肺高血圧症発症関連遺伝子を用いた肺高血圧症の診断および治療
【課題】 本発明は、肺高血圧症発症関連遺伝子、またはその翻訳産物であるタンパク質における変異の変異の有無を検出することにより、肺高血圧症の発症またはその発症可能性を簡便に判定する方法などを提供する。
【解決手段】 本発明においては、肺高血圧症発症関連遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質の変異が肺高血圧症の発症に関係していることを明らかにし、この変異の有無を検出することによって、肺高血圧症の発症またはその発症可能性を簡便に判定する方法などを確立した。
【解決手段】 本発明においては、肺高血圧症発症関連遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質の変異が肺高血圧症の発症に関係していることを明らかにし、この変異の有無を検出することによって、肺高血圧症の発症またはその発症可能性を簡便に判定する方法などを確立した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺高血圧症の発症可能性の新たな判定方法および判定キット等に関するものであって、特に、肺高血圧症発症関連遺伝子またはその翻訳産物たるタンパク質の変異の有無を検出することを特徴とする肺高血圧症の発症可能性の新たな判定方法および判定キット等を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
肺高血圧症（pulmonary hypertension、以下「ＰＨ」ともいう）は肺動脈の血圧が高くなる疾患である。ＰＨの症状を経過とともに追うと、まず、早期段階では、無症状であり、進行すると、労作時息切れ、労作時呼吸困難などの症状が現れる。ＰＨがさらに進行すると、右室が肥大、拡張して右心不全の状態となり、下肢、顔面のむくみといった症状が現れる。そして、最悪の場合には、右心不全を併発して死に至ることもある。
【０００３】
また、ＰＨはしばしば自己免疫疾患である混合型結合組織病（mixed connective tissue disease、以下「ＭＣＴＤ」ともいう）の合併症として認められる。ＰＨは、わが国におけるＭＣＴＤによる死因の第１位にもなっている。したがって、ＰＨ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【０００４】
ＰＨの診断は、右心カテーテル検査によって前毛細血管性ＰＨを確認することにより行う。しかしながら、上記右心カテーテル検査は、必ずしもすべての施設で行える検査とはいえないことから、確定診断まで至らない症例が多く存在するのも事実である。
【０００５】
また、ＰＨの治療は、通常、病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段が異なる。一般的には、組織低酸素血症を改善し、肺動脈を直接弛緩させることを期待して、長期酸素吸入が試みられている。また、ワルファリン投与などの抗凝固療法や各種血管拡張剤による肺血管拡張療法も行われている。
【０００６】
ＰＨの原因は完全には解明されていないが、抗核抗体などの自己抗体がしばしば陽性であること、ＭＣＴＤに代表される膠原病に伴って発症する場合があることなどから、何らかの免疫学的異常が関与していると考えられている。また、家族性の発症例もみられることから、遺伝的要因が考慮されているが、未だ明らかなものは認められていない。したがって、有効な治療方法を確立するためにも、ＰＨの発症原因を明らかにすることが求められている。
【０００７】
一方で、ＰＨが合併症として認められることが多い膠原病の一つである関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）において、最近、その発症との因果関係が認められる遺伝子異常が報告された（特許文献１を参照）。特許文献１では、ＲＡ患者集団において、ＲＡの疾患感受性遺伝子（以下、「ＲＡ関連遺伝子」ともいう）、特にアンジオポエチン１遺伝子変異が有意に多いことが示されている。
【特許文献１】特開２００３−２０４７９０公報（２００３年７月２２日公開）
【非特許文献１】Gavin Thurston et al., Angiopoietin-1 protects the adult vasculature against plasma leakage, Nature Medicine, 6, 460-463 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、ＰＨの初期段階では、無症状なため、患者自身がＰＨであることに気づかず、重篤な症状に至ることが多い。そのため、ＰＨは早期に確定診断を下す方法が求められている。しかしながら、ＰＨの確定診断を行うには、特殊な設備が必要であり、そのような設備を有さない医療機関では診断することが困難であるという問題がある。
【０００９】
さらに、ＰＨは、その発症原因としては、遺伝的要因が考慮されているが、未だ明らかなものは認められていない。そのため、原因に応じた治療ができず、治療方法が確立されていない。
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＰＨ発症との因果関係がある遺伝子（以下「ＰＨ関連遺伝子」ともいう）を同定し、それを利用して簡便にＰＨの発症またはその発症可能性を判定（診断）する方法、およびその判定（診断）キットを提供することにある。さらに、上記遺伝子に変異を持つＰＨ患者に対する有効な治療方法および治療薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＲＡ関連遺伝子における変異の有無とＰＨの発症との間の関連性について検証することにより、ＲＡ関連遺伝子がＰＨ関連遺伝子であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかるＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質をコードするＰＨ関連遺伝子における変異の有無を検出することを特徴としている。
【００１３】
また、上記ＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料において、配列番号２に示される塩基配列を有し、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」（Ｇ、Ｔはそれぞれグアニン、チミンを表す）の３塩基挿入変異をもつＰＨ関連遺伝子における変異の有無を検出することを特徴としている。
【００１４】
さらに、上記ＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料において、上記タンパク質における変異の有無を検出することを特徴としている。
【００１５】
また、本発明にかかるＰＨの発症またはその発症の可能性の判定キットは上記いずれかのＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法を利用することが好ましい。
【００１６】
上記ＰＨの発症またはその発症の可能性の判定キットは、プライマー、プローブおよび抗体の中から少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００１７】
さらに、上記プライマーは、上記ＰＨ関連遺伝子の上記変異位置を含む領域を増幅するためのプライマーであることが好ましい。
【００１８】
上記プローブは、上記ＰＨ関連遺伝子の上記変異位置を含む領域に結合することが好ましい。
【００１９】
また、上記抗体は、上記タンパク質の上記変異部位を認識することが好ましい。
【００２０】
本発明にかかるＰＨの治療方法は、上記の変異タンパク質を有するＰＨ患者に、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴としている。
【００２１】
さらに、本発明にかかるＰＨの治療薬剤は、上記の変異タンパク質を有するＰＨ患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とすることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２２】
以上のように、本発明によれば、変異をもつＰＨ関連遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質を利用して、それらにおける変異の有無を検出することにより、ＰＨの発症またはその発症の可能性を判定することができる。それゆえ、ＰＨの発症またはその発症可能性を簡便に判定することができるという効果を奏する。さらに、変異のないＰＨ関連遺伝子もしくはその翻訳産物であるタンパク質を用いることにより、ＰＨの治療や治療薬剤の開発への応用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の実施形態について、説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
［実施の形態１］
（ＰＨ関連遺伝子）
