走査型顕微鏡装置
【課題】高Ｓ／Ｎ、高感度かつ高速で分光検出を行う。
【解決手段】標本１にレーザ光を照射する光源３と、光源３から照射されたレーザ光を標本１上で走査させるＸＹガルバノミラー１４と、ＸＹガルバノミラー１４により走査されたレーザ光を標本１に照射する一方、レーザ光の照射位置において発生した蛍光を集光する対物レンズ９２と、ＸＹガルバノミラー１４と対物レンズ９２との間に配置され、レーザ光と蛍光とを分離するノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６と、分離された蛍光を入射端７２から入射して導光し、直線状に形成された射出端７４から射出する落射用ファイバ７０と、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出された蛍光を射出端７４の長手方向に直交する方向に分散させる回折格子３２と、回折格子３２により分散させられた蛍光の分散方向に沿って配列された複数のセルを有するマルチアノードＰＭＴ４０とを備える走査型顕微鏡装置１００を提供する。
【解決手段】標本１にレーザ光を照射する光源３と、光源３から照射されたレーザ光を標本１上で走査させるＸＹガルバノミラー１４と、ＸＹガルバノミラー１４により走査されたレーザ光を標本１に照射する一方、レーザ光の照射位置において発生した蛍光を集光する対物レンズ９２と、ＸＹガルバノミラー１４と対物レンズ９２との間に配置され、レーザ光と蛍光とを分離するノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６と、分離された蛍光を入射端７２から入射して導光し、直線状に形成された射出端７４から射出する落射用ファイバ７０と、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出された蛍光を射出端７４の長手方向に直交する方向に分散させる回折格子３２と、回折格子３２により分散させられた蛍光の分散方向に沿って配列された複数のセルを有するマルチアノードＰＭＴ４０とを備える走査型顕微鏡装置１００を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、光検出光路に分光器を配置し、標本から発せられる光の分光検出を行う顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１では、レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）により、ディスキャン光路の共焦点ピンホールを通過させた光を回折格子で分光し、スペクトルが生成される位置に配置した１次元方向に３２個の検出部（セル）を備えるマルチアノード型光電子増倍管（ＰＭＴ）によって分光データを取得することとしている。また、特許文献１には、多光子検出に有効なノンディスキャン光路に回折格子およびマルチアノードＰＭＴを配置し、ディスキャン光と同じようにノンディスキャン光の分光検出を行うことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１８５５８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ノンディスキャン光路において、特許文献１の図６の共焦点ピンホールと共役な位置に像を結像させると、走査と同時に光が共焦点ピンホール上で光軸と直交する方向に動くため、標本面の光軸中心付近の１点の分光データしか取得できないという問題がある。また、光検出光路に配置する共焦点ピンホールやスリットにより散乱光が遮断され、蛍光の検出効率が大きく損なわれるという問題がある。また、対物瞳位置を前述のピンホールと共役な位置に配置すると、スキャンによりピンホールに入射される光の入射角は変わるが位置は変わらない。ただし、瞳には面積があるため、投影された入射光の多くがピンホールでけられてしまい、蛍光を大きく損失することとなる。
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、高いＳ／Ｎが得られ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができる走査型顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本にレーザ光を照射する光源と、該光源から照射された前記レーザ光を前記標本上で走査させるスキャナと、該スキャナにより走査された前記レーザ光を前記標本に照射する一方、該レーザ光の照射位置において発生した蛍光を集光する対物レンズと、前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記レーザ光と前記蛍光とを分離する波長分離部と、該波長分離部により分離された前記蛍光を入射端から入射して導光し、略直線状に形成された射出端から射出する落射用ファイバと、該落射用ファイバの前記射出端から射出された前記蛍光を該射出端の長手方向に直交する方向に分散させる分散素子と、該分散素子により分散させられた前記蛍光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管とを備える走査型顕微鏡装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、光源から発せられスキャナによって走査されたレーザ光が対物レンズにより標本に照射されると、標本において発生した蛍光が対物レンズによって集光されて波長分離部で分離され、落射用ファイバにより分散素子へと導光される。そして、分散素子により蛍光が分散させられて光電子増倍管の複数の検出部によって検出される。
【０００８】
この走査型顕微鏡装置においては、波長分離部により、標本において発生した蛍光をスキャナに戻すことなくレーザ光の光路から分離し、落射用ファイバによって光電子増倍管へと導光することで、標本から光電子増倍管までの光路中での蛍光の損失を最小限に抑えることができる。
【０００９】
また、落射用ファイバの射出端を、分散素子の分散方向、すなわち、光電子増倍管の複数の検出部の配列方向に直交する方向に延びる直線状に形成することで、対物レンズにより集光された蛍光を無駄なく複数の検出部に入射させることができる。これにより、分散させた蛍光を検出部ごとに１度で検出することができ、高Ｓ／Ｎ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができる。
【００１０】
上記発明においては、前記スキャナにより前記標本上で走査された前記レーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズと、該コンデンサレンズにより集光された前記蛍光を入射端から入射して導光し、前記分散素子による分散方向に直交する方向に延びる略直線状に形成された射出端から前記分散素子に向けて前記蛍光を射出する透過用ファイバと、該透過用ファイバの射出端から射出された前記蛍光を前記落射用ファイバの射出端から射出される前記蛍光の光路に入射し、前記落射用ファイバからの前記蛍光に代えて前記透過用ファイバからの前記蛍光を前記分散素子に入射させる透過蛍光入射部とを備えることとしてもよい。
【００１１】
このように構成することで、透過蛍光入射部の作動により、透過用ファイバからの蛍光を落射用ファイバからの蛍光に代えて分散素子に入射させることで、光電子増倍管により標本においてレーザ光の透過方向に発生した蛍光を検出することができる。したがって、標本から戻る方向に発生した蛍光の分光検出と標本を透過する方向に発生した蛍光の分光検出とを切り替えて行うことができる。
【００１２】
本発明は、標本にレーザ光を照射する光源と、該光源から照射された前記レーザ光を前記標本上で走査させるスキャナと、該スキャナにより前記標本上で走査された前記レーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズと、該コンデンサレンズにより集光された前記蛍光を入射端から入射して導光し、略直線状に形成された射出端から射出する透過用ファイバと、該透過用ファイバの前記射出端から射出された前記蛍光を該射出端の長手方向に直交する方向に分散させる分散素子と、該分散素子により分散させられた前記蛍光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管とを備える走査型顕微鏡装置を提供する。
【００１３】
本発明によれば、光源から発せられスキャナによって走査されたレーザ光が標本に照射されると、標本においてレーザ光の透過方向に向かって発生した蛍光がコンデンサレンズによって集光され、透過用ファイバにより分散素子へと導光される。したがって、標本から光電子増倍管までの光路途中での蛍光の損失を最小限に抑え、高Ｓ／Ｎ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができる。
【００１４】
上記発明においては、前記波長分離部と交換可能に配置され、前記対物レンズにより集光された前記蛍光を前記レーザ光の光路に戻す蛍光戻し部と、該蛍光戻し部と前記波長分離部とを切り替える切替え手段と、前記対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、前記切替え手段によって切り替えられた前記蛍光戻し部により前記レーザ光の光路に戻されて前記スキャナを通過した前記蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホールと、該共焦点ピンホールを通過した前記蛍光を前記落射用ファイバの射出端から射出される前記蛍光の光路に入射させる逆走査蛍光入射部とを備えることとしてもよい。
【００１５】
このように構成することで、切替え手段により、波長分離部に変えて蛍光戻し部を光路上に配置すれば、標本において発生した蛍光が蛍光戻し部によってスキャナに戻される。そして、蛍光は共焦点ピンホールを通過して逆走査蛍光入射部によって落射用ファイバから光路に入射させられる。したがって、スキャナに戻さない蛍光とスキャナに戻す蛍光とを切り替えて観察することができ、多光子励起観察による分光検出のための構成を一光子励起観察による分光検出のための構成と共用することができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記落射用ファイバの入射端が前記対物レンズの瞳位置に共役な位置に配置されるとともに、該落射用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が以下の式を満たすこととしてもよい。
φＤｒ≧φｐo×βＰＬ （１）
αｒe≧θａ （２）
ここで、
φＤｒ：落射用ファイバの入射端の径
φｐo：対物レンズの瞳径
βＰＬ：対物レンズの瞳位置から落射用ファイバの入射端への投影倍率
αｒe：落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度
θａ：スキャナによる走査範囲で決まる落射用ファイバの入射端への最大入射角度
【００１７】
落射用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が式（１），（２）を満たすことで、スキャナによる走査範囲全体からの蛍光を落射用ファイバの入射端に入射させることができ、蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００１８】
また、上記発明においては、前記落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度が、さらに以下の式を満たすこととしてもよい。
αｒｅ＞θｂ （３）
ここで、
αｒe：落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度
θｂ：対物レンズの取り込み可能視野で決まる落射用ファイバの入射端への最大入射角度
【００１９】
標本の深部（例えば、標本の表面から５００μ程度）では、散乱光が多いため走査範囲の外側からも蛍光が発生する。落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度が式（３）を満たすことで、深部観察において、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００２０】
また、上記発明においては、前記落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が、以下の式を満たすこととしてもよい。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （４）
Ｈｒ×βＰＭ＜Ｐｈ （５）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （６）
ここで、
Ｗ：落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法
βＰＭ：落射用ファイバの射出端を光電子増倍管に投影する倍率
ＰＷ：光電子増倍管の各検出部の配列方向の幅寸法
Ｈｒ：落射用ファイバの射出端の長手方向の寸法
Ｐｈ：光電子増倍管の各検出部の配列方向に直交する方向の寸法
αｒｏ：落射用ファイバの射出角度
θｐ：光電子増倍管の許容受光角度
【００２１】
落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が式（４），（５），（６）を満たすことで、落射用ファイバの射出端から射出される蛍光を、波長分解能を損なうことなく効率的に光電子増倍管に入射させることができる。
【００２２】
また、上記発明においては、前記透過用ファイバの入射端が前記コンデンサレンズの瞳位置と共役な位置に配置されるとともに、該透過用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が以下の式を満たすこととしてもよい。
φＤｔ＞φｐｃ×βｃｄ （７）
αｔｅ＞θｃ （８）
ここで、
φＤｔ：透過用ファイバの入射端の径
φｐｃ：コンデンサレンズの瞳径
βｃｄ：コンデンサレンズの瞳位置から透過用ファイバの入射端への投影倍率
αｔｅ：透過用ファイバの受光可能最大角度
θｃ：スキャナの走査範囲で決まる透過用ファイバへの最大入射角度
【００２３】
透過用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が式（７），（８）を満たすことで、スキャナの走査範囲全体からの蛍光を透過用ファイバの入射端に入射することができ、蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００２４】
また、上記発明においては、前記透過用ファイバの入射端の受光可能最大角度が、さらに以下の式を満たすこととしてもよい。
αｔｅ＞θｄｔ （９）
ここで、
αｔｅ：透過用ファイバの受光可能最大角度
θｄｔ：コンデンサレンズの取り込み可能視野で決まる透過用ファイバへの最大入射角度
【００２５】
透過用ファイバの入射端の受光可能最大角度が式（９）を満たすことで、深部観察において、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００２６】
上記発明においては、前記透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が、以下の式を満たすこととしてもよい。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （１０）
Ｈｔ×βＰＭ＜Ｐｈ （１１）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （１２）
ここで、
