腫瘍間質抗原ＦＡＰに対するＤＮＡ組成物及びその使用方法
繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物（該ＤＮＡ構築物は、免疫細胞中で発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。）を含む、腫瘍細胞及び腫瘍転移に対する免疫応答を惹起するのに有効なＤＮＡ組成物。該組成物は、ＦＡＰの単一のエピトープ、ＦＡＰの２つ若しくはそれ以上のエピトープを含むポリペプチド、完全なＦＡＰタンパク質又は所望の免疫応答を惹起するこれらのあらゆる一部をコードし得る。好ましい一実施形態において、組成物は、サイトカインなどの免疫エフェクタータンパク質をコードするＤＮＡ構築物も含む。本発明のＤＮＡ組成物は、このような腫瘍及び腫瘍転移などの疾病を治療するために、単独で、又は化学療法剤と組み合わせて使用することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８１５，３１６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所からのグラント番号ＣＡ８３８５６及び国防総省からのグラント番号ＢＣ０３１０７９の下で、合衆国政府の支援を受けて為された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、腫瘍中の間質性繊維芽細胞に対して免疫応答を惹起するのに有効な適切な分子をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）組成物に関する。より具体的には、本発明は、繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）として知られる間質抗原をコードするＤＮＡ組成物に関する。本発明は、腫瘍増殖及び腫瘍転移を阻害するために、並びに化学療法剤の細胞性取り込みを増強するためにＤＮＡ組成物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍抗原は癌治療のための理解しにくい標的であることが益々明白になっている。これは、腫瘍細胞の抗原の変異及びＭＨＣ−抗原発現の下方制御を原因とする不十分な抗原提示を含み、腫瘍細胞に特有の様々な特徴によって説明することができる。さらに、アポトーシスシグナル伝達経路の異常及びサバイビン、ＸＩＡＰ又はｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス要素などのアポトーシス阻害剤の上方制御はＴ細胞媒介性の死滅に対する耐性を付与するのみならず、化学療法剤のアポトーシス誘導効果に対する耐性も付与する。
【０００５】
間質性の区画が腫瘍形成及び腫瘍浸潤において重大な役割を果たしているという認識が高まっている。間質細胞は、正常な上皮細胞の形質転換を刺激すること、並びに隣接する細胞外マトリックスを活性化するために及び新生物細胞の選択と増殖を誘導するために成長因子、サイトカイン及び化学誘引物質をやり取りすることが示されている。ある研究において、懸濁液としてマウス中に注射された腫瘍細胞は腫瘍原性でないことが報告されたのに対して、間質を含有する固形腫瘍の断片の注入は腫瘍の増殖をもたらすことが報告された（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２；１７５：１３９−１４６参照）。活性化された細胞外マトリックスは、おそらくβ１インテグリンによって媒介される化学療法耐性を付与し、β１インテグリンはフィブロネクチンに接着して、β１インテグリンによって刺激されるチロシンキナーゼの活性化をもたらし、次いで、β１インテグリンによって刺激されたチロシンキナーゼは、化学療法によって誘導されるアポトーシスを抑制する。この現象は、ドキソルビシン感受性の骨髄腫細胞中で報告されており、ドキソルビシン感受性の骨髄腫細胞はフィブロネクチンへの接着後に耐性を生じた。最近の報告は、腫瘍間質性繊維芽細胞を調節することによって、又は腫瘍間質ネットワークを分配することによって、腫瘍拒絶を達成できることを示している。さらに、報告によれば、腫瘍関連マクロファージ及び繊維芽細胞は、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１及びＩＬ−１０などのタンパク質を合成する能力の故に、局所的な免疫抑制環境に寄与している。ＶＥＧＦは樹状細胞の成熟の阻害剤として機能し、従って、耐性Ｔ細胞をもたらす。ＶＥＧＦは、腫瘍血管新生に関与する主要な因子でもある。ＶＥＧＦの活性化は、腫瘍−上皮細胞中で、サバイビン及び他の多くのアポトーシス阻害タンパク質の上方制御をもたらし、それらを化学療法のアポトーシス効果から遮蔽する。これに対して、ＴＧＦ−β１の阻害は、腫瘍の根絶及び転移に対する保護をもたらすことができる。ＩＬ−１０は樹状細胞の成熟を阻害することにより、Ｔｈ１細胞によって媒介される細胞媒介性抗腫瘍応答を抑制する。この効果は、ほとんど無効な液性免疫応答の方向に樹状細胞をシフトさせる。
【０００６】
繊維芽細胞は、コラーゲン及び他の高分子に富む細胞外マトリックスを分泌する結合組織細胞である。腫瘍間質（すなわち、腫瘍支持組織）中の繊維芽細胞は、セリンプロテアーゼとして機能するＩＩ型膜貫通タンパク質である繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を合成する。ＦＡＰは、大腸癌、乳癌及び肺癌を伴う間質性繊維芽細胞の９０％超において、選択的に過剰発現する。ＦＡＰの一過性過剰発現は、創傷治癒の間に及び幾つかの胎児間葉組織中にも観察することができる。さらに、この酵素は、報告によれば、ゼラチン及びＩ型コラーゲンを切断し、細胞外マトリックスの再構築が示唆されている。報告によれば、ＦＡＰの過剰発現は腫瘍増殖の促進及び転移能の増加をもたらすのに対して、抗ＦＡＰ抗体での処理は腫瘍増殖を阻害する。さらに、繊維芽細胞によって主に産生されるＩ型コラーゲンの腫瘍間質性発現は、化学療法剤を含む様々な化合物の腫瘍内取り込みと逆相関しており、これにより、化学療法耐性における間質性区画の関与を維持する。
【０００７】
疾病病原体が増殖し、病的効果を引き起こせるようになる前に疾病病原体を破壊するために生物の免疫系を刺激する予防剤を極めて限定的に投与することによって、多数の病状に対する長期の保護を与えるためにワクチンが使用されてきた。ワクチン及びワクチン接種のための様々なアプローチが、「Ｂｅｒｎａｒｄ Ｒ．Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋ Ｊ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２５３−２７６（１９９８）」に記載されている。
【０００８】
ワクチン接種は、感染因子が病的な応答を引き起こす前に、感染因子を捜し出して、破壊するために自分の体の免疫系を誘導する手段である。典型的には、ワクチンは、生の、但し弱毒化された感染性因子（ウイルス又は細菌）か、又は感染性因子の死滅された形態かである。生の細菌又はウイルスからなるワクチンは非病原性でなければならない。典型的には、物理的又は化学的処理によって、細菌又はウイルスの培養物が弱毒化（弱化）される。因子は非病原性であるが、ワクチンで処置された対象において免疫応答をなお惹起することができる。
【０００９】
免疫応答は、特異的な高分子又は感染性因子の何れかであり得る抗原によって惹起される。これらの抗原は、一般に、タンパク質、多糖、脂質又は糖脂質の何れかであり、これらは、Ｂ細胞及びＴ細胞として知られるリンパ球によって、「外来」として認識される。リンパ球の両タイプが抗原に曝露されることによって、急速な細胞分裂と分化応答が惹起され、曝露されたリンパ球のクローンの形成をもたらす。Ｂ細胞は形質細胞を産生し、次いで、感染性因子の上に存在する抗原へ選択的に結合して、病原体を中和又は不活化する抗体（Ａｂ）と呼ばれるタンパク質を産生する（液性免疫）。幾つかの事例において、Ｂ細胞応答は、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の補助を必要とする。
【００１０】
抗原曝露に応答して形成する特殊化されたＴ細胞クローンは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり、これは、抗原を提示する病原体及び組織に結合し、これらを排除することができる（細胞媒介性免疫又は細胞性免疫）。幾つかの事例では、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、病原体又はその他の外来細胞をエンドサイトーシスによって包み込む。次いで、ＡＰＣは、細胞由来の抗原を加工し、組織適合性分子：ペプチド複合体の形態で、これらの抗原をＣＴＬ上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示して、免疫応答を刺激する。
【００１１】
特異的な抗体の形成を特徴とする液性免疫は、一般に、急性の細菌感染及びウイルスからの反復感染に対して最も効果的であるのに対して、細胞媒介性免疫はウイルス感染、慢性細胞内細菌感染及び真菌感染に対して最も効果的である。細胞免疫は、ある種の癌に対して保護することが知られており、、及び臓器移植の拒絶の原因である。
【００１２】
以前の感染に由来する抗原に対する抗体は、極めて長期間にわたって血中で検出可能な状態を保ち、従って、病原体への以前の曝露を決定する手段を与える。同じ病原体へ再度曝露されると、病原因子が増殖し、病原性応答を引き起こすことができるようになる前に、病原性因子を排除することによって、免疫系は再感染を効果的に抑制する。
【００１３】
病原体によって惹起される同じ免疫応答は、時には、病原体と同じ抗原を提示する非病原性因子によっても産生され得る。このようにして、対象は、感染を以前に撃退していなくても、病原体に対するその後の曝露に対して保護され得る。
【００１４】
しかしながら、ワクチン形成のために必要とされるように、全ての感染性因子を容易に培養し、不活化できるわけではない。現代の組み換えＤＮＡ技術によって、この限界の克服を目指して、新しいワクチンを設計することが可能となった。病原性遺伝子を欠如する感染性因子を作製することが可能であり、従って、生物の生きた非病原性形態をワクチンとして使用することが可能となる。病原性担体の細胞表面抗原を提示するために、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの相対的に非病原性の生物を操作することも可能である。このような形質転換された担体をワクチン接種された対象の免疫系は、「だまされて」病原体に対する抗体を形成する。病原性因子の抗原性タンパク質を操作し、非病原性の種内で発現させることが可能であり、「サブユニットワクチン」を作製するために、抗原性タンパク質を単離及び精製することができる。サブユニットワクチンは、安定であり、安全で、化学的に十分に確定されているという利点を有するが、サブユニットワクチンの製造は非常に費用がかかり得る。
【００１５】
近年、ワクチンに対する新たなアプローチが出現し、広く遺伝的免疫法と称されている。このアプローチでは、病原性因子の抗原をコードする核酸（ポリヌクレオチド）が、免疫化されるべき対象中の細胞内へ作用可能に挿入される。処理された細胞、好ましくは、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ５）は形質転換され、病原体の抗原性タンパク質を産生する。インビボで産生されたこれらの抗原は、次いで、所望の免疫応答を宿主内に引き起こす。このような遺伝子ワクチン中で使用される遺伝物質はＤＮＡ又はＲＮＡ構築物の何れかであり得る。しばしば、抗原をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子の挿入、複製又は発現を強化するために、他のプロモーターポリヌクレオチド配列と組み合わせて導入される。
【００１６】
抗原遺伝子をコードするＤＮＡワクチンは、様々な送達系によって、対象の宿主細胞中に導入することができる。これらの送達系には、原核生物性送達系とウイルス性送達系が含まれる。例えば、１つのアプローチは、宿主細胞を接種するために、新しい遺伝物質を取り込んだワクシニアウイルスなどのウイルスベクターを使用することである。あるいは、遺伝物質はプラスミドベクター中に取り込ませることが可能であり、又は「裸の」ポリヌクレオチドとして、すなわち、単に精製されたＤＮＡとして、宿主細胞へ直接送達することが可能である。さらに、ＤＮＡは、サルモネラ・チフィムリウムなどの弱毒化された細菌中へ安定に形質移入することができる。形質転換されたサルモネラで患者を経口的にワクチン接種すると、細菌は腸内のパイエル板（すなわち、二次リンパ組織）へ輸送され、次いで、免疫応答を刺激する。
【００１７】
ＤＮＡワクチンは、遺伝病及び癌など、伝統的な病原体によって引き起こされない病状に対して免疫化するための機会を提供する。典型的には、遺伝子癌ワクチンは、抗原をコードする遺伝子をＡＰＣ中に導入し、このようにして形質転換されたＡＰＣは腫瘍細胞の特異的な種類に対する抗原を産生する。従って、多数の癌の種類に対する効果的な一般的ワクチンは、それに対して免疫化されるべき癌細胞の各種類に対する多数の個別のワクチンを必要とし得る。
【００１８】
癌の様々な形態に対して免疫化するための一般的に有効なＤＮＡ組成物（ワクチンなど）に対する継続的な要望が存在する。本発明はこの要望を満たす。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、マウスＦＡＰＤＮＡ構築物及び化学療法耐性腫瘍細胞株の性質決定である。パネルＡは、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター（ｐＦＡＰ）のＥｃｏＲＩ部位中に挿入された完全なマウスＦＡＰをコードするプラスミドｃＤＮＡを図示している。パネルＢは、ＣＴ２６細胞の一過性形質移入後に、ウェスタンブロッティングによってＦＡＰタンパク質発現が示されたことを示している。パネルＣは、表記濃度の様々な化学療法剤で処理されたＣＴ２６大腸癌細胞及びＤ２Ｆ２乳癌細胞を示している。温置の４８時間後、ヘキスト−３３３４２色素染色によって、核のアポトーシスを評価した。バーは、３つのアッセイの平均＋標準偏差を示している。
【図２】図２Ａから図２Ｃは、ＦＡＰをベースとするＤＮＡ組成物の腫瘍増殖に対する効果を示している。予防的設定：材料と方法に記載されているとおりに実施された１週間隔での３回のワクチン接種の最後の接種から１０日後に、３×１０４のＣＴ２６細胞の致死用量を皮下（ｓ．ｃ．）注射によって（図２Ａ）、又は３×１０５のＤ２Ｆ２細胞の致死用量を正所性に（ｏ．ｔ．）（図２Ｂ）、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）を攻撃誘発した。８匹のマウスの平均腫瘍増殖が図示されている。平均±ＳＥ、ｐ＜０．０１。治療的設定：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）にまず、１０５のＣＴ２６細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、次いで、一旦肺転移が確立されたら、３日後及び１０日後に処理を施した。１８日後に、肺を切り出し、秤量し（正常な肺重量は約０．２ｇであった。）、転移に関して検査し、視覚的評価によってスコア付けを行った。融合された転移によって覆われた肺表面のパーセントを以下のように評価した。０＝０％、１＝＜２０％、２＝２０−５０％、３＝＞５０％、ｐ＜０．０１。（図２Ｃ）。
【図３】図３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって誘導された細胞毒性を示している。（Ａ）被処理マウスでのエフェクター相の間の抗体介在性欠失の寿命に対する効果が図示されている（＊は対照群と比較した統計的有意性を表す。ｐ＜０．０１）。（Ｂ）処理されたマウスの脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、γ線照射された腫瘍標的細胞で刺激し、次いで、ｐＧＦＰ又はｐＧＦＰ／ｐＦａｐ形質移入されたＣＴ２６細胞とともに４８時間温置した。ヘキスト−３３３４２色素での染色により、核のアポトーシスを以下のように評価した。核のアポトーシス段階０：アポトーシスなし；段階１：大規模なクロマチン凝集；段階２ａ：クロマチンの断片化；段階２ｂ：アポトーシス体。（Ｃ、Ｄ）ｐＦａｐ及び空のベクターによって免疫化されたマウス（ｎ＝３）由来の脾細胞を、ｐＦａｐで形質移入されたＡ３１繊維芽細胞で５日間刺激し、次いで、５１Ｃｒ放出アッセイに供した。（Ｄ）抗ＭＨＣクラスＩ抗体とともに、エフェクター及び標的細胞を共温置した（平均＋ＳＤ、＊は空のベクターと比べて統計的に有意であることを示す。ｐ＜０．０５）。（Ｅ）抗ＣＤ３＋ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５及び抗ＣＤ８＋ＦＩＴＣ抗体で染色された、被処理マウス（ｎ＝２）のＣＴ２６腫瘍の単一細胞懸濁液のＦＡＣＳ分析。２つの実験のうちの１つが図示されている。（Ｆ）抗ＣＤ８ＦＩＴＣ抗体及びＤＡＰＩ核染色で染色された、ｐＦａｐ及び空のベクターで処理されたマウスのＣＴ２６腫瘍の代表的な切片。
【図４】図４は、ＦＡＰ／Ｉ型コラーゲンの発現及びフルオレセイン／アルブミン／５−ＦＵの腫瘍内取り込みを示している。（Ａ）ＦＡＰの免疫組織化学的分析（上のパネル）及び被処理マウスの皮下ＣＴ２６腫瘍中でのＩ型コラーゲン（下のパネル）発現。（Ｂ）被処理マウスの皮下ＣＴ２６腫瘍中でのＦＡＰ及びＩ型コラーゲンのイムノブロット。（Ｃ、Ｄ、Ｅ）棒グラフは、フルオレセインの腹腔内注射、エバンスブルーアルブミンの静脈内注射又は１４Ｃ−５−フルオロウラシルの静脈内注射後における、処理されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）から得た皮下ＣＴ２６腫瘍のホモジネートの光学密度又はシンチレーション測定の平均＋ＳＥを示している。それぞれ、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０５。
【図５】図５は、組み合わされた生物及び化学療法の抗転移効果及び副作用を示している。（Ａ）予防的設定。対照ワクチン、ＰＢＳ又は本発明のワクチンを用いた、１週間隔での３回のワクチン接種の最後の接種から１０日後に、３×１０５のＤ２Ｆ２細胞で正所性に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８；平均±ＳＥ）を攻撃誘発した。５、１０及び１５日後に、表記マウスをドキソルビシンで処理した。（Ｂ）治療的設定。１０５のＤ２Ｆ２腫瘍細胞の静脈内注射から５日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）をｐＦａｐワクチン又は対照ワクチンで毎週処理した。各免疫化から１日後に、表記のとおり、マウスをドキソルビシンで静脈内に処理した（＊は、対照群と比較した有意性を示しており、ｐ＜０．０００１、＊＊は、対照、対照／Ｄｏｘ、ｐＦａｐ及びｐＦａｐ／Ｄｏｘ群と比較した有意性を示している、ｐ＜０．０００１）。
【図６】（Ａ）腫瘍内のドキソルビシン濃度：処理されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）に、５×１０５のＤ２Ｆ２細胞を皮下に攻撃誘発し、プールされた腫瘍可溶化液中のドキソルビシン濃度を、ＬＣ−ＭＳによって、１６日後に測定した（２つの実験の代表、平均＋標準偏差、Ｐ＜０．００１）。（Ｂ）処理されたマウス（ｎ＝４）の背中上方に、３ｍｍの直径の円形の創傷を与え、完全な創傷封鎖までの平均時間を測定した（平均＋標準偏差）。
【図７】図７は、ヒトＦＡＰをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１）を示している。
【図８】図８は、ヒトＦＡＰのアミノ酸残基配列（配列番号２）を示している。
【図９】図９は、マウスＦＡＰをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号３）を示している。
【図１０】図１０は、マウスＦＡＰのアミノ酸残基配列（配列番号４）を示している。
【図１１】図１１は、ヒトＩＬ−２をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号５）を示している。
【図１２】図１２は、ヒトＩＬ−２のアミノ酸残基配列（配列番号６）を示している。
【図１３】図１３は、マウスＩＬ−２をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号７）を示している。
【図１４】図１４は、マウスＩＬ−２のアミノ酸残基配列（配列番号８）を示している。
【図１５】図１５は、ヒトＣＣＬ２１をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号９）を示している。
【図１６】図１６は、ヒトＣＣＬ２１のアミノ酸残基配列（配列番号１０）を示している。
【図１７】図１７は、マウスＣＣＬ２１ｂをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示している。
【図１８】図１８は、マウスＣＣＬ２１ｂのアミノ酸残基配列（配列番号１２）を示している。
【図１９】図１９は、ヒトＣＣＬ２１及びマウスＣＣＬ２１ｂ間でのアミノ酸配列の類似性を示している。
【図２０】図２０は、マウスＣＣＬ２１ａをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示している。
【図２１】図２１は、マウスＣＣＬ２１ａのアミノ酸残基配列（配列番号１４）を示している。
【図２２】図２２は、ヒトＣＤ４０Ｌをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示している。
【図２３】図２３は、ヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸残基配列（配列番号１６）を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は、繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）として知られる腫瘍間質抗原を標的とする、腫瘍増殖又は腫瘍転移を阻害するのに有効なＤＮＡ組成物を提供する。このＤＮＡ組成物は、ＦＡＰの少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物を含み、該ＤＮＡ構築物は免疫細胞中において発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。ＤＮＡ構築物は、ＦＡＰの単一のエピトープ、ＦＡＰの２つ若しくはそれ以上のエピトープを含むポリペプチド、完全なＦＡＰタンパク質又は腫瘍間質細胞などのＦＡＰを発現する細胞に対して所望の免疫応答を惹起するこれらのあらゆる一部をコードし得る。本発明の組成物によって惹起された免疫応答は、腫瘍増殖及び腫瘍転移の阻害をもたらす。
【００３７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「ＤＮＡ構築物」という用語は、ＦＡＰエピトープ、ＦＡＰタンパク質、ＩＬ−２、ＣＣＬ２１などの目的のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ構造を表す。ＤＮＡ構築物には、直鎖ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡ並びに細胞又はウイルスの遺伝物質中に取り込まれたＤＮＡなど、標的細胞中で転写されることができるいずれかのＤＮＡが含まれる。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、ウイルス又は細菌送達ベクター、例えば、非病原性である弱毒化されたウイルスベクター又は細菌ベクター中に取り込まれたＤＮＡである。対象が本発明の組成物で処理されると、
