質量分析法
【課題】微量の目的分子および多数の夾雑成分を含む試料に関して、実験者の経験と勘に依存することなしに、高感度で目的分子の質量スペクトル測定を行う方法の提供。
【解決手段】目的分子を含む測定試料の複数の領域に関してプレスキャンＭＳ測定を行い、異なるｍ／ｚを有する複数のイオンのシグナル強度を求め、得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する工程を含むことを特徴とする質量分析法。
【解決手段】目的分子を含む測定試料の複数の領域に関してプレスキャンＭＳ測定を行い、異なるｍ／ｚを有する複数のイオンのシグナル強度を求め、得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する工程を含むことを特徴とする質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析法に関する。より詳細には、本発明は、目的分子イオンの強いシグナルを得られる測定試料の領域を選定する工程を伴う質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、質量分析法において、レーザーを用いて目的分子のイオン化を行う方法が注目を集めてきている。その中で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、試料とマトリックスの混合結晶を調製し、それにレーザー光を照射することでイオン化を行なう方法である。ＭＡＬＤＩ法は、イオン化しにくい生体高分子、タンパク質および糖鎖にも適用できることから、生化学や医学の分野で急速に普及してきた。
【０００３】
ＭＡＬＤＩ法を適用する場合には、試料とマトリックスの混合結晶の状態が均一であることが望ましいとされている。混合結晶の状態の均一性によってスペクトルの良否が支配されるため、マトリックスの選択方法やマトリックスと試料の混合方法などについての改良がなされてきた（例えば特許文献１および２参照）。
【０００４】
しかし、実際には、マトリックスの存在するところ全てに試料のイオンが測定できることはない。多くの場合、測定試料中に、イオン化効率の高い測定部位（スイートスポットと呼ばれる）が点在している。スイートスポットにおいてのみ、目的分子イオンのシグナル強度が大きく、高感度での質量分析が可能となる。ＭＡＬＤＩ法において用いるレーザーのビーム径（約２００μｍ）が測定試料の大きさよりも格段に小さいため、適切な測定部位にレーザーを照射する必要がある。特に、生体試料由来の微量サンプルの解析時には、高感度での多段階質量分析（ＭＳn）を可能とするような測定部位を探索する必要がある。
【０００５】
従来、このような測定部位の探索は，実験者の経験および勘に依存している。一般的には，質量分析計に内蔵されているＣＣＤカメラなどの画像を観察して、レーザーを照射する測定部位を決定している。このような画像観察に基づく探索は、精度および再現性は低いものとなっている。なぜなら、たとえ高い解像度を持った画像出力装置を用いたとしても、マトリックス結晶の形および状態とイオン化効率の高い部位との良好な相関を得ることはできないからである。
【０００６】
また、スペクトルのＳ／Ｎ比を改善するために、プレートを改良してマトリクスを用いることなしに質量分析を行うことも試みられている（たとえば、非特許文献１参照）。この場合は、測定試料中の目的分子は微量であり、したがって質量分析計に内蔵されているＣＣＤカメラの画像では、当該目的分子の存在する部位を特定することができない。すなわち、ＣＣＤカメラの画像の観察によっては、測定部位の探索を行うことができない。
【０００７】
これらの問題点を解決するために、多くの質量分析計には、ラスタースキャンなどのプレスキャン測定機能が装備されている。しかし、その機能は、極めて高純度で大量にある目的分子イオンについて自動測定することを想定している。現状では、その機能は、プレスキャンデータを総イオン量などに従って序列化する機能、あるいは、総イオン量が設定値以上の部分を自動測定する機能などに限定されている。したがって、微量成分の機能解明あるいはバイオマーカー探索のための生体試料の質量分析において、現状のプレスキャン機能を利用することはできない。なぜなら、生体試料中の目的分子が微量であり、かつ生体試料中に多数の成分が混在するためである。特に、存在量が１ｐｍｏｌ以下の試料の場合には、目的イオンのピークよりもノイズのピークを選択することが多く、プレスキャン機能を利用して最適な測定部位を決定することはあまり有効ではなかった。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−０９８１４９号公報
【特許文献２】特開２００３−０９８１５４号公報
【非特許文献１】Jing Wei et al, Nature, 399 (1999), 243
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の点に鑑みて、微量（たとえば、ｆｍｏｌのオーダー）の目的分子および多数の夾雑成分を含む試料に関して、実験者の経験および勘に依存することなしにスイートスポットをより正確に探索し、見いだされたスイートスポットにレーザーを照射することによってイオン化を行い、高感度で目的分子の質量スペクトルを測定する方法を提供することである。特に、本発明は、目的分子の存在量が１ｐｍｏｌ以下である生体試料（糖タンパク中の糖鎖など）の質量スペクトルを測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の質量分析法は、（１）目的分子を含む試料を支持体上に載置して、測定試料を得る工程と、（２）測定試料の複数の領域に関して、ＭＳ測定を行う工程と、（３）前記複数の領域のそれぞれにおいて、工程（２）で得られた質量スペクトル中の異なるｍ／ｚを有する複数のイオンのシグナル強度を求める工程と、（４）工程（３）で得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する工程と、（５）工程（４）で得られた測定領域において、ＭＳn測定を行う工程であって、ｎは１以上の整数である工程とを含むことを特徴とする。
【００１１】
１つの態様においては、工程（３）における複数のイオンは、目的分子に由来するイオンであってもよい。該複数のイオンは、（ａ）目的分子の親イオンと目的分子の解離によって生じる１つまたは複数のフラグメントイオン、（ｂ）目的分子の解離によって生じる複数のフラグメントイオンのいずれであってもよい。ここで、工程（４）において、測定領域として、前記複数のイオンの少なくとも２つが各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示す領域を選択することができる。
【００１２】
別の態様においては、工程（３）における複数のイオンは、目的分子に由来する１つまたは複数のイオン、および目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンであってもよい。ここで、工程（４）において、測定領域として、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第１基準値よりも大きなシグナル強度を示し、および目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第２基準値よりも小さなシグナル強度を示す領域を選択することができる。あるいはまた、工程（４）において、測定領域として、前記複数のイオンのシグナル強度のパーセンテージの総和が基準値よりも大きい領域を選択してもよい（前記パーセンテージは、各領域における全イオンのシグナル強度の総和または各領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする）。
【００１３】
以上の構成において、工程（２）におけるＭＳ測定および工程（５）におけるＭＳn測定において、レーザー脱離イオン化法を用いることができる。ここで、工程（２）におけるＭＳ測定を、工程（５）におけるＭＳn測定よりも大きなレーザー強度で実施してもよい。また、工程（１）の試料がマトリックスをさらに含んでもよい。
【発明の効果】
【００１４】
以上のような構成を採ることによって、試料とマトリックスの混合結晶中のイオン化効率の高い測定領域を、実験者の経験および勘ならびに総イオン量に基づく選択に依存することなしに、正確に決定することが可能となる。そして、１ｐｍｏｌ以下の少ない存在量の目的分子の質量スペクトルおよび高次質量スペクトル（ＭＳn（ｎ＞１））を高感度で得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の質量分析法は、
（１） 目的分子を含む試料を支持体上に載置して、測定試料を得る工程と、
（２） 測定試料の複数の領域に関して、ＭＳ測定を行う工程と、
（３） 前記複数の領域のそれぞれにおいて、工程（２）で得られた質量スペクトル中の異なるｍ／ｚを有する複数のイオンのシグナル強度を求める工程と、
（４） 工程（３）で得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する工程と、
