血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤
【課題】 血糖値の上昇の抑制あるいはフリーラジカルや活性酸素による酸化ストレスの抑制を行うことができる血糖上昇抑制剤又は抗酸化剤を提供する。
【解決手段】 ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分とする。
【解決手段】 ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖値の上昇を抑制するための血糖上昇抑制剤及びフリーラジカルや活性酸素（スーパーオキシドなど）による酸化ストレスを抑制するための抗酸化剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者等は、ツユクサ(Commelina communis L)及びオオボウシバナ(Commelina communis L. var. hortensis)についての食後血糖値上昇抑制効果を見出し、その有効成分（活性成分）がα−グルコシターゼ（α−glucosidase）の阻害活性を示す１−デオキシノジリマイシン(1-deoxynojirimycin、「ＤＮＪ」と略称する)と２，５−ビスハイドロキシメチル−３，４−ジハイドロキシピロリジン(2,5-bishydoroxymethyl-3,4-dihydoroxy pyrrolidine、「ＤＭＤＰ」と略称する)であることを明らかにし、特許出願すると共に特許を受けている（特許文献１〜３参照）。
【０００３】
そして、本発明者等はさらにツユクサ及びオオボウシバナ並びにこれらが属する他のツユクサ科コンメリナ属植物について研究を行ない、新規な血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤を発明した。
【特許文献１】特開２００１−１１８４６９号公報
【特許文献２】特開２００３−４１５３６３号公報（特許第３５７５７６６号公報）
【特許文献３】特開２００１−１１８４６９号公報（特許第３５８１６７０号公報）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、血糖値の上昇を抑制することができる血糖上昇抑制剤を提供することを目的とするものである。
【０００５】
また、本発明は、フリーラジカルや活性酸素による酸化ストレスを抑制することができる抗酸化剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分として成ることを特徴とするものである。
【０００７】
また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物が、オオボウシバナ、ツユクサ、マルバツユクサ、シマツユクサ、ホウライツユクサから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とするものである。
【０００８】
また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物からの抽出物であることを特徴とするものである。
【０００９】
さらに、本発明の血糖上昇抑制剤は、フラボノイドが、イソクェルシトリン、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド、ビテキシン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とするものである。
【００１０】
加えて、本発明の血糖上昇抑制剤は、有効成分として１−デオキシノジリマイシンと２，５−ビスハイドロキシメチル−３，４−ジハイドロキシピロリジンの少なくとも一方を含有して成ることを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明の抗酸化剤は、フラボノイドが、オリエンチン、ビテキシン、イソオリエンチン、イソビテキシン、フラボコンメリン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の血糖上昇抑制剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドによりα−グルコシターゼの作用を阻害することができ、血糖値の上昇を抑制することができるものである。また、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドの多くは、糖部（グリコシル基）が炭素に直接結合したＣ配糖体であって、糖部が切断されにくくて水に溶解し易いものであり、水あるいは熱水抽出して飲用することにより、容易に体内に摂取することができるものである。
【００１３】
本発明の抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドによりフリーラジカルや活性酸素の作用を阻害することができ、これらによる酸化ストレスを抑制することができるものである。また、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドの多くは、糖部（グリコシル基）が炭素に直接結合したＣ配糖体であって、糖部が切断されにくくて水に溶解し易いものであり、水あるいは熱水抽出して飲用することにより、容易に体内に摂取することができるものである。
【００１４】
また、ツユクサ科コンメリナ属植物として、オオボウシバナ、ツユクサ、マルバツユクサ、シマツユクサ、ホウライツユクサから選ばれる少なくとも一つを用いることにより、α−グルコシターゼの作用を阻害するフラボノイドやフリーラジカルや活性酸素の作用を阻害するフラボノイドを容易に得ることができるものである。
【００１５】
また、ツユクサ科コンメリナ属植物からの抽出物を用いることによって、フラボノイド以外の成分を除去してフラボノイドの濃度を高めることができ、少量の摂取量で血糖上昇抑制効果及び抗酸化効果を得ることができるものである。
【００１６】
さらに、本発明の血糖上昇抑制剤は、フラボノイドが、イソクェルシトリン、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド、ビテキシン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つによって、血糖値の上昇を抑制することができるものである。
【００１７】
加えて、本発明の血糖上昇抑制剤は、有効成分として１−デオキシノジリマイシンと２，５−ビスハイドロキシメチル−３，４−ジハイドロキシピロリジンの少なくとも一方を含有することにより、フラボノイドとの相乗効果により高い血糖上昇抑制効果を得ることができるものである。
【００１８】
また、本発明の抗酸化剤は、フラボノイドが、オリエンチン、ビテキシン、イソオリエンチン、イソビテキシン、フラボコンメリン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つによって、フリーラジカルや活性酸素の作用による酸化ストレスを抑制することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための最良の形態を説明する。
【００２０】
本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分として含有するものである。
【００２１】
ツユクサ科コンメリナ属植物としては、オオボウシバナ(C. communis L. var. hortensis Makino)、ツユクサ(Commelina communis L.)、マルバツユクサ(C. benghalensis L.)、シマツユクサ(C. diffusa Burm. fil.)、ホウライツユクサ(C. auriculata Blume)から選ばれる一種類を用いたりあるいは二種類以上を併用したりすることができる。
【００２２】
また、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドはフラボノイド配糖体であって、例えば、イソクェルシトリン（下記化学式（１））、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド（下記化学式（２））、グルコルテオリン（下記化学式（３））、オリエンチン（下記化学式（４））、ビテキシン（下記化学式（５））、クリソリオール−７−ｏ−β−Ｄ−グルコサイド（下記化学式（６））、スウェルチシン（下記化学式（７））、フラボコンメリン（下記化学式（８））、イソオリエンチン（下記化学式（９））、イソビテキシン（下記化学式（１０））などである。以下にこれら十種類のフラボノイドの化学構造式を示す。
