薬剤−高分子結合体
本発明は、ポリペプチド部位、ポリアルキレンオキシド部位、前記ポリペプチド部位を前記ポリアルキレンオキシド部位に結合させるリンカー、前記ポリペプチド部位と前記リンカーとの間の第１の結合、および前記ポリアルキレンオキシド部位と前記リンカーとの間の第２の結合を含むポリペプチド−高分子結合体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／７５５，４５９号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の優先権を主張し、その内容は参照として本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
治療用薬剤分子の薬力学特性および薬動力学特性を改善するために、２つの大きなドラッグデリバリーのアプローチが研究されてきた。一方は、薬剤分子そのものの修飾（例えば、ペグ化によって）であり、他方は、製剤の変更（例えば、リポソーム製剤によって）である。いずれの場合も、長時間の薬理活性、副作用の低減、患者の薬剤服用順守の向上、および患者の生活の質の向上を与えるドラッグデリバリーメカニズムを開発することが望まれる。
【発明の開示】
【０００３】
概要
本発明は、治療用ポリペプチド分子が高分子とカップリングして、有効性が改善された単一の薬剤、すなわちポリペプチド−高分子結合体を形成しうるという概念に基づく。
【０００４】
一形態によれば、本発明は、ポリペプチド部位、ポリアルキレンオキシド部位、前記ポリペプチド部位を前記ポリアルキレンオキシド部位に結合させるリンカー、前記ポリペプチド部位と前記リンカーとの間の第１の結合、および前記ポリアルキレンオキシド部位と前記リンカーとの間の第２の結合を含むポリペプチド−高分子結合体を特徴とする。前記ポリペプチド部位は、ヒトインターフェロン−α部位（すなわち、インターフェロン−α活性を保持するネイティブまたは修飾された部位）および前記ヒトインターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６（例えば１〜４）のさらなるアミノ酸残基を含みうる。例えば、−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＩＦＮ、−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ、−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＩＦＮ、−Ｐｒｏ−ＩＦＮおよび−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−ＩＦＮが挙げられ、ここでＩＦＮはヒトインターフェロン−α２ｂ部位である。前記インターフェロン−α部位は、Ｎ−末端にシステイン残基を含みうる。前記ポリペプチド部位はまた、インターフェロン−β部位または顆粒球コロニー刺激因子を含んでもよい。前記ポリアルキレンオキシド部位は、１〜２０，０００のＣ１〜Ｃ８アルキレンオキシド繰り返し単位を含みうる。ポリアルキレンオキシド部位の例としては、２０，０００ダルトンの数平均分子量を有するポリエチレンオキシド部位などの、５〜１０，０００の繰り返し単位を有するポリエチレンオキシド部位が挙げられる。前記リンカーは、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、または−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−であってよく、ここでＡｒは、アリーレン（例えばフェニレン）またはヘテロアリーレンであり、ＸはＯ、ＳまたはＮ（Ｒ）であり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、ｎは１〜１０でありうる。前記第１の結合および前記第２の結合は、それぞれ独立して、カルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カルバメート、ウレア、エーテル、チオ、スルホニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネート、またはホスフェート基でありうる。上記薬剤−高分子結合体の一例は；
【０００５】
【化１】
【０００６】
であり、ここでｍＰＥＧはメトキシキャップポリエチレンオキシド部位である。
【０００７】
ポリアルキレンオキシド部位は、直鎖、分岐、または星型の部位を意味する。これは飽和であっても不飽和であってもよく、置換されていても置換されていなくてもよい。ポリアルキレンオキシド部位の例としては、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリイソプロピレンオキシド、ポリブテニレンオキシド、およびこれらの共重合体が挙げられる。デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、または炭水化物系高分子などの他の高分子もまた、抗原性、毒性、または免疫反応誘発性でないかぎり、ポリアルキレンオキシド部位に代えて用いられうる。
【０００８】
リンカーは、ポリアルキレンオキシド部位から延び、ポリペプチド部位のポリアルキレンオキシド部位へのカップリングを容易にする。
【０００９】
ポリペプチド部位は、その薬剤活性の少なくとも一部が保持されるかぎり、修飾ポリペプチド薬剤を含みうる。このような治療用ポリペプチド部位の例としては、Ｎ−末端に１以上のさらなるアミノ酸残基を含む修飾ポリペプチド分子または一次タンパク質配列内のアミノ酸残基の１以上の置換を含む修飾ポリペプチド分子が挙げられる。
【００１０】
ポリペプチド部位は、酵素作用下、インビボで（例えば加水分解を介して）ポリペプチド部位とリンカーとの間の結合またはポリアルキレンオキシド部位とリンカーとの間の結合の切断によって放出されうる。インビボの結合切断に関与する酵素の例としては、酸化酵素（例えばペルオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、またはデヒドロゲナーゼ）、還元酵素（例えばケトレダクターゼ）および加水分解酵素（例えばプロテアーゼ、エステラーゼ、スルファターゼまたはホスファターゼ）が挙げられる。本発明のポリペプチド−高分子結合体はまた、インビボでポリペプチド−ポリマー結合体から治療用ポリペプチド部位を切断することなく、有効でありうる。
【００１１】
「アルキル」の用語は、−ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２などの、一価、飽和の、直鎖または分岐の非芳香族の炭化水素部位を意味する。「アルケニル」の用語は、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３などの、少なくとも１つの二重結合を含む直鎖または分岐の炭化水素部位を意味する。「アルキニル」の用語は、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３などの、少なくとも１つの三重結合を含む直鎖または分岐の炭化水素部位を意味する。「シクロアルキル」の用語は、シクロプロピルなどの、飽和の環状の炭化水素部位を意味する。「シクロアルケニル」の用語は、シクロヘキセニルなどの、少なくとも１つの環二重結合を含む非芳香族の環状の炭化水素部位を意味する。「ヘテロシクロアルキル」の用語は、４−テトラヒドロピラニルなどの、少なくとも１つの環ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）を有する飽和の環状の部位を意味する。「ヘテロシクロアルケニル」の用語は、ピラニルなどの、少なくとも１つの環ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）および少なくとも１つの環二重結合を有する非芳香族の環状の部位を意味する。「アリール」の用語は、１以上の芳香環を有する炭化水素部位を意味する。アリール部位の例としては、フェニル（Ｐｈ）、ナフチル、ピレニル、アントリル、およびフェナントリルが挙げられる。「ヘテロアリール」の用語は、少なくとも１つの環ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）を含む、１以上の芳香環を有する部位を意味する。ヘテロアリール部位の例としては、フリル、フルオレニル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、キナゾリニル、キノリル、イソキノリル、およびインドリルが挙げられる。「アルキレン」の用語は、−ＣＨ２−などの、二価、飽和の、直鎖または分岐の非芳香族の炭化水素部位を意味する。「ヘテロアルキレン」の用語は、−ＣＨ２ＯＣＨ２−などの、少なくとも１つのヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）を有するアルキレン部位を意味する。「シクロアルキレン」の用語は、シクロへキシレンなどの、二価、飽和の、環状の炭化水素部位を意味する。「ヘテロシクロアルキレン」の用語は、４−テトラヒドロピラニレンなどの、少なくとも１つの環へテロ原子を有する、二価、飽和の、非芳香族の環状の部位を意味する。「アリーレン」の用語は、１以上の芳香環を有する二価の炭化水素部位を意味する。アリール部位の例としては、フェニレンおよびナフチレンが挙げられる。「ヘテロアリーレン」の用語は、少なくとも１つの環へテロ原子を含む、１以上の芳香環を有する２価の部位を意味する。ヘテロアリーレン部位の例としては、フリレンまたはピロリレンが挙げられる。「アラルキレン」の用語は、アリールまたはヘテロアリールで置換された二価のアルキル部位であって、１つの電子がアルキル部位上に存在し、他の電子がアリールまたはヘテロアリール上に存在する部位を意味する。アラルキレン部位の例としては、ベンジレンまたはピリジニルメチレンが挙げられる。
【００１２】
本明細書中に記載のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、へテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびアラルキレンは、置換および非置換の部位の両方を含む。シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびアラルキレンの置換基の例としては、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ２０ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、ヒドロキシ、ハロゲン、チオ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、カルボキシル、およびカルボン酸エステルが挙げられる。アルキル、アルキレン、およびヘテロアルキレンの置換基の例としては、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル以外の上記のすべての置換基が挙げられる。シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、およびヘテロアリーレンはまた、シクロアルキル、へテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールと縮合してもよい。
【００１３】
他の形態によれば、本発明は、ポリペプチド部位、ポリアルキレンオキシド部位、前記ポリペプチド部位を前記ポリアルキレンオキシド部位に結合させるリンカー、前記ポリペプチド部位と前記リンカーとの間の第１の結合、および前記ポリアルキレンオキシド部位と前記リンカーとの間の第２の結合を含むポリペプチド−高分子結合体を特徴とする。前記ポリエチレンオキシド部位は１〜２０，０００のＣ１〜Ｃ８アルキレンオキシド繰り返し単位を含みうる。前記リンカーは−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−であってよく、Ａｒはアリーレンまたはヘテロアリーレンであり、ＸはＯ、ＳまたはＮ（Ｒ）であり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、ｎは１〜１０でありうる。前記第１の結合および前記第２の結合はそれぞれ独立して、カルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カルバメート、ウレア、エーテル、チオ、スルホニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネート、またはホスフェート基でありうる。
【００１４】
他の形態によれば、本発明は、化学式（Ｉ）の化合物を特徴とする。
【００１５】
【化２】
【００１６】
化学式（Ｉ）中、ｍＰＥＧはメトキシキャップポリエチレンオキシド部位であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つはＣＨＯで置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。化学式（Ｉ）の化合物の一例は、Ｒ２またはＲ３がＣＨＯで置換されたプロピルまたはＣＨＯで置換されたブチルである化合物である。
【００１７】
他の形態によれば、本発明は、インターフェロン−α部位（例えばヒトインターフェロン−α２ｂ部位）および前記インターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を含むポリペプチドを特徴とする。例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＩＦＮ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ、Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＩＦＮ、Ｐｒｏ−ＩＦＮおよびＧｌｙ−Ｍｅｔ−ＩＦＮが挙げられ、ここでＩＦＮはヒトインターフェロン−α２ｂ部位である。前記インターフェロン−α部位はまた、野生型インターフェロン−α部位（例えば野生型ヒトインターフェロン−α２ｂ部位）でありうる。
【００１８】
他の形態によれば、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、および癌（例えばヘアリーセル白血病またはカボジ肉腫）などのさまざまな疾患の治療方法を特徴とする。前記方法は、１以上の上記ポリペプチド−高分子結合体の有効量を必要とする患者に投与することを含む。「治療する」または「治療」の用語は、１以上のポリペプチド−高分子結合体を、上記疾患、その症状、またはその傾向を有する患者に、例えば、上記疾患、その症状、もしくはその傾向の治癒、緩和、変化、作用、改善または予防などの治療効果を与える目的で投与することを意味する。
【００１９】
本発明はまた、少なくとも１つの上記ポリペプチド−高分子結合体の有効量と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物を含む。
【００２０】
上記ポリペプチド−高分子結合体は、適用できる場合、その化合物自体の他に、その塩、プロドラッグ、および溶媒和物を含む。塩は、例えば、アニオンとポリペプチド−高分子結合体上の正に荷電した基（例えばアミノ）との間に形成されうる。適当なアニオンとしては、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、クエン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、および酢酸イオンが挙げられる。同様に、塩はまた、カチオンとポリペプチド−高分子結合体上の負に荷電した基（例えばカルボキシレート）との間に形成されうる。適当なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオンなどのアンモニウムカチオンが挙げられる。プロドラッグの例としては、患者に投与されたときに活性なポリペプチド−高分子結合体を提供できる、エステルおよび他の製薬上許容される誘導体が挙げられる。溶媒和物は、活性なポリペプチド−高分子結合体と製薬上許容される溶媒との間に形成される複合体を意味する。製薬上許容される溶媒の例としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸、およびエタノールアミンが挙げられる。
【００２１】
１以上の上記ポリペプチド−高分子結合体を含む、上記のさまざまな疾患の治療に用いる組成物、および上記の治療用の薬剤の作製のためのこのような組成物の使用もまた本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明の１以上の実施形態の詳細を以下に説明する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２３】
詳細な説明
本発明は、治療用ポリペプチド部位が少なくとも１つの高分子とカップリングしたポリペプチド−高分子結合体に関する。
【００２４】
ポリペプチド−高分子結合体は、化学分野で公知の合成方法によって調製されうる。例えば、官能基（例えばフェニルアミノ基）を含むリンカー分子は、はじめに、ヒドロキシ末端基を含むメトキシキャップポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）高分子にカルバメート結合を介してカップリングされ、リンカー−高分子結合体を形成しうる。続いて、リンカー−高分子結合体の他方の末端基をアルデヒド基に変換した後、他の官能基（例えばアミノ基）を含む治療用ポリペプチド分子（例えばヒトインターフェロン−α２ｂ）が上記リンカー−高分子結合体にカップリングされうる。リンカー分子とカップリングするために、ｍＰＥＧ高分子は、スクシンイミジルエステル、ｐ−ニトロフェノール、スクシンイミジルカーボネート、トレシレート、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、ビオチン、リン脂質、またはフルオレセインなどの基で官能化されうる。他の例としては、治療用ポリペプチド分子（例えばヒトインターフェロン−α２ｂ）は、はじめに、組み換え技術によってそのＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を導入することによって修飾されうる。次いで、修飾されたヒトインターフェロン−α２ｂ分子は、一方の末端にリンカーを有するメトキシキャップポリエチレングリコール部位とカップリングされうる。カップリング反応は、リンカーを修飾して適当な官能基（例えばアルデヒド基）を形成し、次いでリンカー上の官能基を修飾ヒトインターフェロン−α２ｂ分子の官能基（例えば末端アミノ基）と反応させることによって達成されうる。
【００２５】
【化３】
【００２６】
