連続発酵装置
【課題】簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造装置を提供する。
【解決手段】微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物を発酵させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメント２と、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなる。
【解決手段】微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物を発酵させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメント２と、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物または細胞の培養方法の改良およびそれに用いられる培養装置に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得る化学品を製造するための連続発酵装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）バッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と（２）連続発酵法に分類することができる。
【０００３】
上記（１）のバッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性及び収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。
【０００４】
一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積するのを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。Ｌ−グルタミン酸（特許文献１参照。）やＬ−リジン（非特許文献１参照。）の発酵について連続培養法が開示されている。しかしながら、これらの例では、培養液へ原料の連続的な供給を行うと共に、微生物や細胞を含んだ培養液を抜き出すために、培養液中の微生物や細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００５】
このことから、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させることにより、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
【０００６】
例えば、セラミックス膜を用いた連続発酵装置において、連続発酵する技術が提案されている（特許文献２、特許文献３および特許文献４参照。）が、これらの提案では、分離膜の目詰りによる濾過流量や濾過効率の低下に問題があり、目詰まり防止のために、逆洗浄等を行っている。また別に、分離膜を用いたコハク酸の製造方法が提案されている（特許文献５参照。）。しかしながら、この提案では膜分離において、高い濾過圧（約２００ｋＰａ）が採用されている。高い濾過圧は、コスト的にも不利であるばかりでなく、濾過処理において微生物や細胞が圧力によって物理的なダメージを受けることから、微生物や細胞を連続的に培養液に戻す連続発酵法においては適切ではない。
【０００７】
このように、従来の連続発酵法には様々な問題があり、産業的応用が難しかった。すなわち、連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を培養液に還流させ、培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を得ることは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
【特許文献１】特開平１０−１５０９９６号公報
【特許文献２】特開平５−９５７７８号公報
【特許文献３】特開昭６２−１３８１８４号公報
【特許文献４】特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献５】特開２００５−３３３８８６号公報
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al.（ヒラノ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による化学品を製造するための連続発酵装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や細胞を膜間差圧が低い条件で濾過した場合に、分離膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、課題であった高濃度の微生物の濾過が長期間安定に維持できることを可能とし、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に保持または還流させる連続発酵方法による化学品の製造装置であって、分離膜として、平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にある多孔性膜を用い低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させる化学品の製造装置を提供するものである。
【００１１】
すなわち、本発明の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を発酵させるための発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００１２】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は２×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０-7ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００１３】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、その細孔径の標準偏差は０.１μｍ以下である。
【００１４】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の膜表面粗さは０.１μｍ以下の多孔性膜である。
【００１５】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜は多孔質樹脂層を含む多孔性膜であり、その多孔質樹脂層の素材はポリフッ化ビニリデンを含んでいる。
【００１６】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の膜間差圧を制御するための手段は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置である。
【００１７】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の膜間差圧を制御するための手段は、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプである。
【００１８】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の膜間差圧を制御するための手段が、気体または液体の圧力である。
【００１９】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜を含む膜分離エレメントを構成する部材が高圧蒸気滅菌操作に耐性であることである。
【００２０】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、化学品はＬ−乳酸である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の連続発酵装置によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物を発酵させるための発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された微生物と発酵生産物を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００２３】
本発明で分離膜として用いられる多孔性膜について説明する。本発明で用いられる多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。多孔性膜は、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。
【００２４】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布等である。中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００２５】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂等が挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく用いられる。多孔質樹脂層を構成する素材には、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００２６】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００２７】
本発明で用いられる多孔性膜は、発酵に使用する微生物および培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることが重要である。
【００２８】
平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にあると、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にあれば、動物細胞、酵母および糸状菌などを用いた場合、目詰まりが少なく、また、細胞の濾液への漏れもなく安定に連続発酵が実施可能である。また、動物細胞、酵母および糸状菌より小さな細菌類を用いた場合は、０.４μｍ以下の平均細孔径であればよりよく、０.２μｍ以下の平均細孔径であればなお好適に実施可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、通常は０．０２μｍ以上が好ましく、より好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００２９】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００３０】
また、細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。細孔径の標準偏差σは、上記の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋ、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした、下記の式（１）により算出される。
【００３１】
【数１】
【００３２】
本発明で用いられる多孔性膜において、発酵培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。多孔性膜の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、２×１０−９以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上１×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００３３】
