胚幹細胞を用いたトランスジェニック鳥類の生産方法
本発明は、鳥類の胚幹（ＥＳ）細胞を培養する方法であって、ａ）鳥類未孵卵受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；ならびに動物血清；さらに所望により、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン１１（Ｉｌ−１１）、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンを含んでなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子、を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間さらに培養する工程；ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦ、ＦＧＦ、Ｉｌ−６、Ｉｌ−６Ｒ、ＬＩＦ、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンならびにＩｌ−１１から選択される少なくとも１つの増殖因子を除去する工程；ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程、を含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、鳥類バイオテクノロジー、特にトランスジェニック鳥を生産する方法に関する。本発明は、卵において目的の組換えタンパク質を大量に発現するトランスジェニック鳥を作り出すのに特に有用である。
【０００２】
臨床開発において生体分子は４００を超え、市場は３００億ドルを越えて、治療分野はこの１５年で加速的成長を経験した。大部分の組換えタンパク質は、完全な生物学的活性を得るために特異的な翻訳後修飾を必要とし、そのため大規模バイオリアクター内で増殖させた哺乳類細胞において生産しなければならない。かかる生産システムにかかわるコストは、重要な量的必要性と相まって、製品開発までのプロセス全体の遅延増大に関与する。これに関連して、とりわけ前記修飾が生殖細胞系列を通じてその後代に伝達され得るならば、トランスジェニック動物は経済的に魅力的な代替手段に相当し得る。
【０００３】
ウサギ、ヤギおよびウシは目的の多量性を導いたが、長年にわたり雌鳥がニワトリ卵における治療用組換えタンパク質の迅速でコスト効果の高い生産のための最も魅力的な生物学的生産システムと考えられてきた。実際に、商業雌鳥は１年に約２５０個の卵を産み、各卵には大体４ｇの卵白タンパク質が含まれるため、ニワトリの産卵能力は並外れている。１個の卵によって１００ｍｇの組換えタンパク質しか生産されなかったとしても、１０００匹の雌鳥の小群によって１年に２５ｋｇの未加工組換えタンパク質材料を生産することができるであろう。加えて、商業卵産業はすでに高度に自動化されており、数十年にわたってニワトリ卵によって多くのヒトワクチンが生産されていることから監督官庁も卵由来製品に不安を抱かない。
【０００４】
また、養鶏業では商業的関心の高い遺伝形質の選抜促進のために遺伝子導入を利用すること（すなわち「メタ−クローニング技術(meta-cloning technology)」）にも関心を寄せる場合がある。所望の雛を短期間に得るために古典的な選抜スキーム：［系統−＞ＧＧＰ−＞ＧＰ−＞ＰＳ］をバイパスすることがその狙いであろう。家禽生産におけるトランスジェニック技術の最も有望な利用は、トランスジェニック植物においては一般的なことである病害抵抗性を与えることまたは食物同化を改善することである。加えて、トランスジェニック技術は、鳥類遺伝資源を保存する戦略でもある。これまでのところ、養鶏業において最も価値のある動物である純種動物を異なる場所に分割することが、繁殖用施設において問題（例えばウイルス感染）が発生した場合における数年間にわたる選抜プログラムの損失を防ぐ唯一の方法である。かかるアプローチは費用がかかり、２００３年におけるオランダの場合のように、ウイルス感染を検査するために地元の家禽総ての予防的排除を実行する国家公衆衛生決議に対して保証するものではない。
【０００５】
改変動物の工学技術には、まずその動物のゲノムへの導入遺伝子の安定した導入が含まれる。２５年来研究されている異なるＤＮＡ導入技術は：（ｉ）ＤＮＡマイクロインジェクション、（ｉｉ）ウイルス形質導入、（ｉｉｉ）精子を介した遺伝子導入、（ｉｖ）核移植、（ｖ）始原生殖細胞、または（ｖｉ）胚幹細胞を利用した細胞に基づいた導入である。雛では、導入遺伝子の生殖細胞系伝達に関してＤＮＡマイクロインジェクションアプローチ(Love et al, 1994 Biotechnology 12:60-63)およびウイルス形質導入(Bosselman et al, 1990 J. Reprod. Fertil. Suppl. 41: 183-195)の有効性しか確認されていない。しかしながら、これら２つの技術はいくつかの制限を受け；それらは厄介で困難なものであり、一つには導入遺伝子のランダム組込みおよびサイレンシングが原因で有効性は低い。ウイルス形質導入技術には、ウイルスベクターに組み込む導入遺伝子のサイズというさらなる制限がある。これら２つの技術では現在も商業的開発に適合するタンパク質発現レベルに到達させることができなかった。
【０００６】
予めin vitroで遺伝学的に操作した始原生殖細胞（ＰＧＣ）または胚幹（ＥＳ）細胞の発生中の雛胚への注入は、とりわけこれらの技術によって、導入遺伝子の高発現レベルを可能にするゲノム内特定部位への導入遺伝子の組込みを対象とすることができることから鳥類遺伝子導入の有望な技術に含まれる。しかしながら、トランスジェニック雛の生産にこのアプローチを利用するためには、重要な要件を満たさねばならず：細胞はin vitro操作に対して生き延び、一方でなお、レシピエント胚内に組み込まれ、その生殖細胞系列に定着し、その後、その後代に修飾を伝達するそれらの能力を維持しなければならない。
【０００７】
これまでに、それぞれのプロセスステップでの異なる技術的障害を克服するために多くの試みがなされ、現在では、非孵卵胚から単離した新鮮単離胚盤葉細胞を産まれたての胚の胚下腔に注入することによって体細胞および生殖細胞系列キメラが得られている。ドナー細胞およびレシピエント細胞の寄与は、（ｉ）白黒色素沈着試験を通してメラニン細胞集団により（Barred RocksまたはBrown LeghornsはＩ遺伝子座に劣性対立遺伝子を有し、一方White LeghornsはＩ遺伝子座に優性対立遺伝子を有する）；（ｉｉ）ＤＮＡフィンガープリント解析を通して赤血球集団により；（ｉｉｉ）ドナー由来表現型を有する後代の解析を通して生殖腺により(Petitte et al, 1990 Development 108:185-189; Carsience et al, 1993 Development 117:669-675; Thoraval et al, 1994 Poultry Science 73:1897-1905; Pain et al, 1996 Development 122:2339-2348)評価した。体細胞組織と生殖細胞系列の両方への寄与を示すキメラは、胚盤葉細胞を培養から４８時間後(Etches et al, 1996 Mol. Reprod. Dev. 45:291-288)最大７日後まで(Pain et al, 1996)注入したときに観察された。Etches et al, 1996では、マウス繊維芽細胞と同時培養した細胞の注入後に体細胞性が著しく強いキメラが観察されることが示されている。Pain et al (1996)では、鳥類胚盤葉細胞をＳＴＯマウス繊維芽細胞系統上に播種した。培養維持した細胞のＥＳ状態は、ＥＣＭＡ−７およびＳＳＥＡ−１エピトープの発現ならびにテロメラーゼ活性に依存した(Pain et al, 1996)。胚盤葉細胞の分化がない増殖は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および他の因子、Ｉｌ−１１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１の存在によって刺激を受け、抗レチノイン酸モノクローナル抗体への曝露によって分化は阻害された(Pain et al, 1996)。レシピエント胚を、ドナー細胞の注入前に照射暴露によって損傷させたときに、ドナー由来細胞による胚の定着が促進されることは示されている(Carsience et al, 1993)。
【０００８】
しかしながら、培養維持した胚盤葉細胞では、新たに調製した細胞の注入後に観察された体細胞キメラ現象の頻度および程度と比較して体細胞組織への寄与の低下を示す少数のキメラが得られた。さらに、それでも細胞に基づいた鳥類遺伝子導入戦略の各構成部分が成し遂げられる可能性があることが示されたが；ＥＳ細胞技術を用いて得られたトランスジェニック動物は記載されていない。
【０００９】
トランスジェニックニワトリを作製する効率的な方法がなお必要である。これが本発明の目的である。
【００１０】
この目的を達成するために、そして本発明の目的に従って、本明細書において具体化し、広く記載したとおり、本発明は、鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を培養する方法であって、
ａ）好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、
−インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および／または繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；さらに
−所望により、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン１１（Ｉｌ−１１）、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンを含んでなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子；
ならびに
−動物血清；
を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間、好ましくは、２〜２０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦ、ＦＧＦ、Ｉｌ−６、Ｉｌ−６Ｒ、ＬＩＦ、オンコスタチン、カルジオトロフィンおよびＩｌ−１１から選択された少なくとも１つの増殖因子を除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含んでなる方法を提供する。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明の鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ならびに動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間、好ましくは、２〜２０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦ、ＦＧＦ、Ｉｌ−６およびＩｌ−６Ｒを含んでなる群から選択された少なくとも１つの増殖因子を除去する、好ましくは、該培養培地から、増殖因子ＳＣＦ、ＦＧＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒを除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含んでなる。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、本発明の鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦおよびＦＧＦを含んでなる群から選択された少なくとも１つの増殖因子を除去する、好ましくは、該培養培地から、両方の増殖因子 ＳＣＦおよびＦＧＦを除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含む。
【００１３】
本発明の方法の任意選択工程ｃ）は、培養中にＥＳ細胞の死および／または分化の徴候が観察されるときに実施する。分化の徴候の例は、例えば特徴的な形態型（例えば上皮細胞種または繊維芽細胞種など）への細胞の形態学的変化である。分化の別の例は、ＥＳ細胞マーカー（ＥＳ細胞マーカーであるテロメラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ＳＳＥＡ−１抗原など）の発現の不在または減少である。
【００１４】
より好ましい実施形態では、本発明の、鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を工程ａ）の培地中でさらに培養する工程；
を含む。
【００１５】
別のより好ましい実施形態では、本発明の、鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）鳥類未孵卵受精卵胚盤葉板（blastoderm disk of fertilized un-incubated avain egg(s)）由来のＥＳ細胞を少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を工程ａ）の培地中でさらに培養する工程；
を含む。
【００１６】
別のより好ましい実施形態では、本発明の、鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）鳥類未孵卵受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を工程ａ）の培地中でさらに培養する工程；
を含む。
【００１７】
本明細書における用語「鳥類」とは、分類学上の綱”ava”の生物の任意の種、亜種または品種、限定されるものではないが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリなどを指すことが意図される。本明細書における用語「鳥類」、「鳥」、「鳥綱（aves）」または「ava」は、同じ意味を有することが意図され、区別せずに用いられる。好ましい実施形態では、「鳥」とは、以下の分類学上の目の任意の動物を指す：
−「ガンカモ目(Anseriformes)」（すなわちカモ、ガチョウ、ハクチョウおよび同類）。ガンカモ目というこの目には、３つの科に属する約１５０種の鳥が含まれる：サケビドリ科（Anhimidae）（サケビドリ類）、カササギガン科(Anseranatidae)（カササギガン）、およびガンカモ科(Anatidae)（１４０種を超えるミズドリ、中でもカモ、ガチョウ、およびハクチョウを含む）。前記目に属する総ての種は、水表面での水中生活に高度に適応している。総てには、効率的に遊泳するために足に水かきがある（一部は後に主として陸生となった）。この用語には、カモの様々な系統、例えばPekin duckおよびMuscovy duckが含まれる。
【００１８】
−「キジ目(Galliformes)」（すなわちニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、キジおよび同類）。このキジ目は、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラおよびキジを含む鳥目である。世界的には約２５６種が認められる。この用語には、セキショクヤケイ(Gallus gallus)、またはニワトリの様々な系統、例えばS86N、Valo、White Leghorn、Brown Leghorn、Sussex、New Hampshire、Rhode Island、Ausstralorp、Minorca、Amrox、California Gray、East Lansing、Italian-Partridge-colored、Marans、Barred Rock、Cou Nu Rouge(CNR)、GF30、ISAならびにシチメンチョウ、キジ、ウズラ、および一般的に繁殖させる他の家禽の系統が含まれる。
【００１９】
−「ハト目(Columbiformes)」（すなわちイエバトおよび同類）。ハト目というこの鳥目には非常に一般的なハトおよびイエバトが含まれる。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明の鳥類細胞はニワトリ細胞である。前記ニワトリは、S86N、Valo、White Leghorn、Brown Leghorn、Sussex、New Hampshire、Rhode Island、Ausstralorp、Minorca、Amrox、California Gray、East Lansing、Italian-Partridge-colored、Marans、Barred Rock、Cou Nu Rouge (CNR)、GF30、ISAを含んでなるニワトリ系統の群から選択されることが好ましい。より好ましい実施形態では、本発明のニワトリＥＳ細胞はBarred-Rock系統である。別の好ましい実施形態では、本発明の鳥類細胞はカモ細胞である。より好ましい実施形態では、本発明のカモＥＳ細胞はPekinまたはMuscovy系統である。
【００２１】
工程ａ）の細胞は鳥類胚幹細胞である。胚幹細胞（ＥＳ細胞）は、極めて初期（例えば胞胚期）の胚の一部または総ての培養から得られるという特徴を有する幹細胞である。これらのＥＳ細胞は、in vitroで幹細胞の総ての特徴を示し、in vivoで胚の形態形成に寄与し、それらが方法の如何を問わずレシピエント胚に再移植されるときには生殖細胞系列定着に関与する独自の能力を示す。成熟期後に発生する精細胞または卵母細胞の前駆細胞である始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、多能性ＥＳ細胞であり、ＥＳ細胞のサブタイプとなる。好ましくは、本発明の鳥類胚幹細胞は、Eyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩ〜ＸＩＩの間に含まれる、より好ましくは、Eyal-Giladi & Kochav分類のステージＸ前後の発生段階にある鳥類受精卵の胚盤葉板から単離される（EYAL-GILADI分類：EYAL-GILADI and KOCHAV, 1976, ≪ From cleavage to primitive streack formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick ≫. "General Morphology" Dev. Biol. 49: 321-337参照）。好ましい実施形態では、工程ａ）の細胞は、産まれたての受精卵すなわち産卵と名付けられた発生段階にある受精卵から単離される。Sellier et al. (2006, J. Appl. Poult. Res., 15:219-228)によれば、産卵はEyal-Giladi分類による次の発生段階に相当する：
−Muscovy duck：ステージＶＩＩ
−ホロホロチョウ：ステージＶＩＩ〜ＶＩＩＩ
−シチメンチョウ：ステージＶＩＩ〜ＶＩＩＩ
−Pekin duck：ステージＶＩＩＩ
−ニワトリ：ステージＸ
−ニホンウズラ：ステージＸＩ
−ガチョウ：ステージＸＩ。
【００２２】
好ましくは、工程ａ）のPekin duck胚幹（ＥＳ）細胞は、Eyal-Giladi分類のステージＶＩＩＩ（産卵）前後の胚を分離することによって得られる。
【００２３】
好ましくは、工程ａ）のMuscovy duck胚幹（ＥＳ）細胞は、Eyal-Giladi分類のステージＶＩＩ（産卵）前後の胚を分離することによって得られる。
【００２４】
好ましくは、工程ａ）のニワトリ胚幹（ＥＳ）細胞は、Eyal-Giladi分類のステージＸ（産卵）前後の胚を分離することによって得られる。
【００２５】
より好ましくは、前記卵は一度も孵卵されていない（すなわち「未孵卵（un-incubated）」）。胚盤葉板から単離された細胞は、鳥類胚細胞、より詳細には鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を含んでなり；これらの鳥類胚細胞は全能性または多能性細胞である。胚盤葉細胞は、コロニーとして増殖する密に結合した細胞であり；それらの細胞は丸型形態を示し、大きな核と小さな細胞質を有する（図２参照）。胚盤葉細胞の形態は培養中に、密に結合した細胞から結びつきがよりゆるいより分散した細胞へと進化する（本発明の方法の工程 図２ｂ＆ｃ）。工程ｃ）において得られた鳥類ＥＳ細胞は、よりゆるい結びつきを示すことが好ましい。
【００２６】
別の実施形態によれば、工程ａ）の細胞は、始原生殖細胞（ＰＧＣ）が豊富な胚幹細胞集団である。より好ましくは、工程ａ）の鳥類ＥＳ細胞は精製ＰＧＣである。鳥類種では、始原生殖細胞は胚盤葉の中心領域から発生する(Ginsburg and Eyal-Giladi, 1987 Development 101(2):209-19; Karagenc et al, 1996 Dev Genet 19(4):290-301; Petitte et al, 1997 Poult Sci. 76(8): 1084-92)。その後、始原生殖細胞は前方の胚体外部位である生殖三日月環へと移動し、胚発生２．５日〜５日間に血管系に取り込まれるに至って、生殖隆起に到達する。始原生殖細胞は生殖隆起に定着し（colonize）、そこで始原生殖細胞は最後には卵母細胞または精母細胞へと分化する(Nieuwkoop and Sutasurya, 1979. The Migration of the primordial germ cells. In: Primordial germ cell in Chordates. London: Cambridge University Press p113-127)。ドナー鳥類胚からのＰＧＣの単離方法については文献で報告されており、当業者であれば容易に実施することができる（例えば１９９３年９月７日公開（公開番号第０５−２２７９４７号）のＪＰ９２４９９７; Chang et al. 1992. Cell Biol. Int. 19(2): 143-149; Naito et al. 1994 Mol. Reprod. Dev. 39: 153-161; Yasuda et al. 1992. J. Reprod. Fert. 96: 521-528; Chang et al. 1992 Cell Biol. Int. Reporter 16(9): 853-857参照）。一実施形態によれば、ＰＧＣは、Hamburger & Hamilton分類のステージ１２〜１４(Hamburger & Hamilton 1951 A series of normal stages in the development of chick embryo. J. Morphol. 88: 49-92)にあるニワトリ胚の背側大動脈から採取した胚血管から採取される。別の好ましい実施形態では、ＰＧＣは、ニワトリ胚の機械的切開によって生殖三日月環からまたは生殖腺から採取された。しかしながら、上述のとおり、他のＰＧＣ単離方法も知られており、代わりに用いることができる。
【００２７】
「完全培養培地」とは、少なくとも１つの増殖因子および動物血清が添加された、基礎培地、好ましくは基礎合成培地を意味する。完全培養培地の例は、ＷＯ０３／０７６６０１、ＷＯ０５／００７８４０、ＥＰ７８７１８０、ＵＳ６，１１４，１６８、ＵＳ５，３４０，７４０、ＵＳ６，６５６，４７９、ＵＳ５，８３０，５１０およびPain et al. (1996, Development 122:2339-2348)に記載されている。本発明によれば、「基礎培地」とは、単独で、少なくとも細胞生存、さらによくは、細胞増殖を可能にする古典的な培養処方の培地を意味する。基礎培地の例は、ＢＭＥ（基礎イーグル培地）、ＭＥＭ（最少イーグル培地）、１９９培地、ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）、ＧＭＥＭ（Glasgow改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ−ＨａｍＦ１２、Ｈａｍ−Ｆ１２およびＨａｍ−Ｆ１０、イスコフの改変ダルベッコ培地、マッコイの５Ａ培地、ＲＰＭＩ １６４０である。基礎培地は、無機塩（例えば：ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、．．．）、アミノ酸、ビタミン（チアミン、リボフラビン、葉酸、Ｄ−パントテン酸Ｃａ、．．．）および他の成分（グルコース、β−メルカプト−エタノール、ピルビン酸ナトリウムなど）を含んでなる。好ましくは、基礎培地は合成培地である。本発明の最も好ましい基礎培地は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、０．１６ｍＭ β−メルカプト−エタノールが添加されたＤＭＥＭ−ＨａｍＦ１２である。
【００２８】
あるいは、前記完全培養培地は、馴化培地、好ましくはＢＲＬ馴化培地である。一例として、ＢＲＬ馴化培地は、Smith and Hooper(1987, Dev. Biol. 121： 1-9)によって記載されているような当技術分野で認められている技術によって調製される。ＢＲＬ細胞はＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１４４２で入手可能である。馴化培地には、以下に記載する外因性増殖因子を添加してよい。
【００２９】
本明細書における用語「増殖因子」とは、培養下の鳥類細胞の生存および増殖に必要な培養培地に添加される外因性増殖因子を意味する。２つのファミリーの増殖因子を概略的に区別することができる：サイトカインおよび栄養因子。前記サイトカインは、主としてｇｐ１３０タンパク質と関連している受容体を通じて作用するサイトカインである。例えば、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン１１、インターロイキン６、インターロイキン６受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンは、特定鎖の受容体レベルにおける補充および単量体形または場合によってはヘテロ−二量体形でのｇｐ１３０タンパク質との受容体の組合せに関して類似した作用機序を有する。前記栄養因子は、主として幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、好ましくは塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）またはヒトＦＧＦ（ｈＦＧＦ）である。
【００３０】
本発明の方法の工程ａ）において使用される完全培養培地は、基礎培地、好ましくは基礎合成培地、ならびにｇｐ１３０タンパク質と関連している受容体を通じて作用する少なくとも１つのサイトカインおよび／または少なくとも１つの栄養因子を含んでなる。好ましくは、本発明による完全培養培地は、基礎培地、および白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチン、カルジオトロフィン、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）からなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子を含んでなる。
【００３１】
第一の好ましい実施形態によれば、前記完全培養培地は、動物血清ならびに少なくともＩＧＦ−１およびＣＮＴＦを添加した基礎培地である。
【００３２】
第二の好ましい実施形態によれば、前記完全培養培地は、動物血清ならびに少なくともＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒを添加した基礎培地である。
【００３３】
第三の好ましい実施形態によれば、前記完全培養培地は、動物血清ならびに少なくともＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦを添加した基礎培地である。
【００３４】
別の実施形態によれば、前記完全培養培地は、増殖因子（すなわち例えばＢＲＬ細胞によって発現される）を含んでなり、所望により、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）：を含んでなる群において選択された少なくとも１つの外因性増殖因子を添加した馴化培養培地である。
【００３５】
