血小板活性化因子受容体拮抗剤および組成物
【課題】安価、大量、かつ簡便に調製することが可能である新規なＰＡＦ受容体拮抗剤を提供すること、ならびにそのような新規なＰＡＦ受容体拮抗剤を含有する気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシーの治療および／または予防のための組成物を提供すること。
【解決手段】本発明者は、イカ可食部、カツオ精巣およびカツオ卵巣のような魚介類抽出物が、ＰＡＦ受容体拮抗活性を有する物質を含有することを見出した。そして、本発明者は、これら抽出物を提供することによって、上記課題を解決した。
【解決手段】本発明者は、イカ可食部、カツオ精巣およびカツオ卵巣のような魚介類抽出物が、ＰＡＦ受容体拮抗活性を有する物質を含有することを見出した。そして、本発明者は、これら抽出物を提供することによって、上記課題を解決した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板活性化因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ， ＰＡＦ）受容体拮抗剤、およびＰＡＦ受容体拮抗剤を含む気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシーの予防および／または治療のための薬学的組成物および飲食用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＡＦは、１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンという構造を有し、血小板、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、肥満細胞、内皮細胞および種々の組織（肺、心臓、腎臓等）に作用し、炎症を引き起こす（非特許文献１）ことが知られている。
【０００３】
炎症反応における白血球とＰＡＦの関係は、種々の炎症惹起物質の刺激により、ＰＡＦは生体防御の細胞より産生される。また、ＰＡＦは白血球に作用し、細胞内顆粒酸素や活性酸素を放出させる。この結果は、ＰＡＦが炎症病態時に白血球がＰＡＦの産生細胞であると同時に受容体を有する標的細胞であることを意味している（非特許文献２）。
【０００４】
産生されたＰＡＦは、白血球に作用し、血圧低下、血小板減少、気管支収縮および血管透過性亢進を含む種々の生理作用に関与している。これらの作用は、エンドとキシンショック、糸球体腎炎、喘息、血栓症、胃潰瘍、骨粗鬆症および低血圧に関与している（非特許文献３）。また、ＰＡＦがアナフィラキシーによる死亡における重要なメディエーターであることも報告されている（非特許文献４）。
また、ＰＡＦは、喘息などアレルギー反応を亢進し、そして骨粗鬆症を進行させることが公知である。また、ＰＡＦ受容体欠損マウスにおいては、オブアルブミン感作による気管支喘息モデルおよび卵巣摘除による骨粗鬆症モデルのいずれにおいても野生型マウスと比較して病態が軽減していたことも実証されている（非特許文献５）。このことから、ＰＡＦ拮抗剤は、気管支喘息および骨粗鬆症の治療・予防薬となると考えられる。実際に、ＰＡＦ受容体拮抗剤であるＷＥＢ２０８６の投与によって、メタコリンに対する気道の応答が抑制され（非特許文献６）、また、骨再吸収が抑制されている（非特許文献７）。従って、新規のＰＡＦ受容体拮抗剤は、気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーの治療・予防薬として利用可能である。
【０００５】
ＰＡＦ受容体拮抗剤ならびにＰＡＦ受容体拮抗剤を含有する気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーの治療・予防薬の有効成分を供給するには、多大なコストと労力を要する。そのため、ＰＡＦ受容体拮抗剤ならびにＰＡＦ受容体拮抗剤を含有する気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーの治療・予防薬の有効成分を大量かつ安価に供給するための供給源を見出すことが、気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーなどの治療・予防薬、あるいは、気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーに対する薬理効果を有する飲食用組成物の提供のために求められている。また、新規のＰＡＦ受容体拮抗活性を有する物質を見出すことも求められている。
【非特許文献１】イシイ サトシおよびシミズ タカコ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年、３９：ｐ４１−８２
【非特許文献２】和久敬蔵および井上圭三編「血小板活性化因子 −生化学・生理・病理−」、１９８９年、ｐ１１５〜１２１、東京化学同人
【非特許文献３】Ｄｉａｎａ Ｍ． Ｓｔａｆｆｏｒｉｎｉ、外３名、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、２００３年、４０、ｐ６４３−６７２
【非特許文献４】フクダ ヨシアキ、外５名、「Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、２０００年２月、３９０（１−２）、ｐ２０３−７
【非特許文献５】清水孝雄 編、わかる実験医学シリーズ、脂質生物学がわかる、脂質メディエーターの機能からシグナル伝達まで、羊土社
【非特許文献６】イシイ サトシ、外８名、「Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ」、１９９７年、１６（１）、ｐ１３３−１４２
【非特許文献７】ヒキジ ヒサコ、外４名、「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｎｓｔｉｇａｔｉｏｎ」、２００４年、１４４（１）、ｐ８５−９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新規なＰＡＦ受容体拮抗剤を提供すること、ならびにそのような新規なＰＡＦ受容体拮抗剤を含有する気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシーの治療および／または予防のための組成物を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題は、イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物中に、ＰＡＦ受容体拮抗活性を有する物質が含まれていることを見出すことによって、達成された。
【０００８】
従って、一つの実施形態においては、本願発明は、イカ（例えば、イカの可食部）、魚の精巣（例えば、カツオ精巣）および／または魚卵（例えば、カツオ卵巣）の抽出物を含有する、ＰＡＦ受容体拮抗剤ならびに気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシーの治療および／または予防のための組成物を提供する。好ましくは、このＰＡＦ受容体拮抗剤ならびに薬学的組成物および飲食用組成物は、イカの可食部またはカツオ精巣・卵巣の抽出物を用いて調製される。
【０００９】
従って、本発明は以下を提供する。
（項目１） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、気管支喘息の予防または治療のための薬学的組成物。
（項目２） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目１に記載の気管支喘息の予防または治療のための薬学的組成物。
（項目３） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、骨粗鬆症の予防または治療のための薬学的組成物。
（項目４） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目３に記載の骨粗鬆症の予防または治療のための薬学的組成物。
（項目５） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、気管支喘息の予防または治療のための飲食用組成物。
（項目６） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目５に記載の気管支喘息の予防または治療のための飲食用組成物。
（項目７） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、骨粗鬆症の予防または治療のための飲食用組成物。
（項目８） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目７に記載の骨粗鬆症の予防または治療のための飲食用組成物。
（項目９） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、ＰＡＦ受容体拮抗剤。
（項目１０） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目９に記載のＰＡＦ受容体拮抗剤。
（項目１１） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、アナフィラキシーの予防または治療のための薬学的組成物。
（項目１２） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目１１に記載のアナフィラキシーの予防または治療のための薬学的組成物。
（項目１３） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、アナフィラキシーの予防または治療のための飲食用組成物。
（項目１４） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目１３に記載のアナフィラキシーの予防または治療のための飲食用組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、新規なＰＡＦ受容体拮抗剤が提供される。さらに、本発明によって、そのような新規なＰＡＦ受容体拮抗剤を含有する気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシーの治療および／または予防のための薬学的組成物または飲食用組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１２】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１３】
本発明において使用する場合、「リン脂質抽出物」とは、所定の供給源から抽出される物質であって、リン脂質を含有する物質をいう。
【００１４】
本発明において使用する場合、「リン脂質」には、グリセロリン脂質およびスフィンゴリン脂質が包含される。
【００１５】
本発明において使用する場合、用語「スフィンゴリン脂質」とは、リンを含有するスフィンゴ脂質である。本発明において使用する場合、用語「スフィンゴ脂質」とは、スフィンゴシンなどの長鎖塩基を有する脂質をいう。スフィンゴ脂質としては、スフィンゴシンが挙げられるが、これに限定されない。
【００１６】
本明細書において使用する場合、用語「グリセロリン脂質」とは、グリセロールリン酸およびその誘導体をいう。グリセロールリン酸は、異性体として、ｓｎ−グリセロール１−リン酸、ｓｎ−グリセロール２−リン酸、およびｓｎ−グリセロール３−リン酸が存在する。生体内では、ｓｎ−グリセロール３−リン酸（すなわち、Ｌ−グリセロール３−リン酸、Ｄ−グリセロール１−リン酸、およびＬ−α−グリセロリン酸）が存在する。本明細書においてグリセロリン脂質の定義に含まれるグリセロールリン酸の誘導体としては、例えば、１位および２位に脂肪酸を結合し、グリセロールリン酸のリン酸基に、コリン、エタノールアミン、イノシトール、およびセリンなどを結合した、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジルセリン、ならびにホスファチジン酸を結合した物質が挙げられるが、これらに限定されない。これらのリゾリン脂質もまた、本発明のグリセロールリン酸の誘導体としてのグリセロリン脂質に含まれる。
