脂肪蓄積阻害剤
【課題】生活習慣等の変化により増加傾向にあるメタボリックシンドロームをはじめとする疾病、特に糖尿病、動脈硬化症などに影響を及ぼす肥満症に効果を有する成分ならびにこれらを含む植物エキスを提供する。
【解決手段】ハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花に含まれるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを主成分とする、脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤。
【解決手段】ハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花に含まれるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを主成分とする、脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
過食、栄養過多と運動不足という近年の生活習慣により、脂肪組織への過剰な脂肪蓄積、すなわち肥満が引き起こされ、人口に占める肥満者の割合が増加している。さらに糖尿病、高脂血症、高血圧などの生活習慣病が重複することにより、虚血性心疾患などの重篤な疾病を発症するリスクが高くなることも明らかとなっており、すなわち、メタボリックシンドロームと呼ばれる概念が定着している。したがって、上記の生活習慣病を改善することとともに肥満を解消することが動脈硬化症、さらには虚血性心疾患などの病態を抑える一つの要因となる。
【０００３】
糖尿病、高脂血症、高血圧などのいわゆる生活習慣病は、遺伝的素因などの先天的要素や、喫煙、アルコールの過剰摂取、薬剤などの後天的要素で起こることが明らかとなっており、必ずしも脂肪が蓄積して起こる肥満が原因で起こるものではない。
【０００４】
そのため、糖尿病、高脂血症、高血圧症などの生活習慣病を改善する効果を有し、さらに肥満を改善する効果を併せ持つような素材が望まれている。
【０００５】
一般的に肥満の改善には、食餌療法（摂取エネルギーの制限）、運動療法あるいは重度の肥満症では薬物治療が行われている。長年にわたり上記改善法が提唱されているが、継続性の問題等により、肥満は現在でもますます増加の一途をたどっているのが現状である。そのため、体内に蓄積している脂肪を低減させることが注目されている。
【０００６】
また、近年、成人においても脂肪組織の細胞数が増加することが明らかとなり、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の抑制し成熟した脂肪細胞数を減少させること、さらに、脂肪細胞への脂肪の取り込みを抑え、脂肪蓄積を抑制することにより肥満を改善させることが期待されている。
【０００７】
現在までに、脂肪の蓄積を抑制する素材としてきのこ類（特許文献１）、アスタキサンチンおよび／またはそのエステル（特許文献２）、小麦蛋白質の加水分解物（特許文献３）グレープフルーツオイル（特許文献４）、チリロサイド（特許文献５）、ハス胚芽および／またはヤーコンの抽出物（特許文献６）などがある。これらのような素材の使用の場合、実際には脂肪の蓄積を阻害するには多量に摂取しなければならない、他の疾病に対して効果がない、さらには、ヒトでの効果が充分でない場合が多いなどの問題がある。
【０００８】
また、これらの素材においてはチリロサイド（特許文献５）に脂肪の蓄積抑制ならびに糖尿病への有効性が示されているのみであり、その他については糖尿病や高脂血症などその他の有効な効果は見当たらない。
【０００９】
本研究者らはすでに ハマナス類の様々な生理活性について研究の過程で、生活習慣病に対する効果を見出してきた。すなわち、α−アミラーゼ阻害作用、α−グルコシダーゼ阻害作用ならびにグルコース吸収阻害作用（特許文献７）、ハマナス花粉末摂取時のヒト血中中性脂肪低下作用（非特許文献１）、血圧上昇抑制作用などの効果が明らかとなっている。
【００１０】
これらの効果に加え、本発明のように脂肪細胞への脂肪蓄積阻害作用を有することは肥満や糖尿病、高脂血症、高血圧症などを総合的に予防または改善できるメリットがある。
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−６３２０６号公報
【特許文献２】特開２００７−１５３８４５号公報
【特許文献３】特開２００７−１０６６８３号公報
【特許文献４】特開２００５−１９４２５２号公報
【特許文献５】特開２００７−１７６８５８号公報
【特許文献６】特開２００７−１８６４２７号公報
【特許文献７】特開２００５−３０６８０１号公報
【非特許文献１】山岸喬：２００６、化学工業Ｖｏｌ．７，Ｎｏ１，ｐ４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は各種生活習慣病に効果を有することが知られており、かつ、生体内で脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制することにより、肥満を抑える脂肪蓄積阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ハマナス類にはα−アミラーゼ阻害作用、α−グルコシダーゼ阻害作用ならびにグルコース吸収阻害作用、ハマナス花粉末摂取時のヒト血中中性脂肪低下作用、血圧上昇抑制作用など生活習慣病に対する効果が明らかとなっている。
【００１４】
これらの有用な効果に加え、さらに肥満症を改善する効果を明らかにする目的で、本発明者らは脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制する物質について鋭意検討を行った。すなわち、マウス前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を用いて脂肪細胞への脂肪の蓄積阻害効果を指標にスクリーニングを行い、その結果、ハマナス花または偽果、またはマイカイ花抽出物ならびにそれらのポリフェノール画分に脂肪の蓄積を抑制する効果を見出した。さらにその主要成分であり以下の式（１）：
【００１５】
【化１】
で表されるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩに優れた脂肪蓄積阻害作用を見出し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【００１６】
本発明はｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを有効成分とするものである。この化合物は前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の抑制し、脂肪細胞への脂肪の蓄積を阻害する。したがって、脂肪細胞への脂肪の蓄積やそれに伴う肥満症の抑制、改善に寄与し得る。
【００１７】
また、本発明の有効成分を含むハマナスの花または偽果およびマイカイの花抽出物は糖尿病、高脂血症ならびに高血圧症に有用であり、さらに脂肪の蓄積を抑制する上記物質を多量に含有することで、より効果的にこれらのメタボリックシンドロームをはじめとする疾病の改善、予防が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明に用いる「ハマナス類」はバラ科ハマナス（Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ ｔｈｕｍｂ．）、コハマナス（Ｒｏｓａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ ｘ Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ）、ヤマハマナス（Ｒｏｓａ ｄａｕｖｕｒｉｃａ Ｐａｌｌａｓ）、ならびにこれらの交配種、改良種を指し、その形態、花の色、花弁の枚数など、これらいずれにも限定されるものでない。
【００１９】
