超解像顕微鏡
【課題】煩雑な調整作業を要することなく、超解像効果を容易に誘導できる超解像顕微鏡を提供する。
【解決手段】２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料70を観察する超解像顕微鏡であって、前記物質を安定状態から第１量子状態に励起するための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させるための第２照明光を射出する光源部(61,62)と、該光源部から射出された第１照明光および第２照明光を試料70に一部重ね合わせて集光する、顕微鏡対物レンズ68を含む光学系と、第１照明光および第２照明光の集光により試料70から発光する光応答信号を検出する検出部78と、第１照明光または第２照明光の偏光状態を変換する偏光部材72、および偏光部材72に一体に形成されて第２照明光の位相を空間変調する位相変調部73を有する偏光制御素子71と、を備える。
【解決手段】２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料70を観察する超解像顕微鏡であって、前記物質を安定状態から第１量子状態に励起するための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させるための第２照明光を射出する光源部(61,62)と、該光源部から射出された第１照明光および第２照明光を試料70に一部重ね合わせて集光する、顕微鏡対物レンズ68を含む光学系と、第１照明光および第２照明光の集光により試料70から発光する光応答信号を検出する検出部78と、第１照明光または第２照明光の偏光状態を変換する偏光部材72、および偏光部材72に一体に形成されて第２照明光の位相を空間変調する位相変調部73を有する偏光制御素子71と、を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に試料を複数の波長の光により照明して、高い空間分解能で観察する超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明して二重共鳴吸収過程を誘導することにより、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観察するものである。この原理について、図１４〜図１７を参照して説明する。図１４は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１４に示す基底状態（Ｓ０状態：安定状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１５に示す第１励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１６に示す第２励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１７に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１６の吸収過程や図１７の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１５のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１６のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１６の励起状態から図１７に示す基底状態への蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法は、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能である。すなわち、図１４に示す最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有のエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で試料を照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能である。しかし、一般に、いくつかの分子は、吸収帯の波長領域が重複するため、単一波長で試料を照明する場合には、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１８は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１励起状態Ｓ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２励起状態Ｓ２に励起されている様子を示している。なお、図１８は、ある種の分子のＳ２状態からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１８に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１９は、図１８と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１９において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１９の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を、空間的に一部重ね合わせて蛍光領域を抑制するので、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を利用した超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
例えば、ローダミン６Ｇ色素を用いた場合、波長５３２ｎｍの光（ポンプ光）を照射すると、ローダミン６Ｇ分子は、Ｓ０状態からＳ１状態へ励起されて波長５６０ｎｍにピークを有する蛍光を発光する。この際、波長５９９ｎｍの光（イレース光）を照射すると、二重共鳴吸収過程が起こって、ローダミン６Ｇ分子は蛍光発光がしにくいＳ２状態に遷移する。すなわち、これらのポンプ光とイレース光とをローダミン６Ｇに同時に照射すると蛍光が抑制されることになる。
【００１８】
図２０は、従来提案されている超解像顕微鏡の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット２１０、スキャンユニット２３０および顕微鏡ユニット２５０からなっている。
【００１９】
光源ユニット２１０は、ポンプ光用光源２１１およびイレース光用光源２１２を有する。ポンプ光用光源２１１から射出されるポンプ光は、ダイクロイックプリズム２１３に入射され、該ダイクロイックプリズム２１３で反射されて射出される。イレース光用光源２１２から射出されるイレース光は、偏光素子２１４により偏光が調整された後、位相板２１５により位相変調されてダイクロイックプリズム２１３に入射され、該ダイクロイックプリズム２１３を透過して、ポンプ光と同軸上に合成されて射出される。
【００２０】
ここで、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察する場合には、ポンプ光用光源２１１は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザを用い、その２倍高調波である波長５３２ｎｍの光をポンプ光として射出するように構成される。また、イレース光用光源２１２は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザとラマンシフタとを用い、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍高調波をラマンシフタで波長５９９ｎｍに変換した光をイレース光として射出するように構成される。
【００２１】
位相板２１５は、光軸の周りをイレース光の位相差が２π周回するように構成されるもので、例えば図２１に示すように、光軸の周りに独立した８領域を有し、イレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なるようにガラス基板をエッチングして形成される。この位相板２１５を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺された中空状のイレース光が生成される。
【００２２】
スキャンユニット２３０は、光源ユニット２１０から同軸で射出されるポンプ光およびイレース光を、ハーフプリズム２３１を通過させた後、２枚のガルバノミラー２３２および２３３により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット２５０に射出させる。また、スキャンユニット２３０は、顕微鏡ユニット２５０から入射する蛍光を、往路と逆の経路を辿ってハーフプリズム２３１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ２３４、ピンホール２３５、ノッチフィルタ２３６および２３７を経て光電子増倍管２３８で受光するようになっている。
【００２３】
図２０は、図面を簡略化するため、ガルバノミラー２３２，２３３を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ２３６および２３７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール２３５は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００２４】
顕微鏡ユニット２５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット２３０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム２５１で反射させて、顕微鏡対物レンズ２５２により少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料２５３上に集光させる。また、観察試料２５３で発光した蛍光は、再び顕微鏡対物レンズ２５２でコリメートしてハーフプリズム２５１で反射させることにより、再び、スキャンユニット２３０に戻すとともに、ハーフプリズム２５１を通過する蛍光の一部は接眼レンズ２５４に導いて、蛍光像として目視観察できるようにしている。
【００２５】
この超解像顕微鏡によると、観察試料２５３の集光点上においてイレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域に存在する蛍光ラベラー分子のみを計測できる。したがって、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列すれば、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する顕微鏡画像を形成することが可能となる。
【００２６】
ところで、上述した２色照明による光応答を用いた超解像顕微鏡は、偏光依存性が極めて強く、所定の偏光条件を満たさないと期待する光学特性が得られない。例えば、上記の蛍光抑制効果は、２色の照明光の偏光方向が同じの場合に強く発現し、直交する場合は弱くなることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【００２７】
また、偏光状態は、イレース光のビーム形状にも甚大な影響を与える。すなわち、図２１に示した位相板２１５を用いた場合、偏光状態によってビーム形状が変化する。例えば、偏光素子２１４によりイレース光を円偏光に変換して高開口数のレンズで集光すると、円偏光における電場の回転方向に依存して、光軸方向の偏光成分が発生して中心強度がゼロにならず、中空構造のビーム形状が得られない場合があることが知られている（例えば、非特許文献２参照）。これは、平面内で直交する電場ベクトルを有する光を集光すると、各々独立に光軸方向に平行な電場ベクトル成分が生成され、それらが反平行の場合は中心強度がゼロになるが、平行な場合は足し合わされた成分が発生するからである。
【００２８】
このように、イレース光のビーム形状が焦点面上で中空状態にならないと、ポンプ光の中央部での蛍光が抑制されて、空間分解能が劣化してしまうことになる。このため、所望の超解像効果を得るためには、ポンプ光およびイレース光の偏光状態を最適化する必要がある。
【００２９】
また、十分な超解像効果を得るためには、焦点面上でイレース光の中空部とポンプ光の頂点部とを約３０ｎｍの精度で一致させる必要があることも知られている（例えば、非特許文献３参照）。
【００３０】
さらに、図２１に示した位相板２１５を用いる場合は、位相板２１５の中心部をイレース光の中心部に完全に一致させないと、つまり、イレース光の位相が光軸対称の位置で完全に反転していないと、焦点面上で光軸上の電場が相殺されず、理想的な中空スポットが得られなくなる。その結果、超解像効果が得られなくなる。
【００３１】
そこで、従来は、超解像効果が得られるように、偏光素子２１４と位相板２１５とを独立して調整するようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】N. Bokor, Y. Iketaki, T. Watanabe, K. Daigoku, N. Davidson and M. Fujii, Opt. Comm., 272 (1),(2007) 263-269.
【非特許文献２】Y. Iketaki, T. Watanabe, N. Bokor and M. Fujii, Opt. Lett., 32(2007) 2357-2359
【非特許文献３】Y. Iketaki, T. Watanabe, N. Bokor and M. Fujii, e-Journal of Surface Science and Nanotechnology, 6(2008) 175-179
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
しかしながら、上述したように、偏光素子と位相板とを独立して調整する従来装置にあっては、偏光素子の回転調整や位相板の芯出し調整等を独立して行うために、例えばプリズム効果が発生して、光軸が傾いたり（チルト）、ずれたり（シフト）することが知られている。このため、イレース光の中空部とポンプ光の頂点部とを焦点面上で約３０ｎｍの精度で一致させるには、作業が煩雑で、時間がかかり、ユーザの負担が大きくなることが懸念される。
【００３５】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、煩雑な調整作業を要することなく、超解像効果を容易に誘導できる超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
上記目的を達成する第１の観点に係る超解像顕微鏡の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を安定状態から第１量子状態に励起するための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させるための第２照明光を射出する光源部と、
該光源部から射出された前記第１照明光および前記第２照明光を前記試料に一部重ね合わせて集光する、顕微鏡対物レンズを含む光学系と、
前記第１照明光および前記第２照明光の集光により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
前記第１照明光または前記第２照明光の偏光状態を変換する偏光部材、および該偏光部材に一体に形成されて前記第２照明光の位相を空間変調する位相変調部を有する偏光制御素子と、
を備えることを特徴とするものである。
【００３７】
第２の観点に係る発明は、第１の観点に係る超解像顕微鏡において、
前記位相変調部は、前記第２照明光の位相を光軸対称の位置で反転させるように、光学媒質膜の積層またはエッチング加工により段差を有して形成された複数の領域からなる、
ことを特徴とするものである。
【００３８】
第３の観点に係る発明は、第１の観点に係る超解像顕微鏡において、
前記位相変調部は、前記第１照明光に対しては反射作用または透過型の位相変調作用を有し、前記第２照明光に対しては透過型の位相変調作用を有する多層膜からなる、
ことを特徴とするものである。
【００３９】
第４観点に係る発明は、第１〜３のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記物質は蛍光物質であり、
前記第２照明光は、前記蛍光物質の蛍光の発光を抑制する波長である、
ことを特徴とするものである。
【００４０】
第５の観点に係る発明は、第１〜３のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記物質は蛍光物質であり、
前記第２照明光は、前記蛍光物質の蛍光のスペクトルを変化させる波長であり、
前記検出部は、前記第１照明光の照射により前記蛍光物質から発光する蛍光のスペクトルを透過させ、前記第２照明光の照射により前記蛍光物質から発光する蛍光のスペクトルを遮断する波長帯域選択部を有する、
ことを特徴とするものである。
【００４１】
第６の観点に係る発明は、第１〜５のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光制御素子は、前記第２照明光の光軸に関して回転可能である、
ことを特徴とするものである。
【００４２】
第７の観点に係る発明は、第１〜６のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光部材は、前記第２照明光に対して１／２波長板として機能し、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光の偏光方向は平行である、
ことを特徴とするものである。
【００４３】
第８の観点に係る発明は、第１〜６のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光部材は、前記第２照明光に対して１／４波長板として機能し、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光の少なくとも一方の偏光方向は円偏光である、
ことを特徴とするものである。
【００４４】
第９の観点に係る発明は、第８の観点に係る超解像顕微鏡において、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光は、偏光回転方向が反対の円偏光である、
ことを特徴とするものである。
【００４５】
第１０の観点に係る発明は、第１〜９のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光制御素子は、前記第１照明光または前記第２照明光を偏向する反射型である、
ことを特徴とするものである。
【００４６】
第１１の観点に係る発明は、第１〜１０のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光制御素子は、前記偏光部材として液晶またはフォトニック結晶を含む、
ことを特徴とするものである。
【００４７】
第１２の観点に係る発明は、第１〜１１のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記光学系は、前記顕微鏡対物レンズの物体側に結合された内視鏡光学系を備えるスティックレンズを有する、
ことを特徴とするものである。
【００４８】
第１３の観点に係る発明は、第１〜１１のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記顕微鏡対物レンズは、前記試料に対して前記第１照明光および前記第２照明光を空間的に走査可能に構成されている、
ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００４９】
