質量分析システムおよび質量分析方法
【課題】 複数安定同位体で標識した生体試料などの２試料の混合液を液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計で比較定量解析すると、多種類の成分が同時にイオン化するため、２次質量分析に必要な時間を十分にとれず、未分析なイオンが生じてしまう。
【解決手段】 ２次質量分析を行い、その分析データからアミノ酸配列解析を行う。アミノ酸配列解析により安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無を判断可能になり、特定アミノ酸が含まれる場合は、ＭＳスペクトル中の同位体標識ペアのｍ／ｚを計算し、算出したｍ／ｚ情報を用いて２次質量分析対象外情報を作成する。その結果、同じペプチド由来の重複した２次質量分析が避けられ、２次質量分析を効率よく行える。
【解決手段】 ２次質量分析を行い、その分析データからアミノ酸配列解析を行う。アミノ酸配列解析により安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無を判断可能になり、特定アミノ酸が含まれる場合は、ＭＳスペクトル中の同位体標識ペアのｍ／ｚを計算し、算出したｍ／ｚ情報を用いて２次質量分析対象外情報を作成する。その結果、同じペプチド由来の重複した２次質量分析が避けられ、２次質量分析を効率よく行える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析装置を用いた質量分析システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、質量分析法を用いた一般的なタンパク質の同定方法はタンデム型質量分析装置を用いて行われる。この技術では、測定対象試料を液体クロマトグラフなどで分離し、イオン化させた後に生成したイオンを質量分析装置に導入し、質量と電荷の比ｍ／ｚ（以下ｍ／ｚと略記する）で分離し、イオンの強度を検出する。この分析法は１次質量分析法と呼ばれる。得られたデータはコンピュータで処理され、ＭＳスペクトルなどのデータとして出力される。タンデム型質量分析装置では、１次質量分析法により得られた、ある特定のｍ／ｚを持つイオンのうちの１つを親イオンとして選択する。選択した親イオンを不活性気体分子に衝突させ、その際の衝突エネルギーの一部を内部エネルギーに変換し、親イオンを活性化することによってイオンの解離を引き起こす。衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ； ＣＩＤ）と呼ばれる方式などが用いられる。これら親イオンの解離によって生じるプロダクトイオンを検出する方法が２次質量分析法と呼ばれる。２次質量分析法によって得られたＭＳ２スペクトルと既知タンパク質の配列情報から求めた理論スペクトルを統計的手法で比較することによってタンパク質は同定される。
【０００３】
質量分析法を用いたタンパク質の定量方法には、絶対定量法でなく、予め安定同位体で標識した内部標準物質を試料に添加する内部標準法がよく用いられる。例えば、アプライドバイオシステム社製のＣｌｅａｖａｂｌｅ ＩＣＡＴ（登録商標）試薬を用いて特定のアミノ酸残基（システイン）に化学標識し、２試料間での比較定量解析を行うと、前処理操作中の回収率のばらつきや質量分析時におけるイオン化のばらつきを最小限にすることが可能となり、精度の高い比較定量解析を行うことができる。比較定量比は標識されたペプチドイオンのＭＳスペクトルのピーク面積を元にして計算される。このとき、必ずしも同位体標識ペアの両方が同定されている必要はない。
【０００４】
血液（血漿・血清）、尿、臓器などに存在するタンパク質を対象としてプロテオミクスと呼ばれる研究手法で網羅的、包括的な研究を行うと、上記のようなタンパク質の同定法、比較定量法を用いた解析手法がよく用いられる。その中で、試料の網羅的、包括的な解析を高スループットで行う方法が研究されているが、様々な困難があり未だ高スループット化が十分になされた状況ではない。その一つの要因として、短時間でタンパク質の同定・定量のための質量分析計測を行うと、同時にイオン化される成分が多すぎるために２次質量分析法に必要な時間を十分にとれず、未分析なイオンが生じてしまう。さらに、上記のような安定同位体元素で標識した試料を用いて２試料間の比較定量解析を行うと、イオン化されるイオン数は２倍になり、２次質量分析に必要な時間をさらに確保できなくなる。そのため、現状では、計測時間が増えてしまう欠点が有るが、試料調製の段階で試料を分画するなどの工夫を行い、同時にイオン化するイオン数を少なくしている。
【０００５】
試料調製の工夫や装置開発の他に、２次質量分析を行う標的イオンを選択する制御ソフトウエアのアルゴリズムを改良することによって、同時に複数のイオンがイオン化されている中で、解析目的とする親イオンだけを効率的に２次質量分析する制御方法の開発が進められている。
【０００６】
上記のような制御ソフトウエアに関連した多くの報告が存在する。
【０００７】
特許文献１では、１次質量分析から得られたＭＳスペクトル中に固有のｍ／ｚのイオンが存在するか判断し、判定結果に応じて２次質量分析を行う。特許文献２では、１次質量分析から得られたＭＳスペクトル中に含まれる強度情報などを有効に活用し、次の２次質量分析を実施する際の親イオンの選定などの分析フローの最適化を図る。特許文献３では、安定同位体元素で標識された試料において１次質量分析から得られたＭＳスペクトルをリアルタイムに解析して、次の２次質量分析を実施する際の親イオンを決定する。特許文献４では、２次質量分析から得られたＭＳスペクトル中のｍ／ｚのピーク情報に基づき、３段目の質量分析である３次質量分析を行うか決定する。特許文献５では、同じ試料を液体クロマトグラフにおける同一分離条件で繰り返し測定する際に、１周目の計測で親イオンを１次質量分析から得られたＭＳスペクトル中のイオンピークの強度を指標として、自動的に選択し、２次質量分析を実施した親イオンの質量情報および液体クロマトグラフの保持時間を内部データベースに自動登録しておき、２周目以降の測定では同じ親イオンを２次質量分析せず、次に強度の高いイオンを測定する。
【０００８】
【特許文献１】国際公開パンフレット第２００２／０２５２６５号
【特許文献２】特開２００６−３２９８８１号公報
【特許文献３】特開２００５−３４５３３２号公報
【特許文献４】特許公報第３７６６３９１号
【特許文献５】特開２００６−０５３００４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
質量分析時に多種類の成分が同時にイオン化すると、２次質量分析に必要な時間を十分にとれず、未分析なイオンが生じてしまう。従来技術では、試料調製の段階で試料を分画するなどの工夫を行い同時にイオン化するイオン数を少なくすることや、２次質量分析に必要な時間の短縮を目的とする装置の開発や、２次質量分析を行う標的イオンを選択する制御ソフトウエアのアルゴリズムの改良などが行われてきた。
安定同位体で標識した２試料の混合液を比較定量解析する場合、従来技術では、未分析イオンの問題を十分に解決することが難しい。なぜなら、２次質量分析を行う工程では安定同位体標識する長所が短所になりイオン数が増えてしまうからである。安定同位体でそれぞれ標識した２試料は、化学的性質が類似しているため試料分離用の液体クロマトグラフから、ほぼ同じ保持時間に溶出される長所がある。この長所は質量分析時における２試料間のイオン化のばらつきを最小限にする。しかし、２次質量分析を行う親イオンを選択する際に、同時にイオン化される成分が２倍に増えるため、親イオンの選択が複雑かつ困難になる。
【００１０】
本発明の目的は、多種類の成分を含む生体試料などの試料を安定同位体で標識し、比較定量解析を行うときに生じた上記課題を解決し、さらに、多量な成分が含まれる中で微量な成分を効率良く分析し、分析時間を短縮する質量分析システム及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
２次質量分析データからアミノ酸配列解析を行い、安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無を判断し、ＭＳスペクトル中の同位体標識ペアのｍ／ｚを計算し、計算したｍ／ｚ情報を用いて２次質量分析を行う標的イオンを効率良く選択する。
【００１２】
そのために、質量数の異なる複数安定同位体で特定アミノ酸を各々標識された複数試料の混合液を用い、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析装置であって、アミノ酸と標識された特定アミノ酸の配列解析を行うアミノ酸配列解析部と、その解析結果からＭＳスペクトル中の同位体標識ペアのｍ／ｚを算出し、２次質量分析を行うか判断する情報処理部をもつ液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析を提供する。
【００１３】
また、前記アミノ酸配列解析部と情報処理部は、質量数の異なる複数安定同位体で作られた３種類の質量数の標識を用いて特定アミノ酸を各々標識された複数試料の混合液や安定同位体標識以外の修飾された試料からでも、２次質量分析を行うか否かを判断できる。
【００１４】
本装置を用いることにより、比較定量比の精度向上や、ペプチドの同定精度の向上や、計測時またはメインテナンス時における質量分析計のクオリティーコントロール情報として利用可能性を得ることができる。
【００１５】
本発明に係わる質量分析システムは、一例として、質量数の異なる複数安定同位体で特定アミノ酸を各々別個に標識された複数試料の混合液を分離する分離部と、前記分離部で分離された試料をイオン化するイオン化部と、前記イオン化部でイオン化されたイオンについて１次質量分析を行い、かつ特定のイオンを親イオンとして解離させる２次質量分析を行う質量分析部と、前記質量分析部の分析結果について処理する情報処理部と、前記複数の安定同位体で標識されたアミノ酸の質量情報を記憶し、かつ、前記２次質量分析で得る２次フラグメントの情報から前記２次質量分析で解離させた前記親イオンのアミノ酸配列を分析するアミノ酸配列解析部と、前記アミノ酸配列解析部の解析結果に基づき、前記２次フラグメントイオンについて、前記特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの有無を判断する情報処理部と前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、２次質量分析対象外イオン情報を作成し、その情報を記憶する記憶部とを有し、前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記特定のイオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記特定のイオンのピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、複数安定同位体により標識された生体試料などの混合液を比較定量解析する際に、同じ成分由来の重複した二次質量分析を避け、微量な成分を効率良く二次質量分析でき、分析時間を短縮できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、図面を参照し、本発明の実施形態について説明する。
【００１８】
本発明の第１実施例について、図１〜図８を用いて説明する。図１は質量分析システム１の実施の形態を示す機能ブロック図である。分析対象の混合試料１０は質量数の異なる複数安定同位体で特定アミノ酸を各々標識された試料を混合したものである。安定同位体には３Ｈ（Ｄ）、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏなどを用いることができる。標識試料の作成方法にはシステインを標識する方法、リジンを標識する方法、トリプトファンを標識する方法、すでに標識されたアミノ酸培地で培養する方法、合成ペプチドを作成する方法など様々な方法がある。以下では、安定同位体標識の方法としてアプライドバイオシステム社製のＣｌｅａｖａｂｌｅ ＩＣＡＴ(登録商標)試薬を採用した例を示す。
【００１９】
Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ＩＣＡＴ(登録商標)試薬はタンパク質に含まれるシステインを重い標識試薬（１３Ｃ１０Ｈ１７Ｎ３Ｏ３、モノアイソトピック質量２３６．１５）または軽い標識試薬（１２Ｃ１０Ｈ１７Ｎ３Ｏ３、モノアイソトピック質量２２７．１５）で標識する。各々標識された試料を混合した後に、トリプシンなどの消化酵素によって切断されペプチドになり、システインが標識されたペプチドが精製される。その後、精製に用いたタグを切断及び除去すると、混合試料１０となる。さらに、分画・脱塩をしても良い。
【００２０】
混合試料１０は試料分離部１１にて液体クロマトグラフまたはガスクロマトグラフまたはキャピラリー電気泳動などで分離・分画される。以下では、試料分離部１１における分離系として液体クロマトグラフを採用した例を示す。液体クロマトグラフではトラップカラムや分離カラムに一旦試料を吸着させる。カラムに導入される移動相溶液の組成に応じて、特定の物質が移動相溶液に溶出される。移動相の組成を段階的に変化させることによりカラムに吸着させた試料を順次溶出させ分離を行う。一方、比較したいペプチド同士は質量数の異なる複数安定同位体で標識されているが、アミノ酸配列が同じであるためカラムに保持される化学的性質はほぼ等しいため、比較したい試料同士が分離されること無く、ほぼ同じ保持時間に同位体標識ペアとなり液体クロマトグラフから溶出される性質がある。
【００２１】
試料分離部１１で分離された試料はイオン化部１２に導入されイオン化し、質量分析部１３に導入される。イオン化の手法にはエレクトロスプレーイオン化法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、電子イオン化法、化学イオン化法、高速原子衝撃法、大気圧イオン化法などがある。以下では、イオン化部１２におけるイオン化法としてエレクトロイオンスプレー法を採用し、正イオンモードで測定した例を示す。
【００２２】
質量分析部１３に導入されたイオンは、質量分析、または、タンデム質量分析され、イオン検出部１４で検出される。質量分析計には、四重極型質量分析計、イオントラップ型質量分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換型質量分析計などがあり、タンデム質量分析計はこれら質量分析部を連結したものから構成されている。イオントラップ型質量分析計は単独でもｎ次質量分析まで可能である。以下では、質量分析部１３における質量分析装置の構成として、イオントラップ型質量分析計と飛行時間型質量分析計のタンデム質量分析装置を採用した例を示す。タンデム型ではあるが、イオントラップ型質量分析計と組み合わせたことにより、ｎ次質量分析まで可能である。
【００２３】