前記基礎培地中または前記馴化培養培地中の増殖因子ＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦ、ＩＬ−１１の濃度は、約０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌの間で含まれる。
【００３６】
本発明の鳥類胚幹細胞は、フィーダー細胞層上で培養される。フィーダー細胞は、ＥＳ細胞を得るために培養される細胞または細胞系統であり得る。あるいは、前記フィーダー細胞は、細胞外マトリックスと結合した増殖因子とで置き換えることができる。従って、フィーダーマトリックスはフィーダー細胞または細胞外マトリックスを指す。本明細書におけるフィーダーマトリックスは、当技術分野で公知の手法に従って構築される。上述のとおり、前記フィーダーマトリックスは予め馴化されることが好ましい。用語「予め馴化される」とは、鳥類受精卵胚盤葉板由来の細胞が前記フィーダーマトリックスと接触して沈着する前に、前記フィーダーマトリックスが培地の存在下で、ある期間、例えば前記フィーダーマトリックスにより例えば、増殖因子または他の因子の生産が開始され、確立されるのに十分な時間、培養されることを意味し；通常フィーダーマトリックスは、鳥類受精卵胚盤葉板由来の細胞がそのフィーダーマトリックスと接触して沈着する前に、そのフィーダーマトリックスを単独で１〜２日間培養することにより予め馴化させる。前記フィーダー細胞は、マウス繊維芽細胞を好ましくは含んでなる。ＳＴＯ繊維芽細胞が好ましいが、初代繊維芽細胞も好適である。また、本発明は、マウス細胞フィーダーマトリックスの使用に関して記載しているが、他のネズミ種（例えばラット）；他の哺乳類種（例えば；有蹄動物、ウシ、ブタ種）；または鳥類種（例えばGallinacea、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ）由来の細胞を含んでなるフィーダーマトリックスも使用してよいと考えられる。別の実施形態では、本発明のフィーダー細胞は、例えばＳＴＯ細胞において鳥類ＳＣＦなどの増殖因子の構成的発現を可能にする発現ベクターでトランスフェクトしてよい。このようにして、この「フィーダー」は、前記細胞の原形質膜中に溶解しかつ／または付着している状態の前記因子を生産する。従って、本発明の培養方法は、フィーダー細胞の単層を確立することを所望により含んでよい。フィーダー細胞は標準的な技術を用いて分裂不能にされる。例えば、前記フィーダー細胞は、Ｘ線またはγ線照射（例えば４０００ラドのγ線）に曝してよくまたはマイトマイシンＣ（例えば１０μｇ／ｍｌ ２〜３時間）で処理してよい。細胞を分裂不能にするための手法もまた、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209から細胞とともに一般に送られる情報に詳述されている（例えばＳＴＯフィーダー細胞はＡＴＣＣ受託番号１５０３で入手可能である）。単層は、所望により、約８０％コンフルエントまで、好ましくは約９０％コンフルエントまで、より好ましくは約１００％コンフルエントまで培養してよい。単層としての前記フィーダー細胞の構造が前記培養に好ましい構造であるが、いずれもの好適な構造が本発明の範囲内であると考えられる。従って、例えば、フィーダー細胞の層、単層、クラスター、凝集体または他の会合体もしくは集団は、本発明の範囲内に入ると考えられ、特に用語「マトリックス」の意味の範囲内に入ると考えられる。
【００３７】
本発明の培養培地には動物血清が添加される。使用することが好ましい動物血清は、動物胎児血清である。ウシ胎児血清が好ましい。また、本発明は、ウシ胎児血清の使用に関して記載しているが、他の動物種（例えばニワトリ、ウマ、ブタ、有蹄動物など．．．）由来の血清を含んでなる動物血清も使用してよいと考えられる。前記培養培地中の動物血清の終濃度は、およそ１〜２５％間、好ましくは５％〜２０％間、より好ましくは８％〜１２％間で含まれる。その好ましい実施形態では、前記培養培地中の動物血清の終濃度はおよそ１０％である。好ましい実施形態によれば、前記培養培地はおよそ１０％のウシ胎児血清を含んでなる。本発明の培養培地には、細菌汚染を防ぐために、さらに抗生物質（例えばペニシリンおよびストレプトマイシンなど）を含めてよい。
【００３８】
別の実施形態によれば、本発明は、鳥類胚幹細胞を遺伝学的に改変する方法であって、
ａ）上述の方法によって得られ、培養されたＥＳ細胞をベクターでトランスフェクトする工程；
ｂ）トランスフェクトされたＥＳ細胞を、好ましくは、培地中に例えば抗生物質、アミノ酸、ホルモンなどの選抜薬剤を加えることによって、選抜する工程；
ｃ）遺伝学的に改変された耐性ＥＳクローンのスクリーニングおよび増幅する工程、
ｄ）前述のとおりの培養培地中、フィーダー細胞層上で工程ｃ）の該遺伝学的改変ＥＳ細胞を培養する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００３９】
第一の実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清、およびＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、Ｉｌ−１１、ＬＩＦ、ＦＧＦ、ＳＣＦ、オンコスタチン、カルジオトロフィンを含んでなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子を含んでなる。好ましい実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清ならびにＩＧＦ１およびＣＮＴＦを含んでなる。別の実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清ならびにＩＧＦ１およびＣＮＴＦ、さらに所望により、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、Ｉｌ−１１、ＬＩＦ、ＦＧＦ、ＳＣＦ、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンを含んでなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子を含んでなる。、第三の好ましい実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清ならびにＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒを含んでなる。第四の好ましい実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清ならびにＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦおよびＦＧＦを含んでなる。
【００４０】
工程ｃ）のＥＳ細胞は遺伝学的に改変される。遺伝子改変は、ＥＳ細胞において、前記ベクターでの一過性または安定トランスフェクションにより実施される。好ましい実施形態によれば、前記ＥＳは、当業者により周知の技術によって前記ベクターで安定にトランスフェクトされる。第一の実施形態によれば、前記ベクターはＥＳ細胞のゲノムに無作為に挿入される。好ましい実施形態によれば、前記ベクターは、相同組換えによってＥＳ細胞のゲノムに挿入される。ＷＯ０３／０４３４１４では、ＥＳ細胞を相同組換えにより遺伝学的に修飾するためのプロトコールおよび発現ベクターが記載されている。
【００４１】
工程ａ）のＥＳ細胞は、レシピエント胚への導入前にin vitroで長期間維持され、培養され得る。この長い期間によって前記細胞を遺伝学的に改変させることができる。好ましい実施形態によれば、前記細胞はin vitroで少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも１４日間、少なくとも２５日間、少なくとも５０日間、少なくとも７５日間、少なくとも１００日間培養される。
【００４２】
本明細書における用語「ベクター」とは、細胞内にトランスフェクトすることができ、その宿主細胞ゲノムとは独立にまたはその宿主細胞ゲノム内で複製することができる天然もしくは合成一本鎖もしくは二本鎖プラスミドまたはウイルス核酸分子を指す。環状二本鎖プラスミドは、該プラスミドベクターのヌクレオチド配列に基づいた適当な制限酵素での処理により線状化することができる。核酸は、ベクターを制限酵素で切断し、それらの断片を一緒に連結することによって、ベクターに挿入することができる。前記核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。本明細書における用語「プラスミド」とは、細菌または酵母宿主細胞内での独立した複製が可能である小さな環状ＤＮＡベクターを指す。前記核酸ベクターは、「対象となるポリペプチド」をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節配列をさらに含む。調節配列は当技術分野で周知であり、当業者であれば過度に実験を行わずに前記連結ヌクレオチド配列の良好な発現を確実にするように選択し得る。本明細書において、用語「調節配列」には、発現を制御し得るプロモーター、エンハンサー、および他のエレメントが含まれる。好適な発現ベクター、プロモーター、および他の発現制御エレメントを設計するために、標準的な分子生物学テキスト例えばSambrook et al. eds "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd ed. Cold Spring Harbor Press (1989)およびLodish et al. eds., "Molecular Cell Biology," Freeman (2000)を参考にしてよい。しかしながら、好適な発現ベクターの選択は複数の因子（形質転換させる宿主細胞の選択および／または発現させるタンパク質のタイプを含む）に依存することは認識すべきである。また、様々な用途には、組織選択的（すなわち組織特異的）プロモーター、すなわち、１以上の他のタイプの組織に対して、ある特定の種類の組織の細胞において優先的に発現をもたらすプロモーターが有用である。例示的な組織特異的プロモーターは、鳥類卵白のタンパク質（オボアルブミン、リゾチーム、オボムコイド、コンアルブミンおよびオボムチンなどを含む）と本来関係があるニワトリ卵管特異的プロモーターである。有用なプロモーターには、外因性誘導プロモーターも含まれる。これらは、一般に内因性代謝産物やサイトカインではない外部から供給された薬剤または刺激に応じて「作動させる」ことができるプロモーターである。例としては、抗生物質誘導プロモーター（テトラサイクリン誘導プロモーターなど）、熱誘導プロモーター、光誘導プロモーター、またはレーザー誘導プロモーターが挙げられる（例えば、Halloran et al., 2000, Development 127(9): 1953-1960; Gemer et al., 2000, Int. J. Hyperthermia 16(2): 171-81 ; Rang and Will, 2000, Nucleic Acids Res. 28(5): 11205; Hagihara et al., 1999, Cell Transplant. 8(4): 4314; Huang et al., 1999, Mol. Med. 5(2): 129-37; Forster, et al., 1999, Nucleic acids Res. 27(2): 708-10; およびLiu et al., 1998, Biotechniques 24(4): 624-8, 630-2 (1998)）。本明細書において用語「対象となるポリペプチド」または「対象となるタンパク質」とは、ペプチド結合によって連結された、連続的に配列された３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸ポリマーを指す。用語「ポリペプチド」には、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質類似体、オリゴペプチド、ペプチドなどが含まれる。用語「ポリペプチド」は、核酸によってコードされ、組換え技術によって作出され、適当な起源から単離されまたは合成される、上記で定義したポリペプチドを意図する。ポリペプチドの限定されない例は、成長ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、酵素、免疫グロブリンまたはその断片である。本明細書における用語「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」とは、核酸を宿主細胞（すなわち前記鳥類ＥＳ）に挿入する方法を指す。原核生物または真核生物への核酸のトランスフェクションを容易にする多くの技術が当業者に周知である。これらの方法は、宿主細胞を前記核酸分子の取り込みに適したものにするために、限定されるものではないが、前記細胞を高濃度の塩（カルシウムまたはマグネシウム塩などであるがそれだけではない）、電場（すなわちエレクトロポレーション）、界面活性剤、またはリポソーム媒介トランスフェクション（すなわちリポフェクションなど）により処理することを含む種々の技術を必要とする。
【００４３】
本発明はまた、キメラ雛を得る方法であって、
ａ）本発明の方法によって得られ、培養された鳥類ＥＳ細胞をレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程；および
ｂ）雛として孵化（hatch）させるために、工程ａ）において得られた胚をインキュベートする工程；
ｃ）該雛に定着した異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる方法も提供する。
【００４４】
本明細書における用語「雛（chick）」とは、幼鳥を意味し、これには幼鶏が含まれる。用語「胚下腔（subgerminal cavity）」とは、胚盤葉と卵黄の間の空間を意味する。胚盤葉細胞がアルブミンから水分を吸収し、それをそれら自体と卵黄の間に分泌するとこの空間が作り出される。
【００４５】
遺伝学的に修飾されたキメラ雛を得る方法であって、
ａ）本発明の方法によって得られ、培養された遺伝学的修飾ＥＳをレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程；および
ｂ）雛として孵化させるために、工程ａ）において得られた胚をインキュベートする工程；
ｃ）該雛に定着した遺伝学的修飾異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる方法を提供することも本発明の目的である。
【００４６】
前記キメラ雛の選抜は、表現型解析または遺伝子型解析のいずれかによって実施することができる。好ましい実施形態によれば、前記キメラ雛は、羽毛（plumage）の表現型解析によって選抜される。
別の実施形態によれば、本発明のキメラ雛を得る方法は、ＥＳ細胞の導入前にレシピエント胚の性別を決定するさらなる工程を含んでよい。
【００４７】
別の実施形態によれば、前記レシピエント胚は、産まれたての未孵卵の卵に由来し、５，０００個前後〜７０，０００個前後間の細胞を含む。好ましくは、前記レシピエント胚は、Eyal-Giladi & Kochav分類のステージＶｌ〜ＸＩＩの間に含まれる、好ましくは：
−前記胚がニワトリであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＸ前後の；
−前記胚がMuscovy duckであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩＩ前後の；
−前記胚がPekin duckであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩＩＩ前後の；
−前記胚がニホンウズラまたはガチョウであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＸＩ前後の；
−前記胚がホロホロチョウまたはシチメンチョウであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩＩ〜ＶＩＩＩ前後の；
段階にある。
【００４８】
好ましくは、少なくとも１０００個のＥＳ細胞、少なくとも１０，０００個のＥＳ細胞、少なくとも１５，０００個のＥＳ細胞、少なくとも３０，０００個のＥＳ、少なくとも４５，０００個のＥＳ細胞、少なくとも６５，０００個のＥＳ細胞、少なくとも８５，０００個のＥＳ細胞または少なくとも１００，０００個のＥＳ細胞が、前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される。好ましい実施形態によれば、少なくとも３０，０００個のＥＳ細胞が前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される。
【００４９】
前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入されるＥＳ細胞は、雌および雄ＥＳ細胞の混合集団であってよい。別の実施形態によれば、前記レシピエント胚およびドナーＥＳ細胞は、導入前に予め性別判定される。好ましい実施形態によれば、雌ＥＳ細胞は、雌レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される。別の好ましい実施形態によれば、雄ＥＳ細胞は、雄レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される。
【００５０】
本発明のキメラ雛を得るための方法は、ＥＳ細胞の、レシピエント胚の胚下腔への導入前に、レシピエント胚にＸ線またはγ線照射で弱く照射する任意選択工程を含む。好ましい実施形態によれば、前記ニワトリレシピエント胚は、３〜６グレイ間のＸ線、好ましくは４グレイ前後のＸ線で照射される。好ましい実施形態によれば、事前に４グレイ前後でＸ線照射された前記レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、１５，０００個前後のニワトリＥＳ細胞が導入される。別の好ましい実施形態によれば、前記非照射レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、少なくとも３０，０００個のニワトリＥＳ細胞が導入される。
【００５１】
第一の実施形態によれば、レシピエントニワトリ胚はWhite Leghorn系統のものであり、前記ドナーニワトリＥＳ細胞はbarred rock系統、Marans系統、S86N系統からなる群において選択される系統に由来する。第二の実施形態によれば、前記レシピエントニワトリ胚は、barred rock系統、Marans系統およびS86N系統を含んでなる群において選択されるニワトリ系統のものであり、前記ドナーニワトリＥＳ細胞はWhite Leghorn系統に由来する。
【００５２】
異種細胞を含んでなる本発明のキメラ雛の選抜は、
ａ）前記キメラ雛から遺伝物質のサンプルを得る工程；
ｂ）該鳥類ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）のセットとフォワードプライマー５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４）のセットからなる群において選択されたプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含む。好ましい実施形態によれば、前記ニワトリＥＳ細胞はbarred rock種に由来し、前記レシピエント胚はWhite Leghorn種のものである。前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲによって実施され、この際、前記解析は、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの制限酵素ＨｉｎｃＩＩでの消化を含む。
【００５３】
多型の有無を同定する前記方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ） 温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびジデオキシ−フィンガープリント法（ｄｄＦ）：からなる群から選択される。
【００５４】
前記多型の存在についてアッセイする前記工程は、
ａ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素で前記遺伝物質を消化する工程；
ｂ）該消化から得られた断片を分離する工程；
ｃ）該断片によって生じた制限パターンを検出する工程；および
ｄ）所望により、該パターンを、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素を用いてのWhite Leghorn、Marans、Barred Rock、S86N遺伝物質の消化によって得られる少なくとも１つの制限パターンと比較する工程であって、工程ｃ）およびｄ）において検出された制限パターンの違いが異種細胞を含んでなるキメラ雛の指標となる工程
を含む。
【００５５】
本発明はまた、前記キメラ雛の後代を得る方法であって、次の工程：
ａ）本発明の方法によって得られた前記選抜キメラ雛を成鳥として成熟させる工程；
ｂ）内部に異種細胞を有する該成鳥を繁殖させ、その結果、鳥後代を生み出す工程；および
ｃ）異種細胞を含んでなる該後代において該鳥を選抜する工程
を含む方法を含む。
【００５６】
前記鳥の選抜は、羽毛の表現型解析によって、または可能であれば前記鳥ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列におけるＨｉｎｃＩＩ多型の存在についてアッセイすることによる遺伝子型解析によって実施してよい。
【００５７】
前記方法は、遺伝学的に改変された異種細胞中に含まれる前記ベクターによってコードされる異種ポリペプチドを発現させる工程をさらに含んでよい。好ましくは、前記異種ポリペプチドは、前記鳥の生体液（血液、精子、尿など）または前記遺伝学的改変鳥の雌によって産み出された発生中の鳥類卵の卵白に送達される。
【００５８】
本発明はまた、遺伝学的および非遺伝学的に改変された鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞用の培養培地であって、動物血清が添加され、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、インターロイキン１１、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンからなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子を含んでなり、少なくとも１０日間、少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも１００日間、より好ましくは無限期間培養する該ニワトリ胚幹細胞の維持に十分である培養培地にも関する。
【００５９】
好ましい実施形態によれば、本発明はまた、遺伝学的または非遺伝学的に改変された鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞用の基礎培養培地であって、動物血清が添加され、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が添加された基礎培養培地にも関する。
【００６０】
第二の好ましい実施形態によれば、本発明は、遺伝学的または非遺伝学的に改変された鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞用の基礎培養培地であって、動物血清が添加され、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）およびインターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）が添加された基礎培養培地に関する。
【００６１】
第三の好ましい実施形態によれば、本発明は、遺伝学的または非遺伝学的に改変された鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞用の基礎培養培地であって、動物血清が添加され、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が添加された基礎培養培地に関する。
【００６２】
前記培地は、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、少なくとも５０日間、好ましくは少なくとも１００日間培養する前記鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞の維持に十分である。
【００６３】
本発明の培養培地は、所望により、インターロイキン−１１、カルジオトロフィン、オンコスタチンおよび／またはＬＩＦを含んでなる群において選択される少なくとも１つの化合物をさらに含んでもよい。本発明の培養培地は、フィーダー細胞の層（すなわちローン）をさらに含んでもよい。
【００６４】
本発明はまた、White Leghornニワトリ系統を別のニワトリ系統と区別するための遺伝子多型解析方法であって、
ａ）該White Leghornニワトリ系統から遺伝物質のサンプル、および該他ニワトリ系統から遺伝物質のサンプルを得る工程；
ｂ）該ニワトリゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）のセットとフォワードプライマー５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４）のセットからなる群において選択されたプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含む方法も提供する。
【００６５】
本発明による遺伝子多型解析方法では、前記増幅は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲによって実施される。
【００６６】
前記多型の存在についてアッセイする前記工程は、
ａ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素でＰＣＲ増幅ＤＮＡを消化する工程；
ｂ）該消化から得られた断片を分離する工程；
ｃ）該断片によって生じた制限パターンを検出する工程；および
ｄ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素を用いてWhite Leghorn遺伝物質の消化によって得られる該パターンと、前記他ニワトリ系統の遺伝物質の消化によって得られる該パターンとを比較する工程であって、ＨｉｎｃＩＩ制限部位の存在がWhite Leghorn系統の指標となり、ＨｉｎｃＩＩ制限部位の不在がWhite Leghorm系統でないことの指標となる工程
を含む。
【００６７】
多型の有無を同定する前記方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびジデオキシ−フィンガープリント法（ｄｄＦ）からなる群から選択される。
【００６８】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明する。当業者がより明確に理解し、本発明を実施することができるように、次の調製および実施例を示す。しかしながら、本発明は、例示された実施形態の範囲に限定されず、それらの実施形態は単に本発明の単一態様を例示するものであり、機能的に同等の方法は本発明の範囲内である、実際、当業者には上述の説明および添付の図面から、本明細書に記載したものの他に本発明の様々な修飾も明らかになるであろう。かかる修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。説明の残りの部分については、以下の図面の説明に言及する。
【実施例】
【００６９】
実施例
実施例１：材料および方法
胚盤葉細胞
産まれたての未孵卵卵から胚を採取した。カットアウト領域中央の胚盤を有する胚の上に滅菌フィルターペーパーリングを置いた。そのディスク（disk）の外側周囲で卵黄膜を切断した。そのディスクをさっとひっくり返し、室温のＰＢＳのペトリ皿に移した。過剰の卵黄を慎重に洗い流した。パスツールピペットで軽く吸引して胚盤葉全体を取り出し、ＰＢＳ中に移した。平均２００個の胚を一緒にプールした。それらの細胞を３００ｇで２回遠心分離した。この細胞ペレットを培養培地中で機械的に解離した。完全培養培地中の細胞を不活性化ＳＴＯフィーダー層上に播種した。胚盤葉細胞を７．５％ＣＯ２中３９℃で維持した。これらの細胞を、プロナーゼ溶液（５〜２％ｗ／ｖ）中３９℃でのインキュベーションにより解離した。解離細胞を、完全培地中、新たなフィーダー層細胞上に播種した。３〜５代継代間の細胞を最少培地中、ＳＴＯフィーダー層上に播種した。
