蛍光発色化合物
【課題】リン酸化タンパク質に特異的で且つ高い配位能を有し、リン酸化タンパク質を蛍光発色基によりラベル化できる化合物を提供する。
【解決手段】本発明に係る蛍光発色化合物は、以下式（Ｘ）の構造を有する。
［式中、Ｙはリンカー基を示し、Ｚは蛍光発色基を示す。］
【解決手段】本発明に係る蛍光発色化合物は、以下式（Ｘ）の構造を有する。
［式中、Ｙはリンカー基を示し、Ｚは蛍光発色基を示す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化されたタンパク質へ特異的且つ高い配位能で結合することができる蛍光発色化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ある種の生体内酵素は、活性中心やアロステリック部位を代表とする特定部位にセリンやトレオニン、チロシン残基を有し、これらの水酸基が、キナーゼと呼ばれる酵素によりリン酸化されたり或いは脱リン酸化されることによって、酵素活性が調節されている。また、リシン、アルギニン、ヒスチジンのアミノ基或いはイミノ基や、アスパラギン酸、グルタミン酸のカルボキシル基がリン酸化（または脱リン酸化）されることによって、活性が調節されている酵素もある。
【０００３】
この様なリン酸化−脱リン酸化により調節されている代謝系としては、グリコーゲン合成の抑制とその分解系がよく知られている。この代謝系は、主としてリン酸化−脱リン酸化によりカスケード制御され、調節されている。
【０００４】
そして近年、このリン酸化−脱リン酸化が、疾病に関係する代謝系において重要な役割を有していることが明らかとなってきている。
【０００５】
例えば、細胞のガン化は、リン酸化−脱リン酸化の異常が一因であるといわれている。つまり、細胞周期の進行や停止は様々な酵素（タンパク質）のリン酸化（または脱リン酸化）により制御されており、このリン酸化（または脱リン酸化）にはサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）が関与しているが、斯かるメカニズムが損傷するとリン酸化（または脱リン酸化）に乱れが生じ、その結果、細胞の異常増殖が引発されることになる。
【０００６】
その他にも、プロテインキナーゼＣが、アトピー性皮膚炎や花粉症などのアレルギー疾患の原因となるヒスタミンの脱顆粒に関与することや、アルツハイマー病患者の脳で発生する神経原繊維変化は、リン酸化されたタウタンパク質によることが明らかにされている。
【０００７】
従って、タンパク質のリン酸化−脱リン酸化状況を把握することは、生体組織細胞の遺伝子発現の探索や酵素活性評価のみならず、疾病の診断や治療にも役立つ可能性がある。
【０００８】
ところが、従来より用いられてきたリン酸化タンパク質（または脱リン酸化タンパク質）の特定方法には、様々な欠点がある。
【０００９】
例えば、酵素免疫法は、対象となるタンパク質試料が微量であっても分析可能という利点があるが、必要な抗体を充分量得ることが困難である。また、対象タンパク質が数ｋＤａ以下である場合には、タンパク質中のリン酸化部位に結合する抗体を調製することができない。
【００１０】
また、放射性同位元素32Ｐで標識されたリン酸を使用することによって、タンパク質への特異的結合を検出する方法も考えられるが、放射性同位元素の取扱いには当然に注意が必要であり、廃液の管理や処理まで要求される。
【００１１】
更に、リン酸化タンパク質と脱リン酸化タンパク質とでは電荷が異なることから、二次元電気泳動法の応用も考えられる。しかし、特に生体試料を分析する場合には、試料に多種類のタンパク質が含まれていることから、スポットの特定が非常に困難である。それに加え、このスポット特定のために放射性同位元素を用いるとすれば、前述した問題が生じてくる。
【００１２】
その他、リン酸化（または脱リン酸化）タンパク質を特定するこれら技術以外に、リガンド等の特定化合物へ特異的に結合する化合物（タンパク質等）を探索するための一般的手法として、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、以下、「ＳＰＲ」という）を利用した技術が開発されている（図１を参照）。この技術を詳述すると、以下の通りである。
【００１３】
屈折率の異なる界面で光が全反射する際には、全反射表面でエバネッセント波といわれる光が発生する。また、金属表面には表面プラズモンという金属−誘電体界面に生じる電子の疎密波の一種が生じている。この表面プラズモンは、両者（エバネッセント波と表面プラズモン）の位相速度が一致する様に入射光の角度を調節することによって共鳴励起されることから、金属表面の電磁場を大幅に増大させることが可能になる。この際、入射光のエネルギーは表面プラズモンの励起のために奪われるので、反射光の強度が減少する。
【００１４】
そして、この吸収が起こる入射角度と入射光の波長は、特に数百ｎｍ以内における金属表面の状態に応じて非常に鋭敏に変化する。即ち、金属表面における化合物の有無などの状態変化によって反射光の強度が敏感に反応するため、金属表面にリガンド等を結合せしめた上で被検試料を作用させれば、当該リガンド等と相互作用する化合物の有無によって、反射光の強度が変化する。従って、図１に示す通り金属表面にリガンド等を担持させ、更に被検試料を添加した場合としない場合の反射光強度を比較することによって、当該リガンド等と相互作用する化合物の有無を判断することができる。更に、当該技術をバイオイメージングに応用することも考えられる。即ち、細胞や生体組織において、特定の化合物と相互作用する化合物の局在をイメージとして捕らえることも可能になり得る。
【００１５】
斯かる技術の例としては、特許文献１に記載されているものを挙げることができる。当該文献によれば、図１に示す様な貴金属膜に対して、ランニングバッファー→被検試料→ランニングバッファーを連続的に作用させると、ＳＰＲが観測される入射角度は図２に示す様な経時的変化を示す。そして当該技術では、この経時的変化を測定し、反射率の最小値と最大値や屈折率と時間との関係を求めることによって、貴金属膜に担持した化合物と被検試料中の化合物との解離定数や結合定数、および試料中化合物の濃度を決定できるとされている。
【００１６】
また、特許文献２には、貴金属膜へカルボキシメチル化デキストランを介してN-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸を結合させ、更にニッケルを配位させたものを用いてＳＰＲ測定を行なう技術が開示されている。このニッケル錯体は、２つの隣接ヒスチジン残基を有するペプチドに対して特異的な親和性を示すことから、ヒスタグ（His-tag）と呼ばれ、被検試料中からジヒスチジン残基を有するペプチドを検出することができる。
【００１７】
また、表面プラズモン共鳴を測定する方法としては、ラマン分光法の応用が考えられる。ラマン分光法は、物質に一定振動数ν０の単色光を照射することにより発生する散乱光中、同一振動数以外（ν０±νｉ）の散乱光（ラマン散乱光）を測定することによって、化合物の情報を得る技術である。詳しくは、このラマン振動数νｉは、物質を構成する分子や結晶の振動や回転のエネルギー準位間の振動数に等しいことから、物質のエネルギー準位を決定、同定、定量するための情報源となる（「化学大辞典」東京化学同人を参照）。
【００１８】
しかし、このラマン散乱光は非常に微弱であるため、従来、表面プラズモン共鳴効果を利用して増強した上で測定することが行なわれている（例えば、特許文献３）。つまり、一般に光は電子波（プラズモン）とはカップリングしないが、金属粒子表面ではカップリングを起こす。そこで、当該技術では、測定試料の近傍に金属を存在せしめることによって、微弱なラマンバンド強度を増強している。
【００１９】
ところが、斯かる従来技術によるラマンバンド強度の増強効果は、必ずしも満足できるものではなかった。なぜなら、表面プラズモン共鳴効果は標的分子と金属との距離が近いほど高いが、特許文献３の図１の様に、基板（金属）２と試料３とを近接させても、全ての標的分子が金属と接するわけではないからである。斯かる状況は、水溶液試料に金属を添加する場合においても同様である。
【００２０】
ところで、非特許文献１には、リン酸基（リン酸モノエステル基）へ特異的に結合する化合物を用いることによって、リン酸化化合物の分子量を求める方法が記載されている。しかし当該文献には、この特異的結合化合物を介して標的化合物へ金属を接近せしめるという技術思想や、当該化合物を表面プラズモン共鳴の測定に応用するアイデアは、全く記載も示唆もされていない。
【特許文献１】特表平１１−５１２１８６号公報
【特許文献２】特表平１０−５０５９１０号公報
【特許文献３】特開平９−２５７５７８号公報