２次質量分析とは、特定のｍ／ｚを持つイオン（親イオン）を選択し、更に、その親イオンを解離し、その際に断片化したフラグメントイオンの質量分析を行う分析法である。更に、２次質量分析で得られたフラグメントイオンのうちの一つを親イオンとして選択し、解離させて得られたフラグメントイオンの質量分析を３次質量分析と呼ぶ。このようにして、選択と解離を他段階で行う質量分析をｎ次質量分析と呼ぶ。
【００２４】
親イオンの解離方法として、イオンをヘリウムなどの不活性気体分子に衝突させて解離させる衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）と呼ばれる方法や、イオンに電子を捕獲させて断片化させる電子捕獲解離（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃａｐｔｕｒｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＥＣＤ）と呼ばれる方法や、イオン同士の反応を利用する事で試料イオンに電子を提供し断片化させる（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＥＴＤ）と呼ばれる方法や、イオンに強い赤外光を照射して解離させる赤外多光子吸収解離（ｉｎｆｒａｒｅｄ ｍｕｌｔｉ−ｐｈｏｔｏｎ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＩＲＭＰＤ）と呼ばれる方法や、イオン化と同時あるいはその直後にイオン化室でおこるインソース分解（ｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ；ＩＳＤ）やイオン源の加速電場を出た後に自然分解するポストソース分解（ｐｏｓｔ ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ；ＰＳＤ）などがあり、以下では、質量分析部１３における親イオンの解離方法としてＣＩＤ法を採用した例を示す。
【００２５】
情報処理部２０で、試料分離部１１、イオン化部１２、質量分析部１３、イオン検出部１４の制御を行い、さらに、得られたデータの解析処理も行う。さらには、アミノ酸配列解析部２１でアミノ酸配列解析を行い、その解析結果を記憶部２２に記憶し、判断処理を行う。さらには、端末３０の制御も行い、表示部３１には解析結果などが表示され、入力部３２からアミノ酸配列解析に必要な情報を入力することができる。
【００２６】
質量分析システムの実施時の流れを図２のフローを用いて示す。混合試料１０は試料分離部１１に導入され分離し、イオン化部１２でイオン化される。イオンは質量分析部１３で１次質量分析されイオン検出部１４で検出される。
【００２７】
情報処理部２０では、公知の方法を用いて１次質量分析結果を解析し、２次質量分析を行う複数の親イオン候補を抽出する（ステップ１００）。親イオン候補の抽出方法として、ＭＳスペクトル中に固有のｍ／ｚのイオンが存在するか判断して抽出する方法や、ＭＳスペクトル中から安定同位体で標識された同位体標識ペアを探し出し抽出する方法など、さまざまな方法がある。以下では、ＭＳスペクトルを解析し、ピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例を図３に示す。
【００２８】
図３では１次質量分析により、３種類のペプチド（ａ、ｂ、ｃ）由来のピークが観測されたＭＳスペクトルを例として示す。本来、ペプチドイオンのピークはモノアイソトピックピークと同位体ピークの両方から構成されるが、図を簡略化するため、モノアイソトピックピークだけで示す。それぞれのペプチドには同位体標識ペアピーク、すなわち、システインを重い標識試薬で標識されたタンパク質に由来するペプチドのピークとシステインを軽い標識試薬で標識されたタンパク質に由来するペプチドのピークとの対が存在するため、合計６本のピークが観察される。強度の大きい順に１〜６までの番号を振り、２次質量分析を行う親イオン候補の優先順位及びピークの番号とする。
【００２９】
次に、情報処理部２０で公知の方法を用いて親イオンの価数を判定する（ステップ１０１）。図４にペプチド由来のピークの模式図を示す。ペプチドのピークはモノアイソトピックピークと同位体ピークから構成される。それぞれのピーク間隔はΔｍである。価数をｚとすると、Δｍ＝１／ｚの関係が成り立つ。Δｍを求めれば容易に親イオンの価数を判定できる。ステップ１００の前にステップ１０１を行ってもよい。
【００３０】
次に、情報処理部２０で親イオン候補の数のループ処理（ステップ１０２）を行う。
【００３１】
次に、情報処理部２０で記憶部２２と照合し、候補として挙げた親イオンの２次質量分析が禁止されているか判断する（ステップ１０３）。禁止されてなければ、候補親イオンは次の２次質量分析に進み、禁止の場合はステップ１０２に戻り、新たな親イオンを候補に挙げてステップ１０３に進む。ステップ１０３における判断材料として必要な情報は記憶部２２に記憶されている。記憶部２２に記憶された判断情報内容の例を図５に示す。親イオンのｍ／ｚ情報と、その属性情報として２次質量分析は非対象であると指示する情報である。親イオンのｍ／ｚ情報には親イオンのモノアイソトピック質量が記憶される。そのほかの情報として、親イオンの価数、ＭＳスペクトルの強度、液体クロマトグラフでの溶出時間、２次質量分析の分析回数、ＭＳ２スペクトルの強度、記憶情報有効時間などの選択基準を記憶させても良い。記憶部２２に記憶される記憶情報は、予め入力部３２から入力されていてもよい。
【００３２】
ステップ１０３において候補親イオンのｍ／ｚと記憶部に記憶されたｍ／ｚを比較するとき、候補親イオンのｍ／ｚと記憶部に記憶されたｍ／ｚの差であるΔｍ／ｚがδの範囲内、すなわち、｜Δｍ／ｚ｜＜δであるイオンを同一の親イオンとみなしている。δは質量分析計の質量数測定誤差としてもよい。
【００３３】
次に、２次質量分析に進めた親イオンは２次質量分析されイオン検出部で検出される。得られたＭＳ２スペクトルはアミノ酸配列解析部２１でアミノ酸配列解析される（ステップ１０４）。アミノ酸配列解析法として、ペプチドの部分配列をｄｅ ｎｏｖｏ配列解析する手法を用いる。ＭＳ２スペクトル中のフラグメントイオンの間隔に対応する質量のアミノ酸があるかどうか調べ配列解析する方法である。すなわち、既知タンパク質のアミノ酸配列データベースに依存せず、配列を決定できる方法である。そのため、配列が未知なペプチドでも、複数安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無が判断可能になる。
【００３４】
また、複数安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無の判断は、まれにＭＳ２スペクトル中に観測される複数安定同位体で標識された特定アミノ酸のモノアイソトピック質量または標識物のモノアイソトピック質量から判断もできるが、特定アミノ酸の個数が単数か複数か区別できない欠点がある。
【００３５】
また、複数安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無の判断は、ｄｅ ｎｏｖｏ配列解析しなくても、その解析中に行われるフラグメントイオン間の質量差が複数安定同位体で標識された特定アミノ酸のモノアイソトピック質量と等しいかどうかだけ着目して解析すれば判断できるが、ｄｅ ｎｏｖｏ配列解析時に得られるイオンの種類（ｙイオン、ｂイオンなど）情報、配列の連続性情報、解読できた配列数情報などを補助的な情報として、より信頼性の高い判断を行うことが好ましい。
【００３６】
図６に、複数安定同位体で標識された特定アミノ酸配列解析時に必須なモノアイソトピック質量情報の入力画面（表示部に表示される入力部）の例を示す。入力画面１０００から情報を入力（もしくは選択）する。特定アミノ酸名称入力フィールド１００１に、標識された特定アミノ酸名称を入力し、対応するモノアイソトピック質量入力フィールド１００２にモノアイソトピック質量を入力する。登録ボタン１００３を押し登録する。これらの特定アミノ酸の情報は予め入力されていても良い。２０種類ある基本アミノ酸のモノアイソトピック質量情報は予め入力されていても良い。
【００３７】
ステップ１０４における特定アミノ酸も含めたアミノ酸配列解析の例を図７に示す。二次質量分析により得られたＭＳ２スペクトル中のフラグメントイオンのピーク間隔と入力部で入力されたモノアイソトピック質量から、ピーク間隔に対応するアミノ酸を決定できる。ピーク２とピーク１の質量差に対応するアミノ酸はロイシンであり、ピーク３とピーク２の質量差に対応するアミノ酸は軽い標識化システインであり、ピーク４とピーク３の質量差に対応するアミノ酸はフェニルアラニンであり、ピーク５とピーク４の質量差に対応するアミノ酸はロイシンであることが分かる。以上のようにして特定アミノ酸を見つけることができる。
【００３８】
次にアミノ酸配列解析部２２で特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンが有と判断されたとき、情報処理部２０で同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚを計算する（ステップ１０５）。
【００３９】
同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法の流れを図８に示す。最初にアミノ酸配列解析部２２で特定アミノ酸の個数を数え（ステップ２００）、次に、特定アミノ酸を標識した安定同位体の質量数で場合分けを行う（ステップ２０１）。アミノ酸配列解析部２２で、重い標識化システインのみが有と判断されたとき、「より重い」と判断し、ステップ２０２に進み、軽い標識化システインのみが有と判断されたとき「より軽い」と判断し、ステップ２０３に進み、重い標識化システインと軽い標識化システインの両方が有と判断されたとき、「その他」と判断し、終了のステップに進む。ステップ２０２では、親イオンに隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出（式１、数３または数４）し、終了する。
【００４０】
親イオンのｍ／ｚをＭＯ、価数をｚＯ、特定アミノ酸の個数をｎＬ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量をＬＯ、水素原子のモノアイソトピック質量をＨ、特定アミノ酸が標識されていないペプチドのモノアイソトピック質量をＭｒとしたとき、エレクトロスプレーイオン化法の正イオンモードで観測された、親イオンのｍ／ｚは、
【００４１】
【数１】
となり、Ｍｒは式１−１より
【００４２】
【数２】
となる。同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚをＭＰ、価数をｚＰ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量をＬＰとすると、
【００４３】
【数３】
となり、式１−３に式１−２を代入すると、
【００４４】
【数４】
となる。ＭＰは（式１−３）または（式１−４）の何れからか算出できる。負イオンモードの時はプロトンを引いた式にすればよい。
【００４５】
ｍ／ｚの算出方法を式１に数値を入れて示す。親イオンのｍ／ｚであるＭＯが６６９．３１、価数であるｚＯが２、特定アミノ酸の個数であるｎＬが１、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＯが２３６．１５、水素原子のモノアイソトピック質量であるＨが１、特定アミノ酸が安定同位体で標識されていないペプチドのモノアイソトピック質量であるＭｒは式１−２より、１１００．４７となる。隣接する同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚであるＭＰは、価数をｚＰ＝ｚＯ、標識物のモノアイソトピック質量であるＬＰを２２７．１５とすると、式１−３から６６４．８１となる。
【００４６】
以上に示した同位体標識ペアのｍ／ｚの算出方法は、ＭＳ２スペクトル中から特定アミノ酸の直接的な証拠を得てから算出するため擬陽性が生じにくい特徴がある。
【００４７】
ステップ２０３に進んだ場合、式１から同様にして、親イオンに隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出し、終了する。
【００４８】
次に、情報処理部２０でステップ２０２またはステップ２０３で算出した親イオンのｍ／ｚを２次質量分析対象外情報として記憶部に登録する。親イオンのｍ／ｚも２次質量分析対象外情報として記憶部に登録してもよい（ステップ１０６）。
【００４９】
全ての親イオン候補について、ステップ１０２に戻り繰り返す。
【００５０】
次に、試料分離部から溶出されていない試料が残っている場合は、新たに試料分離部から溶出された試料をイオン化するフローに戻る。全ての試料の分離作業が終了していれば、分析を終了し、図２の質量分析フローは終了する。
【００５１】
以上のフローに従って実施すると、図３で示した第１実施例の２次質量分析の順番は以下のようになる。最初にペプチドｂ由来のピーク１が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク２のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。次にペプチドａ由来のピーク３が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク４のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。次にペプチドｃ由来のピーク５が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク６のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。以上の流れにより、従来ならば６回の二次質量分析が必要であるフローが１／２の分析回数で済む。
【００５２】
次に第２実施例について図９を用いて説明する。ここでは、ｎ次質量分析が可能なイオントラップ型質量分析計を用いて、十分な強度を持つフラグメントイオンのアミノ酸配列解析を繰り返し行う。
【００５３】
第１実施例における図２のフローと多くのステップが共通している。新たに増えたステップだけを説明する。まず、ステップ３００でｎ次質量分析の初期値２を入れる。次にステップ３０１でｎ次質量分析を行う。次のステップのイオン検出、アミノ酸配列解析はｎ値に関係なく同じ手法で行われる。ステップ３０２で（ｎ＋１）次質量分析を行うか判断する。例えば、フラグメントイオンの最大強度がある閾値以上のとき、（ｎ＋１）次質量分析を行うと判断してもよい。（ｎ＋１）次質量分析を行うと判断されたとき、ステップ３０３でｎに１を加える。ステップ３０４で選択、解離を行う親イオンを選定する。例えば、最大強度のフラグメントイオンを親イオンに選定してもよい。アミノ酸配列解析を繰り返すため、実施例１よりもアミノ酸配列解析情報が多く得られ、より精度よく特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの有無を明らかにすることができる。