本発明で用いられる多孔性膜の表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。多孔性膜の表面粗さは、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗をさらに低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。また、表面粗さを低くすることにより、微生物や培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物または培養細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００３４】
ここで、表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm,２５μm 四方（気中測定）
５μm,１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製
測定に際し膜サンプルは常温でエタノールに１５分浸漬後ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００３５】
膜の表面粗さdroughはAFMにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の式（２）により算出する。
【００３６】
【数２】
【００３７】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その厚みは用途に応じて選択されるが、例えば、厚みは好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。上述したように、多孔性膜は多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されていても良い。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。中空糸膜の場合、内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編み物を含んでいても良い。
【００３８】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。分離膜エレメントの形態は特に限定されないが、支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明の多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明の分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態では、膜面積を大きくすることが困難なので、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００３９】
本発明において、微生物や培養細胞を濾過処理する際の膜間差圧は、微生物や培養細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよく、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲とする。膜間差圧を制御するための手段である濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。このように膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることで制御することができる。また、ポンプを使用する場合には吸引圧力により制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によって制御することができる。これら圧力制御を行う場合には発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００４０】
また、本発明において使用する多孔性膜は、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができるものが好ましい。
【００４１】
本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品、特にピルビン酸を良好に生産させ得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好ましく用いられる。
【００４２】
炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなども使用される。
【００４３】
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００４４】
無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。
【００４５】
本発明において、発酵培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品、特にピルビン酸の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００４６】
本発明では、発酵培養液中の糖類濃度は、５ｇ／ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。微生物の培養は、通常ｐＨ４〜８、温度２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。発酵培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節することができる。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００４７】
本発明では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、発酵培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。一例として、濃度は乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。
【００４８】
また、必要に応じて発酵反応槽内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、発酵反応槽内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなる場合があることから、引き抜くことにより閉塞から回避することができる。また、発酵反応槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００４９】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、培養管理上単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００５０】
本発明で使用される微生物や培養細胞としては、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００５１】
本発明の連続発酵装置で製造される化学品としては、上記微生物や細胞が培養液中に生産する物質であれば特に制限はないが、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質および組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、カダベリンおよびグリセロールなど、また有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸およびクエン酸などを挙げることができる。本発明の連続発酵装置を用いることにより、上記化学品の高い生産性を得ることができる。
【００５２】
次に、本発明の連続発酵装置を用いて行われる連続発酵の形態について説明する。
【００５３】
従来の連続発酵培養は、発酵反応槽へ新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の発酵培養液を槽外へ排出することによって、発酵反応槽内の液量を常に一定に保つ培養法である。回分培養では、初発基質濃度が消費されると発酵培養が終了するが、連続発酵培養では、理論的には無限に発酵培養を持続させることができる。すなわち、理論的には無限に発酵させることができる。
【００５４】
一般に回分培養では、微生物の増殖、基質の消費および微生物の生産物により、微生物濃度、基質濃度、生産物濃度、ｐＨおよび溶存酸素等の微生物のおかれた環境条件が、発酵培養時間の経過に伴って変化する。それに対して、連続発酵培養においては、これらの環境条件が一定に保たれた状態（定常状態）が出現し且つ持続する。
【００５５】
一方、上述従来の連続培養では発酵培養液と共に微生物も槽外に排出され、発酵反応槽内の微生物濃度を高く維持することは難しい。ここで、発酵生産を行う場合には発酵を行う微生物を高濃度に保つことができれば、発酵容積当たりの発酵生産効率を向上させることができる。そのためには、微生物を発酵反応槽内に保持、あるいは還流させる必要がある。微生物を発酵反応槽内に保持あるいは還流させる方法としては、排出された発酵培養液を重力、例えば、遠心分離により固液分離し、沈殿物である微生物を発酵反応槽に返送する方法、濾過することにより固形分である微生物を分離し、発酵培養液上清のみを発酵反応槽外に排出する方法等が挙げられる。しかしながら、遠心分離による方法は動力費が高く現実的ではない。濾過による方法は、前述のように濾過するために高い圧力要することから、実験室レベルでの検討がほとんどである。
【００５６】
次に、ここで本発明の連続発酵装置の構成および特徴について説明する。本発明の連続発酵装置の主たる構成は、微生物もしくは培養細胞を保持し化学品を製造するための発酵反応槽、および微生物もしくは培養細胞と発酵培養液をろ過分離するための多孔性膜を含む膜分離エレメントであり、多孔性膜は発酵反応槽の内部に設置されることを特徴としている。ここで使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満である。従来の連続発酵装置、例えば、セラミックフィルター等の従来のろ過装置を用いた発酵培養液の分離ろ過時に高いろ過圧力が必要であるが、発酵装置内を加圧状態で保つことが困難なことから、ろ過分離装置は発酵反応槽の外部に設置されていたが、本発明の連続発酵装置においては、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲であり、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、多孔性膜を発酵槽内部に設置することが可能である。このように本発明の連続発酵装置は、濾過分離装置を設置せず、連続発酵装置と濾過分離槽間の発酵培養液を循環させるためのポンプ等の装置の設置が必要ないことから、連続発酵装置のコンパクト化が可能となる上に、装置の構造を単純にすることが可能となる。そのため、雑菌の混入といった微生物培養上のトラブル、および可動部分の機械的トラブルの頻度の低減が可能になることから、装置のメンテナンスが容易になる。また、ろ過分離装置と発酵反応槽間の発酵培養液循環動力が不要となることから、運転コストの低減が実現する。
【００５７】
