選択的なグリコシダーゼインヒビター、インヒビターを作製する方法、およびインヒビターの使用
本発明は、グリコシダーゼを選択的に阻害するための化合物、その化合物のプロドラッグ、およびその化合物または化合物のプロドラッグを含む薬学的組成物を含む。本発明はまた、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損または過剰発現、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積または欠損に関連する疾患および障害、およびそのような疾患および障害の治療を研究するための、動物モデルおよびその動物モデルを作製する方法を含む。本発明はまた、そのような疾患および障害を治療する方法を含む。本発明はまた、その化合物を作製する方法、および選択的グリコシダーゼインヒビターを作製する方法を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年３月１日に出願された米国仮特許出願第６０／６５６，８７８号（これは、参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本出願は、選択的にグリコシダーゼを阻害する化合物、そのインヒビターを作製する方法、およびその使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
広範囲の細胞タンパク質（核および細胞質の細胞タンパク質の両方）は、、単糖２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（β−Ｎ−アセチルグルコサミン）の付加によって翻訳後修飾され、それはＯ−グリコシド結合によって結合する［１］。この修飾は一般的に、Ｏ結合型Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＯ−ＧｌｃＮＡｃと呼ばれる。
【０００４】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質は、例えば転写［２−５］、プロテアソーム分解［６］、および細胞シグナル伝達［７］を含む、広範囲の重要な細胞機能を有する。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃはまた、多くの構造タンパク質においても見出される［８−１０］。例えば、それは神経フィラメントタンパク質［１１、１２］、シナプシン［１３、１４］、シナプシン特異的クラスリン集合タンパク質ＡＰ−３［１５］、およびアンキリンＧ［１６］を含む、多くの細胞骨格タンパク質において見出された。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾は、脳において豊富であることが見出された［１７、１８］。それはまた、ＩＩ型糖尿病、アルツハイマー病（ＡＤ）および癌を含むいくつかの疾患の病因に明らかに関わっているタンパク質においても見出された。
【０００５】
例えば、ＡＤならびにダウン症候群、ピック病、ニーマン−ピック病Ｃ型、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む多くの関連するタウオパチー（tauopathy）は、部分的には、神経原線維変化（ＮＦＴ）の発達によって特徴付けられることが、よく確立している。これらのＮＦＴは、対らせんフィラメント（ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ）（ＰＨＦ）の凝集物であり、そして重要なタンパク質「タウ（tau）」の異常な形態から構成される。正常なタウは、ニューロン内のタンパク質および栄養素の分配に必須である微小管の重要な細胞ネットワークを安定化する。しかしＡＤ患者においては、タウは過剰にリン酸化され、その正常な機能を破壊してＰＨＦを形成し、そして最終的には凝集して有害なＮＦＴを形成する。ＡＤ患者の脳内のＮＦＴレベルと認知症の重症度との間の明らかな類似点は、ＡＤにおけるタウ機能不全の重要な役割を強力に支持する［１９、２０］。このタウの過剰リン酸化の正確な原因は不明のままである。従って、ａ）タウ過剰リン酸化の分子生理学的な基礎を明らかにすること［６］、およびｂ）これらがアルツハイマー病の進行を停止させる、またはさらに逆転させ得ることを期待して、タウ過剰リン酸化を制限し得る戦略を同定すること［７、８］に、多くの努力がなされた。これまで、いくつかの証拠が、タウの過剰リン酸化に多くのキナーゼのアップレギュレーションが関与し得ることを示唆しているが［９、１０、２１］、最近、この過剰リン酸化の第２の基礎が提案された［２１］。特に、タウのリン酸レベルが、タウにおけるＯ−ＧｌｃＮＡｃのレベルによって調節されていることが最近明らかになった。ヒトＡＤ脳における過剰リン酸化タウは、健常なヒト脳において見出されるものより顕著に低いレベルのＯ−ＧｌｃＮＡｃを有する［２、３］。これらの結果は、タウＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルを調節するメカニズムにおける機能不全が、ＮＦＴの形成および関連した神経変性においてきわめて重要であり得ることを示唆する。
【０００６】
ヒトは、複合糖質から末端のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミン残基を切断する酵素をコードする、３つの遺伝子を有する。これらの最初のものは、酵素Ｏ−糖タンパク質２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシダーゼ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ）をコードする。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、グリコシドヒドロラーゼファミリー８４のメンバーであり、それは原核生物の病原体からヒトまでのように多様な有機体由来の酵素を含む（グリコシドヒドロラーゼのファミリー分類に関しては、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／のＣｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（１９９９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓサーバーを参照のこと）［１９、２０］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、翻訳後修飾されたタンパク質のセリンおよびスレオニン残基からＯ−ＧｌｃＮＡｃを加水分解するよう作用する［１、２２、２３］。多くの細胞内タンパク質におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃの存在と一致して、酵素Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、ＩＩ型糖尿病［７、２１］、ＡＤ［９、１７、２４］、および癌［１８］を含むいくつかの疾患の病因に役割を果たしているようである。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、おそらく早くに単離されたが［１１、１２］、タンパク質のセリンおよびスレオニン残基からＯ−ＧｌｃＮＡｃを切断する作用におけるその生化学的役割が理解されるまでに約２０年が経過した［１３］。より近年になって、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅがクローニングされ［１５］、部分的に特徴付けられ［１６］、そしてヒストンアセチルトランスフェラーゼとしてのさらなる活性を有することが示唆された［１４］。しかし、この酵素の触媒メカニズムについてはほとんど知られていなかった。
【０００７】
他の２つの酵素、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢは、複合糖質からの末端β−Ｎ−アセチルグルコサミン残基の加水分解性の切断を触媒する酵素をコードする。ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢの遺伝子産物は、主に２つの二量体アイソザイム、それぞれヘキソサミニダーゼＡおよびヘキソサミニダーゼＢを生ずる。ヘテロダイマーアイソザイムであるヘキソサミニダーゼＡ（αβ）は、αおよびβサブユニットから成る。ホモダイマーアイソザイムであるヘキソサミニダーゼＢ（ββ）は、２つのβサブユニットから成る。２つのサブユニット、αおよびβは、高レベルの配列同一性を有する。これらの酵素はどちらも、グリコシドヒドロラーゼファミリー２０のメンバーとして分類され、そして通常リソソーム内に局在する。これらリソソームのβ−ヘキソサミニダーゼが正しく機能することが、ヒトの発生に決定的であり、それはそれぞれヘキソサミニダーゼＡおよびヘキソサミニダーゼＢの機能不全から起こる悲劇的な遺伝病、テイ−サックス病およびサンドホフ病によって強調される事実である［２５］。これらの酵素欠損は、リソソームにおける糖脂質および複合糖質の蓄積を引き起こし、神経機能障害および変形を引き起こす。有機体レベルにおけるガングリオシドの蓄積の有害な影響が、依然として明らかになりつつある［２６］。
【０００８】
これらのβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼの生物学的重要性の結果として、グリコシダーゼの小分子インヒビター［２７−２９］（非特許文献１）［３０］が、これらの酵素の生物学的プロセスにおける役割を明らかにするツールとして、および潜在的な治療的適用の開発において非常に注目された［３１］。小分子を用いたグリコシダーゼ機能の調節は、遺伝的ノックアウト研究に対して、迅速に投与量を変化させるか、または完全に処置を停止する能力を含む、いくつかの利点を提供する。
【０００９】
しかし、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを含む哺乳類グリコシダーゼの機能を阻害するインヒビターの開発における主な難点は、高等真核生物の組織に存在する多数の機能的に関連した酵素である。従って、１つの特定の酵素の細胞および有機体での生理学的役割の研究において非選択的インヒビターを使用することは、そのような機能的に関連する酵素の同時阻害によって複雑な表現型が生じるので、複雑である。β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの場合には、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用する既存の化合物は、非特異的であり、そしてリソソームβ−ヘキソサミニダーゼを阻害するよう強力に作用する。今までに、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼより核細胞質Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに選択的な、強力なインヒビターは知られていない。
【００１０】
細胞および組織の両方で、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ翻訳後修飾の研究において使用された、よりよく特徴付けられたβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼの少数のインヒビターは、ストレプトゾシン（ＳＴＺ）、２’−メチル−α−Ｄ−グルコピラノ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（ＮＡＧ−チアゾリン）およびＯ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（ＰＵＧＮＡｃ）である［７、３２−３５］。
【００１１】
ＳＴＺは、β−島細胞に対して特に有害な影響を有するので、糖尿病誘発性化合物として長く使用されてきた［３６］。ＳＴＺは、細胞ＤＮＡのアルキル化［３６、３７］および一酸化窒素を含むラジカル種の産生［３８］の両方によって、その細胞毒性効果を発揮する。生じたＤＮＡ鎖の切断は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）［３９］の活性化を促進し、最終的に細胞ＮＡＤ＋レベルを枯渇させ、そして最後には細胞死に至る［４０、４１］。他の研究者は別に、ＳＴＺ毒性は、β−島細胞内で高度に発現しているＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの不可逆的阻害の結果であると提唱した［３２、４２］。しかし、この仮説は、２つの独立した研究グループによって疑問を投げかけられた［４３、４４］。タンパク質の細胞Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルは、多くの形式の細胞ストレスに反応して増加するので［４５］、ＳＴＺは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに対する特異的および直接的作用によってではなく、細胞ストレスを誘発することによって、タンパク質のＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾レベルの増加を引き起こす可能性がある。実際、Ｈａｎｏｖｅｒおよび同僚らは、ＳＴＺはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの弱く、そしていくらか選択的なインヒビターとして機能することを示し［４６］、そしてＳＴＺはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを不可逆的に阻害するよう作用することが他の研究者によって提唱されたが［４７］、この作用形式を明らかに示すものはない。
【００１２】
ＮＡＧ−チアゾリンは、ファミリー２０ヘキソサミニダーゼ（非特許文献１）［３０］、（非特許文献２）［４８］、およびより近年には、ファミリー８４Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（非特許文献３）［４９］の強力なインヒビターであることが見出された。その効力にもかかわらず、複雑な生物学的状態でＮＡＧ−チアゾリンを使用することの欠点は、それが選択性を欠き、そして従って複数の細胞のプロセスを混乱させることである。
【００１３】
ＰＵＧＮＡｃは、同じ選択性の欠如の問題をかかえる別の化合物であるが、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ［１３、５０］およびファミリー２０ヒトβ−ヘキソサミニダーゼ［５１］の両方のインヒビターとして使用されてきた。Ｖａｓｅｌｌａおよび同僚らによって開発されたこの分子は、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ由来のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ、およびウシ腎臓由来のβ−ヘキソサミニダーゼの強力な競合的インヒビターであることが見出された［２８］。
【００１４】
従って、グリコシダーゼの改善された選択的インヒビターに対する必要性が生じた。
【非特許文献１】Ｓ．Ｋｎａｐｐら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９６）１１８、６８０４〜６８０５
【非特許文献２】Ｂ．Ｌ．Ｍａｒｋら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００１）２７６、１０３３０〜１０３３７
【非特許文献３】Ｍ．Ｓ．Ｍａｃａｕｌｅｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００５）２８０、２５３１３〜２５３２２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（要旨）
本発明の実施態様は、グリコシダーゼを選択的に阻害する化合物に関連する。本発明はまた、そのような化合物の作製方法、およびその使用にも関連する。
【００１６】
本発明の１つの実施態様において、その化合物は、一般的な化学式（Ｉ）：
【００１７】
【化５】
を有し、ここでＲ３、Ｒ５、Ｒ６は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る；Ｒ２およびＲ４は、ＣＨ２、ＣＨＲ１、ＮＨ、ＮＲ１、または任意のヘテロ原子であり、そしてＲ１は、Ｈ、エーテル、アミン、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択される。本発明は、上記の化合物の薬学的に受容可能な塩を含む。本発明のいくつかの実施態様において、Ｒ２はＳ、およびＲ１はＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなるグループから選択され、そしてＲ４はＯである。本発明はまた、その化合物のプロドラッグ、その化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物、ならびにその化合物のプロドラッグおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物に関連する。
【００１８】
本発明の別の実施態様において、その化合物は、一般的な化学式（ＩＩ）：
【００１９】
【化６】
およびその薬学的に受容可能な塩を有し、ここでＸ１−Ｘ６はＯ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、そしてＲ１からＲ５は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る。
【００２０】
いくつかの実施態様において、その化合物は、他のグリコシダーゼより特定のグリコシダーゼの活性を選択的に阻害する。本発明の１つの実施態様において、グリコシダーゼはグリコシドヒドロラーゼを含む。本発明の別の実施態様において、グリコシドヒドロラーゼは、ファミリー８４グリコシドヒドロラーゼである。本発明の特定の実施態様において、グリコシダーゼはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅである。化合物は、β−ヘキソサミニダーゼよりＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの活性を選択的に阻害する。特に、この特定の実施態様において、化合物は２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）のタンパク質からの切断を選択的に阻害する。
【００２１】
その化合物は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの過剰発現、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの枯渇に関連する疾患または障害を研究するための、およびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損または過剰発現またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積または枯渇に関連する疾患および障害の治療を研究するための、動物モデルを開発するのに有用である。そのような疾患および障害は、糖尿病、アルツハイマー病を含む神経変性性疾患、および癌を含む。その化合物はまた、グリコシダーゼ阻害治療に反応性の疾患および障害の治療においても有用である。その化合物はまた、細胞および組織を組織損傷またはストレスに関連するストレスに備えること、細胞を刺激すること、および細胞の分化を促進することにも有用である。これらの化合物はまた、特定のグリコシダーゼ、例えばファミリー８４グリコシドヒドロラーゼのメンバーである微生物の毒素を阻害するのにも有用であり得、そして従って抗菌剤としての用途が見出され得る。
【００２２】
本発明はまた、その化合物を作製する方法にも関連する。１つの実施態様において、その方法は、以下の工程を含み得る：
ａ）２−アミノ−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノースの塩酸塩を、ある範囲のアシル化剤でアシル化して、一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体を得る工程；
ｂ）一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体のアミドを、対応するチオアミドへ変換し、そしてチオアミドを環化して一連の３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程；そして
ｃ）チアゾリン化合物を脱アシル化して、一連の１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程。
【００２３】
本発明はまた、以下のことを含む、選択的グリコシダーゼインヒビターを作製する方法にも関連する：
ａ）２つまたはそれ以上のグリコシダーゼまたは１つのクラスのグリコシダーゼのインヒビターを選択する工程；
ｂ）側鎖を拡張または縮小することによって、インヒビターの１つまたはそれ以上の側鎖を修飾する工程；そして
ｃ）１つまたはそれ以上のグリコシダーゼの選択的阻害に関して、修飾したインヒビターを試験する工程。
【００２４】
本発明のいくつかの実施態様において、選択的グリコシダーゼインヒビターを作製する方法は、以下の工程を含む：
ａ）以下：
【００２５】
【化７】
およびその薬学的に受容可能な塩から選択される一般式を有する、β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼのインヒビターを選択する工程であって、ここでＸ１−Ｘ６は、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、そしてＲ１からＲ５は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、工程；
ｂ）側鎖の大きさを拡張または縮小することによって、インヒビターのＲ１側鎖を修飾する工程；そして
ｃ）１つまたはそれ以上のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼの選択的阻害に関して、修飾したインヒビターを試験する工程。
【００２６】
本発明のいくつかの実施態様において、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、またはそのヘテロ原子誘導体を側鎖へ挿入することによって、インヒビターのＲ１側鎖を拡張し得る。いくつかの特定の実施態様において、ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択される基を挿入することによって、Ｒ１鎖を拡張する。
【００２７】
図面において、本発明の実施態様を説明するよう意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（発明の詳細な説明）
以下の説明を通して、本発明のより完全な理解を提供するために特定の詳細を述べる。しかし、本発明はこれらの詳細なしで実施し得る。他の場合には、本発明を不必要にわかりにくくするのを避けるために、周知の要素は詳細に示されないか、または説明されない。従って、明細書および図は、制限的ではなく、説明的な意味にみなされる。
【００２９】
本発明は、グリコシダーゼを選択的に阻害する化合物を含む。本発明の１つの実施態様において、その化合物は、一般的な化学式（Ｉ）：
【００３０】
【化８】
を有し、ここでＲ３、Ｒ５、Ｒ６は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなるグループから選択されるアシル基を含み得る；Ｒ２およびＲ４は、ＣＨ２、ＣＨＲ１、ＮＨ、ＮＲ１または任意のヘテロ原子であり、そしてＲ１は、Ｈ、エーテル、アミン、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択される。本発明は、上記の化合物の薬学的に受容可能な塩を含む。いくつかの実施態様において、Ｒ２はＳ、Ｒ１は、ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択され、そしてＲ４はＯである。本発明のいくつかの特定の実施態様において、その化合物は、１，２−ジデオキシ−２’−エチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−プロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−ブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−ペンチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−イソプロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−イソブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを含む。
【００３１】
当業者によって認識されるように、上記の式（Ｉ）は、代わりに以下：
【００３２】
【化９】
のようにも示し得る。
【００３３】
本発明の別の実施態様において、その化合物は一般的な化学式（ＩＩ）：
【００３４】
【化１０】
、およびその薬学的に受容可能な塩を有し、ここでＸ１−Ｘ６は、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１からＲ５は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなるグループから選択されるアシル基を含み得る。
【００３５】
本発明は、上記の化合物の薬学的に受容可能な塩を含む。いくつかの実施態様において、Ｒ１はＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択され、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はＯＨであり、Ｘ１およびＸ２はＯであり、Ｘ３はＮＨであり、Ｘ４およびＸ５はＯであり、Ｘ６はＮＨであり、そしてＲ５はＣ６Ｈ６である。本発明のいくつかの特定の実施態様において、その化合物は、Ｏ−（２−デオキシ−２−プロパミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、Ｏ−（２−デオキシ−２−ブタミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、Ｏ−（２−デオキシ−２−吉草酸アミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、Ｏ−（２−デオキシ−２−ヘキサミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、Ｏ−（２−デオキシ−２−イソブタミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、またはＯ−（２−デオキシ−２−イソ吉草酸アミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメートを含む。
【００３６】
この出願を通して、「化合物」という用語は、上記で議論された化合物を指し、そしてアシル保護誘導体を含むその化合物の誘導体、およびその化合物および誘導体の薬学的に受容可能な塩を含むことが企図される。本発明はまた、その化合物のプロドラッグ、その化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物、ならびにその化合物のプロドラッグおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物も含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施態様において、その化合物は、他のグリコシダーゼより特定のグリコシダーゼの活性を選択的に阻害する。そのグリコシダーゼは、グリコシドヒドロラーゼを含み得る。例えば、そのグリコシドヒドロラーゼは、ファミリー８４グリコシドヒドロラーゼであり得る。本発明の特定の実施態様において、そのグリコシダーゼはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅである。本発明は、β−ヘキソサミニダーゼよりＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの活性を選択的に阻害する化合物を含む。特に、その化合物は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃのタンパク質からの切断を選択的に阻害する。
【００３８】
本発明の化合物は、細胞および有機体レベルにおいてＯ−ＧｌｃＮＡｃの生理学的役割を研究するための貴重なツールである。その化合物は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損または過剰発現、またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積または枯渇に関連する疾患または障害を研究するための動物モデルを開発するためにか、あるいはこれらの疾患または障害の治療を研究するために有用である。一例として、その化合物は、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病の発症に関する疾患モデルの開発に有用である。
【００３９】
ＩＩ型糖尿病は、ヒトまたは動物が血中グルコースレベルを適切に制御できない場合に発症する。組織は、グルコース利用能の変化および内分泌系の他の構成要素からのシグナルを感知し、そして迅速に応答できなければならない。グルコースは、インスリン合成および膵臓β-細胞からの分泌の調節に重要な栄養素である。細胞に入る全てのグルコースのうち、２−５％はヘキソサミン生合成経路へ向けられ、それによってこの経路の最終産物、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）の細胞濃度を調節する［５２］。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、核細胞質酵素Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＯＧＴａｓｅ）の基質であり［５３−５６］、それは多数の核細胞質タンパク質の特定のセリンおよびスレオニン残基にＧｌｃＮＡｃを翻訳後に付加するように作用する。ＯＧＴａｓｅは、そのテトラトリコペプチド反復（ＴＰＲ）ドメイン［６１、６２］によって、多くのその基質［５７、５８］および結合パートナー［５９、６０］を認識する。上記で記載したように、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ［１３、１５］は、この翻訳後修飾を除去してタンパク質を遊離し、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾を、タンパク質の寿命の間に数回起こる動的なサイクルにする［６３］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃは、いくつかのタンパク質において公知のリン酸化部位に見出され［３、６４−６６］、細胞シグナル伝達におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃの役割を示唆した。さらに、ＯＧＴａｓｅは、細胞内ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ基質濃度、そしてそれゆえグルコース供給に対して鋭敏に感受的にする一般的ではない動態挙動を示す［６７］。これらのデータは全て、栄養素感知メカニズムとして作用するＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルの論理的役割を示す。栄養素感知におけるそのような可能性のある役割を支持するために、末梢組織において上昇したＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルはインスリン抵抗性の発症を引き起こすことが示された［７、２１］。実際、一塩基多型がメキシコ人集団におけるＩＩ型糖尿病の発症に関連することを示す最近の研究によって、顕著に上昇したＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルが、ＩＩ型糖尿病を引き起こし得ることが提唱された［６８］。増加したＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルがインスリン抵抗性を引き起こすことを示すために、培養細胞および組織において、ＰＵＧＮＡｃが使用された［７、３２−３５］。類推によって、本発明の化合物も、同様の研究において使用し得、そして糖尿病の発症におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルの役割を示すための動物モデルを開発するために使用し得る。
【００４０】
本発明の化合物はまた、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損または過剰発現、またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積または枯渇に関連する疾患または障害、またはグリコシダーゼ阻害治療に反応性の任意の疾患または障害の治療においても有用である。そのような疾患および障害は、糖尿病、アルツハイマー病（ＡＤ）のような神経変性性疾患、および癌を含むがこれに限らない。そのような疾患および障害はまた、酵素ＯＧＴａｓｅの蓄積または欠損に関連する疾患または障害を含み得る。
【００４１】
例えば、上記で議論したようなＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルおよびタウのリン酸化レベルの間の関係のために、本発明の化合物を、ＡＤおよび他のタウオパチー（tauopathy）を研究および治療するために使用し得る。ヒト脳において、タウの６個のアイソフォームが見出された。ＡＤ患者において、タウの６個のアイソフォームの全てがＮＦＴにおいて見出され、そして全てが顕著に過剰リン酸化されている［６９、７０］。健常な脳組織におけるタウは、２または３つのリン酸基しか有していないが、ＡＤ患者の脳において見出されるものは平均で８個のリン酸基を有する［７１、７２］。
【００４２】
タウにおけるＯ−ＧｌｃＮＡｃの存在は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルをタウリン酸化レベルと関連付ける研究を刺激した。この分野における最近の関心は、多くのタンパク質においてリン酸化されることも公知であるアミノ酸残基において、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾が起こることが見出されたという観察に由来する［６５、６６、７３］。この観察と一致して、リン酸化レベルの増加は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルの減少を引き起こし、そして逆に、増加したＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルは減少したリン酸化レベルと関連することが見出された［７４］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃおよびリン酸化の間のこの相互関係は、「陰陽仮説」［７５］と命名され、そして酵素ＯＧＴａｓｅ［５５］がタンパク質からリン酸基を除去するよう作用するホスファターゼと機能的複合体を形成するという最近の発見によって、強力な生化学的支持を得た［６０］。リン酸化と同様に、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃは、タンパク質の寿命の間に数回除去および再設置され得る動的な修飾である。示唆的に、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅをコードする遺伝子が、ＡＤに関連した染色体の遺伝子座にマッピングされた［１５、７６］。
【００４３】