【００５４】
次に第３実施例について図１０、図１１を用いて説明する。ここでは質量数の異なる複数安定同位体で作られた３種類の質量数の安定同位体標識の方法としてＳＥＲＶＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ社製のＳＥＲＶＡ ＩＣＰＬ(登録商標)Ｔｒｉｐｌｅｘ−Ｋｉｔ試薬を採用した例を示す。
【００５５】
ＳＥＲＶＡ ＩＣＰＬ(登録商標) Ｔｒｉｐｌｅｘ−Ｋｉｔ試薬は、リジンを重い標識試薬（１−（１３Ｃ６１Ｈ４）−Ｎｉｃｏｔｉｎｏｙｌｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、モノアイソトピック質量１１１．０４１９）または中間の質量の標識試薬（１−（１２Ｃ６１Ｄ４）−Ｎｉｃｏｔｉｎｏｙｌｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、モノアイソトピック質量１０９．０７１５）または軽い標識試薬（１−（１２Ｃ６１Ｈ４）−Ｎｉｃｏｔｉｎｏｙｌｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、モノアイソトピック質量１０５．０２１５）で標識する。
図６のようなモノアイソトピック質量情報入力画面を通して三種類の特定アミノ酸（重い標識化リジン、中間の標識化リジン、軽い標識化リジン）のモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。
【００５６】
３種の混合試料は第１実施例または第２実施例で説明した方法で計測される。その中でステップ１０５における同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法が違う。以下で詳細に説明する。
【００５７】
３種類の質量数の標識で標識されたときの同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法の流れを図１０に示す。最初にアミノ酸配列解析部２２で特定アミノ酸の個数を数え（ステップ４００）、次に、特定アミノ酸を標識された複数安定同位体の質量数で場合分けを行う（ステップ４０１）。アミノ酸配列解析部２２で、重い標識化リジンのみが有と判断されたとき、「より重い」と判断し、ステップ４０２に進み、中間の標識化リジンのみが有と判断されたとき、「中間」と判断し、ステップ４０３に進み、軽い標識化リジンのみが有と判断されたとき「より軽い」と判断し、ステップ４０４に進み、２種類以上の標識化リジンが有と判断されたとき、「その他」と判断し、終了のステップに進む。ステップ４０２では、親イオンに隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚと、中間の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出（式１）し、終了する。
【００５８】
ｍ／ｚの算出方法を式１に数値を入れて示す。親イオンのｍ／ｚであるＭＯが６６９．３１、価数であるｚＯが２、特定アミノ酸の個数であるｎＬが１、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＯが１１１．０４１９、水素原子のモノアイソトピック質量であるＨが１、特定アミノ酸が標識されていないペプチドのモノアイソトピック質量であるＭｒは式１−２より、１２２５．５７となる。隣接する、より軽い同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚであるＭＰ１は、価数をｚＰ＝ｚＯ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＰを１０５．０２１５とすると、式１−３から６６６．２９となる。隣接する、より中間の同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚであるＭＰ２は、価数をｚＰ＝ｚＯ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＰを１０９．０７１５とすると、式１−３から６６８．３２となる。
【００５９】
ステップ４０３に進んだ場合、式１から同様にして、親イオンに隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚと、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出し、終了する。
【００６０】
ステップ４０４に進んだ場合、式１から同様にして、親イオンに隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚと、中間の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出し、終了する。
【００６１】
以上のフローに従って実施したときの、２次質量分析の解析順番を図１１の例を用いて説明する。図１１では１次質量分析により２種類のペプチド（ａ、ｂ）由来のピークが観測されたＭＳスペクトルを例として示す。図を簡略化するためペプチドイオンのピークはモノアイソトピックピークだけで示す。それぞれのペプチドには同位体標識ペアピークが存在するため、合計６本のピークが観察される。強度の大きい順に１〜６までの番号を振り、２次質量分析を行う親イオン候補の優先順位及びピークの番号とする。最初にペプチドｂ由来のピーク１が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク２とピーク３のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。次にペプチドａ由来のピーク４が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク５とピーク６のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。以上の流れにより、従来ならば６回の二次質量分析が必要であるフローが１／３の分析回数で済む。
【００６２】
第３実施例は質量数の異なる複数安定同位体で作られたｎ種類の質量数の安定同位体標識された混合試料にも適用したものである。この場合、以下の手順を行えば適用できる。図６のようなモノアイソトピック質量情報入力画面を通してｎ種類の特定アミノ酸のモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。安定同位体ペアのｍ／ｚの計算時に、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＰにそれぞれの標識物のモノアイソトピック質量を代入すれば、式１−３から全ての安定同位体ペアのｍ／ｚを算出できる。
【００６３】
次に第４実施例について図１２を用いて説明する。ここでは、親イオンの価数が違う同位体標識ペアのｍ／ｚを算出し、２次質量分析対象外とする。
【００６４】
図１２では、１次質量分析の結果、１種類のペプチドａ由来のピークが観測されたＭＳスペクトルを例として示す。図を簡略化するためペプチドイオンのピークはモノアイソトピックピークだけで示す。ａ１は１価のピーク、ａ２は２価のピーク、ａ３は３価のピークを示している。それぞれの価数に付き同位体標識ペアピークが存在するため、合計６本のピークが観察される。強度の大きい順に１〜６までの番号を振り、２次質量分析を行う親イオン候補の優先順位及びピークの番号とする。最初に価数が２のピーク１が２次質量分析されると、その同位体標識ペアピークであるピーク２のｍ／ｚが第１実施例の方法によって算出され２次質量分析対象外となる。さらに、式１−３においてペアとなるイオンの価数であるｚＰに３を代入すると、ピーク４のｍ／ｚが求められ、価数ｚＰに１を代入するとピーク６のｍ／ｚが求める。さらに、式１−４において標識物のモノアイソトピックピーク質量が同じ（ＬＯ＝ＬＰ）とし、ペアとなるイオンの価数であるｚＰに３を代入するとピーク３のｍ／ｚが求められ、価数ｚＰに１を代入するとピーク５のｍ／ｚが求められ、２次質量分析対象外となる。以上の流れにより、従来ならば６回の二次質量分析が必要であるフローが１／６の分析回数で済む。
【００６５】
また、第４実施例は、第２実施例で示したｎ次質量分析が可能なイオントラップ型質量分析計を用いて実施することができる。また、第４実施例は、第３実施例で示した質量数の異なる複数安定同位体で作られたｎ種類の安定同位体標識された混合試料で実施することができる。
【００６６】
次に第５実施例について図１３を用いて説明する。ここでは、修飾されたペプチドから同位体標識ペアのｍ／ｚを算出（式２、数８または数９）し、２次質量分析対象外とする。修飾の例として、スレオニンのリン酸化を採用した例を示す。図６のようなモノアイソトピック質量情報入力画面を通してリン酸化スレオニンのモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。
【００６７】
修飾物のモノアイソトピック質量をＭとしたとき、ｋ種の修飾物のモノアイソトピック質量の和は、
【００６８】
【数５】
となる。
【００６９】
親イオンのｍ／ｚをＭＯ、価数をｚＯ、特定アミノ酸の個数をｎＬ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量をＬＯ、水素原子のモノアイソトピック質量をＨ、特定アミノ酸が標識されていないペプチドのモノアイソトピック質量をＭｒとしたとき、エレクトロスプレーイオン化法の正イオンモードで観測された、ペプチドの修飾を考慮した親イオンのｍ／ｚは、式２−１を式１−１に加えることにより求めると、
【００７０】
【数６】
となり、Ｍｒは式２−２より
【００７１】
【数７】
となる。ペプチドの修飾を考慮していない同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚをＭＰ、価数をｚＰ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量をＬＰとすると、
【００７２】
【数８】
となり、式２−４に式２−３を代入すると、
【００７３】
【数９】
となる。ＭＰは（式２−４）または（式２−５）の何れからか算出できる。負イオンモードの時はプロトンを引いた式にすればよい。
【００７４】
図１３では、１次質量分析の結果、１種類のペプチドａ由来のピークと修飾されたペプチドａ＊由来のピークが観測されたＭＳスペクトルを例として示す。図を簡略化するためペプチドイオンのピークはモノアイソトピックピークだけで示す。ａ１とａ＊１は１価のピーク、ａ２とａ＊２は２価のピーク、ａ３とａ＊３は３価のピークを示している。それぞれの価数に付き同位体標識ペアピークが存在するため、合計１２本のピークが観察される。強度の大きい順に１〜１２までの番号を振り、２次質量分析を行う親イオン候補の優先順位及びピークの番号とする。最初に価数が２のピーク１が２次質量分析されると、アミノ酸配列解析結果よりリン酸化スレオニンの有無が判断できる。１個のリン酸化スレオニンが有と判断されたとき、式２−１における修飾物のモノアイソトピック質量であるＭは７９．９６となる。特定アミノ酸の個数であるｎＬ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＯもアミノ酸配列解析結果から同時に得られ、水素原子のモノアイソトピック質量であるＨを１、ピーク１の親イオンのｍ／ｚをＭＯ、価数をｚＯとして式２−２または式２−３に代入するとＭｒが求められ、リン酸化されていないペプチドの同位体標識ペアであるピーク４のｍ／ｚが式２−４または式２−５より算出できる。
【００７５】
さらに、第４実施例の方法を用いると、ピーク１からピーク２、ピーク５、ピーク６、ピーク９、ピーク１０のｍ／ｚが求められ、ピーク４からピーク３、ピーク７、ピーク８、ピーク１１、ピーク１２のｍ／ｚが求められ、２次質量分析対象外となる。以上の流れにより、従来ならば１２回の二次質量分析が必要であるフローが１／１２の分析回数で済む。
【００７６】
第５実施例は複数箇所のアミノ酸が修飾されたペプチドであっても以下の手順を行えば適用できる。図６のようなモノアイソトピック質量情報入力画面を通して複数個の修飾物のモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。
【００７７】
また、修飾されたペプチドと修飾されてないペプチドは液体クロマトグラフのカラムに保持される化学的性質が異なるため溶出時間が若干異なる事もあるが、記憶部で２次質量分析対象外リストを記憶し続けられるため、溶出時間が異なっても２次質量分析対象外の判断が行える。さらに、経験的に求められる溶出時間の違いを、記憶部２２に記憶情報有効時間として予め入力部から入力しておけば、有効時間の終了後に別種類のペプチドが同じｍ／ｚに計測された場合、２次質量分析を行うことができる。また、リン酸化ペプチドの解析時に親イオンの解離をＣＩＤ法で行うとリン酸基が脱落しやすい。リン酸基の脱落しにくいＥＣＤ法またはＥＴＤ法を用いる事が望ましい。
【００７８】
また、第５実施例はリン酸化だけでなく酸化、アセチル化、ユビキチン化、脂質修飾、糖鎖修飾、過酸化脂質修飾、グリケーション、ニトロシル化などの様々なタンパク質の翻訳後修飾に適用できるが、適用が難しい場合もある。例えば、基本２０種のアミノ酸のモノアイソトピック質量と修飾されたアミノ酸のモノアイソトピック質量が近い場合、両者の区別は難しい。例えば、フェニルアラニンのモノアイソトピック質量は１４７．０６でありメチオニンが酸化された場合の酸化メチオニンのモノアイソトピック質量は１４７．０３である。そのような場合は、アミノ酸配列解析時に用いる質量分析部に質量精度のよいフーリエ変換型質量分析計を用いる事が望ましい。
【００７９】
また、第５実施例は親イオンの解離時にセリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸から脱水（−１８Ｄａ）する場合やアルギニン、リジン、アスパラギン、グルタミンから脱アンモニア（−１７Ｄａ）する場合も以下の手順を行えば適用できる。図６のようなモノアイソトピック質量の情報入力画面を通して水やアンモニアの脱離したアミノ酸のモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。また、第５実施例はアミノ酸配列解析時に安定同位体で標識された特定アミノ酸と特定修飾アミノ酸の有無を判断し、両方が有の時に二次質量分析対象外情報を作成するが、特定修飾アミノ酸だけが有の時にも二次質量分析対象外情報を作成してもよい。また、第５実施例は、第２実施例で示したｎ次質量分析が可能なイオントラップ型質量分析計を用いて実施することができる。また、第５実施例は、第３実施例で示した質量数の異なる複数安定同位体で作られたｎ種類の安定同位体標識された混合試料で実施することができる。