本発明にかかるＰＨ関連遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質をコードする遺伝子である。本発明にかかるＰＨ関連遺伝子としては、具体的には、配列番号２に示される塩基配列を有し、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基挿入変異を持ったアンジオポエチン１遺伝子を例に挙げることができる。上記第８０５〜８０７番目の塩基は、アンジオポエチン１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）の第１１１４〜１１１６番目の塩基に相当する。
【００２５】
上記「遺伝子」とは、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドを含む意味であり、本発明にかかる遺伝子としては、上記アンジオポエチン１遺伝子のｃＤＮＡのほか、このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡや、このｍＲＮＡの鋳型となるゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、翻訳領域以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やプロモーター配列、ベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２６】
本発明にかかるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質である。このタンパク質は、上記アンジオポエチン１遺伝子の翻訳産物であり、さらに付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓタグ等によって当タンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
［実施の形態２］
（ＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法）
本発明にかかるＰＨの発症またはその発症可能性の判定方法（換言すれば、ＰＨの診断方法）において、具体的に、（１）ゲノムＤＮＡを用いる場合、（２）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる場合、（３）本発明にかかるタンパク質を用いる場合を挙げることができる。以下、これら３種の方法について説明する。
（１）ゲノムＤＮＡを用いる場合
ゲノムＤＮＡを用いる本判定方法は、例えば次のようにして実施できる。
【００２７】
被験者のゲノムは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、末梢血から得ることも可能である。
【００２８】
得られたゲノムは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いることができる。
【００２９】
ゲノム上の変異の有無を検出する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法などが挙げられる。
【００３０】
例えば、ゲノムから、遺伝子上の上記変異位置を含む領域を増幅後、得られるＰＣＲ産物をサブクローニングし、これをダイレクトシークエンスすることによってゲノム上の変異の有無を検出できる。
【００３１】
また、遺伝子上の上記変異位置を含む領域をオリゴヌクレオチドプローブに用いることによって、ゲノム上の変異の有無を検出できる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、上記変異位置を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをチップ上に固定してＤＮＡチップを構成し、当該ＤＮＡチップを上記変異の有無の検出用に用いるような場合が挙げられる。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの長さとしては、上記変異位置を含む７〜５０ヌクレオチド、あるいは１０〜３０ヌクレオチドが好ましく、１５〜２５ヌクレオチドがより好ましい。
【００３２】
また、ゲノム上の変異の有無は、適当な制限酵素を使用し、切断されるゲノム断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても検出することができる。
【００３３】
このように、ゲノム上の変異を検出することにより、被験者のＰＨの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる。具体的には、３塩基欠失型ホモが検出された場合は、ＰＨを発症している可能性または将来発症する可能性は低く、一方、ヘテロおよび３塩基挿入型ホモが検出された場合は、ＰＨを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。
【００３４】
なお、上記判定方法により使用されるプライマーおよびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
（２）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる場合
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記変異位置を含む領域を増幅後、上記と同様、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはＤＮＡチップを用いることにより、あるいはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、上記変異の有無を検出できる。
【００３５】
上記変異位置を含む領域の増幅に用いるプライマーとしては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のプライマーの組み合わせによりｃＤＮＡを鋳型とした増幅反応が可能である。
センスプライマー：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマー：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
アンチセンスプライマー：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号５）
このように、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異を検出することにより、上記と同様、被験者のＰＨの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる。
（３）タンパク質を用いる場合
被験者の細胞より調製したタンパク質を利用する場合、配列番号１のアミノ酸配列において上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出する方法が挙げられる。このグリシン挿入の有無の検出は、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよいが、例えば、グリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられ、好ましくは、グリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法が挙げられる。
【００３６】
このように、上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出することにより、被験者のＰＨの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる。具体的には、グリシン挿入型タンパク質が検出されなかった場合（換言すれば、グリシン欠落型タンパク質しか検出されなかった場合）は、ＰＨを発症している可能性または将来発症する可能性は低く、一方、両方のタンパク質が検出された場合および特にグリシン挿入型タンパク質のみが検出された場合は、ＰＨを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。
【００３７】
なお、上記被験者は、特に限定されるものではないが、ＭＣＴＤを発症している者が好ましく、ＭＣＴＤおよび強皮症（以下「ＳＳｃ」ともいう）を併発している者がより好ましい。
【００３８】
さらに、本発明にかかるＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法が適用されるサンプルは、人体等の生体から分離された試料であればよく、上記例示されたものに限定されるものではない。
［実施の形態３］
（ＰＨの発症またはその発症可能性の判定キット）
本発明にかかるＰＨの発症またはその発症可能性の判定キット（換言すれば、ＰＨの診断キット）は、上記の変異を検出できる試薬、例えば、プライマー、プローブ、抗体などを含むものであれば特に限定されず、さらにその他の試薬を組み合わせることにより得ることができる。
【００３９】