ごく最近、ＡＤを発症したヒト脳由来の可溶性タウタンパク質のＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルは、健常な脳由来のものより顕著に低いことが示された［１７］。さらに、罹患した脳由来のＰＨＦは、いかなるＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾も完全に欠くことが示唆された［１７］。このタウの低グリコシル化の分子的基礎は未知であるが、キナーゼの活性の増加および／またはＯ−ＧｌｃＮＡｃのプロセシングに関係する酵素の１つの機能不全に起因し得る。この後者の視点を支持して、ＰＣ−１２神経細胞およびマウスの脳組織切片の両方において、非選択的Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼインヒビターを使用してタウＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルを増加させ、そこでリン酸化レベルが減少したことが観察された［１７］。これらの集合的な結果は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの作用を阻害することによるように、ＡＤ患者において健常なＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルを維持することによって、タウの過剰リン酸化、およびＮＦＴの形成および下流の影響を含む、タウ過剰リン酸化に関連する全ての影響を阻害できるはずであることを意味する。しかし、β−ヘキソサミニダーゼが正常に機能することが重要であるので、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの作用を阻害するＡＤの治療のためのあらゆる可能性のある治療的介入は、ヘキソサミニダーゼＡおよびＢ両方の同時阻害を避けなければならない。この選択的阻害が、本発明の化合物によって提供される。
【００４４】
本発明の化合物は、他の型のグリコシダーゼの選択的インヒビターとして有用である。例えば、いくつかの微生物毒素は、ファミリー８４グリコシドヒドロラーゼのメンバーであり、そして従って本発明の化合物は、抗菌薬として有用であり得る。
【００４５】
本発明の化合物はまた、多能性細胞を島β細胞へ促進するように、細胞の分化を促進するのにも有用である。例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃは、いくつかの転写因子の機能を調節することが公知であり、そして転写因子ＰＤＸ−１において見出されることが公知である。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ残基の修飾による、転写因子ＰＤＸ−１の修飾は、ＰＤＸ−１の活性に影響を与え、それは次に細胞分化に影響を与え得る。
【００４６】
本発明の化合物はまた、ストレスに対して細胞を備えるのに有用である。最近の研究は、ＰＵＧＮＡｃを動物モデルにおいて使用して、左冠動脈閉塞後の心筋梗塞の大きさを抑制し得ることを示した［７７］。
【００４７】
本発明はまた、その化合物を作製する様々な方法に関連する。１つの実施態様において、その方法は以下の工程を含み得る：
ａ）２−アミノ−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノースの塩酸塩を、ある範囲のアシル化剤でアシル化して、一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体を得る工程；
ｂ）一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体のアミドを、対応するチオアミドへ変換し、そしてチオアミドを環化して一連の３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程；そして
ｃ）チアゾリン化合物を脱アシル化して、一連の１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程。
【００４８】
本発明はまた、例えば以下の工程を含む、選択的グリコシダーゼインヒビターを作製する方法に関連する：
ａ）２つまたはそれ以上のグリコシダーゼまたは１つのクラスのグリコシダーゼのインヒビターを選択する工程；
ｂ）側鎖を拡張または縮小することによって、インヒビターの１つまたはそれ以上の側鎖を修飾する工程；そして
ｃ）１つまたはそれ以上のグリコシダーゼの選択的阻害に関して、修飾したインヒビターを試験する工程。
【００４９】
本発明のいくつかの実施態様において、選択的グリコシダーゼインヒビターを作製する方法は、以下の工程を含む：
ａ）以下：
【００５０】
【化１１】
およびその薬学的に受容可能な塩から選択される一般式を有する、β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼのインヒビターを選択する工程であって、ここでＸ１−Ｘ６は、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１からＲ５は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、工程；
ｂ）側鎖の大きさを拡張または縮小することによって、インヒビターのＲ１鎖を修飾する工程；そして
ｃ）１つまたはそれ以上のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼの選択的阻害に関して、修飾したインヒビターを試験する工程。
【００５１】
本発明のいくつかの実施態様において、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、またはそのヘテロ原子誘導体を側鎖へ挿入することによって、インヒビターのＲ１鎖を拡張し得る。いくつかの特定の実施態様において、ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択される基を挿入することによって、Ｒ１鎖を拡張する。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は、本発明の実施態様を説明することを意図し、そして制限する形式で解釈することを意図しない。
【００５３】
（実施例１：Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの触媒メカニズムの比較分析）
１．１ Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの可能性のある触媒メカニズム
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのインヒビターを設計するための論理的な開始点は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの触媒メカニズムを考慮する。ファミリー２０ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＡおよびＢの触媒作用メカニズムはかなりよく確立されたが［７８］、ファミリー８４Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのものは未知のままである。従って、発明者はまず、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの触媒メカニズムを明らかにし、そして次に、強力で、細胞透過性であり、そしてリソソームβ−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに高度に選択的な、単純なインヒビターを設計するためにこの情報を使用した。
【００５４】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびファミリー８４グリコシドヒドロラーゼに関して、３つの現実的なメカニズムの選択肢が存在する。最初の選択肢は、ファミリー２３のグリコシドヒドロラーゼ由来のガチョウリゾチーム［７９］に関して見出されたような、逆転メカニズム（図１Ａ）である。この触媒メカニズムは一般的に、酸触媒された脱離基の離脱と同時に、アノマー中心における水の塩基触媒された求核攻撃を含む。
【００５５】
２番目のメカニズムの可能性は、アノマー中心における配置の保持を引き起こす、標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）２段階２重置換メカニズムである（図１Ｂ）。このメカニズムは、ほとんどの保持性（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）β−グリコシダーゼによって使用され、そして、第１段階でアノマー中心における酵素求核試薬の攻撃を含み、一時的な共有結合性のグリコシル酵素中間体の形成を引き起こす［８０］。アグリコン脱離基の離脱は、一般酸触媒として作用する酵素残基によって促進される。第２段階において、この同じ残基が一般塩基触媒として作用して、アノマー中心における水分子の攻撃を促進し、中間体を分解して立体化学の保持されたヘミアセタール産物を遊離させる。ファミリー３のグリコシドヒドロラーゼ由来のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、ファミリー２２のＣ型リゾチームと同様に［８２］、このメカニズムを使用することが示された［８１］。
【００５６】
３番目のメカニズムの選択肢は、酵素の触媒求核試薬の代わりに、基質の２−アセトアミド基の求核性の関与を含む（図１Ｃ）。この最後のメカニズムの選択肢は、ファミリー２０のグリコシドヒドロラーゼ由来のβ−ヘキソサミニダーゼによって利用される［３０、４８、８３］。これらの３つのメカニズムは、いくつかの面で異なる。逆転メカニズムは、アノマー中心において逆転した立体化学を有する産物の形成を引き起こす１段階の反応である。他の２つの選択肢は、アノマー中心において立体化学を保持し、そして主に中間体の性質において互いに異なる。２番目のメカニズムにおいて、この種は共有結合の酵素付加物であり、一方３番目の場合にはそれは二環性のオキサゾリンまたはオキサゾリニウムイオンであると考えられる。
【００５７】
これらのメカニズムの選択肢間の重要な違いは、基質の２−アセトアミド基の関与である。この部分は、リソソームβヘキソサミニダーゼに関するように、求核試薬として触媒作用に積極的に関与し得るか、または受動的に（as a bystander）作用し得る。
【００５８】
１．２ 基質アナログの合成
基質の２−アセトアミド基の役割に取り組むために、Ｎ−アセチル基に異なるレベルのフッ素置換を有する、いくつかの基質アナログを合成した（スキーム１）。高度に電気陰性のフッ素置換基は、カルボニル基の塩基性度を減少させ、そして隣接基補助を用いる酵素反応に対するそのような置換の期待される効果は、その速度を減少させることである。
【００５９】
【化１２】
１．２．１ 基質アナログの合成に関する一般的な手順
この研究において使用した全ての緩衝液塩は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。乾燥メタノールおよびトルエンは、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。ジクロロメタンおよびトリエチルアミンは、使用の前にＣａＨ２に対して蒸留することによって乾燥した。β−ヘキソサミニダーゼは、Ｓｉｇｍａから購入した（ロット０４３Ｋ３７８３）。ＳＴＺは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、そしてサンプルをアッセイの直前に新しく溶解した。ＰＵＧＮＡｃはＴｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た。他の試薬は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、そしてさらなる精製をせずに使用した。全ての緩衝液を調製するためにＭｉｌｌｉ−Ｑ（１８．２ｍΩ／ｃｍ）水を使用した。合成反応を、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４アルミニウム裏打ちシートを使用してＴＬＣによってモニターした。２ＭのＨ２ＳＯ４中１０％のモリブデン酸アンモニウムで焦がし、そして加熱することによって化合物を検出した。Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（２３０−４００メッシュ）によって、指定された溶離剤を用いて、陽圧下でのフラッシュクロマトグラフィーを行った。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＡＳ５００ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａ分光計で５００ＭＨｚにおいて記録した（適当な場合にＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤ、または（ＣＤ３）２ＳＯに対する相対的な化学シフトを引用した）。１９Ｆ ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＡＳ５００ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａ分光計で４７０ＭＨｚにおいて記録し、そして参照としてＣＦ３ＣＯ２Ｈとプロトンカップリングさせる。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＡＳ５００ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａ分光計で１２５ＭＨｚにおいて記録した（ＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤ、または（ＣＤ３）２ＳＯに対する相対的な化学シフトを引用した）。細胞培養および酵素アッセイにおいて使用した全ての化合物の元素分析を、Ｓｉｍｏｎ Ｆｒａｓｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて行った。
【００６０】
１．２．２ ４−メチルウンベリフェロン２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
４−メチルウンベリフェリル２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド塩酸塩（３）を、本質的にＲｏｅｓｅｒおよびＬｅｇｌｅｒ［８４］によって記載されたように調製し、そしてさらなる精製無しに使用した。
【００６１】
１．２．３ ４−メチルウンベリフェリル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（４ａ）の合成
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１０ｍＬ）中の冷却した（０℃）塩酸塩３（０．５０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．３ｍＬ、０．２１ｇ、２．１ｍｍｏｌ）および乾燥ピリジン（１０ｍＬ）を加えた。乾燥ＤＯＷＥＸ−５０Ｈ＋樹脂（６ｇ）を含む乾燥ＤＭＦ（４５ｍＬ）の攪拌した混合物に、フルオロ酢酸ナトリウム（０．９ｇ）を加えた。１時間後ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１．６ｇ、７．８ｍｍｏｌ）および３０ｍＬのフルオロ酢酸溶液（６．０ｍｍｏｌ）を、塩酸塩３を含む反応容器へカニューレによって加えた。できた溶液を０℃で１６時間置き、その後ＴＬＣ分析によって反応が終わったことを判断した。減圧下で溶媒を部分的に除去し、その後酢酸エチル（５０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム溶液（２０ｍＬ）を加えた。有機層を回収し、そして水層を酢酸エチルで２回抽出した。あわせた有機抽出物を、水、飽和炭酸水素ナトリウムで２回、および最後に飽和塩化ナトリウムで連続的に洗浄した。有機抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で溶媒を除去して淡黄色のシロップを得た。フラッシュカラムシリカクロマトグラフィー（２：１；酢酸エチル−ヘキサン）を用いて望ましい産物を精製し、部分的に精製した望ましい化合物を、非晶質の白色固体として得て（約３５６ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、６８％）、それをさらなる精製なしに、次の工程で使用した。
【００６２】
１．２．４ ４−メチルウンベリフェリル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−ジフルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（４ｂ）の合成
ジメチルホルムアミドの溶液（ＤＭＦ、６ｍＬ）中の冷却した（０℃）塩酸塩３（０．１５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．０９ｍＬ、０．０６３ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）および乾燥ピリジン（３ｍＬ）を加えた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、０．４８ｇ、２．３ｍｍｏｌ）およびジフルオロ酢酸（０．１２ｍＬ、０．１８ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を、シリンジによって反応混合物中に加えた。できた溶液を０℃で１６時間置き、その後２滴のジフルオロ酢酸を加えた。さらに室温で３．５時間後、ＴＬＣ分析によって反応が終わったことを判断した。減圧下で溶媒を部分的に除去し、その後酢酸エチル（５０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム溶液（２０ｍＬ）を加えた。有機層を回収し、そして水層を酢酸エチルで２回抽出した。あわせた有機抽出物を、水、飽和炭酸水素ナトリウムで２回、および最後に飽和塩化ナトリウム溶液で連続的に洗浄した。有機抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で溶媒を除去して淡黄色のシロップを得た。グラジエント溶媒系（１：１；ヘキサン−酢酸エチル）を用いたフラッシュカラムシリカクロマトグラフィーを用いて望ましい産物を精製し、部分的に精製した望ましい化合物を、非晶質の白色固体として得て（約０．１０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、６４％）、それをさらなる精製なしに、次の工程で使用した。
【００６３】
１．２．５ ４−メチルウンベリフェリル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−トリフルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（４ｃ）の合成
ジメチルホルムアミドの溶液（ＤＭＦ、６ｍＬ）中の冷却した（０℃）塩酸塩３（０．１０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．０６ｍＬ、０．４２ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加えた。次いで反応混合物を０℃まで冷却し、そしてシリンジによってトリフルオロ酢酸無水物（０．０８ｍＬ、０．１２ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を加えた。できた溶液を０℃で１６時間置き、その後ＴＬＣ分析によって反応が終わったことを判断した。反応混合物を次いで酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、そして飽和塩化ナトリウム溶液（４０ｍＬ）を加えた。有機相を回収し、そして水相を酢酸エチルで２回抽出した。あわせた有機抽出物を、水、飽和炭酸水素ナトリウムで２回、および最後に飽和塩化ナトリウム溶液で連続的に洗浄した。有機抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で溶媒を除去して淡黄色のシロップを得た。グラジエント溶媒系（１：１；ヘキサン−酢酸エチル）を用いたフラッシュカラムシリカクロマトグラフィーを用いて望ましい産物を精製し、部分的に精製した望ましい化合物を、非晶質の白色固体として得て（約０．９３ｇ、０．１７ｍｍｏｌ、８２％）、それをさらなる精製なしに、次の工程で使用した。
【００６４】
１．２．６ ４−メチルウンベリフェリル２−デオキシ−２−フルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（５ａ−ｃ）の合成の一般的な手順
乾燥メタノール中の各グリコシドの溶液に、スパチュラの先ほどの無水ナトリウムメトキシドを加えた。できた塩基性溶液を、ＴＬＣ分析によって反応が終わったことを判断するまで、窒素下で攪拌した。Ｄｏｗｅｘ−５０Ｈ＋樹脂を、溶液のｐＨが中性になるまで、攪拌した反応混合物に加えた。懸濁液をろ過し、そしてフィルターケーキをメタノールで徹底的にすすぎ、その後あわせたろ過物からの溶媒を減圧下で除去した。望ましい脱保護グリコシドを、以下の溶媒システムを用いたフラッシュカラムシリカクロマトグラフィーによって単離した：Ｎ−トリ−およびＮ−ジフルオロアセチル誘導体（５ｂおよび５ｃ）に関しては酢酸エチル−メタノール−水（１２：１：１）、およびＮ−モノフルオロアセチル誘導体（５ａ）に関しては酢酸エチル−メタノール（１：１）。産物をエタノールおよびジエチルエーテルから再結晶化して望ましい産物を得、２つの工程の全体的な収率は、Ｎ−トリフルオロアセチル誘導体（５ｃ）に関して６６％、Ｎ−ジフルオロアセチル誘導体（５ｂ）に関して３７％、およびＮ−フルオロアセチル誘導体（５ａ）に関して４５％であった。
【００６５】
４−メチルウンベリフェリル２−デオキシ−２−フルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ）（５ａ）
【００６６】
【化１３】
４−メチルウンベリフェリル２−デオキシ−２−ジフルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２）（５ｂ）
【００６７】
【化１４】
４−メチルウンベリフェリル２−デオキシ−２−トリフルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ３）（５ｃ）
【００６８】
【化１５】
１．３ Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの動態分析
１．３．１ 動態分析のための実験手順
全てのアッセイを、停止アッセイ（ｓｔｏｐｐｅｄ ａｓｓａｙ）手順を用いて、３７℃で３０分間、３組行い、ここで酵素反応（２５μＬ）を、６倍過剰（１５０μＬ）の反応停止緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ１０．７５）を加えることによって反応停止させる。酵素（３μＬ）をシリンジで加えることによってアッセイを開始し、そして全ての場合においてできた反応停止溶液の最終的なｐＨは、１０より高かった。β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの時間依存的アッセイは、どちらの酵素も、この期間中そのそれぞれの緩衝液；５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５および５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ６．５の中で安定であったことを明らかにした。３０分の終了における反応の進行を、Ｖａｒｉａｎ ＣＡＲＹ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ９６穴プレートシステムを用いた蛍光測定、および同一の緩衝液条件下での４−メチルウンベリフェロンの標準曲線との比較によって決定した、遊離した４−メチルウンベリフェロンの程度を測定することによって決定した。５ｍｍのスリット開口で、それぞれ３６８および４５０ｎＭの励起および発光波長を使用した。ヒト胎盤β−ヘキソサミニダーゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（ロット０４３Ｋ３７８３）。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのクローニングおよび発現は、文献に記載されている［８５］。両方の酵素を、ＰＢＳ緩衝液に対して透析し、そしてその濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて決定した。フッ素化した基質と共にアッセイで使用したβ−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの濃度（μｇ／μｌ）は以下の通りであった：４−メチルウンベリフェリル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ）（５）：０．０００７７、０．０１２６；ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ（５ａ）：０．００３１、０．０１８９；ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２（５ｂ）：０．０１５４、０．０７５６、およびＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ３（５ｃ）：０．０１５４、０．０１５２３。それに加えて、β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを、それぞれ０．０１５４および０．０３７８の濃度（μｇ／μＬ）で使用して、基質５を０．６４ｍＭの濃度で使用してインヒビターを試験した。８ｅのＫＩ値が高いために、インヒビターをそのような高濃度にできないインヒビター８ｅとβ−ヘキソサミニダーゼのアッセイを除いて、全てのインヒビターを、ＫＩの５倍から５分の１までの範囲の８つの濃度で試験した。ＫＩ値を、ディクソンプロットにおけるデータの線形回帰によって決定した。必要な場合には、アッセイを３組行い、そしてエラーバーをデータのプロットに含める。
【００６９】
１．３．２ 基質アナログを用いた動態分析の結果
リソソームヒトβ−ヘキソサミニダーゼは、隣接基補助を含むメカニズムによって進行することが公知であるので、これらの化合物を、最初にこの酵素と試験した（図２Ａ）。全ての基質に関してＭｉｃｈａｅｌｉａｎ飽和動態は観察されなかったが（表１）、酵素触媒反応を支配する二次速度定数に比例するＶｍａｘ［Ｅ］０／ＫＭを、ミカエリス−メンテンプロットの最初の傾きから決定し得る（図２Ａ挿入図）。Ｎ−アシル置換基のＴａｆｔ電子パラメーター（σ＊）に対するｌｏｇ Ｖｍａｘ［Ｅ］０／ＫＭのプロットは、増加するフッ素置換に対して負の線形の相関を示す（図２Ｃ）。予期されるように、カルボニル酸素の塩基性の減少は、触媒作用に有害な影響を有する。Ｔａｆｔ様線形自由エネルギー分析の急な負の傾き（反応定数によって与えられる、ρ＝−１．０±０．１）は、カルボニル酸素が、アノマー中心を攻撃する求核試薬として作用することを示唆する。
【００７０】
【表１】
表１：一連の４−メチルウンベリフェロン２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドのβ−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ触媒加水分解に関するミカエリス−メンテンパラメーター。
ａ各Ｎ−アシル置換基に関して使用したＴａｆｔ電子パラメーター（σ＊）は、ＨａｎｓｃｈおよびＬｅｏから得た［８６］。
ｂミカエリス−メンテンデータの非線形回帰によって値を推定した。限られた基質の溶解性のために、アッセイした基質濃度はＫＭに匹敵するが超えないことに注意。
ｃ基質溶解性の制限のために飽和動態が観察されなかったので、これらの値は決定できなかった。
ｄミカエリス−メンテンプロットの２次領域の線形回帰によって値を決定した。
【００７１】
このデータは、酵素触媒糖質加水分解に関して一般的に提唱された、アノマー中心の求電子性転移および結果としてのオキソカルベニウムイオン様転移状態を含むメカニズムと一致する［８０、８２］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関しては、ミカエリス飽和動態が４つの基質すべてに関して観察され、従って両方の動態パラメーターを決定した（表１、図２Ｂ）。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関して、Ｖｍａｘ［Ｅ］０／ＫＭの値もフッ素置換の程度に依存しているが、傾きはよりゆるやかである（ρ＝−０．４２±０．０８、図２Ｃ）。これらの結果に基づいて、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼと共通で、隣接基補助を含む触媒メカニズムを使用するようである。
【００７２】
Ｔａｆｔ様分析の相関関係の傾きである反応定数（ρ）は、異なる基質に対する反応の感受性の指標である。この定数は、以下の式によって、電気的要素（ρ＊、置換基の電気的パラメーター、σ＊に対する反応の感受性によって支配される）および空間的要素（δ、置換基の空間的Ｔａｆｔパラメーター、Ｅｓに対する反応の感受性によって支配される）の両方の関数であると考え得る。
【００７３】
ρ＝ρ＊＋δ（式１）。
【００７４】
従って、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関して測定された傾きの間の差異は、反応座標に沿った転移状態の位置を反映し得るか、またはリソソームβ−ヘキソサミニダーゼはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅよりも空間的に制約のある活性部位構造を有することを示し得る。実際、よくある誤解は、フッ素（１４７ｐｍのファンデルワールス半径および１３８ｐｍのＣ−Ｆ結合距離）は、多くの場合水素（１２０ｐｍのファンデルワールス半径および１０９ｐｍのＣ−Ｈ結合距離）と比較して、大きさにわずかな違いしかないと考えられることである。従って、基質およびヒトβ−ヘキソサミニダーゼの活性部位の間の不利な空間的相互作用が、電子を超えて、様々なレベルのフッ素置換の間を区別することにさらなる役割を果たし得ることが可能である。実際、ヒトヘキソサミニダーゼＢの最近の結晶構造は、３つのトリプトファン残基の間にアセトアミド基を堅固に抱える、注意深く構成されたポケットを明らかにした［７８、８７］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関しては、３次元構造は入手可能でない。しかし、全ての基質アナログに関して測定された相対的な定数ＫＭ値は、空間的影響は主要な誘因ではなく、そしてＮ−アシル−フッ素置換基の電子的影響が優勢であることを示唆する。アセトアミド基に２つまたは３つのフッ素置換基を有する２つのパラ−ニトロフェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を用いた、未知のファミリーの単離された酵素についての初期の研究は、−１．４１±０．１のρ＊を得た［８８］。この値は、この研究においてリソソームβ−ヘキソサミニダーゼに関して見出されたもの（ρ＊＝−１．０±０．１）よりさらに大きく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからＫｏｓｍａｎおよびＪｏｎｅｓが研究した酵素は、ファミリー８４ではなく、ファミリー２０のグリコシドヒドロラーゼのメンバーである可能性が高い。
【００７５】
１．３．３ ＮＡＧ−チアゾリンをインヒビターとして使用した動態分析の結果
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅが、隣接基補助を含む触媒メカニズムを使用するかどうかのさらなる試験として、インヒビターＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）をこの酵素と試験した。二環性オキサゾリン中間体の模倣物として設計されたＮＡＧ−チアゾリンは、ファミリー２０ヘキソサミニダーゼのインヒビターとして機能することが以前に示された［３０、４８］。ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質として使用して、ＮＡＧ−チアゾリンは、ファミリー８４ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの強力なインヒビターであることが見出され、そして競合的阻害の明らかなパターンが観察された（図３）。非線形回帰が、ｐＨ７．４における１８０ｎＭのＫＩ値を明らかにし、そしてＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ（５）を用いた分析が、ｐＨ６．５における７０ｎＭのＫＩ値を明らかにした。従って、ＮＡＧ−チアゾリンは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの強力なインヒビターであり、ｐＨ６．５において親の糖類であるＧｌｃＮＡｃ（ＫＩ＝１．５ｍＭ）よりも約２１０００倍強く結合する。この強力な阻害は、ＮＡＧ−チアゾリンの推定されるオキサゾリン中間体または構造的に関連する転移状態との類似に起因し得る。実際、観察された阻害データは、ファミリー２０ヒトリソソームβ−ヘキソサミニダーゼ（ＫＩ＝７０ｎＭ、ＫＩ値が１．２ｍＭであるＧｌｃＮＡｃより１７０００倍強い）に関して発明者が測定したものと同様であり、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、ファミリー２０β−ヘキソサミニダーゼと同様、隣接基補助を含む触媒メカニズムを使用することを示すＴａｆｔ様分析を強力に支持する。オリゴ糖鎖を切断するよう作用するエンドグリコシダーゼである、ファミリー１８［８９］および５６［９０］のグリコシドヒドロラーゼも、隣接基補助を含むメカニズムを使用することが示された［９１］。従って、ファミリー１８、２０、５６および８４は全て、基質のアセトアミド基からの隣接基補助を含む触媒メカニズムを使用する保持性グリコシダーゼから成る。これは、そのそれぞれの基質の２位にアセトアミド基を有する基質に作用するファミリー３および２２の保持性β−グリコシダーゼ［８１、８２］、およびファミリー２３逆転エンドグリコシダーゼと非常に対照的である。
【００７６】
【表２】
表２：Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼ両方に関するインヒビターの阻害定数および選択性。全てのＫＩ値を、ディクソンプロットの線形回帰を用いて決定した。
【００７７】
（実施例２：選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの最初の実施態様の設計および合成）
２．１ 選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの最初の実施態様の設計
ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ、および拡張して（ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｔｉｏｎ）ファミリー８４のグリコシドヒドロラーゼの他のメンバーのメカニズムが確立され、ヒトリソソームβ−ヘキソサミニダーゼよりもこの酵素に選択的なインヒビターの設計にこの情報を使用することへ注意が向けられた。β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅはどちらも隣接基補助を含むメカニズムを使用するので、必要な選択性を生ずるよう作り上げ得る足場として、ＮＡＧ−チアゾリンを選択した。３つの観察が、そのインヒビターの設計における開始点を提供した。最初のものは、リソソーム酵素のＴａｆｔ様分析の傾きが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関して測定されたものよりもかなり急で、それによってＮ−アシル基の大きさが、基質認識における決定要因であり得ることを示唆することである（前述を参照のこと）。２番目の、そして関連する考察は、ヒトリソソームβ−ヘキソサミニダーゼＢの構造は、アセトアミド置換基のメチル基が釣り合う、ぴったり合うポケットを明らかにする［７８］。３番目は、大きなＮ−アシル置換基を有するＳＴＺが、β−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅにいくらかの選択性を示すことである［４６］。
【００７８】
２．２ 選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの最初の実施態様の合成
