美白剤及び皮膚化粧料
【課題】天然物の中から、美白作用を有するものを見出し、それを有効成分として含有する美白剤及び皮膚化粧料を提供する。
【解決手段】美白剤に、エビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を含有せしめる。また、皮膚化粧料に、エビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を配合する。
【解決手段】美白剤に、エビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を含有せしめる。また、皮膚化粧料に、エビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を配合する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然由来成分を有効成分として含有する美白剤及び皮膚化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚においてメラニンは、紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。一般にメラニンは、色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、ついで５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成されるものとされている。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防、治療又は改善するためには、メラニンの産生に関与するチロシナーゼの活性を阻害すること、又はメラニンの産生を抑制することが考えられる。
【０００３】
従来、皮膚色素沈着症、シミ、ソバカス等の予防、治療又は改善には、ハイドロキノン等の化学合成品を有効成分とする美白剤を外用する処置が行われてきた。しかしながら、ハイドロキノン等の化学合成品は、皮膚刺激、アレルギー性等の副作用のおそれがある。そこで、安全性の高い天然原料を有効成分とする美白剤の開発が望まれており、チロシナーゼ活性阻害作用を有するものとしては、例えば、桑葉抽出物（特許文献１参照）、サウスウレア属に属する植物の抽出物（特許文献２参照）、藤茶抽出物（特許文献３参照）、ヤナギタデ抽出物（特許文献４参照）、タケノコ及びカンゾウ根抽出物（特許文献５参照）、マンゴージンジャー抽出物（特許文献６参照）等が知られている。また、メラニン産生抑制作用を有するものとしては、例えば、トウゴマ根部からの抽出物（特許文献７参照）、サウスウレア（Saussurea）属に属する植物からの抽出物（特許文献８参照）等が知られている。
【特許文献１】特開平１１−２４６４２４号公報
【特許文献２】特開２００２−２０１１２２号公報
【特許文献３】特開２００２−３７０９６２号公報
【特許文献４】特開２００４−８３４８８号公報
【特許文献５】特開２００４−３５２６９７号公報
【特許文献６】特開２００５−１０４８８６号公報
【特許文献７】特開２００１−２１３７５７号公報
【特許文献８】特開２００２−２０１１２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、天然物の中からチロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用を有するものを見出し、それを有効成分として含有する美白剤及び皮膚化粧料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、第１に本発明の美白剤は、エビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００６】
第２に本発明の皮膚化粧料は、エビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、優れたチロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用を有するエビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を有効成分として含有する美白剤及び皮膚化粧料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について説明する。
〔美白剤〕
本発明の美白剤は、エビヅルからの抽出物、又は下記式（１）〜（３）で表されるε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を有効成分として含有する。
【０００９】
【化１】
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
ここで、本発明において「エビヅルからの抽出物」には、エビヅルを抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１３】
上記式（１）〜（３）で表されるポリフェノール類化合物（ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ又はアンペロプシンＣ）は、それらを含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することもできるし、合成により製造することもできる。なお、合成により製造する場合、その合成方法は特に限定されるものではなく、公知の方法により合成することができる。
【００１４】
上記ポリフェノール類化合物を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって得ることができる。上記化合物を含有する植物としては、例えば、エビヅル（学名：Vitis ficifolia）が挙げられる。
【００１５】
エビヅル（Vitis ficifolia）は、本州、四国、九州等に分布しているブドウ科ブドウ属に属する木本性つる植物であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る部位としては、例えば、葉部、茎部、蔓部、種子部、果実部、花部、地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは蔓部である。
【００１６】
エビヅルからの抽出物は、エビヅルを乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１９】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２０】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましい。
【００２１】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２２】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物から上記ポリフェノール類化合物を単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、エビヅルからの抽出物を濃縮し、液−液分配抽出、イオン交換樹脂、多孔性樹脂（例えば、シリカゲル等）を用いたカラムクロマトグラフィーに付し、約１時間ごとに溶出液を回収する。このようにして回収した溶出液を、さらに高速液体クロマトグラフィー等に付して分画し、必要に応じて結晶化することにより、上記ポリフェノール類化合物を単離・精製することができる。
【００２３】
上述のようにして得られるエビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物は、美白作用を有しているため、その作用を利用しては美白剤の有効成分として用いることができる。
【００２４】
エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物が有する美白作用は、例えば、チロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用に基づいて発揮される。ただし、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物が有する美白作用は、これらの作用に基づいて発揮される美白作用に限定されるものではない。なお、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物は、チロシナーゼ活性阻害作用又はメラニン産生抑制作用を有するため、これらの作用を利用して、チロシナーゼ活性阻害剤又はメラニン産生抑制剤の有効成分として利用することもできる。
【００２５】
なお、本発明においては、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのうちのいずれか１種のポリフェノール類化合物を上記有効成分として用いてもよいし、それらのうちの２種以上のポリフェノール類化合物を混合して上記有効成分として用いてもよい。また、エビヅルからの抽出物と、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのうちの少なくとも１種のポリフェノール類化合物とを混合して上記有効成分として用いてもよい。ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのうちの２種以上のポリフェノール類化合物を混合して上記有効成分として用いる場合、又はエビヅルからの抽出物と、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのうちの少なくとも１種のポリフェノール類化合物とを混合して上記有効成分として用いる場合、その配合比は、それらの作用の程度に応じて適宜決定すればよい。
【００２６】
本発明の美白剤は、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物のみからなるものであってもよいし、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物を製剤化したものであってもよい。
【００２７】
エビヅルからの抽出物、又は上記ポリフェノール類化合物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。また、エビヅルからの抽出物、又は上記ポリフェノール類化合物は、他の組成物（例えば、後述する皮膚化粧料等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００２８】
なお、本発明の美白剤は、必要に応じて、美白作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として用いることができる。
【００２９】
本発明の美白剤は、エビヅルからの抽出物、又は上記ポリフェノール類化合物が有する美白作用（例えば、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用等）を通じて、皮膚の黒化、シミ、ソバカス等を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明の美白剤は、これらの用途以外にも美白作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３０】
〔皮膚化粧料〕
エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物は、皮膚に適用した場合の使用感と安全性とに優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。この場合、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物を配合してもよいし、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物から製剤化した美白剤を配合してもよい。エビヅルからの抽出物、上記ポリフェノール類化合物又は上記美白剤を皮膚化粧料に配合することによって、皮膚化粧料に美白作用を付与することができる。
【００３１】
エビヅルからの抽出物、上記ポリフェノール化合物又は上記美白剤を配合し得る皮膚化粧料としては、特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディーシャンプー等が挙げられる。
【００３２】
エビヅルからの抽出物、上記ポリフェノール類化合物又は上記美白剤を皮膚化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料の種類に応じて適宜調整することができるが、好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．０００１〜１０質量％であり、特に好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．００１〜１質量％である。
【００３３】
本発明の皮膚化粧料は、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物が有する美白作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することで、より一般性のある製品となり、また、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。
【００３４】
なお、本発明の美白剤又は皮膚化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００３５】
以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００３６】
〔製造例１〕エビヅル抽出物の製造
乾燥したエビヅルの蔓部を粉砕し、その粉砕物１００ｇに抽出溶媒１０００ｍＬを加え、穏やかに攪拌しながら８０℃の温度条件下にて３時間加熱抽出し、熱時濾過した。濾液を４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥してエビヅル抽出物（試料１〜３）を得た。抽出溶媒として水、５０容量％エタノール（水とエタノールとの容量比＝１：１）及びエタノールを用いたときの各抽出物収量（ｇ）を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
〔製造例２〕ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣの製造
製造例１で得られたエビヅル蔓部エタノール抽出物（試料３）５．７ｇを、クロロホルム：メタノール：水＝１０：３：１（容量比）の混合溶媒に溶解し、シリカゲル（商品名：シリカゲル６０，メルク社製）を充填したガラス製カラムの上部から流入して、シリカゲルに吸着させた。
【００３９】
移動相として、クロロホルム：メタノール：水＝１０：３：１（容量比）の混合溶媒を上記カラム上部から注入し、１時間経過後ごとに溶出液を回収し、脱溶媒することで、画分１（３１２ｍｇ）、画分２（７１５ｍｇ）及び画分３（９３３ｍｇ）を得た。
【００４０】
上述のようにして得られた画分１を、下記の高速液体クロマトグラフィー条件１のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し粗精製物１を得て、次いで高速液体クロマトグラフィー条件２のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し、精製物１（１４９ｍｇ）を得た。
【００４１】
＜高速液体クロマトグラフィー条件１＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）を２本連結
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：５００ｍｍ（２５０ｍｍ×２本）
移動相：メタノール