また、本発明に用いる「マイカイ」はバラ科マイカイ（Ｒｏｓａ ｍａｉｋｗａｉ Ｈａｒａ）であり、その蕾はお茶や医薬品として用いられている。
【００２０】
本発明にいう「花」とは被子植物においては、萼、花弁の集まった花冠、花托である。さらに上記のものに花柄を含んでいても差し支えない。
【００２１】
本発明においては、ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを含有するハマナスの花または偽果、および、マイカイの花そのもの、それらを加工したもの（乾燥物、破砕物、粉砕物等、ならびにこれらを成型したものなど）を用いてもよい。さらに、より有効成分であるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの濃度を高めるために溶媒により抽出して得られる抽出物を用いることが好ましい。
【００２２】
ここで抽出物とは上記植物またはそれらを加工したものを溶媒で抽出して得られる抽出液（エキスなど）、その濃縮液あるいは希釈液、さらにはそれらの乾燥物のことである。
【００２３】
上記抽出物は、抽出したままの溶液でもよい。さらに必要に応じて、希釈、濃縮等を行っても差し支えない。また、抽出した液を濃縮乾固、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより乾燥物として用いても良い。また、乾燥の際に適宜賦型剤を加えても差し支えない。
【００２４】
抽出に用いる溶媒は極性溶媒であっても、非極性溶媒であってもよく、特に制限はない。このような溶媒として例を挙げれば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、多価アルコール（グリセリン、１，３−ブチレングリコールなど）、アセトン等のケトン類、エーテル類（ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチルエステル、酢酸ブチルエステルなど）炭化水素類等が挙げられる。これらの溶媒を１種または２種以上混合して用いても良い。
【００２５】
上記溶媒のうち、抽出する成分の抽出効率や安全性の面などから、水、エタノールを用いることが好ましく、さらには水とエタノールとの混合溶媒が好ましい。
【００２６】
抽出方法または抽出条件に特に制限はない。使用上の安全性あるいは利便性、抽出効率などの観点から穏やかな条件で行うのが好ましい。抽出時間については、有効成分であるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩが効率的に抽出されるまで行えばよく、通常、３０分〜４８時間で行われる。
【００２７】
抽出の具体例を示すと、原料植物そのまま、あるいはその乾燥物、またはそれらの破砕、細断、粉砕あるいは微粉砕したもの、これらいずれかを用い、５〜２０倍量の溶媒を加え、４℃〜溶媒が還流する温度で３０分〜４８時間、攪拌や振とうなどの条件下で操作を行う。抽出後、適宜、ろ過、遠心分離などの分離操作を行い不溶物を除去し、必要に応じて濃縮、希釈あるいは乾燥して抽出物を得ることができる。さらに上記不溶物から再び抽出物を得てもよい。
【００２８】
こうして得られた抽出物は、そのままあるいは濃縮して、液状物、ペースト、さらに乾燥した乾燥物などで用いられる。乾燥に関しては、凍結乾燥など当業者が通常用いる方法により行われる。
【００２９】
また、抽出物は溶媒による分配、透析、限外ろ過膜などによる分離、各種クロマトグラフィーなどによる段階的な精製など当業者が通常行う処理により得られた分画物として用いることが可能である。さらに精製されたｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを用いることが最も好適である。
【００３０】
摂取する際には、このようにして得られた抽出物ならびにｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ、またはハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花そのままでも良く、その摂取量は年齢、体重、症状の程度ならびに製剤の形態により適宜決定される。例えば、ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩでは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度が好ましく、抽出物では０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度が好ましい。さらにハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花そのままでは０．３ｍｇ〜３０００ｍｇ／ｋｇ体重程度が好ましい。
【００３１】
本発明の脂肪蓄積阻害剤の利用形態は、摂取される食品、医薬品などの形態に応じて適宜設定される。例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、ゼリー等、当業者が通常用いる添加剤を用いて様々な形状に成型してもよい。あるいは、抽出液または抽出物を水、飲料等に溶解した液剤として用いてもよい。
【００３２】
本発明の脂肪蓄積阻害剤は、上述のごとく食品、医薬品などとして利用される。利用上において、必要に応じ、本発明とは異なる作用を有する物質、例えば、体内脂肪を燃焼させるような素材などと組み合わせてもよく、組み合わせにより作用の増強、相乗効果が期待できる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、統計解析は、Ｎｏｎ−ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｓ ＡＮＯＶＡを用い、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔにより有意差検定を行った。
【００３４】
（実施例１；ハマナス花抽出物、マイカイ花抽出物、ハマナス花ポリフェノール画分ならびにｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの調製）
（１）ハマナス花抽出物の作成
北海道北見産乾燥ハマナス（Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ ｔｈｕｍｂ）花１ｋｇに１０Ｌの５０（Ｖ／Ｖ）％エタノール水溶液を加えて、室温下一晩放置した。この混合物をろ過し、不溶物を回収し再度５０％エタノール水溶液６Ｌを加えて一晩抽出した。得られた抽出液をすべて合わせ、減圧下溶媒を溜去し、凍結乾燥後、抽出物５５１．５ｇを得た。
【００３５】
（２）マイカイ花抽出物の作成
中国市場品乾燥マイカイ（Ｒｏｓａ ｍａｉｋｗａｉ Ｈａｒａ）の花１ｋｇに１０Ｌの５０（Ｖ／Ｖ）％エタノール水溶液を加えて、室温下一晩放置した。この混合物をろ過し、不溶物を回収し再度５０％エタノール水溶液６Ｌを加えて一晩抽出した。得られた抽出液をすべて合わせ、減圧下溶媒を溜去し、凍結乾燥後、抽出物５２６．７ｇを得た。
【００３６】
（３）ハマナス花抽出物からポリフェノール画分の作成
上記北見産乾燥ハマナス花抽出物１００．４ｇを水３００ｍｌに溶解し、ＭＣＩ ＧＥＬＣＨＰ２０Ｐ（平均粒径７５／１５０μｍ、三菱化学社製）を充填（内径１０．０ｃｍｘ２８ｃｍ）したカラムに附し、水３Ｌ、５０（Ｖ／Ｖ）％アセトン水溶液３Ｌならびにアセトン２Ｌで溶出した。得られた５０％アセトン水溶液画分を減圧下にて溶媒を溜去し、凍結乾燥後、ポリフェノール画分３０．６ｇを得た。
【００３７】
（４）ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの分離
北海道紋別市で採集した乾燥ハマナス（Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ ｔｈｕｍｂ）の花５００ｇに３Ｌの７０（Ｖ／Ｖ）％アセトン水溶液を加えて、室温下一晩放置した。この混合物をろ過し、不溶物を回収し再度７０％アセトン水溶液１．５Ｌを加えて一晩抽出した。この混合物をろ過し、不溶物を回収し３０（Ｖ／Ｖ）％アセトン水溶液１．５Ｌで上記と同様の操作を２回行い、得られた抽出液をすべて合わせ、減圧下アセトンを溜去し、残留物に酢酸エチルを加え、水層と酢酸エチル層に分配し、酢酸エチル層を回収した。水層に再び酢酸エチルを加え分配し、計３回分配操作を行った。得られた酢酸エチル層を減圧下にて溶媒を溜去し２９．２ｇの粉末を得た。