一連の７つのインヒビターを調製し、ここでチアゾリン環を、これらの化合物がリソソームヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅについての明確な阻害を可能にすることを期待して、増加する長さの脂肪族の鎖と共に合成した。このインヒビターのパネルの合成を、スキーム２で概略を述べる。この容易な合成経路は、市販で入手可能な開始材料から３つの工程で、または安価な開始材料２−アミノ−２−デオキシ−グルコピラノースから６つの工程で、多量のインヒビターの産生を可能にする。
【００７９】
【化１６】
２．２．１ 化合物の合成の一般的な手順
一般的な手順は、上記で述べた基質アナログの合成と同じである。
【００８０】
２．２．２ １，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ａ−ｇ）の合成の一般的な手順
１容積の乾燥ジクロロメタン中の２−アミノ−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノース（６）［９２］の塩酸塩の溶液に、２当量の乾燥トリエチルアミンを加え、このとき開始材料を溶解した。反応混合物を０℃に冷却し、そして１．２当量の適当な塩化アシルをシリンジで加えた。できた混合物を、室温で約２時間攪拌した。ＴＬＣ分析によって反応混合物が完了したことを判断した時に、５容積の酢酸エチルを加えた。できた有機相を、水、１ＭのＮａＯＨ、および飽和塩化ナトリウムで連続的に洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして濃縮して白色の結晶性固体を得た。その物質を、酢酸エチルおよびヘキサンの混合物を用いて再結晶化し、望ましいＮ−アシル化された物質を、４６から７４％の範囲の収率で得た。
【００８１】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−プロピル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｂ）
【００８２】
【化１７】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−ブチル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｃ）
【００８３】
【化１８】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−ペンチル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｄ）
【００８４】
【化１９】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｅ）
【００８５】
【化２０】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−イソブチル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｆ）
【００８６】
【化２１】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−イソペンチル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｇ）
【００８７】
【化２２】
２．２．３ ３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−ＮＡＧ−チアゾリンアナログ）（８ａ−ｇ）の合成の一般的な手順
無水トルエン中の適当な１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−Ｎ−アシル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（７ａ−ｇ）の溶液に、ローソン試薬（０．６当量）を加え、そして反応混合物を２時間還流し、その後ＴＬＣ分析によって反応が完了したことを判断した。溶液を室温に冷却し、そして溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンに溶解し、そしてヘキサンおよび酢酸エチルの４：１から１：２まで範囲の適当な比の溶媒システムを用いて、フラッシュカラムシリカクロマトグラフィーによって望ましい物質を単離した。６２から８３％の範囲の収率で産物を単離した。３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−メチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ａ）は、上記で記載されたような同様の反応条件を用いて以前に調製された［３０］。全てのスペクトルの特徴は、文献の値と一致した。
【００８８】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−エチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｂ）
【００８９】
【化２３】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−プロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｃ）
【００９０】
【化２４】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−ブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｄ）
【００９１】
【化２５】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−ペンチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｅ）
【００９２】
【化２６】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−イソプロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｆ）
【００９３】
【化２７】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−イソブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｇ）
【００９４】
【化２８】
２．２．４ １，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（ＮＡＧ−チアゾリンアナログ）（９ａ−ｇ）の合成の一般的な手順
乾燥メタノール中の適当な保護チアゾリン（８ａ−ｇ）の溶液に、スパチュラの先ほどの無水ナトリウムメトキシドを加えた。その塩基性溶液を、ＴＬＣ分析によって反応が完了したと判断するまで（典型的には２時間）攪拌した。メタノール中の氷酢酸の溶液（１：２０）を、溶液のｐＨが中性になるまで、反応混合物中に１滴ずつ加えた。次いで溶媒を減圧下で除去し、そして酢酸エチルおよびメタノールの２：１から６：１までの範囲の適当な比の溶媒システムを用いて、フラッシュカラムシリカクロマトグラフィーによって望ましい物質（９ａ−ｇ）を単離した。産物を８６％から９９％までの範囲の収率で単離した。１，２−ジデオキシ−２’−メチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ａ）は、上記で記載されたような同様の反応条件を用いて以前に調製された［３０］。全てのスペクトルの特徴は、これらのアッセイで使用したサンプルの元素分析と同様、文献の値と一致した。Ｃ８Ｈ１３Ｏ４ＮＳの計算値；Ｃ，４３．８２；Ｈ，５．９８；Ｎ，６．３９；実測値 Ｃ，４３．４５；Ｈ，６．２３；Ｎ，６．１８。
【００９５】
１，２−ジデオキシ−２’−エチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｂ）
【００９６】
【化２９】
１，２−ジデオキシ−２’−プロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｃ）
【００９７】
【化３０】
１，２−ジデオキシ−２’−ブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｄ）
【００９８】
【化３１】
１，２−ジデオキシ−２’−ペンチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｅ）
【００９９】
【化３２】
１，２−ジデオキシ−２’−イソプロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｆ）
【０１００】
【化３３】
１，２−ジデオキシ−２’−イソブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｇ）
【０１０１】
【化３４】
２．３ インヒビター９ａ−ｇを用いた動態分析
２．３．１ 動態分析の実験手順
全てのアッセイを、停止アッセイ手順を用いて、３７℃で３０分間、３組行い、ここで酵素反応（２５μＬ）を、６倍過剰（１５０μＬ）の反応停止緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ１０．７５）を加えることによって反応停止させる。酵素（３μＬ）をシリンジで加えることによってアッセイを開始し、そして全ての場合においてできた反応停止溶液の最終的なｐＨは、１０より高かった。β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの時間依存的アッセイは、どちらの酵素も、この期間中そのそれぞれの緩衝液；５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５および５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ６．５の中で安定であったことを明らかにした。３０分の最後における反応の進行を、Ｖａｒｉａｎ ＣＡＲＹ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ９６穴プレートシステムを用いた蛍光測定および同一の緩衝液条件下での４−メチルウンベリフェロンの標準曲線との比較によって決定した、遊離した４−メチルウンベリフェロンの程度を測定することによって決定した。５ｍｍのスリット開口で、それぞれ３６８および４５０ｎＭの励起および発光波長を使用した。可能性のあるＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの時間依存的不活性化を、１０ｍＭのＳＴＺを、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ６．５の存在下で０．０１６ｍｇ／ｍＬのＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅと、または５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５の存在下で０．０３６ｍｇ／ｍＬのβ−ヘキソサミニダーゼとインキュベートすることによってアッセイした。いくつかの時間間隔で、不活性化混合物中に含まれる残留酵素活性をアッセイした。反応を、反応混合物のアリコートを５．７ｍＭのＭＵ−ＧｌｃＮＡｃおよび各酵素に適当な緩衝液を含むアッセイ混合物に加えることによって始めた以外は、上記で各酵素に関して記載されたようにアッセイを行った。ＳＴＺの安定性を、まずＮＭＲによって重水素化水中でのその分解を追跡することによって試験した。室温での水性溶液におけるＳＴＺの半減期は、室温でＮＭＲによってその分解を追跡することによって決定したように、６時間より十分長かった。ヒト胎盤β−ヘキソサミニダーゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（ロット０４３Ｋ３７８３）。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのクローニングおよび発現は、文献に記載されている［８５］。両方の酵素を、ＰＢＳ緩衝液に対して透析し、そしてその濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて決定した。フッ素化した基質と共にアッセイで使用したβ−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの濃度（μｇ／μｌ）は以下の通りであった：４−メチルウンベリフェリル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ）（５）：０．０００７７、０．０１２６；ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ（５ａ）：０．００３１、０．０１８９；ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２（５ｂ）：０．０１５４、０．０７５６、およびＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ３（５ｃ）：０．０１５４、０．０１５２３。それに加えて、β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを、それぞれ０．０１５４および０．０３７８の濃度（μｇ／μＬ）で使用して、基質５を０．６４ｍＭの濃度で使用してインヒビターを試験した。インヒビター８ｅのＫＩ値が高いために、インヒビターをそのような高濃度にできないインヒビター８ｅとβ−ヘキソサミニダーゼとのアッセイを除いて、全てのインヒビターを、ＫＩの５倍から５分の１までの範囲の８つの濃度で試験した。ＫＩ値を、ディクソンプロットにおけるデータの線形回帰によって決定した。必要な場合には、アッセイを３組行い、そしてエラーバーをデータのプロットに含める。
【０１０２】
２．３．２ インヒビター９ａ−ｇを用いた動態分析の結果
ヒトβ−ヘキソサミニダーゼの阻害の分析は、鎖の長さを増加させることは、これらのインヒビターの効力の顕著な減少を引き起こすことを明らかにした（図４および表２）。１つのメチレンユニットの含有さえも（化合物９ｂ）、親化合物ＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）と比較して、β−ヘキソサミニダーゼのＫＩ値における４６０倍の増加を引き起こした。鎖の長さのさらなる増加は、ＫＩ値のさらに大きな増加を引き起こす。しかし、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関しては、状況は著しく異なる（図４および表２）。鎖の長さの増加は、非常によりよく許容され、そして２つのメチレンユニットの含有は、ＫＩ値（ＫＩ＝２３０ｎＭ）が親化合物（９ａ）ＮＡＧ−チアゾリン（ＫＩ＝７０ｎＭ）で測定されたものより３倍しか高くない化合物（９ｃ）を生じる。化合物９ｆおよび９ｇはどちらもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのよいインヒビターであるので、脂肪鎖の分枝も、結合を損なわない。データの分析から、化合物９ｂ、９ｃ、および９ｆはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの強力なインヒビターであり、そしてリソソームヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに顕著な選択性を示すことを見出し得る。実際、β−ヘキソサミニダーゼに対するＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅへの選択性の比は、化合物９ｄに関して３１００倍、化合物９ｃに関して１５００倍、および化合物９ｆに関して７００倍である（図２および表２）。
【０１０３】
２．３．３ 既存のインヒビターを用いた動態分析の結果
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの既存のインヒビターも、その阻害特性および選択性に関して試験した。ＳＴＺのＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（ＫＩ＝１．５ｍＭ）およびβ−ヘキソサミニダーゼ（ＫＩ＝４７ｍＭ）両方とのＫＩ値を決定し（表２）、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関して測定した値は、１から２．５ｍＭの範囲であった以前のＩＣ５０の決定と一致することが見出された［４２、４６］。ＳＴＺのβ−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに対する選択性は、この化合物のＮ−アシル基の大きさを考慮すると驚くほど中程度である（３１倍）。おそらく、チアゾリン化合物は、転移状態または密接に結合した中間体を模倣し得るという事実のために、ＳＴＺよりも高い選択性を示す。可能性のあるＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼのＳＴＺ誘導不可逆的不活性化も調査した。不可逆的インヒビターは、失活剤がタンパク質を修飾するので、酵素活性の時間依存的な喪失を引き起こす。まず水性溶液中でのＳＴＺの安定性および市販で入手可能な物質の純度をチェックするために、重水素化水中に新しく溶解したＳＴＺの時間依存的分解を、ＮＭＲによってモニターした。ＳＴＺは、あきらかに６時間より長い半減期で、時間とともに分解した（図７を参照のこと）。発明者の手において、新しく溶解したＳＴＺは、６時間を超えてはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅまたはβ−ヘキソサミニダーゼの時間依存的な失活剤として作用しなかった（図８を参照のこと）。ＰＵＧＮＡｃの選択性も調査した。ＰＵＧＮＡｃのＫＩ値をＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅで測定し（ＫＩ＝４６ｎＭ）、そして以前に決定された値（ＫＩ＝５０ｎＭ）とほぼ一致することが見出された［１３］。しかし、この化合物は、β−ヘキソサミニダーゼ（ＫＩ＝３６ｎＭ）と比較して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに選択性を示さない。
【０１０４】
これらのデータはまた、上述の、フッ素置換基質のＮ−アシル基の立体容積は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅで測定されたＴａｆｔ様分析の傾き（ρ＝−０．４２）に大きくは寄与しないという見方を支持する。しかし、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼで測定された傾き（ρ＝−１．０）は、式１による電気的効果および立体的効果の両方を複合したもののようである。フッ素置換基の電気的効果に対する反応の感受性（ρ＊）は、従って両方の酵素に関して同じであり得るが、基質の立体的効果に対するリソソームβ−ヘキソサミニダーゼ触媒反応の有意な感受性（δ）は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅで測定されたものよりも、β−ヘキソサミニダーゼに関して明らかに急な傾きをもたらす。合わせると、Ｔａｆｔ様線形自由エネルギー分析および選択的阻害のデータは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの活性部位は、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼよりも、基質の２−アセトアミド基周囲の領域にかなり大きなスペースを有することを示唆する。
【０１０５】
（実施例３：選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの２番目の実施態様の設計および合成）
３．１ ２番目のクラスの選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの設計
上記の観察に基づいて、ＰＵＧＮＡｃのぶら下がったＮ−アシル鎖に修飾をして、異なるインヒビターの足場に基づいた、強力および選択的なＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのインヒビターの２番目の実施態様を得た。そのようなインヒビターは、異なる薬物動態の性質を有し、そして細胞および有機体レベルにおけるＯ−ＧｌｃＮＡｃ翻訳後修飾の役割を分析するために貴重なツールであり得る。
【０１０６】
３．２ 選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの２番目の実施態様の合成
足場としてＰＵＧＮＡｃを用いた一連の６つのインヒビターの合成を、スキーム３において概略を述べる。
【０１０７】
【化３５】
容易に利用可能な塩酸塩１０［９３］から開始して、Ｂｏｃ基を導入してアミン部分を保護し、四酢酸塩１１［９４］を得た（スキーム３）。四酢酸塩１１を利用して、（ＮＨ４）２ＣＯ３を用いた選択的脱−Ｏ−アセチル化は、非常に良い収率でヘミアセタール１２を産生した。このヘミアセタール１２をＮＨ２ＯＨ．ＨＣｌで処理して、未精製のＥおよびＺオキシム１３を良い収率で得た。
【０１０８】
次の反応である酸化的閉環反応は、ＭｏｈａｎおよびＶａｓｅｌｌａによって、かなり神経質（ｔｅｍｐｅｒａｍｅｎｔａｌ）であることが報告された（スキーム４）。
【０１０９】
【化３６】
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）およびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を用いてオキシム１４を酸化する場合、ＮＣＳを加える間の反応混合物の温度の注意深いコントロールが、望ましくない１，４−ラクトンオキシム１５の形成を避けるために重要である［９５］。これらの観察と一致して、いくつかの１４を用いた試行反応は、望ましくない１，４−ラクトンオキシム１５よりも１，５−ラクトンオキシム１６をうまく産生するために、温度が実際重要であることを示す。実際、わずかに上昇した温度（−２０℃）においては、１，４−ラクトンオキシム１５のみを得る。
【０１１０】
スキーム３に戻って参照して、文献の条件下［９５］でオキシム１３をＤＢＵ／ＮＣＳで処理して、望ましい１，５−ラクトン１７および望ましくない１，４−ラクトンオキシム１８を４：１の比で得た。しかし、ＮＣＳを既に溶液中に１３と共に有し、そして次いでＤＢＵを混合物に加えるだけで、いくらか低い収率ではあったが、１７のみを得た。ここで直面する１つの複雑な状況は、これらの反応の副産物であるスクシンイミドは、１７から分離するのが困難であることである。さらに、１７のスペクトル分析は、１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて得られるシグナルの広幅化のために複雑である。
【０１１１】
それにもかかわらず、純粋でないヒドロキシモラクトン（ｈｙｄｒｏｘｉｍｏｌａｃｔｏｎｅ）１７をフェニルイソシアネートで処理すると、フラッシュクロマトグラフィーによる精製後、よい収率で純粋なカルバメート１９を得る。実際、Ｂｏｃ保護基は、ジクロロメタン中で無水トリフルオロ酢酸を用いてスムーズに除去される。できた未精製のアミン塩２０を適当な塩化アシルで処理すると、全体的によい収率でアミド２１ａ−ｇを得る。２１ａおよび２１ｂの詳細な分析は、化合物のこの全体的なＮ−アシル化系列の正体を支持する。続くメタノール中における飽和アンモニアによる２１ａの脱−Ｏ−アセチル化は、よい収率でＰＵＧＮＡｃを生ずる。同様の様式で２２ａを２１ｂから得た。これらの変換の容易さを強調するために、共通の中間体、２０をある範囲の塩化アシルで処理して、２１ｃ−ｇを未精製産物として得ることができる。これらの未精製中間体をすぐ脱−Ｏ−アセチル化して、よい収率でトリオール２２ｂ−ｆを容易に得る。
【０１１２】
３．２．１ 化合物の合成の一般的な手順
全ての溶媒を、使用の前に乾燥した。合成反応を、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４アルミニウム裏打ちシートを用いて、ＴＬＣによってモニターした。エタノール溶液中１０％の濃硫酸で焦がし、そして加熱することによって化合物を検出した。陽圧下でのフラッシュクロマトグラフィーを、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（２３０−４００メッシュ）で、指定された溶出剤を用いて行った。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ４００で４００ＭＨｚにおいて（１３Ｃに関しては１００ＭＨｚ）、またはＶａｒｉａｎ ＡＳ５００ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａ 分光計で５００ＭＨｚにおいて（１３Ｃに関しては１２５ＭＨｚ）記録した（ケミカルシフトは適当な場合にはＣＤＣｌ３またはＣＤ３ＯＤと相対的に引用した）。酵素アッセイにおいて使用した全ての合成化合物の元素分析を、Ｓｉｍｏｎ Ｆｒａｓｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙまたはｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて行った。
【０１１３】
３．２．２ （Ｅ）−および（Ｚ）−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボンアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコースオキシム（１３）の合成
塩酸ヒドロキシルアミン（３．２ｇ、４６ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中のヘミアセタール１２［９３］（１２ｇ、３１ｍｍｏｌ）およびピリジン（６．３ｍＬ、７７ｍｍｏｌ）に加え、そしてできた溶液を還流しながら攪拌した（２ｈ）。その溶液を濃縮し、そしてトルエン（２×２０ｍＬ）と同時蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃに取り、そして水（２×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過および濃縮して推定されるオキシム１３（９．５ｇ）を得た。残渣をさらなる精製無しに使用した。
【０１１４】
３．２．３ ３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボンアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコノヒドロキシモ−１，５−ラクトン（１７）の合成
（ａ）１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（０．９８ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）中の未精製のオキシム１３（２．５ｇ、５．９ｍｍｏｌ）に−４５℃で加え、そして混合物を攪拌した（５分）。次いでＮ−クロロスクシンイミド（０．８７ｇ、６．５ｍｍｏｌ）を、温度が−４０℃を超えないように、溶液に加え、そしてできた混合物をこの温度で３０分間攪拌し、そして次いで２時間以上室温まで温めた。その混合物を水で反応停止し、そしてＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、そして水（２×５０ｍＬ）、ブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、ろ過および濃縮した。できた残渣のフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２：３）で、表題化合物１７を、無色の油状物（１．７ｇ、６８％）として得た。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、目的の化合物を示すようであったが、１，４−ラクトンオキシム１８およびスクシンイミドが混入していた。
【０１１５】
（ｂ）１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（３．０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、−４５℃においてＣＨ２Ｃｌ２（１１０ｍＬ）中のオキシム１３（７．７ｇ、１８ｍｍｏｌ）およびＮ−クロロスクシミニド（２．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）に、温度が−４０℃を超えないように加え、そしてできた混合物をこの温度で３０分間攪拌し、そして次いで２時間以上室温まで暖めた。混合物を続いて（ａ）におけるように処理し、表題化合物１７（４ｇ、５２％+）を得た。
【０１１６】
【化３７】
３．２．４ Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボンアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（１９）の合成
フェニルイソシアネート（０．５ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のラクトン１７（１．３ｇ、３．１ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１．３ｍＬ、９．３ｍｍｏｌ）に加え、そして溶液を攪拌した（室温、３ｈ）。濃縮に続いて、残渣のフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：４）によって、カルバメート１９を無色の油状物（１．２ｇ、７１％）として得た。
【０１１７】
【化３８】
３．２．５ Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アシルアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２１ａ−ｇ）の一般的な合成手順
トリフルオロ酢酸（１３ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のカルバメート１９（１ｍｍｏｌ）に０℃で加え、そして溶液を攪拌した（２ｈ）。次いでピリジン（２００ｍｍｏｌ）を溶液にゆっくりと加え、そしてできた混合物を放置した（０℃、１０分）。次いで適当な塩化アシル（３ｍｍｏｌ）を０℃で加え、そして溶液を４℃で一晩置いた。混合物の濃縮によって、黄色がかった残渣を生じ、それをＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解し、そして水（２×２０ｍＬ）、ブライン（１×２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過および濃縮した。推定される中間体トリ−Ｏ−アセテート２１ｃ−ｇに関して、これらをさらなる精製無しに維持した。２１ａおよび２１ｂと推定される残渣のフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１）は、望ましいアシル誘導体２１ａおよび２１ｂを、それぞれ４８％および４２％の収率で生じた。
【０１１８】
Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２１ａ）は、文献で見出されるものと一致する１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを生じた。［９６］（４８％） Ｒｆ０．２（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン７：３）。
【０１１９】
Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−プロパミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２１ｂ）
【０１２０】
【化３９】
３．２．６ Ｏ−（２−アシルアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（ＰＵＧＮＡｃ、２２ａ−ｆ）を合成するための一般的手順
ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中のアンモニア飽和溶液を、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のカルバメート（０．３ｍｍｏｌ）に加え、そして溶液を放置した（室温、２ｈ）。濃縮に続く、残渣のフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ３：９７）によって、望ましいトリオールＰＵＧＮＡｃ、２２ａ−ｆを、２１％から３２％の範囲の収率で得た。
【０１２１】
Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（ＰＵＧＮＡｃ）−（３２％）は、文献で見出されるものと一致する１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを生じた。［９６］
Ｒｆ ０．１５（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ １：１９）。
【０１２２】
Ｏ−（２−デオキシ−２−プロパミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ａ）−
【０１２３】
【化４０】
Ｏ−（２−デオキシ−２−ブタミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｂ）−
【０１２４】
【化４１】
Ｏ−（２−デオキシ−２−吉草酸アミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｃ）−
【０１２５】
【化４２】
Ｏ−（２−デオキシ−２−ヘキサミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｄ）−
【０１２６】
【化４３】
Ｏ−（２−デオキシ−２−イソブタミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｅ）−
【０１２７】
【化４４】
Ｏ−（２−デオキシ−２−イソ吉草酸アミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｆ）−
【０１２８】
【化４５】
３．３ インヒビター２２ａ−ｆを用いた動態分析
３．３．１ 動態分析の実験手順
全てのアッセイを、停止アッセイ手順を用いて、３７℃で３０分間、３組行い、ここで酵素反応（５０μＬ）を、４倍過剰（２００μＬ）の反応停止緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ１０．７５）を加えることによって反応停止した。酵素（５μＬ）をピペットで注意深く加えることによってアッセイを開始し、そして全ての場合においてできた反応停止溶液の最終的なｐＨは、１０より高かった。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの時間依存的アッセイは、酵素は、アッセイの期間中そのそれぞれの緩衝液：５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ６．５、および５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５の中で安定であったことを明らかにした。３０分の最後における反応の進行を、９６穴プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）および９６穴プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４００ｎｍにおけるＵＶ測定によって決定される、遊離した４−ニトロフェノールの程度を測定することによって決定した。ヒト胎盤β−ヘキソサミニダーゼを、Ｓｉｇｍａから購入し（ロット０４３Ｋ３７８３）、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを使用の前に新しく過剰発現および精製した。［８５］Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼを、阻害アッセイにおいて、それぞれ０．０４０６および０．０１２の濃度（μｇ／μＬ）で、基質ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃを０．５ｍＭの濃度で用いて使用した。その高いＫＩ値のために、インヒビターをそのような高濃度にできないインヒビター２２ｄとβ−ヘキソサミニダーゼとのアッセイを除いて、全てのインヒビターをＫＩの３倍から３分の１の範囲の７つの濃度で試験した。ＫＩ値を、ディクソンプロットからのデータの線形回帰によって決定した。