本発明に係る超解像顕微鏡によると、第１照明光または第２照明光の偏光状態を変換する偏光部材と、第２照明光の位相を空間変調する位相変調部とが一体化された偏光制御素子を備えるので、煩雑な調整作業を要することなく、超解像効果を容易に誘導することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第１例の構成を模式的に示す断面図および平面図である。
【図２】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第２例の構成を模式的に示す断面図および平面図である。
【図３】図２の偏光制御素子の光学特性を示す図である。
【図４】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第３例の光学特性を示す図である。
【図５】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第４例の概略構成を示す断面図および光学的特性を示す図である。
【図６】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第５例の概略構成を示す断面図である。
【図７】本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。
【図８】本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。
【図９】本発明の第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。
【図１０】蛍光タンパク色素「Kaede」の紫外光照射前後の分光スペクトルを示す図である。
【図１１】本発明の第５実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。
【図１２】本発明の第６実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を示す図である。
【図１３】本発明の第７実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を示す図である。
【図１４】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１５】図１４に示す分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１６】図１４に示す分子の第２励起状態を示す概念図である。
【図１７】図１４に示す分子が第２励起状態から基底状態に戻る状態を概念的に示す図である。
【図１８】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１９】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図２０】従来の超解像顕微鏡の要部構成図である。
【図２１】図２０に示す位相板の構成を示す拡大平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
先ず、本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の概要について説明する。
【００５２】
図１（ａ）および（ｂ）は、偏光制御素子の第１例の構成を模式的に示す断面図および平面図である。この偏光制御素子１１は、刺激光の単独光路に配置されるもので、透過型の偏光部材１２と、その射出面側に形成された位相変調部１３とを備える。偏光部材１２は、複屈性性部材からなり、例えば水晶を用いる場合、結晶軸に対して位相差と角度をつけてカットして表面研磨することにより作成される。
【００５３】
そして、例えば、入射光の波長に対して１／２波長の位相差をつけた偏光部材１２は、入射光の直線偏光を任意の角度だけ回転させた直線偏光に変換して射出させることができる。また、入射光の波長に対して１／４波長の位相差をつけた偏光部材１２は、入射光の直線偏光を円偏光に変換して射出させることができる。また、入射光の偏光面に対して結晶軸の方向を適切に設定することにより、中間の楕円偏光への変換も可能である。なお、偏光部材１２は、水晶に限らず、液晶やフォトニック結晶等の他の複屈折性部材を用いて構成することもできる。また、この他グランプリズムなども偏光制御素子として利用可能であり、ファラデー効果により偏光方向を電気的に制御できる電気光学結晶も当然利用可能である。
【００５４】
位相変調部１３は、上記の偏光部材１２の射出側表面を、図２１と同様に、光軸の周りを軸対称に、例えば８領域に分割し、その軸対称の領域で刺激光の波長λ２に対して１／８ずつ位相が異なるように、例えば、段階的に厚みを変えた光学薄膜をコーティングしたり、段階的に深さの異なるエッチングを施したりして、段差を有して形成する。
【００５５】
このような偏光制御素子１１に直線偏光の刺激光を入射させると、刺激光は、偏光部材１２により偏光状態が変換され、さらに、位相変調部１３により波面が光軸対称の位相分布を持つように空間変調されて射出される。例えば、偏光部材１２が１／４波長板で構成された偏光制御素子１１に、直線偏光の刺激光を透過させると、偏光状態が円偏光に変換されると同時に、波面が光軸対称の位相分布を持つようになる。
【００５６】
したがって、非特許文献２に示されているように、この偏光制御素子１１を透過した刺激光を、高開口数の顕微鏡対物レンズにより集光しても、ビーム中央で電場強度が完全に相殺された理想的な輪帯のビームを形成することができる。しかも、偏光制御素子１１を回転させて、偏光部材１１による偏光状態を調整する際、位相変調部１３も一体に回転するので、刺激光は軸ずれすることなく、常に軸対称の位相変調部１３の中央を通過することになる。これにより、超解像顕微鏡として理想的な、軸対称の強度分布をもつ輪帯状の刺激光を集光させることが可能となる。
【００５７】
図２（ａ）および（ｂ）は、偏光制御素子の第２例の構成を模式的に示す断面図および平面図である。この偏光制御素子２１は、励起光と刺激光との共通光路に配置されるもので、透過型の偏光部材２２と、その入射面側の表面に形成された位相変調部２３とを備える。偏光部材２２は、図１の偏光部材１２と同様に、例えば刺激光の偏光状態を変換するように形成する。また、位相変調部２３は、偏光部材２２の入射側表面を、励起光および刺激光の円形瞳面内で同心円状に、例えば２つの領域に分割し、その円形瞳面の中央部分に相当する領域を変調領域２３ａとして、該変調領域２３ａに多層膜２４をコートして形成する。ここでは、多層膜２４は、励起光に対して反射作用を有する光学反射膜として機能する。
【００５８】
図２（ａ）に示すように、多層膜２４は、励起光に対して屈折率が異なる第１物質２５（屈折率ｎａ(λ)）と第２物質２６（屈折率ｎｂ(λ)）とを、偏光部材２２上にバッファ層２７を介して交互に蒸着により積層して構成する。これら第１物質２５および第２物質２６は、それぞれの膜厚をｄａおよびｄｂとすると、励起光に対して光学反射膜として機能させる場合は、励起光の波長λ１に対して、例えば、光路長がλ１／４であればよいので、下記（１）式を満たせばよい。
【００５９】
ｄａｎａ(λ１)＝λ１／４，ｄｂｎｂ(λ１)＝λ１／４ （１）
【００６０】
この条件で設計された多層膜２４は、励起光と波長が異なる刺激光については干渉条件から外れるので、刺激光は反射させずに通過させる。その際、刺激光は位相遅れを受ける。すなわち、多層膜２４は、刺激光に対しては位相を空間変調する作用を有し、位相板として機能する。したがって、この場合、多層膜２４を通過した刺激光と、通過しない刺激光とを比較すると、同じ瞳面で下記（２）式により示される位相差δが発生する。なお、（２）式において、λ２は、刺激光の波長を示し、ｍは第１物質２５と第２物質２６とを対とする総対数を示す。
【００６１】
δ＝ｍ｛ｄａｎａ(λ２)＋ｄｂｎｂ(λ２)｝−ｍ（ｄａ＋ｄｂ） （２）
【００６２】
ここで、位相差δが、下記の（３）式を満たす場合は、多層膜２４を通過した刺激光の波面と、それ以外の領域を通過した刺激光の波面とを比較すると、図３に示すように、電場振幅において完全に同じ振幅で符号が反転する。なお、（３）式において、Ｌは、整数を示す。
【００６３】
δ＝（２Ｌ＋１）λ２／２ （３）
【００６４】
したがって、瞳面内において、多層膜２４を通過しない刺激光と、通過した刺激光との光量が同じであれば、瞳面内を通過した刺激光を集光すると、焦点において完全に電場強度が相殺される。すなわち、焦点面において、干渉により光強度が存在しない、つまり光強度の極小値を有するドーナッツ形状の集光ビームが得られる。これは、例えば、特許第3993553号公報に開示されている輪体型の位相板と同等の機能をもつ。
【００６５】
これに対し、励起光は、多層膜２４を有する領域では反射され、多層膜４以外の領域を通過する。この場合は、例えば、Y.Iketaki,et.al.Opt.Lett.,19(1994)1804-1806.に開示されているように、光強度の極大値を有する通常の集光ビームが得られる。
【００６６】
したがって、図２に示した偏光制御素子２１に、同じ瞳径の励起光と刺激光とを同軸に入射させて、その透過光を集光させれば、刺激光は、集光点を含む近傍領域において、少なくとも光軸方向に中空部を有する中空パターン状（ドーナッツ形状）のビーム形状、より具体的には、カプセル状（３次元的なダークホール形状）または管状（マカロニ状）に集光させることができ、励起光は通常の集光ビームの形状で集光させることができる。しかも、励起光および刺激光は、同じ空間点に集光するので、超解像顕微鏡における最大の課題である励起光と刺激光との光学調整を省くことができる。
【００６７】
なお、偏光制御素子２１に励起光および刺激光を入射させるには、励起光および刺激光を同じシングルモードファイバから取り出し、これを色収差の無いレンズでコリメートして入射させるように、照明光学系を構成するのが好ましい。このように照明光学系を構成すれば、以下のような効果が期待できる。
【００６８】
（１）励起光および刺激光を、シングルモードファイバから取り出すので、これらを完全球面波とすることができる。したがって、色収差の無いレンズでコリメートすれば、波面収差の無い完全な平面波を得ることができるので、偏光制御素子２１において位相変調をより確実に行うことが可能となる。
（２）励起光および刺激光を、シングルモードファイバから取り出して、色収差のないレンズでコリメートすることにより、偏光制御素子２１が多少傾いて配置されたり、偏光制御素子２１の偏光部材２２の平行度が悪かったりした場合でも、色収差のない光学系を用いて集光すれば、試料上に同じ空間ポイントで結像させることができ、ビームずれを解消できる。
（３）シングルモードファイバの射出口は、機械的に固定されるので、励起光および刺激光の集光点の位置が空間的に変動しない、極めて機械的に安定な照明光学系を構築することができる。
【００６９】
なお、位相変調部２３は、同心円状の２領域の中央領域に多層膜２４を形成する構成に限らず、位相型のフレネルゾーンプレートのように、さらに多くの輪体状の領域を形成して、多層膜２４を有する変調領域２３ａを２領域以上形成することもできる。
【００７０】
ところで、上述したように、偏光制御素子１１の多層膜２４を通過した刺激光と、それ以外の領域を通過した刺激光とが、電場振幅において完全に同じ振幅で符号が反転している場合、焦点面においてドーナッツ形状の集光ビームを得るには、多層膜２４を通過しない刺激光と通過した刺激光との光量が等しいことが必要条件である。具体的には、瞳面に入射する刺激光の強度が均一であるならば、多層膜２４の面積をＳＡ、全瞳面の面積をＳ０とすると、下記の（４）式を満たす必要がある。
【００７１】
ＳＡ＝Ｓ０／２ （４）
【００７２】
特に、図２（ｂ）に示した、瞳の形状が半径Ｒの円形で、多層膜２４を形成する変調領域２３ａも半径ρの円形である場合は、（４）式から、Ｒ／ρは、２１／２となる。しかしながら、これは限定された最適条件である。つまり、瞳および変調領域２３ａの形状やサイズが調整できる場合は、「変調領域２３ａを通過した刺激光とそれ以外の領域を通過した刺激光とは、電場振幅において完全に同じ振幅で符号が反転している」と言う条件は、絶対的なものではなく、「変調領域２３ａを通過した刺激光とそれ以外の領域を通過した刺激光とは、符号が反転している」と言う極めて広い最適条件が提示できる。
【００７３】
ここで、刺激光の電場の最大振幅をＥｅとし、多層膜２４による位相遅れ角をδｅとする。この場合、多層膜２４を通過した刺激光とそれ以外の領域を通過した刺激光との振幅を同じ瞳面で調べると、多層膜２４を通過した刺激光の振幅強度Ｅinは、下記の（５）式で表される。なお、下式において、ωｅは刺激光の周波数、上部に右矢印を付して示すｋｅおよびｒｅは、それぞれ波数ベクトルおよび位置ベクトルである。
【００７４】
【数１】
【００７５】
一方、変調領域２３ａ外を通過した刺激光の振幅強度Ｅoutは、下記の（６）式で表される。
【００７６】
【数２】
【００７７】
上記（５）式と（６）式とを比較すると、δｅだけ位相がずれている。したがって、ＥinおよびＥoutは、Ｅｅから−Ｅｅの間で任意の値をとるので、δｅの値によって、符号が異なる値をとることになる。特に、上記（３）式の場合は、振幅の絶対値も同じになる特別な場合である。
【００７８】
以上のことから、ＥinおよびＥoutは、符号が異なれば、上記（４）式の条件に限らず、下記の（７）式で示されるより広い条件となる。
【００７９】
（Ｓ０−ＳＡ）Ｅout＋ＳＡＥin＝０ （７）
【００８０】
すなわち、（７）式の条件で、Ｓ０とＳＡとの比率や位相差δを調整することで、刺激光の焦点における電場を相殺し、ゼロとすることができる。
【００８１】
したがって、ＥinとＥout との符号が異なれば、必ずしも（３）式の条件を満たさずとも、Ｓ０とＳＡとの比率の調整で（７）式の条件を実現することができる。具体的には、多層膜２４の面積ＳＡの調整で可能であるが、瞳径全体の面積Ｓ０をアイリスにより調整して対応することも可能であり、従来法と比較しても、ゆるい調整で超解像を実現することが可能となる。
【００８２】
以上、刺激光に対する偏光制御素子２１の条件について説明したが、励起光に対しても、更に広い適用条件を提示することが可能である。
【００８３】
図４は、偏光制御素子の第３例の光学的特性を示す図である。この偏光制御素子３１は、図２に示した構成において、偏光部材２２上の多層膜２４を、励起光に対して透過型の位相板として機能させるように構成したものである。
【００８４】
図４において、励起光の電場の最大振幅をＥｐとし、多層膜２４による位相遅れ角をδｐとする。この場合、多層膜２４を通過した励起光とそれ以外の領域を通過した励起光との振幅を同じ瞳面で調べると、多層膜２４を通過した励起光の振幅強度Ｅinは、下記の（８）式で表される。なお、下式において、ωｐは励起光の周波数、上部に右矢印を付して示すｋｐおよびｒｐは、それぞれ波数ベクトルおよび位置ベクトルである。
【００８５】
【数３】
【００８６】
一方、多層膜２４の外を通過した励起光の振幅強度Ｅoutは、下記の（９）式で表される。
【００８７】
【数４】
【００８８】
上記（８）式と（９）式とを比較すると、刺激光の場合と同様に、δｐだけ位相がずれている。したがって、ＥinおよびＥoutは、Ｅｐから−Ｅｐの間で任意の値をとるので、励起光の場合は、δｐの値を調整して、同じ符号の値をとるように設定する。
【００８９】
この場合、図４に示すように、多層膜２４を通過した励起光と、それ以外の領域を通過した励起光とは、同じ極性を持つので、集光した際に、刺激光とは異なり電場は相殺されずに加算される。結果として、この場合は、焦点で強度を有するガウス型の集光スポットが得られる。すなわち、多層膜２４を設計する際、δｐとδｅとを調整して、励起光では同極性とし、刺激光では異なる極性とすればよい。具体的には、励起光と刺激光とは、波長が異なるので、多層膜２４における屈折率も異なる。したがって、屈折率差を利用して、層数や厚みを最適化する。例えば、吸収端近傍の異常分散が強いような波長領域において、励起光と刺激光との屈折率差が十分大きい透明な物質を用いることで、多層膜にせずとも１層で上記と同じ効果をもつ、最も単純な偏光制御素子を構成可能である。
【００９０】
図５は、偏光制御素子の第４例を説明するための図で、図５（ａ）は、偏光制御素子の概略構成を示す平面図、図５（ｂ）は、その光学特性を説明するための図である。この偏光制御素子４１は、図４に示した構成において、偏光部材２２上の入射光束の全領域を変調領域２３ａとし、この変調領域２３ａを光軸の周りに複数領域、ここでは図１の場合と同様に８領域に分割して、その８領域に刺激光波長λ２に対して、λ２／８ずつ位相が異なるように、多層膜２４を形成したものである。ここで、多層膜２４は、図５（ｂ）に、励起光および刺激光の位相分布を模式的に示すように、励起光に対しては、図４の場合と同様に、同相で透過させ、刺激光に対しては、位相分布が２πで周回するラゲール・ガウシアンビームとなるように全体を位相変調するように構成する。
【００９１】
図５に示した偏光制御素子４１を用いて、この偏光制御素子４１を透過した励起光および刺激光を顕微鏡対物レンズにより試料上に集光すれば、第３例の場合と同様に、光量ロスを生じることなく、集光面上で、励起光については光軸上に光強度が最大値を有するスポットを形成でき、刺激光については光軸上に光強度が極小値を有する中空状のスポットを形成することができる。
【００９２】
図６は、偏光制御素子の第５例の概略構成を示す断面図である。この偏光制御素子５１は、反射型のもので、第２〜４例の場合と同様に、励起光と刺激光との共通光路に配置される。図６に示す偏光制御素子５１は、プリズム部材５２と、その入射面５２ａに形成された位相変調用の多層膜５３と、射出面５２ｂに形成された偏光部材５４と、反射面５２ｃに形成された反射膜５５とを備える。プリズム部材５２は、例えばガラスで構成する。偏光部材５４および多層膜５３は、第２〜４例に示した偏光部材および多層膜を適宜組み合わせて構成する。また、反射膜５５は、例えばアルミニウム膜で構成する。
【００９３】
図６に示す偏光制御素子５１は、プリズム部材５２の入射面５２ａから入射する励起光（波長λ１）および刺激光（波長λ２）を、反射面５２ｃで反射させて９０度偏向して射出面５２ｂから射出させる。その際に、入射面５２ａに設けた多層膜５３により、刺激光を集光面においてドーナッツ形状の集光ビームが得られるように位相変調し、さらに、射出面５２ｂに設けた偏光部材５４により刺激光の偏光状態を所定の偏光状態に変換する。
【００９４】
このような反射型の偏光制御素子５１を用いれば、超解像顕微鏡を構成する部品のレイアウトの自由度を向上することが可能となる。なお、図６において、偏光部材５４は、プリズム部材５２の反射面５２ｃに設けることもできる。また、プリズム部材５２自体を、水晶、液晶あるいはフォトニック結晶等の複屈折性部材により形成して、該プリズム部材５２に刺激光の偏光状態を変換する偏光機能と、励起光および刺激光の光路を９０度偏向する偏向機能とを持たせることもできる。
【００９５】
以上のように、偏光部材と位相変調部とを一体化して偏光制御素子を構成することにより、超解像顕微鏡に組み込んだ場合に、偏光制御素子のみを回転調整や芯出し調整するだけで、光軸のチルトやシフトの発生を抑えて、刺激光の中空部と励起光の頂点部とを焦点面上で約３０ｎｍの精度で容易に一致させることが可能となり、超解像効果を容易に誘導することが可能となる。また、偏光部材および位相変調部を一つの光学部材である偏光制御素子として、簡単かつ安価にできる。なお、上記の第１例においては、位相変調部１３を偏光部材１２の入射面側に形成してもよい。また、第３〜５例においては、多層膜を射出面側に形成してもよい。ただし、図６の第５例において、多層膜５３が励起光を反射させる場合は、図６に示したように、多層膜５３をプリズム部材５２の入射面５２ａに形成する。また、第２〜５例において、偏光部材は、励起光の偏光状態を変換するように構成することもできる。さらに、第２〜５例の偏光制御素子は、刺激光の単独光路に配置することも可能である。この場合、当然のことながら、励起光に対する条件は不要となる。
【００９６】
以下、上述した偏光制御素子を用いる本発明に係る超解像顕微鏡の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００９７】
（第１実施の形態）