上記のスキーム１は、上述のポリペプチド−高分子結合体の１つの調製例を示す。はじめに、４−ニトロフェノール１は、（ａ）３−クロロプロパン−１−オールを用いたヒドロキシル基のアルキル化；（ｂ）末端ヒドロキシル基のアルデヒド基への酸化；（ｃ）ジメチルアセタール基の形成によるアルデヒド基の保護；（ｄ）ニトロ基のアミノ基への還元；の４つの化学変換でリンカー分子２に変換される。次いで、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネートを用いてメトキシキャップポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）高分子をリンカー分子２とカップリングさせ、リンカー−高分子結合体３を製造する。続いて、リンカー−高分子結合体３のジメチルアセタール保護基を除去してアルデヒド基を含むリンカー−高分子結合体４を得て、その後修飾ヒトインターフェロン−α２ｂ分子であるＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮとカップリングさせてポリペプチド−高分子結合体５を生成させる。
【００２７】
上述の合成経路で用いられる化学物質には、例えば、溶媒、試薬、触媒、保護基および脱保護基の試薬が含まれうる。上述の方法は、ここで具体的に記載した段階の前または後に、最終的にポリペプチド−高分子の合成を可能にするために、適当な保護基を付加または脱離させる段階をさらに含んでもよい。さらに、各種の合成段階は、所望のポリペプチド−高分子結合体を与えるために順序を変えて行ってもよい。適用できるポリペプチド−高分子結合体の合成に有用な合成化学変換および保護基方法論（保護および脱保護）は、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）およびその後続の版に記載されるように、周知の技術である。
【００２８】
このように合成されたポリペプチド−高分子結合体は、カラムクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーなどの方法によってさらに精製してもよい。
【００２９】
本明細書中に記載のポリペプチド−高分子結合体は、非芳香族二重結合および１以上の不斉中心を含んでもよい。したがって、これらは、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、ならびにシスまたはトランス異性体をとりうる。このような異性体はすべて考慮される。
【００３０】
本発明の一形態は、さまざまな疾患の治療のために上記ポリペプチド−高分子結合体の１以上の有効量を投与する方法に関する。具体的には、上記ポリペプチド−高分子結合体の１以上を、疾患、このような疾患の症状、またはこのような疾患の傾向を有する患者に、例えば、前記疾患、その症状、もしくはその傾向の治癒、緩和、変化、作用、改善または予防などの治療効果を与える目的で、治療効果を与えるために必要な量を投与することによって疾患が治療されうる。このような患者は、任意の適当な診断方法からの結果に基づいてヘルスケアの専門家によって同定されうる。
【００３１】
少なくとも１つの上記ポリペプチド−高分子結合体の有効量および製薬上許容される担体を含む薬剤組成物もまた本発明の範囲に含まれる。有効な投与量は、当業者に理解されているように、例えばポリペプチド−高分子結合体の加水分解速度、ポリペプチド−高分子結合体における治療用ポリペプチド部位、高分子の分子量、治療する疾患の型、投与経路、賦形剤の使用および他の治療との併用の可能性に依存して変動するであろう。
【００３２】
本発明の方法を実施するために、１以上の上記ポリペプチド−高分子結合体を有する組成物を、非経口、経口、経鼻、経直腸、局所的または口腔内に投与すればよい。本明細書において「非経口」の用語は、任意の適当な注入技術の他、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、腹腔内、気管内、または頭蓋内の注入を意味する。
【００３３】
無菌注入用組成物は、１，３−ブタンジオール溶液のような、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒の溶液または懸濁液でありうる。使用可能な許容されるビークルおよび溶媒として、マンニトール、水、リンガー溶液、および生理食塩液が挙げられる。さらに、溶媒または懸濁媒体として固定油（例えば合成モノ−またはジグリセリド）が通常用いられる。オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の製薬上許容される油と同様、特にそのポリオキシエチル化された形態において注入液の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースまたは類似した分散剤を含有しうる。ＴｗｅｅｎもしくはＳｐａｎなどの他の広く用いられる界面活性剤、あるいは製薬上許容される固体、液体もしくは他の投与形態の作製に広く用いられる他の類似した乳化剤またはバイオアクティビティエンハンサもまた製剤目的で用いられうる。
【００３４】
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、エマルジョンおよび水性懸濁液、分散液および溶液を含む任意の経口的に許容される投与形態でありうる。錠剤の場合、通常用いられる担体としてはラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤もまた典型的に添加される。カプセル形態の経口投与に有用な希釈剤としてはラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液またはエマルジョンが経口投与される場合、活性成分は乳化剤または懸濁剤と組み合わせた油相に懸濁または溶解されうる。必要に応じて、特定の甘味料、香料、または着色料を添加してもよい。
【００３５】
鼻用エアロゾルまたは吸入用組成物は、医薬製剤において公知の技術に従って調製されうる。例えば、このような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適当な防腐剤、バイオアベイラビリティを向上させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の公知の可溶化剤または分散剤を用いて、生理食塩水溶液として調製されうる。１以上の上記ポリペプチド−高分子結合体を有する組成物はまた、直腸投与用坐薬の形態で投与されうる。
【００３６】
製薬上許容される担体は、１以上の活性な上述のポリペプチド−高分子結合体とともに通常用いられる。薬剤組成物中の担体は、組成物の活性成分と適合し（そして好ましくは活性成分を安定化でき）、治療を受ける患者に有害でないという意味で「許容される」必要がある。上記化合物のデリバリーのための製薬用賦形剤として１以上の可溶化剤が用いられうる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ＃１０が挙げられる。
【実施例】
【００３７】
下記の実施例は、単に説明のためのものであって、開示の残部を何ら制限しないと解釈されるべきである。さらに詳述せずとも、当業者は本明細書中の記載に基づき、本発明をその全範囲まで利用することができると信じられる。本明細書中に引用した文献はすべてその全体が参照として本明細書中に組み込まれる。
【００３８】
実施例１：ｍＰＥＧアルデヒドＡ〜Ｄの調製
【００３９】
【化４】
【００４０】
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製：
段階Ａ：３−（４−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オールの調製
３−クロロプロパン−１−オール（１６０ｇ，１．６９ｍｏｌ）を、４−ニトロフェノール（３２９ｇ，２．３７ｍｏｌ）およびＫＯＨ（１５１ｇ，２．７０ｍｏｌ）を１．４Ｌの１：１のエタノール−水混合物中に含む溶液に添加した。この混合物を還流しながら６０時間加熱し、室温まで冷却し、１ＮのＮａＯＨ水溶液（２．０Ｌ）に注ぎ、ジクロロメタン（２×１．２Ｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、１ＮのＮａＯＨ水溶液（１．０Ｌ）およびブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して黄色がかった固体の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オール（２７３ｇ，８２％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８７−３．８３（ｍ，２Ｈ），２．１０−２．０４（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６３．９，１４１．２，１２５．８，１１４．３，６５．８，５９．１，３１．７；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）；Ｃ９Ｈ１１ＮＯ４の計算値：１９７．２，実測値：１９７，１３９，１２３，１０９。
【００４１】
段階Ｂ：３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナールの調製
ジクロロメタン（２９０ｍＬ）中のＮａＢｒ（１８．６ｇ，１８１．２ｍｍｏｌ）およびＴＥＭＰＯ（０．８５ｇ，５．４ｍｍｏｌ）の混合物を、ＮａＯＣｌの冷溶液（２４０ｍＬ、水と１３ｗｔ％ ＮａＯＣｌ水溶液との１：１混合物として）中の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オール（３５．７ｇ，１８１．２ｍｍｏｌ）に、０℃で３０分間かけて添加した。添加が完了すると、混合物は淡黄色になり、これを０℃で１時間撹拌した。得られた混合物を分離した後、有機層を水（３００ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して淡黄色の液体の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナール（３１ｇ，８７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．９３（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ９Ｈ９ＮＯ４の計算値：１９５．２，実測値：１９５，１６７，１３９，１０９，９３，６５。
【００４２】
段階Ｃ：３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールの調製
ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ ｌｒａ−４００（ＣＩ）イオン交換樹脂（３０ｇ）をメタノール（３００ｍＬ）中の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナール（３０ｇ，０．１５ｍｏｌ）の溶液に添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌し、セライトを通してろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、淡黄色の固体の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナールジメチルアセタール（３０ｇ，８０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｓ，６Ｈ），２．０９−２．１４（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６３．８，１４１．４，１２５．８，１１４．３，１０１．６，６４．８，５３．３，３２．４；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１１Ｈ１５ＮＯ３の計算値：２４１．２，実測値：２４１，１７８，１５２，７５。
【００４３】
段階Ｄ：３−（４−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールの調製
水素化ホウ素ナトリウム（１５．０ｇ，０．３９ｍｏｌ）を、３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナールジメチルアセタール（３０．０ｇ，０．１２ｍｏｌ）および塩化銅（Ｉ）（１．２ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）のエタノール（５００ｍＬ）の冷溶液に添加した。混合物を撹拌しながら３０分間６０℃に加熱し、室温まで冷却し、水（２５０ｍＬ）で希釈し、減圧下で濃縮してエタノールを除去し、メチルｔ−ブチルエーテルまたはＭＴＢＥ（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、ブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗残留物を得た。粗残留物を、中性酸化アルミニウムのカラムクロマトグラフィーで４０％酢酸エチル−ヘキサンを溶離液として用いて精製し、濃紫色の液体の３−（４−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタール（１９．５ｇ，７５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．７４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３５（ｓ，６Ｈ），２．０１−２．０６（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５２．３，１３９．１，１１６．７，１１５．６，１０２．１，６４．５，５３．２，３２．８；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１１Ｈ１７ＮＯ３の計算値：２１１．３，実測値：２１１，１４８，１０９，７５。
【００４４】
段階Ｅ：ｍＰＥＧアルデヒドＡジメチルアセタールの調製
直鎖状の２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨ（６０．０ｇ，３ｍｍｏｌ）を３００ｍＬの乾燥ジオキサンにゆっくりと加熱しながら溶解させた。溶液を室温に冷却した後、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネート（５．０ｇ，１９．５ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２．５ｇ，２０．４ｍｍｏｌ）を順次添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、３−（４-アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタール（１５．０ｇ，７１．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した。この混合物を室温でさらに１８時間撹拌した後、ＭＴＢＥ（４．５Ｌ）を４時間かけて滴下した。得られた白色の沈殿を回収し、減圧下で乾燥させて５９．５ｇの粗生成物を得て、これをジクロロメタン（２５０ｍＬ）に再溶解させた。他のバッチのＭＴＢＥ（６．０Ｌ）を４時間かけて滴下して添加した。このようにして得られた白色の沈殿を回収し、減圧下で乾燥させて白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＡジメチルアセタール（５８．０ｇ，９７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５４（ｂｒ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２５（ｓ，６Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），１．９３−１．９７（ｍ，２Ｈ）。
【００４５】
段階Ｆ：ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡジメチルアセタール（５５．０ｇ，２．７５ｍｍｏｌ）を緩衝液（６００ｍＬ，クエン酸−ＨＣｌ−ＮａＣｌ，ｐＨ＝２）に溶解させた。この溶液を室温で２０時間撹拌し、ジクロロメタン（６×２００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で約３５０ｍＬの体積まで濃縮した。次いで、ＭＴＢＥ（６．０Ｌ）を６時間かけて滴下して添加した。得られた白色の沈殿を回収し、減圧下で乾燥させて白色の粉末のｍＰＥＧアルデヒドＡ（５２．０ｇ，９５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７３（ｓ，１Ｈ），９．５６（ｂｒ，１Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），２．８３−２．８７（ｍ，２Ｈ）。
【００４６】
ｍＰＥＧアルデヒドＢの調製：
段階Ａ：４−（４−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールの調製
ｐ−ニトロフルオロベンゼン（１０．０ｇ，７０．７ｍｍｏｌ）を、１，４−ブタンジオール（３１．９ｇ，３５４ｍｍｏｌ）および水酸化カリウム（５．０ｇ，８９．１ｍｍｏｌ）の混合物に、室温で１５分間かけてゆっくりと添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、これを水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機抽出物をブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を酢酸エチル−へキサンから再結晶し、白色固体の４−（４−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オール（９．６ｇ，６４％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８０−３．７５（ｍ，２Ｈ），２．００−１．９４（ｍ，２Ｈ），１．８３−１．７６（ｍ，２Ｈ），１．６５−１．４８（ｂｒ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６４．０，１４１．４，１２５．９，１１４．４，６８．６，６２．３，２９．０，２５．５；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１０Ｈ１３ＮＯ４の計算値：２１１．２，実測値：２１１，１３９，１２３，１０９，７３，５５。
【００４７】
段階Ｂ：４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｂに記載した方法を用いて、４−（４−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールから収率８１％で白色固体の４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．８６（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．１８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２００．３，１６２．８，１４０．５，１２４．９，１１３．５，６６．７，３９．３，２０．７；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１０Ｈ１１ＮＯ４の計算値：２０９．２，実測値：２０９，１３９，１２３，１０９，７１。
【００４８】