【０１２９】
３．３．２ インヒビター２２ａ−ｆを用いた動態分析の結果
上記で述べたように、ＰＵＧＮＡｃは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ［１３、５０］およびβ−ヘキソサミニダーゼ［２８、５１］両方の強力な競合的インヒビターである。ヒト酵素に関して、それぞれのＫＩ値は４６ｎＭおよび３６ｎＭである［１３、４９］。インヒビター２２ａ−ｆの選択性を評価し、そしてＰＵＧＮＡｃと比較した。ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質として用いて、これらの化合物２２ａ−ｆは、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびヒトβ−ヘキソサミニダーゼ両方のインヒビターであることが見出された（表３）。
【０１３０】
【表３】
（表３．Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼに対するインヒビターの阻害定数および選択性）
ヒトβ−ヘキソサミニダーゼの阻害の分析は、Ｎ−アシル基の鎖の長さの増加は、これらインヒビターの効力の顕著な減少を引き起こすことを明らかにする（表３）。１つのメチレン基のみを含むこと（化合物２２ａ）は、親ＰＵＧＮＡｃと比較して、β−ヘキソサミニダーゼに関してＫＩ値の３３倍の増加を引き起こす。鎖の長さのさらなる増加は、さらに大きなＫＩ値の増加を引き起こす。さらに、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、β−ヘキソサミニダーゼよりもよく鎖の長さの増加を許容する（表３）。
【０１３１】
これら２つのヒト酵素、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼに関して、以前に調製したＮＡＧ−チアゾリン誘導体、９ｂ−ｇ［４９］のＫＩ値との直接比較は、修飾チアゾリンは、対応するＰＵＧＮＡｃに基づく化合物、２２ａ−ｆよりも選択的および強力なインヒビターであることを明らかにする。これらの観察は、インヒビターのアシル基の位置、および潜在的にアノマー炭素の混成状態の重要性を示す。ｓｐ３混成アノマー炭素を有するチアゾリン、ＮＡＧ−チアゾリンおよび９ｂ−ｇは、ｓｐ２混成アノマー炭素を有する対応するＰＵＧＮＡｃ誘導体、ＰＵＧＮＡｃおよび２２ａ−ｆのアシル鎖と比較して、アシル鎖の動きを制限する二環性の足場を含む。同様に、活性部位内の側鎖の正確な配置は、これらの２つのセットの化合物の間で異なっているに相違ない。合わせると、これらの２つの因子が、チアゾリン誘導体と比較した、ＰＵＧＮＡｃ由来の化合物の全体的にいくらか弱い阻害および低い選択性の両方に寄与しているに相違ない。これらの観察と一致して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの弱いインヒビター（ＫＩ＝１．５ｍＭ）であるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）も［４６、４７、４９］、大きな、自由に回転するアシル鎖を有し、そしてβ−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに中程度の選択性を示す［４６、４７、４９］。
【０１３２】
チアゾリンに基づく化合物、ＮＡＧ−チアゾリンおよび９ｂ−ｇ、とＰＵＧＮＡｃ誘導体、ＰＵＧＮＡｃおよび２２ａ−ｆとの間のこれらの違いは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ［４９］およびβ−ヘキソサミニダーゼ［３０、４８、８３、９７］の触媒メカニズムに関与する、推定される二環性様の転移状態を模倣する前者の化合物に起因し得る。対照的に、ＰＵＧＮＡｃアナログおよびＳＴＺのＮ−アシル基の位置は、天然基質Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシドのものに類似し得る。ＰＵＧＮＡｃおよびチアゾリン誘導体のアノマー炭素の異なる混成状態も、これらのＮ−アシル基の正確な位置に寄与し得る。
【０１３３】
上記で調製した化合物は全て、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびヒトβ−ヘキソサミニダーゼ両方のインヒビターであった。しかし、これらの化合物は、これら２つの酵素間の活性部位構造における違いを利用し、それはそれらをＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに対して選択性にする。チアゾリン誘導体と比較して、ＰＵＧＮＡｃアナログの低い選択性にも関わらず、これらの化合物は、その異なる足場のために異なる薬物動態特性を有し得る。従って、チアゾリンおよびＰＵＧＮＡｃ誘導体はどちらも、細胞および有機体レベルにおけるＯ−ＧｌｃＮＡｃ翻訳後修飾の役割を詳細に分析するための貴重なツールであることが示され得る。実際、他のグリコシダーゼインヒビターの合成が、全く異なる酵素を標的とした、臨床的に有用な化合物を生じた。［９８］同様に、ここで概略を述べた戦略を用いた、他のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼインヒビターの足場の体系的な合成［９９、１００］も、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの選択的インヒビターを生じ得る。
【０１３４】
（実施例４：細胞培養物における選択的インヒビターの評価）
インビトロにおいてこれらの化合物の選択性が示されたので、生きた細胞におけるその化合物の使用を評価した。
【０１３５】
４．１ 実験手順
４．１．１ 細胞培養物および阻害
ＣＯＳ−７細胞を、５−１０％のＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。インヒビターのアリコート（９５％エタノール中５０μＬのストック）を、組織培養プレートに分け、そしてエタノールを蒸発させた。細胞を３７℃で４０時間培養し、その時それらは約８０％コンフルエンスに達した。細胞において５０μＭの化合物９ａ、９ｃ、または９ｇによる処理に反応した、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の時間依存的な蓄積を、以下のように研究した。ＣＯＳ−７細胞を、５％のＦＢＳ中で２５％コンフルエンスまで培養し、そして培地に溶解およびろ過滅菌したインヒビターのアリコート（１００μＬ）を各プレートに加えて、最終的なインヒビターの濃度を５０μＭにした。ＣＯＳ−７細胞（２×１０ｃｍプレート）を、適当な時間に掻爬することによって採取し、そして遠心分離（２００×ｇ、１０分）によってプールした。細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．０（１０ｍＬ）で１回洗浄し、そしてペレットにした（２００×ｇ、１０分）。細胞をこの時点で−８０℃で凍結し得る。インヒビターなしのコントロール培養物を、同じ方式で処理した。
【０１３６】
４．１．２ ウェスタンブロット分析
ＣＯＳ−７細胞を、上記で記載したようにインヒビター９ａ、９ｃ、または９ｇの存在下で、約９０％コンフルエンスまで培養した。コントロール細胞の培養物を、以下と同じ方式で処理したが、培養物はインヒビターを含まなかった。細胞を、上記で記載したように採取した。凍結細胞を４℃で解凍し、そして冷却溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、および１ｍＭのインヒビター９ｆを含む１ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を加えた。４℃で１０分後、溶液をエッペンドルフ５４１５Ｃ微量遠心機で、１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を回収した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥローディング緩衝液を、各サンプルのアリコート（１５μＬ）に加え、そして９６℃に加熱した後、アリコートを１０％または１２％のＴｒｉｓ・ＨＣｌポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動後、サンプルをニトロセルロース膜（０．４５μｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に電気ブロットした。着色マーカー（Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｕｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ−ＢｉｏＲａｄ）の転移を目で検査することによって、転移を確認した。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む、ＰＢＳ中５％のＢＳＡ（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ）（マウス抗Ｏ−ＧｌｃＮＡｃモノクローナルＩｇＭ抗体（ＭＡｂ ＣＴＤ １１０．６−Ｃｏｖａｎｃｅ）でプローブするサンプルのためのブロッキング緩衝液Ａ）、または５％低脂肪乾燥粉乳（抗β−アクチンでプローブするサンプルのためのブロッキング緩衝液Ｂ）、ｐＨ７．４を用いて、室温で１時間または４℃で一晩ブロックした。ブロッキング溶液をデカントで捨て、そしてＭＡｂ ＣＴＤ １１０．６を含むブロッキング緩衝液Ａ（ストックの１：２５００）、またはマウスモノクローナル抗β−アクチンＩｇＧ（クローンＡＣ−４０−Ｓｉｇｍａ）を含むブロッキング緩衝液Ｂの溶液を、適当に加えた（１：１０００希釈）。膜を室温で１時間、または４℃で一晩インキュベートし、その後ブロッキング緩衝液をデカントで捨て、そして０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４（洗浄緩衝液）で膜をすすいだ。次いで膜を洗浄緩衝液で２×５分および３×１５分すすいだ。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの免疫学的検出のために、膜をブロッキング緩衝液Ａ中で、ＲＴで１時間インキュベートし、洗浄後、膜を２次ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ結合体（１：２５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、ＲＴで１時間、または４℃で一晩、ブロッキング溶液中でインキュベートした。β−アクチンレベルの検出のために、膜を２次ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（１：１００００、Ｓｉｇｍａ）と、ＲＴで１時間、または４℃で一晩、ブロッキング溶液Ｂ中でインキュベートした。膜を洗浄し、そして膜に結合したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体の検出を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）およびフィルム（Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘ ＭＲ）を用いて、化学発光検出によって達成した。
【０１３７】
４．２ 細胞研究の結果
５０μＭのインヒビター９ａ、９ｃ、または９ｇとプレートでインキュベートしたＣＯＳ−７細胞は、コントロール細胞と比較して、増殖速度または形態において異常を示さなかった（データは示していない）。インヒビター９ａ、９ｃ、または９ｇの存在下で、またはその非存在下で４０時間培養した細胞内のＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルの検出を、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃに対するモノクローナル抗体（６４）ｍＡｂＣＴＤ１１０．６を用いて実施した。コントロールと比較して、細胞内のＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルにおける顕著な増加が観察され（図５Ａ）、これらの化合物は容易に細胞内部に入り、そこでＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用することを示した。チアゾリンインヒビター（９ｃ）がＣＯＳ−７細胞内でＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ作用を阻害するよう作用する速度も探索した。ウェスタンブロット分析を用いてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルをモニターすることによって、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルにおいて明らかな時間依存的増加が見出された。インヒビター（９ｃ）への曝露の１時間後でさえ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質レベルの増加が観察された。インヒビターは、細胞に迅速に入り、そこでＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅをすぐに阻害して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の時間依存的な蓄積を引き起こすようである（図６）。最初の速い増加の後、インヒビター（９ｃ）で処理した細胞におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルは、細胞内で漸近的に定常状態に近づくようである（図６）。この挙動は、ＰＵＧＮＡｃとインキュベートしたＨＴ２９細胞に関して以前に観察された、同様の時間依存的増加と一致する［５０］。α−β−アクチンに続いて適当な２次ＨＲＰ結合体でプローブしたブロットのウェスタンブロット分析（図５Ｂ）は、全ての場合においてサンプルのローディングが等量であったことを明らかにした。親化合物ＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）は、細胞に入り、そこでリソソームβ−ヘキソサミニダーゼに影響を及ぼすことが以前に示されたことも注意するに値する［１０１］。
【０１３８】
（実施例５：ＩＩ型糖尿病を研究するための動物モデルを開発するための選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの使用）
５．１ 様々な組織型およびグルコースクリアランスに対するＢｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリン（９ｃ）の効果を示す動物研究
５．１．１ 実験手順
８週齢（ｅｉｇｈｔ ｇｉｖｅ−ｗｅｅｋ）の健康なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、対でかごに入れた。動物を、Ｓｉｍｏｎ Ｆｒａｓｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（ＳＦＵ ＡＣＦ）で１週間、新しい環境に順応させた。３：００ｐｍ、４匹のラットに、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した４００μｌのインヒビター９ｃを、５０ｍｇ／ｋｇの投与量で、尾静脈注射で与えた。残りの４匹のラットには、コントロールとして４００μｌのＰＢＳを尾静脈注射した。全ての溶液を、０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してあらかじめ滅菌し、そして２８ゲージ×０．５”針（Ｔｅｒｕｍｏ）を有する０．５ｍＬシリンジで、１０秒間のボーラスとして注射した。食餌をおよそ１１：００ｐｍに中止した。次の朝８：３０ａｍに、ラットに２回目の注射をした。３時間後、ラットをイソフルランで麻酔し、そして１００μＬの血液サンプルを頚静脈から採って、空腹時血中グルコースレベルを測定した。次いで静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）を行った。ＰＢＳ（滅菌済み）に溶解したグルコースの５０％ｗ／ｖ溶液の０．５ｍＬを、３０秒かけて尾静脈に注射して投与した。グルコース注射の１０、２０、３０、４０、６０、および９０分後に、１００μＬの血液サンプルを頚静脈から採った。血液サンプル採取の直後、血液の少量のアリコートを使用して、ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ Ａｄｖａｎｔａｇｅ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて血中グルコース濃度を測定し、そして残りの血液を氷上で２０分間保存し、そして遠心分離して血清を単離した。ＩＶＧＴＴの終了後、ラットをＣＯ２／Ｏ２の１：１混合物で屠殺した。組織サンプル（脳、筋肉、肝臓、脾臓、膵臓、脂肪）をすぐに採取し、そして液体窒素で急速冷凍し、そして−８０℃で保存した。組織をホモジナイズして細胞抽出物を得るために、組織を乳鉢と乳棒で微細な粉末に粉砕する間、それらを冷凍したままにしておいた。次いでその粉末の１００ｍｇを、１ｍＬの冷却溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１％のノニデットＰ−４０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、および１ｍＭのブチル−ＮＡＧ−チアゾリン）中で、Ｊｅｎｋｅ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ組織ホモジナイザーで、２回の１０秒パルスを用いてホモジナイズした。次いで組織を微量遠心機（エッペンドルフ）で１３，０００ｒｐｍで遠心沈殿して、細胞の破片を除去した。次いで可溶性の細胞抽出物を、細胞研究に関して上記で記載したように、ウェスタンブロット分析を用いて、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質レベルに関して分析した。
【０１３９】
５．１．２ 様々な組織型に対するＢｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリン（９ｃ）の効果
尾静脈に様々な投与量のインヒビター９ｃを注射したラットは、インヒビター９ｃの静脈内投与が、様々な組織型においてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに影響を与えることを示した（図９）。脳組織のサンプル（図９Ａ）は、ラットに５０、１２０、および３００ｍｇ／ｋｇの投与量のインヒビター９ｃを注射した場合、コントロールと比較して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに顕著な増加があったことを示した。これは、インヒビター９ｃは容易に脳細胞の内部へ入り、そこでＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用することを示す。筋肉および肝臓の組織サンプルに関して、同様の結果が観察された（図９Ｂおよび９Ｃ）。
【０１４０】
その結果から、インヒビターは、半用量依存的な様式で、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのみを阻害するようである。これは、５０ｍｇ／ｋｇのインヒビター９ｃが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の最大の増加を誘発するのに十分であることを示す。同様に、これらの結果は、インヒビターが広く様々な組織に２４時間以内に入ることができ、そして最低６時間は効果を保持することを示す。この研究で使用した、インヒビターで処理したラットは、コントロールラットと比較していかなる不快感も示さなかったようであることも注目すべきである。
【０１４１】
５．１．３ グルコースクリアランスに対するＢｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリンの効果
インヒビター９ｃはラットにおいてＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを阻害し得ることを示したので、増加したレベルのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質が、ラットのグルコースホメオスタシスを維持する能力を変化させるかどうかに取り組むことに注意を向けた。静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）を、１ｇ／ｋｇのグルコース負荷に反応する動物の能力を測定する手段として使用した。その結果は、インヒビターとの短期間の接触（＜２４時間）は、ラットにおいてグルコースクリアランス速度に影響を与えないことを明らかに示す（図１０Ａ）。インヒビターで処理した４匹のラットおよびＰＢＳ緩衝液のコントロール注射で処理した４匹のラットで行ったので、これらの結果は統計学的に有意であることに注目すべきである。ウェスタンブロット分析は、ＩＶＧＴＴにおいてインヒビターで処理した４匹のラットは、増加したレベルのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を有していたことを示す（図１０Ｂ）。
【０１４２】
培養脂肪細胞における上昇したレベルのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質は、インスリン抵抗性を引き起こすことが以前に示されたことを考慮すると、この結果は驚くべきである。本発明者らは、これらの結果の間の違いは、２つの可能性のうち１つに起因するという仮説を立てた。最初に、有機体全体から得られた結果は、培養細胞を用いて行った実験よりも生理学的に関連しており、そして従ってインスリン抵抗性は、末梢組織では発生しない。２番目の可能性は、インヒビター９ｃは実際により多くのインスリンを分泌させるように膵臓β細胞に影響するということである。この影響は、末梢組織におけるインスリン不感受性を克服し、おそらく観察されたような正常なグルコースクリアランスを引き起こす。インスリン産生を刺激する２つの転写因子（ｐｄｘ−１およびｓｐ１）のような、β細胞内でインスリンの産生および輸送に関わる多くのタンパク質が、それ自体Ｏ−ＧｌｃＮＡｃで修飾されているという事実が、この２番目の仮説を支持する。
【０１４３】
５．２ Ｂｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリン（９ｃ）のクリアランス速度を示す動物実験
５．２．１ 実験手順
インヒビターがどれだけ速く組織から排出されるかに関する情報を得るために、５匹の１０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、インヒビター（５０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈注射で与えた。動物を、注射の後３、７、２４、２７、および３２時間後に順次屠殺した。さらに２匹のラットをコントロールとして使用した。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の正常レベルについての情報を得るために、１匹のラットを、他のラットに注射する直前に屠殺した。また、１匹のラットには他のラットと共に滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を注射し、そして実験の最後（３２時間）に屠殺した。組織の採取、ホモジナイゼーション、およびウェスタンブロット分析を、上記で記載したものと同じ様式で行った。
【０１４４】
５．２．２ クリアランス速度の結果
インヒビター９ｃを注射したラットは、インヒビター９ｃの静脈内投与は、注射から３時間という早期に様々な組織型においてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに影響を与えることを示した（図１１）。脳組織のサンプル（図１１Ａ）は、コントロールと比較して、注射の３時間後、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに顕著な増加があったことを示した。これは、インヒビター９ｃが脳細胞の内部に容易に入り、そこでＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用することを示す。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルは、７時間後も高いままであった。そのレベルは２４時間後には減少し、そして３２時間後には正常レベルに戻るようであった。筋肉組織サンプルに関して同様の結果が観察された（図１１Ｂ）。
【０１４５】
５．３ Ｂｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリン（９ｃ）の経口利用能を示す動物実験
５．３．１ 実験手順
インヒビター９ｃが経口的に利用可能であるかどうかを決定するために、これを固形飼料（Ｌａｂ Ｄｉｅｔ ５００１ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ、ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＬＬＣ）に組み込んだ。ラット固形飼料を作るために、６００ｇの粉砕した固形飼料を、３５５ｍｌの水およびエタノールに溶解した５ｍＬのインヒビターと混合した。次いで小片をパスタマシン（Ｐａｓｔａ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ）で調製し、そして３７℃で一晩脱水した（Ｓｎａｃｋｍａｓｔｅｒ Ｄｅｈｙｄｒａｔｏｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈａｒｖｅｓｔ）。以下の量のインヒビターで、５セットの固形飼料を作製した：０ｍｇ／ｋｇ／日、１００または１０００ｍｇ／ｋｇ／日の脱保護（極性）インヒビター、および１００または１０００ｍｇ／ｋｇ／日の保護（非極性）インヒビター。これらの数は、６週齢のラットは１日あたり約２５ｇの餌を食べることを示す、以前の研究から得られたデータに基づく。次いで１０匹の５週齢の健康なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（食餌１セットあたり２匹）に、３日間ラット固形飼料を給餌した。次いで動物を屠殺し、そして上記で記載したように組織を採取し、ホモジナイズし、そして分析した。
【０１４６】
５．３．２ 経口利用能の結果
ラットに、２つの異なる投与量の保護（非極性）および脱保護（極性）形態のインヒビター９ｃを３日間給餌した。ウェスタンブロット分析は、両方の形態のインヒビター９ｃの経口投与が、様々な組織型においてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに影響を与えることを示した（図１２）。脳組織のサンプル（図１２Ａ）は、ラットに１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量の保護または脱保護形態のインヒビター９ｃのいずれかを給餌した場合、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに顕著な増加があったことを示した。脳組織内でのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルは、ラットにより高い投与量の１０００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量の保護または脱保護形態のいずれかのインヒビター９ｃを給餌した場合、さらに高かった。これは、インヒビター９ｃが、経口的に投与された場合でも、脳細胞の内部に容易に入り、そこで用量依存的な様式でＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用することを示す。筋肉、膵臓、脂肪、および脾臓を含む他の型の組織サンプルに関して、同様の結果が観察された（図１２Ｂ−１２Ｅ）。
【０１４７】
前述の開示にかんがみて当業者に明らかであるように、本発明の実施において、その意図または範囲から離れることなく、多くの変更および修飾が可能である。
【０１４８】
（参考文献）
【０１４９】
【化４６】
【０１５０】
【化４７】
【０１５１】
【化４８】
【０１５２】
【化４９】
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの３つの可能性のある触媒メカニズムの説明である。経路Ａ；単一工程反転メカニズム：経路Ｂ；共有結合性のグリコシル酵素中間体の形成および分解を含む二重置換保持（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）メカニズム；経路Ｃ；二環性オキサゾリン中間体の形成および分解を含む二重置換保持（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）メカニズム。
【図２】図２は、ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃのＮ−フルオロアセチル誘導体の存在下での、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの活性を説明する。（Ａ）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃのＮ−フルオロアセチル誘導体の、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼが触媒する加水分解の初速度；（黒塗りの菱形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ（５）、（黒塗りの逆三角形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆ（５ａ）、（黒塗りの四角形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２（５ｂ）、（黒塗りの円）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃＦ３（５ｃ）。挿入図：軸の交点におけるプロットの領域の詳細。（Ｂ）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃのＮ−フルオロアセチル誘導体の、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅが触媒する加水分解の初速度；（黒塗りの菱形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ（５）、（黒塗りの逆三角形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆ（５ａ）、（黒塗りの四角形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２（５ｂ）、（黒塗りの円）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃＦ３（５ｃ）。挿入図：軸の交点におけるプロットの領域の詳細。（Ｃ）（黒塗りの円）Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよび（白抜きの四角形）β−ヘキソサミニダーゼを用いて、パネルＡおよびＢにおいて示したように各基質に関して測定したｌｏｇＶｍａｘ［Ｅ］０／ＫＭ値に対して、ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ基質アナログのＮ−フルオロアセチル置換基のＴａｆｔパラメーター（Ｔａｆｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）（σ＊）をプロットした線形自由エネルギー分析。
【図３】図３は、ＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）の存在下で、ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃのヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅが触媒する加水分解の競合的阻害パターンを説明する。使用した９ａの濃度（ｍＭ）は、０．００（黒塗りの菱形）、０．０３３（△）、０．１００（黒塗りの円）、０．３００（Ｘ）、０．９００（黒塗りの四角形）、および３．０４（○）であった。挿入図：ＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）濃度に対する見かけのＫＭのプロットからの、ＫＩの図による分析。
【図４】図４は、チアゾリンインヒビターのパネルによる、β−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの阻害に対する選択性を説明するグラフである。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（黒塗り）およびβ−ヘキソサミニダーゼ（網掛け）が触媒するＭＵ−ＧｌｃＮＡｃの加水分解の阻害に関して測定された、チアゾリンインヒビターパネル（９ａ−ｆ）のＫＩ値の棒グラフ。
【図５】図５は、５０μＭの異なるチアゾリンインヒビターの存在下または非存在下で４０時間培養したＣＯＳ−７細胞由来のタンパク質のウェスタンブロットである。ＣＯＳ−７細胞のチアゾリンインヒビターとのインキュベーションは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルの増加を引き起こす。レーン１、チアゾリン９ａ；レーン２、チアゾリン９ｃ；レーン３、チアゾリン９ｇ；レーン４、インヒビターなし。（Ａ）抗Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ ＭＡｂ ＣＴＤ１１０．６に続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を用いた、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルのウェスタンブロット分析。（Ｂ）抗βアクチンｍＡｂクローンＡＣ−４０に続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体で処理した、（Ａ）でロードしたサンプルのウェスタンブロットは、各サンプルにおいてβアクチンレベルが同等であることを明らかにする。
【図６】図６は、５０μＭのチアゾリンインヒビター（９ｃ）の存在下または非存在下で４０時間以上培養したＣＯＳ−７細胞由来のタンパク質のウェスタンブロットである。ＣＯＳ−７細胞のチアゾリンインヒビター（９ｃ）とのインキュベーションは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルの時間依存的な増加を引き起こす。（Ａ）抗Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ ＭＡｂ ＣＴＤ １１０．６に続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を用いた、インヒビター（９ｃ）への曝露後の時間の関数としての、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルのウェスタンブロット分析。（Ｂ）抗βアクチンｍＡｂクローンＡＣ−４０に続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体で処理した、（Ａ）でロードしたサンプルのウェスタンブロットは、各サンプルにおいてβアクチンレベルが同等であることを明らかにする。（Ｃ）インヒビターの非存在下における、時間の関数としての、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルのウェスタンブロット分析は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルが、コンフルエンスの関数として有意に変化しないことを示す。０時間において、プレートは約２５％コンフルエントであり、そして４０時間後プレートは約９０％コンフルエントであった。（Ｄ）パネル（Ｂ）と同様に処理した、（Ｃ）でロードしたサンプルのウェスタンブロットは、両方のサンプルにおいてβアクチンレベルが同等であることを明らかにする。