ＦＡＰをコードするＤＮＡが免疫細胞（例えば、マクロファージ及び樹状細胞）に送達され、次いで、免疫細胞がＦＡＰタンパク質を発現する。ＦＡＰＤＮＡのウイルス及び細菌担体は、それ自体、ＦＡＰを発現しない。
【００３８】
本発明のＤＮＡ組成物は、腫瘍間質細胞（例えば、間質性繊維芽細胞）など、ＦＡＰ抗原を提示する細胞に対して活性を有するＣＴＬの形成を刺激する。このような腫瘍間質細胞は、本発明のＤＮＡ組成物による免疫化に応答して産生されるＣＴＬによって選択的に標的とされる。本発明の組成物は、Ｉ型コラーゲンの腫瘍間質性発現も低減することができ、続いて、これは化学療法剤の取り込みを増強することができる。
【００３９】
本明細書において使用される「免疫」という用語は、抗原を発現している細胞に対する長期の免疫学的保護を表す。「免疫化」という用語は、処理された対象中の抗原を発現している細胞に対して免疫をもたらす、抗原への曝露を表す。
【００４０】
「ＦＡＰタンパク質」という用語は、ヒトＦＡＰ、又はヒトＦＡＰに対して少なくとも８０％の配列類似性を有し及びヒトＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドを表す。「ＦＡＰＤＮＡ」という用語は、ヒトＦＡＰをコードするＤＮＡ又はヒトＦＡＰに対して少なくとも８０％の配列類似性を有し及びヒトＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドをコードするＤＮＡを表す。
【００４１】
本発明のＤＮＡ組成物において有用なＤＮＡ構築物は、ＦＡＰの１つ又はそれ以上のエピトープを含むポリペプチドをコードし、及び免疫細胞中での遺伝子発現のために必要とされる制御要素に作用可能に連結されている核酸を好ましくは含む。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、完全長ＦＡＰタンパク質をコードし、又は完全長ＦＡＰタンパク質と少なくとも８０％の配列類似性の高い程度を有し、及びＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドをコードする。有用なＤＮＡ構築物は、好ましくは、免疫細胞中でのヌクレオチドの発現に必要な制御要素を含む。このような要素には、例えば、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、免疫原性標的タンパク質をコードする配列の発現のために、エンハンサーがしばしば必要とされる。本分野において公知であるように、これらの要素は、好ましくは、所望のタンパク質をコードする配列に作用可能に連結される。制御要素が投与されるべき種内において作用可能である制御要素が好ましく選択される。好ましくは、ＤＮＡ構築物はプラスミドの形態であり、又はウイルス若しくは細菌ベクター中に取り込まれる。ＦＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、本分野において周知の方法を用いて、形質移入によって、まず、細菌ベクター中に取り込まれ得る。続いて、形質転換された細菌は、細菌の遺伝物質内にＦＡＰＤＮＡを含む細菌のそのまま使用できる株を提供するために培養することができる。このような形質転換された細菌の培養物は、本発明のＤＮＡ組成物に対してそのまま使用できる源を与える。
【００４２】
本発明のＤＮＡ組成物中に、ＦＡＰをコードするヌクレオチド配列の一部として開始コドン及び停止コドンが好ましく含められる。開始及び停止コドンは、コード配列のフレーム領域内に存在しなければならない。
【００４３】
本発明の組成物中に含められるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、免疫されるべき対象の細胞内で機能的であるように好ましく選択される。
【００４４】
本発明の組成物において、特に、ヒト用の遺伝子ワクチンＤＮＡ組成物の作製において有用なプロモーターの例には、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ），ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーター並びにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明のＤＮＡ組成物において、特に、ヒト用のＤＮＡ組成物の作製において有用なポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
ＤＮＡ発現のために必要とされる制御要素に加えて、ＤＮＡ分子中に他の要素を含めることも可能である。このような追加要素には、エンハンサーが含まれる。エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ由来のものなどのウイルス性エンハンサーであり得る。
【００４７】
制御配列及びコドンは、一般に、種依存性であり、従って、タンパク質産生を最大化するために、制御配列及びコドンは免疫化されるべき種内で効果的であるように、好ましく選択される。当業者は、所定の対象種内で機能的であるＤＮＡ構築物を作製することができる。
【００４８】
本組成物において有用なＤＮＡ構築物は、「Ｒｅｓｔｉｆｏ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０００；７：８９−９２」（その関連する開示内容は、参照により組み込まれる。）に定義されているように「裸の」ＤＮＡとすることができる。好ましくは、ＤＮＡ構築物はプラスミドの形態であり、又は弱毒化されたウイルス若しくは弱毒化された細菌の遺伝物質中に取り込まれたＤＮＡの形態である。有用な送達ビヒクル又は担体には、生物分解性微小カプセル、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）及び裸のＤＮＡ構築物用のリポソーム並びに遺伝的に操作された、弱毒化された生のウイルス又は細菌用の生理的に許容される様々な緩衝液が含まれる。
【００４９】
ＦＡＰＤＮＡ構築物を取り込むように形質転換され得る弱毒化された適切な生の細菌ベクターの例には、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種又は本分野において公知であるあらゆる他の適切な細菌ベクターが含まれる。特に、組成物が経口投与用である場合には、ベクターは、好ましくは、弱毒化された生のサルモネラ・チフィムリウムベクターである。好ましい弱毒化された生のサルモネラ・チフィムリウムには、ＳＬ７２０７などのＡｒｏＡ−株又はＲＥ８８などの二重に弱毒化されたＡｒｏＡ−、ｄａｍ−株が含まれる。二重に弱毒化されたＡｒｏＡ−、ｄａｍ−サルモネラ・チフィムリウムは、特に好ましいベクターである。
【００５０】
外来ＤＮＡ構築物で生の細菌ベクターを形質転換する方法は、本分野において十分に記載されている。例えば、「Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｗ． Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ）」を参照されたい。形質転換後、細菌が複製するにつれて、生物の固有のＤＮＡとともに外来ＤＮＡが複製されるように、外来性遺伝物質は細菌の遺伝物質中に取り込まれる。従って、一旦細菌が形質転換されたら、生物の正常な複製プロセスが外来ＤＮＡの即座の供給を提供する。
【００５１】
好ましいウイルスベクターには、バクテリオファージ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、シンドビスウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス及びトリポックスが含まれる。外来ＤＮＡ構築物でウイルスベクターを形質転換する方法も、本分野において十分に記載されている。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌを参照されたい。
【００５２】
有用なリポソーム担体ビヒクルは、親油性物質及び内部水性部分から形成される膜部分を有する単層又は多層小胞である。標的細胞に送達されるべきポリヌクレオチド物質を含有するために、本発明では、水性部分が使用される。リポソーム形成物質は、四級アンモニウム基などの陽イオン性基と及び約６から約３０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アルキル基などの１つ又はそれ以上の親油性基とを有することが一般に好ましい。適切な物質の一つの群が欧州特許公開０１８７７０２に記載されており、Ｗｏｌｆｆらに付与された米国特許第６，２２８，８４４号にさらに論述されている（これらの関連する開示内容は、参照により組み込まれる。）。他の多くの適切なリポソーム形成陽イオン性脂質化合物が文献中に記載されている。例えば、「Ｌ．Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８８；２７：３９１７−３９２５」及び「Ｈ．Ｅｉｂｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７９；１０：２６１−２７１」を参照されたい。あるいは、ポリラクチド−コグリコリド生物分解性小球体などの小球体を使用することができる。本分野において公知であるように、核酸を組織に送達するために、核酸構築物はリポソーム若しくは小球体で封入され又はその他複合体化される。
【００５３】
他の有用な担体ビヒクルには、「Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００４；３（３）：１９０−６，Ｅｐｕｂ ２００４ Ｆｅｂ．１５」（その関連する開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。）によって記載されているように、生分解性ポリ（オルトエステル）材料を含むポリマー性小球体が含まれる。
【００５４】
好ましくは、本発明のための組成物は、ヒトＦＡＰ又はその機能的相同体をコードするＤＮＡ構築物を含む。ＦＡＰの機能的相同体は、好ましくは、ヒトＦＡＰに対して少なくとも約８０％のアミノ酸残基配列類似性を有し、より好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列類似性を有する。
【００５５】
ＧｅｎＢａｎｋは、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の遺伝子配列データベースであり、これは、公的に入手可能な全てのＤＮＡ配列に注釈を付けて収集したものである。ＧｅｎＢａｎｋは、ＤＮＡ ＤａｔａＢａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎＢａｎｋの協力によるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎの一部である。
【００５６】
ヒトＦＡＰをコードするｃＤＮＡの核酸配列、配列番号１（図７）は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＢＣ０２６２５０で公開されており、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＦＡＰの対応するアミノ酸残基配列は、配列番号２である（図８）。
【００５７】
マウスＦＡＰをコードするＤＮＡの核酸配列、配列番号３（図９）は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＢＣ０１９１９０で公開されており、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。マウスＦＡＰの対応するアミノ酸残基配列は配列番号４である（図１０）。
【００５８】
遺伝子コードの固有の縮重のために、本発明の実施において、ヒトＦＡＰに対するアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を使用することができる。このようなＤＮＡ配列には、ヒトＦＡＰにもハイブリッド形成することができるＤＮＡ配列が含まれる。
【００５９】
本発明において使用することができる、ヒトＦＡＰをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１中のヌクレオチド残基に対して異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を有する核酸を含み、該核酸は同じＦＡＰ遺伝子産物をコードする配列をもたらす。ヒトＦＡＰの機能的に等価な相同体をコードするＤＮＡ分子も、本発明のＤＮＡ組成物中に使用することができる。
【００６０】
核酸によってコードされる遺伝子産物は、サイレントな変化をもたらし、従って、機能的に等価なＦＡＰを産生するアミノ酸残基の欠失、付加又は置換も、ＦＡＰアミノ酸残基配列内に含有し得る。このようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性に基づいて為され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に帯電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ、類似の疎水性値を有する非帯電極性頭部基を有するアミノ酸には、以下のもの、すなわち、ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシンが含まれる。本明細書において使用される、機能的に等価なＦＡＰは、Ｔ細胞によって認識された際に、これらの同じＴ細胞がＦＡＰ発現細胞上に提示されたＦＡＰエピトープを認識できるようにする１つ又はそれ以上のエピトープを含むタンパク質を表す。好ましい実施形態において、機能的に等価なＦＡＰは、ヒトＦＡＰのアミノ酸残基配列（配列番号２）と少なくとも約８０％の配列類似性、例えば、ヒトＦＡＰに対して少なくとも９０％の配列類似性又は少なくとも約９５％の配列類似性を有するアミノ酸残基配列を有する。
【００６１】
ＦＡＰ遺伝子産物のプロセッシング及び発現を修飾する変化などの（但し、これに限定されない）様々な目的のために、（元来のＦＡＰｃＤＮＡ、配列番号１と比べて）ＦＡＰコード配列を変化させるために、ＦＡＰをコードするＤＮＡ構築物を操作することができる。例えば、新たな認識部位を挿入するために、グリコシル化パターン、リン酸化などを変化させるために、本分野において周知の技術、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて、ＤＮＡ中に変異を導入し得る。
【００６２】
好ましい一実施形態において、本発明のＤＮＡ組成物は、ＦＡＰをコードするＤＮＡ構築物及び少なくとも１つの免疫エフェクタータンパク質を操作可能にコードするＤＮＡ構築物を含み、両構築物は免疫細胞中において発現可能である。本明細書において及び添付の特許請求の範囲において使用される「免疫エフェクタータンパク質」という用語は、免疫系経路の制御に関与するタンパク質を意味する。好ましくは、免疫エフェクタータンパク質はサイトカインである。
【００６３】
サイトカインは、細胞増殖、細胞分化、免疫応答の制御、造血及び炎症応答など、他の細胞の挙動に影響を与えることができる、細胞によって産生されるタンパク質及びポリペプチドである。サイトカインは、ケモカイン、ヘマトポエチン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子及び割り当てられていない様々な分子を含む多数のファミリーに分類されてきた。一般に、「Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００」及び「Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｍ．Ｗａｌｐｏｒｔ ａｎｄ Ｍ．Ｓｃｈｌｏｍｃｈｉｋ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００１」（以下、「Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ」）を参照されたい。サイトカインの正確な分類は、「Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩＩ，ページ６７７−６７９」（その関連する開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００６４】
ヘマトポエチンには、例えば、エリスロポエチン、インターロイキン−２（ＩＬ−２、Ｔ細胞によって産生され、Ｔ細胞増殖に関与する１３３アミノ酸タンパク質）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５（腸の上皮、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激する１１４アミノ酸のＩＬ−２様タンパク質）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）が含まれる。
【００６５】
インターフェロンには、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ（Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって産生される１４３アミノ酸のホモ二量体タンパク質であり、マクロファージの活性化、ＭＨＣ分子の増加した発現及び抗原プロセッシング成分、ＩＧクラスのスイッチング並びにＴＨ２の抑制）に関与している。）が含まれる。
【００６６】
免疫グロブリンには、例えば、Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）が含まれ、何れもＴ細胞応答を共同刺激する。
【００６７】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーには、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン）、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ｔｒａｉｌ及びＯＰＧリガンドが含まれる。
【００６８】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の生物学的な役割、特に、Ｔ細胞活性化の共同刺激の間における、抗原提示細胞上に発現されたＣＤ４０とのその相互作用は、本分野において周知である。ＣＤ４０は、全ての成熟したＢ細胞、殆どの成熟したＢ細胞悪性腫瘍及び幾つかの初期のＢ細胞急性リンパ球性白血病の表面上に発現される４８ｋＤａの糖タンパク質であるが、形質細胞上には発現されない（Ｃｌａｒｋ， Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ １９９０，３５：３３−３６）。約３５ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質であるＣＤ４０Ｌは、抗原認識の際に、Ｔ細胞の表面上に発現される。ＴＮＦファミリーのメンバーは、ホモ三量体として発現される場合に、最も生物学的に活性が高い。ＣＤ４０Ｌは、この点に関して例外がなく、このリガンドの完全な細胞外ドメインのＮ末端に融合された３３アミノ酸のロイシンジッパーモチーフの修飾により、ホモ三量体（ＣＤ４０ＬＴ）として発現され得る。高度に免疫原性のモデル抗原β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡでマウスを処理した場合に、ＣＤ４０ＬＴＤＮＡは、ＩＦＮ−γ及び細胞溶解性Ｔ細胞活性の誘導などの細胞性免疫応答を増強することが、「Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６１：４５６３」によって報告されている。
【００６９】
ＣＤ４０ＬＴは、腫瘍自己抗原に対する効果的な防御免疫を誘導するのに必要なＴ細胞の活性化における重要な因子である。抗原が搭載されたＭＨＣクラスＩ複合体が、一旦、樹状細胞（ＤＣ）によって取り込まれ、ナイーブＴ細胞に提示されると、最初の抗原シグナルがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して送達され、続いて、ＣＤ４０ＬＴが上方制御される。Ｔ細胞表面上で、ＣＤ４０ＬＴは、次いで、ＣＤ４０−ＣＤ４０ＬＴ相互作用を介して、ＤＣに対して共同刺激活性を誘導する。このようにして抗原刺激されて、これらのＡＰＣは、共同刺激分子Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）を発現することができ、これらはＣＤ２８との相互作用を介して、第二の共同刺激シグナルをＴ細胞に送信する（炎症促進性のサイトカインＩＮＦ−γ及びＩＬ１２を同時に産生するために、及びエフェクター機能を実施するために、Ｔ細胞の完全な活性化をもたらす現象）。
【００７０】
特定のファミリーに割り当てられない様々なサイトカインには、例えば、腫瘍増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ナチュラルキラー細胞刺激因子；ＮＫ細胞の活性化及びＴＨ１様細胞へのＴ細胞の分化の誘導に関与する１９７アミノ酸鎖及び３０６アミノ酸鎖を有するヘテロ二量体）、マクロファージ阻止因子（ＭＩＦ）、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７（上皮、内皮及び繊維芽細胞中でのサイトカイン産生を誘導するサイトカイン産生誘導因子）及びＩＬ−１８が含まれる。
【００７１】
ケモカインは、白血球（例えば、貪食細胞及びリンパ球）の遊走など、様々な細胞の遊走及び活性化を刺激する、比較的小さな化学誘引性タンパク質及びポリペプチドであるサイトカインのファミリーである。ケモカインは、炎症及び他の免疫応答において役割を果たしている。ケモカインは、Ｃケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ３Ｃケモカインを含む多数のファミリーに分類されてきた。名前は、分子中のシステイン（Ｃ）残基の数及び間隔を表す。Ｃケモカインは１つのシステインを有し、ＣＣケモカインは２つの隣接するシステインを有し、ＣＸＣケモカインは単一のアミノ酸残基によって隔てられた２つのシステインを有し、ＣＸ３Ｃケモカインは３つのアミノ酸残基によって隔てられた２つのシステインを有する。ケモカインは、細胞表面上に存在する多数のケモカイン受容体と相互作用する。「Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ， Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＶ，ページ６８０」（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
【００７２】