本発明の連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持材部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材を用いることが好ましい。これにより分離膜エレメントを含む発酵反応槽内を滅菌可能とすることができる。発酵反応槽内が滅菌可能であれば、連続発酵培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避できることから、安定した連続発酵培養が可能となる。分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持材部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である１２１℃の温度で１５分間という条件に耐性であれば、分離膜ならびに支持材部材の種類は特に限定されない。分離膜の素材としては上述の分離膜として用いられる多孔性膜の素材を用いることが可能である。また、支持材部材としては、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、あるいはポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等を好ましく選定することができる。
【００５８】
次に、本発明の連続発酵装置の代表的な一例を図面で説明する。
【００５９】
図１は、本発明の膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００６０】
図１において、膜分離型の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を発酵させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽１内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメント２と、該分離膜エレメント２に接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなる。発酵反応槽１内には分離膜エレメント２が配設されており、その分離膜エレメント２には、平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００６１】
次に、図１の膜分離型の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１内に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、発酵反応槽１内に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４に供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００６２】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により発酵培養液中の微生物の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記の計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００６３】
発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、微生物と発酵生産物に濾過・分離され連続発酵装置系から排出され取り出される。この排出の方法については下記に詳述する。
【００６４】
また、濾過・分離された微生物は、装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は、発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は、水頭差圧によって行うことを例示したが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【００６５】
すなわち、膜間差圧を制御するための手段として、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置３や、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプを用いることができ、また、気体または液体の圧力によって膜間差圧を制御することができることから、長期間安定な発酵生産が可能となる。
【００６６】
本発明で用いられる分離膜エレメント２の形態は特に限定されないが、好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを、以下に図面を用いてその概略を説明する。図２は、本発明で用いられる分離膜エレメント２の一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【００６７】
分離膜エレメントは、図２に示すように、剛性を有する支持板１１の両面に、流路材１２と前記の分離膜１３をこの順序で配し構成されている。支持板１１は、両面に凹部１４を有している。分離膜１３は、発酵培養液を濾過する。流路材１２は、分離膜１３で濾過された透過水を効率よく支持板１１に流すためのものである。支持板１１に流れた発酵生産物を含む透過液は、支持板１３の凹部１４を通り、排出手段である集水パイプ１５を介して連続発酵装置外部に取り出される。ここで、上述の水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を透過水を取り出すための動力として用いることができる。
【００６８】
上記のように、本発明の連続発酵装置使用して連続発酵をおこなった場合、従来のバッチ発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の式（３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ） ・・・・（式３）
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明の連続発酵装置をさらに詳細に説明するために、上記の化学品としてＬ−乳酸を選定し、図１に示す連続発酵装置を用いることにより、連続的にＬ−乳酸発酵の実施することについて、実施例を挙げて説明する。本発明は、これらの実施例に限定されない。
【００７０】
ここで、Ｌ−乳酸を生産させる微生物としては、酵母サッカロミセス・セレビセ（Saccharomyces cerevisae）を用いた。酵母サッカロミセス・セレビセは、本来Ｌ−乳酸発酵を持たないが、Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入することにより、Ｌ−乳酸発酵能力をもつサッカロミセス・セレビセ株を造成し実施した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸発酵能力を持つ酵母株を造成して使用した。
【００７１】
（参考例１）乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
乳酸生産能力を持つ酵母株を、下記のように造成した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成する。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００７２】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００７３】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲにより、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図３）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【００７４】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片と、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を、常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００７５】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。
・また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
・カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
・移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度 ：３０℃
また、Ｌ−乳酸の光学純度は、次式で計算される。
・光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
（ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度を表し、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。）
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことが確認された。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。
【００７６】
（参考例２）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、そして溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜（多孔性膜）を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記の分離膜について純水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、水頭差１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。このようにして参考例２で作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることが出来る。
【００７７】
（参考例３）多孔性膜の作製（その２）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、開孔剤として分子量が約２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を、そして非溶媒として純水をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ ： ５．５重量％
・ＤＭＡｃ：７８．０重量％
・純水 ： ３．５重量％
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3 で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、塗布後、直ちに２５℃の温度の純水中に５分間浸漬し、さらに８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃおよびＰＥＧを洗い出し、分離膜を得た。この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．０２μｍであった。この分離膜について純水透過係数を評価したところ、２×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、水頭差１ｍで行った。平均細孔径の標準偏差 は０．００５５μｍで、膜表面粗さは０．１μｍであった。このようにして参考例３で作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることが出来る。