【図７】図７は、Ｄ２Ｏにおけるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の分解を説明する。Ｄ２Ｏに溶解したＳＴＺを、２４時間以上の期間モニターした。アステリスク（＊）をつけた共鳴は、ＳＴＺのα−アノマーのＨ−１由来である。スペクトルを、新しくＤ２Ｏに溶解したＳＴＺ（約１０ｍＭ）のサンプルから室温で収集した。ＮＭＲスペクトルを、ＳＴＺを溶解後、Ａ）５分、Ｂ）２０分、Ｃ）４０分、Ｄ）２時間、Ｅ）４時間およびＦ）２４時間後に収集した。
【図８】図８は、ＳＴＺはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの時間依存的な不活性化もβ−ヘキソサミニダーゼの時間依存的な不活性化も示さないことを説明するグラフである。Ａ）Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（０．０１６ｍｇ／ｍＬ）を、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ６．５の存在下で、１０ｍＭのＳＴＺとインキュベートした。いくつかの時間間隔で、不活性化混合物およびコントロールの酵素活性をアッセイした。アッセイ混合物中で１．２ｍＭのＳＴＺの最終濃度を生ずるために、Ｍｕ−ＧｌｃＮＡｃ（５．７ｍＭ）を含むアッセイ混合物（全部で２５μＬ）へ、酵素のアリコート（３μＬ）と共にある程度のＳＴＺが移されたので、これらの値は均一でない。実際、ＳＴＺがＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの競合的インヒビター（ＫＩ＝１．５ｍＭ）として作用すると仮定して計算した、コントロールおよび実験に関するアッセイの反応速度の期待される比（ＶＣｏｎｔｒｏｌ／ＶＳＴＺ）は、１．１７であり、ここで６時間以上測定された値と全体的に一致する。Ｂ）β−ヘキソサミニダーゼ（０．０３６ｍｇ／ｍＬ）を、５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５の存在下で、１０ｍＭのＳＴＺとインキュベートした。いくつかの時間間隔で、不活性化混合物およびコントロールの酵素活性を、方法および材料で記載されたようにアッセイした。アッセイ混合物中で１．２ｍＭのＳＴＺの最終濃度を生ずるために、Ｍｕ−ＧｌｃＮＡｃ（５．７ｍＭ）を含むアッセイ混合物（全部で２５μＬ）へ、酵素のアリコート（３μＬ）と共にある程度のＳＴＺが移されたので、これらの値は正確には均一でない。実際、ＳＴＺがβ−ヘキソサミニダーゼの競合的インヒビター（ＫＩ＝４７ｍＭ）として作用すると仮定して計算した、コントロールおよび実験に関するアッセイの反応速度の期待される比（ＶＣｏｎｔｒｏｌ／ＶＳＴＺ）は、１．０１であり、ここで６時間以上測定された値と一致する。
【図９】図９は、様々な投与量のインヒビター９ｃを注射したラットの脳、筋肉、および肝臓組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。４匹のラットを、異なる投与量のインヒビター９ｃまたは緩衝液コントロールの尾静脈注射によって処置した。約１８時間離して２回の連続的な注射を行い、そして次いでラットを最初の注射の２４時間後に屠殺した。α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析は、インヒビター９ｃが、脳（Ａ）、筋肉（Ｂ）および肝臓（Ｃ）を含む様々な組織へ、容易に入ることを明らかに示し、そして５０ｍｇ／ｋｇのように低い投与量が、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルの最大の増加を誘発するのにほぼ十分であることを示す。
【図１０】図１０は、ラットにおいて行われた静脈内グルコース負荷試験の結果を説明する。（Ａ）８匹のラットを、そのうち４匹に５０ｍｇ／ｋｇのインヒビター９ｃの尾静脈注射に曝して、グルコースを除去する能力に関して試験した。静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）を、これも尾静脈から送達された１ｇ／ｋｇのグルコースの負荷によって行った。エラーバーは、各条件下で使用した４匹のラットの間の分散を示す。（Ｂ）α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析は、ＩＶＧＴＴにおいてインヒビターで処置した４匹のラットにおいて、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルが増加したことを示す。
【図１１】図１１は、様々な時間でインヒビター９ｃを注射したラットの脳および筋肉組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。数匹のラットを、５０ｍｇ／ｋｇのインヒビター９ｃを尾静脈に注射することによって処置し、そして注射の後特定の時間に屠殺して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルが時間につれてどのように変化するのかを観察した。α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析を用いて、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルをモニターした。脳（Ａ）および筋肉（Ｂ）組織は、インヒビターが迅速に組織へ到達し得、そこで迅速にＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルを上昇させるよう作用することを示した（＜３時間）。約２４−３２時間以内に、インヒビター９ｃは組織から排出され、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルは正常に戻る。時間０および３２（−）は、０時間および３２時間における未処置コントロール動物を示す。
【図１２−１】図１２は、２つの異なる形態および投与量のインヒビター９ｃを給餌したラットの脳、筋肉、膵臓、脂肪、および脾臓組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。ラットに、異なる量の脱保護（極性）または保護（非極性）インヒビター９ｃを含むか、またはインヒビターを全く含まない食餌を３日間与えた。組織におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃのレベルを、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析によって評価した。脳（Ａ）、筋肉（Ｂ）、膵臓（Ｃ）、脂肪（Ｄ）および脾臓（Ｅ）組織において、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって判断されるように、１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量が、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを阻害し、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を大きく増加させるために十分である。１０００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のわずかにより大きな増加を引き起こす。αアクチン抗体によるコントロールブロットまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプルのローディングが等量であったことを示す。
【図１２−２】図１２は、２つの異なる形態および投与量のインヒビター９ｃを給餌したラットの脳、筋肉、膵臓、脂肪、および脾臓組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。ラットに、異なる量の脱保護（極性）または保護（非極性）インヒビター９ｃを含むか、またはインヒビターを全く含まない食餌を３日間与えた。組織におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃのレベルを、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析によって評価した。脳（Ａ）、筋肉（Ｂ）、膵臓（Ｃ）、脂肪（Ｄ）および脾臓（Ｅ）組織において、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって判断されるように、１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量が、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを阻害し、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を大きく増加させるために十分である。１０００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のわずかにより大きな増加を引き起こす。αアクチン抗体によるコントロールブロットまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプルのローディングが等量であったことを示す。
【図１２−３】図１２は、２つの異なる形態および投与量のインヒビター９ｃを給餌したラットの脳、筋肉、膵臓、脂肪、および脾臓組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。ラットに、異なる量の脱保護（極性）または保護（非極性）インヒビター９ｃを含むか、またはインヒビターを全く含まない食餌を３日間与えた。組織におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃのレベルを、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析によって評価した。脳（Ａ）、筋肉（Ｂ）、膵臓（Ｃ）、脂肪（Ｄ）および脾臓（Ｅ）組織において、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって判断されるように、１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量が、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを阻害し、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を大きく増加させるために十分である。１０００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のわずかにより大きな増加を引き起こす。αアクチン抗体によるコントロールブロットまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプルのローディングが等量であったことを示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年３月１日に出願された米国仮特許出願第６０／６５６，８７８号（これは、参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本出願は、選択的にグリコシダーゼを阻害する化合物、そのインヒビターを作製する方法、およびその使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
広範囲の細胞タンパク質（核および細胞質の細胞タンパク質の両方）は、、単糖２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（β−Ｎ−アセチルグルコサミン）の付加によって翻訳後修飾され、それはＯ−グリコシド結合によって結合する［１］。この修飾は一般的に、Ｏ結合型Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＯ−ＧｌｃＮＡｃと呼ばれる。
【０００４】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質は、例えば転写［２−５］、プロテアソーム分解［６］、および細胞シグナル伝達［７］を含む、広範囲の重要な細胞機能を有する。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃはまた、多くの構造タンパク質においても見出される［８−１０］。例えば、それは神経フィラメントタンパク質［１１、１２］、シナプシン［１３、１４］、シナプシン特異的クラスリン集合タンパク質ＡＰ−３［１５］、およびアンキリンＧ［１６］を含む、多くの細胞骨格タンパク質において見出された。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾は、脳において豊富であることが見出された［１７、１８］。それはまた、ＩＩ型糖尿病、アルツハイマー病（ＡＤ）および癌を含むいくつかの疾患の病因に明らかに関わっているタンパク質においても見出された。
【０００５】
例えば、ＡＤならびにダウン症候群、ピック病、ニーマン−ピック病Ｃ型、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む多くの関連するタウオパチー（tauopathy）は、部分的には、神経原線維変化（ＮＦＴ）の発達によって特徴付けられることが、よく確立している。これらのＮＦＴは、対らせんフィラメント（ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ）（ＰＨＦ）の凝集物であり、そして重要なタンパク質「タウ（tau）」の異常な形態から構成される。正常なタウは、ニューロン内のタンパク質および栄養素の分配に必須である微小管の重要な細胞ネットワークを安定化する。しかしＡＤ患者においては、タウは過剰にリン酸化され、その正常な機能を破壊してＰＨＦを形成し、そして最終的には凝集して有害なＮＦＴを形成する。ＡＤ患者の脳内のＮＦＴレベルと認知症の重症度との間の明らかな類似点は、ＡＤにおけるタウ機能不全の重要な役割を強力に支持する［１９、２０］。このタウの過剰リン酸化の正確な原因は不明のままである。従って、ａ）タウ過剰リン酸化の分子生理学的な基礎を明らかにすること［６］、およびｂ）これらがアルツハイマー病の進行を停止させる、またはさらに逆転させ得ることを期待して、タウ過剰リン酸化を制限し得る戦略を同定すること［７、８］に、多くの努力がなされた。これまで、いくつかの証拠が、タウの過剰リン酸化に多くのキナーゼのアップレギュレーションが関与し得ることを示唆しているが［９、１０、２１］、最近、この過剰リン酸化の第２の基礎が提案された［２１］。特に、タウのリン酸レベルが、タウにおけるＯ−ＧｌｃＮＡｃのレベルによって調節されていることが最近明らかになった。ヒトＡＤ脳における過剰リン酸化タウは、健常なヒト脳において見出されるものより顕著に低いレベルのＯ−ＧｌｃＮＡｃを有する［２、３］。これらの結果は、タウＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルを調節するメカニズムにおける機能不全が、ＮＦＴの形成および関連した神経変性においてきわめて重要であり得ることを示唆する。
【０００６】
ヒトは、複合糖質から末端のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミン残基を切断する酵素をコードする、３つの遺伝子を有する。これらの最初のものは、酵素Ｏ−糖タンパク質２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシダーゼ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ）をコードする。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、グリコシドヒドロラーゼファミリー８４のメンバーであり、それは原核生物の病原体からヒトまでのように多様な有機体由来の酵素を含む（グリコシドヒドロラーゼのファミリー分類に関しては、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／のＣｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（１９９９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓサーバーを参照のこと）［１９、２０］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、翻訳後修飾されたタンパク質のセリンおよびスレオニン残基からＯ−ＧｌｃＮＡｃを加水分解するよう作用する［１、２２、２３］。多くの細胞内タンパク質におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃの存在と一致して、酵素Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、ＩＩ型糖尿病［７、２１］、ＡＤ［９、１７、２４］、および癌［１８］を含むいくつかの疾患の病因に役割を果たしているようである。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、おそらく早くに単離されたが［１１、１２］、タンパク質のセリンおよびスレオニン残基からＯ−ＧｌｃＮＡｃを切断する作用におけるその生化学的役割が理解されるまでに約２０年が経過した［１３］。より近年になって、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅがクローニングされ［１５］、部分的に特徴付けられ［１６］、そしてヒストンアセチルトランスフェラーゼとしてのさらなる活性を有することが示唆された［１４］。しかし、この酵素の触媒メカニズムについてはほとんど知られていなかった。
【０００７】
他の２つの酵素、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢは、複合糖質からの末端β−Ｎ−アセチルグルコサミン残基の加水分解性の切断を触媒する酵素をコードする。ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢの遺伝子産物は、主に２つの二量体アイソザイム、それぞれヘキソサミニダーゼＡおよびヘキソサミニダーゼＢを生ずる。ヘテロダイマーアイソザイムであるヘキソサミニダーゼＡ（αβ）は、αおよびβサブユニットから成る。ホモダイマーアイソザイムであるヘキソサミニダーゼＢ（ββ）は、２つのβサブユニットから成る。２つのサブユニット、αおよびβは、高レベルの配列同一性を有する。これらの酵素はどちらも、グリコシドヒドロラーゼファミリー２０のメンバーとして分類され、そして通常リソソーム内に局在する。これらリソソームのβ−ヘキソサミニダーゼが正しく機能することが、ヒトの発生に決定的であり、それはそれぞれヘキソサミニダーゼＡおよびヘキソサミニダーゼＢの機能不全から起こる悲劇的な遺伝病、テイ−サックス病およびサンドホフ病によって強調される事実である［２５］。これらの酵素欠損は、リソソームにおける糖脂質および複合糖質の蓄積を引き起こし、神経機能障害および変形を引き起こす。有機体レベルにおけるガングリオシドの蓄積の有害な影響が、依然として明らかになりつつある［２６］。
【０００８】
これらのβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼの生物学的重要性の結果として、グリコシダーゼの小分子インヒビター［２７−２９］（非特許文献１）［３０］が、これらの酵素の生物学的プロセスにおける役割を明らかにするツールとして、および潜在的な治療的適用の開発において非常に注目された［３１］。小分子を用いたグリコシダーゼ機能の調節は、遺伝的ノックアウト研究に対して、迅速に投与量を変化させるか、または完全に処置を停止する能力を含む、いくつかの利点を提供する。
【０００９】
しかし、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを含む哺乳類グリコシダーゼの機能を阻害するインヒビターの開発における主な難点は、高等真核生物の組織に存在する多数の機能的に関連した酵素である。従って、１つの特定の酵素の細胞および有機体での生理学的役割の研究において非選択的インヒビターを使用することは、そのような機能的に関連する酵素の同時阻害によって複雑な表現型が生じるので、複雑である。β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの場合には、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用する既存の化合物は、非特異的であり、そしてリソソームβ−ヘキソサミニダーゼを阻害するよう強力に作用する。今までに、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼより核細胞質Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに選択的な、強力なインヒビターは知られていない。
【００１０】
細胞および組織の両方で、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ翻訳後修飾の研究において使用された、よりよく特徴付けられたβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼの少数のインヒビターは、ストレプトゾシン（ＳＴＺ）、２’−メチル−α−Ｄ−グルコピラノ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（ＮＡＧ−チアゾリン）およびＯ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（ＰＵＧＮＡｃ）である［７、３２−３５］。
【００１１】
ＳＴＺは、β−島細胞に対して特に有害な影響を有するので、糖尿病誘発性化合物として長く使用されてきた［３６］。ＳＴＺは、細胞ＤＮＡのアルキル化［３６、３７］および一酸化窒素を含むラジカル種の産生［３８］の両方によって、その細胞毒性効果を発揮する。生じたＤＮＡ鎖の切断は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）［３９］の活性化を促進し、最終的に細胞ＮＡＤ＋レベルを枯渇させ、そして最後には細胞死に至る［４０、４１］。他の研究者は別に、ＳＴＺ毒性は、β−島細胞内で高度に発現しているＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの不可逆的阻害の結果であると提唱した［３２、４２］。しかし、この仮説は、２つの独立した研究グループによって疑問を投げかけられた［４３、４４］。タンパク質の細胞Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルは、多くの形式の細胞ストレスに反応して増加するので［４５］、ＳＴＺは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに対する特異的および直接的作用によってではなく、細胞ストレスを誘発することによって、タンパク質のＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾レベルの増加を引き起こす可能性がある。実際、Ｈａｎｏｖｅｒおよび同僚らは、ＳＴＺはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの弱く、そしていくらか選択的なインヒビターとして機能することを示し［４６］、そしてＳＴＺはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを不可逆的に阻害するよう作用することが他の研究者によって提唱されたが［４７］、この作用形式を明らかに示すものはない。
【００１２】
ＮＡＧ−チアゾリンは、ファミリー２０ヘキソサミニダーゼ（非特許文献１）［３０］、（非特許文献２）［４８］、およびより近年には、ファミリー８４Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（非特許文献３）［４９］の強力なインヒビターであることが見出された。その効力にもかかわらず、複雑な生物学的状態でＮＡＧ−チアゾリンを使用することの欠点は、それが選択性を欠き、そして従って複数の細胞のプロセスを混乱させることである。
【００１３】
ＰＵＧＮＡｃは、同じ選択性の欠如の問題をかかえる別の化合物であるが、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ［１３、５０］およびファミリー２０ヒトβ−ヘキソサミニダーゼ［５１］の両方のインヒビターとして使用されてきた。Ｖａｓｅｌｌａおよび同僚らによって開発されたこの分子は、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ由来のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ、およびウシ腎臓由来のβ−ヘキソサミニダーゼの強力な競合的インヒビターであることが見出された［２８］。
【００１４】
従って、グリコシダーゼの改善された選択的インヒビターに対する必要性が生じた。
【非特許文献１】Ｓ．Ｋｎａｐｐら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９６）１１８、６８０４〜６８０５
【非特許文献２】Ｂ．Ｌ．Ｍａｒｋら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００１）２７６、１０３３０〜１０３３７
【非特許文献３】Ｍ．Ｓ．Ｍａｃａｕｌｅｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００５）２８０、２５３１３〜２５３２２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（要旨）
本発明の実施態様は、グリコシダーゼを選択的に阻害する化合物に関連する。本発明はまた、そのような化合物の作製方法、およびその使用にも関連する。
【００１６】
本発明の１つの実施態様において、その化合物は、一般的な化学式（Ｉ）：
【００１７】
【化５】
を有し、ここでＲ３、Ｒ５、Ｒ６は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る；Ｒ２およびＲ４は、ＣＨ２、ＣＨＲ１、ＮＨ、ＮＲ１、または任意のヘテロ原子であり、そしてＲ１は、Ｈ、エーテル、アミン、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択される。本発明は、上記の化合物の薬学的に受容可能な塩を含む。本発明のいくつかの実施態様において、Ｒ２はＳ、およびＲ１はＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなるグループから選択され、そしてＲ４はＯである。本発明はまた、その化合物のプロドラッグ、その化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物、ならびにその化合物のプロドラッグおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物に関連する。
【００１８】
本発明の別の実施態様において、その化合物は、一般的な化学式（ＩＩ）：
【００１９】
【化６】
およびその薬学的に受容可能な塩を有し、ここでＸ１−Ｘ６はＯ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、そしてＲ１からＲ５は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る。
【００２０】
いくつかの実施態様において、その化合物は、他のグリコシダーゼより特定のグリコシダーゼの活性を選択的に阻害する。本発明の１つの実施態様において、グリコシダーゼはグリコシドヒドロラーゼを含む。本発明の別の実施態様において、グリコシドヒドロラーゼは、ファミリー８４グリコシドヒドロラーゼである。本発明の特定の実施態様において、グリコシダーゼはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅである。化合物は、β−ヘキソサミニダーゼよりＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの活性を選択的に阻害する。特に、この特定の実施態様において、化合物は２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）のタンパク質からの切断を選択的に阻害する。
【００２１】
その化合物は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの過剰発現、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの枯渇に関連する疾患または障害を研究するための、およびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損または過剰発現またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積または枯渇に関連する疾患および障害の治療を研究するための、動物モデルを開発するのに有用である。そのような疾患および障害は、糖尿病、アルツハイマー病を含む神経変性性疾患、および癌を含む。その化合物はまた、グリコシダーゼ阻害治療に反応性の疾患および障害の治療においても有用である。その化合物はまた、細胞および組織を組織損傷またはストレスに関連するストレスに備えること、細胞を刺激すること、および細胞の分化を促進することにも有用である。これらの化合物はまた、特定のグリコシダーゼ、例えばファミリー８４グリコシドヒドロラーゼのメンバーである微生物の毒素を阻害するのにも有用であり得、そして従って抗菌剤としての用途が見出され得る。
【００２２】
本発明はまた、その化合物を作製する方法にも関連する。１つの実施態様において、その方法は、以下の工程を含み得る：
ａ）２−アミノ−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノースの塩酸塩を、ある範囲のアシル化剤でアシル化して、一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体を得る工程；
ｂ）一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体のアミドを、対応するチオアミドへ変換し、そしてチオアミドを環化して一連の３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程；そして
ｃ）チアゾリン化合物を脱アシル化して、一連の１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程。
【００２３】
本発明はまた、以下のことを含む、選択的グリコシダーゼインヒビターを作製する方法にも関連する：
ａ）２つまたはそれ以上のグリコシダーゼまたは１つのクラスのグリコシダーゼのインヒビターを選択する工程；
ｂ）側鎖を拡張または縮小することによって、インヒビターの１つまたはそれ以上の側鎖を修飾する工程；そして
ｃ）１つまたはそれ以上のグリコシダーゼの選択的阻害に関して、修飾したインヒビターを試験する工程。
【００２４】
本発明のいくつかの実施態様において、選択的グリコシダーゼインヒビターを作製する方法は、以下の工程を含む：
ａ）以下：
【００２５】
【化７】
およびその薬学的に受容可能な塩から選択される一般式を有する、β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼのインヒビターを選択する工程であって、ここでＸ１−Ｘ６は、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、そしてＲ１からＲ５は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、工程；
ｂ）側鎖の大きさを拡張または縮小することによって、インヒビターのＲ１側鎖を修飾する工程；そして
ｃ）１つまたはそれ以上のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼの選択的阻害に関して、修飾したインヒビターを試験する工程。
【００２６】
本発明のいくつかの実施態様において、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、またはそのヘテロ原子誘導体を側鎖へ挿入することによって、インヒビターのＲ１側鎖を拡張し得る。いくつかの特定の実施態様において、ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択される基を挿入することによって、Ｒ１鎖を拡張する。
【００２７】
図面において、本発明の実施態様を説明するよう意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（発明の詳細な説明）
以下の説明を通して、本発明のより完全な理解を提供するために特定の詳細を述べる。しかし、本発明はこれらの詳細なしで実施し得る。他の場合には、本発明を不必要にわかりにくくするのを避けるために、周知の要素は詳細に示されないか、または説明されない。従って、明細書および図は、制限的ではなく、説明的な意味にみなされる。
【００２９】
本発明は、グリコシダーゼを選択的に阻害する化合物を含む。本発明の１つの実施態様において、その化合物は、一般的な化学式（Ｉ）：
【００３０】
【化８】
を有し、ここでＲ３、Ｒ５、Ｒ６は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなるグループから選択されるアシル基を含み得る；Ｒ２およびＲ４は、ＣＨ２、ＣＨＲ１、ＮＨ、ＮＲ１または任意のヘテロ原子であり、そしてＲ１は、Ｈ、エーテル、アミン、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択される。本発明は、上記の化合物の薬学的に受容可能な塩を含む。いくつかの実施態様において、Ｒ２はＳ、Ｒ１は、ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択され、そしてＲ４はＯである。本発明のいくつかの特定の実施態様において、その化合物は、１，２−ジデオキシ−２’−エチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−プロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−ブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−ペンチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−イソプロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−イソブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを含む。
【００３１】
当業者によって認識されるように、上記の式（Ｉ）は、代わりに以下：
【００３２】
【化９】
のようにも示し得る。
【００３３】
本発明の別の実施態様において、その化合物は一般的な化学式（ＩＩ）：
【００３４】
【化１０】
、およびその薬学的に受容可能な塩を有し、ここでＸ１−Ｘ６は、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１からＲ５は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなるグループから選択されるアシル基を含み得る。
【００３５】