さらに、ケモカインは免疫調節活性を有することができ、癌に対する免疫応答に関与していると推測されている。例えば、ヒト二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）のマウス類縁体であるマウス６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（現在、一般にＣＣＬ２１と称されている。）は、Ｃ２６大腸癌腫瘍細胞株中で抗腫瘍応答を誘導することが報告されている。「Ｖｉｃａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６５（４）：１９９２−２０００」を参照されたい。ヒトＣＣＬ２１及びそのマウス対応物である６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣは、ＣＣＲ７ケモカイン受容体と相互作用するＣＣケモカインとして分類されている。マウス６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（ｍｕＣＣＬ２１）は、Ｖｉｃａｒｉらによって、ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体に対するリガンドであることも報告されている。ヒトＣＣＬ２１、マウスｍｕＣＣＬ２１及び様々な他のケモカインは、樹状細胞、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの様々な免疫系細胞の制御に関与していると推定されている。
【００７３】
Ｍｉｇ及びＩＰ−１０は、活性化されたＴ細胞と関連するＣＸＣＲ３受容体と相互作用するＣＸＣケモカインである。リンホタクチンは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞と関連するＸＣＲ１受容体と相互作用するＣケモカインである。フラクタルキンは、Ｔ細胞、単球及び好中球と関連するＣＸ３ＣＲ１受容体と相互作用するＣＸ３Ｃケモカインである。
【００７４】
本発明のＤＮＡ組成物によってコードされるべき特に好ましい免疫エフェクタータンパク質には、サイトカインＩＬ−２（ヘマトポエチン）、ＣＣＬ２１（ケモカイン）及びＣＤ４０リガンド三量体（ＣＤ４０ＬＴ）などのＣＤ４０リガンド、ＴＮＦファミリーサイトカインが含まれる。
【００７５】
ヒトＩＬ−２に対するＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＢＣ０７０３３８に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。マウスＩＬ−２に対するＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ ００８３６６に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００７６】
ヒトＩＬ−２をコードする核酸配列は図１１に示されており（配列番号５）、その対応するアミノ酸残基配列（配列番号６）は図１２に与えられている。マウスＩＬ−２をコードする核酸配列は図１３に示されており（配列番号７）、その対応するアミノ酸配列（配列番号８）は図１４に与えられている。
【００７７】
ヒトＣＣＬ２１に対するＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＢ００２４０９に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれている。マウスＣＣＬ２Ｉａ変異体のＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ０１１３３５に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。マウスＣＣＬ２１ｂ変異体のＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ０１１１２４に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００７８】
ヒトＣＣＬ２１をコードする核酸配列は図１５に示されており（配列番号９）、その対応するアミノ酸残基配列（配列番号１０）は図１６に与えられている。マウスＣＣＬ２１（ＣＣＬ２１ｂ変異体）をコードする核酸配列は図１７に与えられており（配列番号１１）、その対応するアミノ酸配列（配列番号１２）は図１８に与えられている。
【００７９】
ヒトＣＣＬ２１とそのマウス対応物（マウスＣＣＬ２１ｂ）間のタンパク質配列類似性は、図１９に示されている。ヒトＣＣＬ２１（配列番号１０）及びマウスＣＣＬ２１ｂ（配列番号１２）間には、約７３％のアミノ酸残基配列同一性が存在する。
【００８０】
マウスＣＣＬ２１のＣＣＬ２１ａ変異体をコードする核酸配列は図２０に示されており（配列番号１３）、その対応するアミノ酸残基配列（配列番号１４）は図２１に与えられている。
【００８１】
ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は２６１アミノ酸のタンパク質であり、その最も活性が高い形態において三量体（ＣＤ４０ＬＴ）として存在する。ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４としても知られる。）をコードするＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ００００７４で公開されており、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる（図２２、配列番号１５）。ＣＤ４０Ｌの対応するタンパク質配列は図２３に示されている（配列番号１６）。
【００８２】
本発明の方法の態様は、ＦＡＰをコードし、哺乳動物の免疫細胞中で発現可能であるＤＮＡ構築物を含むＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与することを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。組成物は、組成物が調製される具体的な剤形に応じて、経口、筋肉内、鼻内、腹腔内、皮下、皮内又は局所投与することができる。好ましくは、組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、カプセル、錠剤などの経口投与可能な剤形で調製される。
【００８３】
本発明のＤＮＡ組成物は、組成物で処理された患者中での腫瘍増殖及び／又は腫瘍転移の長期阻害を与えるために使用することができる。好ましい実施形態において、ＤＮＡ組成物は、抗腫瘍化学療法剤と組み合わせて投与される。ＤＮＡ組成物は、組み合わされた剤形中で化学療法剤と一緒に投与することが可能であり、又は組成物及び化学療法剤は、別個の剤形で、及び投与されている化学療法剤の薬理学に適合された隔てられた投薬間隔で投与することが可能である。
【００８４】
本発明のＤＮＡ組成物と組み合わせるのに有用な化学療法剤には、ドキソルビシン、パクリタキセル、シクロホスファミド、エトポシド、５−フルオロウラシル、メトトレキサートなどの抗腫瘍剤が含まれる。
【００８５】
本発明のＤＮＡ組成物は、組成物の調合及び投与を補助するために、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロールなど及びこれらの組み合わせなどの医薬として許容される担体又は賦形剤とともに好ましく調合される。組成物は、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤及び医薬分野において周知である他の補助物質などの補助物質も含有することが可能である。
【００８６】
本発明の組成物は、医薬として許容される担体中の溶液又は懸濁液として、ＦＡＰをコードするＤＮＡの重量を基礎として約１から約１０μｇ／ｍＬの範囲のＤＮＡ濃度で、ヒトなどの哺乳動物に好ましく経口投与される。本発明のＤＮＡ組成物に対する特に好ましい剤形は、適切な緩衝溶液中の弱毒化されたＦＡＰ形質移入された細菌の懸濁液であり、これは経口投与のために調合することができる。組成物の適切な投薬量は、処理されるべき対象、組成物の活性、及び１つには、組成物を投与し、又は組成物の投与を要請する医療従事者の判断に依存する。
【００８７】
哺乳動物に投与されるべき投薬量及び２回以上の投与が使用される場合には、投与のスケジュールは、哺乳類ごとに及び剤形に応じて変動する。有効な投薬量及び投与スケジュールは、本分野において周知であるように、臨床的な用量応答研究を通じて経験的に決定することができる。ＦＡＰ抗原を提示する細胞に対する哺乳動物中の免疫応答を惹起するために、免疫細胞中にＦＡＰ発現の十分な量を与えるように、投薬量及び投薬スケジュールが選択される。好ましくは、対象哺乳動物に投与される組成物の投薬量は、少なくとも１ヶ月、例えば少なくとも６ヶ月又は少なくとも約１年の期間にわたって継続するＦＡＰ提示細胞に対する免疫応答を持続するために、哺乳動物の免疫細胞中でＦＡＰ抗原の十分な量の発現を惹起する。
【００８８】
本発明の組成物は、アンプル、瓶又はバイアルなどの適切に滅菌された溶液中に、複数投薬形態又は単位投薬形態の何れかで梱包することができる。容器は、本発明のＤＮＡ組成物が充填された後に好ましくは密閉される。好ましくは、組成物は、ラベルが貼付された容器中に梱包され、該ラベルは組成物を特定し、適切な法律に基づく組成物の承認を反映する米国食品医薬品局などの政府関連機関によって規定された形態の通知、投薬情報などを有する。ラベルは、好ましくは、患者に組成物を投与する医療専門家に対して有用である組成物についての情報を含有する。パッケージは、組成物の投与、指示、適応症及び必要とされる何らかの必要な警告に関連する印刷された情報資料も好ましくは含有する。
【００８９】
以下の実施例は、本発明の特徴及び実施形態をさらに例示するために提供されており、限定を意図するものではない。
【００９０】
材料、方法及び実施例
動物、細菌株及び細胞株。６から８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＴＳＲＩ）Ｒｏｄｅｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した。全ての動物実験は、国立衛生研究所の動物実験の世話及び使用に関する指針に従って行われ、ＴＳＲＩ動物実験委員会によって承認された。二重弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウム株ＲＥ８８（ＡｒｏＡ−ｄａｍ−）は、Ｒｅｍｅｄｙｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供された。マウスＤ２Ｆ２乳癌細胞は、Ｄｒ．Ｗｅｉ−ＺｅｎＷｅｉ，Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩから入手し、ＣＴ２６大腸癌細胞はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手した後、化学耐性サブクローンを得るために数ヶ月にわたって培養した。
【００９１】
マウスＣＴ２６及びＤ２Ｆ２癌細胞は、１％ＤＭＳＯ、エトポシド、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、ビンブラスチン又はパクリタキセル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の存在下で、表記濃度で培養した。４８時間後、ＤＮＡ特異的なヘキスト３３３４２色素（２μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）との温置後に、アポトーシスを生じた核を計数した。
【００９２】
ＣＴ２６大腸癌及びＤ２Ｆ２乳癌細胞の２つのクローンは、それぞれ、化学療法耐性を獲得した（図１、パネルＣ参照）。５つの異なるアポトーシス誘導性化学療法剤をＣＴ２６大腸癌クローンに添加すると（図１、パネルＣ）、ビンブラスチンのみが僅かなアポトーシス効果を誘導することができたが、５μＭの極めて高い濃度においてのみ誘導することができた。元の親ＣＴ２６細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＬＲ−２３２６）は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対して約１．８５μＭのＩＣ５０を有していたのに対して、耐性ＣＴ２６クローンにおいては、５-ＦＵは、１００μＭの高濃度でさえ、核アポトーシスを誘導することができない。耐性Ｄ２Ｆ２乳癌細胞では、ヘキスト−３３３４２色素染色によって測定されたところによれば、１μＭの最高濃度のドキソルビシンのみが核アポトーシスを誘導することができた。これらの結果は、これらの腫瘍細胞株の何れもが多剤耐性であることを示している。
【００９３】
統計解析。実験群と対照間の異なる所見の統計的な有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって決定した。転移スコアの有意性は、ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙＵ検定によって決定した。生存データの有意性は、ログランク検定によって決定した。Ｐ値が０．０５未満であれば、所見を有意とみなした。
【実施例１】
【００９４】
マウスＦＡＰをコードするＤＮＡ組成物１の調製
真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＦＡＰ（ｐＦＡＰ）（図１、パネルＡ参照）を与えるために、マウスＦＡＰ（配列番号４、図１０）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３、図９、Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ｃｈｅｎｇから入手）をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｇｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＥｃｏＲＩ制限部位中にサブクローニングした。独力でＦＡＰを発現しない一過性に形質移入されたＣＴ２６大腸癌細胞から得た細胞可溶化液のウェスタンブロッティングによって、ベクターからの９５ｋＤａＦＡＰタンパク質の正しい発現が示された（図１、パネルＢ）。これは、一過性に形質移入されたＤ２Ｆ２乳癌細胞に対しても当てはまった。一過性の形質移入のために、以前に記載されているように、ＣＴ２６及びＤ２Ｆ２細胞に電気穿孔を行った（Ｌｏｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ，Ｊ．２００１，１５：７５８−７６７参照、参照により本明細書に組み込まれる。）。ポリクローナルウサギ抗マウスＦＡＰ抗体（Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ｃｈｅｎｇから入手）でのウェスタンブロッティングによって、ＦＡＰのタンパク質発現が示された。
【００９５】
ＤＮＡ組成物１は、以下のように調製した。製造業者の推奨される手順に従って、２ｋＶ、９６０μＦ及び２００オームでＢｉｏ−ＲａｄＰｕｌｓｅｒを用いて、調製直後の二重に弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウム（株ＲＥ８８）中に、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＡＰベクター（ｐＤＮＡ約２μｇ）を電気穿孔した。アンピシリン含有プレート上で、ベクターを含有する弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムを選択した。翌日、コロニーを拾い上げ、アンピシリンを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（脱イオン水１Ｌ中のトリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ及び塩化ナトリウム１０ｇ；ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中で一晩培養した。細菌を単離し、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。次いで、弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウム（ＡｒｏＡ−ｄａｍ−）ベクター中に取り込まれた、マウスＦＡＰを作用可能にコードするＤＮＡ構築物を含有するＤＮＡ組成物１の溶液を形成するために、ＰＢＳ１ｍＬ当たり約１０９の組み換えサルモネラの濃度で、洗浄された細菌をＰＢＳ溶媒中に懸濁した。使用するまで、組成物は、密閉されたアンプル中に保存した。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみ（ＦＡＰＤＮＡなし）で形質転換されたサルモネラからなる「対照ワクチン」も、同じ手順に従って調製した。サルモネラを形質転換する前に、約−８０℃で、プラスミドＤＮＡを保存した。
【００９６】
真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ−Ｆａｐ（ｐＦａｐ）を上記のように構築した後（図１、パネルＡ）、それ自体ＦＡＰを発現しない一過性に形質移入されたＣＴ２６大腸癌及びＤ２Ｆ２乳癌細胞の両方から得られた細胞可溶化液のウェスタンブロッティングによって、８８ｋＤａのＦＡＰタンパク質の正しい発現が示された（図１、パネルＢ）。
【実施例２】
【００９７】
マウスＦＡＰ、マウスＩＬ−２及びマウスＣＣＬ２１をコードするＤＮＡ組成物２の調製
ＡＴＣＣ受託番号３９８９２、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから得たマウスＩＬ−２をコードするｃＤＮＡ（ＤＮＡ配列番号５）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得たマウスＣＣＬ２１ａをコードするｃＤＮＡ（ＤＮＡ配列番号７）を、実施例１に記載されている同じ一般的手順によって、実施例１のマウスｐＦＡＰベクター中にサブクローニングした。弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムベクター中に取り込まれた、マウスＦＡＰ、マウスＩＬ−２及びマウスＣＣＬ２１ａを作用可能にコードするＤＮＡ構築物を含有するＤＮＡ組成物２の溶液を与えるために、実施例１に記載された手順によって、得られたベクター（ｐＦＡＰ／ＩＬ−２／ＣＣＬ２１）でＲＥ８８サルモネラ・チフィムリウムを形質転換した。
【実施例３】
【００９８】
大腸癌及び乳癌のマウスモデルでの本発明のＤＮＡ組成物の評価。
【００９９】
経口免疫化、腫瘍細胞攻撃誘発及びドキソルビシンでの処理。予防的設定での実験のために、「Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００２，８：１３６９−１３７５」に記載されている方法によって、マウスＦＡＰ（実施例１のＤＮＡ組成物１）、マウスＦＡＰ、ＩＬ−２及びＣＣＬ２１（実施例２のＤＮＡ組成物２）又は実施例１の対照ワクチンをコードするプラスミドベクターで形質転換された約１０９のＳ．チフィムリウム（ＡｒｏＡ−ｄａｍ−）を含有するＰＢＳ約１００μＬで、強制経口投与により、約１週の間隔を置いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）を３回処理した。左前脇腹中への約３×１０４のＣＴ２６大腸癌細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、又は下から２番目の左の乳房脂肪体中への約３×１０５のＤ２Ｆ２乳癌細胞の同所性（ｏ．ｔ．）注射によって、約１０日後に、動物に攻撃誘発を行った。
【０１００】
二次元（すなわち、長さと幅、ｍｍで）腫瘍を測定し、長さの半分×幅の２乗として容積を計算することによって、腫瘍容積（ｍｍ３で）を計算した。治療的設定では、約１×１０５のＣＴ２６大腸癌細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって最初の腫瘍細胞接種を行い、続いて、約３日後及び１０日後に、対照ワクチン又は活性なＤＮＡ組成物での経口ワクチン接種を行った。約１８日後に、肺を秤量し（正常な肺重量は約０．２ｇであった。）、肺の腫瘍転移を調べ、融合された転移によって覆われた肺表面のパーセントを評価する視覚的評価によって、以下のようにスコア付けした。０％の被覆に対しては０のスコア、約２０％未満の被覆に対しては１のスコア、約２０から５０％の被覆に対しては２のスコア、肺表面の約５０％超の被覆に対しては３のスコア。腫瘍攻撃誘発から５、１０及び１５日後に、約１０ｍｇ／ｋｇドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）を静脈内投与したマウスの群において、ドキソルビシンでの処理を行った。
【０１０１】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞亜集団を枯渇するために、腫瘍細胞攻撃誘発の１日前から開始し、７日ごとに、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）又はＣＤ８（クローン２．４３）に対する抗体（５００μｇ）（何れも、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から入手）又は抗アシアロＧＭ１抗体（Ｗａｋｏ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｔ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を腹腔内注射した。
【０１０２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性。１週間隔での３回の処理の最終処理から約１０日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）の様々な被処理群から得た脾細胞を集めた。ＣＤ８ａ−マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってＣＤ８＋細胞を精製した。次いで、５日の共培養中で、これらの細胞を刺激し、γ線照射された（１０００Ｇｙ、４５分）ＣＴ２６細胞をｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（実施例１の空のベクター）又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＦＡＰ（実施例１のｐＦＡＰベクター）の何れかで一過性に形質移入した。その後、対照としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＰＥＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又はＧＦＰ＋マウスＦＡＰをコードするｐＦＡＰプラスミドの何れかで一過性に形質移入されたＣＴ２６癌細胞とともに、ＣＤ８＋Ｔ細胞を共培養した（Ｅ：Ｔ＝１００：１）。約４８時間後、ＤＮＡ特異的なヘキスト３３３４２色素（２μＭ）を用いて、核アポトーシスを上記のように評価した。
【０１０３】
５１Ｃｒ放出アッセイのために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）を、１週間間隔で４回処理した。最後の処理から１３日後に、脾細胞を採取し、レトロウイルスによってｐＦａｐを感染させた、γ線照射された（約１０００Ｇｙ、４５分）Ａ３１繊維芽細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）とともに、５日間温置した。次いで、刺激された脾細胞を、標識されたＡ３１−ｐＦａｐとともに約４時間温置し、溶解のパーセントを計算した。約１０μｇ／ｍＬの濃度の抗ＭＨＣクラスＩ抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）とも、細胞を共温置した。
【０１０４】
