誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤
【課題】本発明の目的は、安全で効果の高い誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤を提供することにある。
【解決手段】本発明の一般式（１）で表されるピロロキノリン類またはその塩を含有する剤を用いることによって、種々の疾患や障害の発症進展に関わっている誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を抑制することが可能となる。
【化１】
（式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【解決手段】本発明の一般式（１）で表されるピロロキノリン類またはその塩を含有する剤を用いることによって、種々の疾患や障害の発症進展に関わっている誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を抑制することが可能となる。
【化１】
（式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式（１）で表されるピロロキノリンキノン類またはその塩を含有することを特徴とする、誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤に関する。
【化１】
（式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素は、血管弛緩因子として同定されたことを契機に、生体機能の調節に重要な働きを持つ生理活性物質であることが明らかとなっている。血圧調節や情報伝達のコントロールなどの生体防御に役割を担っている一方で、過剰に発現されると炎症や発ガンなどの原因となる。生体内では一酸化窒素合成酵素によりL-アルギニンがL-シトルリンへと転換される際に一酸化窒素が産生される。この一酸化窒素合成酵素には3種類のアイソザイム（血管内皮型、脳型、誘導型）が知られている。この中で、誘導型一酸化窒素合成酵素は、マクロファージ、好中球、肝実質細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞、膵臓β細胞、腎メサンギウム細胞、消化管上皮、グリア細胞等あらゆる細胞に存在している。血管内皮型一酸化窒素合成酵素や脳型一酸化窒素合成酵素が構成的に発現しているのに対して、誘導型一酸化窒素合成酵素はエンドトキシンや各種サイトカイン等の刺激によって発現が誘導され、生体防御のために一酸化窒素を産生するが、血管内皮型一酸化窒素合成酵素や脳型一酸化窒素合成酵素と比較すると、誘導型一酸化窒素合成酵素の作用は長時間持続するため、産生する一酸化窒素量が過剰となり、生体に様々な弊害を起こす原因となる。
【０００３】
一酸化窒素の関与が認められる疾患または障害としては、脊髄損傷をはじめ、敗血症、エンドトキシンショック、心不全、ショック、結核、低血圧、リウマチ性炎症、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、潰瘍性大腸炎、ストレス性胃潰瘍、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植後の組織障害、拒絶反応、虚血再灌流障害、急性冠微小血管塞栓、ショック性血管塞栓（汎発性血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）等）、虚血性脳障害、動脈硬化、悪性貧血、ファンコニー貧血症、鎌形赤血球性貧血病、膵炎、ネフローゼ症候群、レーシュマニア症、糸球体腎炎、インスリン依存性糖尿病、肝性ポルフィリン症、アルコール中毒、パーキンソン病、慢性白血病、急性白血病、腫瘍、骨髄腫、抗がん剤副作用、幼児および成人性呼吸窮迫症候群、肺気腫、アルツハイマー病、多発性硬化症、ビタミンE欠乏症、老化、日焼け、筋ジストロフィー、白内障、インフルエンザ感染症、マラリア、ＡＩＤＳ、放射線障害、火傷、体外受精効率低下など種々の疾患や障害が知られている。これらは、誘導型一酸化窒素合成酵素により産生された一酸化窒素に起因していることが知られているので、誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を抑制することは、これらの疾患や障害の治療や予防に有効であると期待される。
【０００４】
一酸化窒素の関与する様々な疾患の治療や予防を目的として、誘導型一酸化窒素合成酵素の活性を阻害する化合物としてクマリン類やセレナゾリン誘導体などが見出されている（例えば、特許文献１および２参照）。また、アミン誘導体や２−アミノピリジンは、一酸化窒素合成酵素の活性を阻害し、中枢神経系疾患の治療および予防に有用であるとされている（例えば、特許文献３および４参照）。この酵素の発現自体を抑制することができれば、より根本的な治療や予防に利用することが可能となるので、過剰な誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を抑制する剤の開発が切望されているが、これまでのところ、その目的では担子菌培養由来の組成物が見出されているに過ぎない（例えば、特許文献５参照）。
【０００５】
上記したように、誘導型一酸化窒素合成酵素は多くの疾患または障害に関与しているが、例えばその代表的なものとして脊髄損傷を挙げることができる。脊髄損傷は、末梢組織と脳との間の知覚、運動神経情報の伝導路である脊髄が、交通事故やスポーツ事故、高齢者の圧迫骨折等で物理的傷害を受けて神経軸索が傷害されて運動麻痺、呼吸麻痺や知覚障害等の重篤な身体障害に陥る疾患であり、損傷による炎症部位では誘導型一酸化窒素合成酵素が強く発現していることが知られている。脳、脊髄を含む中枢神経系では神経軸索が再生しにくく、脊髄損傷の回復はほとんど望めないのが現状であり、現在のところ有効な治療法は確立されていない。さらに、誘導型一酸化窒素合成酵素の発現抑制剤は、脊髄損傷ばかりでなく、上記に列挙した種々の疾患の治療や予防に役立てることができる。このような経緯から、誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を抑制し、一酸化窒素に起因する過剰な生体反応を抑えることができる化合物の提供が強く求められている。
【０００６】
ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱという）は、１９７９年メタノール資化性菌のメタノール脱水素酵素の補酵素として見出された（例えば、非特許文献１および２参照）。細菌類以外にも、大豆、空豆、ピーマン、ジャガイモ、パセリ、ホウレンソウなどの食用植物や、酢、茶、ココア、納豆、豆腐等の加工食品からも検出されている（例えば、非特許文献３参照）。また、ヒトやラットの生体内にも存在すること（例えば、非特許文献４参照）が報告されている。２００３年にはアミノ酸、リジンの酸化を触媒する酵素（２-アミノアジピン酸 ６-セミアルデヒド脱水素酵素）の酸化還元補酵素として機能することが明らかとなり、新しいビタミンと位置付けられている化合物である（例えば、非特許文献５参照）。
ほ乳類におけるＰＱＱの栄養学的な研究は１９８０年代から進められてきており、ＰＱＱ欠乏餌を与えられたマウスは、発育不良、繁殖能力低下、皮膚障害などの欠乏症の症状を示すが、ＰＱＱを補給すると異常が改善されることから、ＰＱＱは重要な栄養素の一つであると考えられている（例えば、非特許文献６）。
【０００７】
栄養学的な側面だけでなく、ＰＱＱの薬理学的作用についても多くの報告がある。in vitroおよびin vivoで、ＰＱＱには強い活性酸素除去作用が認められることが報告されている（例えば、特許文献６参照）。また、細胞の増殖促進作用（例えば、特許文献７参照）、アルドース還元酵素阻害作用（例えば、特許文献８参照）、メラニン産生抑制および美白作用（例えば、特許文献９参照）、紫外線吸収作用（例えば、特許文献１０参照）などが知られている。また、ＰＱＱの神経系に対する作用としては、神経成長因子産生促進作用（例えば、特許文献１１参照）があるが、これはＰＱＱが神経成長因子を増強することにより、末梢神経の再生を促進するというものであった。また、ラットを用いた検討から、経口摂取したＰＱＱが、学習能力などの認知機能の低下を防ぐ作用を発揮し、さらには、コエンザイムＱ１０との併用効果が認められることが報告されている（非特許文献７参照）。しかし、これまで、ＰＱＱが誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制作用を有していることはまったく知られていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】「ネイチャー（Nature）」、１９７９年、第２３０巻、ｐ．８４３−８４４
【非特許文献２】「フェブス レター（FEBS Letter）」、１９７９年、第１０８巻、ｐ．４４３−４４６
【非特許文献３】「バイオケミカル ジャーナル（Biochem Journal）」、１９９５年、第３０７巻、ｐ．３３１−３３３
【非特許文献４】「バイオケミカ エト バイオフィジカ アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）」、１９９２年、第１１５６巻、ｐ．６２−６６
【非特許文献５】「ネイチャー（Nature）」、２００３年、第４２２巻、ｐ．８３２
【非特許文献６】「サイエンス（Science）」、１９８９年、２４５巻、ｐ．８５０−８５２
【非特許文献７】「ジャーナル オブ クリニカル バイオケミカル ニュートリッション（J Clin Biochem Nutr）」、２００８年、第４２巻、ｐ．２９−３４
【特許文献１】特表２００７−５０４２３４号公報
【特許文献２】特開２００６−２３２６７１号公報
【特許文献３】特表平１１−５１０５１３号公報
【特許文献４】特表２００２−５３７３８１号公報
【特許文献５】特開２００８−１３５５０号公報
【特許文献６】特開平５−０７８２４７号公報
【特許文献７】特開昭６１−５８５８４号公報
【特許文献８】特開平６−２５６１９１号公報
【特許文献９】特開平８−０２０５１２号公報
【特許文献１０】特許第３６２５４９３号公報
【特許文献１１】特開平０６−２１１６６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、誘導型一酸化窒素合成酵素の発現抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、脊髄損傷モデルを用いて中枢神経の修復促進作用を有する物質の探索を行っていたところ、ＰＱＱに当該促進作用が認められ、かつその作用が誘導型一酸化窒素合成酵素の発現抑制作用に基づくものであるこることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、下記（１）に示すようなＰＱＱ類またはその塩を含有することを特徴とする、誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤に関するものである。
（１）一般式（１）で表されるピロロキノリンキノン類またはその塩を含有することを特徴とする、誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤。
【化２】
（式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、種々の疾患や障害の発症進展に関わっている誘導型一酸化窒素合成酵素の発現抑制剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩において、式中のＲ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。
【００１３】
短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基のアルキル部分としては、例えば直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキルが挙げられ、より具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が挙げられ、中でもメチルまたはエチルが好ましい。
短鎖長のアラルキル基としては、例えば炭素数７〜１５のアラルキル基が挙げられ、より具体的にはベンジル、フェネチル、ベンズヒドリル、ナフチルメチル等が挙げられる。
短鎖長のアルキルアリール基のアリール部分としては、例えば炭素数６〜１４のアリールが挙げられ、より具体的にはフェニル、ナフチル、アントリル等が挙げられる。従って、アルキルアリール基としては、メチルフェニル、エチルフェニル等が挙げられる。
【００１４】
短鎖長のアルケニル基としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルケニル基が挙げられ、より具体的にはビニル、アリール、１−プロペニルメタクリル、クロチル、１−ブテニル、３―ブテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、２―ヘキセニル、５−ヘキセニル等が挙げられる。
短鎖長のアルキニル基としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルキニルが挙げられ、より具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等が挙げられる。