本発明は、上記の化合物の薬学的に受容可能な塩を含む。いくつかの実施態様において、Ｒ１はＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択され、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はＯＨであり、Ｘ１およびＸ２はＯであり、Ｘ３はＮＨであり、Ｘ４およびＸ５はＯであり、Ｘ６はＮＨであり、そしてＲ５はＣ６Ｈ６である。本発明のいくつかの特定の実施態様において、その化合物は、Ｏ−（２−デオキシ−２−プロパミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、Ｏ−（２−デオキシ−２−ブタミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、Ｏ−（２−デオキシ−２−吉草酸アミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、Ｏ−（２−デオキシ−２−ヘキサミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、Ｏ−（２−デオキシ−２−イソブタミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート、またはＯ−（２−デオキシ−２−イソ吉草酸アミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメートを含む。
【００３６】
この出願を通して、「化合物」という用語は、上記で議論された化合物を指し、そしてアシル保護誘導体を含むその化合物の誘導体、およびその化合物および誘導体の薬学的に受容可能な塩を含むことが企図される。本発明はまた、その化合物のプロドラッグ、その化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物、ならびにその化合物のプロドラッグおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物も含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施態様において、その化合物は、他のグリコシダーゼより特定のグリコシダーゼの活性を選択的に阻害する。そのグリコシダーゼは、グリコシドヒドロラーゼを含み得る。例えば、そのグリコシドヒドロラーゼは、ファミリー８４グリコシドヒドロラーゼであり得る。本発明の特定の実施態様において、そのグリコシダーゼはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅである。本発明は、β−ヘキソサミニダーゼよりＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの活性を選択的に阻害する化合物を含む。特に、その化合物は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃのタンパク質からの切断を選択的に阻害する。
【００３８】
本発明の化合物は、細胞および有機体レベルにおいてＯ−ＧｌｃＮＡｃの生理学的役割を研究するための貴重なツールである。その化合物は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損または過剰発現、またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積または枯渇に関連する疾患または障害を研究するための動物モデルを開発するためにか、あるいはこれらの疾患または障害の治療を研究するために有用である。一例として、その化合物は、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病の発症に関する疾患モデルの開発に有用である。
【００３９】
ＩＩ型糖尿病は、ヒトまたは動物が血中グルコースレベルを適切に制御できない場合に発症する。組織は、グルコース利用能の変化および内分泌系の他の構成要素からのシグナルを感知し、そして迅速に応答できなければならない。グルコースは、インスリン合成および膵臓β-細胞からの分泌の調節に重要な栄養素である。細胞に入る全てのグルコースのうち、２−５％はヘキソサミン生合成経路へ向けられ、それによってこの経路の最終産物、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）の細胞濃度を調節する［５２］。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、核細胞質酵素Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＯＧＴａｓｅ）の基質であり［５３−５６］、それは多数の核細胞質タンパク質の特定のセリンおよびスレオニン残基にＧｌｃＮＡｃを翻訳後に付加するように作用する。ＯＧＴａｓｅは、そのテトラトリコペプチド反復（ＴＰＲ）ドメイン［６１、６２］によって、多くのその基質［５７、５８］および結合パートナー［５９、６０］を認識する。上記で記載したように、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ［１３、１５］は、この翻訳後修飾を除去してタンパク質を遊離し、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾を、タンパク質の寿命の間に数回起こる動的なサイクルにする［６３］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃは、いくつかのタンパク質において公知のリン酸化部位に見出され［３、６４−６６］、細胞シグナル伝達におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃの役割を示唆した。さらに、ＯＧＴａｓｅは、細胞内ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ基質濃度、そしてそれゆえグルコース供給に対して鋭敏に感受的にする一般的ではない動態挙動を示す［６７］。これらのデータは全て、栄養素感知メカニズムとして作用するＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルの論理的役割を示す。栄養素感知におけるそのような可能性のある役割を支持するために、末梢組織において上昇したＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルはインスリン抵抗性の発症を引き起こすことが示された［７、２１］。実際、一塩基多型がメキシコ人集団におけるＩＩ型糖尿病の発症に関連することを示す最近の研究によって、顕著に上昇したＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルが、ＩＩ型糖尿病を引き起こし得ることが提唱された［６８］。増加したＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルがインスリン抵抗性を引き起こすことを示すために、培養細胞および組織において、ＰＵＧＮＡｃが使用された［７、３２−３５］。類推によって、本発明の化合物も、同様の研究において使用し得、そして糖尿病の発症におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルの役割を示すための動物モデルを開発するために使用し得る。
【００４０】
本発明の化合物はまた、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損または過剰発現、またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積または枯渇に関連する疾患または障害、またはグリコシダーゼ阻害治療に反応性の任意の疾患または障害の治療においても有用である。そのような疾患および障害は、糖尿病、アルツハイマー病（ＡＤ）のような神経変性性疾患、および癌を含むがこれに限らない。そのような疾患および障害はまた、酵素ＯＧＴａｓｅの蓄積または欠損に関連する疾患または障害を含み得る。
【００４１】
例えば、上記で議論したようなＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルおよびタウのリン酸化レベルの間の関係のために、本発明の化合物を、ＡＤおよび他のタウオパチー（tauopathy）を研究および治療するために使用し得る。ヒト脳において、タウの６個のアイソフォームが見出された。ＡＤ患者において、タウの６個のアイソフォームの全てがＮＦＴにおいて見出され、そして全てが顕著に過剰リン酸化されている［６９、７０］。健常な脳組織におけるタウは、２または３つのリン酸基しか有していないが、ＡＤ患者の脳において見出されるものは平均で８個のリン酸基を有する［７１、７２］。
【００４２】
タウにおけるＯ−ＧｌｃＮＡｃの存在は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルをタウリン酸化レベルと関連付ける研究を刺激した。この分野における最近の関心は、多くのタンパク質においてリン酸化されることも公知であるアミノ酸残基において、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾が起こることが見出されたという観察に由来する［６５、６６、７３］。この観察と一致して、リン酸化レベルの増加は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルの減少を引き起こし、そして逆に、増加したＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルは減少したリン酸化レベルと関連することが見出された［７４］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃおよびリン酸化の間のこの相互関係は、「陰陽仮説」［７５］と命名され、そして酵素ＯＧＴａｓｅ［５５］がタンパク質からリン酸基を除去するよう作用するホスファターゼと機能的複合体を形成するという最近の発見によって、強力な生化学的支持を得た［６０］。リン酸化と同様に、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃは、タンパク質の寿命の間に数回除去および再設置され得る動的な修飾である。示唆的に、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅをコードする遺伝子が、ＡＤに関連した染色体の遺伝子座にマッピングされた［１５、７６］。
【００４３】
ごく最近、ＡＤを発症したヒト脳由来の可溶性タウタンパク質のＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルは、健常な脳由来のものより顕著に低いことが示された［１７］。さらに、罹患した脳由来のＰＨＦは、いかなるＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾も完全に欠くことが示唆された［１７］。このタウの低グリコシル化の分子的基礎は未知であるが、キナーゼの活性の増加および／またはＯ−ＧｌｃＮＡｃのプロセシングに関係する酵素の１つの機能不全に起因し得る。この後者の視点を支持して、ＰＣ−１２神経細胞およびマウスの脳組織切片の両方において、非選択的Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼインヒビターを使用してタウＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルを増加させ、そこでリン酸化レベルが減少したことが観察された［１７］。これらの集合的な結果は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの作用を阻害することによるように、ＡＤ患者において健常なＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルを維持することによって、タウの過剰リン酸化、およびＮＦＴの形成および下流の影響を含む、タウ過剰リン酸化に関連する全ての影響を阻害できるはずであることを意味する。しかし、β−ヘキソサミニダーゼが正常に機能することが重要であるので、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの作用を阻害するＡＤの治療のためのあらゆる可能性のある治療的介入は、ヘキソサミニダーゼＡおよびＢ両方の同時阻害を避けなければならない。この選択的阻害が、本発明の化合物によって提供される。
【００４４】
本発明の化合物は、他の型のグリコシダーゼの選択的インヒビターとして有用である。例えば、いくつかの微生物毒素は、ファミリー８４グリコシドヒドロラーゼのメンバーであり、そして従って本発明の化合物は、抗菌薬として有用であり得る。
【００４５】
本発明の化合物はまた、多能性細胞を島β細胞へ促進するように、細胞の分化を促進するのにも有用である。例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃは、いくつかの転写因子の機能を調節することが公知であり、そして転写因子ＰＤＸ−１において見出されることが公知である。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ残基の修飾による、転写因子ＰＤＸ−１の修飾は、ＰＤＸ−１の活性に影響を与え、それは次に細胞分化に影響を与え得る。
【００４６】
本発明の化合物はまた、ストレスに対して細胞を備えるのに有用である。最近の研究は、ＰＵＧＮＡｃを動物モデルにおいて使用して、左冠動脈閉塞後の心筋梗塞の大きさを抑制し得ることを示した［７７］。
【００４７】
本発明はまた、その化合物を作製する様々な方法に関連する。１つの実施態様において、その方法は以下の工程を含み得る：
ａ）２−アミノ−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノースの塩酸塩を、ある範囲のアシル化剤でアシル化して、一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体を得る工程；
ｂ）一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体のアミドを、対応するチオアミドへ変換し、そしてチオアミドを環化して一連の３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程；そして
ｃ）チアゾリン化合物を脱アシル化して、一連の１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程。
【００４８】
本発明はまた、例えば以下の工程を含む、選択的グリコシダーゼインヒビターを作製する方法に関連する：
ａ）２つまたはそれ以上のグリコシダーゼまたは１つのクラスのグリコシダーゼのインヒビターを選択する工程；
ｂ）側鎖を拡張または縮小することによって、インヒビターの１つまたはそれ以上の側鎖を修飾する工程；そして
ｃ）１つまたはそれ以上のグリコシダーゼの選択的阻害に関して、修飾したインヒビターを試験する工程。
【００４９】
本発明のいくつかの実施態様において、選択的グリコシダーゼインヒビターを作製する方法は、以下の工程を含む：
ａ）以下：
【００５０】
【化１１】
およびその薬学的に受容可能な塩から選択される一般式を有する、β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼのインヒビターを選択する工程であって、ここでＸ１−Ｘ６は、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１からＲ５は、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換または非置換カルバメート、置換または非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびそのヘテロ原子を含む誘導体からなる群より選択され、ここで当該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびそのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、工程；
ｂ）側鎖の大きさを拡張または縮小することによって、インヒビターのＲ１鎖を修飾する工程；そして
ｃ）１つまたはそれ以上のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼの選択的阻害に関して、修飾したインヒビターを試験する工程。
【００５１】
本発明のいくつかの実施態様において、分枝アルキル鎖、分枝していないアルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、またはそのヘテロ原子誘導体を側鎖へ挿入することによって、インヒビターのＲ１鎖を拡張し得る。いくつかの特定の実施態様において、ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択される基を挿入することによって、Ｒ１鎖を拡張する。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は、本発明の実施態様を説明することを意図し、そして制限する形式で解釈することを意図しない。
【００５３】
（実施例１：Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの触媒メカニズムの比較分析）
１．１ Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの可能性のある触媒メカニズム
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのインヒビターを設計するための論理的な開始点は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの触媒メカニズムを考慮する。ファミリー２０ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＡおよびＢの触媒作用メカニズムはかなりよく確立されたが［７８］、ファミリー８４Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのものは未知のままである。従って、発明者はまず、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの触媒メカニズムを明らかにし、そして次に、強力で、細胞透過性であり、そしてリソソームβ−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに高度に選択的な、単純なインヒビターを設計するためにこの情報を使用した。
【００５４】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびファミリー８４グリコシドヒドロラーゼに関して、３つの現実的なメカニズムの選択肢が存在する。最初の選択肢は、ファミリー２３のグリコシドヒドロラーゼ由来のガチョウリゾチーム［７９］に関して見出されたような、逆転メカニズム（図１Ａ）である。この触媒メカニズムは一般的に、酸触媒された脱離基の離脱と同時に、アノマー中心における水の塩基触媒された求核攻撃を含む。
【００５５】
２番目のメカニズムの可能性は、アノマー中心における配置の保持を引き起こす、標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）２段階２重置換メカニズムである（図１Ｂ）。このメカニズムは、ほとんどの保持性（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）β−グリコシダーゼによって使用され、そして、第１段階でアノマー中心における酵素求核試薬の攻撃を含み、一時的な共有結合性のグリコシル酵素中間体の形成を引き起こす［８０］。アグリコン脱離基の離脱は、一般酸触媒として作用する酵素残基によって促進される。第２段階において、この同じ残基が一般塩基触媒として作用して、アノマー中心における水分子の攻撃を促進し、中間体を分解して立体化学の保持されたヘミアセタール産物を遊離させる。ファミリー３のグリコシドヒドロラーゼ由来のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、ファミリー２２のＣ型リゾチームと同様に［８２］、このメカニズムを使用することが示された［８１］。
【００５６】
３番目のメカニズムの選択肢は、酵素の触媒求核試薬の代わりに、基質の２−アセトアミド基の求核性の関与を含む（図１Ｃ）。この最後のメカニズムの選択肢は、ファミリー２０のグリコシドヒドロラーゼ由来のβ−ヘキソサミニダーゼによって利用される［３０、４８、８３］。これらの３つのメカニズムは、いくつかの面で異なる。逆転メカニズムは、アノマー中心において逆転した立体化学を有する産物の形成を引き起こす１段階の反応である。他の２つの選択肢は、アノマー中心において立体化学を保持し、そして主に中間体の性質において互いに異なる。２番目のメカニズムにおいて、この種は共有結合の酵素付加物であり、一方３番目の場合にはそれは二環性のオキサゾリンまたはオキサゾリニウムイオンであると考えられる。
【００５７】
これらのメカニズムの選択肢間の重要な違いは、基質の２−アセトアミド基の関与である。この部分は、リソソームβヘキソサミニダーゼに関するように、求核試薬として触媒作用に積極的に関与し得るか、または受動的に（as a bystander）作用し得る。
【００５８】
１．２ 基質アナログの合成
基質の２−アセトアミド基の役割に取り組むために、Ｎ−アセチル基に異なるレベルのフッ素置換を有する、いくつかの基質アナログを合成した（スキーム１）。高度に電気陰性のフッ素置換基は、カルボニル基の塩基性度を減少させ、そして隣接基補助を用いる酵素反応に対するそのような置換の期待される効果は、その速度を減少させることである。
【００５９】
【化１２】
１．２．１ 基質アナログの合成に関する一般的な手順
この研究において使用した全ての緩衝液塩は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。乾燥メタノールおよびトルエンは、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。ジクロロメタンおよびトリエチルアミンは、使用の前にＣａＨ２に対して蒸留することによって乾燥した。β−ヘキソサミニダーゼは、Ｓｉｇｍａから購入した（ロット０４３Ｋ３７８３）。ＳＴＺは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、そしてサンプルをアッセイの直前に新しく溶解した。ＰＵＧＮＡｃはＴｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た。他の試薬は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、そしてさらなる精製をせずに使用した。全ての緩衝液を調製するためにＭｉｌｌｉ−Ｑ（１８．２ｍΩ／ｃｍ）水を使用した。合成反応を、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４アルミニウム裏打ちシートを使用してＴＬＣによってモニターした。２ＭのＨ２ＳＯ４中１０％のモリブデン酸アンモニウムで焦がし、そして加熱することによって化合物を検出した。Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（２３０−４００メッシュ）によって、指定された溶離剤を用いて、陽圧下でのフラッシュクロマトグラフィーを行った。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＡＳ５００ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａ分光計で５００ＭＨｚにおいて記録した（適当な場合にＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤ、または（ＣＤ３）２ＳＯに対する相対的な化学シフトを引用した）。１９Ｆ ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＡＳ５００ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａ分光計で４７０ＭＨｚにおいて記録し、そして参照としてＣＦ３ＣＯ２Ｈとプロトンカップリングさせる。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＡＳ５００ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａ分光計で１２５ＭＨｚにおいて記録した（ＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤ、または（ＣＤ３）２ＳＯに対する相対的な化学シフトを引用した）。細胞培養および酵素アッセイにおいて使用した全ての化合物の元素分析を、Ｓｉｍｏｎ Ｆｒａｓｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて行った。
【００６０】
１．２．２ ４−メチルウンベリフェロン２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
４−メチルウンベリフェリル２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド塩酸塩（３）を、本質的にＲｏｅｓｅｒおよびＬｅｇｌｅｒ［８４］によって記載されたように調製し、そしてさらなる精製無しに使用した。
【００６１】
１．２．３ ４−メチルウンベリフェリル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（４ａ）の合成
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１０ｍＬ）中の冷却した（０℃）塩酸塩３（０．５０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．３ｍＬ、０．２１ｇ、２．１ｍｍｏｌ）および乾燥ピリジン（１０ｍＬ）を加えた。乾燥ＤＯＷＥＸ−５０Ｈ＋樹脂（６ｇ）を含む乾燥ＤＭＦ（４５ｍＬ）の攪拌した混合物に、フルオロ酢酸ナトリウム（０．９ｇ）を加えた。１時間後ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１．６ｇ、７．８ｍｍｏｌ）および３０ｍＬのフルオロ酢酸溶液（６．０ｍｍｏｌ）を、塩酸塩３を含む反応容器へカニューレによって加えた。できた溶液を０℃で１６時間置き、その後ＴＬＣ分析によって反応が終わったことを判断した。減圧下で溶媒を部分的に除去し、その後酢酸エチル（５０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム溶液（２０ｍＬ）を加えた。有機層を回収し、そして水層を酢酸エチルで２回抽出した。あわせた有機抽出物を、水、飽和炭酸水素ナトリウムで２回、および最後に飽和塩化ナトリウムで連続的に洗浄した。有機抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で溶媒を除去して淡黄色のシロップを得た。フラッシュカラムシリカクロマトグラフィー（２：１；酢酸エチル−ヘキサン）を用いて望ましい産物を精製し、部分的に精製した望ましい化合物を、非晶質の白色固体として得て（約３５６ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、６８％）、それをさらなる精製なしに、次の工程で使用した。
【００６２】
１．２．４ ４−メチルウンベリフェリル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−ジフルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（４ｂ）の合成
ジメチルホルムアミドの溶液（ＤＭＦ、６ｍＬ）中の冷却した（０℃）塩酸塩３（０．１５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．０９ｍＬ、０．０６３ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）および乾燥ピリジン（３ｍＬ）を加えた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、０．４８ｇ、２．３ｍｍｏｌ）およびジフルオロ酢酸（０．１２ｍＬ、０．１８ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を、シリンジによって反応混合物中に加えた。できた溶液を０℃で１６時間置き、その後２滴のジフルオロ酢酸を加えた。さらに室温で３．５時間後、ＴＬＣ分析によって反応が終わったことを判断した。減圧下で溶媒を部分的に除去し、その後酢酸エチル（５０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム溶液（２０ｍＬ）を加えた。有機層を回収し、そして水層を酢酸エチルで２回抽出した。あわせた有機抽出物を、水、飽和炭酸水素ナトリウムで２回、および最後に飽和塩化ナトリウム溶液で連続的に洗浄した。有機抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で溶媒を除去して淡黄色のシロップを得た。グラジエント溶媒系（１：１；ヘキサン−酢酸エチル）を用いたフラッシュカラムシリカクロマトグラフィーを用いて望ましい産物を精製し、部分的に精製した望ましい化合物を、非晶質の白色固体として得て（約０．１０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、６４％）、それをさらなる精製なしに、次の工程で使用した。
【００６３】
１．２．５ ４−メチルウンベリフェリル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−トリフルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（４ｃ）の合成
ジメチルホルムアミドの溶液（ＤＭＦ、６ｍＬ）中の冷却した（０℃）塩酸塩３（０．１０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．０６ｍＬ、０．４２ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加えた。次いで反応混合物を０℃まで冷却し、そしてシリンジによってトリフルオロ酢酸無水物（０．０８ｍＬ、０．１２ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を加えた。できた溶液を０℃で１６時間置き、その後ＴＬＣ分析によって反応が終わったことを判断した。反応混合物を次いで酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、そして飽和塩化ナトリウム溶液（４０ｍＬ）を加えた。有機相を回収し、そして水相を酢酸エチルで２回抽出した。あわせた有機抽出物を、水、飽和炭酸水素ナトリウムで２回、および最後に飽和塩化ナトリウム溶液で連続的に洗浄した。有機抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で溶媒を除去して淡黄色のシロップを得た。グラジエント溶媒系（１：１；ヘキサン−酢酸エチル）を用いたフラッシュカラムシリカクロマトグラフィーを用いて望ましい産物を精製し、部分的に精製した望ましい化合物を、非晶質の白色固体として得て（約０．９３ｇ、０．１７ｍｍｏｌ、８２％）、それをさらなる精製なしに、次の工程で使用した。
【００６４】
１．２．６ ４−メチルウンベリフェリル２−デオキシ−２−フルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（５ａ−ｃ）の合成の一般的な手順
乾燥メタノール中の各グリコシドの溶液に、スパチュラの先ほどの無水ナトリウムメトキシドを加えた。できた塩基性溶液を、ＴＬＣ分析によって反応が終わったことを判断するまで、窒素下で攪拌した。Ｄｏｗｅｘ−５０Ｈ＋樹脂を、溶液のｐＨが中性になるまで、攪拌した反応混合物に加えた。懸濁液をろ過し、そしてフィルターケーキをメタノールで徹底的にすすぎ、その後あわせたろ過物からの溶媒を減圧下で除去した。望ましい脱保護グリコシドを、以下の溶媒システムを用いたフラッシュカラムシリカクロマトグラフィーによって単離した：Ｎ−トリ−およびＮ−ジフルオロアセチル誘導体（５ｂおよび５ｃ）に関しては酢酸エチル−メタノール−水（１２：１：１）、およびＮ−モノフルオロアセチル誘導体（５ａ）に関しては酢酸エチル−メタノール（１：１）。産物をエタノールおよびジエチルエーテルから再結晶化して望ましい産物を得、２つの工程の全体的な収率は、Ｎ−トリフルオロアセチル誘導体（５ｃ）に関して６６％、Ｎ−ジフルオロアセチル誘導体（５ｂ）に関して３７％、およびＮ−フルオロアセチル誘導体（５ａ）に関して４５％であった。
【００６５】
４−メチルウンベリフェリル２−デオキシ−２−フルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ）（５ａ）
【００６６】
【化１３】
４−メチルウンベリフェリル２−デオキシ−２−ジフルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２）（５ｂ）
【００６７】
【化１４】
４−メチルウンベリフェリル２−デオキシ−２−トリフルオロアセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ３）（５ｃ）
【００６８】
【化１５】
１．３ Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの動態分析
１．３．１ 動態分析のための実験手順
全てのアッセイを、停止アッセイ（ｓｔｏｐｐｅｄ ａｓｓａｙ）手順を用いて、３７℃で３０分間、３組行い、ここで酵素反応（２５μＬ）を、６倍過剰（１５０μＬ）の反応停止緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ１０．７５）を加えることによって反応停止させる。酵素（３μＬ）をシリンジで加えることによってアッセイを開始し、そして全ての場合においてできた反応停止溶液の最終的なｐＨは、１０より高かった。β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの時間依存的アッセイは、どちらの酵素も、この期間中そのそれぞれの緩衝液；５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５および５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ６．５の中で安定であったことを明らかにした。３０分の終了における反応の進行を、Ｖａｒｉａｎ ＣＡＲＹ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ９６穴プレートシステムを用いた蛍光測定、および同一の緩衝液条件下での４−メチルウンベリフェロンの標準曲線との比較によって決定した、遊離した４−メチルウンベリフェロンの程度を測定することによって決定した。５ｍｍのスリット開口で、それぞれ３６８および４５０ｎＭの励起および発光波長を使用した。ヒト胎盤β−ヘキソサミニダーゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（ロット０４３Ｋ３７８３）。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのクローニングおよび発現は、文献に記載されている［８５］。両方の酵素を、ＰＢＳ緩衝液に対して透析し、そしてその濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて決定した。フッ素化した基質と共にアッセイで使用したβ−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの濃度（μｇ／μｌ）は以下の通りであった：４−メチルウンベリフェリル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ）（５）：０．０００７７、０．０１２６；ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ（５ａ）：０．００３１、０．０１８９；ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２（５ｂ）：０．０１５４、０．０７５６、およびＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ３（５ｃ）：０．０１５４、０．０１５２３。それに加えて、β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを、それぞれ０．０１５４および０．０３７８の濃度（μｇ／μＬ）で使用して、基質５を０．６４ｍＭの濃度で使用してインヒビターを試験した。８ｅのＫＩ値が高いために、インヒビターをそのような高濃度にできないインヒビター８ｅとβ−ヘキソサミニダーゼのアッセイを除いて、全てのインヒビターを、ＫＩの５倍から５分の１までの範囲の８つの濃度で試験した。ＫＩ値を、ディクソンプロットにおけるデータの線形回帰によって決定した。必要な場合には、アッセイを３組行い、そしてエラーバーをデータのプロットに含める。