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００４２】
＜高速液体クロマトグラフィー条件２＞
固定相：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（ＹＭＣ社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：アセトニトリル：水＝２：５
移動相流量：９ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００４３】
また、上述のようにして得られた画分２を、下記の高速液体クロマトグラフィー条件３のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し粗精製物２を得て、次いで高速液体クロマトグラフィー条件４のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し、精製物２（７１５ｍｇ）を得た。
【００４４】
＜高速液体クロマトグラフィー条件３＞
固定相：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（ＹＭＣ社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：アセトニトリル：水＝３：１０
移動相流量：９ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００４５】
＜高速液体クロマトグラフィー条件４＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）を２本連結
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：５００ｍｍ（２５０ｍｍ×２本）
移動相：メタノール
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００４６】
さらに、上述のようにして得られた画分３を、下記の高速液体クロマトグラフィー条件５のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し、精製物３（１１１ｍｇ）を得た。
【００４７】
上述のようにして得られた各精製物（精製物１〜３）をＥＳＩ−マススペクトル及び１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を下記に示す。
【００４８】
＜精製物１のＥＳＩ−マススペクトル＞
m/z 455(M+H)+
【００４９】
＜精製物１の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：＞
162.5(3-C)，159.8(11'-C)，159.6(13'-C)，158.2(12-C，4'-C)，147.4(9'-C)，136.4(1-C)，133.9(1'-C)，130.1(8-C)，129.9(9-C)，128.7(10-C，14-C)，127.9(2'-C，6'-C)，123.5(7-C)，119.8(2-C)，116.3(11-C，13-C)，116.1(3'-C，5'-C)，107.0(10'-C，14'-C)，104.2(6-C)，102.1(12'-C)，96.8(4-C)，93.9(7'-C)，57.1(8'-C)
【００５０】
＜精製物２のＥＳＩ−マススペクトル＞
m/z 471(M+H)+
【００５１】
＜精製物２の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：＞
160.1(11-C)，159.9(13-C，13'-C)，158.5(4-C)，157.3(4'-C)，156.1(11'-C)，143.0(9'-C)，140.3(9-C)，132.6(1'-C)，130.9(1-C)，129.9(2'-C，6'-C)，118.3(10-C)，116.2(10'-C)，116.0(3'-C，5'-C)，115.4(3-C，5-C)，110.5(14-C)，105.5(14'-C)，101.6(12'-C)，97.1(12-C)，88.4(7'-C)，71.2(8-C)，49.5(8'-C)，43.9(7-C)
【００５２】
＜精製物３のＥＳＩ−マススペクトル＞
m/z 681(M+H)+
【００５３】
＜精製物３の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：＞
159.5，159.2*2，158.6，156.8:2，155.9，155.8，154.7，146.8，144.1，141.7，133.3，132.8，130.8，130.5*2，130.2*2，130.0*2，124.8，121.0，116.1*2，116.0*2，115.8，115.5*2，107.4*2，105.9，101.8，101.7，96.6，90.6，62.1，57.4，52.5，48.8，37.5
【００５４】
以上の結果から、得られた精製物１及び精製物２が、それぞれ下記式（１）で表されるε−ビニフェリン（試料２）及び下記式（２）で表されるアンペロプシンＡ（試料３）であることが確認された。また、上記精製物３の分析結果と、Yoshiteru Oshima et al., "AMPELOPSINS A, B AND C, NEW OLIGOSTILBENES OF AMPELOPSIS BREVIPEDUNCULATA VAR. HANCEI", Tetrahedron, Vol. 46, No. 15, pp.5121-5126, 1990に記載されているアンペロプシンＣのマススペクトル解析結果及び１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトとを対比した結果、得られた精製物３が、下記式（３）で表されるアンペロプシンＣ（試料４）であることが確認された。
【００５５】
【化４】
【００５６】
【化５】
【００５７】
【化６】
【００５８】
〔試験例１〕チロシナーゼ活性阻害作用試験
製造例１で得られた各エビヅル抽出物（試料１〜３）、並びに製造例２で得られたε−ビニフェリン（試料４）、アンペロプシンＡ（試料５）及びアンペロプシンＣ（試料６）について、以下のようにしてチロシナーゼ活性阻害作用を試験した。
【００５９】
４８ウェルプレートに、Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ６．８）０．２ｍＬ，０．３ｍｇ／ｍＬのチロシン溶液０．０６ｍＬ、試料（試料１〜４，試料濃度は下記表２を参照）の２５％ＤＭＳＯ溶液０．１８ｍＬを加え、３７℃で１０分間静置した。これに、８００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのチロシナーゼ溶液０．０２ｍＬを加え、引き続き３７℃で１５分間反応させた。反応終了後、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様の方法で空試験を行った。得られた測定結果から、下記式によりチロシナーゼ活性阻害率（％）を算出した。
【００６０】
チロシナーゼ活性阻害率(％)＝{１−(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)}×１００
式中、Ｓｔは「酵素溶液添加・試料溶液添加時の吸光度」を、Ｓｂは「酵素溶液無添加・試料溶液添加時の吸光度」を、Ｃｔは「酵素溶液添加・試料溶液無添加時の吸光度」を、Ｃｂは「酵素溶液無添加・試料溶液無添加時の吸光度」を示す。
結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２に示すように、エビヅル抽出物、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣは、いずれも優れたチロシナーゼ活性阻害作用を有することが確認された。また、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのチロシナーゼ活性阻害作用の程度は、濃度により調整可能であることが確認された。