【００１５】
上述の一般式（１）においてＲ１、Ｒ２およびＲ３がいずれも水素原子である化合物は、有機化学的方法（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３、５５９９−５６００（１９８１））または発酵法、例えばメタノール資化性を有し、かつＰＱＱを生産する能力を有する細菌を、炭素源としてメタノールを含有し鉄化合物の濃度を制御した培養液中で培養することによりＰＱＱを生産する方法（特開平１−２１８５９７号公報）などにより製造することが可能である。
【００１６】
一方、ＰＱＱのエステル体は、ＰＱＱより常法のエステル化反応に従って合成することができる。ＰＱＱのトリエステル体は、例えば、ＰＱＱまたはその塩を酸性条件下でアルコール類と反応させる方法（例えば、特開平３−１２３７８１号公報、特開平３−１４５４９２号公報）や、ＰＱＱまたはその塩を塩基存在下でハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、ハロゲン化アルキニル、ハロゲン化アラルキル、ハロゲン化アラアリール等と反応させる方法などにより合成することができる。また、上記方法によって得られるＰＱＱのトリエステル体を酸性または塩基性条件下で部分加水分解することで、モノエステル体、ジエステル体を得ることができる。
【００１７】
このようにして得られる一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩は、カラムクロマトグラフィー、再結晶法、または溶媒抽出法などの通常の方法により、反応液中から分離、精製することができる。また、それらの同定には、元素分析、ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、質量分析等の各種手段が用いられる。
【００１８】
一般式（１）で表されるＰＱＱ類の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、トリエタノールアミン、トリメチルアミン等の有機アミン塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００１９】
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤としては、一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩をそのまま投与することも可能であるが、通常各種の製剤として提供することが望ましい。製剤は、有効成分として一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩の他に、任意の他の有効成分を含有していてもよく、例えば、さらに一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造することができる。
【００２０】
製剤の投与形態は、経口投与、または静脈内、腹膜内、皮下若しくは経皮等の非経口投与を挙げることができ、投与に際し最も効果的な形態を選択すればよい。剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤、注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の経口剤や非経口剤を挙げることができる。
【００２１】
経口剤として製剤化する際には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることができる。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物である場合は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加して製剤化することができる。
また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤および顆粒剤等の場合には、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して製剤化することができる。
また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば食甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。
【００２２】
経口投与に適当な製剤は、そのまま、または例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等の形態のものであってもよい。また、健康食品、機能性食品、栄養補助食品等の飲食品として用いてもよい。
【００２３】
非経口投与に適当な、例えば注射剤は、好ましくは受容者の血液と等張である一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩を含む滅菌水性剤と、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて調製することができる。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、潤沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することができる。
【００２４】
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤における一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩の濃度は、製剤の種類、該製剤の投与により期待する効果等に応じて適宜選択されるが、例えば経口剤の場合、ＰＱＱ類またはその塩として、通常は０．１〜１００重量％、好ましくは０．５〜７０重量％、特に好ましくは１〜５０重量％である。
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状や重篤度等により異なるが、通常、成人一日当たり、ＰＱＱ類またはその塩として、０．５ｍｇ〜１００００ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜５０００ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇとなるように、一日一回ないし数回投与する。投与期間は、疾患の種類や障害の程度によって適宜選択すればよい。
【００２５】