【非特許文献１】Hironori Takedaら，RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY，Vol.17，Issue 18，pp.2075-2081（2003年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
上述した状況の下、本発明者らは、被検試料中のリン酸化ペプチド（タンパク質）を検出したり、ペプチドがリン酸化されているか否かを判断するための表面プラズモン共鳴測定方法を完成した。
【００２２】
この表面プラズモン共鳴の測定方法は、プリズム底面に貴金属化合物を配し、当該プリズムへ光を照射してその反射光を検出するものであり、
当該貴金属化合物として、当該プリズムに接する側の反対側に下記式（Ｉ）で表される置換基を有するものを使用し、
当該貴金属化合物のうち、当該置換基（Ｉ）を有する側に被検試料を添加することを特徴とする。
【００２３】
【化１】
［式中、Ｘはリンカー基を示す。］
【００２４】
また、本発明者らは、上記方法に使用できるものであって、リン酸モノエステル基に特異的で且つ高い配位能を有する置換基（フォスタグ）を表面に有する貴金属化合物も発明している。
【００２５】
上記表面プラズモン共鳴の測定方法は、（１）蛍光発色基の導入などラベル化操作が不要である、（２）比較的高分子量の分子に対して感度が高い、（３）チオール基やジスルフィド基を有する分子は金等の貴金属化合物表面に容易に結合するので、置換基を表面へ高密度に導入できる、という利点があるため、リン酸化ペプチドの検出に極めて適するものである。
【００２６】
ところで、上記表面プラズモン共鳴の測定方法の利点（１）を考慮すれば、上記発明に係る置換基（フォスタグ）へ蛍光発色基を導入することによって、リン酸モノエステル基を有するタンパク質をラベルすることができると考えられる。
【００２７】
そこで、本発明が解決すべき課題は、リン酸化タンパク質に特異的で且つ高い配位能を有し、リン酸化タンパク質を蛍光発色基によりラベル化できる化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明に係る蛍光発色化合物は、以下式（Ｘ）の構造を有する。
【００２９】
【化２】
［式中、Ｙはリンカー基を示し、Ｚは蛍光発色基を示す。］
【発明の効果】
【００３０】
本発明の蛍光発色化合物は、リン酸化されたタンパク質のリン酸モノエステル基へ特異的で且つ高い配位能で結合することができ、当該タンパク質をラベルすることができる。よって、生体試料など多種多様な化合物が含まれている被検試料であっても、リン酸化ペプチド（タンパク質）の有無を容易に判断でき、また、ペプチドがリン酸化されているか否かを判断することもできる。従って、本発明の蛍光発色化合物は、生体試料等に本発明化合物を適用することによって、病気の診断等に応用でき得る点で非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明者らが開発した表面プラズモン共鳴の測定方法は、
プリズム底面に貴金属化合物を配し、当該プリズムへ光を照射してその反射光を検出する表面プラズモン共鳴の測定方法において、
当該貴金属化合物として、当該プリズムに接する側の反対側に下記式（Ｉ）で表される置換基を有するものを使用し、
当該貴金属化合物のうち、当該置換基（Ｉ）を有する側に被検試料を添加することを特徴とするものである。
【００３２】
【化３】
［式中、Ｘはリンカー基を示す。］
【００３３】
上記の表面プラズモン共鳴測定方法の利点の１つとしては、蛍光発色基の導入などラベル化操作が不要であることがある。本発明者らは、かかる利点を考慮して、逆に、上記置換基のうちリン酸化タンパク質と相互作用する主要部分へ蛍光発色基を導入した化合物を案出した。
【００３４】
本発明に係る蛍光発色化合物は、以下式（Ｘ）の構造を有する。
【００３５】
【化４】
［式中、Ｙはリンカー基を示し、Ｚは標識基を示す。］
【００３６】
上記式（Ｘ）において、配位金属としてＺｎを選択した理由は、リン酸化タンパク質のリン酸基（リン酸モノエステル基）への配位能が極めて高いことによる。
【００３７】
「蛍光発色基」は、当業者に公知のものを用いればよい。例えば、アミノメチルクマリンおよびその誘導体，フルオロセインおよびその誘導体，テトラメチルローダミンおよびその誘導体，アントラニロイルおよびその誘導体，ニトロベンゾオキサジアオールおよびその誘導体，ジメチルアミノナフタレンおよびその誘導体を挙げることができる。
【００３８】
「リンカー基」とは、本発明の蛍光発色化合物中、蛍光発色基部分と上記主骨格（リン酸化タンパク質と相互作用する主要部分。以下、「フォスタグ」または「Phos-tag」ということがある）とを結合する基であり、本発明に係る蛍光発色化合物の製造を容易にしたり、また、蛍光発色化合物の自由度を増し、ペプチドに結合したリン酸基と蛍光発色化合物との配位を容易にする作用を有する。
【００３９】
「リンカー基」としては、前述した作用を有するものであれば特に限定されないが、例えば糖鎖，C1-C6アルキレン基，アミノ基（-NH-），エーテル基（-O-），チオエーテル基（-S-），カルボニル基（-C(=O)-），チオニル基（-C(=S)-），エステル基，アミド基，ウレア基（-NHC(=O)NH-），チオウレア基（-NHC(=S)NH-），ビオチンとストレプトアビジンとの結合体，ビオチンとアビジンとの結合体；アミノ基，エーテル基，チオエーテル基，カルボニル基，チオニル基，エステル基，アミド基，ウレア基，チオウレア基からなる群より選択される基を一端に有する糖鎖；および、アミノ基，エーテル基，チオエーテル基，カルボニル基，チオニル基，エステル基，アミド基，ウレア基，チオウレア基，ビオチンとストレプトアビジンとの結合体，ビオチンとアビジンとの結合体からなる群より選択される基を一端に有するC1-C6アルキレン基；アミノ基，エーテル基，チオエーテル基，カルボニル基，チオニル基，エステル基，アミド基，ウレア基，チオウレア基からなる群より選択される同一または異なった基を両端に有するC1-C6アルキレン基；およびこれら基からなる群より選択される２以上の基が直線状に結合された基を挙げることができる。
【００４０】
本発明において「糖鎖」とは、一般的な糖類が直鎖状または分枝鎖状に連なったものをいい、例えば、D-グルコースがグルコシド結合により重合しているデキストランを挙げることができる。この糖鎖は、上述したリンカー基の作用に加えて、親水性が高いことから生体試料との相性がよく、また、容易に分枝鎖状のものを合成できることから、置換基（Ｘ）の主骨格をより多く結合させることができるという利点もある。
【００４１】
ここで、「C1-C6アルキレン基」とは、炭素数１〜６の直鎖状または分枝鎖状の２価脂肪族炭化水素基をいい、例えば、メチレン，エチレン，プロピレン，テトラメチレン，ヘキサメチレン，メチルエチレン，メチルプロピレン，ジメチルプロピレン等を挙げることができ、C1-C4アルキレン基が好ましく、C1-C2アルキレン基がより好ましい。
【００４２】
以上に説明したリンカー基の長さは特に制限されないが、好適には２００ｎｍ以内、より好ましくは１００ｎｍ以内にする。
【００４３】
なお、置換基（Ｘ）では、本発明と同一の作用効果を享有するものとして、ピリジン環にメチル基等を導入することも可能であるが、この様な均等物も本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００４４】
また、本発明に係る置換基（Ｘ）におけるリンカー基の位置も特に限定されず、下記置換基（Ｘ'）に示す位置に存在する場合もある。
【００４５】
【化５】
【００４６】
この置換基（Ｘ'）と置換基（Ｘ）は全く等価であり、合成で何れの置換基となるかは必ずしも明らかではないが、実際には両者の混合物であると考えられ、勿論、置換基（Ｘ'）も本発明の範囲内に含まれる。
【００４７】
本発明者らが開発した表面プラズモン共鳴の測定方法で使用する貴金属化合物は、スキーム１を含むことを特徴とする方法によって容易に製造することができるが、製造方法は、以下に示すものに制限されない。
［スキーム１］
【００４８】
【化６】
［式中、Ｘはリンカー基を示し、Ｒ１とＲ２は、−Ｘ−フォスタグ基を貴金属膜表面に形成するための反応性基を示す。］
【００４９】
上記スキーム１においては、先ず、リンカー基Ｘを形成するための反応性基であるＲ1を、貴金属上へ置換させる。ここで、反応性基Ｒ1と貴金属との結合の種類は必ずしも明らかでなく、結合の種類は特に問わないものとする。例えば、チオール化合物やジスルフィド化合物は、貴金属表面へ自発的に吸着して自己組織化単分子膜といわれる単分子膜を形成することが知られている。従って、反応性基Ｒ1と貴金属とが硫黄原子を介して結合している場合、上記式中における貴金属と硫黄原子との結合の種類は特に制限されず、何らかの相互作用によって結びついているものとする。