免疫組織化学。凍結切片（約８μｍ厚）をアセトン中に固定し、染色した。一次抗体（ポリクローナルウサギ抗マウスＦＡＰ抗体（Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ｃｈｅｎｇから入手）又はポリクローナルウサギ抗マウスＩ型コラーゲン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の何れか）との温置後、製造業者のプロトコール（ＤＡＫＯ ＬＳＡＢ＋Ｋｉｔ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に従って、切片を免疫染色した。
【０１０５】
焦点顕微鏡のために、固定された凍結切片を抗マウスＣＤ８抗体、ビオチン化された抗ラットＩｇ二次抗体、ＦＩＴＣ標識されたストレプトアビジン（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で染色し、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で共染色した。画像を得るためにレーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）を使用し、ＺｅｉｓｓＩｍａｇｅＥｘａｍｉｎｅｒソフトウェア（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を用いて画像を処理した。Ｔ細胞浸潤のＦＡＣＳ分析のために、ｐＦａｐ又は空のベクターの何れかを用いて、１週間隔で、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６）を３回処理した。最後の処理から１週後、約３×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を用いて、動物の皮下に攻撃誘発を行った。３週後に腫瘍を採取し、コラーゲナーゼＩ型（１２５Ｕ／ｍＩ；ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が補充された溶媒中で４５分間、スライスされた腫瘍組織を温置することによって、単一細胞懸濁液を調製した。ろ過後、２匹のマウスの細胞をプールし、抗ＣＤ３＋ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５及び抗ＣＤ８＋ＦＩＴＣ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。
【０１０６】
フルオレセイン、エバンスブルーアルブミン及び１４Ｃ−５−フルオロウラシルの腫瘍内取り込み。対照ワクチン（実施例１）、ＤＮＡ組成物１（実施例１）又はＤＮＡ組成物２（実施例２）の何れかによる１週間隔での３回の処理の最終処理後、左前脇腹中に約３×１０４個のＣＴ２６細胞を皮下注射することによって、１０日後にマウスを攻撃誘発した。その約１９日後に、約１２μＬ／ｇ体重の１％フルオレセインナトリウム（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内（ｉｐ．）注射、エバンスブルーアルブミン（Ｓｉｇｍａ）約１００μＬの静脈内注射又は１４Ｃ−５−フルオロウラシル（Ｓｉｇｍａ）約２．５μＣｉの静脈内注射の何れかをマウスに施した。それぞれ、４９０ｎｍ、６１２ｎｍで又はγカウンター中で腫瘍ホモジネートの上清の吸収又はシンチレーションを測定するために、それぞれ、約５分、３０分又は１時間後に、マウスを屠殺した。
【０１０７】
腫瘍内ドキソルビシンの取り込みを測定するために、右脇腹中に、約５×１０５のＤ２Ｆ２細胞で、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）の皮下に攻撃誘発を行った。１６日後に、ドキソルビシンを静脈内注射し（１０ｍｇ／ｋｇ）、注射から４５分後に腫瘍を採取した。１１００シリーズＬＣ−ＭＳ上のＥｃｌｉｐｓｅＸＣＢ−Ｃ８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、内部標準ダウノルビシンに対して試料を測定した。
【０１０８】
可能性がある副作用の評価。創傷治癒に対するあらゆる有害な効果を測定するために、マウスを外科的に負傷させた。１週間隔での３回の処理の最終処理から約１０日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）の背中上部に、皮膚穴開けばさみ（Ｍｉｌｔｅｘ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｐａｇｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いて、直径約３ｍｍの円形の傷をつけた。創縫合に必要とされる時間を測定した。創傷治癒の間にＦＡＰが過剰発現されるという事実にかかわらず、本発明の組成物は創傷治癒プロセスを妨害しない。処理されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）の背中に直径約３ｍｍの円形の傷を与えた後、処理されたマウスと処理されていないマウスの間で、創傷治癒には有意差は観察されなかった。組織学的分析のために、検査の７日、１４日、２１日前に、処理されたマウスに対して創傷を与えた。マウス病理学者によって、皮膚生検並びに２６の臓器及び組織が検査された。
【０１０９】
ＦＡＰをベースとするＤＮＡ組成物での予防的処置は、原発性腫瘍増殖を阻害する。対照ワクチン（実施例１）、ＤＮＡ組成物１（実施例１）又はＤＮＡ組成物２（実施例２）の何れかによる１週間隔での３回の処理の最終処理から１０日後に、上述のように、ＣＴ２６大腸癌細胞を用いて皮下に、又はＤ２Ｆ２乳癌細胞を用いて正所性に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの異なる群（ｎ＝８）に攻撃誘発を行った。本発明のＤＮＡ組成物は、多剤耐性ＣＴ２６細胞（図２ａ）及び耐性Ｄ２Ｆ２細胞（図２ｂ）の原発性腫瘍増殖を抑制した。ＦＡＰ、ＣＣＬ２１及びＩＬ−２の組み合わせをコードするＤＮＡ組成物２は、原発性腫瘍増殖を阻害する上で概ね等しく効果的であった（図２ａ）。
【０１１０】
本発明のＤＮＡ組成物は、治療的設定において、確立された転移の増殖を低下させる。約１×１０５のＣＴ２６大腸癌細胞での最初の静脈内接種から３日後及び１０日後に、実施例１のＤＮＡ組成物１で処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、実施例１の対照ワクチンで処理されたマウスと比べて、実験的な肺転移の著しい低下をもたらした。これに対して、対照群中のマウスは大規模な転移を呈し、腫瘍細胞接種から１８日後に死亡し始めた（図２ｃ）。同様に、ｐＣＣＬ２１のみとｐＦＡＰの組み合わせも、概ね等しく効果的であった（図２ｂ）。
【０１１１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、効果的な抗腫瘍免疫応答を与える。ＤＮＡ組成物１（実施例１）で、１週間隔で３回、マウスを静脈内処理し、約１×１０５のＣＴ２６細胞で攻撃誘発した。次いで、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞（図３、パネルＡ）に対する抗体を用いて、エフェクター相の間に、マウスからそれらの各エフェクター細胞を枯渇させた。ＣＤ４＋細胞及びＮＫ細胞の枯渇はｐＦＡＰ処理の有効性を減少させず、免疫応答におけるＣＤ８＋Ｔ細胞に対する重要な役割を示唆している。
【０１１２】
本発明のＦＡＰＤＮＡ組成物での処理がＦＡＰ自己抗原に対する末梢Ｔ細胞耐性を破壊することができる程度を評価するために、ｐＦＡＰで形質移入された細菌又は空のベクターで処理された動物から得られたＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。次いで、γ照射された腫瘍標的細胞でこれらの細胞を刺激し、対照としてのＧＦＰ又はＧＦＰ／ｐＦａｐの何れかで一過性に形質移入された生の腫瘍標的細胞とともに温置した。図３、パネルＢに示されているように、ヘキスト３３３４２色素でのｐＦａｐ形質移入された標的細胞の染色によって評価されたところによれば、ｐＦａｐで処理されたマウスから精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞のみが核のアポトーシスを誘導することができた。
【０１１３】
慣用の５１Ｃｒ放出アッセイでは、処理されたマウスの脾細胞も使用した。この目的のために、組成物１及び対照ワクチンで処理されたマウスから得られた脾細胞を、レトロウイルスによってｐＦａｐに感染させた、γ照射されたＡ３１繊維芽細胞とともに５日間温置した。次いで、刺激された脾細胞を、標識されたＡ３１−ｐＦａｐ細胞とともに４時間温置し、溶解のパーセントを計算した。組成物１で処理されたマウスから得た脾細胞は、１：１００と１：２５の標的対エフェクター比で、空のベクター対照から得られたものより、有意により多くの繊維芽細胞を溶解することができた（図３、パネルＣ）。抗ＭＨＣクラスＩ抗体との共温置は、この効果を消滅させた（図３、パネルＤ）。
【０１１４】
さらなる評価において、組成物１又は対照ワクチンの何れかで、マウスを３回処理し、次いで、ｐＦａｐ処理されたマウスの腫瘍内でのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を調べるために、約３×１０４のＣＴ２６腫瘍細胞で攻撃誘発した。３週後に、腫瘍を採取し、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋細胞に関して、単一細胞懸濁液を染色し、ＦＡＣＳによって分析した。組成物１で処理されたマウスは、空のベクター対照と比べた場合、腫瘍組織中のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の顕著な増加を示した（図３、パネルＥ）。
【０１１５】
腫瘍切片は、抗ＣＤ８ＦＩＴＣ及びＤＡＰＩ核染色でも染色した。共焦点顕微鏡を用いて、組成物１で処理されたマウスの腫瘍は、実施例１の対照ワクチンで処理されたマウスより多くの、ＣＤ８＋細胞による顕著な浸潤を示した（図３、パネルＦ）。総合すると、これらの知見は、ＦＡＰを標的とする本発明のＤＮＡ組成物は、ＦＡＰ自己抗原に対する末梢Ｔ細胞耐性を克服できることを示している。
【０１１６】
Ｉ型コラーゲン発現の抑制は腫瘍内色素取り込みを増加させる。繊維芽細胞はＩ型コラーゲンの主要な源であり、この分子の発現は様々な分子量の化合物の腫瘍内取り込みと逆相関することが報告されている。この同じ機序が本発明のＤＮＡ組成物に対しても当てはまるかどうかを評価するために、処理されたマウスの腫瘍切片を、ＦＡＰに対する抗体（図４、パネルＡ、上の写真）又はＩ型コラーゲンに対する抗体（図４、パネルＡ、下の写真）で染色した。対照ワクチン（実施例１）のみで処理されたマウスと比べて、組成物１で処理されたマウスの群において、ＦＡＰ及びＩ型コラーゲンの発現の減少が検出された。これらの腫瘍抽出物の対応するウェスタンブロットは同じ抗体で染色され、ＦＡＰ発現の約８２．６３＋／−２．５４％の減少（図４、パネルＢ、上の写真）及びＩ型コラーゲンの約７６．３６＋／−２．０１％の減少（図４、パネルＢ、下の写真）を明らかにした。
【０１１７】
次いで、サイズ及び構造が異なる３つの化合物、すなわち、上記のように、フルオレセイン（３７６Ｄａ）（図４、パネルＣ）、エバンスブルーアルブミン（６８，５００Ｄａ）（図４、パネルＤ）又は化学療法剤５−フルオロウラシル（１３０Ｄａ）（図４、パネルＥ）をマウスに注射した。ｐＦａｐＤＮＡ組成物１で処理されたマウスの腫瘍は、対照ワクチンを投与されたマウスの腫瘍より、これらの各分子を有意に多く（ｐ＜０．０５）取り込んだ。
【０１１８】
ＤＮＡ組成物と化学療法の組み合わせは、腫瘍拒絶をもたらす。本発明のＤＮＡ組成物での処理を、Ｄ２Ｆ２細胞が部分的に感受性である化学療法剤ドキソルビシンと組み合わせる治療用プロトコールを開発した（図１、パネルＣ）。実施例１の対照ワクチン又は実施例１の組成物で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）を処理した。次いで、処理されたマウスを、Ｄ２Ｆ２乳癌細胞で正所性に攻撃誘発した。次いで、腫瘍攻撃誘発から５日、１０日及び１５日後に、ドキソルビシン又は対照としてのＰＢＳの何れかで、マウスのこれらの２つの群を処理した。図５、パネルＡに示されているように、免疫療法（組成物１）又は化学療法何れかでの単一の処理は腫瘍増殖を抑制できるにすぎず、腫瘍増殖を根絶することはできなかった。これに対して、組成物１及びドキソルビシンの組み合わせで処理されたマウスの群は腫瘍増殖の顕著な阻害を呈したのみならず、８匹のマウスのうち４匹で、完全な腫瘍拒絶を呈した（図５、パネルＡ）。
【０１１９】
治療的設定での別の組み合わせ療法アプローチでは、Ｄ２Ｆ２腫瘍細胞で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）の静脈内に攻撃誘発を行った。５日後に、一旦、転移が確立されたら、組成物１でマウスを毎週処理した。各処理から１日後に、ドキソルビシンをマウスに静脈内注射した。この組み合わせ処理の結果、これらのマウスの寿命は、ドキソルビシン又は組成物１のみで処理され、約３５から４５日後に既に死亡した対照マウスの寿命の３倍を超えた（図５、パネルＢ）。
【０１２０】
本発明のＦＡＰＤＮＡ組成物は、ドキソルビシンの腫瘍内取り込みを増加させる。腫瘍組織中のドキソルビシン濃度を測定するために、１週間隔で、組成物１でマウス（ｎ＝４）を３回処理し、７日後に、５×１０５のＤ２Ｆ２腫瘍細胞で攻撃誘発し、１６日以後に、ドキソルビシンを静脈内注射した。腫瘍内薬物濃度は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって測定した。組成物１で処理されたマウスの組織は、対照と比べて、腫瘍中のドキソルビシンの取り込みの有意な増加を示した（図６、パネルＡ）。これらの結果は、フルオレセイン、アルブミン及び５−フルオロウラシルで処理されたマウス中の腫瘍で観察された化学的浸潤と合致する（図４、パネルＣからＤ）。
【０１２１】
ＦＡＰに対するＤＮＡワクチンは、創傷治癒を損なわず又は正常組織を損傷しない。ＦＡＰは創傷治癒の間に過剰発現されるので、創傷治癒に対する本発明のＤＮＡ組成物の効果を調べた。処理されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）マウスの背中に、直径約３ｍｍの円形創傷を与えた。驚くべきことに、処理されたマウスと処理されていないマウスの間で、創傷治癒に有意差は観察されなかった（図６、パネルＢ）。異なる時点後における、マウス病理学者によるこれらの創傷の組織学的評価によって、創傷治癒プロセスに定性的な異常が存在しないことが明らかとなった。本発明のＤＮＡ組成物によって誘導された一切の自己免疫反応を除去するために、以下の組織及び臓器：皮膚、脳、脊髄、筋肉、骨、滑膜、心臓、大動脈、肺動脈、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、副甲状腺、副腎、腎臓、子宮、膣、陰核腺、舌、肝臓、肺、膵臓、胃、小腸及び大腸の総合的な組織学的検査を実施した。対照マウスと比べて、識別可能な差は観察されなかった。
【０１２２】
本発明の新規特徴の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施形態の多数の変形及び改変を実施することができる。本明細書に例示されている具体的な実施形態に関する限定は意図されておらず、又は推測すべきでない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８１５，３１６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所からのグラント番号ＣＡ８３８５６及び国防総省からのグラント番号ＢＣ０３１０７９の下で、合衆国政府の支援を受けて為された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、腫瘍中の間質性繊維芽細胞に対して免疫応答を惹起するのに有効な適切な分子をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）組成物に関する。より具体的には、本発明は、繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）として知られる間質抗原をコードするＤＮＡ組成物に関する。本発明は、腫瘍増殖及び腫瘍転移を阻害するために、並びに化学療法剤の細胞性取り込みを増強するためにＤＮＡ組成物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍抗原は癌治療のための理解しにくい標的であることが益々明白になっている。これは、腫瘍細胞の抗原の変異及びＭＨＣ−抗原発現の下方制御を原因とする不十分な抗原提示を含み、腫瘍細胞に特有の様々な特徴によって説明することができる。さらに、アポトーシスシグナル伝達経路の異常及びサバイビン、ＸＩＡＰ又はｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス要素などのアポトーシス阻害剤の上方制御はＴ細胞媒介性の死滅に対する耐性を付与するのみならず、化学療法剤のアポトーシス誘導効果に対する耐性も付与する。
【０００５】
間質性の区画が腫瘍形成及び腫瘍浸潤において重大な役割を果たしているという認識が高まっている。間質細胞は、正常な上皮細胞の形質転換を刺激すること、並びに隣接する細胞外マトリックスを活性化するために及び新生物細胞の選択と増殖を誘導するために成長因子、サイトカイン及び化学誘引物質をやり取りすることが示されている。ある研究において、懸濁液としてマウス中に注射された腫瘍細胞は腫瘍原性でないことが報告されたのに対して、間質を含有する固形腫瘍の断片の注入は腫瘍の増殖をもたらすことが報告された（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２；１７５：１３９−１４６参照）。活性化された細胞外マトリックスは、おそらくβ１インテグリンによって媒介される化学療法耐性を付与し、β１インテグリンはフィブロネクチンに接着して、β１インテグリンによって刺激されるチロシンキナーゼの活性化をもたらし、次いで、β１インテグリンによって刺激されたチロシンキナーゼは、化学療法によって誘導されるアポトーシスを抑制する。この現象は、ドキソルビシン感受性の骨髄腫細胞中で報告されており、ドキソルビシン感受性の骨髄腫細胞はフィブロネクチンへの接着後に耐性を生じた。最近の報告は、腫瘍間質性繊維芽細胞を調節することによって、又は腫瘍間質ネットワークを分配することによって、腫瘍拒絶を達成できることを示している。さらに、報告によれば、腫瘍関連マクロファージ及び繊維芽細胞は、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１及びＩＬ−１０などのタンパク質を合成する能力の故に、局所的な免疫抑制環境に寄与している。ＶＥＧＦは樹状細胞の成熟の阻害剤として機能し、従って、耐性Ｔ細胞をもたらす。ＶＥＧＦは、腫瘍血管新生に関与する主要な因子でもある。ＶＥＧＦの活性化は、腫瘍−上皮細胞中で、サバイビン及び他の多くのアポトーシス阻害タンパク質の上方制御をもたらし、それらを化学療法のアポトーシス効果から遮蔽する。これに対して、ＴＧＦ−β１の阻害は、腫瘍の根絶及び転移に対する保護をもたらすことができる。ＩＬ−１０は樹状細胞の成熟を阻害することにより、Ｔｈ１細胞によって媒介される細胞媒介性抗腫瘍応答を抑制する。この効果は、ほとんど無効な液性免疫応答の方向に樹状細胞をシフトさせる。
【０００６】
繊維芽細胞は、コラーゲン及び他の高分子に富む細胞外マトリックスを分泌する結合組織細胞である。腫瘍間質（すなわち、腫瘍支持組織）中の繊維芽細胞は、セリンプロテアーゼとして機能するＩＩ型膜貫通タンパク質である繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を合成する。ＦＡＰは、大腸癌、乳癌及び肺癌を伴う間質性繊維芽細胞の９０％超において、選択的に過剰発現する。ＦＡＰの一過性過剰発現は、創傷治癒の間に及び幾つかの胎児間葉組織中にも観察することができる。さらに、この酵素は、報告によれば、ゼラチン及びＩ型コラーゲンを切断し、細胞外マトリックスの再構築が示唆されている。報告によれば、ＦＡＰの過剰発現は腫瘍増殖の促進及び転移能の増加をもたらすのに対して、抗ＦＡＰ抗体での処理は腫瘍増殖を阻害する。さらに、繊維芽細胞によって主に産生されるＩ型コラーゲンの腫瘍間質性発現は、化学療法剤を含む様々な化合物の腫瘍内取り込みと逆相関しており、これにより、化学療法耐性における間質性区画の関与を維持する。
【０００７】
疾病病原体が増殖し、病的効果を引き起こせるようになる前に疾病病原体を破壊するために生物の免疫系を刺激する予防剤を極めて限定的に投与することによって、多数の病状に対する長期の保護を与えるためにワクチンが使用されてきた。ワクチン及びワクチン接種のための様々なアプローチが、「Ｂｅｒｎａｒｄ Ｒ．Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋ Ｊ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２５３−２７６（１９９８）」に記載されている。
【０００８】
ワクチン接種は、感染因子が病的な応答を引き起こす前に、感染因子を捜し出して、破壊するために自分の体の免疫系を誘導する手段である。典型的には、ワクチンは、生の、但し弱毒化された感染性因子（ウイルス又は細菌）か、又は感染性因子の死滅された形態かである。生の細菌又はウイルスからなるワクチンは非病原性でなければならない。典型的には、物理的又は化学的処理によって、細菌又はウイルスの培養物が弱毒化（弱化）される。因子は非病原性であるが、ワクチンで処置された対象において免疫応答をなお惹起することができる。
【０００９】
免疫応答は、特異的な高分子又は感染性因子の何れかであり得る抗原によって惹起される。これらの抗原は、一般に、タンパク質、多糖、脂質又は糖脂質の何れかであり、これらは、Ｂ細胞及びＴ細胞として知られるリンパ球によって、「外来」として認識される。リンパ球の両タイプが抗原に曝露されることによって、急速な細胞分裂と分化応答が惹起され、曝露されたリンパ球のクローンの形成をもたらす。Ｂ細胞は形質細胞を産生し、次いで、感染性因子の上に存在する抗原へ選択的に結合して、病原体を中和又は不活化する抗体（Ａｂ）と呼ばれるタンパク質を産生する（液性免疫）。幾つかの事例において、Ｂ細胞応答は、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の補助を必要とする。
【００１０】
抗原曝露に応答して形成する特殊化されたＴ細胞クローンは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり、これは、抗原を提示する病原体及び組織に結合し、これらを排除することができる（細胞媒介性免疫又は細胞性免疫）。幾つかの事例では、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、病原体又はその他の外来細胞をエンドサイトーシスによって包み込む。次いで、ＡＰＣは、細胞由来の抗原を加工し、組織適合性分子：ペプチド複合体の形態で、これらの抗原をＣＴＬ上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示して、免疫応答を刺激する。
【００１１】
特異的な抗体の形成を特徴とする液性免疫は、一般に、急性の細菌感染及びウイルスからの反復感染に対して最も効果的であるのに対して、細胞媒介性免疫はウイルス感染、慢性細胞内細菌感染及び真菌感染に対して最も効果的である。細胞免疫は、ある種の癌に対して保護することが知られており、、及び臓器移植の拒絶の原因である。