【００３８】
得られた粉末２５．０ｇをエタノールに溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を充填（内径８．５ｃｍｘ１８ｃｍ）したカラムにより、以下の溶出条件１で１０画分に分画した。
【００３９】
（条件１）
移動層：エタノール／水／アセトン（容積比が１００／０／０、９０／１０／０、８０／２０／０、７０／３０／０、６０／４０／０、５４／３６／１０、４８／３２／２０、４２／２８／３０、３６／２４／４０および０／０／１００の順で溶出を行った。）
【００４０】
得られた画分のうち、６０％エタノール水溶液溶出部１．００ｇをさらに中圧逆相カラムクロマトグラフィー（充填済ＧＴ−クロマト管 Ｃ１８、ジーエルサイエンス株式会社製、内径３．０ｃｍｘ３０ｃｍ）により以下の溶出条件２で分画した。
【００４１】
（条件２）
移動層：メタノール／水（１５／８、２０／８０、２５／７５および３０／７０）＋０．３％容量のギ酸添加。
【００４２】
分画して得られた画分のうち、２０％メタノールで溶出した画分よりｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを２３５．０ｍｇ得た。得られたｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩは例えば以下の条件３により４．６８ならびに７．３０分に互変異性体として検出される。
【００４３】
（条件３）
カラム：Ｉｎａｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（φ４．６ｘ１５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）
移動層：１２．５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル水溶液＋０．２％容量のギ酸添加
カラム温度：４０℃
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２８０ｎｍ（ＵＶ）
【００４４】
（実施例２：マウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）を用いた脂肪細胞への脂肪蓄積阻害効果）
（１）脂肪細胞への分化・誘導
マウス前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１は、大日本住友製薬株式会社から購入した。３Ｔ３−Ｌ１の培養は、１０％ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（大日本住友製薬Ｌｏｔ．Ｎｏ．８９７９Ｈ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリンならびに１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社製）で継代培養した。
【００４５】
分化誘導は、１０％ＦＢＳ（非動化済仔牛胎児血清、ＡＳＡＨＩ ＴＥＣＨＮＯ社製 Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｓ０４５６９Ｓ１８１０ＢＦ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で２４ウェルプレートに５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを播種し、細胞がコンフルエントになった後（０日目）、次のように実施した。１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ社製）、０．５μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）、１０μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＤＭＥＭ培地で２日間培養した。３日目、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌインスリンを含むＤＭＥＭ培地で培地交換し、以後、２日毎に同様の培地で培地交換を行った。試料はジメチルスルフォキサイド（最終濃度０．１％）で溶解し分化誘導時（０日目）に各ウェルに添加し、さらに培地交換時にも添加した。
【００４６】
（２）脂肪量の測定
脂肪細胞の蓄積脂肪量はオイルレッド０染色液を用い細胞内の脂肪滴を染色し、その染色液を吸光度法を用いて測定した。
すなわち、２４ウェルプレートに播種したのち分化誘導したものを用いた。８日間培養後ＰＢＳで洗浄した後、１０％ホルマリン溶液で固定した。その後、０．５％オイルレッド０／イソプロピルアルコール溶液：蒸留水＝６：４の割合で混合した溶液を、各ウェルに加え１５分間染色した。染色後、蒸留水で３回よく洗浄し検鏡した。検鏡後、各ウェルにイソプロパノールを５００μｌ添加し、１０分間室温で溶解した後、吸光度法（５７０ｎｍ）により細胞中の脂肪量を測定した。
【００４７】
（３）トリグリセライド量の測定
細胞は上記の方法により、１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２ウェルプレートに播種したのち分化誘導したものを用いた。８〜１０日間培養後ＰＢＳで洗浄した後、細胞溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）に溶解後、超音波破砕を行った。Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｅ−ｔｅｓｔ（和光純薬株式会社製）を用いてトリグリセライド量を測定した。求められたトリグリセライド量は、タンパク質含量で補正した。タンパク質の測定は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた。
【００４８】
その結果、図１、図２ならびに図３に示すようにコントロールと比較して、ハマナス花抽出物、マイカイ花抽出物ならびにハマナス花ポリフェノール画分はいずれも濃度依存的に脂肪細胞への脂肪の蓄積およびトリグリセライドの蓄積を抑制することが明らかとなった。
【００４９】
さらに、図４ならびに図５に示すようにハマナス花より分離したｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩも同様に低容量で濃度依存的に脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制した。
【００５０】
（実施例３：ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの細胞分化抑制活性確認試験）
（１）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＰＤＨ）活性の測定
ＧＰＤＨ活性の測定は、上記の方法により細胞を播種したのち分化誘導したものを用いた。８日間培養後ＰＢＳで洗浄した後、酵素抽出バッファーに溶解後、超音波破砕を行った。１２，８００×ｇ、４分間遠心後、上清を回収し、測定溶液とした。活性の測定は、ＧＰＤＨＡｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｋｉｔ（株式会社プライマリーセル社製）を使用した。得られたＧＰＤＨ活性は、タンパク質含量で補正した。タンパク質の測定は、トリグリセライド量の測定試験と同じ方法を用いた。
【００５１】
（２）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ
遺伝子発現は、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＢＩ７５００ＰＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。３Ｔ３−Ｌ１細胞からのＲＮＡの抽出は、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（インビトロジェン社製）に溶解し、ポリトロンを用いてホモジナイズした後、フェノールクロロホルム法で粗抽出した。精製はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用しＤＮａｓｅＩ処理を行った。回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡの純度は、アガロース電気泳動と吸光度により確認を行った。ｃＤＮＡ合成は０．１μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、Ｔａｑｍａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。すなわち、全ＲＮＡ ０．１μｇ、１ｘＴａｑｍａｎ ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ、５．５ｍＭ 塩化マグネシウム、５００μＭ ｄＮＴＰｓ、２．５μＭ Ｒａｎｄａｍ Ｈｅｘａｍｅｒ、０．４Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ ＩｎｈｉｂｉｔｏｒとＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．２５Ｕ／μｌを含む２５μｌの反応液中で反応させた。ｃＤＮＡ合成反応は、２５℃で１０分間の前加熱の後、４８℃で６０分間のＲＴ反応を行い、引き続き９５℃で５分間の後加熱を行った。次に得られたｃＤＮＡを鋳型として、１ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、各０．２μ ＭＦｏｒ ｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒを含む２０μｌの反応液中で反応を行った。ＰＣＲ反応は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の反応を４０サイクル行った。実験に使用した６種類のプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３を用いて設計した。それぞれの遺伝子発現の定量は、β−Ａｃｔｉｎの発現量を内部標準としてΔΔＣｔ法により算出した。
【００５２】
図６に示すようにｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを添加した培地で培養した３Ｔ３−Ｌ１細胞はコントロールに比較してＧＰＤＨの活性を抑制した。また、図７ならびに図８に示すように細胞分化の指標であるＰＰＡＲγならびにＣ／ＥＢＰαの発現を抑制していた。その結果、ｔｅｌｌｉｍａｄｒａｎｄｉｎＩの脂肪細胞への脂肪の蓄積の抑制には、前駆脂肪細胞からの脂肪細胞への分化の抑制が関与していることも明らかとなった。
【００５３】
以上のことから、ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ、ハマナス類の花または偽果ならびにマイカイの花由来の抽出物、またはポリフェノール画分は脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制することが明らかとなった。さらにｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの脂肪の蓄積抑制作用には、前駆脂肪細胞からの脂肪細胞への分化の誘導抑制が関与することも明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上説明したように、本発明によれば、ハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花由来のｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを有効成分としてなることを特徴とする脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤が提供され、ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩならびに本化合物を含有するハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花、あるいはそれらの抽出物、あるいはそれらのポリフェノール画分を摂取することで脂肪細胞への脂肪の蓄積が抑制され、脂肪蓄積による肥満の解消が期待できる。また、ハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花にはα−アミラーゼ阻害作用、α−グルコシダーゼ阻害作用ならびに血中中性脂肪低下作用などが認められており、本発明による効果と合わせ、虚血性心疾患などの重篤な疾病を発症するリスクが高くなることが指摘されているメタボリックシンドロームと呼ばれる病態の予防および改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ハマナス花抽出物とマイカイ花抽出物の脂肪細胞へのオイルレッド ０染色液を用いて測定した時の脂肪蓄積率を示したグラフである。
【図２】ハマナス花抽出物とマイカイ花抽出物の脂肪細胞へのトリグリセライド（中性脂肪）の蓄積率を示したグラフである。
【図３】ハマナス花ポリフェノール画分の脂肪細胞へのオイルレッド ０染色液を用いて測定した時の脂肪蓄積率を示したグラフである。
【図４】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの脂肪細胞への脂肪蓄積率を示したグラフである。
【図５】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの脂肪細胞へのトリグリセライド（中性脂肪）の蓄積率を示したグラフである
【図６】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ添加時の前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の指標である酵素（ＧＤＰＨ）の活性を示すグラフである。
【図７】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ添加時の前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の指標である蛋白質（ＰＰＡＲγ）の遺伝子発現量を示すグラフである。
【図８】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ添加時の前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の指標である蛋白質（Ｃ／ＥＢＰα）の遺伝子発現量を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
過食、栄養過多と運動不足という近年の生活習慣により、脂肪組織への過剰な脂肪蓄積、すなわち肥満が引き起こされ、人口に占める肥満者の割合が増加している。さらに糖尿病、高脂血症、高血圧などの生活習慣病が重複することにより、虚血性心疾患などの重篤な疾病を発症するリスクが高くなることも明らかとなっており、すなわち、メタボリックシンドロームと呼ばれる概念が定着している。したがって、上記の生活習慣病を改善することとともに肥満を解消することが動脈硬化症、さらには虚血性心疾患などの病態を抑える一つの要因となる。
【０００３】