Ｗ：透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法
βＰＭ：透過用ファイバの射出端を光電子増倍管に投影する倍率
ＰＷ：光電子増倍管の各検出部の配列方向の幅寸法
Ｈｔ：透過用ファイバの射出端の長手方向の寸法
Ｐｈ：光電子増倍管の各検出部の配列方向に直交する方向の寸法
αｔｏ：透過用ファイバの射出角度
θｐ：光電子増倍管の許容受光角度
【００２７】
透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が式（１０），（１１），（１２）を満たすことで、透過射用ファイバの射出端から射出される蛍光を、波長分解能を損なうことなく効率的に光電子増倍管に入射させることができる。
【００２８】
また、上記発明においては、前記光電子増倍管の前記検出部の受光面近傍に配列された複数のシリンドリカルレンズを備え、該シリンドリカルレンズの配列ピッチが前記検出部の配列ピッチと略一致し、かつ、各前記シリンドリカルレンズが各前記検出部にそれぞれ対応して配置されていることとしてもよい。
【００２９】
このように構成することで、光電子増倍管の検出部間に電極を構成するための不感帯（ギャップ）が存在する場合であっても、シリンドリカルレンズにより各検出部の受光面に効率的に蛍光を入射させ、ギャップによる蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００３０】
また、上記発明においては、前記シリンドリカルレンズのレンズパワーがない方向の寸法が、前記検出部に入射される前記蛍光の入射範囲の寸法より大きいこととしてもよい。
このように構成することで、光電子増倍管の検出部に入射される蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００３１】
また、上記発明においては、前記検出部により検出された前記蛍光を波長分離する画像処理部と、該画像処理部により波長分離された前記蛍光の像を表示するモニタとを備えることとしてもよい。
このように構成することで、画像処理部により、クロスオーバーが激しい複数の蛍光色素を分離してモニタ上に表示することができる。
【００３２】
また、上記発明においては、所定の時間ごとの前記標本の分光検出結果を記憶する記憶部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、標本の経時変化を観察することができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、高いＳ／Ｎが得られ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡装置の概略構成図である。
【図２】図１のマルチアノードＰＭＴの拡大概略図である。
【図３】図２のセルの拡大概略図である。
【図４】（ａ）は図１の落射用ファイバの落射用ファイバの入射端を示した図であり、（ｂ）は（ａ）の落射用ファイバの全体を示した図であり、（ｃ）は（ｂ）の落射用ファイバの射出端を示した図である。
【図５】図１の対物レンズと落射用ファイバの入射端との間の光学系を示す概略図である。
【図６】図１のマルチアノードＰＭＴの別の拡大概略図である。
【図７】本発明の第１の実施形態の変形例に係る走査型顕微鏡装置の対物レンズと落射用ファイバの入射端との間の光学系を示す概略図である。
【図８】本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡装置の概略構成図である。
【図９】本発明の第１の実施形態の別の変形例に係る走査型顕微鏡装置の分光検出ユニット周辺を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
〔第１の実施形態〕
以下、本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡装置について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００は、図１に示すように、一光子励起観察と多光子励起観察とを切替えて標本１を観察することができる顕微鏡装置である。標本１としては、例えば、生細胞であって、ＣＦＰ（シアン色蛍光タンパク質）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）等の蛍光波長のクロスオーバーが大きい複数の蛍光色素によって標識されたもの（多重染色蛍光標本）を用いることとしてもよい。
【００３６】
この走査型顕微鏡装置１００は、標本１にレーザ光を照射する一光子励起用光源（光源）２および多光子励起用光源（光源）３（以下、単に「光源２，３」という。）と、一光子励起観察用の光路を有するスキャンユニット１０およびスキャンユニット導入投光管５０と、光源２，３から発せられたレーザ光を標本１に照射するとともに標本１の照射位置において発生する蛍光を集光する対物レンズ９２と、多光子励起観察用の光路を構成する落射観察光学系９０とを備えている。符号９４は、目視観察用の顕微鏡観察鏡筒である。
【００３７】
一光子励起用光源２としては、例えば、ＡｒＫｒ（アルゴン・クリプトン）レーザ等が用いられる。一光子励起用光源２は可視レーザユニット６に備えられている。可視レーザユニット６には、一光子励起用光源２から発せられたレーザ光の透過波長を制御するＡＯＴＦ（波長可変フィルタ）４が設けられている。符号８は、可視レーザユニット６からのレーザ光をスキャンユニット１０へ導光する可視用シングルモードファイバである。
多光子励起用光源３としては、例えば、ＩＲパルスレーザ等が用いられる。
【００３８】
スキャンユニット１０は、光源２，３から発せられたレーザ光をそれぞれ同一光路へと導くスキャナ合成ＤＭ（ダイクロイックミラー）１２と、スキャナ合成ＤＭ１２からのレーザ光を反射して標本１上で走査させるＸＹガルバノミラー（スキャナ）１４と、ＸＹガルバノミラー１４により反射されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ１６とを備えている。
【００３９】
スキャンユニット導入投光管５０には、スキャンユニット１０の瞳投影レンズ１６を透過したレーザ光をコリメートする結像レンズ５２と、結像レンズ５２を透過したレーザ光を反射して対物レンズ９２に入射させるとともに標本１において発生した蛍光を反射してスキャンユニット１０へ戻す蛍光戻しミラー（蛍光戻し部）５４とが備えられている。なお、符号９３は対物レンズ９２の瞳位置を示している。
【００４０】
蛍光戻しミラー５４は、一光子励起観察において標本１からの蛍光をＸＹガルバノミラー１４に戻してディスキャンさせるものであり、ＸＹガルバノミラー１４と対物レンズ９２との間の光路に挿脱可能に配置されている。また、蛍光戻しミラー５４は、図示しない切替え手段により、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ（波長分離部）５６と交換可能となっている。
【００４１】
ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６は、多光子励起観察において標本１からの蛍光をＸＹガルバノミラー１４に戻さずに（ノンディスキャン）検出するためのものであり、結像レンズ５２からのレーザ光を反射して対物レンズ９２に入射させる一方、標本１からの蛍光を透過してレーザ光と蛍光とを分離するようになっている。なお、切換え手段としては、特に限定されるものでなく、例えば、手動で蛍光戻しミラー５４とノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を切り換えることとしてもよいし、自動で切り換えを行うことができる装置を採用することとしてもよい。
【００４２】
また、前記スキャンユニット１０には、レーザ光が照射された標本１において発生し対物レンズ９２により集光されて蛍光戻しミラー５４およびＸＹガルバノミラー１４を介してレーザ光の光路を逆方向に戻される蛍光をレーザ光から分離する励起ＤＭ１８と、励起ＤＭ１８により分離された蛍光を集光する共焦点レンズ２２と、対物レンズ９２の焦点位置に共役な位置に配置され、共焦点レンズ２２により集光された蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホール２４とを備えている。
【００４３】
さらに、スキャンユニット１０には、共焦点ピンホール２４を通過した蛍光の一部を透過し一部を反射する第１分光ＤＭ２６および第２分光ＤＭ２７と、第１分光ＤＭ２６によって反射された蛍光の強度を検出する１ＣＨ＿ＰＭＴ２８および第２分光ＤＭ２７によって反射された蛍光の強度を検出する２ＣＨ＿ＰＭＴ２９と、第１分光ＤＭ２６および第２分光ＤＭ２７を透過した蛍光の分光検出を行う分光検出ユニット３０とを備えている。
【００４４】
分光検出ユニット３０は、蛍光を一方向に分散させる回折格子３２と、回折格子３２により分散された蛍光を集光する集光レンズ３４と、集光レンズ３４により集光された蛍光を検出する複数のセル（検出部、図２参照）４２を有するマルチアノードＰＭＴ（光電子増倍管）４０とを備えている。
【００４５】
マルチアノードＰＭＴ４０は、回折格子３２により一方向に分散される蛍光の分散方向に沿って、複数のセル４２が１次元に配列されて構成されている。マルチアノードＰＭＴ４０としては、例えば、３２個のセル４２が１次元に配列されて構成される３２ＣＨマルチアノードＰＭＴ（浜松ホトニクス社製）を採用することができる。
【００４６】
図２に示すように、マルチアノードＰＭＴ４０のセル４２間に電極を構成するためのギャップ（不感帯）４４が存在する場合は、複数のシリンドリカルレンズ４５により構成されるシリンドリカルレンズアレイ４６をセル４２の受光面近傍に配置することとしてもよい。この場合、図３に示すように、シリンドリカルレンズ４５は、セル４２の配列ピッチと略一致するピッチで配列し（同図において符号Ｐ参照）、それぞれ各セル４２に対して１対１で対応するように配置するのが望ましい。図２において、符号Ｓは回折格子３２により分散された蛍光のスペクトル列の結像面を示している。なお、シリンドリカルレンズ４５の入射面とスペクトル列の結像面Ｓを略一致させるのが望ましい。
【００４７】
また、図３に示すように、シリンドリカルレンズ４５は、レンズパワーがない方向の寸法をセル４２の配列方向に直交する方向の寸法と略一致させるとともに、セル４２に入射される蛍光の入射範囲の寸法（例えば、セル４２上に投影される落射用ファイバ７０の射出端７４（図４（ｃ）参照）の長手方向の寸法）より大きく設定することが望ましい。このようにすることで、シリンドリカルレンズ４５により各セル４２の受光面に効率的に蛍光を入射させ、ギャップ４４による蛍光の光量損失を防ぐことができる。同図において、符号Ｔは、落射用ファイバ７０の射出端７４の投影像を示している。
【００４８】
なお、分光検出ユニット３０には、回折格子３２に入射される一光子励起観察用の光路（すなわち、第２分光ＤＭ２７からの蛍光の光路）に多光子励起観察用の光路からの蛍光を合成させる第１切替ミラー（逆走査蛍光入射部）３６が設けられている。第１切替ミラー３６は、言い換えれば、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出される蛍光を共焦点ピンホール２４を通過した蛍光の光路に入射させるものである。
【００４９】
この第１切替ミラー３６は、第２分光ＤＭ２７と回折格子３２との間の光路に挿脱可能に配置され、前記切替え手段により、一光子励起観察時には光路から外され、多光子励起観察時には光路に配置されるようになっている。
【００５０】
落射観察光学系９０は、多光子励起観察において蛍光戻しミラー５４に代えてノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を配置したスキャンユニット導入投光管５０からの蛍光が入射される落射用ノンディスキャンユニット６０と、落射用ノンディスキャンユニット６０からの蛍光をスキャンユニット１０の分光検出ユニット３０に入射させる落射用ファイバ７０および落射用ファイバ導入ユニット８０とを備えている。
【００５１】
落射用ノンディスキャンユニット６０は、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を透過した蛍光が入射される第１投影レンズ６２と、第１投影レンズ６２を透過した蛍光を反射する反射ミラー６４と、反射ミラー６４により反射された蛍光から赤外光を除去するＩＲカットフィルタ６６と、ＩＲカットフィルタ６６により赤外光を除去された蛍光を集光して落射用ファイバ７０端に入射させる第２投影レンズ６８とを備えている。
なお、対物レンズ９２の瞳位置９３と落射用ファイバ７０の入射側の端部（図１の符号７２）は、第１投影レンズ６２および第２投影レンズ６８により光学的に共役となっている。
【００５２】
第１投影レンズ６２および反射ミラー６４は、蛍光の光路に挿脱可能に配置されている。これら第１投影レンズ６２および反射ミラー６４を蛍光の光路から取り外した状態では、標本１からの蛍光が顕微鏡観察鏡筒９４に入射され、図示しない透過光源等により目視観察を行うことができるようになっている。
【００５３】
落射用ファイバ７０は、図４（ａ）〜（ｃ）に示すように、落射用ノンディスキャンユニット６０の第２投影レンズ６８により集光された蛍光が入射される入射端７２と、導光した蛍光を落射用ファイバ導入ユニット８０に向けて射出する射出端７４とを備え、複数の素線を束ねたバンドルファイバにより構成されている。
【００５４】
落射用ファイバ７０の入射端７２は、対物レンズ９２の瞳位置９３に共役な位置に配置され、図４（ａ）に示すように、複数素線が円形に束ねられた略円状に形成されている。また、入射端７２の径および受光可能最大角度は以下の式（１），（２）を満たすように構成されている（図４（ａ）および図５参照）。
φＤｒ＞φｐo×βＰＬ （１）
αｒe＞θａ （２）
ここで、
φＤｒ：落射用ファイバ７０の入射端７２の径
φｐo：対物レンズ９２の瞳径
βＰＬ：対物レンズ９２の瞳位置から落射用ファイバ７０の入射端７２への投影倍率
αｒe：落射用ファイバ７０の入射端７２の受光可能最大角度
θａ：ＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる落射用ファイバ７０の入射端７２への最大入射角度
【００５５】
なお、図５において、符号ＳはＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる走査範囲の像高（画像の中心からの高さ）を示し、符号Ｆoは対物レンズ９２の取り込み可能視野で決まる像高を示し、符号θｂは対物レンズ９２の取り込み可能視野で決まる落射用ファイバ７０の入射端７２への最大入射角度を示している。
【００５６】
落射用ファイバ７０の射出端７４は、図４（ｃ）に示されるように、複数素線が直線状に束ねられ、前記回折格子３２の分散方向、すなわち、マルチアノードＰＭＴ４０のセル４２の配列方向に直交する方向に延びる略直線状に形成されている。また、射出端７４の幅方向の寸法および長手方向の寸法は以下の式（３），（４），（５）を満たすように構成されている（図４（ｃ）および図６参照）。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （３）
Ｈｒ×βＰＭ＜Ｐｈ （４）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （５）
ここで、
Ｗ：落射用ファイバ７０の射出端７４の幅方向の寸法（入射スリット８２の幅寸法がＷより小さい場合は、入射スリット８２の幅寸法をＷとする。）
βＰＭ：落射用ファイバ７０の射出端７４をマルチアノードＰＭＴ４０のセル４２に投影する倍率