【００２３】
【化１】
【００２４】
尚、化学式中のＧｌｃはグルコシル基、Ｍｅはメチル基、Ｒｈａｍはラムノシル基をそれぞれ示す。
【００２５】
上記の化学式から明らかなように、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドの多くは、糖部（グリコシル基）が炭素に直接結合したＣ配糖体であり、多くの植物がＯ配糖体を主成分とするのに対して特徴的である。このため、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドは、糖部が切断されにくくて水に溶解し易いものであり、水抽出しても沈殿しにくいものであり、従って、水あるいは熱水抽出して茶飲料と同様に飲用することにより、容易に体内に摂取することができるものである。
【００２６】
そして、上記フラボノイドの中でイソクェルシトリン、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド、ビテキシン、スウェルチシンがα−グルコシターゼの作用を阻害する活性を有し、また、上記フラボノイドの中でオリエンチン、ビテキシン、イソオリエンチン、イソビテキシン、フラボコンメリン、スウェルチシンがフリーラジカル（ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）など）や活性酸素（スーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）や過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）など）の作用を阻害する活性を有するものである。
【００２７】
上記のフラボノイドはツユクサ科コンメリナ属植物の地上部（花、葉、茎など）や地下部（根など）に含まれている。従って、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤はこれら地上部や地下部をそのままであるいは乾燥した後、適当な大きさ（１０〜２０ｍｍ）に切断・粉砕することにより得ることができる。
【００２８】
また、上記のフラボノイドはツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部から抽出することができ、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤はこれらの抽出物を含んで調製することができる。ツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部から上記のフラボノイドを抽出するにあたっては、例えば、ツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部をそのままであるいは乾燥した後、必要に応じて適当な大きさ（１０〜２０ｍｍ）に切断・粉砕し、この切断、粉砕物を溶媒に浸漬した後、還流抽出あるいは静置抽出することによって、上記のフラボノイドを溶媒に抽出することができる。ここで、上記の溶媒としては水、アルコール、水とアルコールの混合溶媒を用いることができる。水を溶媒として用いる場合は常温以上の熱水であっても良い。また、アルコールを溶媒として用いる場合は、メタノール、エタノールなどを単独であるいは複数種混合して用いることができる。また、水とアルコールの混合溶媒を用いる場合は、両者を任意の割合で混合したものを用いることができるが、例えば、アルコール濃度が５〜９５％、好ましくは６５〜７５％のものを用いるようにする。さらに、抽出時の溶媒の温度は６０〜８０℃に、抽出時の浸漬時間は６０〜１２０分間にそれぞれ設定することができるが、これに限定されるものではない。また、上記の溶媒はツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部の１ｇに対して３〜２００ｍＬ、好ましくは５〜３０ｍＬの割合で配合して抽出を行うことができる。尚、本発明では処理のしやすさなどを考慮してツユクサ科コンメリナ属植物の地上部を好適に用いることができる。
【００２９】
本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部から上記のフラボノイドを溶媒で抽出して得られる抽出液をそのままで用いたりあるいは適当な濃度に希釈したりすることにより得ることができる。この時、抽出液中の不純物は濾過により除去するのが好ましい。また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、抽出液（濾過により不純物を除去したものも含む）中の溶媒を除去することにより乾燥エキスとして得ることができる。さらに、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は上記の乾燥エキスを水やアルコールなどの溶媒に溶解して調製することができる。
【００３０】
本発明では上記の抽出液から単離精製した上記各フラボノイドをそれぞれ単独であるいは複数種混合して血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤として用いることができる。上記の抽出液から各フラボノイドを単離精製するにあたっては、既知の方法を採用することができ、例えば、逆相のシリカゲルなどを備えたクロマトグラフィーを用いた分画方法を挙げることができ、この場合、上記各フラボノイドは水溶性画分として得ることができる。
【００３１】
また、本発明の血糖上昇抑制剤は上記フラボノイドとともに、ＤＮＪとＤＭＤＰの一方あるいは両方を含有するのが好ましく、この場合、フラボノイド及びＤＮＪとＤＭＤＰの相乗効果によりα−グルコシターゼの作用を阻害する効果を向上させることができ、高い血糖上昇抑制効果を得ることができる。ここで、α−グルコシターゼに対して阻害を示したフラボノイド（上記化学式（１）（２）（５）（７））は非拮抗阻害剤であることが考えられる。一方、ツユクサ科コンメリナ属植物に含有されるＤＮＪやＤＭＤＰは糖類似構造を有しており，酵素との拮抗阻害剤である。また、ツユクサやオオボウシバナなどのツユクサ科コンメリナ属植物の水抽出エキスや乾燥エキス（粉末）が、動物実験において、ＤＮＪやＤＭＤＰの含有濃度から予想される効果より強い効果を示す。これらの事実からフラボノイド配糖体がα-グルコシダーゼに対して作用部位の違いからＤＮＪやＤＭＤＰと相乗的に作用していることが推定される。尚、ＤＮＪやＤＭＤＰはツユクサ科コンメリナ属植物（特にツユクサとオオボウシバナ）から得られる上記抽出液中に含有されているために、この抽出液をフラボノイドとＤＮＪとＤＭＤＰを含有する本発明の血糖上昇抑制剤とすることができる。
【００３２】
また、ツユクサ科コンメリナ属植物に含有されるフラボノイドは、フラボンの複素環骨格に単数あるいは複数の水酸基を有しているので、抗酸化剤として作用するものである。
【００３３】
本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、そのまま飲食することにより体内に摂取することができる。この場合、血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤に含まれているフラボノイドの摂取量は任意ではあるが、体重６０ｋｇの成人においてフラボノイドの摂取量が２０〜６０ｍｇとなるようにするのが好ましく、これにより、血糖値の上昇抑制効果及び酸化ストレスの抑制効果を高く得ることができる。
【００３４】
また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤を既知の食品等に配合することにより、機能性食品とすることができる。例えば、口腔用組成物（ガム、キャンデーなど）やかまぼこ、ちくわなどの加工水産ねり製品、ソーセージ、ハムなどの畜産製品、洋菓子類、和菓子類、生めん、中華めん、ゆでめん、ソバなどのめん類、ソース、醤油、タレ、砂糖、ハチミツ、粉末あめ、水あめなどの調味料、カレー粉、からし粉、コショウ粉などの香辛料、ジャム、マーマレード、チョコレートスプレッド、漬物、そう菜、ふりかけや、各種野菜・果実の缶詰・瓶詰など加工野菜・果実類、チーズ、バター、ヨーグルトなど乳製品、みそ汁、スープ、果実ジュース、野菜ジュース、乳清飲料、清涼飲料、酒類などの飲料、茶葉、その他、健康食品など一般的な飲食品類への使用を例示することができる。また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤を既知の賦形材やカプセル材を用いて各種の内用・外用製剤類（動物用に使用する製剤も含む）のように、アンプル状、カプセル状、丸剤、錠剤状、粉末状、顆粒状、固形状、液状、ゲル状あるいは気泡性のように形成することができる。