糖尿病、高脂血症、高血圧などのいわゆる生活習慣病は、遺伝的素因などの先天的要素や、喫煙、アルコールの過剰摂取、薬剤などの後天的要素で起こることが明らかとなっており、必ずしも脂肪が蓄積して起こる肥満が原因で起こるものではない。
【０００４】
そのため、糖尿病、高脂血症、高血圧症などの生活習慣病を改善する効果を有し、さらに肥満を改善する効果を併せ持つような素材が望まれている。
【０００５】
一般的に肥満の改善には、食餌療法（摂取エネルギーの制限）、運動療法あるいは重度の肥満症では薬物治療が行われている。長年にわたり上記改善法が提唱されているが、継続性の問題等により、肥満は現在でもますます増加の一途をたどっているのが現状である。そのため、体内に蓄積している脂肪を低減させることが注目されている。
【０００６】
また、近年、成人においても脂肪組織の細胞数が増加することが明らかとなり、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の抑制し成熟した脂肪細胞数を減少させること、さらに、脂肪細胞への脂肪の取り込みを抑え、脂肪蓄積を抑制することにより肥満を改善させることが期待されている。
【０００７】
現在までに、脂肪の蓄積を抑制する素材としてきのこ類（特許文献１）、アスタキサンチンおよび／またはそのエステル（特許文献２）、小麦蛋白質の加水分解物（特許文献３）グレープフルーツオイル（特許文献４）、チリロサイド（特許文献５）、ハス胚芽および／またはヤーコンの抽出物（特許文献６）などがある。これらのような素材の使用の場合、実際には脂肪の蓄積を阻害するには多量に摂取しなければならない、他の疾病に対して効果がない、さらには、ヒトでの効果が充分でない場合が多いなどの問題がある。
【０００８】
また、これらの素材においてはチリロサイド（特許文献５）に脂肪の蓄積抑制ならびに糖尿病への有効性が示されているのみであり、その他については糖尿病や高脂血症などその他の有効な効果は見当たらない。
【０００９】
本研究者らはすでに ハマナス類の様々な生理活性について研究の過程で、生活習慣病に対する効果を見出してきた。すなわち、α−アミラーゼ阻害作用、α−グルコシダーゼ阻害作用ならびにグルコース吸収阻害作用（特許文献７）、ハマナス花粉末摂取時のヒト血中中性脂肪低下作用（非特許文献１）、血圧上昇抑制作用などの効果が明らかとなっている。
【００１０】
これらの効果に加え、本発明のように脂肪細胞への脂肪蓄積阻害作用を有することは肥満や糖尿病、高脂血症、高血圧症などを総合的に予防または改善できるメリットがある。
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−６３２０６号公報
【特許文献２】特開２００７−１５３８４５号公報
【特許文献３】特開２００７−１０６６８３号公報
【特許文献４】特開２００５−１９４２５２号公報
【特許文献５】特開２００７−１７６８５８号公報
【特許文献６】特開２００７−１８６４２７号公報
【特許文献７】特開２００５−３０６８０１号公報
【非特許文献１】山岸喬：２００６、化学工業Ｖｏｌ．７，Ｎｏ１，ｐ４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は各種生活習慣病に効果を有することが知られており、かつ、生体内で脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制することにより、肥満を抑える脂肪蓄積阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ハマナス類にはα−アミラーゼ阻害作用、α−グルコシダーゼ阻害作用ならびにグルコース吸収阻害作用、ハマナス花粉末摂取時のヒト血中中性脂肪低下作用、血圧上昇抑制作用など生活習慣病に対する効果が明らかとなっている。
【００１４】
これらの有用な効果に加え、さらに肥満症を改善する効果を明らかにする目的で、本発明者らは脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制する物質について鋭意検討を行った。すなわち、マウス前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を用いて脂肪細胞への脂肪の蓄積阻害効果を指標にスクリーニングを行い、その結果、ハマナス花または偽果、またはマイカイ花抽出物ならびにそれらのポリフェノール画分に脂肪の蓄積を抑制する効果を見出した。さらにその主要成分であり以下の式（１）：
【００１５】
【化１】
で表されるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩに優れた脂肪蓄積阻害作用を見出し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【００１６】
本発明はｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを有効成分とするものである。この化合物は前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の抑制し、脂肪細胞への脂肪の蓄積を阻害する。したがって、脂肪細胞への脂肪の蓄積やそれに伴う肥満症の抑制、改善に寄与し得る。
【００１７】
また、本発明の有効成分を含むハマナスの花または偽果およびマイカイの花抽出物は糖尿病、高脂血症ならびに高血圧症に有用であり、さらに脂肪の蓄積を抑制する上記物質を多量に含有することで、より効果的にこれらのメタボリックシンドロームをはじめとする疾病の改善、予防が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明に用いる「ハマナス類」はバラ科ハマナス（Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ ｔｈｕｍｂ．）、コハマナス（Ｒｏｓａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ ｘ Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ）、ヤマハマナス（Ｒｏｓａ ｄａｕｖｕｒｉｃａ Ｐａｌｌａｓ）、ならびにこれらの交配種、改良種を指し、その形態、花の色、花弁の枚数など、これらいずれにも限定されるものでない。
【００１９】
また、本発明に用いる「マイカイ」はバラ科マイカイ（Ｒｏｓａ ｍａｉｋｗａｉ Ｈａｒａ）であり、その蕾はお茶や医薬品として用いられている。
【００２０】
本発明にいう「花」とは被子植物においては、萼、花弁の集まった花冠、花托である。さらに上記のものに花柄を含んでいても差し支えない。
【００２１】
本発明においては、ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを含有するハマナスの花または偽果、および、マイカイの花そのもの、それらを加工したもの（乾燥物、破砕物、粉砕物等、ならびにこれらを成型したものなど）を用いてもよい。さらに、より有効成分であるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの濃度を高めるために溶媒により抽出して得られる抽出物を用いることが好ましい。
【００２２】
ここで抽出物とは上記植物またはそれらを加工したものを溶媒で抽出して得られる抽出液（エキスなど）、その濃縮液あるいは希釈液、さらにはそれらの乾燥物のことである。
【００２３】
上記抽出物は、抽出したままの溶液でもよい。さらに必要に応じて、希釈、濃縮等を行っても差し支えない。また、抽出した液を濃縮乾固、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより乾燥物として用いても良い。また、乾燥の際に適宜賦型剤を加えても差し支えない。
【００２４】
抽出に用いる溶媒は極性溶媒であっても、非極性溶媒であってもよく、特に制限はない。このような溶媒として例を挙げれば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、多価アルコール（グリセリン、１，３−ブチレングリコールなど）、アセトン等のケトン類、エーテル類（ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチルエステル、酢酸ブチルエステルなど）炭化水素類等が挙げられる。これらの溶媒を１種または２種以上混合して用いても良い。
