蛋白質結合性高分子とその用途
【課題】本発明では、蛋白質を安定に包含した安定な粒子を形成し、粒子径が約１００から２００ｎｍのものとなるような蛋白質と高分子の静電複合体粒子を作製し提供することである。これにより、腸管あるいは粘膜等から吸収され、生体内に取り込まれることが可能となるため、新たな蛋白質の経口あるいは非経口の投与方法を提供できる。
【解決手段】、式１のアニオン性高分子を作製し、塩基性蛋白質と静電複合体を形成させることができることを見出し、この静電複合体が塩基性蛋白質の高分子キャリヤーとして機能することを明らかにした。
【化１】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは５から３４７の整数を表す。分子量が４０００から１０００００である。］
【解決手段】、式１のアニオン性高分子を作製し、塩基性蛋白質と静電複合体を形成させることができることを見出し、この静電複合体が塩基性蛋白質の高分子キャリヤーとして機能することを明らかにした。
【化１】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは５から３４７の整数を表す。分子量が４０００から１０００００である。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質を包含して所望の部位に搬送できる高分子キャリヤーに関するものである。更には、この高分子キャリヤーを用いて、経口または非経口の投与を可能にする、蛋白質との静電複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え技術の確立により、生理活性蛋白質の大量生産が可能となり、小人症に対するｈＧＨ補充療法、悪性貧血や癌化学療法時のＥＰＯ， Ｇ−ＣＳＦによる造血療法などの医療分野で、多大な貢献をもたらしている。カルシトニンやインスリン、ｈＧＨについても、遺伝子組み換え技術にて量産が可能となっている。しかし、これら蛋白質やペプチドをもっと多くの患者に広範に適応するには、在宅においても服用が可能な経口製剤、経粘膜製剤の開発が必要である。
非特許文献２、３に示されるように、蛋白質の消化管吸収性を改善するための方策が種々検討されている。非特許文献３では、従来の試みは充分なものではないと考え、蛋白質を脂肪酸で化学修飾して、消化管における吸収性と安定性を向上させている。
このように、蛋白質に関する製剤処方は多く報告されているが、その効果は不十分で、さらに優れた高分子キャリヤーが求められている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−０９２３８８
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３３８， １４９９−１５０６（２００５）
【非特許文献２】日本臨床，５６（３），５８９−５９４（１９９８）
【非特許文献３】日本臨床，５６（３），６０１−６０７（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明では、分岐鎖を有するアニオン性ポリマーを構成要素とする蛋白質の結合性高分子キャリヤーを提供することを目的とする。また、該高分子キャリヤーと蛋白質との間で形成される静電複合体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために、式１のアニオン性高分子化合物を作製したところ、本発明の高分子化合物が蛋白質と静電複合体を形成して、蛋白質の高分子キャリヤーとなることを見出した。
【化１】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは５から３４７の整数を表す。分子量が４０００から１０００００である。］
【０００６】
更に、式１のアニオン性高分子化合物の蛋白質との凝集安定性を向上させるために、アニオン性高分子と感温性高分子をブロック化して以下の式２の高分子化合物を作製した。
【化２】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは４から３４７の整数を表す。ＢはＮ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは２から２５３の整数を表わす。分子量が４０００から１０００００である。］
上記式１と式２のアニオン性高分子化合物を用いて、例えば塩基性蛋白質との静電複合体を作製すると、この静電複合体はアニオン性の静電複合体となっている。
【０００７】
本発明者らは、これまでの遺伝子治療用高分子キャリヤーの研究から、カチオン性のキャリヤー粒子が細胞吸収性に優れていることを見出しているので、この知見を蛋白質にも適用し、更に上記静電複合体の腸管での吸収性を向上させるために、上記塩基性蛋白質の静電複合体粒子の外層に以下の式３のカチオン性高分子化合物を付加させ、新たなカチオン性の静電複合体粒子を作製した。
【化３】
［式中、Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｎは５から２５２の整数を表す。Ｂは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは５から２５２の整数を表わす。分子量が４０００から１０００００である。］
【０００８】
本発明者らは、塩基性蛋白質と上記のアニオン性高分子化合物やカチオン性高分子化合物との静電複合体粒子を作製し、経口的に投与したところ、腸管から吸収されやすいことを見出した。これらの結果から、本発明のアニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物を使用すれば、塩基性蛋白質や酸性蛋白質の新たなキャリヤーになり得ることを見出した。特に、塩基性蛋白質のアニオン性静電複合体粒子にカチオン性高分子化合物を付加させた粒子は、塩基性蛋白質を経口的に腸管で吸収させるため新たなツールとして有効であることを見出した。以上に知見に基づいて本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）下記の式１：
【化１】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ
−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは５から３４７の整数を表す。］で示される、分子量が４０００から１０００００であるアニオン性高分子化合物。
（２）分子量が１００００以上である、上記（１）記載のアニオン性高分子化合物。
（３）ｎが２３から８７である、上記（１）又は（２）に記載のアニオン性高分子化合物。
【００１０】
（４）下記の式２：
【化２】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは４から３４７の整数を表す。ＢはＮ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは２から２５３の整数を表わす。］で示される、分子量が４０００から１０００００である、アニオン性高分子化合物。
（５）分子量が１００００以上である、上記（４）記載のアニオン性高分子化合物。
（６）Ａがカルボキシル基であり、ＢがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、上記（４）または（５）記載のアニオン性高分子化合物。
（７）ｎが２３から８７の整数を表わし、ｍが１１から２５の整数を表わす、上記（４）から（６）のいずれかに記載のアニオン性高分子化合物。
【００１１】
（８）下記の式３：
【化３】
［式中、Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｎは５から２５２の整数を表す。Ｂは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは５から２５２の整数を表わす。］で示される、分子量が４０００から１０００００である、カチオン性高分子化合物。
（９）分子量が１００００以上である、上記（８）記載のカチオン性高分子化合物。
（１０）Ｂが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、ＣがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、上記（８）または（９）記載のカチオン性高分子化合物。
（１１）ｎが５から１６１の整数を表わし、ｍが７から２５２の整数を表わす、上記（８）から（１０）のいずれかに記載のカチオン性高分子化合物。
（１２）Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、ＢがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、上記（８）または（９）記載のカチオン性高分子化合物。
（１３）ｎが７から２５２の整数を表わし、ｍが５から１６１の整数を表わす、上記（１２）に記載のカチオン性高分子化合物。
【００１２】
（１４）塩基性蛋白質と上記（１）から（７）に記載のアニオン性高分子化合物との静電複合体であって、蛋白質の重量を１として、該化合物が重量比で１から３２の組成である塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
（１５）塩基性蛋白質と上記（１）から（７）に記載のアニオン性高分子化合物との静電複合体であって、蛋白質の重量を１として、該化合物が重量比で３から３２の組成である塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
（１６）該静電複合体粒子がアニオン性であり、粒子径が５０から２５０ｎｍである、上記（１４）又は（１５）記載の塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
（１７）塩基性蛋白質が、カルシトニンまたはヒト成長ホルモンである、上記（１４）から（１５）のいずれかに記載の静電複合体粒子。
（１８）上記（１５）から（１７）に記載の静電複合体粒子に、上記（８）から（１３）のカチオン性高分子化合物を静電複合体形成に使用したアニオン性高分子化合物の０．５から４倍量を付加して得られる付加粒子。
【発明の効果】
【００１３】
塩基性蛋白質は、本発明の式１と式２のアニオン性高分子化合物と静電複合体を形成し、また、酸性蛋白質は式３のカチオン性高分子化合物と静電複合体を形成する。細胞表面はアニオン性であるため、腸管吸収を促進させるためには、静電複合体の荷電はカチオン性であることが望ましい。塩基性蛋白質の場合、本発明の式１と式２のアニオン性高分子化合物と反応して生成する静電複合体粒子はアニオン性となるため、更に式３のカチオン性高分子化合物を添加して、粒子の外層がカチオン性となった付加粒子を形成させる。これにより、このカチオン性付加粒子は腸管吸収性が向上した。一方、酸性蛋白質の場合には、式３のカチオン性高分子化合物との静電複合体はカチオン性となるため、この複合体を使用することにより、腸管吸収性の向上が可能である。
このように、蛋白質が塩基性であるか酸性であるかによって、本発明の式１と式２のアニオン性高分子化合物、式３のカチオン性高分子化合物を使用して、蛋白質との静電複合体を形成させ、静電複合体の荷電の量を、式１から式３の高分子化合物を組み合わせて使用することにより、調整することができる。即ち、蛋白質の新たなキャリヤーとして、本発明の式１から式３の高分子化合物の組み合わせによる、蛋白質の混合静電複合体粒子を提供できることが見出せた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
−本発明の第一の態様−
本発明の第一の態様は、蛋白質と静電複合体を形成し得る、式１から式３のアニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物に関するものである。
本発明の式１から式３の分子量とは、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定された各化合物の数平均分子量を表し、分子量が４０００から１０００００の範囲の数値である。好ましい分子量としては、４０００から６００００の範囲を挙げることができる。より好ましくは、１００００から６００００を挙げることができる。
本発明の式１から式３の高分子化合物におけるｎとｍの整数の値は、式１から式３の本発明化合物に関する以下に示す合成方法に基づき、ＧＰＣによる各高分子化合物の数平均分子量と、使用したアクリル酸誘導体の分子量から算出される。
【００１５】
式１から式３の化合物の合成方法を以下に説明する。特許文献１に示されている方法に準じて光重合反応を利用して、それぞれの化合物を合成する。例えば、式４
【化４】
で示される化合物と、モノマーである、アクリル酸、ｐ−ビニル安息香酸メチル、ｐ−ビニルベンゼンスルホニルメチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをそれぞれ使用し、メタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、ＵＶ照射下にリビング重合を行う。式１の高分子化合物は、アニオン性の官能基を持つ、アクリル酸、ｐ−ビニル安息香酸メチル、ｐ−ビニルベンゼンスルホニルメチルを使用し、式４の化合物と光重合し、エステル基を加水分解することにより合成することができる。
式２の高分子化合物は、上述するように式４の化合物とアニオン性官能基を持つモノマーを光重合させた後に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをそれぞれ加えて更に光重合を行うことによって合成できる。
式３の高分子化合物は、式４の化合物とカチオン性の官能基を持つモノマー（例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）を光重合させ、その後、更にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどを加えて光重合することによって合成することができる。また、式４の化合物に付加させる順序が逆である高分子化合物も同様に合成することができる。即ち、式４の化合物とＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどを光重合させた後、更にカチオン性の官能基を持つモノマー（例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）加えて光重合させ合成することができる。
合成された式１と式２のアニオン性高分子あるいは式３のカチオン性高分子は、メタノール溶液を大量のジエチルエーテルに滴下することによる沈殿法を繰り返す、再沈殿法を用いて、あるいは水溶液を透析処理することで精製することができる。
【００１６】
式２や式３の高分子化合物においてＮ−イソプロピルアクリルアミドが重合した領域は疎水性が高くなり、加熱するとその領域が凝集するようになっている。そのため、式２や式３の高分子化合物の３次元構造が大きく変わり、新たな物性を高分子化合物に付与することができる。そこで、このＮ−イソプロピルアクリルアミドが重合した領域を感温性領域（部分）と名付ける。
加熱することによる３次元構造の変化を、具体的に式３のカチオン性高分子化合物を用いて説明する。上述の合成方法で示されるように、感温性領域が４本の側鎖の中心部分に存在する化合物（以下の式５で示される高分子化合物）と感温性領域が４本の側鎖の先端部分に存在する化合物（以下の式６で示される高分子化合物）の２種の化合物（ブロック構造の異なる化合物）が存在する。
【００１７】
【化５】
［式中、ｎ、ｍはモノマーの重合度を表わす整数であり、ｎはカチオン性官能基の付いたカチオン性領域の数平均分子量から算出される数字である。ｍは感温性領域の数平均分子量から算出される数字である。全分子量は４０００から１０００００である。］
【００１８】
【化６】
［式中、ｎ、ｍはモノマーの重合度を表わす整数であり、ｍはカチオン性官能基の付いたカチオン性領域の数平均分子量から算出される数字である。ｎは感温性領域の数平均分子量から算出される数字である。全分子量は４０００から１０００００である。］
【００１９】
これら２種の式５と式６の高分子化合物を加熱すると、感温性領域の凝集が起こり、それぞれ図１と図２に示すような３次元構造の変化が生じた。図１の凝集構造を、イソギンチャクに似ていることから、イソギンチャク構造と名付けた。図２の凝集構造を、クモに似ていることから、スパイダー構造と名付けた。
【００２０】
式１のアニオン性高分子化合物におけるｎの値は、式１の高分子化合物のＧＰＣによる数平均分子量から、使用したモノマーの分子量と側鎖の数（４本）で除して算出される整数である。なお、式４の化合物の分子量は計算に加えなかった。
式１の分子量としては、４０００から１０００００の範囲の数値を表し、好ましくは、１７０００から２５０００の範囲の数値を表す。アクリル酸、ｐ−ビニル安息香酸、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸の分子量は、それぞれ、７２、１４８、１８４である。従って、ｎの値は５から３４７の範囲にある。好ましい範囲としては、２３から８７の範囲を挙げることができる。
【００２１】
式２のアニオン性高分子化合物におけるｎとｍの値は、式４の化合物にアニオン性モノマーが付加重合しただけの合成中間化合物の数平均分子量と、更にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどを光重合させた後の式２の高分子化合物の数平均分子量から、それぞれのモノマーに由来する分子量が概算され、この分子量を使用したモノマーの分子量と側鎖の数（４本）で除して算出される整数である。
アニオン性モノマー由来の領域の分子量としては、３０００から１０００００の範囲の数値を表し、より好ましくは１７０００から２５０００となる数値を表す。更に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどに由来する分子量としては、１０００から１０００００の範囲の数値を表す。好ましくは、５０００から１００００の範囲の数値を表す。上述のごとく、アニオン性モノマーの分子量で上記の合成中間化合物の分子量を除すことにより、ｎの値は、４から３４７の範囲であり、好ましくは２３から８７の範囲を挙げることができる。一方、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの分子量は、９９、１１３であるので、ｍの値は、２から２５３の範囲であり、好ましくは１１から２５の範囲を挙げることができる。
【００２２】
式３におけるカチオン性高分子化合物におけるｎとｍの値は、カチオン性モノマーに由来する領域が、ｎで表わされる領域であるのか、ｍで表わされる領域であるのかで異なる。式５で表わされるイソギンチャク構造を取る高分子化合物においては、カチオン性モノマー由来の分子量としては、３０００から１０００００の範囲を表わし、好ましくは、３０００から１００００の範囲を示す。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに由来する領域の分子量としては、３０００から１０００００の範囲を表わし、好ましくは３０００から２４０００の範囲を挙げることができる。なお、カチオン性モノマー（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）の分子量が１５５であるので、式５の高分子化合物においては、ｎの値は、５から１６１の範囲を表わし、好ましいものとしては５から１６の範囲を挙げることができる。ｍの値は、７から２５２の範囲を表わし、好ましくは７から６０の範囲を挙げることができる。
式６の高分子化合物におけるｎとｍの値は、式５のｎとｍの値を交換したものであり、ｎの値は、７から２５２の範囲を表わし、好ましくは７から６０の範囲を挙げることができる。ｍの値は、５から１６１の範囲を表わし、好ましいものとしては５から１６の範囲を挙げることができる。
【００２３】
−本発明の第二の態様−
本発明の第二の態様は、塩基性蛋白質と上述の式１と式２のアニオン性高分子化合物との静電複合体、更に式３のカチオン性高分子化合物が付加した混合静電複合体（付加粒子）に関するものである。
本発明で言う「静電複合体」とは、塩基性蛋白質と酸性のアニオン性化合物が静電的に結合して得られる複合体（塩）のことを言う。この静電複合体は、蛋白質の重量を１重量部として、式１または式２のアニオン性化合物を３から３２重量部を加えて、蛋白質−アニオン性化合物静電複合体を形成させることができる。好ましくは、式１または式２のアニオン性化合物を３から３２重量部を加えて、静電複合体を形成させることが挙げられる。
この蛋白質静電複合体は、水溶液中で分散して微細な粒子構造を形成しており、蛋白質とアニオン性高分子の構成モル比によっては、酸性（アニオン性）の粒子になったり、塩基性（カチオン性）の粒子になったりする。これを総称して本発明では「静電複合体粒子
」と言う。なお、本発明の蛋白質静電複合体粒子においては、カチオン性高分子化合物の荷電量が蛋白質の荷電量より多くなるため、結果的には酸性（アニオン性）になっている。
上記アニオン性の蛋白質静電複合体粒子の粒子径は、濃度の影響を受けやすく、例えば図３から図４に示されるように高濃度では安定で１５０から２００ｎｍのサイズであるが、低濃度になると粒子径が拡大し７００ｎｍを超えるようになる傾向が見られた。
【００２４】
本発明で言う「カチオン性高分子化合物の付加粒子」とは、溶液中の上記アニオン性の蛋白質静電複合体粒子に、式３のカチオン性化合物を添加し、静電複合体粒子の外層にカチオン性化合物を付加させた粒子（混合静電複合体）のことを表す。本発明の付加粒子は、カチオン性化合物が静電複合体粒子の外層に付加されているため、粒子構造が安定化して上述のような濃度の影響は受けなくなっている。
なお、本発明のカチオン性化合物付加粒子は、カチオン性化合物で被覆されている粒子であり、粒子全体としての電荷はカチオン性になっている。このカチオン性化合物付加粒子（混合静電複合体）は、出発物質である蛋白質静電複合体粒子のアニオン性（酸性）が強いほど安定であって、粒子径も小さくなる傾向がある。逆に出発物質の蛋白質静電複合体粒子のアニオン性（酸性）が弱ければ、不安定になり、粒子径が拡大する傾向にある。例えば図５に示すように、蛋白質に添加するアニオン性高分子化合物の量が少なければ、生成した静電複合体にカチオン性高分子化合物を付加させた場合、添加量が増大してくると粒子径が１３０ｎｍから拡大して７００ｎｍを超えるようになる傾向が見られた。一方、蛋白質に添加するアニオン性高分子化合物の量が充分であれば、生成した静電複合体にカチオン性化合物を付加させた場合、添加量が増大しても粒子径は拡大せず、縮小する傾向になる。例えば図６に示されるように１３０ｎｍから７０ｎｍに粒子が締まってくる傾向が見られる。
更に、特許文献１や非特許文献１の結果を参考にすると、核酸の場合と同じように蛋白質に関しても、生体内への蛋白導入効率を向上できるようになる。
【００２５】
本発明の蛋白質静電複合体粒子をアニオン性（酸性）するためには、使用されるアニオン性化合物のアニオン性（酸性）が強いことが望ましい。この酸性の強さは、有機酸を持つモノマーの重合度に比例すると考えられる。例えばモノマーとしてアクリル酸を使用する場合には、アクリル酸の重合度に比例すると考えられる。例えば、図８に示されるように、静電複合体粒子の溶液中での安定性も、アクリル酸の重合度が高い（酸性が高い）ものがより安定であることが示されている。
【００２６】
以上のことから、本発明の蛋白質静電複合体粒子を安定に且つ粒子径を小さくするには、アニオン性高分子化合物の分子量は、４０００から１０００００の範囲であり、好ましくは約１万以上である。
