−２０バイオチップは、タンパク質Ｇが結合するＰＳ−２０チップである。ＬＳＡＸ−３０（アニオン交換）、ＬＷＣＸ−３０（カチオン交換）及びＩＭＡＣ−４０（金属キレート）バイオチップは、それらの表面に機能化ラテックスビーズを有する。
【００３６】
該表面は、９６ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートのウェルであってもよい。典型的に、このようなプレートの各ウェルは、各ウェルが異なる抗体の２つ以上の別個のスポットを含み得るように、異なる抗体などの異なる捕捉試薬を含むことになる。
【００３７】
該捕捉表面は、捕捉試薬によってコーティングされた複数のビーズを充填したカラムであり得る。各々が単一のマーカータンパク質を捕捉できる複数のカラムを使用できる。或いは、すべてのマーカータンパク質が同じカラムで捕捉されるように、単一のカラムが、種々のマーカータンパク質に対する特異的結合剤によってコーティングされたビーズを含有し得る。
【００３８】
対象のサンプルを典型的に、該表面に対するサンプル中のマーカータンパク質の結合に好適な条件下で、該表面に接触させる。サンプル中に存在する該タンパク質は任意に分画化でき、検出されるマーカーを含む該画分（１つ又は複数）を採集して、該表面に接触させることができる。非結合タンパク質及び他の物質を溶出する一方で該表面への対象となっているマーカーの結合を保持するようにデザインされた適切な溶媒又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液を用いて、非結合物質を洗浄除去する。該対象のサンプルは典型的に、血液、血漿又は血清サンプルである。
【００３９】
捕捉されたマーカータンパク質は、任意の好適な方法によって検出できる。一実施形態において、結合マーカーは、免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又は蛍光ベースの免疫アッセイによって検出できる。典型的な免疫アッセイにおいて、結合マーカーは、該マーカーに結合することが予想される抗体又は抗体断片を用いて検出できる。捕捉試薬が抗体である場合、検出する抗体は典型的に、その捕捉試薬とは異なる抗体である。典型的に、該抗体は、捕捉試薬に結合する部位とは異なる部位でマーカーに結合する。該抗体は、マーカーと支持体に固定化された捕捉試薬との間に形成された複合体に特異的であり得る。
【００４０】
一般に該抗体は、直接的又は間接的に検出可能な標識によって標識化される。直接的に検出可能な標識としては、フルオレセインなどの蛍光標識、テキサスレッド、ローダミン又はオレゴングリーンを挙げることができる。固定化された捕捉試薬／マーカー複合体に対する蛍光標識抗体の結合は顕微鏡によって検出できる。例えば、蛍光顕微鏡、二重焦点顕微鏡又は共焦点顕微鏡を用いる。
【００４１】
該抗体は、間接的に検出できる標識に結合させることが好ましい。間接的に検出できる標識は、自動読取り機を用いて検出できる、沈降非蛍光基質に作用する酵素を含み得る。自動読取り機は典型的に、ビデオカメラ及び画像分析ソフトウェアに基づく。該自動読取り機は、検出された各マーカーの量の計量を提供することができる。好ましい酵素としては、アルカリホスファターゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼが挙げられる。自動読取り機は当業界によく知られており、例えば、Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｔｒｉｔｏｒｕｓ分析装置（Ｇｒｉｆｏｌｓ、ケンブリッジ、英国）が挙げられる。
【００４２】
検出抗体からのシグナルを増強するために、他の間接的方法が使用できる。例えば、検出抗体はビオチン化でき、アルカリホスファターゼ若しくはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素に結合したストレプトアビジン又はＦＩＴＣ、又はテキサスレッドなどの蛍光プローブに結合したストレプトアビジンを用いて検出が可能になる。
【００４３】
すべての検出ステップにおいて、第２の、及びその後の薬剤の非特異的結合を最少化する薬剤を含めることが望ましい。例えば、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を用いて非特異的結合をブロックすることができる。
【００４４】
一実施形態において、捕捉されたタンパク質は、該表面、例えばチップ又はビーズからのタンパク質の溶出後、質量分析、例えば、ＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩなどの気相イオン分光分析によって検出できる。このような検出方法によって、種々のタンパク質、及び同一タンパク質の種々の形態を、標識化を必要とすることなく識別することが可能になる。
【００４５】
気相イオン分光分析は、気相イオンを検出するために気相イオン分光器を必要とする。気相イオン分光器は、気相イオンを供給するイオン源を含み、質量分光器、イオン移動度分光器及び総イオン流測定装置を含む。質量分光器は、気相イオンの質量対電荷比に翻訳できるパラメーターを測定する気相イオン分光器である。質量分光器は典型的に、イオン源及び質量分析装置を含む。質量分光器の例は、飛行時間（ＴｏＦ）、磁気セクター、四極子フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電セクター分析装置及びこれらのハイブリッドである。レーザー脱離質量分光器は、検体を脱着し、蒸発させ、イオン化するための手段としてレーザーを用いる質量分光器である。タンデム型質量分光器は、イオン混合物中のイオンなどのイオンのｍ／ｚベースの識別又は測定の２つの連続的段階を実施できる質量分光器である。
【００４６】
放射性核種のベータ減衰により生成した高エネルギー粒子又は二次イオンを生成する一次イオンなどの好適なイオン化エネルギー源を用いて、捕捉表面から捕捉マーカーを脱着又はイオン化できる。固相検体のイオン化エネルギーの好ましい形態はレーザーである。
【００４７】
本発明に用いられる好ましい質量分光法は、ＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離及びイオン化）であり、これは、タンパク質チップ、又は気相イオン分光器のプローブ界面に係合するＳＥＬＤＩプローブの表面にマーカータンパク質が捕捉される脱離／イオン化気相イオン分光分析の方法である。マーカータンパク質を捕捉するためにタンパク質チップアレイを用いるこの実施形態において、結合マーカーを検出するために、タンパク質チップ読取り機を使用できる。結合タンパク質の分子量を測定するために、エネルギー吸収分子（ＥＡＭ）溶液の添加及びタンパク質チップ読取り機内へのタンパク質チップの挿入の前に、タンパク質チップに結合したタンパク質は典型的には乾燥させる。タンパク質チップ読取り機においてレーザーが活性化すると、サンプルは照射され、脱着／イオン化が進行して、タンパク質チップアレイから気体状イオンを遊離させる。イオンチャンバーを通る各タンパク質の速度に基づいて各タンパク質の質量対電荷比（ｍ／ｚ）測定するタンパク質チップ読取り機の飛行時間質量分光分析（ＴｏＦ ＭＳ）領域に、これらの気体状イオンが進入する。シグナル出力の質量正確度を増加させるために、タイムラグフォーカシングが使用できる。シグナル処理は、パーソナルコンピュータに結合している、デジタルコンバータへの高速アナログによって達成される。検出されたタンパク質は、一連のピークとして表示される。ピークの幅は、サンプル中に存在する各タンパク質の量の表示である。本発明の方法における使用に好適なＥＡＭｓとしては、桂皮酸誘導体、シナピン酸及びジヒドロキシ安息香酸が挙げられる。
【００４８】
発現データはまた、比濁分析によっても得ることができる。比濁分析は、マーカー量の測定値を正確に迅速に得るために用いられる実験室技法である。該データは、例えば、粒子増強免疫比濁分析又は比率比濁分析によって得ることができる。ＢＮＩＩ分析器（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ、ミルトンキーネス、英国）は、粒子増強免疫比濁分析の実施に好適である。比率比濁分析の実施には、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｍｍａｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｎｉｔｅｒ、ハイウィコンベ、英国）が使用できる。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｍｍａｇｅは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ＣＲＭ ４７０に対して検量できる。マーカー発現の測定は、用いられる分析器の製造元によって提供された指示に従って実施できる。
【００４９】
使用できる他の検出方法としては、共焦点顕微鏡法又は蛍光顕微鏡法などの光学的技術、ボルタメトリー（ｖｏｌｔａｍｅｔｒｙ）及びアンペロメトリー（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）などの電気化学的技術、原子力顕微鏡法及び多極共鳴分光法などの無線周波技術が挙げられる。
【００５０】
対象となっているマーカーの発現パターンを調べて、該マーカーの発現がＴＢを有する患者を示しているかどうかを判定する。任意の好適な分析方法が使用できる。典型的には、用いられる分析法は、対象から得られた発現データを、ＴＢに罹患していることが分かっている患者及び結核菌に感染していない対象から得られた発現データと比較することを含む。次いで、対象におけるマーカーの発現が、ＴＢであることが分かっている患者に見られる発現パターンにより類似しているか、それとも対照対象に見られる発現パターンにより類似しているかを判定することができる。分析方法は典型的に、対象がＴＢに罹患している可能性を測定する。
【００５１】
ＴＢに罹患している患者は典型的に、各患者由来のサンプルからの結核菌培養の結果として、ＴＢに罹患していると診断された。対照対象は、ＴＢ以外の呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの１種以上から選択できる。ＴＢに罹患しておらず、上記に挙げられていない他の疾患に罹患している患者もまた、対照対象として用いることができる。典型的には、試験対象のマーカーの発現パターンを比較する対照対象の発現データは、上記対象の少なくとも２種、例えば、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種又は少なくとも８種を含む。ＨＩＶ陽性の患者は、特に疾患に罹患しやすい。ＴＢ患者及び／又は対照対象は、ＨＩＶ陽性でもＨＩＶ陰性でもあり得る。
【００５２】
ＴＢサンプル及び対照サンプルは、１つ超、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、８つ以上、１０以上の地域からの患者及び／又は対象から採取できる。各々の地域は、異なる大陸、国、又はある国の内の地域であり得る。ＴＢ対象及び／又は対照対象からの種々のサンプルは、種々の時間での発現データを得るために処理できる。例えば、サンプルは、１カ月から２年、３カ月から１８カ月又は６カ月から１年などの任意の好適な期間にわたって得ることができ、及び／又は処理できる。
【００５３】
該発現データがＴＢを示しているか否かを判定する方法は典型的にコンピュータを用いて実施される。該コンピュータは、発現データを生成するために用いられる読取り機から物理的に分離されていてもよいし、該読取り機に、例えば、質量分析器に結合されていてもよい。
【００５４】
ＴＢに罹患している患者の発現データを、対照対象の発現データから識別するために、監視付き機械学習分類法が使用できる。ＴＢ患者からの発現データの訓練及び対照対象からの対照データの訓練を用いて、機械学習選別機をまず訓練する。
【００５５】
ＴＢ患者からの発現データを、ＴＢに罹患していない対象からの発現データから識別するために、機械学習選別機を訓練する方法は、図１のフローチャートに示されている。コンピュータシステム上で実施されるコンピュータプログラムによって実行されるステップは、図１における点線によって概略的に示されている。ＴＢ患者及び対照対象からの訓練データ（データＤ１）は、入力変数（典型的には、ｍ／ｚ値、ＥＬＩＳＡ値又は比濁値）になる。ステップＳ１において、コンピュータはこれらの入力変数をマップ化して、カーネルを用いてスペースを特徴づけ、ステップＳ２において、選別機はＴＢデータと対照データとの間を識別することを学習し、したがって、ＴＢデータと対照データとの間を識別するための、ＳＶＭなどの選別機訓練を生じさせる。
【００５６】
次いで、さらなるＴＢ患者及びさらなる対照対象からの発現データを用いて、訓練された選別機を試験することができる。機械学習選別機の一般化を試験する方法は、図２のフローチャートに示されている。コンピュータ実行ステップは、図２における点線によって概略的に示されている。表１に示されるように、各セットに、ＴＢ患者と対照の同様な数、並びに同様な年齢と性別の表示を有する独立した訓練セットと試験セットが使用できる。ＴＢ患者及び／又は対照対象からの試験データ（データＤ２）は、入力変数（典型的には、ｍ／ｚ値、ＥＬＩＳＡ値又は比濁値）になる。ステップＳ３において、コンピュータはこれらの入力変数をマップ化して、カーネルを用いてスペースを特徴づけ、ステップ４では、訓練データを用いて生成させた選別機を用いて入力変数のクラスを、ＴＢデータ又は非ＴＢデータであるとして割り当てる。次いで、試験データが正しく分類されたか誤って分類されたかを判定することができる。
【００５７】
ＴＢに罹患しているとして、又は罹患していないとして診断することが望まれる対象からの発現データが、ＴＢに罹患している、又はＴＢに罹患していない患者を示しているかどうかを判定するために、訓練された機械学習選別機を使用することができる。このような診断方法で用いられる訓練された機械学習選別機は、上記のとおり試験したものであり得るが、この試験ステップは必須ではない。図３は、本発明によるコンピュータで実行する診断方法を示すフローチャートである。コンピュータ実行ステップは、図３における点線によって概略的に示されている。図３において、Ｄ３と標識された試験対象（即ち、新たな未知対象）からのデータは入力変数になる。ステップＳ５において、コンピュータはこれらの入力変数（典型的には、ｍ／ｚ値、ＥＬＩＳＡ値又は比濁値）をマップ化して、カーネルを用いてスペースを特徴づけ、ステップＳ６では、先に得た選別機を用いてサンプルを、ＴＢサンプル又は非ＴＢサンプルであるとして分類する。したがって試験対象は、ＴＢに罹患している、又は罹患していないものとして診断される。
【００５８】
好適な機械学習選別機としては、単層パーセプトロン（ＳＬＰ）、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）、デシジョンツリー及びサポートベクターマシンが挙げられる。好ましくは、サポートベクターマシンにおける該選別機。より好ましくは、該選別機はＧａｕｓｓｉａｎカーネルサポートベクターマシンである。
【００５９】
監視付き学習演算法は、訓練データと呼ばれる例の１セットの入力／出力対に対して正しいラベルを帰属させることのできる決定機能を見出すことが課せられている。未知のサンプル（試験データ）に対して正しいラベルを予測する決定機能の能力は、それの一般化として知られている。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）などの現行の機械学習法は、この性質を最適化することを目指している。選別機の一般化は、性能を最適化するために選択しなければならない１セットのパラメーター（モデル）に依存している。この目的のために、パラメーター値の範囲が離散化され、交差検証によって試験されるグリッド探索法を採用できる。
【００６０】
データセットＤは、入力ベクトル、Ｘ（即ち、カテゴリーの典型）のサンプルとそれらの対応する出力ラベル、Ｙのサンプル、Ｄ＝［Ｘ，Ｙ］によって表される。サンプル入力ベクトルは、ｘによって表される。ｉ番目のサンプルの質量スペクトルは、ｎ次元（質量集団の数）ベクトルｘｉと、関連クラスラベルｙｉ（ＴＢでは＋１、対照では−１）として表され、式中、ｉ＝１，．．．，ｍであり、ｍはサンプルの数である。スペクトルベクトル要素は、ｘｉ，ｋによって表され、式中、ｉ＝１，．．．，ｍであり、ｋ＝１，．．．，ｎである。サンプルクラスラベルｙｉの選別機予測は、
【数５】
によって表される。
【００６１】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）はその入力を、高い、さらには無限の次元特徴スペースへマップ化する。次いで、ＳＶＭの出力は、特徴スペースにおいてマップ化された入力の線形閾値化関数であるが、これは、元の入力空間では非線形であり得る。マッピングは、使用者選択再生カーネル関数Ｋ（ｘ，ｘ’）によって達成され、式中、ｘ及びｘ’は入力ベクトルである。カーネル関数は、マーサー条件を満たさなければならない。カーネルのよく知られた例としては、ガウスの
【数６】
が挙げられ、式中、パラメーターσは幅を決定し；ポリノミナルＫ（ｘ，ｘ’）＝（ｘ・ｘ’）ｄであり、式中、ｄは次数を決定する。ｄ＝１の場合、線形カーネルと呼ばれ、入力データのアイデンティティーマップに対応する。訓練されたＳＶＭ選別機は、
【数７】
の形態を有し、訓練により、α及びｂの値が決定する。典型的には、αの多くはゼロである。非ゼロのものは「サポートベクター」と呼ばれ、変換特徴スペースにおける分離超平面を規定するために用いられる。ＳＶＭの訓練は、多層パーセプトロンとは異なり、局所最小に供されないコンベックス（二次）最適化問題である。ＳＶＭｌｉｇｈｔ（Ｊｏａｃｈｉｍｓ、１９９９年）及び、特に、データに雑音がある場合に実用可能なソフト限界ＳＶＭなどの、ＳＶＭを訓練するために入手できる多くのパッケージがある。また、この場合、該演算により、間違って分類された実施例の距離は、ソフト限界パラメーターと呼ばれるペナルティー値、Ｃを調節することで、限界まで最小化される。
【００６２】
Ｓｉｎｇｌｅ Ｌａｙｅｒ Ｐｅｒｃｅｐｔｒｏｎ（ＳＬＰ）（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ、１９６２年）は、入力層によって与えられる値の線形組合せを計算する１つの出力ニューロンを有する人工ニューラルネットである。識別関数は、
【数８】
によって与えられ、式中、重みｗは、総分類エラー
【数９】
を減少させるためにデザインされた反復学習演算によって得られる。
【００６３】
Ｍｕｌｔｉ−Ｌａｙｅｒ Ｐｅｒｃｅｐｔｒｏｎ（ＭＬＰ）（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ及びＲｕｍｅｌｈａｒｔ、１９８６年）は、隠れニューロンの中間層を有するＳＬＰの一般化である。それは、ニューロンに、活性化レベルでのＳ字形関数
【数１０】
によりそれらの入力を処理させることによって、非線形に分離可能なクラスの問題に取り組む。このネットワークにおいて、重みは、
【数１１】
によって与えられるエラーを最小化するための勾配下降則である逆伝播演算により学習される。
【００６４】
デシジョンツリーは、二元ツリー構造に組織化された１セットの節点内にサンプルのデータセットＤ＝［Ｘ，Ｙ］の特徴を集合させることによって、それらの分類を学習する。ツリー構造を見出すために、分割基準：所与の質量ピークｘｉ，ｋに関して、試験ｘｉ，ｋ＜Ｔ（式中Ｔは、データセットＤの二元分割を生じる任意の試験）を用い、サンプルの特徴が、それらの識別力に従って試験される。Ｃ４．５（Ｑｕｉｎｌａｎら、１９９３年）選別機において、試験閾値は、情報−獲得分割基準
【数１２】
によって評価され、式中、Ｉｎｆｏ（Ｄ）は、サンプルが帰属するクラスのエントロピー計量であり、ｚは、試験Ｔの結果の数である。反復演算により、ツリーの根から葉までの情報獲得を増加させて節点が配置される。選別機のよりコンパクトな提示を得るために、最終のツリーを刈り込んでもよい。試験セットサンプルは、分類出力により根から葉までの通路づたいのツリーの節点における質量ピーク値に対してその質量ピーク値を試験することによって分類することができる。Ｃ５．０演算は、無関連の特徴を選別し、可変性の誤分類コストを組み入れるＣ４．５の拡張型である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｌｅｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／）。Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｒｅｅ（ＡＤＴｒｅｅ）（Ｆｒｅｕｎｄ及びＭａｓｏｎ、１９９９年）は、分類通路にわたって合計される予測値に関する追加節点を有するツリーであり、最終出力はこの合計のサインである。
【００６５】
ｋ倍交差妥当化、又は試験によるｋ倍交差妥当化などの任意の好適な交差妥当化方式を使用できる。ｋ倍交差妥当化では、訓練セットを、等しく分散された陽性事例及び陰性事例のｋ群にランダムに分割する。選別機は、それらの群のｋ−１で訓練され、その一般化性能は残りの群で妥当化される。この処理をｋ回反復し、各々の回で異なる妥当化サブセットが提供されるが、その平均が全体的な一般化を表す。第２の方式、試験によるｋ倍交差妥当化では、データはまず、訓練セットと試験セットにランダムに分割される。ｋ倍交差妥当化を訓練セットで行い、一般化は未知の試験セットで得られる。
【００６６】
選別機の一般化性能は、試験セットにおいて、正しく分類された（真の陽性、ＴＰ及び真の陰性、ＴＮ）並びに間違って分類された（偽陽性、ＦＰ及び偽陰性、ＦＮ）事例の数を考慮することによって評価できる。感受性（ｓｅ）は、真の陽性の条件付き確率、ｓｅ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として、特異性（ｓｐ）は、真の陰性の条件付き確率、ｓｐ＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として、正確さ（ａｃ）は、正しい分類の比率、ａｃ＝（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＦＰ＋ＴＮ＋ＦＮ）として定義できる。選別機の真の陽性比（ｓｅ）及び偽陽性比（１−ｓｐ）によって表された選別機の性能は、レシーバーオペレーター曲線（ＲＯＣ）スペースにプロットできる。
【００６７】
選別機の一般化能力のロバスト予測は、試験付き１０倍交差妥当化の実施によって提供できる。例えば、訓練：試験が８０：２０の１００セットを、データセット全体において置換することなく、ランダムなサンプリングによって作出することができる。８０：２０の訓練：試験セットの各々に１０倍交差妥当化を訓練セットで実施し、最良の性能を有するパラメーターを選択する。１０のサブセットすべてにわたって最良のパラメーターでＳＶＭを再訓練でき、最終的な性能を試験セットにおいて評価する。標準偏差を有する平均曲線を示すために、各ＲＯＣ曲線を補整し、サンプリングし、平均化できる。
【００６８】
本発明はさらに、以下のステップを本質的に含む、コンピュータ実行のＴＢ診断法を提供する：
（ａ）対象における２種以上のマーカーの発現データを入力するステップ；及び
（ｂ）訓練されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）によってプログラムされたコンピュータシステムを用いて、前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定し；
それによって、前記患者がＴＢに罹患しているか否かを診断するステップ。
【００６９】
該発現データは、ＴＢ患者と対照対象とで差異的に発現する上記のマーカーなどの任意の２種以上のマーカーに関するものであり得る。一実施形態において、該発現データは、対象のサンプル、典型的には、ＳＥＬＤＩ分析により得られた血液サンプル、血漿サンプル又は血清サンプルからのプロテオミックなプロフィルである。
【００７０】
サポートベクターマシンは上記のとおり訓練され、好ましくは、Ｇａｕｓｓｉａｎカーネルサポートベクターマシンである。訓練されたサポートベクターマシンによりプログラムされたコンピュータシステムによって、対象からの発現データは、ＴＢに罹患している対象を示しているものとして、又はＴＢに罹患していない対象を示しているものとして分類される。したがって、該コンピュータシステムからの結果によって、ＴＢに罹患している、又はＴＢに罹患していないものとして、対象の診断が可能になる。
【００７１】
本発明の方法によるＴＢの診断に基づいて、さらなる処置が教唆され得る。本発明による診断方法はさらに、ＴＢに罹患していると診断された患者にＴＢを治療するための薬剤を投与することを含むことができる。ＴＢを治療するための薬剤は、治療的有効量で対象に投与された際、該対象の症状を軽減するか、或いは、該対象の苦痛を減少させる物質又は組成物である。該物質又は組成物は、例えば、結核菌の複製を妨げることによって、結核菌を殺すか、又は無能力化する薬剤であり得る。好適な薬剤としては、イソニアジド、リファンピン、ピラジナミド及びエタンブトールが挙げられる。正確な治療法は、個体の状態、例えば、個体が妊娠、ＨＩＶ血清陽性、糖尿病であるかどうかに依存し、医師によって容易に決定され得る。