第１実施例〜第５実施例では算出したｍ／ｚ情報を全て二次質量分析の対象外情報にしたが、二次質量分析の対象情報にしてもよい。その場合は図５に示したｍ／ｚ情報の属性を２次質量分析対象とする。比較定量したい同位体標識ペアを優先的に同定したい場合に用いるとよい。
【００８０】
次に第６実施例について説明する。ここでは、親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含む条件で、１次質量分析の積算回数または測定時間を調整して行う。
【００８１】
第１実施例〜第３実施例にて説明した方法で計測された試料は、ステップ１０５における同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚを計算後、ループを抜け出し、積算回数または測定時間を調整して１次質量分析を行う。このとき、高速に分析を行うために親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含むｍ／ｚ範囲で１次質量分析を行っても良い。１次質量分析結果のＳＮ比がよくなることにより、１次質量分析データを元にして算出する比較定量比の精度がよくなる。
【００８２】
次に第７実施例について説明する。ここでは、親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含む条件で、２次質量分析の積算回数または測定時間を調整して行う。第１実施例〜第３実施例で説明した方法で計測された試料は、ステップ１０５における同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚを計算後、ループを抜け出し、積算回数または測定時間を調整して親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを選択および解離して２次質量分析を行う。全部の親イオンの情報を用いることにより、単独ではイオン量が少なく同定が困難なペプチドを同定できる可能性が増える。
【００８３】
次に第８実施例について図１４を用いて説明する。ここでは、２次質量分析回数あたりの特定アミノ酸出現回数を表示する。第１実施例、第２実施例で示した方法で計測された試料は、ステップ１０５における同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算時に特定アミノ酸の出現回数情報をステップ２００で作成する。さらに、２次質量分析ステップで２次質量分析回数情報を作成する。モニタ画面１０００では、二次質量分析回数がフィールド２００１に表示され、特定アミノ酸の出現回数がフィールド２００２に表示され、より重い安定同位体の出現回数がフィールド２００３に表示され、より軽い安定同位体の出現回数がフィールド２００４に表示される。回数表示フィールドを増やすことにより、第３実施例、第５実施例で示した特定アミノ酸の種類が増えた場合でも表示できる。
【００８４】
以上の表示により、計測者が計測終了後に時間をかけて詳細な解析をしなくても、計測の途中で、試料中に含まれる特定アミノ酸で標識された試料のおおよその数および割合がわかり、試料について考察できる。また、計測時やメインテナンス時における質量分析計のクオリティーコントロール情報としても活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明に係る質量分析システムの実施の形態を示す機能ブロックを示した説明図である。
【図２】本発明の第１実施例による質量分析フローの流れを示した説明図である。
【図３】本発明の第１実施例によるＭＳスペクトルを解析してピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例の説明図である。
【図４】本発明の第１実施例による親イオンの価数判定方法の例の説明図である。
【図５】本発明の第１実施例による記憶部に記憶された判断情報内容の例の説明図である。
【図６】本発明の第１実施例における特定アミノ酸配列解析時に必須なモノアイソトピック質量情報の入力画面の例の説明図である。
【図７】本発明の第１実施例における特定アミノ酸も含めたアミノ酸配列解析の例の説明図である。
【図８】本発明の第１実施例による同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法を示した説明図である。
【図９】本発明の第２実施例によるｎ次質量分析に対応した質量分析フローの流れを示した説明図である。
【図１０】本発明の第３実施例による３種類の質量数の標識で標識したときの同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法を示した説明図である。
【図１１】本発明の第３実施例による３種類の質量数の標識で標識された試料のＭＳスペクトルを解析してピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例を示した説明図である。
【図１２】本発明の第４実施例による親イオンの価数が違う同位体標識ペアのＭＳスペクトルを解析してピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例を示した説明図である。
【図１３】本発明の第５実施例による修飾されたペプチドの同位体標識ペアのＭＳスペクトルを解析してピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例を示した説明図である。
【図１４】本発明の第８実施例における２次質量分析回数あたりの特定アミノ酸出現回数の表示例を示した説明図である。
【符号の説明】
【００８６】
１ 質量分析システム
１０ 混合試料
１１ 試料分離部
１２ イオン化部
１３ 質量分析部
１４ イオン検出部
２０ 情報処理部
２１ アミノ酸配列解析部
２２ 記憶部
３０ 端末
３１ 表示部
３２ 入力部
１０００ モニタ画面
１００１ 特定アミノ酸名称入力フィールド
１００２ モノアイソトピック質量入力フィールド
１００３ 登録ボタン
２００１、２００２、２００３、２００４ 回数表示フィールド。
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析装置を用いた質量分析システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、質量分析法を用いた一般的なタンパク質の同定方法はタンデム型質量分析装置を用いて行われる。この技術では、測定対象試料を液体クロマトグラフなどで分離し、イオン化させた後に生成したイオンを質量分析装置に導入し、質量と電荷の比ｍ／ｚ（以下ｍ／ｚと略記する）で分離し、イオンの強度を検出する。この分析法は１次質量分析法と呼ばれる。得られたデータはコンピュータで処理され、ＭＳスペクトルなどのデータとして出力される。タンデム型質量分析装置では、１次質量分析法により得られた、ある特定のｍ／ｚを持つイオンのうちの１つを親イオンとして選択する。選択した親イオンを不活性気体分子に衝突させ、その際の衝突エネルギーの一部を内部エネルギーに変換し、親イオンを活性化することによってイオンの解離を引き起こす。衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ； ＣＩＤ）と呼ばれる方式などが用いられる。これら親イオンの解離によって生じるプロダクトイオンを検出する方法が２次質量分析法と呼ばれる。２次質量分析法によって得られたＭＳ２スペクトルと既知タンパク質の配列情報から求めた理論スペクトルを統計的手法で比較することによってタンパク質は同定される。
【０００３】
質量分析法を用いたタンパク質の定量方法には、絶対定量法でなく、予め安定同位体で標識した内部標準物質を試料に添加する内部標準法がよく用いられる。例えば、アプライドバイオシステム社製のＣｌｅａｖａｂｌｅ ＩＣＡＴ（登録商標）試薬を用いて特定のアミノ酸残基（システイン）に化学標識し、２試料間での比較定量解析を行うと、前処理操作中の回収率のばらつきや質量分析時におけるイオン化のばらつきを最小限にすることが可能となり、精度の高い比較定量解析を行うことができる。比較定量比は標識されたペプチドイオンのＭＳスペクトルのピーク面積を元にして計算される。このとき、必ずしも同位体標識ペアの両方が同定されている必要はない。
【０００４】
血液（血漿・血清）、尿、臓器などに存在するタンパク質を対象としてプロテオミクスと呼ばれる研究手法で網羅的、包括的な研究を行うと、上記のようなタンパク質の同定法、比較定量法を用いた解析手法がよく用いられる。その中で、試料の網羅的、包括的な解析を高スループットで行う方法が研究されているが、様々な困難があり未だ高スループット化が十分になされた状況ではない。その一つの要因として、短時間でタンパク質の同定・定量のための質量分析計測を行うと、同時にイオン化される成分が多すぎるために２次質量分析法に必要な時間を十分にとれず、未分析なイオンが生じてしまう。さらに、上記のような安定同位体元素で標識した試料を用いて２試料間の比較定量解析を行うと、イオン化されるイオン数は２倍になり、２次質量分析に必要な時間をさらに確保できなくなる。そのため、現状では、計測時間が増えてしまう欠点が有るが、試料調製の段階で試料を分画するなどの工夫を行い、同時にイオン化するイオン数を少なくしている。
【０００５】
試料調製の工夫や装置開発の他に、２次質量分析を行う標的イオンを選択する制御ソフトウエアのアルゴリズムを改良することによって、同時に複数のイオンがイオン化されている中で、解析目的とする親イオンだけを効率的に２次質量分析する制御方法の開発が進められている。
【０００６】
上記のような制御ソフトウエアに関連した多くの報告が存在する。
【０００７】
特許文献１では、１次質量分析から得られたＭＳスペクトル中に固有のｍ／ｚのイオンが存在するか判断し、判定結果に応じて２次質量分析を行う。特許文献２では、１次質量分析から得られたＭＳスペクトル中に含まれる強度情報などを有効に活用し、次の２次質量分析を実施する際の親イオンの選定などの分析フローの最適化を図る。特許文献３では、安定同位体元素で標識された試料において１次質量分析から得られたＭＳスペクトルをリアルタイムに解析して、次の２次質量分析を実施する際の親イオンを決定する。特許文献４では、２次質量分析から得られたＭＳスペクトル中のｍ／ｚのピーク情報に基づき、３段目の質量分析である３次質量分析を行うか決定する。特許文献５では、同じ試料を液体クロマトグラフにおける同一分離条件で繰り返し測定する際に、１周目の計測で親イオンを１次質量分析から得られたＭＳスペクトル中のイオンピークの強度を指標として、自動的に選択し、２次質量分析を実施した親イオンの質量情報および液体クロマトグラフの保持時間を内部データベースに自動登録しておき、２周目以降の測定では同じ親イオンを２次質量分析せず、次に強度の高いイオンを測定する。
【０００８】
【特許文献１】国際公開パンフレット第２００２／０２５２６５号
【特許文献２】特開２００６−３２９８８１号公報
【特許文献３】特開２００５−３４５３３２号公報
【特許文献４】特許公報第３７６６３９１号
【特許文献５】特開２００６−０５３００４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
質量分析時に多種類の成分が同時にイオン化すると、２次質量分析に必要な時間を十分にとれず、未分析なイオンが生じてしまう。従来技術では、試料調製の段階で試料を分画するなどの工夫を行い同時にイオン化するイオン数を少なくすることや、２次質量分析に必要な時間の短縮を目的とする装置の開発や、２次質量分析を行う標的イオンを選択する制御ソフトウエアのアルゴリズムの改良などが行われてきた。
安定同位体で標識した２試料の混合液を比較定量解析する場合、従来技術では、未分析イオンの問題を十分に解決することが難しい。なぜなら、２次質量分析を行う工程では安定同位体標識する長所が短所になりイオン数が増えてしまうからである。安定同位体でそれぞれ標識した２試料は、化学的性質が類似しているため試料分離用の液体クロマトグラフから、ほぼ同じ保持時間に溶出される長所がある。この長所は質量分析時における２試料間のイオン化のばらつきを最小限にする。しかし、２次質量分析を行う親イオンを選択する際に、同時にイオン化される成分が２倍に増えるため、親イオンの選択が複雑かつ困難になる。
【００１０】
本発明の目的は、多種類の成分を含む生体試料などの試料を安定同位体で標識し、比較定量解析を行うときに生じた上記課題を解決し、さらに、多量な成分が含まれる中で微量な成分を効率良く分析し、分析時間を短縮する質量分析システム及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
２次質量分析データからアミノ酸配列解析を行い、安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無を判断し、ＭＳスペクトル中の同位体標識ペアのｍ／ｚを計算し、計算したｍ／ｚ情報を用いて２次質量分析を行う標的イオンを効率良く選択する。
【００１２】
そのために、質量数の異なる複数安定同位体で特定アミノ酸を各々標識された複数試料の混合液を用い、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析装置であって、アミノ酸と標識された特定アミノ酸の配列解析を行うアミノ酸配列解析部と、その解析結果からＭＳスペクトル中の同位体標識ペアのｍ／ｚを算出し、２次質量分析を行うか判断する情報処理部をもつ液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析を提供する。
【００１３】
また、前記アミノ酸配列解析部と情報処理部は、質量数の異なる複数安定同位体で作られた３種類の質量数の標識を用いて特定アミノ酸を各々標識された複数試料の混合液や安定同位体標識以外の修飾された試料からでも、２次質量分析を行うか否かを判断できる。
【００１４】
本装置を用いることにより、比較定量比の精度向上や、ペプチドの同定精度の向上や、計測時またはメインテナンス時における質量分析計のクオリティーコントロール情報として利用可能性を得ることができる。
【００１５】