【００７０】
培養培地
前記完全培養培地は、１０％胎児子ウシ血清(JRH)、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−６(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−６Ｒ(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ(Peprotech)、１％ペニストレプトマイシン(penistreptomycine) (Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースで構成した。
【００７１】
あるいは、前記完全培養培地は、１０％胎児子ウシ血清(JRH)、０．１６ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−６(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−６Ｒ(Tebu)、１％ペニストレプトマイシン (Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースで構成した。
【００７２】
また、前記完全培養培地は、１０％胎児子ウシ血清(JRH)、０．１６ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ(Eurobio)、１％ペニストレプトマイシン(Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースで構成してもよい。
【００７３】
フィーダー細胞の調製
前記マウス繊維芽細胞ＳＴＯ細胞系統（ＡＴＣＣ）を、４％胎児子ウシ血清(JRH)および１％グルタミン(Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ(Cambrex)中３７．５℃、７．５％ＣＯ２で維持した。ＳＴＯ細胞をサブコンフルエンスにおいてプロナーゼ(Roche)１Ｘで解離し、ＰＢＳで洗浄し、γ線源を用いて４５グレイで照射した。フィーダー細胞を１００ｍｍ皿内の新鮮培地に１．５ｘ１０６〜２ｘ１０６細胞で播種した。
【００７４】
トランスフェクション
ＳＴＯ細胞系統：ｐＧＰＡＲαおよびｐＭＥＨＣＳは、Bertrand Pain医師によって提供された。ＰＣＩＮｅｏは、Promegaから購入した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法およびＰＥＧ精製を用いて調製した。トランスフェクションでは、朝、細胞を１００ｍｍ皿当たり０．５ｘ１０６細胞で播種した。夕方、それらをFuGENE 6(Roche)リポフェクション試薬を用いて３．０μｇの環状ｐＣＩＮｅｏ、１５μｇ ｐＧＰＡＲαまたはｐＭＥＨＣＳでトランスフェクトした。翌日、細胞を洗浄し、その培地を交換した。ネオマイシン、０．３ｍｇ／ｍｌでの選抜はＤ１に開始し、８日間適用した。耐性細胞を増幅し、液体窒素で冷凍した。
【００７５】
アルカリ性ホスファターゼ反応：
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１．５％ホルムアルデヒド、０．５％グルタルアルデヒド、０．１％ｌｇｅｐａｌにより４℃で１０〜２０分間固定した。洗浄後、細胞を、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ＮＢＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＣＩＰで構成されるアルカリ性ホスファターゼ染色溶液中で３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ １ｘまたはＨ２Ｏを加えることによってこの反応を停止させた。
【００７６】
免疫蛍光解析：
ＳＳＥＡ−１抗体は、Developmental Studies Hybridoma Bank of the University of IOWAから購入した。
【００７７】
細胞を、１．５％ホルムアルデヒド、０．５％グルタルアルデヒドにより、または０．２％グルタルアルデヒド、０．０１％ＩＧＥＰＡＬにより４℃で２０分、あるいはパラホルムアルデヒド４％またはメタノールにより室温にて１０分固定した。
【００７８】
細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ ０．１％中で２時間〜４時間インキュベートした。第一の希釈抗体を一晩加えた。洗浄後、第二のＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体を４℃で１時間加えた。前記抗体を除去し、前記細胞をＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させた。細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【００７９】
ＰＣＲ ＲＦＬＰ：
１８日間インキュベートした胚組織由来のＤＮＡを、QIAamp DNA mini-kitの使用説明書に従って精製した。前記ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの断片を、次のプライマー対を用いたＰＣＲによって増幅した：
【００８０】
オリゴ（１５７−１５８）：
フォワード：５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ（配列番号１）
リバース：５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ（配列番号２）
オリゴ（７８−８１）：
フォワード：５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ（配列番号３）
リバース：５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ（配列番号４）
【００８１】
アンプリコンはそれぞれ３１０６ｂｐおよび１００４ｂｐである。Barred Rockニワトリ由来のＤＮＡに対するプライマー１５７の特異性は、White Leghorn由来のＤＮＡよりも高い。結果として得られたアンプリコンはＨｉｎｃＩＩ酵素で切断される。
ＲＴ ＰＣＲ解析：
【００８２】
ＲＮＡを、Promega SV total RNA isolation kitの使用説明書に従って精製した。インキュベーションから５日後の胚から頭部ＲＮＡを、１５日間インキュベートした大腿骨胚から骨髄ＲＮＡを、成体ニワトリから精巣ＲＮＡを抽出した。ＢＲ１５細胞由来のＲＮＡを、Qiagen RNeasy kitの使用説明書に従って抽出した。ＲＮＡを、Promega Random primer kitおよびAMV Reverse transcriptase kitの使用説明書に従って逆転写した。ＰＣＲ増幅を次のプライマーを用いて実現した。
【００８３】
オリゴｖａｓａ：
Ｖａｓａフォワード：ＴＴＴＧＧＴＡＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣ（配列番号５）
Ｖａｓａリバース：ＧＴＴＣＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣ（配列番号６）
オリゴＢｒａｃｈｙｕｒｙ：
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙフォワード：ＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧ（配列番号７）
フォワード２：ＴＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＴ（配列番号８）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙリバース：ＣＡＴＡＡＧＴＴＣＧＧＧＴＡＣＴＧＡＣＴＧＧ（配列番号９）
リバース２：ＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＧＴＡＡＡ（配列番号１０）
オリゴＧＡＰＤＨ：
ＧＡＰＤＨフォワード：ＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号１１）
ＧＡＰＤＨリバース：ＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡ（配列番号１２）
オリゴＴｈｙ−１：
フォワード：ＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＴ（配列番号１３）
リバース：ＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号１４）
【００８４】
レシピエント胚への細胞注入：
照射する場合には、産まれたての未孵卵卵を、加速器源からの４グレイのＸ線照射に曝すことによってレシピエント胚を調製した。それらの胚にはその卵の長軸に切り込んだ窓から操作した。卵殻を粉砕により除去した。１滴のＰＢＳを加えることによって卵殻膜を湿った状態に維持した。細胞注入直前にその卵殻膜を切断して胚を露出させた。培養培地中の細胞３μｌをマイクロピペットを用いてレシピエント胚の胚下腔に注入した。
【００８５】
卵白に予め浸した卵殻膜の２切断端を合わせることによって前記窓を閉鎖した。卵殻膜が乾燥する場合には、それらの窓をサージカルテープで密閉した。卵を、３７．５℃、５０％相対湿度に維持した通常のインキュベーター内でインキュベートし、１８日間１時間ごとに９０°回転させた。その後、卵を３７℃、８５％相対湿度の通常の孵卵器に移し、孵化させた。インキュベーションから１８日後の胚において表現型および体細胞キメラ現象を評価した。注入した鳥をBarred Rockニワトリとかけ合わせることによって、ドナー細胞の生殖細胞系列寄与を評価した。
【００８６】
実施例２：ニワトリＥＳ細胞の単離および増幅
ニワトリ胚幹細胞は産みたての卵から単離した。平均２００胚をプールし、照射マウス繊維芽細胞のフィーダー層に播種した。実際に、Etches et al. (1996 Mol. Reprod. Dev. 45:291-288)は、マウス繊維芽細胞と同時培養したニワトリ胚盤葉細胞の注入後に有意に多い体細胞キメラが見られたことを示している。最初の播種から継代培養３〜５代まで、胚盤葉細胞を１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１(TEBU)、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６Ｒ(TEBU)、１ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ(TEBU)、１ｎｇ／ｍｌウシＦＧＦ(Peprotech)、１％ペニストレプトマイシン(Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２塩基からなる完全培養培地で増殖させた。次に、数代後、数種の増殖因子を除去し、分化を避けるために最小培養培地で細胞を増殖させた。除去した増殖因子は（ＳＣＦとＦＧＦ）、または（ＳＣＦ、ＦＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ）のいずれかであった。
【００８７】
分化を避けてニワトリＥＳ細胞を増殖させる培養培地は、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール(SIGMA)、 １％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、および１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６Ｒ、１％ペニストレプトマイシンを添加した基礎培地（すなわちＤＭＥＭ−Ｆ１２）からなった。あるいは、分化を避けてニワトリＥＳ細胞を増殖させる培養培地は、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)を添加し、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ、１％ペニストレプトマイシン(Biowhittaker)を添加した基礎培地（すなわちＤＭＥＭ−Ｆ１２）を含む。
【００８８】
ニワトリＥＳ細胞は種々のニワトリ系統から単離および拡張することができる（表１）。
【００８９】
【表１】
【００９０】
in vitroで単離および増幅された細胞のＥＳ状態の特定は、マウスおよびヒトＥＳ細胞に特異的であることが実証されている一連の生物学的基準：自己再生特性、細胞形態、幹細胞特異的マーカーの発現、および細胞の全能性、すなわち、in vitroにおいて様々な系統へ分化する、また、in vivoにおいて胚の構成に寄与するそれらの能力による。ほとんどの単離物の増殖特徴は１年以上培養維持されたニワトリ胚盤葉細胞で見られるものと同等であり（図１）、これはそれらの不明確な自己再生の可能性を示している。胚盤葉細胞はコロニーとして増殖した。それらは大きな核とわずかな細胞質を有する丸い細胞であった（図２のＢＲ２２ｐ２およびＢＲ２２ｐ３）。興味深いことに、胚盤葉細胞の形態が培養中に密に結合した細胞（図２のＢＲ２２ｐ２およびＢＲ２２ｐ３）から結びつきがよりゆるいより分散した細胞（図２のＢＲ２９ｐ１２）へと進化することが見出された。結びつきがよりゆるい細胞は最小培地での長期培養で安定化させることができた。これら形態の異なる細胞を幹細胞特異的マーカーの発現および胚の構成に寄与するそれらの能力に関してさらに特性決定した。
【００９１】
ＥＳ細胞は従来、種々のマーカー、ＥＣＭＡ−７(Kemler et al. 1981 J. Embryol. Exp. Morphol. 64:45-60)、ＳＳＥＡ−１(Solter and Knowles, 1978 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75(11):5565-5569)、ＥＭＡ−１(Hahnel and Eddy, 1986 J. reprod. Immunol. 10(2)89-110)の発現；特異的酵素活性テロメラーゼおよびアルカリ性ホスファターゼ活性の存在；ならびにＴＲＯＭＡ−１のような分化細胞のマーカーの不在によって定義されている。ＥＭＡ−１およびＳＳＥＡ−１マーカーおよびアルカリ性ホスファターゼ活性の発現を、in vitroで増幅された胚盤葉細胞で評価した。分析を全うするため、培養中に変化する胚盤葉細胞の形態、生殖細胞系列 (Tsunekawa et al, 2000 Development 127:2741-2750)、中胚葉系列(Wilkinson et al, 1990, Nature 343:657-659)および造血系列(Uchida et al, 1994 Blood 83:3758-3779)に特異的なマーカーを加えた。Brachyuryに対する抗体Ｔｈｙ−１およびｖａｓａは利用できないことから、対応する遺伝子の転写をＲＴ ＰＣＲにより評価した。この分析を長期培養期間中、異なる形態に関して行った。ＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１は長期培養期間中発現し続けた（図３）。アルカリ性ホスファターゼ活性もまた、同じ培養期間中、安定し続けていた（図４）。
【００９２】
図５は、細胞が培養維持されている際の分化マーカーの発現の進化を示している。Ｖａｓａ ｍＲＮＡは、予測されたように男性生殖腺は強く存在していた（図５レーン３）。Ｖａｓａ ｍＲＮＡはステージＸの胚には検出されなかった（レーン４）が、生殖細胞はステージＸの胚に存在する。Ｖａｓａ遺伝子は、培養維持された細胞で再現性よく発現されたが弱かった（レーン１８〜３６）。ステージＸの胚にＶａｓａ転写物が存在しないことは、ＲＴ ＰＣＲの感受性の低さによって説明することができる。in vitroで増幅された細胞におけるｖａｓａ遺伝子の発現は、これらの細胞が生殖細胞系列能を有するか、またはステージＸの胚に存在する生殖細胞がin vitroで増幅されたかのいずれかを意味し得る。中胚葉系列のマーカーであるBrachyury ｍＲＮＡはすでにステージＸの胚（産みたての卵からの胚）で検出されている（図５レーン４）。細胞が培養維持されている間、発現は増大した（図５ ＢＲ８ レーン１２および１３；ＢＲ１５ レーン１９〜２６；ＢＲ１８ レーン２７〜３０およびＢＲ１９ レーン３２〜３４）。造血系列は中胚葉を起源としたものである。造血系列のマーカーＴｈｙ−１ ｍＲＮＡもまた、培養維持された細胞で検出された（レーン７、８；１１、１２、１３；１６〜２４；２７〜３４）。雛の神経冠細胞のマーカーであるＨＮＫ１が胚盤葉細胞により発現された。ＨＮＫ１の発現は細胞が培養維持されている間安定であり続けた（データは示されていない）。未分化細胞のマーカーは総ての培養期間に発現された（データは示されていない）。培養胚盤葉細胞は未分化細胞のマーカーならびに神経冠細胞および中胚葉マーカーを発現した。驚くことに、生殖細胞特異的である考えられたＶａｓａ遺伝子はＥＳ細胞で転写される。
【００９３】
in vitro増幅されたニワトリ細胞の全能性は、in vivoにおいて胚の再構成に寄与するそれらの能力を評価することにより確認した。
【００９４】
キメラ現象のレベルに対する作用を決定するため、レシピエントニワトリ胚に異なる数のニワトリＥＳ細胞を注入する試験を設定した。定着効率に対するレシピエント胚の照射の影響も検討した。注入と照射の作用をモニタリングするため、（ｉ）胚の生存力；（ｉｉ）表現型キメラの割合％（有色羽（feathers）を有する胚の割合％）；（ｉｉｉ）表現型キメラ現象の程度（有色羽の割合％）；（ｉｖ）体細胞キメラ現象の割合％（羽以外の組織におけるキメラ現象）の４つのパラメーターを選択した。
【００９５】
予めγ線で傷つけた、または照射を行わなかった産みたてのレシピエント胚の胚下腔に３００、５，０００、１５，０００または３０，０００のＥＳドナー細胞を注入した。注入された卵を標準的な条件に従って孵卵させた。その培養時間で、定着能の進化を測定するため、培養１４日〜４３日に毎週、培養胚盤葉細胞を注入した。孵卵１８日目に総ての胚を分析した。
【００９６】
培養胚盤葉細胞（ドナー細胞）は、優性白色遺伝子座Ｉにおける同型接合劣性（ＩＩ）である有色Barred RockまたはＳ８６Ｎ系統に由来するものであった。ドナー細胞を、Ｉ遺伝子座において同型接合優性であるWhite Leghorn系統（レシピエント系統）から得られたレシピエント胚に注入した。体細胞キメラは孵化において黒色の産毛（black down）の存在によって同定した。しかしながらやはり、ドナー細胞およびレシピエント胚からの遺伝的フィンガープリントを識別するために、ＰＣＲ ＲＦＬＰアプローチも行った（図６）。レシピエント系統のＰＣＲ ＲＦＬＰパターンは個体によって異なる１または２バンドプロフィールである。ドナー系統のＰＣＲ ＲＦＬＰパターンは３バンドプロフィールである。キメラ組織はドナーに典型的な３バンドプロフィールにより同定した。その後、注入した細胞が羽以外の組織に定着する能力を有するかどうかを判定することが可能であった。特異的マーカーの発現と同様に、細胞を長期培養で、細胞形態に従って維持しながらin vitro定着能を調べた。
【００９７】
いくつかの表現型（すなわち、ドナー系統由来の細胞によって定着された羽を有する動物）と体細胞ニワトリキメラ（すなわち、ドナー系統由来の細胞によって定着された羽以外の組織を有する動物）が確認された。ドナー細胞は生殖腺を含む３つの胚葉層の総ての派生物に存在することが示された。この結果は、本発明の方法に従って得られたin vitroで拡張されたニワトリＥＳ細胞が、生殖腺を含むレシピエント胚の種々の組織を接ぎ足し（engraft）、再構成することができたことを示す。
【００９８】
驚くことに、本発明者らは、先行技術で推奨された量（すなわち、照射細胞３００〜５００個前後）よりも多量の細胞の注入でも胚の生存力に影響がないことを実証する。さらに、表現型キメラ現象の割合％は、照射段階の有無にかかわらず、多量の細胞（すなわち、１５０００を超え、さらには３００００前後）を注入する場合に有意に高まった。３００００細胞の注入は上限ではなく、さらに多い細胞の注入も考えられ、制限は、これらの細胞を受容した後にレシピエント胚が生存および発達可能であるかどうかということだけである。本発明者らは、照射レシピエント胚では１５０００細胞の注入が、また、非照射胚では３００００細胞の注入が良好な結果をもたらし、特に、生殖腺がキメラである胚の割合％が高まったことを実証する。
【００９９】
本発明者らは、使用範囲の照射ではニワトリ胚の生存力に影響を及ぼさないことを実証する。さらに、定着の可能性は胚盤葉ニワトリ細胞の培養期間に依存しているとは思われなかった（データは示されていない）。
【０１００】
これらのデータを考え合わせると、in vitroで単離および増幅されたＥＳ細胞が真の胚幹細胞であるということを裏付けるものである。
【０１０１】
実施例３：ニワトリＥＳ細胞による生殖細胞系列伝達
最良の注射法を開発したところ、注入された鳥の９％の生殖腺がキメラであった（データは示されていない）。生殖細胞系列伝達の課題に取り組むため、生殖腺の最適な定着が可能であることが示されている最良の方法に従い、レシピエント胚に培養細胞を注入することによって５８４個体の一群の動物を作出した。これらの鳥の表現型キメラ現象は、孵化時の数枚の羽（これらは後に喪失）から成鳥では９５％を超えるまで拡大した（図７および表２）。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
生殖細胞系列へのドナー系列の寄与を評価するため、Barred Rock細胞を注入した雌鳥とBarred Rocks雄鳥を交尾させた。生殖細胞系列伝達は後代の黒色と黄色の分布を調べることで評価した。２２１羽の雌鳥の後代を調べた。１６００６羽のＦ１鳥のうち、５羽の雛は様々な割合％の白色羽を示し（１羽は孵化前に死亡）、１羽の雛はBarred Rockに典型的な羽毛色素沈着を示した（図８Ａ）。Barred-Rock様の羽毛色素沈着を有する後代を産んだ雌鳥の説明および注入条件の説明は表３に示されている。培養５９日後であっても、細胞は生殖細胞系列定着能を保持していた。生殖細胞系列伝達は雌鳥の高い割合％の表現型キメラ現象と相関していなかった。実際、Barred Rock様の雛の母鳥は白色であった。ＰＧＣ注入可能数を評価したところ、５０のＰＧＣ(Eyal-Giladi et al, 1976)がステージＸの胚に存在しているものと思われた。最終的なＰＧＣ数は、細胞の連続継代培養から得られた希釈率ならびにレシピエント胚に注入された細胞懸濁液の濃度および容量に従って算出した。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
Ｆ１後代（１６００６羽）の５羽の雛のうち４羽が成鳥まで生存した。これら４羽の雌鳥にBarred Rock雄鳥の精液を受精させた。雌鳥５６６４−５６６５の後代はBarred Rock様であった（図８Ｂおよび表４）。他の３羽の雌鳥の後代はBarred Rock様およびWhite Leghorn様の雛であった（表４）。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
本発明者らはニワトリＥＳ細胞を培養する方法を提供する。胚盤葉細胞の増幅は、White LeghornおよびBarred Rockニワトリ系統に関してのみ記載されている(Pain et al, 1996 Dev. 122(8) 2339-2348)、Petitte et al,1990 108(1): 185-189、Zhu et al, 2005 Nat. Biotechnol. 23(9):1159-1169)。この研究で開発された培養法、特に、特定の増殖因子と時間内でのその進化の組合せにより、種々のニワトリ系統から細胞を再現性よく単離および増殖することができた。増幅効率は系統に依存し、この結果はマウスにおいて記載されている(Kawase et al, 1994 Int.J. Dev. Biol. 38(2):385-390)ＥＳ細胞の確立における系統差と一貫している。興味深いことに、マウスとは異なり、長期間培養維持された雛ＥＳ細胞の全能性は、いくつかの増殖因子の除去によって裏付けられる。すなわち、ニワトリＥＳ細胞は完全培養培地でも、また、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦおよびＦＧＦなどの増殖因子を除去した完全培地でも、長期培養中、全能性が保持される。注目すべきは、ヒトＥＳ細胞はマウスＥＳ細胞に関して確立された培養条件では維持できないことである。
【０１０８】
Pain et al (1996)は、ニワトリ胚盤葉長期培養（１６０日を超える）において、マウスＥＳ細胞と同様の典型的な「ＥＳ様」形態羽を有する雛において、小細胞の大きなコロニーが密に詰まっていたことを記載している。対照的に、本発明者が長期培養維持したニワトリ胚盤葉細胞の形態はそれほど安定ではなく、密に結合した丸い形状を有する細胞から結びつきがよりゆるい細胞へ変化した。この形態学的進化は一貫しており、ニワトリの系統によらない。この形態変化は、ＥＳ細胞に特異的な自己再生特性には影響を及ぼさなかった。（ｉ）免疫蛍光またはＲＴ ＰＣＲ分析による細胞の生化学的同定；（ｉｉ）培養細胞の生物学的特性を評価するための遺伝子導入法、によって、種々の系列の細胞の関与の可能性を検討した。細胞を外胚葉、中胚葉および内胚葉の３つの胚葉層の総てに特異的なマーカーに関して特性決定した。極めて早期の分化を示すマーカーが選択された。マーカーの特定の組合せを示す形態はなかった。未分化細胞のマーカーである、３つ総ての胚葉層のマーカーならびにｖａｓａのような生殖細胞系列も検出できた。形態変化に特異的なマーカー発現の進化はなかった。形態学的に最も分化した細胞であっても、ＥＳ細胞に特異的なマーカーを発現し、分化のマーカーは発現しなかった。
【０１０９】
in vitroで増幅された細胞懸濁液をレシピエント胚に注入した。羽の色素沈着は、メラニン細胞から羽の軸へ色素が移動することにより起こる。メラニン細胞は胚の胴部の神経冠細胞に由来する。神経冠細胞の分化は胚発達の極めて初期に起こる。
【０１１０】
黒色系のニワトリの細胞を注入した白色レシピエント胚の羽毛の色素沈着は、注入細胞の全能性を反映し得ないが、メラニン細胞系列へ方向付けられた細胞は、レシピエントのメラニン芽細胞系列を連結することができたことを示し得る。よって、注入細胞のレシピエント胚への寄与の研究は、羽毛の観察に限定されなかったが、３つの胚葉層総ての組織派生物を含んだ。表現型キメラおよび体細胞キメラは、培養において観察された細胞の主要な各形態（コード、クランプおよび彗星状）で得られ、その形態によらず未分化状態を裏付けた。興味深いことに、生殖腺に注入細胞が定着した。
【０１１１】
細胞のＥＳ状態の最終的な証明は生殖細胞系列の伝達である。１羽のＦ０（注入）雌鳥（０．３％）が生殖細胞系列の伝達を裏付けた。この雌鳥の後代の雛１６羽中、１羽のＦ１雛がBarred Rock様であった（６．２５％）。Ｆ１雌鳥からのＦ２雛は総てBarred Rockの表現型を示し、これはドナー形質の獲得が数世代で安定であることを示している。様々な割合％の黒色羽を示したＦ１雌鳥の後代の半数がBarred Rock様であり、他の半数はメンデルの遺伝の法則から予測されるようにWhite Leghornの表現型を有していた。
【０１１２】
従って、本発明者らは、ニワトリ胚盤葉細胞の生殖細胞系列能を実証する。よって、ニワトリ胚盤葉細胞は鳥類の遺伝子導入に有用である。
【０１１３】
実施例４：カモＥＳ細胞の単離および増幅：
４．１−原材料
カモ卵
