美白効果を有する藻類エキス
【課題】優れた美白作用（メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用等）を有し、かつ、安全性の高い美白剤、並びに、前記美白剤を利用した皮膚外用剤及び飲食品を提供すること。
【解決手段】クラミドモナス属に属する藻類の抽出物を含有することを特徴とする美白剤、並びに、前記美白剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤及び飲食品である。
【解決手段】クラミドモナス属に属する藻類の抽出物を含有することを特徴とする美白剤、並びに、前記美白剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤及び飲食品である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白効果を有する藻類エキス（藻類抽出物）を含有する美白剤、並びに、前記美白剤を利用した皮膚外用剤及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚においてメラニンは紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、次いで、５,６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・改善するため、即ち美白のためには、メラニンの産生を抑制すること、或いは既に産生したメラニンを淡色漂白することが有効であると考えられる。
【０００３】
また、これまでの美白剤開発は、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼに注力して進められてきたが、最近、紫外線ＵＶ−Ｂ照射後に表皮ケラチノサイトからの産生が上昇し、色素細胞（メラノサイト）を活性化するサイトカインとして、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、一酸化窒素、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）等が報告されており、これらが関与する情報伝達系を遮断することにより、メラニン産生を抑制して美白効果を導く物質の開発が盛んに行われるようになってきている。
このようなエンドセリン−１（ＥＴ−１）の色素細胞（メラノサイト）への作用を阻害する生薬の抽出物として、例えば、カミツレ抽出物及びアルテア抽出物が報告されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、安全性の高い天然物系のものであって、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさず、皮膚外用剤及び飲食品に広く使用可能な美白剤の更なる提供が、強く求められているのが現状である。
【０００５】
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル」，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．９，ｐ．６５〜７１，２０００年発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた美白作用（メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用等）を有し、かつ、安全性の高い美白剤、並びに、前記美白剤を利用した皮膚外用剤及び飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、クラミドモナス属に属する藻類の抽出物、中でも、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）の抽出物が、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかに基づく、優れた美白作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ クラミドモナス属に属する藻類の抽出物を含有することを特徴とする美白剤である。
＜２＞ クラミドモナス属に属する藻類が、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）である前記＜１＞に記載の美白剤である。
＜３＞ 抽出物が、エタノールと水との混合溶媒を用いて抽出される抽出物である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の美白剤である。
＜４＞ メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかを有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の美白剤である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の美白剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤である。
＜６＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の美白剤を含有することを特徴とする飲食品である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、優れた美白作用（メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用等）を有し、かつ、安全性の高い美白剤、並びに、前記美白剤を利用した皮膚外用剤及び飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（美白剤）
本発明の美白剤は、クラミドモナス属に属する藻類の抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１１】
前記美白剤は、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかに基づく美白作用を有するものである。前記クラミドモナス属に属する藻類（本明細書中において、単に「藻類」と称することがある）の抽出物が含有する、美白作用を発揮する物質の詳細については不明であるが、前記藻類の抽出物がこのような優れた作用を有し、美白剤として有用であることは、従来には全く知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
【００１２】
前記クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）に属する藻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、培養が容易であり、かつ、美白作用に優れる点で、クラミドモナスＷ８０株を使用することが好ましい。クラミドモナスＷ８０株は、日本国近畿地方の沿岸で採集された海産性のクラミドモナスであり、特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］にＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４として寄託されている。
【００１３】
前記藻類の培養方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法に従い行うことができ、例えば、特開２００６−２８４１２号公報に記載の方法等に従い行うことができる。また、前記藻類は、培養後、遠心分離等の常法を用いて回収することができる。
【００１４】
回収した前記藻類は、そのままの状態で、或いは、乾燥させた状態で、抽出原料として使用することができる。前記藻類を乾燥させる方法としては、特に制限はなく、例えば、フリーズドライ、スプレードライなどの手法が挙げられる。また、前記藻類は、細胞そのままの状態で、或いは、細胞を破砕した状態で、抽出原料として使用することができる。なお、前記藻類は、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、前記藻類の極性溶媒による抽出処理を、効率よく行うことができる。
【００１５】
前記藻類の抽出物は、藻類の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。また、前記藻類の抽出物としては、市販品を使用してもよい。なお、前記藻類の抽出物には、前記藻類の抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又は、これらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１６】