なお、本発明の製剤は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物（以下、非ヒト動物と略す）に対しても使用することができる。非ヒト動物としては、ほ乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類等、好ましくはほ乳類に属する非ヒト動物を挙げることができる。
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤を非ヒト動物に投与する場合の投与量および投与回数は、投与形態、動物の年齢、種類等により異なるが、通常、体重１ｋｇ１日当たり、一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩として、０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜２０ｍｇとなるように一日一回ないし数回投与する。投与期間は、疾患の種類や障害の程度によって適宜選択すればよい。
【実施例】
【００２６】
以下に、実施例および比較例にて本発明を説明するが、本発明はこれらの例にのみに限定されるものではない。
実施例１
試験には、７週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（ｎ＝１１）を用いた。飼育は、室温２２±３℃、湿度５０±２５％の条件下で行い、試料および水は自由摂取とした。7週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラットをペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、脊柱を露出後、第９胸椎の椎弓を切除し、鋭利な刃物で第１０胸髄(Ｔ１０)右側半球を切断した。背筋、皮膚を縫合した後、後肢麻痺を確認し試験に用いた。ＰＱＱ二ナトリウム塩（三菱瓦斯化学株式会社製）を１．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ緩衝液に溶解し、０．５ｍｌ (ＰＱＱ二ナトリウム塩として０．６ｍｇ) を1日１回、7日間にわたり腹腔内に投与した。ＢＢＢ (Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ ａｎｄ Ｂｒｅｓｈｎａｈａｎ) 運動機能評価スケール（Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１２，１−２１，１９９５）を用いて、右後肢の運動機能を毎日評価した。この評価スケールでは、完全な麻痺を０、正常を２１として２１段階で評価する。スケール８までは後肢で体重を支えられないレベル、スケール９を超えると体重を支えられるようになり、１４を越えると前肢と後肢の協調運動が認められ、１９、２０になると一見しただけでは正常と区別しにくいレベルとされている。また、経過観察途中のラットから脊髄損傷部位を摘出し、組織中の誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）およびβ-アクチンのｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝４）。表１にＢＢＢスコアおよびｉＮＯＳｍＲＮＡ発現量の経日変化を示す。なお、ｉＮＯＳｍＲＮＡ発現量は、組織の種類や刺激によらず一定に発現しているハウスキーピング遺伝子で、ｍＲＮＡの発現量変化を検討する際の対照遺伝子として一般的に用いられているβ−アクチンｍＲＮＡの電気泳動時のバンドの濃さを基準としたｉＮＯＳｍＲＮＡ／β−アクチンｍＲＮＡ比を用いて示した。
【表１】
ＰＱＱ二ナトリウム投与群では、ＰＢＳ緩衝液を投与した対照のＰＱＱ二ナトリウム非投与群（下表２参照）に比べ、投与後５―１４日間での運動機能の回復度合いが有意に高く、ＰＱＱ二ナトリウムに脊髄損傷の修復を促進する作用が認められた。
一方、ＰＱＱ二ナトリウム投与群と非投与群でのｉＮＯＳｍＲＮＡの発現量は、各々損傷１日目（２１．２：６４．０）、３日目（１２．０：３５．０）、７日目（１．８：１０．５）、１４日目（１．７：９．９）であり、投与後１−１４でのｉＮＯＳｍＲＮＡの発現量は、ＰＱＱ二ナトリウム投与群が有意に低く、ＰＱＱ二ナトリウムにｉＮＯＳ発現を抑制する作用が認められた。
【００２７】
比較例１
比較試験には、７週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（ｎ＝１０）を用いた。飼育は、室温２２±３℃、湿度５０±２５％の条件下で行い、試料および水は自由摂取とした。7週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラットをペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、脊柱を露出後、第９胸椎の椎弓を切除し、鋭利な刃物で第１０胸髄(Ｔ１０)右側半球を切断した。背筋、皮膚を縫合した後、後肢麻痺を確認し試験に用いた。ＰＢＳ緩衝液０．５ｍｌを1日１回、7日間にわたり腹腔内に投与した。実施例１と同様に、ＢＢＢ (Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ ａｎｄ Ｂｒｅｓｈｎａｈａｎ) 運動機能評価スケール（Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．、１９９５）を用いて、右後肢の運動機能を毎日評価した（損傷直後は０、非損傷は２１）。また、経過観察中のラットから脊髄損傷部位を摘出し、組織中のｉＮＯＳおよびβ-アクチンのｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝４）。ＢＢＢスコアおよび両ｍＲＮＡの比を表２に示す。
【表２】
ＰＱＱ二ナトリウム非投与の本比較例の場合は、損傷１日後、著明にｉＮＯＳｍＲＮＡ発現が上昇し、３日後には半減したものの、依然としてＰＱＱ二ナトリウム投与１日目の最大値よりも高値を維持した。７日後、１４日後にはさらにｍＲＮＡレベルは低下したが、ＰＱＱ二ナトリウム投与群と異なり、０日に比べ依然として有意に高かった。
このように、ＰＱＱ二ナトリウム塩は脊髄損傷によって誘導される誘導型一酸化窒素合成酵素ｍＲＮＡの発現を阻害する作用を発揮していた。損傷直後には炎症細胞、例えば好中球およびマクロファージが損傷部位に浸潤し、神経組織に対する二次的な損傷を引き起こすとされている。従って、誘導型一酸化窒素合成酵素ｍＲＮＡの発現を抑制することにより、脊髄損傷局所での炎症を抑制し、二次的な損傷を抑え、実施例１のごとく、脊髄損傷の修復を促進したものと考える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式（１）で表されるピロロキノリンキノン類またはその塩を含有することを特徴とする、誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤に関する。