ＰＷ：マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向の幅寸法
Ｈｒ：落射用ファイバ７０の射出端７４の長手方向の寸法
Ｐｈ：マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向に直交する方向の寸法
αｒｏ：落射用ファイバ７０の射出角度
θｐ：マルチアノードＰＭＴ４０の許容受光角度（感度特性が８０％程度を目安とする。）
【００５７】
落射用ファイバ導入ユニット８０には、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出された蛍光を整形する入射スリット８２が設けられている。入射スリット８２は、落射用ファイバ７０の射出端７４の長手方向と同一方向に沿って形成されている。また、落射用ファイバ導入ユニット８０は、入射スリット８２により整形された蛍光を略平行光にするコリメートレンズ８４を備えている。
【００５８】
多光子励起観察においては、第２分光ＤＭ２７と回折格子３２との間の光路に前記第１切替ミラー３６を配置することで、回折格子３２に入射される一光子励起観察用の光路にコリメートレンズ８４を透過した蛍光を入射させて、回折格子３２によって分散させることができるようになっている。
【００５９】
このように構成された本実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００の作用について説明する。
まず、一光子励起観察を行う場合には、スキャンユニット導入投光管５０内のレーザ光の光路に蛍光戻しミラー５４を配置するとともに、分光検出ユニット３０の光路から第１切替ミラー３６を外した状態に設定する。そして、ステージ（図示略）上に標本１を配置し、一光子励起用光源２からレーザ光を発生する。
【００６０】
一光子励起用光源２から発せられたレーザ光は、ＡＯＴＦ４により透過波長が制御され、可視用シングルモードファイバ８によりスキャンユニット１０へと導光される。スキャンユニット１０へ導光されたレーザ光は、スキャナ合成ＤＭ１２および励起ＤＭ１８で反射されてＸＹガルバノミラー１４により走査される。ＸＹガルバノミラー１４により走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ１６および結像レンズ５２を透過して蛍光戻しミラー５４で反射され、対物レンズ９２によって標本１に照射される。
【００６１】
レーザ光が照射されることにより標本１の照射位置において発生した蛍光は、対物レンズ９２によって集光され、蛍光戻しミラー５４で反射されてレーザ光の光路を逆方向に戻る。そして、蛍光は結像レンズ５２および瞳投影レンズ１６を透過し、ＸＹガルバノミラー１４を介して励起ＤＭ１８に入射される。励起ＤＭ１８に入射した蛍光は、レーザ光から分離された後、共焦点レンズ２２により集光されて共焦点ピンホール２４を通過させられる。
【００６２】
共焦点ピンホール２４を通過した蛍光は、第１分光ＤＭ２６により一部が１ＣＨ＿ＰＭＴ２８に入射されてその強度が検出される。また、第１分光ＤＭ２６を透過した蛍光は、第２分光ＤＭ２７により一部が２ＣＨ＿ＰＭＴ２９に入射されてその強度が検出される。
【００６３】
第１分光ＤＭ２６および第２分光ＤＭ２７を透過した蛍光は、分光検出ユニット３０に入射されて回折格子３２により一方向に分散させられる。そして、分散した蛍光は、集光レンズ３４により集光されてマルチアノードＰＭＴ４０の複数のセル４２に入射される。これにより、各セル４２において、分散された蛍光がそれぞれ検出される。
なお、第１分光ＤＭ２６および第２分光ＤＭ２７を光路から外し、全ての波長の蛍光を分光検出ユニット３０に導くこともできる。
【００６４】
次に、多光子励起観察を行う場合には、切換え手段により、スキャンユニット導入投光管５０内のレーザ光の光路にノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を配置するとともに、分光検出ユニット３０の蛍光の光路に第１切替ミラー３６を配置した状態に設定する。そして、ステージ上に標本１を配置し、多光子励起用光源３からレーザ光を発生する。
【００６５】
多光子励起用光源３から発せられたレーザ光は、スキャナ合成ＤＭ１２を透過し励起ＤＭ１８で反射されてＸＹガルバノミラー１４により走査される。そして、励起光は瞳投影レンズ１６および結像レンズ５２を透過してノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６で反射され、対物レンズ９２によって標本１に照射される。
【００６６】
レーザ光が照射された標本１において発生した蛍光は、対物レンズ９２によって集光された後、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を透過して落射用ノンディスキャンユニット６０に入射される。落射用ノンディスキャンユニット６０に入射した蛍光は、第１投影レンズ６２を透過して反射ミラー６４で反射され、ＩＲカットフィルタ６６によって赤外光が除かれる。そして、赤外光が除去された蛍光は、第２投影レンズ６８を透過して落射用ファイバ７０の入射端７２に入射される。
【００６７】
この場合に、落射用ファイバ７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（１），（２）を満たすように構成されているので、ＸＹガルバノミラー１４による走査範囲全体からの蛍光を入射端７２に入射させることができ、蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００６８】
落射用ファイバ７０に入射された蛍光は、射出端７４から射出されて落射用ファイバ導入ユニット８０の入射スリット８２に入射される。そして、蛍光は入射スリット８２により整形された後、コリメートレンズ８４を透過して略平行光となって分光検出ユニット３０に入射される。
【００６９】
ここで、落射用ファイバ７０の射出端７４の幅方向の寸法および長手方向の寸法は式（３），（４），（５）を満たすように構成されている。すなわち、式（３）に示されるように、マルチアノードＰＭＴ４０に投影される射出端７４の幅方向の寸法がマルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の幅寸法より小さいので、回折格子３２の分散とマルチアノードＰＭＴ４０のセル４２のピッチで決まる波長分解能を確保することができる。
【００７０】
また、式（４）に示されるように、回折格子３２の分散方向に直交する方向、すなわち、落射用ファイバ７０の射出端７４の長手方向の寸法がマルチアノードＰＭＴ４０に投影されると、マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向に直交する方向の寸法より小さいので、各セル４２に入射される蛍光の光量損失を防ぐことができる。なお、式（５）を満たすことで、各セル４２に入射される蛍光のＮＡが大きくなり感度が低下するのを防ぐとともに、波長分解能が低減するのを防ぐことができる。したがって、射出端７４から射出される蛍光を波長分解能を損なうことなく効率的にマルチアノードＰＭＴ４０へと導くことができる。
【００７１】
分光検出ユニット３０においては、落射用ファイバ導入ユニット８０からの蛍光が第１切替ミラー３６で反射され、回折格子３２に入射される一光子励起観察用の光路と同一の光路に沿って回折格子３２に入射される。そして、蛍光は回折格子３２により一方向に分散され、集光レンズ３４により集光されてマルチアノードＰＭＴ４０の複数のセル４２に入射される。
【００７２】
この場合に、落射用ファイバ７０の射出端７４が、回折格子３２の分散方向、すなわち、マルチアノードＰＭＴ４０のセル４２の配列方向に直交する方向に延びる直線状に形成されているので、落射用ファイバ７０によって導光した蛍光を無駄なくセル４２に入射させることができる。また、複数のセル４２により、分散された蛍光を波長ごとに時系列的に検出するのではなく、１度に検出することができる。したがって、例えば、標本１が、複数の蛍光色素で標識された動きが速い生細胞であっても、正確に観察することができる。
【００７３】
以上説明したように、本実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００によれば、スキャンユニット１０および落射観察光学系９０により、一光子励起観察と多光子励起観察とを切り替えて行うことができる。そして、多光子励起観察においては、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６により標本１において発生した蛍光をレーザ光から分離するとともに、落射用ファイバ７０によりＸＹガルバノミラー１４に蛍光を戻すことなくマルチアノードＰＭＴ４０に入射させることで、標本１からマルチアノードＰＭＴ４０までの光路中での蛍光の損失を最小限に抑えることができる。また、複数のセル４２を備えるマルチアノードＰＭＴ４０により、分散された蛍光を１度に検出し、生細胞の経時変化をすばやく追跡することができる。これにより、高Ｓ／Ｎ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができる。
【００７４】
なお、本実施形態においては、落射用ファイバ７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（１），（２）を満たすように構成することとしたが、例えば、式（１）を
φＤｒ≧φｐo×βＰＬ
とし、式（２）を
αｒe≧θａ
としてもよい。
【００７５】
また、標本の深部（例えば、標本１の表面から５００μ程度）では、散乱光が多いため走査範囲の外側からも蛍光が発生する。そこで、落射用ファイバ７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が、式（１），（２）に加えて、さらに以下の式（６）を満たすように構成することとしてもよい。
αｒｅ＞θｂ （６）
ここで、
αｒe：落射用ファイバ７０の入射端７２の受光可能最大角度
θｂ：対物レンズ９２の取り込み可能視野で決まる落射用ファイバ７０の入射端７２への最大入射角度
このようにすることで、深部観察においても、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００７６】
また、本実施形態においては、走査型顕微鏡装置１００が蛍光戻しミラー５４、励起ＤＭ１８、共焦点ピンホール２４等により一光子励起観察を行うこととしたが、例えば、これらの構成を備えず、多光子励起観察のみを行う構成としてもよい。
【００７７】
また、本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、対物レンズ９２の瞳位置９３と落射用ファイバ７０の入射端７２とを共役な配置にするのではなく、図７に示すように、標本面と落射用ファイバ７０の入射端７２とを対物レンズ９２と第３投影レンズ６９によって光学的に共役とし、落射用ファイバ７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（６），（７）を満たすように構成することとしてもよい。
αｏｂ／βｏｂ＜αｒｅ （６）
（φ２×Ｓ）×βｏｂ＜φＤｒ （７）
ここで、
αｏｂ：対物レンズ９２の開口角度（半角）
βｏｂ：標本面を落射用ファイバ７０の入射端７２に投影する倍率
αｒｅ：落射用ファイバ７０の入射端７２の受光可能最大角度（半角）
Ｓ：ＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる走査範囲の像高
φ２×Ｓ：ＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる標本面の走査範囲
φＤｒ：落射用ファイバ７０の入射端７２の径
この場合、落射用ファイバ７０として、複数の素線からなるバンドルファイバではなく、蛍光の入射位置による透過率が変化しないものを用いることが望ましい。
【００７８】
また、本変形例においては、落射用ファイバ７０の入射端７２の径が、さらに以下の式（８）を満たすように構成することとしてもよい。
（φ２×Ｆ）×βｏｂ＜φＤｒ （８）
ここで、
Ｆ：対物レンズ９２の取り込み可能視野で決まる像高
（φ２×Ｆ）：対物レンズ９２の取り込み可能範囲
βｏｂ：標本面を落射用ファイバ７０の入射端７２に投影する倍率
φＤｒ：落射用ファイバ７０の入射端７２の径
このようにすることで、深部観察において、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００７９】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡装置２００は、多光子励起観察用の装置であり、図８に示すように、スキャンユニット１０に代えて、多光子励起スキャンユニット１１０および分光検出ユニット３０と、落射観察光学系９０と、透過観察光学系１９０とを備える点で、第１の実施形態およびその変形例と異なる。
以下、第１の実施形態およびその変形例に係る走査型顕微鏡装置１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００８０】
多光子励起スキャンユニット１１０は、ＸＹガルバノミラー１４と、瞳投影レンズ１６とにより構成されている。
スキャンユニット導入投光管５０にはノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６が配置されている。
【００８１】
透過観察光学系１９０は、ＸＹガルバノミラー１４により標本１上で走査されたレーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズ１９２と、コンデンサレンズ１９２により集光された蛍光が入射される透過用ノンディスキャンユニット１６０と、透過用ノンディスキャンユニット１６０からの蛍光を分光検出ユニット３０に導光する透過用ファイバ１７０および透過用ファイバ導入ユニット１８０とを備えている。符号１９３は、コンデンサレンズ１９２の瞳位置を示している。
【００８２】
透過用ノンディスキャンユニット１６０は、落射用ノンディスキャンユニット６０と同様に、第１投影レンズ６２と、反射ミラー６４と、ＩＲカットフィルタ６６と、第２投影レンズ６８とを備えている。
なお、コンデンサレンズ１９２の瞳位置１９３と透過用ファイバ１７０の入射端７２は、透過用ノンディスキャンユニット１６０の第１投影レンズ６２および第２投影レンズ６８により光学的に共役となっている。
【００８３】
透過用ファイバ１７０は、落射用ファイバ７０と同様に構成され、コンデンサレンズ１９２の瞳位置１９３に共役な位置に配置されている。また、透過用ファイバ１７０の入射端７２の径および受光可能最大角度は以下の式（９），（１０）を満たすように構成されている。
φＤｔ＞φＰｃ×βｃｄ （９）
αｔｅ＞θｃ （１０）
ここで、
φＤｔ：透過用ファイバ１７０の入射端７２の径
φＰｃ：コンデンサレンズ１９２の瞳径
βｃｄ：コンデンサレンズ１９２の瞳位置から透過用ファイバ１７０の入射端７２への投影倍率
αｔｅ：透過用ファイバ１７０の入射端７２の受光可能最大角度
θｃ：ＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる透過用ファイバ１７０の入射端７２への最大入射角度
【００８４】
また、射出端７４の幅方向の寸法および長手方向の寸法は以下の式（１１），（１２），（１３）を満たすように構成されている。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （１１）
Ｈｔ×βＰＭ＜Ｐｈ （１２）
αｔｏ÷βＰＭ＜θｐ （１３）
ここで、