【００６３】
〔試験例２〕Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験
製造例１で得られた各エビヅル抽出物（試料１〜３）、並びに製造例２で得られたε−ビニフェリン（試料４）、アンペロプシンＡ（試料５）及びアンペロプシンＣ（試料６）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用を試験した。
【００６４】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで２５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり３００μＬずつ播種し、６時間培養した。
【００６５】
培養終了後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１〜４，試料濃度は下記表３を参照）を各ｗｅｌｌに３００μＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌから培地を取り除き、２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液２００μＬを添加して超音波破砕器により細胞を破壊し、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定し、メラニン産生量とした。
【００６６】
また、単位細胞あたりのメラニン産生抑制作用を評価するために、上記と同様にして培養した後、培養液を除去し、終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬで１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したニュートラルレッドを各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２．５時間培養した。培養後、ニュートラルレッド溶液を捨て、エタノール・酢酸溶液（エタノール：酢酸：水＝５０：１：４９）を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、色素を抽出した。抽出後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６７】
さらに、空試験として、試料を添加せずに上記と同様にして培養した細胞について、波長４７５ｎｍにおける吸光度及び５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果から、下記式により単位細胞あたりのメラニン産生抑制率（％）を算出した。
【００６８】
メラニン産生抑制率(％)＝{１−(Ｂ／Ｄ)／(Ａ／Ｃ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加時の４７５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料添加時の４７５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料無添加時の５４０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは「試料添加時の５４０ｎｍにおける吸光度」を表す。
結果を表３に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
表３に示すように、エビヅル抽出物、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣは、いずれも優れたメラニン産生抑制作用を有することが確認された。
【００７１】
〔配合例１〕
下記組成の乳液を常法により製造した。
エビヅル５０容量％エタノール抽出物（製造例１） ０．０１ｇ
ホホバオイル ４．０ｇ
黄杞エキス ０．１ｇ
オリーブオイル ２．０ｇ
スクワラン ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．０ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.O） ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O） ２．０ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ３．０ｇ
ヒノキチオール ０．１５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００７２】
〔配合例２〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
ε−ビニフェリン（製造例２） ０．０５ｇ
クジンエキス ０．１ｇ
オウゴンエキス ０．１ｇ
流動パラフィン ５．０ｇ
サラシミツロウ ４．０ｇ
スクワラン １０．０ｇ
セタノール ３．０ｇ
ラノリン ２．０ｇ
ステアリン酸 １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３．０ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００７３】
〔配合例３〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
アンペロプシンＡ（製造例２） ０．０５ｇ
エイジツエキス ０．１ｇ
ワレモコウエキス ０．１ｇ
モノステアリン酸ポリエチレングリコール ２．０ｇ
自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５．０ｇ
ステアリン酸 ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
スクワラン １２．０ｇ
マカダミアナッツ油 ３．０ｇ
メチルポリシロキサン ０．２ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ７．０ｇ
キサンタンガム ０．２ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００７４】
〔配合例４〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
アンペロプシンＣ（製造例２） ０．０１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
ニンジンエキス ０．１ｇ
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ４．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の美白剤又は皮膚化粧料は、メラニンの過剰生成や不均一な蓄積に伴う皮膚の黒化、シミ、ソバカス等の予防、治療又は改善に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然由来成分を有効成分として含有する美白剤及び皮膚化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚においてメラニンは、紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。一般にメラニンは、色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、ついで５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成されるものとされている。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防、治療又は改善するためには、メラニンの産生に関与するチロシナーゼの活性を阻害すること、又はメラニンの産生を抑制することが考えられる。
【０００３】