例えば、ゲノム上およびｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異の有無を検出するキットとしては、上記変異位置を含む領域を増幅できるように設計されたプライマーを含み、さらに、上記変異の有無を検出できるように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、変異を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、変異の検出の妨げとならない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００４０】
プライマーを含むキットの場合、プライマーは、上記変異位置を含む領域を増幅できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば上記配列番号３、４および５に示されるプライマーから選択して用いることができる。
【００４１】
また、タンパク質上の変異の有無を検出するキットとしては、例えばグリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を含むキットなどが挙げられる。
【００４２】
これらの判定キットを使用することにより、上記のように、ＰＨの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる
また、本発明にかかるＰＨの発症またはその発症可能性の判定キットが適用される被験者は特に限定されるものではないが、ＭＣＴＤを発症している者が好ましく、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している者がより好ましい。
［実施の形態４］
（正常型ＰＨ発症関連タンパク質などのＰＨの治療方法および治療薬剤への利用）
このように、ＰＨ関連遺伝子上の３塩基挿入変異をもち、これに対応するアミノ酸配列上のグリシン挿入変異をもつＰＨの患者に正常型タンパク質（即ち、グリシン欠落型タンパク質）を補完することは、ＰＨの治療法として有効であると考えられる。そこで、本発明は、（１）ＰＨの治療方法、および（２）ＰＨの治療薬剤に用いてもよい。
（１）ＰＨの治療方法
上記グリシン挿入変異を持ったタンパク質を有するＰＨ患者に、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完するＰＨの治療方法であることが好ましい。
（２）ＰＨの治療薬剤
上記グリシン挿入変異を持ったタンパク質を有するＰＨ患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とするＰＨの治療薬剤であることが好ましい。
【００４３】
上記のＰＨの治療方法および治療薬剤では、正常型タンパク質の補完方法は特に限定されるものではない。例えば、公知のタンパク質発現系や遺伝子導入方法などを用いることができる。具体的には、哺乳細胞にタンパク質を発現させる場合に用いる発現ベクターやウイルスベクターなどを用いた方法が挙げられる。また、アンジオポエチン１は、ＴＩＥ２受容体のリガンドであることが知られている（非特許文献１を参照）。したがって、このＴＩＥ２受容体のアゴニストとして作用する低分子化合物を経口または静注などによって体内に投与することもＰＨの治療法として有効であると考えられる。なお、ここでいう低分子化合物とは、ペプチドなどのタンパク質を含む。
【００４４】
また、上記正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡと、上記ＴＩＥ２受容体のアゴニストとしての低分子化合物とは、治療薬剤として択一的に使用されるだけでなく、組み合わせて使用することも可能である。
【００４５】
また、本発明にかかるＰＨの治療方法もしくは治療薬剤が適用される被験者は特に限定されるものではないが、ＭＣＴＤを発症している者が好ましく、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している者がより好ましい。
【００４６】
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。
【実施例】
【００４７】
本発明について、実施例および図１〜５に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、以下の実施例におけるアンジオポエチン１遺伝子における変異の有無は次のようにして評価した。
［アンジオポエチン１遺伝子における変異の有無の評価方法］
（１）配列分析
被験者の末梢血を、公知の方法によりＥＤＴＡ採血した。採血した上記末梢血からRNA isolation kit （GENTRA SYSTEMS, MN）を用いて、トータルＲＮＡを単離した。単離した上記トータルＲＮＡから公知の方法により、Oligo dTプライマーによる逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。そして、アンジオポエチン１遺伝子のエクソン４から５にかけて設定したプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅断片を得た。なお、上記の反応に使用したプライマーは、以下に示すとおりである。
センスプライマーＦ２−２：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマーＦ２−４：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
アンチセンスプライマーＲ１１８６：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号５）
また、上記センスプライマーＦ２−２およびＦ２−４、ならびに上記アンチセンスプライマーＲ１１８６の設定位置については、図１に示すとおりである。
【００４８】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅条件は以下の通りである。まず、上記合成ｃＤＮＡを鋳型に、上記センスプライマーＦ２−２およびアンチセンスプライマーＲ１１８６をプライマーに用いて、ＲＴ−ＰＣＲによる断片増幅を行った。
【００４９】
上記ＲＴ−ＰＣＲにおける反応液は、ｃＤＮＡ、１×ＰＣＲ−Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Applied Biosystems）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、２００ｎＭ のそれぞれのプライマー、２．５ＵのAmpliTaq Gold DNA-Polymerase （Applied Biosystems）を含むように調製した。
【００５０】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１２分の行程を１サイクル、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で１分の行程を３０サイクルとした。
【００５１】
以上の条件によりＲＴ−ＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物１μｌを鋳型とし、プライマーに上記センスプライマーＦ２−４およびアンチセンスプライマーＲ１１８６を用いて、上記の反応液組成および反応条件でＰＣＲを行い、増幅断片を得た。
【００５２】
その結果、得られた増幅断片をエタノール沈殿により精製した。次に、精製した増幅断片を使って、上記センスプライマーＦ２−４とBigDye Terminator(Applied Biosystems, CA） を用いたダイターミネーター法によって配列分析用の試料を調製した。その後、蛍光ＤＮＡシークエンサー（ABI377、Applied Biosystems）にて、その試料の配列分析を行った。配列解析により決定した上記増幅断片の配列を、アンジオポエチン１遺伝子の既報配列(アクセッション番号：Ｕ８３５０８)と比較することにより、アンジオポエチン１遺伝子における変異の有無を評価することとした（図２右側上段、中段を参照）。ヘテロの場合は塩基番号８０５からシークエンスフェログラム（波形シグナル）の重複を認めることにより判定することとした（図２右側下段を参照）。
（２）鎖長分析
上記の配列分析の場合と同様の方法で増幅断片を得た。ただし、鎖長分析では、上記センスプライマーＦ２−４はＴＥＴ蛍光標識したものを用いた。最終ＰＣＲ反応産物を１０倍に希釈した上記増幅断片を含む溶液を用いて、鎖長分析を行った。鎖長分析は上記の希釈された増幅断片を含む溶液を１μｌ、５ｍｇ／ｍｌ Blue Dextran、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、分子量マーカーＧＳ５００ ＴＡＭＲＡ（Applied Biosystems）０．３μｌを含むホルムアミド液３μｌを試料とし、蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて行った。
【００５３】
鎖長分析の結果、１０１塩基もしくは９８塩基のピークのいずれが出現するかにより、アンジオポエチン１遺伝子における変異の有無を判定することとした（図２左側上段、中段を参照）。また、１０１塩基と９８塩基との両方のピークが出現する場合には、ヘテロであると判定することとした（図２左側下段を参照）。
［実施例１］