（５） 工程（４）で得られた測定領域において、ＭＳn測定を行う工程であって、ｎは１以上の整数である工程と
を含むことを特徴とする。
【００１６】
工程（１）は、通常のＭＡＬＤＩ法を行う場合と同様の方法によって実施することができる。本発明において用いることができる支持体は、当該技術において知られている、プレート（ステンレス、ガラス、シリコンなど）、膜、表面処理プレート（たとえば、金を表面コーティングされたプレートなど）、官能基を導入したケミカルチップ、抗体を結合したプロテインチップ、ナノドットプレート、および多孔性プレートを含む。
【００１７】
試料中の目的分子のイオン化効率向上およびフラグメントイオンの特異的生成を補助するために、目的分子の誘導体化反応を実施してもよい。誘導体化に用いる反応剤は、目的分子中に存在する官能基に依存して選択することができる。たとえば、目的分子中にカルボキシ基が存在する場合には、アミノ基、ヒドラジド基またはジアゾメチル基を含む反応剤を用いることができる。あるいはまた、目的分子中にアルデヒド基（糖の還元末端を含む）が存在する場合には、アミノ基またはヒドラジド基を含む反応剤を用いることができる。本発明において用いることができる反応剤の一例は、アミノピレン、１−ピレンブタン酸ヒドラジドおよび１−ピレニルジアゾメタンなどのピレン誘導体である。以下の記載において、目的分子およびその誘導体を「目的分子」と総称する場合がある。
【００１８】
試料を支持体上に分散し、レーザー照射のエネルギー吸収およびプロトンまたは電子の授受による試料中の目的分子のイオン化を実施するために、マトリックスを使用してもよい。本発明においては、マトリックスとして当該技術において知られている任意の材料を使用することができ、該材料は、たとえばＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、ＤＨＢＡ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）、ＳＡ（シナピン酸）などを含む。本発明においては、必要に応じて、前述のマトリックスに加えて、イオン化を促進するための添加剤を用いてもよい。あるいはまた、多孔質シリコン支持体、または微細加工によって表面凹凸が形成された支持体を用いることによって、マトリックスを用いなくてもよい。
【００１９】
工程（１）において、測定試料を形成する際に、水、アセトニトリル、アセトンなどの当該技術において知られている任意の溶媒を用いてもよい。また、測定試料の形成方法として、Dried droplet法、Crash crystal法、薄膜法、二層法などの当該技術において知られている任意の方法を利用することができる。
【００２０】
工程（２）においては、工程（１）にて得られた測定試料を複数の領域に区分し、それぞれの領域に関してＭＳ測定を行う。複数の領域への区分は、それぞれの領域に独立的にレーザー光を照射することが可能である限り、特に制限されるものではない。たとえば、２つの直交する方向（ｘ方向およびｙ方向）に反復される矩形領域に区分することができる。
【００２１】
工程（２）における複数の領域のそれぞれに関するＭＳ測定は、レーザー照射によるイオン化を伴う質量分析法によって実施することができる。たとえば、ＭＡＬＤＩ法、ＤＩＯＳ法などを適用することができる。ＭＳ測定における検出部としては、ＴＯＦ型、磁場型、四重極型、およびイオントラップ型を含む当該技術において知られている任意の装置を用いることができる。ＴＯＦ型装置を用いることが望ましい。
【００２２】
工程（２）においてパルス状のレーザー光の照射によりイオン化を行う場合、通常のＭＳ測定よりも少ないパルス数を用いて、質量スペクトルを得るようにしてもよい。
【００２３】
工程（２）におけるＭＳ測定においては、照射するレーザーの出力を通常よりも増大させて、ＩＳＤ(in source decay)およびＰＳＤ(post source decay)によるフラグメント化を促進してもよい。この方法は、工程（３）および（４）において、目的分子（その誘導体を含む）または非目的分子のフラグメントイオンを利用する際に特に有用である。
【００２４】
本工程において複数の領域に関して得られた質量スペクトルは、適切な形態で保存されて、以下の工程で使用される。
【００２５】
次に、工程（３）において、異なるｍ／ｚを有する複数のイオンを選択する。工程（２）で得られた複数の領域に関する質量スペクトルのそれぞれにおいて、それら複数のイオンのシグナル強度を求める。本発明のシグナル強度は、質量分析計の検出器の出力値あるいは、その出力値から算出された数値（Ｓ／Ｎ比を含む）であり、生成するイオンの量に比例する。
【００２６】
工程（３）において選択する複数のイオンは、目的分子（誘導体化を行った場合、その誘導体を含む）に由来する複数のイオンであってもよい。たとえば、目的分子の親イオン（［Ｍ］+、［Ｍ］-、［Ｍ＋Ｈ］+、［Ｍ＋Ｎａ］+、［Ｍ−Ｈ］-等を含む）、および目的分子のフラグメント化によって得られる１つまたは複数のイオンであってもよい。あるいはまた、目的分子のフラグメント化によって得られる複数のイオンを選択してもよい。たとえば、目的分子がシアル酸含有糖鎖（糖ペプチド）の場合は、ｍ／ｚ＝６５５のフラグメントイオンを選択してもよい。また、試料中にフコース含有糖鎖（糖ペプチド）が存在する場合には、ｍ／ｚ＝３２５、３４８、３６４などのフラグメントイオンを選択してもよい。さらには、目的分子の誘導体を行った場合には、目的分子の親イオンと、目的分子誘導体の親イオンとを選択してもよい。
【００２７】
あるいはまた、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンと、目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンを選択してもよい。ここで、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンは、目的分子の親イオンまたはフラグメントイオンのいずれであってもよい。一方、目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンは、試料中に存在する目的分子以外の化合物（夾雑物）に由来するイオンであってもよい。あるいはまた、マトリックスを用いる場合には、マトリックスに由来するイオンであってもよい。
【００２８】
工程（４）において、工程（３）で得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する。
【００２９】
工程（３）において目的分子に由来する複数のイオンを選択した場合、それら複数のイオンの少なくとも２つが各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示すこと、好ましくは、それら複数のイオンの全てが各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示すことを基準として、測定領域の選択することができる。工程（４）における基準値は、目的に応じて種々の値を採用することができる。別個のイオンに関しては、各イオン毎に基準値を設定してもよい。
【００３０】
たとえば、本発明においては、以下の基準を用いて「各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示すこと」を認定することができる。
（Ａ） 全領域の質量スペクトルに関して選択したイオンのシグナル強度の総和を算出し、当該領域のシグナル強度のパーセンテージ（シグナル強度の総和を基準とする）が基準値よりも大きいこと。
（Ｂ） 各領域において、全イオンのシグナル強度の総和を算出し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域の全イオンのシグナル強度の総和を基準とする）が基準値よりも大きいこと。
（Ｃ） 各領域において、シグナル強度が最も大きいイオンを決定し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする）が基準値よりも大きいこと。
（Ｄ） 全領域を通算して選択したイオンのシグナル強度が上位（たとえば上位１０位まで）であること。
（Ｅ） 各領域の質量スペクトルに関してベースラインおよびノイズレベルを算出し、選択したイオンのシグナル強度が（ベースラインの値）＋（ノイズレベルの値）×（評価ファクター）よりも大きいこと。評価ファクターは、目的に応じて種々の値を採用することができる。
（Ｆ） 全領域の質量スペクトルに関して選択したイオンのシグナル強度の平均値を算出し、選択したイオンのシグナル強度が平均値よりも大きなシグナル強度あるいは（平均値）＋（一定値）より大きいこと。この場合には、平均値に加えて標準偏差を算出して、各領域のシグナル強度の偏差値が一定の値よりも大きいことを基準とすることができる。ここで、偏差値は、（シグナル強度の平均値からの偏差）／（標準偏差）の式から計算される。
【００３１】
あるいはまた、工程（３）において目的分子に由来する複数のイオンを選択した場合、工程（３）において選択したイオンのシグナル強度を総合的に比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択してもよい。たとえば、本発明において、以下の基準を用いて測定領域を選択することができる。