前記抽出に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又は、これらの混合溶媒を、室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。前記藻類に含まれる美白作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって、容易に抽出することができる。
【００１７】
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１８】
前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、該親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。これらの中でも、前記抽出溶媒としては、エタノールと水との混合溶媒を使用することが好ましい。
【００１９】
抽出原料である前記藻類から、美白作用を有する抽出物を抽出するにあたって、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出することができる。
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、前記抽出原料を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分〜４時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物を得ることができる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃にて１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃にて３０分間〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明の美白剤の有効成分として用いることができる。
【００２０】
抽出により得られる前記藻類の抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るため、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。なお、得られる前記藻類の抽出液は、そのままでも美白剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、常法を利用することができ、また、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、抽出原料である前記藻類は特有の匂いと味を有している場合があり、そのため、前記藻類の抽出物に対しては、生理活性の低下を招かない範囲で、脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、例えば皮膚化粧料に添加する場合などには大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製は、具体的には、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２１】
以上のようにして得られる前記藻類の抽出物は、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかを有し、これらの作用に基づき、本発明の美白剤の有効成分として好適に利用可能なものである。なお、前記藻類の抽出物は、前記した各作用に基づき、メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１産生抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制剤としても、それぞれ好適に利用可能である。
前記美白剤中の前記藻類の抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記美白剤は、前記藻類の抽出物そのものであってもよい。
また、前記美白剤中、前記藻類の抽出物は、いずれか１種のみが含まれていてもよいし、２種以上が含まれていてもよい。前記美白剤中に２種以上の藻類抽出物が含まれる場合の、各々の含有量比としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２２】
また、前記美白剤中に含まれ得る、前記藻類の抽出物以外のその他の成分としても、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記藻類の抽出物を所望の濃度に希釈等するための、生理食塩液などが挙げられる。また、前記美白剤中の前記その他の成分の含有量にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記美白剤は、必要に応じて製剤化することにより、粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。
【００２３】
本発明の美白剤は、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかに基づく優れた美白作用を有すると共に、安全性に優れるため、例えば、後述する本発明の皮膚外用剤、本発明の飲食品などへの利用に好適である。
【００２４】
（皮膚外用剤）
本発明の皮膚外用剤は、前記した本発明の美白剤を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
ここで、前記皮膚外用剤とは、皮膚に適用される各種の薬剤を意味し、その区分としては特に制限されるものではなく、例えば、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものである。
前記皮膚外用剤は、前記藻類の抽出物を、その活性を妨げないように任意の皮膚外用剤に配合したものであってもよいし、前記藻類の抽出物を主成分とした皮膚外用剤であってもよい。また、前記皮膚外用剤は、前記藻類の抽出物そのものであってもよい。
【００２５】
前記皮膚外用剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプーなどが挙げられる。
【００２６】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、皮膚外用剤を製造するにあたって通常用いられる成分、例えば、収斂剤、殺菌、抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、抗老化剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料などが挙げられる。
【００２７】
前記皮膚外用剤中の、前記美白剤の含有量としては、特に制限はなく、皮膚外用剤の種類などに応じて適宜選択することができるが、例えば、前記藻類の抽出物の量として、０．０００１〜１０質量％が好ましく、０．００１〜５質量％がより好ましい。
【００２８】
（飲食品）
本発明の飲食品は、前記した本発明の美白剤を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
ここで、前記飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口又は消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品などの区分に制限されるものではなく、例えば、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものを意味する。
前記飲食品は、前記藻類の抽出物を、その活性を妨げないように任意の飲食物に配合したものであってもよいし、前記藻類の抽出物を主成分とする栄養補助食品であってもよい。また、前記飲食品は、前記藻類の抽出物そのものであってもよい。
【００２９】
前記飲食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子類；カニ、サケ、アサリ、マグロ、イワシ、エビ、カツオ、サバ、クジラ、カキ、サンマ、イカ、アカガイ、ホタテ、アワビ、ウニ、イクラ、トコブシ等の水産物；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；カレー、シチュー、親子丼、お粥、雑炊、中華丼、かつ丼、天丼、うな丼、ハヤシライス、おでん、マーボドーフ、牛丼、ミートソース、玉子スープ、オムライス、餃子、シューマイ、ハンバーグ、ミートボール等のレトルトパウチ食品；種々の形態の健康食品や栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等の医薬品、医薬部外品などが挙げられる。