Pekin系統ＧＬ３０からのカモ卵をGRIMAUD FRERES SELECTION (La Corbiere, Roussay France)から得た。親カモに大腸菌(Escherichia Coli）（自己ワクチンＣｏｌｉ ０１および０２）、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)(Landavax)、カモウイルス肝炎(Hepatovax)、ブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax)、鳥類メタニューモウイルス(Avian metapneumovirus)(Nemovac)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)および腸炎菌(Enteridis)（自己ワクチン）、リエメレラ・アンチペスティファー(Riemerella antipestifer)（自己ワクチンRiemerella）、鳥類メタニューモウイルス(Avian metapneumovirus)（Nobilis RTV不活性型）およびブタ丹毒菌(Ruvax)に対してワクチン接種されたものである。受け取った後、受精したPekin duck卵を次亜塩素酸塩(hypochloryde)浴中で殺菌を行った後、殻に付着した埃に関連した汚染のリスクを避けるためにFermacidal (Thermo)で除染した。
【０１１４】
フィーダー細胞
カモ幹細胞の多能性を維持するために、ネズミ起源の細胞（ＳＴＯ細胞）をフィーダー層として用いた。これらのフィーダー細胞をγ線照射（４５〜５５グレイ）により分裂不能とした後、プラスチック上に播種する。この照射量は、細胞周期の明らかな停止を誘発してなお、非分化細胞の細胞増殖の促進に必要な増殖因子および細胞外マトリックスの産生を可能とする、致死量以下の用量である。ＳＴＯ細胞系統は、ＳＩＭ(Sandos Inbred Mice)マウス胚繊維芽細胞からA. Bernstein, Ontario Cancer Institute, Toronto, Canadaが誘導し、American Type Culture Collection (ATCC) (ＳＴＯ製品番号: CRL-1503, バッチ番号1198713)が供給したものである。新鮮なフィーダー層を週２回調製した。指数関数的に細胞を分離し、計数した。活力のある培養物を維持するために細胞の一部を播種し、別の一部を照射した。照射に関しては、本発明者らは試験管中１０×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を作製した。細胞を４５〜５５グレイの線量に曝し、プラスチック上に播種した。播種後、不活性化したフィーダー細胞でコーティングしたディッシュまたはプレートを最大５日間用いた。
【０１１５】
培地
培地ＧＴＭ−３（Sigma、カタログ番号Ｇ９９１６）
ＤＭＥＭ−ＨａｍＦ１２（Cambrex、カタログ番号ＢＥ０４−６８７）
添加物
グルタミン（Cambrex、カタログ番号ＢＥ１７−６０５Ｅ）
抗生物質：ペニシリン／ストレプトマイシン（Cambrex、カタログ番号ＢＥ１７−６０２Ｅ））
非必須アミノ酸（Cambrex、カタログ番号ＢＥ１３−１１４Ｅ）
ピルビン酸ナトリウム（Cambrex、カタログ番号ＢＥ１３−１１５）
ビタミン（Cambrex、カタログ番号１３−６０７Ｃ）
βメルカプトエタノール（Sigma、カタログ番号Ｍ７５２２）
酵母自己融解物（SAFC、カタログ番号５８９０２Ｃ）
【０１１６】
因子
６つの異なる組換え因子を用いた。
組換えヒト毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）（Peprotech Inc、カタログ番号４５０−１３）
組換えヒトインスリン様因子Ｉ（ＩＧＦ１）（Peprotech Inc、カタログ番号１００−１１）
組換えヒトインターロイキン６（ＩＬ６）（Peprotech Inc、カタログ番号２００−０６）
組換えヒト可溶性インターロイキン６受容体（ｓＩＬ６ｒ）（Peprotech Inc、カタログ番号２００−０６Ｒ）
組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）（Peprotech Inc、カタログ番号３００−０７）
組換えヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Peprotech Inc、カタログ番号１００−１８Ｂ）
【０１１７】
これらの総ての因子、推定ＩＬ６ｒを大腸菌で産生される。可溶性ＩＬ６ｒはトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞で発現される。
【０１１８】
ウシ胎児血清
非照射ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（JRH、カタログ番号１２００３）
本プログラムで用いた非照射血清はオーストラリアで採取および生産されたものである。採取に用いた動物はＵＳＤＡの視察を受け、屠殺者に許容されるものであった。これを鳥類幹細胞培養中、培地に加えた。このバッチは幹細胞の培養維持に不可欠であり得る重要なタンパク質または成分の破壊を避けるために照射を行わなかった。
【０１１９】
照射血清（JRH、カタログ番号１２１０７）
このプログラムに用いた照射バッチは米国で採取した。この照射バッチは、ＳＴＯ細胞（フィーダー細胞）の培養に用いたＤＭＥＭ培地中の添加物として加えた。これらの細胞は幹細胞のように、増殖および培養維持に特定の品質の血清を必要としない。培地中の高濃度の血清を最小限にするため、本発明者らはＳＴＯ細胞を４％のＦＢＳの存在下でのみ増殖するようにした。
【０１２０】
４．２−カモＥＳ細胞の単離および培養の方法
３６０前後の受精したカモ卵を割り、割っているときに卵白から卵黄を分離した。パンチを用いて予め孔の開いたリングの形に切り抜いた小さな吸収性の濾紙(Whatmann 3M paper)を用い、卵黄から胚を取り出した。切り抜きの直径は約５ｍｍである。これらの小さなリングをオーブン内で約３０分間、乾熱を用いて滅菌した。実際には、胚採取の段階で、小さな濾紙のリングを卵黄の表面にのせ、胚の中心に置き、従って胚は濾紙のリングに取り囲まれる。次に、これを小さなはさみで切り抜き、そのまま取り出してペトリ皿にのせ、ＰＢＳを満たす。このようにリングによって取り出された胚から培地中で余分な卵黄を除去し、このように余分な卵黄素を含まない胚子板をパスツールピペットで採取した。
【０１２１】
これらのカモ胚を、ＰＢＳ１×を含む５０ｍＬ試験管に入れた。次に、カモ胚を機械的に剥離し、ＰＢＳで洗浄し、３９℃、７．５％ ＣＯ２で完全培養培地中、フィーダーＳＴＯ細胞の不活化層に播種した。このフィーダー細胞は２．７×１０４細胞／ｃｍ２前後で６ウェルプレートまたはディッシュに播種した。完全培養培地は、１０％ウシ胎児血清、終濃度１ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１、ＣＮＴＦおよび所望により、Ｉｌ−６、Ｉｌ−６Ｒ、ＳＣＦおよびウシＦＧＦ、１％非必須アミノ酸、市販のビタミンの１％混合物、終濃度０．１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、終濃度０．５ｍＭのβ−メルカプト−エタノール、終濃度２．１ｍＭのグルタミン、終濃度１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、終濃度１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび酵母自己融解物１×を添加した無血清培地ＤＭＥＭ−Ｈａｍ Ｆ１２からなった。早くは、継代培養４代に、抗生物質の混合物をもはや培地に加えない。
【０１２２】
カモＥＳ細胞を継代培養４代までＤＭＥＭ−Ｈａｍ Ｆ１２完全培養培地で培養した。４代後、基本培地を改変し、ＤＭＥＭ−Ｈａｍ Ｆ１２完全培地を下記のいずれかに置き換えた：
【０１２３】
１０％ウシ胎児血清、終濃度１ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１およびＣＮＴＦ、１％非必須アミノ酸、市販のビタミンの１％混合物、終濃度０．１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、終濃度０．５ｍＭのβ−メルカプト−エタノール、終濃度２．１ｍＭのグルタミンおよび酵母自己融解物１×を添加したＸＧＴＭ−３培地、または
【０１２４】
１０％ウシ胎児血清、終濃度１ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、Ｉｌ−６、Ｉｌ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦ、１％非必須アミノ酸、市販のビタミンの１％混合物、終濃度０．１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、終濃度０．５ｍＭのβ−メルカプト−エタノール、終濃度の２．１ｍＭのグルタミンおよび酵母自己融解物１×を添加したＧＴＭ−３培地。
カモＥＳ細胞は、分化させずに、この新たな培養培地で少なくとも１４代さらに培養された。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】鳥類ＥＳ細胞の細胞培養動態。ニワトリＥＳ細胞を、１０％ウシ胎児血清およびＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦを添加した培養培地中、マウスフィーダー層上で増殖させた。解離ごとに細胞の数を決定した。各解離時に得られた細胞の数を加えて、累積増殖係数を決定した
【図２】ニワトリＥＳ細胞の形態。胚盤葉細胞の形態：（Ａ）ＢＲ２２ｐ２および（Ｂ）ＢＲ２２ｐ３：大きな核とわずかな細胞質を有する丸型細胞。（Ｃ）ＢＲ２９ｐ１２：結びつきがよりゆるい分散した胚盤葉細胞。
【図３】細胞特異的マーカーＳＳＥＡ−１の発現。in vitroで異なる培養期間維持した胚盤葉細胞においてＥＳ細胞特異的マーカーＳＳＥＡ−１の発現を試験した。左パネルＡ：位相差。右パネルＢ：抗体染色。
【図４】ＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性。胚盤葉細胞の内因性アルカリ性ホスファターゼ活性。細胞を異なる培養期間アルカリ性ホスファターゼ活性染色した。
【図５】細胞を培養維持する一方での分化マーカーＶＡＳＡ、ＴＨＹ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹの発現の進化。マーカーおよび培養。１：骨髄、２：胚（頭部）；３：雄生殖腺、４：胚（ステージＸ）；５：フィーダー（ＳＴＯ）；６：フィーダー（ＳＮ）；７：ＢＲ ４−５；８：ＢＲ４−６；９：ＢＲ ５−２；１０：ＢＲ ８−７；１１：ＢＲ ８−８；１２：ＢＲ ８−９；１３：ＢＲ ８−１２；１４：Ｖ ９−１９；１５：ＢＲ １５−０；１６：ＢＲ １５−１；１７：ＢＲ １５−２；１８：ＢＲ １５−３；１９：ＢＲ １５−５；２０：ＢＲ １５−６；２１：ＢＲ １５−７；２２：ＢＲ １５−８；２３：ＢＲ １５−８；２４：ＢＲ １５−９；２５：ＢＲ １５−１０；２６：ＢＲ １５−１１；２７：ＢＲ １８−２；２８：ＢＲ １８−３；２９：ＢＲ １８−４；３０：ＢＲ １８−５；３１：ＢＲ １９−１；３２：ＢＲ １９−２；３３：ＢＲ １９−３；３４：ＢＲ １９−４；３５：ＢＲ ２０−２；３６：ＢＲ ２０−３；３７：Ｓ１ ｐ２０；３８：ｇＤＮＡ Barred Rock；３９：水；４０：水。異なる培養期間中のＶａｓａ、Ｔｈｙ−１およびＢｒａｃｈｕｙｒｙ（Ｔ）マーカーの発現。ＧＡＰＤＨ対照マーカー。細胞を数週間培養維持した。解離ごとに細胞ペレットを冷凍した。各細胞ペレットのＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲを同時に実施した。
【図６】ドナーおよびレシピエントニワトリ系統とキメラのＰＣＲ ＲＦＬＰプロフィール解析。ドナーおよびレシピエントニワトリ系統とキメラのＰＣＲ ＲＦＬＰプロフィール。ドナーおよびレシピエントニワトリ系統からの産まれたての有胚卵７個を５日間インキュベートした。全胚からＤＮＡを抽出した。体細胞キメラ：ドナー細胞を注入した胚を１８日間インキュベートした。血液、心臓、肝臓、脾臓および生殖腺からＤＮＡを抽出した。
【図７】キメラ鳥。ドナーニワトリ細胞をレシピエントニワトリ胚に注入した。レシピエント胚を孵化までインキュベートした。キメラ鳥を成体まで飼育した。
【図８】Ｆ１およびＦ２後代。８Ａ：典型的なBarred-Rock羽毛色素沈着を示すＦ１鳥。８Ｂ：５６６４−５６６５雌鳥からのＦ２鳥。雌鳥をBarred Rock雄鳥の精液で人工授精させた。卵を孵化までインキュベートした。
【図９】カモＥＳ細胞の形態。カモＥＳ細胞を、１０％ウシ胎児血清およびＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦを添加したＤＭＥＭ培養培地中、マウスフィーダー層上で増殖させた。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、鳥類バイオテクノロジー、特にトランスジェニック鳥を生産する方法に関する。本発明は、卵において目的の組換えタンパク質を大量に発現するトランスジェニック鳥を作り出すのに特に有用である。
【０００２】
臨床開発において生体分子は４００を超え、市場は３００億ドルを越えて、治療分野はこの１５年で加速的成長を経験した。大部分の組換えタンパク質は、完全な生物学的活性を得るために特異的な翻訳後修飾を必要とし、そのため大規模バイオリアクター内で増殖させた哺乳類細胞において生産しなければならない。かかる生産システムにかかわるコストは、重要な量的必要性と相まって、製品開発までのプロセス全体の遅延増大に関与する。これに関連して、とりわけ前記修飾が生殖細胞系列を通じてその後代に伝達され得るならば、トランスジェニック動物は経済的に魅力的な代替手段に相当し得る。
【０００３】
ウサギ、ヤギおよびウシは目的の多量性を導いたが、長年にわたり雌鳥がニワトリ卵における治療用組換えタンパク質の迅速でコスト効果の高い生産のための最も魅力的な生物学的生産システムと考えられてきた。実際に、商業雌鳥は１年に約２５０個の卵を産み、各卵には大体４ｇの卵白タンパク質が含まれるため、ニワトリの産卵能力は並外れている。１個の卵によって１００ｍｇの組換えタンパク質しか生産されなかったとしても、１０００匹の雌鳥の小群によって１年に２５ｋｇの未加工組換えタンパク質材料を生産することができるであろう。加えて、商業卵産業はすでに高度に自動化されており、数十年にわたってニワトリ卵によって多くのヒトワクチンが生産されていることから監督官庁も卵由来製品に不安を抱かない。
【０００４】
また、養鶏業では商業的関心の高い遺伝形質の選抜促進のために遺伝子導入を利用すること（すなわち「メタ−クローニング技術(meta-cloning technology)」）にも関心を寄せる場合がある。所望の雛を短期間に得るために古典的な選抜スキーム：［系統−＞ＧＧＰ−＞ＧＰ−＞ＰＳ］をバイパスすることがその狙いであろう。家禽生産におけるトランスジェニック技術の最も有望な利用は、トランスジェニック植物においては一般的なことである病害抵抗性を与えることまたは食物同化を改善することである。加えて、トランスジェニック技術は、鳥類遺伝資源を保存する戦略でもある。これまでのところ、養鶏業において最も価値のある動物である純種動物を異なる場所に分割することが、繁殖用施設において問題（例えばウイルス感染）が発生した場合における数年間にわたる選抜プログラムの損失を防ぐ唯一の方法である。かかるアプローチは費用がかかり、２００３年におけるオランダの場合のように、ウイルス感染を検査するために地元の家禽総ての予防的排除を実行する国家公衆衛生決議に対して保証するものではない。
【０００５】
改変動物の工学技術には、まずその動物のゲノムへの導入遺伝子の安定した導入が含まれる。２５年来研究されている異なるＤＮＡ導入技術は：（ｉ）ＤＮＡマイクロインジェクション、（ｉｉ）ウイルス形質導入、（ｉｉｉ）精子を介した遺伝子導入、（ｉｖ）核移植、（ｖ）始原生殖細胞、または（ｖｉ）胚幹細胞を利用した細胞に基づいた導入である。雛では、導入遺伝子の生殖細胞系伝達に関してＤＮＡマイクロインジェクションアプローチ(Love et al, 1994 Biotechnology 12:60-63)およびウイルス形質導入(Bosselman et al, 1990 J. Reprod. Fertil. Suppl. 41: 183-195)の有効性しか確認されていない。しかしながら、これら２つの技術はいくつかの制限を受け；それらは厄介で困難なものであり、一つには導入遺伝子のランダム組込みおよびサイレンシングが原因で有効性は低い。ウイルス形質導入技術には、ウイルスベクターに組み込む導入遺伝子のサイズというさらなる制限がある。これら２つの技術では現在も商業的開発に適合するタンパク質発現レベルに到達させることができなかった。
【０００６】
予めin vitroで遺伝学的に操作した始原生殖細胞（ＰＧＣ）または胚幹（ＥＳ）細胞の発生中の雛胚への注入は、とりわけこれらの技術によって、導入遺伝子の高発現レベルを可能にするゲノム内特定部位への導入遺伝子の組込みを対象とすることができることから鳥類遺伝子導入の有望な技術に含まれる。しかしながら、トランスジェニック雛の生産にこのアプローチを利用するためには、重要な要件を満たさねばならず：細胞はin vitro操作に対して生き延び、一方でなお、レシピエント胚内に組み込まれ、その生殖細胞系列に定着し、その後、その後代に修飾を伝達するそれらの能力を維持しなければならない。
【０００７】
これまでに、それぞれのプロセスステップでの異なる技術的障害を克服するために多くの試みがなされ、現在では、非孵卵胚から単離した新鮮単離胚盤葉細胞を産まれたての胚の胚下腔に注入することによって体細胞および生殖細胞系列キメラが得られている。ドナー細胞およびレシピエント細胞の寄与は、（ｉ）白黒色素沈着試験を通してメラニン細胞集団により（Barred RocksまたはBrown LeghornsはＩ遺伝子座に劣性対立遺伝子を有し、一方White LeghornsはＩ遺伝子座に優性対立遺伝子を有する）；（ｉｉ）ＤＮＡフィンガープリント解析を通して赤血球集団により；（ｉｉｉ）ドナー由来表現型を有する後代の解析を通して生殖腺により(Petitte et al, 1990 Development 108:185-189; Carsience et al, 1993 Development 117:669-675; Thoraval et al, 1994 Poultry Science 73:1897-1905; Pain et al, 1996 Development 122:2339-2348)評価した。体細胞組織と生殖細胞系列の両方への寄与を示すキメラは、胚盤葉細胞を培養から４８時間後(Etches et al, 1996 Mol. Reprod. Dev. 45:291-288)最大７日後まで(Pain et al, 1996)注入したときに観察された。Etches et al, 1996では、マウス繊維芽細胞と同時培養した細胞の注入後に体細胞性が著しく強いキメラが観察されることが示されている。Pain et al (1996)では、鳥類胚盤葉細胞をＳＴＯマウス繊維芽細胞系統上に播種した。培養維持した細胞のＥＳ状態は、ＥＣＭＡ−７およびＳＳＥＡ−１エピトープの発現ならびにテロメラーゼ活性に依存した(Pain et al, 1996)。胚盤葉細胞の分化がない増殖は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および他の因子、Ｉｌ−１１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１の存在によって刺激を受け、抗レチノイン酸モノクローナル抗体への曝露によって分化は阻害された(Pain et al, 1996)。レシピエント胚を、ドナー細胞の注入前に照射暴露によって損傷させたときに、ドナー由来細胞による胚の定着が促進されることは示されている(Carsience et al, 1993)。
【０００８】
しかしながら、培養維持した胚盤葉細胞では、新たに調製した細胞の注入後に観察された体細胞キメラ現象の頻度および程度と比較して体細胞組織への寄与の低下を示す少数のキメラが得られた。さらに、それでも細胞に基づいた鳥類遺伝子導入戦略の各構成部分が成し遂げられる可能性があることが示されたが；ＥＳ細胞技術を用いて得られたトランスジェニック動物は記載されていない。
【０００９】
トランスジェニックニワトリを作製する効率的な方法がなお必要である。これが本発明の目的である。
【００１０】
この目的を達成するために、そして本発明の目的に従って、本明細書において具体化し、広く記載したとおり、本発明は、鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を培養する方法であって、
ａ）好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、
−インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および／または繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；さらに
−所望により、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン１１（Ｉｌ−１１）、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンを含んでなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子；
ならびに
−動物血清；
を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間、好ましくは、２〜２０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦ、ＦＧＦ、Ｉｌ−６、Ｉｌ−６Ｒ、ＬＩＦ、オンコスタチン、カルジオトロフィンおよびＩｌ−１１から選択された少なくとも１つの増殖因子を除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含んでなる方法を提供する。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明の鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ならびに動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間、好ましくは、２〜２０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦ、ＦＧＦ、Ｉｌ−６およびＩｌ−６Ｒを含んでなる群から選択された少なくとも１つの増殖因子を除去する、好ましくは、該培養培地から、増殖因子ＳＣＦ、ＦＧＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒを除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含んでなる。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、本発明の鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦおよびＦＧＦを含んでなる群から選択された少なくとも１つの増殖因子を除去する、好ましくは、該培養培地から、両方の増殖因子 ＳＣＦおよびＦＧＦを除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含む。
【００１３】
本発明の方法の任意選択工程ｃ）は、培養中にＥＳ細胞の死および／または分化の徴候が観察されるときに実施する。分化の徴候の例は、例えば特徴的な形態型（例えば上皮細胞種または繊維芽細胞種など）への細胞の形態学的変化である。分化の別の例は、ＥＳ細胞マーカー（ＥＳ細胞マーカーであるテロメラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ＳＳＥＡ−１抗原など）の発現の不在または減少である。
【００１４】
より好ましい実施形態では、本発明の、鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を工程ａ）の培地中でさらに培養する工程；
を含む。
【００１５】
別のより好ましい実施形態では、本発明の、鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）鳥類未孵卵受精卵胚盤葉板（blastoderm disk of fertilized un-incubated avain egg(s)）由来のＥＳ細胞を少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を工程ａ）の培地中でさらに培養する工程；
を含む。
【００１６】
別のより好ましい実施形態では、本発明の、鳥類胚幹（ＥＳ）細胞培養方法は、
ａ）鳥類未孵卵受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を工程ａ）の培地中でさらに培養する工程；
を含む。
【００１７】
本明細書における用語「鳥類」とは、分類学上の綱”ava”の生物の任意の種、亜種または品種、限定されるものではないが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリなどを指すことが意図される。本明細書における用語「鳥類」、「鳥」、「鳥綱（aves）」または「ava」は、同じ意味を有することが意図され、区別せずに用いられる。好ましい実施形態では、「鳥」とは、以下の分類学上の目の任意の動物を指す：
−「ガンカモ目(Anseriformes)」（すなわちカモ、ガチョウ、ハクチョウおよび同類）。ガンカモ目というこの目には、３つの科に属する約１５０種の鳥が含まれる：サケビドリ科（Anhimidae）（サケビドリ類）、カササギガン科(Anseranatidae)（カササギガン）、およびガンカモ科(Anatidae)（１４０種を超えるミズドリ、中でもカモ、ガチョウ、およびハクチョウを含む）。前記目に属する総ての種は、水表面での水中生活に高度に適応している。総てには、効率的に遊泳するために足に水かきがある（一部は後に主として陸生となった）。この用語には、カモの様々な系統、例えばPekin duckおよびMuscovy duckが含まれる。
【００１８】
−「キジ目(Galliformes)」（すなわちニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、キジおよび同類）。このキジ目は、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラおよびキジを含む鳥目である。世界的には約２５６種が認められる。この用語には、セキショクヤケイ(Gallus gallus)、またはニワトリの様々な系統、例えばS86N、Valo、White Leghorn、Brown Leghorn、Sussex、New Hampshire、Rhode Island、Ausstralorp、Minorca、Amrox、California Gray、East Lansing、Italian-Partridge-colored、Marans、Barred Rock、Cou Nu Rouge(CNR)、GF30、ISAならびにシチメンチョウ、キジ、ウズラ、および一般的に繁殖させる他の家禽の系統が含まれる。
【００１９】
−「ハト目(Columbiformes)」（すなわちイエバトおよび同類）。ハト目というこの鳥目には非常に一般的なハトおよびイエバトが含まれる。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明の鳥類細胞はニワトリ細胞である。前記ニワトリは、S86N、Valo、White Leghorn、Brown Leghorn、Sussex、New Hampshire、Rhode Island、Ausstralorp、Minorca、Amrox、California Gray、East Lansing、Italian-Partridge-colored、Marans、Barred Rock、Cou Nu Rouge (CNR)、GF30、ISAを含んでなるニワトリ系統の群から選択されることが好ましい。より好ましい実施形態では、本発明のニワトリＥＳ細胞はBarred-Rock系統である。別の好ましい実施形態では、本発明の鳥類細胞はカモ細胞である。より好ましい実施形態では、本発明のカモＥＳ細胞はPekinまたはMuscovy系統である。
【００２１】