（Ｇ） 各領域において、全イオンのシグナル強度の総和を算出し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域の全イオンのシグナル強度の総和を基準とする）の総和が基準値よりも大きいこと。
（Ｈ） 各領域において、シグナル強度が最も大きいイオンを決定し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする）の総和が基準値よりも大きいこと。
【００３２】
工程（３）において目的分子に由来する１つまたは複数のイオンと、目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンとを選択した場合、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第１基準値よりも大きなシグナル強度を示し、および目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第２基準値よりも小さなシグナル強度を示すことを基準として、測定領域の選択することができる。この場合に、「各イオンにより規定される第１基準値よりも大きなシグナル強度を示すこと」は、前述と同様の基準（Ａ）〜（Ｈ）を用いて認定することができる。
【００３３】
第２基準値は、前述の第１基準値と同一であっても異なっていてもよい。別個のイオンに関しては、各イオン毎に第２基準値を設定してもよい。たとえば、本発明においては、以下の基準を用いて「各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示すこと」を認定することができる。
（Ｉ） 全領域の質量スペクトルに関して選択したイオンのシグナル強度の総和を算出し、当該領域のシグナル強度のパーセンテージ（シグナル強度の総和を基準とする）が第２基準値よりも小さいこと。
（Ｊ） 各領域において、全イオンのシグナル強度の総和を算出し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域の全イオンのシグナル強度の総和を基準とする）が第２基準値よりも小さいこと。
（Ｋ） 各領域において、シグナル強度が最も大きいイオンを決定し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする）が第２基準値よりも小さいこと。
（Ｌ） 全領域を通算してシグナル強度が下位であること。
（Ｍ） 各領域の質量スペクトルのベースラインおよびノイズレベルを算出し、選択したイオンのシグナル強度が（ベースラインの値）＋（ノイズレベルの値）×（評価ファクター）よりも小さいこと。評価ファクターは、目的に応じて種々の値を採用することができる。ここで、「高いシグナル強度」の評価ファクターと、「低いシグナル強度」の評価ファクターとは、同一の値であっても異なる値であってもよい。
（Ｎ） 選択したイオンのシグナル強度が、全領域の質量スペクトルから得られる選択したイオンのシグナル強度の平均値あるいは（平均値）＋（一定値）よりも小さいこと。この場合には、各領域のシグナル強度の偏差値が第２基準値よりも小さいことを基準とすることもできる。
【００３４】
ここで、ヒトなどの生体試料に由来する糖タンパクまたは糖鎖のように、目的分子中に存在する部分構造のバリエーションが推定ないし限定されている場合が存在する。この場合には、工程（３）における目的分子に由来する複数のフラグメントイオンの選択の特殊な例として、それら存在が推定ないし限定されている部分構造に由来する複数のイオンを選択してもよい。次いで、工程（４）においては、それら複数のイオンの少なくとも１つが高いシグナル強度を示す領域を、測定領域として選択することができる。
【００３５】
また、未知試料で正確な分子量が不明な場合であっても、目的分子が特定の部分構造を有することが推定される場合がある。この場合には、工程（２）においてＩＳＤおよび／またはＰＳＤにより前述の部分構造の脱離を起こし、それによって生じるイオンの組を工程（３）において選択してもよい。たとえば、目的分子がポリラクトサミンを含む糖鎖（糖ペプチド）の場合は、１つまたは複数のラクトサミンの脱離により生じる（３６５×ｎ）Ｄａ差（ここで、ｎは１以上の整数である）の分子イオンの組を検出することが、測定領域の選択に有効である。たとえば、目的分子がシアル酸含有糖鎖（糖ペプチド）の場合は、シアル酸の脱離により生じる２９１Ｄａ差の分子イオンの組を検出することが、測定領域の選択に有効である。あるいはまた、目的分子がフコース含有糖鎖（糖ペプチド）である場合には、フコースの脱離により生じる１４６Ｄａ差をもつ分子イオンの組の存在を検出することが有効である。さらに、目的分子が硫酸含有糖鎖（糖ペプチド）またはリン酸含有糖鎖（糖ペプチド）である場合には、それぞれ、硫酸またはリン酸の脱離により生じる８０Ｄａ差または９８Ｄａ差の分子イオンの組を検出することが有効である。
【００３６】
工程（５）において、工程（４）で得られた測定領域において、ＭＳn測定（ここで、ｎは１以上の整数である）を行う。本工程におけるＭＳn測定は、前述のようにレーザー照射によるイオン化（たとえば、ＭＡＬＤＩ法、ＤＩＯＳ法など）を伴う質量分析法によって実施することができる。その際の検出部としては、ＴＯＦ型、磁場型、四重極型、およびイオントラップ型を含む当該技術において知られている任意の装置を用いることができる。ＴＯＦ型装置を用いることが望ましい。本工程におけるＭＳn測定は、当該技術において知られている任意の手順に従って実施することができる。
【実施例】
【００３７】
（比較例１） 特定の１点のシグナル強度による序列化
本実施例においては、以下に示す構造を有する糖鎖１（２００ｆｍｏｌ）を主成分とする試料を用いた。試料を金でコーティングしたプレート上に載置し、乾燥させた。その上に、１−ピレニルジアゾメタン５００ｐｍｏｌ含有ＤＭＳＯ溶液０．２５μＬを滴下し、２５分間にわたって４０℃に加熱して乾燥させることにより、ピレン標識された標識糖鎖１を得た。次に、ＤＨＢＡ（マトリクス）の溶液（溶媒：アセトニトリル−水）を滴下して、乾燥させて、測定試料を調製した。得られた測定試料の写真を図1に示す。図１の写真は、明瞭性のためにネガポジ変換を行っている。
【００３８】
【化１】
【００３９】
得られた測定試料を、ｘ×ｙ＝２１×２１の合計４４１の領域に分割し、質量分析計（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ、島津製作所）のラスタースキャンによって各領域のネガティブイオンを測定した。ラスタースキャンによって得られた各領域の測定ファイルの情報を、測定位置座標（ｘ，ｙ）、ｍ／ｚおよびシグナル強度を含むテキストに変換した。
【００４０】
得られたプレスキャンの結果を、装置に付属している機能を用いて、クロマトグラム表示した（図２参照）。このクロマトグラムからは、どの測定領域において目的とする糖鎖に由来するイオンが良好に検出できるかは不明であった。通常、このようなクロマトグラムが得られた場合は、測定試料が不適であるとしてこれ以上の解析は断念していた。
【００４１】
また、テキスト変換したデータに基づいて、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布を、公開ソフトＧｒａｐｈ−Ｒを用いて二次元で表示した。ここで、ｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度およびその上位５箇所の測定領域を図３に示し、当該測定領域における質量スペクトルを図４に示した。図４（ａ）〜（ｅ）においては、１００％が同一のシグナル強度になるように縦軸を規格化した。
【００４２】
経験的に、試料とマトリックスとの混合結晶の周縁部において、目的分子イオンを生じやすいといわれている。この場合にも、ｍ／ｚ＝２５８２のイオンは周縁部にかなり局在しており、プレスキャンが有効であるように思われた。しかし、図４（ａ）〜（ｅ）を一見して判るように、５箇所の測定領域のスペクトルのうち、Ｎｏ．３０４の領域のスペクトル（図４（ｂ）参照）においてのみ目的分子イオンが検出されており、その他の領域にはノイズしか見出すことができなかった。
【００４３】
また、既存の質量分析計に具備された機能として一般的である、トータルのイオン強度（総イオン量に相当）が設定値を越えた領域のスペクトルを測定する機能、およびＳ／Ｎ比が設定値を越えた領域のスペクトルを測定する機能も、Ｎｏ．３０４の領域を選択することができず、実際に最適な測定領域を決定する機能として満足すべきものではなかった。以上の結果から、これらの機能は、イオンが検出されるか否かを判断基準としており、比較的大量にプレート上に存在する高純度の試料に対しては有効であるが、生体試料のような多くの夾雑成分が混在している低純度の試料および目的分子が微量である試料には全く応用できないことが明らかとなった。
【００４４】
（実施例１） 目的分子に由来する２つのイオンのシグナル強度による序列化
比較例１と同様にして試料調製、プレスキャンおよび測定ファイル情報のテキスト変換を行った。