Ｗ：透過用ファイバ１７０の射出端７４の幅方向の寸法（入射スリット８２の幅寸法がＷより小さい場合は、入射スリット８２の幅寸法をＷとする。）
βＰＭ：透過用ファイバ１７０の射出端７４をマルチアノードＰＭＴ４０のセル４２に投影する倍率
ＰＷ：マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向の幅寸法
Ｈｔ：透過用ファイバ１７０の射出端７４の長手方向の寸法
Ｐｈ：マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向に直交する方向の寸法
αｔｏ：透過用ファイバ１７０の射出角度
θｐ：マルチアノードＰＭＴ４０の許容受光角度（感度特性が８０％程度を目安とする。）
【００８５】
透過用ファイバ導入ユニット１８０は、透過用ファイバ１７０により導光された蛍光を分光検出ユニット３０に導入するものであり、落射用ファイバ導入ユニット８０と同様に構成されている。
【００８６】
分光検出ユニット３０は、落射観察光学系９０からの蛍光と透過観察光学系１９０からの蛍光とを切り替えて回折格子３２に導入させる第２切替ミラー（透過蛍光入射部）１３６を備えている。第２切替ミラー１３６は、言い換えれば、透過用ファイバ１７０の射出端７４から射出された蛍光を落射用ファイバ７０の射出端７０から射出される蛍光の光路に入射し、落射用ファイバ７０からの蛍光に代えて透過用ファイバ１７０からの蛍光を回折格子３２に入射させるものである。
【００８７】
この第２切替ミラー１３６は、図示しない切替え手段により、落射観察光学系９０からの蛍光を分光検出する場合に光路上に配置され、透過観察光学系１９０からの蛍光を分光検出する場合に光路から外されるようになっている。第２切替ミラー１３６を光路に配置することで、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出される蛍光を反射して回折格子３２に入射させ、一方、第２切替ミラー１３６を光路から外すことで、透過用ファイバ１７０の射出端７４から射出される蛍光を落射用ファイバ７０からの光路と同一の光路に沿って回折格子３２に入射させるようになっている。
【００８８】
このように構成された本実施形態に係る走査型顕微鏡装置２００の作用について説明する。
透過観察光学系１９０により多光子励起観察を行う場合には、分光検出ユニット３０の光路から第２切替ミラー１３６を外した状態に設定し、ステージ上に標本１を配置して多光子励起用光源３からレーザ光を発生する。多光子励起用光源３から発せられたレーザ光は、ＸＹガルバノミラー１４により走査されて瞳投影レンズ１６および結像レンズ５２を透過し、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６で反射されて対物レンズ９２によって標本１に照射される。
【００８９】
レーザ光が照射されることにより標本１の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光は、コンデンサレンズ１９２により集光された後、第１投影レンズ６２を透過して反射ミラー６４で反射され、ＩＲカットフィルタ６６によって赤外光が除かれる。そして、赤外光が除去された蛍光は、第２投影レンズ６８を透過して透過用ファイバ１７０の入射端７２に入射される。
【００９０】
この場合に、透過用ファイバ１７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（９），（１０）を満たすように構成されているので、ＸＹガルバノミラー１４による走査範囲全体からの蛍光を入射端７２に入射させることができ、蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００９１】
透過用ファイバ１７０に入射された蛍光は、射出端７４から射出されて透過用ファイバ導入ユニット１８０の入射スリット８２およびコリメートレンズ８４を介して略平行光となって分光検出ユニット３０に入射される。
【００９２】
分光検出ユニット３０においては、透過用ファイバ導入ユニット１８０からの蛍光が落射用ファイバ７０から蛍光の光路と同一の光路に沿って回折格子３２に入射される。そして、蛍光は回折格子３２により一方向に分散され、集光レンズ３４により集光されてマルチアノードＰＭＴ４０の複数のセル４２に入射される。これにより、マルチアノードＰＭＴ４０において、標本１のレーザ光の透過方向に発生した蛍光を検出することができる。
【００９３】
以上説明したように、本実施形態に係る走査型顕微鏡装置２００によれば、切替ミラー１３６の配置を変えるだけで、落射観察光学系９０による標本１から戻る方向に発生する蛍光の分光検出と、透過観察光学系１９０による標本１を透過する方向に発生する蛍光の分光検出とを切り替えて行うことができる。
【００９４】
なお、本実施形態においては、透過用ファイバ１７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（９），（１０）を満たすように構成することとしたが、さらに以下の式（１４）を満たすように構成することとしてもよい。
αｔｅ＞θｄｔ （１４）
ここで、
αｔｅ：透過用ファイバ１７０の入射端７２の受光可能最大角度
θｄｔ：コンデンサレンズ１９２の取り込み可能視野で決まる透過用ファイバ１７０の入射端７２への最大入射角度
このようにすることで、深部観察において、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００９５】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
例えば、一光子励起観察と多光子励起観察とを切り替えて行うことができる第１の実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００が、さらに透過観察光学系１９０を備えることとしてもよい。この場合、図９に示すように、入射スリット８２とコンデンサレンズ８４との間の光路に第２切替ミラー１３６を挿脱可能に配置し、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出される蛍光の光路に透過用ファイバ１７０の射出端７４から射出される蛍光を入射させる構成とすればよい。
【００９６】
また、上記各実施形態および変形例においては、落射観察光学系９０および透過観察光学系１９０により多光子励起による蛍光を検出することとして説明したが、これに代えて、例えば、ＣＡＲＳ光（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光）やＳＨＧ光（第２高調波発生光）等、非線形現象により発生する光を検出することとしてもよい。なお、ＣＡＲＳ光やＳＨＧ光は、一般的に標本１の透過側に発生するので、透過観察光学系１９０を構成する透過用ファイバ１７０等によって検出することとすればよい。
【００９７】
また、上記各実施形態において多重染色された蛍光標本を観察する場合、走査型顕微鏡装置１００，２００がセル４２により検出された蛍光の分光スペクトルに基づいて、複数種の蛍光のそれぞれを波長分離する画像処理部と、画像処理部により波長分離された蛍光ごとの像を表示するモニタとを備えることとしてもよい。このようにすることで、画像処理部により、クロスオーバーが激しい複数の蛍光色素を分離してモニタ上に表示することができる。また、走査型顕微鏡装置１００，２００が所定の時間ごとの標本１の分光検出結果を記憶する記憶部を備えることとしてもよい。このようにすることで、標本１の経時変化を観察することができる。
【符号の説明】
【００９８】
１ 標本
２、３ 光源（２：一光子励起用光源、３：多光子励起用光源）
１４ ＸＹガルバノミラー（スキャナ）
２４ 共焦点ピンホール
３２ 回折格子（分散素子）
３６ 第１切替ミラー（逆走査蛍光入射部）
４０ マルチアノードＰＭＴ（光電子増倍管）
４２ セル（検出部）
５４ 蛍光戻しミラー（蛍光戻し部）
５６ ノンディスキャン検出用励起ＤＭ（波長分離部）
７０ 落射用ファイバ
７２ 入射端
７４ 射出端
９２ 対物レンズ
１００、２００ 走査型顕微鏡装置
１３６ 第２切替ミラー（透過蛍光入射部）
１７０ 透過用ファイバ
１９２ コンデンサレンズ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、光検出光路に分光器を配置し、標本から発せられる光の分光検出を行う顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１では、レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）により、ディスキャン光路の共焦点ピンホールを通過させた光を回折格子で分光し、スペクトルが生成される位置に配置した１次元方向に３２個の検出部（セル）を備えるマルチアノード型光電子増倍管（ＰＭＴ）によって分光データを取得することとしている。また、特許文献１には、多光子検出に有効なノンディスキャン光路に回折格子およびマルチアノードＰＭＴを配置し、ディスキャン光と同じようにノンディスキャン光の分光検出を行うことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１８５５８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ノンディスキャン光路において、特許文献１の図６の共焦点ピンホールと共役な位置に像を結像させると、走査と同時に光が共焦点ピンホール上で光軸と直交する方向に動くため、標本面の光軸中心付近の１点の分光データしか取得できないという問題がある。また、光検出光路に配置する共焦点ピンホールやスリットにより散乱光が遮断され、蛍光の検出効率が大きく損なわれるという問題がある。また、対物瞳位置を前述のピンホールと共役な位置に配置すると、スキャンによりピンホールに入射される光の入射角は変わるが位置は変わらない。ただし、瞳には面積があるため、投影された入射光の多くがピンホールでけられてしまい、蛍光を大きく損失することとなる。
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、高いＳ／Ｎが得られ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができる走査型顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本にレーザ光を照射する光源と、該光源から照射された前記レーザ光を前記標本上で走査させるスキャナと、該スキャナにより走査された前記レーザ光を前記標本に照射する一方、該レーザ光の照射位置において発生した蛍光を集光する対物レンズと、前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記レーザ光と前記蛍光とを分離する波長分離部と、該波長分離部により分離された前記蛍光を入射端から入射して導光し、略直線状に形成された射出端から射出する落射用ファイバと、該落射用ファイバの前記射出端から射出された前記蛍光を該射出端の長手方向に直交する方向に分散させる分散素子と、該分散素子により分散させられた前記蛍光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管とを備える走査型顕微鏡装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、光源から発せられスキャナによって走査されたレーザ光が対物レンズにより標本に照射されると、標本において発生した蛍光が対物レンズによって集光されて波長分離部で分離され、落射用ファイバにより分散素子へと導光される。そして、分散素子により蛍光が分散させられて光電子増倍管の複数の検出部によって検出される。
【０００８】
この走査型顕微鏡装置においては、波長分離部により、標本において発生した蛍光をスキャナに戻すことなくレーザ光の光路から分離し、落射用ファイバによって光電子増倍管へと導光することで、標本から光電子増倍管までの光路中での蛍光の損失を最小限に抑えることができる。
【０００９】
また、落射用ファイバの射出端を、分散素子の分散方向、すなわち、光電子増倍管の複数の検出部の配列方向に直交する方向に延びる直線状に形成することで、対物レンズにより集光された蛍光を無駄なく複数の検出部に入射させることができる。これにより、分散させた蛍光を検出部ごとに１度で検出することができ、高Ｓ／Ｎ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができる。
【００１０】
上記発明においては、前記スキャナにより前記標本上で走査された前記レーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズと、該コンデンサレンズにより集光された前記蛍光を入射端から入射して導光し、前記分散素子による分散方向に直交する方向に延びる略直線状に形成された射出端から前記分散素子に向けて前記蛍光を射出する透過用ファイバと、該透過用ファイバの射出端から射出された前記蛍光を前記落射用ファイバの射出端から射出される前記蛍光の光路に入射し、前記落射用ファイバからの前記蛍光に代えて前記透過用ファイバからの前記蛍光を前記分散素子に入射させる透過蛍光入射部とを備えることとしてもよい。
【００１１】
このように構成することで、透過蛍光入射部の作動により、透過用ファイバからの蛍光を落射用ファイバからの蛍光に代えて分散素子に入射させることで、光電子増倍管により標本においてレーザ光の透過方向に発生した蛍光を検出することができる。したがって、標本から戻る方向に発生した蛍光の分光検出と標本を透過する方向に発生した蛍光の分光検出とを切り替えて行うことができる。
【００１２】
本発明は、標本にレーザ光を照射する光源と、該光源から照射された前記レーザ光を前記標本上で走査させるスキャナと、該スキャナにより前記標本上で走査された前記レーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズと、該コンデンサレンズにより集光された前記蛍光を入射端から入射して導光し、略直線状に形成された射出端から射出する透過用ファイバと、該透過用ファイバの前記射出端から射出された前記蛍光を該射出端の長手方向に直交する方向に分散させる分散素子と、該分散素子により分散させられた前記蛍光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管とを備える走査型顕微鏡装置を提供する。
【００１３】
本発明によれば、光源から発せられスキャナによって走査されたレーザ光が標本に照射されると、標本においてレーザ光の透過方向に向かって発生した蛍光がコンデンサレンズによって集光され、透過用ファイバにより分散素子へと導光される。したがって、標本から光電子増倍管までの光路途中での蛍光の損失を最小限に抑え、高Ｓ／Ｎ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができる。
【００１４】
上記発明においては、前記波長分離部と交換可能に配置され、前記対物レンズにより集光された前記蛍光を前記レーザ光の光路に戻す蛍光戻し部と、該蛍光戻し部と前記波長分離部とを切り替える切替え手段と、前記対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、前記切替え手段によって切り替えられた前記蛍光戻し部により前記レーザ光の光路に戻されて前記スキャナを通過した前記蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホールと、該共焦点ピンホールを通過した前記蛍光を前記落射用ファイバの射出端から射出される前記蛍光の光路に入射させる逆走査蛍光入射部とを備えることとしてもよい。