従来、皮膚色素沈着症、シミ、ソバカス等の予防、治療又は改善には、ハイドロキノン等の化学合成品を有効成分とする美白剤を外用する処置が行われてきた。しかしながら、ハイドロキノン等の化学合成品は、皮膚刺激、アレルギー性等の副作用のおそれがある。そこで、安全性の高い天然原料を有効成分とする美白剤の開発が望まれており、チロシナーゼ活性阻害作用を有するものとしては、例えば、桑葉抽出物（特許文献１参照）、サウスウレア属に属する植物の抽出物（特許文献２参照）、藤茶抽出物（特許文献３参照）、ヤナギタデ抽出物（特許文献４参照）、タケノコ及びカンゾウ根抽出物（特許文献５参照）、マンゴージンジャー抽出物（特許文献６参照）等が知られている。また、メラニン産生抑制作用を有するものとしては、例えば、トウゴマ根部からの抽出物（特許文献７参照）、サウスウレア（Saussurea）属に属する植物からの抽出物（特許文献８参照）等が知られている。
【特許文献１】特開平１１−２４６４２４号公報
【特許文献２】特開２００２−２０１１２２号公報
【特許文献３】特開２００２−３７０９６２号公報
【特許文献４】特開２００４−８３４８８号公報
【特許文献５】特開２００４−３５２６９７号公報
【特許文献６】特開２００５−１０４８８６号公報
【特許文献７】特開２００１−２１３７５７号公報
【特許文献８】特開２００２−２０１１２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、天然物の中からチロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用を有するものを見出し、それを有効成分として含有する美白剤及び皮膚化粧料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、第１に本発明の美白剤は、エビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００６】
第２に本発明の皮膚化粧料は、エビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、優れたチロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用を有するエビヅルからの抽出物、又はε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を有効成分として含有する美白剤及び皮膚化粧料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について説明する。
〔美白剤〕
本発明の美白剤は、エビヅルからの抽出物、又は下記式（１）〜（３）で表されるε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種若しくは２種以上のポリフェノール類化合物を有効成分として含有する。
【０００９】
【化１】
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
ここで、本発明において「エビヅルからの抽出物」には、エビヅルを抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１３】
上記式（１）〜（３）で表されるポリフェノール類化合物（ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ又はアンペロプシンＣ）は、それらを含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することもできるし、合成により製造することもできる。なお、合成により製造する場合、その合成方法は特に限定されるものではなく、公知の方法により合成することができる。
【００１４】
上記ポリフェノール類化合物を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって得ることができる。上記化合物を含有する植物としては、例えば、エビヅル（学名：Vitis ficifolia）が挙げられる。
【００１５】
エビヅル（Vitis ficifolia）は、本州、四国、九州等に分布しているブドウ科ブドウ属に属する木本性つる植物であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る部位としては、例えば、葉部、茎部、蔓部、種子部、果実部、花部、地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは蔓部である。
【００１６】
エビヅルからの抽出物は、エビヅルを乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１９】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２０】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましい。
【００２１】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２２】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物から上記ポリフェノール類化合物を単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、エビヅルからの抽出物を濃縮し、液−液分配抽出、イオン交換樹脂、多孔性樹脂（例えば、シリカゲル等）を用いたカラムクロマトグラフィーに付し、約１時間ごとに溶出液を回収する。このようにして回収した溶出液を、さらに高速液体クロマトグラフィー等に付して分画し、必要に応じて結晶化することにより、上記ポリフェノール類化合物を単離・精製することができる。
【００２３】
上述のようにして得られるエビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物は、美白作用を有しているため、その作用を利用しては美白剤の有効成分として用いることができる。
【００２４】
エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物が有する美白作用は、例えば、チロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用に基づいて発揮される。ただし、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物が有する美白作用は、これらの作用に基づいて発揮される美白作用に限定されるものではない。なお、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物は、チロシナーゼ活性阻害作用又はメラニン産生抑制作用を有するため、これらの作用を利用して、チロシナーゼ活性阻害剤又はメラニン産生抑制剤の有効成分として利用することもできる。
【００２５】
なお、本発明においては、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのうちのいずれか１種のポリフェノール類化合物を上記有効成分として用いてもよいし、それらのうちの２種以上のポリフェノール類化合物を混合して上記有効成分として用いてもよい。また、エビヅルからの抽出物と、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのうちの少なくとも１種のポリフェノール類化合物とを混合して上記有効成分として用いてもよい。ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのうちの２種以上のポリフェノール類化合物を混合して上記有効成分として用いる場合、又はエビヅルからの抽出物と、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのうちの少なくとも１種のポリフェノール類化合物とを混合して上記有効成分として用いる場合、その配合比は、それらの作用の程度に応じて適宜決定すればよい。