【００５０】
反応性基Ｒ1を置換させるべき貴金属は、最終目的物が貴金属膜である場合には、原料貴金属を適切な厚さまで延展した後、使用するＳＰＲ測定装置に適した形状に切り出せばよい。粒子の場合には、公知の金属粒子製造方法を適用して製造した後、所望の粒径に対応するメンブランフィルター等を使用して、大き過ぎたり小さ過ぎる粒子を除去すればよい。
【００５１】
上記スキーム１において、硫黄原子を介して反応性基Ｒ1を貴金属表面に結合せしめる場合、チオール化合物（例えば、Ｒ１-ＳＨ）と貴金属との反応は極めて容易に進行することが分かっており、その反応条件等は従来法に従えばよい。例えば、貴金属表面とチオール化合物の溶液を接触させるのみでも、両者を縮合させることができる。
【００５２】
次いで、リンカー基Ｘを介してフォスタグ前駆体を結合させるために、置換基Ｒ２を有するテトラキス(ピリジン-2-イルメチル)-1,3-ジアミノプロパン-2-オール誘導体（化合物（ＶI））を反応させる。上記スキーム１中Ｒ1とＲ2とを反応させる工程におけるＲ1とＲ2の種類や溶媒，反応温度，その他の試薬，精製方法等は、主としてＸの種類により決定される。例えば、アミド結合によりＲ1とＲ2とを結合してＸとする場合には、Ｒ1とＲ2の組合わせとしては末端にアミノ基（第一級アミノ基）を有する基と活性化されたカルボキシ基との組合わせを挙げることができる。この場合の一般的な反応条件は、有機合成化学分野において一般的なものを適用すればよい。こうして、置換基（ＶII）を表面に有する貴金属化合物を得ることができる。
【００５３】
最後に、置換基（ＶII）を有する貴金属化合物に金属塩を添加することによって、表面にフォスタグを有する貴金属化合物を得ることができる。例えば硝酸亜鉛（II）や酢酸亜鉛(II)を添加すればよいが、酢酸亜鉛(II)を添加する場合には、一旦酢酸が配位した以下の化合物が得られる。
【００５４】
【化７】
【００５５】
この化合物は、置換基（Ｉ）よりも安定であり保存に便利であるが、置換基（Ｉ）と等価なものであり、置換基（Ｉ）と同様に用いることができる。即ち、ＳＰＲ測定時には、リン酸モノエステル基が酢酸と交換的に配位するため、リン酸化ペプチドを検出することができる。
【００５６】
以上を考慮すれば、本発明の蛍光発色化合物は、上記リンカー基Ｙを形成するための反応性基Ｒ2を有する化合物（ＶＩ）を出発原料とし、当該反応性基Ｒ2へ蛍光発色基Ｚをリンカー基Ｙを介して結合させた後、金属塩を添加して亜鉛イオンを配位させることにより合成することができる。
【００５７】
上記スキーム１において、フォスタグを貴金属へ結合させるための、および本発明の蛍光発色化合物を合成するための原料化合物（化合物（ＶI））は、以下のスキーム２により製造することができる。
［スキーム２］
【００５８】
【化８】
［式中、Ｒ２は前述したものと同義とする。また、“Ｈａｌ”は、ハロゲン原子を示し、好適には臭素原子を示す。］
【００５９】
原料化合物である化合物（II）（1,3-ジアミノ-2-プロパノール）は、市販のものを使用することができる。また、化合物（III）と化合物（Ｖ）は比較的簡単な構造を有しているので、市販のものを用いるか、或いは当業者公知の方法により合成することができる。
【００６０】
スキーム２では、先ず、触媒の存在下に化合物（II）と（III）を縮合反応させて、化合物（IＶ）を得る。本反応は一段階ずつ化合物（III）を導入していってもよいが、３当量以上の化合物（III）を使用することによって一段階反応で化合物（IＶ）を得ることもできる。
【００６１】
スキーム２では、縮合反応として還元的アミノ化反応を行なっている。その場合に使用される溶媒は、化合物（II）と（III）とを実質的に溶解でき、反応を阻害しないものであれば特に制限なく使用することができるが、例えば、メタノール，エタノール，イソプロパノール等のアルコール類；ジエチルエーテル，テトラヒドロフラン，ジオキサン等のエーテル類；水；又はこれらの混合溶媒を使用することができる。
【００６２】
還元的アミノ化反応では、先ず化合物（II）と（III）を触媒としての濃塩酸存在下に縮合した後、一般的な還元試薬により還元することができる。
【００６３】
反応温度と反応温度は、原料化合物の種類等によって好適な条件を採用すればよいが、例えば２０〜８０℃で１２〜１００時間反応させる。
【００６４】
反応終了後は、溶媒等を減圧留去した後に水を加え、非水溶性溶媒で抽出し、油相を無水硫酸マグネシウム等で乾燥した後、溶媒を減圧留去する。次いで、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知方法により精製して、化合物（IＶ）を得ることができる。
【００６５】
なお、化合物（IＶ）を得る方法はスキーム２で示した方法に限られず、例えば化合物（II）とハロゲン化合物から化合物（IＶ）を合成してもよい。
【００６６】
次に、化合物（Ｖ）を反応させることにより、化合物（ＶI）を得ることができる。この反応は、一般的な三級アミンの合成反応を採用することができる。例えば、溶媒中塩基の存在下で縮合させる。また、当該ステップにおいては、Ｒ２の種類に応じて、適宜保護基の導入と脱保護を行なってもよい。或いは、化合物（Ｖ）中Ｒ２の代わりに不活性置換基を有する化合物を用いて当該ステップを行なった後、官能基変換により当該不活性置換基をＲ２へ変換することによって、化合物（ＶI）を合成してもよい。例えば、不活性置換基としてニトロ基と有する化合物を使用し、当該ステップ後、ニトロ基を反応性基であるアミノ基に変換してもよい。
【００６７】
本発明の蛍光発色化合物は、ピリジン環上の４または６位において、電子供与性置換基を有するものであってもよい。かかる化合物は、適切な置換位置に導入された電子供与性置換基によってピリジン窒素が電気的にリッチとなっているため、亜鉛に対する配位性に優れており、結果的に製造が容易であり、また、安定性を有する。置換基（Ｉ）に準ずるものを使用することができる。
【００６８】
以下に、製造例および試験例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
製造例１ ＳＰＲ分析用のフォスタグ−センサーチップの製造
カルボキシメチルデキストランがコーティングされているセンサーチップ（BIOCRE社製，Sensor Chip CM5）を、ＳＰＲ測定装置（BIOCRE社製，BIOCORE J）にセットした。
【００７０】
ランニングバッファーとして、5×10-3％（v/v）Ｔｗｅｅｎ ２０，0.20M 硝酸ナトリウムおよび10μM 硝酸亜鉛を含む10mM ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）−水酸化ナトリウム水溶液（pH 7.4）を使用した。センサーチップの温度を２５℃、ランニングバッファーの流速を３０μL/minとした。表面プラズモン共鳴の値が安定したことを確認した後、カルボキシル基活性化剤であるＥＤＣ（1-エチル-3,4-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド，200mM）とＮＨＳ（N-ヒドロキシスクシンイミド，50mM）の混合水溶液を６分間添加することによって、センサーチップのカルボキシル基を活性化した。
【００７１】
次いで、センサーチップにフォスタグを担持するために、N,N,N'-トリ(2-ピリジルメチル)-N'-[5-N''-(2-アミノエチル)カルバモイル-2-ピリジルメチル]-1,3-ジアミノプロパン-2-オールの50％（v/v）アセトニトリル溶液（10mM）を、６分間添加した。その後、残存する活性化カルボキシル基をブロッキングするために、モノエタノールアミン水溶液（1.0M）を６分間添加した。
【００７２】
以上の操作によって、フォスタグを結合したセンサー部を有するサンプル流路（フローセルＡ）を作製した。
【００７３】
比較製造例１
上記製造例１において、カルボキシル基の活性化とそのブロッキングを含め、フォスタグを担持させる以外は同一の手法を用いて、フォスタグが結合していないレファレンス部を有するサンプル流路（フローセルＢ）を、フローセルＡと平行に作製した。
【００７４】
試験例１
分析サンプルとして、（ｉ）β−カゼイン（ペンタリン酸化タンパク質，SIGMA社），（ii）脱リン酸化β−カゼイン，および（iii）牛血清アルブミン（BSA，New England BioLabs社）を使用した。脱リン酸化β−カゼインは、β−カゼイン 10mg/mL（50μL）とジャガイモ由来酸性フォスファターゼ（SIGMA社）と0.20M ＭＥＳ−ＮａＯＨ（pH 6.8，50μL）との混合溶液を、１２時間３８℃でインキュベートすることにより調製した。それぞれのサンプルは、上記製造例１で用いたランニングバッファーに溶解し、サンプル濃度1.5μMのサンプル溶液を得た。
【００７５】