【００１５】
このように構成することで、切替え手段により、波長分離部に変えて蛍光戻し部を光路上に配置すれば、標本において発生した蛍光が蛍光戻し部によってスキャナに戻される。そして、蛍光は共焦点ピンホールを通過して逆走査蛍光入射部によって落射用ファイバから光路に入射させられる。したがって、スキャナに戻さない蛍光とスキャナに戻す蛍光とを切り替えて観察することができ、多光子励起観察による分光検出のための構成を一光子励起観察による分光検出のための構成と共用することができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記落射用ファイバの入射端が前記対物レンズの瞳位置に共役な位置に配置されるとともに、該落射用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が以下の式を満たすこととしてもよい。
φＤｒ≧φｐo×βＰＬ （１）
αｒe≧θａ （２）
ここで、
φＤｒ：落射用ファイバの入射端の径
φｐo：対物レンズの瞳径
βＰＬ：対物レンズの瞳位置から落射用ファイバの入射端への投影倍率
αｒe：落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度
θａ：スキャナによる走査範囲で決まる落射用ファイバの入射端への最大入射角度
【００１７】
落射用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が式（１），（２）を満たすことで、スキャナによる走査範囲全体からの蛍光を落射用ファイバの入射端に入射させることができ、蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００１８】
また、上記発明においては、前記落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度が、さらに以下の式を満たすこととしてもよい。
αｒｅ＞θｂ （３）
ここで、
αｒe：落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度
θｂ：対物レンズの取り込み可能視野で決まる落射用ファイバの入射端への最大入射角度
【００１９】
標本の深部（例えば、標本の表面から５００μ程度）では、散乱光が多いため走査範囲の外側からも蛍光が発生する。落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度が式（３）を満たすことで、深部観察において、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００２０】
また、上記発明においては、前記落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が、以下の式を満たすこととしてもよい。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （４）
Ｈｒ×βＰＭ＜Ｐｈ （５）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （６）
ここで、
Ｗ：落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法
βＰＭ：落射用ファイバの射出端を光電子増倍管に投影する倍率
ＰＷ：光電子増倍管の各検出部の配列方向の幅寸法
Ｈｒ：落射用ファイバの射出端の長手方向の寸法
Ｐｈ：光電子増倍管の各検出部の配列方向に直交する方向の寸法
αｒｏ：落射用ファイバの射出角度
θｐ：光電子増倍管の許容受光角度
【００２１】
落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が式（４），（５），（６）を満たすことで、落射用ファイバの射出端から射出される蛍光を、波長分解能を損なうことなく効率的に光電子増倍管に入射させることができる。
【００２２】
また、上記発明においては、前記透過用ファイバの入射端が前記コンデンサレンズの瞳位置と共役な位置に配置されるとともに、該透過用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が以下の式を満たすこととしてもよい。
φＤｔ＞φｐｃ×βｃｄ （７）
αｔｅ＞θｃ （８）
ここで、
φＤｔ：透過用ファイバの入射端の径
φｐｃ：コンデンサレンズの瞳径
βｃｄ：コンデンサレンズの瞳位置から透過用ファイバの入射端への投影倍率
αｔｅ：透過用ファイバの受光可能最大角度
θｃ：スキャナの走査範囲で決まる透過用ファイバへの最大入射角度
【００２３】
透過用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が式（７），（８）を満たすことで、スキャナの走査範囲全体からの蛍光を透過用ファイバの入射端に入射することができ、蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００２４】
また、上記発明においては、前記透過用ファイバの入射端の受光可能最大角度が、さらに以下の式を満たすこととしてもよい。
αｔｅ＞θｄｔ （９）
ここで、
αｔｅ：透過用ファイバの受光可能最大角度
θｄｔ：コンデンサレンズの取り込み可能視野で決まる透過用ファイバへの最大入射角度
【００２５】
透過用ファイバの入射端の受光可能最大角度が式（９）を満たすことで、深部観察において、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００２６】
上記発明においては、前記透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が、以下の式を満たすこととしてもよい。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （１０）
Ｈｔ×βＰＭ＜Ｐｈ （１１）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （１２）
ここで、
Ｗ：透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法
βＰＭ：透過用ファイバの射出端を光電子増倍管に投影する倍率
ＰＷ：光電子増倍管の各検出部の配列方向の幅寸法
Ｈｔ：透過用ファイバの射出端の長手方向の寸法
Ｐｈ：光電子増倍管の各検出部の配列方向に直交する方向の寸法
αｔｏ：透過用ファイバの射出角度
θｐ：光電子増倍管の許容受光角度
【００２７】
透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が式（１０），（１１），（１２）を満たすことで、透過射用ファイバの射出端から射出される蛍光を、波長分解能を損なうことなく効率的に光電子増倍管に入射させることができる。
【００２８】
また、上記発明においては、前記光電子増倍管の前記検出部の受光面近傍に配列された複数のシリンドリカルレンズを備え、該シリンドリカルレンズの配列ピッチが前記検出部の配列ピッチと略一致し、かつ、各前記シリンドリカルレンズが各前記検出部にそれぞれ対応して配置されていることとしてもよい。
【００２９】
このように構成することで、光電子増倍管の検出部間に電極を構成するための不感帯（ギャップ）が存在する場合であっても、シリンドリカルレンズにより各検出部の受光面に効率的に蛍光を入射させ、ギャップによる蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００３０】
また、上記発明においては、前記シリンドリカルレンズのレンズパワーがない方向の寸法が、前記検出部に入射される前記蛍光の入射範囲の寸法より大きいこととしてもよい。
このように構成することで、光電子増倍管の検出部に入射される蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００３１】
また、上記発明においては、前記検出部により検出された前記蛍光を波長分離する画像処理部と、該画像処理部により波長分離された前記蛍光の像を表示するモニタとを備えることとしてもよい。
このように構成することで、画像処理部により、クロスオーバーが激しい複数の蛍光色素を分離してモニタ上に表示することができる。
【００３２】
また、上記発明においては、所定の時間ごとの前記標本の分光検出結果を記憶する記憶部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、標本の経時変化を観察することができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、高いＳ／Ｎが得られ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡装置の概略構成図である。
【図２】図１のマルチアノードＰＭＴの拡大概略図である。
【図３】図２のセルの拡大概略図である。
【図４】（ａ）は図１の落射用ファイバの落射用ファイバの入射端を示した図であり、（ｂ）は（ａ）の落射用ファイバの全体を示した図であり、（ｃ）は（ｂ）の落射用ファイバの射出端を示した図である。
【図５】図１の対物レンズと落射用ファイバの入射端との間の光学系を示す概略図である。
【図６】図１のマルチアノードＰＭＴの別の拡大概略図である。
【図７】本発明の第１の実施形態の変形例に係る走査型顕微鏡装置の対物レンズと落射用ファイバの入射端との間の光学系を示す概略図である。
【図８】本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡装置の概略構成図である。
【図９】本発明の第１の実施形態の別の変形例に係る走査型顕微鏡装置の分光検出ユニット周辺を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
〔第１の実施形態〕
以下、本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡装置について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００は、図１に示すように、一光子励起観察と多光子励起観察とを切替えて標本１を観察することができる顕微鏡装置である。標本１としては、例えば、生細胞であって、ＣＦＰ（シアン色蛍光タンパク質）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）等の蛍光波長のクロスオーバーが大きい複数の蛍光色素によって標識されたもの（多重染色蛍光標本）を用いることとしてもよい。
【００３６】
この走査型顕微鏡装置１００は、標本１にレーザ光を照射する一光子励起用光源（光源）２および多光子励起用光源（光源）３（以下、単に「光源２，３」という。）と、一光子励起観察用の光路を有するスキャンユニット１０およびスキャンユニット導入投光管５０と、光源２，３から発せられたレーザ光を標本１に照射するとともに標本１の照射位置において発生する蛍光を集光する対物レンズ９２と、多光子励起観察用の光路を構成する落射観察光学系９０とを備えている。符号９４は、目視観察用の顕微鏡観察鏡筒である。
【００３７】
一光子励起用光源２としては、例えば、ＡｒＫｒ（アルゴン・クリプトン）レーザ等が用いられる。一光子励起用光源２は可視レーザユニット６に備えられている。可視レーザユニット６には、一光子励起用光源２から発せられたレーザ光の透過波長を制御するＡＯＴＦ（波長可変フィルタ）４が設けられている。符号８は、可視レーザユニット６からのレーザ光をスキャンユニット１０へ導光する可視用シングルモードファイバである。
多光子励起用光源３としては、例えば、ＩＲパルスレーザ等が用いられる。
【００３８】
スキャンユニット１０は、光源２，３から発せられたレーザ光をそれぞれ同一光路へと導くスキャナ合成ＤＭ（ダイクロイックミラー）１２と、スキャナ合成ＤＭ１２からのレーザ光を反射して標本１上で走査させるＸＹガルバノミラー（スキャナ）１４と、ＸＹガルバノミラー１４により反射されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ１６とを備えている。
【００３９】
スキャンユニット導入投光管５０には、スキャンユニット１０の瞳投影レンズ１６を透過したレーザ光をコリメートする結像レンズ５２と、結像レンズ５２を透過したレーザ光を反射して対物レンズ９２に入射させるとともに標本１において発生した蛍光を反射してスキャンユニット１０へ戻す蛍光戻しミラー（蛍光戻し部）５４とが備えられている。なお、符号９３は対物レンズ９２の瞳位置を示している。
【００４０】
蛍光戻しミラー５４は、一光子励起観察において標本１からの蛍光をＸＹガルバノミラー１４に戻してディスキャンさせるものであり、ＸＹガルバノミラー１４と対物レンズ９２との間の光路に挿脱可能に配置されている。また、蛍光戻しミラー５４は、図示しない切替え手段により、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ（波長分離部）５６と交換可能となっている。
【００４１】
ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６は、多光子励起観察において標本１からの蛍光をＸＹガルバノミラー１４に戻さずに（ノンディスキャン）検出するためのものであり、結像レンズ５２からのレーザ光を反射して対物レンズ９２に入射させる一方、標本１からの蛍光を透過してレーザ光と蛍光とを分離するようになっている。なお、切換え手段としては、特に限定されるものでなく、例えば、手動で蛍光戻しミラー５４とノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を切り換えることとしてもよいし、自動で切り換えを行うことができる装置を採用することとしてもよい。
【００４２】
また、前記スキャンユニット１０には、レーザ光が照射された標本１において発生し対物レンズ９２により集光されて蛍光戻しミラー５４およびＸＹガルバノミラー１４を介してレーザ光の光路を逆方向に戻される蛍光をレーザ光から分離する励起ＤＭ１８と、励起ＤＭ１８により分離された蛍光を集光する共焦点レンズ２２と、対物レンズ９２の焦点位置に共役な位置に配置され、共焦点レンズ２２により集光された蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホール２４とを備えている。
【００４３】
さらに、スキャンユニット１０には、共焦点ピンホール２４を通過した蛍光の一部を透過し一部を反射する第１分光ＤＭ２６および第２分光ＤＭ２７と、第１分光ＤＭ２６によって反射された蛍光の強度を検出する１ＣＨ＿ＰＭＴ２８および第２分光ＤＭ２７によって反射された蛍光の強度を検出する２ＣＨ＿ＰＭＴ２９と、第１分光ＤＭ２６および第２分光ＤＭ２７を透過した蛍光の分光検出を行う分光検出ユニット３０とを備えている。
【００４４】
分光検出ユニット３０は、蛍光を一方向に分散させる回折格子３２と、回折格子３２により分散された蛍光を集光する集光レンズ３４と、集光レンズ３４により集光された蛍光を検出する複数のセル（検出部、図２参照）４２を有するマルチアノードＰＭＴ（光電子増倍管）４０とを備えている。
【００４５】
マルチアノードＰＭＴ４０は、回折格子３２により一方向に分散される蛍光の分散方向に沿って、複数のセル４２が１次元に配列されて構成されている。マルチアノードＰＭＴ４０としては、例えば、３２個のセル４２が１次元に配列されて構成される３２ＣＨマルチアノードＰＭＴ（浜松ホトニクス社製）を採用することができる。
【００４６】