【００４５】
テキスト変換したデータに基づいて、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）のシグナル強度の上位５箇所を選択し、次いで、その５箇所の領域について未標識の糖鎖１に由来する脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２０７７）のシグナル強度に基づいて序列化することによって、ノイズのみが検出される領域ではなく、目的分子イオンを検出することができる領域番号Ｎｏ．３０４の領域を選択することができた。着目した各領域におけるｍ／ｚ＝２５８２および２０７７のイオンのシグナル強度を第1表に示した。
【００４６】
この結果から、目的分子に由来する複数のイオンのシグナル強度に着目することによって、より正確に測定領域を選択できることが明らかとなった。
【００４７】
【表１】
【００４８】
（実施例２） 未知試料に関する測定領域の選択およびＭＳ2測定
本実施例は、糖鎖を含む試料中の目的とする糖鎖の正確な分子量が不明であると仮定し、糖鎖を同定するためのＭＳ解析の例を示す。最初に、比較例１と同様にして測定試料を調製した。得られた測定試料に対して、ＩＳＤおよびＰＳＤを促進するために通常の測定よりも２０％位レーザー出力を増加して、ｘ×ｙ＝２１×２１の合計４４１の領域に関するプレスキャンを行なった。
【００４９】
テキスト変換したデータに基づいて、シアル酸が結合した糖鎖から生じるフラグメントイオン(ｍ／ｚ＝６５５）および代表的な夾雑イオン（ｍ／ｚ＝７９９）のシグナル強度を抽出し、ｍ／ｚ＝６５５のイオンのシグナル強度の上位１０個のファイルを、第２表に示した（図３）。
【００５０】
【表２】
【００５１】
第２表においては、ｍ／ｚ＝６５５のイオンのシグナル強度が、ｍ／ｚ＝７９９のイオンのシグナル強度よりも大きい測定領域を、「○」と評価した。「○」と評価されなかった測定領域の代表として、Ｎｏ．１３０の領域を選択し、その質量スペクトルを図５（ａ）に示した。図５（ａ）から分かるように、この測定領域においてはノイズが見いだされるのみであり、目的とする糖鎖に由来するイオンのシグナルは得られなかった。
【００５２】
一方、「○」と評価された測定領域の代表として、Ｎｏ．２９０の領域を選択し、その質量スペクトルを図５（ｂ）に示した。なお、図５（ａ）および（ｂ）においては、１００％が同一のシグナル強度になるように縦軸を規格化した。この測定領域においては、糖鎖に由来するフラグメントであるｍ／ｚ＝６５５，８７９，１１１３，１４７８のイオンの他に、これらフラグメントを生成したｍ／ｚ＝１９３０，２０７７，２５８２の糖鎖イオンを検出することができた。この結果から、目的とする分子量不明の糖鎖から生じるフラグメントイオンと夾雑イオンとを判断基準とし、フラグメントイオンが多く存在することに加えて、夾雑イオンが少ない測定領域を選択することがきわめて有効であることが分かった。そして、そのような選択によって、目的とする糖鎖の質量スペクトルを高いＳ／Ｎ比で得ることができた。
【００５３】
次に、Ｎｏ．２９０の領域において得られたｍ／ｚ＝２５８２の糖鎖イオンをプレカーサーイオンとして選択して、ＭＳ2測定を行った。ＭＳ2測定によって得られる質量スペクトルを図５（ｃ）に示した。さらに、ＭＳ2測定によって得られるｍ／ｚ＝６５５．０、１１１３．６、１５４８．７および２２１５．１の各イオンをプレカーサーイオンとして選択して、ＭＳ3測定を行うことができた。
【００５４】
Ｎｏ．２９０の領域において高次のＭＳが容易になった重要な理由は、以下の通りである：（１）プレスキャンを行った全４４１領域におけるｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度の平均が約１０ｍＶであるのに比較して、Ｎｏ．２９０の領域におけるｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度は約２００ｍＶであったこと、すなわち、Ｎｏ．２９０の領域が平均の約２０倍のイオンを生成する部位であったこと；および（２）Ｎｏ．２９０の領域においては、夾雑物に起因するイオンが少なく、Ｓ／Ｎ比が良好であったこと。
【００５５】
以上の結果から、正確な分子量が不明な未知試料についても、ＩＳＤおよび／またはＰＳＤで生じる特異的イオンをプレスキャンで検出することで、最適な測定領域を決定することが可能であることも示された。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】比較例１で得られた測定試料の写真を示す図である。
【図２】比較例１のプレスキャンの結果のクロマトグラムを示す図である。
【図３】比較例１におけるｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度、およびその上位５箇所の領域を示す図である。
【図４】比較例１におけるｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度の上位５箇所の領域における質量スペクトルを示す図であり、（ａ）〜（ｅ）は、それぞれＮｏ．９６、３０４、１５４、１７７および２２０の領域における質量スペクトルを示す図である。
【図５】実施例２において得られる質量スペクトルを示す図であり、（ａ）は、Ｎｏ．１３０の領域における質量スペクトルを示す図であり、（ｂ）は、Ｎｏ．２９０の領域における質量スペクトルを示す図であり、（ｃ）は、Ｎｏ．２９０の領域において、ｍ／ｚ＝２５８２のイオンをプリカーサーイオンとして用いたＭＳ2測定によって得られる質量スペクトルを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析法に関する。より詳細には、本発明は、目的分子イオンの強いシグナルを得られる測定試料の領域を選定する工程を伴う質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、質量分析法において、レーザーを用いて目的分子のイオン化を行う方法が注目を集めてきている。その中で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、試料とマトリックスの混合結晶を調製し、それにレーザー光を照射することでイオン化を行なう方法である。ＭＡＬＤＩ法は、イオン化しにくい生体高分子、タンパク質および糖鎖にも適用できることから、生化学や医学の分野で急速に普及してきた。
【０００３】
ＭＡＬＤＩ法を適用する場合には、試料とマトリックスの混合結晶の状態が均一であることが望ましいとされている。混合結晶の状態の均一性によってスペクトルの良否が支配されるため、マトリックスの選択方法やマトリックスと試料の混合方法などについての改良がなされてきた（例えば特許文献１および２参照）。
【０００４】
しかし、実際には、マトリックスの存在するところ全てに試料のイオンが測定できることはない。多くの場合、測定試料中に、イオン化効率の高い測定部位（スイートスポットと呼ばれる）が点在している。スイートスポットにおいてのみ、目的分子イオンのシグナル強度が大きく、高感度での質量分析が可能となる。ＭＡＬＤＩ法において用いるレーザーのビーム径（約２００μｍ）が測定試料の大きさよりも格段に小さいため、適切な測定部位にレーザーを照射する必要がある。特に、生体試料由来の微量サンプルの解析時には、高感度での多段階質量分析（ＭＳn）を可能とするような測定部位を探索する必要がある。
【０００５】
従来、このような測定部位の探索は，実験者の経験および勘に依存している。一般的には，質量分析計に内蔵されているＣＣＤカメラなどの画像を観察して、レーザーを照射する測定部位を決定している。このような画像観察に基づく探索は、精度および再現性は低いものとなっている。なぜなら、たとえ高い解像度を持った画像出力装置を用いたとしても、マトリックス結晶の形および状態とイオン化効率の高い部位との良好な相関を得ることはできないからである。
【０００６】
また、スペクトルのＳ／Ｎ比を改善するために、プレートを改良してマトリクスを用いることなしに質量分析を行うことも試みられている（たとえば、非特許文献１参照）。この場合は、測定試料中の目的分子は微量であり、したがって質量分析計に内蔵されているＣＣＤカメラの画像では、当該目的分子の存在する部位を特定することができない。すなわち、ＣＣＤカメラの画像の観察によっては、測定部位の探索を行うことができない。
【０００７】
これらの問題点を解決するために、多くの質量分析計には、ラスタースキャンなどのプレスキャン測定機能が装備されている。しかし、その機能は、極めて高純度で大量にある目的分子イオンについて自動測定することを想定している。現状では、その機能は、プレスキャンデータを総イオン量などに従って序列化する機能、あるいは、総イオン量が設定値以上の部分を自動測定する機能などに限定されている。したがって、微量成分の機能解明あるいはバイオマーカー探索のための生体試料の質量分析において、現状のプレスキャン機能を利用することはできない。なぜなら、生体試料中の目的分子が微量であり、かつ生体試料中に多数の成分が混在するためである。特に、存在量が１ｐｍｏｌ以下の試料の場合には、目的イオンのピークよりもノイズのピークを選択することが多く、プレスキャン機能を利用して最適な測定部位を決定することはあまり有効ではなかった。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−０９８１４９号公報