図７は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、蛍光色素で染色された試料を観察するもので、光源部を構成する励起光用光源６１および刺激光用光源６２を備える。励起光用光源６１から射出される励起光は、ダイクロイックミラー６３で反射された後、偏光ビームスプリッタ６４を透過する。そして、２枚のガルバノミラー６５および６６により２次元方向に揺動走査されて、瞳投影レンズ系６７を経て顕微鏡対物レンズ６８により観察試料７０に集光される。なお、図１では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー６５，６６を同一平面内で揺動可能に示している。
【００９８】
一方、刺激光用光源６２から射出される刺激光は、偏光制御素子７１を透過してダイクロイックミラー６３に入射される。そして、ダイクロイックミラー６３を透過して、励起光用光源６１からの励起光とほぼ同軸に合成された後、偏光ビームスプリッタ６４を透過し、さらにガルバノミラー６５および６６により２次元方向に揺動走査されて、瞳投影レンズ系６７を経て顕微鏡対物レンズ６８により観察試料７０に集光される。
【００９９】
また、観察試料７０からの光は、顕微鏡対物レンズ６８でコリメートされ、瞳投影レンズ系６７、ガルバノミラー６６および６５を経て偏光ビームスプリッタ６４に入射される。そして、偏光ビームスプリッタ６４で所要の偏光成分が反射された後、蛍光分離フィルタ７５により蛍光が取出（透過）され、その透過した蛍光が集光レンズ７６および共焦点ピンホール７７を経て、検出部を構成する光電子増倍管からなる光検出器７８で受光される。
【０１００】
図７に示す超解像顕微鏡は、顕微鏡対物レンズ６８の瞳面を、瞳投影レンズ系６７によりガルバノミラー６５，６６間に投影して共役瞳面６９を形成し、これにより瞳面６９を軸にしてガルバノミラー６５，６６による照明光の空間走査が行われる。
【０１０１】
本実施の形態では、説明の便宜上、ローダミン６Ｇのようなキサンチン系の色素で染色された試料を観察するものとする。このため、励起光用光源６１は、例えば、Ｎｄ：ＹＶＯ４固体レーザを用い、その発振波長１０６４ｎｍの２倍波（波長５３２ｎｍ）を励起光（ポンプ光）とする。また、刺激光用光源６２は、例えば、Ｋｒレーザを用い、その発振波長６４７．１ｎｍを刺激光（イレース光）とする。
【０１０２】
また、偏光制御素子７１は、例えば図１に例示した第１例の構成とする。ここでは、偏光制御素子７１の偏光部材７２を、イレース光に対して１／４波長板として機能するように構成する。これにより、刺激光用光源６２からの直線偏光のイレース光を、所定の偏光回転方向の円偏光に変換し、その円偏光に変換されたイレース光を位相変調部７３で位相変調する。この場合、偏光部材７２は、厚さ２ｍｍ程度であるのに対し、位相変調部７３を構成する光学薄膜やエッチングによる段差の高さは、高々１μｍ程度である。したがって、位相変調部７３が、偏光部材７２による偏光機能に何ら支障を及ぼすことはない。
【０１０３】
なお、偏光制御素子７１は、２枚のガルバノミラー６５，６６間に位置する共役瞳面６９に配置するのが理想的であるが、ガルバノミラー６５，６６の間隔は、実際には５ｍｍ程度で、配置するのが困難である。しかし、偏光制御素子７１は、入射側のガルバノミラー６５の手前のイレース光の光路中であれば、任意の位置に配置しても、事実上、結像性能の劣化は殆ど発生しない。
【０１０４】
また、励起光用光源６１から射出されるポンプ光は、直線偏光、あるいは、図示しない偏光部材により偏光制御素子７１によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光に変換して顕微鏡対物レンズ６８により集光する。
【０１０５】
本実施の形態によれば、偏光部材７２と位相変調部７３とが一体化された偏光制御素子７１を用いるので、該偏光制御素子７１を、例えば位相変調部７３の中心がイレース光の光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、イレース光を所定の偏光回転方向の円偏光に変換して変調することができる。これにより、ポンプ光およびイレース光を高開口数の顕微鏡対物レンズ６８により集光した際に、集光面上で、イレース光を光軸方向の電場成分が相殺された対称なドーナッツビームとすることができる。また、イレース光の光軸チルトやシフトを生じることなく、該イレース光の中空部とポンプ光の頂点部とを約３０ｎｍの精度で容易に一致させることができ、超解像効果を発現することができる。また、特に、ポンプ光の偏光状態を、偏光制御素子７１によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光とした場合は、ランダムに分散している分子の蛍光を平均化して検出できるという効果が得られる。
【０１０６】
（第２実施の形態）
図８は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット８０、スキャンユニット９０および顕微鏡ユニット１００を有しており、スキャンユニット９０および顕微鏡ユニット１００は、瞳投影レンズ系１１０を介して光学的に結合されている。
【０１０７】
光源ユニット８０は、光源部を構成するもので、励起光用光源８１、刺激光用光源８２、ダイクロイックプリズムや偏光プリズムからなるビームコンバイナ８３、ファイバ集光レンズ８４、シングルモードファイバ８５およびファイバコリメータレンズ８６を有している。励起光用光源８１から射出される励起光（ポンプ光）および刺激光用光源８２から射出される刺激光（イレース光）は、ビームコンバイナ８３でほぼ同軸に合成された後、ファイバ集光レンズ８４を経て同一のシングルモードファイバ８５にほぼ同軸に入射され、これによりシングルモードファイバ８５の射出口から放射立体角が揃えられた完全球面波として射出される。シングルモードファイバ８５から射出されるポンプ光およびイレース光は、色収差のないファイバコリメータレンズ８６で平面波に変換されて、スキャンユニット９０に導入される。
【０１０８】
本実施の形態では、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察するため、励起光用光源８１は、例えば連続波を射出するＨｅ−Ｎｅレーザを用い、その波長５４３ｎｍの発振線をポンプ光とする。また、刺激光用光源８２は、例えば連続波を射出するＨｅ−Ｎｅレーザを用い、その波長６３３ｎｍの発振線をイレース光とする。したがって、後述の偏光制御素子を含む光学系は、これらの波長に対して最適化したものとする。
【０１０９】
スキャンユニット９０は、光源ユニット８０から射出されるポンプ光およびイレース光を、偏光ビームスプリッタ９１を通過させた後、走査光学系である２枚のガルバノミラー９２および９３により２次元方向に揺動走査して、瞳投影レンズ系１１０を介して顕微鏡ユニット１００に入射させる。
【０１１０】
顕微鏡ユニット１００は、スキャンユニット９０から瞳投影レンズ系１１０を介して入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム１０１で反射させて、顕微鏡対物レンズ１０２によりローダミン６Ｇ色素で染色された観察試料１０３上に集光させる。また、観察試料１０３で発光した蛍光は、顕微鏡対物レンズ１０２でコリメートしてハーフプリズム１０１で反射させることにより、瞳投影レンズ系１１０を経てスキャンユニット９０に戻すと同時に、ハーフプリズム１０１を通過する蛍光の一部は、蛍光像として目視観察できるように接眼レンズ１０４に導く。なお、顕微鏡対物レンズ１０２は、その鏡筒も含めて示している。
【０１１１】
また、スキャンユニット９０は、顕微鏡ユニット１００から瞳投影レンズ系１１０を経て入射する蛍光を、往路とは逆の経路を辿って偏光ビームスプリッタ９１で所要の偏光成分を分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ９４、ピンホール９５を、ノッチフィルタ９６および９７を経て、検出部を構成する光電子増倍管からなる光検出器９８で受光する。
【０１１２】
なお、ピンホール９５は、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものであり、ノッチフィルタ９６および９７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。
【０１１３】
図８に示す超解像顕微鏡は、図７と同様に、顕微鏡対物レンズ１０２の瞳面を、瞳投影レンズ系１１０によりスキャンユニット９０内のガルバノミラー９２，９３間に投影して共役瞳面を形成し、これにより瞳面を軸にしてガルバノミラー９２，９３による照明光の空間走査が行われる。
【０１１４】
本実施の形態では、ポンプ光とイレース光との共通光路で、顕微鏡ユニット１００内の瞳面またはその近傍に、図４に例示した構成を有する偏光制御素子１０５と、ビーム径を制限するアイリス（可変絞り）１０８とを設置する。
【０１１５】
偏光制御素子１０５は、偏光部材１０６がイレース光に対して１／４波長板として機能するように構成する。また、多層膜１０７は、図２に示したバッファ層２７として波長５３２ｎｍでの屈折率が１．５２のＳｉＯ２を厚さ５３２．７ｎｍコートし、このバッファ層２７上に、波長５３２ｎｍでの屈折率が２．１６のＴａＯ５と、波長５３２ｎｍでの屈折率が１．５２のＳｉＯ２とを、ＴａＯ５については厚さ６２．８ｎｍ、ＳｉＯ２については厚さ８９．９ｎｍで、交互に１１層まで蒸着により積層して構成する。この多層膜１０７は、ポンプ光に対しては、透明部材として機能し、イレース光に対しては、位相を１／２波長（π）だけ遅延させる位相変調素子として機能する。
【０１１６】
そして、偏光制御素子１０５を、光軸に対して直交する平面内で回転調整して配置することにより、イレース光ビームを所定の偏光回転方向の円偏光に変換するとともに、イレース光の位相を空間変調し、この空間変調されたイレース光と、空間変調を受けないポンプ光とを、アイリス１０８を経て色収差の無い顕微鏡対物レンズ１０２により試料１０３上に集光させる。
【０１１７】
また、偏光制御素子１０５を通過したポンプ光およびイレース光は、集光面でイレース光を完全な中空ビームとするために、アイリス１０８でビーム径を調整する。すなわち、瞳面における強度分布が均一であれば、図２に示したように、瞳の形状が半径Ｒの円形で、変調領域２３ａも半径ρの円形であれば、上記（４）式を満たすには、Ｒ／ρが２１／２となる。しかし、一般のレーザ走査型顕微鏡は、ビームの強度分布が均一でなく、ガウス状の分布をもつ。したがって、完全な中空ビームを形成するためには、上記（７）式に準じて、Ｒ／ρを調整する必要がある。そのため、瞳面の直後に設けたアイリス１０８でビーム外径を調整して、Ｒ／ρの最適化を図る。さらに、アイリス１０８は、偏光制御素子１０５の多層膜１０７を透過するイレース光の位相遅れ誤差も調整可能である。
【０１１８】
なお、励起光用光源８２から射出されるポンプ光は、直線偏光、あるいは、図示しない偏光部材により、偏光制御素子１０５によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光に変換してビームコンバイナ８３に入射させる。
【０１１９】
このように、本実施の形態では、イレース光とポンプ光とを、同軸に合成した後、偏光制御素子１０５に入射させている。したがって、例えば、偏光制御素子１０５をその中心が光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、光軸チルトやシフトを生じることなく、偏光制御素子１０５の偏光部材１０６によりイレース光を所定の偏光回転方向の円偏光に変換し、さらに、多層膜１０７を通過したイレース光と、通過しないイレース光との間で、相対的に位相をほぼπだけ遅延させて、イレース光の中空ビームをポンプ光と同軸で形成することができる。しかも、偏光制御素子１０５では、イレース光の光量ロスが生じないので、刺激光用光源８２から射出するイレース光の光パワーを必要最小限として、顕著な超解像効果を誘導することができる。さらに、ポンプ光の偏光状態を、偏光制御素子１０５によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光とした場合は、ランダムに分散している分子の蛍光を平均化して検出できるという効果が得られる。
【０１２０】
また、偏光制御素子１０５およびアイリス１０８は、顕微鏡ユニット１００内の瞳面またはその近傍に配置され、その共役瞳面またはその近傍にガルバノミラー９２，９３を配置して、ポンプ光およびイレース光を空間走査するので、走査による波面収差の発生を抑えることができる。したがって、超解像顕微鏡性能を左右するイレース光の集光形状を乱すことなく、広い視野で高い結像性能を保つことができるとともに、観察試料１０３上ではポンプ光およびイレース光を常に同軸上で集光でき、顕著な超解像効果を誘導することができる。
【０１２１】
さらに、光源ユニット８０においては、励起光用光源８１から射出されるポンプ光および刺激光用光源８２から射出されるイレース光を、ビームコンバイナ８３で合成した後は、いずれの光もデリバリすることなく、同一光学系、すなわちファイバ集光レンズ８４およびシングルモードファイバ８５を経て射出させている。しかも、シングルモードファイバ８５から射出される完全球面波のポンプ光およびイレース光を、ファイバコリメータレンズ８６により同じ条件でコリメートしている。したがって、面倒な光学調整を要することなく、ポンプ光およびイレース光を、波面収差を与えることなく、同じダイバージェンス（ビーム広がり）で顕微鏡対物レンズ１０２により観察試料１０３の全く同じ結像点に集光させることができる。
【０１２２】
（第３実施の形態）
図９は、本発明の第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、図８に示した超解像顕微鏡において、光源ユニット８０を、１台のレーザ光源８７を用い、このレーザ光源８７から射出されるレーザ光を、ファイバ集光レンズ８４、シングルモードファイバ８５およびファイバコリメータレンズ８６を経てスキャンユニット９０に導入するようにしたものである。
【０１２３】
ここで、レーザ光源８７は、例えば、マルチラインで発振するＨｅ−Ｎｅレーザを用い、波長５４３ｎｍの発振線をポンプ光として用い、波長６３３ｎｍの発振線をイレース光として用いる。その他の構成および動作は、第２実施の形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。
【０１２４】
本実施の形態によれば、１台のＨｅ−Ｎｅレーザから、ポンプ光とイレース光とを同時に取り出すことができるので、第２実施の形態におけるよりも構成を簡略化できるとともに、第２実施の形態では必要となる、ポンプ光とイレース光との光軸を調整してシングルモードファイバ８５に導入する作業を省くことができ、調整もより簡単にできる。その他の作用効果については、第２実施の形態と同様であるので、説明を省略する。
【０１２５】
（第４実施の形態）
本発明の第４実施の形態に係る超解像顕微鏡は、上述した第１〜３実施の形態のいずれかの構成において、偏光制御素子の偏光部材をイレース光に対して１／２波長板として機能するように構成する。そして、観察試料に集光するイレース光を直線偏光として、その直線偏光の方向を偏光制御素子の偏光部材で調整する。すなわち、図７に示した構成においては、偏光制御素子７１の偏光部材７２を１／２波長板により構成し、図８または図９に示した構成においては、偏光制御素子１０５の偏光部材１０６を１／２波長板により構成する。
【０１２６】
そして、観察試料に対して、ポンプ光を直線偏光として集光させるとともに、偏光制御素子を、光軸に対して直交する平面内で回転調整して、イレース光の直線偏光を、ポンプ光の直線偏光の方向と一致させて観察試料に集光させる。
【０１２７】
このように、観察試料に集光されるポンプ光とイレース光とを、偏光方向が一致した直線偏光とすれば、特に、ローダミン６Ｇのような色素の蛍光を検出する場合は、蛍光抑制効果を最大に発揮でき、良好な超解像効果を誘導することができる。
【０１２８】
上述した各実施の形態は、ポンプ光とイレース光とを重ね合わせて観察試料に集光して、観察試料上で円形のポンプ光スポットと、中空のイレース光スポットとを形成し、これによりイレース光の照射領域の蛍光強度を抑制して蛍光抑制効果を発現させ、ポンプ光のみが照射された超解像領域から発光する蛍光を光検出器で検出するようにしている。すなわち、ポンプ光およびイレース光の照射により発光する蛍光の総量を検出するようにしている。
【０１２９】
しかし、超解像効果を誘導する蛍光抑制効果は、上記の場合に限らず、分光学的な手法を導入して発現することも可能である。このような手法に利用可能な色素として、近年、特定の波長の光を照射すると、蛍光スペクトルが変化する、所謂、光活性型の色素が知られている。特に、有名な光活性型の色素として、「Kaede」と呼ばれる蛍光タンパクが存在する。
【０１３０】
この「Kaede」は、紫外光が照射されると蛍光波長が長波長側にレッドシフトする。図１０は、「Kaede」の紫外光照射前後の分光スペクトルを示す図で、図１０（ａ）は紫外光照射前の分光スペクトル、図１０（ｂ）は波長３５５ｎｍの紫外光が照射された後の分光スペクトルをそれぞれ示す。また、図１０（ａ），（ｂ）において、実線は発光スペクトルを示し、破線は吸収スペクトルを示す。
【０１３１】
図１０から明らかなように、「Kaede」は、紫外光が照射される前は、波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍの帯域に発光スペクトルを有しているが、波長３５５ｎｍの紫外光が照射されると、中心蛍光波長が５８０ｎｍ付近にレッドシフトする。しかも、注目すべきことは、短波長側の５００ｎｍ〜５５０ｎｍの波長帯域の蛍光成分が消失する。したがって、この場合は、例えば、波長４８８ｎｍの可視光を励起光とし、波長３５５ｎｍの紫外光を刺激光として、これらを上記実施の形態と同様の構成により観察試料に照射し、励起光のみが照射された領域から発生する短波長側の蛍光を、分光器あるいは光学フィルタを介して計測すれば、同様に超解像効果を発現することができる。以下、この場合の一例の構成を、本発明の第５実施の形態として図１１を参照して説明する。
【０１３２】
（第５実施の形態）
図１１は、本発明の第５実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、光源部を構成する励起光用光源１２１および刺激光用光源１２２を備える。励起光用光源１２１から射出される励起光は、図７の場合と同様に、ダイクロイックミラー１２３で反射された後、偏光ビームスプリッタ１２４を透過する。そして、２枚のガルバノミラー１２５および１２６により２次元方向に揺動走査されて、瞳投影レンズ系１２７および顕微鏡対物レンズ１２８を経て、「Kaede」により染色された観察試料１３０に集光される。
【０１３３】
一方、刺激光用光源１２２から射出される刺激光は、偏光制御素子１３１を透過してダイクロイックミラー１２３に入射される。そして、ダイクロイックミラー１２３を透過して、励起光用光源１２１からの励起光とほぼ同軸に合成された後、ガルバノミラー１２５および１２６により２次元方向に揺動走査されて、瞳投影レンズ系１２７を経て顕微鏡対物レンズ１２８により観察試料１３０に集光される。
【０１３４】
また、観察試料１３０からの光は、顕微鏡対物レンズ１２８でコリメートされ、瞳投影レンズ系１２７、ガルバノミラー１２６および１２５を経て偏光ビームスプリッタ１２４に入射される。そして、偏光ビームスプリッタ１２４で所要の偏光成分が反射された後、蛍光分離フィルタ１３５により蛍光が取出（透過）され、その透過した蛍光が集光レンズ１３６および分光器１３７を経て、検出部を構成する光電子増倍管からなる光検出器１３８で受光される。
【０１３５】
分光器１３７は、波長帯域選択部を構成するもので、入射側の共焦点ピンホール１４１、射出側ピンホール１４２、２枚の反射ミラー１４３，１４４および反射型の回折格子１４５を備える。この分光器１３７は、共焦点ピンホール１４１から入射した蛍光を、反射ミラー１４３を経て回折格子１４３で反射させて回折させ、その回折光を反射ミラー１４４を経て射出側ピンホール１４２から射出するもので、回折格子１４５への入射光の入射角度および射出側ピンホール１４２の径を適切に調整することにより、所望の波長帯域の蛍光を取り出すことが可能である。