【００６９】
１．３．２ 基質アナログを用いた動態分析の結果
リソソームヒトβ−ヘキソサミニダーゼは、隣接基補助を含むメカニズムによって進行することが公知であるので、これらの化合物を、最初にこの酵素と試験した（図２Ａ）。全ての基質に関してＭｉｃｈａｅｌｉａｎ飽和動態は観察されなかったが（表１）、酵素触媒反応を支配する二次速度定数に比例するＶｍａｘ［Ｅ］０／ＫＭを、ミカエリス−メンテンプロットの最初の傾きから決定し得る（図２Ａ挿入図）。Ｎ−アシル置換基のＴａｆｔ電子パラメーター（σ＊）に対するｌｏｇ Ｖｍａｘ［Ｅ］０／ＫＭのプロットは、増加するフッ素置換に対して負の線形の相関を示す（図２Ｃ）。予期されるように、カルボニル酸素の塩基性の減少は、触媒作用に有害な影響を有する。Ｔａｆｔ様線形自由エネルギー分析の急な負の傾き（反応定数によって与えられる、ρ＝−１．０±０．１）は、カルボニル酸素が、アノマー中心を攻撃する求核試薬として作用することを示唆する。
【００７０】
【表１】
表１：一連の４−メチルウンベリフェロン２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドのβ−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ触媒加水分解に関するミカエリス−メンテンパラメーター。
ａ各Ｎ−アシル置換基に関して使用したＴａｆｔ電子パラメーター（σ＊）は、ＨａｎｓｃｈおよびＬｅｏから得た［８６］。
ｂミカエリス−メンテンデータの非線形回帰によって値を推定した。限られた基質の溶解性のために、アッセイした基質濃度はＫＭに匹敵するが超えないことに注意。
ｃ基質溶解性の制限のために飽和動態が観察されなかったので、これらの値は決定できなかった。
ｄミカエリス−メンテンプロットの２次領域の線形回帰によって値を決定した。
【００７１】
このデータは、酵素触媒糖質加水分解に関して一般的に提唱された、アノマー中心の求電子性転移および結果としてのオキソカルベニウムイオン様転移状態を含むメカニズムと一致する［８０、８２］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関しては、ミカエリス飽和動態が４つの基質すべてに関して観察され、従って両方の動態パラメーターを決定した（表１、図２Ｂ）。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関して、Ｖｍａｘ［Ｅ］０／ＫＭの値もフッ素置換の程度に依存しているが、傾きはよりゆるやかである（ρ＝−０．４２±０．０８、図２Ｃ）。これらの結果に基づいて、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼと共通で、隣接基補助を含む触媒メカニズムを使用するようである。
【００７２】
Ｔａｆｔ様分析の相関関係の傾きである反応定数（ρ）は、異なる基質に対する反応の感受性の指標である。この定数は、以下の式によって、電気的要素（ρ＊、置換基の電気的パラメーター、σ＊に対する反応の感受性によって支配される）および空間的要素（δ、置換基の空間的Ｔａｆｔパラメーター、Ｅｓに対する反応の感受性によって支配される）の両方の関数であると考え得る。
【００７３】
ρ＝ρ＊＋δ（式１）。
【００７４】
従って、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関して測定された傾きの間の差異は、反応座標に沿った転移状態の位置を反映し得るか、またはリソソームβ−ヘキソサミニダーゼはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅよりも空間的に制約のある活性部位構造を有することを示し得る。実際、よくある誤解は、フッ素（１４７ｐｍのファンデルワールス半径および１３８ｐｍのＣ−Ｆ結合距離）は、多くの場合水素（１２０ｐｍのファンデルワールス半径および１０９ｐｍのＣ−Ｈ結合距離）と比較して、大きさにわずかな違いしかないと考えられることである。従って、基質およびヒトβ−ヘキソサミニダーゼの活性部位の間の不利な空間的相互作用が、電子を超えて、様々なレベルのフッ素置換の間を区別することにさらなる役割を果たし得ることが可能である。実際、ヒトヘキソサミニダーゼＢの最近の結晶構造は、３つのトリプトファン残基の間にアセトアミド基を堅固に抱える、注意深く構成されたポケットを明らかにした［７８、８７］。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関しては、３次元構造は入手可能でない。しかし、全ての基質アナログに関して測定された相対的な定数ＫＭ値は、空間的影響は主要な誘因ではなく、そしてＮ−アシル−フッ素置換基の電子的影響が優勢であることを示唆する。アセトアミド基に２つまたは３つのフッ素置換基を有する２つのパラ−ニトロフェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を用いた、未知のファミリーの単離された酵素についての初期の研究は、−１．４１±０．１のρ＊を得た［８８］。この値は、この研究においてリソソームβ−ヘキソサミニダーゼに関して見出されたもの（ρ＊＝−１．０±０．１）よりさらに大きく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからＫｏｓｍａｎおよびＪｏｎｅｓが研究した酵素は、ファミリー８４ではなく、ファミリー２０のグリコシドヒドロラーゼのメンバーである可能性が高い。
【００７５】
１．３．３ ＮＡＧ−チアゾリンをインヒビターとして使用した動態分析の結果
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅが、隣接基補助を含む触媒メカニズムを使用するかどうかのさらなる試験として、インヒビターＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）をこの酵素と試験した。二環性オキサゾリン中間体の模倣物として設計されたＮＡＧ−チアゾリンは、ファミリー２０ヘキソサミニダーゼのインヒビターとして機能することが以前に示された［３０、４８］。ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質として使用して、ＮＡＧ−チアゾリンは、ファミリー８４ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの強力なインヒビターであることが見出され、そして競合的阻害の明らかなパターンが観察された（図３）。非線形回帰が、ｐＨ７．４における１８０ｎＭのＫＩ値を明らかにし、そしてＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ（５）を用いた分析が、ｐＨ６．５における７０ｎＭのＫＩ値を明らかにした。従って、ＮＡＧ−チアゾリンは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの強力なインヒビターであり、ｐＨ６．５において親の糖類であるＧｌｃＮＡｃ（ＫＩ＝１．５ｍＭ）よりも約２１０００倍強く結合する。この強力な阻害は、ＮＡＧ−チアゾリンの推定されるオキサゾリン中間体または構造的に関連する転移状態との類似に起因し得る。実際、観察された阻害データは、ファミリー２０ヒトリソソームβ−ヘキソサミニダーゼ（ＫＩ＝７０ｎＭ、ＫＩ値が１．２ｍＭであるＧｌｃＮＡｃより１７０００倍強い）に関して発明者が測定したものと同様であり、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、ファミリー２０β−ヘキソサミニダーゼと同様、隣接基補助を含む触媒メカニズムを使用することを示すＴａｆｔ様分析を強力に支持する。オリゴ糖鎖を切断するよう作用するエンドグリコシダーゼである、ファミリー１８［８９］および５６［９０］のグリコシドヒドロラーゼも、隣接基補助を含むメカニズムを使用することが示された［９１］。従って、ファミリー１８、２０、５６および８４は全て、基質のアセトアミド基からの隣接基補助を含む触媒メカニズムを使用する保持性グリコシダーゼから成る。これは、そのそれぞれの基質の２位にアセトアミド基を有する基質に作用するファミリー３および２２の保持性β−グリコシダーゼ［８１、８２］、およびファミリー２３逆転エンドグリコシダーゼと非常に対照的である。
【００７６】
【表２】
表２：Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼ両方に関するインヒビターの阻害定数および選択性。全てのＫＩ値を、ディクソンプロットの線形回帰を用いて決定した。
【００７７】
（実施例２：選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの最初の実施態様の設計および合成）
２．１ 選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの最初の実施態様の設計
ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ、および拡張して（ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｔｉｏｎ）ファミリー８４のグリコシドヒドロラーゼの他のメンバーのメカニズムが確立され、ヒトリソソームβ−ヘキソサミニダーゼよりもこの酵素に選択的なインヒビターの設計にこの情報を使用することへ注意が向けられた。β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅはどちらも隣接基補助を含むメカニズムを使用するので、必要な選択性を生ずるよう作り上げ得る足場として、ＮＡＧ−チアゾリンを選択した。３つの観察が、そのインヒビターの設計における開始点を提供した。最初のものは、リソソーム酵素のＴａｆｔ様分析の傾きが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関して測定されたものよりもかなり急で、それによってＮ−アシル基の大きさが、基質認識における決定要因であり得ることを示唆することである（前述を参照のこと）。２番目の、そして関連する考察は、ヒトリソソームβ−ヘキソサミニダーゼＢの構造は、アセトアミド置換基のメチル基が釣り合う、ぴったり合うポケットを明らかにする［７８］。３番目は、大きなＮ−アシル置換基を有するＳＴＺが、β−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅにいくらかの選択性を示すことである［４６］。
【００７８】
２．２ 選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの最初の実施態様の合成
一連の７つのインヒビターを調製し、ここでチアゾリン環を、これらの化合物がリソソームヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅについての明確な阻害を可能にすることを期待して、増加する長さの脂肪族の鎖と共に合成した。このインヒビターのパネルの合成を、スキーム２で概略を述べる。この容易な合成経路は、市販で入手可能な開始材料から３つの工程で、または安価な開始材料２−アミノ−２−デオキシ−グルコピラノースから６つの工程で、多量のインヒビターの産生を可能にする。
【００７９】
【化１６】
２．２．１ 化合物の合成の一般的な手順
一般的な手順は、上記で述べた基質アナログの合成と同じである。
【００８０】
２．２．２ １，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ａ−ｇ）の合成の一般的な手順
１容積の乾燥ジクロロメタン中の２−アミノ−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノース（６）［９２］の塩酸塩の溶液に、２当量の乾燥トリエチルアミンを加え、このとき開始材料を溶解した。反応混合物を０℃に冷却し、そして１．２当量の適当な塩化アシルをシリンジで加えた。できた混合物を、室温で約２時間攪拌した。ＴＬＣ分析によって反応混合物が完了したことを判断した時に、５容積の酢酸エチルを加えた。できた有機相を、水、１ＭのＮａＯＨ、および飽和塩化ナトリウムで連続的に洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして濃縮して白色の結晶性固体を得た。その物質を、酢酸エチルおよびヘキサンの混合物を用いて再結晶化し、望ましいＮ−アシル化された物質を、４６から７４％の範囲の収率で得た。
【００８１】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−プロピル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｂ）
【００８２】
【化１７】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−ブチル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｃ）
【００８３】
【化１８】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−ペンチル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｄ）
【００８４】
【化１９】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｅ）
【００８５】
【化２０】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−イソブチル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｆ）
【００８６】
【化２１】
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−イソペンチル−β−Ｄ−グルコピラノース（７ｇ）
【００８７】
【化２２】
２．２．３ ３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−ＮＡＧ−チアゾリンアナログ）（８ａ−ｇ）の合成の一般的な手順
無水トルエン中の適当な１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−Ｎ−アシル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（７ａ−ｇ）の溶液に、ローソン試薬（０．６当量）を加え、そして反応混合物を２時間還流し、その後ＴＬＣ分析によって反応が完了したことを判断した。溶液を室温に冷却し、そして溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンに溶解し、そしてヘキサンおよび酢酸エチルの４：１から１：２まで範囲の適当な比の溶媒システムを用いて、フラッシュカラムシリカクロマトグラフィーによって望ましい物質を単離した。６２から８３％の範囲の収率で産物を単離した。３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−メチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ａ）は、上記で記載されたような同様の反応条件を用いて以前に調製された［３０］。全てのスペクトルの特徴は、文献の値と一致した。
【００８８】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−エチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｂ）
【００８９】
【化２３】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−プロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｃ）
【００９０】
【化２４】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−ブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｄ）
【００９１】
【化２５】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−ペンチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｅ）
【００９２】
【化２６】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−イソプロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｆ）
【００９３】
【化２７】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−イソブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（８ｇ）
【００９４】
【化２８】
２．２．４ １，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（ＮＡＧ−チアゾリンアナログ）（９ａ−ｇ）の合成の一般的な手順
乾燥メタノール中の適当な保護チアゾリン（８ａ−ｇ）の溶液に、スパチュラの先ほどの無水ナトリウムメトキシドを加えた。その塩基性溶液を、ＴＬＣ分析によって反応が完了したと判断するまで（典型的には２時間）攪拌した。メタノール中の氷酢酸の溶液（１：２０）を、溶液のｐＨが中性になるまで、反応混合物中に１滴ずつ加えた。次いで溶媒を減圧下で除去し、そして酢酸エチルおよびメタノールの２：１から６：１までの範囲の適当な比の溶媒システムを用いて、フラッシュカラムシリカクロマトグラフィーによって望ましい物質（９ａ−ｇ）を単離した。産物を８６％から９９％までの範囲の収率で単離した。１，２−ジデオキシ−２’−メチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ａ）は、上記で記載されたような同様の反応条件を用いて以前に調製された［３０］。全てのスペクトルの特徴は、これらのアッセイで使用したサンプルの元素分析と同様、文献の値と一致した。Ｃ８Ｈ１３Ｏ４ＮＳの計算値；Ｃ，４３．８２；Ｈ，５．９８；Ｎ，６．３９；実測値 Ｃ，４３．４５；Ｈ，６．２３；Ｎ，６．１８。
【００９５】
１，２−ジデオキシ−２’−エチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｂ）
【００９６】
【化２９】
１，２−ジデオキシ−２’−プロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｃ）
【００９７】
【化３０】
１，２−ジデオキシ−２’−ブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｄ）
【００９８】
【化３１】
１，２−ジデオキシ−２’−ペンチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｅ）
【００９９】
【化３２】
１，２−ジデオキシ−２’−イソプロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｆ）
【０１００】
【化３３】
１，２−ジデオキシ−２’−イソブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリン（９ｇ）
【０１０１】
【化３４】
２．３ インヒビター９ａ−ｇを用いた動態分析
２．３．１ 動態分析の実験手順
全てのアッセイを、停止アッセイ手順を用いて、３７℃で３０分間、３組行い、ここで酵素反応（２５μＬ）を、６倍過剰（１５０μＬ）の反応停止緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ１０．７５）を加えることによって反応停止させる。酵素（３μＬ）をシリンジで加えることによってアッセイを開始し、そして全ての場合においてできた反応停止溶液の最終的なｐＨは、１０より高かった。β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの時間依存的アッセイは、どちらの酵素も、この期間中そのそれぞれの緩衝液；５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５および５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ６．５の中で安定であったことを明らかにした。３０分の最後における反応の進行を、Ｖａｒｉａｎ ＣＡＲＹ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ９６穴プレートシステムを用いた蛍光測定および同一の緩衝液条件下での４−メチルウンベリフェロンの標準曲線との比較によって決定した、遊離した４−メチルウンベリフェロンの程度を測定することによって決定した。５ｍｍのスリット開口で、それぞれ３６８および４５０ｎＭの励起および発光波長を使用した。可能性のあるＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの時間依存的不活性化を、１０ｍＭのＳＴＺを、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ６．５の存在下で０．０１６ｍｇ／ｍＬのＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅと、または５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５の存在下で０．０３６ｍｇ／ｍＬのβ−ヘキソサミニダーゼとインキュベートすることによってアッセイした。いくつかの時間間隔で、不活性化混合物中に含まれる残留酵素活性をアッセイした。反応を、反応混合物のアリコートを５．７ｍＭのＭＵ−ＧｌｃＮＡｃおよび各酵素に適当な緩衝液を含むアッセイ混合物に加えることによって始めた以外は、上記で各酵素に関して記載されたようにアッセイを行った。ＳＴＺの安定性を、まずＮＭＲによって重水素化水中でのその分解を追跡することによって試験した。室温での水性溶液におけるＳＴＺの半減期は、室温でＮＭＲによってその分解を追跡することによって決定したように、６時間より十分長かった。ヒト胎盤β−ヘキソサミニダーゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（ロット０４３Ｋ３７８３）。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのクローニングおよび発現は、文献に記載されている［８５］。両方の酵素を、ＰＢＳ緩衝液に対して透析し、そしてその濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて決定した。フッ素化した基質と共にアッセイで使用したβ−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの濃度（μｇ／μｌ）は以下の通りであった：４−メチルウンベリフェリル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｕＧｌｃＮＡｃ）（５）：０．０００７７、０．０１２６；ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ（５ａ）：０．００３１、０．０１８９；ＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２（５ｂ）：０．０１５４、０．０７５６、およびＭｕＧｌｃＮＡｃ−Ｆ３（５ｃ）：０．０１５４、０．０１５２３。それに加えて、β−ヘキソサミニダーゼおよびＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを、それぞれ０．０１５４および０．０３７８の濃度（μｇ／μＬ）で使用して、基質５を０．６４ｍＭの濃度で使用してインヒビターを試験した。インヒビター８ｅのＫＩ値が高いために、インヒビターをそのような高濃度にできないインヒビター８ｅとβ−ヘキソサミニダーゼとのアッセイを除いて、全てのインヒビターを、ＫＩの５倍から５分の１までの範囲の８つの濃度で試験した。ＫＩ値を、ディクソンプロットにおけるデータの線形回帰によって決定した。必要な場合には、アッセイを３組行い、そしてエラーバーをデータのプロットに含める。
【０１０２】
２．３．２ インヒビター９ａ−ｇを用いた動態分析の結果
ヒトβ−ヘキソサミニダーゼの阻害の分析は、鎖の長さを増加させることは、これらのインヒビターの効力の顕著な減少を引き起こすことを明らかにした（図４および表２）。１つのメチレンユニットの含有さえも（化合物９ｂ）、親化合物ＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）と比較して、β−ヘキソサミニダーゼのＫＩ値における４６０倍の増加を引き起こした。鎖の長さのさらなる増加は、ＫＩ値のさらに大きな増加を引き起こす。しかし、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関しては、状況は著しく異なる（図４および表２）。鎖の長さの増加は、非常によりよく許容され、そして２つのメチレンユニットの含有は、ＫＩ値（ＫＩ＝２３０ｎＭ）が親化合物（９ａ）ＮＡＧ−チアゾリン（ＫＩ＝７０ｎＭ）で測定されたものより３倍しか高くない化合物（９ｃ）を生じる。化合物９ｆおよび９ｇはどちらもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのよいインヒビターであるので、脂肪鎖の分枝も、結合を損なわない。データの分析から、化合物９ｂ、９ｃ、および９ｆはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの強力なインヒビターであり、そしてリソソームヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに顕著な選択性を示すことを見出し得る。実際、β−ヘキソサミニダーゼに対するＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅへの選択性の比は、化合物９ｄに関して３１００倍、化合物９ｃに関して１５００倍、および化合物９ｆに関して７００倍である（図２および表２）。
【０１０３】
２．３．３ 既存のインヒビターを用いた動態分析の結果
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの既存のインヒビターも、その阻害特性および選択性に関して試験した。ＳＴＺのＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（ＫＩ＝１．５ｍＭ）およびβ−ヘキソサミニダーゼ（ＫＩ＝４７ｍＭ）両方とのＫＩ値を決定し（表２）、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに関して測定した値は、１から２．５ｍＭの範囲であった以前のＩＣ５０の決定と一致することが見出された［４２、４６］。ＳＴＺのβ−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに対する選択性は、この化合物のＮ−アシル基の大きさを考慮すると驚くほど中程度である（３１倍）。おそらく、チアゾリン化合物は、転移状態または密接に結合した中間体を模倣し得るという事実のために、ＳＴＺよりも高い選択性を示す。可能性のあるＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼのＳＴＺ誘導不可逆的不活性化も調査した。不可逆的インヒビターは、失活剤がタンパク質を修飾するので、酵素活性の時間依存的な喪失を引き起こす。まず水性溶液中でのＳＴＺの安定性および市販で入手可能な物質の純度をチェックするために、重水素化水中に新しく溶解したＳＴＺの時間依存的分解を、ＮＭＲによってモニターした。ＳＴＺは、あきらかに６時間より長い半減期で、時間とともに分解した（図７を参照のこと）。発明者の手において、新しく溶解したＳＴＺは、６時間を超えてはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅまたはβ−ヘキソサミニダーゼの時間依存的な失活剤として作用しなかった（図８を参照のこと）。ＰＵＧＮＡｃの選択性も調査した。ＰＵＧＮＡｃのＫＩ値をＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅで測定し（ＫＩ＝４６ｎＭ）、そして以前に決定された値（ＫＩ＝５０ｎＭ）とほぼ一致することが見出された［１３］。しかし、この化合物は、β−ヘキソサミニダーゼ（ＫＩ＝３６ｎＭ）と比較して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに選択性を示さない。
【０１０４】
これらのデータはまた、上述の、フッ素置換基質のＮ−アシル基の立体容積は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅで測定されたＴａｆｔ様分析の傾き（ρ＝−０．４２）に大きくは寄与しないという見方を支持する。しかし、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼで測定された傾き（ρ＝−１．０）は、式１による電気的効果および立体的効果の両方を複合したもののようである。フッ素置換基の電気的効果に対する反応の感受性（ρ＊）は、従って両方の酵素に関して同じであり得るが、基質の立体的効果に対するリソソームβ−ヘキソサミニダーゼ触媒反応の有意な感受性（δ）は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅで測定されたものよりも、β−ヘキソサミニダーゼに関して明らかに急な傾きをもたらす。合わせると、Ｔａｆｔ様線形自由エネルギー分析および選択的阻害のデータは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの活性部位は、リソソームβ−ヘキソサミニダーゼよりも、基質の２−アセトアミド基周囲の領域にかなり大きなスペースを有することを示唆する。
【０１０５】
（実施例３：選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの２番目の実施態様の設計および合成）
３．１ ２番目のクラスの選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの設計
上記の観察に基づいて、ＰＵＧＮＡｃのぶら下がったＮ−アシル鎖に修飾をして、異なるインヒビターの足場に基づいた、強力および選択的なＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのインヒビターの２番目の実施態様を得た。そのようなインヒビターは、異なる薬物動態の性質を有し、そして細胞および有機体レベルにおけるＯ−ＧｌｃＮＡｃ翻訳後修飾の役割を分析するために貴重なツールであり得る。
【０１０６】
３．２ 選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの２番目の実施態様の合成
足場としてＰＵＧＮＡｃを用いた一連の６つのインヒビターの合成を、スキーム３において概略を述べる。
【０１０７】
【化３５】
容易に利用可能な塩酸塩１０［９３］から開始して、Ｂｏｃ基を導入してアミン部分を保護し、四酢酸塩１１［９４］を得た（スキーム３）。四酢酸塩１１を利用して、（ＮＨ４）２ＣＯ３を用いた選択的脱−Ｏ−アセチル化は、非常に良い収率でヘミアセタール１２を産生した。このヘミアセタール１２をＮＨ２ＯＨ．ＨＣｌで処理して、未精製のＥおよびＺオキシム１３を良い収率で得た。
【０１０８】
次の反応である酸化的閉環反応は、ＭｏｈａｎおよびＶａｓｅｌｌａによって、かなり神経質（ｔｅｍｐｅｒａｍｅｎｔａｌ）であることが報告された（スキーム４）。
【０１０９】
【化３６】
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）およびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を用いてオキシム１４を酸化する場合、ＮＣＳを加える間の反応混合物の温度の注意深いコントロールが、望ましくない１，４−ラクトンオキシム１５の形成を避けるために重要である［９５］。これらの観察と一致して、いくつかの１４を用いた試行反応は、望ましくない１，４−ラクトンオキシム１５よりも１，５−ラクトンオキシム１６をうまく産生するために、温度が実際重要であることを示す。実際、わずかに上昇した温度（−２０℃）においては、１，４−ラクトンオキシム１５のみを得る。
【０１１０】
スキーム３に戻って参照して、文献の条件下［９５］でオキシム１３をＤＢＵ／ＮＣＳで処理して、望ましい１，５−ラクトン１７および望ましくない１，４−ラクトンオキシム１８を４：１の比で得た。しかし、ＮＣＳを既に溶液中に１３と共に有し、そして次いでＤＢＵを混合物に加えるだけで、いくらか低い収率ではあったが、１７のみを得た。ここで直面する１つの複雑な状況は、これらの反応の副産物であるスクシンイミドは、１７から分離するのが困難であることである。さらに、１７のスペクトル分析は、１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて得られるシグナルの広幅化のために複雑である。
【０１１１】
それにもかかわらず、純粋でないヒドロキシモラクトン（ｈｙｄｒｏｘｉｍｏｌａｃｔｏｎｅ）１７をフェニルイソシアネートで処理すると、フラッシュクロマトグラフィーによる精製後、よい収率で純粋なカルバメート１９を得る。実際、Ｂｏｃ保護基は、ジクロロメタン中で無水トリフルオロ酢酸を用いてスムーズに除去される。できた未精製のアミン塩２０を適当な塩化アシルで処理すると、全体的によい収率でアミド２１ａ−ｇを得る。２１ａおよび２１ｂの詳細な分析は、化合物のこの全体的なＮ−アシル化系列の正体を支持する。続くメタノール中における飽和アンモニアによる２１ａの脱−Ｏ−アセチル化は、よい収率でＰＵＧＮＡｃを生ずる。同様の様式で２２ａを２１ｂから得た。これらの変換の容易さを強調するために、共通の中間体、２０をある範囲の塩化アシルで処理して、２１ｃ−ｇを未精製産物として得ることができる。これらの未精製中間体をすぐ脱−Ｏ−アセチル化して、よい収率でトリオール２２ｂ−ｆを容易に得る。
【０１１２】
３．２．１ 化合物の合成の一般的な手順
全ての溶媒を、使用の前に乾燥した。合成反応を、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４アルミニウム裏打ちシートを用いて、ＴＬＣによってモニターした。エタノール溶液中１０％の濃硫酸で焦がし、そして加熱することによって化合物を検出した。陽圧下でのフラッシュクロマトグラフィーを、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（２３０−４００メッシュ）で、指定された溶出剤を用いて行った。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ４００で４００ＭＨｚにおいて（１３Ｃに関しては１００ＭＨｚ）、またはＶａｒｉａｎ ＡＳ５００ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａ 分光計で５００ＭＨｚにおいて（１３Ｃに関しては１２５ＭＨｚ）記録した（ケミカルシフトは適当な場合にはＣＤＣｌ３またはＣＤ３ＯＤと相対的に引用した）。酵素アッセイにおいて使用した全ての合成化合物の元素分析を、Ｓｉｍｏｎ Ｆｒａｓｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙまたはｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて行った。
【０１１３】
３．２．２ （Ｅ）−および（Ｚ）−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボンアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコースオキシム（１３）の合成
塩酸ヒドロキシルアミン（３．２ｇ、４６ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中のヘミアセタール１２［９３］（１２ｇ、３１ｍｍｏｌ）およびピリジン（６．３ｍＬ、７７ｍｍｏｌ）に加え、そしてできた溶液を還流しながら攪拌した（２ｈ）。その溶液を濃縮し、そしてトルエン（２×２０ｍＬ）と同時蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃに取り、そして水（２×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過および濃縮して推定されるオキシム１３（９．５ｇ）を得た。残渣をさらなる精製無しに使用した。