【００３０】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、飲食品を製造するにあたって通常用いられる、補助的原料又は添加物などが挙げられる。
前記補助的原料又は添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤などが挙げられる。
【００３１】
前記飲食品中の、前記美白剤の含有量としては、対象となる飲食品の種類に応じて異なり、一概には規定することができないが、例えば、飲食品本来の味を損なわない範囲で任意の飲食物に配合することを目的とする場合には、有効成分である前記藻類の抽出物の量として、０．００１質量％〜５０質量％が好ましく、０．０１質量％〜２０質量％がより好ましい。また、例えば、前記藻類の抽出物を主成分とする顆粒、錠剤、カプセル形態等の栄養補助飲食品を製造することを目的とする場合には、有効成分である前記藻類の抽出物の量として、０．０１質量％〜１００質量％が好ましく、５質量％〜１００質量％がより好ましい。
【００３２】
（効果）
本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品は、日常的に使用することが可能であり、有効成分である前記藻類の抽出物の働きによって、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかに基づく美白作用を、極めて効果的に発揮させることができるものである。そのため、本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品によれば、例えば、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）の予防・改善を、効果的に行えるようになることが期待される。
【００３３】
なお、本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなど）に対して適用することも可能である。また、本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品は、天然由来の前記藻類の抽出物を有効成分としたものであり、安全性に優れる点でも、有利である。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３５】
（製造例１）
−クラミドモナスＷ８０株の水抽出物の製造−
抽出原料として、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）の凍結乾燥品、１００ｇを、水１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、濾過した。濾液を６０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００３６】
（製造例２）
−クラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物の製造−
抽出原料として、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）の凍結乾燥品、１００ｇを、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：１）１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、濾過した。濾液を６０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００３７】
（製造例３）
−クラミドモナスＷ８０株の８０質量％エタノール抽出物の製造−
抽出原料として、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）の凍結乾燥品、１００ｇを、８０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：４）１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、濾過した。濾液を６０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（実施例１：メラニン産生抑制作用試験）
前記製造例２で得られたクラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりメラニン産生抑制作用を試験した。
【００４０】
Ｂ１６メラノーマ細胞を１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ テオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで８．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ テオフィリン含有ダルベッコＭＥＭを２ｍＬ加えた直径６０ｍｍシャーレに０．５ｍＬずつ播種し、８時間培養した。培養後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ テオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで終濃度の２倍に調製した被験試料を２．５ｍＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、トリプシン処理により細胞を回収し細胞数を数えた。その後、遠心（２，５００×ｇ、６分、室温）して培地を取り除き、１０％ＤＭＳＯ含有１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液２ｍＬを添加して超音波破砕機により細胞を破壊した。これをろ過し、得られたろ液の波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。
メラニン産生抑制作用の計算方法は以下のとおりである。結果を表２に示す。
メラニン産生抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×（Ｃ／Ｄ）×１００
Ａ：被験試料無添加での４７５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料添加での４７５ｎｍにおける吸光度
Ｃ：被験試料添加での細胞数
Ｄ：被験試料無添加での細胞数
【００４１】
【表２】
【００４２】
（実施例２：エンドセリン−１産生抑制作用試験）
前記製造例２で得られたクラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりエンドセリン−１産生抑制作用を試験した。
【００４３】
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＥｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２で希釈した後、６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり２ｍＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、ハンクス緩衝液１ｍＬで洗浄し、同緩衝液１ｍＬに交換した。これにＴＯＲＥＸ ＦＬ２０ＳＥ−３０／ＤＭＲを４灯装着した紫外線照射装置を光源として紫外線ＵＶ−Ｂを３０ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射後すぐに緩衝液を抜き、Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１．５ｍＬ添加して４８時間培養した。また、紫外線未照射・被験試料無添加の細胞に関しても、同様の条件で培養した。培養終了後、培養上清中に産生されたエンドセリン−１の量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
結果は、紫外線未照射・被験試料無添加、紫外線照射・被験試料無添加、及び、紫外線照射・被験試料添加の各培養上清中のエンドセリン−１量を定量し、紫外線未照射・被験試料無添加のエンドセリン−１量を１００とした時の紫外線照射・被験試料無添加、及び、紫外線照射・被験試料添加の産生量の割合（エンドセリン−１産生率）を算出した。なお、培養上清採取後にＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率の確認を行った。
エンドセリン−１産生抑制作用の計算方法は以下のとおりである。結果を表３に示す。
エンドセリン−１産生抑制率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／（Ａ−１００）｝×１００
Ａ：紫外線照射・被験試料無添加時のエンドセリン−１産生率