【実施例】
【００３５】
以下本発明を実施例によって具体的に説明する。
【００３６】
（実施例１）
乾燥した草津産オオボウシバナ２００ｇを熱水（約５Ｌ、温度８０〜９５℃）で２時間抽出し、その抽出液を濾過後に減圧下で濃縮し、熱水抽出エキスを約２２ｇを得た。この熱水抽出エキスは上記化学式（１）〜（１０）に示す全てのフラボノイドとＤＮＪとＤＭＤＰとが含有された熱水抽出エキスである。
【００３７】
（実施例２〜１１）
草津産オオボウシバナ１．２ｋｇを７０％エタノール水溶液２０Ｌで還流抽出し、その抽出液を減圧下で濃縮し、エキス（抽出物）約１００ｇを得た。このエキスをダイヤイオンＨＰ−２０カラム（７００ｇ）に通導し、Ｈ２Ｏ溶出画分、ＭｅＯＨ溶出画分、ＥｔＯＡｃ溶出画分を得た。さらに、ＭｅＯＨ溶出画分について、シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル：４００ｇ，５ｃｍｉ．ｄ．×４０ｃｍ，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ系）に付し、計３２フラクションを得た。次に、フラクションＮｏ．１９−２７について分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ−５ＰＥまたはＮｕｃｌｅｏｓｉｌ５Ｃ１８ＡＢ，移動相：１５％ＭｅＣＮまたは１３％ＭｅＣＮまたは１０％ＭｅＣＮ（１％酢酸含有），流速：１．５〜２．０ｍＬ／ｍｉｎ，検出：紫外線２５４ｎｍ，温度：４０℃）に付し、上記のフラボノイド（１）〜（１０）をそれぞれ４０ｍｇ，２５ｍｇ，４０ｍｇ，６０ｍｇ，５０ｍｇ，３５ｍｇ，４０ｍｇ，５５ｍｇ，６０ｍｇ，２０ｍｇの収量で単離した。尚、上記の手順を図１に示す。
【００３８】
各フラクションの化合物の構造は、５００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトルや質量分析等を用いて文献記載のデータと比較することにより、上記化学式（１）〜（１０）のフラボノイドであることを同定した。
【００３９】
（実施例１２）
上記と同様のオオボウシバナの地上部２ｇを１００％メタノール溶液１００ｍＬに一夜常温で浸漬して抽出液を得、この抽出液をダイヤイオンＨＰ−２０カラムに付し、５０％メタノール水溶液で溶出して粗フラボノイド画分を得て、これを高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）のサンプルとした。
【００４０】
（実施例１３）
オオボウシバナの代わりにツユクサを用いた以外は、実施例１２と同様にして高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）のサンプルとした。
【００４１】
［ＤＮＳ法によるα−グルコシターゼ活性阻害試験］
実施例１〜１１について、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法によるα−グルコシターゼ活性阻害試験を行なった。試験方法は、実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドを１００ｍＬの５０％エタノール水溶液（５０％ＥｔＯＨ）に溶解し、その溶液２５μＬに５０ｍＭリン酸緩衝液（phosphate buffer、ｐＨ７．０）を２００μＬ加えて３７℃で５分間加温した。次に、サンプルを混入した緩衝溶液に基質溶液（１００ｍＭショ糖水溶液）を１７５μＬ加えて３７℃で５分間加温した。次に、この溶液に酵素溶液（１００μＬのα−グルコシダーゼ溶液）を加えて３７℃で３０分間反応した。α−グルコシダーゼ溶液としては酵素標準品（Saccharomyces sp.由来）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍｇ／ｍＬに溶解し、同緩衝液で約４０倍に希釈したものを用いた。次に、α−グルコシダーゼ溶液を加えた溶液にＤＮＳ溶液を加えて１００℃で１０分間反応した。ＤＮＳ溶液としては水１リットルに対して、3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)を１％、酒石酸カリウムを５％、ＮａＯＨを１％、フェノールを０．２％、Ｎａ２ＳＯ３を０．０５％の割合で溶解した溶液を用いた。そして、ＤＮＳ溶液を加えた溶液を水で３倍に希釈した後、５４０ｎｍにおける３−アミノ−５−ニトロサリチル酸の光学濃度を測定した。
【００４２】
この結果をＩＣ５０値として表１に示す。また、比較のために、ＤＮＪとＤＭＤＰのα−グルコシターゼ活性阻害試験の結果も比較例１、２として併記する。ＤＮＪとＤＭＤＰの構造式は下記［化２］の通りである。表１においてＩＣ５０の値が小さいほどα−グルコシターゼの活性阻害効果が高いことを示す。すなわち、下記［化３］に示すように、ショ糖はα−グルコシターゼの作用によりＤ−グルコースに分解され、このＤ−グルコースがジニトロサリチル酸と反応して３−アミノ−５−ニトロサリチル酸が生成されるが、実施例１〜１４によりα−グルコシターゼの活性が阻害されると、Ｄ−グルコースの生成が抑制されて３−アミノ−５−ニトロサリチル酸の生成量が少なくなる。従って、３−アミノ−５−ニトロサリチル酸の光学濃度が小さいほど、α−グルコシターゼの活性阻害効果が高いことになる。
【００４３】
【化２】
【００４４】
【化３】
【００４５】
［ＤＰＰＨラジカル消去能試験］
実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドについて、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（ＤＰＰＨ）のラジカルの消去能試験を行なった。試験方法は、実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドをそれぞれ１００ｍＬの５０％エタノール水溶液（５０％ＥｔＯＨ）に溶解し、その溶液２ｍＬと０．１Ｍアセテート緩衝液（acetate buffer、ｐＨ５．５）の２ｍＬとを混合した。
【００４６】
次に、上記溶液とアセテート緩衝液との混合液に０．５ｍＭのＤＰＰＨ溶液（エタノール溶液）を１ｍＬ加え、３０℃で３０分間、暗下で反応させた。
【００４７】
この後、反応後の混合液について吸光光度法（測定波長５１７ｎｍ）によりＤＰＰＨラジカル消去能を評価した。
【００４８】
この結果をＥＣ５０値として表１に示す。また、比較のために、没食子酸エピガロカテキン（epigallocatechin gallate）のＤＰＰＨラジカル消去能の結果も比較例３として併記する。尚、ＤＰＰＨの構造式を下記［化４］に示す。
【００４９】
【化４】
【００５０】
［化学発光による抗酸化能の測定］
実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドについて、化学発光による抗酸化能の測定(Chemiluminescence quenching/antioxidant capacity 略してＣＱＡＣ測定法)を行なった。ＣＱＡＣ測定法の過程で起こる化学反応式を以下に示す。
CumOOH + microperoxidase(MP) → CumO・
CumO・ + isoluminol(QH−) → CumOH + semiquinoneradical(・Q−)
・Q− + O2 → Q +・O2−
・Q− +・O2− → isoluminol endoperoxide → light
また、この過程を下記［化５］に示す。
【００５１】
【化５】
【００５２】