【００１７】
本発明において使用するリン脂質の供給源としては、動物、植物、魚介類、藻類、微生物が挙げられる。採取効率および作業・操作の容易性等の点を考慮すれば、動物性原料または魚介類由来の原料を選択し、これから抽出することが望ましい。動物性原料としては牛、豚、鶏、アザラシ、ハープシール、オットセイ、セイウチ、トド等の各種動物臓器、ならびに魚介類を使用することが可能である。好ましい供給源は、魚介類である。
【００１８】
魚介類の供給源としては、カツオ、マグロ、イワシ等の魚類の組織が挙げられるが、これらに限定されない。魚類の組織としては、例えば、精巣および卵巣が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
魚介類のさらなる供給源としては、ケンサキイカ、コウイカ、マイカ、マツイカ、スルメイカ、ホタルイカ、ヤリイカ等のイカ組織およびこれらの皮（例えば、可食部）が挙げられるが、これらに限定されない。イカ組織から抽出して得られる油分は、本発明のリン脂質の好ましい供給源である。イカ皮（外套筋）も同様に本発明のリン脂質の好ましい供給源である。
【００２０】
本発明の「リン脂質抽出物」を抽出する方法としては、例えば、圧搾法、煮とり法、溶剤抽出法等の公知の方法を用いることができる。
【００２１】
溶剤抽出法の場合、上記供給源を何ら前処理することなく、または、上記供給源を凍結乾燥した後に、溶媒で活性成分を抽出することによって、行うことができる。溶媒としては、例えば、脂溶性有機溶剤、脂溶性有機溶剤と親水性アルコールとの混合溶剤、および親水性アルコール含有溶剤が挙げられるが、これらに限定されない。脂溶性有機溶剤としては、アセトン、ヘキサン、エーテル、および石油エーテル、ならびにこれらの組合せ等が挙げられるが、これらに限定されない。親水性アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびブタノールならびにこれらの組合せ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
溶剤抽出は、常温または加温下で、常圧または加圧下で、必要に応じて攪拌して、油分の画分を抽出することによって行われる。この抽出された油分画分は一般に原油と称せられ、グリセリドを主成分とするものであるため、これに水を添加して脱ガム処理し、分離したガム質区分を乾燥してリン脂質含量が２０〜６０重量％のリン脂質含有画分を得ることができる。あるいは、前記親水性アルコールの含水溶剤を用いて抽出すると、抽出物として前記同様のリン脂質含有油分が得られる。
【００２３】
かかる油分の分画物を得るためには、有効成分の溶剤に対する溶解性の差異を利用する液−液分離法が簡便かつ実用的である。例えば、エタノールを用いて調製された抽出物にアセトン沈殿処理を施してリン脂質含量をさらに高めた分画物を得ることができ。また、エタノール抽出物を、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤を充填したカラムクロマトグラフィー処理に供することにより、リン脂質含量が９０重量％以上の分画物を得ることもできる。
【００２４】
このようにして得られるリン脂質含有油分およびこの分画物の望ましい態様は、リン脂質の含量が２０重量％以上、より好ましくは３０重量％以上である。以下の実施例に示す方法で調製されたリン脂質では、高度不飽和脂肪酸がリン脂質の構成脂肪酸として含有されているため、魚油等の高度不飽和脂肪酸トリグリセリドと比較して酸化安定性が優れており、精製後の戻り臭や不快臭がほとんどない。
【００２５】
本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤、ならびに薬学的組成物および飲食用組成物は、前記リン脂質またはこれを含む油分を有効成分として含有する。本発明の薬学的組成物および飲食用組成物は、活性成分としてＰＡＦ受容体拮抗剤のみを単独で配合した形態、あるいはＰＡＦ受容体拮抗剤以外の活性成分と組み合わせた形態、またはＰＡＦ受容体拮抗活性を有するリン脂質以外の活性成分と組み合わせた形態において構成され、望ましくはリン脂質の含有量が２０重量％以上、さらに好ましくは３０重量％以上である。本発明の所望の効果を阻害しない範囲および程度であれば、他の公知の成分あるいは原材料を適宜に併用せしめてもよい。これらの例としてアスコルビン酸、アミノ酸、ペプチド、蛋白質およびこの分解物、各種糖質、澱粉およびこの分解物、ミネラル類、ビタミンＥ、トコフェロール、フィトステロール、カテキン、グァバ葉等のポリフェノール類等およびこれらの誘導体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２６】
これらの併用物質がアスコルビン酸パルミテート、フィトステロール、ビタミンＥ等のように油溶性の場合は、本発明に係るリン脂質またはこれを含む油分と混合して均一状態となし、また、アスコルビン酸、アミノ酸、ミネラル、蛋白質等のように水溶性ないしは水分散性の場合は、例えばその乾燥粉末を本発明に係るリン脂質またはこれを含む油分と混練して分散状態にするか、水および適宜に界面活性剤を共存させて乳化状態となすこともできる。
【００２７】
本発明では、前述のように、リン脂質を有効成分としてなるＰＡＦ受容体拮抗剤が提供されるが、さらにこの予防剤を配合してなる組成物も提供される。この組成物の態様としては医薬用組成物および食用組成物が好適である。
【００２８】
（薬学的組成物の処方）
本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与による、ＰＡＦ受容体の作用を抑制することによって治療および／または予防され得る疾患または障害（例えば、気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシー）の処置および／または予防の方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明の組成物を意味する。
【００２９】
治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ＧＭＰ＝ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【００３０】
一般的提案として、用量当り、経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約２μｇ／ｋｇ／日〜４０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤について、この用量は、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約２０ｍｇ／ｋｇ／日と約４０ｍｇ／ｋｇ／日との間である。また、一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約０．２μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤について、この用量は、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約５ｍｇ／ｋｇ／日と約１０ｍｇ／ｋｇ／日との間である。
【００３１】
治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。本発明の薬学的組成物の代表的投与経路は、経口投与である。
【００３２】
「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。
【００３３】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【００３４】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【００３５】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５： １６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【００３６】
徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の治療剤を包含する（一般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出 願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適治療剤のために調整される。
【００３７】
なおさらなる実施態様において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達されうる（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【００３８】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。
【００３９】
非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、治療剤は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【００４０】
一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【００４１】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００４２】
治療剤は、代表的には約１００ｍｇ／ｍｌ〜２，０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５００〜２，０００ｍｇ／ｍｌの濃度で、約６〜９のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、塩が形成されることが理解される。
【００４３】
治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、有効成分としてのウイルス以外の生物・ウイルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
【００４４】
治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した５％（ｗ／ｖ）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【００４５】
本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【００４６】
本発明の治療剤は、単独または他の治療剤と組合わせて投与され得る。組合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々の投与をさらに含む。
【００４７】
本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤の製剤化にあたっては、前述の抽出物をそのまま使用してもよいが、これをさらに分画処理して有効成分であるリン脂質をより高濃度に含有する分画物として用いてもよい。
【００４８】
（飲食用組成物の製造）