段階Ｃ：４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｃに記載した方法を用いて、４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールから収率８２％で淡黄色固体の４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｓ，６Ｈ），１．９０−１．９３（ｍ，２Ｈ），１．８５−１．８１（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６３．９，１４１．３，１２５．８，１１４．３，１０４．０，６８．３，５２．９，２８．９，２４．１；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１２Ｈ１７ＮＯ５の計算値：２５５．３，実測値：２５５，２２４，１９２，１１７，７５。
【００４９】
段階Ｄ：４−（４−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールの調製
４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールジメチルアセタール（４．０ｇ，１５．７ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム担持炭素（０．４ｇ）の存在下、室温で１６時間水素化した。混合物をセライトを通してろ過した後、ろ液を減圧下で濃縮して粗残留物を得て、これを中性酸化アルミニウムのカラムクロマトグラフィーで５０％酢酸エチル−ヘキサンを溶離液として用いて精製し、濃紫色の液体の４−（４−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタール（２．５ｇ，７０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．７０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．５７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３０（ｓ，６Ｈ），１．７８−１．７３（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５１．６，１３９．９，１１５．９，１１５．３，１０４．０，６７．８，５２．４，２８．８，２４．３；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ３の計算値：２２５．３，実測値：２２５，１９４，１６２，１０９，８５。
【００５０】
段階Ｅ：ｍＰＥＧアルデヒドＢジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｅに記載した方法を用いて、直鎖状の２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨおよび４−（４−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールから収率９３％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＢジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５３（ｂｒ，１Ｈ）７．３５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｓ，６Ｈ），１．７１−１．６３（ｍ，４Ｈ）。
【００５１】
段階Ｆ：ｍＰＥＧアルデヒドＢの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｆに記載した方法を用いて、ｍＰＥＧアルデヒドＢジメチルアセタールから収率８７％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＢを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７１（ｓ，１Ｈ），９．５４（ｂｒ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．６０−２．５６（ｍ，２Ｈ），１．９７−１．９３（ｍ，２Ｈ）。
【００５２】
ｍＰＥＧアルデヒドＣの調製：
段階Ａ：３−（３−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ａに記載した方法を用いて、３−ニトロフェノールおよび３−クロロプロパン−１−オールから収率９３％で淡黄色の液体の３−（３−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｓ，１Ｈ），７．４６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．１６−２．０９（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５９．３，１４９．１，１２９．９，１２１．５，１１５．７，１０８．７，６５．７，５９．６，３１．７。
【００５３】
段階Ｂ：３−（３−ニトロフェノキシ）プロパナールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｂに記載した方法を用いて、３−（３−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オールから収率７８％で淡黄色の液体の３−（３−ニトロフェノキシ）プロパナールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．９０（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２６−７．２２（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１９９．１，１５８．９，１４９．１，１３０．０，１２１．５，１１６．１，１０８．７，６２．０，４２．８；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ９Ｈ９ＮＯ４の計算値：１９５．２，実測値：１９５，１６７，１３９，９３，６５。
【００５４】
段階Ｃ：３−（３−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｃに記載した方法およびｍＰＥＧアルデヒドＢの調製の段階Ｄに記載した方法を順次用いて、３−（３−ニトロフェノキシ）プロパナールから収率４５％で濃紫色の液体の３−（３−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．０４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３３−６．２４（ｍ，２Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６１（ｂｒ，２Ｈ），３．３６（ｓ，６Ｈ），２．０８−２．０３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５９．９，１４７．６，１３０．０，１０７．９，１０４．５，１０２．１，１０１．６，６３．６，５３．３，３２．８；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１１Ｈ１７ＮＯ３の計算値：２１１．２，実測値：２１１，１９６，１６４，１４８，１０９，７５。
【００５５】
段階Ｄ：ｍＰＥＧアルデヒドＣジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｅに記載した方法を用いて、直鎖状の２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨおよび３−（３−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールから収率９５％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＣジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７２（ｂｒ，１Ｈ），７．１７−７．１３（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９５（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２４（ｓ，６Ｈ），２．００−１．９５（ｍ，２Ｈ）。
【００５６】
段階Ｅ：ｍＰＥＧアルデヒドＣの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｆに記載した方法を用いて、ｍＰＥＧアルデヒドＣジメチルアセタールから収率９５％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＣを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７２（ｓ，１Ｈ），９．６９（ｂｒ，１Ｈ），７．２０−７．１３（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．５５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２４−４．０７（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）。
【００５７】
ｍＰＥＧアルデヒドＤの調製：
段階Ａ：４−（３−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ａに記載した方法を用い、次いでエタノール中で還流しながら濃硫酸と０．５時間反応させて、３−ニトロフェノールおよび２−［（４-クロロブチル）オキシ］テトラヒドロピランから収率８１％で４−（３−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２６−７．１９（ｍ，１Ｈ），４．０８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９６−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．８９−１．７１（ｍ，２Ｈ）；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１０Ｈ１３ＮＯ４の計算値：２１１．２，実測値：２１１，１３９，１２３，１０９，９３，７３，５５。
【００５８】
段階Ｂ：４−（３−ニトロフェノキシ）ブタナールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｂに記載した方法を用いて、４−（３−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールから収率７８％で４−（３−ニトロフェノキシ）ブタナールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．８６（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２２−７．１９（ｍ，１Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２０−２．１４（ｍ，２Ｈ）。
【００５９】
段階Ｃ：４−（３−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｃに記載した方法およびｍＰＥＧアルデヒドＢの調製の段階Ｄに記載した方法を順次用いて、４−（３−ニトロフェノキシブタナールから収率５２％で４−（３−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．１０−７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９４−６．３３（ｍ，３Ｈ），４．４３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），１．８２−１．７８（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６０．１，１６４．５，１３０．１，１０８．３，１０５．３，１０４．３，１０２．１，６７．３，５２．８，２９．１，２４．５；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ３の計算値：２２５．３，実測値：２２５，１９４，１６４，１０９，８５。
【００６０】
段階Ｄ：ｍＰＥＧアルデヒドＤジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｅに記載した方法を用いて、直鎖状の２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨおよび４−（３−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールから収率９０％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＤジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７１（ｂｒ，１Ｈ），７．１６−７．１２（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２５（ｓ，６Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），１．７１−１．６４（ｍ，４Ｈ）。
【００６１】
段階Ｅ：ｍＰＥＧアルデヒドＤの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｆに記載した方法を用いて、ｍＰＥＧアルデヒドＤジメチルアセタールから収率９５％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＤを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７２（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｂｒ，１Ｈ），７．１６−７．１３（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．７４−２．６１（ｍ，２Ｈ），１．９８−１．９１（ｍ，２Ｈ）。
【００６２】
実施例２：Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの調製
修飾された組み換えヒトインターフェロン−α２ｂ、すなわちＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ法によって複製した。ヒトインターフェロン−α２ｂのフランキング配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃ＮＭ＿０００６０５）に基づいてオリゴヌクレオチドを合成した。誘導されたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。ＩＦＮ変異体をｐＧＥＭ−Ｔクローンを介して再びＰＣＲ増幅し、続いて、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩをクローニングサイトとして用いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ駆動ベクターであるタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。次いで、ベクターｐＥＴ−２４ａをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）株に変換した。変換されたＥ．−ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬをカラマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニカル（５０μｇ／ｍＬ）の存在下で維持することによって高発現クローンを選択した。
【００６３】
１，０００ｍＬのフラスコ中でＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬをＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ遺伝子を用いて増殖させるためにＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地（ＢＤ，２００ｍＬ）を採用した。フラスコを３７℃で２３０ｒｐｍで１６時間振とうした。回分発酵および流加発酵を５リットルのジャーファーメンター（ニュージャージー州、エジソン、ニュー ブランズウィック サイエンティフィク社、Ｂｉｏｆｌｏ ３０００）中で行った。回分発酵は１５０ｍＬの一晩の前培養接種剤ならびにカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニカル（５０μｇ／ｍＬ）、０．４％グリセロールおよび０．５％（ｖ／ｖ）の微量成分（１０ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、０．８４ｇ／ＬのＥＤＴＡ、５０ｍｌ／ＬのＨＣｌ）を含む３ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地を用いた。溶解酸素濃度を３５％に制御し、５ＮのＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨを７．２に維持した。６００ｇ／Ｌのグルコースおよび２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む供給液を準備した。ｐＨが定値を超える値まで上昇した場合、適当な体積の供給液を添加して培地ブロスのグルコース濃度を増加させた。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで加えることによってＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ遺伝子の発現を誘導し、３時間インキュベートした後、培地ブロスを採取した。
【００６４】