【００７８】
（参考例４）多孔性膜の作製（その３）
次に示す組成の原液を用いた他は、参考例３と同様にして分離膜を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ： ５．５重量％
・ＤＭＡｃ：８１．５重量％
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１９μｍであり、この分離膜について純水透過係数を評価したところ、１００×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、水頭差１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０６０μｍで、膜表面粗さは０．０８μｍであった。このようにして参考例４で作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることが出来る。
【００７９】
（実施例１）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
図１の膜分離型の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、この装置の連続発酵試験を行った。該培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。また、分離膜には参考例２で作製した多孔性膜を用いた。この実施例１における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・滅菌：分離膜エレメント２を含む発酵反応槽１、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（膜間差圧として２ ｋＰａ以下に制御した。）。
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【００８０】
微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。
【００８１】
【表１】
【００８２】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた発酵培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容の坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続発酵培養し、連続発酵培養による乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜分離槽水頭差を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることで行った。
【００８３】
適宜、膜透過発酵液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該乳酸、およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された乳酸対糖収率と、乳酸生産速度を表２に示した。２８０時間の発酵試験を行った結果、図１に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１以上で推移した。
【００８４】
（実施例２）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
図１の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、この装置の連続発酵試験を行った。該培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材２には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。また、分離膜には参考例１で作製した多孔性膜を用いた。この実施例２における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・反応槽容量：１．５（Ｌ）
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御。
【００８５】
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【００８６】
微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。
【００８７】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた発酵培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続発酵培養し、連続発酵培養による乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された乳酸対糖収率と、乳酸生産速度を表２に示した。２４０時間の発酵試験を行った結果、本膜分離型連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。尚、連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１以上で推移した。
【００８８】
（実施例３）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
分離膜に参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例２と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１以上で推移した。
【００８９】
（実施例４）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その４）
分離膜に参考例４で作製した多孔性膜を用い、実施例２と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１以上で推移した。
【００９０】
（比較例１）回分発酵によるＬ−乳酸の製造
図１に示す膜分離型の連続発酵装置を用いることにより、Ｌ−乳酸発酵生産性が向上するかどうかを調べるため、微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、その乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、図１の連続発酵装置で分離膜エレメントによる濾過を行うことなく回分発酵試験を行った。該培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例１でも、微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。比較例１の運転条件を次に示す。
・発酵反応槽容量（乳酸発酵培地量）：１（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を膜分離型連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５で４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１を通気した。温度調整、ｐＨ調整を行い、発酵培養液循環ポンプ１０を稼働させることなく、回分発酵培養を行った。このときの菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１５であった。回分発酵の結果を、実施例１の連続発酵試験で得られたＬ―乳酸発酵生産性を比較して表２に示す。
【００９１】
これらの比較の結果、図１の連続発酵装置を用いることにより、Ｌ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにできた。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ膜分離型の連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるＬ―乳酸等の化学品の製造が可能であることが明らかとなった。
【００９２】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の連続発酵装置は、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能であり、広く発酵工業において、発酵生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することが出来、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、本発明の膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【図３】実施例で用いた酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【符号の説明】
【００９５】
１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 支持板
１２ 流路材
１３ 分離膜
１４ 凹部
１５ 集水パイプ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物または細胞の培養方法の改良およびそれに用いられる培養装置に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得る化学品を製造するための連続発酵装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）バッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と（２）連続発酵法に分類することができる。
【０００３】
上記（１）のバッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性及び収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。
【０００４】
一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積するのを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。Ｌ−グルタミン酸（特許文献１参照。）やＬ−リジン（非特許文献１参照。）の発酵について連続培養法が開示されている。しかしながら、これらの例では、培養液へ原料の連続的な供給を行うと共に、微生物や細胞を含んだ培養液を抜き出すために、培養液中の微生物や細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００５】
このことから、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させることにより、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
【０００６】
例えば、セラミックス膜を用いた連続発酵装置において、連続発酵する技術が提案されている（特許文献２、特許文献３および特許文献４参照。）が、これらの提案では、分離膜の目詰りによる濾過流量や濾過効率の低下に問題があり、目詰まり防止のために、逆洗浄等を行っている。また別に、分離膜を用いたコハク酸の製造方法が提案されている（特許文献５参照。）。しかしながら、この提案では膜分離において、高い濾過圧（約２００ｋＰａ）が採用されている。高い濾過圧は、コスト的にも不利であるばかりでなく、濾過処理において微生物や細胞が圧力によって物理的なダメージを受けることから、微生物や細胞を連続的に培養液に戻す連続発酵法においては適切ではない。