【００１２】
以前の感染に由来する抗原に対する抗体は、極めて長期間にわたって血中で検出可能な状態を保ち、従って、病原体への以前の曝露を決定する手段を与える。同じ病原体へ再度曝露されると、病原因子が増殖し、病原性応答を引き起こすことができるようになる前に、病原性因子を排除することによって、免疫系は再感染を効果的に抑制する。
【００１３】
病原体によって惹起される同じ免疫応答は、時には、病原体と同じ抗原を提示する非病原性因子によっても産生され得る。このようにして、対象は、感染を以前に撃退していなくても、病原体に対するその後の曝露に対して保護され得る。
【００１４】
しかしながら、ワクチン形成のために必要とされるように、全ての感染性因子を容易に培養し、不活化できるわけではない。現代の組み換えＤＮＡ技術によって、この限界の克服を目指して、新しいワクチンを設計することが可能となった。病原性遺伝子を欠如する感染性因子を作製することが可能であり、従って、生物の生きた非病原性形態をワクチンとして使用することが可能となる。病原性担体の細胞表面抗原を提示するために、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの相対的に非病原性の生物を操作することも可能である。このような形質転換された担体をワクチン接種された対象の免疫系は、「だまされて」病原体に対する抗体を形成する。病原性因子の抗原性タンパク質を操作し、非病原性の種内で発現させることが可能であり、「サブユニットワクチン」を作製するために、抗原性タンパク質を単離及び精製することができる。サブユニットワクチンは、安定であり、安全で、化学的に十分に確定されているという利点を有するが、サブユニットワクチンの製造は非常に費用がかかり得る。
【００１５】
近年、ワクチンに対する新たなアプローチが出現し、広く遺伝的免疫法と称されている。このアプローチでは、病原性因子の抗原をコードする核酸（ポリヌクレオチド）が、免疫化されるべき対象中の細胞内へ作用可能に挿入される。処理された細胞、好ましくは、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ５）は形質転換され、病原体の抗原性タンパク質を産生する。インビボで産生されたこれらの抗原は、次いで、所望の免疫応答を宿主内に引き起こす。このような遺伝子ワクチン中で使用される遺伝物質はＤＮＡ又はＲＮＡ構築物の何れかであり得る。しばしば、抗原をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子の挿入、複製又は発現を強化するために、他のプロモーターポリヌクレオチド配列と組み合わせて導入される。
【００１６】
抗原遺伝子をコードするＤＮＡワクチンは、様々な送達系によって、対象の宿主細胞中に導入することができる。これらの送達系には、原核生物性送達系とウイルス性送達系が含まれる。例えば、１つのアプローチは、宿主細胞を接種するために、新しい遺伝物質を取り込んだワクシニアウイルスなどのウイルスベクターを使用することである。あるいは、遺伝物質はプラスミドベクター中に取り込ませることが可能であり、又は「裸の」ポリヌクレオチドとして、すなわち、単に精製されたＤＮＡとして、宿主細胞へ直接送達することが可能である。さらに、ＤＮＡは、サルモネラ・チフィムリウムなどの弱毒化された細菌中へ安定に形質移入することができる。形質転換されたサルモネラで患者を経口的にワクチン接種すると、細菌は腸内のパイエル板（すなわち、二次リンパ組織）へ輸送され、次いで、免疫応答を刺激する。
【００１７】
ＤＮＡワクチンは、遺伝病及び癌など、伝統的な病原体によって引き起こされない病状に対して免疫化するための機会を提供する。典型的には、遺伝子癌ワクチンは、抗原をコードする遺伝子をＡＰＣ中に導入し、このようにして形質転換されたＡＰＣは腫瘍細胞の特異的な種類に対する抗原を産生する。従って、多数の癌の種類に対する効果的な一般的ワクチンは、それに対して免疫化されるべき癌細胞の各種類に対する多数の個別のワクチンを必要とし得る。
【００１８】
癌の様々な形態に対して免疫化するための一般的に有効なＤＮＡ組成物（ワクチンなど）に対する継続的な要望が存在する。本発明はこの要望を満たす。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、マウスＦＡＰＤＮＡ構築物及び化学療法耐性腫瘍細胞株の性質決定である。パネルＡは、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター（ｐＦＡＰ）のＥｃｏＲＩ部位中に挿入された完全なマウスＦＡＰをコードするプラスミドｃＤＮＡを図示している。パネルＢは、ＣＴ２６細胞の一過性形質移入後に、ウェスタンブロッティングによってＦＡＰタンパク質発現が示されたことを示している。パネルＣは、表記濃度の様々な化学療法剤で処理されたＣＴ２６大腸癌細胞及びＤ２Ｆ２乳癌細胞を示している。温置の４８時間後、ヘキスト−３３３４２色素染色によって、核のアポトーシスを評価した。バーは、３つのアッセイの平均＋標準偏差を示している。
【図２】図２Ａから図２Ｃは、ＦＡＰをベースとするＤＮＡ組成物の腫瘍増殖に対する効果を示している。予防的設定：材料と方法に記載されているとおりに実施された１週間隔での３回のワクチン接種の最後の接種から１０日後に、３×１０４のＣＴ２６細胞の致死用量を皮下（ｓ．ｃ．）注射によって（図２Ａ）、又は３×１０５のＤ２Ｆ２細胞の致死用量を正所性に（ｏ．ｔ．）（図２Ｂ）、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）を攻撃誘発した。８匹のマウスの平均腫瘍増殖が図示されている。平均±ＳＥ、ｐ＜０．０１。治療的設定：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）にまず、１０５のＣＴ２６細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、次いで、一旦肺転移が確立されたら、３日後及び１０日後に処理を施した。１８日後に、肺を切り出し、秤量し（正常な肺重量は約０．２ｇであった。）、転移に関して検査し、視覚的評価によってスコア付けを行った。融合された転移によって覆われた肺表面のパーセントを以下のように評価した。０＝０％、１＝＜２０％、２＝２０−５０％、３＝＞５０％、ｐ＜０．０１。（図２Ｃ）。
【図３】図３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって誘導された細胞毒性を示している。（Ａ）被処理マウスでのエフェクター相の間の抗体介在性欠失の寿命に対する効果が図示されている（＊は対照群と比較した統計的有意性を表す。ｐ＜０．０１）。（Ｂ）処理されたマウスの脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、γ線照射された腫瘍標的細胞で刺激し、次いで、ｐＧＦＰ又はｐＧＦＰ／ｐＦａｐ形質移入されたＣＴ２６細胞とともに４８時間温置した。ヘキスト−３３３４２色素での染色により、核のアポトーシスを以下のように評価した。核のアポトーシス段階０：アポトーシスなし；段階１：大規模なクロマチン凝集；段階２ａ：クロマチンの断片化；段階２ｂ：アポトーシス体。（Ｃ、Ｄ）ｐＦａｐ及び空のベクターによって免疫化されたマウス（ｎ＝３）由来の脾細胞を、ｐＦａｐで形質移入されたＡ３１繊維芽細胞で５日間刺激し、次いで、５１Ｃｒ放出アッセイに供した。（Ｄ）抗ＭＨＣクラスＩ抗体とともに、エフェクター及び標的細胞を共温置した（平均＋ＳＤ、＊は空のベクターと比べて統計的に有意であることを示す。ｐ＜０．０５）。（Ｅ）抗ＣＤ３＋ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５及び抗ＣＤ８＋ＦＩＴＣ抗体で染色された、被処理マウス（ｎ＝２）のＣＴ２６腫瘍の単一細胞懸濁液のＦＡＣＳ分析。２つの実験のうちの１つが図示されている。（Ｆ）抗ＣＤ８ＦＩＴＣ抗体及びＤＡＰＩ核染色で染色された、ｐＦａｐ及び空のベクターで処理されたマウスのＣＴ２６腫瘍の代表的な切片。
【図４】図４は、ＦＡＰ／Ｉ型コラーゲンの発現及びフルオレセイン／アルブミン／５−ＦＵの腫瘍内取り込みを示している。（Ａ）ＦＡＰの免疫組織化学的分析（上のパネル）及び被処理マウスの皮下ＣＴ２６腫瘍中でのＩ型コラーゲン（下のパネル）発現。（Ｂ）被処理マウスの皮下ＣＴ２６腫瘍中でのＦＡＰ及びＩ型コラーゲンのイムノブロット。（Ｃ、Ｄ、Ｅ）棒グラフは、フルオレセインの腹腔内注射、エバンスブルーアルブミンの静脈内注射又は１４Ｃ−５−フルオロウラシルの静脈内注射後における、処理されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）から得た皮下ＣＴ２６腫瘍のホモジネートの光学密度又はシンチレーション測定の平均＋ＳＥを示している。それぞれ、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０５。
【図５】図５は、組み合わされた生物及び化学療法の抗転移効果及び副作用を示している。（Ａ）予防的設定。対照ワクチン、ＰＢＳ又は本発明のワクチンを用いた、１週間隔での３回のワクチン接種の最後の接種から１０日後に、３×１０５のＤ２Ｆ２細胞で正所性に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８；平均±ＳＥ）を攻撃誘発した。５、１０及び１５日後に、表記マウスをドキソルビシンで処理した。（Ｂ）治療的設定。１０５のＤ２Ｆ２腫瘍細胞の静脈内注射から５日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）をｐＦａｐワクチン又は対照ワクチンで毎週処理した。各免疫化から１日後に、表記のとおり、マウスをドキソルビシンで静脈内に処理した（＊は、対照群と比較した有意性を示しており、ｐ＜０．０００１、＊＊は、対照、対照／Ｄｏｘ、ｐＦａｐ及びｐＦａｐ／Ｄｏｘ群と比較した有意性を示している、ｐ＜０．０００１）。
【図６】（Ａ）腫瘍内のドキソルビシン濃度：処理されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）に、５×１０５のＤ２Ｆ２細胞を皮下に攻撃誘発し、プールされた腫瘍可溶化液中のドキソルビシン濃度を、ＬＣ−ＭＳによって、１６日後に測定した（２つの実験の代表、平均＋標準偏差、Ｐ＜０．００１）。（Ｂ）処理されたマウス（ｎ＝４）の背中上方に、３ｍｍの直径の円形の創傷を与え、完全な創傷封鎖までの平均時間を測定した（平均＋標準偏差）。
【図７】図７は、ヒトＦＡＰをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１）を示している。
【図８】図８は、ヒトＦＡＰのアミノ酸残基配列（配列番号２）を示している。
【図９】図９は、マウスＦＡＰをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号３）を示している。
【図１０】図１０は、マウスＦＡＰのアミノ酸残基配列（配列番号４）を示している。
【図１１】図１１は、ヒトＩＬ−２をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号５）を示している。
【図１２】図１２は、ヒトＩＬ−２のアミノ酸残基配列（配列番号６）を示している。
【図１３】図１３は、マウスＩＬ−２をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号７）を示している。
【図１４】図１４は、マウスＩＬ−２のアミノ酸残基配列（配列番号８）を示している。
【図１５】図１５は、ヒトＣＣＬ２１をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号９）を示している。
【図１６】図１６は、ヒトＣＣＬ２１のアミノ酸残基配列（配列番号１０）を示している。
【図１７】図１７は、マウスＣＣＬ２１ｂをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示している。
【図１８】図１８は、マウスＣＣＬ２１ｂのアミノ酸残基配列（配列番号１２）を示している。
【図１９】図１９は、ヒトＣＣＬ２１及びマウスＣＣＬ２１ｂ間でのアミノ酸配列の類似性を示している。
【図２０】図２０は、マウスＣＣＬ２１ａをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示している。
【図２１】図２１は、マウスＣＣＬ２１ａのアミノ酸残基配列（配列番号１４）を示している。
【図２２】図２２は、ヒトＣＤ４０Ｌをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示している。
【図２３】図２３は、ヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸残基配列（配列番号１６）を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は、繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）として知られる腫瘍間質抗原を標的とする、腫瘍増殖又は腫瘍転移を阻害するのに有効なＤＮＡ組成物を提供する。このＤＮＡ組成物は、ＦＡＰの少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物を含み、該ＤＮＡ構築物は免疫細胞中において発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。ＤＮＡ構築物は、ＦＡＰの単一のエピトープ、ＦＡＰの２つ若しくはそれ以上のエピトープを含むポリペプチド、完全なＦＡＰタンパク質又は腫瘍間質細胞などのＦＡＰを発現する細胞に対して所望の免疫応答を惹起するこれらのあらゆる一部をコードし得る。本発明の組成物によって惹起された免疫応答は、腫瘍増殖及び腫瘍転移の阻害をもたらす。
【００３７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「ＤＮＡ構築物」という用語は、ＦＡＰエピトープ、ＦＡＰタンパク質、ＩＬ−２、ＣＣＬ２１などの目的のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ構造を表す。ＤＮＡ構築物には、直鎖ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡ並びに細胞又はウイルスの遺伝物質中に取り込まれたＤＮＡなど、標的細胞中で転写されることができるいずれかのＤＮＡが含まれる。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、ウイルス又は細菌送達ベクター、例えば、非病原性である弱毒化されたウイルスベクター又は細菌ベクター中に取り込まれたＤＮＡである。対象が本発明の組成物で処理されると、
ＦＡＰをコードするＤＮＡが免疫細胞（例えば、マクロファージ及び樹状細胞）に送達され、次いで、免疫細胞がＦＡＰタンパク質を発現する。ＦＡＰＤＮＡのウイルス及び細菌担体は、それ自体、ＦＡＰを発現しない。
【００３８】
本発明のＤＮＡ組成物は、腫瘍間質細胞（例えば、間質性繊維芽細胞）など、ＦＡＰ抗原を提示する細胞に対して活性を有するＣＴＬの形成を刺激する。このような腫瘍間質細胞は、本発明のＤＮＡ組成物による免疫化に応答して産生されるＣＴＬによって選択的に標的とされる。本発明の組成物は、Ｉ型コラーゲンの腫瘍間質性発現も低減することができ、続いて、これは化学療法剤の取り込みを増強することができる。
【００３９】
本明細書において使用される「免疫」という用語は、抗原を発現している細胞に対する長期の免疫学的保護を表す。「免疫化」という用語は、処理された対象中の抗原を発現している細胞に対して免疫をもたらす、抗原への曝露を表す。
【００４０】
「ＦＡＰタンパク質」という用語は、ヒトＦＡＰ、又はヒトＦＡＰに対して少なくとも８０％の配列類似性を有し及びヒトＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドを表す。「ＦＡＰＤＮＡ」という用語は、ヒトＦＡＰをコードするＤＮＡ又はヒトＦＡＰに対して少なくとも８０％の配列類似性を有し及びヒトＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドをコードするＤＮＡを表す。
【００４１】
本発明のＤＮＡ組成物において有用なＤＮＡ構築物は、ＦＡＰの１つ又はそれ以上のエピトープを含むポリペプチドをコードし、及び免疫細胞中での遺伝子発現のために必要とされる制御要素に作用可能に連結されている核酸を好ましくは含む。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、完全長ＦＡＰタンパク質をコードし、又は完全長ＦＡＰタンパク質と少なくとも８０％の配列類似性の高い程度を有し、及びＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドをコードする。有用なＤＮＡ構築物は、好ましくは、免疫細胞中でのヌクレオチドの発現に必要な制御要素を含む。このような要素には、例えば、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、免疫原性標的タンパク質をコードする配列の発現のために、エンハンサーがしばしば必要とされる。本分野において公知であるように、これらの要素は、好ましくは、所望のタンパク質をコードする配列に作用可能に連結される。制御要素が投与されるべき種内において作用可能である制御要素が好ましく選択される。好ましくは、ＤＮＡ構築物はプラスミドの形態であり、又はウイルス若しくは細菌ベクター中に取り込まれる。ＦＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、本分野において周知の方法を用いて、形質移入によって、まず、細菌ベクター中に取り込まれ得る。続いて、形質転換された細菌は、細菌の遺伝物質内にＦＡＰＤＮＡを含む細菌のそのまま使用できる株を提供するために培養することができる。このような形質転換された細菌の培養物は、本発明のＤＮＡ組成物に対してそのまま使用できる源を与える。
【００４２】
本発明のＤＮＡ組成物中に、ＦＡＰをコードするヌクレオチド配列の一部として開始コドン及び停止コドンが好ましく含められる。開始及び停止コドンは、コード配列のフレーム領域内に存在しなければならない。
【００４３】
本発明の組成物中に含められるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、免疫されるべき対象の細胞内で機能的であるように好ましく選択される。
【００４４】
本発明の組成物において、特に、ヒト用の遺伝子ワクチンＤＮＡ組成物の作製において有用なプロモーターの例には、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ），ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーター並びにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明のＤＮＡ組成物において、特に、ヒト用のＤＮＡ組成物の作製において有用なポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
ＤＮＡ発現のために必要とされる制御要素に加えて、ＤＮＡ分子中に他の要素を含めることも可能である。このような追加要素には、エンハンサーが含まれる。エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ由来のものなどのウイルス性エンハンサーであり得る。
【００４７】
制御配列及びコドンは、一般に、種依存性であり、従って、タンパク質産生を最大化するために、制御配列及びコドンは免疫化されるべき種内で効果的であるように、好ましく選択される。当業者は、所定の対象種内で機能的であるＤＮＡ構築物を作製することができる。
【００４８】
本組成物において有用なＤＮＡ構築物は、「Ｒｅｓｔｉｆｏ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０００；７：８９−９２」（その関連する開示内容は、参照により組み込まれる。）に定義されているように「裸の」ＤＮＡとすることができる。好ましくは、ＤＮＡ構築物はプラスミドの形態であり、又は弱毒化されたウイルス若しくは弱毒化された細菌の遺伝物質中に取り込まれたＤＮＡの形態である。有用な送達ビヒクル又は担体には、生物分解性微小カプセル、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）及び裸のＤＮＡ構築物用のリポソーム並びに遺伝的に操作された、弱毒化された生のウイルス又は細菌用の生理的に許容される様々な緩衝液が含まれる。
【００４９】
ＦＡＰＤＮＡ構築物を取り込むように形質転換され得る弱毒化された適切な生の細菌ベクターの例には、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種又は本分野において公知であるあらゆる他の適切な細菌ベクターが含まれる。特に、組成物が経口投与用である場合には、ベクターは、好ましくは、弱毒化された生のサルモネラ・チフィムリウムベクターである。好ましい弱毒化された生のサルモネラ・チフィムリウムには、ＳＬ７２０７などのＡｒｏＡ−株又はＲＥ８８などの二重に弱毒化されたＡｒｏＡ−、ｄａｍ−株が含まれる。二重に弱毒化されたＡｒｏＡ−、ｄａｍ−サルモネラ・チフィムリウムは、特に好ましいベクターである。
【００５０】
外来ＤＮＡ構築物で生の細菌ベクターを形質転換する方法は、本分野において十分に記載されている。例えば、「Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｗ． Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ）」を参照されたい。形質転換後、細菌が複製するにつれて、生物の固有のＤＮＡとともに外来ＤＮＡが複製されるように、外来性遺伝物質は細菌の遺伝物質中に取り込まれる。従って、一旦細菌が形質転換されたら、生物の正常な複製プロセスが外来ＤＮＡの即座の供給を提供する。
【００５１】
好ましいウイルスベクターには、バクテリオファージ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、シンドビスウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス及びトリポックスが含まれる。外来ＤＮＡ構築物でウイルスベクターを形質転換する方法も、本分野において十分に記載されている。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌを参照されたい。
【００５２】
有用なリポソーム担体ビヒクルは、親油性物質及び内部水性部分から形成される膜部分を有する単層又は多層小胞である。標的細胞に送達されるべきポリヌクレオチド物質を含有するために、本発明では、水性部分が使用される。リポソーム形成物質は、四級アンモニウム基などの陽イオン性基と及び約６から約３０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アルキル基などの１つ又はそれ以上の親油性基とを有することが一般に好ましい。適切な物質の一つの群が欧州特許公開０１８７７０２に記載されており、Ｗｏｌｆｆらに付与された米国特許第６，２２８，８４４号にさらに論述されている（これらの関連する開示内容は、参照により組み込まれる。）。他の多くの適切なリポソーム形成陽イオン性脂質化合物が文献中に記載されている。例えば、「Ｌ．Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８８；２７：３９１７−３９２５」及び「Ｈ．Ｅｉｂｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７９；１０：２６１−２７１」を参照されたい。あるいは、ポリラクチド−コグリコリド生物分解性小球体などの小球体を使用することができる。本分野において公知であるように、核酸を組織に送達するために、核酸構築物はリポソーム若しくは小球体で封入され又はその他複合体化される。