上記サンプル溶液について、ＳＰＲ測定を行なった。具体的には、上記製造例１と比較製造例１のそれぞれで作成し、ランニングバッファーで安定化させたフローセルＡ，Ｂについて、各サンプル溶液を温度：２５℃，流速：３０μL/minで流して１５分間結合させ、次いでランニングバッファーのみを１５分間流して解離させた。各サンプル溶液の測定後には、25mM リン酸一カリウム−25mM リン酸二ナトリウム水溶液（pH 6.86）を６分間、0.20M エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液（pH 7.4）を６分間、上記ランニングバッファーを５分間流して、センサーチップの再活性化（残存結合物の除去）を行なった。
【００７６】
各サンプル（i）〜（iii）のＳＰＲ測定結果をそれぞれ図３〜５に、各サンプルの測定結果において、フローセルＡのＲＵ値からフローセルＢのＲＵ値の差を示したものを図６に示す。図４〜６の結果によれば、フローセルＡとＢの変化はほぼ同じであり、脱リン酸化β−カゼインとＢＳＡは、特異的な結合をしないことが分かる。一方、図３と６の結果より、リン酸化されているβ−カゼインは、フォスタグが結合しているセンサー部へ特異的に結合することが明らかにされた（最大結合量：3150RU）。従って、本発明方法によれば、リン酸化されたペプチドのみを検出できることが実証された。
【００７７】
試験例２
分析サンプルとして、（iｖ）リン酸化SRCペプチド（モノリン酸化ペプチド，ANA SPEC社）および（ｖ）SRCペプチド（非リン酸化ペプチド，ANA SPEC社）を使用した。それぞれのサンプルは、上記製造例１で用いたランニングバッファーに溶解し、サンプル濃度1〜15μMのサンプル溶液を得た。
【００７８】
上記サンプル溶液について、上記製造例１と比較製造例１で作製したフローセルＡ，Ｂを用いてＳＰＲ測定を行なった。具体的には、上記試験例１において、サンプルの結合時間と解離時間を５分、センサーチップの再活性化（残存結合物の除去）を0.40M リン酸バッファー（pH 7.0）を５分間，0.20M エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液（pH 7.4）を５分間，上記製造例１のランニングバッファーを５分間流して行なった以外は、上記試験例１と同様の条件でＳＰＲ測定を行なった。結果を図７に示す。
【００７９】
当該結果より、非リン酸化ペプチドは濃度15μMであっても殆ど変化は認められないのに対して、リン酸化ペプチドでは、その濃度が15μMの場合のみならず1と5μMの場合であっても、明確にその存在を把握することができた。従って、本発明によれば、同一のアミノ酸配列を有するペプチドであっても、リン酸が結合しているか否かを明確に判断できることが明らかにされた。
【００８０】
製造例２ ＳＰＲ分析用のフォスタグ−センサーチップの製造
表面にストレプトアビジンが結合しているストレプトアビジン−センサーチップ（BIOCRE社製，Sensor Chip SA）を、ＳＰＲ測定装置（BIOCRE社製，BIOCORE J）にセットした。
【００８１】
ランニングバッファーとして、5×10-3％（v/v）Ｔｗｅｅｎ ２０，0.20M 硝酸ナトリウムおよび10μM 硝酸亜鉛を含む10mM ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）−水酸化ナトリウム水溶液（pH 7.4）を使用した。センサーチップの温度を２５℃とし、表面プラズモン共鳴の値が安定するまで、流速３０μL/minでランニングバッファーを流した。
【００８２】
次いで、センサーチップにフォスタグを担持するために、末端にビオチン構造を有するN,N,N'-トリ(2-ピリジルメチル)-N'-[5-N''-2-(6-D-ビオチンアミドヘキサカルボキシアミドエチル)カルバモイル-2-ピリジルメチル]-1,3-ジアミノプロパン-2-オール（下記構造を有する化合物）の1.0mM 上記ランニングバッファー溶液を流した。温度は２５℃、流速は３０μL/min、結合時間は６分とした。
【００８３】
【化９】
【００８４】
上記化合物は、ランニングバッファー中の亜鉛イオンに配位されてフォスタグとなり、且つ末端のビオチンはストレプトアビジンに対して極めて高い親和性を示すので、フォスタグがセンサーチップ上に担持されることになる。
【００８５】
比較製造例２
上記製造例２において、フォスタグを担持させる以外は同一の手法を用いて、フォスタグが結合していないセンサーチップを作製した。
【００８６】
試験例３
分析サンプルとして、ランニングバッファー（5×10-3％（v/v）Ｔｗｅｅｎ ２０，0.20M 硝酸ナトリウムおよび10μM 硝酸亜鉛を含む10mM ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム水溶液（pH 7.4））に溶解したβ−カゼイン（ペンタリン酸化タンパク質，SIGMA社）を使用した。サンプル濃度は、1.5μMとした。
【００８７】
上記分析サンプルについて、温度２５℃、流速３０μL/min、結合時間１５分間、解離時間１０分間でＳＰＲ測定を行なった。測定後には、0.40M リン酸水溶液を６分間、0.20M エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液（pH 8.0）水溶液を６分間、上記ランニングバッファーを５分間流して、センサーチップを再活性化（残存結合物の除去）した。
【００８８】
測定結果を図８に示す。当該結果によれば、分析サンプルを流すことによってＲＵが２０５６増加したことから、本発明の貴金属膜（フォスタグが結合した貴金属センサーチップ）にリン酸化タンパク質が結合していることが分かる。また、以上と同一の条件において、リン酸化タンパク質の代わりに非リン酸化タンパク質である牛血清アルブミンを用いて実験を行なったが、ＲＵは全く変化しなかった。従って、本発明の貴金属膜は、リン酸が結合したタンパク質のみを検出できることが明らかにされた。
【００８９】
また、比較製造例２で製造したセンサーチップについても同様の条件で実験を行なったが、ＲＵは全く変化しなかった。
【００９０】
以上の通り、本発明に係るフォスタグは、リン酸化されたタンパク質へ特異的で且つ高い配位能で結合できることが実証されている。よって、フォスタグ部分と蛍光発色基を有する本発明の蛍光発色化合物は、リン酸化されたタンパク質へ特異的に結合し、蛍光標識できることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＳＰＲを測定するための一手法を示す模式図である。ＳＰＲが測定される（反射光強度が減少する）様に入射光の波長と入射角度を調整した上で、リガンドを結合した貴金属膜に被検試料を添加し、入射光強度の変化を観測するものである。図中の１はプリズム，２は貴金属膜，３はリガンド，４は被検試料に含まれているタンパク質であって、リガンドと相互作用を示すものを示す。
【図２】図１に示すＳＰＲ測定において、ランニングバッファー→被検試料→ランニングバッファーを連続的に作用させた場合におけるＳＰＲ角度の経時的変化を模式的に示す図である。被検試料中の化合物が貴金属膜に結合した際には、ＳＰＲが測定される入射角度に変化が生じることを示している。
【図３】リン酸化されているβ−カゼインが含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【図４】脱リン酸化されたβ−カゼインが含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【図５】リン酸化されない一般的なタンパク質である牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【図６】図３〜５に示す測定結果において、フローセルＡのＲＵ値からフローセルＢのＲＵ値の差を示す図である。
【図７】リン酸化ペプチド（P-p60csrc）と非リン酸化ペプチド（p60csrc）が含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【図８】リン酸化されているβ−カゼインが含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化されたタンパク質へ特異的且つ高い配位能で結合することができる蛍光発色化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ある種の生体内酵素は、活性中心やアロステリック部位を代表とする特定部位にセリンやトレオニン、チロシン残基を有し、これらの水酸基が、キナーゼと呼ばれる酵素によりリン酸化されたり或いは脱リン酸化されることによって、酵素活性が調節されている。また、リシン、アルギニン、ヒスチジンのアミノ基或いはイミノ基や、アスパラギン酸、グルタミン酸のカルボキシル基がリン酸化（または脱リン酸化）されることによって、活性が調節されている酵素もある。