回収した細胞ペレットをＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）に約１：１０（湿重量ｇ／ｍＬ）の比で再懸濁させ、マイクロ流動化装置で分裂させ、次いで１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。封入体（ＩＢ）を含むペレットを、ＴＥＮ緩衝液で二回洗浄し、上記のように遠心分離した。次いで、ＩＢを含むペレットを、４ＭのグアニジウムＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）水溶液１５０ｍＬに懸濁させ、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その後、ＩＢを６ＭのＧｕＨＣｌ溶液５０ｍＬに可溶化させた。ＧｕＨＣｌに可溶化させた材料を２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。変性したＩＢを、新たに調製し添加の間のみ撹拌したリフォールディング緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ＭのＬ−アルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ）１．５Ｌで希釈することによってリフォールディングを開始した。リフォールディング反応混合物を撹拌せずに４８時間インキュベートした。リフォールディングされた組み換えヒトインターフェロン−α２ｂ（すなわちＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ）を２０ｍＭのトリス緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１Ｍの尿素を含む、ｐＨ７．０）に対して透析し、Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィーでさらに精製した。
【００６５】
リフォールディングされた組み換えヒトタンパク質Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮをＱ−セファロースカラム（ペンシルバニア州、ピッツバーグ、ＧＥ アマシャムファルマシア社製）にロードした。カラムを予備平衡にし、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。生成物を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）および２００ｍＭのＮａＣｌの混合物で溶離した。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを含むフラクションを、その２８０ｎｍでの吸光度に基づいて回収した。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの濃度を、ブラッドフォード法を用いたプロテインアッセイキット（イリノイ州、ロックフィールド、ピアス社製）によって決定した。
【００６６】
実施例３：ｍＰＥＧアルデヒドＡとＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮとの結合
ｍＰＥＧアルデヒドＡおよびＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを含む代表的なポリペプチド−高分子結合体を以下のように調製した。
【００６７】
上記実施例２で調製したＱ−セファロース精製したＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ（１ｍｇ）を、ｍＰＥＧアルデヒドＡで処理した。最終の反応混合物は５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５ｍＭのシアノホウ水素化ナトリウム（ウィスコンシン州、ミルウォーキー、アルドリッチ社製）および１０ｍｇのｍＰＥＧアルデヒドＡを含有した。その後、混合物を室温で２０時間インキュベートし、主生成物としてモノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを得て、次いでこれをＳＰ ＸＬセファロースクロマトグラフィー（ペンシルバニア州、ピッツバーグ、ＧＥ アマシャムファルマシア社製）で精製した。具体的には、ＳＰカラムを予備平衡にし、２０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．４）で洗浄した。次いで、モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）および６０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶離させた。未反応のＩＦＮ、すなわちＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）および２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶離させた。溶離させたフラクションをゲル電気泳動で１２％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルを用いて分析し、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０および銀染色剤で染色することによって信号を検出した。モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを含むフラクションを、その保持時間および２８０ｎｍでの吸光度に基づいて回収した。モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの濃度を、ブラッドフォード法を用いたプロテインアッセイキット（イリノイ州、ロックフィールド、ピアス社製）によって決定した。モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの単離収率は３０％〜４０％であった。
【００６８】
実施例４：モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの物理的および生物学的特性
上記のペグ化反応の特異性をＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮおよびモノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの両方のトリプシンペプチドマッピングによって決定した。各化合物の１００μｇの試料を減圧乾燥させ、６０μＬの８Ｍ尿素／０．４Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液で再構成させた。還元剤およびヨード酢酸で処理した後、溶液をプロメガ社のトリプシン（シークエンシンググレード）を用いて分解させた。アリコートを採取し、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムに注入した。得られたトリプシンペプチドを、０〜７０％のアセトニトリルを０．１％のＴＦＡ−Ｈ２Ｏ中に含む７５−ｍｉｎグラジエント溶離液を用いて分離した。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮおよびモノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの両方の試料からのペプチドフラグメントをその２１４ｎｍでの吸光度によってモニターし、手作業で回収し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃシステムで乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。両方の試料のデータの比較から、ペグ化反応の主なサイトはＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮのＮ−末端で生じることが示された。
【００６９】
モノＰＥＧ化−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮおよび他の修飾されたヒトＩＦＮ−α２ｂ変異体のモノＰＥＧ化産物（すなわちモノＰＥＧ化−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＩＦＮ、−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ、−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＩＦＮ、−Ｐｒｏ−ＩＦＮ、および−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ）の抗ウイルス活性を、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に攻撃されたウシ腎臓上皮細胞（ＭＤＢＫ）において試験した。感染した細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１をアッセイに添加した後、生存する細胞性酵素からのホルマザンの生成によって決定した。このＣＰＥバイオアッセイを、各濃度で３点のデータ点を用いて行った。これらのすべてのモノＰＥＧ化修飾ヒトＩＦＮ−α２ｂ化合物の特異的な抗ウイルス活性を、５０％の細胞保護（ＥＣ５０、すなわち５０％の細胞変性効果）を与える濃度に基づいて計算した。ＣＰＥ抗ウイルスバイオアッセイの結果をＲｏｆｅｒｏｎ（登録商標）を参照標準として用いてＩＵ／ｍｇの単位で報告した。その結果、モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮのＣＰＥバイオアクティビティは２．０×１０８であり、他のモノＰＥＧ化ヒトＩＦＮ−α２ｂ変異体のＣＰＥバイオアクティビティは８．３×１０６〜２．９×１０７ＩＵ／ｍｇで変化した。
【００７０】
他の実施形態
本明細書中に開示された全ての特徴は任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書中に開示された特徴はそれぞれ同一の、等価の、または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられてもよい。したがって、特に言及しないかぎり、開示された特徴は等価のまたは類似の特徴の一般的な系列の一例にすぎない。
【００７１】
上記の記載から、当業者であれば本発明の本質的な特徴を容易に確認でき、本発明の思想および技術的範囲を逸脱することなく、本発明をさまざまな用途および条件に適合させるために本発明に多様な変化および修正を与えることができるであろう。したがって、他の実施形態もまた以下の特許請求の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／７５５，４５９号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の優先権を主張し、その内容は参照として本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
治療用薬剤分子の薬力学特性および薬動力学特性を改善するために、２つの大きなドラッグデリバリーのアプローチが研究されてきた。一方は、薬剤分子そのものの修飾（例えば、ペグ化によって）であり、他方は、製剤の変更（例えば、リポソーム製剤によって）である。いずれの場合も、長時間の薬理活性、副作用の低減、患者の薬剤服用順守の向上、および患者の生活の質の向上を与えるドラッグデリバリーメカニズムを開発することが望まれる。
【発明の開示】
【０００３】
概要
本発明は、治療用ポリペプチド分子が高分子とカップリングして、有効性が改善された単一の薬剤、すなわちポリペプチド−高分子結合体を形成しうるという概念に基づく。
【０００４】
一形態によれば、本発明は、ポリペプチド部位、ポリアルキレンオキシド部位、前記ポリペプチド部位を前記ポリアルキレンオキシド部位に結合させるリンカー、前記ポリペプチド部位と前記リンカーとの間の第１の結合、および前記ポリアルキレンオキシド部位と前記リンカーとの間の第２の結合を含むポリペプチド−高分子結合体を特徴とする。前記ポリペプチド部位は、ヒトインターフェロン−α部位（すなわち、インターフェロン−α活性を保持するネイティブまたは修飾された部位）および前記ヒトインターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６（例えば１〜４）のさらなるアミノ酸残基を含みうる。例えば、−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＩＦＮ、−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ、−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＩＦＮ、−Ｐｒｏ−ＩＦＮおよび−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−ＩＦＮが挙げられ、ここでＩＦＮはヒトインターフェロン−α２ｂ部位である。前記インターフェロン−α部位は、Ｎ−末端にシステイン残基を含みうる。前記ポリペプチド部位はまた、インターフェロン−β部位または顆粒球コロニー刺激因子を含んでもよい。前記ポリアルキレンオキシド部位は、１〜２０，０００のＣ１〜Ｃ８アルキレンオキシド繰り返し単位を含みうる。ポリアルキレンオキシド部位の例としては、２０，０００ダルトンの数平均分子量を有するポリエチレンオキシド部位などの、５〜１０，０００の繰り返し単位を有するポリエチレンオキシド部位が挙げられる。前記リンカーは、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、または−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−であってよく、ここでＡｒは、アリーレン（例えばフェニレン）またはヘテロアリーレンであり、ＸはＯ、ＳまたはＮ（Ｒ）であり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、ｎは１〜１０でありうる。前記第１の結合および前記第２の結合は、それぞれ独立して、カルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カルバメート、ウレア、エーテル、チオ、スルホニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネート、またはホスフェート基でありうる。上記薬剤−高分子結合体の一例は；
【０００５】
【化１】
【０００６】
であり、ここでｍＰＥＧはメトキシキャップポリエチレンオキシド部位である。
【０００７】
ポリアルキレンオキシド部位は、直鎖、分岐、または星型の部位を意味する。これは飽和であっても不飽和であってもよく、置換されていても置換されていなくてもよい。ポリアルキレンオキシド部位の例としては、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリイソプロピレンオキシド、ポリブテニレンオキシド、およびこれらの共重合体が挙げられる。デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、または炭水化物系高分子などの他の高分子もまた、抗原性、毒性、または免疫反応誘発性でないかぎり、ポリアルキレンオキシド部位に代えて用いられうる。
【０００８】
リンカーは、ポリアルキレンオキシド部位から延び、ポリペプチド部位のポリアルキレンオキシド部位へのカップリングを容易にする。
【０００９】
ポリペプチド部位は、その薬剤活性の少なくとも一部が保持されるかぎり、修飾ポリペプチド薬剤を含みうる。このような治療用ポリペプチド部位の例としては、Ｎ−末端に１以上のさらなるアミノ酸残基を含む修飾ポリペプチド分子または一次タンパク質配列内のアミノ酸残基の１以上の置換を含む修飾ポリペプチド分子が挙げられる。
【００１０】
ポリペプチド部位は、酵素作用下、インビボで（例えば加水分解を介して）ポリペプチド部位とリンカーとの間の結合またはポリアルキレンオキシド部位とリンカーとの間の結合の切断によって放出されうる。インビボの結合切断に関与する酵素の例としては、酸化酵素（例えばペルオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、またはデヒドロゲナーゼ）、還元酵素（例えばケトレダクターゼ）および加水分解酵素（例えばプロテアーゼ、エステラーゼ、スルファターゼまたはホスファターゼ）が挙げられる。本発明のポリペプチド−高分子結合体はまた、インビボでポリペプチド−ポリマー結合体から治療用ポリペプチド部位を切断することなく、有効でありうる。
【００１１】
「アルキル」の用語は、−ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２などの、一価、飽和の、直鎖または分岐の非芳香族の炭化水素部位を意味する。「アルケニル」の用語は、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３などの、少なくとも１つの二重結合を含む直鎖または分岐の炭化水素部位を意味する。「アルキニル」の用語は、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３などの、少なくとも１つの三重結合を含む直鎖または分岐の炭化水素部位を意味する。「シクロアルキル」の用語は、シクロプロピルなどの、飽和の環状の炭化水素部位を意味する。「シクロアルケニル」の用語は、シクロヘキセニルなどの、少なくとも１つの環二重結合を含む非芳香族の環状の炭化水素部位を意味する。「ヘテロシクロアルキル」の用語は、４−テトラヒドロピラニルなどの、少なくとも１つの環ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）を有する飽和の環状の部位を意味する。「ヘテロシクロアルケニル」の用語は、ピラニルなどの、少なくとも１つの環ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）および少なくとも１つの環二重結合を有する非芳香族の環状の部位を意味する。「アリール」の用語は、１以上の芳香環を有する炭化水素部位を意味する。アリール部位の例としては、フェニル（Ｐｈ）、ナフチル、ピレニル、アントリル、およびフェナントリルが挙げられる。「ヘテロアリール」の用語は、少なくとも１つの環ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）を含む、１以上の芳香環を有する部位を意味する。ヘテロアリール部位の例としては、フリル、フルオレニル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、キナゾリニル、キノリル、イソキノリル、およびインドリルが挙げられる。「アルキレン」の用語は、−ＣＨ２−などの、二価、飽和の、直鎖または分岐の非芳香族の炭化水素部位を意味する。「ヘテロアルキレン」の用語は、−ＣＨ２ＯＣＨ２−などの、少なくとも１つのヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）を有するアルキレン部位を意味する。「シクロアルキレン」の用語は、シクロへキシレンなどの、二価、飽和の、環状の炭化水素部位を意味する。「ヘテロシクロアルキレン」の用語は、４−テトラヒドロピラニレンなどの、少なくとも１つの環へテロ原子を有する、二価、飽和の、非芳香族の環状の部位を意味する。「アリーレン」の用語は、１以上の芳香環を有する二価の炭化水素部位を意味する。アリール部位の例としては、フェニレンおよびナフチレンが挙げられる。「ヘテロアリーレン」の用語は、少なくとも１つの環へテロ原子を含む、１以上の芳香環を有する２価の部位を意味する。ヘテロアリーレン部位の例としては、フリレンまたはピロリレンが挙げられる。「アラルキレン」の用語は、アリールまたはヘテロアリールで置換された二価のアルキル部位であって、１つの電子がアルキル部位上に存在し、他の電子がアリールまたはヘテロアリール上に存在する部位を意味する。アラルキレン部位の例としては、ベンジレンまたはピリジニルメチレンが挙げられる。