ＭＣＴＤ患者から上記の方法で採血した末梢血を用いて、上記の配列解析および鎖長解析を行った。図３は、変異位置を含む領域のシークエンス解析結果を示している。図３に示すように、アンジオポエチン１遺伝子においては、３塩基挿入型および３塩基欠失型の２種類が存在することが見出された。なお、同図（左）が３塩基挿入型の解析結果であり、同図（右）が３塩基欠失型の解析結果である。つまり、３塩基挿入型では、「ＧＧＴ」の３塩基挿入が生じていることが確認でき（図３（左）を参照）、３塩基欠失型では、この３塩基が欠落していることが確認できた（図３（右）を参照）。
【００５４】
なお、配列番号２には、このうち３塩基挿入型の遺伝子配列が示されている。この３塩基挿入型では、配列番号２に示されるように、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基が挿入されている。
【００５５】
また、上記３塩基挿入型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質は、配列番号１に示されるように、そのアミノ酸配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンが挿入されている。一方、上記３塩基欠失型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質においては、この第２６９番目のグリシンが欠落している。
［実施例２］
ＲＡ患者、ＭＣＴＤ患者、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者、ならびに健常者から採血した末梢血を用いて、上記方法により、アンジオポエチン１遺伝子における上記３塩基挿入変異の有無を検出した結果を図４に示す。
【００５６】
なお、図４において、ｎは各種被験者の全体数を示し、正常型遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「−／−」と示す）、変異型遺伝子をヘテロで有する者（図中および以下、「ｍｔ／−」と示す）、変異型遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「ｍｔ／ｍｔ」と示す）の数をそれぞれの欄に示している。さらに、括弧内には、各種被験者における上記それぞれの者の割合を示す。
【００５７】
図４に示すように、健常者では、「-/-」は１１．９％、「mt/-」は７８．０％、「mt/mt」は１０．１％であった。ＲＡ患者では、「-/-」は５．１％、「mt/-」は７９．０％、「mt/mt」は２４．５％であった。また、ＭＣＴＤ患者では、「-/-」は１０．５％、「mt/-」は３４．２％、「mt/mt」は５５．３％であった。さらに、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者では、「-/-」は６．４％、「mt/-」は３８．３％、「mt/mt」は５５．３％であった。
［実施例３］
図４中のＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者について、ＰＨ、レイノー現象および関節炎の発症頻度を調べた。その結果を図５に示す。
【００５８】
なお、図５において、正常型遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「-/-」と示す）、変異型遺伝子をヘテロで有する者（図中および以下、「mt/-」と示す）、変異型遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「mt/mt」と示す）のうち、上記各種症状を発症している患者の割合（分母は各種被験者数、分子は各種症状の発症者数を表す）をそれぞれの欄に示している。さらに、括弧内には、上記割合を百分率％で示している。
【００５９】
図５に示すように、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者のうち、レイノー現象を発症している患者は、「-/-」では３３．３％、「mt/-」では、３８．９％、「mt/mt」では５３．８％であった。また、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者のうち、関節炎を発症している患者は、「-/-」では６６．７％、「mt/-」では、２７．８％、「mt/mt」では３８．５％であった。このことから、レイノー現象や関節炎の発症と、アンジオポエチン１の変異には有意な関連性が認められなかった。
【００６０】
一方、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者のうち、ＰＨを発症している患者は、「-/-」では０％、「mt/-」では、１７．６％、「mt/mt」では１２．５％であった。このことから、アンジオポエチン１の変異の有無は、ＰＨの発症に関係することが確認された。また、その変異型アンジオポエチン１遺伝子をホモで有する者とヘテロで有する者との間には、ＰＨの発症に関して大きな違いは見られなかった。
【００６１】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上のように、本発明では、ＰＨ関連遺伝子もしくはそれをコードする遺伝子における変異を検出することにより、ＰＨの発症の可能性を予測することができるため、ＰＨの発症またはその発症可能性の判定方法や判定キットに代表される診断医療の分野に利用することができる。さらには、変異のないＰＨ関連遺伝子もしくはそれをコードする遺伝子を用いることにより、ＰＨの治療や治療するための薬剤に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明にかかるＰＨ関連遺伝子のｃＤＮＡの一部を模式的に示した概略図である。
【図２】本実施例において、ＰＨ関連遺伝子の３塩基挿入変異位置を含む領域の配列解析および鎖長解析を行った結果を示す図である。図の右側は、配列解析の結果であり、左側は、鎖長解析の結果である。
【図３】本実施例において、ＰＨ関連遺伝子の３塩基挿入変異位置を含む領域のシークエンス解析を行った結果を示す図である。同図（左）は、３塩基挿入型のシークエンス解析の結果であり、同図（右）は、３塩基欠損型のシークエンス解析の結果である。
【図４】本実施例において、ＲＡ患者、ＭＣＴＤ患者、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者、ならびに健常者において、３塩基挿入変異の有無の検出を行った結果を示す表である。
【図５】本実施例において、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者で、さらに、ＰＨ、レイノー現象または関節炎を発症している患者において、３塩基挿入変異の有無の検出を行った結果を示す表である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺高血圧症の発症可能性の新たな判定方法および判定キット等に関するものであって、特に、肺高血圧症発症関連遺伝子またはその翻訳産物たるタンパク質の変異の有無を検出することを特徴とする肺高血圧症の発症可能性の新たな判定方法および判定キット等を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
肺高血圧症（pulmonary hypertension、以下「ＰＨ」ともいう）は肺動脈の血圧が高くなる疾患である。ＰＨの症状を経過とともに追うと、まず、早期段階では、無症状であり、進行すると、労作時息切れ、労作時呼吸困難などの症状が現れる。ＰＨがさらに進行すると、右室が肥大、拡張して右心不全の状態となり、下肢、顔面のむくみといった症状が現れる。そして、最悪の場合には、右心不全を併発して死に至ることもある。
【０００３】
また、ＰＨはしばしば自己免疫疾患である混合型結合組織病（mixed connective tissue disease、以下「ＭＣＴＤ」ともいう）の合併症として認められる。ＰＨは、わが国におけるＭＣＴＤによる死因の第１位にもなっている。したがって、ＰＨ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【０００４】
ＰＨの診断は、右心カテーテル検査によって前毛細血管性ＰＨを確認することにより行う。しかしながら、上記右心カテーテル検査は、必ずしもすべての施設で行える検査とはいえないことから、確定診断まで至らない症例が多く存在するのも事実である。
【０００５】
また、ＰＨの治療は、通常、病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段が異なる。一般的には、組織低酸素血症を改善し、肺動脈を直接弛緩させることを期待して、長期酸素吸入が試みられている。また、ワルファリン投与などの抗凝固療法や各種血管拡張剤による肺血管拡張療法も行われている。
【０００６】
ＰＨの原因は完全には解明されていないが、抗核抗体などの自己抗体がしばしば陽性であること、ＭＣＴＤに代表される膠原病に伴って発症する場合があることなどから、何らかの免疫学的異常が関与していると考えられている。また、家族性の発症例もみられることから、遺伝的要因が考慮されているが、未だ明らかなものは認められていない。したがって、有効な治療方法を確立するためにも、ＰＨの発症原因を明らかにすることが求められている。
【０００７】