【０００７】
このように、従来の連続発酵法には様々な問題があり、産業的応用が難しかった。すなわち、連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を培養液に還流させ、培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を得ることは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
【特許文献１】特開平１０−１５０９９６号公報
【特許文献２】特開平５−９５７７８号公報
【特許文献３】特開昭６２−１３８１８４号公報
【特許文献４】特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献５】特開２００５−３３３８８６号公報
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al.（ヒラノ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による化学品を製造するための連続発酵装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や細胞を膜間差圧が低い条件で濾過した場合に、分離膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、課題であった高濃度の微生物の濾過が長期間安定に維持できることを可能とし、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に保持または還流させる連続発酵方法による化学品の製造装置であって、分離膜として、平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にある多孔性膜を用い低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させる化学品の製造装置を提供するものである。
【００１１】
すなわち、本発明の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を発酵させるための発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００１２】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は２×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０-7ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００１３】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、その細孔径の標準偏差は０.１μｍ以下である。
【００１４】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の膜表面粗さは０.１μｍ以下の多孔性膜である。
【００１５】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜は多孔質樹脂層を含む多孔性膜であり、その多孔質樹脂層の素材はポリフッ化ビニリデンを含んでいる。
【００１６】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の膜間差圧を制御するための手段は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置である。
【００１７】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の膜間差圧を制御するための手段は、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプである。
【００１８】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の膜間差圧を制御するための手段が、気体または液体の圧力である。
【００１９】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜を含む膜分離エレメントを構成する部材が高圧蒸気滅菌操作に耐性であることである。
【００２０】
本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、化学品はＬ−乳酸である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の連続発酵装置によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物を発酵させるための発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された微生物と発酵生産物を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００２３】
本発明で分離膜として用いられる多孔性膜について説明する。本発明で用いられる多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。多孔性膜は、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。
【００２４】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布等である。中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００２５】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂等が挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく用いられる。多孔質樹脂層を構成する素材には、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００２６】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００２７】
本発明で用いられる多孔性膜は、発酵に使用する微生物および培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることが重要である。
【００２８】
平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にあると、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にあれば、動物細胞、酵母および糸状菌などを用いた場合、目詰まりが少なく、また、細胞の濾液への漏れもなく安定に連続発酵が実施可能である。また、動物細胞、酵母および糸状菌より小さな細菌類を用いた場合は、０.４μｍ以下の平均細孔径であればよりよく、０.２μｍ以下の平均細孔径であればなお好適に実施可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、通常は０．０２μｍ以上が好ましく、より好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００２９】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００３０】
また、細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。細孔径の標準偏差σは、上記の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋ、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした、下記の式（１）により算出される。
【００３１】
【数１】
【００３２】
本発明で用いられる多孔性膜において、発酵培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。多孔性膜の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、２×１０−９以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上１×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００３３】
本発明で用いられる多孔性膜の表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。多孔性膜の表面粗さは、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗をさらに低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。また、表面粗さを低くすることにより、微生物や培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物または培養細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００３４】
ここで、表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm,２５μm 四方（気中測定）
５μm,１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製
測定に際し膜サンプルは常温でエタノールに１５分浸漬後ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００３５】
膜の表面粗さdroughはAFMにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の式（２）により算出する。
【００３６】
【数２】
【００３７】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その厚みは用途に応じて選択されるが、例えば、厚みは好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。上述したように、多孔性膜は多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されていても良い。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。中空糸膜の場合、内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編み物を含んでいても良い。
【００３８】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。分離膜エレメントの形態は特に限定されないが、支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明の多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明の分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態では、膜面積を大きくすることが困難なので、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００３９】