工程ａ）の細胞は鳥類胚幹細胞である。胚幹細胞（ＥＳ細胞）は、極めて初期（例えば胞胚期）の胚の一部または総ての培養から得られるという特徴を有する幹細胞である。これらのＥＳ細胞は、in vitroで幹細胞の総ての特徴を示し、in vivoで胚の形態形成に寄与し、それらが方法の如何を問わずレシピエント胚に再移植されるときには生殖細胞系列定着に関与する独自の能力を示す。成熟期後に発生する精細胞または卵母細胞の前駆細胞である始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、多能性ＥＳ細胞であり、ＥＳ細胞のサブタイプとなる。好ましくは、本発明の鳥類胚幹細胞は、Eyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩ〜ＸＩＩの間に含まれる、より好ましくは、Eyal-Giladi & Kochav分類のステージＸ前後の発生段階にある鳥類受精卵の胚盤葉板から単離される（EYAL-GILADI分類：EYAL-GILADI and KOCHAV, 1976, ≪ From cleavage to primitive streack formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick ≫. "General Morphology" Dev. Biol. 49: 321-337参照）。好ましい実施形態では、工程ａ）の細胞は、産まれたての受精卵すなわち産卵と名付けられた発生段階にある受精卵から単離される。Sellier et al. (2006, J. Appl. Poult. Res., 15:219-228)によれば、産卵はEyal-Giladi分類による次の発生段階に相当する：
−Muscovy duck：ステージＶＩＩ
−ホロホロチョウ：ステージＶＩＩ〜ＶＩＩＩ
−シチメンチョウ：ステージＶＩＩ〜ＶＩＩＩ
−Pekin duck：ステージＶＩＩＩ
−ニワトリ：ステージＸ
−ニホンウズラ：ステージＸＩ
−ガチョウ：ステージＸＩ。
【００２２】
好ましくは、工程ａ）のPekin duck胚幹（ＥＳ）細胞は、Eyal-Giladi分類のステージＶＩＩＩ（産卵）前後の胚を分離することによって得られる。
【００２３】
好ましくは、工程ａ）のMuscovy duck胚幹（ＥＳ）細胞は、Eyal-Giladi分類のステージＶＩＩ（産卵）前後の胚を分離することによって得られる。
【００２４】
好ましくは、工程ａ）のニワトリ胚幹（ＥＳ）細胞は、Eyal-Giladi分類のステージＸ（産卵）前後の胚を分離することによって得られる。
【００２５】
より好ましくは、前記卵は一度も孵卵されていない（すなわち「未孵卵（un-incubated）」）。胚盤葉板から単離された細胞は、鳥類胚細胞、より詳細には鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を含んでなり；これらの鳥類胚細胞は全能性または多能性細胞である。胚盤葉細胞は、コロニーとして増殖する密に結合した細胞であり；それらの細胞は丸型形態を示し、大きな核と小さな細胞質を有する（図２参照）。胚盤葉細胞の形態は培養中に、密に結合した細胞から結びつきがよりゆるいより分散した細胞へと進化する（本発明の方法の工程 図２ｂ＆ｃ）。工程ｃ）において得られた鳥類ＥＳ細胞は、よりゆるい結びつきを示すことが好ましい。
【００２６】
別の実施形態によれば、工程ａ）の細胞は、始原生殖細胞（ＰＧＣ）が豊富な胚幹細胞集団である。より好ましくは、工程ａ）の鳥類ＥＳ細胞は精製ＰＧＣである。鳥類種では、始原生殖細胞は胚盤葉の中心領域から発生する(Ginsburg and Eyal-Giladi, 1987 Development 101(2):209-19; Karagenc et al, 1996 Dev Genet 19(4):290-301; Petitte et al, 1997 Poult Sci. 76(8): 1084-92)。その後、始原生殖細胞は前方の胚体外部位である生殖三日月環へと移動し、胚発生２．５日〜５日間に血管系に取り込まれるに至って、生殖隆起に到達する。始原生殖細胞は生殖隆起に定着し（colonize）、そこで始原生殖細胞は最後には卵母細胞または精母細胞へと分化する(Nieuwkoop and Sutasurya, 1979. The Migration of the primordial germ cells. In: Primordial germ cell in Chordates. London: Cambridge University Press p113-127)。ドナー鳥類胚からのＰＧＣの単離方法については文献で報告されており、当業者であれば容易に実施することができる（例えば１９９３年９月７日公開（公開番号第０５−２２７９４７号）のＪＰ９２４９９７; Chang et al. 1992. Cell Biol. Int. 19(2): 143-149; Naito et al. 1994 Mol. Reprod. Dev. 39: 153-161; Yasuda et al. 1992. J. Reprod. Fert. 96: 521-528; Chang et al. 1992 Cell Biol. Int. Reporter 16(9): 853-857参照）。一実施形態によれば、ＰＧＣは、Hamburger & Hamilton分類のステージ１２〜１４(Hamburger & Hamilton 1951 A series of normal stages in the development of chick embryo. J. Morphol. 88: 49-92)にあるニワトリ胚の背側大動脈から採取した胚血管から採取される。別の好ましい実施形態では、ＰＧＣは、ニワトリ胚の機械的切開によって生殖三日月環からまたは生殖腺から採取された。しかしながら、上述のとおり、他のＰＧＣ単離方法も知られており、代わりに用いることができる。
【００２７】
「完全培養培地」とは、少なくとも１つの増殖因子および動物血清が添加された、基礎培地、好ましくは基礎合成培地を意味する。完全培養培地の例は、ＷＯ０３／０７６６０１、ＷＯ０５／００７８４０、ＥＰ７８７１８０、ＵＳ６，１１４，１６８、ＵＳ５，３４０，７４０、ＵＳ６，６５６，４７９、ＵＳ５，８３０，５１０およびPain et al. (1996, Development 122:2339-2348)に記載されている。本発明によれば、「基礎培地」とは、単独で、少なくとも細胞生存、さらによくは、細胞増殖を可能にする古典的な培養処方の培地を意味する。基礎培地の例は、ＢＭＥ（基礎イーグル培地）、ＭＥＭ（最少イーグル培地）、１９９培地、ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）、ＧＭＥＭ（Glasgow改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ−ＨａｍＦ１２、Ｈａｍ−Ｆ１２およびＨａｍ−Ｆ１０、イスコフの改変ダルベッコ培地、マッコイの５Ａ培地、ＲＰＭＩ １６４０である。基礎培地は、無機塩（例えば：ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、．．．）、アミノ酸、ビタミン（チアミン、リボフラビン、葉酸、Ｄ−パントテン酸Ｃａ、．．．）および他の成分（グルコース、β−メルカプト−エタノール、ピルビン酸ナトリウムなど）を含んでなる。好ましくは、基礎培地は合成培地である。本発明の最も好ましい基礎培地は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、０．１６ｍＭ β−メルカプト−エタノールが添加されたＤＭＥＭ−ＨａｍＦ１２である。
【００２８】
あるいは、前記完全培養培地は、馴化培地、好ましくはＢＲＬ馴化培地である。一例として、ＢＲＬ馴化培地は、Smith and Hooper(1987, Dev. Biol. 121： 1-9)によって記載されているような当技術分野で認められている技術によって調製される。ＢＲＬ細胞はＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１４４２で入手可能である。馴化培地には、以下に記載する外因性増殖因子を添加してよい。
【００２９】
本明細書における用語「増殖因子」とは、培養下の鳥類細胞の生存および増殖に必要な培養培地に添加される外因性増殖因子を意味する。２つのファミリーの増殖因子を概略的に区別することができる：サイトカインおよび栄養因子。前記サイトカインは、主としてｇｐ１３０タンパク質と関連している受容体を通じて作用するサイトカインである。例えば、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン１１、インターロイキン６、インターロイキン６受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンは、特定鎖の受容体レベルにおける補充および単量体形または場合によってはヘテロ−二量体形でのｇｐ１３０タンパク質との受容体の組合せに関して類似した作用機序を有する。前記栄養因子は、主として幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、好ましくは塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）またはヒトＦＧＦ（ｈＦＧＦ）である。
【００３０】
本発明の方法の工程ａ）において使用される完全培養培地は、基礎培地、好ましくは基礎合成培地、ならびにｇｐ１３０タンパク質と関連している受容体を通じて作用する少なくとも１つのサイトカインおよび／または少なくとも１つの栄養因子を含んでなる。好ましくは、本発明による完全培養培地は、基礎培地、および白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチン、カルジオトロフィン、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）からなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子を含んでなる。
【００３１】
第一の好ましい実施形態によれば、前記完全培養培地は、動物血清ならびに少なくともＩＧＦ−１およびＣＮＴＦを添加した基礎培地である。
【００３２】
第二の好ましい実施形態によれば、前記完全培養培地は、動物血清ならびに少なくともＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒを添加した基礎培地である。
【００３３】
第三の好ましい実施形態によれば、前記完全培養培地は、動物血清ならびに少なくともＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦを添加した基礎培地である。
【００３４】
別の実施形態によれば、前記完全培養培地は、増殖因子（すなわち例えばＢＲＬ細胞によって発現される）を含んでなり、所望により、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）：を含んでなる群において選択された少なくとも１つの外因性増殖因子を添加した馴化培養培地である。
【００３５】
前記基礎培地中または前記馴化培養培地中の増殖因子ＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦ、ＩＬ−１１の濃度は、約０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌの間で含まれる。
【００３６】
本発明の鳥類胚幹細胞は、フィーダー細胞層上で培養される。フィーダー細胞は、ＥＳ細胞を得るために培養される細胞または細胞系統であり得る。あるいは、前記フィーダー細胞は、細胞外マトリックスと結合した増殖因子とで置き換えることができる。従って、フィーダーマトリックスはフィーダー細胞または細胞外マトリックスを指す。本明細書におけるフィーダーマトリックスは、当技術分野で公知の手法に従って構築される。上述のとおり、前記フィーダーマトリックスは予め馴化されることが好ましい。用語「予め馴化される」とは、鳥類受精卵胚盤葉板由来の細胞が前記フィーダーマトリックスと接触して沈着する前に、前記フィーダーマトリックスが培地の存在下で、ある期間、例えば前記フィーダーマトリックスにより例えば、増殖因子または他の因子の生産が開始され、確立されるのに十分な時間、培養されることを意味し；通常フィーダーマトリックスは、鳥類受精卵胚盤葉板由来の細胞がそのフィーダーマトリックスと接触して沈着する前に、そのフィーダーマトリックスを単独で１〜２日間培養することにより予め馴化させる。前記フィーダー細胞は、マウス繊維芽細胞を好ましくは含んでなる。ＳＴＯ繊維芽細胞が好ましいが、初代繊維芽細胞も好適である。また、本発明は、マウス細胞フィーダーマトリックスの使用に関して記載しているが、他のネズミ種（例えばラット）；他の哺乳類種（例えば；有蹄動物、ウシ、ブタ種）；または鳥類種（例えばGallinacea、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ）由来の細胞を含んでなるフィーダーマトリックスも使用してよいと考えられる。別の実施形態では、本発明のフィーダー細胞は、例えばＳＴＯ細胞において鳥類ＳＣＦなどの増殖因子の構成的発現を可能にする発現ベクターでトランスフェクトしてよい。このようにして、この「フィーダー」は、前記細胞の原形質膜中に溶解しかつ／または付着している状態の前記因子を生産する。従って、本発明の培養方法は、フィーダー細胞の単層を確立することを所望により含んでよい。フィーダー細胞は標準的な技術を用いて分裂不能にされる。例えば、前記フィーダー細胞は、Ｘ線またはγ線照射（例えば４０００ラドのγ線）に曝してよくまたはマイトマイシンＣ（例えば１０μｇ／ｍｌ ２〜３時間）で処理してよい。細胞を分裂不能にするための手法もまた、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209から細胞とともに一般に送られる情報に詳述されている（例えばＳＴＯフィーダー細胞はＡＴＣＣ受託番号１５０３で入手可能である）。単層は、所望により、約８０％コンフルエントまで、好ましくは約９０％コンフルエントまで、より好ましくは約１００％コンフルエントまで培養してよい。単層としての前記フィーダー細胞の構造が前記培養に好ましい構造であるが、いずれもの好適な構造が本発明の範囲内であると考えられる。従って、例えば、フィーダー細胞の層、単層、クラスター、凝集体または他の会合体もしくは集団は、本発明の範囲内に入ると考えられ、特に用語「マトリックス」の意味の範囲内に入ると考えられる。
【００３７】
本発明の培養培地には動物血清が添加される。使用することが好ましい動物血清は、動物胎児血清である。ウシ胎児血清が好ましい。また、本発明は、ウシ胎児血清の使用に関して記載しているが、他の動物種（例えばニワトリ、ウマ、ブタ、有蹄動物など．．．）由来の血清を含んでなる動物血清も使用してよいと考えられる。前記培養培地中の動物血清の終濃度は、およそ１〜２５％間、好ましくは５％〜２０％間、より好ましくは８％〜１２％間で含まれる。その好ましい実施形態では、前記培養培地中の動物血清の終濃度はおよそ１０％である。好ましい実施形態によれば、前記培養培地はおよそ１０％のウシ胎児血清を含んでなる。本発明の培養培地には、細菌汚染を防ぐために、さらに抗生物質（例えばペニシリンおよびストレプトマイシンなど）を含めてよい。
【００３８】
別の実施形態によれば、本発明は、鳥類胚幹細胞を遺伝学的に改変する方法であって、
ａ）上述の方法によって得られ、培養されたＥＳ細胞をベクターでトランスフェクトする工程；
ｂ）トランスフェクトされたＥＳ細胞を、好ましくは、培地中に例えば抗生物質、アミノ酸、ホルモンなどの選抜薬剤を加えることによって、選抜する工程；
ｃ）遺伝学的に改変された耐性ＥＳクローンのスクリーニングおよび増幅する工程、
ｄ）前述のとおりの培養培地中、フィーダー細胞層上で工程ｃ）の該遺伝学的改変ＥＳ細胞を培養する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００３９】
第一の実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清、およびＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、Ｉｌ−１１、ＬＩＦ、ＦＧＦ、ＳＣＦ、オンコスタチン、カルジオトロフィンを含んでなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子を含んでなる。好ましい実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清ならびにＩＧＦ１およびＣＮＴＦを含んでなる。別の実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清ならびにＩＧＦ１およびＣＮＴＦ、さらに所望により、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、Ｉｌ−１１、ＬＩＦ、ＦＧＦ、ＳＣＦ、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンを含んでなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子を含んでなる。、第三の好ましい実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清ならびにＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒを含んでなる。第四の好ましい実施形態によれば、工程ｄ）の前記培養培地は、動物血清ならびにＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦおよびＦＧＦを含んでなる。
【００４０】
工程ｃ）のＥＳ細胞は遺伝学的に改変される。遺伝子改変は、ＥＳ細胞において、前記ベクターでの一過性または安定トランスフェクションにより実施される。好ましい実施形態によれば、前記ＥＳは、当業者により周知の技術によって前記ベクターで安定にトランスフェクトされる。第一の実施形態によれば、前記ベクターはＥＳ細胞のゲノムに無作為に挿入される。好ましい実施形態によれば、前記ベクターは、相同組換えによってＥＳ細胞のゲノムに挿入される。ＷＯ０３／０４３４１４では、ＥＳ細胞を相同組換えにより遺伝学的に修飾するためのプロトコールおよび発現ベクターが記載されている。
【００４１】
工程ａ）のＥＳ細胞は、レシピエント胚への導入前にin vitroで長期間維持され、培養され得る。この長い期間によって前記細胞を遺伝学的に改変させることができる。好ましい実施形態によれば、前記細胞はin vitroで少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも１４日間、少なくとも２５日間、少なくとも５０日間、少なくとも７５日間、少なくとも１００日間培養される。
【００４２】
本明細書における用語「ベクター」とは、細胞内にトランスフェクトすることができ、その宿主細胞ゲノムとは独立にまたはその宿主細胞ゲノム内で複製することができる天然もしくは合成一本鎖もしくは二本鎖プラスミドまたはウイルス核酸分子を指す。環状二本鎖プラスミドは、該プラスミドベクターのヌクレオチド配列に基づいた適当な制限酵素での処理により線状化することができる。核酸は、ベクターを制限酵素で切断し、それらの断片を一緒に連結することによって、ベクターに挿入することができる。前記核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。本明細書における用語「プラスミド」とは、細菌または酵母宿主細胞内での独立した複製が可能である小さな環状ＤＮＡベクターを指す。前記核酸ベクターは、「対象となるポリペプチド」をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節配列をさらに含む。調節配列は当技術分野で周知であり、当業者であれば過度に実験を行わずに前記連結ヌクレオチド配列の良好な発現を確実にするように選択し得る。本明細書において、用語「調節配列」には、発現を制御し得るプロモーター、エンハンサー、および他のエレメントが含まれる。好適な発現ベクター、プロモーター、および他の発現制御エレメントを設計するために、標準的な分子生物学テキスト例えばSambrook et al. eds "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd ed. Cold Spring Harbor Press (1989)およびLodish et al. eds., "Molecular Cell Biology," Freeman (2000)を参考にしてよい。しかしながら、好適な発現ベクターの選択は複数の因子（形質転換させる宿主細胞の選択および／または発現させるタンパク質のタイプを含む）に依存することは認識すべきである。また、様々な用途には、組織選択的（すなわち組織特異的）プロモーター、すなわち、１以上の他のタイプの組織に対して、ある特定の種類の組織の細胞において優先的に発現をもたらすプロモーターが有用である。例示的な組織特異的プロモーターは、鳥類卵白のタンパク質（オボアルブミン、リゾチーム、オボムコイド、コンアルブミンおよびオボムチンなどを含む）と本来関係があるニワトリ卵管特異的プロモーターである。有用なプロモーターには、外因性誘導プロモーターも含まれる。これらは、一般に内因性代謝産物やサイトカインではない外部から供給された薬剤または刺激に応じて「作動させる」ことができるプロモーターである。例としては、抗生物質誘導プロモーター（テトラサイクリン誘導プロモーターなど）、熱誘導プロモーター、光誘導プロモーター、またはレーザー誘導プロモーターが挙げられる（例えば、Halloran et al., 2000, Development 127(9): 1953-1960; Gemer et al., 2000, Int. J. Hyperthermia 16(2): 171-81 ; Rang and Will, 2000, Nucleic Acids Res. 28(5): 11205; Hagihara et al., 1999, Cell Transplant. 8(4): 4314; Huang et al., 1999, Mol. Med. 5(2): 129-37; Forster, et al., 1999, Nucleic acids Res. 27(2): 708-10; およびLiu et al., 1998, Biotechniques 24(4): 624-8, 630-2 (1998)）。本明細書において用語「対象となるポリペプチド」または「対象となるタンパク質」とは、ペプチド結合によって連結された、連続的に配列された３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸ポリマーを指す。用語「ポリペプチド」には、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質類似体、オリゴペプチド、ペプチドなどが含まれる。用語「ポリペプチド」は、核酸によってコードされ、組換え技術によって作出され、適当な起源から単離されまたは合成される、上記で定義したポリペプチドを意図する。ポリペプチドの限定されない例は、成長ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、酵素、免疫グロブリンまたはその断片である。本明細書における用語「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」とは、核酸を宿主細胞（すなわち前記鳥類ＥＳ）に挿入する方法を指す。原核生物または真核生物への核酸のトランスフェクションを容易にする多くの技術が当業者に周知である。これらの方法は、宿主細胞を前記核酸分子の取り込みに適したものにするために、限定されるものではないが、前記細胞を高濃度の塩（カルシウムまたはマグネシウム塩などであるがそれだけではない）、電場（すなわちエレクトロポレーション）、界面活性剤、またはリポソーム媒介トランスフェクション（すなわちリポフェクションなど）により処理することを含む種々の技術を必要とする。
【００４３】
本発明はまた、キメラ雛を得る方法であって、
ａ）本発明の方法によって得られ、培養された鳥類ＥＳ細胞をレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程；および
ｂ）雛として孵化（hatch）させるために、工程ａ）において得られた胚をインキュベートする工程；
ｃ）該雛に定着した異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる方法も提供する。
【００４４】
本明細書における用語「雛（chick）」とは、幼鳥を意味し、これには幼鶏が含まれる。用語「胚下腔（subgerminal cavity）」とは、胚盤葉と卵黄の間の空間を意味する。胚盤葉細胞がアルブミンから水分を吸収し、それをそれら自体と卵黄の間に分泌するとこの空間が作り出される。
【００４５】
遺伝学的に修飾されたキメラ雛を得る方法であって、
ａ）本発明の方法によって得られ、培養された遺伝学的修飾ＥＳをレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程；および
ｂ）雛として孵化させるために、工程ａ）において得られた胚をインキュベートする工程；
ｃ）該雛に定着した遺伝学的修飾異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる方法を提供することも本発明の目的である。
【００４６】
前記キメラ雛の選抜は、表現型解析または遺伝子型解析のいずれかによって実施することができる。好ましい実施形態によれば、前記キメラ雛は、羽毛（plumage）の表現型解析によって選抜される。
別の実施形態によれば、本発明のキメラ雛を得る方法は、ＥＳ細胞の導入前にレシピエント胚の性別を決定するさらなる工程を含んでよい。
【００４７】
別の実施形態によれば、前記レシピエント胚は、産まれたての未孵卵の卵に由来し、５，０００個前後〜７０，０００個前後間の細胞を含む。好ましくは、前記レシピエント胚は、Eyal-Giladi & Kochav分類のステージＶｌ〜ＸＩＩの間に含まれる、好ましくは：
−前記胚がニワトリであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＸ前後の；
−前記胚がMuscovy duckであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩＩ前後の；
−前記胚がPekin duckであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩＩＩ前後の；
−前記胚がニホンウズラまたはガチョウであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＸＩ前後の；
−前記胚がホロホロチョウまたはシチメンチョウであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩＩ〜ＶＩＩＩ前後の；
段階にある。
【００４８】
好ましくは、少なくとも１０００個のＥＳ細胞、少なくとも１０，０００個のＥＳ細胞、少なくとも１５，０００個のＥＳ細胞、少なくとも３０，０００個のＥＳ、少なくとも４５，０００個のＥＳ細胞、少なくとも６５，０００個のＥＳ細胞、少なくとも８５，０００個のＥＳ細胞または少なくとも１００，０００個のＥＳ細胞が、前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される。好ましい実施形態によれば、少なくとも３０，０００個のＥＳ細胞が前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される。
【００４９】
前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入されるＥＳ細胞は、雌および雄ＥＳ細胞の混合集団であってよい。別の実施形態によれば、前記レシピエント胚およびドナーＥＳ細胞は、導入前に予め性別判定される。好ましい実施形態によれば、雌ＥＳ細胞は、雌レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される。別の好ましい実施形態によれば、雄ＥＳ細胞は、雄レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される。
【００５０】