本発明の好適な態様は飲食用組成物である。すなわち、前述のようにして得られるリン脂質を有効成分として含むＰＡＦ受容体拮抗剤あるいは薬学的組成物または飲食用組成物は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、コーヒー、紅茶、日本茶、ウーロン茶、野菜ジュース、天然果汁、乳飲料、牛乳、豆乳、スポーツ飲料、ニアウォーター系飲料、栄養補給飲料、コーヒー飲料、ココア、スープ、ドレッシング、ムース、ゼリー、ヨーグルト、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、加工乳、スポーツドリンク、栄養ドリンク、ケーキミックス、パン、ピザ、パイ、クラッカー、ビスケット、ケーキ、クッキー、スパゲティー、マカロニ、パスタ、うどん、そば、ラーメン、キャンデー、ソフトキャンデー、ガム、チョコレート、おかき、ポテトチップス、スナック、アイスクリーム、シャーベット、クリーム、チーズ、粉乳、練乳、乳飲料などの粉末状または液状の乳製品、饅頭、ういろ、もち、おはぎ、醤油、たれ、麺つゆ、ソース、だしの素、シチューの素、スープの素、複合調味料、カレーの素、マヨネーズ、ケチャップ、レトルトカレー、レトルトシチュー、レトルトスープ、レトルトどんぶり、缶詰、ハム、ハンバーグ、ミートボール、コロッケ、餃子、ピラフ、おにぎり、冷凍食品および冷蔵食品、ちくわ、蒲鉾、弁当のご飯、寿司、乳児用ミルク、離乳食、ベビーフード、スポーツ食品、栄養補助食品、サプリメント、健康食品等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦型剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。これらの食品類あるいは飲食用組成物における本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤またはこれを含む抽出物の配合量は、当該食品や組成物の種類や状態等により一律に規定しがたいが、約０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％である。配合量が０．０１重量％未満では経口摂取による所望の効果が小さく、５０重量％を超えると食品の種類によっては風味を損なったり当該食品を調製できなくなる場合がある。なお、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤活性を有する抽出物は、これをそのまま食用に供してもさしつかえない。
【００４９】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
（実施例１：イカ可食部よりの抽出物の調製）
イカの可食部を凍結乾燥で乾燥した。乾燥スルメイカ１００ｇに純度９９％のエタノール８００ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾過した後、残渣に純度９９％のエタノール３５０ｍＬを加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾液を合わせて濃縮し、イカ抽出物を１３ｇ得た。イカ抽出物からアセトン沈殿により、イカリン脂質６ｇを得た。
【００５１】
（実施例２：カツオ卵巣よりの抽出物の調製）
カツオ卵巣を凍結乾燥で乾燥した。乾燥カツオ卵巣１００ｇに純度９９％のエタノール８００ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾過した後、残渣に純度９９％のエタノール３５０ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾液を合わせて濃縮し、カツオ卵巣抽出物１４ｇ得た。カツオ卵巣抽出物からアセトン沈殿によりカツオ卵巣リン脂質７ｇを得た。
【００５２】
（実施例３：カツオ精巣よりの抽出物の調製）
カツオ精巣を凍結乾燥で乾燥した。乾燥カツオ精巣１００ｇに純度９９％のエタノール８００ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾過した後、残渣に純度９９％のエタノール３５０ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾液を合わせて濃縮し、カツオ精巣抽出物９ｇ得た。カツオ精巣抽出物からアセトン沈殿によりカツオ精巣リン脂質５ｇを得た。
（実施例４：各種供給源由来の抽出物の比較）
上記実施例１〜３によって単離された抽出物、ならびにコントロールとしての大豆リン脂質（辻製油（株）三重県松阪市、およびＤＨＡトリグリセライド（備前化成（株）岡山県赤磐市）のＤＨＡ含有量およびリン脂質含有量を日本油化学会制定基準油脂分析試験法（財団法人 日本油化学会）に従って、決定した。具体的には、ＤＨＡ含有量を２．４．２．２−１９９６ 脂肪酸組成ＦＩＤ昇温ガスクロマトグラフ法に従って決定し、リン脂質含有量を４．３．４−１９９６ リン湿式分解法に従って、決定した。
【００５３】
【表１】
上記の結果に示されるように、実施例１〜３において調製された抽出物は、約３０〜４０％のＤＨＡ含有量および約７０％のリン脂質含有量を有した。
【００５４】
（実施例５：上記リン脂質のＰＡＦ受容体結合能活性）
実施例１〜３によって得られたリン脂質のＰＡＦ受容体結合能活性を調べた。
【００５５】
上記ＰＡＦ受容体結合能活性は、ヒト血小板を用いて、常法より行なった。具体的には、０．１２ｎＭの３Ｈ標識ＰＡＦと、実施例１〜３の各抽出物との置換反応を、３時間、２５℃で行ない、置換反応を放射能活性により測定した。ＰＡＦ受容体結合活性を有さないＤＨＡトリグリセライドをネガティブコントロールとして用いた。
【００５６】
【表２】
表２に示すようにイカおよびカツオ卵巣由来のリン脂質には、ＰＡＦ受容体結合能活性が見られた。また、リン脂質を含むがＤＨＡを含まないダイズリン脂質、およびＤＨＡを含むがリン脂質を含まないＤＨＡトリグリセライドは、ＰＡＦ受容体結合能を示さなかった。これに対して、カツオ精巣由来のサンプルは、リン脂質を含まないＤＨＡトリグリセライドと比較して有意に高い結合能を示した。
【００５７】
これらの結果から、ＰＡＦ受容体に結合してＰＡＦと競合する成分が、これらリン脂質抽出物中にあることが明らかとなった。
【００５８】
（実施例６：上記リン脂質のＰＡＦ惹起血小板凝集阻害活性）
ＰＡＦ惹起血小板凝集阻害活性を、常法より行なった。具体的には、ウサギ由来の血小板含有血漿を用いて、３７℃、５分間の血小板凝集反応を測定した。５ｎＭのＰＡＦを添加し、血小板凝集の抑制作用（アンタゴニスト活性）もしくは、単独での血小板凝集反応（アゴニスト活性）を確認した。その結果を、表３に示す。
【００５９】
【表３】
表２でＰＡＦ受容体結合能活性が見られたイカおよびカツオ卵巣由来のリン脂質は、アンタゴニスト活性であることがわかった。従って、イカ抽出物中およびカツオ卵巣抽出物中に含まれるＰＡＦ受容体結合活性を示す物質は、ＰＡＦ受容体アンタゴニストであることが実証された。
【００６０】
（実施例７：気管支喘息の治療・予防についての薬理学的効果の測定）
ＰＡＦ受容体遺伝子は既に単離されており、ＰＡＦ受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスも得られている。そして、ＰＡＦ受容体を過剰発現するマウスは、気管支喘息の病態生理学を研究するためのモデルマウスとして提唱されている。なぜなら、ＰＡＦ受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスは、メタコリン（アセチルコリンの誘導体であり気管支過敏反応をテストするときの気管支収縮剤として用いる副交感神経興奮薬）に対して過剰反応するからである（非特許文献５）。
【００６１】
（１．ＰＡＦ受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスの調製）
ＰＡＦ受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスの調製は、非特許文献５に従って、以下の様に行う。
【００６２】
モルモットのＰＡＦ受容体ｃＤＮＡを、ニワトリのβアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスの前初期エンハンサーの制御下に置く。Ｈｏｇａｎら（Ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８６））の方法を用いて、野生型の雄性マウスと交配した過剰排卵する雌性マウスの受精卵の前核に、精製したトランスジーン構築物（４．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメント）をマイクロインジェクションする。次世代マウスを４週間で離乳させ、そして、遺伝子タイピングのために、マウスの尾部からゲノムＤＮＡを調製して、ＰＣＲを行う。ＰＣＲプライマーには、正方向プライマー５’−ＡＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＡＴＣ−３’（配列番号１）と、逆方向プライマー５’−ＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＴ−３’（配列番号２）を用い、９４℃ １分間；５５℃ ２分間；７２℃ ２分間のサイクルを３０回繰り返す。トランスジーンを含む場合、２９０ｂｐの増幅産物を生じる。マウスは、空調した部屋のケージ内で、実験マウス用の餌を自由に食べさせて、飼育する。
【００６３】
上記ＰＣＲを用いるスクリーニングによってトランスジーンを含む次世代マウスを同定し、さらにそのマウスの中から生殖細胞系にトランスジーンを含むマウスを同定する。その生殖細胞系にトランスジーンを含むマウスを交配に用いて、さらに次世代マウスを調製する。尾部を用いて、マウスゲノムがトランスジーンを含むことを確認する。マウスの心臓および筋肉を用いて、トランスジーンの発現を確認する。
【００６４】
（２．肺抵抗試験）
ＰＡＦ受容体遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスと、同腹子のコントロールに、ケタミンとペントバービタルの混合物（各々２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注入することによって、麻酔する。金属性のカニューレ（内径 １．０ｍｍ）を、気管切開術を行ったマウスの気管に挿入する。マウスに対して、１５０呼吸／分の頻度、一回呼吸気量８ｍｌ／ｋｇ、３ｃｍ Ｈ２Ｏの呼気終末陽圧にて、機械的に通気する（モデル６８３；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）。正中線での胸骨切開術および肋骨の横隔膜の縁にわたる広範な横向きの切開の手段によって、胸郭を広く開く。麻酔剤（臭化パンクロニウム、０．１ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内に投与して、自発的な呼吸を消去する。実験の間、通気システムに連続的に酸素を供給する。気管圧力および気管の流れを、それぞれ、ピエゾ抵抗微小変換器（Ｅｎｄｅｖｃｏ ８５４０Ｂ−２，Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣＡ）およびフライシュ呼吸気流計（Ｎｏ．０００００，Ｍｅｔａｂｏ ＳＡ．ｌａｕｚａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定する。これらの測定結果から、総肺抵抗を、Ｂａｔｅｓらの方法（Ｒｅｓｐｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７８，３６９−３８２）に従って計算する。カニューレの抵抗を、０．２２５ｃｍＨ２Ｏ／ｍｌ／ｓであると推定して、全ての総肺抵抗から減算する。
【００６５】
ベースライン気管圧の記録後、ＰＡＦのビヒクル（生理食塩水中の０．２５％ＢＳＡ）を注入し、その後ＰＡＦ（１０μｇ／ｋｇ）を注入する。各々３．０ｍｌ／ｋｇの注入量を頚静脈を介して注入する。
【００６６】
エアロゾルは、超音波ネブライザー（Ｕｌｔｒａ−Ｎｅｂ １００，Ｄｅ Ｖｉｌｂｉｓｓ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＰＡ）を用いる。生理食塩水のエアロゾルに１分間マウスを曝露した後、一連のメタコリンエアロゾル（０．６２５〜８０ｍｇ／ｍｌ）を、１分間にわたり気管に送達する。本発明のリン脂質抽出物を５００〜２００ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｌ／ｋｇの容量で、メタコリン投与の２分前に、静脈内に注入する。ＰＡＦ受容体拮抗活性のコントロールとして、ＷＥＢ２０８６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１．０ｍｇ／ｋｇ）を用いる。