本発明に係わる質量分析システムは、一例として、質量数の異なる複数安定同位体で特定アミノ酸を各々別個に標識された複数試料の混合液を分離する分離部と、前記分離部で分離された試料をイオン化するイオン化部と、前記イオン化部でイオン化されたイオンについて１次質量分析を行い、かつ特定のイオンを親イオンとして解離させる２次質量分析を行う質量分析部と、前記質量分析部の分析結果について処理する情報処理部と、前記複数の安定同位体で標識されたアミノ酸の質量情報を記憶し、かつ、前記２次質量分析で得る２次フラグメントの情報から前記２次質量分析で解離させた前記親イオンのアミノ酸配列を分析するアミノ酸配列解析部と、前記アミノ酸配列解析部の解析結果に基づき、前記２次フラグメントイオンについて、前記特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの有無を判断する情報処理部と前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、２次質量分析対象外イオン情報を作成し、その情報を記憶する記憶部とを有し、前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記特定のイオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記特定のイオンのピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、複数安定同位体により標識された生体試料などの混合液を比較定量解析する際に、同じ成分由来の重複した二次質量分析を避け、微量な成分を効率良く二次質量分析でき、分析時間を短縮できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、図面を参照し、本発明の実施形態について説明する。
【００１８】
本発明の第１実施例について、図１〜図８を用いて説明する。図１は質量分析システム１の実施の形態を示す機能ブロック図である。分析対象の混合試料１０は質量数の異なる複数安定同位体で特定アミノ酸を各々標識された試料を混合したものである。安定同位体には３Ｈ（Ｄ）、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏなどを用いることができる。標識試料の作成方法にはシステインを標識する方法、リジンを標識する方法、トリプトファンを標識する方法、すでに標識されたアミノ酸培地で培養する方法、合成ペプチドを作成する方法など様々な方法がある。以下では、安定同位体標識の方法としてアプライドバイオシステム社製のＣｌｅａｖａｂｌｅ ＩＣＡＴ(登録商標)試薬を採用した例を示す。
【００１９】
Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ＩＣＡＴ(登録商標)試薬はタンパク質に含まれるシステインを重い標識試薬（１３Ｃ１０Ｈ１７Ｎ３Ｏ３、モノアイソトピック質量２３６．１５）または軽い標識試薬（１２Ｃ１０Ｈ１７Ｎ３Ｏ３、モノアイソトピック質量２２７．１５）で標識する。各々標識された試料を混合した後に、トリプシンなどの消化酵素によって切断されペプチドになり、システインが標識されたペプチドが精製される。その後、精製に用いたタグを切断及び除去すると、混合試料１０となる。さらに、分画・脱塩をしても良い。
【００２０】
混合試料１０は試料分離部１１にて液体クロマトグラフまたはガスクロマトグラフまたはキャピラリー電気泳動などで分離・分画される。以下では、試料分離部１１における分離系として液体クロマトグラフを採用した例を示す。液体クロマトグラフではトラップカラムや分離カラムに一旦試料を吸着させる。カラムに導入される移動相溶液の組成に応じて、特定の物質が移動相溶液に溶出される。移動相の組成を段階的に変化させることによりカラムに吸着させた試料を順次溶出させ分離を行う。一方、比較したいペプチド同士は質量数の異なる複数安定同位体で標識されているが、アミノ酸配列が同じであるためカラムに保持される化学的性質はほぼ等しいため、比較したい試料同士が分離されること無く、ほぼ同じ保持時間に同位体標識ペアとなり液体クロマトグラフから溶出される性質がある。
【００２１】
試料分離部１１で分離された試料はイオン化部１２に導入されイオン化し、質量分析部１３に導入される。イオン化の手法にはエレクトロスプレーイオン化法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、電子イオン化法、化学イオン化法、高速原子衝撃法、大気圧イオン化法などがある。以下では、イオン化部１２におけるイオン化法としてエレクトロイオンスプレー法を採用し、正イオンモードで測定した例を示す。
【００２２】
質量分析部１３に導入されたイオンは、質量分析、または、タンデム質量分析され、イオン検出部１４で検出される。質量分析計には、四重極型質量分析計、イオントラップ型質量分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換型質量分析計などがあり、タンデム質量分析計はこれら質量分析部を連結したものから構成されている。イオントラップ型質量分析計は単独でもｎ次質量分析まで可能である。以下では、質量分析部１３における質量分析装置の構成として、イオントラップ型質量分析計と飛行時間型質量分析計のタンデム質量分析装置を採用した例を示す。タンデム型ではあるが、イオントラップ型質量分析計と組み合わせたことにより、ｎ次質量分析まで可能である。
【００２３】
２次質量分析とは、特定のｍ／ｚを持つイオン（親イオン）を選択し、更に、その親イオンを解離し、その際に断片化したフラグメントイオンの質量分析を行う分析法である。更に、２次質量分析で得られたフラグメントイオンのうちの一つを親イオンとして選択し、解離させて得られたフラグメントイオンの質量分析を３次質量分析と呼ぶ。このようにして、選択と解離を他段階で行う質量分析をｎ次質量分析と呼ぶ。
【００２４】
親イオンの解離方法として、イオンをヘリウムなどの不活性気体分子に衝突させて解離させる衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）と呼ばれる方法や、イオンに電子を捕獲させて断片化させる電子捕獲解離（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃａｐｔｕｒｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＥＣＤ）と呼ばれる方法や、イオン同士の反応を利用する事で試料イオンに電子を提供し断片化させる（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＥＴＤ）と呼ばれる方法や、イオンに強い赤外光を照射して解離させる赤外多光子吸収解離（ｉｎｆｒａｒｅｄ ｍｕｌｔｉ−ｐｈｏｔｏｎ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＩＲＭＰＤ）と呼ばれる方法や、イオン化と同時あるいはその直後にイオン化室でおこるインソース分解（ｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ；ＩＳＤ）やイオン源の加速電場を出た後に自然分解するポストソース分解（ｐｏｓｔ ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ；ＰＳＤ）などがあり、以下では、質量分析部１３における親イオンの解離方法としてＣＩＤ法を採用した例を示す。
【００２５】
情報処理部２０で、試料分離部１１、イオン化部１２、質量分析部１３、イオン検出部１４の制御を行い、さらに、得られたデータの解析処理も行う。さらには、アミノ酸配列解析部２１でアミノ酸配列解析を行い、その解析結果を記憶部２２に記憶し、判断処理を行う。さらには、端末３０の制御も行い、表示部３１には解析結果などが表示され、入力部３２からアミノ酸配列解析に必要な情報を入力することができる。
【００２６】
質量分析システムの実施時の流れを図２のフローを用いて示す。混合試料１０は試料分離部１１に導入され分離し、イオン化部１２でイオン化される。イオンは質量分析部１３で１次質量分析されイオン検出部１４で検出される。
【００２７】
情報処理部２０では、公知の方法を用いて１次質量分析結果を解析し、２次質量分析を行う複数の親イオン候補を抽出する（ステップ１００）。親イオン候補の抽出方法として、ＭＳスペクトル中に固有のｍ／ｚのイオンが存在するか判断して抽出する方法や、ＭＳスペクトル中から安定同位体で標識された同位体標識ペアを探し出し抽出する方法など、さまざまな方法がある。以下では、ＭＳスペクトルを解析し、ピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例を図３に示す。
【００２８】
図３では１次質量分析により、３種類のペプチド（ａ、ｂ、ｃ）由来のピークが観測されたＭＳスペクトルを例として示す。本来、ペプチドイオンのピークはモノアイソトピックピークと同位体ピークの両方から構成されるが、図を簡略化するため、モノアイソトピックピークだけで示す。それぞれのペプチドには同位体標識ペアピーク、すなわち、システインを重い標識試薬で標識されたタンパク質に由来するペプチドのピークとシステインを軽い標識試薬で標識されたタンパク質に由来するペプチドのピークとの対が存在するため、合計６本のピークが観察される。強度の大きい順に１〜６までの番号を振り、２次質量分析を行う親イオン候補の優先順位及びピークの番号とする。
【００２９】
次に、情報処理部２０で公知の方法を用いて親イオンの価数を判定する（ステップ１０１）。図４にペプチド由来のピークの模式図を示す。ペプチドのピークはモノアイソトピックピークと同位体ピークから構成される。それぞれのピーク間隔はΔｍである。価数をｚとすると、Δｍ＝１／ｚの関係が成り立つ。Δｍを求めれば容易に親イオンの価数を判定できる。ステップ１００の前にステップ１０１を行ってもよい。
【００３０】
次に、情報処理部２０で親イオン候補の数のループ処理（ステップ１０２）を行う。
【００３１】
次に、情報処理部２０で記憶部２２と照合し、候補として挙げた親イオンの２次質量分析が禁止されているか判断する（ステップ１０３）。禁止されてなければ、候補親イオンは次の２次質量分析に進み、禁止の場合はステップ１０２に戻り、新たな親イオンを候補に挙げてステップ１０３に進む。ステップ１０３における判断材料として必要な情報は記憶部２２に記憶されている。記憶部２２に記憶された判断情報内容の例を図５に示す。親イオンのｍ／ｚ情報と、その属性情報として２次質量分析は非対象であると指示する情報である。親イオンのｍ／ｚ情報には親イオンのモノアイソトピック質量が記憶される。そのほかの情報として、親イオンの価数、ＭＳスペクトルの強度、液体クロマトグラフでの溶出時間、２次質量分析の分析回数、ＭＳ２スペクトルの強度、記憶情報有効時間などの選択基準を記憶させても良い。記憶部２２に記憶される記憶情報は、予め入力部３２から入力されていてもよい。
【００３２】
ステップ１０３において候補親イオンのｍ／ｚと記憶部に記憶されたｍ／ｚを比較するとき、候補親イオンのｍ／ｚと記憶部に記憶されたｍ／ｚの差であるΔｍ／ｚがδの範囲内、すなわち、｜Δｍ／ｚ｜＜δであるイオンを同一の親イオンとみなしている。δは質量分析計の質量数測定誤差としてもよい。
【００３３】
次に、２次質量分析に進めた親イオンは２次質量分析されイオン検出部で検出される。得られたＭＳ２スペクトルはアミノ酸配列解析部２１でアミノ酸配列解析される（ステップ１０４）。アミノ酸配列解析法として、ペプチドの部分配列をｄｅ ｎｏｖｏ配列解析する手法を用いる。ＭＳ２スペクトル中のフラグメントイオンの間隔に対応する質量のアミノ酸があるかどうか調べ配列解析する方法である。すなわち、既知タンパク質のアミノ酸配列データベースに依存せず、配列を決定できる方法である。そのため、配列が未知なペプチドでも、複数安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無が判断可能になる。
【００３４】
また、複数安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無の判断は、まれにＭＳ２スペクトル中に観測される複数安定同位体で標識された特定アミノ酸のモノアイソトピック質量または標識物のモノアイソトピック質量から判断もできるが、特定アミノ酸の個数が単数か複数か区別できない欠点がある。
【００３５】
また、複数安定同位体で標識された特定アミノ酸の有無の判断は、ｄｅ ｎｏｖｏ配列解析しなくても、その解析中に行われるフラグメントイオン間の質量差が複数安定同位体で標識された特定アミノ酸のモノアイソトピック質量と等しいかどうかだけ着目して解析すれば判断できるが、ｄｅ ｎｏｖｏ配列解析時に得られるイオンの種類（ｙイオン、ｂイオンなど）情報、配列の連続性情報、解読できた配列数情報などを補助的な情報として、より信頼性の高い判断を行うことが好ましい。
【００３６】
図６に、複数安定同位体で標識された特定アミノ酸配列解析時に必須なモノアイソトピック質量情報の入力画面（表示部に表示される入力部）の例を示す。入力画面１０００から情報を入力（もしくは選択）する。特定アミノ酸名称入力フィールド１００１に、標識された特定アミノ酸名称を入力し、対応するモノアイソトピック質量入力フィールド１００２にモノアイソトピック質量を入力する。登録ボタン１００３を押し登録する。これらの特定アミノ酸の情報は予め入力されていても良い。２０種類ある基本アミノ酸のモノアイソトピック質量情報は予め入力されていても良い。
【００３７】
ステップ１０４における特定アミノ酸も含めたアミノ酸配列解析の例を図７に示す。二次質量分析により得られたＭＳ２スペクトル中のフラグメントイオンのピーク間隔と入力部で入力されたモノアイソトピック質量から、ピーク間隔に対応するアミノ酸を決定できる。ピーク２とピーク１の質量差に対応するアミノ酸はロイシンであり、ピーク３とピーク２の質量差に対応するアミノ酸は軽い標識化システインであり、ピーク４とピーク３の質量差に対応するアミノ酸はフェニルアラニンであり、ピーク５とピーク４の質量差に対応するアミノ酸はロイシンであることが分かる。以上のようにして特定アミノ酸を見つけることができる。
【００３８】
次にアミノ酸配列解析部２２で特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンが有と判断されたとき、情報処理部２０で同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚを計算する（ステップ１０５）。
【００３９】
同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法の流れを図８に示す。最初にアミノ酸配列解析部２２で特定アミノ酸の個数を数え（ステップ２００）、次に、特定アミノ酸を標識した安定同位体の質量数で場合分けを行う（ステップ２０１）。アミノ酸配列解析部２２で、重い標識化システインのみが有と判断されたとき、「より重い」と判断し、ステップ２０２に進み、軽い標識化システインのみが有と判断されたとき「より軽い」と判断し、ステップ２０３に進み、重い標識化システインと軽い標識化システインの両方が有と判断されたとき、「その他」と判断し、終了のステップに進む。ステップ２０２では、親イオンに隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出（式１、数３または数４）し、終了する。
【００４０】
親イオンのｍ／ｚをＭＯ、価数をｚＯ、特定アミノ酸の個数をｎＬ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量をＬＯ、水素原子のモノアイソトピック質量をＨ、特定アミノ酸が標識されていないペプチドのモノアイソトピック質量をＭｒとしたとき、エレクトロスプレーイオン化法の正イオンモードで観測された、親イオンのｍ／ｚは、