本発明において、微生物や培養細胞を濾過処理する際の膜間差圧は、微生物や培養細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよく、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲とする。膜間差圧を制御するための手段である濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。このように膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることで制御することができる。また、ポンプを使用する場合には吸引圧力により制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によって制御することができる。これら圧力制御を行う場合には発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００４０】
また、本発明において使用する多孔性膜は、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができるものが好ましい。
【００４１】
本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品、特にピルビン酸を良好に生産させ得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好ましく用いられる。
【００４２】
炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなども使用される。
【００４３】
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００４４】
無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。
【００４５】
本発明において、発酵培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品、特にピルビン酸の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００４６】
本発明では、発酵培養液中の糖類濃度は、５ｇ／ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。微生物の培養は、通常ｐＨ４〜８、温度２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。発酵培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節することができる。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００４７】
本発明では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、発酵培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。一例として、濃度は乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。
【００４８】
また、必要に応じて発酵反応槽内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、発酵反応槽内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなる場合があることから、引き抜くことにより閉塞から回避することができる。また、発酵反応槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００４９】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、培養管理上単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００５０】
本発明で使用される微生物や培養細胞としては、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００５１】
本発明の連続発酵装置で製造される化学品としては、上記微生物や細胞が培養液中に生産する物質であれば特に制限はないが、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質および組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、カダベリンおよびグリセロールなど、また有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸およびクエン酸などを挙げることができる。本発明の連続発酵装置を用いることにより、上記化学品の高い生産性を得ることができる。
【００５２】
次に、本発明の連続発酵装置を用いて行われる連続発酵の形態について説明する。
【００５３】
従来の連続発酵培養は、発酵反応槽へ新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の発酵培養液を槽外へ排出することによって、発酵反応槽内の液量を常に一定に保つ培養法である。回分培養では、初発基質濃度が消費されると発酵培養が終了するが、連続発酵培養では、理論的には無限に発酵培養を持続させることができる。すなわち、理論的には無限に発酵させることができる。
【００５４】
一般に回分培養では、微生物の増殖、基質の消費および微生物の生産物により、微生物濃度、基質濃度、生産物濃度、ｐＨおよび溶存酸素等の微生物のおかれた環境条件が、発酵培養時間の経過に伴って変化する。それに対して、連続発酵培養においては、これらの環境条件が一定に保たれた状態（定常状態）が出現し且つ持続する。
【００５５】
一方、上述従来の連続培養では発酵培養液と共に微生物も槽外に排出され、発酵反応槽内の微生物濃度を高く維持することは難しい。ここで、発酵生産を行う場合には発酵を行う微生物を高濃度に保つことができれば、発酵容積当たりの発酵生産効率を向上させることができる。そのためには、微生物を発酵反応槽内に保持、あるいは還流させる必要がある。微生物を発酵反応槽内に保持あるいは還流させる方法としては、排出された発酵培養液を重力、例えば、遠心分離により固液分離し、沈殿物である微生物を発酵反応槽に返送する方法、濾過することにより固形分である微生物を分離し、発酵培養液上清のみを発酵反応槽外に排出する方法等が挙げられる。しかしながら、遠心分離による方法は動力費が高く現実的ではない。濾過による方法は、前述のように濾過するために高い圧力要することから、実験室レベルでの検討がほとんどである。
【００５６】
次に、ここで本発明の連続発酵装置の構成および特徴について説明する。本発明の連続発酵装置の主たる構成は、微生物もしくは培養細胞を保持し化学品を製造するための発酵反応槽、および微生物もしくは培養細胞と発酵培養液をろ過分離するための多孔性膜を含む膜分離エレメントであり、多孔性膜は発酵反応槽の内部に設置されることを特徴としている。ここで使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満である。従来の連続発酵装置、例えば、セラミックフィルター等の従来のろ過装置を用いた発酵培養液の分離ろ過時に高いろ過圧力が必要であるが、発酵装置内を加圧状態で保つことが困難なことから、ろ過分離装置は発酵反応槽の外部に設置されていたが、本発明の連続発酵装置においては、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲であり、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、多孔性膜を発酵槽内部に設置することが可能である。このように本発明の連続発酵装置は、濾過分離装置を設置せず、連続発酵装置と濾過分離槽間の発酵培養液を循環させるためのポンプ等の装置の設置が必要ないことから、連続発酵装置のコンパクト化が可能となる上に、装置の構造を単純にすることが可能となる。そのため、雑菌の混入といった微生物培養上のトラブル、および可動部分の機械的トラブルの頻度の低減が可能になることから、装置のメンテナンスが容易になる。また、ろ過分離装置と発酵反応槽間の発酵培養液循環動力が不要となることから、運転コストの低減が実現する。
【００５７】
本発明の連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持材部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材を用いることが好ましい。これにより分離膜エレメントを含む発酵反応槽内を滅菌可能とすることができる。発酵反応槽内が滅菌可能であれば、連続発酵培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避できることから、安定した連続発酵培養が可能となる。分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持材部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である１２１℃の温度で１５分間という条件に耐性であれば、分離膜ならびに支持材部材の種類は特に限定されない。分離膜の素材としては上述の分離膜として用いられる多孔性膜の素材を用いることが可能である。また、支持材部材としては、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、あるいはポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等を好ましく選定することができる。
【００５８】
次に、本発明の連続発酵装置の代表的な一例を図面で説明する。
【００５９】
図１は、本発明の膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００６０】
図１において、膜分離型の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を発酵させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽１内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメント２と、該分離膜エレメント２に接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなる。発酵反応槽１内には分離膜エレメント２が配設されており、その分離膜エレメント２には、平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００６１】
次に、図１の膜分離型の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１内に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、発酵反応槽１内に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４に供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００６２】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により発酵培養液中の微生物の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記の計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００６３】
発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、微生物と発酵生産物に濾過・分離され連続発酵装置系から排出され取り出される。この排出の方法については下記に詳述する。