また、蛋白質に対して、アニオン性化合物の添加量が多くなれば、上記の分子量の効果と同じ効果が見られる。例えば図９に示されるように、アニオン性化合物の添加量が多くなれば、静電複合体粒子の粒子径は縮小する傾向にある。また、溶液の散乱強度（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）から、分子量約１万のアニオン性化合物を用いて、蛋白質１重量部に対して３重量部あれば、静電複合体粒子が充分形成されることが分かった。それ故、これ以上のアニオン性化合物を添加しても静電複合体形成に加わることがなく、過剰のアニオン性化合物として溶液中に共存することになることが分かった。
【００２７】
本発明で言う「蛋白質」とは、生理活性を示す蛋白質であれば特に限定されないが、塩基性蛋白質を使用することが望ましい。なお、酸性の蛋白質を使用する場合には、式３のカチオン性（塩基性）化合物を用いて静電複合体粒子を作製できる。
本発明で使用可能な塩基性蛋白質としては、例えばカルシトニン、インターフェロン等のホルモン類、例えばｈＧＨ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子、例えば
ＢＤＮＦ等の神経栄養因子等を挙げることができる。好ましいものとしては、カルシトニン、ｈＧＨ、ＨＧＦ等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子化合物の付加粒子（混合静電複合体）に関して、その粒子径が５０から４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、複合体粒子等の内部の蛋白質にまで酵素の作用が及ぶ恐れがある。更には腎臓にて濾過排出される恐れもある。一方、これよりも粒子径が大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。特に、経口による腸管吸収性を考慮すれば、本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子付加粒子の粒子径は１５０ｎｍ以下が好ましい。また、静電複合体粒子に添加すべきカチオン性高分子化合物（式３）の重量は、静電複合体の重量を１として、０．５から４の範囲であり、好ましくは、０．５から２の範囲を挙げることができる。
【００２９】
また、式２の感温性高分子が導入されたアニオン性高分子化合物についても、式１のアニオン性高分子化合物と同様の挙動が見られることが明らかとなった。例えば式２のアニオン性化合物（アニオン性部分の分子量：１７０００、感温性部分の分子量：９５００）を用いて、蛋白質との静電複合体を作製した場合にも、図１１に示されるように、静電複合体の安定性は良好で、濃度による影響は少ないことが示された。また、図１３に示されるように蛋白質を１重量部として、式２のアニオン性高分子化合物を１重量部添加すれば、充分な静電複合体が得られることが分かった。
図１４に示されるように、この静電複合体粒子は、ｐＨ６．５よりも高いｐＨでは式３のアニオン性化合物の添加量の効果を受け難いが、ｐＨ６．５以下になれば大きく添加量効果を受けることが示された。
【００３０】
本発明のアニオン性高分子化合物と塩基性蛋白質とを反応させ静電複合体を形成させるには、蛋白質の濃度０．１から１０μｇ／μＬ程度の水溶液に対し、常温にてアニオン性高分子化合物の水溶液（０．１から１０μｇ／μＬ）を添加し、混合すればよい。蛋白質１重量部に対してアニオン性高分子化合物を重量比として３から３２倍量添加することが望ましい。好ましくはアニオン性高分子化合物を荷電的に過剰量添加し、生成する静電複合体粒子がアニオン性となることが望ましい。
【００３１】
本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子化合物の付加粒子は任意の方法で生体に投与することができる。当該投与方法としては経口あるいは非経口での投与が可能であり、経口では、液剤やゼリー剤として投与することができる。非経口としては、静脈内又は動脈内への注射を挙げることができる。それ以外にも、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与も可能であり、更には、気管内視鏡を用いて肺胞へ噴霧するなど病変組織内に直接投与することも可能である。
【００３２】
本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子化合物の付加粒子を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る試剤（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら試剤は公知のものが使用できる。また、本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子化合物の付加粒子を有効成分とする医薬の投与量は、治療目的とする疾患、疾患部位、投与方法等の種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分な量を投与することが行われる。
【実施例】
【００３３】
本発明は更に下記の実施例、試験例で詳しく説明されるが、これらの例示は単なる実例であって本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させ
ても良い。
【００３４】
（実施例１）１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンの合成
【化７】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼン（１ｇ，２．２２ｍｍｏｌ，Ｍｗ．４４９．８３）にエタノール（１００ｍｌ）とナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（４ｇ，１７．７６ｍｍｏｌ，Ｍｗ．２２５．３１）を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始４８時間後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケータにて真空乾燥させて１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンを得た（白色固体）。収量１．４８ｇ（収率９１．４％）。１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果、δ７．４８７ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、δ４．５７３ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｓ）、δ４．０６５から３．９９４ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ３．７６５から３．６８７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ１．３０４から１．２５６ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３）であった。
【００３５】
（実施例２）アニオン性高分子化合物（式１、Ａ：カルボキシル基）の合成
上記反応式により、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにアクリル酸を重合させてアニオン性官能基の領域がアクリル酸重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式１）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（１０８ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ，Ｍｗ．７２３．３０）をトルエンで希釈し、アクリル酸（１．４４ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、トルエンで全量を２０ｍｌとし、さらにメタノールを４０ｍｌ加えた溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、アニオン性高分子化合物（式１）である白色の４分岐型ポリアクリル酸化合物を１３２ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約１０，０００であった。
また、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの量を１０８ｍｇに固定し、とアクリル酸の量を０．６４５ｇとすることで、生成するアニオン性高分子化合物の数平均分子量は約４５００となり、アクリル酸の量を６．７６ｇとすることで数平均分子量は約５５０００となった。
使用したアクリル酸の量と生成した式１のアニオン性化合物の分子量とは、図１５で示されるような相関関係を有することが明らかとなった。
【００３６】
（実施例３）アニオン性高分子化合物（式２）の合成
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにアクリル酸、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの順で重合させてベンゼン環に近い部分がアクリル酸重合体であり、４本の側鎖の末端部が感温性領域のＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式２）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（２１６ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ，Ｍｗ．７２３．３０）にアクリル酸（１．３１ｇ，
１８ｍｍｏｌ）を加え、トルエンで全量を６０ｍｌとた溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、白色の４分岐型ポリアクリル酸化合物を３４８ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約２２，０００であった。
得られた４分岐型ポリアクリル酸化合物（１６２ｍｇ，７．２μｍｏｌ，Ｍｎ＝２２０００）にＮ−イソプロピルアクリルアミド（９３０ｍｇ，８．２ｍｍｏｌ）を加え、メタノールで全量を２０ｍｌとした溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、アニオン性高分子化合物（式２）である白色の４分岐型ポリアクリル酸-ポリＮ−イソプロピ
ルアクリルアミド化合物を２２８ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約２７，０００であった（ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド部の分子量は約５０００）。
【００３７】
（実施例４）アニオン性化合物（式２）の合成
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにＮ−イソプロピルアクリルアミド、アクリル酸の順で重合させて実施例３とは反応させるモノマーの順序を逆にした。ベンゼン環に近い部分が感温性領域のＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体であり、４本の側鎖の末端部分がアクリル酸重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式２）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（５４ｍｇ，０．０７５ｍｍｏｌ，Ｍｗ．７２３．３０）にＮ−イソプロピルアクリルアミド（２．３４ｇ，１８ｍｍｏｌ）を加え、トルエンで全量を２０とし、さらにメタノール４０ｍｌを加えた溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、白色の４分岐型Ｎ−イソプロピルアクリルアミド化合物を３３４ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約９，５００であった。
得られた４分岐型ポリアクリル酸化合物（１６２ｍｇ，７．２μｍｏｌ，Ｍｎ＝２２０００）にアクリル酸（１．４４ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、トルエンで全量を２０ｍｌとし、さらにメタノール４０ｍｌを加えた溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、白色のアニオン性高分子化合物（式３）である４分岐型ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド−ポリアクリル酸化合物を１９０ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約２７，０００であった（ポリアクリル酸部の分子量は約１７，０００）。
【００３８】
（実施例５）カチオン性化合物（式３）の合成
【化８】
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの順で重合させてＣがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド重合体で、ＢがＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体である４分岐型カチオン性高分子化合物（式３）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（４３２ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ，Ｍｗ．７２３．３０）を３６ｍｌのベンゼンに溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（５．１６ｇ、３３ｍｍｏｌ）を加えた後、メタノールで希釈し、全量を１２０ｍｌの溶液を調製した。この溶液から２０ｍｌを取り、窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射９０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、白色の４分岐型ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド化合物を８０３ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約３，７００であった。
得られた４分岐型ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド化合物（６５０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）にメタノール１０ｍｌを加えて溶解させ、これにＮ−イソプロピルアクリルアミド（１．２４ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）を加え、メタノールを加えて全量を２０ｍｌとした溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射９０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、カチオン性高分子化合物（式３）である白色の４分岐型ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド-ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物を３９５ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた
高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約１５，０００であった（ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド部の分子量は約１２，０００）。
使用したＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの添加量と、生成したカチオン性中間体（ｉｎｉｆｅｒｔｅｒ）の分子量とは、図１６で示される相関関係があることを示した。また、同様にカチオン性の中間体（ｉｎｉｆｅｒｔｅｒ）の分子量と、添加したＮ−イソプロピルアクリルアミドの量とは、同じく図１７で示される相関関係があることを示した。
【００３９】
（実施例６）アニオン性高分子化合物（式１、Ａ：ｐ−カルボキシルフェニル基）の合成
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにビニル安息香酸メチルを重合させた後に加水分解を行い、ｐ−ビニル安息香酸重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式１）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベ
ンゼン（５０ｍｇ）とｐ−ビニル安息香酸メチルエステル（２ｇ）をクロロホルム３０ｍｌとメタノール３０ｍｌに溶解させた。生成した溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、脱イオン水３０ｍｌを加えた後、水酸化ナトリウム２００ｍｇを加えた。８０℃で１時間撹拌した後、１Ｎ塩化水素水溶液で中和を行い、３日間透析（限外濾過分子量１０００）を行った。凍結乾燥によりアニオン性高分子化合物である白色の４分岐型ポリビニル安息香酸化合物１９０ｍｇを得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約１０，０００であった。
【００４０】
（実施例７）アニオン性高分子化合物（式１、Ａ：ｐ−ヒドロキシスルホニルフェニル基）の合成
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにｐ−ビニルベンゼンスルホン酸メチルエステルを重合させた後に加水分解を行い、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式１）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（１００ｍｇ）とｐ−ビニルベンゼンスルホン酸メチルエステル（１ｇ）をトルエン６０ｍｌに溶解させた。生成した溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射６０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、脱イオン水３０ｍｌを加えた後、水酸化ナトリウム２００ｍｇを加えた。８０℃で１時間撹拌した後、１Ｎ塩化水素水溶液で中和を行い、３日間透析（限外濾過分子量１０００）を行った。凍結乾燥によりアニオン性高分子化合物である白色の４分岐型ポリビニルベンゼンスルホン酸化合物２４４ｍｇを得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約６，１００であった。
【００４１】
（実施例８）アニオン性高分子化合物（式１）とカルシトニンとの静電複合体の合成
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物（式１）であるポリアクリル酸化合物（分子量約２７０００）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調整した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸化合物水溶液２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図３と図４に示す。
この結果から、アニオン性のカルシトニン蛋白質静電複合体粒子の粒子径は、濃度の影響を受けやすく、例えば図４に示されるように高濃度では安定で１５０から２００ｎｍのサイズであるが、低濃度になると粒子径が拡大し７００ｎｍを超えるようになる傾向が見られた。一方、図３に示されるように、該静電複合体粒子は熱的には安定で経時的な変化は受け難いことが示された。
【００４２】
（実施例９）アニオン性化合物（式２）とカルシトニンとの静電複合体の合成
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物（式２）であるポリアクリル酸-ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物（分子量約２７０００）を精製水にて希
釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調整した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸-ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物水溶液２００μｌを加え
、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図２６に示す。
【００４３】
（実施例１０）アニオン性化合物（式３）とカルシトニンとの静電複合体の合成
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物（式３）であるポリＮ−イソプロピルアクリルアミドーポリアクリル酸化合物（分子量約２７０００）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調整した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸-ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物水溶液２００μｌを加え
、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図２５に示す。
【００４４】
（実施例１１）アニオン性化合物（式１）とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子の合成
実施例８に従って調整した、アニオン性高分子化合物（式１）とカルシトニンとの静電複合体の水溶液２５０μｌに、実施例７に従って合成したカチオン性高分子の水溶液２００μｌ（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を室温で加え、１０分放置することでアニオン性化合物とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図５に示す。
図５に示されるように、蛋白質（カルシトニン）に添加するアニオン性化合物の量が少なければ、生成した静電複合体にカチオン性化合物を付加させた場合、付加量が増大してくると粒子径が１３０ｎｍから拡大して７００ｎｍを超えるようになる傾向が見られた。一方、図６に示されるようにカルシトニンに添加するアニオン性化合物の量が充分であれば、生成した静電複合体にカチオン性化合物を付加させた場合、付加量が増大しても粒子径は拡大せず、縮小する傾向になる。例えば１３０ｎｍから７０ｎｍに粒子径が締まってくる傾向が見られた。
【００４５】
（実施例１２）アニオン性化合物（式２）とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子の合成
実施例８に従って調整した、アニオン性高分子化合物（式１）とカルシトニンとの静電複合体の水溶液２５０μｌに、実施例５に従って合成したカチオン性高分子の水溶液２５０μｌ（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を室温で加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図２８に示す。