【００４１】
【数１】
となり、Ｍｒは式１−１より
【００４２】
【数２】
となる。同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚをＭＰ、価数をｚＰ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量をＬＰとすると、
【００４３】
【数３】
となり、式１−３に式１−２を代入すると、
【００４４】
【数４】
となる。ＭＰは（式１−３）または（式１−４）の何れからか算出できる。負イオンモードの時はプロトンを引いた式にすればよい。
【００４５】
ｍ／ｚの算出方法を式１に数値を入れて示す。親イオンのｍ／ｚであるＭＯが６６９．３１、価数であるｚＯが２、特定アミノ酸の個数であるｎＬが１、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＯが２３６．１５、水素原子のモノアイソトピック質量であるＨが１、特定アミノ酸が安定同位体で標識されていないペプチドのモノアイソトピック質量であるＭｒは式１−２より、１１００．４７となる。隣接する同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚであるＭＰは、価数をｚＰ＝ｚＯ、標識物のモノアイソトピック質量であるＬＰを２２７．１５とすると、式１−３から６６４．８１となる。
【００４６】
以上に示した同位体標識ペアのｍ／ｚの算出方法は、ＭＳ２スペクトル中から特定アミノ酸の直接的な証拠を得てから算出するため擬陽性が生じにくい特徴がある。
【００４７】
ステップ２０３に進んだ場合、式１から同様にして、親イオンに隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出し、終了する。
【００４８】
次に、情報処理部２０でステップ２０２またはステップ２０３で算出した親イオンのｍ／ｚを２次質量分析対象外情報として記憶部に登録する。親イオンのｍ／ｚも２次質量分析対象外情報として記憶部に登録してもよい（ステップ１０６）。
【００４９】
全ての親イオン候補について、ステップ１０２に戻り繰り返す。
【００５０】
次に、試料分離部から溶出されていない試料が残っている場合は、新たに試料分離部から溶出された試料をイオン化するフローに戻る。全ての試料の分離作業が終了していれば、分析を終了し、図２の質量分析フローは終了する。
【００５１】
以上のフローに従って実施すると、図３で示した第１実施例の２次質量分析の順番は以下のようになる。最初にペプチドｂ由来のピーク１が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク２のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。次にペプチドａ由来のピーク３が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク４のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。次にペプチドｃ由来のピーク５が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク６のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。以上の流れにより、従来ならば６回の二次質量分析が必要であるフローが１／２の分析回数で済む。
【００５２】
次に第２実施例について図９を用いて説明する。ここでは、ｎ次質量分析が可能なイオントラップ型質量分析計を用いて、十分な強度を持つフラグメントイオンのアミノ酸配列解析を繰り返し行う。
【００５３】
第１実施例における図２のフローと多くのステップが共通している。新たに増えたステップだけを説明する。まず、ステップ３００でｎ次質量分析の初期値２を入れる。次にステップ３０１でｎ次質量分析を行う。次のステップのイオン検出、アミノ酸配列解析はｎ値に関係なく同じ手法で行われる。ステップ３０２で（ｎ＋１）次質量分析を行うか判断する。例えば、フラグメントイオンの最大強度がある閾値以上のとき、（ｎ＋１）次質量分析を行うと判断してもよい。（ｎ＋１）次質量分析を行うと判断されたとき、ステップ３０３でｎに１を加える。ステップ３０４で選択、解離を行う親イオンを選定する。例えば、最大強度のフラグメントイオンを親イオンに選定してもよい。アミノ酸配列解析を繰り返すため、実施例１よりもアミノ酸配列解析情報が多く得られ、より精度よく特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの有無を明らかにすることができる。
【００５４】
次に第３実施例について図１０、図１１を用いて説明する。ここでは質量数の異なる複数安定同位体で作られた３種類の質量数の安定同位体標識の方法としてＳＥＲＶＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ社製のＳＥＲＶＡ ＩＣＰＬ(登録商標)Ｔｒｉｐｌｅｘ−Ｋｉｔ試薬を採用した例を示す。
【００５５】
ＳＥＲＶＡ ＩＣＰＬ(登録商標) Ｔｒｉｐｌｅｘ−Ｋｉｔ試薬は、リジンを重い標識試薬（１−（１３Ｃ６１Ｈ４）−Ｎｉｃｏｔｉｎｏｙｌｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、モノアイソトピック質量１１１．０４１９）または中間の質量の標識試薬（１−（１２Ｃ６１Ｄ４）−Ｎｉｃｏｔｉｎｏｙｌｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、モノアイソトピック質量１０９．０７１５）または軽い標識試薬（１−（１２Ｃ６１Ｈ４）−Ｎｉｃｏｔｉｎｏｙｌｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、モノアイソトピック質量１０５．０２１５）で標識する。
図６のようなモノアイソトピック質量情報入力画面を通して三種類の特定アミノ酸（重い標識化リジン、中間の標識化リジン、軽い標識化リジン）のモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。
【００５６】
３種の混合試料は第１実施例または第２実施例で説明した方法で計測される。その中でステップ１０５における同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法が違う。以下で詳細に説明する。
【００５７】
３種類の質量数の標識で標識されたときの同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法の流れを図１０に示す。最初にアミノ酸配列解析部２２で特定アミノ酸の個数を数え（ステップ４００）、次に、特定アミノ酸を標識された複数安定同位体の質量数で場合分けを行う（ステップ４０１）。アミノ酸配列解析部２２で、重い標識化リジンのみが有と判断されたとき、「より重い」と判断し、ステップ４０２に進み、中間の標識化リジンのみが有と判断されたとき、「中間」と判断し、ステップ４０３に進み、軽い標識化リジンのみが有と判断されたとき「より軽い」と判断し、ステップ４０４に進み、２種類以上の標識化リジンが有と判断されたとき、「その他」と判断し、終了のステップに進む。ステップ４０２では、親イオンに隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚと、中間の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出（式１）し、終了する。
【００５８】
ｍ／ｚの算出方法を式１に数値を入れて示す。親イオンのｍ／ｚであるＭＯが６６９．３１、価数であるｚＯが２、特定アミノ酸の個数であるｎＬが１、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＯが１１１．０４１９、水素原子のモノアイソトピック質量であるＨが１、特定アミノ酸が標識されていないペプチドのモノアイソトピック質量であるＭｒは式１−２より、１２２５．５７となる。隣接する、より軽い同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚであるＭＰ１は、価数をｚＰ＝ｚＯ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＰを１０５．０２１５とすると、式１−３から６６６．２９となる。隣接する、より中間の同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚであるＭＰ２は、価数をｚＰ＝ｚＯ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＰを１０９．０７１５とすると、式１−３から６６８．３２となる。
【００５９】
ステップ４０３に進んだ場合、式１から同様にして、親イオンに隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚと、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出し、終了する。
【００６０】
ステップ４０４に進んだ場合、式１から同様にして、親イオンに隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚと、中間の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む親イオンのｍ／ｚを算出し、終了する。
【００６１】
以上のフローに従って実施したときの、２次質量分析の解析順番を図１１の例を用いて説明する。図１１では１次質量分析により２種類のペプチド（ａ、ｂ）由来のピークが観測されたＭＳスペクトルを例として示す。図を簡略化するためペプチドイオンのピークはモノアイソトピックピークだけで示す。それぞれのペプチドには同位体標識ペアピークが存在するため、合計６本のピークが観察される。強度の大きい順に１〜６までの番号を振り、２次質量分析を行う親イオン候補の優先順位及びピークの番号とする。最初にペプチドｂ由来のピーク１が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク２とピーク３のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。次にペプチドａ由来のピーク４が２次質量分析されると、その同位体標識ペアであるピーク５とピーク６のｍ／ｚが算出され２次質量分析対象外となる。以上の流れにより、従来ならば６回の二次質量分析が必要であるフローが１／３の分析回数で済む。
【００６２】
第３実施例は質量数の異なる複数安定同位体で作られたｎ種類の質量数の安定同位体標識された混合試料にも適用したものである。この場合、以下の手順を行えば適用できる。図６のようなモノアイソトピック質量情報入力画面を通してｎ種類の特定アミノ酸のモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。安定同位体ペアのｍ／ｚの計算時に、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＰにそれぞれの標識物のモノアイソトピック質量を代入すれば、式１−３から全ての安定同位体ペアのｍ／ｚを算出できる。
【００６３】
次に第４実施例について図１２を用いて説明する。ここでは、親イオンの価数が違う同位体標識ペアのｍ／ｚを算出し、２次質量分析対象外とする。
【００６４】
図１２では、１次質量分析の結果、１種類のペプチドａ由来のピークが観測されたＭＳスペクトルを例として示す。図を簡略化するためペプチドイオンのピークはモノアイソトピックピークだけで示す。ａ１は１価のピーク、ａ２は２価のピーク、ａ３は３価のピークを示している。それぞれの価数に付き同位体標識ペアピークが存在するため、合計６本のピークが観察される。強度の大きい順に１〜６までの番号を振り、２次質量分析を行う親イオン候補の優先順位及びピークの番号とする。最初に価数が２のピーク１が２次質量分析されると、その同位体標識ペアピークであるピーク２のｍ／ｚが第１実施例の方法によって算出され２次質量分析対象外となる。さらに、式１−３においてペアとなるイオンの価数であるｚＰに３を代入すると、ピーク４のｍ／ｚが求められ、価数ｚＰに１を代入するとピーク６のｍ／ｚが求める。さらに、式１−４において標識物のモノアイソトピックピーク質量が同じ（ＬＯ＝ＬＰ）とし、ペアとなるイオンの価数であるｚＰに３を代入するとピーク３のｍ／ｚが求められ、価数ｚＰに１を代入するとピーク５のｍ／ｚが求められ、２次質量分析対象外となる。以上の流れにより、従来ならば６回の二次質量分析が必要であるフローが１／６の分析回数で済む。
【００６５】
また、第４実施例は、第２実施例で示したｎ次質量分析が可能なイオントラップ型質量分析計を用いて実施することができる。また、第４実施例は、第３実施例で示した質量数の異なる複数安定同位体で作られたｎ種類の安定同位体標識された混合試料で実施することができる。
【００６６】
次に第５実施例について図１３を用いて説明する。ここでは、修飾されたペプチドから同位体標識ペアのｍ／ｚを算出（式２、数８または数９）し、２次質量分析対象外とする。修飾の例として、スレオニンのリン酸化を採用した例を示す。図６のようなモノアイソトピック質量情報入力画面を通してリン酸化スレオニンのモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。
【００６７】
修飾物のモノアイソトピック質量をＭとしたとき、ｋ種の修飾物のモノアイソトピック質量の和は、
【００６８】
【数５】
となる。
【００６９】
親イオンのｍ／ｚをＭＯ、価数をｚＯ、特定アミノ酸の個数をｎＬ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量をＬＯ、水素原子のモノアイソトピック質量をＨ、特定アミノ酸が標識されていないペプチドのモノアイソトピック質量をＭｒとしたとき、エレクトロスプレーイオン化法の正イオンモードで観測された、ペプチドの修飾を考慮した親イオンのｍ／ｚは、式２−１を式１−１に加えることにより求めると、
【００７０】
【数６】
となり、Ｍｒは式２−２より
【００７１】
【数７】
となる。ペプチドの修飾を考慮していない同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚをＭＰ、価数をｚＰ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量をＬＰとすると、
【００７２】
【数８】
となり、式２−４に式２−３を代入すると、
【００７３】
【数９】
となる。ＭＰは（式２−４）または（式２−５）の何れからか算出できる。負イオンモードの時はプロトンを引いた式にすればよい。
【００７４】