図２に示すように、マルチアノードＰＭＴ４０のセル４２間に電極を構成するためのギャップ（不感帯）４４が存在する場合は、複数のシリンドリカルレンズ４５により構成されるシリンドリカルレンズアレイ４６をセル４２の受光面近傍に配置することとしてもよい。この場合、図３に示すように、シリンドリカルレンズ４５は、セル４２の配列ピッチと略一致するピッチで配列し（同図において符号Ｐ参照）、それぞれ各セル４２に対して１対１で対応するように配置するのが望ましい。図２において、符号Ｓは回折格子３２により分散された蛍光のスペクトル列の結像面を示している。なお、シリンドリカルレンズ４５の入射面とスペクトル列の結像面Ｓを略一致させるのが望ましい。
【００４７】
また、図３に示すように、シリンドリカルレンズ４５は、レンズパワーがない方向の寸法をセル４２の配列方向に直交する方向の寸法と略一致させるとともに、セル４２に入射される蛍光の入射範囲の寸法（例えば、セル４２上に投影される落射用ファイバ７０の射出端７４（図４（ｃ）参照）の長手方向の寸法）より大きく設定することが望ましい。このようにすることで、シリンドリカルレンズ４５により各セル４２の受光面に効率的に蛍光を入射させ、ギャップ４４による蛍光の光量損失を防ぐことができる。同図において、符号Ｔは、落射用ファイバ７０の射出端７４の投影像を示している。
【００４８】
なお、分光検出ユニット３０には、回折格子３２に入射される一光子励起観察用の光路（すなわち、第２分光ＤＭ２７からの蛍光の光路）に多光子励起観察用の光路からの蛍光を合成させる第１切替ミラー（逆走査蛍光入射部）３６が設けられている。第１切替ミラー３６は、言い換えれば、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出される蛍光を共焦点ピンホール２４を通過した蛍光の光路に入射させるものである。
【００４９】
この第１切替ミラー３６は、第２分光ＤＭ２７と回折格子３２との間の光路に挿脱可能に配置され、前記切替え手段により、一光子励起観察時には光路から外され、多光子励起観察時には光路に配置されるようになっている。
【００５０】
落射観察光学系９０は、多光子励起観察において蛍光戻しミラー５４に代えてノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を配置したスキャンユニット導入投光管５０からの蛍光が入射される落射用ノンディスキャンユニット６０と、落射用ノンディスキャンユニット６０からの蛍光をスキャンユニット１０の分光検出ユニット３０に入射させる落射用ファイバ７０および落射用ファイバ導入ユニット８０とを備えている。
【００５１】
落射用ノンディスキャンユニット６０は、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を透過した蛍光が入射される第１投影レンズ６２と、第１投影レンズ６２を透過した蛍光を反射する反射ミラー６４と、反射ミラー６４により反射された蛍光から赤外光を除去するＩＲカットフィルタ６６と、ＩＲカットフィルタ６６により赤外光を除去された蛍光を集光して落射用ファイバ７０端に入射させる第２投影レンズ６８とを備えている。
なお、対物レンズ９２の瞳位置９３と落射用ファイバ７０の入射側の端部（図１の符号７２）は、第１投影レンズ６２および第２投影レンズ６８により光学的に共役となっている。
【００５２】
第１投影レンズ６２および反射ミラー６４は、蛍光の光路に挿脱可能に配置されている。これら第１投影レンズ６２および反射ミラー６４を蛍光の光路から取り外した状態では、標本１からの蛍光が顕微鏡観察鏡筒９４に入射され、図示しない透過光源等により目視観察を行うことができるようになっている。
【００５３】
落射用ファイバ７０は、図４（ａ）〜（ｃ）に示すように、落射用ノンディスキャンユニット６０の第２投影レンズ６８により集光された蛍光が入射される入射端７２と、導光した蛍光を落射用ファイバ導入ユニット８０に向けて射出する射出端７４とを備え、複数の素線を束ねたバンドルファイバにより構成されている。
【００５４】
落射用ファイバ７０の入射端７２は、対物レンズ９２の瞳位置９３に共役な位置に配置され、図４（ａ）に示すように、複数素線が円形に束ねられた略円状に形成されている。また、入射端７２の径および受光可能最大角度は以下の式（１），（２）を満たすように構成されている（図４（ａ）および図５参照）。
φＤｒ＞φｐo×βＰＬ （１）
αｒe＞θａ （２）
ここで、
φＤｒ：落射用ファイバ７０の入射端７２の径
φｐo：対物レンズ９２の瞳径
βＰＬ：対物レンズ９２の瞳位置から落射用ファイバ７０の入射端７２への投影倍率
αｒe：落射用ファイバ７０の入射端７２の受光可能最大角度
θａ：ＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる落射用ファイバ７０の入射端７２への最大入射角度
【００５５】
なお、図５において、符号ＳはＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる走査範囲の像高（画像の中心からの高さ）を示し、符号Ｆoは対物レンズ９２の取り込み可能視野で決まる像高を示し、符号θｂは対物レンズ９２の取り込み可能視野で決まる落射用ファイバ７０の入射端７２への最大入射角度を示している。
【００５６】
落射用ファイバ７０の射出端７４は、図４（ｃ）に示されるように、複数素線が直線状に束ねられ、前記回折格子３２の分散方向、すなわち、マルチアノードＰＭＴ４０のセル４２の配列方向に直交する方向に延びる略直線状に形成されている。また、射出端７４の幅方向の寸法および長手方向の寸法は以下の式（３），（４），（５）を満たすように構成されている（図４（ｃ）および図６参照）。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （３）
Ｈｒ×βＰＭ＜Ｐｈ （４）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （５）
ここで、
Ｗ：落射用ファイバ７０の射出端７４の幅方向の寸法（入射スリット８２の幅寸法がＷより小さい場合は、入射スリット８２の幅寸法をＷとする。）
βＰＭ：落射用ファイバ７０の射出端７４をマルチアノードＰＭＴ４０のセル４２に投影する倍率
ＰＷ：マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向の幅寸法
Ｈｒ：落射用ファイバ７０の射出端７４の長手方向の寸法
Ｐｈ：マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向に直交する方向の寸法
αｒｏ：落射用ファイバ７０の射出角度
θｐ：マルチアノードＰＭＴ４０の許容受光角度（感度特性が８０％程度を目安とする。）
【００５７】
落射用ファイバ導入ユニット８０には、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出された蛍光を整形する入射スリット８２が設けられている。入射スリット８２は、落射用ファイバ７０の射出端７４の長手方向と同一方向に沿って形成されている。また、落射用ファイバ導入ユニット８０は、入射スリット８２により整形された蛍光を略平行光にするコリメートレンズ８４を備えている。
【００５８】
多光子励起観察においては、第２分光ＤＭ２７と回折格子３２との間の光路に前記第１切替ミラー３６を配置することで、回折格子３２に入射される一光子励起観察用の光路にコリメートレンズ８４を透過した蛍光を入射させて、回折格子３２によって分散させることができるようになっている。
【００５９】
このように構成された本実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００の作用について説明する。
まず、一光子励起観察を行う場合には、スキャンユニット導入投光管５０内のレーザ光の光路に蛍光戻しミラー５４を配置するとともに、分光検出ユニット３０の光路から第１切替ミラー３６を外した状態に設定する。そして、ステージ（図示略）上に標本１を配置し、一光子励起用光源２からレーザ光を発生する。
【００６０】
一光子励起用光源２から発せられたレーザ光は、ＡＯＴＦ４により透過波長が制御され、可視用シングルモードファイバ８によりスキャンユニット１０へと導光される。スキャンユニット１０へ導光されたレーザ光は、スキャナ合成ＤＭ１２および励起ＤＭ１８で反射されてＸＹガルバノミラー１４により走査される。ＸＹガルバノミラー１４により走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ１６および結像レンズ５２を透過して蛍光戻しミラー５４で反射され、対物レンズ９２によって標本１に照射される。
【００６１】
レーザ光が照射されることにより標本１の照射位置において発生した蛍光は、対物レンズ９２によって集光され、蛍光戻しミラー５４で反射されてレーザ光の光路を逆方向に戻る。そして、蛍光は結像レンズ５２および瞳投影レンズ１６を透過し、ＸＹガルバノミラー１４を介して励起ＤＭ１８に入射される。励起ＤＭ１８に入射した蛍光は、レーザ光から分離された後、共焦点レンズ２２により集光されて共焦点ピンホール２４を通過させられる。
【００６２】
共焦点ピンホール２４を通過した蛍光は、第１分光ＤＭ２６により一部が１ＣＨ＿ＰＭＴ２８に入射されてその強度が検出される。また、第１分光ＤＭ２６を透過した蛍光は、第２分光ＤＭ２７により一部が２ＣＨ＿ＰＭＴ２９に入射されてその強度が検出される。
【００６３】
第１分光ＤＭ２６および第２分光ＤＭ２７を透過した蛍光は、分光検出ユニット３０に入射されて回折格子３２により一方向に分散させられる。そして、分散した蛍光は、集光レンズ３４により集光されてマルチアノードＰＭＴ４０の複数のセル４２に入射される。これにより、各セル４２において、分散された蛍光がそれぞれ検出される。
なお、第１分光ＤＭ２６および第２分光ＤＭ２７を光路から外し、全ての波長の蛍光を分光検出ユニット３０に導くこともできる。
【００６４】
次に、多光子励起観察を行う場合には、切換え手段により、スキャンユニット導入投光管５０内のレーザ光の光路にノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を配置するとともに、分光検出ユニット３０の蛍光の光路に第１切替ミラー３６を配置した状態に設定する。そして、ステージ上に標本１を配置し、多光子励起用光源３からレーザ光を発生する。
【００６５】
多光子励起用光源３から発せられたレーザ光は、スキャナ合成ＤＭ１２を透過し励起ＤＭ１８で反射されてＸＹガルバノミラー１４により走査される。そして、励起光は瞳投影レンズ１６および結像レンズ５２を透過してノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６で反射され、対物レンズ９２によって標本１に照射される。
【００６６】
レーザ光が照射された標本１において発生した蛍光は、対物レンズ９２によって集光された後、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を透過して落射用ノンディスキャンユニット６０に入射される。落射用ノンディスキャンユニット６０に入射した蛍光は、第１投影レンズ６２を透過して反射ミラー６４で反射され、ＩＲカットフィルタ６６によって赤外光が除かれる。そして、赤外光が除去された蛍光は、第２投影レンズ６８を透過して落射用ファイバ７０の入射端７２に入射される。
【００６７】
この場合に、落射用ファイバ７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（１），（２）を満たすように構成されているので、ＸＹガルバノミラー１４による走査範囲全体からの蛍光を入射端７２に入射させることができ、蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００６８】
落射用ファイバ７０に入射された蛍光は、射出端７４から射出されて落射用ファイバ導入ユニット８０の入射スリット８２に入射される。そして、蛍光は入射スリット８２により整形された後、コリメートレンズ８４を透過して略平行光となって分光検出ユニット３０に入射される。
【００６９】
ここで、落射用ファイバ７０の射出端７４の幅方向の寸法および長手方向の寸法は式（３），（４），（５）を満たすように構成されている。すなわち、式（３）に示されるように、マルチアノードＰＭＴ４０に投影される射出端７４の幅方向の寸法がマルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の幅寸法より小さいので、回折格子３２の分散とマルチアノードＰＭＴ４０のセル４２のピッチで決まる波長分解能を確保することができる。
【００７０】
また、式（４）に示されるように、回折格子３２の分散方向に直交する方向、すなわち、落射用ファイバ７０の射出端７４の長手方向の寸法がマルチアノードＰＭＴ４０に投影されると、マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向に直交する方向の寸法より小さいので、各セル４２に入射される蛍光の光量損失を防ぐことができる。なお、式（５）を満たすことで、各セル４２に入射される蛍光のＮＡが大きくなり感度が低下するのを防ぐとともに、波長分解能が低減するのを防ぐことができる。したがって、射出端７４から射出される蛍光を波長分解能を損なうことなく効率的にマルチアノードＰＭＴ４０へと導くことができる。
【００７１】
分光検出ユニット３０においては、落射用ファイバ導入ユニット８０からの蛍光が第１切替ミラー３６で反射され、回折格子３２に入射される一光子励起観察用の光路と同一の光路に沿って回折格子３２に入射される。そして、蛍光は回折格子３２により一方向に分散され、集光レンズ３４により集光されてマルチアノードＰＭＴ４０の複数のセル４２に入射される。
【００７２】
この場合に、落射用ファイバ７０の射出端７４が、回折格子３２の分散方向、すなわち、マルチアノードＰＭＴ４０のセル４２の配列方向に直交する方向に延びる直線状に形成されているので、落射用ファイバ７０によって導光した蛍光を無駄なくセル４２に入射させることができる。また、複数のセル４２により、分散された蛍光を波長ごとに時系列的に検出するのではなく、１度に検出することができる。したがって、例えば、標本１が、複数の蛍光色素で標識された動きが速い生細胞であっても、正確に観察することができる。
【００７３】
以上説明したように、本実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００によれば、スキャンユニット１０および落射観察光学系９０により、一光子励起観察と多光子励起観察とを切り替えて行うことができる。そして、多光子励起観察においては、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６により標本１において発生した蛍光をレーザ光から分離するとともに、落射用ファイバ７０によりＸＹガルバノミラー１４に蛍光を戻すことなくマルチアノードＰＭＴ４０に入射させることで、標本１からマルチアノードＰＭＴ４０までの光路中での蛍光の損失を最小限に抑えることができる。また、複数のセル４２を備えるマルチアノードＰＭＴ４０により、分散された蛍光を１度に検出し、生細胞の経時変化をすばやく追跡することができる。これにより、高Ｓ／Ｎ、高感度かつ高速で分光検出を行うことができる。
【００７４】
なお、本実施形態においては、落射用ファイバ７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（１），（２）を満たすように構成することとしたが、例えば、式（１）を
φＤｒ≧φｐo×βＰＬ
とし、式（２）を
αｒe≧θａ
としてもよい。
【００７５】