【００７２】
本発明はさらに、以下のステップを本質的に含む、ＴＢを診断するためのサポートベクターマシン（ＳＶＭ）選別機を訓練する方法を提供する：
（ａ）（ｉ）ＴＢ患者の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ；及び
（ｉｉ）対照対象の第１のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する訓練データ
を含む訓練データを提供するステップ；
（ｂ）ＴＢ患者の訓練データを、対照対象の訓練データから識別するためにＳＶＭを使用し；
そのことにより、ＴＢを診断するためにＳＶＭを訓練するステップ。
該方法は任意に、以下を本質的にさらに含む：
（ｃ）（ｉ）ＴＢ患者の第２のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する試験データ；及び
（ｉｉ）対照対象の第２のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する試験データ
を含む試験データを提供すること；
（ｄ）ＴＢ患者の試験データを、対照対象の試験データから正しく識別するためにＳＶＭの能力を判定すること。
【００７３】
訓練データ及び試験データは、上記のものなど、任意の好適な方法によって得ることができる。
【００７４】
試験データは典型的に、ＳＶＭ選別機の感受性、特異性及び／又は正確さを判定するために用いられる。
【００７５】
本発明はさらに、本発明による診断方法を実施するように構成された装置を提供し、該装置は本質的に以下を含む：
（ｉ）対象のサンプルにおける２種以上のマーカーの発現データを受け入れるための手段；
（ｉｉ）前記データがＴＢを示しているかどうかを判定するためのモジュールであって、ＴＢ患者からのデータと対照対象からのデータとを識別することのできる訓練された機械学習選別機を含むモジュール；及び
（ｉｉｉ）前記判定の結果を表示する手段。
【００７６】
発現データを受け入れるための手段は、データを手動で入れることのできるキーボードであり得る。或いは、タンパク質チップ読取り機又は自動画像分析装置などの、発現データを解析しているコンピュータから、発現データを直接受け入れることができる。該発現データは、ワイヤ接続又はワイヤレス接続によって受け入れることができる。さらなる代替として、発現データは、該装置によって読取り可能な形態で保存媒体に記録することができる。該保存媒体は、該装置内に含まれる好適な読取り機内に配置できる。
【００７７】
ＴＢに関して試験中の対象からの訓練データ、試験データ及び／又は発現データは、生データであってもよいし、該コンピュータシステム内に入力される前に処理されてもよい。該コンピュータシステムは、生データをさらなる解析に好適な形態へと変換する手段を含み得る。
【００７８】
該データがＴＢを示しているかどうかを判定するためのモジュールは、機械学習選別機がＴＢ患者に特徴的な発現データを対照対象に特徴的な発現データから識別できるように本明細書に記載された方法によって訓練された、機械学習選別機を含む。
【００７９】
前記判定の結果を表示する手段は、ビジュアルスクリーン、オーディオ出力又はプリントアウトであり得る。これらの結果は典型的に、発現データの分類を示し、任意に、分類が正しいという確実度を示し得る。
【００８０】
本発明の装置は、パーソナルコンピュータであり得る。該パーソナルコンピュータは、ラップトップであり得る。或いは、該装置は手持ち型コンピュータ、例えば、野外で容易に携帯可能であるという利点を有する、特別にデザインされた手持ち型コンピュータであり得る。
【００８１】
本発明はさらに、コンピュータシステムによって実行可能なコンピュータプログラムであって、該コンピュータシステムによる実行の際、該コンピュータシステムに本発明による診断方法を実施させることができるコンピュータプログラムを提供する。該コンピュータプログラムは一般に、機械学習選別機、好ましくは、本明細書に記載されたとおり訓練されたサポートベクターマシンを含む。
【００８２】
本発明はさらに、本発明のコンピュータシステムコンピュータプログラムによって読取り可能な形態で保存する保存手段を提供する。ＣＤ−ＲＯＭ又はフロッピー（登録商標）デスクなどの任意の好適な保存媒体が使用できる。
【００８３】
さらなる一態様において、本発明は、ＴＢの診断に使用するためのキットを提供する。該キットは典型的に、本明細書に定義した２種以上のマーカーを検出するための手段を含む。該検出手段は典型的に、タンパク質チップ、又は抗体若しくは抗体断片などの特異的結合試薬のアレイなどの、本明細書に記載された捕捉表面を含む。該キットは、ラベル又は別個の挿入物の形態における操作に関する使用説明書を含み得る。例えば、該使用説明書は、サンプル採取の仕方、捕捉表面によるサンプルのインキュベーションの仕方及び／又はプローブの洗浄の仕方を、消費者に知らせることができる。該キットは、マーカーの発現データを本発明の装置内に入れる説明書を含み得る。該キットは本発明の保存媒体を含み得る。
【００８４】
該キットは、３種、４種、５種又は６種以上など、２種以上のマーカー、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、Ａｐｏ−Ａ１、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２の任意の組合せを検出するために適合化されることが好ましい。好ましい一実施形態において、該キットは、３種又は４種など、２種以上のマーカー、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ及びＳＡＡ、例えば、トランスシレチン、ネオプテリン及びＣＲＰの任意の組合せを検出するために適合化される。該キットは、これら４種の指定されたマーカー以外の追加マーカーを検出する能力があり得る。
【００８５】
該キットは、下表に挙げられた陽性マーカー及び／又は陰性マーカーを検出するために適合化される。
【００８６】
【表１】
【００８７】
本実施形態において、検出手段は好ましくはタンパク質チップである。
【００８８】
該キットは、容器内の１種以上のマーカーの１種以上のサンプルをさらに含み得る。該キットに提供されたマーカーは、対照として、又は検量用に使用できる。
【００８９】
本発明はまた、ＴＢ治療のための候補薬剤を同定するための方法を提供する。トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬのうちの１種以上の活性又は発現の改変における試験薬剤の活性に関して評価することによって、候補薬剤を同定できる。トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬの各々の生物学的活性は、当業界に知られている。したがって、当業者は、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬのいずれか１種の活性に及ぼす試験薬剤の効果を評価するために、容易にアッセイを実施できるであろう。
【００９０】
本発明の一実施形態において、結核菌に感染した細胞中の１種以上のＴＢマーカーの発現に及ぼす試験薬剤の効果を判定することによって、候補治療薬が同定できる。１種以上のＴＢマーカーは一般に、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される。１種以上のマーカーの発現における増加又は減少により、該試験薬剤がＴＢの治療に有用であることが示される。典型的に、該マーカーがＴＢの陽性マーカーである場合、ＴＢの治療に有用な試験薬剤は、該試験薬剤の不在下での感染細胞における該マーカーの発現レベルに比較して、該マーカーの発現レベルを減少させる。典型的に、該マーカーがＴＢの陰性マーカーである場合、ＴＢの治療に有用な試験薬剤は、該試験薬剤の不在下での感染細胞における該マーカーの発現レベルに比較して、該マーカーの発現レベルを増加させる。
【００９１】
該感染細胞は、インビボ又はエクスビボであり得る。該細胞がインビボである場合、それらは典型的に、実験動物、典型的には、マウス又はラットなどの齧歯類に存在する。該感染細胞は、結核菌が感染し得る任意の細胞であり得る。一実施形態において、該細胞は、呼吸器系の細胞であるか、又はそれ由来の細胞系である。
【００９２】
また、本発明の方法などによって同定される候補治療薬も本発明によって提供される。好適な候補治療薬としては、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬのうちの１種に特異的な抗体が挙げられる。
【００９３】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
患者並びに対照対象の選択
ＴＢ診断の新規アプローチを開発するために、本発明者らは、少なくとも４つの民族背景からの患者を代表する複数地域（英国、アンゴラ、ガンビア及びウガンダ）からの患者（ｎ＝１７９）及び対照（ｎ＝１７０）の血清を採集した（表１）。本発明者らは、肺疾患に典型的な症状（Ｒａｔｈｍａｎら、２００３年）を呈するＴＢ患者に限定した。これが、すべての地域における成人ＴＢの最もよく見られる呈示だからである。診断は結核菌の培養によって確認された。スミア陽性及びスミア陰性双方の患者並びに対照対象（ＨＩＶ状態を含む）を含む患者の詳細は、表１及び表２ａに与えられている。予想どおり、咳、発熱及び体重減少を呈した大方の患者は、空洞性肺疾患に罹患していた。
【００９５】
対照対象には、健康な志願者、並びにＴＢに重なり得る臨床的特徴を有する状態にある患者を採用した（表２ｂ）。本発明者らの対照対象は、標準的な診断基準によって確認された異種起源の炎症原因を有する。例えば、しばしば、肺ＴＢの差異的診断に含まれるサルコイドーシスに罹患している患者及び非結核性の破壊的な肺の病状にある患者を表している他の重篤な呼吸器感染を含めた。ＴＢに擬態し得る全身性炎症過程を考慮するため、他の全身性感染に罹患している患者、並びに炎症性腸疾患及び自己免疫疾患に罹患している患者を採用した。
【００９６】
（実施例２）
プロテオミックプロファイリング並びに監視付き機械学習分類
本発明者らはまず、これらの対象からの３４９の血清サンプルを、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ）による弱カチオン交換（ＣＭ１０）タンパク質チップアレイ上でプロファイルし（Ｉｓｓａｑら、２００２年；ｖｏｎ Ｅｇｇｅｌｉｎｇら、２００１年）、２，０００〜１００，０００の範囲におけるｍ／ｚスペクトルからの２１９のピーク集団を同定した。次いで、現状技術の監視付き機械学習分類法を用い（表３及び図４）、訓練−試験−セットアプローチを用いて、ＴＢに罹患している患者のプロテオミックスペクトルを、対照から識別した（表１）。試験セットにおけるデータを正しく識別する選別機の能力は、選別機の一般化性能として知られている（Ｖａｐｎｉｋ、１９９８年；Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ及びＳｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ、２０００年）。種々の選別機の一般化性能を、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）スペースにおいて異なる試験セットに対するそれらの性能をプロットすることによって比較した。
【００９７】
当該試験において、ＳＬＰは最適識別機能を提供することなく、独立した試験セットにおいて、８６．５％の正確さを与えた（表３）。本発明者らのデータでは、ＭＬＰはＳＬＰと同様な一般化性能を示し、分類の正確さは８６．５％であった（表３）。ＴＢのデータセット対対照のデータセット（表２）において、ＡＤＴｒｅｅ及びＣ４．５選別機は、それぞれ、９２．３％と９１．０％の正確さに達した（表３）が、このような一般化レベルに達するには、ＡｄａＢｏｏｓｔ増強に依存した（Ｗｉｔｔｅｎ及びＦｒａｎｋ、２０００年）（表３）。本発明者らは、ＡＤＴｒｅｅ及びＣ４．５選別機に関して、ＡｄａＢｏｏｓｔを１００回反復して用い、Ｃ５．０選別機の非市販型に関しては、最高１０回反復して増強した。
【００９８】
ガウスカーネルサポートベクターマシン（Ｂｏｓｅｒら、１９９２年；Ｖａｐｎｉｋ、１９９８年；Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ及びＳｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ、２０００年）（ＳＶＭ、表３）は、９３．５％の感受性及び９４．９％の特異性（全体的な正確さは９４．２％）を有する、ＴＢ群と対照群との間の最良の識別装置である。試験セット中、５つのＴＢサンプル及び４つの対照サンプルが間違って分類された。このＳＶＭ選別機は、ＲＯＣスペースの凸閉包を規定し、最良の正確さを達成する。
【００９９】
スペクトルのセット全体（訓練及び試験の双方）に対して、１０倍交差妥当化の実施によるＳＶＭの一般化性能のさらなる試験を適用し、正確さに関して最適化した場合、９３．１±３．８％の正確さ、９４．４±４．５％の感受性及び９１．８±８．８％の特異性を得た。本発明者らはまた、訓練事例：試験事例の比率を、９０：１０から５０：５０に変えることによって、ＳＶＭの一般化性能を評価した。８０：２０のセットでは、９０％超の正確さ、感受性及び特異性の値が得られた。ＳＶＭのロバストネスをさらに、０．９６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有するＲＯＣ曲線に示されるように、１００のランダムに作出した８０：２０のセットにおける平均性能によって確認した。図５は、１０倍トレーン交差妥当化試験を用いた平均ＲＯＣを示している。図５ａでは、カーネルパラメーターは感受性のみについて選択され、図５ｂでは、カーネルパラメーターは、特異性基準について選択されている。
【０１００】
対照群を意図的に異種起源としたが、当該選別機は、ＴＢに罹患している患者（スミア陰性とスミア陽性の双方）と感染性及び非感染性の炎症状態の種類に罹患している患者との間を正確に識別する。これらの結果は、ＴＢがプロテオミックな識別特性をベースにした診断アプローチで調べることができることを示している。サンプルの採集、取り扱い又はスペクトル生成に関連したアーチファクトにより、偽の分類を生じさせる可能性はある。しかし、６カ月間にわたってＴＢ患者と対照対象のサンプル処理を分散させ、４つの異なる地域からのサンプルを使用し、ＨＩＶ血清状態を変化させたことから、患者と対照対象との間の体系的な偏りの可能性はきわめて低くされている。質量スペクトルの再現性の目安として、６カ月間にわたる種々の時点で操作された２８の汎発対照スペクトルが、１０倍交差妥当化で得られたＳＶＭ選別機により対照対象として正しく分類された。呼吸器の症状を呈する患者におけるＴＢの罹患率がおよそ１０％である臨床集団において、本発明者らの最良の選別機に関する陽性及び陰性の予測値は、それぞれ、６７％と９９％となるであろう。この診断正確性は、他の入手可能な診断オプションの診断正確性に優っている。
【０１０１】
（実施例３）
マーカーの選択
しかしながら、ＳＥＬＤＩ法が報知的な識別特性を構成するタンパク質の同一性について先立つ仮定をしないＴＢに対する診断試験を提供できる一方、コスト及び複雑さによって、その広範な一般的使用が妨げられることがあり得る。したがって、本発明者らは、独立して報知的なピークを検出するために、相関フィルター法を適用することによって、さらなる評価のための報知的ピーク集団のサブセットを選択した（Ｇｕｙｏｎ及びＥｌｉｓｅｅｆｆ、２００３年）。最高陽性の１０の質量集団、最高陰性の１０の質量集団、ピヤソン相関係数を評価した。これらのマーカーのｍ／ｚ値は、下表に示されている。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
選択された２０の質量集団の識別力を試験するために、本発明者らはまず、各質量を１つおきに対にして（４００対）、ＳＶＭ選別機にＴＢ患者を診断させる訓練をした。結果は表４に示されている。正確さによって一般化性能を評価し、選択された質量集団の２０対（５％）、並びに、これらの負の相関及び正の相関の質量集団組合せのうちの１７が８０％超の正確さを与えることを示した。感受性及び特異性が、それぞれ、９５％と８５％超に達した質量集団の対はなく、良好な一般化は、２つ超の質量ピークの組合せに依存することが確認された。第２に、丁度２０の相関選択された質量集団によって訓練されたＳＶＭは、独立試験セットにおいて、８９．７％の正確さを達成し、これらの集団が最も関連性のある識別情報を含むことを示した。残りのピーク集団（ｎ＝１９９）は、許容できる診断正確性（８５．９％）ではあったが、下位を保っている。本発明者らは、種々の質量集団セットを用いて、ＲＯＣスペースにおけるＳＶＭｓの一般化性能をまとめた。ＲＯＣ凸閉包は、２つの選別機によって規定される。最高の特異性は、正に相関しているすべてのピークマイナス１０（即ち、合計２０９）で得られ、負の相関ピークにおける情報値が確認された。他の最適選別機は、質量集団の１０の正の相関サブセット及び１０の負の相関サブセットのみを使用した後に得られた。
【０１０４】
（実施例４）
マーカーの同定
トリプシン消化後、高分解能質量分光器を用いて、本発明者らは、１１．５ｋＤａの「陽性」マーカー及び１３．７ｋＤａの「陰性」マーカーを、それぞれ、血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）のｄｅｓ−アルギニン変異体及びトランスシレチンとして同定した。興味深いことに、ピヤソン相関分析によって選択され、プロテオミックな識別特性のＳＶＭ分類によって確認されたこれらのペプチドは、ＴＢにおける病態生理学的過程にすでに独立して関連していた。ＳＡＡは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の循環（Ｋｉｅｒｎａｎら、２００３年）及び脂質輸送の調整並びに免疫応答に関連した急性相タンパク質である。それは、反応性アミロイドーシスにおける前駆体タンパク質であり、一部の個体において慢性ＴＢを複雑化させ、また、結核などのいくつかの炎症状態における疾患活性のマーカーである（Ｓａｌａｚａｒら、２００１年）。トランスシレチンは、血清中、５５ｋＤａのホモテトラマーであり、チロキシン及びトリ−ヨードチロニン、並びにレチノール結合タンパク質との結合を介したビタミンＡ（レチノール又はトランスレチノイン酸）の主要なトランスポーターである（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、１９７１年）。レチノイン酸は、単球の分化を刺激し、ヒトマクロファージにおける結核菌の増殖を阻害する（Ｃｒｏｗｌｅら、１９８９年）。トランスシレチンの減少及びＣ反応性タンパク質濃度の上昇とビタミンＡの低濃度が相関していることが、ＴＢに罹患している患者において報告されている（Ｈａｎｅｋｏｍら、１９９７年；Ｋｏｙａｎａｇｉら、２００４年）。
【０１０５】
（実施例５）
免疫アッセイ試験並びに監視付き機械学習分類
プロテオミックな識別特性から慣例的な試験様式へ翻訳するために、すべての対象において免疫アッセイにより血清ＳＡＡ及びトランスシレチンを定量化した。双方のペプチドとも炎症のマーカーであるため、ＴＢにおける疾患活性をモニターするために以前使用された（Ｈｏｓｐら、１９９７年）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びネオプテリンもまた測定した。次いで、これら４種のマーカーに関して多名のガウスカーナルＳＶＭｓをパラメーター化した。ガウスＳＶＭｓを用いて、４つの最良の選別機を得た。トランスシレチン、ＣＲＰ及びネオプテリン値によって訓練されたＳＶＭ選別機は、ＴＢ患者を対照患者から、８４％の正確さで（８２％の感受性、８６％の特異性）識別した。他の最適化された選別機はトランスシレチンを含み、トランスシレチン及びネオプテリンを用いたＳＡＡ及びＣＲＰによるものであった。元の識別特性に追加のマーカーを含めることにより、免疫アッセイベースの分類の正確さが改善される可能性が高い。
【０１０６】
トランスシレチンの切断形態は、卵巣癌に対するプロテオミックなフィンガープリント試験における陰性マーカーであり（Ｚｈａｎｇら、２００４年）ＳＡＡは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）における陽性マーカーであり（Ｒｅｎら、２００４年）、鼻咽頭癌における再発を示す（Ｃｈｏら、２００４年）。単一のタンパク質マーカーは、ＴＢの診断において正確さが不十分であり得るが、ＳＶＭなどの機械学習方法と合せたプロテオーム誘導分析は、現行の標準的方法より優れた正確さを達成し得る。これらの所見により、個々の診断特異性の低いマーカーが特定の組合せで使用されると診断成果が増強され得ることが示唆される。いくつかの場合、一般的な血漿タンパク質の切断化又は断片化誘導体が、いくつかの疾患のより特異的マーカーであり得、限定された疾患状態に特徴的なタンパク質分解酵素の誘導によって生じ得る（Ｔｏｌｓｏｎら、２００４年）。プロテオミックな識別特性から免疫アッセイに翻訳する際の高い診断正確性の保持、及び同定されたバイオマーカーの生物学的妥当性により、ＴＢ診断に対するＳＶＭ選別機の価値が確立され、血清学的試験のための強力な基礎が提供されている。パーソナルコンピュータに訓練されたＳＶＭ選別機を備えることにより、免疫アッセイ（又は、入手可能な場合は、ＳＥＬＤＩプロテオミック分析）を用いてＴＢの診断を補助する機会が提供される。次いで、これらの試験を、ＴＢの長期的試験及び喀痰陰性ＴＢ、肺外の事例及び小児科感染症などの他の診断困難な範囲に適用することができる。
【０１０７】
（実施例６）
材料及び方法
血清の採集及び保存。血清サンプル（１７９）は、遡及的に確認された培養陽性ＴＢの患者から採集した（表２）。ウガンダ及びガンビアで採集されたバンク血清は、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ＴＢ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｔｄｒ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｔｂ／ｓｐｅｃｉｍｅｎ．ｈｔｍ）から入手し、他のものは、英国、ロンドンのＳｔ．Ｇｅｏｒｇｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおける入院及び外来施設でＴＢを呈する患者から予測的に採集した。他の炎症状態の範囲の対照患者からの血清サンプル（１７０）は、英国のＳｔ．Ｇｅｏｒｇｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、アンゴラ及びガンビアのｔｈｅ Ａｎｇｏｔｒｉｐ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｅｎｔｒｅで採集した。各々の場合に、地域の研究倫理委員会の方針に従って、十分なインフォームドコンセントを得た。臨床情報は、連結され、匿名化されたデータベースにおいて保管された。５ｍｌの血液から、遠心分離により血清を分離し、サンプルを滅菌ガラス管中、室温で３０分間、凝血させた。アリコート（１００μｌ）を採集１時間以内に凍結させ（−８０℃）、質量分析前、２回のみの凍結−解凍サイクルに供した。
【０１０８】
質量分析のためのサンプル調製。サンプルを、以前記載されたとおり（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓら、２００４年）ＣＭ１０タンパク質チップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、フレモント、カリフォルニア州、米国）に適用し、５０％アセトニトリル、０．５％トリフルオロ酢酸中、シナピン酸の飽和溶液を、アレイ上の各スポットに２回適用し、各適用の間は風乾した。偏りを最小化するために、ＴＢ患者の血清と対照とは、同一のチップ上でアッセイした。
【０１０９】
表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ）。２００、２２０及び２４０のレーザー強度、高質量１００ｋＤａ、検出器感度８及び焦点質量１０ｋＤａで、ＰＢＳ−ＩＩ質量分析器（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、フリーモント、カリフォルニア州、米国）を用いて、飛行時間スペクトルを生じさせた。アレイ上の各スポットの位置２０から８０、デルタ４を、２０５、２２５又は２４５のレーザー強度で、２回のウォーミングショットで進行させ、１箇所当たり７ショットで分析した。各タンパク質チップアレイは、「汎用対照」サンプル（１個体からの１回の採集からアリコート化し、−８０℃で保存）を含んだ。双方のスペクトル群（ＴＢ及び対照）とも６カ月間にわたって種々の機会に扱われたサンプルを含んだ。