図１３では、１次質量分析の結果、１種類のペプチドａ由来のピークと修飾されたペプチドａ＊由来のピークが観測されたＭＳスペクトルを例として示す。図を簡略化するためペプチドイオンのピークはモノアイソトピックピークだけで示す。ａ１とａ＊１は１価のピーク、ａ２とａ＊２は２価のピーク、ａ３とａ＊３は３価のピークを示している。それぞれの価数に付き同位体標識ペアピークが存在するため、合計１２本のピークが観察される。強度の大きい順に１〜１２までの番号を振り、２次質量分析を行う親イオン候補の優先順位及びピークの番号とする。最初に価数が２のピーク１が２次質量分析されると、アミノ酸配列解析結果よりリン酸化スレオニンの有無が判断できる。１個のリン酸化スレオニンが有と判断されたとき、式２−１における修飾物のモノアイソトピック質量であるＭは７９．９６となる。特定アミノ酸の個数であるｎＬ、安定同位体標識物のモノアイソトピック質量であるＬＯもアミノ酸配列解析結果から同時に得られ、水素原子のモノアイソトピック質量であるＨを１、ピーク１の親イオンのｍ／ｚをＭＯ、価数をｚＯとして式２−２または式２−３に代入するとＭｒが求められ、リン酸化されていないペプチドの同位体標識ペアであるピーク４のｍ／ｚが式２−４または式２−５より算出できる。
【００７５】
さらに、第４実施例の方法を用いると、ピーク１からピーク２、ピーク５、ピーク６、ピーク９、ピーク１０のｍ／ｚが求められ、ピーク４からピーク３、ピーク７、ピーク８、ピーク１１、ピーク１２のｍ／ｚが求められ、２次質量分析対象外となる。以上の流れにより、従来ならば１２回の二次質量分析が必要であるフローが１／１２の分析回数で済む。
【００７６】
第５実施例は複数箇所のアミノ酸が修飾されたペプチドであっても以下の手順を行えば適用できる。図６のようなモノアイソトピック質量情報入力画面を通して複数個の修飾物のモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。
【００７７】
また、修飾されたペプチドと修飾されてないペプチドは液体クロマトグラフのカラムに保持される化学的性質が異なるため溶出時間が若干異なる事もあるが、記憶部で２次質量分析対象外リストを記憶し続けられるため、溶出時間が異なっても２次質量分析対象外の判断が行える。さらに、経験的に求められる溶出時間の違いを、記憶部２２に記憶情報有効時間として予め入力部から入力しておけば、有効時間の終了後に別種類のペプチドが同じｍ／ｚに計測された場合、２次質量分析を行うことができる。また、リン酸化ペプチドの解析時に親イオンの解離をＣＩＤ法で行うとリン酸基が脱落しやすい。リン酸基の脱落しにくいＥＣＤ法またはＥＴＤ法を用いる事が望ましい。
【００７８】
また、第５実施例はリン酸化だけでなく酸化、アセチル化、ユビキチン化、脂質修飾、糖鎖修飾、過酸化脂質修飾、グリケーション、ニトロシル化などの様々なタンパク質の翻訳後修飾に適用できるが、適用が難しい場合もある。例えば、基本２０種のアミノ酸のモノアイソトピック質量と修飾されたアミノ酸のモノアイソトピック質量が近い場合、両者の区別は難しい。例えば、フェニルアラニンのモノアイソトピック質量は１４７．０６でありメチオニンが酸化された場合の酸化メチオニンのモノアイソトピック質量は１４７．０３である。そのような場合は、アミノ酸配列解析時に用いる質量分析部に質量精度のよいフーリエ変換型質量分析計を用いる事が望ましい。
【００７９】
また、第５実施例は親イオンの解離時にセリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸から脱水（−１８Ｄａ）する場合やアルギニン、リジン、アスパラギン、グルタミンから脱アンモニア（−１７Ｄａ）する場合も以下の手順を行えば適用できる。図６のようなモノアイソトピック質量の情報入力画面を通して水やアンモニアの脱離したアミノ酸のモノアイソトピック質量を入力し、登録する。これらの情報は予め入力されていても良い。また、第５実施例はアミノ酸配列解析時に安定同位体で標識された特定アミノ酸と特定修飾アミノ酸の有無を判断し、両方が有の時に二次質量分析対象外情報を作成するが、特定修飾アミノ酸だけが有の時にも二次質量分析対象外情報を作成してもよい。また、第５実施例は、第２実施例で示したｎ次質量分析が可能なイオントラップ型質量分析計を用いて実施することができる。また、第５実施例は、第３実施例で示した質量数の異なる複数安定同位体で作られたｎ種類の安定同位体標識された混合試料で実施することができる。
第１実施例〜第５実施例では算出したｍ／ｚ情報を全て二次質量分析の対象外情報にしたが、二次質量分析の対象情報にしてもよい。その場合は図５に示したｍ／ｚ情報の属性を２次質量分析対象とする。比較定量したい同位体標識ペアを優先的に同定したい場合に用いるとよい。
【００８０】
次に第６実施例について説明する。ここでは、親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含む条件で、１次質量分析の積算回数または測定時間を調整して行う。
【００８１】
第１実施例〜第３実施例にて説明した方法で計測された試料は、ステップ１０５における同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚを計算後、ループを抜け出し、積算回数または測定時間を調整して１次質量分析を行う。このとき、高速に分析を行うために親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含むｍ／ｚ範囲で１次質量分析を行っても良い。１次質量分析結果のＳＮ比がよくなることにより、１次質量分析データを元にして算出する比較定量比の精度がよくなる。
【００８２】
次に第７実施例について説明する。ここでは、親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含む条件で、２次質量分析の積算回数または測定時間を調整して行う。第１実施例〜第３実施例で説明した方法で計測された試料は、ステップ１０５における同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚを計算後、ループを抜け出し、積算回数または測定時間を調整して親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを選択および解離して２次質量分析を行う。全部の親イオンの情報を用いることにより、単独ではイオン量が少なく同定が困難なペプチドを同定できる可能性が増える。
【００８３】
次に第８実施例について図１４を用いて説明する。ここでは、２次質量分析回数あたりの特定アミノ酸出現回数を表示する。第１実施例、第２実施例で示した方法で計測された試料は、ステップ１０５における同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算時に特定アミノ酸の出現回数情報をステップ２００で作成する。さらに、２次質量分析ステップで２次質量分析回数情報を作成する。モニタ画面１０００では、二次質量分析回数がフィールド２００１に表示され、特定アミノ酸の出現回数がフィールド２００２に表示され、より重い安定同位体の出現回数がフィールド２００３に表示され、より軽い安定同位体の出現回数がフィールド２００４に表示される。回数表示フィールドを増やすことにより、第３実施例、第５実施例で示した特定アミノ酸の種類が増えた場合でも表示できる。
【００８４】
以上の表示により、計測者が計測終了後に時間をかけて詳細な解析をしなくても、計測の途中で、試料中に含まれる特定アミノ酸で標識された試料のおおよその数および割合がわかり、試料について考察できる。また、計測時やメインテナンス時における質量分析計のクオリティーコントロール情報としても活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明に係る質量分析システムの実施の形態を示す機能ブロックを示した説明図である。
【図２】本発明の第１実施例による質量分析フローの流れを示した説明図である。
【図３】本発明の第１実施例によるＭＳスペクトルを解析してピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例の説明図である。
【図４】本発明の第１実施例による親イオンの価数判定方法の例の説明図である。
【図５】本発明の第１実施例による記憶部に記憶された判断情報内容の例の説明図である。
【図６】本発明の第１実施例における特定アミノ酸配列解析時に必須なモノアイソトピック質量情報の入力画面の例の説明図である。
【図７】本発明の第１実施例における特定アミノ酸も含めたアミノ酸配列解析の例の説明図である。
【図８】本発明の第１実施例による同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法を示した説明図である。
【図９】本発明の第２実施例によるｎ次質量分析に対応した質量分析フローの流れを示した説明図である。
【図１０】本発明の第３実施例による３種類の質量数の標識で標識したときの同位体標識ペアとなる親イオンのｍ／ｚの計算方法を示した説明図である。
【図１１】本発明の第３実施例による３種類の質量数の標識で標識された試料のＭＳスペクトルを解析してピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例を示した説明図である。
【図１２】本発明の第４実施例による親イオンの価数が違う同位体標識ペアのＭＳスペクトルを解析してピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例を示した説明図である。
【図１３】本発明の第５実施例による修飾されたペプチドの同位体標識ペアのＭＳスペクトルを解析してピーク強度の高い順に親イオン候補を抽出した例を示した説明図である。
【図１４】本発明の第８実施例における２次質量分析回数あたりの特定アミノ酸出現回数の表示例を示した説明図である。
【符号の説明】
【００８６】
１ 質量分析システム
１０ 混合試料
１１ 試料分離部
１２ イオン化部
１３ 質量分析部
１４ イオン検出部
２０ 情報処理部
２１ アミノ酸配列解析部
２２ 記憶部
３０ 端末
３１ 表示部
３２ 入力部
１０００ モニタ画面
１００１ 特定アミノ酸名称入力フィールド
１００２ モノアイソトピック質量入力フィールド
１００３ 登録ボタン
２００１、２００２、２００３、２００４ 回数表示フィールド。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量数の異なる複数安定同位体で特定アミノ酸を各々別個に標識された複数試料の混合液を分離する分離部と、
前記分離部で分離された試料をイオン化するイオン化部と、
前記イオン化部でイオン化されたイオンについて１次質量分析を行い、かつ特定のイオンを親イオンとして解離させる２次質量分析を行う質量分析部と、
前記質量分析部の分析結果について処理する情報処理部と、
前記複数の安定同位体で標識されたアミノ酸の質量情報を記憶し、かつ、前記２次質量分析で得る２次フラグメントの情報から前記２次質量分析で解離させた前記親イオンのアミノ酸配列を分析するアミノ酸配列解析部と、
前記アミノ酸配列解析部の解析結果に基づき、前記２次フラグメントイオンについて、前記特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの有無を判断する情報処理部と
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、２次質量分析対象外イオン情報を作成し、その情報を記憶する記憶部とを有し、
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記特定のイオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記特定のイオンのピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする質量分析システム。
【請求項２】
前記親イオンは、特定の質量対電荷比を持つイオンであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項３】
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて質量対電荷比情報をさらに作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて質量対電荷比情報をさらに作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項４】
前記情報処理部は、前記２次質量分析の分析候補イオンが、前記記憶部に記憶された２次質量分析対象外イオン情報に該当するかをさらに判断し、前記質量分析部は、前記２次質量分析対象外イオン情報に該当しない前記２次質量分析候補イオンを２次質量分析することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項５】
前記質量分析部は、特定の親イオンについてｎ次質量分析を行い、
前記アミノ酸配列解析部は、前記ｎ次質量分析から得られるｎ次フラグメントイオンの情報から前記２次質量分析のために解離させた親イオンのアミノ酸配列を分析し、
前記情報処理部は、前記アミノ酸配列解析部の解析結果に基づき、前記ｎ次フラグメントイオンについて、前記特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの有無を判断することを有する請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項６】
前記分離部は、質量数の異なる３種類の安定同位体で特定アミノ酸を各々別個に標識された複数試料の混合液を分離し、
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、
前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報、および中間の質量の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、
前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうち、中間の質量の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報、および、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、
前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうち、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、中間の質量の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報、および、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項７】