化学発光による抗酸化能の測定の試験方法は、まず、過酸化物標準液を作成した。過酸化物標準液は、２５０μＭクメンペルオキシド（ＣｕｍＯＯＨ）／０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．４）と、０．１ｍＭジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）と、５０％メタノール水溶液とを混合したものである。また、実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドを含む試料液を作成した。この試料液は実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドを１０００μＬの５０％メタノール水溶液に溶解して用いた。さらに、化学発光試薬を作成した。この化学発光試薬は、１ｍＭイソルミノール（Isoluminol）と０．００５％マイクロペルオキシターゼ（ＭＰ）の混合物である。
【００５３】
そして、過酸化物標準液０．８ｍＬに試料液２０〜２００μＬと化学発光試薬０．１５ｍＬとを添加し、化学発光測定を３分間行なった。この測定にはアロカ（株）製のルミネッセンスリーダＢＬＲ−２０１を用いた。結果を図２のグラフに示す。尚、比較のために、ルチン（rutin）及びヘスペリジン（hesperidin）の抗酸化能についても併記した。また、１Ｕはtroloxの５０ｎｍｏｌの抗酸化力に相当する。ルチン、ヘスペリジン、troloxの構造式を下記［化６］に示す。
【００５４】
【化６】
【００５５】
［高速液体クロマトグラフ法によるフラボノイドの確認試験］
実施例１２、１３で得られたサンプルについて、高速液体クロマトグラフ法により含有フラボノイドの同定を行なった。高速液体クロマトグラフ法による分析条件は、カラムとして全多孔性球状シリカゲルを用いたCosmosil（登録商標）５ＰＥ−ＭＳ ４．６×１５０ｍｍを用いて、１０％アセトニトリル水溶液から３０％アセトニトリル水溶液へ５０分でグラジエント溶出を行ない、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎとした。また、検出は紫外線の２５４ｎｍで行ない、温度は４０℃に設定した。結果を図３に示す。
【００５６】
［実施例１と「ベイスン０．２錠」とのα−グルコシターゼ阻害活性の対比試験］
実施例１のエキスの乾燥粉末（１．２２０５ｇ）と「ベイスン０．２錠」（商品名）３錠（０．３９２１ｇ）とをそれぞれ蒸留水１０ｍＬに溶解し、この溶液を蒸留水で希釈して表２に示す各種の希釈濃度の希釈サンプルを得、各希釈サンプルについてα−グルコシターゼ阻害活性率を測定した。測定方法はp-nitrophenyl法を用いた。この方法は、p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(PNP-α-D-glc)を基質とし、酵素はラット小腸由来のα−グルコシターゼを使用した。実験方法は、まず、２５μＬの希釈サンプルと０．１Ｍリン酸緩衝液（phosphate buffer、ｐＨ７．０）４７５μＬとを混合して３７℃で５分間加温した後、２５０μＬの２０ｍＭパラニトロフェニルα−グルコピラノシド（p-nitrophenyl-α-glucopyranoside、ＰＮＰ）をさらに加え、３７℃で５分間加温した後、２５０μＬのα−グルコシターゼ（ラット小腸由来）を用いて、３７℃で１５分間反応させた。次に、１０００μＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（Ｎａ２ＣＯ３）を加え、この後、この混合液について吸光光度法（測定波長４００ｎｍ）により吸光度を測定し、α−グルコシターゼ阻害活性を評価した。結果を表２に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
表１から明らかなように、イソクェルシトリン（実施例２）、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド（実施例３）、ビテキシン（実施例６）、スウェルチシン（実施例８）が高いα−グルコシターゼの作用を阻害する活性を示した。また、表１及び図４から明らかなように、オリエンチン（実施例５）、ビテキシン（実施例６）、イソオリエンチン（実施例１０）、イソビテキシン（実施例１１）、フラボコンメリン（実施例９）、スウェルチシン（実施例８）がフリーラジカルや活性酸素の作用を阻害する活性を示した。
【００５９】
また、図３から明らかなように、実施例１２と実施例１３で得られたサンプルのいずれの測定結果においても、同じ保持時間(Retention time)でのピークを有し、実施例１２と実施例１３で得られたサンプルに同等のフラボノイドが含有されていることが判る。従って、オオボウシバナ以外のツユクサ科コンメリナ属植物についても上記のフラボノイドが得られて、これを有効成分とするα−グルコシターゼ阻害活性剤や抗酸化性剤を得ることができる。尚、図３において（１）（２）（５）（７）は、上記化学式（１）（２）（５）（７）の各フラボノイドのピークを示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】
表２から明らかなように、実施例１のエキス粉末はベイスン０．２錠に比べて、少ない量で同等のα−グルコシターゼ阻害活性を示す。そして、p-nitrophenyl法による実施例１とベイスン０．２錠とのＩＣ５０値は、実施例１のエキス粉末は０．０２６ｍｇ／ｍＬ、ベイスン０．２錠が０．４９ｍｇ／ｍＬであった。これは、ベイスン１錠が約１３０ｍｇ（voglibose（ボグリボース）０．２ｍｇ含有）であるので、実施例１のエキス粉末が約１０ｍｇ（ＤＮＪ、ＤＭＤＰ ０．０３４６ｍｇ含有）程度と考えられ、実施例１のエキス粉末が少ない量で高いα−グルコシターゼ阻害活性を示すことが判る。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】フラボノイドの単離精製の過程を示す説明図である。
【図２】化学発光による抗酸化能の測定の結果を示すグラフである。
【図３】高速液体クロマトグラフ法によるフラボノイドの確認試験の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖値の上昇を抑制するための血糖上昇抑制剤及びフリーラジカルや活性酸素（スーパーオキシドなど）による酸化ストレスを抑制するための抗酸化剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者等は、ツユクサ(Commelina communis L)及びオオボウシバナ(Commelina communis L. var. hortensis)についての食後血糖値上昇抑制効果を見出し、その有効成分（活性成分）がα−グルコシターゼ（α−glucosidase）の阻害活性を示す１−デオキシノジリマイシン(1-deoxynojirimycin、「ＤＮＪ」と略称する)と２，５−ビスハイドロキシメチル−３，４−ジハイドロキシピロリジン(2,5-bishydoroxymethyl-3,4-dihydoroxy pyrrolidine、「ＤＭＤＰ」と略称する)であることを明らかにし、特許出願すると共に特許を受けている（特許文献１〜３参照）。
【０００３】
そして、本発明者等はさらにツユクサ及びオオボウシバナ並びにこれらが属する他のツユクサ科コンメリナ属植物について研究を行ない、新規な血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤を発明した。
【特許文献１】特開２００１−１１８４６９号公報
【特許文献２】特開２００３−４１５３６３号公報（特許第３５７５７６６号公報）
【特許文献３】特開２００１−１１８４６９号公報（特許第３５８１６７０号公報）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、血糖値の上昇を抑制することができる血糖上昇抑制剤を提供することを目的とするものである。
【０００５】
また、本発明は、フリーラジカルや活性酸素による酸化ストレスを抑制することができる抗酸化剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分として成ることを特徴とするものである。
【０００７】
また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物が、オオボウシバナ、ツユクサ、マルバツユクサ、シマツユクサ、ホウライツユクサから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とするものである。
【０００８】