【００４６】
（実施例１３）動物実験用のカルシトニン含有カチオン性高分子化合物の付加粒子の合成
カルシトニンを精製水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を３ｍｌ調整した。また、実施例３に従って合成したアニオン性高分子化合物（式３、分子量約１０，０００）を精製水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を５ｍｌ調整した。さらに、実施例２に従って合成したカチオン性高分子化合物（式２、分子量約１５，０００）を精製水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を５ｍｌ調整した。
カルシトニン水溶液１ｍｌに室温でアニオン性高分子化合物水溶液４ｍｌを加え、１０分間放置した。これにカチオン性高分子化合物水溶液４ｍｌを加え、１０分間放置し、カチオン性高分子付加粒子の水溶液を調整した。２０分間３７℃で保温し、経口投与用カルシトニンス水溶液（カルシトニン濃度１ｍｇ／９ｍｌ）を調整した。ラットへの経口投与では体重あたり１ｍｇ／ｋｇ量の割合で与えた。
上記で調整した経口投与水溶液から９００μｌを計り取り、３７℃下で生理食塩水１１００μｌを加え、十二指腸投与用カルシトニン水溶液（カルシトニン濃度１００μｇ／２ｍｌ）を調整した。ラットへの十二指腸投与では体重あたり１００μｇ／ｋｇ量の割合で
与えた。
上記で調整した十二指腸投与用水溶液から２０μｌを計り取り、３７℃下で生理食塩水１９８０μｌを加え、カルシトニン濃度を１μｇ／２ｍｌに希釈した。これから１００μｌを計り取り３７℃下で生理食塩水１９００μｌを加えて全量を２ｍｌとし、静脈注射用カルシトニン水溶液（カルシトニン濃度５０ｎｇ／２ｍｌ）を調整した。ラットへの静脈内投与では体重あたり５０ｎｇ／ｋｇの割合で与えた。
【００４７】
（試験例１）感温性カチオン性高分子化合物（式３）の凝集性
実施例５に従って合成したカチオン性高分子化合物の１％水溶液を調整した。この溶液を２５℃とし、１分間に０．５℃の割合で昇温させながら、８００ｎｍの光の透過率を分光光度計（島津製作所ＵＶ−１７００）にて測定することで凝集性を調べた。
その結果を図１８に示す。
図１８に示されるように、３５℃から３７℃で式３の感温性カチオン性化合物は凝集して白濁し、透過度が減少した。
【００４８】
（試験例２）直鎖構造（２本側鎖）を持つアニオン性高分子化合物（対照例）と蛋白質とのナノ粒子形成能
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成されたアニオン性高分子化合物水溶液２５０μｌ（濃度２５０μｇ／２５０μｌ）を加え、アニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。これを測定用セルに加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）を用いて、静電複合体の粒径測定を行った。粒径はキュウムラント解析値とした。
その結果を図１９に示す。
２本側鎖のアニオン性高分子化合物を用いた場合、蛋白質との静電複合体粒子の安定性が悪く、経時的に粒子径が拡大して行くことが示された。
【００４９】
（試験例３）分岐構造を持つアニオン性高分子化合物（式１）と蛋白質とのナノ粒子形成能
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成された分岐構造を持つアニオン性高分子化合物水溶液２５０μｌ（濃度２５０μｇ／２５０μｌ）を加え、アニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。これを測定用セルに加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）を用いて、静電複合体の粒径測定を行った。粒径はキュウムラント解析値とした。
その結果を図２４に示す。
図１９と図２４から示されるように、４本側鎖のアニオン性高分子化合物の方が２本側鎖のアニオン性高分子化合物より、粒子の安定性が良好になる傾向にあることが分かった。このことから、ベンゼン環の側鎖（置換基）の数は、多い方が少ないよりも蛋白質との絡み合いが増え安定性が良い傾向にあると言える。
【００５０】
（試験例４）アニオン性高分子化合物（式１）と蛋白質とのナノ粒子形成の安定化
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成されたアニオン性高分子化合物水溶液２５０μｌ（濃度２５０μｇ／２５０μｌ）を加え、アニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。これを測定用セルに加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）を用いて、静電複合体の粒径を経時的に測定することで、粒径の変化を調べ、安定性を評価した。粒径はキュウムラント解析値とした。
その結果を図８に示す。
この結果から、アニオン性化合物の分子量が大きくなる（モノマーの重合度が上がり、アニオン性（酸性）が高くなる）ほど粒子は安定になり、粒子径が拡張しないことが示された。
【００５１】
（試験例５）アニオン性高分子化合物（式１）の最適化
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、そこに実施例２に従って合成されたアニオン性高分子化合物水溶液（濃度２５０μｇ／２５０μｌ）を５０μｌづつ加え、光散乱強度測定によって粒子の形成量を、キュウムラント解析による粒径測定を行い、アニオン性高分子化合物の使用量の最適化を行った。
その結果を図９に示す。
図７に示されるように、アニオン性高分子化合物の添加量が多くなれば、静電複合体粒子の粒子径は縮小する傾向にある。また、溶液の散乱強度（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）から、分子量約１万のアニオン性高分子化合物を用いて、蛋白質１重量部に対して３重量部あれば、静電複合体粒子が充分形成されることが分かった。それ故、これ以上のアニオン性高分子化合物を添加しても静電複合体形成に加わることがなく、過剰のアニオン性高分子化合物として溶液中に共存することになることが分かった。
【００５２】
（試験例６）カルシトニン非存在下でのアニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物同士の安定性
実施例２に従って合成したアニオン性化合物２００μｇ（濃度２００μｇ／２００μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、そこに実施例５に従って合成したカチオン性化合物を５０μｇ（濃度５０μｇ／５０μｌ）ずつ加え、キュウムラント解析による粒径測定を行い、安定性を調べた。
その結果を図２０に示す。
図２０に示されるように、式２のアニオン性化合物と式３のカチオン性化合物は静電複合体を形成することが分かった。粒子径も約２００ｎｍで一定し、安定な粒子を形成することが分かった。
【００５３】
（試験例７）カルシトニンとアニオン性高分子化合物との静電複合体とカチオン性高分子化合物同士の安定性
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、実施例２に従って合成したアニオン性高分子化合物の水溶液（濃度１００μｇ／１００μｌ）を１００μｌあるいは２００μｌ添加した。そこに実施例５に従って合成したカチオン性高分子化合物の水溶液（濃度１００μｇ／１００μｌ）を５０μｌづつ加え、キュウムラント解析による粒径測定を行い、安定性を調べた。
その結果を図５と図６に示す。
図５に示されるようにアニオン性化合物の添加量が少ない場合の蛋白質静電複合体は、カチオン性化合物を付加させると粒子の安定性が弱くなり、粒子径が拡大する傾向になることが分かった。また、図６に示されるようにアニオン性化合物の添加量が充分である場合の蛋白質静電複合体は、カチオン性化合物を付加させて行くと粒子が凝集して粒子径が縮小する傾向にあることが分かった。
【００５４】
（試験例８）感温性高分子化合物の安定性
実施例４の中間生成物として合成したポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物の１％水溶液を調整した。この溶液を２４℃とし、１分間に０．５℃の割合で昇温させながら、８００ｎｍの光の透過率を分光光度計（島津製作所ＵＶ−１７００）にて測定することで安定性を調べた。
その結果を図２１に示す。
【００５５】
（試験例９）感温性アニオン性高分子化合物の安定性
実施例２から４に従って合成したアニオン性化合物の１％水溶液を調整した。この溶液
を２４℃とし、１分間に０．５℃の割合で昇温させながら、８００ｎｍの光の透過率を分光光度計（島津製作所ＵＶ−１７００）にて測定することで安定性を調べた。
その結果を図２２に示す。
【００５６】
（試験例１０）感温性アニオン性高分子化合物のみの安定性
実施例４に従って合成したアニオン性高分子化合物の水溶液２００μｌ（濃度２００μｇ／２００μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、経時的に、あるいは精製水で希釈しながら、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで安定性を調べた。
その結果を図２３と図２４に示す。
【００５７】
（試験例１１）カルシトニンとアニオン性高分子化合物との静電複合体（ナノ粒子）の安定性
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に実施例４に従って合成したアニオン性高分子化合物の水溶液２００μｌ（濃度２００μｇ／２００μｌ）を加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、経時的に、あるいは精製水で希釈しながら、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで安定性を調べた。
その結果を図１１と図１２に示す。
図１１に示されるように、静電複合体粒子の安定性は良好で、粒子径の経時変化は少ししかなく、また、図１２に示されるように希釈による静電複合体濃度の粒子径に対する影響は少ないことが示された。
【００５８】
（試験例１２）カルシトニンとアニオン性高分子化合物の静電複合体形成における高分子化合物の分子量の効果
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、実施例４に従って合成した式２のアニオン性高分子化合物の水溶液（濃度２００μｇ／２００μｌ）を５０μｌづつ加え、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで分子量の効果を調べた。
その結果を図１３に示す。
図１３に示されるように蛋白質を１重量部として、式２のアニオン性高分子化合物を１重量部添加すれば、充分な静電複合体が得られることが分かった。
【００５９】
（試験例１３）カルシトニンとの静電複合体粒子のｐＨ安定性
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例４に従って合成した式２のアニオン性高分子化合物の水溶液（濃度２００μｇ／２００μｌ）を５０、２５０、あるいは５００μｌ加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、０．１Ｎ塩酸または、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを調整しながら、キュウムラント解析による粒径測定を行うことでカルシトニンとの静電複合体粒子のｐＨ安定性を調べた。
その結果を図１４に示す。
図１４に示されるように、この静電複合体粒子は、ｐＨ６．５よりも高いｐＨでは式２のアニオン性化合物の添加量の効果を受け難いが、ｐＨ６．５以下になれば大きく添加量効果を受けることが示された。
【００６０】
（試験例１４）カルシトニンとの静電複合体粒子におけるアニオン性高分子化合物の分子量の効果
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成した分子量の異なる種々のアニオン性化合物の水溶液（濃度２００μｇ／２００μｌ）２００μｌを加え、これを動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入
れて装置にセットし、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで、カルシトニン粒子の粒径のアニオン性高分子化合物の分子量の効果を調べた。
その結果を図７に示す。
図７に示されるように、静電複合体粒子の溶液中での安定性は、アニオン性化合物の分子量が多いほど、即ちアクリル酸の重合度が高い（酸性が高い）ものがより安定であることが示されている。
【００６１】
（試験例１５）２本側鎖鎖と４本側鎖のアニオン性高分子化合物による粒子サイズの依存性
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成した分子量の異なる種々のアニオン性高分子化合物の水溶液（濃度２００μｇ／２００μｌ）２００μｌ、あるいは市販の直鎖状ポリアクリル酸の水溶液（分子量５０００または２５０００）２００μｌを加え、これを動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで、カルシトニン粒子の粒径のアニオン性高分子の分子量依存性を調べた。
その結果を図１０に示す。
図１０に示すように、本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子付加粒子（混合静電複合体）を作製する場合、それらの粒子径はベンゼン環の置換基の数とアニオン性高分子化合物の分子量に影響を受けやすい。例えば２本側鎖のアニオン性高分子化合物の方が粒子径の小さいものができやすい傾向にあることが示された。
【００６２】
（試験例１６）ラット経口投与による血中カルシウム濃度変化
実施例１３に示した動物実験用のカルシトニン含有カチオン製高分子付加粒子（以下高分子付加粒子と記載）を、ラットに各種投与ルートで投与し、カルシトニン薬理活性（血中カルシウム低下作用）を、高分子を付加しないカルシトニン（以下原体と記載）と、比較検討した。各投与群に群分けした８週齢の雄性ＳＤラットの体重を朝９：００に体重を測定し，１０：００から絶食を開始した。３時間後（１３：００）からヘマトクリット管を用いて尾静脈より採血を行った（投与前値）．採血後，ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与して麻酔し，気管内チューブを挿管後，人工呼吸器に接続した。薬剤投与は、投与経路ごとに、以下のように処置した。
無処置群 ： 呼吸器接続後，少なくとも１５分以上安定させた後に試験を開始した。
静脈内投与群 ： 呼吸器接続後，左大腿静脈を露出させた。その後少なくとも１５分以上安定させた後に，溶解溶液または被験物質を左大腿静脈から投与した。
十二指腸投与群 ： 呼吸器接続後，腹部を開腹し十二指腸を露出させた。その後少なくとも１５分以上安定させた後に，溶解溶液または被験物質を，注射針を用いて十二指腸内へ直接投与した。
経口投与群： 呼吸器接続後，胃内経口ゾンデを装着した。その後少なくとも１５分以上安定させた後に，溶解溶液または被験物質を，シリンジを用いて装着した胃内経口ゾンデから経口投与した。
採血は、投与３０，６０，１２０，１８０および３００分後にヘマトクリット管を用いて尾静脈から採血した。血液は採血後室温でしばらく放置した後，３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し，血清を分取し、測定日まで−８０℃以下で保存した。血清中カルシウム濃度は、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ社製，ＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍＴＭ Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ［ＤＩＣＡ−５００］を使用して測定した。
各投与ルートの投与量は表１（カルシトニン投与群の構成）のように設定した。また、図２７に、十二指腸投与群での血中Ｃａ濃度の変化を示した。高分子付加粒子投与において、血中Ｃａの低下（カルシトニン薬理作用）が見られ、カチオン製高分子付加粒子の有効性が確認された。
【００６３】
【表１】
【００６４】
（試験例１７）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）との静電複合体形成とその安定性
（１）カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約９４００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を２ｍｌ調製した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸化合物水溶液２００μｌ、４００μｌ、８００μｌあるいは１６００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３０左図に示す。
ポリアクリル酸化合物を用いたカルシトニンとの静電複合体はポリアクリル酸化合物の添加量の増加に伴って安定性が増すことが分かった。
（２）カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性化合物である４分岐ポリビニル安息香酸化合物（分子量約１２０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸化合物水溶液２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３０中央図に示す。
ポリアクリル酸化合物を用いたカルシトニンとの静電複合体はポリビニル安息香酸化合物が２００ｕｌにおいても安定性であることが分かった。
（３）カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性化合物である４分岐ポリビニル安息香酸化合物（分子量約６１００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸化合物水溶液２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３０右図に示す。
ポリアクリル酸化合物を用いたカルシトニンとの静電複合体はポリスチレンスルフォン酸化合物が２００μｌにおいても安定性であることが分かった。
【００６５】
（試験例１８）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体にカチオン性高分子化合物を付加した付加粒子の安定性
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、式１のアニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約９４００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、カチオン性高分子化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド化合物（分子量約４７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物８００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性高分子化合物２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性高分子化合物との３者静電複合体を調製した。得られた３者静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３１に示す。
ポリアニオン性高分子化合物とカルシトニン、ポリカチオン性高分子化合物との３者静電複合体は比較的安定性であることが分かった。
【００６６】
（試験例１９）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子の安定性
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約８７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、カチオン性−非イオン性化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドーポリジメチルアミノアクリルアミドブロック共重合体化合物（カチオン部分子量約１００００-非イオン性部分子量約３００００、カチオン性部
分子量約４０００-非イオン性部分子量約４０００、あるいはカチオン性部分子量約４０
００-非イオン性部分子量８０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水
溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物２００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性−非イオン性化合物２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性化合物とカルシトニン、カチオン性−非イオン性化合物との３者静電複合体を調製した。得られた３者静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３２に示す。
ポリアニオン性化合物とカルシトニン、ポリカチオン性−非イオン性化合物との３者静電複合体は直後の粒子径は約１００ｎｍであった。非イオン性部が長いと粒子は不安定であったが、非イオン性部の分子量１００００以下では比較的安定であることが分かった。
【００６７】
（試験例２０）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子の安定性
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約８７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、式５のポリ感温性−カチオン性高分子化合物である４分岐ポリイソプロピルアクリルアミドーポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドブロック共重合体化合物（感温性部分子量約９０００-カチオン性部分子量約３０００）をＰＢＳ
（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物４００μｌあるいは１６００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液に感温性−カチオン性高分子化合物２００μｌを加え、１０分間放置す
ることでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、感温性−カチオン性高分子化合物との３者静電複合体を調製した。得られた３者静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３３に示す。
ポリアニオン性化合物とカルシトニン、ポリ感温性−ポリカチオン性化合物との３者静電複合体は直後の粒子径は約３００ｎｍであった。ポリアニオン性化合物の組成比が多い３者静電複合体は極めて安定であることが分かった。
【００６８】