【００１２】
本明細書中に記載のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、へテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびアラルキレンは、置換および非置換の部位の両方を含む。シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびアラルキレンの置換基の例としては、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ２０ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、ヒドロキシ、ハロゲン、チオ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、カルボキシル、およびカルボン酸エステルが挙げられる。アルキル、アルキレン、およびヘテロアルキレンの置換基の例としては、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル以外の上記のすべての置換基が挙げられる。シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、およびヘテロアリーレンはまた、シクロアルキル、へテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールと縮合してもよい。
【００１３】
他の形態によれば、本発明は、ポリペプチド部位、ポリアルキレンオキシド部位、前記ポリペプチド部位を前記ポリアルキレンオキシド部位に結合させるリンカー、前記ポリペプチド部位と前記リンカーとの間の第１の結合、および前記ポリアルキレンオキシド部位と前記リンカーとの間の第２の結合を含むポリペプチド−高分子結合体を特徴とする。前記ポリエチレンオキシド部位は１〜２０，０００のＣ１〜Ｃ８アルキレンオキシド繰り返し単位を含みうる。前記リンカーは−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−であってよく、Ａｒはアリーレンまたはヘテロアリーレンであり、ＸはＯ、ＳまたはＮ（Ｒ）であり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、ｎは１〜１０でありうる。前記第１の結合および前記第２の結合はそれぞれ独立して、カルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カルバメート、ウレア、エーテル、チオ、スルホニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネート、またはホスフェート基でありうる。
【００１４】
他の形態によれば、本発明は、化学式（Ｉ）の化合物を特徴とする。
【００１５】
【化２】
【００１６】
化学式（Ｉ）中、ｍＰＥＧはメトキシキャップポリエチレンオキシド部位であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つはＣＨＯで置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。化学式（Ｉ）の化合物の一例は、Ｒ２またはＲ３がＣＨＯで置換されたプロピルまたはＣＨＯで置換されたブチルである化合物である。
【００１７】
他の形態によれば、本発明は、インターフェロン−α部位（例えばヒトインターフェロン−α２ｂ部位）および前記インターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を含むポリペプチドを特徴とする。例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＩＦＮ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ、Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＩＦＮ、Ｐｒｏ−ＩＦＮおよびＧｌｙ−Ｍｅｔ−ＩＦＮが挙げられ、ここでＩＦＮはヒトインターフェロン−α２ｂ部位である。前記インターフェロン−α部位はまた、野生型インターフェロン−α部位（例えば野生型ヒトインターフェロン−α２ｂ部位）でありうる。
【００１８】
他の形態によれば、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、および癌（例えばヘアリーセル白血病またはカボジ肉腫）などのさまざまな疾患の治療方法を特徴とする。前記方法は、１以上の上記ポリペプチド−高分子結合体の有効量を必要とする患者に投与することを含む。「治療する」または「治療」の用語は、１以上のポリペプチド−高分子結合体を、上記疾患、その症状、またはその傾向を有する患者に、例えば、上記疾患、その症状、もしくはその傾向の治癒、緩和、変化、作用、改善または予防などの治療効果を与える目的で投与することを意味する。
【００１９】
本発明はまた、少なくとも１つの上記ポリペプチド−高分子結合体の有効量と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物を含む。
【００２０】
上記ポリペプチド−高分子結合体は、適用できる場合、その化合物自体の他に、その塩、プロドラッグ、および溶媒和物を含む。塩は、例えば、アニオンとポリペプチド−高分子結合体上の正に荷電した基（例えばアミノ）との間に形成されうる。適当なアニオンとしては、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、クエン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、および酢酸イオンが挙げられる。同様に、塩はまた、カチオンとポリペプチド−高分子結合体上の負に荷電した基（例えばカルボキシレート）との間に形成されうる。適当なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオンなどのアンモニウムカチオンが挙げられる。プロドラッグの例としては、患者に投与されたときに活性なポリペプチド−高分子結合体を提供できる、エステルおよび他の製薬上許容される誘導体が挙げられる。溶媒和物は、活性なポリペプチド−高分子結合体と製薬上許容される溶媒との間に形成される複合体を意味する。製薬上許容される溶媒の例としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸、およびエタノールアミンが挙げられる。
【００２１】
１以上の上記ポリペプチド−高分子結合体を含む、上記のさまざまな疾患の治療に用いる組成物、および上記の治療用の薬剤の作製のためのこのような組成物の使用もまた本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明の１以上の実施形態の詳細を以下に説明する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２３】
詳細な説明
本発明は、治療用ポリペプチド部位が少なくとも１つの高分子とカップリングしたポリペプチド−高分子結合体に関する。
【００２４】
ポリペプチド−高分子結合体は、化学分野で公知の合成方法によって調製されうる。例えば、官能基（例えばフェニルアミノ基）を含むリンカー分子は、はじめに、ヒドロキシ末端基を含むメトキシキャップポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）高分子にカルバメート結合を介してカップリングされ、リンカー−高分子結合体を形成しうる。続いて、リンカー−高分子結合体の他方の末端基をアルデヒド基に変換した後、他の官能基（例えばアミノ基）を含む治療用ポリペプチド分子（例えばヒトインターフェロン−α２ｂ）が上記リンカー−高分子結合体にカップリングされうる。リンカー分子とカップリングするために、ｍＰＥＧ高分子は、スクシンイミジルエステル、ｐ−ニトロフェノール、スクシンイミジルカーボネート、トレシレート、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、ビオチン、リン脂質、またはフルオレセインなどの基で官能化されうる。他の例としては、治療用ポリペプチド分子（例えばヒトインターフェロン−α２ｂ）は、はじめに、組み換え技術によってそのＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を導入することによって修飾されうる。次いで、修飾されたヒトインターフェロン−α２ｂ分子は、一方の末端にリンカーを有するメトキシキャップポリエチレングリコール部位とカップリングされうる。カップリング反応は、リンカーを修飾して適当な官能基（例えばアルデヒド基）を形成し、次いでリンカー上の官能基を修飾ヒトインターフェロン−α２ｂ分子の官能基（例えば末端アミノ基）と反応させることによって達成されうる。
【００２５】
【化３】
【００２６】
上記のスキーム１は、上述のポリペプチド−高分子結合体の１つの調製例を示す。はじめに、４−ニトロフェノール１は、（ａ）３−クロロプロパン−１−オールを用いたヒドロキシル基のアルキル化；（ｂ）末端ヒドロキシル基のアルデヒド基への酸化；（ｃ）ジメチルアセタール基の形成によるアルデヒド基の保護；（ｄ）ニトロ基のアミノ基への還元；の４つの化学変換でリンカー分子２に変換される。次いで、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネートを用いてメトキシキャップポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）高分子をリンカー分子２とカップリングさせ、リンカー−高分子結合体３を製造する。続いて、リンカー−高分子結合体３のジメチルアセタール保護基を除去してアルデヒド基を含むリンカー−高分子結合体４を得て、その後修飾ヒトインターフェロン−α２ｂ分子であるＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮとカップリングさせてポリペプチド−高分子結合体５を生成させる。
【００２７】
上述の合成経路で用いられる化学物質には、例えば、溶媒、試薬、触媒、保護基および脱保護基の試薬が含まれうる。上述の方法は、ここで具体的に記載した段階の前または後に、最終的にポリペプチド−高分子の合成を可能にするために、適当な保護基を付加または脱離させる段階をさらに含んでもよい。さらに、各種の合成段階は、所望のポリペプチド−高分子結合体を与えるために順序を変えて行ってもよい。適用できるポリペプチド−高分子結合体の合成に有用な合成化学変換および保護基方法論（保護および脱保護）は、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）およびその後続の版に記載されるように、周知の技術である。
【００２８】
このように合成されたポリペプチド−高分子結合体は、カラムクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーなどの方法によってさらに精製してもよい。
【００２９】
本明細書中に記載のポリペプチド−高分子結合体は、非芳香族二重結合および１以上の不斉中心を含んでもよい。したがって、これらは、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、ならびにシスまたはトランス異性体をとりうる。このような異性体はすべて考慮される。
【００３０】
本発明の一形態は、さまざまな疾患の治療のために上記ポリペプチド−高分子結合体の１以上の有効量を投与する方法に関する。具体的には、上記ポリペプチド−高分子結合体の１以上を、疾患、このような疾患の症状、またはこのような疾患の傾向を有する患者に、例えば、前記疾患、その症状、もしくはその傾向の治癒、緩和、変化、作用、改善または予防などの治療効果を与える目的で、治療効果を与えるために必要な量を投与することによって疾患が治療されうる。このような患者は、任意の適当な診断方法からの結果に基づいてヘルスケアの専門家によって同定されうる。
【００３１】
少なくとも１つの上記ポリペプチド−高分子結合体の有効量および製薬上許容される担体を含む薬剤組成物もまた本発明の範囲に含まれる。有効な投与量は、当業者に理解されているように、例えばポリペプチド−高分子結合体の加水分解速度、ポリペプチド−高分子結合体における治療用ポリペプチド部位、高分子の分子量、治療する疾患の型、投与経路、賦形剤の使用および他の治療との併用の可能性に依存して変動するであろう。
【００３２】
本発明の方法を実施するために、１以上の上記ポリペプチド−高分子結合体を有する組成物を、非経口、経口、経鼻、経直腸、局所的または口腔内に投与すればよい。本明細書において「非経口」の用語は、任意の適当な注入技術の他、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、腹腔内、気管内、または頭蓋内の注入を意味する。
【００３３】
無菌注入用組成物は、１，３−ブタンジオール溶液のような、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒の溶液または懸濁液でありうる。使用可能な許容されるビークルおよび溶媒として、マンニトール、水、リンガー溶液、および生理食塩液が挙げられる。さらに、溶媒または懸濁媒体として固定油（例えば合成モノ−またはジグリセリド）が通常用いられる。オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の製薬上許容される油と同様、特にそのポリオキシエチル化された形態において注入液の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースまたは類似した分散剤を含有しうる。ＴｗｅｅｎもしくはＳｐａｎなどの他の広く用いられる界面活性剤、あるいは製薬上許容される固体、液体もしくは他の投与形態の作製に広く用いられる他の類似した乳化剤またはバイオアクティビティエンハンサもまた製剤目的で用いられうる。
【００３４】
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、エマルジョンおよび水性懸濁液、分散液および溶液を含む任意の経口的に許容される投与形態でありうる。錠剤の場合、通常用いられる担体としてはラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤もまた典型的に添加される。カプセル形態の経口投与に有用な希釈剤としてはラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液またはエマルジョンが経口投与される場合、活性成分は乳化剤または懸濁剤と組み合わせた油相に懸濁または溶解されうる。必要に応じて、特定の甘味料、香料、または着色料を添加してもよい。
【００３５】
鼻用エアロゾルまたは吸入用組成物は、医薬製剤において公知の技術に従って調製されうる。例えば、このような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適当な防腐剤、バイオアベイラビリティを向上させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の公知の可溶化剤または分散剤を用いて、生理食塩水溶液として調製されうる。１以上の上記ポリペプチド−高分子結合体を有する組成物はまた、直腸投与用坐薬の形態で投与されうる。
【００３６】
製薬上許容される担体は、１以上の活性な上述のポリペプチド−高分子結合体とともに通常用いられる。薬剤組成物中の担体は、組成物の活性成分と適合し（そして好ましくは活性成分を安定化でき）、治療を受ける患者に有害でないという意味で「許容される」必要がある。上記化合物のデリバリーのための製薬用賦形剤として１以上の可溶化剤が用いられうる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ＃１０が挙げられる。
【実施例】
【００３７】
下記の実施例は、単に説明のためのものであって、開示の残部を何ら制限しないと解釈されるべきである。さらに詳述せずとも、当業者は本明細書中の記載に基づき、本発明をその全範囲まで利用することができると信じられる。本明細書中に引用した文献はすべてその全体が参照として本明細書中に組み込まれる。
【００３８】
実施例１：ｍＰＥＧアルデヒドＡ〜Ｄの調製
【００３９】
【化４】
【００４０】
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製：
段階Ａ：３−（４−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オールの調製
３−クロロプロパン−１−オール（１６０ｇ，１．６９ｍｏｌ）を、４−ニトロフェノール（３２９ｇ，２．３７ｍｏｌ）およびＫＯＨ（１５１ｇ，２．７０ｍｏｌ）を１．４Ｌの１：１のエタノール−水混合物中に含む溶液に添加した。この混合物を還流しながら６０時間加熱し、室温まで冷却し、１ＮのＮａＯＨ水溶液（２．０Ｌ）に注ぎ、ジクロロメタン（２×１．２Ｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、１ＮのＮａＯＨ水溶液（１．０Ｌ）およびブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して黄色がかった固体の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オール（２７３ｇ，８２％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８７−３．８３（ｍ，２Ｈ），２．１０−２．０４（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６３．９，１４１．２，１２５．８，１１４．３，６５．８，５９．１，３１．７；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）；Ｃ９Ｈ１１ＮＯ４の計算値：１９７．２，実測値：１９７，１３９，１２３，１０９。
【００４１】
段階Ｂ：３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナールの調製
ジクロロメタン（２９０ｍＬ）中のＮａＢｒ（１８．６ｇ，１８１．２ｍｍｏｌ）およびＴＥＭＰＯ（０．８５ｇ，５．４ｍｍｏｌ）の混合物を、ＮａＯＣｌの冷溶液（２４０ｍＬ、水と１３ｗｔ％ ＮａＯＣｌ水溶液との１：１混合物として）中の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オール（３５．７ｇ，１８１．２ｍｍｏｌ）に、０℃で３０分間かけて添加した。添加が完了すると、混合物は淡黄色になり、これを０℃で１時間撹拌した。得られた混合物を分離した後、有機層を水（３００ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して淡黄色の液体の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナール（３１ｇ，８７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．９３（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ９Ｈ９ＮＯ４の計算値：１９５．２，実測値：１９５，１６７，１３９，１０９，９３，６５。