【０００３】
この様なリン酸化−脱リン酸化により調節されている代謝系としては、グリコーゲン合成の抑制とその分解系がよく知られている。この代謝系は、主としてリン酸化−脱リン酸化によりカスケード制御され、調節されている。
【０００４】
そして近年、このリン酸化−脱リン酸化が、疾病に関係する代謝系において重要な役割を有していることが明らかとなってきている。
【０００５】
例えば、細胞のガン化は、リン酸化−脱リン酸化の異常が一因であるといわれている。つまり、細胞周期の進行や停止は様々な酵素（タンパク質）のリン酸化（または脱リン酸化）により制御されており、このリン酸化（または脱リン酸化）にはサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）が関与しているが、斯かるメカニズムが損傷するとリン酸化（または脱リン酸化）に乱れが生じ、その結果、細胞の異常増殖が引発されることになる。
【０００６】
その他にも、プロテインキナーゼＣが、アトピー性皮膚炎や花粉症などのアレルギー疾患の原因となるヒスタミンの脱顆粒に関与することや、アルツハイマー病患者の脳で発生する神経原繊維変化は、リン酸化されたタウタンパク質によることが明らかにされている。
【０００７】
従って、タンパク質のリン酸化−脱リン酸化状況を把握することは、生体組織細胞の遺伝子発現の探索や酵素活性評価のみならず、疾病の診断や治療にも役立つ可能性がある。
【０００８】
ところが、従来より用いられてきたリン酸化タンパク質（または脱リン酸化タンパク質）の特定方法には、様々な欠点がある。
【０００９】
例えば、酵素免疫法は、対象となるタンパク質試料が微量であっても分析可能という利点があるが、必要な抗体を充分量得ることが困難である。また、対象タンパク質が数ｋＤａ以下である場合には、タンパク質中のリン酸化部位に結合する抗体を調製することができない。
【００１０】
また、放射性同位元素32Ｐで標識されたリン酸を使用することによって、タンパク質への特異的結合を検出する方法も考えられるが、放射性同位元素の取扱いには当然に注意が必要であり、廃液の管理や処理まで要求される。
【００１１】
更に、リン酸化タンパク質と脱リン酸化タンパク質とでは電荷が異なることから、二次元電気泳動法の応用も考えられる。しかし、特に生体試料を分析する場合には、試料に多種類のタンパク質が含まれていることから、スポットの特定が非常に困難である。それに加え、このスポット特定のために放射性同位元素を用いるとすれば、前述した問題が生じてくる。
【００１２】
その他、リン酸化（または脱リン酸化）タンパク質を特定するこれら技術以外に、リガンド等の特定化合物へ特異的に結合する化合物（タンパク質等）を探索するための一般的手法として、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、以下、「ＳＰＲ」という）を利用した技術が開発されている（図１を参照）。この技術を詳述すると、以下の通りである。
【００１３】
屈折率の異なる界面で光が全反射する際には、全反射表面でエバネッセント波といわれる光が発生する。また、金属表面には表面プラズモンという金属−誘電体界面に生じる電子の疎密波の一種が生じている。この表面プラズモンは、両者（エバネッセント波と表面プラズモン）の位相速度が一致する様に入射光の角度を調節することによって共鳴励起されることから、金属表面の電磁場を大幅に増大させることが可能になる。この際、入射光のエネルギーは表面プラズモンの励起のために奪われるので、反射光の強度が減少する。
【００１４】
そして、この吸収が起こる入射角度と入射光の波長は、特に数百ｎｍ以内における金属表面の状態に応じて非常に鋭敏に変化する。即ち、金属表面における化合物の有無などの状態変化によって反射光の強度が敏感に反応するため、金属表面にリガンド等を結合せしめた上で被検試料を作用させれば、当該リガンド等と相互作用する化合物の有無によって、反射光の強度が変化する。従って、図１に示す通り金属表面にリガンド等を担持させ、更に被検試料を添加した場合としない場合の反射光強度を比較することによって、当該リガンド等と相互作用する化合物の有無を判断することができる。更に、当該技術をバイオイメージングに応用することも考えられる。即ち、細胞や生体組織において、特定の化合物と相互作用する化合物の局在をイメージとして捕らえることも可能になり得る。
【００１５】
斯かる技術の例としては、特許文献１に記載されているものを挙げることができる。当該文献によれば、図１に示す様な貴金属膜に対して、ランニングバッファー→被検試料→ランニングバッファーを連続的に作用させると、ＳＰＲが観測される入射角度は図２に示す様な経時的変化を示す。そして当該技術では、この経時的変化を測定し、反射率の最小値と最大値や屈折率と時間との関係を求めることによって、貴金属膜に担持した化合物と被検試料中の化合物との解離定数や結合定数、および試料中化合物の濃度を決定できるとされている。
【００１６】
また、特許文献２には、貴金属膜へカルボキシメチル化デキストランを介してN-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸を結合させ、更にニッケルを配位させたものを用いてＳＰＲ測定を行なう技術が開示されている。このニッケル錯体は、２つの隣接ヒスチジン残基を有するペプチドに対して特異的な親和性を示すことから、ヒスタグ（His-tag）と呼ばれ、被検試料中からジヒスチジン残基を有するペプチドを検出することができる。
【００１７】
また、表面プラズモン共鳴を測定する方法としては、ラマン分光法の応用が考えられる。ラマン分光法は、物質に一定振動数ν０の単色光を照射することにより発生する散乱光中、同一振動数以外（ν０±νｉ）の散乱光（ラマン散乱光）を測定することによって、化合物の情報を得る技術である。詳しくは、このラマン振動数νｉは、物質を構成する分子や結晶の振動や回転のエネルギー準位間の振動数に等しいことから、物質のエネルギー準位を決定、同定、定量するための情報源となる（「化学大辞典」東京化学同人を参照）。
【００１８】
しかし、このラマン散乱光は非常に微弱であるため、従来、表面プラズモン共鳴効果を利用して増強した上で測定することが行なわれている（例えば、特許文献３）。つまり、一般に光は電子波（プラズモン）とはカップリングしないが、金属粒子表面ではカップリングを起こす。そこで、当該技術では、測定試料の近傍に金属を存在せしめることによって、微弱なラマンバンド強度を増強している。
【００１９】
ところが、斯かる従来技術によるラマンバンド強度の増強効果は、必ずしも満足できるものではなかった。なぜなら、表面プラズモン共鳴効果は標的分子と金属との距離が近いほど高いが、特許文献３の図１の様に、基板（金属）２と試料３とを近接させても、全ての標的分子が金属と接するわけではないからである。斯かる状況は、水溶液試料に金属を添加する場合においても同様である。
【００２０】
ところで、非特許文献１には、リン酸基（リン酸モノエステル基）へ特異的に結合する化合物を用いることによって、リン酸化化合物の分子量を求める方法が記載されている。しかし当該文献には、この特異的結合化合物を介して標的化合物へ金属を接近せしめるという技術思想や、当該化合物を表面プラズモン共鳴の測定に応用するアイデアは、全く記載も示唆もされていない。
【特許文献１】特表平１１−５１２１８６号公報
【特許文献２】特表平１０−５０５９１０号公報
【特許文献３】特開平９−２５７５７８号公報
【非特許文献１】Hironori Takedaら，RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY，Vol.17，Issue 18，pp.2075-2081（2003年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
上述した状況の下、本発明者らは、被検試料中のリン酸化ペプチド（タンパク質）を検出したり、ペプチドがリン酸化されているか否かを判断するための表面プラズモン共鳴測定方法を完成した。
【００２２】
この表面プラズモン共鳴の測定方法は、プリズム底面に貴金属化合物を配し、当該プリズムへ光を照射してその反射光を検出するものであり、
当該貴金属化合物として、当該プリズムに接する側の反対側に下記式（Ｉ）で表される置換基を有するものを使用し、
当該貴金属化合物のうち、当該置換基（Ｉ）を有する側に被検試料を添加することを特徴とする。
【００２３】
【化１】
［式中、Ｘはリンカー基を示す。］
【００２４】
また、本発明者らは、上記方法に使用できるものであって、リン酸モノエステル基に特異的で且つ高い配位能を有する置換基（フォスタグ）を表面に有する貴金属化合物も発明している。