【００６７】
ネブライザー処理をしたメタコリンを、気管を通してマウスに投与した後に、総肺抵抗を計算する。用量応答曲線を作成し、それに基づいて、ＥＣ２００（ベースラインの総肺抵抗の１００％増加をもたらすために必要とされる、メタコリンの用量）を計算する。候補薬物（例えば、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤または組成物、あるいはコントロールとしてのＷＥＢ２０８６）の存在下および非存在下における、ＥＣ２００を比較する。候補薬物を予め注入した場合に、ＥＣ２００が上昇した場合、その候補薬物が、気管支喘息の治療・予防効果を有することを示す。
【００６８】
ＰＡＦ受容体遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスのみならず、野生型マウスにおいても、ＷＥＢ２０８６によるメタコリン応答に対する抑制効果が確認されている（非特許文献５）。従って、ＰＡＦ受容体遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスのみならず、野生型マウスを用いても、上記試験によって、ＰＡＦ受容体拮抗活性を測定することが可能である。
【００６９】
（実施例８：骨粗鬆症の治療・予防についての薬理学的効果の測定）
骨粗鬆症の症状としては、例えば、骨質量の減少が挙げられる。骨質量の減少は、例えば、骨の再吸収を抑制することによって、抑制することができる。従って、骨再吸収を抑制する薬剤は、骨粗鬆症の治療・予防薬として使用することができる。
【００７０】
ＰＡＦは、骨粗鬆症を進行させる効果を有する。また、ＰＡＦは、破骨細胞のアポトーシスを刺激する。破骨細胞は、骨再吸収において重要な役割を担う細胞であるため、ＰＡＦによる破骨細胞のアポトーシスの刺激によって、骨の再吸収は促進される。それとは反対に、破骨細胞のアポトーシスを抑制することによって、骨の再吸収を抑制することができる。従って、ＰＡＦによる破骨細胞アポトーシスを抑制するＰＡＦ受容体拮抗剤は、骨再吸収を抑制し、その結果、骨粗鬆症の治療効果および／または予防効果をもたらす。
【００７１】
実際に、ＷＥＢ２０８６のようなＰＡＦ受容体拮抗剤は、骨再吸収を顕著に抑制することが公知である（非特許文献６）。従って、新規のＰＡＦ受容体拮抗剤を同定することによって、新規の骨粗鬆症の治療剤・予防剤を提供することができる。単離および／または同定したＰＡＦ受容体拮抗剤が骨再吸収の抑制活性という薬理効果を有するか否かについて、以下の手法を用いて決定することができる。
【００７２】
ＰＡＦによる破骨細胞の生存率の上昇を、候補薬物（例えば、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤または組成物、あるいはコントロールとしてのＷＥＢ２０８６）の存在下および非存在下で比較する。ＰＡＦは、加水分解されやすい化合物であるため、加水分解されないＰＡＦアナログであるメチルカルバモイルＰＡＦ（ｍｃＰＡＦ）を用いることも好ましい。
【００７３】
候補化合物によって、ＰＡＦまたはＰＡＦアナログによる破骨細胞の生存率の上昇が抑制される場合、その候補化合物は、骨粗鬆症の治療効果および／または予防効果を有すると判断できる。
【００７４】
（１．破骨細胞の培養）
脾臓を、７〜８週齢の雄性マウスより単離し、４０μｍのナイロンメッシュ細胞ストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を通過させる。７〜８週齢の雌性マウスの大腿骨および脛骨から、骨髄を、洗い流す。ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦを用いる刺激によって、破骨細胞を、骨髄培養物中の造血細胞から分化させる。脾臓細胞または骨髄細胞を、１０％のＦＢＳならびに可溶性ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むαＭＥＭ中で、７日間培養する。破骨細胞に分化させるために、ＲＡＷ２６４．７マウスのマクロファージ細胞を、１０％のＦＢＳおよび可溶性ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中で、５日間培養する。培地交換の際に、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加することによって、破骨細胞を、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βで処理する。生きている破骨細胞の検出のために、細胞を、トリパンブルーで染色し、その後、１００ｍＭ Ｌ（＋／−）酒石酸（ｐＨ ５．０）存在下、０．０１％ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェートと反応させ、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（ＴＲＡＰ活性）を測定する。トリパンブルーについてネガティブであり、ＴＲＡＰについてポジティブであり、かつ３個より多い核を有する細胞を、生きている破骨細胞として計数する。
【００７５】
（２．骨芽細胞培養）
１歳齢のマウスから、頭蓋冠を切除し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％コラゲナーゼおよび０．２％ディスパーゼで１０分間、５回消化し、そして、画分２〜５からの細胞を、プールし、そして７日間、１０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ中で培養する。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウスの骨形成原細胞（理研、埼玉）も、１０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ中で培養する。培養の６日目に、ｍｃＰＡＦ（１μＭ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を培地交換の際に添加する。骨芽細胞を、サイトカイン刺激の存在下および非存在下において、さらに培養する。
【００７６】
（３．破骨細胞生存アッセイ）
マウスの骨芽細胞培養および骨髄細胞の共培養系を開発し、そして、破骨細胞機能の調節メカニズムを試験する。共培養からの骨芽細胞／間質細胞の除去は、破骨細胞のアポトーシスを誘導する。７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの大腿骨および脛骨由来のマウス骨芽細胞（１×１０６細胞／ディッシュ）およびマウス骨髄細胞（２×１０７細胞／ディッシュ）を、上記のように調製し、０．２４％のコラーゲンゲルマトリクスでコートした１０ｃｍの培養ディッシュで培養する。培養培地は、１０％ＦＢＳ，１００ｎＭ １，２５−（ＯＨ）２Ｄ３、および１μＭ ＰＧＥ２を添加したαＭＥＭを用い、２〜３日に一回培地を交換する。培養の７日後、ディッシュを、１０％のＦＢＳを含有するαＭＥＭ中の４ｍｌの０．２％コラゲナーゼで、３７℃で２０分間処理する。破骨細胞の粗調製物を、２４ウェルプレートで培養する。２時間のインキュベーションの後、プレートを０．１％コラゲナーゼおよび０．２％ディスパーゼを含有するＰＢＳで処理して、骨芽細胞／間質細胞を除去する。精製した破骨細胞を、ｍｃＰＡＦ（１μＭ）、Ｍ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）とともに、候補薬物（例えば、本発明のリン脂質抽出物、あるいはコントロールとしてのＷＥＢ２０８６）存在下で２４時間培養する。破骨細胞の生存率を計算するために、生存した破骨細胞を、インキュベーションの前後、光学顕微鏡を用いて計数する。
【００７７】
（実施例９：ＰＡＦ惹起アナフィラキシー試験）
イカリン脂質のＰＡＦ惹起による抗アナフィラキシー試験を常法により行った。具体的には、ＣＤ−１マウス（２２±２ｇ）を購入し、１週間予備飼育したマウス（２４±２ｇ）に、実施例１で調製したイカリン脂質２，０００ｍｇ／１０ｍｌ（２％ Ｔｗｅｅｎ８０溶液）／ｋｇを経口投与した。経口投与の６０分後、０．１ｍｇ／ｋｇの用量のＰＡＦ（０．１ｍｇ／１０ｍｌ（生理食塩水）／ｋｇ）を静脈内に投与し、さらに６０分後の生存率を測定した。ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとしては、イカリン脂質の代わりに、それぞれ、１０ｍｌ／ｋｇの２％Ｔｗｅｅｎ８０溶液およびＷＥＢ−２０８６（ベーリンガーインゲルハイム社）１０ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｇ／ｍｌ（２％ Ｔｗｅｅｎ８０溶液）／ｋｇ）を用いた。動物は１２時間の明暗サイクル、温度（２３−２４℃）、湿度（６０−７０％）で飼育した。５匹の動物について試験した結果を表４に示す。
【００７８】
【表４】
表４に示されるように、ＰＡＦでアナフィラキシーを起こした場合、ネガティブコントロールの２％Ｔｗｅｅｎ８０を用いた場合には２０％の生存率であったのに対して、イカリン脂質を用いた場合は６０％の生存率であった。上記の結果により、イカリン脂質はＰＡＦにより引き起こされるアナフィラキシーを処置および／または予防する効果を有することが明らかとなった。また、上記の結果は、本願発明の組成物が、生体内においてもＰＡＦ受容体拮抗剤として作用することを実証するものである。
【００７９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
以上のように、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤ならびにＰＡＦ受容体拮抗活性を有する活性成分を含有する薬学的組成物および飲食用組成物は、気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーの予防、治療剤等として利用可能である。また、特に機能性食品などに好適に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１＝ＰＣＲ正方向プライマー
配列番号２＝ＰＣＲ逆方向プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板活性化因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ， ＰＡＦ）受容体拮抗剤、およびＰＡＦ受容体拮抗剤を含む気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシーの予防および／または治療のための薬学的組成物および飲食用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＡＦは、１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンという構造を有し、血小板、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、肥満細胞、内皮細胞および種々の組織（肺、心臓、腎臓等）に作用し、炎症を引き起こす（非特許文献１）ことが知られている。
【０００３】
炎症反応における白血球とＰＡＦの関係は、種々の炎症惹起物質の刺激により、ＰＡＦは生体防御の細胞より産生される。また、ＰＡＦは白血球に作用し、細胞内顆粒酸素や活性酸素を放出させる。この結果は、ＰＡＦが炎症病態時に白血球がＰＡＦの産生細胞であると同時に受容体を有する標的細胞であることを意味している（非特許文献２）。
【０００４】
産生されたＰＡＦは、白血球に作用し、血圧低下、血小板減少、気管支収縮および血管透過性亢進を含む種々の生理作用に関与している。これらの作用は、エンドとキシンショック、糸球体腎炎、喘息、血栓症、胃潰瘍、骨粗鬆症および低血圧に関与している（非特許文献３）。また、ＰＡＦがアナフィラキシーによる死亡における重要なメディエーターであることも報告されている（非特許文献４）。