【００４２】
段階Ｃ：３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールの調製
ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ ｌｒａ−４００（ＣＩ）イオン交換樹脂（３０ｇ）をメタノール（３００ｍＬ）中の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナール（３０ｇ，０．１５ｍｏｌ）の溶液に添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌し、セライトを通してろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、淡黄色の固体の３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナールジメチルアセタール（３０ｇ，８０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｓ，６Ｈ），２．０９−２．１４（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６３．８，１４１．４，１２５．８，１１４．３，１０１．６，６４．８，５３．３，３２．４；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１１Ｈ１５ＮＯ３の計算値：２４１．２，実測値：２４１，１７８，１５２，７５。
【００４３】
段階Ｄ：３−（４−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールの調製
水素化ホウ素ナトリウム（１５．０ｇ，０．３９ｍｏｌ）を、３−（４−ニトロフェノキシ）プロパナールジメチルアセタール（３０．０ｇ，０．１２ｍｏｌ）および塩化銅（Ｉ）（１．２ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）のエタノール（５００ｍＬ）の冷溶液に添加した。混合物を撹拌しながら３０分間６０℃に加熱し、室温まで冷却し、水（２５０ｍＬ）で希釈し、減圧下で濃縮してエタノールを除去し、メチルｔ−ブチルエーテルまたはＭＴＢＥ（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、ブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗残留物を得た。粗残留物を、中性酸化アルミニウムのカラムクロマトグラフィーで４０％酢酸エチル−ヘキサンを溶離液として用いて精製し、濃紫色の液体の３−（４−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタール（１９．５ｇ，７５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．７４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３５（ｓ，６Ｈ），２．０１−２．０６（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５２．３，１３９．１，１１６．７，１１５．６，１０２．１，６４．５，５３．２，３２．８；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１１Ｈ１７ＮＯ３の計算値：２１１．３，実測値：２１１，１４８，１０９，７５。
【００４４】
段階Ｅ：ｍＰＥＧアルデヒドＡジメチルアセタールの調製
直鎖状の２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨ（６０．０ｇ，３ｍｍｏｌ）を３００ｍＬの乾燥ジオキサンにゆっくりと加熱しながら溶解させた。溶液を室温に冷却した後、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネート（５．０ｇ，１９．５ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２．５ｇ，２０．４ｍｍｏｌ）を順次添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、３−（４-アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタール（１５．０ｇ，７１．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した。この混合物を室温でさらに１８時間撹拌した後、ＭＴＢＥ（４．５Ｌ）を４時間かけて滴下した。得られた白色の沈殿を回収し、減圧下で乾燥させて５９．５ｇの粗生成物を得て、これをジクロロメタン（２５０ｍＬ）に再溶解させた。他のバッチのＭＴＢＥ（６．０Ｌ）を４時間かけて滴下して添加した。このようにして得られた白色の沈殿を回収し、減圧下で乾燥させて白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＡジメチルアセタール（５８．０ｇ，９７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５４（ｂｒ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２５（ｓ，６Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），１．９３−１．９７（ｍ，２Ｈ）。
【００４５】
段階Ｆ：ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡジメチルアセタール（５５．０ｇ，２．７５ｍｍｏｌ）を緩衝液（６００ｍＬ，クエン酸−ＨＣｌ−ＮａＣｌ，ｐＨ＝２）に溶解させた。この溶液を室温で２０時間撹拌し、ジクロロメタン（６×２００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で約３５０ｍＬの体積まで濃縮した。次いで、ＭＴＢＥ（６．０Ｌ）を６時間かけて滴下して添加した。得られた白色の沈殿を回収し、減圧下で乾燥させて白色の粉末のｍＰＥＧアルデヒドＡ（５２．０ｇ，９５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７３（ｓ，１Ｈ），９．５６（ｂｒ，１Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），２．８３−２．８７（ｍ，２Ｈ）。
【００４６】
ｍＰＥＧアルデヒドＢの調製：
段階Ａ：４−（４−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールの調製
ｐ−ニトロフルオロベンゼン（１０．０ｇ，７０．７ｍｍｏｌ）を、１，４−ブタンジオール（３１．９ｇ，３５４ｍｍｏｌ）および水酸化カリウム（５．０ｇ，８９．１ｍｍｏｌ）の混合物に、室温で１５分間かけてゆっくりと添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、これを水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機抽出物をブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を酢酸エチル−へキサンから再結晶し、白色固体の４−（４−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オール（９．６ｇ，６４％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８０−３．７５（ｍ，２Ｈ），２．００−１．９４（ｍ，２Ｈ），１．８３−１．７６（ｍ，２Ｈ），１．６５−１．４８（ｂｒ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６４．０，１４１．４，１２５．９，１１４．４，６８．６，６２．３，２９．０，２５．５；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１０Ｈ１３ＮＯ４の計算値：２１１．２，実測値：２１１，１３９，１２３，１０９，７３，５５。
【００４７】
段階Ｂ：４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｂに記載した方法を用いて、４−（４−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールから収率８１％で白色固体の４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．８６（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．１８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２００．３，１６２．８，１４０．５，１２４．９，１１３．５，６６．７，３９．３，２０．７；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１０Ｈ１１ＮＯ４の計算値：２０９．２，実測値：２０９，１３９，１２３，１０９，７１。
【００４８】
段階Ｃ：４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｃに記載した方法を用いて、４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールから収率８２％で淡黄色固体の４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｓ，６Ｈ），１．９０−１．９３（ｍ，２Ｈ），１．８５−１．８１（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６３．９，１４１．３，１２５．８，１１４．３，１０４．０，６８．３，５２．９，２８．９，２４．１；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１２Ｈ１７ＮＯ５の計算値：２５５．３，実測値：２５５，２２４，１９２，１１７，７５。
【００４９】
段階Ｄ：４−（４−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールの調製
４−（４−ニトロフェノキシ）ブタナールジメチルアセタール（４．０ｇ，１５．７ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム担持炭素（０．４ｇ）の存在下、室温で１６時間水素化した。混合物をセライトを通してろ過した後、ろ液を減圧下で濃縮して粗残留物を得て、これを中性酸化アルミニウムのカラムクロマトグラフィーで５０％酢酸エチル−ヘキサンを溶離液として用いて精製し、濃紫色の液体の４−（４−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタール（２．５ｇ，７０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．７０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．５７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３０（ｓ，６Ｈ），１．７８−１．７３（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５１．６，１３９．９，１１５．９，１１５．３，１０４．０，６７．８，５２．４，２８．８，２４．３；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ３の計算値：２２５．３，実測値：２２５，１９４，１６２，１０９，８５。
【００５０】
段階Ｅ：ｍＰＥＧアルデヒドＢジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｅに記載した方法を用いて、直鎖状の２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨおよび４−（４−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールから収率９３％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＢジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５３（ｂｒ，１Ｈ）７．３５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｓ，６Ｈ），１．７１−１．６３（ｍ，４Ｈ）。
【００５１】
段階Ｆ：ｍＰＥＧアルデヒドＢの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｆに記載した方法を用いて、ｍＰＥＧアルデヒドＢジメチルアセタールから収率８７％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＢを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７１（ｓ，１Ｈ），９．５４（ｂｒ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．６０−２．５６（ｍ，２Ｈ），１．９７−１．９３（ｍ，２Ｈ）。
【００５２】
ｍＰＥＧアルデヒドＣの調製：
段階Ａ：３−（３−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ａに記載した方法を用いて、３−ニトロフェノールおよび３−クロロプロパン−１−オールから収率９３％で淡黄色の液体の３−（３−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｓ，１Ｈ），７．４６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．１６−２．０９（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５９．３，１４９．１，１２９．９，１２１．５，１１５．７，１０８．７，６５．７，５９．６，３１．７。
【００５３】
段階Ｂ：３−（３−ニトロフェノキシ）プロパナールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｂに記載した方法を用いて、３−（３−ニトロフェノキシ）プロパン−１−オールから収率７８％で淡黄色の液体の３−（３−ニトロフェノキシ）プロパナールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．９０（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２６−７．２２（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１９９．１，１５８．９，１４９．１，１３０．０，１２１．５，１１６．１，１０８．７，６２．０，４２．８；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ９Ｈ９ＮＯ４の計算値：１９５．２，実測値：１９５，１６７，１３９，９３，６５。
【００５４】
段階Ｃ：３−（３−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｃに記載した方法およびｍＰＥＧアルデヒドＢの調製の段階Ｄに記載した方法を順次用いて、３−（３−ニトロフェノキシ）プロパナールから収率４５％で濃紫色の液体の３−（３−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．０４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３３−６．２４（ｍ，２Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６１（ｂｒ，２Ｈ），３．３６（ｓ，６Ｈ），２．０８−２．０３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５９．９，１４７．６，１３０．０，１０７．９，１０４．５，１０２．１，１０１．６，６３．６，５３．３，３２．８；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１１Ｈ１７ＮＯ３の計算値：２１１．２，実測値：２１１，１９６，１６４，１４８，１０９，７５。
【００５５】
段階Ｄ：ｍＰＥＧアルデヒドＣジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｅに記載した方法を用いて、直鎖状の２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨおよび３−（３−アミノフェノキシ）プロパナールジメチルアセタールから収率９５％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＣジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７２（ｂｒ，１Ｈ），７．１７−７．１３（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９５（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２４（ｓ，６Ｈ），２．００−１．９５（ｍ，２Ｈ）。
【００５６】
段階Ｅ：ｍＰＥＧアルデヒドＣの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｆに記載した方法を用いて、ｍＰＥＧアルデヒドＣジメチルアセタールから収率９５％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＣを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７２（ｓ，１Ｈ），９．６９（ｂｒ，１Ｈ），７．２０−７．１３（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．５５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２４−４．０７（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）。
【００５７】
ｍＰＥＧアルデヒドＤの調製：
段階Ａ：４−（３−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ａに記載した方法を用い、次いでエタノール中で還流しながら濃硫酸と０．５時間反応させて、３−ニトロフェノールおよび２−［（４-クロロブチル）オキシ］テトラヒドロピランから収率８１％で４−（３−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２６−７．１９（ｍ，１Ｈ），４．０８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９６−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．８９−１．７１（ｍ，２Ｈ）；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１０Ｈ１３ＮＯ４の計算値：２１１．２，実測値：２１１，１３９，１２３，１０９，９３，７３，５５。