【０１３６】
本実施の形態では、「Kaede」から発生される蛍光を観測するため、励起光用光源１２１は、例えば、Ａｒレーザを用い、その発振波長４８８ｎｍを励起光とする。また、刺激光用光源１２２は、例えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザを用い、その発振波長１０６４ｎｍの３倍波（波長３５５ｎｍ）を刺激光とする。
【０１３７】
偏光制御素子１３１は、例えば図１に例示した第１例の構成とする。ここでは、偏光制御素子１３１の偏光部材１３２を、刺激光に対して１／４波長板として機能するように構成する。そして、この偏光制御素子１３１を、光軸に対して直交する平面内で回転調整して配置することにより、刺激光用光源１３２からの直線偏光の刺激光を、所定の偏光回転方向の円偏光に変換し、その円偏光に変換された刺激光を位相変調部１３３で位相変調して、観察試料１３０上で励起光と同軸の中空の刺激光スポットを形成する。
【０１３８】
また、分光器１３７は、波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍの帯域の蛍光が通るように、回折格子１４５の入射光に対する角度および射出側ピンホール１４２の径を適切に調整する。なお、励起光用光源１２１から射出される励起光は、直線偏光、あるいは、図示しない偏光部材により偏光制御素子１３１によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光に変換して顕微鏡対物レンズ１２８により集光する。
【０１３９】
本実施の形態によると、観察試料１３０上で刺激光の中空スポットが照射された領域の蛍光はレッドシフトされるので、分光器１３７で遮断される。これに対し。刺激光の中空スポットの中央領域は、励起光のみが照射されるので、その中央領域から発生する波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍの蛍光が、分光器１３７で分光されて光検出器１３８で受光される。これにより、蛍光抑制効果が誘導される。しかも、この刺激光の中空スポットの中央領域は、励起光の集光サイズよりも小さいので、超解像効果を得ることができる。したがって、煩雑な調整作業を要することなく、例えば、偏光制御素子１３１を、上述した実施の形態と同様に、その中心が光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、超解像効果を容易に誘導することができる。
【０１４０】
なお、図１１では、波長帯域選択部を分光器１３７を用いて構成して、波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍの帯域の蛍光を選択するようにしたが、分光器１３７に代えてバンドパスフィルタを用いることもできる。また、偏光制御素子１３１の偏光部材１３２は、１／４波長板に限らず、１／２波長板として、刺激光を所定の方向の直線偏光に調整して観察試料１３０に照射するように構成することもできる。すなわち、「Kaede」のような分子は、分子独自の配向性を有しており、特に、分子軸に対して特定の方向に直線偏光した紫外光が入射した場合に、レッドシフトが効率的に起きる。このように、蛍光色素分子が極めて強い偏光依存性を有する場合は、刺激光の形状の対称性よりも分子の異方性を優先させて、特定の方向に直線偏光した刺激光を集光させることにより、蛍光抑制効果が最大に発揮されたより顕著な超解像効果を誘導することもできる。
【０１４１】
（第６実施の形態）
図１２は、本発明の第６実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、顕微鏡対物レンズ１５１の物体側（先端）に内視鏡光学系１５２をハイブリッドで結合したスティックレンズ１５３を有し、このスティックレンズ１５３の内視鏡光学系１５２の先端部を生体試料１５５に直接差し込んで、生体試料１５５の生命現象をin-vivoで観察するものである。顕微鏡対物レンズ１５１には、同軸に合成された励起光および刺激光が、ガルバノミラー１５６，１５７により二次元走査されて、瞳投影レンズ１５８を経て入射させる。
【０１４２】
本実施の形態においては、ガルバノミラー１５７と顕微鏡対物レンズ１５１との間の励起光および刺激光の共通光路中に、例えば図４または図５に例示した構成の偏光制御素子１６１を配置する。なお、偏光制御素子１６１の偏光部材は、上述した実施の形態の場合と同様に、刺激光に対して１／４波長板あるいは１／２波長板として機能するように構成する。
【０１４３】
このように構成された本実施の形態に係る超解像顕微鏡によると、偏光制御素子１６１を、上述した実施の形態と同様に、例えば、その中心が光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、超解像効果を容易に発現することができる。これにより、スティックレンズ１５３の開口数を、光学設計上、大きくできなくても、空間分解能を画期的に向上することができる。
【０１４４】
（第７実施の形態）
図１３は、本発明の第７実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、顕微鏡対物レンズ１７１を、光軸と直交する平面内で、直交するＸ方向およびＹ方向に移動可能として、顕微鏡対物レンズ１７１自体で観察試料１７２に対して光束を空間走査するようにしたものである。観察試料１７２に照射する励起光および刺激光は、図８と同様にして、ファイバ１７３に同軸に合波して入射させ、このファイバ１７３の射出口から射出される球面波の励起光および刺激光を、コリメータレンズ１７４で平面波に変換して顕微鏡対物レンズ１７１に入射させる。
【０１４５】
本実施の形態においては、コリメータレンズ１７４と顕微鏡対物レンズ１７１との間の励起光および刺激光の共通光路中に、例えば図４または図５に例示した構成の偏光制御素子１７５を配置する。なお、偏光制御素子１７５の偏光部材は、上述した実施の形態の場合と同様に、刺激光に対して１／４波長板あるいは１／２波長板として機能するように構成する。
【０１４６】
本実施の形態に係る超解像顕微鏡によると、上述した実施の形態の場合と同様に、偏光制御素子１７５を、例えば、その中心が光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、超解像効果を容易に発現することができる。これにより、ファイバ１７３を用いるために、顕微鏡対物レンズ１７１の開口数を大きくできなくても、十分な空間分解能を得ることができる。
【０１４７】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、偏光制御素子を励起光と刺激光との共通光路に配置する場合、偏光制御素子の偏光部材は、励起光に対して偏光機能を有するように構成したり、励起光と刺激光との両方の光に対して偏光機能を有するように構成したりすることもできる。特に、後者の場合は、偏光部材としてフレネルロムを用いれば、励起光および刺激光の双方に対して１／２波長板、あるいは１／４波長板として機能させることができる。また、第２実施の形態では、ポンプ光とイレース光とを、ビームコンバイナ８３およびシングルモードファイバ８５を用いて同軸に合成するようにしたが、２入力１出力の光合成ファイバを用いて同軸に合成することもできる。
【符号の説明】
【０１４８】
６１ 励起光用光源
６２ 刺激光用光源
６３ ダイクロイックミラー
６４ 偏光ビームスプリッタ
６８ 顕微鏡対物レンズ
７０ 観察試料
７１ 偏光制御素子
７２ 偏光部材
７３ 位相変調部
７８ 光検出器
８０ 光源ユニット
８１ 励起光用光源
８２ 刺激光用光源
８３ ビームコンバイナ
８７ レーザ光源
９０ スキャンユニット
９８ 光検出器
１００ 顕微鏡ユニット
１０２ 顕微鏡対物レンズ
１０３ 観察試料
１０５ 偏光制御素子
１０６ 偏光部材
１０７ 多層膜
１２１ 励起光用光源
１２２ 刺激光用光源
１２３ ダイクロイックミラー
１２８ 顕微鏡対物レンズ
１３０ 観察試料
１３１ 偏光制御素子
１３２ 偏光部材
１３３ 位相変調部
１３７ 分光器
１３８ 光検出器
１５１ 顕微鏡対物レンズ
１５２ 内視鏡光学系
１５３ スティックレンズ
１５５ 生体試料
１６１ 偏光制御素子
１７１ 顕微鏡対物レンズ
１７２ 観察試料
１７３ ファイバ
１７５ 偏光制御素子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に試料を複数の波長の光により照明して、高い空間分解能で観察する超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明して二重共鳴吸収過程を誘導することにより、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観察するものである。この原理について、図１４〜図１７を参照して説明する。図１４は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１４に示す基底状態（Ｓ０状態：安定状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１５に示す第１励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１６に示す第２励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１７に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１６の吸収過程や図１７の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１５のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１６のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１６の励起状態から図１７に示す基底状態への蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法は、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能である。すなわち、図１４に示す最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有のエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で試料を照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能である。しかし、一般に、いくつかの分子は、吸収帯の波長領域が重複するため、単一波長で試料を照明する場合には、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１８は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１励起状態Ｓ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２励起状態Ｓ２に励起されている様子を示している。なお、図１８は、ある種の分子のＳ２状態からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１８に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１９は、図１８と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１９において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１９の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を、空間的に一部重ね合わせて蛍光領域を抑制するので、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を利用した超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
例えば、ローダミン６Ｇ色素を用いた場合、波長５３２ｎｍの光（ポンプ光）を照射すると、ローダミン６Ｇ分子は、Ｓ０状態からＳ１状態へ励起されて波長５６０ｎｍにピークを有する蛍光を発光する。この際、波長５９９ｎｍの光（イレース光）を照射すると、二重共鳴吸収過程が起こって、ローダミン６Ｇ分子は蛍光発光がしにくいＳ２状態に遷移する。すなわち、これらのポンプ光とイレース光とをローダミン６Ｇに同時に照射すると蛍光が抑制されることになる。
【００１８】
図２０は、従来提案されている超解像顕微鏡の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット２１０、スキャンユニット２３０および顕微鏡ユニット２５０からなっている。
【００１９】
光源ユニット２１０は、ポンプ光用光源２１１およびイレース光用光源２１２を有する。ポンプ光用光源２１１から射出されるポンプ光は、ダイクロイックプリズム２１３に入射され、該ダイクロイックプリズム２１３で反射されて射出される。イレース光用光源２１２から射出されるイレース光は、偏光素子２１４により偏光が調整された後、位相板２１５により位相変調されてダイクロイックプリズム２１３に入射され、該ダイクロイックプリズム２１３を透過して、ポンプ光と同軸上に合成されて射出される。
【００２０】
ここで、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察する場合には、ポンプ光用光源２１１は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザを用い、その２倍高調波である波長５３２ｎｍの光をポンプ光として射出するように構成される。また、イレース光用光源２１２は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザとラマンシフタとを用い、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍高調波をラマンシフタで波長５９９ｎｍに変換した光をイレース光として射出するように構成される。
【００２１】
位相板２１５は、光軸の周りをイレース光の位相差が２π周回するように構成されるもので、例えば図２１に示すように、光軸の周りに独立した８領域を有し、イレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なるようにガラス基板をエッチングして形成される。この位相板２１５を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺された中空状のイレース光が生成される。
【００２２】
スキャンユニット２３０は、光源ユニット２１０から同軸で射出されるポンプ光およびイレース光を、ハーフプリズム２３１を通過させた後、２枚のガルバノミラー２３２および２３３により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット２５０に射出させる。また、スキャンユニット２３０は、顕微鏡ユニット２５０から入射する蛍光を、往路と逆の経路を辿ってハーフプリズム２３１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ２３４、ピンホール２３５、ノッチフィルタ２３６および２３７を経て光電子増倍管２３８で受光するようになっている。
【００２３】
図２０は、図面を簡略化するため、ガルバノミラー２３２，２３３を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ２３６および２３７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール２３５は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００２４】
顕微鏡ユニット２５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット２３０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム２５１で反射させて、顕微鏡対物レンズ２５２により少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料２５３上に集光させる。また、観察試料２５３で発光した蛍光は、再び顕微鏡対物レンズ２５２でコリメートしてハーフプリズム２５１で反射させることにより、再び、スキャンユニット２３０に戻すとともに、ハーフプリズム２５１を通過する蛍光の一部は接眼レンズ２５４に導いて、蛍光像として目視観察できるようにしている。
【００２５】
この超解像顕微鏡によると、観察試料２５３の集光点上においてイレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域に存在する蛍光ラベラー分子のみを計測できる。したがって、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列すれば、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する顕微鏡画像を形成することが可能となる。
【００２６】
ところで、上述した２色照明による光応答を用いた超解像顕微鏡は、偏光依存性が極めて強く、所定の偏光条件を満たさないと期待する光学特性が得られない。例えば、上記の蛍光抑制効果は、２色の照明光の偏光方向が同じの場合に強く発現し、直交する場合は弱くなることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【００２７】
また、偏光状態は、イレース光のビーム形状にも甚大な影響を与える。すなわち、図２１に示した位相板２１５を用いた場合、偏光状態によってビーム形状が変化する。例えば、偏光素子２１４によりイレース光を円偏光に変換して高開口数のレンズで集光すると、円偏光における電場の回転方向に依存して、光軸方向の偏光成分が発生して中心強度がゼロにならず、中空構造のビーム形状が得られない場合があることが知られている（例えば、非特許文献２参照）。これは、平面内で直交する電場ベクトルを有する光を集光すると、各々独立に光軸方向に平行な電場ベクトル成分が生成され、それらが反平行の場合は中心強度がゼロになるが、平行な場合は足し合わされた成分が発生するからである。
【００２８】
このように、イレース光のビーム形状が焦点面上で中空状態にならないと、ポンプ光の中央部での蛍光が抑制されて、空間分解能が劣化してしまうことになる。このため、所望の超解像効果を得るためには、ポンプ光およびイレース光の偏光状態を最適化する必要がある。
【００２９】
また、十分な超解像効果を得るためには、焦点面上でイレース光の中空部とポンプ光の頂点部とを約３０ｎｍの精度で一致させる必要があることも知られている（例えば、非特許文献３参照）。
【００３０】
さらに、図２１に示した位相板２１５を用いる場合は、位相板２１５の中心部をイレース光の中心部に完全に一致させないと、つまり、イレース光の位相が光軸対称の位置で完全に反転していないと、焦点面上で光軸上の電場が相殺されず、理想的な中空スポットが得られなくなる。その結果、超解像効果が得られなくなる。
【００３１】
そこで、従来は、超解像効果が得られるように、偏光素子２１４と位相板２１５とを独立して調整するようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】N. Bokor, Y. Iketaki, T. Watanabe, K. Daigoku, N. Davidson and M. Fujii, Opt. Comm., 272 (1),(2007) 263-269.