一方で、ＰＨが合併症として認められることが多い膠原病の一つである関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）において、最近、その発症との因果関係が認められる遺伝子異常が報告された（特許文献１を参照）。特許文献１では、ＲＡ患者集団において、ＲＡの疾患感受性遺伝子（以下、「ＲＡ関連遺伝子」ともいう）、特にアンジオポエチン１遺伝子変異が有意に多いことが示されている。
【特許文献１】特開２００３−２０４７９０公報（２００３年７月２２日公開）
【非特許文献１】Gavin Thurston et al., Angiopoietin-1 protects the adult vasculature against plasma leakage, Nature Medicine, 6, 460-463 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、ＰＨの初期段階では、無症状なため、患者自身がＰＨであることに気づかず、重篤な症状に至ることが多い。そのため、ＰＨは早期に確定診断を下す方法が求められている。しかしながら、ＰＨの確定診断を行うには、特殊な設備が必要であり、そのような設備を有さない医療機関では診断することが困難であるという問題がある。
【０００９】
さらに、ＰＨは、その発症原因としては、遺伝的要因が考慮されているが、未だ明らかなものは認められていない。そのため、原因に応じた治療ができず、治療方法が確立されていない。
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＰＨ発症との因果関係がある遺伝子（以下「ＰＨ関連遺伝子」ともいう）を同定し、それを利用して簡便にＰＨの発症またはその発症可能性を判定（診断）する方法、およびその判定（診断）キットを提供することにある。さらに、上記遺伝子に変異を持つＰＨ患者に対する有効な治療方法および治療薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＲＡ関連遺伝子における変異の有無とＰＨの発症との間の関連性について検証することにより、ＲＡ関連遺伝子がＰＨ関連遺伝子であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかるＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質をコードするＰＨ関連遺伝子における変異の有無を検出することを特徴としている。
【００１３】
また、上記ＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料において、配列番号２に示される塩基配列を有し、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」（Ｇ、Ｔはそれぞれグアニン、チミンを表す）の３塩基挿入変異をもつＰＨ関連遺伝子における変異の有無を検出することを特徴としている。
【００１４】
さらに、上記ＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料において、上記タンパク質における変異の有無を検出することを特徴としている。
【００１５】
また、本発明にかかるＰＨの発症またはその発症の可能性の判定キットは上記いずれかのＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法を利用することが好ましい。
【００１６】
上記ＰＨの発症またはその発症の可能性の判定キットは、プライマー、プローブおよび抗体の中から少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００１７】
さらに、上記プライマーは、上記ＰＨ関連遺伝子の上記変異位置を含む領域を増幅するためのプライマーであることが好ましい。
【００１８】
上記プローブは、上記ＰＨ関連遺伝子の上記変異位置を含む領域に結合することが好ましい。
【００１９】
また、上記抗体は、上記タンパク質の上記変異部位を認識することが好ましい。
【００２０】
本発明にかかるＰＨの治療方法は、上記の変異タンパク質を有するＰＨ患者に、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴としている。
【００２１】
さらに、本発明にかかるＰＨの治療薬剤は、上記の変異タンパク質を有するＰＨ患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とすることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２２】
以上のように、本発明によれば、変異をもつＰＨ関連遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質を利用して、それらにおける変異の有無を検出することにより、ＰＨの発症またはその発症の可能性を判定することができる。それゆえ、ＰＨの発症またはその発症可能性を簡便に判定することができるという効果を奏する。さらに、変異のないＰＨ関連遺伝子もしくはその翻訳産物であるタンパク質を用いることにより、ＰＨの治療や治療薬剤の開発への応用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の実施形態について、説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
［実施の形態１］
（ＰＨ関連遺伝子）
本発明にかかるＰＨ関連遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質をコードする遺伝子である。本発明にかかるＰＨ関連遺伝子としては、具体的には、配列番号２に示される塩基配列を有し、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基挿入変異を持ったアンジオポエチン１遺伝子を例に挙げることができる。上記第８０５〜８０７番目の塩基は、アンジオポエチン１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）の第１１１４〜１１１６番目の塩基に相当する。
【００２５】
上記「遺伝子」とは、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドを含む意味であり、本発明にかかる遺伝子としては、上記アンジオポエチン１遺伝子のｃＤＮＡのほか、このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡや、このｍＲＮＡの鋳型となるゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、翻訳領域以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やプロモーター配列、ベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２６】
本発明にかかるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質である。このタンパク質は、上記アンジオポエチン１遺伝子の翻訳産物であり、さらに付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓタグ等によって当タンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
［実施の形態２］
（ＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法）
本発明にかかるＰＨの発症またはその発症可能性の判定方法（換言すれば、ＰＨの診断方法）において、具体的に、（１）ゲノムＤＮＡを用いる場合、（２）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる場合、（３）本発明にかかるタンパク質を用いる場合を挙げることができる。以下、これら３種の方法について説明する。
（１）ゲノムＤＮＡを用いる場合
ゲノムＤＮＡを用いる本判定方法は、例えば次のようにして実施できる。
【００２７】
被験者のゲノムは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、末梢血から得ることも可能である。
【００２８】
得られたゲノムは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いることができる。
【００２９】
ゲノム上の変異の有無を検出する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法などが挙げられる。
【００３０】
例えば、ゲノムから、遺伝子上の上記変異位置を含む領域を増幅後、得られるＰＣＲ産物をサブクローニングし、これをダイレクトシークエンスすることによってゲノム上の変異の有無を検出できる。
【００３１】
また、遺伝子上の上記変異位置を含む領域をオリゴヌクレオチドプローブに用いることによって、ゲノム上の変異の有無を検出できる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、上記変異位置を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをチップ上に固定してＤＮＡチップを構成し、当該ＤＮＡチップを上記変異の有無の検出用に用いるような場合が挙げられる。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの長さとしては、上記変異位置を含む７〜５０ヌクレオチド、あるいは１０〜３０ヌクレオチドが好ましく、１５〜２５ヌクレオチドがより好ましい。