【００６４】
また、濾過・分離された微生物は、装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は、発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は、水頭差圧によって行うことを例示したが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【００６５】
すなわち、膜間差圧を制御するための手段として、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置３や、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプを用いることができ、また、気体または液体の圧力によって膜間差圧を制御することができることから、長期間安定な発酵生産が可能となる。
【００６６】
本発明で用いられる分離膜エレメント２の形態は特に限定されないが、好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを、以下に図面を用いてその概略を説明する。図２は、本発明で用いられる分離膜エレメント２の一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【００６７】
分離膜エレメントは、図２に示すように、剛性を有する支持板１１の両面に、流路材１２と前記の分離膜１３をこの順序で配し構成されている。支持板１１は、両面に凹部１４を有している。分離膜１３は、発酵培養液を濾過する。流路材１２は、分離膜１３で濾過された透過水を効率よく支持板１１に流すためのものである。支持板１１に流れた発酵生産物を含む透過液は、支持板１３の凹部１４を通り、排出手段である集水パイプ１５を介して連続発酵装置外部に取り出される。ここで、上述の水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を透過水を取り出すための動力として用いることができる。
【００６８】
上記のように、本発明の連続発酵装置使用して連続発酵をおこなった場合、従来のバッチ発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の式（３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ） ・・・・（式３）
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明の連続発酵装置をさらに詳細に説明するために、上記の化学品としてＬ−乳酸を選定し、図１に示す連続発酵装置を用いることにより、連続的にＬ−乳酸発酵の実施することについて、実施例を挙げて説明する。本発明は、これらの実施例に限定されない。
【００７０】
ここで、Ｌ−乳酸を生産させる微生物としては、酵母サッカロミセス・セレビセ（Saccharomyces cerevisae）を用いた。酵母サッカロミセス・セレビセは、本来Ｌ−乳酸発酵を持たないが、Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入することにより、Ｌ−乳酸発酵能力をもつサッカロミセス・セレビセ株を造成し実施した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸発酵能力を持つ酵母株を造成して使用した。
【００７１】
（参考例１）乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
乳酸生産能力を持つ酵母株を、下記のように造成した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成する。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００７２】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００７３】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲにより、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図３）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【００７４】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片と、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を、常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００７５】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。
・また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
・カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
・移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度 ：３０℃
また、Ｌ−乳酸の光学純度は、次式で計算される。
・光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
（ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度を表し、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。）
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことが確認された。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。
【００７６】
（参考例２）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、そして溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜（多孔性膜）を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記の分離膜について純水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、水頭差１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。このようにして参考例２で作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることが出来る。
【００７７】
（参考例３）多孔性膜の作製（その２）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、開孔剤として分子量が約２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を、そして非溶媒として純水をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ ： ５．５重量％
・ＤＭＡｃ：７８．０重量％
・純水 ： ３．５重量％
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3 で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、塗布後、直ちに２５℃の温度の純水中に５分間浸漬し、さらに８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃおよびＰＥＧを洗い出し、分離膜を得た。この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．０２μｍであった。この分離膜について純水透過係数を評価したところ、２×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、水頭差１ｍで行った。平均細孔径の標準偏差 は０．００５５μｍで、膜表面粗さは０．１μｍであった。このようにして参考例３で作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることが出来る。
【００７８】
（参考例４）多孔性膜の作製（その３）
次に示す組成の原液を用いた他は、参考例３と同様にして分離膜を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ： ５．５重量％
・ＤＭＡｃ：８１．５重量％
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１９μｍであり、この分離膜について純水透過係数を評価したところ、１００×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、水頭差１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０６０μｍで、膜表面粗さは０．０８μｍであった。このようにして参考例４で作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることが出来る。
【００７９】
（実施例１）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
図１の膜分離型の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、この装置の連続発酵試験を行った。該培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。また、分離膜には参考例２で作製した多孔性膜を用いた。この実施例１における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・滅菌：分離膜エレメント２を含む発酵反応槽１、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（膜間差圧として２ ｋＰａ以下に制御した。）。
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【００８０】
微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。
【００８１】
【表１】
【００８２】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた発酵培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容の坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続発酵培養し、連続発酵培養による乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜分離槽水頭差を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることで行った。
【００８３】
適宜、膜透過発酵液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該乳酸、およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された乳酸対糖収率と、乳酸生産速度を表２に示した。２８０時間の発酵試験を行った結果、図１に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１以上で推移した。