【非特許文献２】Y. Iketaki, T. Watanabe, N. Bokor and M. Fujii, Opt. Lett., 32(2007) 2357-2359
【非特許文献３】Y. Iketaki, T. Watanabe, N. Bokor and M. Fujii, e-Journal of Surface Science and Nanotechnology, 6(2008) 175-179
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
しかしながら、上述したように、偏光素子と位相板とを独立して調整する従来装置にあっては、偏光素子の回転調整や位相板の芯出し調整等を独立して行うために、例えばプリズム効果が発生して、光軸が傾いたり（チルト）、ずれたり（シフト）することが知られている。このため、イレース光の中空部とポンプ光の頂点部とを焦点面上で約３０ｎｍの精度で一致させるには、作業が煩雑で、時間がかかり、ユーザの負担が大きくなることが懸念される。
【００３５】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、煩雑な調整作業を要することなく、超解像効果を容易に誘導できる超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
上記目的を達成する第１の観点に係る超解像顕微鏡の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を安定状態から第１量子状態に励起するための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させるための第２照明光を射出する光源部と、
該光源部から射出された前記第１照明光および前記第２照明光を前記試料に一部重ね合わせて集光する、顕微鏡対物レンズを含む光学系と、
前記第１照明光および前記第２照明光の集光により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
前記第１照明光または前記第２照明光の偏光状態を変換する偏光部材、および該偏光部材に一体に形成されて前記第２照明光の位相を空間変調する位相変調部を有する偏光制御素子と、
を備えることを特徴とするものである。
【００３７】
第２の観点に係る発明は、第１の観点に係る超解像顕微鏡において、
前記位相変調部は、前記第２照明光の位相を光軸対称の位置で反転させるように、光学媒質膜の積層またはエッチング加工により段差を有して形成された複数の領域からなる、
ことを特徴とするものである。
【００３８】
第３の観点に係る発明は、第１の観点に係る超解像顕微鏡において、
前記位相変調部は、前記第１照明光に対しては反射作用または透過型の位相変調作用を有し、前記第２照明光に対しては透過型の位相変調作用を有する多層膜からなる、
ことを特徴とするものである。
【００３９】
第４観点に係る発明は、第１〜３のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記物質は蛍光物質であり、
前記第２照明光は、前記蛍光物質の蛍光の発光を抑制する波長である、
ことを特徴とするものである。
【００４０】
第５の観点に係る発明は、第１〜３のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記物質は蛍光物質であり、
前記第２照明光は、前記蛍光物質の蛍光のスペクトルを変化させる波長であり、
前記検出部は、前記第１照明光の照射により前記蛍光物質から発光する蛍光のスペクトルを透過させ、前記第２照明光の照射により前記蛍光物質から発光する蛍光のスペクトルを遮断する波長帯域選択部を有する、
ことを特徴とするものである。
【００４１】
第６の観点に係る発明は、第１〜５のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光制御素子は、前記第２照明光の光軸に関して回転可能である、
ことを特徴とするものである。
【００４２】
第７の観点に係る発明は、第１〜６のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光部材は、前記第２照明光に対して１／２波長板として機能し、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光の偏光方向は平行である、
ことを特徴とするものである。
【００４３】
第８の観点に係る発明は、第１〜６のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光部材は、前記第２照明光に対して１／４波長板として機能し、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光の少なくとも一方の偏光方向は円偏光である、
ことを特徴とするものである。
【００４４】
第９の観点に係る発明は、第８の観点に係る超解像顕微鏡において、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光は、偏光回転方向が反対の円偏光である、
ことを特徴とするものである。
【００４５】
第１０の観点に係る発明は、第１〜９のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光制御素子は、前記第１照明光または前記第２照明光を偏向する反射型である、
ことを特徴とするものである。
【００４６】
第１１の観点に係る発明は、第１〜１０のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記偏光制御素子は、前記偏光部材として液晶またはフォトニック結晶を含む、
ことを特徴とするものである。
【００４７】
第１２の観点に係る発明は、第１〜１１のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記光学系は、前記顕微鏡対物レンズの物体側に結合された内視鏡光学系を備えるスティックレンズを有する、
ことを特徴とするものである。
【００４８】
第１３の観点に係る発明は、第１〜１１のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、
前記顕微鏡対物レンズは、前記試料に対して前記第１照明光および前記第２照明光を空間的に走査可能に構成されている、
ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００４９】
本発明に係る超解像顕微鏡によると、第１照明光または第２照明光の偏光状態を変換する偏光部材と、第２照明光の位相を空間変調する位相変調部とが一体化された偏光制御素子を備えるので、煩雑な調整作業を要することなく、超解像効果を容易に誘導することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第１例の構成を模式的に示す断面図および平面図である。
【図２】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第２例の構成を模式的に示す断面図および平面図である。
【図３】図２の偏光制御素子の光学特性を示す図である。
【図４】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第３例の光学特性を示す図である。
【図５】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第４例の概略構成を示す断面図および光学的特性を示す図である。
【図６】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の第５例の概略構成を示す断面図である。
【図７】本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。
【図８】本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。
【図９】本発明の第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。
【図１０】蛍光タンパク色素「Kaede」の紫外光照射前後の分光スペクトルを示す図である。
【図１１】本発明の第５実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。
【図１２】本発明の第６実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を示す図である。
【図１３】本発明の第７実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を示す図である。
【図１４】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１５】図１４に示す分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１６】図１４に示す分子の第２励起状態を示す概念図である。
【図１７】図１４に示す分子が第２励起状態から基底状態に戻る状態を概念的に示す図である。
【図１８】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１９】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図２０】従来の超解像顕微鏡の要部構成図である。
【図２１】図２０に示す位相板の構成を示す拡大平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
先ず、本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な偏光制御素子の概要について説明する。
【００５２】
図１（ａ）および（ｂ）は、偏光制御素子の第１例の構成を模式的に示す断面図および平面図である。この偏光制御素子１１は、刺激光の単独光路に配置されるもので、透過型の偏光部材１２と、その射出面側に形成された位相変調部１３とを備える。偏光部材１２は、複屈性性部材からなり、例えば水晶を用いる場合、結晶軸に対して位相差と角度をつけてカットして表面研磨することにより作成される。
【００５３】
そして、例えば、入射光の波長に対して１／２波長の位相差をつけた偏光部材１２は、入射光の直線偏光を任意の角度だけ回転させた直線偏光に変換して射出させることができる。また、入射光の波長に対して１／４波長の位相差をつけた偏光部材１２は、入射光の直線偏光を円偏光に変換して射出させることができる。また、入射光の偏光面に対して結晶軸の方向を適切に設定することにより、中間の楕円偏光への変換も可能である。なお、偏光部材１２は、水晶に限らず、液晶やフォトニック結晶等の他の複屈折性部材を用いて構成することもできる。また、この他グランプリズムなども偏光制御素子として利用可能であり、ファラデー効果により偏光方向を電気的に制御できる電気光学結晶も当然利用可能である。
【００５４】
位相変調部１３は、上記の偏光部材１２の射出側表面を、図２１と同様に、光軸の周りを軸対称に、例えば８領域に分割し、その軸対称の領域で刺激光の波長λ２に対して１／８ずつ位相が異なるように、例えば、段階的に厚みを変えた光学薄膜をコーティングしたり、段階的に深さの異なるエッチングを施したりして、段差を有して形成する。
【００５５】
このような偏光制御素子１１に直線偏光の刺激光を入射させると、刺激光は、偏光部材１２により偏光状態が変換され、さらに、位相変調部１３により波面が光軸対称の位相分布を持つように空間変調されて射出される。例えば、偏光部材１２が１／４波長板で構成された偏光制御素子１１に、直線偏光の刺激光を透過させると、偏光状態が円偏光に変換されると同時に、波面が光軸対称の位相分布を持つようになる。
【００５６】
したがって、非特許文献２に示されているように、この偏光制御素子１１を透過した刺激光を、高開口数の顕微鏡対物レンズにより集光しても、ビーム中央で電場強度が完全に相殺された理想的な輪帯のビームを形成することができる。しかも、偏光制御素子１１を回転させて、偏光部材１１による偏光状態を調整する際、位相変調部１３も一体に回転するので、刺激光は軸ずれすることなく、常に軸対称の位相変調部１３の中央を通過することになる。これにより、超解像顕微鏡として理想的な、軸対称の強度分布をもつ輪帯状の刺激光を集光させることが可能となる。
【００５７】
図２（ａ）および（ｂ）は、偏光制御素子の第２例の構成を模式的に示す断面図および平面図である。この偏光制御素子２１は、励起光と刺激光との共通光路に配置されるもので、透過型の偏光部材２２と、その入射面側の表面に形成された位相変調部２３とを備える。偏光部材２２は、図１の偏光部材１２と同様に、例えば刺激光の偏光状態を変換するように形成する。また、位相変調部２３は、偏光部材２２の入射側表面を、励起光および刺激光の円形瞳面内で同心円状に、例えば２つの領域に分割し、その円形瞳面の中央部分に相当する領域を変調領域２３ａとして、該変調領域２３ａに多層膜２４をコートして形成する。ここでは、多層膜２４は、励起光に対して反射作用を有する光学反射膜として機能する。
【００５８】
図２（ａ）に示すように、多層膜２４は、励起光に対して屈折率が異なる第１物質２５（屈折率ｎａ(λ)）と第２物質２６（屈折率ｎｂ(λ)）とを、偏光部材２２上にバッファ層２７を介して交互に蒸着により積層して構成する。これら第１物質２５および第２物質２６は、それぞれの膜厚をｄａおよびｄｂとすると、励起光に対して光学反射膜として機能させる場合は、励起光の波長λ１に対して、例えば、光路長がλ１／４であればよいので、下記（１）式を満たせばよい。
【００５９】
ｄａｎａ(λ１)＝λ１／４，ｄｂｎｂ(λ１)＝λ１／４ （１）
【００６０】
この条件で設計された多層膜２４は、励起光と波長が異なる刺激光については干渉条件から外れるので、刺激光は反射させずに通過させる。その際、刺激光は位相遅れを受ける。すなわち、多層膜２４は、刺激光に対しては位相を空間変調する作用を有し、位相板として機能する。したがって、この場合、多層膜２４を通過した刺激光と、通過しない刺激光とを比較すると、同じ瞳面で下記（２）式により示される位相差δが発生する。なお、（２）式において、λ２は、刺激光の波長を示し、ｍは第１物質２５と第２物質２６とを対とする総対数を示す。
【００６１】
δ＝ｍ｛ｄａｎａ(λ２)＋ｄｂｎｂ(λ２)｝−ｍ（ｄａ＋ｄｂ） （２）
【００６２】
ここで、位相差δが、下記の（３）式を満たす場合は、多層膜２４を通過した刺激光の波面と、それ以外の領域を通過した刺激光の波面とを比較すると、図３に示すように、電場振幅において完全に同じ振幅で符号が反転する。なお、（３）式において、Ｌは、整数を示す。
【００６３】
δ＝（２Ｌ＋１）λ２／２ （３）
【００６４】
したがって、瞳面内において、多層膜２４を通過しない刺激光と、通過した刺激光との光量が同じであれば、瞳面内を通過した刺激光を集光すると、焦点において完全に電場強度が相殺される。すなわち、焦点面において、干渉により光強度が存在しない、つまり光強度の極小値を有するドーナッツ形状の集光ビームが得られる。これは、例えば、特許第3993553号公報に開示されている輪体型の位相板と同等の機能をもつ。
【００６５】
これに対し、励起光は、多層膜２４を有する領域では反射され、多層膜４以外の領域を通過する。この場合は、例えば、Y.Iketaki,et.al.Opt.Lett.,19(1994)1804-1806.に開示されているように、光強度の極大値を有する通常の集光ビームが得られる。
【００６６】
したがって、図２に示した偏光制御素子２１に、同じ瞳径の励起光と刺激光とを同軸に入射させて、その透過光を集光させれば、刺激光は、集光点を含む近傍領域において、少なくとも光軸方向に中空部を有する中空パターン状（ドーナッツ形状）のビーム形状、より具体的には、カプセル状（３次元的なダークホール形状）または管状（マカロニ状）に集光させることができ、励起光は通常の集光ビームの形状で集光させることができる。しかも、励起光および刺激光は、同じ空間点に集光するので、超解像顕微鏡における最大の課題である励起光と刺激光との光学調整を省くことができる。
【００６７】