（試験例２１）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子の安定性
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約８７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、式６のポリ感温性−カチオン性化合物である４分岐ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ブロック共重合体化合物（カチオン性部分子量約３０００-感温性部分子量約１０
０００、カチオン性部分子量約１００００-感温性部分子量約１００００、あるいはカチ
オン性部分子量約３０００-感温性部分子量約２４０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、
１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物２００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性−感温性化合物２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性−感温性化合物との３者静電複合体を調製した。得られた３者静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３４に示す。
ポリアニオン性化合物とカルシトニン、ポリポリカチオン性−ポリ感温性化合物との３者静電複合体は直後から約１０００ｎｍと大きく凝集した。
【００６９】
（試験例２２）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体のＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
（１）Ｃａｃｏ−２細胞単層膜透過試験方法
透過性実験はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製ＢＩＯＣＯＡＴ ＨＴＳ Ｃａｃｏ−２ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキットを用いて行った。Ｃａｃｏ−２細胞を単層膜状に培養した２４穴トランスウェル（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ １μｍ）内の培養液を吸引し、ＰＢＳで洗浄した後、カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体サンプル２５０μｌを２穴ずつ入れた。各ウエルに１ｍｌのＰＢＳを添加した２４穴マルチウエルに先のトランスウエルを重ね、３７℃下、二酸化炭素濃度５％のインキュベータ内で培養を行った。所定時間毎にマルチウエル内のＰＢＳ１００μｌを採取し、新たにＰＢＳ１００μｌを加え、サンプリングを繰り返した。
（２）ラジオイムノアッセイ測定
サンプリングした溶液５０μｌをＲＩＡ用バッファー５０ｕｌで希釈し、カルシトニン抗体１００μｌを加えた。これにＲＩ値がγカウンターで２００００ｃｐｍ／１００μｌになるように溶液濃度を調整したヨウ素１２５ラベル化カルシトニン溶液を加え、４℃で４０時間放置した。氷上において１．０％ウシγグロブリンを各サンプルに１００μｌづつ加えて撹拌し、次いで２３％ポリエチレングリコール水溶液を各サンプルに５００μｌづつ加えて撹拌した。遠心機で３０００ｒｐｍ、１５分遠心し、上清を吸引し、沈殿物のＲＩ値をγカウンターで測定し、検量線を元にカルシトニン量を求めた。透過率（Ｐａａｐ（ｃｍ／ｓｅｃ））の計算は以下の計算式を用いて行った。
【化９】
ｄＭ／ｄｔは組織を通過する流量（μＭ ｍｉｎ−１またはｄｐｍ ｍｉｎ−１）、Ａ（０．１９６３ｃｍ２）はメンブレンの表面積、Ｃ０は試薬の初期濃度である。
（３）評価試験
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物として、４分岐型ポリアクリル酸（分子量約９４００）、ポリスチレンスルフォン酸ナトリウム（分子量約６１００）あるいはポリビニル安息香酸（分子量約１２０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。アニオン性高分子化合物２００μｌあるいは１６００μｌとカルシトニン水溶液５０μｌを混合することで静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０μｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって測定した。その結果を図３５に示す。
アニオン性高分子化合物の中で、ポリアクリル酸やポリビニル安息香酸を用いた場合にはほとんど細胞膜を透過しなかったが、ポリスチレンスルフォン酸の場合にはカルシトニンと同程度の透過性を有していた。
【００７０】
（試験例２３）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式２）の静電複合体のＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
試験例２２と同様にして、カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１と式２）の静電複合体の細胞膜透過活性を評価した。評価サンプルは、以下のように作成した。カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物として、４分岐型ポリアクリル酸（分子量約９４００）、ポリアクリル酸−ポリジメチルアクリルアミド（アニオン性部分子量約５０００-非イオン性部分子量約５０００）あるいはポリイソプロピルアクリル
アミド−ポリアクリル酸（感温性部分子量約９０００-アニオン性部分子量約９０００）
をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。アニオン性高分子化合物２００μｌとカルシトニン水溶液５０μｌを混合することで静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０μｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって経時的に測定した。その結果を図３６に示す。
アニオン性単独のポリアクリル酸から作製した静電複合体ではほとんど細胞膜を透過しなかったが、感温性や非イオン性化させたアニオン性化合物から作製した静電複合体ではカルシトニンに比べて透過速度が高くなることが分かった。また、感温性−アニオン性である（イソギンチャク構造）場合には、より細胞膜透過活性が優れていることが分かった。
【００７１】
（試験例２４）カルシトニンとアニオン性高分子化合物の静電複合体のＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
試験例２２と同様にして、カルシトニンとアニオン性高分子化合物の静電複合体の細胞膜透過活性を評価した。評価サンプルは、以下のように作成した。カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物として、４分岐型ポリアクリル酸−ポリジメチルアクリルアミド（アニオン性部分子量約５０００-非イオン性部分子量約５０００）あ
るいは感温性部分が４分岐側鎖の中心部分に存在する、ポリイソプロピルアクリルアミド−ポリアクリル酸（感温性部分子量約９０００-アニオン性部分子量約９０００、感温性
部分子量約２２０００-アニオン性部分子量約２４０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、
１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。アニオン性高分子化合物２００μｌ、８００μｌあるいは１６００μｌとカルシトニン水溶液５０μｌを混合することで静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０μｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって測定した。その結果を図３７に示す。
感温性や非イオン性化させたアニオン性化合物から作製した静電複合体ではカルシトニンに比べて約２倍の高い細胞膜透過性を有していることが分かった。また、アニオン性高分子化合物においては、感温性部分を４本側鎖の中心部に持ち、アニオン性部分を４本側鎖の末端部分に持つイソギンチャク構造のアニオン性高分子化合物の方が、より優れた細胞膜透過活性を持つことが分かった。
【００７２】
（試験例２５）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体に対してカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子に関するＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
試験例２２と同様にして、アニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性高分子化合物との３者静電複合体のＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験を行なった。評価サンプルは、以下のように作成した。カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約８７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、カチオン性化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド（分子量約１７００または４７００）、カチオン性−非イオン性化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド−ポリジメチルアクリルアミド（カチオン性部分子量約４００００-非イオン性部分子量約８
００００、またはカチオン性部分子量約１００００-非イオン性部分子量約３０００）、
あるいは式５と式６のカチオン性−感温性化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドーポリイソプロピルアクリルアミド（カチオン性部分子量約１００００-感温性部分子量約１００００（式６）、カチオン性部分子量約３０００-感温性部分子量約９０００（式５））をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物２００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性高分子化合物２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性高分子化合物との３者静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０μｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって測定した。その結果を図３８に示す。
感温性化させたカチオン性高分子化合物を用いることで細胞膜透過性はカルシトニンのみの約２倍となることが分かった。また、式３のカチオン性高分子化合物の付加粒子においては、感温性部分を４本側鎖の末端部分に持つ化合物（スパイダー構造）の方が、非イオン性部分を４本側鎖の末端部分に持つ化合物よりも、優れた細胞膜透過活性を持つことが分かった。
【００７３】
（試験例２６）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体に対してカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子に関するＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
試験例２２と同様にして、カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合
体に対してカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子に関する細胞膜透過活性を評価した。評価サンプルは、以下のように作成された。カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約９４００）、ポリスチレンスルフォン酸（分子量約６１００）あるいはポリビニル安息香酸（分子量約１２０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、感温性−カチオン性高分子化合物である４分岐ポリイソプロピルアクリルアミド−ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド（感温性部分子量約９０００-カチオ
ン性部分子量約３０００、感温性部分子量約９０００−カチオン性部分子量約５０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアニオン化合物２００μｌまたは４００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性化合物２００μｌまたは４００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性高分子化合物との３者静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０ｕｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって測定した。その結果を図３９に示す。
アニオン性高分子化合物の種類を問わずに、感温性-カチオン性高分子化合物と組み合
わせた３者複合体はカルシトニン単独の約４倍の非常に高い細胞膜透過性を有していることが分かった。なお、付加粒子を作成するには、式１のアニオン性高分子化合物としては、疎水性のより高い、ｐ−ナトリウムカルボキシルフェニル基、ｐ−ナトリウムスルホン酸フェニル基を持つ化合物の方が、カルボキシル基を持つ化合物よりも、より優れた細胞膜透過活性を持つことが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】カチオン性高分子化合物（式５）の加熱による３次元的な構造変化（イソギンチャク構造）
【図２】カチオン性高分子化合物（式６）の加熱による３次元的な構造変化（スパイダー構造）
【図３】カルシトニンとアニオン性化合物との静電複合体粒子の安定性
【図４】カルシトニンとアニオン性化合物との静電複合体粒子の濃度依存性
【図５】カチオン性化合物付加粒子（アニオン性が低い蛋白質静電複合体粒子）の安定性
【図６】カチオン性化合物付加粒子（アニオン性が高い蛋白質静電複合体粒子）の安定性
【図７】蛋白質静電複合体粒子の粒子径に対するアニオン性高分子化合物の分子量の影響
【図８】蛋白質静電複合体粒子の安定性に対するアニオン性高分子化合物の分子量（低分子量のアニオン性高分子化合物）の影響
【図９】蛋白質静電複合体を作製するためのアニオン性高分子化合物の最適量
【図１０】アニオン性高分子化合物の分枝側鎖（２本側鎖、４本側鎖）の影響
【図１１】アニオン性高分子化合物（式３、感温性）を用いた蛋白質静電複合体粒子の安定性
【図１２】アニオン性高分子化合物（式３、感温性）を用いた蛋白質静電複合体粒子の濃度安定性
【図１３】アニオン性高分子化合物（式３、感温性）を用いた蛋白質静電複合体粒子の分子量依存性
【図１４】アニオン性高分子化合物（式３、感温性）を用いた蛋白質静電複合体粒子のｐＨ安定性
【図１５】アニオン性高分子化合物（式１）の分子量とアクリル酸の使用量の量的相関関係
【図１６】カチオン性中間体（ｉｎｉｆｅｒｔｅｒ）の分子量と使用したＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの使用量の量的相関関係
【図１７】カチオン性中間体（ｉｎｉｆｅｒｔｅｒ）の分子量と添加したＮ−イソプロピルアクリルアミドの使用量との相関関係
【図１８】カチオン性化合物（式４）の感温性（凝集性）
【図１９】直鎖アニオン性化合物（式１）による蛋白質静電複合体の安定性
【図２０】アニオン性化合物（式１）とカチオン性化合物（式４）との静電複合体の安定性
【図２１】感温性高分子化合物の安定性
【図２２】感温性高分子化合物、アニオン性感温性化合物（式２、式３）の安定性
【図２３】アニオン性感温性化合物（式３）の安定性（経時変化）
【図２４】アニオン性感温性化合物（式３）の希釈安定性
【図２５】直鎖アニオン性化合物と分枝状アニオン性化合物（式１）による蛋白質静電複合体の安定性
【図２６】アニオン性化合物（式２）とカルシトニンとの静電複合体の粒子径
【図２７】アニオン性化合物（式３）とカルシトニンとの静電複合体の粒子径
【図２８】アニオン性化合物（式２）とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子の粒子径
【図２９】カルシトニン含有カチオン性高分子付加粒子の十二指腸投与によるラット血中Ｃａ低下作用
【図３０】カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）との静電複合体の安定性
【図３１】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物（カチオン性部分のみ）を付加させた付加粒子の安定性
【図３２】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式３、カチオン性部分＋非イオン性部分）を付加させた付加粒子の安定性
【図３３】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式５、感温性部分＋カチオン性部分：イソギンチャク構造）を付加させた付加粒子の安定性
【図３４】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式６、カチオン性部分＋感温性部分：スパイダー構造）を付加させた付加粒子の安定性
【図３５】カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）との各種静電複合体における細胞膜透過活性
【図３６】カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１と式２）との各種静電複合体における細胞膜透過量の比較
【図３７】カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式２、アニオン性部分＋非イオン性部分、感温性部分＋アニオン性部分）との２種の静電複合体における細胞膜透過活性
【図３８】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物を付加した付加粒子の細胞膜透過活性
【図３９】カチオン性高分子化合物（式３、イソギンチャク構造）を付加した付加粒子において、アニオン性高分子化合物（式１）の組成変化が及ぼす細胞膜透過性に対する効果
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質を包含して所望の部位に搬送できる高分子キャリヤーに関するものである。更には、この高分子キャリヤーを用いて、経口または非経口の投与を可能にする、蛋白質との静電複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え技術の確立により、生理活性蛋白質の大量生産が可能となり、小人症に対するｈＧＨ補充療法、悪性貧血や癌化学療法時のＥＰＯ， Ｇ−ＣＳＦによる造血療法などの医療分野で、多大な貢献をもたらしている。カルシトニンやインスリン、ｈＧＨについても、遺伝子組み換え技術にて量産が可能となっている。しかし、これら蛋白質やペプチドをもっと多くの患者に広範に適応するには、在宅においても服用が可能な経口製剤、経粘膜製剤の開発が必要である。
非特許文献２、３に示されるように、蛋白質の消化管吸収性を改善するための方策が種々検討されている。非特許文献３では、従来の試みは充分なものではないと考え、蛋白質を脂肪酸で化学修飾して、消化管における吸収性と安定性を向上させている。
このように、蛋白質に関する製剤処方は多く報告されているが、その効果は不十分で、さらに優れた高分子キャリヤーが求められている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−０９２３８８
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３３８， １４９９−１５０６（２００５）
【非特許文献２】日本臨床，５６（３），５８９−５９４（１９９８）
【非特許文献３】日本臨床，５６（３），６０１−６０７（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明では、分岐鎖を有するアニオン性ポリマーを構成要素とする蛋白質の結合性高分子キャリヤーを提供することを目的とする。また、該高分子キャリヤーと蛋白質との間で形成される静電複合体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために、式１のアニオン性高分子化合物を作製したところ、本発明の高分子化合物が蛋白質と静電複合体を形成して、蛋白質の高分子キャリヤーとなることを見出した。
【化１】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは５から３４７の整数を表す。分子量が４０００から１０００００である。］
【０００６】
更に、式１のアニオン性高分子化合物の蛋白質との凝集安定性を向上させるために、アニオン性高分子と感温性高分子をブロック化して以下の式２の高分子化合物を作製した。
【化２】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは４から３４７の整数を表す。ＢはＮ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは２から２５３の整数を表わす。分子量が４０００から１０００００である。］
上記式１と式２のアニオン性高分子化合物を用いて、例えば塩基性蛋白質との静電複合体を作製すると、この静電複合体はアニオン性の静電複合体となっている。
【０００７】
本発明者らは、これまでの遺伝子治療用高分子キャリヤーの研究から、カチオン性のキャリヤー粒子が細胞吸収性に優れていることを見出しているので、この知見を蛋白質にも適用し、更に上記静電複合体の腸管での吸収性を向上させるために、上記塩基性蛋白質の静電複合体粒子の外層に以下の式３のカチオン性高分子化合物を付加させ、新たなカチオン性の静電複合体粒子を作製した。
【化３】
［式中、Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｎは５から２５２の整数を表す。Ｂは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは５から２５２の整数を表わす。分子量が４０００から１０００００である。］
【０００８】
本発明者らは、塩基性蛋白質と上記のアニオン性高分子化合物やカチオン性高分子化合物との静電複合体粒子を作製し、経口的に投与したところ、腸管から吸収されやすいことを見出した。これらの結果から、本発明のアニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物を使用すれば、塩基性蛋白質や酸性蛋白質の新たなキャリヤーになり得ることを見出した。特に、塩基性蛋白質のアニオン性静電複合体粒子にカチオン性高分子化合物を付加させた粒子は、塩基性蛋白質を経口的に腸管で吸収させるため新たなツールとして有効であることを見出した。以上に知見に基づいて本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）下記の式１：