【０１１０】
ピークの同定。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎのオールインワンタンパク質及びペプチド検量体を用いて、スペクトルを毎週検量し、ベースライン減算後、２，０００〜１００，０００にわたるｍ／ｚ範囲において総イオン流に対して正規化した。各タンパク質に関して、２００、２２０又は２４０のレーザー強度で生じた単一のスペクトルを選択して、以前に記載されたとおり（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓら、２００４年）全患者の平均の０．４〜０．６倍以内に総イオン流の偏差を最小化した。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｉｚａｒｄ型３．１を用いて、分子質量の０．６％以内の各スペクトル（「ピーク集団」）における対応するピークを同定した。シグナル対ノイズ比を、最初のパスでは１０に設定し、第２のパスでは２に設定した。再現性を評価するために、２５回操作した（６アッセイ）単一サンプル由来のスペクトルに関するピークサイズの変動係数は、１５．６％（アッセイ内）及び２４．４％（アッセイ間）であった。これらのデータは、以下のｍ／ｚ値：５６４８、６２０３、６４４９、６６４７、８９０７、９２１３、９３１０、９３７０及び９４１９における９つの最高幅ピークに関する値を平均化することによって得られた。
【０１１１】
タンパク質の同定。５０μｌの結合緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ９．０中、１：９希釈した変性緩衝液）に希釈した３０μｌの変性緩衝液により、血清（２０μｌ）を氷上で（２０分）インキュベートし、その後さらに３０分、氷上でインキュベートした。最初はトリス（５０ｍＭ、ｐＨ９）、その後結合緩衝液中で予備平衡化したＱ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ スピンカラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、２０分）に適用した。１１．５ｋＤａ及び１３．７ｋＤａのバイオマーカー双方が、スピンカラムから溶出緩衝液（５０ｍＭのクエン酸Ｎａ、０．１％オクチルグルコピラノシド、ｐＨ３）中に溶出し、選択的濃縮化は、未分画血清に関する上記の条件下でＣＭ１０タンパク質チップアレイに適用した溶出物サンプルのＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ分析によって確認した。
【０１１２】
該バイオマーカーは、１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ、４〜１２％のＢｉｓ−トリス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により単離し、クーマシーブルーで染色し、ゲルから切り出した。該ゲル片を重炭酸アンモニウム（５０ｍＭ）とアセトニトリル（５０％）の混合液中、３回洗浄し、アセトニトリル（１００％）中、脱水し、乾燥した。
【０１１３】
アセトニトリル（１０％）及び重炭酸アンモニウム（２５ｍＭ）中、トリプシン（２０ｎｇ／μｌ）の添加により、タンパク質をゲル内消化（１５分、室温）に供した後、重炭酸アンモニウム（２５ｍＭ）中、４時間、最終インキュベーションに供した。
【０１１４】
マトリックスとして２０％α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳにより、該消化物のペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦｓ）を分析した。ゲル内トリプシン消化の結果を、ゲルから該タンパク質受動溶出後のトリプシン消化により実証した。
【０１１５】
ＭＡＳＣＯＴデータベースを識別するためにＰＭＦｓを用い、ある場合には血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）由来、他の場合にはトランスシレチン由来としてペプチドを同定した。トランスシレチンとして同定されたタンパク質に関する質量スペクトル（１３．７ｋＤａ）で見られた分子量は、このタンパク質の理論値（１３．７６ｋＤａ）に密接に相当した。しかし、ＳＡＡ１に関して見られたもの（１１．５２ｋＤａ）は、その理論値（１１．６８ｋＤａ）より１５６Ｄａ低く、このタンパク質がＳＡＡ１変異体であることを示唆していた。
【０１１６】
この変異体の性質を調べるために、トリプシン消化物をより詳細に分析し、ＳＡＡ１の完全アミノ酸配列から予測されたトリプシンペプチドに相当しないｍ／ｚ１５５１におけるペプチドを含むことを見出した。しかし、それは、Ｎ末端のアルギニンの欠失から生じたと考えられる２〜１５のペプチド（ＳＦＦＳＦＬＧＥＡＦＤＧＡＲ）には相当した。
【０１１７】
バイオマーカーの免疫定量化。検出に用いられた各マーカー及び抗体タイプに関する下限検出は、以下のとおりであった：粒子増強ヒツジ抗ＳＡＡでは０．７ｍｇ／ｌＳＡＡ、ヤギ抗ＣＲＰでは、１ｍｇ／ｌ、ヤギ抗トランスシレチンでは、０．０５ｇ／ｌトランスシレチン、及びウサギ抗ネオプテリンでは、１．５ｎｍｏｌ／ｌネオプテリン。ネオプテリンは、Ｔｒｉｔｕｒｕｓ分析装置（Ｇｒｉｆｏｌｓ ＵＫ社）において、キット（ＥＬＩｔｅｓｔ Ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ、Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ、アクチーンゲゼルシャフト、ドイツ国）を用い、競合的ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃ反応性タンパク質、トランスシレチンの測定（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｉｍｍａｇｅ８００分析装置、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＵＫ社）及び血清アミロイドＡの測定（Ｎ ｌａｔｅｘ ＳＡＡ、ＢＮＩＩ分析装置、Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、マールブルグ、ドイツ国）には、比率比濁分析を用いた。ＳＡＡアッセイに用いられた抗体は、総ＳＡＡを検出する。ＥＬＩＳＡｓからの値は、ＳＶＭ分類実験に使用する前に、０〜１の範囲に等級化し、可能なすべての組合せを特徴スペースとして用いた。
【０１１８】
監視付き機械学習。データセットＤは、入力ベクトル、Ｘ（即ち、カテゴリーの典型）のサンプルとそれらに対応する出力ラベル、Ｙ，Ｄ＝［Ｘ，Ｙ］のサンプルによって表される。サンプル入力ベクトルはｘによって表される。ｉ番目のサンプルの質量スペクトルは、ｎ次元（質量集団の数）のベクトルｘｉと関連クラスラベルのｙｉ（ＴＢでは＋１、対照では−１）として表され、式中、ｉ＝１，．．．，ｍ及びｍはサンプルの数である。スペクトルのベクトル要素は、ｘｉ，ｋによって表され、式中、ｉ＝１，．．．，ｍであり、ｋ＝１，．．．，ｎである。サンプルクラスラベルｙｉの選別機予測は、
【数１３】
として表される。
【０１１９】
監視付き学習演算法の課題は、訓練データと称される、実施例の入力／出力対のセットに関する正しいラベル割り当てのできる決定関数を見出すことである。未知のサンプル（試験データ）に関する正しいラベルを予測する決定関数の能力は、その一般化として知られている。現行のＳＶＭなどの機械学習法は、この性質の最適化を目指している。選別機の一般化は、性能を最適化するために選択しなければならないパラメーターセット（モデル）に依存している。この目的のために、本発明者らは、ある範囲のパラメーター値が打ち切られ、交差妥当化を用いて試験されるグリッド探索法を採用した。
【０１２０】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、その入力を高い、又はさらに無限の次元特徴スペースにマップ化する（Ｖａｐｎｉｋら、１９９８年；Ａｒｏｎｓｚａｊｎ、１９５０年）。次いで、ＳＶＭの出力は、特徴スペースにおいてマップ化された入力の線形閾値化関数であるが、これは、元の入力空間では非線形であり得る。マッピングは、使用者選択再生カーネル関数Ｋ（ｘ，ｘ’）によって達成され、式中、ｘ及びｘ’は入力ベクトルである。カーネル関数は、マーサー条件（Ｊｏａｃｈｉｍｓ、１９９９年）を満たさなければならない。カーネルのよく知られた例としては、ガウスの
【数１４】
が挙げられ、式中、パラメーターσは幅を決定し；ポリノミナルＫ（ｘ，ｘ’）＝（ｘ・ｘ’）ｄであり、式中、ｄは次数を決定する。ｄ＝１の場合、線形カーネルと呼ばれ、入力データのアイデンティティーマップに対応する。訓練されたＳＶＭ選別機は、
【数１５】
の形態を有し、訓練により、α及びｂの値が決定する。典型的には、αの多くはゼロである。非ゼロのものは「サポートベクター」と呼ばれ、変換特徴スペースにおける分離超平面を規定するために用いられる。ＳＶＭの訓練は、多層パーセプトロンとは異なり、局所最小に供されないコンベックス（二次）最適化問題である。ＳＶＭを訓練するために入手できる多くのパッケージがあり；ＳＶＭｌｉｇｈｔ（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ、１９６２年）が用いられ、特に、データに雑音がある場合に実用可能なソフト限界ＳＶＭｓが訓練される。この場合、該演算により、間違って分類された実施例の距離は、ソフト限界パラメーターと呼ばれるペナルティー値、Ｃを調節することで、限界まで最小化される。
【０１２１】
本発明者らは２つの交差妥当化方式を用いた。ｋ倍交差妥当化では、訓練セットを、等しく分散された陽性事例及び陰性事例のｋ群に、ランダムに分割する。選別機をｋ−１で訓練し、その一般化性能を、残りの群で妥当化する。この処理をｋ回反復し、各々の回で異なる検証サブセットが提供されるが、その平均が全体的な一般化を表す。第２の方式、試験によるｋ倍交差妥当化では、データはまず、訓練セットと試験セットにランダムに分割される。ｋ倍交差妥当化を訓練セットで行い、一般化は未知の試験セットで得られる。
【０１２２】
選別機の一般化性能は、試験セットにおいて、正しく分類された（真の陽性、ＴＰ及び真の陰性、ＴＮ）並びに間違って分類された（偽陽性、ＦＰ及び偽陰性、ＦＮ）事例の数を考慮することによって評価した。感受性（ｓｅ）は、真の陽性の条件付き確率、ｓｅ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として、特異性（ｓｐ）は、真の陰性の条件付き確率、ｓｐ＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として、正確さ（ａｃ）は、正しい分類の比率、ａｃ＝（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＦＰ＋ＴＮ＋ＦＮ）として定義した。選別機の真の陽性比（ｓｅ）及び偽陽性比（１−ｓｐ）によって表された選別機の性能は、レシーバーオペレーター曲線（ＲＯＣ）スペースにプロットできる。
【０１２３】
各セットに、ＴＢ患者と対照の同様な数、並びに同様な年齢と性別の表示を有する独立した訓練セットと試験セットを作出した（表１）。これらのセットを用いて、単層パーセプトロン（ＳＬＰ）（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ及びＲｕｍｅｌｌｈａｒｔ、１９８６年）、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）（Ｑｕｉｎｌａｎら、１９９３年）、ツリー選別機（Ｆｒｅｕｎｄ及びＭａｓｏｎ、１９９９年；Ｆｒｅｕｎｄ及びＳｃｈａｐｉｒｅ、１９９６年及びＷｉｔｔｅｎ及びＦｒａｎｋ、２０００年）及びサポートベクターマシンなどのいくつかの監視付き機械学習法の一般化性能を評価した（表３）。
【０１２４】
選別機の一般化能力のロバスト予測を提供するために、試験による１０倍交差妥当化を実施した。まず、訓練セット：試験セットが８０：２０である１００セットを、データセット全体において置換することなく、ランダムなサンプリングによって作出した。８０：２０の訓練セット：試験セットの各々に１０倍交差妥当化を実施し、最良の性能を有するパラメーターを選択する。１０のサブセットすべてにわたって最良のパラメーターでＳＶＭを再訓練し、最終的な性能を試験セットで評価する。これらの実験では、標準偏差を有する平均曲線を示すために、各ＲＯＣ曲線を補整し、サンプリングし、平均化する。
【０１２５】
質量ピーク集団の選択。ピークをそれらの識別力に関して等級付けするために、ピヤソン相関係数を用いた。ピヤソン相関係数は、
【数１６】
として定義され、式中、Ｘｋは、サンプル入力ベクトルｘのｋ番目の成分に相当するランダムな変数であり、Ｙは、出力ラベルのランダムな変数である。
Ｒ（ｋ）の予測は、
【数１７】
によって与えられ、式中、ｘｉ，ｋはサンプルｉの質量集団ｋのｍ／ｚ値に相当し、ｙｉはサンプルｉのクラスラベルであり、ｍはサンプルの数である。Ｒ（ｉ）は、変数の有意性を評価するための試験統計値であり得、それはｔ検定に関連する。訓練セットにわたって、各質量集団の値と対応するクラスラベルとの間で
【数１８】
を算出した（表１）。次いで、正及び負に相関した質量集団を等級付けするために、
【数１９】
を用いた。このアプローチを用いて、最高に正の、及び最高に負の相関係数を有する１０の質量集団を選択した。選別機によって見出された決定境界及び特徴スペースにおける識別質量集団対は、図２ａ（緑色線）に示されている。
【０１２６】
ソフトウェア。本発明者らは、サポートベクターマシンＳＶＭｌｉｇｈｔのチャンキング及び分解実行を用いた。デシジョンツリー演算、増強及びＭＬＰのために、Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＷＥＫＡ）に関するＷａｉｋａｔｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔを用いた。実験フレームワークは、ＭＡＴＬＡＢ及びＪａｖａ（登録商標）においてコード化された。カスタムで再使用可能な目標指向型データベースを、ＯｂｊｅｃｔＤＢを用いて作出し、実験フレームワークにインターフェースさせた。ＳＶＭｌｉｇｈｔに対するＭＡＴＬＡＢインターフェースは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｇｉ．ｔｕｇｒａｚ．ａｔ／ａｓｃｈｗａｉｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌ．から入手した。
【０１２７】
（実施例７）
ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ／ＭＳにより同定されたマーカーの同一性の割り当て
結核に罹患している患者の血清を、正常な個体の血清から識別することのできるものとして、ＳＥＬＤＩ−Ｔｏｆ／ＭＳにより同定されたタンパク質バイオマーカーに同一性を割り当てるために、ＴＢに罹患している２０人の患者からの血清のプール及び２０人の健康な対照からの血清の第２のプールを作出した。これらを２Ｄゲル電気泳動により分離した。バイオマーカーのＳＥＬＤＩピーク質量を２Ｄゲル内のタンパク質スポット質量にマッチさせるために、各スポットが切り出された第２の２Ｄゲルを操作し、そこからタンパク質を受動溶出させて完全長タンパク質の溶液を生成させた。完全長タンパク質の溶液をＳＥＬＤＩ−Ｔｏｆ／ＭＳにより分析し、単一ピークを有するスペクトルを生じさせた。次いで、この質量を、元のＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ／ＭＳバイオマーカー質量リストと比較した。２つのＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ／ＭＳ質量間のマッチによって、そのゲルスポットは、ＳＥＬＤＩ−Ｔｏｆ／ＭＳバイオマーカーピークに相当するものとして同定される。
【０１２８】
マッチする２Ｄゲルからのゲルスポットを取り出し、トリプシンでゲル内消化して、そのタンパク質診断用のペプチド混合物を生じさせる。次いで、この混合物を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析して、ゲノムデータベースのＢＬＡＳＴ探索に基づいた同一性の高確率予測を与えた。
【０１２９】
表５に示されるように、この方法で３つのバイオマーカーが明確に同定された。１８３９４のｍ／ｚ値を有するＴＢマーカーは、血清アルブミン前駆体であり、１１４５４のｍ／ｚ値を有するＴＢマーカーは、Ａｐｏ−Ａ１であり、１３７７４のｍ／ｚ値を有するＴＢマーカーは、トランスシレチンである。
【０１３０】
（実施例８）
さらなるマーカーの同定
ＴＢ患者及び対照対象からの血清タンパク質を含有する２Ｄゲルの分析により、ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦによって同定されたマーカーに対応すると思われないいくつかのタンパク質は、ＴＢ血清と対照対象の血清とでは差異的に存在することが判明した。該タンパク質スポットを取り出し、トリプシンでゲル内消化し、そのタンパク質診断用のペプチド混合物を生じさせることによって、該タンパク質を同定した。次いで、この混合物を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析して、ゲノムデータベースのＢＬＡＳＴ探索に基づいた同一性の高確率予測を与えた。同定されたさらなるマーカーは、アポリポタンパク質−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ又はＬＲＧ１）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２であった。
【０１３１】
この分析の結果は、表６に示されている。表６から分かるように、トランスシレチンは、対照ゲルとＴＢゲルの双方から同定された。しかし、トランスシレチンは、対照ゲルに比較して、ＴＢゲルでの発現は低レベルであり、トランスシレチンはＴＢの陰性マーカーであることが確認された。同様に、Ａｐｏ−Ａ２の発現は、対照ゲルに比較して、ＴＢゲルではより低いので、Ａｐｏ−Ａ２は、ＴＢの陰性マーカーである。同様に、ハプトグロビン及びヘモグロビンベータは双方とも、対照ゲルに比較して、ＴＢゲルでの発現はより低レベルであるので、ＴＢの陰性マーカーである。一方、Ａ２ＧＬ（ＬＲＧ１）及びＤＥＰドメインタンパク質は、対照ゲルに比較して、ＴＢゲルではアップレギュレートするので、ＴＢの陽性マーカーである。
【０１３２】
仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２は、対照ゲルにのみ見られたので、ＴＢの陰性マーカーである。
【０１３３】
（参考文献）
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
【表５】
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
【表８】
太字は、該タンパク質スポットが他のゲルにおける等価なスポットよりも強かったことを表している。
イタリック文字は、該タンパク質スポットが他のゲルにおける等価なスポットよりも弱かったことを表している。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】機械学習選別機を訓練する方法のフローチャートを示す図である。
【図２】訓練された機械学習選別機を試験する方法のフローチャートを示す図である。
【図３】訓練された機械学習選別機を用いて、対象がＴＢに罹患しているか否かを判定する方法のフローチャートを示す図である。
【図４】選別機（表３のＳＶＭ＿１）のガウスカーネルシグマ値のパラメーター化を示す図であり、ガウスＳＶＭは、すべての質量ピーク集団を用いて、最初の訓練セット（表２）によって訓練し（パラメーター選択に関しては１０倍交差妥当化）、次いで、最初の試験セット（表２）で、選別機の性能を評価した図である。
【図５】１０倍訓練交差妥当化試験を用いて平均化したＲＯＣを示す図であり、訓練：試験比（８０：２０）で、１００のランダムに選択した訓練セット及び試験セットを作出し、パラメーターは、訓練セットで１０倍交差妥当化を用いて選択し、性能は対応する試験セットで得た図である。ａ）上部の線は、カーネルパラメーターが感受性基準に基づいて選択される場合に得られた選別機の平均ＲＯＣ曲線を示す。ｂ）上部の線は、カーネルパラメーターが特異性基準に基づいて選択される場合に得られた選別機の平均ＲＯＣ曲線を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核（ＴＢ）の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
潜在性ＴＢは世界の人口の３分の１に存在し、多くの地域で活性ＴＢは、人口１０万人当たり７００例を超えている（ＷＨＯ Ｓｔｏｐ ＴＢ ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｇｒｂ）。この世界的ＴＢ伝染病は、活性ＴＢに罹患しているアフリカの親の４０％〜７０％に見られるＨＩＶとの相乗作用によってさらに勢いを強めている。ＴＢの高罹患率地域では、喀痰スミア顕微鏡検査が、提供され利用できる唯一の試験であることが多いが、得られる感度はせいぜい５０％である。診断の判断基準である結核菌の培養により、感度はさらに２５％増加する。ツベルクリン皮膚試験は、特にＴＢの高罹患率地域では、診断を補助する上で正確さが不十分であることが多い。ＴＢに対する血清学的試験は、ミコバクテリア抗原（１種又は複数）の検出に焦点を当ててきたが、皮膚試験と同様に、非病原性のミコバクテリアとの交差反応性、又はＢＣＧによる以前の免疫化により混同されることが多い。
【０００３】
結核（ＴＢ）による死亡の多くは、早期診断と早期治療によって防止することができる。早期診断はまた、罹患率及び伝染の危険性を最小化するが、一般に、結核菌の顕微鏡による同定に頼られている。しかしながら、顕微鏡検査は感度が低く、生物の培養は治療的決定を助ける上で遅すぎることが多い。最近開発されたＤＮＡ増幅及びインターフェロンガンマに基づく試験は費用がかかり、特定の専門的知識が必要とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＴＢに対する正確で迅速な診断試験は、この疾病の制御に莫大な影響を及ぼすであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、プロテオミックプロフィルに対する監視付き機械学習解析を適用して、活性ＴＢに罹患している患者を、臨床的特徴の重複している対照患者から、識別することに成功した。本発明者は、ＴＢに罹患している患者に対して、９４％の診断的正確性を達成し、これは、民族又はＨＩＶの状態に影響されない。特徴選択によって、プロテオミックプロフィルにおける最も報知的なピークである４種のポリペプチド、血清アミロイドＡタンパク質、トランスシレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）、アポリポタンパク質−Ａ１及び血清アルブミンを同定し、免疫アッセイによって定量化した。これらのポリペプチドのうちの２種、血清アミロイドＡ及びトランスシレチンは、炎症状態を反映するため、本発明者は、ネオプテリン及びＣ反応性タンパク質もまた定量化した。さらに、プロテオミックプロフィルにおけるピークを同定するために用いた２Ｄゲルを分析することにより、アポリポタンパク質−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２を、ＴＢのマーカーとして同定した。サポートベクターマシン選別機をこれらのマーカーの組合せに適用することにより、ＴＢに対して８４％までの診断的正確性が与えられた。
【０００６】
したがって、本発明は、
−（ｉ）試験対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；及び
（ｉｉ）前記発現データを、ＴＢ以外の炎症性状態に罹患している患者を含む対照対象の群からの前記２種以上のマーカーの発現データと比較することによって前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定し、
それによって、前記試験対象がＴＢに罹患しているかどうかを判定すること
を含む、試験対象における結核（ＴＢ）を診断する方法；
−（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ（ＬＲＧ１））及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；及び
（ｉｉ）前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること
を含む、結核（ＴＢ）を診断する方法；
−（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；及び
（ｉｉ）訓練された機械学習選別機によってプログラムされたコンピュータシステムを用いて実施される、前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること
を含む、結核（ＴＢ）を診断する方法；
−（ｉ）対象における２種以上のマーカーの発現データを入力すること；及び
（ｉｉ）訓練されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）によってプログラムされたコンピュータシステムを用いて前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること
を含み、それによって、前記患者がＴＢに罹患しているかどうかを診断する、コンピュータにより実施されるＴＢを診断する方法；
−（ｉ）（ａ）結核（ＴＢ）患者の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ；及び
（ｂ）対照対象の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ
を含む訓練データを提供すること；
（ｉｉ）ＴＢ患者の訓練データを、対照対象の訓練データから識別するためにサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用すること
を含み、そのことにより、ＴＢを診断するためにＳＶＭを訓練する、ＴＢを診断するためにＳＶＭ選別機を訓練する方法；
−（ｉ）対象のサンプル中の２種以上のマーカーの発現データを受け入れる手段；
（ｉｉ）前記データがＴＢを示しているかどうかを判定するモジュールであって、ＴＢ患者のデータを、対照対象のデータから識別することのできる訓練された機械学習選別機を含むモジュール；及び
（ｉｉｉ）前記判定の結果を表示する手段
を含む、本発明による方法を実施するように構成された装置；
− コンピュータシステムによって実行可能なコンピュータプログラムであって、コンピュータシステムによる実行の際、コンピュータシステムに、本発明による方法を実施させることのできるコンピュータプログラム；
− 本発明によるコンピュータプログラムを有するコンピュータシステムによって読取り可能な形態において保存する保存媒体；
−（ｉ）２種以上のマーカーを検出するための手段；及び
（ｉｉ）本発明による保存媒体
を含む、ＴＢを診断するためのキット；
−（ｉ）２種以上のマーカーを検出するための手段；
（ｉｉ）本発明による装置に、前記マーカーの検出に関連するデータを入力するための使用説明書
を含む、ＴＢを診断するためのキット；
−（ｉ）トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される２種以上のマーカーを検出するための手段を含む、ＴＢを診断するためのキット；
−（ｉ）試験薬剤を、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミンＡｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質及びＡ２ＧＬから選択されるＴＢマーカーに接触させること；及び
（ｉｉ）前記試験薬剤が、前記マーカーの活性又は発現を調節するかどうかを判定すること
を含み、それによって、前記試験薬剤がＴＢの治療における使用に好適であるかどうかを判定する、ＴＢを治療するための薬剤を同定する方法；及び
−（ｉ）エクスビボ又はインビボで、細胞を結核菌及び試験薬剤に接触させること；
（ｉ）トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質及びＡ２ＧＬから選択される１種以上のＴＢマーカーの発現をモニターすること；及び
（ｉｉ）試験薬剤が前記１種以上の試験マーカーの発現を調節するかどうかを判定すること
を含み、それによって、前記試験薬剤がＴＢの治療における使用に好適であるかどうかを判定する、ＴＢを治療するための薬剤を同定する方法
を提供する。
【０００７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒト血清アミロイドＡ１のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒトＣ反応性タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトトランスシレチンのアミノ酸配列である。
配列番号４は、ヒト血清アルブミン前駆体のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ヒトアポリポタンパク質−Ａ１のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ヒトロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ヒトヘモグロビンベータのアミノ酸配列である。
配列番号８は、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列である。
配列番号９は、ヒトアポリポタンパク質−Ａ２のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ヒトＤＥＰドメインタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ヒト仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、試験対象における結核（ＴＢ）を診断するエクスビボ方法を提供し、前記方法は本質的に、以下のステップを含む：
（ｉ）試験対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；及び
（ｉｉ）前記発現データを、ＴＢ以外の炎症性状態に罹患している患者を含む対照患者の群からの前記マーカーの発現データと比較することによって、前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定し、
それによって、前記試験対象がＴＢに罹患しているかどうかを判定すること。
【０００９】
対照対象の群は、呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象の１種以上から選択できる。
【００１０】
本発明は、結核（ＴＢ）を診断するエクスビボ方法を提供し、前記方法は本質的に、以下のステップを含む：
（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；並びに
（ｉｉ）前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定し、それによって、患者が結核（ＴＢ）に罹患しているかどうかを診断すること。
【００１１】
マーカーは、ＴＢに罹患していない１種以上の対照対象から採取した等価なサンプル（１つ又は複数）に比較して、ＴＢ患者から採取したサンプルにおいて差異的に発現するタンパク質又はペプチドなどの分子である。該発現データは典型的に、対象からのサンプルに存在するマーカーの量の表示を提供する。マーカーは、対照サンプルに比較してＴＢサンプルにおいて、増加したレベルで（陽性マーカー）又は減少したレベルで（陰性マーカー）存在する場合、ＴＢ患者から採取したサンプル及び対照対象から採取したサンプルにおいて差異的に存在する。マーカーの量の増加又は減少は、統計的に有意な差異であることが好ましい。
【００１２】
用語の「感受性」は、本明細書において、真の陽性の条件的確率として定義される。用語の「特異性」は、本明細書において、真の陰性の条件的確率として定義される。用語の「正確さ」は、本明細書において、正しい分類の比率として定義される。したがって、正確さは、ＴＢの診断に関する特異的マーカー対又はマーカー集団の再現性を示し；感受性は、真の陽性診断を達成する結合可能性の程度を示し；特異性は、ＴＢ感染に関する真の陰性としてのサンプル同定において、各マーカーの結合の良好性の程度を示す。
【００１３】
トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ及びＳＡＡは、ＴＢにおける病態生理学的過程に関連していることが知られている。しかし、これらのタンパク質のいずれも、ＴＢの診断におけるマーカーとして使用できることが以前示唆されたことはない。本発明者は、ＳＡＡ、ネオプテリン、ＣＲＰ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａ２ＧＬ及びＤＥＰドメインタンパク質を、ＴＢの陽性マーカーとして、並びに、トランスシレチン、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２をＴＢの陰性マーカーとして同定した。種々の組合せで用いられた場合、これらのマーカー、特に、ＳＡＡ、ネオプテリン、ＣＲＰ及びトランスシレチンは、高程度の感受性、特異性及び正確さでＴＢの診断に使用できることを、本発明者は見出した。本発明の方法は典型的に、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の正確さ、特異性及び／又は感受性でのＴＢの診断を可能にする。
【００１４】
したがって、本発明は、対象が結核菌に感染しているかどうかを、前記対象のサンプルにおける結核菌を培養する必要なしに、迅速に容易に判定することを可能にする。本発明の方法は、ＴＢを、ＴＢ以外のウィルス及び細菌の感染症などの他の感染症及び炎症性疾患から識別することを可能にする。ＴＢから識別できる感染症及び炎症性疾患の例としては、他の呼吸器感染症、サルコイドーシス、炎症性腸疾患、マラリア、ヒトアフリカトリパノソーマ症、神経系疾患、自己免疫疾患及び骨髄腫が挙げられる。
【００１５】
本発明の一方法において、対象からの発現データが典型的に、ＴＢ患者における同じマーカーの発現データと比較される。ＴＢ患者は、該患者からのサンプルの結核菌を培養することにより、ＴＢに罹患しているとして診断できたことがあり得る。該発現データを、１種以上の対照対象における同じマーカーの発現データと比較することもできる。該対照対象は、ＴＢ以外の炎症性疾患に罹患している患者かも知れない。炎症性疾患は、病原性の感染、例えば、細菌、ウィルス又は真菌の感染によって引き起こされ得る。該対照対象は、本明細書に記載された、ＴＢ以外の疾患のいずれかに罹患していることがあり得る。或いは、又はそれに加えて、１種以上の対照対象は健康な個体であり得る。健康な個体は、炎症性疾患に罹患していない個体である。
【００１６】
２種以上のマーカーの発現データを用いることによって、診断の正確さが増強する。３種以上のマーカーなど、２種超のマーカーを組み合わせて用いることによって、診断の正確さをさらに増強できる。したがって、本発明において、２種以上のマーカー、好ましくは３種以上のマーカー、例えば、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種又はそれ以上のマーカーなど、４種以上のマーカーの発現データが用いられる。診断の方法に用いられるこれらのマーカーのうちの１種はトランスシレチンであることが好ましい。好ましい組合せとしては、（ｉ）トランスシレチン、ＳＡＡ及びＣＲＰ、（ｉｉ）トランスシレチン及びネオプテリン及び（ｉｉｉ）トランスシレチン、ネオプテリン及びＣＲＰが挙げられる。トランスシレチン、ネオプテリン、ＳＡＡ及びＣＲＰ以外の血清アルブミン及び／又はＡｐｏ−Ａ１などの追加マーカーを該分析に含めることができる。さらなる追加マーカーとしては、アポリポタンパク質−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２が挙げられる。
【００１７】
さらなる追加マーカーは、対照サンプルに比較して、ＴＢサンプル中に増加又は減少したレベルで存在するタンパク質又はペプチドであり得る。さらなるマーカー（１種又は複数）は、例えば、質量分析によって判定される、見かけの分子量又は質量対電荷比（ｍ／ｚ値）によって特徴づけることができる。
【００１８】
このような追加の生体マーカーは、本発明者によって、ＳＡＡ、血清アルブミン及びＡｐｏ−Ａ１がＴＢの陽性マーカーであり、トランスシレチンがＴＢの陰性マーカーであると判定するために使用される方法によって同定できる。他の陽性及び陰性関連マーカーは、表面増強レーザー脱離及びイオン化（ＳＥＬＤＩ）技法及び監視付き機械学習分類法により同定できる。
【００１９】
例えば、本発明者は、サポートベクターマシン選別機を用いて、ＴＢ患者のプロテオミックな識別特性を、対照対象のプロテオミックな識別特性と比較することによって１０種の陽性マーカー及び１０種の陰性マーカーを同定した。該陽性マーカーは、約Ｍ１８３９４＿９、約Ｍ８９５２＿７５、約Ｍ１１７２０＿０、約Ｍ１１４５４＿１、約Ｍ１８５９１＿２、約Ｍ１１４８８＿１、約Ｍ９０７６＿６８、約Ｍ８８９５＿１３、約Ｍ１０８５６＿８及び約Ｍ１１５４１＿５のｍ／ｚ値を有し、負に相関したマーカーは、約Ｍ４１００＿０３、約Ｍ３８９８＿５２、約Ｍ１３９７２＿１、約Ｍ３３２２＿０１、約Ｍ２９５６＿４５、約Ｍ５６４４＿９６、約Ｍ３９３９＿６３、約Ｍ４０５６＿３９、約Ｍ６６４９＿７４及び約Ｍ１３７７４＿３のｍ／ｚ値有する。約Ｍ１１５４１＿５のｍ／ｚ値を有するマーカーはＳＡＡである。約Ｍ１８３９４＿９のｍ／ｚ値を有するマーカーは血清アルブミンである。約Ｍ１１４５４＿１のｍ／ｚ値を有するマーカーはＡｐｏ−Ａ１である。約Ｍ１３７７４＿３のｍ／ｚ値を有するマーカーはトランスシレチンである。ｍ／ｚ値にはいくらか変動があり得る。例えば、ｍ／ｚ値の決定に用いる機械の分解能、又は該マーカーの翻訳後修飾に依存する変動があり得る。したがって、上記に挙げたマーカーは、指定されたｍ／ｚ値プラス又はマイナス約１０％、約５％、約１％、約０．５％又は約０．２％を有し得る。
【００２０】
ＳＥＬＤＩ分析によって同定された追加マーカーの同定は、トリプシン消化及びペプチド質量フィンガープリントのＭａｔｒｉｘ補助レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）質量分析、並びにＭＡＳＣＯＴデータベースなどのタンパク質データベースとの比較によって決定できる。ＳＡＡ１はＭ１１５４１＿５のｍ／ｚ値を有し、トランスシレチンは、Ｍ１３７７４＿３のｍ／ｚ値を有するが、このような方法によって同定された。
【００２１】
該マーカーはまた、２次元（２Ｄ）ゲル上のｍ／ｚ値に対応するタンパク質のスポットを同定し、切り出し、該スポットに存在するタンパク質を同定することによって同定できる。該２Ｄゲルは、約１０、約２０又はそれ以上などの数のＴＢ患者、又は約１０、約２０又はそれ以上などの数の対照対象のプールされた血清から得ることができる。ｍ／ｚ値は一般に、受動的溶出（ＰＥ）質量よりもわずかに小さい。ｍ／ｚ値以上のＰＥ質量の増加は、受動的溶出を行うのに用いられた時間に比例する。したがって、この方法が用いる場合、ｍ／ｚ値とＰＥ質量との間の関連は近似的であることに注意することが重要である。しかし、該マーカーの同定は、元のサンプルの免疫減少及びＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ分析の反復によって確認できる。対象となっているｍ／ｚ値を有するピークサイズの減少は、正しい同定がなされたことを示している。しかし、本発明の方法にマーカーとして質量使用されるタンパク質にとって、さらなる同定は必須ではない。この方法を用いて、Ｍ１８３９４＿９及びＭ１１４５４＿１のｍ／ｚ値を有する陽性マーカーは、血清アルブミン前駆体並びにアポリポタンパク質Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）として同定された。したがって、血清アルブミン及び／又はＡｐｏ−Ａ１など、それらのｍ／ｚ値によって同定されたマーカーの１種以上を、本発明の方法におけるマーカーとして用いることができる。
【００２２】
ＴＢのさらなるマーカーは、ＴＢ患者及び対照対象からの血清タンパク質を含有する２Ｄゲルに差異的に存在するポリペプチドを同定することによって同定したものであり得る。この方法で同定されたマーカーは、アポリポタンパク質Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質及び仮想タンパク質（ＤＦＫＺｐ６６Ｉ０３２）並びにロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ（ＬＲＧ１））である。
【００２３】
ＴＢ患者と対照対象からのプロテオミックな識別特性の監視機械学習分析後、ＴＢのマーカーとしての使用に好適なタンパク質集団を、ＴＢ患者と対照対象との間を識別する能力を有するタンパク質集団の選択を可能にする任意の方法により同定できる。典型的には、相関フィルター法を用いて、独立して情報を与えるピークを検出する。例えば、ピヤソン相関係数を使用して、ピークをそれらの識別力に関して等級づけることができる。ピヤソン相関係数は、
【数１】
として定義され、式中、Ｘｋは、サンプル入力ベクトルＸのｋ番目の成分に対応するランダムな変数であり、Ｙは、出力ラベルのランダムな変数である。Ｒ（ｋ）の推定値は、
【数２】
により与えられ、式中、ｘｉ，ｋは、サンプルｉの質量集団ｋのｍ／ｚ値に対応し、ｙｉは、サンプルｉのクラスラベルであり、ｍはサンプルの数である。Ｒ（ｉ）は、変数の有意性を評価するための検定統計値として使用でき、ｔ検定に関連している。
【数３】
は、訓練セットにわたって各質量集団の値と対応するクラスラベルとの間で算出できる。次いで、
【数４】
を用いて、正及び負に相関した質量集団を等級づけることができる。最高の正及び／又は最高の負の相関係数を有する質量集団を選択できる。
【００２４】
タンパク質はしばしば、異なって検出できる分子質量によって特徴づけられる複数の異なる形態において生物学的材料に存在する。したがって、ＳＥＬＤＩなどの方法による生物学的サンプル中の発現タンパク質の分析では、タンパク質集団として、種々の形態のタンパク質が検出される。種々の形態は、翻訳前及び／又は翻訳後修飾から生じ得る。例えば、トランスシレチンマーカーは、トランスシレチン前駆体又は成熟トランスシレチンであり得る。さらなる例として、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１及びＡｐｏ−Ａ２マーカーの各々もまた、該タンパク質の前駆体形態又は成熟形態であり得、好ましくは、前駆体形態である。対立形質変異、スプライス変異体の生成及びＲＮＡ編集は、翻訳前修飾を増加させる。翻訳後修飾としては、タンパク質分解的開裂、グリコシル化、リン酸化、脂質化、酸化、メチル化、シスチニル化、スルフォン化及びアセチル化が挙げられる。発現データは、該タンパク質の１つ又は複数の形態のいずれかに関するものであり得る。翻訳前及び／又は翻訳後修飾は、ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦにおけるマーカーのｍ／ｚ値における変動を増加させ得る。
【００２５】
本発明の一実施形態において、該発現データは、前記マーカーに由来する１種又は複数のペプチドに関するものであり得る。例えば、ＳＡＡの発現データは、ＳＡＡのＮ末端アルギニンの欠失から生じるペプチドの発現に関するものであり得る。ＳＡＡ１の完全配列は、配列番号１に示されている。
【００２６】
一実施形態において、発現データは、該マーカーの特定の形態に関するものであり得る。例えば、陽性マーカー、Ａｐｏ−Ａ１は、約１１４００から約１１６００ダルトン（Ｄａ）の分子質量を有する形態であり得、及び／又は陽性マーカー、血清アルブミンは、約１８３００から約１８５００ダルトンの分子質量を有する形態であり得る。
【００２７】
発現データは任意の好適な方法によって得ることができる。一実施形態において、該発現データは、対象となっている各マーカーの存在又は不在を示す。該発現データが対象のサンプルに存在する各マーカーの量の表示を提供する、即ち、該データが定量的であることが好ましい。該発現データはさらに、各マーカーの形態、例えば、存在するタンパク質の形態を限定し得る。
【００２８】
典型的に発現データは、固相、又は表面上へのマーカーの捕捉、及び捕捉されたマーカーの検出によって得られる。該表面は、サンプルからのマーカータンパク質を、使用されているマーカーの一般的な性質に従って、又は種々のタンパク質マーカーの特定の性質に従って選択するようにデザインされる。該表面は典型的に、１つ又は複数の捕捉試薬が結合するビーズ、プレート、膜又はチップである。該捕捉試薬は、特定のクロマトグラフィー表面であり得る。該クロマトグラフィー表面は、化学的又は生化学的に処理され得る。化学処理された表面は、アニオン性、カチオン性、疎水性、親水性又は金属であり得る。このような化学処理された表面は、特定の化学的性質を有するタンパク質を捕捉することができる。このような化学処理された表面は、例えば、イオン交換材料、ニトリロ酢酸又はイミノ二酢酸などの金属キレート化剤、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、染料、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖及び脂肪酸などの単純な生体分子、並びに、疎水性の吸引／静電斥力吸着剤などの混合様式吸着剤を含み得る。
【００２９】
表面が生化学処理されている一実施形態において、該捕捉試薬は典型的に、特定のマーカーに対する特異的結合試薬である。この実施形態において、該表面は典型的に、使用されている各マーカーに対する特異的結合試薬を含む。タンパク質が、それに対して特異的なマーカーに優先的に、又は高親和性で結合するが、他の物質には、結合しないか、実質的に結合しないか、又は低親和性でしか結合しない場合、該タンパク質は該マーカーに「特異的に結合」する。タンパク質の特異的結合能力は、任意の好適な方法により判定できる。競合的結合に関する種々のプロトコルが当業界によく知られている（例えば、Ｍａｄｄｏｘら、（１９９３）を参照）。
【００３０】
特異的結合剤は、該マーカーに特異的な抗体又は抗体断片であり得る。好適な抗体が当業界で入手できる。抗体及び抗体断片はまた、当業界に知られた標準的操作を用いて作出することもできる。
【００３１】
該抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体が好ましい。結合タンパク質はまた、親和性リガンド又は該マーカーに結合できる抗体断片であり得るか、又はそれを含み得る。このような抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２断片、並びに一本鎖抗体が挙げられる。アプタマー、抗体及び相互作用する融合タンパク質もまた、特異的結合剤として使用できる。該特異的結合剤は、対象となっているマーカーの１つ又は複数の形態を認識し得る。
【００３２】
他の生化学処理された表面は、ポリペプチドなどの核酸分子、多糖、脂質、ステロイド又は糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質又は核酸などの結合分子（例えば、ＤＮＡ−タンパク質結合体）によってコーティングされ得る。
【００３３】
抗体などの特異的結合剤を表面に結合させる方法は、当業界によく知られている。
【００３４】
該表面はタンパク質チップアレイであり得る。タンパク質チップアレイは、捕捉試薬の、典型的には２ｍｍの直径の個別のスポットを含む。該アレイ上の各スポットにおける捕捉試薬は、同一でもよいし異なっていてもよい。本発明の使用に好適なタンパク質チップアレイは当業界によく知られている。例えば、好適なチップはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手でき、ＣＭ１０、ＩＭＡＣ−３、ＣＭ１６、ＳＡＸ２、Ｈ４、ＮＰ２０、Ｈ５０、Ｑ−１０、ＷＣＸ−２、ＩＭＡＣ−３０、ＬＳＡＸ−３０、ＬＷＣＸ−３０、ＩＭＡＣ−４０、ＰＳ１０、ＰＳ−２０及びＰＧ−２０のタンパク質チップアレイが含まれる。
【００３５】