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンの価数の異なるピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンの価数の異なるピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項８】
前記アミノ酸配列解析部は、修飾されたアミノ酸のモノアイソトピック質量情報をさらに記憶するものであり、前記情報処理部は、前記アミノ酸配列解析部の解析結果に基づき、前記２次フラグメントイオンについて、前記特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンおよび前記特定修飾アミノ酸を含む特定修飾フラグメントイオンの有無を判断し、
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンと特定修飾フラグメントイオンの両方について有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、修飾のない前記親イオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、修飾のない前記親イオンのピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項９】
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンと特定修飾フラグメントイオンの両方について有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記修飾のない前記親イオンの価数の異なるピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記修飾のない前記親イオンの価数の異なるピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項８に記載の質量分析システム。
【請求項１０】
前記２次質量分析対象外情報に基づいて、前記親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含む条件で、１次質量分析の積算回数または測定時間を調整することを特徴とする請求項１のいずれかに記載の質量分析システム。
【請求項１１】
前記２次質量分析対象外情報に基づいて、前記親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含む条件で、２次質量分析の積算回数または測定時間を調整することを特徴とする請求項１のいずれかに記載の質量分析システム。
【請求項１２】
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するときであって、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオン、もしくはより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの検出情報から特定アミノ酸の出現回数情報を作成し、前記表示部で表示することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１３】
前記特定アミノ酸は、システインであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１４】
前記特定アミノ酸は、リジンであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１５】
前記特定アミノ酸は、トリプトファンであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１６】
前記特定アミノ酸は、リン酸化アミノ酸、酸化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ユビキチン化アミノ酸、脂質修飾したアミノ酸、糖鎖修飾したアミノ酸、過酸化脂質修飾したアミノ酸、グリケーションしたアミノ酸もしくはニトロシル化アミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１７】
前記特定アミノ酸は、脱水したアミノ酸もしくは脱アンモニアしたアミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１８】
前記特定アミノ酸の情報を入力する入力部をさらに有すること特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１】
質量数の異なる複数安定同位体で特定アミノ酸を各々別個に標識された複数試料の混合液を分離する分離部と、
前記分離部で分離された試料をイオン化するイオン化部と、
前記イオン化部でイオン化されたイオンについて１次質量分析を行い、かつ特定のイオンを親イオンとして解離させる２次質量分析を行う質量分析部と、
前記質量分析部の分析結果について処理する情報処理部と、
前記複数の安定同位体で標識されたアミノ酸の質量情報を記憶し、かつ、前記２次質量分析で得る２次フラグメントの情報から前記２次質量分析で解離させた前記親イオンのアミノ酸配列を分析するアミノ酸配列解析部と、
前記アミノ酸配列解析部の解析結果に基づき、前記２次フラグメントイオンについて、前記特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの有無を判断する情報処理部と
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、２次質量分析対象外イオン情報を作成し、その情報を記憶する記憶部とを有し、
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記特定のイオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記特定のイオンのピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする質量分析システム。
【請求項２】
前記親イオンは、特定の質量対電荷比を持つイオンであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項３】
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて質量対電荷比情報をさらに作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについて質量対電荷比情報をさらに作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項４】
前記情報処理部は、前記２次質量分析の分析候補イオンが、前記記憶部に記憶された２次質量分析対象外イオン情報に該当するかをさらに判断し、前記質量分析部は、前記２次質量分析対象外イオン情報に該当しない前記２次質量分析候補イオンを２次質量分析することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項５】
前記質量分析部は、特定の親イオンについてｎ次質量分析を行い、
前記アミノ酸配列解析部は、前記ｎ次質量分析から得られるｎ次フラグメントイオンの情報から前記２次質量分析のために解離させた親イオンのアミノ酸配列を分析し、
前記情報処理部は、前記アミノ酸配列解析部の解析結果に基づき、前記ｎ次フラグメントイオンについて、前記特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの有無を判断することを有する請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項６】
前記分離部は、質量数の異なる３種類の安定同位体で特定アミノ酸を各々別個に標識された複数試料の混合液を分離し、
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、
前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報、および中間の質量の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、
前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうち、中間の質量の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報、および、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、
前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうち、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンのピークにピークが隣接した、中間の質量の安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報、および、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項７】
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンの価数の異なるピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記親イオンの価数の異なるピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項８】
前記アミノ酸配列解析部は、修飾されたアミノ酸のモノアイソトピック質量情報をさらに記憶するものであり、前記情報処理部は、前記アミノ酸配列解析部の解析結果に基づき、前記２次フラグメントイオンについて、前記特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンおよび前記特定修飾アミノ酸を含む特定修飾フラグメントイオンの有無を判断し、
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンと特定修飾フラグメントイオンの両方について有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、修飾のない前記親イオンのピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、修飾のない前記親イオンのピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項９】
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンと特定修飾フラグメントイオンの両方について有と判断するとき、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記修飾のない前記親イオンの価数の異なるピークにピークが隣接した、より軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての前記２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶し、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むときには、前記修飾のない前記親イオンの価数の異なるピークにピークが隣接した、より重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含むイオンについての２次質量分析対象外情報を作成して前記記憶部に記憶することを特徴とする請求項８に記載の質量分析システム。
【請求項１０】
前記２次質量分析対象外情報に基づいて、前記親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含む条件で、１次質量分析の積算回数または測定時間を調整することを特徴とする請求項１のいずれかに記載の質量分析システム。
【請求項１１】
前記２次質量分析対象外情報に基づいて、前記親イオンと同位体標識ペアイオンの全てを含む条件で、２次質量分析の積算回数または測定時間を調整することを特徴とする請求項１のいずれかに記載の質量分析システム。
【請求項１２】
前記情報処理部が前記特定フラグメントイオンについて有と判断するときであって、前記特定フラグメントイオンが前記複数安定同位体のうちより重い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオン、もしくはより軽い安定同位体で標識された特定アミノ酸を含む特定フラグメントイオンの検出情報から特定アミノ酸の出現回数情報を作成し、前記表示部で表示することを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１３】
前記特定アミノ酸は、システインであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１４】
前記特定アミノ酸は、リジンであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１５】
前記特定アミノ酸は、トリプトファンであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１６】
前記特定アミノ酸は、リン酸化アミノ酸、酸化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ユビキチン化アミノ酸、脂質修飾したアミノ酸、糖鎖修飾したアミノ酸、過酸化脂質修飾したアミノ酸、グリケーションしたアミノ酸もしくはニトロシル化アミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１７】
前記特定アミノ酸は、脱水したアミノ酸もしくは脱アンモニアしたアミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【請求項１８】
前記特定アミノ酸の情報を入力する入力部をさらに有すること特徴とする請求項１に記載の質量分析システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００８−２８６５６８（Ｐ２００８−２８６５６８Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２９９９８（Ｐ２００７−１２９９９８）
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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