【化１】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ
−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは５から３４７の整数を表す。］で示される、分子量が４０００から１０００００であるアニオン性高分子化合物。
（２）分子量が１００００以上である、上記（１）記載のアニオン性高分子化合物。
（３）ｎが２３から８７である、上記（１）又は（２）に記載のアニオン性高分子化合物。
【００１０】
（４）下記の式２：
【化２】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは４から３４７の整数を表す。ＢはＮ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは２から２５３の整数を表わす。］で示される、分子量が４０００から１０００００である、アニオン性高分子化合物。
（５）分子量が１００００以上である、上記（４）記載のアニオン性高分子化合物。
（６）Ａがカルボキシル基であり、ＢがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、上記（４）または（５）記載のアニオン性高分子化合物。
（７）ｎが２３から８７の整数を表わし、ｍが１１から２５の整数を表わす、上記（４）から（６）のいずれかに記載のアニオン性高分子化合物。
【００１１】
（８）下記の式３：
【化３】
［式中、Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｎは５から２５２の整数を表す。Ｂは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは５から２５２の整数を表わす。］で示される、分子量が４０００から１０００００である、カチオン性高分子化合物。
（９）分子量が１００００以上である、上記（８）記載のカチオン性高分子化合物。
（１０）Ｂが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、ＣがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、上記（８）または（９）記載のカチオン性高分子化合物。
（１１）ｎが５から１６１の整数を表わし、ｍが７から２５２の整数を表わす、上記（８）から（１０）のいずれかに記載のカチオン性高分子化合物。
（１２）Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、ＢがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、上記（８）または（９）記載のカチオン性高分子化合物。
（１３）ｎが７から２５２の整数を表わし、ｍが５から１６１の整数を表わす、上記（１２）に記載のカチオン性高分子化合物。
【００１２】
（１４）塩基性蛋白質と上記（１）から（７）に記載のアニオン性高分子化合物との静電複合体であって、蛋白質の重量を１として、該化合物が重量比で１から３２の組成である塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
（１５）塩基性蛋白質と上記（１）から（７）に記載のアニオン性高分子化合物との静電複合体であって、蛋白質の重量を１として、該化合物が重量比で３から３２の組成である塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
（１６）該静電複合体粒子がアニオン性であり、粒子径が５０から２５０ｎｍである、上記（１４）又は（１５）記載の塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
（１７）塩基性蛋白質が、カルシトニンまたはヒト成長ホルモンである、上記（１４）から（１５）のいずれかに記載の静電複合体粒子。
（１８）上記（１５）から（１７）に記載の静電複合体粒子に、上記（８）から（１３）のカチオン性高分子化合物を静電複合体形成に使用したアニオン性高分子化合物の０．５から４倍量を付加して得られる付加粒子。
【発明の効果】
【００１３】
塩基性蛋白質は、本発明の式１と式２のアニオン性高分子化合物と静電複合体を形成し、また、酸性蛋白質は式３のカチオン性高分子化合物と静電複合体を形成する。細胞表面はアニオン性であるため、腸管吸収を促進させるためには、静電複合体の荷電はカチオン性であることが望ましい。塩基性蛋白質の場合、本発明の式１と式２のアニオン性高分子化合物と反応して生成する静電複合体粒子はアニオン性となるため、更に式３のカチオン性高分子化合物を添加して、粒子の外層がカチオン性となった付加粒子を形成させる。これにより、このカチオン性付加粒子は腸管吸収性が向上した。一方、酸性蛋白質の場合には、式３のカチオン性高分子化合物との静電複合体はカチオン性となるため、この複合体を使用することにより、腸管吸収性の向上が可能である。
このように、蛋白質が塩基性であるか酸性であるかによって、本発明の式１と式２のアニオン性高分子化合物、式３のカチオン性高分子化合物を使用して、蛋白質との静電複合体を形成させ、静電複合体の荷電の量を、式１から式３の高分子化合物を組み合わせて使用することにより、調整することができる。即ち、蛋白質の新たなキャリヤーとして、本発明の式１から式３の高分子化合物の組み合わせによる、蛋白質の混合静電複合体粒子を提供できることが見出せた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
−本発明の第一の態様−
本発明の第一の態様は、蛋白質と静電複合体を形成し得る、式１から式３のアニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物に関するものである。
本発明の式１から式３の分子量とは、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定された各化合物の数平均分子量を表し、分子量が４０００から１０００００の範囲の数値である。好ましい分子量としては、４０００から６００００の範囲を挙げることができる。より好ましくは、１００００から６００００を挙げることができる。
本発明の式１から式３の高分子化合物におけるｎとｍの整数の値は、式１から式３の本発明化合物に関する以下に示す合成方法に基づき、ＧＰＣによる各高分子化合物の数平均分子量と、使用したアクリル酸誘導体の分子量から算出される。
【００１５】
式１から式３の化合物の合成方法を以下に説明する。特許文献１に示されている方法に準じて光重合反応を利用して、それぞれの化合物を合成する。例えば、式４
【化４】
で示される化合物と、モノマーである、アクリル酸、ｐ−ビニル安息香酸メチル、ｐ−ビニルベンゼンスルホニルメチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをそれぞれ使用し、メタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、ＵＶ照射下にリビング重合を行う。式１の高分子化合物は、アニオン性の官能基を持つ、アクリル酸、ｐ−ビニル安息香酸メチル、ｐ−ビニルベンゼンスルホニルメチルを使用し、式４の化合物と光重合し、エステル基を加水分解することにより合成することができる。
式２の高分子化合物は、上述するように式４の化合物とアニオン性官能基を持つモノマーを光重合させた後に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをそれぞれ加えて更に光重合を行うことによって合成できる。
式３の高分子化合物は、式４の化合物とカチオン性の官能基を持つモノマー（例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）を光重合させ、その後、更にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどを加えて光重合することによって合成することができる。また、式４の化合物に付加させる順序が逆である高分子化合物も同様に合成することができる。即ち、式４の化合物とＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどを光重合させた後、更にカチオン性の官能基を持つモノマー（例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）加えて光重合させ合成することができる。
合成された式１と式２のアニオン性高分子あるいは式３のカチオン性高分子は、メタノール溶液を大量のジエチルエーテルに滴下することによる沈殿法を繰り返す、再沈殿法を用いて、あるいは水溶液を透析処理することで精製することができる。
【００１６】
式２や式３の高分子化合物においてＮ−イソプロピルアクリルアミドが重合した領域は疎水性が高くなり、加熱するとその領域が凝集するようになっている。そのため、式２や式３の高分子化合物の３次元構造が大きく変わり、新たな物性を高分子化合物に付与することができる。そこで、このＮ−イソプロピルアクリルアミドが重合した領域を感温性領域（部分）と名付ける。
加熱することによる３次元構造の変化を、具体的に式３のカチオン性高分子化合物を用いて説明する。上述の合成方法で示されるように、感温性領域が４本の側鎖の中心部分に存在する化合物（以下の式５で示される高分子化合物）と感温性領域が４本の側鎖の先端部分に存在する化合物（以下の式６で示される高分子化合物）の２種の化合物（ブロック構造の異なる化合物）が存在する。
【００１７】
【化５】
［式中、ｎ、ｍはモノマーの重合度を表わす整数であり、ｎはカチオン性官能基の付いたカチオン性領域の数平均分子量から算出される数字である。ｍは感温性領域の数平均分子量から算出される数字である。全分子量は４０００から１０００００である。］
【００１８】
【化６】
［式中、ｎ、ｍはモノマーの重合度を表わす整数であり、ｍはカチオン性官能基の付いたカチオン性領域の数平均分子量から算出される数字である。ｎは感温性領域の数平均分子量から算出される数字である。全分子量は４０００から１０００００である。］
【００１９】
これら２種の式５と式６の高分子化合物を加熱すると、感温性領域の凝集が起こり、それぞれ図１と図２に示すような３次元構造の変化が生じた。図１の凝集構造を、イソギンチャクに似ていることから、イソギンチャク構造と名付けた。図２の凝集構造を、クモに似ていることから、スパイダー構造と名付けた。
【００２０】
式１のアニオン性高分子化合物におけるｎの値は、式１の高分子化合物のＧＰＣによる数平均分子量から、使用したモノマーの分子量と側鎖の数（４本）で除して算出される整数である。なお、式４の化合物の分子量は計算に加えなかった。
式１の分子量としては、４０００から１０００００の範囲の数値を表し、好ましくは、１７０００から２５０００の範囲の数値を表す。アクリル酸、ｐ−ビニル安息香酸、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸の分子量は、それぞれ、７２、１４８、１８４である。従って、ｎの値は５から３４７の範囲にある。好ましい範囲としては、２３から８７の範囲を挙げることができる。
【００２１】
式２のアニオン性高分子化合物におけるｎとｍの値は、式４の化合物にアニオン性モノマーが付加重合しただけの合成中間化合物の数平均分子量と、更にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどを光重合させた後の式２の高分子化合物の数平均分子量から、それぞれのモノマーに由来する分子量が概算され、この分子量を使用したモノマーの分子量と側鎖の数（４本）で除して算出される整数である。
アニオン性モノマー由来の領域の分子量としては、３０００から１０００００の範囲の数値を表し、より好ましくは１７０００から２５０００となる数値を表す。更に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどに由来する分子量としては、１０００から１０００００の範囲の数値を表す。好ましくは、５０００から１００００の範囲の数値を表す。上述のごとく、アニオン性モノマーの分子量で上記の合成中間化合物の分子量を除すことにより、ｎの値は、４から３４７の範囲であり、好ましくは２３から８７の範囲を挙げることができる。一方、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの分子量は、９９、１１３であるので、ｍの値は、２から２５３の範囲であり、好ましくは１１から２５の範囲を挙げることができる。
【００２２】
式３におけるカチオン性高分子化合物におけるｎとｍの値は、カチオン性モノマーに由来する領域が、ｎで表わされる領域であるのか、ｍで表わされる領域であるのかで異なる。式５で表わされるイソギンチャク構造を取る高分子化合物においては、カチオン性モノマー由来の分子量としては、３０００から１０００００の範囲を表わし、好ましくは、３０００から１００００の範囲を示す。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに由来する領域の分子量としては、３０００から１０００００の範囲を表わし、好ましくは３０００から２４０００の範囲を挙げることができる。なお、カチオン性モノマー（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）の分子量が１５５であるので、式５の高分子化合物においては、ｎの値は、５から１６１の範囲を表わし、好ましいものとしては５から１６の範囲を挙げることができる。ｍの値は、７から２５２の範囲を表わし、好ましくは７から６０の範囲を挙げることができる。
式６の高分子化合物におけるｎとｍの値は、式５のｎとｍの値を交換したものであり、ｎの値は、７から２５２の範囲を表わし、好ましくは７から６０の範囲を挙げることができる。ｍの値は、５から１６１の範囲を表わし、好ましいものとしては５から１６の範囲を挙げることができる。
【００２３】
−本発明の第二の態様−
本発明の第二の態様は、塩基性蛋白質と上述の式１と式２のアニオン性高分子化合物との静電複合体、更に式３のカチオン性高分子化合物が付加した混合静電複合体（付加粒子）に関するものである。
本発明で言う「静電複合体」とは、塩基性蛋白質と酸性のアニオン性化合物が静電的に結合して得られる複合体（塩）のことを言う。この静電複合体は、蛋白質の重量を１重量部として、式１または式２のアニオン性化合物を３から３２重量部を加えて、蛋白質−アニオン性化合物静電複合体を形成させることができる。好ましくは、式１または式２のアニオン性化合物を３から３２重量部を加えて、静電複合体を形成させることが挙げられる。
この蛋白質静電複合体は、水溶液中で分散して微細な粒子構造を形成しており、蛋白質とアニオン性高分子の構成モル比によっては、酸性（アニオン性）の粒子になったり、塩基性（カチオン性）の粒子になったりする。これを総称して本発明では「静電複合体粒子
」と言う。なお、本発明の蛋白質静電複合体粒子においては、カチオン性高分子化合物の荷電量が蛋白質の荷電量より多くなるため、結果的には酸性（アニオン性）になっている。
上記アニオン性の蛋白質静電複合体粒子の粒子径は、濃度の影響を受けやすく、例えば図３から図４に示されるように高濃度では安定で１５０から２００ｎｍのサイズであるが、低濃度になると粒子径が拡大し７００ｎｍを超えるようになる傾向が見られた。
【００２４】
本発明で言う「カチオン性高分子化合物の付加粒子」とは、溶液中の上記アニオン性の蛋白質静電複合体粒子に、式３のカチオン性化合物を添加し、静電複合体粒子の外層にカチオン性化合物を付加させた粒子（混合静電複合体）のことを表す。本発明の付加粒子は、カチオン性化合物が静電複合体粒子の外層に付加されているため、粒子構造が安定化して上述のような濃度の影響は受けなくなっている。
なお、本発明のカチオン性化合物付加粒子は、カチオン性化合物で被覆されている粒子であり、粒子全体としての電荷はカチオン性になっている。このカチオン性化合物付加粒子（混合静電複合体）は、出発物質である蛋白質静電複合体粒子のアニオン性（酸性）が強いほど安定であって、粒子径も小さくなる傾向がある。逆に出発物質の蛋白質静電複合体粒子のアニオン性（酸性）が弱ければ、不安定になり、粒子径が拡大する傾向にある。例えば図５に示すように、蛋白質に添加するアニオン性高分子化合物の量が少なければ、生成した静電複合体にカチオン性高分子化合物を付加させた場合、添加量が増大してくると粒子径が１３０ｎｍから拡大して７００ｎｍを超えるようになる傾向が見られた。一方、蛋白質に添加するアニオン性高分子化合物の量が充分であれば、生成した静電複合体にカチオン性化合物を付加させた場合、添加量が増大しても粒子径は拡大せず、縮小する傾向になる。例えば図６に示されるように１３０ｎｍから７０ｎｍに粒子が締まってくる傾向が見られる。
更に、特許文献１や非特許文献１の結果を参考にすると、核酸の場合と同じように蛋白質に関しても、生体内への蛋白導入効率を向上できるようになる。
【００２５】
本発明の蛋白質静電複合体粒子をアニオン性（酸性）するためには、使用されるアニオン性化合物のアニオン性（酸性）が強いことが望ましい。この酸性の強さは、有機酸を持つモノマーの重合度に比例すると考えられる。例えばモノマーとしてアクリル酸を使用する場合には、アクリル酸の重合度に比例すると考えられる。例えば、図８に示されるように、静電複合体粒子の溶液中での安定性も、アクリル酸の重合度が高い（酸性が高い）ものがより安定であることが示されている。
【００２６】
以上のことから、本発明の蛋白質静電複合体粒子を安定に且つ粒子径を小さくするには、アニオン性高分子化合物の分子量は、４０００から１０００００の範囲であり、好ましくは約１万以上である。
また、蛋白質に対して、アニオン性化合物の添加量が多くなれば、上記の分子量の効果と同じ効果が見られる。例えば図９に示されるように、アニオン性化合物の添加量が多くなれば、静電複合体粒子の粒子径は縮小する傾向にある。また、溶液の散乱強度（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）から、分子量約１万のアニオン性化合物を用いて、蛋白質１重量部に対して３重量部あれば、静電複合体粒子が充分形成されることが分かった。それ故、これ以上のアニオン性化合物を添加しても静電複合体形成に加わることがなく、過剰のアニオン性化合物として溶液中に共存することになることが分かった。
【００２７】
本発明で言う「蛋白質」とは、生理活性を示す蛋白質であれば特に限定されないが、塩基性蛋白質を使用することが望ましい。なお、酸性の蛋白質を使用する場合には、式３のカチオン性（塩基性）化合物を用いて静電複合体粒子を作製できる。
本発明で使用可能な塩基性蛋白質としては、例えばカルシトニン、インターフェロン等のホルモン類、例えばｈＧＨ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子、例えば
ＢＤＮＦ等の神経栄養因子等を挙げることができる。好ましいものとしては、カルシトニン、ｈＧＨ、ＨＧＦ等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子化合物の付加粒子（混合静電複合体）に関して、その粒子径が５０から４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、複合体粒子等の内部の蛋白質にまで酵素の作用が及ぶ恐れがある。更には腎臓にて濾過排出される恐れもある。一方、これよりも粒子径が大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。特に、経口による腸管吸収性を考慮すれば、本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子付加粒子の粒子径は１５０ｎｍ以下が好ましい。また、静電複合体粒子に添加すべきカチオン性高分子化合物（式３）の重量は、静電複合体の重量を１として、０．５から４の範囲であり、好ましくは、０．５から２の範囲を挙げることができる。
【００２９】
また、式２の感温性高分子が導入されたアニオン性高分子化合物についても、式１のアニオン性高分子化合物と同様の挙動が見られることが明らかとなった。例えば式２のアニオン性化合物（アニオン性部分の分子量：１７０００、感温性部分の分子量：９５００）を用いて、蛋白質との静電複合体を作製した場合にも、図１１に示されるように、静電複合体の安定性は良好で、濃度による影響は少ないことが示された。また、図１３に示されるように蛋白質を１重量部として、式２のアニオン性高分子化合物を１重量部添加すれば、充分な静電複合体が得られることが分かった。
図１４に示されるように、この静電複合体粒子は、ｐＨ６．５よりも高いｐＨでは式３のアニオン性化合物の添加量の効果を受け難いが、ｐＨ６．５以下になれば大きく添加量効果を受けることが示された。
【００３０】
本発明のアニオン性高分子化合物と塩基性蛋白質とを反応させ静電複合体を形成させるには、蛋白質の濃度０．１から１０μｇ／μＬ程度の水溶液に対し、常温にてアニオン性高分子化合物の水溶液（０．１から１０μｇ／μＬ）を添加し、混合すればよい。蛋白質１重量部に対してアニオン性高分子化合物を重量比として３から３２倍量添加することが望ましい。好ましくはアニオン性高分子化合物を荷電的に過剰量添加し、生成する静電複合体粒子がアニオン性となることが望ましい。
【００３１】
本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子化合物の付加粒子は任意の方法で生体に投与することができる。当該投与方法としては経口あるいは非経口での投与が可能であり、経口では、液剤やゼリー剤として投与することができる。非経口としては、静脈内又は動脈内への注射を挙げることができる。それ以外にも、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与も可能であり、更には、気管内視鏡を用いて肺胞へ噴霧するなど病変組織内に直接投与することも可能である。
【００３２】
本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子化合物の付加粒子を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る試剤（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら試剤は公知のものが使用できる。また、本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子化合物の付加粒子を有効成分とする医薬の投与量は、治療目的とする疾患、疾患部位、投与方法等の種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分な量を投与することが行われる。
【実施例】
【００３３】
本発明は更に下記の実施例、試験例で詳しく説明されるが、これらの例示は単なる実例であって本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させ
ても良い。
【００３４】
（実施例１）１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンの合成