なお、偏光制御素子２１に励起光および刺激光を入射させるには、励起光および刺激光を同じシングルモードファイバから取り出し、これを色収差の無いレンズでコリメートして入射させるように、照明光学系を構成するのが好ましい。このように照明光学系を構成すれば、以下のような効果が期待できる。
【００６８】
（１）励起光および刺激光を、シングルモードファイバから取り出すので、これらを完全球面波とすることができる。したがって、色収差の無いレンズでコリメートすれば、波面収差の無い完全な平面波を得ることができるので、偏光制御素子２１において位相変調をより確実に行うことが可能となる。
（２）励起光および刺激光を、シングルモードファイバから取り出して、色収差のないレンズでコリメートすることにより、偏光制御素子２１が多少傾いて配置されたり、偏光制御素子２１の偏光部材２２の平行度が悪かったりした場合でも、色収差のない光学系を用いて集光すれば、試料上に同じ空間ポイントで結像させることができ、ビームずれを解消できる。
（３）シングルモードファイバの射出口は、機械的に固定されるので、励起光および刺激光の集光点の位置が空間的に変動しない、極めて機械的に安定な照明光学系を構築することができる。
【００６９】
なお、位相変調部２３は、同心円状の２領域の中央領域に多層膜２４を形成する構成に限らず、位相型のフレネルゾーンプレートのように、さらに多くの輪体状の領域を形成して、多層膜２４を有する変調領域２３ａを２領域以上形成することもできる。
【００７０】
ところで、上述したように、偏光制御素子１１の多層膜２４を通過した刺激光と、それ以外の領域を通過した刺激光とが、電場振幅において完全に同じ振幅で符号が反転している場合、焦点面においてドーナッツ形状の集光ビームを得るには、多層膜２４を通過しない刺激光と通過した刺激光との光量が等しいことが必要条件である。具体的には、瞳面に入射する刺激光の強度が均一であるならば、多層膜２４の面積をＳＡ、全瞳面の面積をＳ０とすると、下記の（４）式を満たす必要がある。
【００７１】
ＳＡ＝Ｓ０／２ （４）
【００７２】
特に、図２（ｂ）に示した、瞳の形状が半径Ｒの円形で、多層膜２４を形成する変調領域２３ａも半径ρの円形である場合は、（４）式から、Ｒ／ρは、２１／２となる。しかしながら、これは限定された最適条件である。つまり、瞳および変調領域２３ａの形状やサイズが調整できる場合は、「変調領域２３ａを通過した刺激光とそれ以外の領域を通過した刺激光とは、電場振幅において完全に同じ振幅で符号が反転している」と言う条件は、絶対的なものではなく、「変調領域２３ａを通過した刺激光とそれ以外の領域を通過した刺激光とは、符号が反転している」と言う極めて広い最適条件が提示できる。
【００７３】
ここで、刺激光の電場の最大振幅をＥｅとし、多層膜２４による位相遅れ角をδｅとする。この場合、多層膜２４を通過した刺激光とそれ以外の領域を通過した刺激光との振幅を同じ瞳面で調べると、多層膜２４を通過した刺激光の振幅強度Ｅinは、下記の（５）式で表される。なお、下式において、ωｅは刺激光の周波数、上部に右矢印を付して示すｋｅおよびｒｅは、それぞれ波数ベクトルおよび位置ベクトルである。
【００７４】
【数１】
【００７５】
一方、変調領域２３ａ外を通過した刺激光の振幅強度Ｅoutは、下記の（６）式で表される。
【００７６】
【数２】
【００７７】
上記（５）式と（６）式とを比較すると、δｅだけ位相がずれている。したがって、ＥinおよびＥoutは、Ｅｅから−Ｅｅの間で任意の値をとるので、δｅの値によって、符号が異なる値をとることになる。特に、上記（３）式の場合は、振幅の絶対値も同じになる特別な場合である。
【００７８】
以上のことから、ＥinおよびＥoutは、符号が異なれば、上記（４）式の条件に限らず、下記の（７）式で示されるより広い条件となる。
【００７９】
（Ｓ０−ＳＡ）Ｅout＋ＳＡＥin＝０ （７）
【００８０】
すなわち、（７）式の条件で、Ｓ０とＳＡとの比率や位相差δを調整することで、刺激光の焦点における電場を相殺し、ゼロとすることができる。
【００８１】
したがって、ＥinとＥout との符号が異なれば、必ずしも（３）式の条件を満たさずとも、Ｓ０とＳＡとの比率の調整で（７）式の条件を実現することができる。具体的には、多層膜２４の面積ＳＡの調整で可能であるが、瞳径全体の面積Ｓ０をアイリスにより調整して対応することも可能であり、従来法と比較しても、ゆるい調整で超解像を実現することが可能となる。
【００８２】
以上、刺激光に対する偏光制御素子２１の条件について説明したが、励起光に対しても、更に広い適用条件を提示することが可能である。
【００８３】
図４は、偏光制御素子の第３例の光学的特性を示す図である。この偏光制御素子３１は、図２に示した構成において、偏光部材２２上の多層膜２４を、励起光に対して透過型の位相板として機能させるように構成したものである。
【００８４】
図４において、励起光の電場の最大振幅をＥｐとし、多層膜２４による位相遅れ角をδｐとする。この場合、多層膜２４を通過した励起光とそれ以外の領域を通過した励起光との振幅を同じ瞳面で調べると、多層膜２４を通過した励起光の振幅強度Ｅinは、下記の（８）式で表される。なお、下式において、ωｐは励起光の周波数、上部に右矢印を付して示すｋｐおよびｒｐは、それぞれ波数ベクトルおよび位置ベクトルである。
【００８５】
【数３】
【００８６】
一方、多層膜２４の外を通過した励起光の振幅強度Ｅoutは、下記の（９）式で表される。
【００８７】
【数４】
【００８８】
上記（８）式と（９）式とを比較すると、刺激光の場合と同様に、δｐだけ位相がずれている。したがって、ＥinおよびＥoutは、Ｅｐから−Ｅｐの間で任意の値をとるので、励起光の場合は、δｐの値を調整して、同じ符号の値をとるように設定する。
【００８９】
この場合、図４に示すように、多層膜２４を通過した励起光と、それ以外の領域を通過した励起光とは、同じ極性を持つので、集光した際に、刺激光とは異なり電場は相殺されずに加算される。結果として、この場合は、焦点で強度を有するガウス型の集光スポットが得られる。すなわち、多層膜２４を設計する際、δｐとδｅとを調整して、励起光では同極性とし、刺激光では異なる極性とすればよい。具体的には、励起光と刺激光とは、波長が異なるので、多層膜２４における屈折率も異なる。したがって、屈折率差を利用して、層数や厚みを最適化する。例えば、吸収端近傍の異常分散が強いような波長領域において、励起光と刺激光との屈折率差が十分大きい透明な物質を用いることで、多層膜にせずとも１層で上記と同じ効果をもつ、最も単純な偏光制御素子を構成可能である。
【００９０】
図５は、偏光制御素子の第４例を説明するための図で、図５（ａ）は、偏光制御素子の概略構成を示す平面図、図５（ｂ）は、その光学特性を説明するための図である。この偏光制御素子４１は、図４に示した構成において、偏光部材２２上の入射光束の全領域を変調領域２３ａとし、この変調領域２３ａを光軸の周りに複数領域、ここでは図１の場合と同様に８領域に分割して、その８領域に刺激光波長λ２に対して、λ２／８ずつ位相が異なるように、多層膜２４を形成したものである。ここで、多層膜２４は、図５（ｂ）に、励起光および刺激光の位相分布を模式的に示すように、励起光に対しては、図４の場合と同様に、同相で透過させ、刺激光に対しては、位相分布が２πで周回するラゲール・ガウシアンビームとなるように全体を位相変調するように構成する。
【００９１】
図５に示した偏光制御素子４１を用いて、この偏光制御素子４１を透過した励起光および刺激光を顕微鏡対物レンズにより試料上に集光すれば、第３例の場合と同様に、光量ロスを生じることなく、集光面上で、励起光については光軸上に光強度が最大値を有するスポットを形成でき、刺激光については光軸上に光強度が極小値を有する中空状のスポットを形成することができる。
【００９２】
図６は、偏光制御素子の第５例の概略構成を示す断面図である。この偏光制御素子５１は、反射型のもので、第２〜４例の場合と同様に、励起光と刺激光との共通光路に配置される。図６に示す偏光制御素子５１は、プリズム部材５２と、その入射面５２ａに形成された位相変調用の多層膜５３と、射出面５２ｂに形成された偏光部材５４と、反射面５２ｃに形成された反射膜５５とを備える。プリズム部材５２は、例えばガラスで構成する。偏光部材５４および多層膜５３は、第２〜４例に示した偏光部材および多層膜を適宜組み合わせて構成する。また、反射膜５５は、例えばアルミニウム膜で構成する。
【００９３】
図６に示す偏光制御素子５１は、プリズム部材５２の入射面５２ａから入射する励起光（波長λ１）および刺激光（波長λ２）を、反射面５２ｃで反射させて９０度偏向して射出面５２ｂから射出させる。その際に、入射面５２ａに設けた多層膜５３により、刺激光を集光面においてドーナッツ形状の集光ビームが得られるように位相変調し、さらに、射出面５２ｂに設けた偏光部材５４により刺激光の偏光状態を所定の偏光状態に変換する。
【００９４】
このような反射型の偏光制御素子５１を用いれば、超解像顕微鏡を構成する部品のレイアウトの自由度を向上することが可能となる。なお、図６において、偏光部材５４は、プリズム部材５２の反射面５２ｃに設けることもできる。また、プリズム部材５２自体を、水晶、液晶あるいはフォトニック結晶等の複屈折性部材により形成して、該プリズム部材５２に刺激光の偏光状態を変換する偏光機能と、励起光および刺激光の光路を９０度偏向する偏向機能とを持たせることもできる。
【００９５】
以上のように、偏光部材と位相変調部とを一体化して偏光制御素子を構成することにより、超解像顕微鏡に組み込んだ場合に、偏光制御素子のみを回転調整や芯出し調整するだけで、光軸のチルトやシフトの発生を抑えて、刺激光の中空部と励起光の頂点部とを焦点面上で約３０ｎｍの精度で容易に一致させることが可能となり、超解像効果を容易に誘導することが可能となる。また、偏光部材および位相変調部を一つの光学部材である偏光制御素子として、簡単かつ安価にできる。なお、上記の第１例においては、位相変調部１３を偏光部材１２の入射面側に形成してもよい。また、第３〜５例においては、多層膜を射出面側に形成してもよい。ただし、図６の第５例において、多層膜５３が励起光を反射させる場合は、図６に示したように、多層膜５３をプリズム部材５２の入射面５２ａに形成する。また、第２〜５例において、偏光部材は、励起光の偏光状態を変換するように構成することもできる。さらに、第２〜５例の偏光制御素子は、刺激光の単独光路に配置することも可能である。この場合、当然のことながら、励起光に対する条件は不要となる。
【００９６】
以下、上述した偏光制御素子を用いる本発明に係る超解像顕微鏡の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００９７】
（第１実施の形態）
図７は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、蛍光色素で染色された試料を観察するもので、光源部を構成する励起光用光源６１および刺激光用光源６２を備える。励起光用光源６１から射出される励起光は、ダイクロイックミラー６３で反射された後、偏光ビームスプリッタ６４を透過する。そして、２枚のガルバノミラー６５および６６により２次元方向に揺動走査されて、瞳投影レンズ系６７を経て顕微鏡対物レンズ６８により観察試料７０に集光される。なお、図１では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー６５，６６を同一平面内で揺動可能に示している。
【００９８】
一方、刺激光用光源６２から射出される刺激光は、偏光制御素子７１を透過してダイクロイックミラー６３に入射される。そして、ダイクロイックミラー６３を透過して、励起光用光源６１からの励起光とほぼ同軸に合成された後、偏光ビームスプリッタ６４を透過し、さらにガルバノミラー６５および６６により２次元方向に揺動走査されて、瞳投影レンズ系６７を経て顕微鏡対物レンズ６８により観察試料７０に集光される。
【００９９】
また、観察試料７０からの光は、顕微鏡対物レンズ６８でコリメートされ、瞳投影レンズ系６７、ガルバノミラー６６および６５を経て偏光ビームスプリッタ６４に入射される。そして、偏光ビームスプリッタ６４で所要の偏光成分が反射された後、蛍光分離フィルタ７５により蛍光が取出（透過）され、その透過した蛍光が集光レンズ７６および共焦点ピンホール７７を経て、検出部を構成する光電子増倍管からなる光検出器７８で受光される。
【０１００】
図７に示す超解像顕微鏡は、顕微鏡対物レンズ６８の瞳面を、瞳投影レンズ系６７によりガルバノミラー６５，６６間に投影して共役瞳面６９を形成し、これにより瞳面６９を軸にしてガルバノミラー６５，６６による照明光の空間走査が行われる。
【０１０１】
本実施の形態では、説明の便宜上、ローダミン６Ｇのようなキサンチン系の色素で染色された試料を観察するものとする。このため、励起光用光源６１は、例えば、Ｎｄ：ＹＶＯ４固体レーザを用い、その発振波長１０６４ｎｍの２倍波（波長５３２ｎｍ）を励起光（ポンプ光）とする。また、刺激光用光源６２は、例えば、Ｋｒレーザを用い、その発振波長６４７．１ｎｍを刺激光（イレース光）とする。
【０１０２】
また、偏光制御素子７１は、例えば図１に例示した第１例の構成とする。ここでは、偏光制御素子７１の偏光部材７２を、イレース光に対して１／４波長板として機能するように構成する。これにより、刺激光用光源６２からの直線偏光のイレース光を、所定の偏光回転方向の円偏光に変換し、その円偏光に変換されたイレース光を位相変調部７３で位相変調する。この場合、偏光部材７２は、厚さ２ｍｍ程度であるのに対し、位相変調部７３を構成する光学薄膜やエッチングによる段差の高さは、高々１μｍ程度である。したがって、位相変調部７３が、偏光部材７２による偏光機能に何ら支障を及ぼすことはない。
【０１０３】
なお、偏光制御素子７１は、２枚のガルバノミラー６５，６６間に位置する共役瞳面６９に配置するのが理想的であるが、ガルバノミラー６５，６６の間隔は、実際には５ｍｍ程度で、配置するのが困難である。しかし、偏光制御素子７１は、入射側のガルバノミラー６５の手前のイレース光の光路中であれば、任意の位置に配置しても、事実上、結像性能の劣化は殆ど発生しない。
【０１０４】
また、励起光用光源６１から射出されるポンプ光は、直線偏光、あるいは、図示しない偏光部材により偏光制御素子７１によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光に変換して顕微鏡対物レンズ６８により集光する。
【０１０５】
本実施の形態によれば、偏光部材７２と位相変調部７３とが一体化された偏光制御素子７１を用いるので、該偏光制御素子７１を、例えば位相変調部７３の中心がイレース光の光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、イレース光を所定の偏光回転方向の円偏光に変換して変調することができる。これにより、ポンプ光およびイレース光を高開口数の顕微鏡対物レンズ６８により集光した際に、集光面上で、イレース光を光軸方向の電場成分が相殺された対称なドーナッツビームとすることができる。また、イレース光の光軸チルトやシフトを生じることなく、該イレース光の中空部とポンプ光の頂点部とを約３０ｎｍの精度で容易に一致させることができ、超解像効果を発現することができる。また、特に、ポンプ光の偏光状態を、偏光制御素子７１によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光とした場合は、ランダムに分散している分子の蛍光を平均化して検出できるという効果が得られる。
【０１０６】
（第２実施の形態）
図８は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット８０、スキャンユニット９０および顕微鏡ユニット１００を有しており、スキャンユニット９０および顕微鏡ユニット１００は、瞳投影レンズ系１１０を介して光学的に結合されている。
【０１０７】
光源ユニット８０は、光源部を構成するもので、励起光用光源８１、刺激光用光源８２、ダイクロイックプリズムや偏光プリズムからなるビームコンバイナ８３、ファイバ集光レンズ８４、シングルモードファイバ８５およびファイバコリメータレンズ８６を有している。励起光用光源８１から射出される励起光（ポンプ光）および刺激光用光源８２から射出される刺激光（イレース光）は、ビームコンバイナ８３でほぼ同軸に合成された後、ファイバ集光レンズ８４を経て同一のシングルモードファイバ８５にほぼ同軸に入射され、これによりシングルモードファイバ８５の射出口から放射立体角が揃えられた完全球面波として射出される。シングルモードファイバ８５から射出されるポンプ光およびイレース光は、色収差のないファイバコリメータレンズ８６で平面波に変換されて、スキャンユニット９０に導入される。