【００５３】
他の有用な担体ビヒクルには、「Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００４；３（３）：１９０−６，Ｅｐｕｂ ２００４ Ｆｅｂ．１５」（その関連する開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。）によって記載されているように、生分解性ポリ（オルトエステル）材料を含むポリマー性小球体が含まれる。
【００５４】
好ましくは、本発明のための組成物は、ヒトＦＡＰ又はその機能的相同体をコードするＤＮＡ構築物を含む。ＦＡＰの機能的相同体は、好ましくは、ヒトＦＡＰに対して少なくとも約８０％のアミノ酸残基配列類似性を有し、より好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列類似性を有する。
【００５５】
ＧｅｎＢａｎｋは、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の遺伝子配列データベースであり、これは、公的に入手可能な全てのＤＮＡ配列に注釈を付けて収集したものである。ＧｅｎＢａｎｋは、ＤＮＡ ＤａｔａＢａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎＢａｎｋの協力によるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎの一部である。
【００５６】
ヒトＦＡＰをコードするｃＤＮＡの核酸配列、配列番号１（図７）は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＢＣ０２６２５０で公開されており、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＦＡＰの対応するアミノ酸残基配列は、配列番号２である（図８）。
【００５７】
マウスＦＡＰをコードするＤＮＡの核酸配列、配列番号３（図９）は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＢＣ０１９１９０で公開されており、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。マウスＦＡＰの対応するアミノ酸残基配列は配列番号４である（図１０）。
【００５８】
遺伝子コードの固有の縮重のために、本発明の実施において、ヒトＦＡＰに対するアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を使用することができる。このようなＤＮＡ配列には、ヒトＦＡＰにもハイブリッド形成することができるＤＮＡ配列が含まれる。
【００５９】
本発明において使用することができる、ヒトＦＡＰをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１中のヌクレオチド残基に対して異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を有する核酸を含み、該核酸は同じＦＡＰ遺伝子産物をコードする配列をもたらす。ヒトＦＡＰの機能的に等価な相同体をコードするＤＮＡ分子も、本発明のＤＮＡ組成物中に使用することができる。
【００６０】
核酸によってコードされる遺伝子産物は、サイレントな変化をもたらし、従って、機能的に等価なＦＡＰを産生するアミノ酸残基の欠失、付加又は置換も、ＦＡＰアミノ酸残基配列内に含有し得る。このようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性に基づいて為され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に帯電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ、類似の疎水性値を有する非帯電極性頭部基を有するアミノ酸には、以下のもの、すなわち、ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシンが含まれる。本明細書において使用される、機能的に等価なＦＡＰは、Ｔ細胞によって認識された際に、これらの同じＴ細胞がＦＡＰ発現細胞上に提示されたＦＡＰエピトープを認識できるようにする１つ又はそれ以上のエピトープを含むタンパク質を表す。好ましい実施形態において、機能的に等価なＦＡＰは、ヒトＦＡＰのアミノ酸残基配列（配列番号２）と少なくとも約８０％の配列類似性、例えば、ヒトＦＡＰに対して少なくとも９０％の配列類似性又は少なくとも約９５％の配列類似性を有するアミノ酸残基配列を有する。
【００６１】
ＦＡＰ遺伝子産物のプロセッシング及び発現を修飾する変化などの（但し、これに限定されない）様々な目的のために、（元来のＦＡＰｃＤＮＡ、配列番号１と比べて）ＦＡＰコード配列を変化させるために、ＦＡＰをコードするＤＮＡ構築物を操作することができる。例えば、新たな認識部位を挿入するために、グリコシル化パターン、リン酸化などを変化させるために、本分野において周知の技術、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて、ＤＮＡ中に変異を導入し得る。
【００６２】
好ましい一実施形態において、本発明のＤＮＡ組成物は、ＦＡＰをコードするＤＮＡ構築物及び少なくとも１つの免疫エフェクタータンパク質を操作可能にコードするＤＮＡ構築物を含み、両構築物は免疫細胞中において発現可能である。本明細書において及び添付の特許請求の範囲において使用される「免疫エフェクタータンパク質」という用語は、免疫系経路の制御に関与するタンパク質を意味する。好ましくは、免疫エフェクタータンパク質はサイトカインである。
【００６３】
サイトカインは、細胞増殖、細胞分化、免疫応答の制御、造血及び炎症応答など、他の細胞の挙動に影響を与えることができる、細胞によって産生されるタンパク質及びポリペプチドである。サイトカインは、ケモカイン、ヘマトポエチン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子及び割り当てられていない様々な分子を含む多数のファミリーに分類されてきた。一般に、「Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００」及び「Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｍ．Ｗａｌｐｏｒｔ ａｎｄ Ｍ．Ｓｃｈｌｏｍｃｈｉｋ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００１」（以下、「Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ」）を参照されたい。サイトカインの正確な分類は、「Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩＩ，ページ６７７−６７９」（その関連する開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００６４】
ヘマトポエチンには、例えば、エリスロポエチン、インターロイキン−２（ＩＬ−２、Ｔ細胞によって産生され、Ｔ細胞増殖に関与する１３３アミノ酸タンパク質）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５（腸の上皮、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激する１１４アミノ酸のＩＬ−２様タンパク質）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）が含まれる。
【００６５】
インターフェロンには、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ（Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって産生される１４３アミノ酸のホモ二量体タンパク質であり、マクロファージの活性化、ＭＨＣ分子の増加した発現及び抗原プロセッシング成分、ＩＧクラスのスイッチング並びにＴＨ２の抑制）に関与している。）が含まれる。
【００６６】
免疫グロブリンには、例えば、Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）が含まれ、何れもＴ細胞応答を共同刺激する。
【００６７】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーには、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン）、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ｔｒａｉｌ及びＯＰＧリガンドが含まれる。
【００６８】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の生物学的な役割、特に、Ｔ細胞活性化の共同刺激の間における、抗原提示細胞上に発現されたＣＤ４０とのその相互作用は、本分野において周知である。ＣＤ４０は、全ての成熟したＢ細胞、殆どの成熟したＢ細胞悪性腫瘍及び幾つかの初期のＢ細胞急性リンパ球性白血病の表面上に発現される４８ｋＤａの糖タンパク質であるが、形質細胞上には発現されない（Ｃｌａｒｋ， Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ １９９０，３５：３３−３６）。約３５ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質であるＣＤ４０Ｌは、抗原認識の際に、Ｔ細胞の表面上に発現される。ＴＮＦファミリーのメンバーは、ホモ三量体として発現される場合に、最も生物学的に活性が高い。ＣＤ４０Ｌは、この点に関して例外がなく、このリガンドの完全な細胞外ドメインのＮ末端に融合された３３アミノ酸のロイシンジッパーモチーフの修飾により、ホモ三量体（ＣＤ４０ＬＴ）として発現され得る。高度に免疫原性のモデル抗原β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡでマウスを処理した場合に、ＣＤ４０ＬＴＤＮＡは、ＩＦＮ−γ及び細胞溶解性Ｔ細胞活性の誘導などの細胞性免疫応答を増強することが、「Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６１：４５６３」によって報告されている。
【００６９】
ＣＤ４０ＬＴは、腫瘍自己抗原に対する効果的な防御免疫を誘導するのに必要なＴ細胞の活性化における重要な因子である。抗原が搭載されたＭＨＣクラスＩ複合体が、一旦、樹状細胞（ＤＣ）によって取り込まれ、ナイーブＴ細胞に提示されると、最初の抗原シグナルがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して送達され、続いて、ＣＤ４０ＬＴが上方制御される。Ｔ細胞表面上で、ＣＤ４０ＬＴは、次いで、ＣＤ４０−ＣＤ４０ＬＴ相互作用を介して、ＤＣに対して共同刺激活性を誘導する。このようにして抗原刺激されて、これらのＡＰＣは、共同刺激分子Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）を発現することができ、これらはＣＤ２８との相互作用を介して、第二の共同刺激シグナルをＴ細胞に送信する（炎症促進性のサイトカインＩＮＦ−γ及びＩＬ１２を同時に産生するために、及びエフェクター機能を実施するために、Ｔ細胞の完全な活性化をもたらす現象）。
【００７０】
特定のファミリーに割り当てられない様々なサイトカインには、例えば、腫瘍増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ナチュラルキラー細胞刺激因子；ＮＫ細胞の活性化及びＴＨ１様細胞へのＴ細胞の分化の誘導に関与する１９７アミノ酸鎖及び３０６アミノ酸鎖を有するヘテロ二量体）、マクロファージ阻止因子（ＭＩＦ）、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７（上皮、内皮及び繊維芽細胞中でのサイトカイン産生を誘導するサイトカイン産生誘導因子）及びＩＬ−１８が含まれる。
【００７１】
ケモカインは、白血球（例えば、貪食細胞及びリンパ球）の遊走など、様々な細胞の遊走及び活性化を刺激する、比較的小さな化学誘引性タンパク質及びポリペプチドであるサイトカインのファミリーである。ケモカインは、炎症及び他の免疫応答において役割を果たしている。ケモカインは、Ｃケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ３Ｃケモカインを含む多数のファミリーに分類されてきた。名前は、分子中のシステイン（Ｃ）残基の数及び間隔を表す。Ｃケモカインは１つのシステインを有し、ＣＣケモカインは２つの隣接するシステインを有し、ＣＸＣケモカインは単一のアミノ酸残基によって隔てられた２つのシステインを有し、ＣＸ３Ｃケモカインは３つのアミノ酸残基によって隔てられた２つのシステインを有する。ケモカインは、細胞表面上に存在する多数のケモカイン受容体と相互作用する。「Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ， Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＶ，ページ６８０」（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
【００７２】
さらに、ケモカインは免疫調節活性を有することができ、癌に対する免疫応答に関与していると推測されている。例えば、ヒト二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）のマウス類縁体であるマウス６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（現在、一般にＣＣＬ２１と称されている。）は、Ｃ２６大腸癌腫瘍細胞株中で抗腫瘍応答を誘導することが報告されている。「Ｖｉｃａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６５（４）：１９９２−２０００」を参照されたい。ヒトＣＣＬ２１及びそのマウス対応物である６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣは、ＣＣＲ７ケモカイン受容体と相互作用するＣＣケモカインとして分類されている。マウス６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（ｍｕＣＣＬ２１）は、Ｖｉｃａｒｉらによって、ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体に対するリガンドであることも報告されている。ヒトＣＣＬ２１、マウスｍｕＣＣＬ２１及び様々な他のケモカインは、樹状細胞、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの様々な免疫系細胞の制御に関与していると推定されている。
【００７３】
Ｍｉｇ及びＩＰ−１０は、活性化されたＴ細胞と関連するＣＸＣＲ３受容体と相互作用するＣＸＣケモカインである。リンホタクチンは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞と関連するＸＣＲ１受容体と相互作用するＣケモカインである。フラクタルキンは、Ｔ細胞、単球及び好中球と関連するＣＸ３ＣＲ１受容体と相互作用するＣＸ３Ｃケモカインである。
【００７４】
本発明のＤＮＡ組成物によってコードされるべき特に好ましい免疫エフェクタータンパク質には、サイトカインＩＬ−２（ヘマトポエチン）、ＣＣＬ２１（ケモカイン）及びＣＤ４０リガンド三量体（ＣＤ４０ＬＴ）などのＣＤ４０リガンド、ＴＮＦファミリーサイトカインが含まれる。
【００７５】
ヒトＩＬ−２に対するＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＢＣ０７０３３８に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。マウスＩＬ−２に対するＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ ００８３６６に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００７６】
ヒトＩＬ−２をコードする核酸配列は図１１に示されており（配列番号５）、その対応するアミノ酸残基配列（配列番号６）は図１２に与えられている。マウスＩＬ−２をコードする核酸配列は図１３に示されており（配列番号７）、その対応するアミノ酸配列（配列番号８）は図１４に与えられている。
【００７７】
ヒトＣＣＬ２１に対するＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＢ００２４０９に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれている。マウスＣＣＬ２Ｉａ変異体のＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ０１１３３５に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。マウスＣＣＬ２１ｂ変異体のＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ０１１１２４に公開されており、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００７８】
ヒトＣＣＬ２１をコードする核酸配列は図１５に示されており（配列番号９）、その対応するアミノ酸残基配列（配列番号１０）は図１６に与えられている。マウスＣＣＬ２１（ＣＣＬ２１ｂ変異体）をコードする核酸配列は図１７に与えられており（配列番号１１）、その対応するアミノ酸配列（配列番号１２）は図１８に与えられている。
【００７９】
ヒトＣＣＬ２１とそのマウス対応物（マウスＣＣＬ２１ｂ）間のタンパク質配列類似性は、図１９に示されている。ヒトＣＣＬ２１（配列番号１０）及びマウスＣＣＬ２１ｂ（配列番号１２）間には、約７３％のアミノ酸残基配列同一性が存在する。
【００８０】
マウスＣＣＬ２１のＣＣＬ２１ａ変異体をコードする核酸配列は図２０に示されており（配列番号１３）、その対応するアミノ酸残基配列（配列番号１４）は図２１に与えられている。
【００８１】
ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は２６１アミノ酸のタンパク質であり、その最も活性が高い形態において三量体（ＣＤ４０ＬＴ）として存在する。ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４としても知られる。）をコードするＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ００００７４で公開されており、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる（図２２、配列番号１５）。ＣＤ４０Ｌの対応するタンパク質配列は図２３に示されている（配列番号１６）。
【００８２】
本発明の方法の態様は、ＦＡＰをコードし、哺乳動物の免疫細胞中で発現可能であるＤＮＡ構築物を含むＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与することを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。組成物は、組成物が調製される具体的な剤形に応じて、経口、筋肉内、鼻内、腹腔内、皮下、皮内又は局所投与することができる。好ましくは、組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、カプセル、錠剤などの経口投与可能な剤形で調製される。
【００８３】
本発明のＤＮＡ組成物は、組成物で処理された患者中での腫瘍増殖及び／又は腫瘍転移の長期阻害を与えるために使用することができる。好ましい実施形態において、ＤＮＡ組成物は、抗腫瘍化学療法剤と組み合わせて投与される。ＤＮＡ組成物は、組み合わされた剤形中で化学療法剤と一緒に投与することが可能であり、又は組成物及び化学療法剤は、別個の剤形で、及び投与されている化学療法剤の薬理学に適合された隔てられた投薬間隔で投与することが可能である。
【００８４】
本発明のＤＮＡ組成物と組み合わせるのに有用な化学療法剤には、ドキソルビシン、パクリタキセル、シクロホスファミド、エトポシド、５−フルオロウラシル、メトトレキサートなどの抗腫瘍剤が含まれる。
【００８５】
本発明のＤＮＡ組成物は、組成物の調合及び投与を補助するために、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロールなど及びこれらの組み合わせなどの医薬として許容される担体又は賦形剤とともに好ましく調合される。組成物は、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤及び医薬分野において周知である他の補助物質などの補助物質も含有することが可能である。
【００８６】
本発明の組成物は、医薬として許容される担体中の溶液又は懸濁液として、ＦＡＰをコードするＤＮＡの重量を基礎として約１から約１０μｇ／ｍＬの範囲のＤＮＡ濃度で、ヒトなどの哺乳動物に好ましく経口投与される。本発明のＤＮＡ組成物に対する特に好ましい剤形は、適切な緩衝溶液中の弱毒化されたＦＡＰ形質移入された細菌の懸濁液であり、これは経口投与のために調合することができる。組成物の適切な投薬量は、処理されるべき対象、組成物の活性、及び１つには、組成物を投与し、又は組成物の投与を要請する医療従事者の判断に依存する。
【００８７】
哺乳動物に投与されるべき投薬量及び２回以上の投与が使用される場合には、投与のスケジュールは、哺乳類ごとに及び剤形に応じて変動する。有効な投薬量及び投与スケジュールは、本分野において周知であるように、臨床的な用量応答研究を通じて経験的に決定することができる。ＦＡＰ抗原を提示する細胞に対する哺乳動物中の免疫応答を惹起するために、免疫細胞中にＦＡＰ発現の十分な量を与えるように、投薬量及び投薬スケジュールが選択される。好ましくは、対象哺乳動物に投与される組成物の投薬量は、少なくとも１ヶ月、例えば少なくとも６ヶ月又は少なくとも約１年の期間にわたって継続するＦＡＰ提示細胞に対する免疫応答を持続するために、哺乳動物の免疫細胞中でＦＡＰ抗原の十分な量の発現を惹起する。
【００８８】
本発明の組成物は、アンプル、瓶又はバイアルなどの適切に滅菌された溶液中に、複数投薬形態又は単位投薬形態の何れかで梱包することができる。容器は、本発明のＤＮＡ組成物が充填された後に好ましくは密閉される。好ましくは、組成物は、ラベルが貼付された容器中に梱包され、該ラベルは組成物を特定し、適切な法律に基づく組成物の承認を反映する米国食品医薬品局などの政府関連機関によって規定された形態の通知、投薬情報などを有する。ラベルは、好ましくは、患者に組成物を投与する医療専門家に対して有用である組成物についての情報を含有する。パッケージは、組成物の投与、指示、適応症及び必要とされる何らかの必要な警告に関連する印刷された情報資料も好ましくは含有する。
【００８９】
以下の実施例は、本発明の特徴及び実施形態をさらに例示するために提供されており、限定を意図するものではない。