【００２５】
上記表面プラズモン共鳴の測定方法は、（１）蛍光発色基の導入などラベル化操作が不要である、（２）比較的高分子量の分子に対して感度が高い、（３）チオール基やジスルフィド基を有する分子は金等の貴金属化合物表面に容易に結合するので、置換基を表面へ高密度に導入できる、という利点があるため、リン酸化ペプチドの検出に極めて適するものである。
【００２６】
ところで、上記表面プラズモン共鳴の測定方法の利点（１）を考慮すれば、上記発明に係る置換基（フォスタグ）へ蛍光発色基を導入することによって、リン酸モノエステル基を有するタンパク質をラベルすることができると考えられる。
【００２７】
そこで、本発明が解決すべき課題は、リン酸化タンパク質に特異的で且つ高い配位能を有し、リン酸化タンパク質を蛍光発色基によりラベル化できる化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明に係る蛍光発色化合物は、以下式（Ｘ）の構造を有する。
【００２９】
【化２】
［式中、Ｙはリンカー基を示し、Ｚは蛍光発色基を示す。］
【発明の効果】
【００３０】
本発明の蛍光発色化合物は、リン酸化されたタンパク質のリン酸モノエステル基へ特異的で且つ高い配位能で結合することができ、当該タンパク質をラベルすることができる。よって、生体試料など多種多様な化合物が含まれている被検試料であっても、リン酸化ペプチド（タンパク質）の有無を容易に判断でき、また、ペプチドがリン酸化されているか否かを判断することもできる。従って、本発明の蛍光発色化合物は、生体試料等に本発明化合物を適用することによって、病気の診断等に応用でき得る点で非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明者らが開発した表面プラズモン共鳴の測定方法は、
プリズム底面に貴金属化合物を配し、当該プリズムへ光を照射してその反射光を検出する表面プラズモン共鳴の測定方法において、
当該貴金属化合物として、当該プリズムに接する側の反対側に下記式（Ｉ）で表される置換基を有するものを使用し、
当該貴金属化合物のうち、当該置換基（Ｉ）を有する側に被検試料を添加することを特徴とするものである。
【００３２】
【化３】
［式中、Ｘはリンカー基を示す。］
【００３３】
上記の表面プラズモン共鳴測定方法の利点の１つとしては、蛍光発色基の導入などラベル化操作が不要であることがある。本発明者らは、かかる利点を考慮して、逆に、上記置換基のうちリン酸化タンパク質と相互作用する主要部分へ蛍光発色基を導入した化合物を案出した。
【００３４】
本発明に係る蛍光発色化合物は、以下式（Ｘ）の構造を有する。
【００３５】
【化４】
［式中、Ｙはリンカー基を示し、Ｚは標識基を示す。］
【００３６】
上記式（Ｘ）において、配位金属としてＺｎを選択した理由は、リン酸化タンパク質のリン酸基（リン酸モノエステル基）への配位能が極めて高いことによる。
【００３７】
「蛍光発色基」は、当業者に公知のものを用いればよい。例えば、アミノメチルクマリンおよびその誘導体，フルオロセインおよびその誘導体，テトラメチルローダミンおよびその誘導体，アントラニロイルおよびその誘導体，ニトロベンゾオキサジアオールおよびその誘導体，ジメチルアミノナフタレンおよびその誘導体を挙げることができる。
【００３８】
「リンカー基」とは、本発明の蛍光発色化合物中、蛍光発色基部分と上記主骨格（リン酸化タンパク質と相互作用する主要部分。以下、「フォスタグ」または「Phos-tag」ということがある）とを結合する基であり、本発明に係る蛍光発色化合物の製造を容易にしたり、また、蛍光発色化合物の自由度を増し、ペプチドに結合したリン酸基と蛍光発色化合物との配位を容易にする作用を有する。
【００３９】
「リンカー基」としては、前述した作用を有するものであれば特に限定されないが、例えば糖鎖，C1-C6アルキレン基，アミノ基（-NH-），エーテル基（-O-），チオエーテル基（-S-），カルボニル基（-C(=O)-），チオニル基（-C(=S)-），エステル基，アミド基，ウレア基（-NHC(=O)NH-），チオウレア基（-NHC(=S)NH-），ビオチンとストレプトアビジンとの結合体，ビオチンとアビジンとの結合体；アミノ基，エーテル基，チオエーテル基，カルボニル基，チオニル基，エステル基，アミド基，ウレア基，チオウレア基からなる群より選択される基を一端に有する糖鎖；および、アミノ基，エーテル基，チオエーテル基，カルボニル基，チオニル基，エステル基，アミド基，ウレア基，チオウレア基，ビオチンとストレプトアビジンとの結合体，ビオチンとアビジンとの結合体からなる群より選択される基を一端に有するC1-C6アルキレン基；アミノ基，エーテル基，チオエーテル基，カルボニル基，チオニル基，エステル基，アミド基，ウレア基，チオウレア基からなる群より選択される同一または異なった基を両端に有するC1-C6アルキレン基；およびこれら基からなる群より選択される２以上の基が直線状に結合された基を挙げることができる。
【００４０】
本発明において「糖鎖」とは、一般的な糖類が直鎖状または分枝鎖状に連なったものをいい、例えば、D-グルコースがグルコシド結合により重合しているデキストランを挙げることができる。この糖鎖は、上述したリンカー基の作用に加えて、親水性が高いことから生体試料との相性がよく、また、容易に分枝鎖状のものを合成できることから、置換基（Ｘ）の主骨格をより多く結合させることができるという利点もある。
【００４１】
ここで、「C1-C6アルキレン基」とは、炭素数１〜６の直鎖状または分枝鎖状の２価脂肪族炭化水素基をいい、例えば、メチレン，エチレン，プロピレン，テトラメチレン，ヘキサメチレン，メチルエチレン，メチルプロピレン，ジメチルプロピレン等を挙げることができ、C1-C4アルキレン基が好ましく、C1-C2アルキレン基がより好ましい。
【００４２】
以上に説明したリンカー基の長さは特に制限されないが、好適には２００ｎｍ以内、より好ましくは１００ｎｍ以内にする。
【００４３】
なお、置換基（Ｘ）では、本発明と同一の作用効果を享有するものとして、ピリジン環にメチル基等を導入することも可能であるが、この様な均等物も本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００４４】
また、本発明に係る置換基（Ｘ）におけるリンカー基の位置も特に限定されず、下記置換基（Ｘ'）に示す位置に存在する場合もある。
【００４５】
【化５】
【００４６】
この置換基（Ｘ'）と置換基（Ｘ）は全く等価であり、合成で何れの置換基となるかは必ずしも明らかではないが、実際には両者の混合物であると考えられ、勿論、置換基（Ｘ'）も本発明の範囲内に含まれる。
【００４７】
本発明者らが開発した表面プラズモン共鳴の測定方法で使用する貴金属化合物は、スキーム１を含むことを特徴とする方法によって容易に製造することができるが、製造方法は、以下に示すものに制限されない。
［スキーム１］
【００４８】
【化６】
［式中、Ｘはリンカー基を示し、Ｒ１とＲ２は、−Ｘ−フォスタグ基を貴金属膜表面に形成するための反応性基を示す。］
【００４９】
上記スキーム１においては、先ず、リンカー基Ｘを形成するための反応性基であるＲ1を、貴金属上へ置換させる。ここで、反応性基Ｒ1と貴金属との結合の種類は必ずしも明らかでなく、結合の種類は特に問わないものとする。例えば、チオール化合物やジスルフィド化合物は、貴金属表面へ自発的に吸着して自己組織化単分子膜といわれる単分子膜を形成することが知られている。従って、反応性基Ｒ1と貴金属とが硫黄原子を介して結合している場合、上記式中における貴金属と硫黄原子との結合の種類は特に制限されず、何らかの相互作用によって結びついているものとする。
【００５０】
反応性基Ｒ1を置換させるべき貴金属は、最終目的物が貴金属膜である場合には、原料貴金属を適切な厚さまで延展した後、使用するＳＰＲ測定装置に適した形状に切り出せばよい。粒子の場合には、公知の金属粒子製造方法を適用して製造した後、所望の粒径に対応するメンブランフィルター等を使用して、大き過ぎたり小さ過ぎる粒子を除去すればよい。
【００５１】
上記スキーム１において、硫黄原子を介して反応性基Ｒ1を貴金属表面に結合せしめる場合、チオール化合物（例えば、Ｒ１-ＳＨ）と貴金属との反応は極めて容易に進行することが分かっており、その反応条件等は従来法に従えばよい。例えば、貴金属表面とチオール化合物の溶液を接触させるのみでも、両者を縮合させることができる。
【００５２】