【００３２】
また、ゲノム上の変異の有無は、適当な制限酵素を使用し、切断されるゲノム断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても検出することができる。
【００３３】
このように、ゲノム上の変異を検出することにより、被験者のＰＨの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる。具体的には、３塩基欠失型ホモが検出された場合は、ＰＨを発症している可能性または将来発症する可能性は低く、一方、ヘテロおよび３塩基挿入型ホモが検出された場合は、ＰＨを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。
【００３４】
なお、上記判定方法により使用されるプライマーおよびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
（２）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる場合
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記変異位置を含む領域を増幅後、上記と同様、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはＤＮＡチップを用いることにより、あるいはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、上記変異の有無を検出できる。
【００３５】
上記変異位置を含む領域の増幅に用いるプライマーとしては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のプライマーの組み合わせによりｃＤＮＡを鋳型とした増幅反応が可能である。
センスプライマー：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマー：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
アンチセンスプライマー：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号５）
このように、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異を検出することにより、上記と同様、被験者のＰＨの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる。
（３）タンパク質を用いる場合
被験者の細胞より調製したタンパク質を利用する場合、配列番号１のアミノ酸配列において上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出する方法が挙げられる。このグリシン挿入の有無の検出は、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよいが、例えば、グリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられ、好ましくは、グリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法が挙げられる。
【００３６】
このように、上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出することにより、被験者のＰＨの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる。具体的には、グリシン挿入型タンパク質が検出されなかった場合（換言すれば、グリシン欠落型タンパク質しか検出されなかった場合）は、ＰＨを発症している可能性または将来発症する可能性は低く、一方、両方のタンパク質が検出された場合および特にグリシン挿入型タンパク質のみが検出された場合は、ＰＨを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。
【００３７】
なお、上記被験者は、特に限定されるものではないが、ＭＣＴＤを発症している者が好ましく、ＭＣＴＤおよび強皮症（以下「ＳＳｃ」ともいう）を併発している者がより好ましい。
【００３８】
さらに、本発明にかかるＰＨの発症またはその発症の可能性の判定方法が適用されるサンプルは、人体等の生体から分離された試料であればよく、上記例示されたものに限定されるものではない。
［実施の形態３］
（ＰＨの発症またはその発症可能性の判定キット）
本発明にかかるＰＨの発症またはその発症可能性の判定キット（換言すれば、ＰＨの診断キット）は、上記の変異を検出できる試薬、例えば、プライマー、プローブ、抗体などを含むものであれば特に限定されず、さらにその他の試薬を組み合わせることにより得ることができる。
【００３９】
例えば、ゲノム上およびｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異の有無を検出するキットとしては、上記変異位置を含む領域を増幅できるように設計されたプライマーを含み、さらに、上記変異の有無を検出できるように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、変異を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、変異の検出の妨げとならない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００４０】
プライマーを含むキットの場合、プライマーは、上記変異位置を含む領域を増幅できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば上記配列番号３、４および５に示されるプライマーから選択して用いることができる。
【００４１】
また、タンパク質上の変異の有無を検出するキットとしては、例えばグリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を含むキットなどが挙げられる。
【００４２】
これらの判定キットを使用することにより、上記のように、ＰＨの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる
また、本発明にかかるＰＨの発症またはその発症可能性の判定キットが適用される被験者は特に限定されるものではないが、ＭＣＴＤを発症している者が好ましく、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している者がより好ましい。
［実施の形態４］
（正常型ＰＨ発症関連タンパク質などのＰＨの治療方法および治療薬剤への利用）
このように、ＰＨ関連遺伝子上の３塩基挿入変異をもち、これに対応するアミノ酸配列上のグリシン挿入変異をもつＰＨの患者に正常型タンパク質（即ち、グリシン欠落型タンパク質）を補完することは、ＰＨの治療法として有効であると考えられる。そこで、本発明は、（１）ＰＨの治療方法、および（２）ＰＨの治療薬剤に用いてもよい。
（１）ＰＨの治療方法
上記グリシン挿入変異を持ったタンパク質を有するＰＨ患者に、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完するＰＨの治療方法であることが好ましい。
（２）ＰＨの治療薬剤
上記グリシン挿入変異を持ったタンパク質を有するＰＨ患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とするＰＨの治療薬剤であることが好ましい。
【００４３】
上記のＰＨの治療方法および治療薬剤では、正常型タンパク質の補完方法は特に限定されるものではない。例えば、公知のタンパク質発現系や遺伝子導入方法などを用いることができる。具体的には、哺乳細胞にタンパク質を発現させる場合に用いる発現ベクターやウイルスベクターなどを用いた方法が挙げられる。また、アンジオポエチン１は、ＴＩＥ２受容体のリガンドであることが知られている（非特許文献１を参照）。したがって、このＴＩＥ２受容体のアゴニストとして作用する低分子化合物を経口または静注などによって体内に投与することもＰＨの治療法として有効であると考えられる。なお、ここでいう低分子化合物とは、ペプチドなどのタンパク質を含む。
【００４４】
また、上記正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡと、上記ＴＩＥ２受容体のアゴニストとしての低分子化合物とは、治療薬剤として択一的に使用されるだけでなく、組み合わせて使用することも可能である。
【００４５】
また、本発明にかかるＰＨの治療方法もしくは治療薬剤が適用される被験者は特に限定されるものではないが、ＭＣＴＤを発症している者が好ましく、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している者がより好ましい。
【００４６】