【化１】
（式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素は、血管弛緩因子として同定されたことを契機に、生体機能の調節に重要な働きを持つ生理活性物質であることが明らかとなっている。血圧調節や情報伝達のコントロールなどの生体防御に役割を担っている一方で、過剰に発現されると炎症や発ガンなどの原因となる。生体内では一酸化窒素合成酵素によりL-アルギニンがL-シトルリンへと転換される際に一酸化窒素が産生される。この一酸化窒素合成酵素には3種類のアイソザイム（血管内皮型、脳型、誘導型）が知られている。この中で、誘導型一酸化窒素合成酵素は、マクロファージ、好中球、肝実質細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞、膵臓β細胞、腎メサンギウム細胞、消化管上皮、グリア細胞等あらゆる細胞に存在している。血管内皮型一酸化窒素合成酵素や脳型一酸化窒素合成酵素が構成的に発現しているのに対して、誘導型一酸化窒素合成酵素はエンドトキシンや各種サイトカイン等の刺激によって発現が誘導され、生体防御のために一酸化窒素を産生するが、血管内皮型一酸化窒素合成酵素や脳型一酸化窒素合成酵素と比較すると、誘導型一酸化窒素合成酵素の作用は長時間持続するため、産生する一酸化窒素量が過剰となり、生体に様々な弊害を起こす原因となる。
【０００３】
一酸化窒素の関与が認められる疾患または障害としては、脊髄損傷をはじめ、敗血症、エンドトキシンショック、心不全、ショック、結核、低血圧、リウマチ性炎症、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、潰瘍性大腸炎、ストレス性胃潰瘍、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植後の組織障害、拒絶反応、虚血再灌流障害、急性冠微小血管塞栓、ショック性血管塞栓（汎発性血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）等）、虚血性脳障害、動脈硬化、悪性貧血、ファンコニー貧血症、鎌形赤血球性貧血病、膵炎、ネフローゼ症候群、レーシュマニア症、糸球体腎炎、インスリン依存性糖尿病、肝性ポルフィリン症、アルコール中毒、パーキンソン病、慢性白血病、急性白血病、腫瘍、骨髄腫、抗がん剤副作用、幼児および成人性呼吸窮迫症候群、肺気腫、アルツハイマー病、多発性硬化症、ビタミンE欠乏症、老化、日焼け、筋ジストロフィー、白内障、インフルエンザ感染症、マラリア、ＡＩＤＳ、放射線障害、火傷、体外受精効率低下など種々の疾患や障害が知られている。これらは、誘導型一酸化窒素合成酵素により産生された一酸化窒素に起因していることが知られているので、誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を抑制することは、これらの疾患や障害の治療や予防に有効であると期待される。
【０００４】
一酸化窒素の関与する様々な疾患の治療や予防を目的として、誘導型一酸化窒素合成酵素の活性を阻害する化合物としてクマリン類やセレナゾリン誘導体などが見出されている（例えば、特許文献１および２参照）。また、アミン誘導体や２−アミノピリジンは、一酸化窒素合成酵素の活性を阻害し、中枢神経系疾患の治療および予防に有用であるとされている（例えば、特許文献３および４参照）。この酵素の発現自体を抑制することができれば、より根本的な治療や予防に利用することが可能となるので、過剰な誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を抑制する剤の開発が切望されているが、これまでのところ、その目的では担子菌培養由来の組成物が見出されているに過ぎない（例えば、特許文献５参照）。
【０００５】
上記したように、誘導型一酸化窒素合成酵素は多くの疾患または障害に関与しているが、例えばその代表的なものとして脊髄損傷を挙げることができる。脊髄損傷は、末梢組織と脳との間の知覚、運動神経情報の伝導路である脊髄が、交通事故やスポーツ事故、高齢者の圧迫骨折等で物理的傷害を受けて神経軸索が傷害されて運動麻痺、呼吸麻痺や知覚障害等の重篤な身体障害に陥る疾患であり、損傷による炎症部位では誘導型一酸化窒素合成酵素が強く発現していることが知られている。脳、脊髄を含む中枢神経系では神経軸索が再生しにくく、脊髄損傷の回復はほとんど望めないのが現状であり、現在のところ有効な治療法は確立されていない。さらに、誘導型一酸化窒素合成酵素の発現抑制剤は、脊髄損傷ばかりでなく、上記に列挙した種々の疾患の治療や予防に役立てることができる。このような経緯から、誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を抑制し、一酸化窒素に起因する過剰な生体反応を抑えることができる化合物の提供が強く求められている。
【０００６】
ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱという）は、１９７９年メタノール資化性菌のメタノール脱水素酵素の補酵素として見出された（例えば、非特許文献１および２参照）。細菌類以外にも、大豆、空豆、ピーマン、ジャガイモ、パセリ、ホウレンソウなどの食用植物や、酢、茶、ココア、納豆、豆腐等の加工食品からも検出されている（例えば、非特許文献３参照）。また、ヒトやラットの生体内にも存在すること（例えば、非特許文献４参照）が報告されている。２００３年にはアミノ酸、リジンの酸化を触媒する酵素（２-アミノアジピン酸 ６-セミアルデヒド脱水素酵素）の酸化還元補酵素として機能することが明らかとなり、新しいビタミンと位置付けられている化合物である（例えば、非特許文献５参照）。
ほ乳類におけるＰＱＱの栄養学的な研究は１９８０年代から進められてきており、ＰＱＱ欠乏餌を与えられたマウスは、発育不良、繁殖能力低下、皮膚障害などの欠乏症の症状を示すが、ＰＱＱを補給すると異常が改善されることから、ＰＱＱは重要な栄養素の一つであると考えられている（例えば、非特許文献６）。
【０００７】