Ｂ：紫外線照射・被験試料添加時のエンドセリン−１産生率
【００４４】
【表３】
【００４５】
（実施例３：幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用試験）
前記製造例２で得られたクラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用を試験した。
【００４６】
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＥｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２で希釈した後、６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり２ｍＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、ハンクス緩衝液１ｍＬで洗浄し、同緩衝液１ｍＬに交換した。これにＴＯＲＥＸ ＦＬ２０ＳＥ−３０／ＤＭＲを４灯装着した紫外線照射装置を光源として紫外線ＵＶ−Ｂを３０ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射後すぐに緩衝液を抜き、Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１．５ｍＬ添加して４８時間培養した。また、紫外線未照射・被験試料無添加の細胞に関しても、同様の条件で培養した。培養終了後、培養上清中に産生されたＳＣＦの量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
結果は、紫外線未照射・被験試料無添加、紫外線照射・被験試料無添加、及び、紫外線照射・被験試料添加の各培養上清中のＳＣＦ量を定量し、紫外線未照射・被験試料無添加のＳＣＦ量を１００とした時の紫外線照射・被験試料無添加、及び、紫外線照射・被験試料添加の産生量の割合（ＳＣＦ産生率）を算出した。なお、培養上清採取後にＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率の確認を行った。
ＳＣＦ産生抑制作用の計算方法は以下のとおりである。結果を表４に示す。
ＳＣＦ産生抑制率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／（Ａ−１００）｝×１００
Ａ：紫外線照射・被験試料無添加時のＳＣＦ産生率
Ｂ：紫外線照射・被験試料添加時のＳＣＦ産生率
【００４７】
【表４】
【００４８】
実施例１〜３の結果から、クラミドモナスＷ８０株等のクラミドモナス属に属する藻類の抽出物は、優れたメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用を有することが確認され、美白剤の有効成分として、好適に利用可能であることが示された。
【００４９】
（配合例１）
−乳液−
下記組成に従い、乳液を常法により製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の水抽出物（製造例１）・・・０．１０ｇ
・ホホバオイル・・・４．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．５０ｇ
・オリーブオイル・・・２．００ｇ
・スクワラン・・・２．００ｇ
・セタノール・・・２．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・黄杞エキス・・・０．１０ｇ
・グリチルリチン酸ジカリウム・・・０．１０ｇ
・イチョウ葉エキス・・・０．１０ｇ
・コンキオリン・・・０．１０ｇ
・オウバクエキス・・・０．１０ｇ
・カツミレエキス・・・０．１０ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計１００．００ｇ）
【００５０】
（配合例２）
−化粧水−
下記組成に従い、化粧水を常法により製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物（製造例２）・・・０．１０ｇ
・グリセリン・・・３．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・クエン酸・・・０．１０ｇ
・クエン酸ソーダ・・・０．１０ｇ
・油溶性甘草エキス・・・０．１０ｇ
・海藻エキス・・・０．１０ｇ
・クジンエキス・・・０．１０ｇ
・キシロビオースミクスチャー・・・０．０５ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００５１】
（配合例３）
−クリーム−
下記組成に従い、クリームを常法により製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の８０質量％エタノール抽出物（製造例３）・・・０．１０ｇ
・スクワラン・・・１０．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・６．００ｇ
・流動パラフィン・・・５．００ｇ
・サラシミツロウ・・・４．００ｇ
・セタノール・・・３．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・３．００ｇ
・ラノリン・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．５０ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・１．５０ｇ
・ステアリン酸・・・１．００ｇ
・酵母抽出液・・・０．１０ｇ
・シソ抽出液・・・０．１０ｇ
・シナノキ抽出液・・・０．１０ｇ
・ジユ抽出液・・・０．１０ｇ
・香料・・・０．１０ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００５２】
（配合例４）
−パック−
下記組成に従い、パックを常法により製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の水抽出物（製造例１）・・・０．２０ｇ
・ポリビニルアルコール・・・１５．００ｇ
・エタノール・・・１０．００ｇ
・プロピレングリコール・・・７．００ｇ
・ポリエチレングリコール・・・３．００ｇ
・セージ抽出液・・・０．１０ｇ
・トウキ抽出液・・・０．１０ｇ
・オタネニンジン抽出液・・・０．１０ｇ
・パラオキシ安息香酸エチル・・・０．０５ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００５３】
（配合例５）
−錠剤状栄養補助食品−
下記の混合物を打錠して、錠剤状栄養補助食品を製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物（製造例２）・・・３０ｇ
・粉糖（ショ糖）・・・１７８ｇ
・ソルビット・・・１０ｇ
・グリセリン脂肪酸エステル・・・１２ｇ
【００５４】
（配合例６）
−顆粒状栄養補助食品−
下記の混合物を顆粒状に形成して、顆粒状栄養補助食品を製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の８０質量％エタノール抽出物（製造例３）・・・２０ｇ
・ビートオリゴ糖・・・１０００ｇ
・ビタミンＣ・・・１６７ｇ
・ステビア抽出物・・・１０ｇ
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品は、優れた美白作用を有するので、例えば、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）の予防・改善を目的とした皮膚外用剤や飲食品に、好適に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白効果を有する藻類エキス（藻類抽出物）を含有する美白剤、並びに、前記美白剤を利用した皮膚外用剤及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚においてメラニンは紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、次いで、５,６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・改善するため、即ち美白のためには、メラニンの産生を抑制すること、或いは既に産生したメラニンを淡色漂白することが有効であると考えられる。
【０００３】
また、これまでの美白剤開発は、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼに注力して進められてきたが、最近、紫外線ＵＶ−Ｂ照射後に表皮ケラチノサイトからの産生が上昇し、色素細胞（メラノサイト）を活性化するサイトカインとして、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、一酸化窒素、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）等が報告されており、これらが関与する情報伝達系を遮断することにより、メラニン産生を抑制して美白効果を導く物質の開発が盛んに行われるようになってきている。