【０１０８】
本実施の形態では、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察するため、励起光用光源８１は、例えば連続波を射出するＨｅ−Ｎｅレーザを用い、その波長５４３ｎｍの発振線をポンプ光とする。また、刺激光用光源８２は、例えば連続波を射出するＨｅ−Ｎｅレーザを用い、その波長６３３ｎｍの発振線をイレース光とする。したがって、後述の偏光制御素子を含む光学系は、これらの波長に対して最適化したものとする。
【０１０９】
スキャンユニット９０は、光源ユニット８０から射出されるポンプ光およびイレース光を、偏光ビームスプリッタ９１を通過させた後、走査光学系である２枚のガルバノミラー９２および９３により２次元方向に揺動走査して、瞳投影レンズ系１１０を介して顕微鏡ユニット１００に入射させる。
【０１１０】
顕微鏡ユニット１００は、スキャンユニット９０から瞳投影レンズ系１１０を介して入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム１０１で反射させて、顕微鏡対物レンズ１０２によりローダミン６Ｇ色素で染色された観察試料１０３上に集光させる。また、観察試料１０３で発光した蛍光は、顕微鏡対物レンズ１０２でコリメートしてハーフプリズム１０１で反射させることにより、瞳投影レンズ系１１０を経てスキャンユニット９０に戻すと同時に、ハーフプリズム１０１を通過する蛍光の一部は、蛍光像として目視観察できるように接眼レンズ１０４に導く。なお、顕微鏡対物レンズ１０２は、その鏡筒も含めて示している。
【０１１１】
また、スキャンユニット９０は、顕微鏡ユニット１００から瞳投影レンズ系１１０を経て入射する蛍光を、往路とは逆の経路を辿って偏光ビームスプリッタ９１で所要の偏光成分を分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ９４、ピンホール９５を、ノッチフィルタ９６および９７を経て、検出部を構成する光電子増倍管からなる光検出器９８で受光する。
【０１１２】
なお、ピンホール９５は、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものであり、ノッチフィルタ９６および９７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。
【０１１３】
図８に示す超解像顕微鏡は、図７と同様に、顕微鏡対物レンズ１０２の瞳面を、瞳投影レンズ系１１０によりスキャンユニット９０内のガルバノミラー９２，９３間に投影して共役瞳面を形成し、これにより瞳面を軸にしてガルバノミラー９２，９３による照明光の空間走査が行われる。
【０１１４】
本実施の形態では、ポンプ光とイレース光との共通光路で、顕微鏡ユニット１００内の瞳面またはその近傍に、図４に例示した構成を有する偏光制御素子１０５と、ビーム径を制限するアイリス（可変絞り）１０８とを設置する。
【０１１５】
偏光制御素子１０５は、偏光部材１０６がイレース光に対して１／４波長板として機能するように構成する。また、多層膜１０７は、図２に示したバッファ層２７として波長５３２ｎｍでの屈折率が１．５２のＳｉＯ２を厚さ５３２．７ｎｍコートし、このバッファ層２７上に、波長５３２ｎｍでの屈折率が２．１６のＴａＯ５と、波長５３２ｎｍでの屈折率が１．５２のＳｉＯ２とを、ＴａＯ５については厚さ６２．８ｎｍ、ＳｉＯ２については厚さ８９．９ｎｍで、交互に１１層まで蒸着により積層して構成する。この多層膜１０７は、ポンプ光に対しては、透明部材として機能し、イレース光に対しては、位相を１／２波長（π）だけ遅延させる位相変調素子として機能する。
【０１１６】
そして、偏光制御素子１０５を、光軸に対して直交する平面内で回転調整して配置することにより、イレース光ビームを所定の偏光回転方向の円偏光に変換するとともに、イレース光の位相を空間変調し、この空間変調されたイレース光と、空間変調を受けないポンプ光とを、アイリス１０８を経て色収差の無い顕微鏡対物レンズ１０２により試料１０３上に集光させる。
【０１１７】
また、偏光制御素子１０５を通過したポンプ光およびイレース光は、集光面でイレース光を完全な中空ビームとするために、アイリス１０８でビーム径を調整する。すなわち、瞳面における強度分布が均一であれば、図２に示したように、瞳の形状が半径Ｒの円形で、変調領域２３ａも半径ρの円形であれば、上記（４）式を満たすには、Ｒ／ρが２１／２となる。しかし、一般のレーザ走査型顕微鏡は、ビームの強度分布が均一でなく、ガウス状の分布をもつ。したがって、完全な中空ビームを形成するためには、上記（７）式に準じて、Ｒ／ρを調整する必要がある。そのため、瞳面の直後に設けたアイリス１０８でビーム外径を調整して、Ｒ／ρの最適化を図る。さらに、アイリス１０８は、偏光制御素子１０５の多層膜１０７を透過するイレース光の位相遅れ誤差も調整可能である。
【０１１８】
なお、励起光用光源８２から射出されるポンプ光は、直線偏光、あるいは、図示しない偏光部材により、偏光制御素子１０５によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光に変換してビームコンバイナ８３に入射させる。
【０１１９】
このように、本実施の形態では、イレース光とポンプ光とを、同軸に合成した後、偏光制御素子１０５に入射させている。したがって、例えば、偏光制御素子１０５をその中心が光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、光軸チルトやシフトを生じることなく、偏光制御素子１０５の偏光部材１０６によりイレース光を所定の偏光回転方向の円偏光に変換し、さらに、多層膜１０７を通過したイレース光と、通過しないイレース光との間で、相対的に位相をほぼπだけ遅延させて、イレース光の中空ビームをポンプ光と同軸で形成することができる。しかも、偏光制御素子１０５では、イレース光の光量ロスが生じないので、刺激光用光源８２から射出するイレース光の光パワーを必要最小限として、顕著な超解像効果を誘導することができる。さらに、ポンプ光の偏光状態を、偏光制御素子１０５によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光とした場合は、ランダムに分散している分子の蛍光を平均化して検出できるという効果が得られる。
【０１２０】
また、偏光制御素子１０５およびアイリス１０８は、顕微鏡ユニット１００内の瞳面またはその近傍に配置され、その共役瞳面またはその近傍にガルバノミラー９２，９３を配置して、ポンプ光およびイレース光を空間走査するので、走査による波面収差の発生を抑えることができる。したがって、超解像顕微鏡性能を左右するイレース光の集光形状を乱すことなく、広い視野で高い結像性能を保つことができるとともに、観察試料１０３上ではポンプ光およびイレース光を常に同軸上で集光でき、顕著な超解像効果を誘導することができる。
【０１２１】
さらに、光源ユニット８０においては、励起光用光源８１から射出されるポンプ光および刺激光用光源８２から射出されるイレース光を、ビームコンバイナ８３で合成した後は、いずれの光もデリバリすることなく、同一光学系、すなわちファイバ集光レンズ８４およびシングルモードファイバ８５を経て射出させている。しかも、シングルモードファイバ８５から射出される完全球面波のポンプ光およびイレース光を、ファイバコリメータレンズ８６により同じ条件でコリメートしている。したがって、面倒な光学調整を要することなく、ポンプ光およびイレース光を、波面収差を与えることなく、同じダイバージェンス（ビーム広がり）で顕微鏡対物レンズ１０２により観察試料１０３の全く同じ結像点に集光させることができる。
【０１２２】
（第３実施の形態）
図９は、本発明の第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、図８に示した超解像顕微鏡において、光源ユニット８０を、１台のレーザ光源８７を用い、このレーザ光源８７から射出されるレーザ光を、ファイバ集光レンズ８４、シングルモードファイバ８５およびファイバコリメータレンズ８６を経てスキャンユニット９０に導入するようにしたものである。
【０１２３】
ここで、レーザ光源８７は、例えば、マルチラインで発振するＨｅ−Ｎｅレーザを用い、波長５４３ｎｍの発振線をポンプ光として用い、波長６３３ｎｍの発振線をイレース光として用いる。その他の構成および動作は、第２実施の形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。
【０１２４】
本実施の形態によれば、１台のＨｅ−Ｎｅレーザから、ポンプ光とイレース光とを同時に取り出すことができるので、第２実施の形態におけるよりも構成を簡略化できるとともに、第２実施の形態では必要となる、ポンプ光とイレース光との光軸を調整してシングルモードファイバ８５に導入する作業を省くことができ、調整もより簡単にできる。その他の作用効果については、第２実施の形態と同様であるので、説明を省略する。
【０１２５】
（第４実施の形態）
本発明の第４実施の形態に係る超解像顕微鏡は、上述した第１〜３実施の形態のいずれかの構成において、偏光制御素子の偏光部材をイレース光に対して１／２波長板として機能するように構成する。そして、観察試料に集光するイレース光を直線偏光として、その直線偏光の方向を偏光制御素子の偏光部材で調整する。すなわち、図７に示した構成においては、偏光制御素子７１の偏光部材７２を１／２波長板により構成し、図８または図９に示した構成においては、偏光制御素子１０５の偏光部材１０６を１／２波長板により構成する。
【０１２６】
そして、観察試料に対して、ポンプ光を直線偏光として集光させるとともに、偏光制御素子を、光軸に対して直交する平面内で回転調整して、イレース光の直線偏光を、ポンプ光の直線偏光の方向と一致させて観察試料に集光させる。
【０１２７】
このように、観察試料に集光されるポンプ光とイレース光とを、偏光方向が一致した直線偏光とすれば、特に、ローダミン６Ｇのような色素の蛍光を検出する場合は、蛍光抑制効果を最大に発揮でき、良好な超解像効果を誘導することができる。
【０１２８】
上述した各実施の形態は、ポンプ光とイレース光とを重ね合わせて観察試料に集光して、観察試料上で円形のポンプ光スポットと、中空のイレース光スポットとを形成し、これによりイレース光の照射領域の蛍光強度を抑制して蛍光抑制効果を発現させ、ポンプ光のみが照射された超解像領域から発光する蛍光を光検出器で検出するようにしている。すなわち、ポンプ光およびイレース光の照射により発光する蛍光の総量を検出するようにしている。
【０１２９】
しかし、超解像効果を誘導する蛍光抑制効果は、上記の場合に限らず、分光学的な手法を導入して発現することも可能である。このような手法に利用可能な色素として、近年、特定の波長の光を照射すると、蛍光スペクトルが変化する、所謂、光活性型の色素が知られている。特に、有名な光活性型の色素として、「Kaede」と呼ばれる蛍光タンパクが存在する。
【０１３０】
この「Kaede」は、紫外光が照射されると蛍光波長が長波長側にレッドシフトする。図１０は、「Kaede」の紫外光照射前後の分光スペクトルを示す図で、図１０（ａ）は紫外光照射前の分光スペクトル、図１０（ｂ）は波長３５５ｎｍの紫外光が照射された後の分光スペクトルをそれぞれ示す。また、図１０（ａ），（ｂ）において、実線は発光スペクトルを示し、破線は吸収スペクトルを示す。
【０１３１】
図１０から明らかなように、「Kaede」は、紫外光が照射される前は、波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍの帯域に発光スペクトルを有しているが、波長３５５ｎｍの紫外光が照射されると、中心蛍光波長が５８０ｎｍ付近にレッドシフトする。しかも、注目すべきことは、短波長側の５００ｎｍ〜５５０ｎｍの波長帯域の蛍光成分が消失する。したがって、この場合は、例えば、波長４８８ｎｍの可視光を励起光とし、波長３５５ｎｍの紫外光を刺激光として、これらを上記実施の形態と同様の構成により観察試料に照射し、励起光のみが照射された領域から発生する短波長側の蛍光を、分光器あるいは光学フィルタを介して計測すれば、同様に超解像効果を発現することができる。以下、この場合の一例の構成を、本発明の第５実施の形態として図１１を参照して説明する。
【０１３２】
（第５実施の形態）
図１１は、本発明の第５実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、光源部を構成する励起光用光源１２１および刺激光用光源１２２を備える。励起光用光源１２１から射出される励起光は、図７の場合と同様に、ダイクロイックミラー１２３で反射された後、偏光ビームスプリッタ１２４を透過する。そして、２枚のガルバノミラー１２５および１２６により２次元方向に揺動走査されて、瞳投影レンズ系１２７および顕微鏡対物レンズ１２８を経て、「Kaede」により染色された観察試料１３０に集光される。
【０１３３】
一方、刺激光用光源１２２から射出される刺激光は、偏光制御素子１３１を透過してダイクロイックミラー１２３に入射される。そして、ダイクロイックミラー１２３を透過して、励起光用光源１２１からの励起光とほぼ同軸に合成された後、ガルバノミラー１２５および１２６により２次元方向に揺動走査されて、瞳投影レンズ系１２７を経て顕微鏡対物レンズ１２８により観察試料１３０に集光される。
【０１３４】
また、観察試料１３０からの光は、顕微鏡対物レンズ１２８でコリメートされ、瞳投影レンズ系１２７、ガルバノミラー１２６および１２５を経て偏光ビームスプリッタ１２４に入射される。そして、偏光ビームスプリッタ１２４で所要の偏光成分が反射された後、蛍光分離フィルタ１３５により蛍光が取出（透過）され、その透過した蛍光が集光レンズ１３６および分光器１３７を経て、検出部を構成する光電子増倍管からなる光検出器１３８で受光される。
【０１３５】
分光器１３７は、波長帯域選択部を構成するもので、入射側の共焦点ピンホール１４１、射出側ピンホール１４２、２枚の反射ミラー１４３，１４４および反射型の回折格子１４５を備える。この分光器１３７は、共焦点ピンホール１４１から入射した蛍光を、反射ミラー１４３を経て回折格子１４３で反射させて回折させ、その回折光を反射ミラー１４４を経て射出側ピンホール１４２から射出するもので、回折格子１４５への入射光の入射角度および射出側ピンホール１４２の径を適切に調整することにより、所望の波長帯域の蛍光を取り出すことが可能である。
【０１３６】
本実施の形態では、「Kaede」から発生される蛍光を観測するため、励起光用光源１２１は、例えば、Ａｒレーザを用い、その発振波長４８８ｎｍを励起光とする。また、刺激光用光源１２２は、例えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザを用い、その発振波長１０６４ｎｍの３倍波（波長３５５ｎｍ）を刺激光とする。
【０１３７】
偏光制御素子１３１は、例えば図１に例示した第１例の構成とする。ここでは、偏光制御素子１３１の偏光部材１３２を、刺激光に対して１／４波長板として機能するように構成する。そして、この偏光制御素子１３１を、光軸に対して直交する平面内で回転調整して配置することにより、刺激光用光源１３２からの直線偏光の刺激光を、所定の偏光回転方向の円偏光に変換し、その円偏光に変換された刺激光を位相変調部１３３で位相変調して、観察試料１３０上で励起光と同軸の中空の刺激光スポットを形成する。
【０１３８】
また、分光器１３７は、波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍの帯域の蛍光が通るように、回折格子１４５の入射光に対する角度および射出側ピンホール１４２の径を適切に調整する。なお、励起光用光源１２１から射出される励起光は、直線偏光、あるいは、図示しない偏光部材により偏光制御素子１３１によるイレース光の偏光回転方向とは反対方向の円偏光に変換して顕微鏡対物レンズ１２８により集光する。
【０１３９】