また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物からの抽出物であることを特徴とするものである。
【０００９】
さらに、本発明の血糖上昇抑制剤は、フラボノイドが、イソクェルシトリン、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド、ビテキシン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とするものである。
【００１０】
加えて、本発明の血糖上昇抑制剤は、有効成分として１−デオキシノジリマイシンと２，５−ビスハイドロキシメチル−３，４−ジハイドロキシピロリジンの少なくとも一方を含有して成ることを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明の抗酸化剤は、フラボノイドが、オリエンチン、ビテキシン、イソオリエンチン、イソビテキシン、フラボコンメリン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の血糖上昇抑制剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドによりα−グルコシターゼの作用を阻害することができ、血糖値の上昇を抑制することができるものである。また、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドの多くは、糖部（グリコシル基）が炭素に直接結合したＣ配糖体であって、糖部が切断されにくくて水に溶解し易いものであり、水あるいは熱水抽出して飲用することにより、容易に体内に摂取することができるものである。
【００１３】
本発明の抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドによりフリーラジカルや活性酸素の作用を阻害することができ、これらによる酸化ストレスを抑制することができるものである。また、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドの多くは、糖部（グリコシル基）が炭素に直接結合したＣ配糖体であって、糖部が切断されにくくて水に溶解し易いものであり、水あるいは熱水抽出して飲用することにより、容易に体内に摂取することができるものである。
【００１４】
また、ツユクサ科コンメリナ属植物として、オオボウシバナ、ツユクサ、マルバツユクサ、シマツユクサ、ホウライツユクサから選ばれる少なくとも一つを用いることにより、α−グルコシターゼの作用を阻害するフラボノイドやフリーラジカルや活性酸素の作用を阻害するフラボノイドを容易に得ることができるものである。
【００１５】
また、ツユクサ科コンメリナ属植物からの抽出物を用いることによって、フラボノイド以外の成分を除去してフラボノイドの濃度を高めることができ、少量の摂取量で血糖上昇抑制効果及び抗酸化効果を得ることができるものである。
【００１６】
さらに、本発明の血糖上昇抑制剤は、フラボノイドが、イソクェルシトリン、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド、ビテキシン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つによって、血糖値の上昇を抑制することができるものである。
【００１７】
加えて、本発明の血糖上昇抑制剤は、有効成分として１−デオキシノジリマイシンと２，５−ビスハイドロキシメチル−３，４−ジハイドロキシピロリジンの少なくとも一方を含有することにより、フラボノイドとの相乗効果により高い血糖上昇抑制効果を得ることができるものである。
【００１８】
また、本発明の抗酸化剤は、フラボノイドが、オリエンチン、ビテキシン、イソオリエンチン、イソビテキシン、フラボコンメリン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つによって、フリーラジカルや活性酸素の作用による酸化ストレスを抑制することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための最良の形態を説明する。
【００２０】
本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分として含有するものである。
【００２１】
ツユクサ科コンメリナ属植物としては、オオボウシバナ(C. communis L. var. hortensis Makino)、ツユクサ(Commelina communis L.)、マルバツユクサ(C. benghalensis L.)、シマツユクサ(C. diffusa Burm. fil.)、ホウライツユクサ(C. auriculata Blume)から選ばれる一種類を用いたりあるいは二種類以上を併用したりすることができる。
【００２２】
また、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドはフラボノイド配糖体であって、例えば、イソクェルシトリン（下記化学式（１））、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド（下記化学式（２））、グルコルテオリン（下記化学式（３））、オリエンチン（下記化学式（４））、ビテキシン（下記化学式（５））、クリソリオール−７−ｏ−β−Ｄ−グルコサイド（下記化学式（６））、スウェルチシン（下記化学式（７））、フラボコンメリン（下記化学式（８））、イソオリエンチン（下記化学式（９））、イソビテキシン（下記化学式（１０））などである。以下にこれら十種類のフラボノイドの化学構造式を示す。
【００２３】
【化１】
【００２４】
尚、化学式中のＧｌｃはグルコシル基、Ｍｅはメチル基、Ｒｈａｍはラムノシル基をそれぞれ示す。
【００２５】
上記の化学式から明らかなように、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドの多くは、糖部（グリコシル基）が炭素に直接結合したＣ配糖体であり、多くの植物がＯ配糖体を主成分とするのに対して特徴的である。このため、ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドは、糖部が切断されにくくて水に溶解し易いものであり、水抽出しても沈殿しにくいものであり、従って、水あるいは熱水抽出して茶飲料と同様に飲用することにより、容易に体内に摂取することができるものである。
【００２６】
そして、上記フラボノイドの中でイソクェルシトリン、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド、ビテキシン、スウェルチシンがα−グルコシターゼの作用を阻害する活性を有し、また、上記フラボノイドの中でオリエンチン、ビテキシン、イソオリエンチン、イソビテキシン、フラボコンメリン、スウェルチシンがフリーラジカル（ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）など）や活性酸素（スーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）や過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）など）の作用を阻害する活性を有するものである。
【００２７】
上記のフラボノイドはツユクサ科コンメリナ属植物の地上部（花、葉、茎など）や地下部（根など）に含まれている。従って、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤はこれら地上部や地下部をそのままであるいは乾燥した後、適当な大きさ（１０〜２０ｍｍ）に切断・粉砕することにより得ることができる。
【００２８】