このようなエンドセリン−１（ＥＴ−１）の色素細胞（メラノサイト）への作用を阻害する生薬の抽出物として、例えば、カミツレ抽出物及びアルテア抽出物が報告されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、安全性の高い天然物系のものであって、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさず、皮膚外用剤及び飲食品に広く使用可能な美白剤の更なる提供が、強く求められているのが現状である。
【０００５】
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル」，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．９，ｐ．６５〜７１，２０００年発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた美白作用（メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用等）を有し、かつ、安全性の高い美白剤、並びに、前記美白剤を利用した皮膚外用剤及び飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、クラミドモナス属に属する藻類の抽出物、中でも、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）の抽出物が、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかに基づく、優れた美白作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ クラミドモナス属に属する藻類の抽出物を含有することを特徴とする美白剤である。
＜２＞ クラミドモナス属に属する藻類が、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）である前記＜１＞に記載の美白剤である。
＜３＞ 抽出物が、エタノールと水との混合溶媒を用いて抽出される抽出物である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の美白剤である。
＜４＞ メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかを有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の美白剤である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の美白剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤である。
＜６＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の美白剤を含有することを特徴とする飲食品である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、優れた美白作用（メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用等）を有し、かつ、安全性の高い美白剤、並びに、前記美白剤を利用した皮膚外用剤及び飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（美白剤）
本発明の美白剤は、クラミドモナス属に属する藻類の抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１１】
前記美白剤は、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかに基づく美白作用を有するものである。前記クラミドモナス属に属する藻類（本明細書中において、単に「藻類」と称することがある）の抽出物が含有する、美白作用を発揮する物質の詳細については不明であるが、前記藻類の抽出物がこのような優れた作用を有し、美白剤として有用であることは、従来には全く知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
【００１２】
前記クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）に属する藻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、培養が容易であり、かつ、美白作用に優れる点で、クラミドモナスＷ８０株を使用することが好ましい。クラミドモナスＷ８０株は、日本国近畿地方の沿岸で採集された海産性のクラミドモナスであり、特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］にＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４として寄託されている。
【００１３】
前記藻類の培養方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法に従い行うことができ、例えば、特開２００６−２８４１２号公報に記載の方法等に従い行うことができる。また、前記藻類は、培養後、遠心分離等の常法を用いて回収することができる。
【００１４】
回収した前記藻類は、そのままの状態で、或いは、乾燥させた状態で、抽出原料として使用することができる。前記藻類を乾燥させる方法としては、特に制限はなく、例えば、フリーズドライ、スプレードライなどの手法が挙げられる。また、前記藻類は、細胞そのままの状態で、或いは、細胞を破砕した状態で、抽出原料として使用することができる。なお、前記藻類は、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、前記藻類の極性溶媒による抽出処理を、効率よく行うことができる。
【００１５】
前記藻類の抽出物は、藻類の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。また、前記藻類の抽出物としては、市販品を使用してもよい。なお、前記藻類の抽出物には、前記藻類の抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又は、これらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１６】
前記抽出に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又は、これらの混合溶媒を、室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。前記藻類に含まれる美白作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって、容易に抽出することができる。
【００１７】
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１８】
前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、該親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。これらの中でも、前記抽出溶媒としては、エタノールと水との混合溶媒を使用することが好ましい。
【００１９】
抽出原料である前記藻類から、美白作用を有する抽出物を抽出するにあたって、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出することができる。
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、前記抽出原料を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分〜４時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物を得ることができる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃にて１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃にて３０分間〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明の美白剤の有効成分として用いることができる。