【００８４】
（実施例２）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
図１の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、この装置の連続発酵試験を行った。該培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材２には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。また、分離膜には参考例１で作製した多孔性膜を用いた。この実施例２における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・反応槽容量：１．５（Ｌ）
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御。
【００８５】
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【００８６】
微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。
【００８７】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた発酵培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続発酵培養し、連続発酵培養による乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された乳酸対糖収率と、乳酸生産速度を表２に示した。２４０時間の発酵試験を行った結果、本膜分離型連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。尚、連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１以上で推移した。
【００８８】
（実施例３）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
分離膜に参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例２と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１以上で推移した。
【００８９】
（実施例４）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その４）
分離膜に参考例４で作製した多孔性膜を用い、実施例２と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１以上で推移した。
【００９０】
（比較例１）回分発酵によるＬ−乳酸の製造
図１に示す膜分離型の連続発酵装置を用いることにより、Ｌ−乳酸発酵生産性が向上するかどうかを調べるため、微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、その乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、図１の連続発酵装置で分離膜エレメントによる濾過を行うことなく回分発酵試験を行った。該培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例１でも、微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。比較例１の運転条件を次に示す。
・発酵反応槽容量（乳酸発酵培地量）：１（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を膜分離型連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５で４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１を通気した。温度調整、ｐＨ調整を行い、発酵培養液循環ポンプ１０を稼働させることなく、回分発酵培養を行った。このときの菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１５であった。回分発酵の結果を、実施例１の連続発酵試験で得られたＬ―乳酸発酵生産性を比較して表２に示す。
【００９１】
これらの比較の結果、図１の連続発酵装置を用いることにより、Ｌ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにできた。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ膜分離型の連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるＬ―乳酸等の化学品の製造が可能であることが明らかとなった。
【００９２】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の連続発酵装置は、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能であり、広く発酵工業において、発酵生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することが出来、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、本発明の膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【図３】実施例で用いた酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【符号の説明】
【００９５】
１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 支持板
１２ 流路材
１３ 分離膜
１４ 凹部
１５ 集水パイプ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を発酵させるための発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置。
【請求項２】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０-7ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である請求項１記載の連続発酵装置。
【請求項３】
多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、その平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１または２に記載の連続発酵装置。
【請求項４】
多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下の多孔性膜である請求項１から３のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項５】
多孔性膜が多孔質樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項６】
多孔質樹脂層の素材がポリフッ化ビニリデンである請求項１から５のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項７】
膜間差圧を制御するための手段が、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置である請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項８】
膜間差圧を制御するための手段が、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプである請求項１から７のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項９】
膜間差圧を制御するための手段が、気体または液体の圧力である請求項１から８のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１０】
多孔性膜を含む分離膜エレメントを構成する部材が高圧蒸気滅菌操作に耐性である請求項１から９のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１１】
化学品がＬ−乳酸である請求項１から１０のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を発酵させるための発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置。
【請求項２】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０-7ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である請求項１記載の連続発酵装置。
【請求項３】
多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、その平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１または２に記載の連続発酵装置。
【請求項４】
多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下の多孔性膜である請求項１から３のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項５】
多孔性膜が多孔質樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項６】
多孔質樹脂層の素材がポリフッ化ビニリデンである請求項１から５のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項７】
膜間差圧を制御するための手段が、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置である請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項８】
膜間差圧を制御するための手段が、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプである請求項１から７のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項９】
膜間差圧を制御するための手段が、気体または液体の圧力である請求項１から８のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１０】
多孔性膜を含む分離膜エレメントを構成する部材が高圧蒸気滅菌操作に耐性である請求項１から９のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１１】
化学品がＬ−乳酸である請求項１から１０のいずれかに記載の連続発酵装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−４８７２１（Ｐ２００８−４８７２１Ａ）
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４０５１９（Ｐ２００７−４０５１９）
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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