【００２６】
本発明の美白剤は、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物のみからなるものであってもよいし、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物を製剤化したものであってもよい。
【００２７】
エビヅルからの抽出物、又は上記ポリフェノール類化合物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。また、エビヅルからの抽出物、又は上記ポリフェノール類化合物は、他の組成物（例えば、後述する皮膚化粧料等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００２８】
なお、本発明の美白剤は、必要に応じて、美白作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として用いることができる。
【００２９】
本発明の美白剤は、エビヅルからの抽出物、又は上記ポリフェノール類化合物が有する美白作用（例えば、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用等）を通じて、皮膚の黒化、シミ、ソバカス等を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明の美白剤は、これらの用途以外にも美白作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３０】
〔皮膚化粧料〕
エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物は、皮膚に適用した場合の使用感と安全性とに優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。この場合、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物を配合してもよいし、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物から製剤化した美白剤を配合してもよい。エビヅルからの抽出物、上記ポリフェノール類化合物又は上記美白剤を皮膚化粧料に配合することによって、皮膚化粧料に美白作用を付与することができる。
【００３１】
エビヅルからの抽出物、上記ポリフェノール化合物又は上記美白剤を配合し得る皮膚化粧料としては、特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディーシャンプー等が挙げられる。
【００３２】
エビヅルからの抽出物、上記ポリフェノール類化合物又は上記美白剤を皮膚化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料の種類に応じて適宜調整することができるが、好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．０００１〜１０質量％であり、特に好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．００１〜１質量％である。
【００３３】
本発明の皮膚化粧料は、エビヅルからの抽出物又は上記ポリフェノール類化合物が有する美白作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することで、より一般性のある製品となり、また、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。
【００３４】
なお、本発明の美白剤又は皮膚化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００３５】
以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００３６】
〔製造例１〕エビヅル抽出物の製造
乾燥したエビヅルの蔓部を粉砕し、その粉砕物１００ｇに抽出溶媒１０００ｍＬを加え、穏やかに攪拌しながら８０℃の温度条件下にて３時間加熱抽出し、熱時濾過した。濾液を４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥してエビヅル抽出物（試料１〜３）を得た。抽出溶媒として水、５０容量％エタノール（水とエタノールとの容量比＝１：１）及びエタノールを用いたときの各抽出物収量（ｇ）を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
〔製造例２〕ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣの製造
製造例１で得られたエビヅル蔓部エタノール抽出物（試料３）５．７ｇを、クロロホルム：メタノール：水＝１０：３：１（容量比）の混合溶媒に溶解し、シリカゲル（商品名：シリカゲル６０，メルク社製）を充填したガラス製カラムの上部から流入して、シリカゲルに吸着させた。
【００３９】
移動相として、クロロホルム：メタノール：水＝１０：３：１（容量比）の混合溶媒を上記カラム上部から注入し、１時間経過後ごとに溶出液を回収し、脱溶媒することで、画分１（３１２ｍｇ）、画分２（７１５ｍｇ）及び画分３（９３３ｍｇ）を得た。
【００４０】
上述のようにして得られた画分１を、下記の高速液体クロマトグラフィー条件１のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し粗精製物１を得て、次いで高速液体クロマトグラフィー条件２のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し、精製物１（１４９ｍｇ）を得た。
【００４１】
＜高速液体クロマトグラフィー条件１＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）を２本連結
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：５００ｍｍ（２５０ｍｍ×２本）
移動相：メタノール
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００４２】
＜高速液体クロマトグラフィー条件２＞
固定相：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（ＹＭＣ社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：アセトニトリル：水＝２：５
移動相流量：９ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００４３】
また、上述のようにして得られた画分２を、下記の高速液体クロマトグラフィー条件３のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し粗精製物２を得て、次いで高速液体クロマトグラフィー条件４のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し、精製物２（７１５ｍｇ）を得た。
【００４４】
＜高速液体クロマトグラフィー条件３＞
固定相：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（ＹＭＣ社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：アセトニトリル：水＝３：１０
移動相流量：９ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００４５】
＜高速液体クロマトグラフィー条件４＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）を２本連結
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：５００ｍｍ（２５０ｍｍ×２本）
移動相：メタノール