また、ＰＡＦは、喘息などアレルギー反応を亢進し、そして骨粗鬆症を進行させることが公知である。また、ＰＡＦ受容体欠損マウスにおいては、オブアルブミン感作による気管支喘息モデルおよび卵巣摘除による骨粗鬆症モデルのいずれにおいても野生型マウスと比較して病態が軽減していたことも実証されている（非特許文献５）。このことから、ＰＡＦ拮抗剤は、気管支喘息および骨粗鬆症の治療・予防薬となると考えられる。実際に、ＰＡＦ受容体拮抗剤であるＷＥＢ２０８６の投与によって、メタコリンに対する気道の応答が抑制され（非特許文献６）、また、骨再吸収が抑制されている（非特許文献７）。従って、新規のＰＡＦ受容体拮抗剤は、気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーの治療・予防薬として利用可能である。
【０００５】
ＰＡＦ受容体拮抗剤ならびにＰＡＦ受容体拮抗剤を含有する気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーの治療・予防薬の有効成分を供給するには、多大なコストと労力を要する。そのため、ＰＡＦ受容体拮抗剤ならびにＰＡＦ受容体拮抗剤を含有する気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーの治療・予防薬の有効成分を大量かつ安価に供給するための供給源を見出すことが、気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーなどの治療・予防薬、あるいは、気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーに対する薬理効果を有する飲食用組成物の提供のために求められている。また、新規のＰＡＦ受容体拮抗活性を有する物質を見出すことも求められている。
【非特許文献１】イシイ サトシおよびシミズ タカコ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年、３９：ｐ４１−８２
【非特許文献２】和久敬蔵および井上圭三編「血小板活性化因子 −生化学・生理・病理−」、１９８９年、ｐ１１５〜１２１、東京化学同人
【非特許文献３】Ｄｉａｎａ Ｍ． Ｓｔａｆｆｏｒｉｎｉ、外３名、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、２００３年、４０、ｐ６４３−６７２
【非特許文献４】フクダ ヨシアキ、外５名、「Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、２０００年２月、３９０（１−２）、ｐ２０３−７
【非特許文献５】清水孝雄 編、わかる実験医学シリーズ、脂質生物学がわかる、脂質メディエーターの機能からシグナル伝達まで、羊土社
【非特許文献６】イシイ サトシ、外８名、「Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ」、１９９７年、１６（１）、ｐ１３３−１４２
【非特許文献７】ヒキジ ヒサコ、外４名、「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｎｓｔｉｇａｔｉｏｎ」、２００４年、１４４（１）、ｐ８５−９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新規なＰＡＦ受容体拮抗剤を提供すること、ならびにそのような新規なＰＡＦ受容体拮抗剤を含有する気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシーの治療および／または予防のための組成物を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題は、イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物中に、ＰＡＦ受容体拮抗活性を有する物質が含まれていることを見出すことによって、達成された。
【０００８】
従って、一つの実施形態においては、本願発明は、イカ（例えば、イカの可食部）、魚の精巣（例えば、カツオ精巣）および／または魚卵（例えば、カツオ卵巣）の抽出物を含有する、ＰＡＦ受容体拮抗剤ならびに気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシーの治療および／または予防のための組成物を提供する。好ましくは、このＰＡＦ受容体拮抗剤ならびに薬学的組成物および飲食用組成物は、イカの可食部またはカツオ精巣・卵巣の抽出物を用いて調製される。
【０００９】
従って、本発明は以下を提供する。
（項目１） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、気管支喘息の予防または治療のための薬学的組成物。
（項目２） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目１に記載の気管支喘息の予防または治療のための薬学的組成物。
（項目３） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、骨粗鬆症の予防または治療のための薬学的組成物。
（項目４） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目３に記載の骨粗鬆症の予防または治療のための薬学的組成物。
（項目５） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、気管支喘息の予防または治療のための飲食用組成物。
（項目６） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目５に記載の気管支喘息の予防または治療のための飲食用組成物。
（項目７） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、骨粗鬆症の予防または治療のための飲食用組成物。
（項目８） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目７に記載の骨粗鬆症の予防または治療のための飲食用組成物。
（項目９） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、ＰＡＦ受容体拮抗剤。
（項目１０） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目９に記載のＰＡＦ受容体拮抗剤。
（項目１１） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、アナフィラキシーの予防または治療のための薬学的組成物。
（項目１２） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目１１に記載のアナフィラキシーの予防または治療のための薬学的組成物。
（項目１３） イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、アナフィラキシーの予防または治療のための飲食用組成物。
（項目１４） 前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、項目１３に記載のアナフィラキシーの予防または治療のための飲食用組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、新規なＰＡＦ受容体拮抗剤が提供される。さらに、本発明によって、そのような新規なＰＡＦ受容体拮抗剤を含有する気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシーの治療および／または予防のための薬学的組成物または飲食用組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１２】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１３】
本発明において使用する場合、「リン脂質抽出物」とは、所定の供給源から抽出される物質であって、リン脂質を含有する物質をいう。
【００１４】
本発明において使用する場合、「リン脂質」には、グリセロリン脂質およびスフィンゴリン脂質が包含される。
【００１５】
本発明において使用する場合、用語「スフィンゴリン脂質」とは、リンを含有するスフィンゴ脂質である。本発明において使用する場合、用語「スフィンゴ脂質」とは、スフィンゴシンなどの長鎖塩基を有する脂質をいう。スフィンゴ脂質としては、スフィンゴシンが挙げられるが、これに限定されない。
【００１６】
本明細書において使用する場合、用語「グリセロリン脂質」とは、グリセロールリン酸およびその誘導体をいう。グリセロールリン酸は、異性体として、ｓｎ−グリセロール１−リン酸、ｓｎ−グリセロール２−リン酸、およびｓｎ−グリセロール３−リン酸が存在する。生体内では、ｓｎ−グリセロール３−リン酸（すなわち、Ｌ−グリセロール３−リン酸、Ｄ−グリセロール１−リン酸、およびＬ−α−グリセロリン酸）が存在する。本明細書においてグリセロリン脂質の定義に含まれるグリセロールリン酸の誘導体としては、例えば、１位および２位に脂肪酸を結合し、グリセロールリン酸のリン酸基に、コリン、エタノールアミン、イノシトール、およびセリンなどを結合した、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジルセリン、ならびにホスファチジン酸を結合した物質が挙げられるが、これらに限定されない。これらのリゾリン脂質もまた、本発明のグリセロールリン酸の誘導体としてのグリセロリン脂質に含まれる。
【００１７】
本発明において使用するリン脂質の供給源としては、動物、植物、魚介類、藻類、微生物が挙げられる。採取効率および作業・操作の容易性等の点を考慮すれば、動物性原料または魚介類由来の原料を選択し、これから抽出することが望ましい。動物性原料としては牛、豚、鶏、アザラシ、ハープシール、オットセイ、セイウチ、トド等の各種動物臓器、ならびに魚介類を使用することが可能である。好ましい供給源は、魚介類である。
【００１８】
魚介類の供給源としては、カツオ、マグロ、イワシ等の魚類の組織が挙げられるが、これらに限定されない。魚類の組織としては、例えば、精巣および卵巣が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
魚介類のさらなる供給源としては、ケンサキイカ、コウイカ、マイカ、マツイカ、スルメイカ、ホタルイカ、ヤリイカ等のイカ組織およびこれらの皮（例えば、可食部）が挙げられるが、これらに限定されない。イカ組織から抽出して得られる油分は、本発明のリン脂質の好ましい供給源である。イカ皮（外套筋）も同様に本発明のリン脂質の好ましい供給源である。
【００２０】
本発明の「リン脂質抽出物」を抽出する方法としては、例えば、圧搾法、煮とり法、溶剤抽出法等の公知の方法を用いることができる。
【００２１】
溶剤抽出法の場合、上記供給源を何ら前処理することなく、または、上記供給源を凍結乾燥した後に、溶媒で活性成分を抽出することによって、行うことができる。溶媒としては、例えば、脂溶性有機溶剤、脂溶性有機溶剤と親水性アルコールとの混合溶剤、および親水性アルコール含有溶剤が挙げられるが、これらに限定されない。脂溶性有機溶剤としては、アセトン、ヘキサン、エーテル、および石油エーテル、ならびにこれらの組合せ等が挙げられるが、これらに限定されない。親水性アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびブタノールならびにこれらの組合せ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
溶剤抽出は、常温または加温下で、常圧または加圧下で、必要に応じて攪拌して、油分の画分を抽出することによって行われる。この抽出された油分画分は一般に原油と称せられ、グリセリドを主成分とするものであるため、これに水を添加して脱ガム処理し、分離したガム質区分を乾燥してリン脂質含量が２０〜６０重量％のリン脂質含有画分を得ることができる。あるいは、前記親水性アルコールの含水溶剤を用いて抽出すると、抽出物として前記同様のリン脂質含有油分が得られる。