また、上記のフラボノイドはツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部から抽出することができ、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤はこれらの抽出物を含んで調製することができる。ツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部から上記のフラボノイドを抽出するにあたっては、例えば、ツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部をそのままであるいは乾燥した後、必要に応じて適当な大きさ（１０〜２０ｍｍ）に切断・粉砕し、この切断、粉砕物を溶媒に浸漬した後、還流抽出あるいは静置抽出することによって、上記のフラボノイドを溶媒に抽出することができる。ここで、上記の溶媒としては水、アルコール、水とアルコールの混合溶媒を用いることができる。水を溶媒として用いる場合は常温以上の熱水であっても良い。また、アルコールを溶媒として用いる場合は、メタノール、エタノールなどを単独であるいは複数種混合して用いることができる。また、水とアルコールの混合溶媒を用いる場合は、両者を任意の割合で混合したものを用いることができるが、例えば、アルコール濃度が５〜９５％、好ましくは６５〜７５％のものを用いるようにする。さらに、抽出時の溶媒の温度は６０〜８０℃に、抽出時の浸漬時間は６０〜１２０分間にそれぞれ設定することができるが、これに限定されるものではない。また、上記の溶媒はツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部の１ｇに対して３〜２００ｍＬ、好ましくは５〜３０ｍＬの割合で配合して抽出を行うことができる。尚、本発明では処理のしやすさなどを考慮してツユクサ科コンメリナ属植物の地上部を好適に用いることができる。
【００２９】
本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、ツユクサ科コンメリナ属植物の地上部や地下部から上記のフラボノイドを溶媒で抽出して得られる抽出液をそのままで用いたりあるいは適当な濃度に希釈したりすることにより得ることができる。この時、抽出液中の不純物は濾過により除去するのが好ましい。また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、抽出液（濾過により不純物を除去したものも含む）中の溶媒を除去することにより乾燥エキスとして得ることができる。さらに、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は上記の乾燥エキスを水やアルコールなどの溶媒に溶解して調製することができる。
【００３０】
本発明では上記の抽出液から単離精製した上記各フラボノイドをそれぞれ単独であるいは複数種混合して血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤として用いることができる。上記の抽出液から各フラボノイドを単離精製するにあたっては、既知の方法を採用することができ、例えば、逆相のシリカゲルなどを備えたクロマトグラフィーを用いた分画方法を挙げることができ、この場合、上記各フラボノイドは水溶性画分として得ることができる。
【００３１】
また、本発明の血糖上昇抑制剤は上記フラボノイドとともに、ＤＮＪとＤＭＤＰの一方あるいは両方を含有するのが好ましく、この場合、フラボノイド及びＤＮＪとＤＭＤＰの相乗効果によりα−グルコシターゼの作用を阻害する効果を向上させることができ、高い血糖上昇抑制効果を得ることができる。ここで、α−グルコシターゼに対して阻害を示したフラボノイド（上記化学式（１）（２）（５）（７））は非拮抗阻害剤であることが考えられる。一方、ツユクサ科コンメリナ属植物に含有されるＤＮＪやＤＭＤＰは糖類似構造を有しており，酵素との拮抗阻害剤である。また、ツユクサやオオボウシバナなどのツユクサ科コンメリナ属植物の水抽出エキスや乾燥エキス（粉末）が、動物実験において、ＤＮＪやＤＭＤＰの含有濃度から予想される効果より強い効果を示す。これらの事実からフラボノイド配糖体がα-グルコシダーゼに対して作用部位の違いからＤＮＪやＤＭＤＰと相乗的に作用していることが推定される。尚、ＤＮＪやＤＭＤＰはツユクサ科コンメリナ属植物（特にツユクサとオオボウシバナ）から得られる上記抽出液中に含有されているために、この抽出液をフラボノイドとＤＮＪとＤＭＤＰを含有する本発明の血糖上昇抑制剤とすることができる。
【００３２】
また、ツユクサ科コンメリナ属植物に含有されるフラボノイドは、フラボンの複素環骨格に単数あるいは複数の水酸基を有しているので、抗酸化剤として作用するものである。
【００３３】
本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤は、そのまま飲食することにより体内に摂取することができる。この場合、血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤に含まれているフラボノイドの摂取量は任意ではあるが、体重６０ｋｇの成人においてフラボノイドの摂取量が２０〜６０ｍｇとなるようにするのが好ましく、これにより、血糖値の上昇抑制効果及び酸化ストレスの抑制効果を高く得ることができる。
【００３４】
また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤を既知の食品等に配合することにより、機能性食品とすることができる。例えば、口腔用組成物（ガム、キャンデーなど）やかまぼこ、ちくわなどの加工水産ねり製品、ソーセージ、ハムなどの畜産製品、洋菓子類、和菓子類、生めん、中華めん、ゆでめん、ソバなどのめん類、ソース、醤油、タレ、砂糖、ハチミツ、粉末あめ、水あめなどの調味料、カレー粉、からし粉、コショウ粉などの香辛料、ジャム、マーマレード、チョコレートスプレッド、漬物、そう菜、ふりかけや、各種野菜・果実の缶詰・瓶詰など加工野菜・果実類、チーズ、バター、ヨーグルトなど乳製品、みそ汁、スープ、果実ジュース、野菜ジュース、乳清飲料、清涼飲料、酒類などの飲料、茶葉、その他、健康食品など一般的な飲食品類への使用を例示することができる。また、本発明の血糖上昇抑制剤及び抗酸化剤を既知の賦形材やカプセル材を用いて各種の内用・外用製剤類（動物用に使用する製剤も含む）のように、アンプル状、カプセル状、丸剤、錠剤状、粉末状、顆粒状、固形状、液状、ゲル状あるいは気泡性のように形成することができる。
【実施例】
【００３５】
以下本発明を実施例によって具体的に説明する。
【００３６】
（実施例１）
乾燥した草津産オオボウシバナ２００ｇを熱水（約５Ｌ、温度８０〜９５℃）で２時間抽出し、その抽出液を濾過後に減圧下で濃縮し、熱水抽出エキスを約２２ｇを得た。この熱水抽出エキスは上記化学式（１）〜（１０）に示す全てのフラボノイドとＤＮＪとＤＭＤＰとが含有された熱水抽出エキスである。
【００３７】
（実施例２〜１１）
草津産オオボウシバナ１．２ｋｇを７０％エタノール水溶液２０Ｌで還流抽出し、その抽出液を減圧下で濃縮し、エキス（抽出物）約１００ｇを得た。このエキスをダイヤイオンＨＰ−２０カラム（７００ｇ）に通導し、Ｈ２Ｏ溶出画分、ＭｅＯＨ溶出画分、ＥｔＯＡｃ溶出画分を得た。さらに、ＭｅＯＨ溶出画分について、シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル：４００ｇ，５ｃｍｉ．ｄ．×４０ｃｍ，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ系）に付し、計３２フラクションを得た。次に、フラクションＮｏ．１９−２７について分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ−５ＰＥまたはＮｕｃｌｅｏｓｉｌ５Ｃ１８ＡＢ，移動相：１５％ＭｅＣＮまたは１３％ＭｅＣＮまたは１０％ＭｅＣＮ（１％酢酸含有），流速：１．５〜２．０ｍＬ／ｍｉｎ，検出：紫外線２５４ｎｍ，温度：４０℃）に付し、上記のフラボノイド（１）〜（１０）をそれぞれ４０ｍｇ，２５ｍｇ，４０ｍｇ，６０ｍｇ，５０ｍｇ，３５ｍｇ，４０ｍｇ，５５ｍｇ，６０ｍｇ，２０ｍｇの収量で単離した。尚、上記の手順を図１に示す。
【００３８】
各フラクションの化合物の構造は、５００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトルや質量分析等を用いて文献記載のデータと比較することにより、上記化学式（１）〜（１０）のフラボノイドであることを同定した。
【００３９】
（実施例１２）
上記と同様のオオボウシバナの地上部２ｇを１００％メタノール溶液１００ｍＬに一夜常温で浸漬して抽出液を得、この抽出液をダイヤイオンＨＰ−２０カラムに付し、５０％メタノール水溶液で溶出して粗フラボノイド画分を得て、これを高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）のサンプルとした。
【００４０】
（実施例１３）