【００２５】
上記溶媒のうち、抽出する成分の抽出効率や安全性の面などから、水、エタノールを用いることが好ましく、さらには水とエタノールとの混合溶媒が好ましい。
【００２６】
抽出方法または抽出条件に特に制限はない。使用上の安全性あるいは利便性、抽出効率などの観点から穏やかな条件で行うのが好ましい。抽出時間については、有効成分であるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩが効率的に抽出されるまで行えばよく、通常、３０分〜４８時間で行われる。
【００２７】
抽出の具体例を示すと、原料植物そのまま、あるいはその乾燥物、またはそれらの破砕、細断、粉砕あるいは微粉砕したもの、これらいずれかを用い、５〜２０倍量の溶媒を加え、４℃〜溶媒が還流する温度で３０分〜４８時間、攪拌や振とうなどの条件下で操作を行う。抽出後、適宜、ろ過、遠心分離などの分離操作を行い不溶物を除去し、必要に応じて濃縮、希釈あるいは乾燥して抽出物を得ることができる。さらに上記不溶物から再び抽出物を得てもよい。
【００２８】
こうして得られた抽出物は、そのままあるいは濃縮して、液状物、ペースト、さらに乾燥した乾燥物などで用いられる。乾燥に関しては、凍結乾燥など当業者が通常用いる方法により行われる。
【００２９】
また、抽出物は溶媒による分配、透析、限外ろ過膜などによる分離、各種クロマトグラフィーなどによる段階的な精製など当業者が通常行う処理により得られた分画物として用いることが可能である。さらに精製されたｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを用いることが最も好適である。
【００３０】
摂取する際には、このようにして得られた抽出物ならびにｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ、またはハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花そのままでも良く、その摂取量は年齢、体重、症状の程度ならびに製剤の形態により適宜決定される。例えば、ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩでは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度が好ましく、抽出物では０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度が好ましい。さらにハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花そのままでは０．３ｍｇ〜３０００ｍｇ／ｋｇ体重程度が好ましい。
【００３１】
本発明の脂肪蓄積阻害剤の利用形態は、摂取される食品、医薬品などの形態に応じて適宜設定される。例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、ゼリー等、当業者が通常用いる添加剤を用いて様々な形状に成型してもよい。あるいは、抽出液または抽出物を水、飲料等に溶解した液剤として用いてもよい。
【００３２】
本発明の脂肪蓄積阻害剤は、上述のごとく食品、医薬品などとして利用される。利用上において、必要に応じ、本発明とは異なる作用を有する物質、例えば、体内脂肪を燃焼させるような素材などと組み合わせてもよく、組み合わせにより作用の増強、相乗効果が期待できる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、統計解析は、Ｎｏｎ−ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｓ ＡＮＯＶＡを用い、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔにより有意差検定を行った。
【００３４】
（実施例１；ハマナス花抽出物、マイカイ花抽出物、ハマナス花ポリフェノール画分ならびにｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの調製）
（１）ハマナス花抽出物の作成
北海道北見産乾燥ハマナス（Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ ｔｈｕｍｂ）花１ｋｇに１０Ｌの５０（Ｖ／Ｖ）％エタノール水溶液を加えて、室温下一晩放置した。この混合物をろ過し、不溶物を回収し再度５０％エタノール水溶液６Ｌを加えて一晩抽出した。得られた抽出液をすべて合わせ、減圧下溶媒を溜去し、凍結乾燥後、抽出物５５１．５ｇを得た。
【００３５】
（２）マイカイ花抽出物の作成
中国市場品乾燥マイカイ（Ｒｏｓａ ｍａｉｋｗａｉ Ｈａｒａ）の花１ｋｇに１０Ｌの５０（Ｖ／Ｖ）％エタノール水溶液を加えて、室温下一晩放置した。この混合物をろ過し、不溶物を回収し再度５０％エタノール水溶液６Ｌを加えて一晩抽出した。得られた抽出液をすべて合わせ、減圧下溶媒を溜去し、凍結乾燥後、抽出物５２６．７ｇを得た。
【００３６】
（３）ハマナス花抽出物からポリフェノール画分の作成
上記北見産乾燥ハマナス花抽出物１００．４ｇを水３００ｍｌに溶解し、ＭＣＩ ＧＥＬＣＨＰ２０Ｐ（平均粒径７５／１５０μｍ、三菱化学社製）を充填（内径１０．０ｃｍｘ２８ｃｍ）したカラムに附し、水３Ｌ、５０（Ｖ／Ｖ）％アセトン水溶液３Ｌならびにアセトン２Ｌで溶出した。得られた５０％アセトン水溶液画分を減圧下にて溶媒を溜去し、凍結乾燥後、ポリフェノール画分３０．６ｇを得た。
【００３７】
（４）ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの分離
北海道紋別市で採集した乾燥ハマナス（Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ ｔｈｕｍｂ）の花５００ｇに３Ｌの７０（Ｖ／Ｖ）％アセトン水溶液を加えて、室温下一晩放置した。この混合物をろ過し、不溶物を回収し再度７０％アセトン水溶液１．５Ｌを加えて一晩抽出した。この混合物をろ過し、不溶物を回収し３０（Ｖ／Ｖ）％アセトン水溶液１．５Ｌで上記と同様の操作を２回行い、得られた抽出液をすべて合わせ、減圧下アセトンを溜去し、残留物に酢酸エチルを加え、水層と酢酸エチル層に分配し、酢酸エチル層を回収した。水層に再び酢酸エチルを加え分配し、計３回分配操作を行った。得られた酢酸エチル層を減圧下にて溶媒を溜去し２９．２ｇの粉末を得た。
【００３８】
得られた粉末２５．０ｇをエタノールに溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を充填（内径８．５ｃｍｘ１８ｃｍ）したカラムにより、以下の溶出条件１で１０画分に分画した。
【００３９】
（条件１）
移動層：エタノール／水／アセトン（容積比が１００／０／０、９０／１０／０、８０／２０／０、７０／３０／０、６０／４０／０、５４／３６／１０、４８／３２／２０、４２／２８／３０、３６／２４／４０および０／０／１００の順で溶出を行った。）
【００４０】
得られた画分のうち、６０％エタノール水溶液溶出部１．００ｇをさらに中圧逆相カラムクロマトグラフィー（充填済ＧＴ−クロマト管 Ｃ１８、ジーエルサイエンス株式会社製、内径３．０ｃｍｘ３０ｃｍ）により以下の溶出条件２で分画した。
【００４１】
（条件２）
移動層：メタノール／水（１５／８、２０／８０、２５／７５および３０／７０）＋０．３％容量のギ酸添加。
【００４２】
分画して得られた画分のうち、２０％メタノールで溶出した画分よりｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを２３５．０ｍｇ得た。得られたｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩは例えば以下の条件３により４．６８ならびに７．３０分に互変異性体として検出される。