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。
【実施例】
【００４７】
本発明について、実施例および図１〜５に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、以下の実施例におけるアンジオポエチン１遺伝子における変異の有無は次のようにして評価した。
［アンジオポエチン１遺伝子における変異の有無の評価方法］
（１）配列分析
被験者の末梢血を、公知の方法によりＥＤＴＡ採血した。採血した上記末梢血からRNA isolation kit （GENTRA SYSTEMS, MN）を用いて、トータルＲＮＡを単離した。単離した上記トータルＲＮＡから公知の方法により、Oligo dTプライマーによる逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。そして、アンジオポエチン１遺伝子のエクソン４から５にかけて設定したプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅断片を得た。なお、上記の反応に使用したプライマーは、以下に示すとおりである。
センスプライマーＦ２−２：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマーＦ２−４：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
アンチセンスプライマーＲ１１８６：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号５）
また、上記センスプライマーＦ２−２およびＦ２−４、ならびに上記アンチセンスプライマーＲ１１８６の設定位置については、図１に示すとおりである。
【００４８】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅条件は以下の通りである。まず、上記合成ｃＤＮＡを鋳型に、上記センスプライマーＦ２−２およびアンチセンスプライマーＲ１１８６をプライマーに用いて、ＲＴ−ＰＣＲによる断片増幅を行った。
【００４９】
上記ＲＴ−ＰＣＲにおける反応液は、ｃＤＮＡ、１×ＰＣＲ−Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Applied Biosystems）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、２００ｎＭ のそれぞれのプライマー、２．５ＵのAmpliTaq Gold DNA-Polymerase （Applied Biosystems）を含むように調製した。
【００５０】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１２分の行程を１サイクル、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で１分の行程を３０サイクルとした。
【００５１】
以上の条件によりＲＴ−ＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物１μｌを鋳型とし、プライマーに上記センスプライマーＦ２−４およびアンチセンスプライマーＲ１１８６を用いて、上記の反応液組成および反応条件でＰＣＲを行い、増幅断片を得た。
【００５２】
その結果、得られた増幅断片をエタノール沈殿により精製した。次に、精製した増幅断片を使って、上記センスプライマーＦ２−４とBigDye Terminator(Applied Biosystems, CA） を用いたダイターミネーター法によって配列分析用の試料を調製した。その後、蛍光ＤＮＡシークエンサー（ABI377、Applied Biosystems）にて、その試料の配列分析を行った。配列解析により決定した上記増幅断片の配列を、アンジオポエチン１遺伝子の既報配列(アクセッション番号：Ｕ８３５０８)と比較することにより、アンジオポエチン１遺伝子における変異の有無を評価することとした（図２右側上段、中段を参照）。ヘテロの場合は塩基番号８０５からシークエンスフェログラム（波形シグナル）の重複を認めることにより判定することとした（図２右側下段を参照）。
（２）鎖長分析
上記の配列分析の場合と同様の方法で増幅断片を得た。ただし、鎖長分析では、上記センスプライマーＦ２−４はＴＥＴ蛍光標識したものを用いた。最終ＰＣＲ反応産物を１０倍に希釈した上記増幅断片を含む溶液を用いて、鎖長分析を行った。鎖長分析は上記の希釈された増幅断片を含む溶液を１μｌ、５ｍｇ／ｍｌ Blue Dextran、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、分子量マーカーＧＳ５００ ＴＡＭＲＡ（Applied Biosystems）０．３μｌを含むホルムアミド液３μｌを試料とし、蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて行った。
【００５３】
鎖長分析の結果、１０１塩基もしくは９８塩基のピークのいずれが出現するかにより、アンジオポエチン１遺伝子における変異の有無を判定することとした（図２左側上段、中段を参照）。また、１０１塩基と９８塩基との両方のピークが出現する場合には、ヘテロであると判定することとした（図２左側下段を参照）。
［実施例１］
ＭＣＴＤ患者から上記の方法で採血した末梢血を用いて、上記の配列解析および鎖長解析を行った。図３は、変異位置を含む領域のシークエンス解析結果を示している。図３に示すように、アンジオポエチン１遺伝子においては、３塩基挿入型および３塩基欠失型の２種類が存在することが見出された。なお、同図（左）が３塩基挿入型の解析結果であり、同図（右）が３塩基欠失型の解析結果である。つまり、３塩基挿入型では、「ＧＧＴ」の３塩基挿入が生じていることが確認でき（図３（左）を参照）、３塩基欠失型では、この３塩基が欠落していることが確認できた（図３（右）を参照）。
【００５４】
なお、配列番号２には、このうち３塩基挿入型の遺伝子配列が示されている。この３塩基挿入型では、配列番号２に示されるように、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基が挿入されている。
【００５５】
また、上記３塩基挿入型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質は、配列番号１に示されるように、そのアミノ酸配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンが挿入されている。一方、上記３塩基欠失型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質においては、この第２６９番目のグリシンが欠落している。
［実施例２］
ＲＡ患者、ＭＣＴＤ患者、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者、ならびに健常者から採血した末梢血を用いて、上記方法により、アンジオポエチン１遺伝子における上記３塩基挿入変異の有無を検出した結果を図４に示す。
【００５６】
なお、図４において、ｎは各種被験者の全体数を示し、正常型遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「−／−」と示す）、変異型遺伝子をヘテロで有する者（図中および以下、「ｍｔ／−」と示す）、変異型遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「ｍｔ／ｍｔ」と示す）の数をそれぞれの欄に示している。さらに、括弧内には、各種被験者における上記それぞれの者の割合を示す。
【００５７】
図４に示すように、健常者では、「-/-」は１１．９％、「mt/-」は７８．０％、「mt/mt」は１０．１％であった。ＲＡ患者では、「-/-」は５．１％、「mt/-」は７９．０％、「mt/mt」は２４．５％であった。また、ＭＣＴＤ患者では、「-/-」は１０．５％、「mt/-」は３４．２％、「mt/mt」は５５．３％であった。さらに、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者では、「-/-」は６．４％、「mt/-」は３８．３％、「mt/mt」は５５．３％であった。
［実施例３］
図４中のＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者について、ＰＨ、レイノー現象および関節炎の発症頻度を調べた。その結果を図５に示す。
【００５８】
なお、図５において、正常型遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「-/-」と示す）、変異型遺伝子をヘテロで有する者（図中および以下、「mt/-」と示す）、変異型遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「mt/mt」と示す）のうち、上記各種症状を発症している患者の割合（分母は各種被験者数、分子は各種症状の発症者数を表す）をそれぞれの欄に示している。さらに、括弧内には、上記割合を百分率％で示している。
【００５９】