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００４６】
さらに、上述のようにして得られた画分３を、下記の高速液体クロマトグラフィー条件５のリサイクルＨＰＬＣを用いて分画し、精製物３（１１１ｍｇ）を得た。
【００４７】
上述のようにして得られた各精製物（精製物１〜３）をＥＳＩ−マススペクトル及び１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を下記に示す。
【００４８】
＜精製物１のＥＳＩ−マススペクトル＞
m/z 455(M+H)+
【００４９】
＜精製物１の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：＞
162.5(3-C)，159.8(11'-C)，159.6(13'-C)，158.2(12-C，4'-C)，147.4(9'-C)，136.4(1-C)，133.9(1'-C)，130.1(8-C)，129.9(9-C)，128.7(10-C，14-C)，127.9(2'-C，6'-C)，123.5(7-C)，119.8(2-C)，116.3(11-C，13-C)，116.1(3'-C，5'-C)，107.0(10'-C，14'-C)，104.2(6-C)，102.1(12'-C)，96.8(4-C)，93.9(7'-C)，57.1(8'-C)
【００５０】
＜精製物２のＥＳＩ−マススペクトル＞
m/z 471(M+H)+
【００５１】
＜精製物２の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：＞
160.1(11-C)，159.9(13-C，13'-C)，158.5(4-C)，157.3(4'-C)，156.1(11'-C)，143.0(9'-C)，140.3(9-C)，132.6(1'-C)，130.9(1-C)，129.9(2'-C，6'-C)，118.3(10-C)，116.2(10'-C)，116.0(3'-C，5'-C)，115.4(3-C，5-C)，110.5(14-C)，105.5(14'-C)，101.6(12'-C)，97.1(12-C)，88.4(7'-C)，71.2(8-C)，49.5(8'-C)，43.9(7-C)
【００５２】
＜精製物３のＥＳＩ−マススペクトル＞
m/z 681(M+H)+
【００５３】
＜精製物３の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：＞
159.5，159.2*2，158.6，156.8:2，155.9，155.8，154.7，146.8，144.1，141.7，133.3，132.8，130.8，130.5*2，130.2*2，130.0*2，124.8，121.0，116.1*2，116.0*2，115.8，115.5*2，107.4*2，105.9，101.8，101.7，96.6，90.6，62.1，57.4，52.5，48.8，37.5
【００５４】
以上の結果から、得られた精製物１及び精製物２が、それぞれ下記式（１）で表されるε−ビニフェリン（試料２）及び下記式（２）で表されるアンペロプシンＡ（試料３）であることが確認された。また、上記精製物３の分析結果と、Yoshiteru Oshima et al., "AMPELOPSINS A, B AND C, NEW OLIGOSTILBENES OF AMPELOPSIS BREVIPEDUNCULATA VAR. HANCEI", Tetrahedron, Vol. 46, No. 15, pp.5121-5126, 1990に記載されているアンペロプシンＣのマススペクトル解析結果及び１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトとを対比した結果、得られた精製物３が、下記式（３）で表されるアンペロプシンＣ（試料４）であることが確認された。
【００５５】
【化４】
【００５６】
【化５】
【００５７】
【化６】
【００５８】
〔試験例１〕チロシナーゼ活性阻害作用試験
製造例１で得られた各エビヅル抽出物（試料１〜３）、並びに製造例２で得られたε−ビニフェリン（試料４）、アンペロプシンＡ（試料５）及びアンペロプシンＣ（試料６）について、以下のようにしてチロシナーゼ活性阻害作用を試験した。
【００５９】
４８ウェルプレートに、Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ６．８）０．２ｍＬ，０．３ｍｇ／ｍＬのチロシン溶液０．０６ｍＬ、試料（試料１〜４，試料濃度は下記表２を参照）の２５％ＤＭＳＯ溶液０．１８ｍＬを加え、３７℃で１０分間静置した。これに、８００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのチロシナーゼ溶液０．０２ｍＬを加え、引き続き３７℃で１５分間反応させた。反応終了後、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様の方法で空試験を行った。得られた測定結果から、下記式によりチロシナーゼ活性阻害率（％）を算出した。
【００６０】
チロシナーゼ活性阻害率(％)＝{１−(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)}×１００
式中、Ｓｔは「酵素溶液添加・試料溶液添加時の吸光度」を、Ｓｂは「酵素溶液無添加・試料溶液添加時の吸光度」を、Ｃｔは「酵素溶液添加・試料溶液無添加時の吸光度」を、Ｃｂは「酵素溶液無添加・試料溶液無添加時の吸光度」を示す。
結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２に示すように、エビヅル抽出物、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣは、いずれも優れたチロシナーゼ活性阻害作用を有することが確認された。また、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣのチロシナーゼ活性阻害作用の程度は、濃度により調整可能であることが確認された。
【００６３】
〔試験例２〕Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験
製造例１で得られた各エビヅル抽出物（試料１〜３）、並びに製造例２で得られたε−ビニフェリン（試料４）、アンペロプシンＡ（試料５）及びアンペロプシンＣ（試料６）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用を試験した。
【００６４】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで２５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり３００μＬずつ播種し、６時間培養した。
【００６５】
培養終了後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１〜４，試料濃度は下記表３を参照）を各ｗｅｌｌに３００μＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌから培地を取り除き、２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液２００μＬを添加して超音波破砕器により細胞を破壊し、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定し、メラニン産生量とした。
【００６６】