これらのタンパク質バイオチップは典型的に、ストリップの形態におけるアルミニウム基質を含む。該ストリップの表面は、二酸化ケイ素でコーティングされている。ＮＰ−２０バイオチップの場合、二酸化ケイ素は、親水性タンパク質を捕捉するための親水性吸着剤として機能する。Ｈ４、Ｈ５０、ＳＡＸ−２、Ｑ−１０、ＷＣＸ−２、ＣＭ−１０、ＩＭＡＣ−３、ＩＭＡＣ−３０、ＰＳ−１０及びＰＳ−２０バイオチップは、バイオチップの表面に物理的に結合した、又はバイオチップの表面にシランを介して共有結合したヒドロゲルの形態における機能化された架橋ポリマーをさらに含む。Ｈ４バイオチップは、親水性結合のためのイソプロピル機能性を有する。Ｈ５０バイオチップは、疎水性結合のためのノニルフェノキシルポリ（エチレングリコール）メタクリレートを有する。ＳＡＸ−２及びＱ−１０バイオチップは、アニオン交換のための四級アンモニウム機能性を有する。ＷＣＸ−２及びＣＭ−１０バイオチップは、カチオン交換のためのカルボキシレート機能性を有する。ＩＭＡＣ−３及びＩＭＡＣ−３０バイオチップは、キレート化によりＣｕ２＋及びＮｉ２＋などの遷移金属イオンを吸着するニトリロ酢酸機能性を有する。これらの固定化金属イオンは、配位結合によりペプチド及びタンパク質の吸着を可能にする。ＰＳ−１０バイオチップは、共有結合のたにタンパク質上の基と反応できるカルボイミジゾール官能基を有する。ＰＳ−２０バイオチップは、タンパク質との共有結合のためにエポキシド官能基を有する。ＰＳ系のバイオチップは、サンプルからの検体を特異的に捕捉するために機能するチップ表面に、抗体、受容体、レクチン、ヘパリン、タンパク質Ａ、ビオチン／ストレプトアビジンなどの生体特異的吸着剤を結合させる上で有用である。ＰＧ−２０バイオチップは、タンパク質Ｇが結合するＰＳ−２０チップである。ＬＳＡＸ−３０（アニオン交換）、ＬＷＣＸ−３０（カチオン交換）及びＩＭＡＣ−４０（金属キレート）バイオチップは、それらの表面に機能化ラテックスビーズを有する。
【００３６】
該表面は、９６ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートのウェルであってもよい。典型的に、このようなプレートの各ウェルは、各ウェルが異なる抗体の２つ以上の別個のスポットを含み得るように、異なる抗体などの異なる捕捉試薬を含むことになる。
【００３７】
該捕捉表面は、捕捉試薬によってコーティングされた複数のビーズを充填したカラムであり得る。各々が単一のマーカータンパク質を捕捉できる複数のカラムを使用できる。或いは、すべてのマーカータンパク質が同じカラムで捕捉されるように、単一のカラムが、種々のマーカータンパク質に対する特異的結合剤によってコーティングされたビーズを含有し得る。
【００３８】
対象のサンプルを典型的に、該表面に対するサンプル中のマーカータンパク質の結合に好適な条件下で、該表面に接触させる。サンプル中に存在する該タンパク質は任意に分画化でき、検出されるマーカーを含む該画分（１つ又は複数）を採集して、該表面に接触させることができる。非結合タンパク質及び他の物質を溶出する一方で該表面への対象となっているマーカーの結合を保持するようにデザインされた適切な溶媒又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液を用いて、非結合物質を洗浄除去する。該対象のサンプルは典型的に、血液、血漿又は血清サンプルである。
【００３９】
捕捉されたマーカータンパク質は、任意の好適な方法によって検出できる。一実施形態において、結合マーカーは、免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又は蛍光ベースの免疫アッセイによって検出できる。典型的な免疫アッセイにおいて、結合マーカーは、該マーカーに結合することが予想される抗体又は抗体断片を用いて検出できる。捕捉試薬が抗体である場合、検出する抗体は典型的に、その捕捉試薬とは異なる抗体である。典型的に、該抗体は、捕捉試薬に結合する部位とは異なる部位でマーカーに結合する。該抗体は、マーカーと支持体に固定化された捕捉試薬との間に形成された複合体に特異的であり得る。
【００４０】
一般に該抗体は、直接的又は間接的に検出可能な標識によって標識化される。直接的に検出可能な標識としては、フルオレセインなどの蛍光標識、テキサスレッド、ローダミン又はオレゴングリーンを挙げることができる。固定化された捕捉試薬／マーカー複合体に対する蛍光標識抗体の結合は顕微鏡によって検出できる。例えば、蛍光顕微鏡、二重焦点顕微鏡又は共焦点顕微鏡を用いる。
【００４１】
該抗体は、間接的に検出できる標識に結合させることが好ましい。間接的に検出できる標識は、自動読取り機を用いて検出できる、沈降非蛍光基質に作用する酵素を含み得る。自動読取り機は典型的に、ビデオカメラ及び画像分析ソフトウェアに基づく。該自動読取り機は、検出された各マーカーの量の計量を提供することができる。好ましい酵素としては、アルカリホスファターゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼが挙げられる。自動読取り機は当業界によく知られており、例えば、Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｔｒｉｔｏｒｕｓ分析装置（Ｇｒｉｆｏｌｓ、ケンブリッジ、英国）が挙げられる。
【００４２】
検出抗体からのシグナルを増強するために、他の間接的方法が使用できる。例えば、検出抗体はビオチン化でき、アルカリホスファターゼ若しくはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素に結合したストレプトアビジン又はＦＩＴＣ、又はテキサスレッドなどの蛍光プローブに結合したストレプトアビジンを用いて検出が可能になる。
【００４３】
すべての検出ステップにおいて、第２の、及びその後の薬剤の非特異的結合を最少化する薬剤を含めることが望ましい。例えば、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を用いて非特異的結合をブロックすることができる。
【００４４】
一実施形態において、捕捉されたタンパク質は、該表面、例えばチップ又はビーズからのタンパク質の溶出後、質量分析、例えば、ＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩなどの気相イオン分光分析によって検出できる。このような検出方法によって、種々のタンパク質、及び同一タンパク質の種々の形態を、標識化を必要とすることなく識別することが可能になる。
【００４５】
気相イオン分光分析は、気相イオンを検出するために気相イオン分光器を必要とする。気相イオン分光器は、気相イオンを供給するイオン源を含み、質量分光器、イオン移動度分光器及び総イオン流測定装置を含む。質量分光器は、気相イオンの質量対電荷比に翻訳できるパラメーターを測定する気相イオン分光器である。質量分光器は典型的に、イオン源及び質量分析装置を含む。質量分光器の例は、飛行時間（ＴｏＦ）、磁気セクター、四極子フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電セクター分析装置及びこれらのハイブリッドである。レーザー脱離質量分光器は、検体を脱着し、蒸発させ、イオン化するための手段としてレーザーを用いる質量分光器である。タンデム型質量分光器は、イオン混合物中のイオンなどのイオンのｍ／ｚベースの識別又は測定の２つの連続的段階を実施できる質量分光器である。
【００４６】
放射性核種のベータ減衰により生成した高エネルギー粒子又は二次イオンを生成する一次イオンなどの好適なイオン化エネルギー源を用いて、捕捉表面から捕捉マーカーを脱着又はイオン化できる。固相検体のイオン化エネルギーの好ましい形態はレーザーである。
【００４７】
本発明に用いられる好ましい質量分光法は、ＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離及びイオン化）であり、これは、タンパク質チップ、又は気相イオン分光器のプローブ界面に係合するＳＥＬＤＩプローブの表面にマーカータンパク質が捕捉される脱離／イオン化気相イオン分光分析の方法である。マーカータンパク質を捕捉するためにタンパク質チップアレイを用いるこの実施形態において、結合マーカーを検出するために、タンパク質チップ読取り機を使用できる。結合タンパク質の分子量を測定するために、エネルギー吸収分子（ＥＡＭ）溶液の添加及びタンパク質チップ読取り機内へのタンパク質チップの挿入の前に、タンパク質チップに結合したタンパク質は典型的には乾燥させる。タンパク質チップ読取り機においてレーザーが活性化すると、サンプルは照射され、脱着／イオン化が進行して、タンパク質チップアレイから気体状イオンを遊離させる。イオンチャンバーを通る各タンパク質の速度に基づいて各タンパク質の質量対電荷比（ｍ／ｚ）測定するタンパク質チップ読取り機の飛行時間質量分光分析（ＴｏＦ ＭＳ）領域に、これらの気体状イオンが進入する。シグナル出力の質量正確度を増加させるために、タイムラグフォーカシングが使用できる。シグナル処理は、パーソナルコンピュータに結合している、デジタルコンバータへの高速アナログによって達成される。検出されたタンパク質は、一連のピークとして表示される。ピークの幅は、サンプル中に存在する各タンパク質の量の表示である。本発明の方法における使用に好適なＥＡＭｓとしては、桂皮酸誘導体、シナピン酸及びジヒドロキシ安息香酸が挙げられる。
【００４８】
発現データはまた、比濁分析によっても得ることができる。比濁分析は、マーカー量の測定値を正確に迅速に得るために用いられる実験室技法である。該データは、例えば、粒子増強免疫比濁分析又は比率比濁分析によって得ることができる。ＢＮＩＩ分析器（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ、ミルトンキーネス、英国）は、粒子増強免疫比濁分析の実施に好適である。比率比濁分析の実施には、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｍｍａｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｎｉｔｅｒ、ハイウィコンベ、英国）が使用できる。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｍｍａｇｅは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ＣＲＭ ４７０に対して検量できる。マーカー発現の測定は、用いられる分析器の製造元によって提供された指示に従って実施できる。
【００４９】
使用できる他の検出方法としては、共焦点顕微鏡法又は蛍光顕微鏡法などの光学的技術、ボルタメトリー（ｖｏｌｔａｍｅｔｒｙ）及びアンペロメトリー（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）などの電気化学的技術、原子力顕微鏡法及び多極共鳴分光法などの無線周波技術が挙げられる。
【００５０】
対象となっているマーカーの発現パターンを調べて、該マーカーの発現がＴＢを有する患者を示しているかどうかを判定する。任意の好適な分析方法が使用できる。典型的には、用いられる分析法は、対象から得られた発現データを、ＴＢに罹患していることが分かっている患者及び結核菌に感染していない対象から得られた発現データと比較することを含む。次いで、対象におけるマーカーの発現が、ＴＢであることが分かっている患者に見られる発現パターンにより類似しているか、それとも対照対象に見られる発現パターンにより類似しているかを判定することができる。分析方法は典型的に、対象がＴＢに罹患している可能性を測定する。
【００５１】
ＴＢに罹患している患者は典型的に、各患者由来のサンプルからの結核菌培養の結果として、ＴＢに罹患していると診断された。対照対象は、ＴＢ以外の呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの１種以上から選択できる。ＴＢに罹患しておらず、上記に挙げられていない他の疾患に罹患している患者もまた、対照対象として用いることができる。典型的には、試験対象のマーカーの発現パターンを比較する対照対象の発現データは、上記対象の少なくとも２種、例えば、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種又は少なくとも８種を含む。ＨＩＶ陽性の患者は、特に疾患に罹患しやすい。ＴＢ患者及び／又は対照対象は、ＨＩＶ陽性でもＨＩＶ陰性でもあり得る。
【００５２】
ＴＢサンプル及び対照サンプルは、１つ超、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、８つ以上、１０以上の地域からの患者及び／又は対象から採取できる。各々の地域は、異なる大陸、国、又はある国の内の地域であり得る。ＴＢ対象及び／又は対照対象からの種々のサンプルは、種々の時間での発現データを得るために処理できる。例えば、サンプルは、１カ月から２年、３カ月から１８カ月又は６カ月から１年などの任意の好適な期間にわたって得ることができ、及び／又は処理できる。
【００５３】
該発現データがＴＢを示しているか否かを判定する方法は典型的にコンピュータを用いて実施される。該コンピュータは、発現データを生成するために用いられる読取り機から物理的に分離されていてもよいし、該読取り機に、例えば、質量分析器に結合されていてもよい。
【００５４】
ＴＢに罹患している患者の発現データを、対照対象の発現データから識別するために、監視付き機械学習分類法が使用できる。ＴＢ患者からの発現データの訓練及び対照対象からの対照データの訓練を用いて、機械学習選別機をまず訓練する。
【００５５】
ＴＢ患者からの発現データを、ＴＢに罹患していない対象からの発現データから識別するために、機械学習選別機を訓練する方法は、図１のフローチャートに示されている。コンピュータシステム上で実施されるコンピュータプログラムによって実行されるステップは、図１における点線によって概略的に示されている。ＴＢ患者及び対照対象からの訓練データ（データＤ１）は、入力変数（典型的には、ｍ／ｚ値、ＥＬＩＳＡ値又は比濁値）になる。ステップＳ１において、コンピュータはこれらの入力変数をマップ化して、カーネルを用いてスペースを特徴づけ、ステップＳ２において、選別機はＴＢデータと対照データとの間を識別することを学習し、したがって、ＴＢデータと対照データとの間を識別するための、ＳＶＭなどの選別機訓練を生じさせる。
【００５６】
次いで、さらなるＴＢ患者及びさらなる対照対象からの発現データを用いて、訓練された選別機を試験することができる。機械学習選別機の一般化を試験する方法は、図２のフローチャートに示されている。コンピュータ実行ステップは、図２における点線によって概略的に示されている。表１に示されるように、各セットに、ＴＢ患者と対照の同様な数、並びに同様な年齢と性別の表示を有する独立した訓練セットと試験セットが使用できる。ＴＢ患者及び／又は対照対象からの試験データ（データＤ２）は、入力変数（典型的には、ｍ／ｚ値、ＥＬＩＳＡ値又は比濁値）になる。ステップＳ３において、コンピュータはこれらの入力変数をマップ化して、カーネルを用いてスペースを特徴づけ、ステップ４では、訓練データを用いて生成させた選別機を用いて入力変数のクラスを、ＴＢデータ又は非ＴＢデータであるとして割り当てる。次いで、試験データが正しく分類されたか誤って分類されたかを判定することができる。
【００５７】
ＴＢに罹患しているとして、又は罹患していないとして診断することが望まれる対象からの発現データが、ＴＢに罹患している、又はＴＢに罹患していない患者を示しているかどうかを判定するために、訓練された機械学習選別機を使用することができる。このような診断方法で用いられる訓練された機械学習選別機は、上記のとおり試験したものであり得るが、この試験ステップは必須ではない。図３は、本発明によるコンピュータで実行する診断方法を示すフローチャートである。コンピュータ実行ステップは、図３における点線によって概略的に示されている。図３において、Ｄ３と標識された試験対象（即ち、新たな未知対象）からのデータは入力変数になる。ステップＳ５において、コンピュータはこれらの入力変数（典型的には、ｍ／ｚ値、ＥＬＩＳＡ値又は比濁値）をマップ化して、カーネルを用いてスペースを特徴づけ、ステップＳ６では、先に得た選別機を用いてサンプルを、ＴＢサンプル又は非ＴＢサンプルであるとして分類する。したがって試験対象は、ＴＢに罹患している、又は罹患していないものとして診断される。
【００５８】
好適な機械学習選別機としては、単層パーセプトロン（ＳＬＰ）、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）、デシジョンツリー及びサポートベクターマシンが挙げられる。好ましくは、サポートベクターマシンにおける該選別機。より好ましくは、該選別機はＧａｕｓｓｉａｎカーネルサポートベクターマシンである。
【００５９】
監視付き学習演算法は、訓練データと呼ばれる例の１セットの入力／出力対に対して正しいラベルを帰属させることのできる決定機能を見出すことが課せられている。未知のサンプル（試験データ）に対して正しいラベルを予測する決定機能の能力は、それの一般化として知られている。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）などの現行の機械学習法は、この性質を最適化することを目指している。選別機の一般化は、性能を最適化するために選択しなければならない１セットのパラメーター（モデル）に依存している。この目的のために、パラメーター値の範囲が離散化され、交差検証によって試験されるグリッド探索法を採用できる。
【００６０】
データセットＤは、入力ベクトル、Ｘ（即ち、カテゴリーの典型）のサンプルとそれらの対応する出力ラベル、Ｙのサンプル、Ｄ＝［Ｘ，Ｙ］によって表される。サンプル入力ベクトルは、ｘによって表される。ｉ番目のサンプルの質量スペクトルは、ｎ次元（質量集団の数）ベクトルｘｉと、関連クラスラベルｙｉ（ＴＢでは＋１、対照では−１）として表され、式中、ｉ＝１，．．．，ｍであり、ｍはサンプルの数である。スペクトルベクトル要素は、ｘｉ，ｋによって表され、式中、ｉ＝１，．．．，ｍであり、ｋ＝１，．．．，ｎである。サンプルクラスラベルｙｉの選別機予測は、
【数５】
によって表される。
【００６１】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）はその入力を、高い、さらには無限の次元特徴スペースへマップ化する。次いで、ＳＶＭの出力は、特徴スペースにおいてマップ化された入力の線形閾値化関数であるが、これは、元の入力空間では非線形であり得る。マッピングは、使用者選択再生カーネル関数Ｋ（ｘ，ｘ’）によって達成され、式中、ｘ及びｘ’は入力ベクトルである。カーネル関数は、マーサー条件を満たさなければならない。カーネルのよく知られた例としては、ガウスの
【数６】
が挙げられ、式中、パラメーターσは幅を決定し；ポリノミナルＫ（ｘ，ｘ’）＝（ｘ・ｘ’）ｄであり、式中、ｄは次数を決定する。ｄ＝１の場合、線形カーネルと呼ばれ、入力データのアイデンティティーマップに対応する。訓練されたＳＶＭ選別機は、
【数７】
の形態を有し、訓練により、α及びｂの値が決定する。典型的には、αの多くはゼロである。非ゼロのものは「サポートベクター」と呼ばれ、変換特徴スペースにおける分離超平面を規定するために用いられる。ＳＶＭの訓練は、多層パーセプトロンとは異なり、局所最小に供されないコンベックス（二次）最適化問題である。ＳＶＭｌｉｇｈｔ（Ｊｏａｃｈｉｍｓ、１９９９年）及び、特に、データに雑音がある場合に実用可能なソフト限界ＳＶＭなどの、ＳＶＭを訓練するために入手できる多くのパッケージがある。また、この場合、該演算により、間違って分類された実施例の距離は、ソフト限界パラメーターと呼ばれるペナルティー値、Ｃを調節することで、限界まで最小化される。
【００６２】
Ｓｉｎｇｌｅ Ｌａｙｅｒ Ｐｅｒｃｅｐｔｒｏｎ（ＳＬＰ）（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ、１９６２年）は、入力層によって与えられる値の線形組合せを計算する１つの出力ニューロンを有する人工ニューラルネットである。識別関数は、
【数８】
によって与えられ、式中、重みｗは、総分類エラー
【数９】
を減少させるためにデザインされた反復学習演算によって得られる。
【００６３】
Ｍｕｌｔｉ−Ｌａｙｅｒ Ｐｅｒｃｅｐｔｒｏｎ（ＭＬＰ）（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ及びＲｕｍｅｌｈａｒｔ、１９８６年）は、隠れニューロンの中間層を有するＳＬＰの一般化である。それは、ニューロンに、活性化レベルでのＳ字形関数
【数１０】
によりそれらの入力を処理させることによって、非線形に分離可能なクラスの問題に取り組む。このネットワークにおいて、重みは、
【数１１】
によって与えられるエラーを最小化するための勾配下降則である逆伝播演算により学習される。
【００６４】
デシジョンツリーは、二元ツリー構造に組織化された１セットの節点内にサンプルのデータセットＤ＝［Ｘ，Ｙ］の特徴を集合させることによって、それらの分類を学習する。ツリー構造を見出すために、分割基準：所与の質量ピークｘｉ，ｋに関して、試験ｘｉ，ｋ＜Ｔ（式中Ｔは、データセットＤの二元分割を生じる任意の試験）を用い、サンプルの特徴が、それらの識別力に従って試験される。Ｃ４．５（Ｑｕｉｎｌａｎら、１９９３年）選別機において、試験閾値は、情報−獲得分割基準
【数１２】
によって評価され、式中、Ｉｎｆｏ（Ｄ）は、サンプルが帰属するクラスのエントロピー計量であり、ｚは、試験Ｔの結果の数である。反復演算により、ツリーの根から葉までの情報獲得を増加させて節点が配置される。選別機のよりコンパクトな提示を得るために、最終のツリーを刈り込んでもよい。試験セットサンプルは、分類出力により根から葉までの通路づたいのツリーの節点における質量ピーク値に対してその質量ピーク値を試験することによって分類することができる。Ｃ５．０演算は、無関連の特徴を選別し、可変性の誤分類コストを組み入れるＣ４．５の拡張型である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｌｅｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／）。Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｒｅｅ（ＡＤＴｒｅｅ）（Ｆｒｅｕｎｄ及びＭａｓｏｎ、１９９９年）は、分類通路にわたって合計される予測値に関する追加節点を有するツリーであり、最終出力はこの合計のサインである。
【００６５】
ｋ倍交差妥当化、又は試験によるｋ倍交差妥当化などの任意の好適な交差妥当化方式を使用できる。ｋ倍交差妥当化では、訓練セットを、等しく分散された陽性事例及び陰性事例のｋ群にランダムに分割する。選別機は、それらの群のｋ−１で訓練され、その一般化性能は残りの群で妥当化される。この処理をｋ回反復し、各々の回で異なる妥当化サブセットが提供されるが、その平均が全体的な一般化を表す。第２の方式、試験によるｋ倍交差妥当化では、データはまず、訓練セットと試験セットにランダムに分割される。ｋ倍交差妥当化を訓練セットで行い、一般化は未知の試験セットで得られる。
【００６６】
選別機の一般化性能は、試験セットにおいて、正しく分類された（真の陽性、ＴＰ及び真の陰性、ＴＮ）並びに間違って分類された（偽陽性、ＦＰ及び偽陰性、ＦＮ）事例の数を考慮することによって評価できる。感受性（ｓｅ）は、真の陽性の条件付き確率、ｓｅ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として、特異性（ｓｐ）は、真の陰性の条件付き確率、ｓｐ＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として、正確さ（ａｃ）は、正しい分類の比率、ａｃ＝（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＦＰ＋ＴＮ＋ＦＮ）として定義できる。選別機の真の陽性比（ｓｅ）及び偽陽性比（１−ｓｐ）によって表された選別機の性能は、レシーバーオペレーター曲線（ＲＯＣ）スペースにプロットできる。
【００６７】
選別機の一般化能力のロバスト予測は、試験付き１０倍交差妥当化の実施によって提供できる。例えば、訓練：試験が８０：２０の１００セットを、データセット全体において置換することなく、ランダムなサンプリングによって作出することができる。８０：２０の訓練：試験セットの各々に１０倍交差妥当化を訓練セットで実施し、最良の性能を有するパラメーターを選択する。１０のサブセットすべてにわたって最良のパラメーターでＳＶＭを再訓練でき、最終的な性能を試験セットにおいて評価する。標準偏差を有する平均曲線を示すために、各ＲＯＣ曲線を補整し、サンプリングし、平均化できる。
【００６８】
本発明はさらに、以下のステップを本質的に含む、コンピュータ実行のＴＢ診断法を提供する：
（ａ）対象における２種以上のマーカーの発現データを入力するステップ；及び
（ｂ）訓練されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）によってプログラムされたコンピュータシステムを用いて、前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定し；
それによって、前記患者がＴＢに罹患しているか否かを診断するステップ。
【００６９】
該発現データは、ＴＢ患者と対照対象とで差異的に発現する上記のマーカーなどの任意の２種以上のマーカーに関するものであり得る。一実施形態において、該発現データは、対象のサンプル、典型的には、ＳＥＬＤＩ分析により得られた血液サンプル、血漿サンプル又は血清サンプルからのプロテオミックなプロフィルである。
【００７０】