また、標本の深部（例えば、標本１の表面から５００μ程度）では、散乱光が多いため走査範囲の外側からも蛍光が発生する。そこで、落射用ファイバ７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が、式（１），（２）に加えて、さらに以下の式（６）を満たすように構成することとしてもよい。
αｒｅ＞θｂ （６）
ここで、
αｒe：落射用ファイバ７０の入射端７２の受光可能最大角度
θｂ：対物レンズ９２の取り込み可能視野で決まる落射用ファイバ７０の入射端７２への最大入射角度
このようにすることで、深部観察においても、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００７６】
また、本実施形態においては、走査型顕微鏡装置１００が蛍光戻しミラー５４、励起ＤＭ１８、共焦点ピンホール２４等により一光子励起観察を行うこととしたが、例えば、これらの構成を備えず、多光子励起観察のみを行う構成としてもよい。
【００７７】
また、本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、対物レンズ９２の瞳位置９３と落射用ファイバ７０の入射端７２とを共役な配置にするのではなく、図７に示すように、標本面と落射用ファイバ７０の入射端７２とを対物レンズ９２と第３投影レンズ６９によって光学的に共役とし、落射用ファイバ７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（６），（７）を満たすように構成することとしてもよい。
αｏｂ／βｏｂ＜αｒｅ （６）
（φ２×Ｓ）×βｏｂ＜φＤｒ （７）
ここで、
αｏｂ：対物レンズ９２の開口角度（半角）
βｏｂ：標本面を落射用ファイバ７０の入射端７２に投影する倍率
αｒｅ：落射用ファイバ７０の入射端７２の受光可能最大角度（半角）
Ｓ：ＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる走査範囲の像高
φ２×Ｓ：ＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる標本面の走査範囲
φＤｒ：落射用ファイバ７０の入射端７２の径
この場合、落射用ファイバ７０として、複数の素線からなるバンドルファイバではなく、蛍光の入射位置による透過率が変化しないものを用いることが望ましい。
【００７８】
また、本変形例においては、落射用ファイバ７０の入射端７２の径が、さらに以下の式（８）を満たすように構成することとしてもよい。
（φ２×Ｆ）×βｏｂ＜φＤｒ （８）
ここで、
Ｆ：対物レンズ９２の取り込み可能視野で決まる像高
（φ２×Ｆ）：対物レンズ９２の取り込み可能範囲
βｏｂ：標本面を落射用ファイバ７０の入射端７２に投影する倍率
φＤｒ：落射用ファイバ７０の入射端７２の径
このようにすることで、深部観察において、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００７９】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡装置２００は、多光子励起観察用の装置であり、図８に示すように、スキャンユニット１０に代えて、多光子励起スキャンユニット１１０および分光検出ユニット３０と、落射観察光学系９０と、透過観察光学系１９０とを備える点で、第１の実施形態およびその変形例と異なる。
以下、第１の実施形態およびその変形例に係る走査型顕微鏡装置１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００８０】
多光子励起スキャンユニット１１０は、ＸＹガルバノミラー１４と、瞳投影レンズ１６とにより構成されている。
スキャンユニット導入投光管５０にはノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６が配置されている。
【００８１】
透過観察光学系１９０は、ＸＹガルバノミラー１４により標本１上で走査されたレーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズ１９２と、コンデンサレンズ１９２により集光された蛍光が入射される透過用ノンディスキャンユニット１６０と、透過用ノンディスキャンユニット１６０からの蛍光を分光検出ユニット３０に導光する透過用ファイバ１７０および透過用ファイバ導入ユニット１８０とを備えている。符号１９３は、コンデンサレンズ１９２の瞳位置を示している。
【００８２】
透過用ノンディスキャンユニット１６０は、落射用ノンディスキャンユニット６０と同様に、第１投影レンズ６２と、反射ミラー６４と、ＩＲカットフィルタ６６と、第２投影レンズ６８とを備えている。
なお、コンデンサレンズ１９２の瞳位置１９３と透過用ファイバ１７０の入射端７２は、透過用ノンディスキャンユニット１６０の第１投影レンズ６２および第２投影レンズ６８により光学的に共役となっている。
【００８３】
透過用ファイバ１７０は、落射用ファイバ７０と同様に構成され、コンデンサレンズ１９２の瞳位置１９３に共役な位置に配置されている。また、透過用ファイバ１７０の入射端７２の径および受光可能最大角度は以下の式（９），（１０）を満たすように構成されている。
φＤｔ＞φＰｃ×βｃｄ （９）
αｔｅ＞θｃ （１０）
ここで、
φＤｔ：透過用ファイバ１７０の入射端７２の径
φＰｃ：コンデンサレンズ１９２の瞳径
βｃｄ：コンデンサレンズ１９２の瞳位置から透過用ファイバ１７０の入射端７２への投影倍率
αｔｅ：透過用ファイバ１７０の入射端７２の受光可能最大角度
θｃ：ＸＹガルバノミラー１４の振り角範囲で決まる透過用ファイバ１７０の入射端７２への最大入射角度
【００８４】
また、射出端７４の幅方向の寸法および長手方向の寸法は以下の式（１１），（１２），（１３）を満たすように構成されている。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （１１）
Ｈｔ×βＰＭ＜Ｐｈ （１２）
αｔｏ÷βＰＭ＜θｐ （１３）
ここで、
Ｗ：透過用ファイバ１７０の射出端７４の幅方向の寸法（入射スリット８２の幅寸法がＷより小さい場合は、入射スリット８２の幅寸法をＷとする。）
βＰＭ：透過用ファイバ１７０の射出端７４をマルチアノードＰＭＴ４０のセル４２に投影する倍率
ＰＷ：マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向の幅寸法
Ｈｔ：透過用ファイバ１７０の射出端７４の長手方向の寸法
Ｐｈ：マルチアノードＰＭＴ４０の各セル４２の配列方向に直交する方向の寸法
αｔｏ：透過用ファイバ１７０の射出角度
θｐ：マルチアノードＰＭＴ４０の許容受光角度（感度特性が８０％程度を目安とする。）
【００８５】
透過用ファイバ導入ユニット１８０は、透過用ファイバ１７０により導光された蛍光を分光検出ユニット３０に導入するものであり、落射用ファイバ導入ユニット８０と同様に構成されている。
【００８６】
分光検出ユニット３０は、落射観察光学系９０からの蛍光と透過観察光学系１９０からの蛍光とを切り替えて回折格子３２に導入させる第２切替ミラー（透過蛍光入射部）１３６を備えている。第２切替ミラー１３６は、言い換えれば、透過用ファイバ１７０の射出端７４から射出された蛍光を落射用ファイバ７０の射出端７０から射出される蛍光の光路に入射し、落射用ファイバ７０からの蛍光に代えて透過用ファイバ１７０からの蛍光を回折格子３２に入射させるものである。
【００８７】
この第２切替ミラー１３６は、図示しない切替え手段により、落射観察光学系９０からの蛍光を分光検出する場合に光路上に配置され、透過観察光学系１９０からの蛍光を分光検出する場合に光路から外されるようになっている。第２切替ミラー１３６を光路に配置することで、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出される蛍光を反射して回折格子３２に入射させ、一方、第２切替ミラー１３６を光路から外すことで、透過用ファイバ１７０の射出端７４から射出される蛍光を落射用ファイバ７０からの光路と同一の光路に沿って回折格子３２に入射させるようになっている。
【００８８】
このように構成された本実施形態に係る走査型顕微鏡装置２００の作用について説明する。
透過観察光学系１９０により多光子励起観察を行う場合には、分光検出ユニット３０の光路から第２切替ミラー１３６を外した状態に設定し、ステージ上に標本１を配置して多光子励起用光源３からレーザ光を発生する。多光子励起用光源３から発せられたレーザ光は、ＸＹガルバノミラー１４により走査されて瞳投影レンズ１６および結像レンズ５２を透過し、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６で反射されて対物レンズ９２によって標本１に照射される。
【００８９】
レーザ光が照射されることにより標本１の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光は、コンデンサレンズ１９２により集光された後、第１投影レンズ６２を透過して反射ミラー６４で反射され、ＩＲカットフィルタ６６によって赤外光が除かれる。そして、赤外光が除去された蛍光は、第２投影レンズ６８を透過して透過用ファイバ１７０の入射端７２に入射される。
【００９０】
この場合に、透過用ファイバ１７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（９），（１０）を満たすように構成されているので、ＸＹガルバノミラー１４による走査範囲全体からの蛍光を入射端７２に入射させることができ、蛍光の光量損失を防ぐことができる。
【００９１】
透過用ファイバ１７０に入射された蛍光は、射出端７４から射出されて透過用ファイバ導入ユニット１８０の入射スリット８２およびコリメートレンズ８４を介して略平行光となって分光検出ユニット３０に入射される。
【００９２】
分光検出ユニット３０においては、透過用ファイバ導入ユニット１８０からの蛍光が落射用ファイバ７０から蛍光の光路と同一の光路に沿って回折格子３２に入射される。そして、蛍光は回折格子３２により一方向に分散され、集光レンズ３４により集光されてマルチアノードＰＭＴ４０の複数のセル４２に入射される。これにより、マルチアノードＰＭＴ４０において、標本１のレーザ光の透過方向に発生した蛍光を検出することができる。
【００９３】
以上説明したように、本実施形態に係る走査型顕微鏡装置２００によれば、切替ミラー１３６の配置を変えるだけで、落射観察光学系９０による標本１から戻る方向に発生する蛍光の分光検出と、透過観察光学系１９０による標本１を透過する方向に発生する蛍光の分光検出とを切り替えて行うことができる。
【００９４】
なお、本実施形態においては、透過用ファイバ１７０の入射端７２の径および受光可能最大角度が式（９），（１０）を満たすように構成することとしたが、さらに以下の式（１４）を満たすように構成することとしてもよい。
αｔｅ＞θｄｔ （１４）
ここで、
αｔｅ：透過用ファイバ１７０の入射端７２の受光可能最大角度
θｄｔ：コンデンサレンズ１９２の取り込み可能視野で決まる透過用ファイバ１７０の入射端７２への最大入射角度
このようにすることで、深部観察において、より多くの蛍光散乱光を集光することができる。
【００９５】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
例えば、一光子励起観察と多光子励起観察とを切り替えて行うことができる第１の実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００が、さらに透過観察光学系１９０を備えることとしてもよい。この場合、図９に示すように、入射スリット８２とコンデンサレンズ８４との間の光路に第２切替ミラー１３６を挿脱可能に配置し、落射用ファイバ７０の射出端７４から射出される蛍光の光路に透過用ファイバ１７０の射出端７４から射出される蛍光を入射させる構成とすればよい。
【００９６】
また、上記各実施形態および変形例においては、落射観察光学系９０および透過観察光学系１９０により多光子励起による蛍光を検出することとして説明したが、これに代えて、例えば、ＣＡＲＳ光（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光）やＳＨＧ光（第２高調波発生光）等、非線形現象により発生する光を検出することとしてもよい。なお、ＣＡＲＳ光やＳＨＧ光は、一般的に標本１の透過側に発生するので、透過観察光学系１９０を構成する透過用ファイバ１７０等によって検出することとすればよい。
【００９７】
また、上記各実施形態において多重染色された蛍光標本を観察する場合、走査型顕微鏡装置１００，２００がセル４２により検出された蛍光の分光スペクトルに基づいて、複数種の蛍光のそれぞれを波長分離する画像処理部と、画像処理部により波長分離された蛍光ごとの像を表示するモニタとを備えることとしてもよい。このようにすることで、画像処理部により、クロスオーバーが激しい複数の蛍光色素を分離してモニタ上に表示することができる。また、走査型顕微鏡装置１００，２００が所定の時間ごとの標本１の分光検出結果を記憶する記憶部を備えることとしてもよい。このようにすることで、標本１の経時変化を観察することができる。
【符号の説明】
【００９８】
１ 標本
２、３ 光源（２：一光子励起用光源、３：多光子励起用光源）
１４ ＸＹガルバノミラー（スキャナ）
２４ 共焦点ピンホール
３２ 回折格子（分散素子）
３６ 第１切替ミラー（逆走査蛍光入射部）
４０ マルチアノードＰＭＴ（光電子増倍管）
４２ セル（検出部）
５４ 蛍光戻しミラー（蛍光戻し部）
５６ ノンディスキャン検出用励起ＤＭ（波長分離部）
７０ 落射用ファイバ
７２ 入射端
７４ 射出端
９２ 対物レンズ
１００、２００ 走査型顕微鏡装置
１３６ 第２切替ミラー（透過蛍光入射部）
１７０ 透過用ファイバ
１９２ コンデンサレンズ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本にレーザ光を照射する光源と、
該光源から照射された前記レーザ光を前記標本上で走査させるスキャナと、
該スキャナにより走査された前記レーザ光を前記標本に照射する一方、該レーザ光の照射位置において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記レーザ光と前記蛍光とを分離する波長分離部と、
該波長分離部により分離された前記蛍光を入射端から入射して導光し、略直線状に形成された射出端から射出する落射用ファイバと、
該落射用ファイバの前記射出端から射出された前記蛍光を該射出端の長手方向に直交する方向に分散させる分散素子と、
該分散素子により分散させられた前記蛍光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管と、
を備える走査型顕微鏡装置。
【請求項２】
前記スキャナにより前記標本上で走査された前記レーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズと、
該コンデンサレンズにより集光された前記蛍光を入射端から入射して導光し、前記分散素子による分散方向に直交する方向に延びる略直線状に形成された射出端から前記分散素子に向けて前記蛍光を射出する透過用ファイバと、
該透過用ファイバの射出端から射出された前記蛍光を前記落射用ファイバの射出端から射出される前記蛍光の光路に入射し、前記落射用ファイバからの前記蛍光に代えて前記透過用ファイバからの前記蛍光を前記分散素子に入射させる透過蛍光入射部と、
を備える請求項１に記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項３】
標本にレーザ光を照射する光源と、
該光源から照射された前記レーザ光を前記標本上で走査させるスキャナと、