本実施の形態によると、観察試料１３０上で刺激光の中空スポットが照射された領域の蛍光はレッドシフトされるので、分光器１３７で遮断される。これに対し。刺激光の中空スポットの中央領域は、励起光のみが照射されるので、その中央領域から発生する波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍの蛍光が、分光器１３７で分光されて光検出器１３８で受光される。これにより、蛍光抑制効果が誘導される。しかも、この刺激光の中空スポットの中央領域は、励起光の集光サイズよりも小さいので、超解像効果を得ることができる。したがって、煩雑な調整作業を要することなく、例えば、偏光制御素子１３１を、上述した実施の形態と同様に、その中心が光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、超解像効果を容易に誘導することができる。
【０１４０】
なお、図１１では、波長帯域選択部を分光器１３７を用いて構成して、波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍの帯域の蛍光を選択するようにしたが、分光器１３７に代えてバンドパスフィルタを用いることもできる。また、偏光制御素子１３１の偏光部材１３２は、１／４波長板に限らず、１／２波長板として、刺激光を所定の方向の直線偏光に調整して観察試料１３０に照射するように構成することもできる。すなわち、「Kaede」のような分子は、分子独自の配向性を有しており、特に、分子軸に対して特定の方向に直線偏光した紫外光が入射した場合に、レッドシフトが効率的に起きる。このように、蛍光色素分子が極めて強い偏光依存性を有する場合は、刺激光の形状の対称性よりも分子の異方性を優先させて、特定の方向に直線偏光した刺激光を集光させることにより、蛍光抑制効果が最大に発揮されたより顕著な超解像効果を誘導することもできる。
【０１４１】
（第６実施の形態）
図１２は、本発明の第６実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、顕微鏡対物レンズ１５１の物体側（先端）に内視鏡光学系１５２をハイブリッドで結合したスティックレンズ１５３を有し、このスティックレンズ１５３の内視鏡光学系１５２の先端部を生体試料１５５に直接差し込んで、生体試料１５５の生命現象をin-vivoで観察するものである。顕微鏡対物レンズ１５１には、同軸に合成された励起光および刺激光が、ガルバノミラー１５６，１５７により二次元走査されて、瞳投影レンズ１５８を経て入射させる。
【０１４２】
本実施の形態においては、ガルバノミラー１５７と顕微鏡対物レンズ１５１との間の励起光および刺激光の共通光路中に、例えば図４または図５に例示した構成の偏光制御素子１６１を配置する。なお、偏光制御素子１６１の偏光部材は、上述した実施の形態の場合と同様に、刺激光に対して１／４波長板あるいは１／２波長板として機能するように構成する。
【０１４３】
このように構成された本実施の形態に係る超解像顕微鏡によると、偏光制御素子１６１を、上述した実施の形態と同様に、例えば、その中心が光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、超解像効果を容易に発現することができる。これにより、スティックレンズ１５３の開口数を、光学設計上、大きくできなくても、空間分解能を画期的に向上することができる。
【０１４４】
（第７実施の形態）
図１３は、本発明の第７実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、顕微鏡対物レンズ１７１を、光軸と直交する平面内で、直交するＸ方向およびＹ方向に移動可能として、顕微鏡対物レンズ１７１自体で観察試料１７２に対して光束を空間走査するようにしたものである。観察試料１７２に照射する励起光および刺激光は、図８と同様にして、ファイバ１７３に同軸に合波して入射させ、このファイバ１７３の射出口から射出される球面波の励起光および刺激光を、コリメータレンズ１７４で平面波に変換して顕微鏡対物レンズ１７１に入射させる。
【０１４５】
本実施の形態においては、コリメータレンズ１７４と顕微鏡対物レンズ１７１との間の励起光および刺激光の共通光路中に、例えば図４または図５に例示した構成の偏光制御素子１７５を配置する。なお、偏光制御素子１７５の偏光部材は、上述した実施の形態の場合と同様に、刺激光に対して１／４波長板あるいは１／２波長板として機能するように構成する。
【０１４６】
本実施の形態に係る超解像顕微鏡によると、上述した実施の形態の場合と同様に、偏光制御素子１７５を、例えば、その中心が光軸と一致するように芯出し調整した状態で、光軸に対して直交する平面内で回転調整する簡単な作業で、超解像効果を容易に発現することができる。これにより、ファイバ１７３を用いるために、顕微鏡対物レンズ１７１の開口数を大きくできなくても、十分な空間分解能を得ることができる。
【０１４７】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、偏光制御素子を励起光と刺激光との共通光路に配置する場合、偏光制御素子の偏光部材は、励起光に対して偏光機能を有するように構成したり、励起光と刺激光との両方の光に対して偏光機能を有するように構成したりすることもできる。特に、後者の場合は、偏光部材としてフレネルロムを用いれば、励起光および刺激光の双方に対して１／２波長板、あるいは１／４波長板として機能させることができる。また、第２実施の形態では、ポンプ光とイレース光とを、ビームコンバイナ８３およびシングルモードファイバ８５を用いて同軸に合成するようにしたが、２入力１出力の光合成ファイバを用いて同軸に合成することもできる。
【符号の説明】
【０１４８】
６１ 励起光用光源
６２ 刺激光用光源
６３ ダイクロイックミラー
６４ 偏光ビームスプリッタ
６８ 顕微鏡対物レンズ
７０ 観察試料
７１ 偏光制御素子
７２ 偏光部材
７３ 位相変調部
７８ 光検出器
８０ 光源ユニット
８１ 励起光用光源
８２ 刺激光用光源
８３ ビームコンバイナ
８７ レーザ光源
９０ スキャンユニット
９８ 光検出器
１００ 顕微鏡ユニット
１０２ 顕微鏡対物レンズ
１０３ 観察試料
１０５ 偏光制御素子
１０６ 偏光部材
１０７ 多層膜
１２１ 励起光用光源
１２２ 刺激光用光源
１２３ ダイクロイックミラー
１２８ 顕微鏡対物レンズ
１３０ 観察試料
１３１ 偏光制御素子
１３２ 偏光部材
１３３ 位相変調部
１３７ 分光器
１３８ 光検出器
１５１ 顕微鏡対物レンズ
１５２ 内視鏡光学系
１５３ スティックレンズ
１５５ 生体試料
１６１ 偏光制御素子
１７１ 顕微鏡対物レンズ
１７２ 観察試料
１７３ ファイバ
１７５ 偏光制御素子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を安定状態から第１量子状態に励起するための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させるための第２照明光を射出する光源部と、
該光源部から射出された前記第１照明光および前記第２照明光を前記試料に一部重ね合わせて集光する、顕微鏡対物レンズを含む光学系と、
前記第１照明光および前記第２照明光の集光により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
前記第１照明光または前記第２照明光の偏光状態を変換する偏光部材、および該偏光部材に一体に形成されて前記第２照明光の位相を空間変調する位相変調部を有する偏光制御素子と、
を備えることを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】
前記位相変調部は、前記第２照明光の位相を光軸対称の位置で反転させるように、光学媒質膜の積層またはエッチング加工により段差を有して形成された複数の領域からなる、
ことを特徴とする請求項１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項３】
前記位相変調部は、前記第１照明光に対しては反射作用または透過型の位相変調作用を有し、前記第２照明光に対しては透過型の位相変調作用を有する多層膜からなる、
ことを特徴とする請求項１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項４】
前記物質は蛍光物質であり、
前記第２照明光は、前記蛍光物質の蛍光の発光を抑制する波長である、
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項５】
前記物質は蛍光物質であり、
前記第２照明光は、前記蛍光物質の蛍光のスペクトルを変化させる波長であり、
前記検出部は、前記第１照明光の照射により前記蛍光物質から発光する蛍光のスペクトルを透過させ、前記第２照明光の照射により前記蛍光物質から発光する蛍光のスペクトルを遮断する波長帯域選択部を有する、
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項６】
前記偏光制御素子は、前記第２照明光の光軸に関して回転可能である、
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項７】
前記偏光部材は、前記第２照明光に対して１／２波長板として機能し、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光の偏光方向は平行である、
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項８】
前記偏光部材は、前記第２照明光に対して１／４波長板として機能し、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光の少なくとも一方の偏光方向は円偏光である、
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項９】
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光は、偏光回転方向が反対の円偏光である、
ことを特徴とする請求項８に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１０】
前記偏光制御素子は、前記第１照明光または前記第２照明光を偏向する反射型である、
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１１】
前記偏光制御素子は、前記偏光部材として液晶またはフォトニック結晶を含む、
ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１２】
前記光学系は、前記顕微鏡対物レンズの物体側に結合された内視鏡光学系を備えるスティックレンズを有する、
ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１３】
前記顕微鏡対物レンズは、前記試料に対して前記第１照明光および前記第２照明光を空間的に走査可能に構成されている、
ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１】
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を安定状態から第１量子状態に励起するための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させるための第２照明光を射出する光源部と、
該光源部から射出された前記第１照明光および前記第２照明光を前記試料に一部重ね合わせて集光する、顕微鏡対物レンズを含む光学系と、
前記第１照明光および前記第２照明光の集光により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
前記第１照明光または前記第２照明光の偏光状態を変換する偏光部材、および該偏光部材に一体に形成されて前記第２照明光の位相を空間変調する位相変調部を有する偏光制御素子と、
を備えることを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】
前記位相変調部は、前記第２照明光の位相を光軸対称の位置で反転させるように、光学媒質膜の積層またはエッチング加工により段差を有して形成された複数の領域からなる、
ことを特徴とする請求項１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項３】
前記位相変調部は、前記第１照明光に対しては反射作用または透過型の位相変調作用を有し、前記第２照明光に対しては透過型の位相変調作用を有する多層膜からなる、
ことを特徴とする請求項１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項４】
前記物質は蛍光物質であり、
前記第２照明光は、前記蛍光物質の蛍光の発光を抑制する波長である、
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項５】
前記物質は蛍光物質であり、
前記第２照明光は、前記蛍光物質の蛍光のスペクトルを変化させる波長であり、
前記検出部は、前記第１照明光の照射により前記蛍光物質から発光する蛍光のスペクトルを透過させ、前記第２照明光の照射により前記蛍光物質から発光する蛍光のスペクトルを遮断する波長帯域選択部を有する、
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項６】
前記偏光制御素子は、前記第２照明光の光軸に関して回転可能である、
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項７】
前記偏光部材は、前記第２照明光に対して１／２波長板として機能し、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光の偏光方向は平行である、
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項８】
前記偏光部材は、前記第２照明光に対して１／４波長板として機能し、
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光の少なくとも一方の偏光方向は円偏光である、
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項９】
前記試料に集光される前記第１照明光および前記第２照明光は、偏光回転方向が反対の円偏光である、
ことを特徴とする請求項８に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１０】
前記偏光制御素子は、前記第１照明光または前記第２照明光を偏向する反射型である、
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１１】
前記偏光制御素子は、前記偏光部材として液晶またはフォトニック結晶を含む、
ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１２】
前記光学系は、前記顕微鏡対物レンズの物体側に結合された内視鏡光学系を備えるスティックレンズを有する、
ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１３】
前記顕微鏡対物レンズは、前記試料に対して前記第１照明光および前記第２照明光を空間的に走査可能に構成されている、
ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２０１１−１２３３１４（Ｐ２０１１−１２３３１４Ａ）
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８１１７９（Ｐ２００９−２８１１７９）
【出願日】平成２１年１２月１１日（２００９．１２．１１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１１日（２００９．１２．１１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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