【００２０】
抽出により得られる前記藻類の抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るため、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。なお、得られる前記藻類の抽出液は、そのままでも美白剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、常法を利用することができ、また、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、抽出原料である前記藻類は特有の匂いと味を有している場合があり、そのため、前記藻類の抽出物に対しては、生理活性の低下を招かない範囲で、脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、例えば皮膚化粧料に添加する場合などには大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製は、具体的には、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２１】
以上のようにして得られる前記藻類の抽出物は、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかを有し、これらの作用に基づき、本発明の美白剤の有効成分として好適に利用可能なものである。なお、前記藻類の抽出物は、前記した各作用に基づき、メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１産生抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制剤としても、それぞれ好適に利用可能である。
前記美白剤中の前記藻類の抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記美白剤は、前記藻類の抽出物そのものであってもよい。
また、前記美白剤中、前記藻類の抽出物は、いずれか１種のみが含まれていてもよいし、２種以上が含まれていてもよい。前記美白剤中に２種以上の藻類抽出物が含まれる場合の、各々の含有量比としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２２】
また、前記美白剤中に含まれ得る、前記藻類の抽出物以外のその他の成分としても、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記藻類の抽出物を所望の濃度に希釈等するための、生理食塩液などが挙げられる。また、前記美白剤中の前記その他の成分の含有量にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記美白剤は、必要に応じて製剤化することにより、粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。
【００２３】
本発明の美白剤は、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかに基づく優れた美白作用を有すると共に、安全性に優れるため、例えば、後述する本発明の皮膚外用剤、本発明の飲食品などへの利用に好適である。
【００２４】
（皮膚外用剤）
本発明の皮膚外用剤は、前記した本発明の美白剤を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
ここで、前記皮膚外用剤とは、皮膚に適用される各種の薬剤を意味し、その区分としては特に制限されるものではなく、例えば、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものである。
前記皮膚外用剤は、前記藻類の抽出物を、その活性を妨げないように任意の皮膚外用剤に配合したものであってもよいし、前記藻類の抽出物を主成分とした皮膚外用剤であってもよい。また、前記皮膚外用剤は、前記藻類の抽出物そのものであってもよい。
【００２５】
前記皮膚外用剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプーなどが挙げられる。
【００２６】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、皮膚外用剤を製造するにあたって通常用いられる成分、例えば、収斂剤、殺菌、抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、抗老化剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料などが挙げられる。
【００２７】
前記皮膚外用剤中の、前記美白剤の含有量としては、特に制限はなく、皮膚外用剤の種類などに応じて適宜選択することができるが、例えば、前記藻類の抽出物の量として、０．０００１〜１０質量％が好ましく、０．００１〜５質量％がより好ましい。
【００２８】
（飲食品）
本発明の飲食品は、前記した本発明の美白剤を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
ここで、前記飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口又は消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品などの区分に制限されるものではなく、例えば、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものを意味する。
前記飲食品は、前記藻類の抽出物を、その活性を妨げないように任意の飲食物に配合したものであってもよいし、前記藻類の抽出物を主成分とする栄養補助食品であってもよい。また、前記飲食品は、前記藻類の抽出物そのものであってもよい。
【００２９】
前記飲食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子類；カニ、サケ、アサリ、マグロ、イワシ、エビ、カツオ、サバ、クジラ、カキ、サンマ、イカ、アカガイ、ホタテ、アワビ、ウニ、イクラ、トコブシ等の水産物；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；カレー、シチュー、親子丼、お粥、雑炊、中華丼、かつ丼、天丼、うな丼、ハヤシライス、おでん、マーボドーフ、牛丼、ミートソース、玉子スープ、オムライス、餃子、シューマイ、ハンバーグ、ミートボール等のレトルトパウチ食品；種々の形態の健康食品や栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等の医薬品、医薬部外品などが挙げられる。
【００３０】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、飲食品を製造するにあたって通常用いられる、補助的原料又は添加物などが挙げられる。
前記補助的原料又は添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤などが挙げられる。
【００３１】
前記飲食品中の、前記美白剤の含有量としては、対象となる飲食品の種類に応じて異なり、一概には規定することができないが、例えば、飲食品本来の味を損なわない範囲で任意の飲食物に配合することを目的とする場合には、有効成分である前記藻類の抽出物の量として、０．００１質量％〜５０質量％が好ましく、０．０１質量％〜２０質量％がより好ましい。また、例えば、前記藻類の抽出物を主成分とする顆粒、錠剤、カプセル形態等の栄養補助飲食品を製造することを目的とする場合には、有効成分である前記藻類の抽出物の量として、０．０１質量％〜１００質量％が好ましく、５質量％〜１００質量％がより好ましい。
【００３２】
（効果）
本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品は、日常的に使用することが可能であり、有効成分である前記藻類の抽出物の働きによって、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかに基づく美白作用を、極めて効果的に発揮させることができるものである。そのため、本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品によれば、例えば、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）の予防・改善を、効果的に行えるようになることが期待される。
【００３３】