オオボウシバナの代わりにツユクサを用いた以外は、実施例１２と同様にして高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）のサンプルとした。
【００４１】
［ＤＮＳ法によるα−グルコシターゼ活性阻害試験］
実施例１〜１１について、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法によるα−グルコシターゼ活性阻害試験を行なった。試験方法は、実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドを１００ｍＬの５０％エタノール水溶液（５０％ＥｔＯＨ）に溶解し、その溶液２５μＬに５０ｍＭリン酸緩衝液（phosphate buffer、ｐＨ７．０）を２００μＬ加えて３７℃で５分間加温した。次に、サンプルを混入した緩衝溶液に基質溶液（１００ｍＭショ糖水溶液）を１７５μＬ加えて３７℃で５分間加温した。次に、この溶液に酵素溶液（１００μＬのα−グルコシダーゼ溶液）を加えて３７℃で３０分間反応した。α−グルコシダーゼ溶液としては酵素標準品（Saccharomyces sp.由来）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍｇ／ｍＬに溶解し、同緩衝液で約４０倍に希釈したものを用いた。次に、α−グルコシダーゼ溶液を加えた溶液にＤＮＳ溶液を加えて１００℃で１０分間反応した。ＤＮＳ溶液としては水１リットルに対して、3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)を１％、酒石酸カリウムを５％、ＮａＯＨを１％、フェノールを０．２％、Ｎａ２ＳＯ３を０．０５％の割合で溶解した溶液を用いた。そして、ＤＮＳ溶液を加えた溶液を水で３倍に希釈した後、５４０ｎｍにおける３−アミノ−５−ニトロサリチル酸の光学濃度を測定した。
【００４２】
この結果をＩＣ５０値として表１に示す。また、比較のために、ＤＮＪとＤＭＤＰのα−グルコシターゼ活性阻害試験の結果も比較例１、２として併記する。ＤＮＪとＤＭＤＰの構造式は下記［化２］の通りである。表１においてＩＣ５０の値が小さいほどα−グルコシターゼの活性阻害効果が高いことを示す。すなわち、下記［化３］に示すように、ショ糖はα−グルコシターゼの作用によりＤ−グルコースに分解され、このＤ−グルコースがジニトロサリチル酸と反応して３−アミノ−５−ニトロサリチル酸が生成されるが、実施例１〜１４によりα−グルコシターゼの活性が阻害されると、Ｄ−グルコースの生成が抑制されて３−アミノ−５−ニトロサリチル酸の生成量が少なくなる。従って、３−アミノ−５−ニトロサリチル酸の光学濃度が小さいほど、α−グルコシターゼの活性阻害効果が高いことになる。
【００４３】
【化２】
【００４４】
【化３】
【００４５】
［ＤＰＰＨラジカル消去能試験］
実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドについて、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（ＤＰＰＨ）のラジカルの消去能試験を行なった。試験方法は、実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドをそれぞれ１００ｍＬの５０％エタノール水溶液（５０％ＥｔＯＨ）に溶解し、その溶液２ｍＬと０．１Ｍアセテート緩衝液（acetate buffer、ｐＨ５．５）の２ｍＬとを混合した。
【００４６】
次に、上記溶液とアセテート緩衝液との混合液に０．５ｍＭのＤＰＰＨ溶液（エタノール溶液）を１ｍＬ加え、３０℃で３０分間、暗下で反応させた。
【００４７】
この後、反応後の混合液について吸光光度法（測定波長５１７ｎｍ）によりＤＰＰＨラジカル消去能を評価した。
【００４８】
この結果をＥＣ５０値として表１に示す。また、比較のために、没食子酸エピガロカテキン（epigallocatechin gallate）のＤＰＰＨラジカル消去能の結果も比較例３として併記する。尚、ＤＰＰＨの構造式を下記［化４］に示す。
【００４９】
【化４】
【００５０】
［化学発光による抗酸化能の測定］
実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドについて、化学発光による抗酸化能の測定(Chemiluminescence quenching/antioxidant capacity 略してＣＱＡＣ測定法)を行なった。ＣＱＡＣ測定法の過程で起こる化学反応式を以下に示す。
CumOOH + microperoxidase(MP) → CumO・
CumO・ + isoluminol(QH−) → CumOH + semiquinoneradical(・Q−)
・Q− + O2 → Q +・O2−
・Q− +・O2− → isoluminol endoperoxide → light
また、この過程を下記［化５］に示す。
【００５１】
【化５】
【００５２】
化学発光による抗酸化能の測定の試験方法は、まず、過酸化物標準液を作成した。過酸化物標準液は、２５０μＭクメンペルオキシド（ＣｕｍＯＯＨ）／０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．４）と、０．１ｍＭジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）と、５０％メタノール水溶液とを混合したものである。また、実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドを含む試料液を作成した。この試料液は実施例１のエキス及び実施例２〜１１で得られたフラボノイドを１０００μＬの５０％メタノール水溶液に溶解して用いた。さらに、化学発光試薬を作成した。この化学発光試薬は、１ｍＭイソルミノール（Isoluminol）と０．００５％マイクロペルオキシターゼ（ＭＰ）の混合物である。
【００５３】
そして、過酸化物標準液０．８ｍＬに試料液２０〜２００μＬと化学発光試薬０．１５ｍＬとを添加し、化学発光測定を３分間行なった。この測定にはアロカ（株）製のルミネッセンスリーダＢＬＲ−２０１を用いた。結果を図２のグラフに示す。尚、比較のために、ルチン（rutin）及びヘスペリジン（hesperidin）の抗酸化能についても併記した。また、１Ｕはtroloxの５０ｎｍｏｌの抗酸化力に相当する。ルチン、ヘスペリジン、troloxの構造式を下記［化６］に示す。
【００５４】
【化６】
【００５５】
［高速液体クロマトグラフ法によるフラボノイドの確認試験］
実施例１２、１３で得られたサンプルについて、高速液体クロマトグラフ法により含有フラボノイドの同定を行なった。高速液体クロマトグラフ法による分析条件は、カラムとして全多孔性球状シリカゲルを用いたCosmosil（登録商標）５ＰＥ−ＭＳ ４．６×１５０ｍｍを用いて、１０％アセトニトリル水溶液から３０％アセトニトリル水溶液へ５０分でグラジエント溶出を行ない、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎとした。また、検出は紫外線の２５４ｎｍで行ない、温度は４０℃に設定した。結果を図３に示す。
【００５６】
［実施例１と「ベイスン０．２錠」とのα−グルコシターゼ阻害活性の対比試験］
実施例１のエキスの乾燥粉末（１．２２０５ｇ）と「ベイスン０．２錠」（商品名）３錠（０．３９２１ｇ）とをそれぞれ蒸留水１０ｍＬに溶解し、この溶液を蒸留水で希釈して表２に示す各種の希釈濃度の希釈サンプルを得、各希釈サンプルについてα−グルコシターゼ阻害活性率を測定した。測定方法はp-nitrophenyl法を用いた。この方法は、p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(PNP-α-D-glc)を基質とし、酵素はラット小腸由来のα−グルコシターゼを使用した。実験方法は、まず、２５μＬの希釈サンプルと０．１Ｍリン酸緩衝液（phosphate buffer、ｐＨ７．０）４７５μＬとを混合して３７℃で５分間加温した後、２５０μＬの２０ｍＭパラニトロフェニルα−グルコピラノシド（p-nitrophenyl-α-glucopyranoside、ＰＮＰ）をさらに加え、３７℃で５分間加温した後、２５０μＬのα−グルコシターゼ（ラット小腸由来）を用いて、３７℃で１５分間反応させた。次に、１０００μＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（Ｎａ２ＣＯ３）を加え、この後、この混合液について吸光光度法（測定波長４００ｎｍ）により吸光度を測定し、α−グルコシターゼ阻害活性を評価した。結果を表２に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