また、単位細胞あたりのメラニン産生抑制作用を評価するために、上記と同様にして培養した後、培養液を除去し、終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬで１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したニュートラルレッドを各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２．５時間培養した。培養後、ニュートラルレッド溶液を捨て、エタノール・酢酸溶液（エタノール：酢酸：水＝５０：１：４９）を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、色素を抽出した。抽出後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６７】
さらに、空試験として、試料を添加せずに上記と同様にして培養した細胞について、波長４７５ｎｍにおける吸光度及び５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果から、下記式により単位細胞あたりのメラニン産生抑制率（％）を算出した。
【００６８】
メラニン産生抑制率(％)＝{１−(Ｂ／Ｄ)／(Ａ／Ｃ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加時の４７５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料添加時の４７５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料無添加時の５４０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは「試料添加時の５４０ｎｍにおける吸光度」を表す。
結果を表３に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
表３に示すように、エビヅル抽出物、ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣは、いずれも優れたメラニン産生抑制作用を有することが確認された。
【００７１】
〔配合例１〕
下記組成の乳液を常法により製造した。
エビヅル５０容量％エタノール抽出物（製造例１） ０．０１ｇ
ホホバオイル ４．０ｇ
黄杞エキス ０．１ｇ
オリーブオイル ２．０ｇ
スクワラン ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．０ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.O） ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O） ２．０ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ３．０ｇ
ヒノキチオール ０．１５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００７２】
〔配合例２〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
ε−ビニフェリン（製造例２） ０．０５ｇ
クジンエキス ０．１ｇ
オウゴンエキス ０．１ｇ
流動パラフィン ５．０ｇ
サラシミツロウ ４．０ｇ
スクワラン １０．０ｇ
セタノール ３．０ｇ
ラノリン ２．０ｇ
ステアリン酸 １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３．０ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００７３】
〔配合例３〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
アンペロプシンＡ（製造例２） ０．０５ｇ
エイジツエキス ０．１ｇ
ワレモコウエキス ０．１ｇ
モノステアリン酸ポリエチレングリコール ２．０ｇ
自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５．０ｇ
ステアリン酸 ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
スクワラン １２．０ｇ
マカダミアナッツ油 ３．０ｇ
メチルポリシロキサン ０．２ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ７．０ｇ
キサンタンガム ０．２ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００７４】
〔配合例４〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
アンペロプシンＣ（製造例２） ０．０１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
ニンジンエキス ０．１ｇ
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ４．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の美白剤又は皮膚化粧料は、メラニンの過剰生成や不均一な蓄積に伴う皮膚の黒化、シミ、ソバカス等の予防、治療又は改善に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エビヅルからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美白剤。
【請求項２】
前記抽出物が、チロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用を有することを特徴とする請求項１に記載の美白剤。
【請求項３】
ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種又は２種以上のポリフェノール類化合物を有効成分として含有することを特徴とする美白剤。
【請求項４】
前記ポリフェノール類化合物が、チロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用を有することを特徴とする請求項３に記載の美白剤。
【請求項５】
エビヅルからの抽出物を配合したことを特徴とする皮膚化粧料。
【請求項６】
ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種又は２種以上のポリフェノール類化合物を配合したことを特徴とする皮膚化粧料。
【請求項１】
エビヅルからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美白剤。
【請求項２】
前記抽出物が、チロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用を有することを特徴とする請求項１に記載の美白剤。
【請求項３】
ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種又は２種以上のポリフェノール類化合物を有効成分として含有することを特徴とする美白剤。
【請求項４】
前記ポリフェノール類化合物が、チロシナーゼ活性阻害作用及び／又はメラニン産生抑制作用を有することを特徴とする請求項３に記載の美白剤。
【請求項５】
エビヅルからの抽出物を配合したことを特徴とする皮膚化粧料。
【請求項６】
ε−ビニフェリン、アンペロプシンＡ及びアンペロプシンＣからなる群より選ばれる１種又は２種以上のポリフェノール類化合物を配合したことを特徴とする皮膚化粧料。
【公開番号】特開２０１０−１１１６４５（Ｐ２０１０−１１１６４５Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８７１９７（Ｐ２００８−２８７１９７）
【出願日】平成２０年１１月７日（２００８．１１．７）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月７日（２００８．１１．７）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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