なお、本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなど）に対して適用することも可能である。また、本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品は、天然由来の前記藻類の抽出物を有効成分としたものであり、安全性に優れる点でも、有利である。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３５】
（製造例１）
−クラミドモナスＷ８０株の水抽出物の製造−
抽出原料として、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）の凍結乾燥品、１００ｇを、水１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、濾過した。濾液を６０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００３６】
（製造例２）
−クラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物の製造−
抽出原料として、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）の凍結乾燥品、１００ｇを、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：１）１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、濾過した。濾液を６０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００３７】
（製造例３）
−クラミドモナスＷ８０株の８０質量％エタノール抽出物の製造−
抽出原料として、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）の凍結乾燥品、１００ｇを、８０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：４）１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、濾過した。濾液を６０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（実施例１：メラニン産生抑制作用試験）
前記製造例２で得られたクラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりメラニン産生抑制作用を試験した。
【００４０】
Ｂ１６メラノーマ細胞を１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ テオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで８．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ テオフィリン含有ダルベッコＭＥＭを２ｍＬ加えた直径６０ｍｍシャーレに０．５ｍＬずつ播種し、８時間培養した。培養後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ テオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで終濃度の２倍に調製した被験試料を２．５ｍＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、トリプシン処理により細胞を回収し細胞数を数えた。その後、遠心（２，５００×ｇ、６分、室温）して培地を取り除き、１０％ＤＭＳＯ含有１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液２ｍＬを添加して超音波破砕機により細胞を破壊した。これをろ過し、得られたろ液の波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。
メラニン産生抑制作用の計算方法は以下のとおりである。結果を表２に示す。
メラニン産生抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×（Ｃ／Ｄ）×１００
Ａ：被験試料無添加での４７５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料添加での４７５ｎｍにおける吸光度
Ｃ：被験試料添加での細胞数
Ｄ：被験試料無添加での細胞数
【００４１】
【表２】
【００４２】
（実施例２：エンドセリン−１産生抑制作用試験）
前記製造例２で得られたクラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりエンドセリン−１産生抑制作用を試験した。
【００４３】
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＥｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２で希釈した後、６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり２ｍＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、ハンクス緩衝液１ｍＬで洗浄し、同緩衝液１ｍＬに交換した。これにＴＯＲＥＸ ＦＬ２０ＳＥ−３０／ＤＭＲを４灯装着した紫外線照射装置を光源として紫外線ＵＶ−Ｂを３０ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射後すぐに緩衝液を抜き、Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１．５ｍＬ添加して４８時間培養した。また、紫外線未照射・被験試料無添加の細胞に関しても、同様の条件で培養した。培養終了後、培養上清中に産生されたエンドセリン−１の量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
結果は、紫外線未照射・被験試料無添加、紫外線照射・被験試料無添加、及び、紫外線照射・被験試料添加の各培養上清中のエンドセリン−１量を定量し、紫外線未照射・被験試料無添加のエンドセリン−１量を１００とした時の紫外線照射・被験試料無添加、及び、紫外線照射・被験試料添加の産生量の割合（エンドセリン−１産生率）を算出した。なお、培養上清採取後にＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率の確認を行った。
エンドセリン−１産生抑制作用の計算方法は以下のとおりである。結果を表３に示す。
エンドセリン−１産生抑制率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／（Ａ−１００）｝×１００
Ａ：紫外線照射・被験試料無添加時のエンドセリン−１産生率
Ｂ：紫外線照射・被験試料添加時のエンドセリン−１産生率
【００４４】
【表３】
【００４５】
（実施例３：幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用試験）
前記製造例２で得られたクラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用を試験した。
【００４６】
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＥｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２で希釈した後、６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり２ｍＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、ハンクス緩衝液１ｍＬで洗浄し、同緩衝液１ｍＬに交換した。これにＴＯＲＥＸ ＦＬ２０ＳＥ−３０／ＤＭＲを４灯装着した紫外線照射装置を光源として紫外線ＵＶ−Ｂを３０ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射後すぐに緩衝液を抜き、Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１．５ｍＬ添加して４８時間培養した。また、紫外線未照射・被験試料無添加の細胞に関しても、同様の条件で培養した。培養終了後、培養上清中に産生されたＳＣＦの量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
結果は、紫外線未照射・被験試料無添加、紫外線照射・被験試料無添加、及び、紫外線照射・被験試料添加の各培養上清中のＳＣＦ量を定量し、紫外線未照射・被験試料無添加のＳＣＦ量を１００とした時の紫外線照射・被験試料無添加、及び、紫外線照射・被験試料添加の産生量の割合（ＳＣＦ産生率）を算出した。なお、培養上清採取後にＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率の確認を行った。