表１から明らかなように、イソクェルシトリン（実施例２）、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド（実施例３）、ビテキシン（実施例６）、スウェルチシン（実施例８）が高いα−グルコシターゼの作用を阻害する活性を示した。また、表１及び図４から明らかなように、オリエンチン（実施例５）、ビテキシン（実施例６）、イソオリエンチン（実施例１０）、イソビテキシン（実施例１１）、フラボコンメリン（実施例９）、スウェルチシン（実施例８）がフリーラジカルや活性酸素の作用を阻害する活性を示した。
【００５９】
また、図３から明らかなように、実施例１２と実施例１３で得られたサンプルのいずれの測定結果においても、同じ保持時間(Retention time)でのピークを有し、実施例１２と実施例１３で得られたサンプルに同等のフラボノイドが含有されていることが判る。従って、オオボウシバナ以外のツユクサ科コンメリナ属植物についても上記のフラボノイドが得られて、これを有効成分とするα−グルコシターゼ阻害活性剤や抗酸化性剤を得ることができる。尚、図３において（１）（２）（５）（７）は、上記化学式（１）（２）（５）（７）の各フラボノイドのピークを示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】
表２から明らかなように、実施例１のエキス粉末はベイスン０．２錠に比べて、少ない量で同等のα−グルコシターゼ阻害活性を示す。そして、p-nitrophenyl法による実施例１とベイスン０．２錠とのＩＣ５０値は、実施例１のエキス粉末は０．０２６ｍｇ／ｍＬ、ベイスン０．２錠が０．４９ｍｇ／ｍＬであった。これは、ベイスン１錠が約１３０ｍｇ（voglibose（ボグリボース）０．２ｍｇ含有）であるので、実施例１のエキス粉末が約１０ｍｇ（ＤＮＪ、ＤＭＤＰ ０．０３４６ｍｇ含有）程度と考えられ、実施例１のエキス粉末が少ない量で高いα−グルコシターゼ阻害活性を示すことが判る。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】フラボノイドの単離精製の過程を示す説明図である。
【図２】化学発光による抗酸化能の測定の結果を示すグラフである。
【図３】高速液体クロマトグラフ法によるフラボノイドの確認試験の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分として成ることを特徴とする血糖上昇抑制剤。
【請求項２】
ツユクサ科コンメリナ属植物が、オオボウシバナ、ツユクサ、マルバツユクサ、シマツユクサ、ホウライツユクサから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の血糖上昇抑制剤。
【請求項３】
ツユクサ科コンメリナ属植物からの抽出物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の血糖上昇抑制剤。
【請求項４】
フラボノイドが、イソクェルシトリン、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド、ビテキシン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の血糖上昇抑制剤。
【請求項５】
有効成分として１−デオキシノジリマイシンと２，５−ビスハイドロキシメチル−３，４−ジハイドロキシピロリジンの少なくとも一方を含有して成ることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の血糖上昇抑制剤。
【請求項６】
ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分として成ることを特徴とする抗酸化剤。
【請求項７】
ツユクサ科コンメリナ属植物が、オオボウシバナ、ツユクサ、マルバツユクサ、シマツユクサ、ホウライツユクサから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項６に記載の抗酸化剤。
【請求項８】
ツユクサ科コンメリナ属植物からの抽出物であることを特徴とする請求項６又は７に記載の抗酸化剤。
【請求項９】
フラボノイドが、オリエンチン、ビテキシン、イソオリエンチン、イソビテキシン、フラボコンメリン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項６乃至８のいずれかに記載の抗酸化剤。
【請求項１】
ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分として成ることを特徴とする血糖上昇抑制剤。
【請求項２】
ツユクサ科コンメリナ属植物が、オオボウシバナ、ツユクサ、マルバツユクサ、シマツユクサ、ホウライツユクサから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の血糖上昇抑制剤。
【請求項３】
ツユクサ科コンメリナ属植物からの抽出物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の血糖上昇抑制剤。
【請求項４】
フラボノイドが、イソクェルシトリン、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノサイド、ビテキシン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の血糖上昇抑制剤。
【請求項５】
有効成分として１−デオキシノジリマイシンと２，５−ビスハイドロキシメチル−３，４−ジハイドロキシピロリジンの少なくとも一方を含有して成ることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の血糖上昇抑制剤。
【請求項６】
ツユクサ科コンメリナ属植物から得られるフラボノイドを有効成分として成ることを特徴とする抗酸化剤。
【請求項７】
ツユクサ科コンメリナ属植物が、オオボウシバナ、ツユクサ、マルバツユクサ、シマツユクサ、ホウライツユクサから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項６に記載の抗酸化剤。
【請求項８】
ツユクサ科コンメリナ属植物からの抽出物であることを特徴とする請求項６又は７に記載の抗酸化剤。
【請求項９】
フラボノイドが、オリエンチン、ビテキシン、イソオリエンチン、イソビテキシン、フラボコンメリン、スウェルチシンから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項６乃至８のいずれかに記載の抗酸化剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−１４３６５８（Ｐ２００６−１４３６５８Ａ）
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３３６５９１（Ｐ２００４−３３６５９１）
【出願日】平成１６年１１月１９日（２００４．１１．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年８月９日 日本生薬学会発行の「日本生薬学会 第５１回（２００４年）年会講演要旨集」に発表
【出願人】（０００１３２３２３）株式会社スピルリナ研究所 (6)
【出願人】（３９７０１４５５８）株式会社ヤマダ薬研 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１９日（２００４．１１．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年８月９日 日本生薬学会発行の「日本生薬学会 第５１回（２００４年）年会講演要旨集」に発表
【出願人】（０００１３２３２３）株式会社スピルリナ研究所 (6)
【出願人】（３９７０１４５５８）株式会社ヤマダ薬研 (4)
【Ｆターム（参考）】
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