該スキャナにより前記標本上で走査された前記レーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズと、
該コンデンサレンズにより集光された前記蛍光を入射端から入射して導光し、略直線状に形成された射出端から射出する透過用ファイバと、
該透過用ファイバの前記射出端から射出された前記蛍光を該射出端の長手方向に直交する方向に分散させる分散素子と、
該分散素子により分散させられた前記蛍光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管と、
を備える走査型顕微鏡装置。
【請求項４】
前記波長分離部と交換可能に配置され、前記対物レンズにより集光された前記蛍光を前記レーザ光の光路に戻す蛍光戻し部と、
該蛍光戻し部と前記波長分離部とを切り替える切替え手段と、
前記対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、前記切替え手段によって切り替えられた前記蛍光戻し部により前記レーザ光の光路に戻されて前記スキャナを通過した前記蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホールと、
該共焦点ピンホールを通過した前記蛍光を前記落射用ファイバの射出端から射出される前記蛍光の光路に入射させる逆走査蛍光入射部と、
を備える請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項５】
前記落射用ファイバの入射端が前記対物レンズの瞳位置に共役な位置に配置されるとともに、該落射用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が以下の式を満たす請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡装置。
φＤｒ≧φｐo×βＰＬ （１）
αｒe≧θａ （２）
ここで、
φＤｒ：落射用ファイバの入射端の径
φｐo：対物レンズの瞳径
βＰＬ：対物レンズの瞳位置から落射用ファイバの入射端への投影倍率
αｒe：落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度
θａ：スキャナによる走査範囲で決まる落射用ファイバの入射端への最大入射角度
【請求項６】
前記落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度が、さらに以下の式を満たす請求項５に記載の走査型顕微鏡装置。
αｒｅ＞θｂ （３）
ここで、
αｒe：落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度
θｂ：対物レンズの取り込み可能視野で決まる落射用ファイバの入射端への最大入射角度
【請求項７】
前記落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が、以下の式を満たす請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡装置。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （４）
Ｈｒ×βＰＭ＜Ｐｈ （５）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （６）
ここで、
Ｗ：落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法
βＰＭ：落射用ファイバの射出端を光電子増倍管に投影する倍率
ＰＷ：光電子増倍管の各検出部の配列方向の幅寸法
Ｈｒ：落射用ファイバの射出端の長手方向の寸法
Ｐｈ：光電子増倍管の各検出部の配列方向に直交する方向の寸法
αｒｏ：落射用ファイバの射出角度
θｐ：光電子増倍管の許容受光角度
【請求項８】
前記透過用ファイバの入射端が前記コンデンサレンズの瞳位置と共役な位置に配置されるとともに、該透過用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が以下の式を満たす請求項２または請求項３に記載の走査型顕微鏡装置。
φＤｔ＞φｐｃ×βｃｄ （７）
αｔｅ＞θｃ （８）
ここで、
φＤｔ：透過用ファイバの入射端の径
φｐｃ：コンデンサレンズの瞳径
βｃｄ：コンデンサレンズの瞳位置から透過用ファイバの入射端への投影倍率
αｔｅ：透過用ファイバの受光可能最大角度
θｃ：スキャナの走査範囲で決まる透過用ファイバへの最大入射角度
【請求項９】
前記透過用ファイバの入射端の受光可能最大角度が、さらに以下の式を満たす請求項８に記載の走査型顕微鏡装置。
αｔｅ＞θｄｔ （９）
ここで、
αｔｅ：透過用ファイバの受光可能最大角度
θｄｔ：コンデンサレンズの取り込み可能視野で決まる透過用ファイバへの最大入射角度
【請求項１０】
前記透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が、以下の式を満たす請求項８または請求項９に記載の走査型顕微鏡装置。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （１０）
Ｈｔ×βＰＭ＜Ｐｈ （１１）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （１２）
ここで、
Ｗ：透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法
βＰＭ：透過用ファイバの射出端を光電子増倍管に投影する倍率
ＰＷ：光電子増倍管の各検出部の配列方向の幅寸法
Ｈｔ：透過用ファイバの射出端の長手方向の寸法
Ｐｈ：光電子増倍管の各検出部の配列方向に直交する方向の寸法
αｔｏ：透過用ファイバの射出角度
θｐ：光電子増倍管の許容受光角度
【請求項１１】
前記光電子増倍管の前記検出部の受光面近傍に配列された複数のシリンドリカルレンズを備え、該シリンドリカルレンズの配列ピッチが前記検出部の配列ピッチと略一致し、かつ、各前記シリンドリカルレンズが各前記検出部にそれぞれ対応して配置されている請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項１２】
前記シリンドリカルレンズのレンズパワーがない方向の寸法が、前記検出部に入射される前記蛍光の入射範囲の寸法より大きい請求項１１に記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記検出部により検出された前記蛍光を波長分離する画像処理部と、該画像処理部により波長分離された前記蛍光の像を表示するモニタとを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項１４】
所定の時間ごとの前記標本の分光検出結果を記憶する記憶部を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項１】
標本にレーザ光を照射する光源と、
該光源から照射された前記レーザ光を前記標本上で走査させるスキャナと、
該スキャナにより走査された前記レーザ光を前記標本に照射する一方、該レーザ光の照射位置において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記レーザ光と前記蛍光とを分離する波長分離部と、
該波長分離部により分離された前記蛍光を入射端から入射して導光し、略直線状に形成された射出端から射出する落射用ファイバと、
該落射用ファイバの前記射出端から射出された前記蛍光を該射出端の長手方向に直交する方向に分散させる分散素子と、
該分散素子により分散させられた前記蛍光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管と、
を備える走査型顕微鏡装置。
【請求項２】
前記スキャナにより前記標本上で走査された前記レーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズと、
該コンデンサレンズにより集光された前記蛍光を入射端から入射して導光し、前記分散素子による分散方向に直交する方向に延びる略直線状に形成された射出端から前記分散素子に向けて前記蛍光を射出する透過用ファイバと、
該透過用ファイバの射出端から射出された前記蛍光を前記落射用ファイバの射出端から射出される前記蛍光の光路に入射し、前記落射用ファイバからの前記蛍光に代えて前記透過用ファイバからの前記蛍光を前記分散素子に入射させる透過蛍光入射部と、
を備える請求項１に記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項３】
標本にレーザ光を照射する光源と、
該光源から照射された前記レーザ光を前記標本上で走査させるスキャナと、
該スキャナにより前記標本上で走査された前記レーザ光の照射位置において透過方向に向かって発生した蛍光を集光するコンデンサレンズと、
該コンデンサレンズにより集光された前記蛍光を入射端から入射して導光し、略直線状に形成された射出端から射出する透過用ファイバと、
該透過用ファイバの前記射出端から射出された前記蛍光を該射出端の長手方向に直交する方向に分散させる分散素子と、
該分散素子により分散させられた前記蛍光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管と、
を備える走査型顕微鏡装置。
【請求項４】
前記波長分離部と交換可能に配置され、前記対物レンズにより集光された前記蛍光を前記レーザ光の光路に戻す蛍光戻し部と、
該蛍光戻し部と前記波長分離部とを切り替える切替え手段と、
前記対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、前記切替え手段によって切り替えられた前記蛍光戻し部により前記レーザ光の光路に戻されて前記スキャナを通過した前記蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホールと、
該共焦点ピンホールを通過した前記蛍光を前記落射用ファイバの射出端から射出される前記蛍光の光路に入射させる逆走査蛍光入射部と、
を備える請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項５】
前記落射用ファイバの入射端が前記対物レンズの瞳位置に共役な位置に配置されるとともに、該落射用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が以下の式を満たす請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡装置。
φＤｒ≧φｐo×βＰＬ （１）
αｒe≧θａ （２）
ここで、
φＤｒ：落射用ファイバの入射端の径
φｐo：対物レンズの瞳径
βＰＬ：対物レンズの瞳位置から落射用ファイバの入射端への投影倍率
αｒe：落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度
θａ：スキャナによる走査範囲で決まる落射用ファイバの入射端への最大入射角度
【請求項６】
前記落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度が、さらに以下の式を満たす請求項５に記載の走査型顕微鏡装置。
αｒｅ＞θｂ （３）
ここで、
αｒe：落射用ファイバの入射端の受光可能最大角度
θｂ：対物レンズの取り込み可能視野で決まる落射用ファイバの入射端への最大入射角度
【請求項７】
前記落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が、以下の式を満たす請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡装置。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （４）
Ｈｒ×βＰＭ＜Ｐｈ （５）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （６）
ここで、
Ｗ：落射用ファイバの射出端の幅方向の寸法
βＰＭ：落射用ファイバの射出端を光電子増倍管に投影する倍率
ＰＷ：光電子増倍管の各検出部の配列方向の幅寸法
Ｈｒ：落射用ファイバの射出端の長手方向の寸法
Ｐｈ：光電子増倍管の各検出部の配列方向に直交する方向の寸法
αｒｏ：落射用ファイバの射出角度
θｐ：光電子増倍管の許容受光角度
【請求項８】
前記透過用ファイバの入射端が前記コンデンサレンズの瞳位置と共役な位置に配置されるとともに、該透過用ファイバの入射端の径および受光可能最大角度が以下の式を満たす請求項２または請求項３に記載の走査型顕微鏡装置。
φＤｔ＞φｐｃ×βｃｄ （７）
αｔｅ＞θｃ （８）
ここで、
φＤｔ：透過用ファイバの入射端の径
φｐｃ：コンデンサレンズの瞳径
βｃｄ：コンデンサレンズの瞳位置から透過用ファイバの入射端への投影倍率
αｔｅ：透過用ファイバの受光可能最大角度
θｃ：スキャナの走査範囲で決まる透過用ファイバへの最大入射角度
【請求項９】
前記透過用ファイバの入射端の受光可能最大角度が、さらに以下の式を満たす請求項８に記載の走査型顕微鏡装置。
αｔｅ＞θｄｔ （９）
ここで、
αｔｅ：透過用ファイバの受光可能最大角度
θｄｔ：コンデンサレンズの取り込み可能視野で決まる透過用ファイバへの最大入射角度
【請求項１０】
前記透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法および長手方向の寸法が、以下の式を満たす請求項８または請求項９に記載の走査型顕微鏡装置。
Ｗ×βＰＭ＜ＰＷ （１０）
Ｈｔ×βＰＭ＜Ｐｈ （１１）
αｒｏ÷βＰＭ＜θｐ （１２）
ここで、
Ｗ：透過用ファイバの射出端の幅方向の寸法
βＰＭ：透過用ファイバの射出端を光電子増倍管に投影する倍率
ＰＷ：光電子増倍管の各検出部の配列方向の幅寸法
Ｈｔ：透過用ファイバの射出端の長手方向の寸法
Ｐｈ：光電子増倍管の各検出部の配列方向に直交する方向の寸法
αｔｏ：透過用ファイバの射出角度
θｐ：光電子増倍管の許容受光角度
【請求項１１】
前記光電子増倍管の前記検出部の受光面近傍に配列された複数のシリンドリカルレンズを備え、該シリンドリカルレンズの配列ピッチが前記検出部の配列ピッチと略一致し、かつ、各前記シリンドリカルレンズが各前記検出部にそれぞれ対応して配置されている請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項１２】
前記シリンドリカルレンズのレンズパワーがない方向の寸法が、前記検出部に入射される前記蛍光の入射範囲の寸法より大きい請求項１１に記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記検出部により検出された前記蛍光を波長分離する画像処理部と、該画像処理部により波長分離された前記蛍光の像を表示するモニタとを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項１４】
所定の時間ごとの前記標本の分光検出結果を記憶する記憶部を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型顕微鏡装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２７１５６９（Ｐ２０１０−２７１５６９Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２３９１２（Ｐ２００９−１２３９１２）
【出願日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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