サポートベクターマシンは上記のとおり訓練され、好ましくは、Ｇａｕｓｓｉａｎカーネルサポートベクターマシンである。訓練されたサポートベクターマシンによりプログラムされたコンピュータシステムによって、対象からの発現データは、ＴＢに罹患している対象を示しているものとして、又はＴＢに罹患していない対象を示しているものとして分類される。したがって、該コンピュータシステムからの結果によって、ＴＢに罹患している、又はＴＢに罹患していないものとして、対象の診断が可能になる。
【００７１】
本発明の方法によるＴＢの診断に基づいて、さらなる処置が教唆され得る。本発明による診断方法はさらに、ＴＢに罹患していると診断された患者にＴＢを治療するための薬剤を投与することを含むことができる。ＴＢを治療するための薬剤は、治療的有効量で対象に投与された際、該対象の症状を軽減するか、或いは、該対象の苦痛を減少させる物質又は組成物である。該物質又は組成物は、例えば、結核菌の複製を妨げることによって、結核菌を殺すか、又は無能力化する薬剤であり得る。好適な薬剤としては、イソニアジド、リファンピン、ピラジナミド及びエタンブトールが挙げられる。正確な治療法は、個体の状態、例えば、個体が妊娠、ＨＩＶ血清陽性、糖尿病であるかどうかに依存し、医師によって容易に決定され得る。
【００７２】
本発明はさらに、以下のステップを本質的に含む、ＴＢを診断するためのサポートベクターマシン（ＳＶＭ）選別機を訓練する方法を提供する：
（ａ）（ｉ）ＴＢ患者の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ；及び
（ｉｉ）対照対象の第１のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する訓練データ
を含む訓練データを提供するステップ；
（ｂ）ＴＢ患者の訓練データを、対照対象の訓練データから識別するためにＳＶＭを使用し；
そのことにより、ＴＢを診断するためにＳＶＭを訓練するステップ。
該方法は任意に、以下を本質的にさらに含む：
（ｃ）（ｉ）ＴＢ患者の第２のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する試験データ；及び
（ｉｉ）対照対象の第２のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する試験データ
を含む試験データを提供すること；
（ｄ）ＴＢ患者の試験データを、対照対象の試験データから正しく識別するためにＳＶＭの能力を判定すること。
【００７３】
訓練データ及び試験データは、上記のものなど、任意の好適な方法によって得ることができる。
【００７４】
試験データは典型的に、ＳＶＭ選別機の感受性、特異性及び／又は正確さを判定するために用いられる。
【００７５】
本発明はさらに、本発明による診断方法を実施するように構成された装置を提供し、該装置は本質的に以下を含む：
（ｉ）対象のサンプルにおける２種以上のマーカーの発現データを受け入れるための手段；
（ｉｉ）前記データがＴＢを示しているかどうかを判定するためのモジュールであって、ＴＢ患者からのデータと対照対象からのデータとを識別することのできる訓練された機械学習選別機を含むモジュール；及び
（ｉｉｉ）前記判定の結果を表示する手段。
【００７６】
発現データを受け入れるための手段は、データを手動で入れることのできるキーボードであり得る。或いは、タンパク質チップ読取り機又は自動画像分析装置などの、発現データを解析しているコンピュータから、発現データを直接受け入れることができる。該発現データは、ワイヤ接続又はワイヤレス接続によって受け入れることができる。さらなる代替として、発現データは、該装置によって読取り可能な形態で保存媒体に記録することができる。該保存媒体は、該装置内に含まれる好適な読取り機内に配置できる。
【００７７】
ＴＢに関して試験中の対象からの訓練データ、試験データ及び／又は発現データは、生データであってもよいし、該コンピュータシステム内に入力される前に処理されてもよい。該コンピュータシステムは、生データをさらなる解析に好適な形態へと変換する手段を含み得る。
【００７８】
該データがＴＢを示しているかどうかを判定するためのモジュールは、機械学習選別機がＴＢ患者に特徴的な発現データを対照対象に特徴的な発現データから識別できるように本明細書に記載された方法によって訓練された、機械学習選別機を含む。
【００７９】
前記判定の結果を表示する手段は、ビジュアルスクリーン、オーディオ出力又はプリントアウトであり得る。これらの結果は典型的に、発現データの分類を示し、任意に、分類が正しいという確実度を示し得る。
【００８０】
本発明の装置は、パーソナルコンピュータであり得る。該パーソナルコンピュータは、ラップトップであり得る。或いは、該装置は手持ち型コンピュータ、例えば、野外で容易に携帯可能であるという利点を有する、特別にデザインされた手持ち型コンピュータであり得る。
【００８１】
本発明はさらに、コンピュータシステムによって実行可能なコンピュータプログラムであって、該コンピュータシステムによる実行の際、該コンピュータシステムに本発明による診断方法を実施させることができるコンピュータプログラムを提供する。該コンピュータプログラムは一般に、機械学習選別機、好ましくは、本明細書に記載されたとおり訓練されたサポートベクターマシンを含む。
【００８２】
本発明はさらに、本発明のコンピュータシステムコンピュータプログラムによって読取り可能な形態で保存する保存手段を提供する。ＣＤ−ＲＯＭ又はフロッピー（登録商標）デスクなどの任意の好適な保存媒体が使用できる。
【００８３】
さらなる一態様において、本発明は、ＴＢの診断に使用するためのキットを提供する。該キットは典型的に、本明細書に定義した２種以上のマーカーを検出するための手段を含む。該検出手段は典型的に、タンパク質チップ、又は抗体若しくは抗体断片などの特異的結合試薬のアレイなどの、本明細書に記載された捕捉表面を含む。該キットは、ラベル又は別個の挿入物の形態における操作に関する使用説明書を含み得る。例えば、該使用説明書は、サンプル採取の仕方、捕捉表面によるサンプルのインキュベーションの仕方及び／又はプローブの洗浄の仕方を、消費者に知らせることができる。該キットは、マーカーの発現データを本発明の装置内に入れる説明書を含み得る。該キットは本発明の保存媒体を含み得る。
【００８４】
該キットは、３種、４種、５種又は６種以上など、２種以上のマーカー、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、Ａｐｏ−Ａ１、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２の任意の組合せを検出するために適合化されることが好ましい。好ましい一実施形態において、該キットは、３種又は４種など、２種以上のマーカー、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ及びＳＡＡ、例えば、トランスシレチン、ネオプテリン及びＣＲＰの任意の組合せを検出するために適合化される。該キットは、これら４種の指定されたマーカー以外の追加マーカーを検出する能力があり得る。
【００８５】
該キットは、下表に挙げられた陽性マーカー及び／又は陰性マーカーを検出するために適合化される。
【００８６】
【表１】
【００８７】
本実施形態において、検出手段は好ましくはタンパク質チップである。
【００８８】
該キットは、容器内の１種以上のマーカーの１種以上のサンプルをさらに含み得る。該キットに提供されたマーカーは、対照として、又は検量用に使用できる。
【００８９】
本発明はまた、ＴＢ治療のための候補薬剤を同定するための方法を提供する。トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬのうちの１種以上の活性又は発現の改変における試験薬剤の活性に関して評価することによって、候補薬剤を同定できる。トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬの各々の生物学的活性は、当業界に知られている。したがって、当業者は、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬのいずれか１種の活性に及ぼす試験薬剤の効果を評価するために、容易にアッセイを実施できるであろう。
【００９０】
本発明の一実施形態において、結核菌に感染した細胞中の１種以上のＴＢマーカーの発現に及ぼす試験薬剤の効果を判定することによって、候補治療薬が同定できる。１種以上のＴＢマーカーは一般に、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される。１種以上のマーカーの発現における増加又は減少により、該試験薬剤がＴＢの治療に有用であることが示される。典型的に、該マーカーがＴＢの陽性マーカーである場合、ＴＢの治療に有用な試験薬剤は、該試験薬剤の不在下での感染細胞における該マーカーの発現レベルに比較して、該マーカーの発現レベルを減少させる。典型的に、該マーカーがＴＢの陰性マーカーである場合、ＴＢの治療に有用な試験薬剤は、該試験薬剤の不在下での感染細胞における該マーカーの発現レベルに比較して、該マーカーの発現レベルを増加させる。
【００９１】
該感染細胞は、インビボ又はエクスビボであり得る。該細胞がインビボである場合、それらは典型的に、実験動物、典型的には、マウス又はラットなどの齧歯類に存在する。該感染細胞は、結核菌が感染し得る任意の細胞であり得る。一実施形態において、該細胞は、呼吸器系の細胞であるか、又はそれ由来の細胞系である。
【００９２】
また、本発明の方法などによって同定される候補治療薬も本発明によって提供される。好適な候補治療薬としては、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬのうちの１種に特異的な抗体が挙げられる。
【００９３】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
患者並びに対照対象の選択
ＴＢ診断の新規アプローチを開発するために、本発明者らは、少なくとも４つの民族背景からの患者を代表する複数地域（英国、アンゴラ、ガンビア及びウガンダ）からの患者（ｎ＝１７９）及び対照（ｎ＝１７０）の血清を採集した（表１）。本発明者らは、肺疾患に典型的な症状（Ｒａｔｈｍａｎら、２００３年）を呈するＴＢ患者に限定した。これが、すべての地域における成人ＴＢの最もよく見られる呈示だからである。診断は結核菌の培養によって確認された。スミア陽性及びスミア陰性双方の患者並びに対照対象（ＨＩＶ状態を含む）を含む患者の詳細は、表１及び表２ａに与えられている。予想どおり、咳、発熱及び体重減少を呈した大方の患者は、空洞性肺疾患に罹患していた。
【００９５】
対照対象には、健康な志願者、並びにＴＢに重なり得る臨床的特徴を有する状態にある患者を採用した（表２ｂ）。本発明者らの対照対象は、標準的な診断基準によって確認された異種起源の炎症原因を有する。例えば、しばしば、肺ＴＢの差異的診断に含まれるサルコイドーシスに罹患している患者及び非結核性の破壊的な肺の病状にある患者を表している他の重篤な呼吸器感染を含めた。ＴＢに擬態し得る全身性炎症過程を考慮するため、他の全身性感染に罹患している患者、並びに炎症性腸疾患及び自己免疫疾患に罹患している患者を採用した。
【００９６】
（実施例２）
プロテオミックプロファイリング並びに監視付き機械学習分類
本発明者らはまず、これらの対象からの３４９の血清サンプルを、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ）による弱カチオン交換（ＣＭ１０）タンパク質チップアレイ上でプロファイルし（Ｉｓｓａｑら、２００２年；ｖｏｎ Ｅｇｇｅｌｉｎｇら、２００１年）、２，０００〜１００，０００の範囲におけるｍ／ｚスペクトルからの２１９のピーク集団を同定した。次いで、現状技術の監視付き機械学習分類法を用い（表３及び図４）、訓練−試験−セットアプローチを用いて、ＴＢに罹患している患者のプロテオミックスペクトルを、対照から識別した（表１）。試験セットにおけるデータを正しく識別する選別機の能力は、選別機の一般化性能として知られている（Ｖａｐｎｉｋ、１９９８年；Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ及びＳｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ、２０００年）。種々の選別機の一般化性能を、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）スペースにおいて異なる試験セットに対するそれらの性能をプロットすることによって比較した。
【００９７】
当該試験において、ＳＬＰは最適識別機能を提供することなく、独立した試験セットにおいて、８６．５％の正確さを与えた（表３）。本発明者らのデータでは、ＭＬＰはＳＬＰと同様な一般化性能を示し、分類の正確さは８６．５％であった（表３）。ＴＢのデータセット対対照のデータセット（表２）において、ＡＤＴｒｅｅ及びＣ４．５選別機は、それぞれ、９２．３％と９１．０％の正確さに達した（表３）が、このような一般化レベルに達するには、ＡｄａＢｏｏｓｔ増強に依存した（Ｗｉｔｔｅｎ及びＦｒａｎｋ、２０００年）（表３）。本発明者らは、ＡＤＴｒｅｅ及びＣ４．５選別機に関して、ＡｄａＢｏｏｓｔを１００回反復して用い、Ｃ５．０選別機の非市販型に関しては、最高１０回反復して増強した。
【００９８】
ガウスカーネルサポートベクターマシン（Ｂｏｓｅｒら、１９９２年；Ｖａｐｎｉｋ、１９９８年；Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ及びＳｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ、２０００年）（ＳＶＭ、表３）は、９３．５％の感受性及び９４．９％の特異性（全体的な正確さは９４．２％）を有する、ＴＢ群と対照群との間の最良の識別装置である。試験セット中、５つのＴＢサンプル及び４つの対照サンプルが間違って分類された。このＳＶＭ選別機は、ＲＯＣスペースの凸閉包を規定し、最良の正確さを達成する。
【００９９】
スペクトルのセット全体（訓練及び試験の双方）に対して、１０倍交差妥当化の実施によるＳＶＭの一般化性能のさらなる試験を適用し、正確さに関して最適化した場合、９３．１±３．８％の正確さ、９４．４±４．５％の感受性及び９１．８±８．８％の特異性を得た。本発明者らはまた、訓練事例：試験事例の比率を、９０：１０から５０：５０に変えることによって、ＳＶＭの一般化性能を評価した。８０：２０のセットでは、９０％超の正確さ、感受性及び特異性の値が得られた。ＳＶＭのロバストネスをさらに、０．９６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有するＲＯＣ曲線に示されるように、１００のランダムに作出した８０：２０のセットにおける平均性能によって確認した。図５は、１０倍トレーン交差妥当化試験を用いた平均ＲＯＣを示している。図５ａでは、カーネルパラメーターは感受性のみについて選択され、図５ｂでは、カーネルパラメーターは、特異性基準について選択されている。
【０１００】
対照群を意図的に異種起源としたが、当該選別機は、ＴＢに罹患している患者（スミア陰性とスミア陽性の双方）と感染性及び非感染性の炎症状態の種類に罹患している患者との間を正確に識別する。これらの結果は、ＴＢがプロテオミックな識別特性をベースにした診断アプローチで調べることができることを示している。サンプルの採集、取り扱い又はスペクトル生成に関連したアーチファクトにより、偽の分類を生じさせる可能性はある。しかし、６カ月間にわたってＴＢ患者と対照対象のサンプル処理を分散させ、４つの異なる地域からのサンプルを使用し、ＨＩＶ血清状態を変化させたことから、患者と対照対象との間の体系的な偏りの可能性はきわめて低くされている。質量スペクトルの再現性の目安として、６カ月間にわたる種々の時点で操作された２８の汎発対照スペクトルが、１０倍交差妥当化で得られたＳＶＭ選別機により対照対象として正しく分類された。呼吸器の症状を呈する患者におけるＴＢの罹患率がおよそ１０％である臨床集団において、本発明者らの最良の選別機に関する陽性及び陰性の予測値は、それぞれ、６７％と９９％となるであろう。この診断正確性は、他の入手可能な診断オプションの診断正確性に優っている。
【０１０１】
（実施例３）
マーカーの選択
しかしながら、ＳＥＬＤＩ法が報知的な識別特性を構成するタンパク質の同一性について先立つ仮定をしないＴＢに対する診断試験を提供できる一方、コスト及び複雑さによって、その広範な一般的使用が妨げられることがあり得る。したがって、本発明者らは、独立して報知的なピークを検出するために、相関フィルター法を適用することによって、さらなる評価のための報知的ピーク集団のサブセットを選択した（Ｇｕｙｏｎ及びＥｌｉｓｅｅｆｆ、２００３年）。最高陽性の１０の質量集団、最高陰性の１０の質量集団、ピヤソン相関係数を評価した。これらのマーカーのｍ／ｚ値は、下表に示されている。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
選択された２０の質量集団の識別力を試験するために、本発明者らはまず、各質量を１つおきに対にして（４００対）、ＳＶＭ選別機にＴＢ患者を診断させる訓練をした。結果は表４に示されている。正確さによって一般化性能を評価し、選択された質量集団の２０対（５％）、並びに、これらの負の相関及び正の相関の質量集団組合せのうちの１７が８０％超の正確さを与えることを示した。感受性及び特異性が、それぞれ、９５％と８５％超に達した質量集団の対はなく、良好な一般化は、２つ超の質量ピークの組合せに依存することが確認された。第２に、丁度２０の相関選択された質量集団によって訓練されたＳＶＭは、独立試験セットにおいて、８９．７％の正確さを達成し、これらの集団が最も関連性のある識別情報を含むことを示した。残りのピーク集団（ｎ＝１９９）は、許容できる診断正確性（８５．９％）ではあったが、下位を保っている。本発明者らは、種々の質量集団セットを用いて、ＲＯＣスペースにおけるＳＶＭｓの一般化性能をまとめた。ＲＯＣ凸閉包は、２つの選別機によって規定される。最高の特異性は、正に相関しているすべてのピークマイナス１０（即ち、合計２０９）で得られ、負の相関ピークにおける情報値が確認された。他の最適選別機は、質量集団の１０の正の相関サブセット及び１０の負の相関サブセットのみを使用した後に得られた。
【０１０４】
（実施例４）
マーカーの同定
トリプシン消化後、高分解能質量分光器を用いて、本発明者らは、１１．５ｋＤａの「陽性」マーカー及び１３．７ｋＤａの「陰性」マーカーを、それぞれ、血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）のｄｅｓ−アルギニン変異体及びトランスシレチンとして同定した。興味深いことに、ピヤソン相関分析によって選択され、プロテオミックな識別特性のＳＶＭ分類によって確認されたこれらのペプチドは、ＴＢにおける病態生理学的過程にすでに独立して関連していた。ＳＡＡは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の循環（Ｋｉｅｒｎａｎら、２００３年）及び脂質輸送の調整並びに免疫応答に関連した急性相タンパク質である。それは、反応性アミロイドーシスにおける前駆体タンパク質であり、一部の個体において慢性ＴＢを複雑化させ、また、結核などのいくつかの炎症状態における疾患活性のマーカーである（Ｓａｌａｚａｒら、２００１年）。トランスシレチンは、血清中、５５ｋＤａのホモテトラマーであり、チロキシン及びトリ−ヨードチロニン、並びにレチノール結合タンパク質との結合を介したビタミンＡ（レチノール又はトランスレチノイン酸）の主要なトランスポーターである（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、１９７１年）。レチノイン酸は、単球の分化を刺激し、ヒトマクロファージにおける結核菌の増殖を阻害する（Ｃｒｏｗｌｅら、１９８９年）。トランスシレチンの減少及びＣ反応性タンパク質濃度の上昇とビタミンＡの低濃度が相関していることが、ＴＢに罹患している患者において報告されている（Ｈａｎｅｋｏｍら、１９９７年；Ｋｏｙａｎａｇｉら、２００４年）。
【０１０５】
（実施例５）
免疫アッセイ試験並びに監視付き機械学習分類
プロテオミックな識別特性から慣例的な試験様式へ翻訳するために、すべての対象において免疫アッセイにより血清ＳＡＡ及びトランスシレチンを定量化した。双方のペプチドとも炎症のマーカーであるため、ＴＢにおける疾患活性をモニターするために以前使用された（Ｈｏｓｐら、１９９７年）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びネオプテリンもまた測定した。次いで、これら４種のマーカーに関して多名のガウスカーナルＳＶＭｓをパラメーター化した。ガウスＳＶＭｓを用いて、４つの最良の選別機を得た。トランスシレチン、ＣＲＰ及びネオプテリン値によって訓練されたＳＶＭ選別機は、ＴＢ患者を対照患者から、８４％の正確さで（８２％の感受性、８６％の特異性）識別した。他の最適化された選別機はトランスシレチンを含み、トランスシレチン及びネオプテリンを用いたＳＡＡ及びＣＲＰによるものであった。元の識別特性に追加のマーカーを含めることにより、免疫アッセイベースの分類の正確さが改善される可能性が高い。
【０１０６】
トランスシレチンの切断形態は、卵巣癌に対するプロテオミックなフィンガープリント試験における陰性マーカーであり（Ｚｈａｎｇら、２００４年）ＳＡＡは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）における陽性マーカーであり（Ｒｅｎら、２００４年）、鼻咽頭癌における再発を示す（Ｃｈｏら、２００４年）。単一のタンパク質マーカーは、ＴＢの診断において正確さが不十分であり得るが、ＳＶＭなどの機械学習方法と合せたプロテオーム誘導分析は、現行の標準的方法より優れた正確さを達成し得る。これらの所見により、個々の診断特異性の低いマーカーが特定の組合せで使用されると診断成果が増強され得ることが示唆される。いくつかの場合、一般的な血漿タンパク質の切断化又は断片化誘導体が、いくつかの疾患のより特異的マーカーであり得、限定された疾患状態に特徴的なタンパク質分解酵素の誘導によって生じ得る（Ｔｏｌｓｏｎら、２００４年）。プロテオミックな識別特性から免疫アッセイに翻訳する際の高い診断正確性の保持、及び同定されたバイオマーカーの生物学的妥当性により、ＴＢ診断に対するＳＶＭ選別機の価値が確立され、血清学的試験のための強力な基礎が提供されている。パーソナルコンピュータに訓練されたＳＶＭ選別機を備えることにより、免疫アッセイ（又は、入手可能な場合は、ＳＥＬＤＩプロテオミック分析）を用いてＴＢの診断を補助する機会が提供される。次いで、これらの試験を、ＴＢの長期的試験及び喀痰陰性ＴＢ、肺外の事例及び小児科感染症などの他の診断困難な範囲に適用することができる。
【０１０７】
（実施例６）
材料及び方法
血清の採集及び保存。血清サンプル（１７９）は、遡及的に確認された培養陽性ＴＢの患者から採集した（表２）。ウガンダ及びガンビアで採集されたバンク血清は、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ＴＢ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｔｄｒ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｔｂ／ｓｐｅｃｉｍｅｎ．ｈｔｍ）から入手し、他のものは、英国、ロンドンのＳｔ．Ｇｅｏｒｇｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおける入院及び外来施設でＴＢを呈する患者から予測的に採集した。他の炎症状態の範囲の対照患者からの血清サンプル（１７０）は、英国のＳｔ．Ｇｅｏｒｇｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、アンゴラ及びガンビアのｔｈｅ Ａｎｇｏｔｒｉｐ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｅｎｔｒｅで採集した。各々の場合に、地域の研究倫理委員会の方針に従って、十分なインフォームドコンセントを得た。臨床情報は、連結され、匿名化されたデータベースにおいて保管された。５ｍｌの血液から、遠心分離により血清を分離し、サンプルを滅菌ガラス管中、室温で３０分間、凝血させた。アリコート（１００μｌ）を採集１時間以内に凍結させ（−８０℃）、質量分析前、２回のみの凍結−解凍サイクルに供した。
【０１０８】
質量分析のためのサンプル調製。サンプルを、以前記載されたとおり（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓら、２００４年）ＣＭ１０タンパク質チップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、フレモント、カリフォルニア州、米国）に適用し、５０％アセトニトリル、０．５％トリフルオロ酢酸中、シナピン酸の飽和溶液を、アレイ上の各スポットに２回適用し、各適用の間は風乾した。偏りを最小化するために、ＴＢ患者の血清と対照とは、同一のチップ上でアッセイした。
【０１０９】