栄養学的な側面だけでなく、ＰＱＱの薬理学的作用についても多くの報告がある。in vitroおよびin vivoで、ＰＱＱには強い活性酸素除去作用が認められることが報告されている（例えば、特許文献６参照）。また、細胞の増殖促進作用（例えば、特許文献７参照）、アルドース還元酵素阻害作用（例えば、特許文献８参照）、メラニン産生抑制および美白作用（例えば、特許文献９参照）、紫外線吸収作用（例えば、特許文献１０参照）などが知られている。また、ＰＱＱの神経系に対する作用としては、神経成長因子産生促進作用（例えば、特許文献１１参照）があるが、これはＰＱＱが神経成長因子を増強することにより、末梢神経の再生を促進するというものであった。また、ラットを用いた検討から、経口摂取したＰＱＱが、学習能力などの認知機能の低下を防ぐ作用を発揮し、さらには、コエンザイムＱ１０との併用効果が認められることが報告されている（非特許文献７参照）。しかし、これまで、ＰＱＱが誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制作用を有していることはまったく知られていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】「ネイチャー（Nature）」、１９７９年、第２３０巻、ｐ．８４３−８４４
【非特許文献２】「フェブス レター（FEBS Letter）」、１９７９年、第１０８巻、ｐ．４４３−４４６
【非特許文献３】「バイオケミカル ジャーナル（Biochem Journal）」、１９９５年、第３０７巻、ｐ．３３１−３３３
【非特許文献４】「バイオケミカ エト バイオフィジカ アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）」、１９９２年、第１１５６巻、ｐ．６２−６６
【非特許文献５】「ネイチャー（Nature）」、２００３年、第４２２巻、ｐ．８３２
【非特許文献６】「サイエンス（Science）」、１９８９年、２４５巻、ｐ．８５０−８５２
【非特許文献７】「ジャーナル オブ クリニカル バイオケミカル ニュートリッション（J Clin Biochem Nutr）」、２００８年、第４２巻、ｐ．２９−３４
【特許文献１】特表２００７−５０４２３４号公報
【特許文献２】特開２００６−２３２６７１号公報
【特許文献３】特表平１１−５１０５１３号公報
【特許文献４】特表２００２−５３７３８１号公報
【特許文献５】特開２００８−１３５５０号公報
【特許文献６】特開平５−０７８２４７号公報
【特許文献７】特開昭６１−５８５８４号公報
【特許文献８】特開平６−２５６１９１号公報
【特許文献９】特開平８−０２０５１２号公報
【特許文献１０】特許第３６２５４９３号公報
【特許文献１１】特開平０６−２１１６６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、誘導型一酸化窒素合成酵素の発現抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、脊髄損傷モデルを用いて中枢神経の修復促進作用を有する物質の探索を行っていたところ、ＰＱＱに当該促進作用が認められ、かつその作用が誘導型一酸化窒素合成酵素の発現抑制作用に基づくものであるこることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、下記（１）に示すようなＰＱＱ類またはその塩を含有することを特徴とする、誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤に関するものである。
（１）一般式（１）で表されるピロロキノリンキノン類またはその塩を含有することを特徴とする、誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤。
【化２】
（式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、種々の疾患や障害の発症進展に関わっている誘導型一酸化窒素合成酵素の発現抑制剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩において、式中のＲ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。
【００１３】
短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基のアルキル部分としては、例えば直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキルが挙げられ、より具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が挙げられ、中でもメチルまたはエチルが好ましい。
短鎖長のアラルキル基としては、例えば炭素数７〜１５のアラルキル基が挙げられ、より具体的にはベンジル、フェネチル、ベンズヒドリル、ナフチルメチル等が挙げられる。
短鎖長のアルキルアリール基のアリール部分としては、例えば炭素数６〜１４のアリールが挙げられ、より具体的にはフェニル、ナフチル、アントリル等が挙げられる。従って、アルキルアリール基としては、メチルフェニル、エチルフェニル等が挙げられる。
【００１４】
短鎖長のアルケニル基としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルケニル基が挙げられ、より具体的にはビニル、アリール、１−プロペニルメタクリル、クロチル、１−ブテニル、３―ブテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、２―ヘキセニル、５−ヘキセニル等が挙げられる。
短鎖長のアルキニル基としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルキニルが挙げられ、より具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等が挙げられる。
【００１５】
上述の一般式（１）においてＲ１、Ｒ２およびＲ３がいずれも水素原子である化合物は、有機化学的方法（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３、５５９９−５６００（１９８１））または発酵法、例えばメタノール資化性を有し、かつＰＱＱを生産する能力を有する細菌を、炭素源としてメタノールを含有し鉄化合物の濃度を制御した培養液中で培養することによりＰＱＱを生産する方法（特開平１−２１８５９７号公報）などにより製造することが可能である。
【００１６】
一方、ＰＱＱのエステル体は、ＰＱＱより常法のエステル化反応に従って合成することができる。ＰＱＱのトリエステル体は、例えば、ＰＱＱまたはその塩を酸性条件下でアルコール類と反応させる方法（例えば、特開平３−１２３７８１号公報、特開平３−１４５４９２号公報）や、ＰＱＱまたはその塩を塩基存在下でハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、ハロゲン化アルキニル、ハロゲン化アラルキル、ハロゲン化アラアリール等と反応させる方法などにより合成することができる。また、上記方法によって得られるＰＱＱのトリエステル体を酸性または塩基性条件下で部分加水分解することで、モノエステル体、ジエステル体を得ることができる。