【特許文献２】特開２００３−０９８１５４号公報
【非特許文献１】Jing Wei et al, Nature, 399 (1999), 243
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の点に鑑みて、微量（たとえば、ｆｍｏｌのオーダー）の目的分子および多数の夾雑成分を含む試料に関して、実験者の経験および勘に依存することなしにスイートスポットをより正確に探索し、見いだされたスイートスポットにレーザーを照射することによってイオン化を行い、高感度で目的分子の質量スペクトルを測定する方法を提供することである。特に、本発明は、目的分子の存在量が１ｐｍｏｌ以下である生体試料（糖タンパク中の糖鎖など）の質量スペクトルを測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の質量分析法は、（１）目的分子を含む試料を支持体上に載置して、測定試料を得る工程と、（２）測定試料の複数の領域に関して、ＭＳ測定を行う工程と、（３）前記複数の領域のそれぞれにおいて、工程（２）で得られた質量スペクトル中の異なるｍ／ｚを有する複数のイオンのシグナル強度を求める工程と、（４）工程（３）で得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する工程と、（５）工程（４）で得られた測定領域において、ＭＳn測定を行う工程であって、ｎは１以上の整数である工程とを含むことを特徴とする。
【００１１】
１つの態様においては、工程（３）における複数のイオンは、目的分子に由来するイオンであってもよい。該複数のイオンは、（ａ）目的分子の親イオンと目的分子の解離によって生じる１つまたは複数のフラグメントイオン、（ｂ）目的分子の解離によって生じる複数のフラグメントイオンのいずれであってもよい。ここで、工程（４）において、測定領域として、前記複数のイオンの少なくとも２つが各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示す領域を選択することができる。
【００１２】
別の態様においては、工程（３）における複数のイオンは、目的分子に由来する１つまたは複数のイオン、および目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンであってもよい。ここで、工程（４）において、測定領域として、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第１基準値よりも大きなシグナル強度を示し、および目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第２基準値よりも小さなシグナル強度を示す領域を選択することができる。あるいはまた、工程（４）において、測定領域として、前記複数のイオンのシグナル強度のパーセンテージの総和が基準値よりも大きい領域を選択してもよい（前記パーセンテージは、各領域における全イオンのシグナル強度の総和または各領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする）。
【００１３】
以上の構成において、工程（２）におけるＭＳ測定および工程（５）におけるＭＳn測定において、レーザー脱離イオン化法を用いることができる。ここで、工程（２）におけるＭＳ測定を、工程（５）におけるＭＳn測定よりも大きなレーザー強度で実施してもよい。また、工程（１）の試料がマトリックスをさらに含んでもよい。
【発明の効果】
【００１４】
以上のような構成を採ることによって、試料とマトリックスの混合結晶中のイオン化効率の高い測定領域を、実験者の経験および勘ならびに総イオン量に基づく選択に依存することなしに、正確に決定することが可能となる。そして、１ｐｍｏｌ以下の少ない存在量の目的分子の質量スペクトルおよび高次質量スペクトル（ＭＳn（ｎ＞１））を高感度で得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の質量分析法は、
（１） 目的分子を含む試料を支持体上に載置して、測定試料を得る工程と、
（２） 測定試料の複数の領域に関して、ＭＳ測定を行う工程と、
（３） 前記複数の領域のそれぞれにおいて、工程（２）で得られた質量スペクトル中の異なるｍ／ｚを有する複数のイオンのシグナル強度を求める工程と、
（４） 工程（３）で得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する工程と、
（５） 工程（４）で得られた測定領域において、ＭＳn測定を行う工程であって、ｎは１以上の整数である工程と
を含むことを特徴とする。
【００１６】
工程（１）は、通常のＭＡＬＤＩ法を行う場合と同様の方法によって実施することができる。本発明において用いることができる支持体は、当該技術において知られている、プレート（ステンレス、ガラス、シリコンなど）、膜、表面処理プレート（たとえば、金を表面コーティングされたプレートなど）、官能基を導入したケミカルチップ、抗体を結合したプロテインチップ、ナノドットプレート、および多孔性プレートを含む。
【００１７】
試料中の目的分子のイオン化効率向上およびフラグメントイオンの特異的生成を補助するために、目的分子の誘導体化反応を実施してもよい。誘導体化に用いる反応剤は、目的分子中に存在する官能基に依存して選択することができる。たとえば、目的分子中にカルボキシ基が存在する場合には、アミノ基、ヒドラジド基またはジアゾメチル基を含む反応剤を用いることができる。あるいはまた、目的分子中にアルデヒド基（糖の還元末端を含む）が存在する場合には、アミノ基またはヒドラジド基を含む反応剤を用いることができる。本発明において用いることができる反応剤の一例は、アミノピレン、１−ピレンブタン酸ヒドラジドおよび１−ピレニルジアゾメタンなどのピレン誘導体である。以下の記載において、目的分子およびその誘導体を「目的分子」と総称する場合がある。
【００１８】
試料を支持体上に分散し、レーザー照射のエネルギー吸収およびプロトンまたは電子の授受による試料中の目的分子のイオン化を実施するために、マトリックスを使用してもよい。本発明においては、マトリックスとして当該技術において知られている任意の材料を使用することができ、該材料は、たとえばＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、ＤＨＢＡ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）、ＳＡ（シナピン酸）などを含む。本発明においては、必要に応じて、前述のマトリックスに加えて、イオン化を促進するための添加剤を用いてもよい。あるいはまた、多孔質シリコン支持体、または微細加工によって表面凹凸が形成された支持体を用いることによって、マトリックスを用いなくてもよい。
【００１９】
工程（１）において、測定試料を形成する際に、水、アセトニトリル、アセトンなどの当該技術において知られている任意の溶媒を用いてもよい。また、測定試料の形成方法として、Dried droplet法、Crash crystal法、薄膜法、二層法などの当該技術において知られている任意の方法を利用することができる。
【００２０】
工程（２）においては、工程（１）にて得られた測定試料を複数の領域に区分し、それぞれの領域に関してＭＳ測定を行う。複数の領域への区分は、それぞれの領域に独立的にレーザー光を照射することが可能である限り、特に制限されるものではない。たとえば、２つの直交する方向（ｘ方向およびｙ方向）に反復される矩形領域に区分することができる。
【００２１】
工程（２）における複数の領域のそれぞれに関するＭＳ測定は、レーザー照射によるイオン化を伴う質量分析法によって実施することができる。たとえば、ＭＡＬＤＩ法、ＤＩＯＳ法などを適用することができる。ＭＳ測定における検出部としては、ＴＯＦ型、磁場型、四重極型、およびイオントラップ型を含む当該技術において知られている任意の装置を用いることができる。ＴＯＦ型装置を用いることが望ましい。
【００２２】
工程（２）においてパルス状のレーザー光の照射によりイオン化を行う場合、通常のＭＳ測定よりも少ないパルス数を用いて、質量スペクトルを得るようにしてもよい。
【００２３】
工程（２）におけるＭＳ測定においては、照射するレーザーの出力を通常よりも増大させて、ＩＳＤ(in source decay)およびＰＳＤ(post source decay)によるフラグメント化を促進してもよい。この方法は、工程（３）および（４）において、目的分子（その誘導体を含む）または非目的分子のフラグメントイオンを利用する際に特に有用である。
【００２４】
本工程において複数の領域に関して得られた質量スペクトルは、適切な形態で保存されて、以下の工程で使用される。
【００２５】