【化７】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼン（１ｇ，２．２２ｍｍｏｌ，Ｍｗ．４４９．８３）にエタノール（１００ｍｌ）とナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（４ｇ，１７．７６ｍｍｏｌ，Ｍｗ．２２５．３１）を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始４８時間後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケータにて真空乾燥させて１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンを得た（白色固体）。収量１．４８ｇ（収率９１．４％）。１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果、δ７．４８７ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、δ４．５７３ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｓ）、δ４．０６５から３．９９４ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ３．７６５から３．６８７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ１．３０４から１．２５６ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３）であった。
【００３５】
（実施例２）アニオン性高分子化合物（式１、Ａ：カルボキシル基）の合成
上記反応式により、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにアクリル酸を重合させてアニオン性官能基の領域がアクリル酸重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式１）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（１０８ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ，Ｍｗ．７２３．３０）をトルエンで希釈し、アクリル酸（１．４４ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、トルエンで全量を２０ｍｌとし、さらにメタノールを４０ｍｌ加えた溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、アニオン性高分子化合物（式１）である白色の４分岐型ポリアクリル酸化合物を１３２ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約１０，０００であった。
また、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの量を１０８ｍｇに固定し、とアクリル酸の量を０．６４５ｇとすることで、生成するアニオン性高分子化合物の数平均分子量は約４５００となり、アクリル酸の量を６．７６ｇとすることで数平均分子量は約５５０００となった。
使用したアクリル酸の量と生成した式１のアニオン性化合物の分子量とは、図１５で示されるような相関関係を有することが明らかとなった。
【００３６】
（実施例３）アニオン性高分子化合物（式２）の合成
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにアクリル酸、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの順で重合させてベンゼン環に近い部分がアクリル酸重合体であり、４本の側鎖の末端部が感温性領域のＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式２）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（２１６ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ，Ｍｗ．７２３．３０）にアクリル酸（１．３１ｇ，
１８ｍｍｏｌ）を加え、トルエンで全量を６０ｍｌとた溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、白色の４分岐型ポリアクリル酸化合物を３４８ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約２２，０００であった。
得られた４分岐型ポリアクリル酸化合物（１６２ｍｇ，７．２μｍｏｌ，Ｍｎ＝２２０００）にＮ−イソプロピルアクリルアミド（９３０ｍｇ，８．２ｍｍｏｌ）を加え、メタノールで全量を２０ｍｌとした溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、アニオン性高分子化合物（式２）である白色の４分岐型ポリアクリル酸-ポリＮ−イソプロピ
ルアクリルアミド化合物を２２８ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約２７，０００であった（ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド部の分子量は約５０００）。
【００３７】
（実施例４）アニオン性化合物（式２）の合成
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにＮ−イソプロピルアクリルアミド、アクリル酸の順で重合させて実施例３とは反応させるモノマーの順序を逆にした。ベンゼン環に近い部分が感温性領域のＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体であり、４本の側鎖の末端部分がアクリル酸重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式２）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（５４ｍｇ，０．０７５ｍｍｏｌ，Ｍｗ．７２３．３０）にＮ−イソプロピルアクリルアミド（２．３４ｇ，１８ｍｍｏｌ）を加え、トルエンで全量を２０とし、さらにメタノール４０ｍｌを加えた溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、白色の４分岐型Ｎ−イソプロピルアクリルアミド化合物を３３４ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約９，５００であった。
得られた４分岐型ポリアクリル酸化合物（１６２ｍｇ，７．２μｍｏｌ，Ｍｎ＝２２０００）にアクリル酸（１．４４ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、トルエンで全量を２０ｍｌとし、さらにメタノール４０ｍｌを加えた溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、白色のアニオン性高分子化合物（式３）である４分岐型ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド−ポリアクリル酸化合物を１９０ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約２７，０００であった（ポリアクリル酸部の分子量は約１７，０００）。
【００３８】
（実施例５）カチオン性化合物（式３）の合成
【化８】
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの順で重合させてＣがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド重合体で、ＢがＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体である４分岐型カチオン性高分子化合物（式３）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（４３２ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ，Ｍｗ．７２３．３０）を３６ｍｌのベンゼンに溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（５．１６ｇ、３３ｍｍｏｌ）を加えた後、メタノールで希釈し、全量を１２０ｍｌの溶液を調製した。この溶液から２０ｍｌを取り、窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射９０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、白色の４分岐型ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド化合物を８０３ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約３，７００であった。
得られた４分岐型ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド化合物（６５０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）にメタノール１０ｍｌを加えて溶解させ、これにＮ−イソプロピルアクリルアミド（１．２４ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）を加え、メタノールを加えて全量を２０ｍｌとした溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射９０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥し、カチオン性高分子化合物（式３）である白色の４分岐型ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド-ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物を３９５ｍｇ得た。ＧＰＣにて得られた
高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約１５，０００であった（ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド部の分子量は約１２，０００）。
使用したＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの添加量と、生成したカチオン性中間体（ｉｎｉｆｅｒｔｅｒ）の分子量とは、図１６で示される相関関係があることを示した。また、同様にカチオン性の中間体（ｉｎｉｆｅｒｔｅｒ）の分子量と、添加したＮ−イソプロピルアクリルアミドの量とは、同じく図１７で示される相関関係があることを示した。
【００３９】
（実施例６）アニオン性高分子化合物（式１、Ａ：ｐ−カルボキシルフェニル基）の合成
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにビニル安息香酸メチルを重合させた後に加水分解を行い、ｐ−ビニル安息香酸重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式１）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベ
ンゼン（５０ｍｇ）とｐ−ビニル安息香酸メチルエステル（２ｇ）をクロロホルム３０ｍｌとメタノール３０ｍｌに溶解させた。生成した溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、脱イオン水３０ｍｌを加えた後、水酸化ナトリウム２００ｍｇを加えた。８０℃で１時間撹拌した後、１Ｎ塩化水素水溶液で中和を行い、３日間透析（限外濾過分子量１０００）を行った。凍結乾燥によりアニオン性高分子化合物である白色の４分岐型ポリビニル安息香酸化合物１９０ｍｇを得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約１０，０００であった。
【００４０】
（実施例７）アニオン性高分子化合物（式１、Ａ：ｐ−ヒドロキシスルホニルフェニル基）の合成
１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにｐ−ビニルベンゼンスルホン酸メチルエステルを重合させた後に加水分解を行い、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸重合体である４分岐型アニオン性高分子化合物（式１）を合成した。
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（１００ｍｇ）とｐ−ビニルベンゼンスルホン酸メチルエステル（１ｇ）をトルエン６０ｍｌに溶解させた。生成した溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射６０分後、重合溶液をエバポレーターにて濃縮し、脱イオン水３０ｍｌを加えた後、水酸化ナトリウム２００ｍｇを加えた。８０℃で１時間撹拌した後、１Ｎ塩化水素水溶液で中和を行い、３日間透析（限外濾過分子量１０００）を行った。凍結乾燥によりアニオン性高分子化合物である白色の４分岐型ポリビニルベンゼンスルホン酸化合物２４４ｍｇを得た。ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、数平均分子量は約６，１００であった。
【００４１】
（実施例８）アニオン性高分子化合物（式１）とカルシトニンとの静電複合体の合成
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物（式１）であるポリアクリル酸化合物（分子量約２７０００）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調整した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸化合物水溶液２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図３と図４に示す。
この結果から、アニオン性のカルシトニン蛋白質静電複合体粒子の粒子径は、濃度の影響を受けやすく、例えば図４に示されるように高濃度では安定で１５０から２００ｎｍのサイズであるが、低濃度になると粒子径が拡大し７００ｎｍを超えるようになる傾向が見られた。一方、図３に示されるように、該静電複合体粒子は熱的には安定で経時的な変化は受け難いことが示された。
【００４２】
（実施例９）アニオン性化合物（式２）とカルシトニンとの静電複合体の合成
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物（式２）であるポリアクリル酸-ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物（分子量約２７０００）を精製水にて希
釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調整した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸-ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物水溶液２００μｌを加え
、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図２６に示す。
【００４３】
（実施例１０）アニオン性化合物（式３）とカルシトニンとの静電複合体の合成
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物（式３）であるポリＮ−イソプロピルアクリルアミドーポリアクリル酸化合物（分子量約２７０００）を精製水にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調整した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸-ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物水溶液２００μｌを加え
、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図２５に示す。
【００４４】
（実施例１１）アニオン性化合物（式１）とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子の合成
実施例８に従って調整した、アニオン性高分子化合物（式１）とカルシトニンとの静電複合体の水溶液２５０μｌに、実施例７に従って合成したカチオン性高分子の水溶液２００μｌ（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を室温で加え、１０分放置することでアニオン性化合物とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図５に示す。
図５に示されるように、蛋白質（カルシトニン）に添加するアニオン性化合物の量が少なければ、生成した静電複合体にカチオン性化合物を付加させた場合、付加量が増大してくると粒子径が１３０ｎｍから拡大して７００ｎｍを超えるようになる傾向が見られた。一方、図６に示されるようにカルシトニンに添加するアニオン性化合物の量が充分であれば、生成した静電複合体にカチオン性化合物を付加させた場合、付加量が増大しても粒子径は拡大せず、縮小する傾向になる。例えば１３０ｎｍから７０ｎｍに粒子径が締まってくる傾向が見られた。
【００４５】
（実施例１２）アニオン性化合物（式２）とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子の合成
実施例８に従って調整した、アニオン性高分子化合物（式１）とカルシトニンとの静電複合体の水溶液２５０μｌに、実施例５に従って合成したカチオン性高分子の水溶液２５０μｌ（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を室温で加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子を調整した。
得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱法で測定した。その結果を図２８に示す。
【００４６】
（実施例１３）動物実験用のカルシトニン含有カチオン性高分子化合物の付加粒子の合成
カルシトニンを精製水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を３ｍｌ調整した。また、実施例３に従って合成したアニオン性高分子化合物（式３、分子量約１０，０００）を精製水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を５ｍｌ調整した。さらに、実施例２に従って合成したカチオン性高分子化合物（式２、分子量約１５，０００）を精製水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を５ｍｌ調整した。
カルシトニン水溶液１ｍｌに室温でアニオン性高分子化合物水溶液４ｍｌを加え、１０分間放置した。これにカチオン性高分子化合物水溶液４ｍｌを加え、１０分間放置し、カチオン性高分子付加粒子の水溶液を調整した。２０分間３７℃で保温し、経口投与用カルシトニンス水溶液（カルシトニン濃度１ｍｇ／９ｍｌ）を調整した。ラットへの経口投与では体重あたり１ｍｇ／ｋｇ量の割合で与えた。
上記で調整した経口投与水溶液から９００μｌを計り取り、３７℃下で生理食塩水１１００μｌを加え、十二指腸投与用カルシトニン水溶液（カルシトニン濃度１００μｇ／２ｍｌ）を調整した。ラットへの十二指腸投与では体重あたり１００μｇ／ｋｇ量の割合で
与えた。
上記で調整した十二指腸投与用水溶液から２０μｌを計り取り、３７℃下で生理食塩水１９８０μｌを加え、カルシトニン濃度を１μｇ／２ｍｌに希釈した。これから１００μｌを計り取り３７℃下で生理食塩水１９００μｌを加えて全量を２ｍｌとし、静脈注射用カルシトニン水溶液（カルシトニン濃度５０ｎｇ／２ｍｌ）を調整した。ラットへの静脈内投与では体重あたり５０ｎｇ／ｋｇの割合で与えた。
【００４７】
（試験例１）感温性カチオン性高分子化合物（式３）の凝集性
実施例５に従って合成したカチオン性高分子化合物の１％水溶液を調整した。この溶液を２５℃とし、１分間に０．５℃の割合で昇温させながら、８００ｎｍの光の透過率を分光光度計（島津製作所ＵＶ−１７００）にて測定することで凝集性を調べた。
その結果を図１８に示す。
図１８に示されるように、３５℃から３７℃で式３の感温性カチオン性化合物は凝集して白濁し、透過度が減少した。
【００４８】
（試験例２）直鎖構造（２本側鎖）を持つアニオン性高分子化合物（対照例）と蛋白質とのナノ粒子形成能
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成されたアニオン性高分子化合物水溶液２５０μｌ（濃度２５０μｇ／２５０μｌ）を加え、アニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。これを測定用セルに加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）を用いて、静電複合体の粒径測定を行った。粒径はキュウムラント解析値とした。
その結果を図１９に示す。
２本側鎖のアニオン性高分子化合物を用いた場合、蛋白質との静電複合体粒子の安定性が悪く、経時的に粒子径が拡大して行くことが示された。
【００４９】
（試験例３）分岐構造を持つアニオン性高分子化合物（式１）と蛋白質とのナノ粒子形成能
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成された分岐構造を持つアニオン性高分子化合物水溶液２５０μｌ（濃度２５０μｇ／２５０μｌ）を加え、アニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。これを測定用セルに加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）を用いて、静電複合体の粒径測定を行った。粒径はキュウムラント解析値とした。
その結果を図２４に示す。
図１９と図２４から示されるように、４本側鎖のアニオン性高分子化合物の方が２本側鎖のアニオン性高分子化合物より、粒子の安定性が良好になる傾向にあることが分かった。このことから、ベンゼン環の側鎖（置換基）の数は、多い方が少ないよりも蛋白質との絡み合いが増え安定性が良い傾向にあると言える。
【００５０】
（試験例４）アニオン性高分子化合物（式１）と蛋白質とのナノ粒子形成の安定化
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成されたアニオン性高分子化合物水溶液２５０μｌ（濃度２５０μｇ／２５０μｌ）を加え、アニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。これを測定用セルに加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）を用いて、静電複合体の粒径を経時的に測定することで、粒径の変化を調べ、安定性を評価した。粒径はキュウムラント解析値とした。
その結果を図８に示す。
この結果から、アニオン性化合物の分子量が大きくなる（モノマーの重合度が上がり、アニオン性（酸性）が高くなる）ほど粒子は安定になり、粒子径が拡張しないことが示された。
【００５１】
（試験例５）アニオン性高分子化合物（式１）の最適化
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、そこに実施例２に従って合成されたアニオン性高分子化合物水溶液（濃度２５０μｇ／２５０μｌ）を５０μｌづつ加え、光散乱強度測定によって粒子の形成量を、キュウムラント解析による粒径測定を行い、アニオン性高分子化合物の使用量の最適化を行った。
その結果を図９に示す。