次いで、リンカー基Ｘを介してフォスタグ前駆体を結合させるために、置換基Ｒ２を有するテトラキス(ピリジン-2-イルメチル)-1,3-ジアミノプロパン-2-オール誘導体（化合物（ＶI））を反応させる。上記スキーム１中Ｒ1とＲ2とを反応させる工程におけるＲ1とＲ2の種類や溶媒，反応温度，その他の試薬，精製方法等は、主としてＸの種類により決定される。例えば、アミド結合によりＲ1とＲ2とを結合してＸとする場合には、Ｒ1とＲ2の組合わせとしては末端にアミノ基（第一級アミノ基）を有する基と活性化されたカルボキシ基との組合わせを挙げることができる。この場合の一般的な反応条件は、有機合成化学分野において一般的なものを適用すればよい。こうして、置換基（ＶII）を表面に有する貴金属化合物を得ることができる。
【００５３】
最後に、置換基（ＶII）を有する貴金属化合物に金属塩を添加することによって、表面にフォスタグを有する貴金属化合物を得ることができる。例えば硝酸亜鉛（II）や酢酸亜鉛(II)を添加すればよいが、酢酸亜鉛(II)を添加する場合には、一旦酢酸が配位した以下の化合物が得られる。
【００５４】
【化７】
【００５５】
この化合物は、置換基（Ｉ）よりも安定であり保存に便利であるが、置換基（Ｉ）と等価なものであり、置換基（Ｉ）と同様に用いることができる。即ち、ＳＰＲ測定時には、リン酸モノエステル基が酢酸と交換的に配位するため、リン酸化ペプチドを検出することができる。
【００５６】
以上を考慮すれば、本発明の蛍光発色化合物は、上記リンカー基Ｙを形成するための反応性基Ｒ2を有する化合物（ＶＩ）を出発原料とし、当該反応性基Ｒ2へ蛍光発色基Ｚをリンカー基Ｙを介して結合させた後、金属塩を添加して亜鉛イオンを配位させることにより合成することができる。
【００５７】
上記スキーム１において、フォスタグを貴金属へ結合させるための、および本発明の蛍光発色化合物を合成するための原料化合物（化合物（ＶI））は、以下のスキーム２により製造することができる。
［スキーム２］
【００５８】
【化８】
［式中、Ｒ２は前述したものと同義とする。また、“Ｈａｌ”は、ハロゲン原子を示し、好適には臭素原子を示す。］
【００５９】
原料化合物である化合物（II）（1,3-ジアミノ-2-プロパノール）は、市販のものを使用することができる。また、化合物（III）と化合物（Ｖ）は比較的簡単な構造を有しているので、市販のものを用いるか、或いは当業者公知の方法により合成することができる。
【００６０】
スキーム２では、先ず、触媒の存在下に化合物（II）と（III）を縮合反応させて、化合物（IＶ）を得る。本反応は一段階ずつ化合物（III）を導入していってもよいが、３当量以上の化合物（III）を使用することによって一段階反応で化合物（IＶ）を得ることもできる。
【００６１】
スキーム２では、縮合反応として還元的アミノ化反応を行なっている。その場合に使用される溶媒は、化合物（II）と（III）とを実質的に溶解でき、反応を阻害しないものであれば特に制限なく使用することができるが、例えば、メタノール，エタノール，イソプロパノール等のアルコール類；ジエチルエーテル，テトラヒドロフラン，ジオキサン等のエーテル類；水；又はこれらの混合溶媒を使用することができる。
【００６２】
還元的アミノ化反応では、先ず化合物（II）と（III）を触媒としての濃塩酸存在下に縮合した後、一般的な還元試薬により還元することができる。
【００６３】
反応温度と反応温度は、原料化合物の種類等によって好適な条件を採用すればよいが、例えば２０〜８０℃で１２〜１００時間反応させる。
【００６４】
反応終了後は、溶媒等を減圧留去した後に水を加え、非水溶性溶媒で抽出し、油相を無水硫酸マグネシウム等で乾燥した後、溶媒を減圧留去する。次いで、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知方法により精製して、化合物（IＶ）を得ることができる。
【００６５】
なお、化合物（IＶ）を得る方法はスキーム２で示した方法に限られず、例えば化合物（II）とハロゲン化合物から化合物（IＶ）を合成してもよい。
【００６６】
次に、化合物（Ｖ）を反応させることにより、化合物（ＶI）を得ることができる。この反応は、一般的な三級アミンの合成反応を採用することができる。例えば、溶媒中塩基の存在下で縮合させる。また、当該ステップにおいては、Ｒ２の種類に応じて、適宜保護基の導入と脱保護を行なってもよい。或いは、化合物（Ｖ）中Ｒ２の代わりに不活性置換基を有する化合物を用いて当該ステップを行なった後、官能基変換により当該不活性置換基をＲ２へ変換することによって、化合物（ＶI）を合成してもよい。例えば、不活性置換基としてニトロ基と有する化合物を使用し、当該ステップ後、ニトロ基を反応性基であるアミノ基に変換してもよい。
【００６７】
本発明の蛍光発色化合物は、ピリジン環上の４または６位において、電子供与性置換基を有するものであってもよい。かかる化合物は、適切な置換位置に導入された電子供与性置換基によってピリジン窒素が電気的にリッチとなっているため、亜鉛に対する配位性に優れており、結果的に製造が容易であり、また、安定性を有する。置換基（Ｉ）に準ずるものを使用することができる。
【００６８】
以下に、製造例および試験例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
製造例１ ＳＰＲ分析用のフォスタグ−センサーチップの製造
カルボキシメチルデキストランがコーティングされているセンサーチップ（BIOCRE社製，Sensor Chip CM5）を、ＳＰＲ測定装置（BIOCRE社製，BIOCORE J）にセットした。
【００７０】
ランニングバッファーとして、5×10-3％（v/v）Ｔｗｅｅｎ ２０，0.20M 硝酸ナトリウムおよび10μM 硝酸亜鉛を含む10mM ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）−水酸化ナトリウム水溶液（pH 7.4）を使用した。センサーチップの温度を２５℃、ランニングバッファーの流速を３０μL/minとした。表面プラズモン共鳴の値が安定したことを確認した後、カルボキシル基活性化剤であるＥＤＣ（1-エチル-3,4-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド，200mM）とＮＨＳ（N-ヒドロキシスクシンイミド，50mM）の混合水溶液を６分間添加することによって、センサーチップのカルボキシル基を活性化した。
【００７１】
次いで、センサーチップにフォスタグを担持するために、N,N,N'-トリ(2-ピリジルメチル)-N'-[5-N''-(2-アミノエチル)カルバモイル-2-ピリジルメチル]-1,3-ジアミノプロパン-2-オールの50％（v/v）アセトニトリル溶液（10mM）を、６分間添加した。その後、残存する活性化カルボキシル基をブロッキングするために、モノエタノールアミン水溶液（1.0M）を６分間添加した。
【００７２】
以上の操作によって、フォスタグを結合したセンサー部を有するサンプル流路（フローセルＡ）を作製した。
【００７３】
比較製造例１
上記製造例１において、カルボキシル基の活性化とそのブロッキングを含め、フォスタグを担持させる以外は同一の手法を用いて、フォスタグが結合していないレファレンス部を有するサンプル流路（フローセルＢ）を、フローセルＡと平行に作製した。
【００７４】
試験例１
分析サンプルとして、（ｉ）β−カゼイン（ペンタリン酸化タンパク質，SIGMA社），（ii）脱リン酸化β−カゼイン，および（iii）牛血清アルブミン（BSA，New England BioLabs社）を使用した。脱リン酸化β−カゼインは、β−カゼイン 10mg/mL（50μL）とジャガイモ由来酸性フォスファターゼ（SIGMA社）と0.20M ＭＥＳ−ＮａＯＨ（pH 6.8，50μL）との混合溶液を、１２時間３８℃でインキュベートすることにより調製した。それぞれのサンプルは、上記製造例１で用いたランニングバッファーに溶解し、サンプル濃度1.5μMのサンプル溶液を得た。
【００７５】
上記サンプル溶液について、ＳＰＲ測定を行なった。具体的には、上記製造例１と比較製造例１のそれぞれで作成し、ランニングバッファーで安定化させたフローセルＡ，Ｂについて、各サンプル溶液を温度：２５℃，流速：３０μL/minで流して１５分間結合させ、次いでランニングバッファーのみを１５分間流して解離させた。各サンプル溶液の測定後には、25mM リン酸一カリウム−25mM リン酸二ナトリウム水溶液（pH 6.86）を６分間、0.20M エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液（pH 7.4）を６分間、上記ランニングバッファーを５分間流して、センサーチップの再活性化（残存結合物の除去）を行なった。
【００７６】