次に、工程（３）において、異なるｍ／ｚを有する複数のイオンを選択する。工程（２）で得られた複数の領域に関する質量スペクトルのそれぞれにおいて、それら複数のイオンのシグナル強度を求める。本発明のシグナル強度は、質量分析計の検出器の出力値あるいは、その出力値から算出された数値（Ｓ／Ｎ比を含む）であり、生成するイオンの量に比例する。
【００２６】
工程（３）において選択する複数のイオンは、目的分子（誘導体化を行った場合、その誘導体を含む）に由来する複数のイオンであってもよい。たとえば、目的分子の親イオン（［Ｍ］+、［Ｍ］-、［Ｍ＋Ｈ］+、［Ｍ＋Ｎａ］+、［Ｍ−Ｈ］-等を含む）、および目的分子のフラグメント化によって得られる１つまたは複数のイオンであってもよい。あるいはまた、目的分子のフラグメント化によって得られる複数のイオンを選択してもよい。たとえば、目的分子がシアル酸含有糖鎖（糖ペプチド）の場合は、ｍ／ｚ＝６５５のフラグメントイオンを選択してもよい。また、試料中にフコース含有糖鎖（糖ペプチド）が存在する場合には、ｍ／ｚ＝３２５、３４８、３６４などのフラグメントイオンを選択してもよい。さらには、目的分子の誘導体を行った場合には、目的分子の親イオンと、目的分子誘導体の親イオンとを選択してもよい。
【００２７】
あるいはまた、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンと、目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンを選択してもよい。ここで、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンは、目的分子の親イオンまたはフラグメントイオンのいずれであってもよい。一方、目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンは、試料中に存在する目的分子以外の化合物（夾雑物）に由来するイオンであってもよい。あるいはまた、マトリックスを用いる場合には、マトリックスに由来するイオンであってもよい。
【００２８】
工程（４）において、工程（３）で得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する。
【００２９】
工程（３）において目的分子に由来する複数のイオンを選択した場合、それら複数のイオンの少なくとも２つが各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示すこと、好ましくは、それら複数のイオンの全てが各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示すことを基準として、測定領域の選択することができる。工程（４）における基準値は、目的に応じて種々の値を採用することができる。別個のイオンに関しては、各イオン毎に基準値を設定してもよい。
【００３０】
たとえば、本発明においては、以下の基準を用いて「各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示すこと」を認定することができる。
（Ａ） 全領域の質量スペクトルに関して選択したイオンのシグナル強度の総和を算出し、当該領域のシグナル強度のパーセンテージ（シグナル強度の総和を基準とする）が基準値よりも大きいこと。
（Ｂ） 各領域において、全イオンのシグナル強度の総和を算出し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域の全イオンのシグナル強度の総和を基準とする）が基準値よりも大きいこと。
（Ｃ） 各領域において、シグナル強度が最も大きいイオンを決定し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする）が基準値よりも大きいこと。
（Ｄ） 全領域を通算して選択したイオンのシグナル強度が上位（たとえば上位１０位まで）であること。
（Ｅ） 各領域の質量スペクトルに関してベースラインおよびノイズレベルを算出し、選択したイオンのシグナル強度が（ベースラインの値）＋（ノイズレベルの値）×（評価ファクター）よりも大きいこと。評価ファクターは、目的に応じて種々の値を採用することができる。
（Ｆ） 全領域の質量スペクトルに関して選択したイオンのシグナル強度の平均値を算出し、選択したイオンのシグナル強度が平均値よりも大きなシグナル強度あるいは（平均値）＋（一定値）より大きいこと。この場合には、平均値に加えて標準偏差を算出して、各領域のシグナル強度の偏差値が一定の値よりも大きいことを基準とすることができる。ここで、偏差値は、（シグナル強度の平均値からの偏差）／（標準偏差）の式から計算される。
【００３１】
あるいはまた、工程（３）において目的分子に由来する複数のイオンを選択した場合、工程（３）において選択したイオンのシグナル強度を総合的に比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択してもよい。たとえば、本発明において、以下の基準を用いて測定領域を選択することができる。
（Ｇ） 各領域において、全イオンのシグナル強度の総和を算出し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域の全イオンのシグナル強度の総和を基準とする）の総和が基準値よりも大きいこと。
（Ｈ） 各領域において、シグナル強度が最も大きいイオンを決定し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする）の総和が基準値よりも大きいこと。
【００３２】
工程（３）において目的分子に由来する１つまたは複数のイオンと、目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンとを選択した場合、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第１基準値よりも大きなシグナル強度を示し、および目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第２基準値よりも小さなシグナル強度を示すことを基準として、測定領域の選択することができる。この場合に、「各イオンにより規定される第１基準値よりも大きなシグナル強度を示すこと」は、前述と同様の基準（Ａ）〜（Ｈ）を用いて認定することができる。
【００３３】
第２基準値は、前述の第１基準値と同一であっても異なっていてもよい。別個のイオンに関しては、各イオン毎に第２基準値を設定してもよい。たとえば、本発明においては、以下の基準を用いて「各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示すこと」を認定することができる。
（Ｉ） 全領域の質量スペクトルに関して選択したイオンのシグナル強度の総和を算出し、当該領域のシグナル強度のパーセンテージ（シグナル強度の総和を基準とする）が第２基準値よりも小さいこと。
（Ｊ） 各領域において、全イオンのシグナル強度の総和を算出し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域の全イオンのシグナル強度の総和を基準とする）が第２基準値よりも小さいこと。
（Ｋ） 各領域において、シグナル強度が最も大きいイオンを決定し、選択したイオンのシグナル強度のパーセンテージ（当該領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする）が第２基準値よりも小さいこと。
（Ｌ） 全領域を通算してシグナル強度が下位であること。
（Ｍ） 各領域の質量スペクトルのベースラインおよびノイズレベルを算出し、選択したイオンのシグナル強度が（ベースラインの値）＋（ノイズレベルの値）×（評価ファクター）よりも小さいこと。評価ファクターは、目的に応じて種々の値を採用することができる。ここで、「高いシグナル強度」の評価ファクターと、「低いシグナル強度」の評価ファクターとは、同一の値であっても異なる値であってもよい。
（Ｎ） 選択したイオンのシグナル強度が、全領域の質量スペクトルから得られる選択したイオンのシグナル強度の平均値あるいは（平均値）＋（一定値）よりも小さいこと。この場合には、各領域のシグナル強度の偏差値が第２基準値よりも小さいことを基準とすることもできる。
【００３４】
ここで、ヒトなどの生体試料に由来する糖タンパクまたは糖鎖のように、目的分子中に存在する部分構造のバリエーションが推定ないし限定されている場合が存在する。この場合には、工程（３）における目的分子に由来する複数のフラグメントイオンの選択の特殊な例として、それら存在が推定ないし限定されている部分構造に由来する複数のイオンを選択してもよい。次いで、工程（４）においては、それら複数のイオンの少なくとも１つが高いシグナル強度を示す領域を、測定領域として選択することができる。
【００３５】