図５に示すように、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者のうち、レイノー現象を発症している患者は、「-/-」では３３．３％、「mt/-」では、３８．９％、「mt/mt」では５３．８％であった。また、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者のうち、関節炎を発症している患者は、「-/-」では６６．７％、「mt/-」では、２７．８％、「mt/mt」では３８．５％であった。このことから、レイノー現象や関節炎の発症と、アンジオポエチン１の変異には有意な関連性が認められなかった。
【００６０】
一方、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者のうち、ＰＨを発症している患者は、「-/-」では０％、「mt/-」では、１７．６％、「mt/mt」では１２．５％であった。このことから、アンジオポエチン１の変異の有無は、ＰＨの発症に関係することが確認された。また、その変異型アンジオポエチン１遺伝子をホモで有する者とヘテロで有する者との間には、ＰＨの発症に関して大きな違いは見られなかった。
【００６１】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上のように、本発明では、ＰＨ関連遺伝子もしくはそれをコードする遺伝子における変異を検出することにより、ＰＨの発症の可能性を予測することができるため、ＰＨの発症またはその発症可能性の判定方法や判定キットに代表される診断医療の分野に利用することができる。さらには、変異のないＰＨ関連遺伝子もしくはそれをコードする遺伝子を用いることにより、ＰＨの治療や治療するための薬剤に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明にかかるＰＨ関連遺伝子のｃＤＮＡの一部を模式的に示した概略図である。
【図２】本実施例において、ＰＨ関連遺伝子の３塩基挿入変異位置を含む領域の配列解析および鎖長解析を行った結果を示す図である。図の右側は、配列解析の結果であり、左側は、鎖長解析の結果である。
【図３】本実施例において、ＰＨ関連遺伝子の３塩基挿入変異位置を含む領域のシークエンス解析を行った結果を示す図である。同図（左）は、３塩基挿入型のシークエンス解析の結果であり、同図（右）は、３塩基欠損型のシークエンス解析の結果である。
【図４】本実施例において、ＲＡ患者、ＭＣＴＤ患者、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者、ならびに健常者において、３塩基挿入変異の有無の検出を行った結果を示す表である。
【図５】本実施例において、ＭＣＴＤおよびＳＳｃを併発している患者で、さらに、ＰＨ、レイノー現象または関節炎を発症している患者において、３塩基挿入変異の有無の検出を行った結果を示す表である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された試料において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異をもつタンパク質をコードする肺高血圧症発症関連遺伝子における変異の有無を検出することを特徴とする肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項２】
生体から分離された試料において、配列番号２に示される塩基配列を有し、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」（Ｇ、Ｔはそれぞれグアニン、チミンを表す）の３塩基挿入変異をもつ肺高血圧症関連遺伝子における変異の有無を検出することを特徴とする肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項３】
生体から分離された試料において、請求項１に記載のタンパク質における変異の有無を検出することを特徴とする肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定方法を利用することを特徴とする肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項５】
上記肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キットが、プライマー、プローブおよび抗体の中から少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項４に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項６】
上記プライマーが、上記肺高血圧症発症関連遺伝子の上記変異位置を含む領域を増幅するためのプライマーであることを特徴とする請求項５に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項７】
上記プローブが、上記肺高血圧症発症関連遺伝子の上記変異位置を含む領域に結合することを特徴とする請求項５に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項８】
上記抗体が、請求項１に記載のタンパク質の上記変異部位を認識することを特徴とする請求項５に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項９】
請求項１に記載の変異タンパク質を有する肺高血圧症患者に、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴とする肺高血圧症の治療方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の変異タンパク質を有する肺高血圧症患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とする肺高血圧症の治療薬剤。
【請求項１】
生体から分離された試料において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異をもつタンパク質をコードする肺高血圧症発症関連遺伝子における変異の有無を検出することを特徴とする肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項２】
生体から分離された試料において、配列番号２に示される塩基配列を有し、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」（Ｇ、Ｔはそれぞれグアニン、チミンを表す）の３塩基挿入変異をもつ肺高血圧症関連遺伝子における変異の有無を検出することを特徴とする肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項３】
生体から分離された試料において、請求項１に記載のタンパク質における変異の有無を検出することを特徴とする肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定方法を利用することを特徴とする肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項５】
上記肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キットが、プライマー、プローブおよび抗体の中から少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項４に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項６】
上記プライマーが、上記肺高血圧症発症関連遺伝子の上記変異位置を含む領域を増幅するためのプライマーであることを特徴とする請求項５に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項７】
上記プローブが、上記肺高血圧症発症関連遺伝子の上記変異位置を含む領域に結合することを特徴とする請求項５に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項８】
上記抗体が、請求項１に記載のタンパク質の上記変異部位を認識することを特徴とする請求項５に記載の肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項９】
請求項１に記載の変異タンパク質を有する肺高血圧症患者に、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴とする肺高血圧症の治療方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の変異タンパク質を有する肺高血圧症患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とする肺高血圧症の治療薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２３０２４１（Ｐ２００６−２３０２４１Ａ）
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−４７３４４（Ｐ２００５−４７３４４）
【出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]