【００５８】
段階Ｂ：４−（３−ニトロフェノキシ）ブタナールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｂに記載した方法を用いて、４−（３−ニトロフェノキシ）ブタン−１−オールから収率７８％で４−（３−ニトロフェノキシ）ブタナールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．８６（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２２−７．１９（ｍ，１Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２０−２．１４（ｍ，２Ｈ）。
【００５９】
段階Ｃ：４−（３−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｃに記載した方法およびｍＰＥＧアルデヒドＢの調製の段階Ｄに記載した方法を順次用いて、４−（３−ニトロフェノキシブタナールから収率５２％で４−（３−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．１０−７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９４−６．３３（ｍ，３Ｈ），４．４３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），１．８２−１．７８（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６０．１，１６４．５，１３０．１，１０８．３，１０５．３，１０４．３，１０２．１，６７．３，５２．８，２９．１，２４．５；ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ３の計算値：２２５．３，実測値：２２５，１９４，１６４，１０９，８５。
【００６０】
段階Ｄ：ｍＰＥＧアルデヒドＤジメチルアセタールの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｅに記載した方法を用いて、直鎖状の２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨおよび４−（３−アミノフェノキシ）ブタナールジメチルアセタールから収率９０％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＤジメチルアセタールを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７１（ｂｒ，１Ｈ），７．１６−７．１２（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２５（ｓ，６Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），１．７１−１．６４（ｍ，４Ｈ）。
【００６１】
段階Ｅ：ｍＰＥＧアルデヒドＤの調製
ｍＰＥＧアルデヒドＡの調製の段階Ｆに記載した方法を用いて、ｍＰＥＧアルデヒドＤジメチルアセタールから収率９５％で白色粉末のｍＰＥＧアルデヒドＤを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７２（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｂｒ，１Ｈ），７．１６−７．１３（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．７４−２．６１（ｍ，２Ｈ），１．９８−１．９１（ｍ，２Ｈ）。
【００６２】
実施例２：Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの調製
修飾された組み換えヒトインターフェロン−α２ｂ、すなわちＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ法によって複製した。ヒトインターフェロン−α２ｂのフランキング配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃ＮＭ＿０００６０５）に基づいてオリゴヌクレオチドを合成した。誘導されたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。ＩＦＮ変異体をｐＧＥＭ−Ｔクローンを介して再びＰＣＲ増幅し、続いて、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩをクローニングサイトとして用いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ駆動ベクターであるタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。次いで、ベクターｐＥＴ−２４ａをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）株に変換した。変換されたＥ．−ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬをカラマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニカル（５０μｇ／ｍＬ）の存在下で維持することによって高発現クローンを選択した。
【００６３】
１，０００ｍＬのフラスコ中でＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬをＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ遺伝子を用いて増殖させるためにＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地（ＢＤ，２００ｍＬ）を採用した。フラスコを３７℃で２３０ｒｐｍで１６時間振とうした。回分発酵および流加発酵を５リットルのジャーファーメンター（ニュージャージー州、エジソン、ニュー ブランズウィック サイエンティフィク社、Ｂｉｏｆｌｏ ３０００）中で行った。回分発酵は１５０ｍＬの一晩の前培養接種剤ならびにカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニカル（５０μｇ／ｍＬ）、０．４％グリセロールおよび０．５％（ｖ／ｖ）の微量成分（１０ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、０．８４ｇ／ＬのＥＤＴＡ、５０ｍｌ／ＬのＨＣｌ）を含む３ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地を用いた。溶解酸素濃度を３５％に制御し、５ＮのＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨを７．２に維持した。６００ｇ／Ｌのグルコースおよび２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む供給液を準備した。ｐＨが定値を超える値まで上昇した場合、適当な体積の供給液を添加して培地ブロスのグルコース濃度を増加させた。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで加えることによってＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ遺伝子の発現を誘導し、３時間インキュベートした後、培地ブロスを採取した。
【００６４】
回収した細胞ペレットをＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）に約１：１０（湿重量ｇ／ｍＬ）の比で再懸濁させ、マイクロ流動化装置で分裂させ、次いで１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。封入体（ＩＢ）を含むペレットを、ＴＥＮ緩衝液で二回洗浄し、上記のように遠心分離した。次いで、ＩＢを含むペレットを、４ＭのグアニジウムＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）水溶液１５０ｍＬに懸濁させ、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その後、ＩＢを６ＭのＧｕＨＣｌ溶液５０ｍＬに可溶化させた。ＧｕＨＣｌに可溶化させた材料を２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。変性したＩＢを、新たに調製し添加の間のみ撹拌したリフォールディング緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ＭのＬ−アルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ）１．５Ｌで希釈することによってリフォールディングを開始した。リフォールディング反応混合物を撹拌せずに４８時間インキュベートした。リフォールディングされた組み換えヒトインターフェロン−α２ｂ（すなわちＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ）を２０ｍＭのトリス緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１Ｍの尿素を含む、ｐＨ７．０）に対して透析し、Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィーでさらに精製した。
【００６５】
リフォールディングされた組み換えヒトタンパク質Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮをＱ−セファロースカラム（ペンシルバニア州、ピッツバーグ、ＧＥ アマシャムファルマシア社製）にロードした。カラムを予備平衡にし、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。生成物を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）および２００ｍＭのＮａＣｌの混合物で溶離した。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを含むフラクションを、その２８０ｎｍでの吸光度に基づいて回収した。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの濃度を、ブラッドフォード法を用いたプロテインアッセイキット（イリノイ州、ロックフィールド、ピアス社製）によって決定した。
【００６６】
実施例３：ｍＰＥＧアルデヒドＡとＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮとの結合
ｍＰＥＧアルデヒドＡおよびＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを含む代表的なポリペプチド−高分子結合体を以下のように調製した。
【００６７】
上記実施例２で調製したＱ−セファロース精製したＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ（１ｍｇ）を、ｍＰＥＧアルデヒドＡで処理した。最終の反応混合物は５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５ｍＭのシアノホウ水素化ナトリウム（ウィスコンシン州、ミルウォーキー、アルドリッチ社製）および１０ｍｇのｍＰＥＧアルデヒドＡを含有した。その後、混合物を室温で２０時間インキュベートし、主生成物としてモノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを得て、次いでこれをＳＰ ＸＬセファロースクロマトグラフィー（ペンシルバニア州、ピッツバーグ、ＧＥ アマシャムファルマシア社製）で精製した。具体的には、ＳＰカラムを予備平衡にし、２０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．４）で洗浄した。次いで、モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）および６０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶離させた。未反応のＩＦＮ、すなわちＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）および２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶離させた。溶離させたフラクションをゲル電気泳動で１２％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルを用いて分析し、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０および銀染色剤で染色することによって信号を検出した。モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮを含むフラクションを、その保持時間および２８０ｎｍでの吸光度に基づいて回収した。モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの濃度を、ブラッドフォード法を用いたプロテインアッセイキット（イリノイ州、ロックフィールド、ピアス社製）によって決定した。モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの単離収率は３０％〜４０％であった。
【００６８】
実施例４：モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの物理的および生物学的特性
上記のペグ化反応の特異性をＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮおよびモノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの両方のトリプシンペプチドマッピングによって決定した。各化合物の１００μｇの試料を減圧乾燥させ、６０μＬの８Ｍ尿素／０．４Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液で再構成させた。還元剤およびヨード酢酸で処理した後、溶液をプロメガ社のトリプシン（シークエンシンググレード）を用いて分解させた。アリコートを採取し、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムに注入した。得られたトリプシンペプチドを、０〜７０％のアセトニトリルを０．１％のＴＦＡ−Ｈ２Ｏ中に含む７５−ｍｉｎグラジエント溶離液を用いて分離した。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮおよびモノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮの両方の試料からのペプチドフラグメントをその２１４ｎｍでの吸光度によってモニターし、手作業で回収し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃシステムで乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。両方の試料のデータの比較から、ペグ化反応の主なサイトはＳｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮのＮ−末端で生じることが示された。
【００６９】
モノＰＥＧ化−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮおよび他の修飾されたヒトＩＦＮ−α２ｂ変異体のモノＰＥＧ化産物（すなわちモノＰＥＧ化−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＩＦＮ、−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ、−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＩＦＮ、−Ｐｒｏ−ＩＦＮ、および−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ）の抗ウイルス活性を、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に攻撃されたウシ腎臓上皮細胞（ＭＤＢＫ）において試験した。感染した細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１をアッセイに添加した後、生存する細胞性酵素からのホルマザンの生成によって決定した。このＣＰＥバイオアッセイを、各濃度で３点のデータ点を用いて行った。これらのすべてのモノＰＥＧ化修飾ヒトＩＦＮ−α２ｂ化合物の特異的な抗ウイルス活性を、５０％の細胞保護（ＥＣ５０、すなわち５０％の細胞変性効果）を与える濃度に基づいて計算した。ＣＰＥ抗ウイルスバイオアッセイの結果をＲｏｆｅｒｏｎ（登録商標）を参照標準として用いてＩＵ／ｍｇの単位で報告した。その結果、モノＰＥＧ化Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮのＣＰＥバイオアクティビティは２．０×１０８であり、他のモノＰＥＧ化ヒトＩＦＮ−α２ｂ変異体のＣＰＥバイオアクティビティは８．３×１０６〜２．９×１０７ＩＵ／ｍｇで変化した。
【００７０】
他の実施形態
本明細書中に開示された全ての特徴は任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書中に開示された特徴はそれぞれ同一の、等価の、または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられてもよい。したがって、特に言及しないかぎり、開示された特徴は等価のまたは類似の特徴の一般的な系列の一例にすぎない。
【００７１】
上記の記載から、当業者であれば本発明の本質的な特徴を容易に確認でき、本発明の思想および技術的範囲を逸脱することなく、本発明をさまざまな用途および条件に適合させるために本発明に多様な変化および修正を与えることができるであろう。したがって、他の実施形態もまた以下の特許請求の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド部位；
ポリアルキレンオキシド部位；
前記ポリペプチド部位を前記ポリアルキレンオキシド部位に結合させるリンカー；
前記ポリペプチド部位と前記リンカーとの間の第１の結合；および
前記ポリアルキレンオキシド部位と前記リンカーとの間の第２の結合；
を含むポリペプチド−高分子結合体であって、