【００４３】
（条件３）
カラム：Ｉｎａｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（φ４．６ｘ１５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）
移動層：１２．５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル水溶液＋０．２％容量のギ酸添加
カラム温度：４０℃
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２８０ｎｍ（ＵＶ）
【００４４】
（実施例２：マウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）を用いた脂肪細胞への脂肪蓄積阻害効果）
（１）脂肪細胞への分化・誘導
マウス前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１は、大日本住友製薬株式会社から購入した。３Ｔ３−Ｌ１の培養は、１０％ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（大日本住友製薬Ｌｏｔ．Ｎｏ．８９７９Ｈ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリンならびに１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社製）で継代培養した。
【００４５】
分化誘導は、１０％ＦＢＳ（非動化済仔牛胎児血清、ＡＳＡＨＩ ＴＥＣＨＮＯ社製 Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｓ０４５６９Ｓ１８１０ＢＦ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で２４ウェルプレートに５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを播種し、細胞がコンフルエントになった後（０日目）、次のように実施した。１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ社製）、０．５μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）、１０μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＤＭＥＭ培地で２日間培養した。３日目、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌインスリンを含むＤＭＥＭ培地で培地交換し、以後、２日毎に同様の培地で培地交換を行った。試料はジメチルスルフォキサイド（最終濃度０．１％）で溶解し分化誘導時（０日目）に各ウェルに添加し、さらに培地交換時にも添加した。
【００４６】
（２）脂肪量の測定
脂肪細胞の蓄積脂肪量はオイルレッド０染色液を用い細胞内の脂肪滴を染色し、その染色液を吸光度法を用いて測定した。
すなわち、２４ウェルプレートに播種したのち分化誘導したものを用いた。８日間培養後ＰＢＳで洗浄した後、１０％ホルマリン溶液で固定した。その後、０．５％オイルレッド０／イソプロピルアルコール溶液：蒸留水＝６：４の割合で混合した溶液を、各ウェルに加え１５分間染色した。染色後、蒸留水で３回よく洗浄し検鏡した。検鏡後、各ウェルにイソプロパノールを５００μｌ添加し、１０分間室温で溶解した後、吸光度法（５７０ｎｍ）により細胞中の脂肪量を測定した。
【００４７】
（３）トリグリセライド量の測定
細胞は上記の方法により、１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２ウェルプレートに播種したのち分化誘導したものを用いた。８〜１０日間培養後ＰＢＳで洗浄した後、細胞溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）に溶解後、超音波破砕を行った。Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｅ−ｔｅｓｔ（和光純薬株式会社製）を用いてトリグリセライド量を測定した。求められたトリグリセライド量は、タンパク質含量で補正した。タンパク質の測定は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた。
【００４８】
その結果、図１、図２ならびに図３に示すようにコントロールと比較して、ハマナス花抽出物、マイカイ花抽出物ならびにハマナス花ポリフェノール画分はいずれも濃度依存的に脂肪細胞への脂肪の蓄積およびトリグリセライドの蓄積を抑制することが明らかとなった。
【００４９】
さらに、図４ならびに図５に示すようにハマナス花より分離したｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩも同様に低容量で濃度依存的に脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制した。
【００５０】
（実施例３：ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの細胞分化抑制活性確認試験）
（１）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＰＤＨ）活性の測定
ＧＰＤＨ活性の測定は、上記の方法により細胞を播種したのち分化誘導したものを用いた。８日間培養後ＰＢＳで洗浄した後、酵素抽出バッファーに溶解後、超音波破砕を行った。１２，８００×ｇ、４分間遠心後、上清を回収し、測定溶液とした。活性の測定は、ＧＰＤＨＡｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｋｉｔ（株式会社プライマリーセル社製）を使用した。得られたＧＰＤＨ活性は、タンパク質含量で補正した。タンパク質の測定は、トリグリセライド量の測定試験と同じ方法を用いた。
【００５１】
（２）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ
遺伝子発現は、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＢＩ７５００ＰＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。３Ｔ３−Ｌ１細胞からのＲＮＡの抽出は、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（インビトロジェン社製）に溶解し、ポリトロンを用いてホモジナイズした後、フェノールクロロホルム法で粗抽出した。精製はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用しＤＮａｓｅＩ処理を行った。回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡの純度は、アガロース電気泳動と吸光度により確認を行った。ｃＤＮＡ合成は０．１μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、Ｔａｑｍａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。すなわち、全ＲＮＡ ０．１μｇ、１ｘＴａｑｍａｎ ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ、５．５ｍＭ 塩化マグネシウム、５００μＭ ｄＮＴＰｓ、２．５μＭ Ｒａｎｄａｍ Ｈｅｘａｍｅｒ、０．４Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ ＩｎｈｉｂｉｔｏｒとＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．２５Ｕ／μｌを含む２５μｌの反応液中で反応させた。ｃＤＮＡ合成反応は、２５℃で１０分間の前加熱の後、４８℃で６０分間のＲＴ反応を行い、引き続き９５℃で５分間の後加熱を行った。次に得られたｃＤＮＡを鋳型として、１ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、各０．２μ ＭＦｏｒ ｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒを含む２０μｌの反応液中で反応を行った。ＰＣＲ反応は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の反応を４０サイクル行った。実験に使用した６種類のプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３を用いて設計した。それぞれの遺伝子発現の定量は、β−Ａｃｔｉｎの発現量を内部標準としてΔΔＣｔ法により算出した。