【００２３】
かかる油分の分画物を得るためには、有効成分の溶剤に対する溶解性の差異を利用する液−液分離法が簡便かつ実用的である。例えば、エタノールを用いて調製された抽出物にアセトン沈殿処理を施してリン脂質含量をさらに高めた分画物を得ることができ。また、エタノール抽出物を、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤を充填したカラムクロマトグラフィー処理に供することにより、リン脂質含量が９０重量％以上の分画物を得ることもできる。
【００２４】
このようにして得られるリン脂質含有油分およびこの分画物の望ましい態様は、リン脂質の含量が２０重量％以上、より好ましくは３０重量％以上である。以下の実施例に示す方法で調製されたリン脂質では、高度不飽和脂肪酸がリン脂質の構成脂肪酸として含有されているため、魚油等の高度不飽和脂肪酸トリグリセリドと比較して酸化安定性が優れており、精製後の戻り臭や不快臭がほとんどない。
【００２５】
本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤、ならびに薬学的組成物および飲食用組成物は、前記リン脂質またはこれを含む油分を有効成分として含有する。本発明の薬学的組成物および飲食用組成物は、活性成分としてＰＡＦ受容体拮抗剤のみを単独で配合した形態、あるいはＰＡＦ受容体拮抗剤以外の活性成分と組み合わせた形態、またはＰＡＦ受容体拮抗活性を有するリン脂質以外の活性成分と組み合わせた形態において構成され、望ましくはリン脂質の含有量が２０重量％以上、さらに好ましくは３０重量％以上である。本発明の所望の効果を阻害しない範囲および程度であれば、他の公知の成分あるいは原材料を適宜に併用せしめてもよい。これらの例としてアスコルビン酸、アミノ酸、ペプチド、蛋白質およびこの分解物、各種糖質、澱粉およびこの分解物、ミネラル類、ビタミンＥ、トコフェロール、フィトステロール、カテキン、グァバ葉等のポリフェノール類等およびこれらの誘導体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２６】
これらの併用物質がアスコルビン酸パルミテート、フィトステロール、ビタミンＥ等のように油溶性の場合は、本発明に係るリン脂質またはこれを含む油分と混合して均一状態となし、また、アスコルビン酸、アミノ酸、ミネラル、蛋白質等のように水溶性ないしは水分散性の場合は、例えばその乾燥粉末を本発明に係るリン脂質またはこれを含む油分と混練して分散状態にするか、水および適宜に界面活性剤を共存させて乳化状態となすこともできる。
【００２７】
本発明では、前述のように、リン脂質を有効成分としてなるＰＡＦ受容体拮抗剤が提供されるが、さらにこの予防剤を配合してなる組成物も提供される。この組成物の態様としては医薬用組成物および食用組成物が好適である。
【００２８】
（薬学的組成物の処方）
本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与による、ＰＡＦ受容体の作用を抑制することによって治療および／または予防され得る疾患または障害（例えば、気管支喘息、骨粗鬆症、および／または、アナフィラキシー）の処置および／または予防の方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明の組成物を意味する。
【００２９】
治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ＧＭＰ＝ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【００３０】
一般的提案として、用量当り、経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約２μｇ／ｋｇ／日〜４０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤について、この用量は、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約２０ｍｇ／ｋｇ／日と約４０ｍｇ／ｋｇ／日との間である。また、一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約０．２μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤について、この用量は、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約５ｍｇ／ｋｇ／日と約１０ｍｇ／ｋｇ／日との間である。
【００３１】
治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。本発明の薬学的組成物の代表的投与経路は、経口投与である。
【００３２】
「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。
【００３３】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【００３４】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【００３５】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５： １６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【００３６】
徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の治療剤を包含する（一般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出 願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適治療剤のために調整される。
【００３７】
なおさらなる実施態様において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達されうる（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【００３８】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。
【００３９】
非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、治療剤は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【００４０】
一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【００４１】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００４２】
治療剤は、代表的には約１００ｍｇ／ｍｌ〜２，０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５００〜２，０００ｍｇ／ｍｌの濃度で、約６〜９のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、塩が形成されることが理解される。
【００４３】
治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、有効成分としてのウイルス以外の生物・ウイルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
【００４４】
治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した５％（ｗ／ｖ）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【００４５】
本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【００４６】
本発明の治療剤は、単独または他の治療剤と組合わせて投与され得る。組合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々の投与をさらに含む。
【００４７】
本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤の製剤化にあたっては、前述の抽出物をそのまま使用してもよいが、これをさらに分画処理して有効成分であるリン脂質をより高濃度に含有する分画物として用いてもよい。
【００４８】
（飲食用組成物の製造）
本発明の好適な態様は飲食用組成物である。すなわち、前述のようにして得られるリン脂質を有効成分として含むＰＡＦ受容体拮抗剤あるいは薬学的組成物または飲食用組成物は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、コーヒー、紅茶、日本茶、ウーロン茶、野菜ジュース、天然果汁、乳飲料、牛乳、豆乳、スポーツ飲料、ニアウォーター系飲料、栄養補給飲料、コーヒー飲料、ココア、スープ、ドレッシング、ムース、ゼリー、ヨーグルト、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、加工乳、スポーツドリンク、栄養ドリンク、ケーキミックス、パン、ピザ、パイ、クラッカー、ビスケット、ケーキ、クッキー、スパゲティー、マカロニ、パスタ、うどん、そば、ラーメン、キャンデー、ソフトキャンデー、ガム、チョコレート、おかき、ポテトチップス、スナック、アイスクリーム、シャーベット、クリーム、チーズ、粉乳、練乳、乳飲料などの粉末状または液状の乳製品、饅頭、ういろ、もち、おはぎ、醤油、たれ、麺つゆ、ソース、だしの素、シチューの素、スープの素、複合調味料、カレーの素、マヨネーズ、ケチャップ、レトルトカレー、レトルトシチュー、レトルトスープ、レトルトどんぶり、缶詰、ハム、ハンバーグ、ミートボール、コロッケ、餃子、ピラフ、おにぎり、冷凍食品および冷蔵食品、ちくわ、蒲鉾、弁当のご飯、寿司、乳児用ミルク、離乳食、ベビーフード、スポーツ食品、栄養補助食品、サプリメント、健康食品等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦型剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。これらの食品類あるいは飲食用組成物における本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤またはこれを含む抽出物の配合量は、当該食品や組成物の種類や状態等により一律に規定しがたいが、約０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％である。配合量が０．０１重量％未満では経口摂取による所望の効果が小さく、５０重量％を超えると食品の種類によっては風味を損なったり当該食品を調製できなくなる場合がある。なお、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤活性を有する抽出物は、これをそのまま食用に供してもさしつかえない。
【００４９】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
（実施例１：イカ可食部よりの抽出物の調製）
イカの可食部を凍結乾燥で乾燥した。乾燥スルメイカ１００ｇに純度９９％のエタノール８００ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾過した後、残渣に純度９９％のエタノール３５０ｍＬを加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾液を合わせて濃縮し、イカ抽出物を１３ｇ得た。イカ抽出物からアセトン沈殿により、イカリン脂質６ｇを得た。