前記ポリペプチド部位がヒトインターフェロン−α部位、および前記ヒトインターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を含み；
前記ポリアルキレンオキシド部位が１〜２０，０００のＣ１〜Ｃ８アルキレンオキシド繰り返し単位を含み、前記リンカーがＣ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ１〜Ｃ８へテロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、または−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでＡｒはアリーレンまたはヘテロアリーレンであり、ＸはＯ、ＳまたはＮ（Ｒ）であり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、ｎは１〜１０であり；前記第１の結合および前記第２の結合は、それぞれ独立してカルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カルバメート、ウレア、エーテル、チオ、スルホニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネート、またはホスフェート基である、ポリペプチド−高分子結合体。
【請求項２】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、ヒトインターフェロン−α２ｂ部位である、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記ポリペプチド部位が−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮであり、ＩＦＮがヒトインターフェロン−α２ｂ部位である、請求項２に記載の結合体。
【請求項４】
前記ポリアルキレンオキシド部位が、５〜１０，０００の繰り返し単位を有するポリエチレンオキシド部位である、請求項３に記載の結合体。
【請求項５】
前記ポリエチレンオキシド部位が、２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する、請求項４に記載の結合体。
【請求項６】
前記リンカーが、−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−である、請求項５に記載の結合体。
【請求項７】
Ａｒがフェニレンである、請求項６に記載の結合体。
【請求項８】
ＸがＯである、請求項７に記載の結合体。
【請求項９】
ｎが３である、請求項７に記載の結合体。
【請求項１０】
前記第１の結合がアミノ基であり、前記第２の結合がカルバメート基である、請求項９に記載の結合体。
【請求項１１】
前記結合体が、
【化１】
であり、ここでｍＰＥＧはメトキシキャップポリエチレンオキシド部位である、請求項１０に記載の結合体。
【請求項１２】
前記ポリアルキレンオキシド部位が、５〜１０，０００の繰り返し単位を有するポリエチレンオキシド部位である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１３】
前記ポリエチレンオキシド部位が、２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する、請求項１２に記載の結合体。
【請求項１４】
前記リンカーが、−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１５】
Ａｒがフェニレンである、請求項１４に記載の結合体。
【請求項１６】
ＸがＯである、請求項１５に記載の結合体。
【請求項１７】
ｎが３である、請求項１６に記載の結合体。
【請求項１８】
前記第１の結合がアミノ基であり、前記第２の結合がカルバメート基である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１９】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、Ｎ−末端にシステイン残基を有する、請求項１に記載の結合体。
【請求項２０】
ポリペプチド部位；
ポリアルキレンオキシド部位；
前記ポリペプチド部位を前記ポリアルキレンオキシド部位に結合させるリンカー；
前記ポリペプチド部位と前記リンカーとの間の第１の結合；および
前記ポリアルキレンオキシド部位と前記リンカーとの間の第２の結合；
を含むポリペプチド−高分子結合体であって、
前記ポリアルキレンオキシド部位が１〜２０，０００のＣ１〜Ｃ８アルキレンオキシド繰り返し単位を含み、前記リンカーがＡｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでＡｒはアリーレンまたはヘテロアリーレンであり、ＸはＯ、Ｓ、またはＮ（Ｒ）であり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、ｎは１〜１０であり；前記第１の結合および前記第２の結合は、それぞれ独立してカルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カルバメート、ウレア、エーテル、チオ、スルホニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネート、またはホスフェート基である、ポリペプチド−高分子結合体。
【請求項２１】
Ａｒがフェニレンである、請求項２０に記載の結合体。
【請求項２２】
ＸがＯである、請求項２１に記載の結合体。
【請求項２３】
ｎが３である、請求項２２に記載の結合体。
【請求項２４】
前記ポリペプチド部位が、インターフェロン−α部位、および前記インターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を含む、請求項２０に記載の結合体。
【請求項２５】
前記ポリペプチド部位が、インターフェロン−β部位または顆粒球コロニー刺激因子を含む、請求項２０に記載の結合体。
【請求項２６】
化学式（Ｉ）で表される化合物：
【化２】
式中
ｍＰＥＧはメトキシキャップポリエチレンオキシド部位であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つはＣＨＯで置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、
他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。
【請求項２７】
前記ｍＰＥＧが、５〜１０，０００の繰り返し単位を含む、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
前記ｍＰＥＧが、２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ２が、ＣＨＯで置換されたプロピルまたはＣＨＯで置換されたブチルである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ３が、ＣＨＯで置換されたプロピルまたはＣＨＯで置換されたブチルである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３１】
インターフェロン−α部位、および前記インターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を含む、ポリペプチド。
【請求項３２】
前記インターフェロン−α部位が、ヒトインターフェロン−α部位である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、ヒトインターフェロン−α２ｂ部位である、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、Ｎ−末端にシステイン残基を有する、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、野生型インターフェロン−α部位である、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＩＦＮ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ、Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＩＦＮ、Ｐｒｏ−ＩＦＮまたはＧｌｙ−Ｍｅｔ−ＩＦＮであり、ＩＦＮがヒトインターフェロン−α２ｂ部位である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記インターフェロン−α部位が、野生型インターフェロン−α部位である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項１】
ポリペプチド部位；
ポリアルキレンオキシド部位；
前記ポリペプチド部位を前記ポリアルキレンオキシド部位に結合させるリンカー；
前記ポリペプチド部位と前記リンカーとの間の第１の結合；および
前記ポリアルキレンオキシド部位と前記リンカーとの間の第２の結合；
を含むポリペプチド−高分子結合体であって、
前記ポリペプチド部位がヒトインターフェロン−α部位、および前記ヒトインターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を含み；
前記ポリアルキレンオキシド部位が１〜２０，０００のＣ１〜Ｃ８アルキレンオキシド繰り返し単位を含み、前記リンカーがＣ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ１〜Ｃ８へテロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、または−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでＡｒはアリーレンまたはヘテロアリーレンであり、ＸはＯ、ＳまたはＮ（Ｒ）であり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、ｎは１〜１０であり；前記第１の結合および前記第２の結合は、それぞれ独立してカルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カルバメート、ウレア、エーテル、チオ、スルホニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネート、またはホスフェート基である、ポリペプチド−高分子結合体。
【請求項２】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、ヒトインターフェロン−α２ｂ部位である、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記ポリペプチド部位が−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮであり、ＩＦＮがヒトインターフェロン−α２ｂ部位である、請求項２に記載の結合体。
【請求項４】
前記ポリアルキレンオキシド部位が、５〜１０，０００の繰り返し単位を有するポリエチレンオキシド部位である、請求項３に記載の結合体。
【請求項５】
前記ポリエチレンオキシド部位が、２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する、請求項４に記載の結合体。
【請求項６】
前記リンカーが、−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−である、請求項５に記載の結合体。
【請求項７】
Ａｒがフェニレンである、請求項６に記載の結合体。
【請求項８】
ＸがＯである、請求項７に記載の結合体。
【請求項９】
ｎが３である、請求項７に記載の結合体。
【請求項１０】
前記第１の結合がアミノ基であり、前記第２の結合がカルバメート基である、請求項９に記載の結合体。
【請求項１１】
前記結合体が、
【化１】
であり、ここでｍＰＥＧはメトキシキャップポリエチレンオキシド部位である、請求項１０に記載の結合体。
【請求項１２】
前記ポリアルキレンオキシド部位が、５〜１０，０００の繰り返し単位を有するポリエチレンオキシド部位である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１３】
前記ポリエチレンオキシド部位が、２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する、請求項１２に記載の結合体。
【請求項１４】
前記リンカーが、−Ａｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１５】
Ａｒがフェニレンである、請求項１４に記載の結合体。
【請求項１６】
ＸがＯである、請求項１５に記載の結合体。
【請求項１７】
ｎが３である、請求項１６に記載の結合体。
【請求項１８】
前記第１の結合がアミノ基であり、前記第２の結合がカルバメート基である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１９】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、Ｎ−末端にシステイン残基を有する、請求項１に記載の結合体。
【請求項２０】
ポリペプチド部位；
ポリアルキレンオキシド部位；
前記ポリペプチド部位を前記ポリアルキレンオキシド部位に結合させるリンカー；
前記ポリペプチド部位と前記リンカーとの間の第１の結合；および
前記ポリアルキレンオキシド部位と前記リンカーとの間の第２の結合；
を含むポリペプチド−高分子結合体であって、
前記ポリアルキレンオキシド部位が１〜２０，０００のＣ１〜Ｃ８アルキレンオキシド繰り返し単位を含み、前記リンカーがＡｒ−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでＡｒはアリーレンまたはヘテロアリーレンであり、ＸはＯ、Ｓ、またはＮ（Ｒ）であり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、ｎは１〜１０であり；前記第１の結合および前記第２の結合は、それぞれ独立してカルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カルバメート、ウレア、エーテル、チオ、スルホニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネート、またはホスフェート基である、ポリペプチド−高分子結合体。
【請求項２１】
Ａｒがフェニレンである、請求項２０に記載の結合体。
【請求項２２】
ＸがＯである、請求項２１に記載の結合体。
【請求項２３】
ｎが３である、請求項２２に記載の結合体。
【請求項２４】
前記ポリペプチド部位が、インターフェロン−α部位、および前記インターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を含む、請求項２０に記載の結合体。
【請求項２５】
前記ポリペプチド部位が、インターフェロン−β部位または顆粒球コロニー刺激因子を含む、請求項２０に記載の結合体。
【請求項２６】
化学式（Ｉ）で表される化合物：
【化２】
式中
ｍＰＥＧはメトキシキャップポリエチレンオキシド部位であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つはＣＨＯで置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、
他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。
【請求項２７】
前記ｍＰＥＧが、５〜１０，０００の繰り返し単位を含む、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
前記ｍＰＥＧが、２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ２が、ＣＨＯで置換されたプロピルまたはＣＨＯで置換されたブチルである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ３が、ＣＨＯで置換されたプロピルまたはＣＨＯで置換されたブチルである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３１】
インターフェロン−α部位、および前記インターフェロン−α部位のＮ−末端に１〜６のさらなるアミノ酸残基を含む、ポリペプチド。
【請求項３２】
前記インターフェロン−α部位が、ヒトインターフェロン−α部位である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、ヒトインターフェロン−α２ｂ部位である、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、Ｎ−末端にシステイン残基を有する、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ヒトインターフェロン−α部位が、野生型インターフェロン−α部位である、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＩＦＮ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−ＩＦＮ、Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＩＦＮ、Ｐｒｏ−ＩＦＮまたはＧｌｙ−Ｍｅｔ−ＩＦＮであり、ＩＦＮがヒトインターフェロン−α２ｂ部位である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記インターフェロン−α部位が、野生型インターフェロン−α部位である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【公表番号】特表２００９−５２４５９８（Ｐ２００９−５２４５９８Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４８８６７（Ｐ２００８−５４８８６７）
【出願日】平成１８年１２月２９日（２００６．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６２７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７９４０４
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０８１９７３７６）ファーマエッセンティア コーポレイション (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２９日（２００６．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６２７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７９４０４
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０８１９７３７６）ファーマエッセンティア コーポレイション (5)
【Ｆターム（参考）】
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