【００１７】
このようにして得られる一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩は、カラムクロマトグラフィー、再結晶法、または溶媒抽出法などの通常の方法により、反応液中から分離、精製することができる。また、それらの同定には、元素分析、ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、質量分析等の各種手段が用いられる。
【００１８】
一般式（１）で表されるＰＱＱ類の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、トリエタノールアミン、トリメチルアミン等の有機アミン塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００１９】
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤としては、一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩をそのまま投与することも可能であるが、通常各種の製剤として提供することが望ましい。製剤は、有効成分として一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩の他に、任意の他の有効成分を含有していてもよく、例えば、さらに一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造することができる。
【００２０】
製剤の投与形態は、経口投与、または静脈内、腹膜内、皮下若しくは経皮等の非経口投与を挙げることができ、投与に際し最も効果的な形態を選択すればよい。剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤、注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の経口剤や非経口剤を挙げることができる。
【００２１】
経口剤として製剤化する際には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることができる。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物である場合は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加して製剤化することができる。
また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤および顆粒剤等の場合には、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して製剤化することができる。
また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば食甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。
【００２２】
経口投与に適当な製剤は、そのまま、または例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等の形態のものであってもよい。また、健康食品、機能性食品、栄養補助食品等の飲食品として用いてもよい。
【００２３】
非経口投与に適当な、例えば注射剤は、好ましくは受容者の血液と等張である一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩を含む滅菌水性剤と、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて調製することができる。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、潤沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することができる。
【００２４】
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤における一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩の濃度は、製剤の種類、該製剤の投与により期待する効果等に応じて適宜選択されるが、例えば経口剤の場合、ＰＱＱ類またはその塩として、通常は０．１〜１００重量％、好ましくは０．５〜７０重量％、特に好ましくは１〜５０重量％である。
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状や重篤度等により異なるが、通常、成人一日当たり、ＰＱＱ類またはその塩として、０．５ｍｇ〜１００００ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜５０００ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇとなるように、一日一回ないし数回投与する。投与期間は、疾患の種類や障害の程度によって適宜選択すればよい。
【００２５】
なお、本発明の製剤は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物（以下、非ヒト動物と略す）に対しても使用することができる。非ヒト動物としては、ほ乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類等、好ましくはほ乳類に属する非ヒト動物を挙げることができる。
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤を非ヒト動物に投与する場合の投与量および投与回数は、投与形態、動物の年齢、種類等により異なるが、通常、体重１ｋｇ１日当たり、一般式（１）で表されるＰＱＱ類またはその塩として、０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜２０ｍｇとなるように一日一回ないし数回投与する。投与期間は、疾患の種類や障害の程度によって適宜選択すればよい。
【実施例】
【００２６】
以下に、実施例および比較例にて本発明を説明するが、本発明はこれらの例にのみに限定されるものではない。
実施例１