図７に示されるように、アニオン性高分子化合物の添加量が多くなれば、静電複合体粒子の粒子径は縮小する傾向にある。また、溶液の散乱強度（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）から、分子量約１万のアニオン性高分子化合物を用いて、蛋白質１重量部に対して３重量部あれば、静電複合体粒子が充分形成されることが分かった。それ故、これ以上のアニオン性高分子化合物を添加しても静電複合体形成に加わることがなく、過剰のアニオン性高分子化合物として溶液中に共存することになることが分かった。
【００５２】
（試験例６）カルシトニン非存在下でのアニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物同士の安定性
実施例２に従って合成したアニオン性化合物２００μｇ（濃度２００μｇ／２００μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、そこに実施例５に従って合成したカチオン性化合物を５０μｇ（濃度５０μｇ／５０μｌ）ずつ加え、キュウムラント解析による粒径測定を行い、安定性を調べた。
その結果を図２０に示す。
図２０に示されるように、式２のアニオン性化合物と式３のカチオン性化合物は静電複合体を形成することが分かった。粒子径も約２００ｎｍで一定し、安定な粒子を形成することが分かった。
【００５３】
（試験例７）カルシトニンとアニオン性高分子化合物との静電複合体とカチオン性高分子化合物同士の安定性
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、実施例２に従って合成したアニオン性高分子化合物の水溶液（濃度１００μｇ／１００μｌ）を１００μｌあるいは２００μｌ添加した。そこに実施例５に従って合成したカチオン性高分子化合物の水溶液（濃度１００μｇ／１００μｌ）を５０μｌづつ加え、キュウムラント解析による粒径測定を行い、安定性を調べた。
その結果を図５と図６に示す。
図５に示されるようにアニオン性化合物の添加量が少ない場合の蛋白質静電複合体は、カチオン性化合物を付加させると粒子の安定性が弱くなり、粒子径が拡大する傾向になることが分かった。また、図６に示されるようにアニオン性化合物の添加量が充分である場合の蛋白質静電複合体は、カチオン性化合物を付加させて行くと粒子が凝集して粒子径が縮小する傾向にあることが分かった。
【００５４】
（試験例８）感温性高分子化合物の安定性
実施例４の中間生成物として合成したポリＮ−イソプロピルアクリルアミド化合物の１％水溶液を調整した。この溶液を２４℃とし、１分間に０．５℃の割合で昇温させながら、８００ｎｍの光の透過率を分光光度計（島津製作所ＵＶ−１７００）にて測定することで安定性を調べた。
その結果を図２１に示す。
【００５５】
（試験例９）感温性アニオン性高分子化合物の安定性
実施例２から４に従って合成したアニオン性化合物の１％水溶液を調整した。この溶液
を２４℃とし、１分間に０．５℃の割合で昇温させながら、８００ｎｍの光の透過率を分光光度計（島津製作所ＵＶ−１７００）にて測定することで安定性を調べた。
その結果を図２２に示す。
【００５６】
（試験例１０）感温性アニオン性高分子化合物のみの安定性
実施例４に従って合成したアニオン性高分子化合物の水溶液２００μｌ（濃度２００μｇ／２００μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、経時的に、あるいは精製水で希釈しながら、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで安定性を調べた。
その結果を図２３と図２４に示す。
【００５７】
（試験例１１）カルシトニンとアニオン性高分子化合物との静電複合体（ナノ粒子）の安定性
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に実施例４に従って合成したアニオン性高分子化合物の水溶液２００μｌ（濃度２００μｇ／２００μｌ）を加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、経時的に、あるいは精製水で希釈しながら、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで安定性を調べた。
その結果を図１１と図１２に示す。
図１１に示されるように、静電複合体粒子の安定性は良好で、粒子径の経時変化は少ししかなく、また、図１２に示されるように希釈による静電複合体濃度の粒子径に対する影響は少ないことが示された。
【００５８】
（試験例１２）カルシトニンとアニオン性高分子化合物の静電複合体形成における高分子化合物の分子量の効果
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）を動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、実施例４に従って合成した式２のアニオン性高分子化合物の水溶液（濃度２００μｇ／２００μｌ）を５０μｌづつ加え、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで分子量の効果を調べた。
その結果を図１３に示す。
図１３に示されるように蛋白質を１重量部として、式２のアニオン性高分子化合物を１重量部添加すれば、充分な静電複合体が得られることが分かった。
【００５９】
（試験例１３）カルシトニンとの静電複合体粒子のｐＨ安定性
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例４に従って合成した式２のアニオン性高分子化合物の水溶液（濃度２００μｇ／２００μｌ）を５０、２５０、あるいは５００μｌ加え、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、０．１Ｎ塩酸または、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを調整しながら、キュウムラント解析による粒径測定を行うことでカルシトニンとの静電複合体粒子のｐＨ安定性を調べた。
その結果を図１４に示す。
図１４に示されるように、この静電複合体粒子は、ｐＨ６．５よりも高いｐＨでは式２のアニオン性化合物の添加量の効果を受け難いが、ｐＨ６．５以下になれば大きく添加量効果を受けることが示された。
【００６０】
（試験例１４）カルシトニンとの静電複合体粒子におけるアニオン性高分子化合物の分子量の効果
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成した分子量の異なる種々のアニオン性化合物の水溶液（濃度２００μｇ／２００μｌ）２００μｌを加え、これを動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入
れて装置にセットし、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで、カルシトニン粒子の粒径のアニオン性高分子化合物の分子量の効果を調べた。
その結果を図７に示す。
図７に示されるように、静電複合体粒子の溶液中での安定性は、アニオン性化合物の分子量が多いほど、即ちアクリル酸の重合度が高い（酸性が高い）ものがより安定であることが示されている。
【００６１】
（試験例１５）２本側鎖鎖と４本側鎖のアニオン性高分子化合物による粒子サイズの依存性
カルシトニン水溶液５０μｌ（濃度５０μｇ／５０μｌ）に、実施例２に従って合成した分子量の異なる種々のアニオン性高分子化合物の水溶液（濃度２００μｇ／２００μｌ）２００μｌ、あるいは市販の直鎖状ポリアクリル酸の水溶液（分子量５０００または２５０００）２００μｌを加え、これを動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）の測定用セルに入れて装置にセットし、キュウムラント解析による粒径測定を行うことで、カルシトニン粒子の粒径のアニオン性高分子の分子量依存性を調べた。
その結果を図１０に示す。
図１０に示すように、本発明の静電複合体粒子あるいはカチオン性高分子付加粒子（混合静電複合体）を作製する場合、それらの粒子径はベンゼン環の置換基の数とアニオン性高分子化合物の分子量に影響を受けやすい。例えば２本側鎖のアニオン性高分子化合物の方が粒子径の小さいものができやすい傾向にあることが示された。
【００６２】
（試験例１６）ラット経口投与による血中カルシウム濃度変化
実施例１３に示した動物実験用のカルシトニン含有カチオン製高分子付加粒子（以下高分子付加粒子と記載）を、ラットに各種投与ルートで投与し、カルシトニン薬理活性（血中カルシウム低下作用）を、高分子を付加しないカルシトニン（以下原体と記載）と、比較検討した。各投与群に群分けした８週齢の雄性ＳＤラットの体重を朝９：００に体重を測定し，１０：００から絶食を開始した。３時間後（１３：００）からヘマトクリット管を用いて尾静脈より採血を行った（投与前値）．採血後，ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与して麻酔し，気管内チューブを挿管後，人工呼吸器に接続した。薬剤投与は、投与経路ごとに、以下のように処置した。
無処置群 ： 呼吸器接続後，少なくとも１５分以上安定させた後に試験を開始した。
静脈内投与群 ： 呼吸器接続後，左大腿静脈を露出させた。その後少なくとも１５分以上安定させた後に，溶解溶液または被験物質を左大腿静脈から投与した。
十二指腸投与群 ： 呼吸器接続後，腹部を開腹し十二指腸を露出させた。その後少なくとも１５分以上安定させた後に，溶解溶液または被験物質を，注射針を用いて十二指腸内へ直接投与した。
経口投与群： 呼吸器接続後，胃内経口ゾンデを装着した。その後少なくとも１５分以上安定させた後に，溶解溶液または被験物質を，シリンジを用いて装着した胃内経口ゾンデから経口投与した。
採血は、投与３０，６０，１２０，１８０および３００分後にヘマトクリット管を用いて尾静脈から採血した。血液は採血後室温でしばらく放置した後，３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し，血清を分取し、測定日まで−８０℃以下で保存した。血清中カルシウム濃度は、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ社製，ＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍＴＭ Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ［ＤＩＣＡ−５００］を使用して測定した。
各投与ルートの投与量は表１（カルシトニン投与群の構成）のように設定した。また、図２７に、十二指腸投与群での血中Ｃａ濃度の変化を示した。高分子付加粒子投与において、血中Ｃａの低下（カルシトニン薬理作用）が見られ、カチオン製高分子付加粒子の有効性が確認された。
【００６３】
【表１】
【００６４】
（試験例１７）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）との静電複合体形成とその安定性
（１）カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約９４００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を２ｍｌ調製した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸化合物水溶液２００μｌ、４００μｌ、８００μｌあるいは１６００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３０左図に示す。
ポリアクリル酸化合物を用いたカルシトニンとの静電複合体はポリアクリル酸化合物の添加量の増加に伴って安定性が増すことが分かった。
（２）カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性化合物である４分岐ポリビニル安息香酸化合物（分子量約１２０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸化合物水溶液２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３０中央図に示す。
ポリアクリル酸化合物を用いたカルシトニンとの静電複合体はポリビニル安息香酸化合物が２００ｕｌにおいても安定性であることが分かった。
（３）カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性化合物である４分岐ポリビニル安息香酸化合物（分子量約６１００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。カルシトニン水溶液５０μｌに室温でポリアクリル酸化合物水溶液２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３０右図に示す。
ポリアクリル酸化合物を用いたカルシトニンとの静電複合体はポリスチレンスルフォン酸化合物が２００μｌにおいても安定性であることが分かった。
【００６５】
（試験例１８）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体にカチオン性高分子化合物を付加した付加粒子の安定性
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、式１のアニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約９４００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、カチオン性高分子化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド化合物（分子量約４７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物８００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性高分子化合物２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性高分子化合物との３者静電複合体を調製した。得られた３者静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３１に示す。
ポリアニオン性高分子化合物とカルシトニン、ポリカチオン性高分子化合物との３者静電複合体は比較的安定性であることが分かった。
【００６６】
（試験例１９）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子の安定性
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約８７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、カチオン性−非イオン性化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドーポリジメチルアミノアクリルアミドブロック共重合体化合物（カチオン部分子量約１００００-非イオン性部分子量約３００００、カチオン性部
分子量約４０００-非イオン性部分子量約４０００、あるいはカチオン性部分子量約４０
００-非イオン性部分子量８０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水
溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物２００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性−非イオン性化合物２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性化合物とカルシトニン、カチオン性−非イオン性化合物との３者静電複合体を調製した。得られた３者静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３２に示す。
ポリアニオン性化合物とカルシトニン、ポリカチオン性−非イオン性化合物との３者静電複合体は直後の粒子径は約１００ｎｍであった。非イオン性部が長いと粒子は不安定であったが、非イオン性部の分子量１００００以下では比較的安定であることが分かった。
【００６７】
（試験例２０）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子の安定性
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約８７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、式５のポリ感温性−カチオン性高分子化合物である４分岐ポリイソプロピルアクリルアミドーポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドブロック共重合体化合物（感温性部分子量約９０００-カチオン性部分子量約３０００）をＰＢＳ
（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物４００μｌあるいは１６００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液に感温性−カチオン性高分子化合物２００μｌを加え、１０分間放置す
ることでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、感温性−カチオン性高分子化合物との３者静電複合体を調製した。得られた３者静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３３に示す。
ポリアニオン性化合物とカルシトニン、ポリ感温性−ポリカチオン性化合物との３者静電複合体は直後の粒子径は約３００ｎｍであった。ポリアニオン性化合物の組成比が多い３者静電複合体は極めて安定であることが分かった。
【００６８】
（試験例２１）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子の安定性
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約８７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、式６のポリ感温性−カチオン性化合物である４分岐ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ブロック共重合体化合物（カチオン性部分子量約３０００-感温性部分子量約１０
０００、カチオン性部分子量約１００００-感温性部分子量約１００００、あるいはカチ
オン性部分子量約３０００-感温性部分子量約２４０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、
１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物２００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性−感温性化合物２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性−感温性化合物との３者静電複合体を調製した。得られた３者静電複合体粒子の粒子径は、動的光散乱装置（大塚電子、ＥＬＳ−８０００）のセルを用いて動的光散乱法で測定した。その結果を図３４に示す。
ポリアニオン性化合物とカルシトニン、ポリポリカチオン性−ポリ感温性化合物との３者静電複合体は直後から約１０００ｎｍと大きく凝集した。
【００６９】
（試験例２２）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体のＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
（１）Ｃａｃｏ−２細胞単層膜透過試験方法
透過性実験はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製ＢＩＯＣＯＡＴ ＨＴＳ Ｃａｃｏ−２ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキットを用いて行った。Ｃａｃｏ−２細胞を単層膜状に培養した２４穴トランスウェル（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ １μｍ）内の培養液を吸引し、ＰＢＳで洗浄した後、カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体サンプル２５０μｌを２穴ずつ入れた。各ウエルに１ｍｌのＰＢＳを添加した２４穴マルチウエルに先のトランスウエルを重ね、３７℃下、二酸化炭素濃度５％のインキュベータ内で培養を行った。所定時間毎にマルチウエル内のＰＢＳ１００μｌを採取し、新たにＰＢＳ１００μｌを加え、サンプリングを繰り返した。
（２）ラジオイムノアッセイ測定
サンプリングした溶液５０μｌをＲＩＡ用バッファー５０ｕｌで希釈し、カルシトニン抗体１００μｌを加えた。これにＲＩ値がγカウンターで２００００ｃｐｍ／１００μｌになるように溶液濃度を調整したヨウ素１２５ラベル化カルシトニン溶液を加え、４℃で４０時間放置した。氷上において１．０％ウシγグロブリンを各サンプルに１００μｌづつ加えて撹拌し、次いで２３％ポリエチレングリコール水溶液を各サンプルに５００μｌづつ加えて撹拌した。遠心機で３０００ｒｐｍ、１５分遠心し、上清を吸引し、沈殿物のＲＩ値をγカウンターで測定し、検量線を元にカルシトニン量を求めた。透過率（Ｐａａｐ（ｃｍ／ｓｅｃ））の計算は以下の計算式を用いて行った。
【化９】
ｄＭ／ｄｔは組織を通過する流量（μＭ ｍｉｎ−１またはｄｐｍ ｍｉｎ−１）、Ａ（０．１９６３ｃｍ２）はメンブレンの表面積、Ｃ０は試薬の初期濃度である。
（３）評価試験
カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物として、４分岐型ポリアクリル酸（分子量約９４００）、ポリスチレンスルフォン酸ナトリウム（分子量約６１００）あるいはポリビニル安息香酸（分子量約１２０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。アニオン性高分子化合物２００μｌあるいは１６００μｌとカルシトニン水溶液５０μｌを混合することで静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０μｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって測定した。その結果を図３５に示す。
アニオン性高分子化合物の中で、ポリアクリル酸やポリビニル安息香酸を用いた場合にはほとんど細胞膜を透過しなかったが、ポリスチレンスルフォン酸の場合にはカルシトニンと同程度の透過性を有していた。
【００７０】
（試験例２３）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式２）の静電複合体のＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
試験例２２と同様にして、カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１と式２）の静電複合体の細胞膜透過活性を評価した。評価サンプルは、以下のように作成した。カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物として、４分岐型ポリアクリル酸（分子量約９４００）、ポリアクリル酸−ポリジメチルアクリルアミド（アニオン性部分子量約５０００-非イオン性部分子量約５０００）あるいはポリイソプロピルアクリル