表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ）。２００、２２０及び２４０のレーザー強度、高質量１００ｋＤａ、検出器感度８及び焦点質量１０ｋＤａで、ＰＢＳ−ＩＩ質量分析器（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、フリーモント、カリフォルニア州、米国）を用いて、飛行時間スペクトルを生じさせた。アレイ上の各スポットの位置２０から８０、デルタ４を、２０５、２２５又は２４５のレーザー強度で、２回のウォーミングショットで進行させ、１箇所当たり７ショットで分析した。各タンパク質チップアレイは、「汎用対照」サンプル（１個体からの１回の採集からアリコート化し、−８０℃で保存）を含んだ。双方のスペクトル群（ＴＢ及び対照）とも６カ月間にわたって種々の機会に扱われたサンプルを含んだ。
【０１１０】
ピークの同定。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎのオールインワンタンパク質及びペプチド検量体を用いて、スペクトルを毎週検量し、ベースライン減算後、２，０００〜１００，０００にわたるｍ／ｚ範囲において総イオン流に対して正規化した。各タンパク質に関して、２００、２２０又は２４０のレーザー強度で生じた単一のスペクトルを選択して、以前に記載されたとおり（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓら、２００４年）全患者の平均の０．４〜０．６倍以内に総イオン流の偏差を最小化した。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｉｚａｒｄ型３．１を用いて、分子質量の０．６％以内の各スペクトル（「ピーク集団」）における対応するピークを同定した。シグナル対ノイズ比を、最初のパスでは１０に設定し、第２のパスでは２に設定した。再現性を評価するために、２５回操作した（６アッセイ）単一サンプル由来のスペクトルに関するピークサイズの変動係数は、１５．６％（アッセイ内）及び２４．４％（アッセイ間）であった。これらのデータは、以下のｍ／ｚ値：５６４８、６２０３、６４４９、６６４７、８９０７、９２１３、９３１０、９３７０及び９４１９における９つの最高幅ピークに関する値を平均化することによって得られた。
【０１１１】
タンパク質の同定。５０μｌの結合緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ９．０中、１：９希釈した変性緩衝液）に希釈した３０μｌの変性緩衝液により、血清（２０μｌ）を氷上で（２０分）インキュベートし、その後さらに３０分、氷上でインキュベートした。最初はトリス（５０ｍＭ、ｐＨ９）、その後結合緩衝液中で予備平衡化したＱ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ スピンカラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、２０分）に適用した。１１．５ｋＤａ及び１３．７ｋＤａのバイオマーカー双方が、スピンカラムから溶出緩衝液（５０ｍＭのクエン酸Ｎａ、０．１％オクチルグルコピラノシド、ｐＨ３）中に溶出し、選択的濃縮化は、未分画血清に関する上記の条件下でＣＭ１０タンパク質チップアレイに適用した溶出物サンプルのＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ分析によって確認した。
【０１１２】
該バイオマーカーは、１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ、４〜１２％のＢｉｓ−トリス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により単離し、クーマシーブルーで染色し、ゲルから切り出した。該ゲル片を重炭酸アンモニウム（５０ｍＭ）とアセトニトリル（５０％）の混合液中、３回洗浄し、アセトニトリル（１００％）中、脱水し、乾燥した。
【０１１３】
アセトニトリル（１０％）及び重炭酸アンモニウム（２５ｍＭ）中、トリプシン（２０ｎｇ／μｌ）の添加により、タンパク質をゲル内消化（１５分、室温）に供した後、重炭酸アンモニウム（２５ｍＭ）中、４時間、最終インキュベーションに供した。
【０１１４】
マトリックスとして２０％α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳにより、該消化物のペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦｓ）を分析した。ゲル内トリプシン消化の結果を、ゲルから該タンパク質受動溶出後のトリプシン消化により実証した。
【０１１５】
ＭＡＳＣＯＴデータベースを識別するためにＰＭＦｓを用い、ある場合には血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）由来、他の場合にはトランスシレチン由来としてペプチドを同定した。トランスシレチンとして同定されたタンパク質に関する質量スペクトル（１３．７ｋＤａ）で見られた分子量は、このタンパク質の理論値（１３．７６ｋＤａ）に密接に相当した。しかし、ＳＡＡ１に関して見られたもの（１１．５２ｋＤａ）は、その理論値（１１．６８ｋＤａ）より１５６Ｄａ低く、このタンパク質がＳＡＡ１変異体であることを示唆していた。
【０１１６】
この変異体の性質を調べるために、トリプシン消化物をより詳細に分析し、ＳＡＡ１の完全アミノ酸配列から予測されたトリプシンペプチドに相当しないｍ／ｚ１５５１におけるペプチドを含むことを見出した。しかし、それは、Ｎ末端のアルギニンの欠失から生じたと考えられる２〜１５のペプチド（ＳＦＦＳＦＬＧＥＡＦＤＧＡＲ）には相当した。
【０１１７】
バイオマーカーの免疫定量化。検出に用いられた各マーカー及び抗体タイプに関する下限検出は、以下のとおりであった：粒子増強ヒツジ抗ＳＡＡでは０．７ｍｇ／ｌＳＡＡ、ヤギ抗ＣＲＰでは、１ｍｇ／ｌ、ヤギ抗トランスシレチンでは、０．０５ｇ／ｌトランスシレチン、及びウサギ抗ネオプテリンでは、１．５ｎｍｏｌ／ｌネオプテリン。ネオプテリンは、Ｔｒｉｔｕｒｕｓ分析装置（Ｇｒｉｆｏｌｓ ＵＫ社）において、キット（ＥＬＩｔｅｓｔ Ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ、Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ、アクチーンゲゼルシャフト、ドイツ国）を用い、競合的ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃ反応性タンパク質、トランスシレチンの測定（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｉｍｍａｇｅ８００分析装置、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＵＫ社）及び血清アミロイドＡの測定（Ｎ ｌａｔｅｘ ＳＡＡ、ＢＮＩＩ分析装置、Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、マールブルグ、ドイツ国）には、比率比濁分析を用いた。ＳＡＡアッセイに用いられた抗体は、総ＳＡＡを検出する。ＥＬＩＳＡｓからの値は、ＳＶＭ分類実験に使用する前に、０〜１の範囲に等級化し、可能なすべての組合せを特徴スペースとして用いた。
【０１１８】
監視付き機械学習。データセットＤは、入力ベクトル、Ｘ（即ち、カテゴリーの典型）のサンプルとそれらに対応する出力ラベル、Ｙ，Ｄ＝［Ｘ，Ｙ］のサンプルによって表される。サンプル入力ベクトルはｘによって表される。ｉ番目のサンプルの質量スペクトルは、ｎ次元（質量集団の数）のベクトルｘｉと関連クラスラベルのｙｉ（ＴＢでは＋１、対照では−１）として表され、式中、ｉ＝１，．．．，ｍ及びｍはサンプルの数である。スペクトルのベクトル要素は、ｘｉ，ｋによって表され、式中、ｉ＝１，．．．，ｍであり、ｋ＝１，．．．，ｎである。サンプルクラスラベルｙｉの選別機予測は、
【数１３】
として表される。
【０１１９】
監視付き学習演算法の課題は、訓練データと称される、実施例の入力／出力対のセットに関する正しいラベル割り当てのできる決定関数を見出すことである。未知のサンプル（試験データ）に関する正しいラベルを予測する決定関数の能力は、その一般化として知られている。現行のＳＶＭなどの機械学習法は、この性質の最適化を目指している。選別機の一般化は、性能を最適化するために選択しなければならないパラメーターセット（モデル）に依存している。この目的のために、本発明者らは、ある範囲のパラメーター値が打ち切られ、交差妥当化を用いて試験されるグリッド探索法を採用した。
【０１２０】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、その入力を高い、又はさらに無限の次元特徴スペースにマップ化する（Ｖａｐｎｉｋら、１９９８年；Ａｒｏｎｓｚａｊｎ、１９５０年）。次いで、ＳＶＭの出力は、特徴スペースにおいてマップ化された入力の線形閾値化関数であるが、これは、元の入力空間では非線形であり得る。マッピングは、使用者選択再生カーネル関数Ｋ（ｘ，ｘ’）によって達成され、式中、ｘ及びｘ’は入力ベクトルである。カーネル関数は、マーサー条件（Ｊｏａｃｈｉｍｓ、１９９９年）を満たさなければならない。カーネルのよく知られた例としては、ガウスの
【数１４】
が挙げられ、式中、パラメーターσは幅を決定し；ポリノミナルＫ（ｘ，ｘ’）＝（ｘ・ｘ’）ｄであり、式中、ｄは次数を決定する。ｄ＝１の場合、線形カーネルと呼ばれ、入力データのアイデンティティーマップに対応する。訓練されたＳＶＭ選別機は、
【数１５】
の形態を有し、訓練により、α及びｂの値が決定する。典型的には、αの多くはゼロである。非ゼロのものは「サポートベクター」と呼ばれ、変換特徴スペースにおける分離超平面を規定するために用いられる。ＳＶＭの訓練は、多層パーセプトロンとは異なり、局所最小に供されないコンベックス（二次）最適化問題である。ＳＶＭを訓練するために入手できる多くのパッケージがあり；ＳＶＭｌｉｇｈｔ（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ、１９６２年）が用いられ、特に、データに雑音がある場合に実用可能なソフト限界ＳＶＭｓが訓練される。この場合、該演算により、間違って分類された実施例の距離は、ソフト限界パラメーターと呼ばれるペナルティー値、Ｃを調節することで、限界まで最小化される。
【０１２１】
本発明者らは２つの交差妥当化方式を用いた。ｋ倍交差妥当化では、訓練セットを、等しく分散された陽性事例及び陰性事例のｋ群に、ランダムに分割する。選別機をｋ−１で訓練し、その一般化性能を、残りの群で妥当化する。この処理をｋ回反復し、各々の回で異なる検証サブセットが提供されるが、その平均が全体的な一般化を表す。第２の方式、試験によるｋ倍交差妥当化では、データはまず、訓練セットと試験セットにランダムに分割される。ｋ倍交差妥当化を訓練セットで行い、一般化は未知の試験セットで得られる。
【０１２２】
選別機の一般化性能は、試験セットにおいて、正しく分類された（真の陽性、ＴＰ及び真の陰性、ＴＮ）並びに間違って分類された（偽陽性、ＦＰ及び偽陰性、ＦＮ）事例の数を考慮することによって評価した。感受性（ｓｅ）は、真の陽性の条件付き確率、ｓｅ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として、特異性（ｓｐ）は、真の陰性の条件付き確率、ｓｐ＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として、正確さ（ａｃ）は、正しい分類の比率、ａｃ＝（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＦＰ＋ＴＮ＋ＦＮ）として定義した。選別機の真の陽性比（ｓｅ）及び偽陽性比（１−ｓｐ）によって表された選別機の性能は、レシーバーオペレーター曲線（ＲＯＣ）スペースにプロットできる。
【０１２３】
各セットに、ＴＢ患者と対照の同様な数、並びに同様な年齢と性別の表示を有する独立した訓練セットと試験セットを作出した（表１）。これらのセットを用いて、単層パーセプトロン（ＳＬＰ）（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ及びＲｕｍｅｌｌｈａｒｔ、１９８６年）、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）（Ｑｕｉｎｌａｎら、１９９３年）、ツリー選別機（Ｆｒｅｕｎｄ及びＭａｓｏｎ、１９９９年；Ｆｒｅｕｎｄ及びＳｃｈａｐｉｒｅ、１９９６年及びＷｉｔｔｅｎ及びＦｒａｎｋ、２０００年）及びサポートベクターマシンなどのいくつかの監視付き機械学習法の一般化性能を評価した（表３）。
【０１２４】
選別機の一般化能力のロバスト予測を提供するために、試験による１０倍交差妥当化を実施した。まず、訓練セット：試験セットが８０：２０である１００セットを、データセット全体において置換することなく、ランダムなサンプリングによって作出した。８０：２０の訓練セット：試験セットの各々に１０倍交差妥当化を実施し、最良の性能を有するパラメーターを選択する。１０のサブセットすべてにわたって最良のパラメーターでＳＶＭを再訓練し、最終的な性能を試験セットで評価する。これらの実験では、標準偏差を有する平均曲線を示すために、各ＲＯＣ曲線を補整し、サンプリングし、平均化する。
【０１２５】
質量ピーク集団の選択。ピークをそれらの識別力に関して等級付けするために、ピヤソン相関係数を用いた。ピヤソン相関係数は、
【数１６】
として定義され、式中、Ｘｋは、サンプル入力ベクトルｘのｋ番目の成分に相当するランダムな変数であり、Ｙは、出力ラベルのランダムな変数である。
Ｒ（ｋ）の予測は、
【数１７】
によって与えられ、式中、ｘｉ，ｋはサンプルｉの質量集団ｋのｍ／ｚ値に相当し、ｙｉはサンプルｉのクラスラベルであり、ｍはサンプルの数である。Ｒ（ｉ）は、変数の有意性を評価するための試験統計値であり得、それはｔ検定に関連する。訓練セットにわたって、各質量集団の値と対応するクラスラベルとの間で
【数１８】
を算出した（表１）。次いで、正及び負に相関した質量集団を等級付けするために、
【数１９】
を用いた。このアプローチを用いて、最高に正の、及び最高に負の相関係数を有する１０の質量集団を選択した。選別機によって見出された決定境界及び特徴スペースにおける識別質量集団対は、図２ａ（緑色線）に示されている。
【０１２６】
ソフトウェア。本発明者らは、サポートベクターマシンＳＶＭｌｉｇｈｔのチャンキング及び分解実行を用いた。デシジョンツリー演算、増強及びＭＬＰのために、Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＷＥＫＡ）に関するＷａｉｋａｔｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔを用いた。実験フレームワークは、ＭＡＴＬＡＢ及びＪａｖａ（登録商標）においてコード化された。カスタムで再使用可能な目標指向型データベースを、ＯｂｊｅｃｔＤＢを用いて作出し、実験フレームワークにインターフェースさせた。ＳＶＭｌｉｇｈｔに対するＭＡＴＬＡＢインターフェースは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｇｉ．ｔｕｇｒａｚ．ａｔ／ａｓｃｈｗａｉｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌ．から入手した。
【０１２７】
（実施例７）
ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ／ＭＳにより同定されたマーカーの同一性の割り当て
結核に罹患している患者の血清を、正常な個体の血清から識別することのできるものとして、ＳＥＬＤＩ−Ｔｏｆ／ＭＳにより同定されたタンパク質バイオマーカーに同一性を割り当てるために、ＴＢに罹患している２０人の患者からの血清のプール及び２０人の健康な対照からの血清の第２のプールを作出した。これらを２Ｄゲル電気泳動により分離した。バイオマーカーのＳＥＬＤＩピーク質量を２Ｄゲル内のタンパク質スポット質量にマッチさせるために、各スポットが切り出された第２の２Ｄゲルを操作し、そこからタンパク質を受動溶出させて完全長タンパク質の溶液を生成させた。完全長タンパク質の溶液をＳＥＬＤＩ−Ｔｏｆ／ＭＳにより分析し、単一ピークを有するスペクトルを生じさせた。次いで、この質量を、元のＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ／ＭＳバイオマーカー質量リストと比較した。２つのＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ／ＭＳ質量間のマッチによって、そのゲルスポットは、ＳＥＬＤＩ−Ｔｏｆ／ＭＳバイオマーカーピークに相当するものとして同定される。
【０１２８】
マッチする２Ｄゲルからのゲルスポットを取り出し、トリプシンでゲル内消化して、そのタンパク質診断用のペプチド混合物を生じさせる。次いで、この混合物を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析して、ゲノムデータベースのＢＬＡＳＴ探索に基づいた同一性の高確率予測を与えた。
【０１２９】
表５に示されるように、この方法で３つのバイオマーカーが明確に同定された。１８３９４のｍ／ｚ値を有するＴＢマーカーは、血清アルブミン前駆体であり、１１４５４のｍ／ｚ値を有するＴＢマーカーは、Ａｐｏ−Ａ１であり、１３７７４のｍ／ｚ値を有するＴＢマーカーは、トランスシレチンである。
【０１３０】
（実施例８）
さらなるマーカーの同定
ＴＢ患者及び対照対象からの血清タンパク質を含有する２Ｄゲルの分析により、ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦによって同定されたマーカーに対応すると思われないいくつかのタンパク質は、ＴＢ血清と対照対象の血清とでは差異的に存在することが判明した。該タンパク質スポットを取り出し、トリプシンでゲル内消化し、そのタンパク質診断用のペプチド混合物を生じさせることによって、該タンパク質を同定した。次いで、この混合物を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析して、ゲノムデータベースのＢＬＡＳＴ探索に基づいた同一性の高確率予測を与えた。同定されたさらなるマーカーは、アポリポタンパク質−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ又はＬＲＧ１）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２であった。
【０１３１】
この分析の結果は、表６に示されている。表６から分かるように、トランスシレチンは、対照ゲルとＴＢゲルの双方から同定された。しかし、トランスシレチンは、対照ゲルに比較して、ＴＢゲルでの発現は低レベルであり、トランスシレチンはＴＢの陰性マーカーであることが確認された。同様に、Ａｐｏ−Ａ２の発現は、対照ゲルに比較して、ＴＢゲルではより低いので、Ａｐｏ−Ａ２は、ＴＢの陰性マーカーである。同様に、ハプトグロビン及びヘモグロビンベータは双方とも、対照ゲルに比較して、ＴＢゲルでの発現はより低レベルであるので、ＴＢの陰性マーカーである。一方、Ａ２ＧＬ（ＬＲＧ１）及びＤＥＰドメインタンパク質は、対照ゲルに比較して、ＴＢゲルではアップレギュレートするので、ＴＢの陽性マーカーである。
【０１３２】
仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２は、対照ゲルにのみ見られたので、ＴＢの陰性マーカーである。
【０１３３】
（参考文献）
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
【表５】
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
【表８】
太字は、該タンパク質スポットが他のゲルにおける等価なスポットよりも強かったことを表している。
イタリック文字は、該タンパク質スポットが他のゲルにおける等価なスポットよりも弱かったことを表している。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】機械学習選別機を訓練する方法のフローチャートを示す図である。
【図２】訓練された機械学習選別機を試験する方法のフローチャートを示す図である。
【図３】訓練された機械学習選別機を用いて、対象がＴＢに罹患しているか否かを判定する方法のフローチャートを示す図である。
【図４】選別機（表３のＳＶＭ＿１）のガウスカーネルシグマ値のパラメーター化を示す図であり、ガウスＳＶＭは、すべての質量ピーク集団を用いて、最初の訓練セット（表２）によって訓練し（パラメーター選択に関しては１０倍交差妥当化）、次いで、最初の試験セット（表２）で、選別機の性能を評価した図である。
【図５】１０倍訓練交差妥当化試験を用いて平均化したＲＯＣを示す図であり、訓練：試験比（８０：２０）で、１００のランダムに選択した訓練セット及び試験セットを作出し、パラメーターは、訓練セットで１０倍交差妥当化を用いて選択し、性能は対応する試験セットで得た図である。ａ）上部の線は、カーネルパラメーターが感受性基準に基づいて選択される場合に得られた選別機の平均ＲＯＣ曲線を示す。ｂ）上部の線は、カーネルパラメーターが特異性基準に基づいて選択される場合に得られた選別機の平均ＲＯＣ曲線を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；並びに
（ｉｉ）前記発現データを、ＴＢ以外の炎症性状態に罹患している患者を含む対照患者の群からの前記マーカーの発現データと比較し、それによって、前記試験対象がＴＢに罹患しているかどうかを判定すること
を含む、試験対象における結核（ＴＢ）を診断する方法。
【請求項２】
前記対照対象の群が、呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの２種以上から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；並びに
（ｉｉ）前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること
を含む、結核（ＴＢ）を診断する方法。
【請求項４】
前記マーカーの１種がトランスシレチンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーが、トランスシレチン、ＣＲＰ及びネオプテリンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉｉ）がコンピュータシステムを用いて実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記コンピュータシステムが、訓練された機械学習選別機によりプログラムされる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記機械学習選別機がサポートベクターマシン（ＳＶＭ）である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉｉ）が、前記対象における前記マーカーの発現を、対照対象における前記マーカーの発現と比較することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項１０】
前記対照対象がＴＢ以外の炎症性状態に罹患している患者である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記対照対象が、呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの１種以上から選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｉｉ）が、前記対象における前記マーカーの発現を、ＴＢ患者における前記マーカーの発現と比較することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＢ患者が、結核菌の培養によって、ＴＢに罹患していると診断された患者である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