【００５１】
（実施例２：カツオ卵巣よりの抽出物の調製）
カツオ卵巣を凍結乾燥で乾燥した。乾燥カツオ卵巣１００ｇに純度９９％のエタノール８００ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾過した後、残渣に純度９９％のエタノール３５０ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾液を合わせて濃縮し、カツオ卵巣抽出物１４ｇ得た。カツオ卵巣抽出物からアセトン沈殿によりカツオ卵巣リン脂質７ｇを得た。
【００５２】
（実施例３：カツオ精巣よりの抽出物の調製）
カツオ精巣を凍結乾燥で乾燥した。乾燥カツオ精巣１００ｇに純度９９％のエタノール８００ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾過した後、残渣に純度９９％のエタノール３５０ｍＬ加え、６０℃で２時間抽出を行った。濾液を合わせて濃縮し、カツオ精巣抽出物９ｇ得た。カツオ精巣抽出物からアセトン沈殿によりカツオ精巣リン脂質５ｇを得た。
（実施例４：各種供給源由来の抽出物の比較）
上記実施例１〜３によって単離された抽出物、ならびにコントロールとしての大豆リン脂質（辻製油（株）三重県松阪市、およびＤＨＡトリグリセライド（備前化成（株）岡山県赤磐市）のＤＨＡ含有量およびリン脂質含有量を日本油化学会制定基準油脂分析試験法（財団法人 日本油化学会）に従って、決定した。具体的には、ＤＨＡ含有量を２．４．２．２−１９９６ 脂肪酸組成ＦＩＤ昇温ガスクロマトグラフ法に従って決定し、リン脂質含有量を４．３．４−１９９６ リン湿式分解法に従って、決定した。
【００５３】
【表１】
上記の結果に示されるように、実施例１〜３において調製された抽出物は、約３０〜４０％のＤＨＡ含有量および約７０％のリン脂質含有量を有した。
【００５４】
（実施例５：上記リン脂質のＰＡＦ受容体結合能活性）
実施例１〜３によって得られたリン脂質のＰＡＦ受容体結合能活性を調べた。
【００５５】
上記ＰＡＦ受容体結合能活性は、ヒト血小板を用いて、常法より行なった。具体的には、０．１２ｎＭの３Ｈ標識ＰＡＦと、実施例１〜３の各抽出物との置換反応を、３時間、２５℃で行ない、置換反応を放射能活性により測定した。ＰＡＦ受容体結合活性を有さないＤＨＡトリグリセライドをネガティブコントロールとして用いた。
【００５６】
【表２】
表２に示すようにイカおよびカツオ卵巣由来のリン脂質には、ＰＡＦ受容体結合能活性が見られた。また、リン脂質を含むがＤＨＡを含まないダイズリン脂質、およびＤＨＡを含むがリン脂質を含まないＤＨＡトリグリセライドは、ＰＡＦ受容体結合能を示さなかった。これに対して、カツオ精巣由来のサンプルは、リン脂質を含まないＤＨＡトリグリセライドと比較して有意に高い結合能を示した。
【００５７】
これらの結果から、ＰＡＦ受容体に結合してＰＡＦと競合する成分が、これらリン脂質抽出物中にあることが明らかとなった。
【００５８】
（実施例６：上記リン脂質のＰＡＦ惹起血小板凝集阻害活性）
ＰＡＦ惹起血小板凝集阻害活性を、常法より行なった。具体的には、ウサギ由来の血小板含有血漿を用いて、３７℃、５分間の血小板凝集反応を測定した。５ｎＭのＰＡＦを添加し、血小板凝集の抑制作用（アンタゴニスト活性）もしくは、単独での血小板凝集反応（アゴニスト活性）を確認した。その結果を、表３に示す。
【００５９】
【表３】
表２でＰＡＦ受容体結合能活性が見られたイカおよびカツオ卵巣由来のリン脂質は、アンタゴニスト活性であることがわかった。従って、イカ抽出物中およびカツオ卵巣抽出物中に含まれるＰＡＦ受容体結合活性を示す物質は、ＰＡＦ受容体アンタゴニストであることが実証された。
【００６０】
（実施例７：気管支喘息の治療・予防についての薬理学的効果の測定）
ＰＡＦ受容体遺伝子は既に単離されており、ＰＡＦ受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスも得られている。そして、ＰＡＦ受容体を過剰発現するマウスは、気管支喘息の病態生理学を研究するためのモデルマウスとして提唱されている。なぜなら、ＰＡＦ受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスは、メタコリン（アセチルコリンの誘導体であり気管支過敏反応をテストするときの気管支収縮剤として用いる副交感神経興奮薬）に対して過剰反応するからである（非特許文献５）。
【００６１】
（１．ＰＡＦ受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスの調製）
ＰＡＦ受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスの調製は、非特許文献５に従って、以下の様に行う。
【００６２】
モルモットのＰＡＦ受容体ｃＤＮＡを、ニワトリのβアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスの前初期エンハンサーの制御下に置く。Ｈｏｇａｎら（Ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８６））の方法を用いて、野生型の雄性マウスと交配した過剰排卵する雌性マウスの受精卵の前核に、精製したトランスジーン構築物（４．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメント）をマイクロインジェクションする。次世代マウスを４週間で離乳させ、そして、遺伝子タイピングのために、マウスの尾部からゲノムＤＮＡを調製して、ＰＣＲを行う。ＰＣＲプライマーには、正方向プライマー５’−ＡＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＡＴＣ−３’（配列番号１）と、逆方向プライマー５’−ＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＴ−３’（配列番号２）を用い、９４℃ １分間；５５℃ ２分間；７２℃ ２分間のサイクルを３０回繰り返す。トランスジーンを含む場合、２９０ｂｐの増幅産物を生じる。マウスは、空調した部屋のケージ内で、実験マウス用の餌を自由に食べさせて、飼育する。
【００６３】
上記ＰＣＲを用いるスクリーニングによってトランスジーンを含む次世代マウスを同定し、さらにそのマウスの中から生殖細胞系にトランスジーンを含むマウスを同定する。その生殖細胞系にトランスジーンを含むマウスを交配に用いて、さらに次世代マウスを調製する。尾部を用いて、マウスゲノムがトランスジーンを含むことを確認する。マウスの心臓および筋肉を用いて、トランスジーンの発現を確認する。
【００６４】
（２．肺抵抗試験）
ＰＡＦ受容体遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスと、同腹子のコントロールに、ケタミンとペントバービタルの混合物（各々２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注入することによって、麻酔する。金属性のカニューレ（内径 １．０ｍｍ）を、気管切開術を行ったマウスの気管に挿入する。マウスに対して、１５０呼吸／分の頻度、一回呼吸気量８ｍｌ／ｋｇ、３ｃｍ Ｈ２Ｏの呼気終末陽圧にて、機械的に通気する（モデル６８３；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）。正中線での胸骨切開術および肋骨の横隔膜の縁にわたる広範な横向きの切開の手段によって、胸郭を広く開く。麻酔剤（臭化パンクロニウム、０．１ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内に投与して、自発的な呼吸を消去する。実験の間、通気システムに連続的に酸素を供給する。気管圧力および気管の流れを、それぞれ、ピエゾ抵抗微小変換器（Ｅｎｄｅｖｃｏ ８５４０Ｂ−２，Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣＡ）およびフライシュ呼吸気流計（Ｎｏ．０００００，Ｍｅｔａｂｏ ＳＡ．ｌａｕｚａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定する。これらの測定結果から、総肺抵抗を、Ｂａｔｅｓらの方法（Ｒｅｓｐｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７８，３６９−３８２）に従って計算する。カニューレの抵抗を、０．２２５ｃｍＨ２Ｏ／ｍｌ／ｓであると推定して、全ての総肺抵抗から減算する。
【００６５】
ベースライン気管圧の記録後、ＰＡＦのビヒクル（生理食塩水中の０．２５％ＢＳＡ）を注入し、その後ＰＡＦ（１０μｇ／ｋｇ）を注入する。各々３．０ｍｌ／ｋｇの注入量を頚静脈を介して注入する。
【００６６】
エアロゾルは、超音波ネブライザー（Ｕｌｔｒａ−Ｎｅｂ １００，Ｄｅ Ｖｉｌｂｉｓｓ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＰＡ）を用いる。生理食塩水のエアロゾルに１分間マウスを曝露した後、一連のメタコリンエアロゾル（０．６２５〜８０ｍｇ／ｍｌ）を、１分間にわたり気管に送達する。本発明のリン脂質抽出物を５００〜２００ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｌ／ｋｇの容量で、メタコリン投与の２分前に、静脈内に注入する。ＰＡＦ受容体拮抗活性のコントロールとして、ＷＥＢ２０８６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１．０ｍｇ／ｋｇ）を用いる。
【００６７】
ネブライザー処理をしたメタコリンを、気管を通してマウスに投与した後に、総肺抵抗を計算する。用量応答曲線を作成し、それに基づいて、ＥＣ２００（ベースラインの総肺抵抗の１００％増加をもたらすために必要とされる、メタコリンの用量）を計算する。候補薬物（例えば、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤または組成物、あるいはコントロールとしてのＷＥＢ２０８６）の存在下および非存在下における、ＥＣ２００を比較する。候補薬物を予め注入した場合に、ＥＣ２００が上昇した場合、その候補薬物が、気管支喘息の治療・予防効果を有することを示す。
【００６８】
ＰＡＦ受容体遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスのみならず、野生型マウスにおいても、ＷＥＢ２０８６によるメタコリン応答に対する抑制効果が確認されている（非特許文献５）。従って、ＰＡＦ受容体遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスのみならず、野生型マウスを用いても、上記試験によって、ＰＡＦ受容体拮抗活性を測定することが可能である。
【００６９】
（実施例８：骨粗鬆症の治療・予防についての薬理学的効果の測定）
骨粗鬆症の症状としては、例えば、骨質量の減少が挙げられる。骨質量の減少は、例えば、骨の再吸収を抑制することによって、抑制することができる。従って、骨再吸収を抑制する薬剤は、骨粗鬆症の治療・予防薬として使用することができる。
【００７０】
ＰＡＦは、骨粗鬆症を進行させる効果を有する。また、ＰＡＦは、破骨細胞のアポトーシスを刺激する。破骨細胞は、骨再吸収において重要な役割を担う細胞であるため、ＰＡＦによる破骨細胞のアポトーシスの刺激によって、骨の再吸収は促進される。それとは反対に、破骨細胞のアポトーシスを抑制することによって、骨の再吸収を抑制することができる。従って、ＰＡＦによる破骨細胞アポトーシスを抑制するＰＡＦ受容体拮抗剤は、骨再吸収を抑制し、その結果、骨粗鬆症の治療効果および／または予防効果をもたらす。
【００７１】
実際に、ＷＥＢ２０８６のようなＰＡＦ受容体拮抗剤は、骨再吸収を顕著に抑制することが公知である（非特許文献６）。従って、新規のＰＡＦ受容体拮抗剤を同定することによって、新規の骨粗鬆症の治療剤・予防剤を提供することができる。単離および／または同定したＰＡＦ受容体拮抗剤が骨再吸収の抑制活性という薬理効果を有するか否かについて、以下の手法を用いて決定することができる。