本発明のキメラ雛を得るための方法は、ＥＳ細胞の、レシピエント胚の胚下腔への導入前に、レシピエント胚にＸ線またはγ線照射で弱く照射する任意選択工程を含む。好ましい実施形態によれば、前記ニワトリレシピエント胚は、３〜６グレイ間のＸ線、好ましくは４グレイ前後のＸ線で照射される。好ましい実施形態によれば、事前に４グレイ前後でＸ線照射された前記レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、１５，０００個前後のニワトリＥＳ細胞が導入される。別の好ましい実施形態によれば、前記非照射レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、少なくとも３０，０００個のニワトリＥＳ細胞が導入される。
【００５１】
第一の実施形態によれば、レシピエントニワトリ胚はWhite Leghorn系統のものであり、前記ドナーニワトリＥＳ細胞はbarred rock系統、Marans系統、S86N系統からなる群において選択される系統に由来する。第二の実施形態によれば、前記レシピエントニワトリ胚は、barred rock系統、Marans系統およびS86N系統を含んでなる群において選択されるニワトリ系統のものであり、前記ドナーニワトリＥＳ細胞はWhite Leghorn系統に由来する。
【００５２】
異種細胞を含んでなる本発明のキメラ雛の選抜は、
ａ）前記キメラ雛から遺伝物質のサンプルを得る工程；
ｂ）該鳥類ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）のセットとフォワードプライマー５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４）のセットからなる群において選択されたプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含む。好ましい実施形態によれば、前記ニワトリＥＳ細胞はbarred rock種に由来し、前記レシピエント胚はWhite Leghorn種のものである。前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲによって実施され、この際、前記解析は、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの制限酵素ＨｉｎｃＩＩでの消化を含む。
【００５３】
多型の有無を同定する前記方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ） 温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびジデオキシ−フィンガープリント法（ｄｄＦ）：からなる群から選択される。
【００５４】
前記多型の存在についてアッセイする前記工程は、
ａ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素で前記遺伝物質を消化する工程；
ｂ）該消化から得られた断片を分離する工程；
ｃ）該断片によって生じた制限パターンを検出する工程；および
ｄ）所望により、該パターンを、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素を用いてのWhite Leghorn、Marans、Barred Rock、S86N遺伝物質の消化によって得られる少なくとも１つの制限パターンと比較する工程であって、工程ｃ）およびｄ）において検出された制限パターンの違いが異種細胞を含んでなるキメラ雛の指標となる工程
を含む。
【００５５】
本発明はまた、前記キメラ雛の後代を得る方法であって、次の工程：
ａ）本発明の方法によって得られた前記選抜キメラ雛を成鳥として成熟させる工程；
ｂ）内部に異種細胞を有する該成鳥を繁殖させ、その結果、鳥後代を生み出す工程；および
ｃ）異種細胞を含んでなる該後代において該鳥を選抜する工程
を含む方法を含む。
【００５６】
前記鳥の選抜は、羽毛の表現型解析によって、または可能であれば前記鳥ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列におけるＨｉｎｃＩＩ多型の存在についてアッセイすることによる遺伝子型解析によって実施してよい。
【００５７】
前記方法は、遺伝学的に改変された異種細胞中に含まれる前記ベクターによってコードされる異種ポリペプチドを発現させる工程をさらに含んでよい。好ましくは、前記異種ポリペプチドは、前記鳥の生体液（血液、精子、尿など）または前記遺伝学的改変鳥の雌によって産み出された発生中の鳥類卵の卵白に送達される。
【００５８】
本発明はまた、遺伝学的および非遺伝学的に改変された鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞用の培養培地であって、動物血清が添加され、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、インターロイキン１１、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンからなる群において選択された少なくとも１つの増殖因子を含んでなり、少なくとも１０日間、少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも１００日間、より好ましくは無限期間培養する該ニワトリ胚幹細胞の維持に十分である培養培地にも関する。
【００５９】
好ましい実施形態によれば、本発明はまた、遺伝学的または非遺伝学的に改変された鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞用の基礎培養培地であって、動物血清が添加され、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が添加された基礎培養培地にも関する。
【００６０】
第二の好ましい実施形態によれば、本発明は、遺伝学的または非遺伝学的に改変された鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞用の基礎培養培地であって、動物血清が添加され、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）およびインターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）が添加された基礎培養培地に関する。
【００６１】
第三の好ましい実施形態によれば、本発明は、遺伝学的または非遺伝学的に改変された鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞用の基礎培養培地であって、動物血清が添加され、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が添加された基礎培養培地に関する。
【００６２】
前記培地は、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、少なくとも５０日間、好ましくは少なくとも１００日間培養する前記鳥類胚幹（ＥＳ）細胞、好ましくはニワトリおよびカモＥＳ細胞の維持に十分である。
【００６３】
本発明の培養培地は、所望により、インターロイキン−１１、カルジオトロフィン、オンコスタチンおよび／またはＬＩＦを含んでなる群において選択される少なくとも１つの化合物をさらに含んでもよい。本発明の培養培地は、フィーダー細胞の層（すなわちローン）をさらに含んでもよい。
【００６４】
本発明はまた、White Leghornニワトリ系統を別のニワトリ系統と区別するための遺伝子多型解析方法であって、
ａ）該White Leghornニワトリ系統から遺伝物質のサンプル、および該他ニワトリ系統から遺伝物質のサンプルを得る工程；
ｂ）該ニワトリゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）のセットとフォワードプライマー５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４）のセットからなる群において選択されたプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含む方法も提供する。
【００６５】
本発明による遺伝子多型解析方法では、前記増幅は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲによって実施される。
【００６６】
前記多型の存在についてアッセイする前記工程は、
ａ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素でＰＣＲ増幅ＤＮＡを消化する工程；
ｂ）該消化から得られた断片を分離する工程；
ｃ）該断片によって生じた制限パターンを検出する工程；および
ｄ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素を用いてWhite Leghorn遺伝物質の消化によって得られる該パターンと、前記他ニワトリ系統の遺伝物質の消化によって得られる該パターンとを比較する工程であって、ＨｉｎｃＩＩ制限部位の存在がWhite Leghorn系統の指標となり、ＨｉｎｃＩＩ制限部位の不在がWhite Leghorm系統でないことの指標となる工程
を含む。
【００６７】
多型の有無を同定する前記方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびジデオキシ−フィンガープリント法（ｄｄＦ）からなる群から選択される。
【００６８】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明する。当業者がより明確に理解し、本発明を実施することができるように、次の調製および実施例を示す。しかしながら、本発明は、例示された実施形態の範囲に限定されず、それらの実施形態は単に本発明の単一態様を例示するものであり、機能的に同等の方法は本発明の範囲内である、実際、当業者には上述の説明および添付の図面から、本明細書に記載したものの他に本発明の様々な修飾も明らかになるであろう。かかる修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。説明の残りの部分については、以下の図面の説明に言及する。
【実施例】
【００６９】
実施例
実施例１：材料および方法
胚盤葉細胞
産まれたての未孵卵卵から胚を採取した。カットアウト領域中央の胚盤を有する胚の上に滅菌フィルターペーパーリングを置いた。そのディスク（disk）の外側周囲で卵黄膜を切断した。そのディスクをさっとひっくり返し、室温のＰＢＳのペトリ皿に移した。過剰の卵黄を慎重に洗い流した。パスツールピペットで軽く吸引して胚盤葉全体を取り出し、ＰＢＳ中に移した。平均２００個の胚を一緒にプールした。それらの細胞を３００ｇで２回遠心分離した。この細胞ペレットを培養培地中で機械的に解離した。完全培養培地中の細胞を不活性化ＳＴＯフィーダー層上に播種した。胚盤葉細胞を７．５％ＣＯ２中３９℃で維持した。これらの細胞を、プロナーゼ溶液（５〜２％ｗ／ｖ）中３９℃でのインキュベーションにより解離した。解離細胞を、完全培地中、新たなフィーダー層細胞上に播種した。３〜５代継代間の細胞を最少培地中、ＳＴＯフィーダー層上に播種した。
【００７０】
培養培地
前記完全培養培地は、１０％胎児子ウシ血清(JRH)、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−６(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−６Ｒ(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ(Peprotech)、１％ペニストレプトマイシン(penistreptomycine) (Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースで構成した。
【００７１】
あるいは、前記完全培養培地は、１０％胎児子ウシ血清(JRH)、０．１６ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−６(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ Ｉｌ−６Ｒ(Tebu)、１％ペニストレプトマイシン (Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースで構成した。
【００７２】
また、前記完全培養培地は、１０％胎児子ウシ血清(JRH)、０．１６ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１(Tebu)、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ(Eurobio)、１％ペニストレプトマイシン(Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースで構成してもよい。
【００７３】
フィーダー細胞の調製
前記マウス繊維芽細胞ＳＴＯ細胞系統（ＡＴＣＣ）を、４％胎児子ウシ血清(JRH)および１％グルタミン(Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ(Cambrex)中３７．５℃、７．５％ＣＯ２で維持した。ＳＴＯ細胞をサブコンフルエンスにおいてプロナーゼ(Roche)１Ｘで解離し、ＰＢＳで洗浄し、γ線源を用いて４５グレイで照射した。フィーダー細胞を１００ｍｍ皿内の新鮮培地に１．５ｘ１０６〜２ｘ１０６細胞で播種した。
【００７４】
トランスフェクション
ＳＴＯ細胞系統：ｐＧＰＡＲαおよびｐＭＥＨＣＳは、Bertrand Pain医師によって提供された。ＰＣＩＮｅｏは、Promegaから購入した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法およびＰＥＧ精製を用いて調製した。トランスフェクションでは、朝、細胞を１００ｍｍ皿当たり０．５ｘ１０６細胞で播種した。夕方、それらをFuGENE 6(Roche)リポフェクション試薬を用いて３．０μｇの環状ｐＣＩＮｅｏ、１５μｇ ｐＧＰＡＲαまたはｐＭＥＨＣＳでトランスフェクトした。翌日、細胞を洗浄し、その培地を交換した。ネオマイシン、０．３ｍｇ／ｍｌでの選抜はＤ１に開始し、８日間適用した。耐性細胞を増幅し、液体窒素で冷凍した。
【００７５】
アルカリ性ホスファターゼ反応：
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１．５％ホルムアルデヒド、０．５％グルタルアルデヒド、０．１％ｌｇｅｐａｌにより４℃で１０〜２０分間固定した。洗浄後、細胞を、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ＮＢＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＣＩＰで構成されるアルカリ性ホスファターゼ染色溶液中で３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ １ｘまたはＨ２Ｏを加えることによってこの反応を停止させた。
【００７６】
免疫蛍光解析：
ＳＳＥＡ−１抗体は、Developmental Studies Hybridoma Bank of the University of IOWAから購入した。
【００７７】
細胞を、１．５％ホルムアルデヒド、０．５％グルタルアルデヒドにより、または０．２％グルタルアルデヒド、０．０１％ＩＧＥＰＡＬにより４℃で２０分、あるいはパラホルムアルデヒド４％またはメタノールにより室温にて１０分固定した。
【００７８】
細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ ０．１％中で２時間〜４時間インキュベートした。第一の希釈抗体を一晩加えた。洗浄後、第二のＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体を４℃で１時間加えた。前記抗体を除去し、前記細胞をＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させた。細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【００７９】
ＰＣＲ ＲＦＬＰ：
１８日間インキュベートした胚組織由来のＤＮＡを、QIAamp DNA mini-kitの使用説明書に従って精製した。前記ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの断片を、次のプライマー対を用いたＰＣＲによって増幅した：
【００８０】
オリゴ（１５７−１５８）：
フォワード：５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ（配列番号１）
リバース：５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ（配列番号２）
オリゴ（７８−８１）：
フォワード：５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ（配列番号３）
リバース：５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ（配列番号４）
【００８１】
アンプリコンはそれぞれ３１０６ｂｐおよび１００４ｂｐである。Barred Rockニワトリ由来のＤＮＡに対するプライマー１５７の特異性は、White Leghorn由来のＤＮＡよりも高い。結果として得られたアンプリコンはＨｉｎｃＩＩ酵素で切断される。
ＲＴ ＰＣＲ解析：
【００８２】
ＲＮＡを、Promega SV total RNA isolation kitの使用説明書に従って精製した。インキュベーションから５日後の胚から頭部ＲＮＡを、１５日間インキュベートした大腿骨胚から骨髄ＲＮＡを、成体ニワトリから精巣ＲＮＡを抽出した。ＢＲ１５細胞由来のＲＮＡを、Qiagen RNeasy kitの使用説明書に従って抽出した。ＲＮＡを、Promega Random primer kitおよびAMV Reverse transcriptase kitの使用説明書に従って逆転写した。ＰＣＲ増幅を次のプライマーを用いて実現した。
【００８３】
オリゴｖａｓａ：
Ｖａｓａフォワード：ＴＴＴＧＧＴＡＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣ（配列番号５）
Ｖａｓａリバース：ＧＴＴＣＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣ（配列番号６）
オリゴＢｒａｃｈｙｕｒｙ：
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙフォワード：ＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧ（配列番号７）
フォワード２：ＴＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＴ（配列番号８）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙリバース：ＣＡＴＡＡＧＴＴＣＧＧＧＴＡＣＴＧＡＣＴＧＧ（配列番号９）
リバース２：ＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＧＴＡＡＡ（配列番号１０）
オリゴＧＡＰＤＨ：
ＧＡＰＤＨフォワード：ＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号１１）
ＧＡＰＤＨリバース：ＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡ（配列番号１２）
オリゴＴｈｙ−１：
フォワード：ＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＴ（配列番号１３）
リバース：ＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号１４）
【００８４】
レシピエント胚への細胞注入：
照射する場合には、産まれたての未孵卵卵を、加速器源からの４グレイのＸ線照射に曝すことによってレシピエント胚を調製した。それらの胚にはその卵の長軸に切り込んだ窓から操作した。卵殻を粉砕により除去した。１滴のＰＢＳを加えることによって卵殻膜を湿った状態に維持した。細胞注入直前にその卵殻膜を切断して胚を露出させた。培養培地中の細胞３μｌをマイクロピペットを用いてレシピエント胚の胚下腔に注入した。
【００８５】
卵白に予め浸した卵殻膜の２切断端を合わせることによって前記窓を閉鎖した。卵殻膜が乾燥する場合には、それらの窓をサージカルテープで密閉した。卵を、３７．５℃、５０％相対湿度に維持した通常のインキュベーター内でインキュベートし、１８日間１時間ごとに９０°回転させた。その後、卵を３７℃、８５％相対湿度の通常の孵卵器に移し、孵化させた。インキュベーションから１８日後の胚において表現型および体細胞キメラ現象を評価した。注入した鳥をBarred Rockニワトリとかけ合わせることによって、ドナー細胞の生殖細胞系列寄与を評価した。
【００８６】
実施例２：ニワトリＥＳ細胞の単離および増幅
ニワトリ胚幹細胞は産みたての卵から単離した。平均２００胚をプールし、照射マウス繊維芽細胞のフィーダー層に播種した。実際に、Etches et al. (1996 Mol. Reprod. Dev. 45:291-288)は、マウス繊維芽細胞と同時培養したニワトリ胚盤葉細胞の注入後に有意に多い体細胞キメラが見られたことを示している。最初の播種から継代培養３〜５代まで、胚盤葉細胞を１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１(TEBU)、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６(Eurobio)、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６Ｒ(TEBU)、１ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ(TEBU)、１ｎｇ／ｍｌウシＦＧＦ(Peprotech)、１％ペニストレプトマイシン(Biowhittaker)を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２塩基からなる完全培養培地で増殖させた。次に、数代後、数種の増殖因子を除去し、分化を避けるために最小培養培地で細胞を増殖させた。除去した増殖因子は（ＳＣＦとＦＧＦ）、または（ＳＣＦ、ＦＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ）のいずれかであった。
【００８７】
分化を避けてニワトリＥＳ細胞を増殖させる培養培地は、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール(SIGMA)、 １％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)、および１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６Ｒ、１％ペニストレプトマイシンを添加した基礎培地（すなわちＤＭＥＭ−Ｆ１２）からなった。あるいは、分化を避けてニワトリＥＳ細胞を増殖させる培養培地は、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール(SIGMA)、１％非必須アミノ酸(Biowhittaker)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)を添加し、１ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１、１ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ、１％ペニストレプトマイシン(Biowhittaker)を添加した基礎培地（すなわちＤＭＥＭ−Ｆ１２）を含む。
【００８８】
ニワトリＥＳ細胞は種々のニワトリ系統から単離および拡張することができる（表１）。
【００８９】
【表１】
【００９０】
in vitroで単離および増幅された細胞のＥＳ状態の特定は、マウスおよびヒトＥＳ細胞に特異的であることが実証されている一連の生物学的基準：自己再生特性、細胞形態、幹細胞特異的マーカーの発現、および細胞の全能性、すなわち、in vitroにおいて様々な系統へ分化する、また、in vivoにおいて胚の構成に寄与するそれらの能力による。ほとんどの単離物の増殖特徴は１年以上培養維持されたニワトリ胚盤葉細胞で見られるものと同等であり（図１）、これはそれらの不明確な自己再生の可能性を示している。胚盤葉細胞はコロニーとして増殖した。それらは大きな核とわずかな細胞質を有する丸い細胞であった（図２のＢＲ２２ｐ２およびＢＲ２２ｐ３）。興味深いことに、胚盤葉細胞の形態が培養中に密に結合した細胞（図２のＢＲ２２ｐ２およびＢＲ２２ｐ３）から結びつきがよりゆるいより分散した細胞（図２のＢＲ２９ｐ１２）へと進化することが見出された。結びつきがよりゆるい細胞は最小培地での長期培養で安定化させることができた。これら形態の異なる細胞を幹細胞特異的マーカーの発現および胚の構成に寄与するそれらの能力に関してさらに特性決定した。
【００９１】
ＥＳ細胞は従来、種々のマーカー、ＥＣＭＡ−７(Kemler et al. 1981 J. Embryol. Exp. Morphol. 64:45-60)、ＳＳＥＡ−１(Solter and Knowles, 1978 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75(11):5565-5569)、ＥＭＡ−１(Hahnel and Eddy, 1986 J. reprod. Immunol. 10(2)89-110)の発現；特異的酵素活性テロメラーゼおよびアルカリ性ホスファターゼ活性の存在；ならびにＴＲＯＭＡ−１のような分化細胞のマーカーの不在によって定義されている。ＥＭＡ−１およびＳＳＥＡ−１マーカーおよびアルカリ性ホスファターゼ活性の発現を、in vitroで増幅された胚盤葉細胞で評価した。分析を全うするため、培養中に変化する胚盤葉細胞の形態、生殖細胞系列 (Tsunekawa et al, 2000 Development 127:2741-2750)、中胚葉系列(Wilkinson et al, 1990, Nature 343:657-659)および造血系列(Uchida et al, 1994 Blood 83:3758-3779)に特異的なマーカーを加えた。Brachyuryに対する抗体Ｔｈｙ−１およびｖａｓａは利用できないことから、対応する遺伝子の転写をＲＴ ＰＣＲにより評価した。この分析を長期培養期間中、異なる形態に関して行った。ＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１は長期培養期間中発現し続けた（図３）。アルカリ性ホスファターゼ活性もまた、同じ培養期間中、安定し続けていた（図４）。
【００９２】
図５は、細胞が培養維持されている際の分化マーカーの発現の進化を示している。Ｖａｓａ ｍＲＮＡは、予測されたように男性生殖腺は強く存在していた（図５レーン３）。Ｖａｓａ ｍＲＮＡはステージＸの胚には検出されなかった（レーン４）が、生殖細胞はステージＸの胚に存在する。Ｖａｓａ遺伝子は、培養維持された細胞で再現性よく発現されたが弱かった（レーン１８〜３６）。ステージＸの胚にＶａｓａ転写物が存在しないことは、ＲＴ ＰＣＲの感受性の低さによって説明することができる。in vitroで増幅された細胞におけるｖａｓａ遺伝子の発現は、これらの細胞が生殖細胞系列能を有するか、またはステージＸの胚に存在する生殖細胞がin vitroで増幅されたかのいずれかを意味し得る。中胚葉系列のマーカーであるBrachyury ｍＲＮＡはすでにステージＸの胚（産みたての卵からの胚）で検出されている（図５レーン４）。細胞が培養維持されている間、発現は増大した（図５ ＢＲ８ レーン１２および１３；ＢＲ１５ レーン１９〜２６；ＢＲ１８ レーン２７〜３０およびＢＲ１９ レーン３２〜３４）。造血系列は中胚葉を起源としたものである。造血系列のマーカーＴｈｙ−１ ｍＲＮＡもまた、培養維持された細胞で検出された（レーン７、８；１１、１２、１３；１６〜２４；２７〜３４）。雛の神経冠細胞のマーカーであるＨＮＫ１が胚盤葉細胞により発現された。ＨＮＫ１の発現は細胞が培養維持されている間安定であり続けた（データは示されていない）。未分化細胞のマーカーは総ての培養期間に発現された（データは示されていない）。培養胚盤葉細胞は未分化細胞のマーカーならびに神経冠細胞および中胚葉マーカーを発現した。驚くことに、生殖細胞特異的である考えられたＶａｓａ遺伝子はＥＳ細胞で転写される。