【００９０】
材料、方法及び実施例
動物、細菌株及び細胞株。６から８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＴＳＲＩ）Ｒｏｄｅｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した。全ての動物実験は、国立衛生研究所の動物実験の世話及び使用に関する指針に従って行われ、ＴＳＲＩ動物実験委員会によって承認された。二重弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウム株ＲＥ８８（ＡｒｏＡ−ｄａｍ−）は、Ｒｅｍｅｄｙｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供された。マウスＤ２Ｆ２乳癌細胞は、Ｄｒ．Ｗｅｉ−ＺｅｎＷｅｉ，Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩから入手し、ＣＴ２６大腸癌細胞はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手した後、化学耐性サブクローンを得るために数ヶ月にわたって培養した。
【００９１】
マウスＣＴ２６及びＤ２Ｆ２癌細胞は、１％ＤＭＳＯ、エトポシド、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、ビンブラスチン又はパクリタキセル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の存在下で、表記濃度で培養した。４８時間後、ＤＮＡ特異的なヘキスト３３３４２色素（２μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）との温置後に、アポトーシスを生じた核を計数した。
【００９２】
ＣＴ２６大腸癌及びＤ２Ｆ２乳癌細胞の２つのクローンは、それぞれ、化学療法耐性を獲得した（図１、パネルＣ参照）。５つの異なるアポトーシス誘導性化学療法剤をＣＴ２６大腸癌クローンに添加すると（図１、パネルＣ）、ビンブラスチンのみが僅かなアポトーシス効果を誘導することができたが、５μＭの極めて高い濃度においてのみ誘導することができた。元の親ＣＴ２６細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＬＲ−２３２６）は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対して約１．８５μＭのＩＣ５０を有していたのに対して、耐性ＣＴ２６クローンにおいては、５-ＦＵは、１００μＭの高濃度でさえ、核アポトーシスを誘導することができない。耐性Ｄ２Ｆ２乳癌細胞では、ヘキスト−３３３４２色素染色によって測定されたところによれば、１μＭの最高濃度のドキソルビシンのみが核アポトーシスを誘導することができた。これらの結果は、これらの腫瘍細胞株の何れもが多剤耐性であることを示している。
【００９３】
統計解析。実験群と対照間の異なる所見の統計的な有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって決定した。転移スコアの有意性は、ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙＵ検定によって決定した。生存データの有意性は、ログランク検定によって決定した。Ｐ値が０．０５未満であれば、所見を有意とみなした。
【実施例１】
【００９４】
マウスＦＡＰをコードするＤＮＡ組成物１の調製
真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＦＡＰ（ｐＦＡＰ）（図１、パネルＡ参照）を与えるために、マウスＦＡＰ（配列番号４、図１０）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３、図９、Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ｃｈｅｎｇから入手）をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｇｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＥｃｏＲＩ制限部位中にサブクローニングした。独力でＦＡＰを発現しない一過性に形質移入されたＣＴ２６大腸癌細胞から得た細胞可溶化液のウェスタンブロッティングによって、ベクターからの９５ｋＤａＦＡＰタンパク質の正しい発現が示された（図１、パネルＢ）。これは、一過性に形質移入されたＤ２Ｆ２乳癌細胞に対しても当てはまった。一過性の形質移入のために、以前に記載されているように、ＣＴ２６及びＤ２Ｆ２細胞に電気穿孔を行った（Ｌｏｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ，Ｊ．２００１，１５：７５８−７６７参照、参照により本明細書に組み込まれる。）。ポリクローナルウサギ抗マウスＦＡＰ抗体（Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ｃｈｅｎｇから入手）でのウェスタンブロッティングによって、ＦＡＰのタンパク質発現が示された。
【００９５】
ＤＮＡ組成物１は、以下のように調製した。製造業者の推奨される手順に従って、２ｋＶ、９６０μＦ及び２００オームでＢｉｏ−ＲａｄＰｕｌｓｅｒを用いて、調製直後の二重に弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウム（株ＲＥ８８）中に、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＡＰベクター（ｐＤＮＡ約２μｇ）を電気穿孔した。アンピシリン含有プレート上で、ベクターを含有する弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムを選択した。翌日、コロニーを拾い上げ、アンピシリンを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（脱イオン水１Ｌ中のトリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ及び塩化ナトリウム１０ｇ；ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中で一晩培養した。細菌を単離し、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。次いで、弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウム（ＡｒｏＡ−ｄａｍ−）ベクター中に取り込まれた、マウスＦＡＰを作用可能にコードするＤＮＡ構築物を含有するＤＮＡ組成物１の溶液を形成するために、ＰＢＳ１ｍＬ当たり約１０９の組み換えサルモネラの濃度で、洗浄された細菌をＰＢＳ溶媒中に懸濁した。使用するまで、組成物は、密閉されたアンプル中に保存した。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみ（ＦＡＰＤＮＡなし）で形質転換されたサルモネラからなる「対照ワクチン」も、同じ手順に従って調製した。サルモネラを形質転換する前に、約−８０℃で、プラスミドＤＮＡを保存した。
【００９６】
真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ−Ｆａｐ（ｐＦａｐ）を上記のように構築した後（図１、パネルＡ）、それ自体ＦＡＰを発現しない一過性に形質移入されたＣＴ２６大腸癌及びＤ２Ｆ２乳癌細胞の両方から得られた細胞可溶化液のウェスタンブロッティングによって、８８ｋＤａのＦＡＰタンパク質の正しい発現が示された（図１、パネルＢ）。
【実施例２】
【００９７】
マウスＦＡＰ、マウスＩＬ−２及びマウスＣＣＬ２１をコードするＤＮＡ組成物２の調製
ＡＴＣＣ受託番号３９８９２、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから得たマウスＩＬ−２をコードするｃＤＮＡ（ＤＮＡ配列番号５）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得たマウスＣＣＬ２１ａをコードするｃＤＮＡ（ＤＮＡ配列番号７）を、実施例１に記載されている同じ一般的手順によって、実施例１のマウスｐＦＡＰベクター中にサブクローニングした。弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムベクター中に取り込まれた、マウスＦＡＰ、マウスＩＬ−２及びマウスＣＣＬ２１ａを作用可能にコードするＤＮＡ構築物を含有するＤＮＡ組成物２の溶液を与えるために、実施例１に記載された手順によって、得られたベクター（ｐＦＡＰ／ＩＬ−２／ＣＣＬ２１）でＲＥ８８サルモネラ・チフィムリウムを形質転換した。
【実施例３】
【００９８】
大腸癌及び乳癌のマウスモデルでの本発明のＤＮＡ組成物の評価。
【００９９】
経口免疫化、腫瘍細胞攻撃誘発及びドキソルビシンでの処理。予防的設定での実験のために、「Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００２，８：１３６９−１３７５」に記載されている方法によって、マウスＦＡＰ（実施例１のＤＮＡ組成物１）、マウスＦＡＰ、ＩＬ−２及びＣＣＬ２１（実施例２のＤＮＡ組成物２）又は実施例１の対照ワクチンをコードするプラスミドベクターで形質転換された約１０９のＳ．チフィムリウム（ＡｒｏＡ−ｄａｍ−）を含有するＰＢＳ約１００μＬで、強制経口投与により、約１週の間隔を置いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）を３回処理した。左前脇腹中への約３×１０４のＣＴ２６大腸癌細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、又は下から２番目の左の乳房脂肪体中への約３×１０５のＤ２Ｆ２乳癌細胞の同所性（ｏ．ｔ．）注射によって、約１０日後に、動物に攻撃誘発を行った。
【０１００】
二次元（すなわち、長さと幅、ｍｍで）腫瘍を測定し、長さの半分×幅の２乗として容積を計算することによって、腫瘍容積（ｍｍ３で）を計算した。治療的設定では、約１×１０５のＣＴ２６大腸癌細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって最初の腫瘍細胞接種を行い、続いて、約３日後及び１０日後に、対照ワクチン又は活性なＤＮＡ組成物での経口ワクチン接種を行った。約１８日後に、肺を秤量し（正常な肺重量は約０．２ｇであった。）、肺の腫瘍転移を調べ、融合された転移によって覆われた肺表面のパーセントを評価する視覚的評価によって、以下のようにスコア付けした。０％の被覆に対しては０のスコア、約２０％未満の被覆に対しては１のスコア、約２０から５０％の被覆に対しては２のスコア、肺表面の約５０％超の被覆に対しては３のスコア。腫瘍攻撃誘発から５、１０及び１５日後に、約１０ｍｇ／ｋｇドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）を静脈内投与したマウスの群において、ドキソルビシンでの処理を行った。
【０１０１】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞亜集団を枯渇するために、腫瘍細胞攻撃誘発の１日前から開始し、７日ごとに、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）又はＣＤ８（クローン２．４３）に対する抗体（５００μｇ）（何れも、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から入手）又は抗アシアロＧＭ１抗体（Ｗａｋｏ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｔ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を腹腔内注射した。
【０１０２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性。１週間隔での３回の処理の最終処理から約１０日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）の様々な被処理群から得た脾細胞を集めた。ＣＤ８ａ−マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってＣＤ８＋細胞を精製した。次いで、５日の共培養中で、これらの細胞を刺激し、γ線照射された（１０００Ｇｙ、４５分）ＣＴ２６細胞をｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（実施例１の空のベクター）又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＦＡＰ（実施例１のｐＦＡＰベクター）の何れかで一過性に形質移入した。その後、対照としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＰＥＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又はＧＦＰ＋マウスＦＡＰをコードするｐＦＡＰプラスミドの何れかで一過性に形質移入されたＣＴ２６癌細胞とともに、ＣＤ８＋Ｔ細胞を共培養した（Ｅ：Ｔ＝１００：１）。約４８時間後、ＤＮＡ特異的なヘキスト３３３４２色素（２μＭ）を用いて、核アポトーシスを上記のように評価した。
【０１０３】
５１Ｃｒ放出アッセイのために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）を、１週間間隔で４回処理した。最後の処理から１３日後に、脾細胞を採取し、レトロウイルスによってｐＦａｐを感染させた、γ線照射された（約１０００Ｇｙ、４５分）Ａ３１繊維芽細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）とともに、５日間温置した。次いで、刺激された脾細胞を、標識されたＡ３１−ｐＦａｐとともに約４時間温置し、溶解のパーセントを計算した。約１０μｇ／ｍＬの濃度の抗ＭＨＣクラスＩ抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）とも、細胞を共温置した。
【０１０４】
免疫組織化学。凍結切片（約８μｍ厚）をアセトン中に固定し、染色した。一次抗体（ポリクローナルウサギ抗マウスＦＡＰ抗体（Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ｃｈｅｎｇから入手）又はポリクローナルウサギ抗マウスＩ型コラーゲン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の何れか）との温置後、製造業者のプロトコール（ＤＡＫＯ ＬＳＡＢ＋Ｋｉｔ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に従って、切片を免疫染色した。
【０１０５】
焦点顕微鏡のために、固定された凍結切片を抗マウスＣＤ８抗体、ビオチン化された抗ラットＩｇ二次抗体、ＦＩＴＣ標識されたストレプトアビジン（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で染色し、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で共染色した。画像を得るためにレーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）を使用し、ＺｅｉｓｓＩｍａｇｅＥｘａｍｉｎｅｒソフトウェア（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を用いて画像を処理した。Ｔ細胞浸潤のＦＡＣＳ分析のために、ｐＦａｐ又は空のベクターの何れかを用いて、１週間隔で、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６）を３回処理した。最後の処理から１週後、約３×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を用いて、動物の皮下に攻撃誘発を行った。３週後に腫瘍を採取し、コラーゲナーゼＩ型（１２５Ｕ／ｍＩ；ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が補充された溶媒中で４５分間、スライスされた腫瘍組織を温置することによって、単一細胞懸濁液を調製した。ろ過後、２匹のマウスの細胞をプールし、抗ＣＤ３＋ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５及び抗ＣＤ８＋ＦＩＴＣ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。
【０１０６】
フルオレセイン、エバンスブルーアルブミン及び１４Ｃ−５−フルオロウラシルの腫瘍内取り込み。対照ワクチン（実施例１）、ＤＮＡ組成物１（実施例１）又はＤＮＡ組成物２（実施例２）の何れかによる１週間隔での３回の処理の最終処理後、左前脇腹中に約３×１０４個のＣＴ２６細胞を皮下注射することによって、１０日後にマウスを攻撃誘発した。その約１９日後に、約１２μＬ／ｇ体重の１％フルオレセインナトリウム（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内（ｉｐ．）注射、エバンスブルーアルブミン（Ｓｉｇｍａ）約１００μＬの静脈内注射又は１４Ｃ−５−フルオロウラシル（Ｓｉｇｍａ）約２．５μＣｉの静脈内注射の何れかをマウスに施した。それぞれ、４９０ｎｍ、６１２ｎｍで又はγカウンター中で腫瘍ホモジネートの上清の吸収又はシンチレーションを測定するために、それぞれ、約５分、３０分又は１時間後に、マウスを屠殺した。
【０１０７】
腫瘍内ドキソルビシンの取り込みを測定するために、右脇腹中に、約５×１０５のＤ２Ｆ２細胞で、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）の皮下に攻撃誘発を行った。１６日後に、ドキソルビシンを静脈内注射し（１０ｍｇ／ｋｇ）、注射から４５分後に腫瘍を採取した。１１００シリーズＬＣ−ＭＳ上のＥｃｌｉｐｓｅＸＣＢ−Ｃ８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、内部標準ダウノルビシンに対して試料を測定した。
【０１０８】
可能性がある副作用の評価。創傷治癒に対するあらゆる有害な効果を測定するために、マウスを外科的に負傷させた。１週間隔での３回の処理の最終処理から約１０日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）の背中上部に、皮膚穴開けばさみ（Ｍｉｌｔｅｘ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｐａｇｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いて、直径約３ｍｍの円形の傷をつけた。創縫合に必要とされる時間を測定した。創傷治癒の間にＦＡＰが過剰発現されるという事実にかかわらず、本発明の組成物は創傷治癒プロセスを妨害しない。処理されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）の背中に直径約３ｍｍの円形の傷を与えた後、処理されたマウスと処理されていないマウスの間で、創傷治癒には有意差は観察されなかった。組織学的分析のために、検査の７日、１４日、２１日前に、処理されたマウスに対して創傷を与えた。マウス病理学者によって、皮膚生検並びに２６の臓器及び組織が検査された。
【０１０９】
ＦＡＰをベースとするＤＮＡ組成物での予防的処置は、原発性腫瘍増殖を阻害する。対照ワクチン（実施例１）、ＤＮＡ組成物１（実施例１）又はＤＮＡ組成物２（実施例２）の何れかによる１週間隔での３回の処理の最終処理から１０日後に、上述のように、ＣＴ２６大腸癌細胞を用いて皮下に、又はＤ２Ｆ２乳癌細胞を用いて正所性に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの異なる群（ｎ＝８）に攻撃誘発を行った。本発明のＤＮＡ組成物は、多剤耐性ＣＴ２６細胞（図２ａ）及び耐性Ｄ２Ｆ２細胞（図２ｂ）の原発性腫瘍増殖を抑制した。ＦＡＰ、ＣＣＬ２１及びＩＬ−２の組み合わせをコードするＤＮＡ組成物２は、原発性腫瘍増殖を阻害する上で概ね等しく効果的であった（図２ａ）。
【０１１０】
本発明のＤＮＡ組成物は、治療的設定において、確立された転移の増殖を低下させる。約１×１０５のＣＴ２６大腸癌細胞での最初の静脈内接種から３日後及び１０日後に、実施例１のＤＮＡ組成物１で処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、実施例１の対照ワクチンで処理されたマウスと比べて、実験的な肺転移の著しい低下をもたらした。これに対して、対照群中のマウスは大規模な転移を呈し、腫瘍細胞接種から１８日後に死亡し始めた（図２ｃ）。同様に、ｐＣＣＬ２１のみとｐＦＡＰの組み合わせも、概ね等しく効果的であった（図２ｂ）。
【０１１１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、効果的な抗腫瘍免疫応答を与える。ＤＮＡ組成物１（実施例１）で、１週間隔で３回、マウスを静脈内処理し、約１×１０５のＣＴ２６細胞で攻撃誘発した。次いで、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞（図３、パネルＡ）に対する抗体を用いて、エフェクター相の間に、マウスからそれらの各エフェクター細胞を枯渇させた。ＣＤ４＋細胞及びＮＫ細胞の枯渇はｐＦＡＰ処理の有効性を減少させず、免疫応答におけるＣＤ８＋Ｔ細胞に対する重要な役割を示唆している。
【０１１２】
本発明のＦＡＰＤＮＡ組成物での処理がＦＡＰ自己抗原に対する末梢Ｔ細胞耐性を破壊することができる程度を評価するために、ｐＦＡＰで形質移入された細菌又は空のベクターで処理された動物から得られたＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。次いで、γ照射された腫瘍標的細胞でこれらの細胞を刺激し、対照としてのＧＦＰ又はＧＦＰ／ｐＦａｐの何れかで一過性に形質移入された生の腫瘍標的細胞とともに温置した。図３、パネルＢに示されているように、ヘキスト３３３４２色素でのｐＦａｐ形質移入された標的細胞の染色によって評価されたところによれば、ｐＦａｐで処理されたマウスから精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞のみが核のアポトーシスを誘導することができた。
【０１１３】
慣用の５１Ｃｒ放出アッセイでは、処理されたマウスの脾細胞も使用した。この目的のために、組成物１及び対照ワクチンで処理されたマウスから得られた脾細胞を、レトロウイルスによってｐＦａｐに感染させた、γ照射されたＡ３１繊維芽細胞とともに５日間温置した。次いで、刺激された脾細胞を、標識されたＡ３１−ｐＦａｐ細胞とともに４時間温置し、溶解のパーセントを計算した。組成物１で処理されたマウスから得た脾細胞は、１：１００と１：２５の標的対エフェクター比で、空のベクター対照から得られたものより、有意により多くの繊維芽細胞を溶解することができた（図３、パネルＣ）。抗ＭＨＣクラスＩ抗体との共温置は、この効果を消滅させた（図３、パネルＤ）。
【０１１４】