また、未知試料で正確な分子量が不明な場合であっても、目的分子が特定の部分構造を有することが推定される場合がある。この場合には、工程（２）においてＩＳＤおよび／またはＰＳＤにより前述の部分構造の脱離を起こし、それによって生じるイオンの組を工程（３）において選択してもよい。たとえば、目的分子がポリラクトサミンを含む糖鎖（糖ペプチド）の場合は、１つまたは複数のラクトサミンの脱離により生じる（３６５×ｎ）Ｄａ差（ここで、ｎは１以上の整数である）の分子イオンの組を検出することが、測定領域の選択に有効である。たとえば、目的分子がシアル酸含有糖鎖（糖ペプチド）の場合は、シアル酸の脱離により生じる２９１Ｄａ差の分子イオンの組を検出することが、測定領域の選択に有効である。あるいはまた、目的分子がフコース含有糖鎖（糖ペプチド）である場合には、フコースの脱離により生じる１４６Ｄａ差をもつ分子イオンの組の存在を検出することが有効である。さらに、目的分子が硫酸含有糖鎖（糖ペプチド）またはリン酸含有糖鎖（糖ペプチド）である場合には、それぞれ、硫酸またはリン酸の脱離により生じる８０Ｄａ差または９８Ｄａ差の分子イオンの組を検出することが有効である。
【００３６】
工程（５）において、工程（４）で得られた測定領域において、ＭＳn測定（ここで、ｎは１以上の整数である）を行う。本工程におけるＭＳn測定は、前述のようにレーザー照射によるイオン化（たとえば、ＭＡＬＤＩ法、ＤＩＯＳ法など）を伴う質量分析法によって実施することができる。その際の検出部としては、ＴＯＦ型、磁場型、四重極型、およびイオントラップ型を含む当該技術において知られている任意の装置を用いることができる。ＴＯＦ型装置を用いることが望ましい。本工程におけるＭＳn測定は、当該技術において知られている任意の手順に従って実施することができる。
【実施例】
【００３７】
（比較例１） 特定の１点のシグナル強度による序列化
本実施例においては、以下に示す構造を有する糖鎖１（２００ｆｍｏｌ）を主成分とする試料を用いた。試料を金でコーティングしたプレート上に載置し、乾燥させた。その上に、１−ピレニルジアゾメタン５００ｐｍｏｌ含有ＤＭＳＯ溶液０．２５μＬを滴下し、２５分間にわたって４０℃に加熱して乾燥させることにより、ピレン標識された標識糖鎖１を得た。次に、ＤＨＢＡ（マトリクス）の溶液（溶媒：アセトニトリル−水）を滴下して、乾燥させて、測定試料を調製した。得られた測定試料の写真を図1に示す。図１の写真は、明瞭性のためにネガポジ変換を行っている。
【００３８】
【化１】
【００３９】
得られた測定試料を、ｘ×ｙ＝２１×２１の合計４４１の領域に分割し、質量分析計（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ、島津製作所）のラスタースキャンによって各領域のネガティブイオンを測定した。ラスタースキャンによって得られた各領域の測定ファイルの情報を、測定位置座標（ｘ，ｙ）、ｍ／ｚおよびシグナル強度を含むテキストに変換した。
【００４０】
得られたプレスキャンの結果を、装置に付属している機能を用いて、クロマトグラム表示した（図２参照）。このクロマトグラムからは、どの測定領域において目的とする糖鎖に由来するイオンが良好に検出できるかは不明であった。通常、このようなクロマトグラムが得られた場合は、測定試料が不適であるとしてこれ以上の解析は断念していた。
【００４１】
また、テキスト変換したデータに基づいて、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布を、公開ソフトＧｒａｐｈ−Ｒを用いて二次元で表示した。ここで、ｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度およびその上位５箇所の測定領域を図３に示し、当該測定領域における質量スペクトルを図４に示した。図４（ａ）〜（ｅ）においては、１００％が同一のシグナル強度になるように縦軸を規格化した。
【００４２】
経験的に、試料とマトリックスとの混合結晶の周縁部において、目的分子イオンを生じやすいといわれている。この場合にも、ｍ／ｚ＝２５８２のイオンは周縁部にかなり局在しており、プレスキャンが有効であるように思われた。しかし、図４（ａ）〜（ｅ）を一見して判るように、５箇所の測定領域のスペクトルのうち、Ｎｏ．３０４の領域のスペクトル（図４（ｂ）参照）においてのみ目的分子イオンが検出されており、その他の領域にはノイズしか見出すことができなかった。
【００４３】
また、既存の質量分析計に具備された機能として一般的である、トータルのイオン強度（総イオン量に相当）が設定値を越えた領域のスペクトルを測定する機能、およびＳ／Ｎ比が設定値を越えた領域のスペクトルを測定する機能も、Ｎｏ．３０４の領域を選択することができず、実際に最適な測定領域を決定する機能として満足すべきものではなかった。以上の結果から、これらの機能は、イオンが検出されるか否かを判断基準としており、比較的大量にプレート上に存在する高純度の試料に対しては有効であるが、生体試料のような多くの夾雑成分が混在している低純度の試料および目的分子が微量である試料には全く応用できないことが明らかとなった。
【００４４】
（実施例１） 目的分子に由来する２つのイオンのシグナル強度による序列化
比較例１と同様にして試料調製、プレスキャンおよび測定ファイル情報のテキスト変換を行った。
【００４５】
テキスト変換したデータに基づいて、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）のシグナル強度の上位５箇所を選択し、次いで、その５箇所の領域について未標識の糖鎖１に由来する脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２０７７）のシグナル強度に基づいて序列化することによって、ノイズのみが検出される領域ではなく、目的分子イオンを検出することができる領域番号Ｎｏ．３０４の領域を選択することができた。着目した各領域におけるｍ／ｚ＝２５８２および２０７７のイオンのシグナル強度を第1表に示した。
【００４６】
この結果から、目的分子に由来する複数のイオンのシグナル強度に着目することによって、より正確に測定領域を選択できることが明らかとなった。
【００４７】
【表１】
【００４８】
（実施例２） 未知試料に関する測定領域の選択およびＭＳ2測定
本実施例は、糖鎖を含む試料中の目的とする糖鎖の正確な分子量が不明であると仮定し、糖鎖を同定するためのＭＳ解析の例を示す。最初に、比較例１と同様にして測定試料を調製した。得られた測定試料に対して、ＩＳＤおよびＰＳＤを促進するために通常の測定よりも２０％位レーザー出力を増加して、ｘ×ｙ＝２１×２１の合計４４１の領域に関するプレスキャンを行なった。
【００４９】
テキスト変換したデータに基づいて、シアル酸が結合した糖鎖から生じるフラグメントイオン(ｍ／ｚ＝６５５）および代表的な夾雑イオン（ｍ／ｚ＝７９９）のシグナル強度を抽出し、ｍ／ｚ＝６５５のイオンのシグナル強度の上位１０個のファイルを、第２表に示した（図３）。
【００５０】
【表２】
【００５１】
第２表においては、ｍ／ｚ＝６５５のイオンのシグナル強度が、ｍ／ｚ＝７９９のイオンのシグナル強度よりも大きい測定領域を、「○」と評価した。「○」と評価されなかった測定領域の代表として、Ｎｏ．１３０の領域を選択し、その質量スペクトルを図５（ａ）に示した。図５（ａ）から分かるように、この測定領域においてはノイズが見いだされるのみであり、目的とする糖鎖に由来するイオンのシグナルは得られなかった。
【００５２】
一方、「○」と評価された測定領域の代表として、Ｎｏ．２９０の領域を選択し、その質量スペクトルを図５（ｂ）に示した。なお、図５（ａ）および（ｂ）においては、１００％が同一のシグナル強度になるように縦軸を規格化した。この測定領域においては、糖鎖に由来するフラグメントであるｍ／ｚ＝６５５，８７９，１１１３，１４７８のイオンの他に、これらフラグメントを生成したｍ／ｚ＝１９３０，２０７７，２５８２の糖鎖イオンを検出することができた。この結果から、目的とする分子量不明の糖鎖から生じるフラグメントイオンと夾雑イオンとを判断基準とし、フラグメントイオンが多く存在することに加えて、夾雑イオンが少ない測定領域を選択することがきわめて有効であることが分かった。そして、そのような選択によって、目的とする糖鎖の質量スペクトルを高いＳ／Ｎ比で得ることができた。
【００５３】
次に、Ｎｏ．２９０の領域において得られたｍ／ｚ＝２５８２の糖鎖イオンをプレカーサーイオンとして選択して、ＭＳ2測定を行った。ＭＳ2測定によって得られる質量スペクトルを図５（ｃ）に示した。さらに、ＭＳ2測定によって得られるｍ／ｚ＝６５５．０、１１１３．６、１５４８．７および２２１５．１の各イオンをプレカーサーイオンとして選択して、ＭＳ3測定を行うことができた。
【００５４】
Ｎｏ．２９０の領域において高次のＭＳが容易になった重要な理由は、以下の通りである：（１）プレスキャンを行った全４４１領域におけるｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度の平均が約１０ｍＶであるのに比較して、Ｎｏ．２９０の領域におけるｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度は約２００ｍＶであったこと、すなわち、Ｎｏ．２９０の領域が平均の約２０倍のイオンを生成する部位であったこと；および（２）Ｎｏ．２９０の領域においては、夾雑物に起因するイオンが少なく、Ｓ／Ｎ比が良好であったこと。
【００５５】
以上の結果から、正確な分子量が不明な未知試料についても、ＩＳＤおよび／またはＰＳＤで生じる特異的イオンをプレスキャンで検出することで、最適な測定領域を決定することが可能であることも示された。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】比較例１で得られた測定試料の写真を示す図である。