１種以上のＴＢ患者、及び／又は１種以上の対照対象がＨＩＶ陽性である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーが、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン及びＡｐｏ−Ａ１の２種以上、並びにアポリポタンパク質−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２の１種以上を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現データが、表面上の前記マーカーの捕捉及び前記捕捉されたマーカーの検出によって得られる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面が表面増強レーザー脱離及びイオン化（ＳＥＬＤＩ）プローブであり、前記検出が、ＳＥＬＤＩ−飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ）によるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記マーカーが、約Ｍ１８３９４＿９、約Ｍ８９５２＿７５、約Ｍ１１７２０＿０、約Ｍ１１４５４＿１、約Ｍ１８５９１＿２、約Ｍ１１４８８＿１、約Ｍ９０７６＿６８、約Ｍ８８９５＿１３及び約Ｍ１０８５６＿８のｍ／ｚ値を有する正相関するマーカーの１種以上及び／又は約Ｍ４１００＿０３、約Ｍ３８９８＿５２、約Ｍ１３９７２＿１、約Ｍ３３２２＿０１、約Ｍ２９５６＿４５、約Ｍ５６４４＿９６、約Ｍ３９３９＿６３、約Ｍ４０５６＿３９及び約Ｍ６６４９＿７４のｍ／ｚ値を有する負相関するマーカーの１種以上を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記マーカーが、前記正相関するマーカーのすべて及び／又は前記負に関連するマーカーのすべてを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記表面が前記マーカーに対する特異的結合試薬を含み、前記検出が免疫アッセイによるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）対象における２種以上のマーカーの発現データを入力すること；及び
（ｉｉ）訓練されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）によってプログラムされたコンピュータシステムを用いて前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること、
を含み、それによって、前記患者がＴＢに罹患しているかどうかを診断する、コンピュータにより実施されるＴＢを診断する方法。
【請求項２２】
結核菌の培養によりＴＢに罹患していると診断された患者、並びに呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの１種以上から選択された対照対象から得られたデータを用いて前記ＳＶＭが訓練された、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）（ａ）結核（ＴＢ）患者の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ；及び
（ｂ）対照対象の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ、
を含む訓練データを提供すること；
（ｉｉ）ＴＢ患者の訓練データを、対照対象の訓練データから識別するためにサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用すること、
を含み、そのことにより、ＴＢを診断するためにＳＶＭを訓練する、ＴＢを診断するためにＳＶＭ選別機を訓練する方法。
【請求項２４】
（ｉｉｉ）（ａ）ＴＢ患者の第２のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する試験データ；及び
（ｂ）対照対象の第２のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する試験データ、
を含む試験データを提供すること；
（ｉｖ）ＴＢ患者の試験データを、対照対象の試験データから正しく識別するためにＳＶＭの能力を判定すること、
をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記対照対象が、呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの１種以上から選択される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記訓練データ及び前記試験データがＳＥＬＤＩ解析によって得られる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記訓練データ及び前記試験データが免疫アッセイ分析によって得られる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記マーカーの少なくとも１種が、ＣＲＰ、ネオプテリン、ＳＡＡ、トランスシレチン、血清アルブミン及びＡｐｏ−Ａ１から選択される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記マーカーが、ＣＲＰ、トランスシレチン及びネオプテリンを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記マーカーの少なくとも１種が、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
（ｉ）対象のサンプル中の２種以上のマーカーの発現データを受け入れる手段；
（ｉｉ）前記データがＴＢを示しているかどうかを判定するモジュールであって、ＴＢ患者のデータを、対照対象のデータから識別することのできる訓練された機械学習選別機を含むモジュール；及び
（ｉｉｉ）前記判定の結果を表示する手段、
を含む、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された装置。
【請求項３２】
パーソナルコンピュータである、請求項３１記載の装置。
【請求項３３】
コンピュータシステムによって実行可能なコンピュータプログラムであって、前記コンピュータシステムによる実行の際、前記コンピュータシステムに、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法を実施させることのできるコンピュータプログラム。
【請求項３４】
請求項３３記載のコンピュータプログラムを有するコンピュータシステムによって読取り可能な形態において保存する保存媒体。
【請求項３５】
（ｉ）２種以上のマーカーを検出するための手段；及び
（ｉｉ）請求項３４に記載の保存媒体、
を含む、ＴＢを診断するためのキット。
【請求項３６】
（ｉ）２種以上のマーカーを検出するための手段；
（ｉｉ）請求項３１又は３２に記載の装置に、前記マーカーの検出に関連するデータを入力するための使用説明書、
を含む、ＴＢを診断するためのキット。
【請求項３７】
前記マーカーが、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン及びＡｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される、請求項３５又は３６に記載のキット。
【請求項３８】
（ｉ）トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される２種以上のマーカーを検出するための手段
を含む、ＴＢを診断するためのキット。
【請求項３９】
２種以上のマーカーを検出するための前記手段が捕捉表面を含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
前記捕捉表面がタンパク質チップである、請求項３９記載のキット。
【請求項４１】
前記捕捉表面が前記マーカーに対する特異的結合試薬を含む、請求項３９又は４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記特異的結合試薬が抗体又は抗体断片である、請求項４１記載のキット。
【請求項４３】
前記マーカーがトランスシレチン、ネオプテリン及びＣＲＰである、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
ＴＢに罹患していると診断された患者に、ＴＢの治療のための薬剤を投与することをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
（ｉ）試験薬剤を、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬに接触させること；及び
（ｉｉ）試験薬剤が、前記トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬの活性を調節するかどうかを判定すること、
を含み、それによって、前記試験薬剤がＴＢの治療における使用に好適であるかどうかを判定する、ＴＢを治療するための薬剤を同定する方法。
【請求項４６】
（ｉ）エクスビボ又はインビボで、細胞を結核菌及び試験薬剤に接触させること；
（ｉｉｉ）トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質及びＡ２ＧＬから選択される１種以上のＴＢマーカーの発現をモニターすること；及び
（ｉｖ）試験薬剤が前記１種以上の試験マーカーの発現を調節するかどうかを判定すること、
を含み、それによって、前記試験薬剤がＴＢの治療における使用に好適であるかどうかを判定する、ＴＢを治療するための薬剤を同定する方法。
【請求項１】
（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；並びに
（ｉｉ）前記発現データを、ＴＢ以外の炎症性状態に罹患している患者を含む対照患者の群からの前記マーカーの発現データと比較し、それによって、前記試験対象がＴＢに罹患しているかどうかを判定すること
を含む、試験対象における結核（ＴＢ）を診断する方法。
【請求項２】
前記対照対象の群が、呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの２種以上から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）対象における２種以上のマーカーであって、前記マーカーの少なくとも２種が、トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択されるマーカーの発現データを提供すること；並びに
（ｉｉ）前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること
を含む、結核（ＴＢ）を診断する方法。
【請求項４】
前記マーカーの１種がトランスシレチンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーが、トランスシレチン、ＣＲＰ及びネオプテリンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉｉ）がコンピュータシステムを用いて実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記コンピュータシステムが、訓練された機械学習選別機によりプログラムされる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記機械学習選別機がサポートベクターマシン（ＳＶＭ）である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉｉ）が、前記対象における前記マーカーの発現を、対照対象における前記マーカーの発現と比較することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項１０】
前記対照対象がＴＢ以外の炎症性状態に罹患している患者である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記対照対象が、呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの１種以上から選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｉｉ）が、前記対象における前記マーカーの発現を、ＴＢ患者における前記マーカーの発現と比較することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＢ患者が、結核菌の培養によって、ＴＢに罹患していると診断された患者である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
１種以上のＴＢ患者、及び／又は１種以上の対照対象がＨＩＶ陽性である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーが、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン及びＡｐｏ−Ａ１の２種以上、並びにアポリポタンパク質−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２の１種以上を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現データが、表面上の前記マーカーの捕捉及び前記捕捉されたマーカーの検出によって得られる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面が表面増強レーザー脱離及びイオン化（ＳＥＬＤＩ）プローブであり、前記検出が、ＳＥＬＤＩ−飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ）によるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記マーカーが、約Ｍ１８３９４＿９、約Ｍ８９５２＿７５、約Ｍ１１７２０＿０、約Ｍ１１４５４＿１、約Ｍ１８５９１＿２、約Ｍ１１４８８＿１、約Ｍ９０７６＿６８、約Ｍ８８９５＿１３及び約Ｍ１０８５６＿８のｍ／ｚ値を有する正相関するマーカーの１種以上及び／又は約Ｍ４１００＿０３、約Ｍ３８９８＿５２、約Ｍ１３９７２＿１、約Ｍ３３２２＿０１、約Ｍ２９５６＿４５、約Ｍ５６４４＿９６、約Ｍ３９３９＿６３、約Ｍ４０５６＿３９及び約Ｍ６６４９＿７４のｍ／ｚ値を有する負相関するマーカーの１種以上を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記マーカーが、前記正相関するマーカーのすべて及び／又は前記負に関連するマーカーのすべてを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記表面が前記マーカーに対する特異的結合試薬を含み、前記検出が免疫アッセイによるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）対象における２種以上のマーカーの発現データを入力すること；及び
（ｉｉ）訓練されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）によってプログラムされたコンピュータシステムを用いて前記マーカーの発現がＴＢを示しているかどうかを判定すること、
を含み、それによって、前記患者がＴＢに罹患しているかどうかを診断する、コンピュータにより実施されるＴＢを診断する方法。
【請求項２２】
結核菌の培養によりＴＢに罹患していると診断された患者、並びに呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの１種以上から選択された対照対象から得られたデータを用いて前記ＳＶＭが訓練された、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）（ａ）結核（ＴＢ）患者の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ；及び
（ｂ）対照対象の第１のセットの各々における２種以上のマーカーに関する訓練データ、
を含む訓練データを提供すること；
（ｉｉ）ＴＢ患者の訓練データを、対照対象の訓練データから識別するためにサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用すること、
を含み、そのことにより、ＴＢを診断するためにＳＶＭを訓練する、ＴＢを診断するためにＳＶＭ選別機を訓練する方法。
【請求項２４】
（ｉｉｉ）（ａ）ＴＢ患者の第２のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する試験データ；及び
（ｂ）対照対象の第２のセットの各々における前記２種以上のマーカーに関する試験データ、
を含む試験データを提供すること；
（ｉｖ）ＴＢ患者の試験データを、対照対象の試験データから正しく識別するためにＳＶＭの能力を判定すること、
をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記対照対象が、呼吸器感染症に罹患している患者、サルコイドーシスに罹患している患者、炎症性腸疾患に罹患している患者、マラリアに罹患している患者、ヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）に罹患している患者、神経系疾患に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者、骨髄腫に罹患している患者及び健康対象のうちの１種以上から選択される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記訓練データ及び前記試験データがＳＥＬＤＩ解析によって得られる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記訓練データ及び前記試験データが免疫アッセイ分析によって得られる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記マーカーの少なくとも１種が、ＣＲＰ、ネオプテリン、ＳＡＡ、トランスシレチン、血清アルブミン及びＡｐｏ−Ａ１から選択される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記マーカーが、ＣＲＰ、トランスシレチン及びネオプテリンを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記マーカーの少なくとも１種が、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
（ｉ）対象のサンプル中の２種以上のマーカーの発現データを受け入れる手段；
（ｉｉ）前記データがＴＢを示しているかどうかを判定するモジュールであって、ＴＢ患者のデータを、対照対象のデータから識別することのできる訓練された機械学習選別機を含むモジュール；及び
（ｉｉｉ）前記判定の結果を表示する手段、
を含む、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された装置。
【請求項３２】
パーソナルコンピュータである、請求項３１記載の装置。
【請求項３３】
コンピュータシステムによって実行可能なコンピュータプログラムであって、前記コンピュータシステムによる実行の際、前記コンピュータシステムに、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法を実施させることのできるコンピュータプログラム。
【請求項３４】
請求項３３記載のコンピュータプログラムを有するコンピュータシステムによって読取り可能な形態において保存する保存媒体。
【請求項３５】
（ｉ）２種以上のマーカーを検出するための手段；及び
（ｉｉ）請求項３４に記載の保存媒体、
を含む、ＴＢを診断するためのキット。
【請求項３６】
（ｉ）２種以上のマーカーを検出するための手段；
（ｉｉ）請求項３１又は３２に記載の装置に、前記マーカーの検出に関連するデータを入力するための使用説明書、
を含む、ＴＢを診断するためのキット。
【請求項３７】
前記マーカーが、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン及びＡｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、Ａ２ＧＬ及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される、請求項３５又は３６に記載のキット。
【請求項３８】
（ｉ）トランスシレチン、ネオプテリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アルブミン、アポリオポタンパク質−Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）、アポリポタンパク質−Ａ２（Ａｐｏ−Ａ２）、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビンタンパク質、ＤＥＰドメインタンパク質、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（Ａ２ＧＬ）及び仮想タンパク質ＤＦＫＺｐ６６７Ｉ０３２から選択される２種以上のマーカーを検出するための手段
を含む、ＴＢを診断するためのキット。
【請求項３９】
２種以上のマーカーを検出するための前記手段が捕捉表面を含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
前記捕捉表面がタンパク質チップである、請求項３９記載のキット。
【請求項４１】
前記捕捉表面が前記マーカーに対する特異的結合試薬を含む、請求項３９又は４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記特異的結合試薬が抗体又は抗体断片である、請求項４１記載のキット。
【請求項４３】
前記マーカーがトランスシレチン、ネオプテリン及びＣＲＰである、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
ＴＢに罹患していると診断された患者に、ＴＢの治療のための薬剤を投与することをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
（ｉ）試験薬剤を、トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬに接触させること；及び
（ｉｉ）試験薬剤が、前記トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質又はＡ２ＧＬの活性を調節するかどうかを判定すること、
を含み、それによって、前記試験薬剤がＴＢの治療における使用に好適であるかどうかを判定する、ＴＢを治療するための薬剤を同定する方法。
【請求項４６】
（ｉ）エクスビボ又はインビボで、細胞を結核菌及び試験薬剤に接触させること；
（ｉｉｉ）トランスシレチン、ネオプテリン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、血清アルブミン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ２、ヘモグロビンベータ、ハプトグロビン、ＤＥＰドメインタンパク質及びＡ２ＧＬから選択される１種以上のＴＢマーカーの発現をモニターすること；及び
（ｉｖ）試験薬剤が前記１種以上の試験マーカーの発現を調節するかどうかを判定すること、
を含み、それによって、前記試験薬剤がＴＢの治療における使用に好適であるかどうかを判定する、ＴＢを治療するための薬剤を同定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５４５９６０（Ｐ２００８−５４５９６０Ａ）
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１２９０７（Ｐ２００８−５１２９０７）
【出願日】平成１８年５月２３日（２００６．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１８８８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２５９７３
【国際公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（５０７１７１１００）セント ジョージズ エンタープライゼズ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２３日（２００６．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１８８８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２５９７３
【国際公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（５０７１７１１００）セント ジョージズ エンタープライゼズ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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