さらなる評価において、組成物１又は対照ワクチンの何れかで、マウスを３回処理し、次いで、ｐＦａｐ処理されたマウスの腫瘍内でのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を調べるために、約３×１０４のＣＴ２６腫瘍細胞で攻撃誘発した。３週後に、腫瘍を採取し、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋細胞に関して、単一細胞懸濁液を染色し、ＦＡＣＳによって分析した。組成物１で処理されたマウスは、空のベクター対照と比べた場合、腫瘍組織中のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の顕著な増加を示した（図３、パネルＥ）。
【０１１５】
腫瘍切片は、抗ＣＤ８ＦＩＴＣ及びＤＡＰＩ核染色でも染色した。共焦点顕微鏡を用いて、組成物１で処理されたマウスの腫瘍は、実施例１の対照ワクチンで処理されたマウスより多くの、ＣＤ８＋細胞による顕著な浸潤を示した（図３、パネルＦ）。総合すると、これらの知見は、ＦＡＰを標的とする本発明のＤＮＡ組成物は、ＦＡＰ自己抗原に対する末梢Ｔ細胞耐性を克服できることを示している。
【０１１６】
Ｉ型コラーゲン発現の抑制は腫瘍内色素取り込みを増加させる。繊維芽細胞はＩ型コラーゲンの主要な源であり、この分子の発現は様々な分子量の化合物の腫瘍内取り込みと逆相関することが報告されている。この同じ機序が本発明のＤＮＡ組成物に対しても当てはまるかどうかを評価するために、処理されたマウスの腫瘍切片を、ＦＡＰに対する抗体（図４、パネルＡ、上の写真）又はＩ型コラーゲンに対する抗体（図４、パネルＡ、下の写真）で染色した。対照ワクチン（実施例１）のみで処理されたマウスと比べて、組成物１で処理されたマウスの群において、ＦＡＰ及びＩ型コラーゲンの発現の減少が検出された。これらの腫瘍抽出物の対応するウェスタンブロットは同じ抗体で染色され、ＦＡＰ発現の約８２．６３＋／−２．５４％の減少（図４、パネルＢ、上の写真）及びＩ型コラーゲンの約７６．３６＋／−２．０１％の減少（図４、パネルＢ、下の写真）を明らかにした。
【０１１７】
次いで、サイズ及び構造が異なる３つの化合物、すなわち、上記のように、フルオレセイン（３７６Ｄａ）（図４、パネルＣ）、エバンスブルーアルブミン（６８，５００Ｄａ）（図４、パネルＤ）又は化学療法剤５−フルオロウラシル（１３０Ｄａ）（図４、パネルＥ）をマウスに注射した。ｐＦａｐＤＮＡ組成物１で処理されたマウスの腫瘍は、対照ワクチンを投与されたマウスの腫瘍より、これらの各分子を有意に多く（ｐ＜０．０５）取り込んだ。
【０１１８】
ＤＮＡ組成物と化学療法の組み合わせは、腫瘍拒絶をもたらす。本発明のＤＮＡ組成物での処理を、Ｄ２Ｆ２細胞が部分的に感受性である化学療法剤ドキソルビシンと組み合わせる治療用プロトコールを開発した（図１、パネルＣ）。実施例１の対照ワクチン又は実施例１の組成物で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）を処理した。次いで、処理されたマウスを、Ｄ２Ｆ２乳癌細胞で正所性に攻撃誘発した。次いで、腫瘍攻撃誘発から５日、１０日及び１５日後に、ドキソルビシン又は対照としてのＰＢＳの何れかで、マウスのこれらの２つの群を処理した。図５、パネルＡに示されているように、免疫療法（組成物１）又は化学療法何れかでの単一の処理は腫瘍増殖を抑制できるにすぎず、腫瘍増殖を根絶することはできなかった。これに対して、組成物１及びドキソルビシンの組み合わせで処理されたマウスの群は腫瘍増殖の顕著な阻害を呈したのみならず、８匹のマウスのうち４匹で、完全な腫瘍拒絶を呈した（図５、パネルＡ）。
【０１１９】
治療的設定での別の組み合わせ療法アプローチでは、Ｄ２Ｆ２腫瘍細胞で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）の静脈内に攻撃誘発を行った。５日後に、一旦、転移が確立されたら、組成物１でマウスを毎週処理した。各処理から１日後に、ドキソルビシンをマウスに静脈内注射した。この組み合わせ処理の結果、これらのマウスの寿命は、ドキソルビシン又は組成物１のみで処理され、約３５から４５日後に既に死亡した対照マウスの寿命の３倍を超えた（図５、パネルＢ）。
【０１２０】
本発明のＦＡＰＤＮＡ組成物は、ドキソルビシンの腫瘍内取り込みを増加させる。腫瘍組織中のドキソルビシン濃度を測定するために、１週間隔で、組成物１でマウス（ｎ＝４）を３回処理し、７日後に、５×１０５のＤ２Ｆ２腫瘍細胞で攻撃誘発し、１６日以後に、ドキソルビシンを静脈内注射した。腫瘍内薬物濃度は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって測定した。組成物１で処理されたマウスの組織は、対照と比べて、腫瘍中のドキソルビシンの取り込みの有意な増加を示した（図６、パネルＡ）。これらの結果は、フルオレセイン、アルブミン及び５−フルオロウラシルで処理されたマウス中の腫瘍で観察された化学的浸潤と合致する（図４、パネルＣからＤ）。
【０１２１】
ＦＡＰに対するＤＮＡワクチンは、創傷治癒を損なわず又は正常組織を損傷しない。ＦＡＰは創傷治癒の間に過剰発現されるので、創傷治癒に対する本発明のＤＮＡ組成物の効果を調べた。処理されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）マウスの背中に、直径約３ｍｍの円形創傷を与えた。驚くべきことに、処理されたマウスと処理されていないマウスの間で、創傷治癒に有意差は観察されなかった（図６、パネルＢ）。異なる時点後における、マウス病理学者によるこれらの創傷の組織学的評価によって、創傷治癒プロセスに定性的な異常が存在しないことが明らかとなった。本発明のＤＮＡ組成物によって誘導された一切の自己免疫反応を除去するために、以下の組織及び臓器：皮膚、脳、脊髄、筋肉、骨、滑膜、心臓、大動脈、肺動脈、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、副甲状腺、副腎、腎臓、子宮、膣、陰核腺、舌、肝臓、肺、膵臓、胃、小腸及び大腸の総合的な組織学的検査を実施した。対照マウスと比べて、識別可能な差は観察されなかった。
【０１２２】
本発明の新規特徴の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施形態の多数の変形及び改変を実施することができる。本明細書に例示されている具体的な実施形態に関する限定は意図されておらず、又は推測すべきでない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物（該ＤＮＡ構築物は、免疫細胞中で発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。）を含む、繊維芽細胞活性化タンパク質を発現する腫瘍間質細胞に対する免疫応答を惹起するのに有効なＤＮＡ組成物。
【請求項２】
ＤＮＡ構築物が、ヒトＦＡＰ（配列番号２）をコードし、又はヒトＦＡＰと少なくとも８０％の配列類似性を有し及びヒトＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項３】
ＤＮＡ構築物がヒトＦＡＰ（配列番号２）をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項４】
ＤＮＡ構築物が裸のＤＮＡ構築物である、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項５】
裸のＤＮＡ構築物がプラスミドの形態である、請求項４に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ構築物が弱毒化されたウイルスベクター中に取り込まれている、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項７】
ＤＮＡ構築物が弱毒化された細菌ベクター中に取り込まれている、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項８】
弱毒化された細菌ベクターが弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）である、請求項７に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項９】
ＤＮＡ構築物が、配列番号１からなるポリヌクレオチド配列を有する又は配列番号１からなるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の配列類似性を有するポリヌクレオチド配列を有する実質的に精製されたＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１０】
ＤＮＡ構築物が弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムベクター中に取り込まれている、請求項９に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１１】
免疫細胞中で発現可能な免疫エフェクタータンパク質をコードするＤＮＡ構築物をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１２】
免疫エフェクタータンパク質がサイトカインである、請求項１１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１３】
サイトカインがＣＣＬ２１、ＩＬ−２又はＣＤ４０ＬＴである、請求項１２に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１４】
繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物（該ＤＮＡ構築物は、哺乳動物の免疫細胞中で発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。）を含むＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与することを含み、前記組成物がＦＡＰ抗原を発現する前記哺乳動物中の細胞に対して免疫応答を惹起するのに十分な量で投与される、哺乳動物中の腫瘍増殖又は腫瘍転移を阻害する方法。
【請求項１５】
哺乳動物がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ構築物が弱毒化された細菌ベクター中に取り込まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
弱毒化された細菌ベクターが弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が経口的に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物（該ＤＮＡ構築物は、哺乳動物の免疫細胞中で発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。）を含むＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与する工程、並びに抗腫瘍化学療法剤の抗腫瘍有効量を前記哺乳動物にその後投与する工程を含み、前記組成物がＦＡＰ抗原を発現する前記哺乳動物中の細胞に対して免疫応答を惹起するのに十分な量で投与される、哺乳動物中の腫瘍増殖又は腫瘍転移を阻害する方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
化学療法剤がドキソルビシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＮＡ構築物が弱毒化された細菌ベクター中に取り込まれている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
弱毒化された細菌ベクターが弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
組成物が経口的に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物（該ＤＮＡ構築物は、哺乳動物の免疫細胞中で発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。）を含むＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与する工程、並びに化学療法剤の有効量を前記哺乳動物にその後投与する工程を含み、前記組成物がＦＡＰ抗原を発現する前記哺乳動物中の細胞に対して免疫応答を惹起するのに十分な量で投与される、哺乳動物中での化学療法剤の取り込みを増強する方法。
【請求項２６】
哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
化学療法剤がドキソルビシンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ構築物が弱毒化された細菌ベクター中に取り込まれている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
弱毒化された細菌ベクターが弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
組成物が経口的に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
ヒト繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物を含むプラスミドベクター。
【請求項３２】
ＤＮＡ構築物がヒトＦＡＰ（配列番号２）をコードし、又はヒトＦＡＰと少なくとも８０％の配列類似性を有し及びヒトＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質をコードする、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
免疫エフェクタータンパク質をコードするＤＮＡ構築物をさらに含む、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３４】
免疫エフェクタータンパク質がサイトカインである、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
サイトカインがＣＣＬ２１、ＩＬ−２又はＣＤ４０ＬＴである、請求項３４に記載のベクター。
【請求項１】
繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物（該ＤＮＡ構築物は、免疫細胞中で発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。）を含む、繊維芽細胞活性化タンパク質を発現する腫瘍間質細胞に対する免疫応答を惹起するのに有効なＤＮＡ組成物。
【請求項２】
ＤＮＡ構築物が、ヒトＦＡＰ（配列番号２）をコードし、又はヒトＦＡＰと少なくとも８０％の配列類似性を有し及びヒトＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項３】
ＤＮＡ構築物がヒトＦＡＰ（配列番号２）をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項４】
ＤＮＡ構築物が裸のＤＮＡ構築物である、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項５】
裸のＤＮＡ構築物がプラスミドの形態である、請求項４に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ構築物が弱毒化されたウイルスベクター中に取り込まれている、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項７】
ＤＮＡ構築物が弱毒化された細菌ベクター中に取り込まれている、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項８】
弱毒化された細菌ベクターが弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）である、請求項７に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項９】
ＤＮＡ構築物が、配列番号１からなるポリヌクレオチド配列を有する又は配列番号１からなるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の配列類似性を有するポリヌクレオチド配列を有する実質的に精製されたＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１０】
ＤＮＡ構築物が弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムベクター中に取り込まれている、請求項９に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１１】
免疫細胞中で発現可能な免疫エフェクタータンパク質をコードするＤＮＡ構築物をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１２】
免疫エフェクタータンパク質がサイトカインである、請求項１１に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１３】
サイトカインがＣＣＬ２１、ＩＬ−２又はＣＤ４０ＬＴである、請求項１２に記載のＤＮＡ組成物。
【請求項１４】
繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物（該ＤＮＡ構築物は、哺乳動物の免疫細胞中で発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。）を含むＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与することを含み、前記組成物がＦＡＰ抗原を発現する前記哺乳動物中の細胞に対して免疫応答を惹起するのに十分な量で投与される、哺乳動物中の腫瘍増殖又は腫瘍転移を阻害する方法。
【請求項１５】
哺乳動物がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ構築物が弱毒化された細菌ベクター中に取り込まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
弱毒化された細菌ベクターが弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が経口的に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物（該ＤＮＡ構築物は、哺乳動物の免疫細胞中で発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。）を含むＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与する工程、並びに抗腫瘍化学療法剤の抗腫瘍有効量を前記哺乳動物にその後投与する工程を含み、前記組成物がＦＡＰ抗原を発現する前記哺乳動物中の細胞に対して免疫応答を惹起するのに十分な量で投与される、哺乳動物中の腫瘍増殖又は腫瘍転移を阻害する方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
化学療法剤がドキソルビシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＮＡ構築物が弱毒化された細菌ベクター中に取り込まれている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
弱毒化された細菌ベクターが弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
組成物が経口的に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物（該ＤＮＡ構築物は、哺乳動物の免疫細胞中で発現可能であり、及び医薬として許容される担体中に取り込まれている。）を含むＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与する工程、並びに化学療法剤の有効量を前記哺乳動物にその後投与する工程を含み、前記組成物がＦＡＰ抗原を発現する前記哺乳動物中の細胞に対して免疫応答を惹起するのに十分な量で投与される、哺乳動物中での化学療法剤の取り込みを増強する方法。
【請求項２６】
哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
化学療法剤がドキソルビシンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ構築物が弱毒化された細菌ベクター中に取り込まれている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
弱毒化された細菌ベクターが弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
組成物が経口的に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
ヒト繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ構築物を含むプラスミドベクター。
【請求項３２】
ＤＮＡ構築物がヒトＦＡＰ（配列番号２）をコードし、又はヒトＦＡＰと少なくとも８０％の配列類似性を有し及びヒトＦＡＰの少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質をコードする、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
免疫エフェクタータンパク質をコードするＤＮＡ構築物をさらに含む、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３４】
免疫エフェクタータンパク質がサイトカインである、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
サイトカインがＣＣＬ２１、ＩＬ−２又はＣＤ４０ＬＴである、請求項３４に記載のベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２００９−５４１３２８（Ｐ２００９−５４１３２８Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１６５６８（Ｐ２００９−５１６５６８）
【出願日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１４４４０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４９５１８
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（５０１３１８９１４）ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート (23)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１４４４０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４９５１８
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（５０１３１８９１４）ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート (23)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]