各サンプル（i）〜（iii）のＳＰＲ測定結果をそれぞれ図３〜５に、各サンプルの測定結果において、フローセルＡのＲＵ値からフローセルＢのＲＵ値の差を示したものを図６に示す。図４〜６の結果によれば、フローセルＡとＢの変化はほぼ同じであり、脱リン酸化β−カゼインとＢＳＡは、特異的な結合をしないことが分かる。一方、図３と６の結果より、リン酸化されているβ−カゼインは、フォスタグが結合しているセンサー部へ特異的に結合することが明らかにされた（最大結合量：3150RU）。従って、本発明方法によれば、リン酸化されたペプチドのみを検出できることが実証された。
【００７７】
試験例２
分析サンプルとして、（iｖ）リン酸化SRCペプチド（モノリン酸化ペプチド，ANA SPEC社）および（ｖ）SRCペプチド（非リン酸化ペプチド，ANA SPEC社）を使用した。それぞれのサンプルは、上記製造例１で用いたランニングバッファーに溶解し、サンプル濃度1〜15μMのサンプル溶液を得た。
【００７８】
上記サンプル溶液について、上記製造例１と比較製造例１で作製したフローセルＡ，Ｂを用いてＳＰＲ測定を行なった。具体的には、上記試験例１において、サンプルの結合時間と解離時間を５分、センサーチップの再活性化（残存結合物の除去）を0.40M リン酸バッファー（pH 7.0）を５分間，0.20M エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液（pH 7.4）を５分間，上記製造例１のランニングバッファーを５分間流して行なった以外は、上記試験例１と同様の条件でＳＰＲ測定を行なった。結果を図７に示す。
【００７９】
当該結果より、非リン酸化ペプチドは濃度15μMであっても殆ど変化は認められないのに対して、リン酸化ペプチドでは、その濃度が15μMの場合のみならず1と5μMの場合であっても、明確にその存在を把握することができた。従って、本発明によれば、同一のアミノ酸配列を有するペプチドであっても、リン酸が結合しているか否かを明確に判断できることが明らかにされた。
【００８０】
製造例２ ＳＰＲ分析用のフォスタグ−センサーチップの製造
表面にストレプトアビジンが結合しているストレプトアビジン−センサーチップ（BIOCRE社製，Sensor Chip SA）を、ＳＰＲ測定装置（BIOCRE社製，BIOCORE J）にセットした。
【００８１】
ランニングバッファーとして、5×10-3％（v/v）Ｔｗｅｅｎ ２０，0.20M 硝酸ナトリウムおよび10μM 硝酸亜鉛を含む10mM ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）−水酸化ナトリウム水溶液（pH 7.4）を使用した。センサーチップの温度を２５℃とし、表面プラズモン共鳴の値が安定するまで、流速３０μL/minでランニングバッファーを流した。
【００８２】
次いで、センサーチップにフォスタグを担持するために、末端にビオチン構造を有するN,N,N'-トリ(2-ピリジルメチル)-N'-[5-N''-2-(6-D-ビオチンアミドヘキサカルボキシアミドエチル)カルバモイル-2-ピリジルメチル]-1,3-ジアミノプロパン-2-オール（下記構造を有する化合物）の1.0mM 上記ランニングバッファー溶液を流した。温度は２５℃、流速は３０μL/min、結合時間は６分とした。
【００８３】
【化９】
【００８４】
上記化合物は、ランニングバッファー中の亜鉛イオンに配位されてフォスタグとなり、且つ末端のビオチンはストレプトアビジンに対して極めて高い親和性を示すので、フォスタグがセンサーチップ上に担持されることになる。
【００８５】
比較製造例２
上記製造例２において、フォスタグを担持させる以外は同一の手法を用いて、フォスタグが結合していないセンサーチップを作製した。
【００８６】
試験例３
分析サンプルとして、ランニングバッファー（5×10-3％（v/v）Ｔｗｅｅｎ ２０，0.20M 硝酸ナトリウムおよび10μM 硝酸亜鉛を含む10mM ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム水溶液（pH 7.4））に溶解したβ−カゼイン（ペンタリン酸化タンパク質，SIGMA社）を使用した。サンプル濃度は、1.5μMとした。
【００８７】
上記分析サンプルについて、温度２５℃、流速３０μL/min、結合時間１５分間、解離時間１０分間でＳＰＲ測定を行なった。測定後には、0.40M リン酸水溶液を６分間、0.20M エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液（pH 8.0）水溶液を６分間、上記ランニングバッファーを５分間流して、センサーチップを再活性化（残存結合物の除去）した。
【００８８】
測定結果を図８に示す。当該結果によれば、分析サンプルを流すことによってＲＵが２０５６増加したことから、本発明の貴金属膜（フォスタグが結合した貴金属センサーチップ）にリン酸化タンパク質が結合していることが分かる。また、以上と同一の条件において、リン酸化タンパク質の代わりに非リン酸化タンパク質である牛血清アルブミンを用いて実験を行なったが、ＲＵは全く変化しなかった。従って、本発明の貴金属膜は、リン酸が結合したタンパク質のみを検出できることが明らかにされた。
【００８９】
また、比較製造例２で製造したセンサーチップについても同様の条件で実験を行なったが、ＲＵは全く変化しなかった。
【００９０】
以上の通り、本発明に係るフォスタグは、リン酸化されたタンパク質へ特異的で且つ高い配位能で結合できることが実証されている。よって、フォスタグ部分と蛍光発色基を有する本発明の蛍光発色化合物は、リン酸化されたタンパク質へ特異的に結合し、蛍光標識できることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＳＰＲを測定するための一手法を示す模式図である。ＳＰＲが測定される（反射光強度が減少する）様に入射光の波長と入射角度を調整した上で、リガンドを結合した貴金属膜に被検試料を添加し、入射光強度の変化を観測するものである。図中の１はプリズム，２は貴金属膜，３はリガンド，４は被検試料に含まれているタンパク質であって、リガンドと相互作用を示すものを示す。
【図２】図１に示すＳＰＲ測定において、ランニングバッファー→被検試料→ランニングバッファーを連続的に作用させた場合におけるＳＰＲ角度の経時的変化を模式的に示す図である。被検試料中の化合物が貴金属膜に結合した際には、ＳＰＲが測定される入射角度に変化が生じることを示している。
【図３】リン酸化されているβ−カゼインが含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【図４】脱リン酸化されたβ−カゼインが含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【図５】リン酸化されない一般的なタンパク質である牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【図６】図３〜５に示す測定結果において、フローセルＡのＲＵ値からフローセルＢのＲＵ値の差を示す図である。
【図７】リン酸化ペプチド（P-p60csrc）と非リン酸化ペプチド（p60csrc）が含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【図８】リン酸化されているβ−カゼインが含まれる試料についてＳＰＲ測定を行なった結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下式（Ｘ）の構造を有する蛍光発色化合物。
【化１】
［式中、Ｙはリンカー基を示し、Ｚは蛍光発色基を示す。］
【請求項１】
以下式（Ｘ）の構造を有する蛍光発色化合物。
【化１】
［式中、Ｙはリンカー基を示し、Ｚは蛍光発色基を示す。］
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−２９８９０８（Ｐ２００６−２９８９０８Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−７７２４０（Ｐ２００６−７７２４０）
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【分割の表示】特願２００５−５１４８１０（Ｐ２００５−５１４８１０）の分割
【原出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【出願人】（０００１３４６３７）株式会社ナード研究所 (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【分割の表示】特願２００５−５１４８１０（Ｐ２００５−５１４８１０）の分割
【原出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【出願人】（０００１３４６３７）株式会社ナード研究所 (31)
【Ｆターム（参考）】
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