【００５２】
図６に示すようにｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを添加した培地で培養した３Ｔ３−Ｌ１細胞はコントロールに比較してＧＰＤＨの活性を抑制した。また、図７ならびに図８に示すように細胞分化の指標であるＰＰＡＲγならびにＣ／ＥＢＰαの発現を抑制していた。その結果、ｔｅｌｌｉｍａｄｒａｎｄｉｎＩの脂肪細胞への脂肪の蓄積の抑制には、前駆脂肪細胞からの脂肪細胞への分化の抑制が関与していることも明らかとなった。
【００５３】
以上のことから、ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ、ハマナス類の花または偽果ならびにマイカイの花由来の抽出物、またはポリフェノール画分は脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制することが明らかとなった。さらにｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの脂肪の蓄積抑制作用には、前駆脂肪細胞からの脂肪細胞への分化の誘導抑制が関与することも明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上説明したように、本発明によれば、ハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花由来のｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを有効成分としてなることを特徴とする脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤が提供され、ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩならびに本化合物を含有するハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花、あるいはそれらの抽出物、あるいはそれらのポリフェノール画分を摂取することで脂肪細胞への脂肪の蓄積が抑制され、脂肪蓄積による肥満の解消が期待できる。また、ハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花にはα−アミラーゼ阻害作用、α−グルコシダーゼ阻害作用ならびに血中中性脂肪低下作用などが認められており、本発明による効果と合わせ、虚血性心疾患などの重篤な疾病を発症するリスクが高くなることが指摘されているメタボリックシンドロームと呼ばれる病態の予防および改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ハマナス花抽出物とマイカイ花抽出物の脂肪細胞へのオイルレッド ０染色液を用いて測定した時の脂肪蓄積率を示したグラフである。
【図２】ハマナス花抽出物とマイカイ花抽出物の脂肪細胞へのトリグリセライド（中性脂肪）の蓄積率を示したグラフである。
【図３】ハマナス花ポリフェノール画分の脂肪細胞へのオイルレッド ０染色液を用いて測定した時の脂肪蓄積率を示したグラフである。
【図４】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの脂肪細胞への脂肪蓄積率を示したグラフである。
【図５】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩの脂肪細胞へのトリグリセライド（中性脂肪）の蓄積率を示したグラフである
【図６】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ添加時の前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の指標である酵素（ＧＤＰＨ）の活性を示すグラフである。
【図７】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ添加時の前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の指標である蛋白質（ＰＰＡＲγ）の遺伝子発現量を示すグラフである。
【図８】ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩ添加時の前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の指標である蛋白質（Ｃ／ＥＢＰα）の遺伝子発現量を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式（１）
【化１】
で表されるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを有効成分とする脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤
【請求項２】
請求項１記載の化合物がハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花由来の脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤
【請求項１】
次の化学式（１）
【化１】
で表されるｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎＩを有効成分とする脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤
【請求項２】
請求項１記載の化合物がハマナス類の花または偽果、またはマイカイの花由来の脂肪細胞への脂肪蓄積阻害剤
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−１０２２８８（Ｐ２００９−１０２２８８Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９７２４４（Ｐ２００７−２９７２４４）
【出願日】平成１９年１０月１９日（２００７．１０．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年５月１９日 社団法人 日本栄養・食糧学会発行の「第６１回日本栄養・食糧学会大会」に文書をもって発表
【出願人】（５０３２４７１９３）株式会社はるにれバイオ研究所 (1)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１９日（２００７．１０．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年５月１９日 社団法人 日本栄養・食糧学会発行の「第６１回日本栄養・食糧学会大会」に文書をもって発表
【出願人】（５０３２４７１９３）株式会社はるにれバイオ研究所 (1)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
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