【００９３】
in vitro増幅されたニワトリ細胞の全能性は、in vivoにおいて胚の再構成に寄与するそれらの能力を評価することにより確認した。
【００９４】
キメラ現象のレベルに対する作用を決定するため、レシピエントニワトリ胚に異なる数のニワトリＥＳ細胞を注入する試験を設定した。定着効率に対するレシピエント胚の照射の影響も検討した。注入と照射の作用をモニタリングするため、（ｉ）胚の生存力；（ｉｉ）表現型キメラの割合％（有色羽（feathers）を有する胚の割合％）；（ｉｉｉ）表現型キメラ現象の程度（有色羽の割合％）；（ｉｖ）体細胞キメラ現象の割合％（羽以外の組織におけるキメラ現象）の４つのパラメーターを選択した。
【００９５】
予めγ線で傷つけた、または照射を行わなかった産みたてのレシピエント胚の胚下腔に３００、５，０００、１５，０００または３０，０００のＥＳドナー細胞を注入した。注入された卵を標準的な条件に従って孵卵させた。その培養時間で、定着能の進化を測定するため、培養１４日〜４３日に毎週、培養胚盤葉細胞を注入した。孵卵１８日目に総ての胚を分析した。
【００９６】
培養胚盤葉細胞（ドナー細胞）は、優性白色遺伝子座Ｉにおける同型接合劣性（ＩＩ）である有色Barred RockまたはＳ８６Ｎ系統に由来するものであった。ドナー細胞を、Ｉ遺伝子座において同型接合優性であるWhite Leghorn系統（レシピエント系統）から得られたレシピエント胚に注入した。体細胞キメラは孵化において黒色の産毛（black down）の存在によって同定した。しかしながらやはり、ドナー細胞およびレシピエント胚からの遺伝的フィンガープリントを識別するために、ＰＣＲ ＲＦＬＰアプローチも行った（図６）。レシピエント系統のＰＣＲ ＲＦＬＰパターンは個体によって異なる１または２バンドプロフィールである。ドナー系統のＰＣＲ ＲＦＬＰパターンは３バンドプロフィールである。キメラ組織はドナーに典型的な３バンドプロフィールにより同定した。その後、注入した細胞が羽以外の組織に定着する能力を有するかどうかを判定することが可能であった。特異的マーカーの発現と同様に、細胞を長期培養で、細胞形態に従って維持しながらin vitro定着能を調べた。
【００９７】
いくつかの表現型（すなわち、ドナー系統由来の細胞によって定着された羽を有する動物）と体細胞ニワトリキメラ（すなわち、ドナー系統由来の細胞によって定着された羽以外の組織を有する動物）が確認された。ドナー細胞は生殖腺を含む３つの胚葉層の総ての派生物に存在することが示された。この結果は、本発明の方法に従って得られたin vitroで拡張されたニワトリＥＳ細胞が、生殖腺を含むレシピエント胚の種々の組織を接ぎ足し（engraft）、再構成することができたことを示す。
【００９８】
驚くことに、本発明者らは、先行技術で推奨された量（すなわち、照射細胞３００〜５００個前後）よりも多量の細胞の注入でも胚の生存力に影響がないことを実証する。さらに、表現型キメラ現象の割合％は、照射段階の有無にかかわらず、多量の細胞（すなわち、１５０００を超え、さらには３００００前後）を注入する場合に有意に高まった。３００００細胞の注入は上限ではなく、さらに多い細胞の注入も考えられ、制限は、これらの細胞を受容した後にレシピエント胚が生存および発達可能であるかどうかということだけである。本発明者らは、照射レシピエント胚では１５０００細胞の注入が、また、非照射胚では３００００細胞の注入が良好な結果をもたらし、特に、生殖腺がキメラである胚の割合％が高まったことを実証する。
【００９９】
本発明者らは、使用範囲の照射ではニワトリ胚の生存力に影響を及ぼさないことを実証する。さらに、定着の可能性は胚盤葉ニワトリ細胞の培養期間に依存しているとは思われなかった（データは示されていない）。
【０１００】
これらのデータを考え合わせると、in vitroで単離および増幅されたＥＳ細胞が真の胚幹細胞であるということを裏付けるものである。
【０１０１】
実施例３：ニワトリＥＳ細胞による生殖細胞系列伝達
最良の注射法を開発したところ、注入された鳥の９％の生殖腺がキメラであった（データは示されていない）。生殖細胞系列伝達の課題に取り組むため、生殖腺の最適な定着が可能であることが示されている最良の方法に従い、レシピエント胚に培養細胞を注入することによって５８４個体の一群の動物を作出した。これらの鳥の表現型キメラ現象は、孵化時の数枚の羽（これらは後に喪失）から成鳥では９５％を超えるまで拡大した（図７および表２）。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
生殖細胞系列へのドナー系列の寄与を評価するため、Barred Rock細胞を注入した雌鳥とBarred Rocks雄鳥を交尾させた。生殖細胞系列伝達は後代の黒色と黄色の分布を調べることで評価した。２２１羽の雌鳥の後代を調べた。１６００６羽のＦ１鳥のうち、５羽の雛は様々な割合％の白色羽を示し（１羽は孵化前に死亡）、１羽の雛はBarred Rockに典型的な羽毛色素沈着を示した（図８Ａ）。Barred-Rock様の羽毛色素沈着を有する後代を産んだ雌鳥の説明および注入条件の説明は表３に示されている。培養５９日後であっても、細胞は生殖細胞系列定着能を保持していた。生殖細胞系列伝達は雌鳥の高い割合％の表現型キメラ現象と相関していなかった。実際、Barred Rock様の雛の母鳥は白色であった。ＰＧＣ注入可能数を評価したところ、５０のＰＧＣ(Eyal-Giladi et al, 1976)がステージＸの胚に存在しているものと思われた。最終的なＰＧＣ数は、細胞の連続継代培養から得られた希釈率ならびにレシピエント胚に注入された細胞懸濁液の濃度および容量に従って算出した。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
Ｆ１後代（１６００６羽）の５羽の雛のうち４羽が成鳥まで生存した。これら４羽の雌鳥にBarred Rock雄鳥の精液を受精させた。雌鳥５６６４−５６６５の後代はBarred Rock様であった（図８Ｂおよび表４）。他の３羽の雌鳥の後代はBarred Rock様およびWhite Leghorn様の雛であった（表４）。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
本発明者らはニワトリＥＳ細胞を培養する方法を提供する。胚盤葉細胞の増幅は、White LeghornおよびBarred Rockニワトリ系統に関してのみ記載されている(Pain et al, 1996 Dev. 122(8) 2339-2348)、Petitte et al,1990 108(1): 185-189、Zhu et al, 2005 Nat. Biotechnol. 23(9):1159-1169)。この研究で開発された培養法、特に、特定の増殖因子と時間内でのその進化の組合せにより、種々のニワトリ系統から細胞を再現性よく単離および増殖することができた。増幅効率は系統に依存し、この結果はマウスにおいて記載されている(Kawase et al, 1994 Int.J. Dev. Biol. 38(2):385-390)ＥＳ細胞の確立における系統差と一貫している。興味深いことに、マウスとは異なり、長期間培養維持された雛ＥＳ細胞の全能性は、いくつかの増殖因子の除去によって裏付けられる。すなわち、ニワトリＥＳ細胞は完全培養培地でも、また、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦおよびＦＧＦなどの増殖因子を除去した完全培地でも、長期培養中、全能性が保持される。注目すべきは、ヒトＥＳ細胞はマウスＥＳ細胞に関して確立された培養条件では維持できないことである。
【０１０８】
Pain et al (1996)は、ニワトリ胚盤葉長期培養（１６０日を超える）において、マウスＥＳ細胞と同様の典型的な「ＥＳ様」形態羽を有する雛において、小細胞の大きなコロニーが密に詰まっていたことを記載している。対照的に、本発明者が長期培養維持したニワトリ胚盤葉細胞の形態はそれほど安定ではなく、密に結合した丸い形状を有する細胞から結びつきがよりゆるい細胞へ変化した。この形態学的進化は一貫しており、ニワトリの系統によらない。この形態変化は、ＥＳ細胞に特異的な自己再生特性には影響を及ぼさなかった。（ｉ）免疫蛍光またはＲＴ ＰＣＲ分析による細胞の生化学的同定；（ｉｉ）培養細胞の生物学的特性を評価するための遺伝子導入法、によって、種々の系列の細胞の関与の可能性を検討した。細胞を外胚葉、中胚葉および内胚葉の３つの胚葉層の総てに特異的なマーカーに関して特性決定した。極めて早期の分化を示すマーカーが選択された。マーカーの特定の組合せを示す形態はなかった。未分化細胞のマーカーである、３つ総ての胚葉層のマーカーならびにｖａｓａのような生殖細胞系列も検出できた。形態変化に特異的なマーカー発現の進化はなかった。形態学的に最も分化した細胞であっても、ＥＳ細胞に特異的なマーカーを発現し、分化のマーカーは発現しなかった。
【０１０９】
in vitroで増幅された細胞懸濁液をレシピエント胚に注入した。羽の色素沈着は、メラニン細胞から羽の軸へ色素が移動することにより起こる。メラニン細胞は胚の胴部の神経冠細胞に由来する。神経冠細胞の分化は胚発達の極めて初期に起こる。
【０１１０】
黒色系のニワトリの細胞を注入した白色レシピエント胚の羽毛の色素沈着は、注入細胞の全能性を反映し得ないが、メラニン細胞系列へ方向付けられた細胞は、レシピエントのメラニン芽細胞系列を連結することができたことを示し得る。よって、注入細胞のレシピエント胚への寄与の研究は、羽毛の観察に限定されなかったが、３つの胚葉層総ての組織派生物を含んだ。表現型キメラおよび体細胞キメラは、培養において観察された細胞の主要な各形態（コード、クランプおよび彗星状）で得られ、その形態によらず未分化状態を裏付けた。興味深いことに、生殖腺に注入細胞が定着した。
【０１１１】
細胞のＥＳ状態の最終的な証明は生殖細胞系列の伝達である。１羽のＦ０（注入）雌鳥（０．３％）が生殖細胞系列の伝達を裏付けた。この雌鳥の後代の雛１６羽中、１羽のＦ１雛がBarred Rock様であった（６．２５％）。Ｆ１雌鳥からのＦ２雛は総てBarred Rockの表現型を示し、これはドナー形質の獲得が数世代で安定であることを示している。様々な割合％の黒色羽を示したＦ１雌鳥の後代の半数がBarred Rock様であり、他の半数はメンデルの遺伝の法則から予測されるようにWhite Leghornの表現型を有していた。
【０１１２】
従って、本発明者らは、ニワトリ胚盤葉細胞の生殖細胞系列能を実証する。よって、ニワトリ胚盤葉細胞は鳥類の遺伝子導入に有用である。
【０１１３】
実施例４：カモＥＳ細胞の単離および増幅：
４．１−原材料
カモ卵
Pekin系統ＧＬ３０からのカモ卵をGRIMAUD FRERES SELECTION (La Corbiere, Roussay France)から得た。親カモに大腸菌(Escherichia Coli）（自己ワクチンＣｏｌｉ ０１および０２）、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)(Landavax)、カモウイルス肝炎(Hepatovax)、ブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax)、鳥類メタニューモウイルス(Avian metapneumovirus)(Nemovac)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)および腸炎菌(Enteridis)（自己ワクチン）、リエメレラ・アンチペスティファー(Riemerella antipestifer)（自己ワクチンRiemerella）、鳥類メタニューモウイルス(Avian metapneumovirus)（Nobilis RTV不活性型）およびブタ丹毒菌(Ruvax)に対してワクチン接種されたものである。受け取った後、受精したPekin duck卵を次亜塩素酸塩(hypochloryde)浴中で殺菌を行った後、殻に付着した埃に関連した汚染のリスクを避けるためにFermacidal (Thermo)で除染した。
【０１１４】
フィーダー細胞
カモ幹細胞の多能性を維持するために、ネズミ起源の細胞（ＳＴＯ細胞）をフィーダー層として用いた。これらのフィーダー細胞をγ線照射（４５〜５５グレイ）により分裂不能とした後、プラスチック上に播種する。この照射量は、細胞周期の明らかな停止を誘発してなお、非分化細胞の細胞増殖の促進に必要な増殖因子および細胞外マトリックスの産生を可能とする、致死量以下の用量である。ＳＴＯ細胞系統は、ＳＩＭ(Sandos Inbred Mice)マウス胚繊維芽細胞からA. Bernstein, Ontario Cancer Institute, Toronto, Canadaが誘導し、American Type Culture Collection (ATCC) (ＳＴＯ製品番号: CRL-1503, バッチ番号1198713)が供給したものである。新鮮なフィーダー層を週２回調製した。指数関数的に細胞を分離し、計数した。活力のある培養物を維持するために細胞の一部を播種し、別の一部を照射した。照射に関しては、本発明者らは試験管中１０×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を作製した。細胞を４５〜５５グレイの線量に曝し、プラスチック上に播種した。播種後、不活性化したフィーダー細胞でコーティングしたディッシュまたはプレートを最大５日間用いた。
【０１１５】
培地
培地ＧＴＭ−３（Sigma、カタログ番号Ｇ９９１６）
ＤＭＥＭ−ＨａｍＦ１２（Cambrex、カタログ番号ＢＥ０４−６８７）
添加物
グルタミン（Cambrex、カタログ番号ＢＥ１７−６０５Ｅ）
抗生物質：ペニシリン／ストレプトマイシン（Cambrex、カタログ番号ＢＥ１７−６０２Ｅ））
非必須アミノ酸（Cambrex、カタログ番号ＢＥ１３−１１４Ｅ）
ピルビン酸ナトリウム（Cambrex、カタログ番号ＢＥ１３−１１５）
ビタミン（Cambrex、カタログ番号１３−６０７Ｃ）
βメルカプトエタノール（Sigma、カタログ番号Ｍ７５２２）
酵母自己融解物（SAFC、カタログ番号５８９０２Ｃ）
【０１１６】
因子
６つの異なる組換え因子を用いた。
組換えヒト毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）（Peprotech Inc、カタログ番号４５０−１３）
組換えヒトインスリン様因子Ｉ（ＩＧＦ１）（Peprotech Inc、カタログ番号１００−１１）
組換えヒトインターロイキン６（ＩＬ６）（Peprotech Inc、カタログ番号２００−０６）
組換えヒト可溶性インターロイキン６受容体（ｓＩＬ６ｒ）（Peprotech Inc、カタログ番号２００−０６Ｒ）
組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）（Peprotech Inc、カタログ番号３００−０７）
組換えヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Peprotech Inc、カタログ番号１００−１８Ｂ）
【０１１７】
これらの総ての因子、推定ＩＬ６ｒを大腸菌で産生される。可溶性ＩＬ６ｒはトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞で発現される。
【０１１８】
ウシ胎児血清
非照射ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（JRH、カタログ番号１２００３）
本プログラムで用いた非照射血清はオーストラリアで採取および生産されたものである。採取に用いた動物はＵＳＤＡの視察を受け、屠殺者に許容されるものであった。これを鳥類幹細胞培養中、培地に加えた。このバッチは幹細胞の培養維持に不可欠であり得る重要なタンパク質または成分の破壊を避けるために照射を行わなかった。
【０１１９】
照射血清（JRH、カタログ番号１２１０７）
このプログラムに用いた照射バッチは米国で採取した。この照射バッチは、ＳＴＯ細胞（フィーダー細胞）の培養に用いたＤＭＥＭ培地中の添加物として加えた。これらの細胞は幹細胞のように、増殖および培養維持に特定の品質の血清を必要としない。培地中の高濃度の血清を最小限にするため、本発明者らはＳＴＯ細胞を４％のＦＢＳの存在下でのみ増殖するようにした。
【０１２０】
４．２−カモＥＳ細胞の単離および培養の方法
３６０前後の受精したカモ卵を割り、割っているときに卵白から卵黄を分離した。パンチを用いて予め孔の開いたリングの形に切り抜いた小さな吸収性の濾紙(Whatmann 3M paper)を用い、卵黄から胚を取り出した。切り抜きの直径は約５ｍｍである。これらの小さなリングをオーブン内で約３０分間、乾熱を用いて滅菌した。実際には、胚採取の段階で、小さな濾紙のリングを卵黄の表面にのせ、胚の中心に置き、従って胚は濾紙のリングに取り囲まれる。次に、これを小さなはさみで切り抜き、そのまま取り出してペトリ皿にのせ、ＰＢＳを満たす。このようにリングによって取り出された胚から培地中で余分な卵黄を除去し、このように余分な卵黄素を含まない胚子板をパスツールピペットで採取した。
【０１２１】
これらのカモ胚を、ＰＢＳ１×を含む５０ｍＬ試験管に入れた。次に、カモ胚を機械的に剥離し、ＰＢＳで洗浄し、３９℃、７．５％ ＣＯ２で完全培養培地中、フィーダーＳＴＯ細胞の不活化層に播種した。このフィーダー細胞は２．７×１０４細胞／ｃｍ２前後で６ウェルプレートまたはディッシュに播種した。完全培養培地は、１０％ウシ胎児血清、終濃度１ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１、ＣＮＴＦおよび所望により、Ｉｌ−６、Ｉｌ−６Ｒ、ＳＣＦおよびウシＦＧＦ、１％非必須アミノ酸、市販のビタミンの１％混合物、終濃度０．１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、終濃度０．５ｍＭのβ−メルカプト−エタノール、終濃度２．１ｍＭのグルタミン、終濃度１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、終濃度１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび酵母自己融解物１×を添加した無血清培地ＤＭＥＭ−Ｈａｍ Ｆ１２からなった。早くは、継代培養４代に、抗生物質の混合物をもはや培地に加えない。
【０１２２】
カモＥＳ細胞を継代培養４代までＤＭＥＭ−Ｈａｍ Ｆ１２完全培養培地で培養した。４代後、基本培地を改変し、ＤＭＥＭ−Ｈａｍ Ｆ１２完全培地を下記のいずれかに置き換えた：
【０１２３】
１０％ウシ胎児血清、終濃度１ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１およびＣＮＴＦ、１％非必須アミノ酸、市販のビタミンの１％混合物、終濃度０．１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、終濃度０．５ｍＭのβ−メルカプト−エタノール、終濃度２．１ｍＭのグルタミンおよび酵母自己融解物１×を添加したＸＧＴＭ−３培地、または
【０１２４】
１０％ウシ胎児血清、終濃度１ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、Ｉｌ−６、Ｉｌ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦ、１％非必須アミノ酸、市販のビタミンの１％混合物、終濃度０．１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、終濃度０．５ｍＭのβ−メルカプト−エタノール、終濃度の２．１ｍＭのグルタミンおよび酵母自己融解物１×を添加したＧＴＭ−３培地。
カモＥＳ細胞は、分化させずに、この新たな培養培地で少なくとも１４代さらに培養された。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】鳥類ＥＳ細胞の細胞培養動態。ニワトリＥＳ細胞を、１０％ウシ胎児血清およびＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦを添加した培養培地中、マウスフィーダー層上で増殖させた。解離ごとに細胞の数を決定した。各解離時に得られた細胞の数を加えて、累積増殖係数を決定した
【図２】ニワトリＥＳ細胞の形態。胚盤葉細胞の形態：（Ａ）ＢＲ２２ｐ２および（Ｂ）ＢＲ２２ｐ３：大きな核とわずかな細胞質を有する丸型細胞。（Ｃ）ＢＲ２９ｐ１２：結びつきがよりゆるい分散した胚盤葉細胞。
【図３】細胞特異的マーカーＳＳＥＡ−１の発現。in vitroで異なる培養期間維持した胚盤葉細胞においてＥＳ細胞特異的マーカーＳＳＥＡ−１の発現を試験した。左パネルＡ：位相差。右パネルＢ：抗体染色。
【図４】ＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性。胚盤葉細胞の内因性アルカリ性ホスファターゼ活性。細胞を異なる培養期間アルカリ性ホスファターゼ活性染色した。
【図５】細胞を培養維持する一方での分化マーカーＶＡＳＡ、ＴＨＹ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹの発現の進化。マーカーおよび培養。１：骨髄、２：胚（頭部）；３：雄生殖腺、４：胚（ステージＸ）；５：フィーダー（ＳＴＯ）；６：フィーダー（ＳＮ）；７：ＢＲ ４−５；８：ＢＲ４−６；９：ＢＲ ５−２；１０：ＢＲ ８−７；１１：ＢＲ ８−８；１２：ＢＲ ８−９；１３：ＢＲ ８−１２；１４：Ｖ ９−１９；１５：ＢＲ １５−０；１６：ＢＲ １５−１；１７：ＢＲ １５−２；１８：ＢＲ １５−３；１９：ＢＲ １５−５；２０：ＢＲ １５−６；２１：ＢＲ １５−７；２２：ＢＲ １５−８；２３：ＢＲ １５−８；２４：ＢＲ １５−９；２５：ＢＲ １５−１０；２６：ＢＲ １５−１１；２７：ＢＲ １８−２；２８：ＢＲ １８−３；２９：ＢＲ １８−４；３０：ＢＲ １８−５；３１：ＢＲ １９−１；３２：ＢＲ １９−２；３３：ＢＲ １９−３；３４：ＢＲ １９−４；３５：ＢＲ ２０−２；３６：ＢＲ ２０−３；３７：Ｓ１ ｐ２０；３８：ｇＤＮＡ Barred Rock；３９：水；４０：水。異なる培養期間中のＶａｓａ、Ｔｈｙ−１およびＢｒａｃｈｕｙｒｙ（Ｔ）マーカーの発現。ＧＡＰＤＨ対照マーカー。細胞を数週間培養維持した。解離ごとに細胞ペレットを冷凍した。各細胞ペレットのＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲを同時に実施した。
【図６】ドナーおよびレシピエントニワトリ系統とキメラのＰＣＲ ＲＦＬＰプロフィール解析。ドナーおよびレシピエントニワトリ系統とキメラのＰＣＲ ＲＦＬＰプロフィール。ドナーおよびレシピエントニワトリ系統からの産まれたての有胚卵７個を５日間インキュベートした。全胚からＤＮＡを抽出した。体細胞キメラ：ドナー細胞を注入した胚を１８日間インキュベートした。血液、心臓、肝臓、脾臓および生殖腺からＤＮＡを抽出した。
【図７】キメラ鳥。ドナーニワトリ細胞をレシピエントニワトリ胚に注入した。レシピエント胚を孵化までインキュベートした。キメラ鳥を成体まで飼育した。
【図８】Ｆ１およびＦ２後代。８Ａ：典型的なBarred-Rock羽毛色素沈着を示すＦ１鳥。８Ｂ：５６６４−５６６５雌鳥からのＦ２鳥。雌鳥をBarred Rock雄鳥の精液で人工授精させた。卵を孵化までインキュベートした。
【図９】カモＥＳ細胞の形態。カモＥＳ細胞を、１０％ウシ胎児血清およびＩＧＦ１、ＣＮＴＦ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦを添加したＤＭＥＭ培養培地中、マウスフィーダー層上で増殖させた。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を培養する方法であって、
ａ）未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、
−インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；さらに
−動物血清；ならびに
−所望により、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン１１（Ｉｌ−１１）、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンを含んでなる群において選択される少なくとも１つの増殖因子；
を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦ、ＦＧＦ、Ｉｌ−６、Ｉｌ−６Ｒ、ＬＩＦ、オンコスタチン、カルジオトロフィンおよびＩｌ−１１から選択された少なくとも１つの増殖因子を除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
ａ）未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ならびに動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦ、ＦＧＦ、Ｉｌ−６およびＩｌ−６Ｒを含んでなる群から選択される少なくとも１つの増殖因子を除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含んでなる、請求項１に記載の鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を培養する方法。
【請求項３】
ａ）未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦおよびＦＧＦを含んでなる群から選択される少なくとも１つの増殖因子を除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含んでなる、請求項１に記載の鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を培養する方法。
【請求項４】
前記鳥類がニワトリである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記鳥類がカモである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
鳥類胚幹細胞を遺伝学的に改変する方法であって、
ａ）請求項１〜５に記載の方法によって培養されたＥＳ細胞をベクターでトランスフェクトする工程；
ｂ）トランスフェクトされたＥＳ細胞を選抜する工程；
ｃ）遺伝学的に改変された選抜ＥＳクローンをスクリーニングおよび増幅する工程、
ｄ）動物血清ならびに少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および所望により、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含んでなる群において選択される少なくとも１つの増殖因子を含んでなる培養培地中、フィーダー細胞層上で、工程ｃ）の該遺伝学的改変ＥＳ細胞を培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７】
キメラ雛を得る方法であって、
ａ）請求項１〜５に記載の方法によって培養されたＥＳ細胞をレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程；および
ｂ）雛として孵化させるために、工程ａ）において得られた胚をインキュベートする工程；
ｃ）該雛に定着した異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる、方法
【請求項８】
遺伝学的に改変されたキメラ雛を得る方法であって、
ａ）請求項６に記載の工程ｄ）において得られた遺伝学的改変ＥＳ細胞をレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程；および
ｂ）雛として孵化させるために、工程ａ）において得られた胚をインキュベートする工程；