試験には、７週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（ｎ＝１１）を用いた。飼育は、室温２２±３℃、湿度５０±２５％の条件下で行い、試料および水は自由摂取とした。7週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラットをペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、脊柱を露出後、第９胸椎の椎弓を切除し、鋭利な刃物で第１０胸髄(Ｔ１０)右側半球を切断した。背筋、皮膚を縫合した後、後肢麻痺を確認し試験に用いた。ＰＱＱ二ナトリウム塩（三菱瓦斯化学株式会社製）を１．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ緩衝液に溶解し、０．５ｍｌ (ＰＱＱ二ナトリウム塩として０．６ｍｇ) を1日１回、7日間にわたり腹腔内に投与した。ＢＢＢ (Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ ａｎｄ Ｂｒｅｓｈｎａｈａｎ) 運動機能評価スケール（Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１２，１−２１，１９９５）を用いて、右後肢の運動機能を毎日評価した。この評価スケールでは、完全な麻痺を０、正常を２１として２１段階で評価する。スケール８までは後肢で体重を支えられないレベル、スケール９を超えると体重を支えられるようになり、１４を越えると前肢と後肢の協調運動が認められ、１９、２０になると一見しただけでは正常と区別しにくいレベルとされている。また、経過観察途中のラットから脊髄損傷部位を摘出し、組織中の誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）およびβ-アクチンのｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝４）。表１にＢＢＢスコアおよびｉＮＯＳｍＲＮＡ発現量の経日変化を示す。なお、ｉＮＯＳｍＲＮＡ発現量は、組織の種類や刺激によらず一定に発現しているハウスキーピング遺伝子で、ｍＲＮＡの発現量変化を検討する際の対照遺伝子として一般的に用いられているβ−アクチンｍＲＮＡの電気泳動時のバンドの濃さを基準としたｉＮＯＳｍＲＮＡ／β−アクチンｍＲＮＡ比を用いて示した。
【表１】
ＰＱＱ二ナトリウム投与群では、ＰＢＳ緩衝液を投与した対照のＰＱＱ二ナトリウム非投与群（下表２参照）に比べ、投与後５―１４日間での運動機能の回復度合いが有意に高く、ＰＱＱ二ナトリウムに脊髄損傷の修復を促進する作用が認められた。
一方、ＰＱＱ二ナトリウム投与群と非投与群でのｉＮＯＳｍＲＮＡの発現量は、各々損傷１日目（２１．２：６４．０）、３日目（１２．０：３５．０）、７日目（１．８：１０．５）、１４日目（１．７：９．９）であり、投与後１−１４でのｉＮＯＳｍＲＮＡの発現量は、ＰＱＱ二ナトリウム投与群が有意に低く、ＰＱＱ二ナトリウムにｉＮＯＳ発現を抑制する作用が認められた。
【００２７】
比較例１
比較試験には、７週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（ｎ＝１０）を用いた。飼育は、室温２２±３℃、湿度５０±２５％の条件下で行い、試料および水は自由摂取とした。7週齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラットをペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、脊柱を露出後、第９胸椎の椎弓を切除し、鋭利な刃物で第１０胸髄(Ｔ１０)右側半球を切断した。背筋、皮膚を縫合した後、後肢麻痺を確認し試験に用いた。ＰＢＳ緩衝液０．５ｍｌを1日１回、7日間にわたり腹腔内に投与した。実施例１と同様に、ＢＢＢ (Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ ａｎｄ Ｂｒｅｓｈｎａｈａｎ) 運動機能評価スケール（Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．、１９９５）を用いて、右後肢の運動機能を毎日評価した（損傷直後は０、非損傷は２１）。また、経過観察中のラットから脊髄損傷部位を摘出し、組織中のｉＮＯＳおよびβ-アクチンのｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝４）。ＢＢＢスコアおよび両ｍＲＮＡの比を表２に示す。
【表２】
ＰＱＱ二ナトリウム非投与の本比較例の場合は、損傷１日後、著明にｉＮＯＳｍＲＮＡ発現が上昇し、３日後には半減したものの、依然としてＰＱＱ二ナトリウム投与１日目の最大値よりも高値を維持した。７日後、１４日後にはさらにｍＲＮＡレベルは低下したが、ＰＱＱ二ナトリウム投与群と異なり、０日に比べ依然として有意に高かった。
このように、ＰＱＱ二ナトリウム塩は脊髄損傷によって誘導される誘導型一酸化窒素合成酵素ｍＲＮＡの発現を阻害する作用を発揮していた。損傷直後には炎症細胞、例えば好中球およびマクロファージが損傷部位に浸潤し、神経組織に対する二次的な損傷を引き起こすとされている。従って、誘導型一酸化窒素合成酵素ｍＲＮＡの発現を抑制することにより、脊髄損傷局所での炎症を抑制し、二次的な損傷を抑え、実施例１のごとく、脊髄損傷の修復を促進したものと考える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表されるピロロキノリンキノン類またはその塩を含有することを特徴とする、誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤。
【化１】
（式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【請求項１】
一般式（１）で表されるピロロキノリンキノン類またはその塩を含有することを特徴とする、誘導型一酸化窒素合成酵素発現抑制剤。
【化１】
（式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【公開番号】特開２０１０−４７５３６（Ｐ２０１０−４７５３６Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１４２９３（Ｐ２００８−２１４２９３）
【出願日】平成２０年８月２２日（２００８．８．２２）
【出願人】（０００００４４６６）三菱瓦斯化学株式会社 (1,281)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２２日（２００８．８．２２）
【出願人】（０００００４４６６）三菱瓦斯化学株式会社 (1,281)
【Ｆターム（参考）】
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