【００７２】
ＰＡＦによる破骨細胞の生存率の上昇を、候補薬物（例えば、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤または組成物、あるいはコントロールとしてのＷＥＢ２０８６）の存在下および非存在下で比較する。ＰＡＦは、加水分解されやすい化合物であるため、加水分解されないＰＡＦアナログであるメチルカルバモイルＰＡＦ（ｍｃＰＡＦ）を用いることも好ましい。
【００７３】
候補化合物によって、ＰＡＦまたはＰＡＦアナログによる破骨細胞の生存率の上昇が抑制される場合、その候補化合物は、骨粗鬆症の治療効果および／または予防効果を有すると判断できる。
【００７４】
（１．破骨細胞の培養）
脾臓を、７〜８週齢の雄性マウスより単離し、４０μｍのナイロンメッシュ細胞ストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を通過させる。７〜８週齢の雌性マウスの大腿骨および脛骨から、骨髄を、洗い流す。ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦを用いる刺激によって、破骨細胞を、骨髄培養物中の造血細胞から分化させる。脾臓細胞または骨髄細胞を、１０％のＦＢＳならびに可溶性ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むαＭＥＭ中で、７日間培養する。破骨細胞に分化させるために、ＲＡＷ２６４．７マウスのマクロファージ細胞を、１０％のＦＢＳおよび可溶性ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中で、５日間培養する。培地交換の際に、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加することによって、破骨細胞を、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βで処理する。生きている破骨細胞の検出のために、細胞を、トリパンブルーで染色し、その後、１００ｍＭ Ｌ（＋／−）酒石酸（ｐＨ ５．０）存在下、０．０１％ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェートと反応させ、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（ＴＲＡＰ活性）を測定する。トリパンブルーについてネガティブであり、ＴＲＡＰについてポジティブであり、かつ３個より多い核を有する細胞を、生きている破骨細胞として計数する。
【００７５】
（２．骨芽細胞培養）
１歳齢のマウスから、頭蓋冠を切除し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％コラゲナーゼおよび０．２％ディスパーゼで１０分間、５回消化し、そして、画分２〜５からの細胞を、プールし、そして７日間、１０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ中で培養する。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウスの骨形成原細胞（理研、埼玉）も、１０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ中で培養する。培養の６日目に、ｍｃＰＡＦ（１μＭ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を培地交換の際に添加する。骨芽細胞を、サイトカイン刺激の存在下および非存在下において、さらに培養する。
【００７６】
（３．破骨細胞生存アッセイ）
マウスの骨芽細胞培養および骨髄細胞の共培養系を開発し、そして、破骨細胞機能の調節メカニズムを試験する。共培養からの骨芽細胞／間質細胞の除去は、破骨細胞のアポトーシスを誘導する。７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの大腿骨および脛骨由来のマウス骨芽細胞（１×１０６細胞／ディッシュ）およびマウス骨髄細胞（２×１０７細胞／ディッシュ）を、上記のように調製し、０．２４％のコラーゲンゲルマトリクスでコートした１０ｃｍの培養ディッシュで培養する。培養培地は、１０％ＦＢＳ，１００ｎＭ １，２５−（ＯＨ）２Ｄ３、および１μＭ ＰＧＥ２を添加したαＭＥＭを用い、２〜３日に一回培地を交換する。培養の７日後、ディッシュを、１０％のＦＢＳを含有するαＭＥＭ中の４ｍｌの０．２％コラゲナーゼで、３７℃で２０分間処理する。破骨細胞の粗調製物を、２４ウェルプレートで培養する。２時間のインキュベーションの後、プレートを０．１％コラゲナーゼおよび０．２％ディスパーゼを含有するＰＢＳで処理して、骨芽細胞／間質細胞を除去する。精製した破骨細胞を、ｍｃＰＡＦ（１μＭ）、Ｍ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）とともに、候補薬物（例えば、本発明のリン脂質抽出物、あるいはコントロールとしてのＷＥＢ２０８６）存在下で２４時間培養する。破骨細胞の生存率を計算するために、生存した破骨細胞を、インキュベーションの前後、光学顕微鏡を用いて計数する。
【００７７】
（実施例９：ＰＡＦ惹起アナフィラキシー試験）
イカリン脂質のＰＡＦ惹起による抗アナフィラキシー試験を常法により行った。具体的には、ＣＤ−１マウス（２２±２ｇ）を購入し、１週間予備飼育したマウス（２４±２ｇ）に、実施例１で調製したイカリン脂質２，０００ｍｇ／１０ｍｌ（２％ Ｔｗｅｅｎ８０溶液）／ｋｇを経口投与した。経口投与の６０分後、０．１ｍｇ／ｋｇの用量のＰＡＦ（０．１ｍｇ／１０ｍｌ（生理食塩水）／ｋｇ）を静脈内に投与し、さらに６０分後の生存率を測定した。ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとしては、イカリン脂質の代わりに、それぞれ、１０ｍｌ／ｋｇの２％Ｔｗｅｅｎ８０溶液およびＷＥＢ−２０８６（ベーリンガーインゲルハイム社）１０ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｇ／ｍｌ（２％ Ｔｗｅｅｎ８０溶液）／ｋｇ）を用いた。動物は１２時間の明暗サイクル、温度（２３−２４℃）、湿度（６０−７０％）で飼育した。５匹の動物について試験した結果を表４に示す。
【００７８】
【表４】
表４に示されるように、ＰＡＦでアナフィラキシーを起こした場合、ネガティブコントロールの２％Ｔｗｅｅｎ８０を用いた場合には２０％の生存率であったのに対して、イカリン脂質を用いた場合は６０％の生存率であった。上記の結果により、イカリン脂質はＰＡＦにより引き起こされるアナフィラキシーを処置および／または予防する効果を有することが明らかとなった。また、上記の結果は、本願発明の組成物が、生体内においてもＰＡＦ受容体拮抗剤として作用することを実証するものである。
【００７９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
以上のように、本発明のＰＡＦ受容体拮抗剤ならびにＰＡＦ受容体拮抗活性を有する活性成分を含有する薬学的組成物および飲食用組成物は、気管支喘息、骨粗鬆症、および、アナフィラキシーの予防、治療剤等として利用可能である。また、特に機能性食品などに好適に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１＝ＰＣＲ正方向プライマー
配列番号２＝ＰＣＲ逆方向プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、気管支喘息の予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項２】
前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、請求項１に記載の気管支喘息の予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項３】
イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、骨粗鬆症の予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項４】
前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、請求項３に記載の骨粗鬆症の予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項５】
イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、ＰＡＦ受容体拮抗剤。
【請求項６】
前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、請求項５に記載のＰＡＦ受容体拮抗剤。
【請求項７】
イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、アナフィラキシーの予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項８】
前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、請求項７に記載のアナフィラキシーの予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項１】
イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、気管支喘息の予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項２】
前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、請求項１に記載の気管支喘息の予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項３】
イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、骨粗鬆症の予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項４】
前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、請求項３に記載の骨粗鬆症の予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項５】
イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、ＰＡＦ受容体拮抗剤。
【請求項６】
前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、請求項５に記載のＰＡＦ受容体拮抗剤。
【請求項７】
イカリン脂質抽出物、カツオ精巣リン脂質抽出物およびカツオ卵巣リン脂質抽出物からなる群から選択されるリン脂質抽出物を含有する、アナフィラキシーの予防または治療のための飲食用組成物。
【請求項８】
前記リン脂質抽出物がエタノール抽出物である、請求項７に記載のアナフィラキシーの予防または治療のための飲食用組成物。
【公開番号】特開２００７−１４５８１４（Ｐ２００７−１４５８１４Ａ）
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８５５２３（Ｐ２００６−２８５５２３）
【出願日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（３９１００７３５６）備前化成株式会社 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（３９１００７３５６）備前化成株式会社 (16)
【Ｆターム（参考）】
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