ｃ）該雛に定着した遺伝学的改変異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる、方法
【請求項９】
前記キメラ雛の選抜が、羽毛の表現型解析によって実施される、請求項７および請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＳ細胞の導入前にレシピエント胚の性別を決定する工程をさらに含んでなる、請求項７〜９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）の培養されたＥＳ細胞が、in vitroで少なくとも５日間培養されたものである、請求項７および請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レシピエント胚が、産まれたての未孵卵の卵に由来し、５，０００個前後〜７０，０００個前後の細胞を含む、請求項７〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記レシピエント胚が、Eyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩ〜ＸＩＩの間に含まれる段階、好ましくはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＸ前後の段階にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１０００個のＥＳ細胞、好ましくは少なくとも１５，０００個のＥＳ細胞が、前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項７〜１３に記載の方法。。
【請求項１５】
少なくとも３０，０００個のＥＳ細胞が、前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項７〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入されるＥＳ細胞が、雌および雄ＥＳ細胞の混合集団である、請求項７〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
雌ＥＳ細胞が、雌レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項７〜１５に記載の方法。
【請求項１８】
雄ＥＳ細胞が、雄レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項７〜１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＳ細胞の前記レシピエント胚の胚下腔への導入前に、前記レシピエント胚にＸ線またはγ線照射を照射する工程をさらに含んでなる、請求項７〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
ニワトリレシピエント胚が、３〜６グレイ間のＸ線、好ましくは４グレイ前後のＸ線で照射される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
事前に４グレイ前後でＸ線照射された前記レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、１５，０００個前後のニワトリＥＳ細胞が導入される、請求項７〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記非照射レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、少なくとも３０，０００個のニワトリＥＳ細胞が導入される、請求項７〜２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記レシピエントニワトリ胚が、White Leghorn系統のものであり、前記ニワトリＥＳ細胞が、barred rock系統、Marans系統、S86N系統からなる群において選択される系統に由来する、請求項７〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レシピエントニワトリ胚が、barred rock系統、Marans系統およびS86N系統からなる群において選択されるニワトリ系統のものであり、前記ニワトリＥＳ細胞が、White Leghorn系統に由来する、請求項７〜２２に記載の方法。
【請求項２５】
異種細胞を含んでなる前記キメラ雛の選抜が
ａ）前記キメラ雛から遺伝物質のサンプルを得る工程；
ｂ）該鳥類ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）のセットとフォワードプライマー５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４）のセットからなる群において選択されるプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含んでなる、請求項２３〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
多型の有無を同定する前記方法が、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ） 温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびジデオキシ−フィンガープリント法（ｄｄＦ）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記多型の存在についてアッセイする前記工程が、
ａ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素で前記遺伝物質を消化する工程；
ｂ）該消化から得られた断片を分離する工程；
ｃ）該断片によって生じた制限パターンを検出する工程；および
ｄ）所望により、該パターンと、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素を用いてのWhite Leghorn、Marans、Barred Rock、S86N遺伝物質の消化によって得られる少なくとも１つの制限パターンとを比較する工程であって、工程ｃ）およびｄ）において検出された制限パターンの違いが異種細胞を含んでなるキメラ雛の指標となる工程
を含む、請求項２５および請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲによって実施され、この際、前記解析が、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの制限酵素ＨｉｎｃＩＩでの消化を含む、請求項２５〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
キメラ雛の後代を得る方法であって、次の工程：
ａ）請求項７または請求項８に記載の工程ｃ）において得られた選抜キメラ雛を成鳥として成熟させる工程；
ｂ）内部に異種細胞を有する該成鳥を繁殖させ、その結果、鳥後代を生み出す工程；および
ｃ）該後代において対象となる鳥を選抜する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記鳥の選抜が、羽毛の表現型解析によって実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記鳥の選抜が、前記鳥ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列におけるＨｉｎｃＩＩ多型の存在についてアッセイすることによる遺伝子型解析によって実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝学的に改変された異種細胞中に含まれる前記ベクターによってコードされる異種ポリペプチドを発現させる工程をさらに含んでなる、請求項２９〜３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記異種ポリペプチドが、前記遺伝学的改変鳥によって産み出された発生中の鳥類卵の卵白に送達される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
鳥類胚幹細胞用の培養培地であって、少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、および所望により、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含んでなる群において選択される少なくとも１つの化合物を含んでなり、少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１００日間培養する該鳥類胚幹細胞の維持に十分である、培養培地。
【請求項３５】
フィーダー細胞の層をさらに含んでなる、請求項３４に記載の培養培地。
【請求項３６】
White Leghornニワトリ系統と別のニワトリ系統とを区別するための遺伝子多型解析方法であって、
ａ）該White Leghornニワトリ系統からの遺伝物質のサンプル、および該他ニワトリ系統からの遺伝物質のサンプルを得る工程；
ｂ）該ニワトリゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）のセットとフォワードプライマー５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４）のセットからなる群において選択されるプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含む、方法
【請求項３７】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲによって実施される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記多型の存在についてアッセイする前記工程が、
ａ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素でＰＣＲ増幅ＤＮＡを消化する工程；
ｂ）該消化から得られた断片を分離する工程；
ｃ）該断片によって生じた制限パターンを検出する工程；および
ｄ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素を用いてWhite Leghorn遺伝物質の消化によって得られる該パターンと、前記他ニワトリ系統の遺伝物質の消化によって得られる該パターンとを比較する工程であって、ＨｉｎｃＩＩ制限部位の存在がWhite Leghorn系統の指標となり、ＨｉｎｃＩＩ制限部位の不在がWhite Leghorm系統でないことの指標となる工程
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
多型の有無を同定する前記方法が、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ） 温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびジデオキシ−フィンガープリント法（ｄｄＦ）からなる群から選択される、請求項３６〜３８に記載の方法。
【請求項１】
鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を培養する方法であって、
ａ）未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、
−インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；さらに
−動物血清；ならびに
−所望により、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン１１（Ｉｌ−１１）、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンを含んでなる群において選択される少なくとも１つの増殖因子；
を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦ、ＦＧＦ、Ｉｌ−６、Ｉｌ−６Ｒ、ＬＩＦ、オンコスタチン、カルジオトロフィンおよびＩｌ−１１から選択された少なくとも１つの増殖因子を除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
ａ）未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ならびに動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦ、ＦＧＦ、Ｉｌ−６およびＩｌ−６Ｒを含んでなる群から選択される少なくとも１つの増殖因子を除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含んでなる、請求項１に記載の鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を培養する方法。
【請求項３】
ａ）未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のＥＳ細胞を、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程；
ｂ）工程ａ）において得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ＥＳ細胞を少なくとも２〜１０代継代の間さらに培養する工程；
ｃ）所望により、該培養培地から、ＳＣＦおよびＦＧＦを含んでなる群から選択される少なくとも１つの増殖因子を除去する工程；
ｄ）工程ｃ）の培地中、フィーダー細胞層上で該ＥＳ細胞をさらに培養する工程；
を含んでなる、請求項１に記載の鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を培養する方法。
【請求項４】
前記鳥類がニワトリである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記鳥類がカモである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
鳥類胚幹細胞を遺伝学的に改変する方法であって、
ａ）請求項１〜５に記載の方法によって培養されたＥＳ細胞をベクターでトランスフェクトする工程；
ｂ）トランスフェクトされたＥＳ細胞を選抜する工程；
ｃ）遺伝学的に改変された選抜ＥＳクローンをスクリーニングおよび増幅する工程、
ｄ）動物血清ならびに少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および所望により、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含んでなる群において選択される少なくとも１つの増殖因子を含んでなる培養培地中、フィーダー細胞層上で、工程ｃ）の該遺伝学的改変ＥＳ細胞を培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７】
キメラ雛を得る方法であって、
ａ）請求項１〜５に記載の方法によって培養されたＥＳ細胞をレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程；および
ｂ）雛として孵化させるために、工程ａ）において得られた胚をインキュベートする工程；
ｃ）該雛に定着した異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる、方法
【請求項８】
遺伝学的に改変されたキメラ雛を得る方法であって、
ａ）請求項６に記載の工程ｄ）において得られた遺伝学的改変ＥＳ細胞をレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程；および
ｂ）雛として孵化させるために、工程ａ）において得られた胚をインキュベートする工程；
ｃ）該雛に定着した遺伝学的改変異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる、方法
【請求項９】
前記キメラ雛の選抜が、羽毛の表現型解析によって実施される、請求項７および請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＳ細胞の導入前にレシピエント胚の性別を決定する工程をさらに含んでなる、請求項７〜９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）の培養されたＥＳ細胞が、in vitroで少なくとも５日間培養されたものである、請求項７および請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レシピエント胚が、産まれたての未孵卵の卵に由来し、５，０００個前後〜７０，０００個前後の細胞を含む、請求項７〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記レシピエント胚が、Eyal-Giladi & Kochav分類のステージＶＩ〜ＸＩＩの間に含まれる段階、好ましくはEyal-Giladi & Kochav分類のステージＸ前後の段階にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１０００個のＥＳ細胞、好ましくは少なくとも１５，０００個のＥＳ細胞が、前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項７〜１３に記載の方法。。
【請求項１５】
少なくとも３０，０００個のＥＳ細胞が、前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項７〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入されるＥＳ細胞が、雌および雄ＥＳ細胞の混合集団である、請求項７〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
雌ＥＳ細胞が、雌レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項７〜１５に記載の方法。
【請求項１８】
雄ＥＳ細胞が、雄レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項７〜１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＳ細胞の前記レシピエント胚の胚下腔への導入前に、前記レシピエント胚にＸ線またはγ線照射を照射する工程をさらに含んでなる、請求項７〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
ニワトリレシピエント胚が、３〜６グレイ間のＸ線、好ましくは４グレイ前後のＸ線で照射される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
事前に４グレイ前後でＸ線照射された前記レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、１５，０００個前後のニワトリＥＳ細胞が導入される、請求項７〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記非照射レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、少なくとも３０，０００個のニワトリＥＳ細胞が導入される、請求項７〜２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記レシピエントニワトリ胚が、White Leghorn系統のものであり、前記ニワトリＥＳ細胞が、barred rock系統、Marans系統、S86N系統からなる群において選択される系統に由来する、請求項７〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レシピエントニワトリ胚が、barred rock系統、Marans系統およびS86N系統からなる群において選択されるニワトリ系統のものであり、前記ニワトリＥＳ細胞が、White Leghorn系統に由来する、請求項７〜２２に記載の方法。
【請求項２５】
異種細胞を含んでなる前記キメラ雛の選抜が
ａ）前記キメラ雛から遺伝物質のサンプルを得る工程；
ｂ）該鳥類ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）のセットとフォワードプライマー５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４）のセットからなる群において選択されるプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含んでなる、請求項２３〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
多型の有無を同定する前記方法が、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ） 温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびジデオキシ−フィンガープリント法（ｄｄＦ）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記多型の存在についてアッセイする前記工程が、
ａ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素で前記遺伝物質を消化する工程；
ｂ）該消化から得られた断片を分離する工程；
ｃ）該断片によって生じた制限パターンを検出する工程；および
ｄ）所望により、該パターンと、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素を用いてのWhite Leghorn、Marans、Barred Rock、S86N遺伝物質の消化によって得られる少なくとも１つの制限パターンとを比較する工程であって、工程ｃ）およびｄ）において検出された制限パターンの違いが異種細胞を含んでなるキメラ雛の指標となる工程
を含む、請求項２５および請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲによって実施され、この際、前記解析が、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの制限酵素ＨｉｎｃＩＩでの消化を含む、請求項２５〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
キメラ雛の後代を得る方法であって、次の工程：
ａ）請求項７または請求項８に記載の工程ｃ）において得られた選抜キメラ雛を成鳥として成熟させる工程；
ｂ）内部に異種細胞を有する該成鳥を繁殖させ、その結果、鳥後代を生み出す工程；および
ｃ）該後代において対象となる鳥を選抜する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記鳥の選抜が、羽毛の表現型解析によって実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記鳥の選抜が、前記鳥ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列におけるＨｉｎｃＩＩ多型の存在についてアッセイすることによる遺伝子型解析によって実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝学的に改変された異種細胞中に含まれる前記ベクターによってコードされる異種ポリペプチドを発現させる工程をさらに含んでなる、請求項２９〜３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記異種ポリペプチドが、前記遺伝学的改変鳥によって産み出された発生中の鳥類卵の卵白に送達される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
鳥類胚幹細胞用の培養培地であって、少なくともインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、および所望により、インターロイキン６（Ｉｌ−６）、インターロイキン６受容体（Ｉｌ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含んでなる群において選択される少なくとも１つの化合物を含んでなり、少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１００日間培養する該鳥類胚幹細胞の維持に十分である、培養培地。
【請求項３５】
フィーダー細胞の層をさらに含んでなる、請求項３４に記載の培養培地。
【請求項３６】
White Leghornニワトリ系統と別のニワトリ系統とを区別するための遺伝子多型解析方法であって、
ａ）該White Leghornニワトリ系統からの遺伝物質のサンプル、および該他ニワトリ系統からの遺伝物質のサンプルを得る工程；
ｂ）該ニワトリゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）のセットとフォワードプライマー５’−ＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４）のセットからなる群において選択されるプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含む、方法
【請求項３７】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲによって実施される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記多型の存在についてアッセイする前記工程が、
ａ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素でＰＣＲ増幅ＤＮＡを消化する工程；
ｂ）該消化から得られた断片を分離する工程；
ｃ）該断片によって生じた制限パターンを検出する工程；および
ｄ）ＨｉｎｃＩＩ制限酵素を用いてWhite Leghorn遺伝物質の消化によって得られる該パターンと、前記他ニワトリ系統の遺伝物質の消化によって得られる該パターンとを比較する工程であって、ＨｉｎｃＩＩ制限部位の存在がWhite Leghorn系統の指標となり、ＨｉｎｃＩＩ制限部位の不在がWhite Leghorm系統でないことの指標となる工程
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
多型の有無を同定する前記方法が、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ） 温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびジデオキシ−フィンガープリント法（ｄｄＦ）からなる群から選択される、請求項３６〜３８に記載の方法。
【図５】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５０００１５（Ｐ２０１０−５０００１５Ａ）
【公表日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２３２９６（Ｐ２００９−５２３２９６）
【出願日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５８２６３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１７７０４
【国際公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（５０４３４１１２８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５８２６３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１７７０４
【国際公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（５０４３４１１２８）
【Ｆターム（参考）】
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