ＳＣＦ産生抑制作用の計算方法は以下のとおりである。結果を表４に示す。
ＳＣＦ産生抑制率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／（Ａ−１００）｝×１００
Ａ：紫外線照射・被験試料無添加時のＳＣＦ産生率
Ｂ：紫外線照射・被験試料添加時のＳＣＦ産生率
【００４７】
【表４】
【００４８】
実施例１〜３の結果から、クラミドモナスＷ８０株等のクラミドモナス属に属する藻類の抽出物は、優れたメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用を有することが確認され、美白剤の有効成分として、好適に利用可能であることが示された。
【００４９】
（配合例１）
−乳液−
下記組成に従い、乳液を常法により製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の水抽出物（製造例１）・・・０．１０ｇ
・ホホバオイル・・・４．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．５０ｇ
・オリーブオイル・・・２．００ｇ
・スクワラン・・・２．００ｇ
・セタノール・・・２．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・黄杞エキス・・・０．１０ｇ
・グリチルリチン酸ジカリウム・・・０．１０ｇ
・イチョウ葉エキス・・・０．１０ｇ
・コンキオリン・・・０．１０ｇ
・オウバクエキス・・・０．１０ｇ
・カツミレエキス・・・０．１０ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計１００．００ｇ）
【００５０】
（配合例２）
−化粧水−
下記組成に従い、化粧水を常法により製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物（製造例２）・・・０．１０ｇ
・グリセリン・・・３．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・クエン酸・・・０．１０ｇ
・クエン酸ソーダ・・・０．１０ｇ
・油溶性甘草エキス・・・０．１０ｇ
・海藻エキス・・・０．１０ｇ
・クジンエキス・・・０．１０ｇ
・キシロビオースミクスチャー・・・０．０５ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００５１】
（配合例３）
−クリーム−
下記組成に従い、クリームを常法により製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の８０質量％エタノール抽出物（製造例３）・・・０．１０ｇ
・スクワラン・・・１０．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・６．００ｇ
・流動パラフィン・・・５．００ｇ
・サラシミツロウ・・・４．００ｇ
・セタノール・・・３．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・３．００ｇ
・ラノリン・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．５０ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・１．５０ｇ
・ステアリン酸・・・１．００ｇ
・酵母抽出液・・・０．１０ｇ
・シソ抽出液・・・０．１０ｇ
・シナノキ抽出液・・・０．１０ｇ
・ジユ抽出液・・・０．１０ｇ
・香料・・・０．１０ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００５２】
（配合例４）
−パック−
下記組成に従い、パックを常法により製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の水抽出物（製造例１）・・・０．２０ｇ
・ポリビニルアルコール・・・１５．００ｇ
・エタノール・・・１０．００ｇ
・プロピレングリコール・・・７．００ｇ
・ポリエチレングリコール・・・３．００ｇ
・セージ抽出液・・・０．１０ｇ
・トウキ抽出液・・・０．１０ｇ
・オタネニンジン抽出液・・・０．１０ｇ
・パラオキシ安息香酸エチル・・・０．０５ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００５３】
（配合例５）
−錠剤状栄養補助食品−
下記の混合物を打錠して、錠剤状栄養補助食品を製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の５０質量％エタノール抽出物（製造例２）・・・３０ｇ
・粉糖（ショ糖）・・・１７８ｇ
・ソルビット・・・１０ｇ
・グリセリン脂肪酸エステル・・・１２ｇ
【００５４】
（配合例６）
−顆粒状栄養補助食品−
下記の混合物を顆粒状に形成して、顆粒状栄養補助食品を製造した。
・クラミドモナスＷ８０株の８０質量％エタノール抽出物（製造例３）・・・２０ｇ
・ビートオリゴ糖・・・１０００ｇ
・ビタミンＣ・・・１６７ｇ
・ステビア抽出物・・・１０ｇ
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の美白剤、並びに、皮膚外用剤及び飲食品は、優れた美白作用を有するので、例えば、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）の予防・改善を目的とした皮膚外用剤や飲食品に、好適に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミドモナス属に属する藻類の抽出物を含有することを特徴とする美白剤。
【請求項２】
クラミドモナス属に属する藻類が、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）である請求項１に記載の美白剤。
【請求項３】
抽出物が、エタノールと水との混合溶媒を用いて抽出される抽出物である請求項１から２のいずれかに記載の美白剤。
【請求項４】
メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかを有する請求項１から３のいずれかに記載の美白剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の美白剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の美白剤を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項１】
クラミドモナス属に属する藻類の抽出物を含有することを特徴とする美白剤。
【請求項２】
クラミドモナス属に属する藻類が、クラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４７４）である請求項１に記載の美白剤。
【請求項３】
抽出物が、エタノールと水との混合溶媒を用いて抽出される抽出物である請求項１から２のいずれかに記載の美白剤。
【請求項４】
メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１産生抑制作用、及び、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）産生抑制作用の少なくともいずれかを有する請求項１から３のいずれかに記載の美白剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の美白剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の美白剤を含有することを特徴とする飲食品。
【公開番号】特開２０１０−１３４１３（Ｐ２０１０−１３４１３Ａ）
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１７６６６０（Ｐ２００８−１７６６６０）
【出願日】平成２０年７月７日（２００８．７．７）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【出願人】（０００１５６９３８）関西電力株式会社 (1,442)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月７日（２００８．７．７）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【出願人】（０００１５６９３８）関西電力株式会社 (1,442)
【Ｆターム（参考）】
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