アミド−ポリアクリル酸（感温性部分子量約９０００-アニオン性部分子量約９０００）
をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。アニオン性高分子化合物２００μｌとカルシトニン水溶液５０μｌを混合することで静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０μｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって経時的に測定した。その結果を図３６に示す。
アニオン性単独のポリアクリル酸から作製した静電複合体ではほとんど細胞膜を透過しなかったが、感温性や非イオン性化させたアニオン性化合物から作製した静電複合体ではカルシトニンに比べて透過速度が高くなることが分かった。また、感温性−アニオン性である（イソギンチャク構造）場合には、より細胞膜透過活性が優れていることが分かった。
【００７１】
（試験例２４）カルシトニンとアニオン性高分子化合物の静電複合体のＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
試験例２２と同様にして、カルシトニンとアニオン性高分子化合物の静電複合体の細胞膜透過活性を評価した。評価サンプルは、以下のように作成した。カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物として、４分岐型ポリアクリル酸−ポリジメチルアクリルアミド（アニオン性部分子量約５０００-非イオン性部分子量約５０００）あ
るいは感温性部分が４分岐側鎖の中心部分に存在する、ポリイソプロピルアクリルアミド−ポリアクリル酸（感温性部分子量約９０００-アニオン性部分子量約９０００、感温性
部分子量約２２０００-アニオン性部分子量約２４０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、
１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。アニオン性高分子化合物２００μｌ、８００μｌあるいは１６００μｌとカルシトニン水溶液５０μｌを混合することで静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０μｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって測定した。その結果を図３７に示す。
感温性や非イオン性化させたアニオン性化合物から作製した静電複合体ではカルシトニンに比べて約２倍の高い細胞膜透過性を有していることが分かった。また、アニオン性高分子化合物においては、感温性部分を４本側鎖の中心部に持ち、アニオン性部分を４本側鎖の末端部分に持つイソギンチャク構造のアニオン性高分子化合物の方が、より優れた細胞膜透過活性を持つことが分かった。
【００７２】
（試験例２５）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体に対してカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子に関するＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
試験例２２と同様にして、アニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性高分子化合物との３者静電複合体のＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験を行なった。評価サンプルは、以下のように作成した。カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約８７００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、カチオン性化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド（分子量約１７００または４７００）、カチオン性−非イオン性化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド−ポリジメチルアクリルアミド（カチオン性部分子量約４００００-非イオン性部分子量約８
００００、またはカチオン性部分子量約１００００-非イオン性部分子量約３０００）、
あるいは式５と式６のカチオン性−感温性化合物である４分岐ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドーポリイソプロピルアクリルアミド（カチオン性部分子量約１００００-感温性部分子量約１００００（式６）、カチオン性部分子量約３０００-感温性部分子量約９０００（式５））をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアクリル酸化合物２００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性高分子化合物２００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性高分子化合物との３者静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０μｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって測定した。その結果を図３８に示す。
感温性化させたカチオン性高分子化合物を用いることで細胞膜透過性はカルシトニンのみの約２倍となることが分かった。また、式３のカチオン性高分子化合物の付加粒子においては、感温性部分を４本側鎖の末端部分に持つ化合物（スパイダー構造）の方が、非イオン性部分を４本側鎖の末端部分に持つ化合物よりも、優れた細胞膜透過活性を持つことが分かった。
【００７３】
（試験例２６）カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合体に対してカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子に関するＣａｃｏ−２細胞単層膜透過試験
試験例２２と同様にして、カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）の静電複合
体に対してカチオン性高分子化合物（式３）を付加した付加粒子に関する細胞膜透過活性を評価した。評価サンプルは、以下のように作成された。カルシトニン酢酸塩（サケ、分子量３４９１）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。また、アニオン性高分子化合物である４分岐ポリアクリル酸化合物（分子量約９４００）、ポリスチレンスルフォン酸（分子量約６１００）あるいはポリビニル安息香酸（分子量約１２０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。さらに、感温性−カチオン性高分子化合物である４分岐ポリイソプロピルアクリルアミド−ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド（感温性部分子量約９０００-カチオ
ン性部分子量約３０００、感温性部分子量約９０００−カチオン性部分子量約５０００）をＰＢＳ（−）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を１ｍｌ調製した。ポリアニオン化合物２００μｌまたは４００μｌに室温でカルシトニン水溶液５０μｌを加え、１０分放置することでアニオン性化合物とカルシトニンとの静電複合体を調製した。得られた静電複合体溶液にカチオン性化合物２００μｌまたは４００μｌを加え、１０分間放置することでアニオン性高分子化合物とカルシトニン、カチオン性高分子化合物との３者静電複合体を調製した。別に、インターセル内でＣａｃｏ−２細胞を培養し、腸間膜モデルを作製した。インターセル上面に先に調製した静電複合体溶液２５０ｕｌを加え、１時間ごとに３時間までインターセル下面に移動したカルシトニン量をラジオイムノアッセイによって測定した。その結果を図３９に示す。
アニオン性高分子化合物の種類を問わずに、感温性-カチオン性高分子化合物と組み合
わせた３者複合体はカルシトニン単独の約４倍の非常に高い細胞膜透過性を有していることが分かった。なお、付加粒子を作成するには、式１のアニオン性高分子化合物としては、疎水性のより高い、ｐ−ナトリウムカルボキシルフェニル基、ｐ−ナトリウムスルホン酸フェニル基を持つ化合物の方が、カルボキシル基を持つ化合物よりも、より優れた細胞膜透過活性を持つことが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】カチオン性高分子化合物（式５）の加熱による３次元的な構造変化（イソギンチャク構造）
【図２】カチオン性高分子化合物（式６）の加熱による３次元的な構造変化（スパイダー構造）
【図３】カルシトニンとアニオン性化合物との静電複合体粒子の安定性
【図４】カルシトニンとアニオン性化合物との静電複合体粒子の濃度依存性
【図５】カチオン性化合物付加粒子（アニオン性が低い蛋白質静電複合体粒子）の安定性
【図６】カチオン性化合物付加粒子（アニオン性が高い蛋白質静電複合体粒子）の安定性
【図７】蛋白質静電複合体粒子の粒子径に対するアニオン性高分子化合物の分子量の影響
【図８】蛋白質静電複合体粒子の安定性に対するアニオン性高分子化合物の分子量（低分子量のアニオン性高分子化合物）の影響
【図９】蛋白質静電複合体を作製するためのアニオン性高分子化合物の最適量
【図１０】アニオン性高分子化合物の分枝側鎖（２本側鎖、４本側鎖）の影響
【図１１】アニオン性高分子化合物（式３、感温性）を用いた蛋白質静電複合体粒子の安定性
【図１２】アニオン性高分子化合物（式３、感温性）を用いた蛋白質静電複合体粒子の濃度安定性
【図１３】アニオン性高分子化合物（式３、感温性）を用いた蛋白質静電複合体粒子の分子量依存性
【図１４】アニオン性高分子化合物（式３、感温性）を用いた蛋白質静電複合体粒子のｐＨ安定性
【図１５】アニオン性高分子化合物（式１）の分子量とアクリル酸の使用量の量的相関関係
【図１６】カチオン性中間体（ｉｎｉｆｅｒｔｅｒ）の分子量と使用したＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの使用量の量的相関関係
【図１７】カチオン性中間体（ｉｎｉｆｅｒｔｅｒ）の分子量と添加したＮ−イソプロピルアクリルアミドの使用量との相関関係
【図１８】カチオン性化合物（式４）の感温性（凝集性）
【図１９】直鎖アニオン性化合物（式１）による蛋白質静電複合体の安定性
【図２０】アニオン性化合物（式１）とカチオン性化合物（式４）との静電複合体の安定性
【図２１】感温性高分子化合物の安定性
【図２２】感温性高分子化合物、アニオン性感温性化合物（式２、式３）の安定性
【図２３】アニオン性感温性化合物（式３）の安定性（経時変化）
【図２４】アニオン性感温性化合物（式３）の希釈安定性
【図２５】直鎖アニオン性化合物と分枝状アニオン性化合物（式１）による蛋白質静電複合体の安定性
【図２６】アニオン性化合物（式２）とカルシトニンとの静電複合体の粒子径
【図２７】アニオン性化合物（式３）とカルシトニンとの静電複合体の粒子径
【図２８】アニオン性化合物（式２）とカルシトニンとの静電複合体に基づくカチオン性高分子付加粒子の粒子径
【図２９】カルシトニン含有カチオン性高分子付加粒子の十二指腸投与によるラット血中Ｃａ低下作用
【図３０】カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）との静電複合体の安定性
【図３１】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物（カチオン性部分のみ）を付加させた付加粒子の安定性
【図３２】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式３、カチオン性部分＋非イオン性部分）を付加させた付加粒子の安定性
【図３３】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式５、感温性部分＋カチオン性部分：イソギンチャク構造）を付加させた付加粒子の安定性
【図３４】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物（式６、カチオン性部分＋感温性部分：スパイダー構造）を付加させた付加粒子の安定性
【図３５】カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１）との各種静電複合体における細胞膜透過活性
【図３６】カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式１と式２）との各種静電複合体における細胞膜透過量の比較
【図３７】カルシトニンとアニオン性高分子化合物（式２、アニオン性部分＋非イオン性部分、感温性部分＋アニオン性部分）との２種の静電複合体における細胞膜透過活性
【図３８】カルシトニン含有の静電複合体にカチオン性高分子化合物を付加した付加粒子の細胞膜透過活性
【図３９】カチオン性高分子化合物（式３、イソギンチャク構造）を付加した付加粒子において、アニオン性高分子化合物（式１）の組成変化が及ぼす細胞膜透過性に対する効果
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式１：
【化１】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは５から３４７の整数を表す。］で示される、分子量が４０００から１０００００であるアニオン性高分子化合物。
【請求項２】
分子量が１００００以上である、請求項１記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項３】
ｎが２３から８７である、請求項１又は２に記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項４】
下記の式２：
【化２】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは４から３４７の整数を表す。ＢはＮ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは２から２５３の整数を表わす。］で示される、分子量が４０００から１０００００である、アニオン性高分子化合物。
【請求項５】
分子量が１００００以上である、請求項４記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項６】
Ａがカルボキシル基であり、ＢがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、請求項４または５記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項７】
ｎが２３から８７の整数を表わし、ｍが１１から２５の整数を表わす、請求項４から６のいずれかに記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項８】
下記の式３：
【化３】
［式中、Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｎは５から２５２の整数を表す。Ｂは３−（Ｎ
，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは５から２５２の整数を表わす。］で示される、分子量が４０００から１０００００である、カチオン性高分子化合物。
【請求項９】
分子量が１００００以上である、請求項８記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１０】
Ｂが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、ＣがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、請求項８または９記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１１】
ｎが５から１６１の整数を表わし、ｍが７から２５２の整数を表わす、請求項８から１０のいずれかに記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１２】
Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、ＢがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、請求項８または９記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１３】
ｎが７から２５２の整数を表わし、ｍが５から１６１の整数を表わす、請求項１２に記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１４】
塩基性蛋白質と上記請求項１から７に記載のアニオン性高分子化合物との静電複合体であって、蛋白質の重量を１として、該化合物が重量比で１から３２の組成である塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
【請求項１５】
該静電複合体粒子がアニオン性であり、粒子径が５０から２５０ｎｍである、請求項１４記載の塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
【請求項１６】
塩基性蛋白質が、カルシトニンまたはヒト成長ホルモンである、請求項１４又は１５記載の静電複合体粒子。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の静電複合体粒子に、請求項８から１３のカチオン性高分子化合物をアニオン性高分子化合物の０．５から４倍量を付加して得られる付加粒子。
【請求項１】
下記の式１：
【化１】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは５から３４７の整数を表す。］で示される、分子量が４０００から１０００００であるアニオン性高分子化合物。
【請求項２】
分子量が１００００以上である、請求項１記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項３】
ｎが２３から８７である、請求項１又は２に記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項４】
下記の式２：
【化２】
［式中、Ａはカルボキシル基、ｐ−（ナトリウムカルボキシレート）フェニル基またはｐ−（ナトリウムスルホネート）フェニル基を表し、ｎは４から３４７の整数を表す。ＢはＮ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは２から２５３の整数を表わす。］で示される、分子量が４０００から１０００００である、アニオン性高分子化合物。
【請求項５】
分子量が１００００以上である、請求項４記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項６】
Ａがカルボキシル基であり、ＢがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、請求項４または５記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項７】
ｎが２３から８７の整数を表わし、ｍが１１から２５の整数を表わす、請求項４から６のいずれかに記載のアニオン性高分子化合物。
【請求項８】
下記の式３：
【化３】
［式中、Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｎは５から２５２の整数を表す。Ｂは３−（Ｎ
，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基またはＮ−イソプロピルアミノカルボニル基を表わし、ｍは５から２５２の整数を表わす。］で示される、分子量が４０００から１０００００である、カチオン性高分子化合物。
【請求項９】
分子量が１００００以上である、請求項８記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１０】
Ｂが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、ＣがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、請求項８または９記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１１】
ｎが５から１６１の整数を表わし、ｍが７から２５２の整数を表わす、請求項８から１０のいずれかに記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１２】
Ｃが３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミノカルボニル基、ＢがＮ−イソプロピルアミノカルボニル基である、請求項８または９記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１３】
ｎが７から２５２の整数を表わし、ｍが５から１６１の整数を表わす、請求項１２に記載のカチオン性高分子化合物。
【請求項１４】
塩基性蛋白質と上記請求項１から７に記載のアニオン性高分子化合物との静電複合体であって、蛋白質の重量を１として、該化合物が重量比で１から３２の組成である塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
【請求項１５】
該静電複合体粒子がアニオン性であり、粒子径が５０から２５０ｎｍである、請求項１４記載の塩基性蛋白質の静電複合体粒子。
【請求項１６】
塩基性蛋白質が、カルシトニンまたはヒト成長ホルモンである、請求項１４又は１５記載の静電複合体粒子。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の静電複合体粒子に、請求項８から１３のカチオン性高分子化合物をアニオン性高分子化合物の０．５から４倍量を付加して得られる付加粒子。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３６】
【図１】
【図２】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３５】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３６】
【図１】
【図２】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３５】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【公開番号】特開２００８−２６６６３１（Ｐ２００８−２６６６３１Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８２５８９（Ｐ２００８−８２５８９）
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（３０２００５６２８）株式会社 メドレックス (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（３０２００５６２８）株式会社 メドレックス (35)
【Ｆターム（参考）】
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