【図２】比較例１のプレスキャンの結果のクロマトグラムを示す図である。
【図３】比較例１におけるｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度、およびその上位５箇所の領域を示す図である。
【図４】比較例１におけるｍ／ｚ＝２５８２のイオンのシグナル強度の上位５箇所の領域における質量スペクトルを示す図であり、（ａ）〜（ｅ）は、それぞれＮｏ．９６、３０４、１５４、１７７および２２０の領域における質量スペクトルを示す図である。
【図５】実施例２において得られる質量スペクトルを示す図であり、（ａ）は、Ｎｏ．１３０の領域における質量スペクトルを示す図であり、（ｂ）は、Ｎｏ．２９０の領域における質量スペクトルを示す図であり、（ｃ）は、Ｎｏ．２９０の領域において、ｍ／ｚ＝２５８２のイオンをプリカーサーイオンとして用いたＭＳ2測定によって得られる質量スペクトルを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１） 目的分子を含む試料を支持体上に載置して、測定試料を得る工程と、
（２） 測定試料の複数の領域に関して、ＭＳ測定を行う工程と、
（３） 前記複数の領域のそれぞれにおいて、工程（２）で得られた質量スペクトル中の異なるｍ／ｚを有する複数のイオンのシグナル強度を求める工程と、
（４） 工程（３）で得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する工程と、
（５） 工程（４）で得られた測定領域において、ＭＳn測定を行う工程であって、ｎは１以上の整数である工程と
を含むことを特徴とする質量分析法。
【請求項２】
工程（３）における複数のイオンが、目的分子に由来するイオンであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析法。
【請求項３】
工程（３）における複数のイオンが、目的分子の親イオンと目的分子の解離によって生じる１つまたは複数のフラグメントイオンであることを特徴とする請求項２に記載の質量分析法。
【請求項４】
工程（３）における複数のイオンが、目的分子の解離によって生じる複数のフラグメントイオンであることを特徴とする請求項２に記載の質量分析法。
【請求項５】
工程（４）において、測定領域として、前記複数のイオンの少なくとも２つが各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示す領域を選択することを特徴とする請求項２から４のいずれかに記載の質量分析法。
【請求項６】
工程（４）において、測定領域として、前記複数のイオンのシグナル強度のパーセンテージの総和が基準値よりも大きい領域を選択し、
前記パーセンテージは、各領域における全イオンのシグナル強度の総和、または各領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする
ことを特徴とする請求項２から４のいずれかに記載の質量分析法。
【請求項７】
工程（３）における複数のイオンが、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンと、目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンとを含むことを特徴とする請求項１に記載の質量分析法。
【請求項８】
工程（４）において、測定領域として、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第１基準値よりも大きなシグナル強度を示し、および目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第２基準値よりも小さなシグナル強度を示す領域を選択することを特徴とする請求項７に記載の質量分析法。
【請求項９】
工程（２）におけるＭＳ測定および工程（５）におけるＭＳn測定において、レーザ脱離イオン化法を用いることを特徴とする請求項１に記載の質量分析法。
【請求項１０】
工程（２）におけるＭＳ測定を、工程（５）におけるＭＳn測定よりも大きなレーザー強度で実施する、レーザ脱離イオン化法を用いることを特徴とする請求項９に記載の質量分析法。
【請求項１１】
工程（１）の試料がマトリクスをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の質量分析法。
【請求項１】
（１） 目的分子を含む試料を支持体上に載置して、測定試料を得る工程と、
（２） 測定試料の複数の領域に関して、ＭＳ測定を行う工程と、
（３） 前記複数の領域のそれぞれにおいて、工程（２）で得られた質量スペクトル中の異なるｍ／ｚを有する複数のイオンのシグナル強度を求める工程と、
（４） 工程（３）で得られたシグナル強度を比較して、前記複数の領域の中から測定領域を選択する工程と、
（５） 工程（４）で得られた測定領域において、ＭＳn測定を行う工程であって、ｎは１以上の整数である工程と
を含むことを特徴とする質量分析法。
【請求項２】
工程（３）における複数のイオンが、目的分子に由来するイオンであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析法。
【請求項３】
工程（３）における複数のイオンが、目的分子の親イオンと目的分子の解離によって生じる１つまたは複数のフラグメントイオンであることを特徴とする請求項２に記載の質量分析法。
【請求項４】
工程（３）における複数のイオンが、目的分子の解離によって生じる複数のフラグメントイオンであることを特徴とする請求項２に記載の質量分析法。
【請求項５】
工程（４）において、測定領域として、前記複数のイオンの少なくとも２つが各イオンにより規定される基準値よりも大きなシグナル強度を示す領域を選択することを特徴とする請求項２から４のいずれかに記載の質量分析法。
【請求項６】
工程（４）において、測定領域として、前記複数のイオンのシグナル強度のパーセンテージの総和が基準値よりも大きい領域を選択し、
前記パーセンテージは、各領域における全イオンのシグナル強度の総和、または各領域においてシグナル強度が最も大きいイオンのシグナル強度を基準とする
ことを特徴とする請求項２から４のいずれかに記載の質量分析法。
【請求項７】
工程（３）における複数のイオンが、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンと、目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンとを含むことを特徴とする請求項１に記載の質量分析法。
【請求項８】
工程（４）において、測定領域として、目的分子に由来する１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第１基準値よりも大きなシグナル強度を示し、および目的分子に由来しない１つまたは複数のイオンが各イオンにより規定される第２基準値よりも小さなシグナル強度を示す領域を選択することを特徴とする請求項７に記載の質量分析法。
【請求項９】
工程（２）におけるＭＳ測定および工程（５）におけるＭＳn測定において、レーザ脱離イオン化法を用いることを特徴とする請求項１に記載の質量分析法。
【請求項１０】
工程（２）におけるＭＳ測定を、工程（５）におけるＭＳn測定よりも大きなレーザー強度で実施する、レーザ脱離イオン化法を用いることを特徴とする請求項９に記載の質量分析法。
【請求項１１】
工程（１）の試料がマトリクスをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の質量分析法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２６９８４５（Ｐ２００８−２６９８４５Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０８４１４（Ｐ２００７−１０８４１４）
【出願日】平成１９年４月１７日（２００７．４．１７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人科学技術振興機構、大学発ベンチャー創出推進に係る委託研究契約、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００１７３９２４）財団法人野口研究所 (108)
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１７日（２００７．４．１７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人科学技術振興機構、大学発ベンチャー創出推進に係る委託研究契約、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００１７３９２４）財団法人野口研究所 (108)
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]