【０１１４】
３．２．３ ３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボンアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコノヒドロキシモ−１，５−ラクトン（１７）の合成
（ａ）１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（０．９８ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）中の未精製のオキシム１３（２．５ｇ、５．９ｍｍｏｌ）に−４５℃で加え、そして混合物を攪拌した（５分）。次いでＮ−クロロスクシンイミド（０．８７ｇ、６．５ｍｍｏｌ）を、温度が−４０℃を超えないように、溶液に加え、そしてできた混合物をこの温度で３０分間攪拌し、そして次いで２時間以上室温まで温めた。その混合物を水で反応停止し、そしてＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、そして水（２×５０ｍＬ）、ブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、ろ過および濃縮した。できた残渣のフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２：３）で、表題化合物１７を、無色の油状物（１．７ｇ、６８％）として得た。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、目的の化合物を示すようであったが、１，４−ラクトンオキシム１８およびスクシンイミドが混入していた。
【０１１５】
（ｂ）１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（３．０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、−４５℃においてＣＨ２Ｃｌ２（１１０ｍＬ）中のオキシム１３（７．７ｇ、１８ｍｍｏｌ）およびＮ−クロロスクシミニド（２．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）に、温度が−４０℃を超えないように加え、そしてできた混合物をこの温度で３０分間攪拌し、そして次いで２時間以上室温まで暖めた。混合物を続いて（ａ）におけるように処理し、表題化合物１７（４ｇ、５２％+）を得た。
【０１１６】
【化３７】
３．２．４ Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボンアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（１９）の合成
フェニルイソシアネート（０．５ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のラクトン１７（１．３ｇ、３．１ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１．３ｍＬ、９．３ｍｍｏｌ）に加え、そして溶液を攪拌した（室温、３ｈ）。濃縮に続いて、残渣のフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：４）によって、カルバメート１９を無色の油状物（１．２ｇ、７１％）として得た。
【０１１７】
【化３８】
３．２．５ Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アシルアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２１ａ−ｇ）の一般的な合成手順
トリフルオロ酢酸（１３ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のカルバメート１９（１ｍｍｏｌ）に０℃で加え、そして溶液を攪拌した（２ｈ）。次いでピリジン（２００ｍｍｏｌ）を溶液にゆっくりと加え、そしてできた混合物を放置した（０℃、１０分）。次いで適当な塩化アシル（３ｍｍｏｌ）を０℃で加え、そして溶液を４℃で一晩置いた。混合物の濃縮によって、黄色がかった残渣を生じ、それをＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解し、そして水（２×２０ｍＬ）、ブライン（１×２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過および濃縮した。推定される中間体トリ−Ｏ−アセテート２１ｃ−ｇに関して、これらをさらなる精製無しに維持した。２１ａおよび２１ｂと推定される残渣のフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１）は、望ましいアシル誘導体２１ａおよび２１ｂを、それぞれ４８％および４２％の収率で生じた。
【０１１８】
Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２１ａ）は、文献で見出されるものと一致する１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを生じた。［９６］（４８％） Ｒｆ０．２（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン７：３）。
【０１１９】
Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−プロパミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２１ｂ）
【０１２０】
【化３９】
３．２．６ Ｏ−（２−アシルアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（ＰＵＧＮＡｃ、２２ａ−ｆ）を合成するための一般的手順
ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中のアンモニア飽和溶液を、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のカルバメート（０．３ｍｍｏｌ）に加え、そして溶液を放置した（室温、２ｈ）。濃縮に続く、残渣のフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ３：９７）によって、望ましいトリオールＰＵＧＮＡｃ、２２ａ−ｆを、２１％から３２％の範囲の収率で得た。
【０１２１】
Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（ＰＵＧＮＡｃ）−（３２％）は、文献で見出されるものと一致する１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを生じた。［９６］
Ｒｆ ０．１５（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ １：１９）。
【０１２２】
Ｏ−（２−デオキシ−２−プロパミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ａ）−
【０１２３】
【化４０】
Ｏ−（２−デオキシ−２−ブタミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｂ）−
【０１２４】
【化４１】
Ｏ−（２−デオキシ−２−吉草酸アミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｃ）−
【０１２５】
【化４２】
Ｏ−（２−デオキシ−２−ヘキサミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｄ）−
【０１２６】
【化４３】
Ｏ−（２−デオキシ−２−イソブタミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｅ）−
【０１２７】
【化４４】
Ｏ−（２−デオキシ−２−イソ吉草酸アミド−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノＮ−フェニルカルバメート（２２ｆ）−
【０１２８】
【化４５】
３．３ インヒビター２２ａ−ｆを用いた動態分析
３．３．１ 動態分析の実験手順
全てのアッセイを、停止アッセイ手順を用いて、３７℃で３０分間、３組行い、ここで酵素反応（５０μＬ）を、４倍過剰（２００μＬ）の反応停止緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ１０．７５）を加えることによって反応停止した。酵素（５μＬ）をピペットで注意深く加えることによってアッセイを開始し、そして全ての場合においてできた反応停止溶液の最終的なｐＨは、１０より高かった。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの時間依存的アッセイは、酵素は、アッセイの期間中そのそれぞれの緩衝液：５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ６．５、および５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５の中で安定であったことを明らかにした。３０分の最後における反応の進行を、９６穴プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）および９６穴プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４００ｎｍにおけるＵＶ測定によって決定される、遊離した４−ニトロフェノールの程度を測定することによって決定した。ヒト胎盤β−ヘキソサミニダーゼを、Ｓｉｇｍａから購入し（ロット０４３Ｋ３７８３）、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを使用の前に新しく過剰発現および精製した。［８５］Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼを、阻害アッセイにおいて、それぞれ０．０４０６および０．０１２の濃度（μｇ／μＬ）で、基質ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃを０．５ｍＭの濃度で用いて使用した。その高いＫＩ値のために、インヒビターをそのような高濃度にできないインヒビター２２ｄとβ−ヘキソサミニダーゼとのアッセイを除いて、全てのインヒビターをＫＩの３倍から３分の１の範囲の７つの濃度で試験した。ＫＩ値を、ディクソンプロットからのデータの線形回帰によって決定した。
【０１２９】
３．３．２ インヒビター２２ａ−ｆを用いた動態分析の結果
上記で述べたように、ＰＵＧＮＡｃは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ［１３、５０］およびβ−ヘキソサミニダーゼ［２８、５１］両方の強力な競合的インヒビターである。ヒト酵素に関して、それぞれのＫＩ値は４６ｎＭおよび３６ｎＭである［１３、４９］。インヒビター２２ａ−ｆの選択性を評価し、そしてＰＵＧＮＡｃと比較した。ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質として用いて、これらの化合物２２ａ−ｆは、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびヒトβ−ヘキソサミニダーゼ両方のインヒビターであることが見出された（表３）。
【０１３０】
【表３】
（表３．Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼに対するインヒビターの阻害定数および選択性）
ヒトβ−ヘキソサミニダーゼの阻害の分析は、Ｎ−アシル基の鎖の長さの増加は、これらインヒビターの効力の顕著な減少を引き起こすことを明らかにする（表３）。１つのメチレン基のみを含むこと（化合物２２ａ）は、親ＰＵＧＮＡｃと比較して、β−ヘキソサミニダーゼに関してＫＩ値の３３倍の増加を引き起こす。鎖の長さのさらなる増加は、さらに大きなＫＩ値の増加を引き起こす。さらに、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、β−ヘキソサミニダーゼよりもよく鎖の長さの増加を許容する（表３）。
【０１３１】
これら２つのヒト酵素、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼに関して、以前に調製したＮＡＧ−チアゾリン誘導体、９ｂ−ｇ［４９］のＫＩ値との直接比較は、修飾チアゾリンは、対応するＰＵＧＮＡｃに基づく化合物、２２ａ−ｆよりも選択的および強力なインヒビターであることを明らかにする。これらの観察は、インヒビターのアシル基の位置、および潜在的にアノマー炭素の混成状態の重要性を示す。ｓｐ３混成アノマー炭素を有するチアゾリン、ＮＡＧ−チアゾリンおよび９ｂ−ｇは、ｓｐ２混成アノマー炭素を有する対応するＰＵＧＮＡｃ誘導体、ＰＵＧＮＡｃおよび２２ａ−ｆのアシル鎖と比較して、アシル鎖の動きを制限する二環性の足場を含む。同様に、活性部位内の側鎖の正確な配置は、これらの２つのセットの化合物の間で異なっているに相違ない。合わせると、これらの２つの因子が、チアゾリン誘導体と比較した、ＰＵＧＮＡｃ由来の化合物の全体的にいくらか弱い阻害および低い選択性の両方に寄与しているに相違ない。これらの観察と一致して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの弱いインヒビター（ＫＩ＝１．５ｍＭ）であるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）も［４６、４７、４９］、大きな、自由に回転するアシル鎖を有し、そしてβ−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに中程度の選択性を示す［４６、４７、４９］。
【０１３２】
チアゾリンに基づく化合物、ＮＡＧ−チアゾリンおよび９ｂ−ｇ、とＰＵＧＮＡｃ誘導体、ＰＵＧＮＡｃおよび２２ａ−ｆとの間のこれらの違いは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ［４９］およびβ−ヘキソサミニダーゼ［３０、４８、８３、９７］の触媒メカニズムに関与する、推定される二環性様の転移状態を模倣する前者の化合物に起因し得る。対照的に、ＰＵＧＮＡｃアナログおよびＳＴＺのＮ−アシル基の位置は、天然基質Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシドのものに類似し得る。ＰＵＧＮＡｃおよびチアゾリン誘導体のアノマー炭素の異なる混成状態も、これらのＮ−アシル基の正確な位置に寄与し得る。
【０１３３】
上記で調製した化合物は全て、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびヒトβ−ヘキソサミニダーゼ両方のインヒビターであった。しかし、これらの化合物は、これら２つの酵素間の活性部位構造における違いを利用し、それはそれらをＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅに対して選択性にする。チアゾリン誘導体と比較して、ＰＵＧＮＡｃアナログの低い選択性にも関わらず、これらの化合物は、その異なる足場のために異なる薬物動態特性を有し得る。従って、チアゾリンおよびＰＵＧＮＡｃ誘導体はどちらも、細胞および有機体レベルにおけるＯ−ＧｌｃＮＡｃ翻訳後修飾の役割を詳細に分析するための貴重なツールであることが示され得る。実際、他のグリコシダーゼインヒビターの合成が、全く異なる酵素を標的とした、臨床的に有用な化合物を生じた。［９８］同様に、ここで概略を述べた戦略を用いた、他のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼインヒビターの足場の体系的な合成［９９、１００］も、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの選択的インヒビターを生じ得る。
【０１３４】
（実施例４：細胞培養物における選択的インヒビターの評価）
インビトロにおいてこれらの化合物の選択性が示されたので、生きた細胞におけるその化合物の使用を評価した。
【０１３５】
４．１ 実験手順
４．１．１ 細胞培養物および阻害
ＣＯＳ−７細胞を、５−１０％のＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。インヒビターのアリコート（９５％エタノール中５０μＬのストック）を、組織培養プレートに分け、そしてエタノールを蒸発させた。細胞を３７℃で４０時間培養し、その時それらは約８０％コンフルエンスに達した。細胞において５０μＭの化合物９ａ、９ｃ、または９ｇによる処理に反応した、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の時間依存的な蓄積を、以下のように研究した。ＣＯＳ−７細胞を、５％のＦＢＳ中で２５％コンフルエンスまで培養し、そして培地に溶解およびろ過滅菌したインヒビターのアリコート（１００μＬ）を各プレートに加えて、最終的なインヒビターの濃度を５０μＭにした。ＣＯＳ−７細胞（２×１０ｃｍプレート）を、適当な時間に掻爬することによって採取し、そして遠心分離（２００×ｇ、１０分）によってプールした。細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．０（１０ｍＬ）で１回洗浄し、そしてペレットにした（２００×ｇ、１０分）。細胞をこの時点で−８０℃で凍結し得る。インヒビターなしのコントロール培養物を、同じ方式で処理した。
【０１３６】
４．１．２ ウェスタンブロット分析
ＣＯＳ−７細胞を、上記で記載したようにインヒビター９ａ、９ｃ、または９ｇの存在下で、約９０％コンフルエンスまで培養した。コントロール細胞の培養物を、以下と同じ方式で処理したが、培養物はインヒビターを含まなかった。細胞を、上記で記載したように採取した。凍結細胞を４℃で解凍し、そして冷却溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、および１ｍＭのインヒビター９ｆを含む１ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を加えた。４℃で１０分後、溶液をエッペンドルフ５４１５Ｃ微量遠心機で、１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を回収した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥローディング緩衝液を、各サンプルのアリコート（１５μＬ）に加え、そして９６℃に加熱した後、アリコートを１０％または１２％のＴｒｉｓ・ＨＣｌポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動後、サンプルをニトロセルロース膜（０．４５μｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に電気ブロットした。着色マーカー（Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｕｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ−ＢｉｏＲａｄ）の転移を目で検査することによって、転移を確認した。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む、ＰＢＳ中５％のＢＳＡ（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ）（マウス抗Ｏ−ＧｌｃＮＡｃモノクローナルＩｇＭ抗体（ＭＡｂ ＣＴＤ １１０．６−Ｃｏｖａｎｃｅ）でプローブするサンプルのためのブロッキング緩衝液Ａ）、または５％低脂肪乾燥粉乳（抗β−アクチンでプローブするサンプルのためのブロッキング緩衝液Ｂ）、ｐＨ７．４を用いて、室温で１時間または４℃で一晩ブロックした。ブロッキング溶液をデカントで捨て、そしてＭＡｂ ＣＴＤ １１０．６を含むブロッキング緩衝液Ａ（ストックの１：２５００）、またはマウスモノクローナル抗β−アクチンＩｇＧ（クローンＡＣ−４０−Ｓｉｇｍａ）を含むブロッキング緩衝液Ｂの溶液を、適当に加えた（１：１０００希釈）。膜を室温で１時間、または４℃で一晩インキュベートし、その後ブロッキング緩衝液をデカントで捨て、そして０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４（洗浄緩衝液）で膜をすすいだ。次いで膜を洗浄緩衝液で２×５分および３×１５分すすいだ。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの免疫学的検出のために、膜をブロッキング緩衝液Ａ中で、ＲＴで１時間インキュベートし、洗浄後、膜を２次ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ結合体（１：２５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、ＲＴで１時間、または４℃で一晩、ブロッキング溶液中でインキュベートした。β−アクチンレベルの検出のために、膜を２次ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（１：１００００、Ｓｉｇｍａ）と、ＲＴで１時間、または４℃で一晩、ブロッキング溶液Ｂ中でインキュベートした。膜を洗浄し、そして膜に結合したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体の検出を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）およびフィルム（Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘ ＭＲ）を用いて、化学発光検出によって達成した。
【０１３７】
４．２ 細胞研究の結果
５０μＭのインヒビター９ａ、９ｃ、または９ｇとプレートでインキュベートしたＣＯＳ−７細胞は、コントロール細胞と比較して、増殖速度または形態において異常を示さなかった（データは示していない）。インヒビター９ａ、９ｃ、または９ｇの存在下で、またはその非存在下で４０時間培養した細胞内のＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルの検出を、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃに対するモノクローナル抗体（６４）ｍＡｂＣＴＤ１１０．６を用いて実施した。コントロールと比較して、細胞内のＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルにおける顕著な増加が観察され（図５Ａ）、これらの化合物は容易に細胞内部に入り、そこでＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用することを示した。チアゾリンインヒビター（９ｃ）がＣＯＳ−７細胞内でＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ作用を阻害するよう作用する速度も探索した。ウェスタンブロット分析を用いてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルをモニターすることによって、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルにおいて明らかな時間依存的増加が見出された。インヒビター（９ｃ）への曝露の１時間後でさえ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質レベルの増加が観察された。インヒビターは、細胞に迅速に入り、そこでＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅをすぐに阻害して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の時間依存的な蓄積を引き起こすようである（図６）。最初の速い増加の後、インヒビター（９ｃ）で処理した細胞におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルは、細胞内で漸近的に定常状態に近づくようである（図６）。この挙動は、ＰＵＧＮＡｃとインキュベートしたＨＴ２９細胞に関して以前に観察された、同様の時間依存的増加と一致する［５０］。α−β−アクチンに続いて適当な２次ＨＲＰ結合体でプローブしたブロットのウェスタンブロット分析（図５Ｂ）は、全ての場合においてサンプルのローディングが等量であったことを明らかにした。親化合物ＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）は、細胞に入り、そこでリソソームβ−ヘキソサミニダーゼに影響を及ぼすことが以前に示されたことも注意するに値する［１０１］。
【０１３８】
（実施例５：ＩＩ型糖尿病を研究するための動物モデルを開発するための選択的Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅインヒビターの使用）
５．１ 様々な組織型およびグルコースクリアランスに対するＢｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリン（９ｃ）の効果を示す動物研究
５．１．１ 実験手順
８週齢（ｅｉｇｈｔ ｇｉｖｅ−ｗｅｅｋ）の健康なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、対でかごに入れた。動物を、Ｓｉｍｏｎ Ｆｒａｓｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（ＳＦＵ ＡＣＦ）で１週間、新しい環境に順応させた。３：００ｐｍ、４匹のラットに、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した４００μｌのインヒビター９ｃを、５０ｍｇ／ｋｇの投与量で、尾静脈注射で与えた。残りの４匹のラットには、コントロールとして４００μｌのＰＢＳを尾静脈注射した。全ての溶液を、０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してあらかじめ滅菌し、そして２８ゲージ×０．５”針（Ｔｅｒｕｍｏ）を有する０．５ｍＬシリンジで、１０秒間のボーラスとして注射した。食餌をおよそ１１：００ｐｍに中止した。次の朝８：３０ａｍに、ラットに２回目の注射をした。３時間後、ラットをイソフルランで麻酔し、そして１００μＬの血液サンプルを頚静脈から採って、空腹時血中グルコースレベルを測定した。次いで静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）を行った。ＰＢＳ（滅菌済み）に溶解したグルコースの５０％ｗ／ｖ溶液の０．５ｍＬを、３０秒かけて尾静脈に注射して投与した。グルコース注射の１０、２０、３０、４０、６０、および９０分後に、１００μＬの血液サンプルを頚静脈から採った。血液サンプル採取の直後、血液の少量のアリコートを使用して、ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ Ａｄｖａｎｔａｇｅ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて血中グルコース濃度を測定し、そして残りの血液を氷上で２０分間保存し、そして遠心分離して血清を単離した。ＩＶＧＴＴの終了後、ラットをＣＯ２／Ｏ２の１：１混合物で屠殺した。組織サンプル（脳、筋肉、肝臓、脾臓、膵臓、脂肪）をすぐに採取し、そして液体窒素で急速冷凍し、そして−８０℃で保存した。組織をホモジナイズして細胞抽出物を得るために、組織を乳鉢と乳棒で微細な粉末に粉砕する間、それらを冷凍したままにしておいた。次いでその粉末の１００ｍｇを、１ｍＬの冷却溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１％のノニデットＰ−４０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、および１ｍＭのブチル−ＮＡＧ−チアゾリン）中で、Ｊｅｎｋｅ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ組織ホモジナイザーで、２回の１０秒パルスを用いてホモジナイズした。次いで組織を微量遠心機（エッペンドルフ）で１３，０００ｒｐｍで遠心沈殿して、細胞の破片を除去した。次いで可溶性の細胞抽出物を、細胞研究に関して上記で記載したように、ウェスタンブロット分析を用いて、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質レベルに関して分析した。
【０１３９】
５．１．２ 様々な組織型に対するＢｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリン（９ｃ）の効果
尾静脈に様々な投与量のインヒビター９ｃを注射したラットは、インヒビター９ｃの静脈内投与が、様々な組織型においてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに影響を与えることを示した（図９）。脳組織のサンプル（図９Ａ）は、ラットに５０、１２０、および３００ｍｇ／ｋｇの投与量のインヒビター９ｃを注射した場合、コントロールと比較して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに顕著な増加があったことを示した。これは、インヒビター９ｃは容易に脳細胞の内部へ入り、そこでＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用することを示す。筋肉および肝臓の組織サンプルに関して、同様の結果が観察された（図９Ｂおよび９Ｃ）。
【０１４０】
その結果から、インヒビターは、半用量依存的な様式で、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅのみを阻害するようである。これは、５０ｍｇ／ｋｇのインヒビター９ｃが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の最大の増加を誘発するのに十分であることを示す。同様に、これらの結果は、インヒビターが広く様々な組織に２４時間以内に入ることができ、そして最低６時間は効果を保持することを示す。この研究で使用した、インヒビターで処理したラットは、コントロールラットと比較していかなる不快感も示さなかったようであることも注目すべきである。
【０１４１】
５．１．３ グルコースクリアランスに対するＢｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリンの効果
インヒビター９ｃはラットにおいてＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを阻害し得ることを示したので、増加したレベルのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質が、ラットのグルコースホメオスタシスを維持する能力を変化させるかどうかに取り組むことに注意を向けた。静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）を、１ｇ／ｋｇのグルコース負荷に反応する動物の能力を測定する手段として使用した。その結果は、インヒビターとの短期間の接触（＜２４時間）は、ラットにおいてグルコースクリアランス速度に影響を与えないことを明らかに示す（図１０Ａ）。インヒビターで処理した４匹のラットおよびＰＢＳ緩衝液のコントロール注射で処理した４匹のラットで行ったので、これらの結果は統計学的に有意であることに注目すべきである。ウェスタンブロット分析は、ＩＶＧＴＴにおいてインヒビターで処理した４匹のラットは、増加したレベルのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を有していたことを示す（図１０Ｂ）。
【０１４２】
培養脂肪細胞における上昇したレベルのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質は、インスリン抵抗性を引き起こすことが以前に示されたことを考慮すると、この結果は驚くべきである。本発明者らは、これらの結果の間の違いは、２つの可能性のうち１つに起因するという仮説を立てた。最初に、有機体全体から得られた結果は、培養細胞を用いて行った実験よりも生理学的に関連しており、そして従ってインスリン抵抗性は、末梢組織では発生しない。２番目の可能性は、インヒビター９ｃは実際により多くのインスリンを分泌させるように膵臓β細胞に影響するということである。この影響は、末梢組織におけるインスリン不感受性を克服し、おそらく観察されたような正常なグルコースクリアランスを引き起こす。インスリン産生を刺激する２つの転写因子（ｐｄｘ−１およびｓｐ１）のような、β細胞内でインスリンの産生および輸送に関わる多くのタンパク質が、それ自体Ｏ−ＧｌｃＮＡｃで修飾されているという事実が、この２番目の仮説を支持する。
【０１４３】
５．２ Ｂｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリン（９ｃ）のクリアランス速度を示す動物実験
５．２．１ 実験手順
インヒビターがどれだけ速く組織から排出されるかに関する情報を得るために、５匹の１０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、インヒビター（５０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈注射で与えた。動物を、注射の後３、７、２４、２７、および３２時間後に順次屠殺した。さらに２匹のラットをコントロールとして使用した。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の正常レベルについての情報を得るために、１匹のラットを、他のラットに注射する直前に屠殺した。また、１匹のラットには他のラットと共に滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を注射し、そして実験の最後（３２時間）に屠殺した。組織の採取、ホモジナイゼーション、およびウェスタンブロット分析を、上記で記載したものと同じ様式で行った。
【０１４４】
５．２．２ クリアランス速度の結果
インヒビター９ｃを注射したラットは、インヒビター９ｃの静脈内投与は、注射から３時間という早期に様々な組織型においてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに影響を与えることを示した（図１１）。脳組織のサンプル（図１１Ａ）は、コントロールと比較して、注射の３時間後、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに顕著な増加があったことを示した。これは、インヒビター９ｃが脳細胞の内部に容易に入り、そこでＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用することを示す。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルは、７時間後も高いままであった。そのレベルは２４時間後には減少し、そして３２時間後には正常レベルに戻るようであった。筋肉組織サンプルに関して同様の結果が観察された（図１１Ｂ）。
【０１４５】
５．３ Ｂｕｔ−ＮＡＧ−チアゾリン（９ｃ）の経口利用能を示す動物実験
５．３．１ 実験手順
インヒビター９ｃが経口的に利用可能であるかどうかを決定するために、これを固形飼料（Ｌａｂ Ｄｉｅｔ ５００１ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ、ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＬＬＣ）に組み込んだ。ラット固形飼料を作るために、６００ｇの粉砕した固形飼料を、３５５ｍｌの水およびエタノールに溶解した５ｍＬのインヒビターと混合した。次いで小片をパスタマシン（Ｐａｓｔａ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ）で調製し、そして３７℃で一晩脱水した（Ｓｎａｃｋｍａｓｔｅｒ Ｄｅｈｙｄｒａｔｏｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈａｒｖｅｓｔ）。以下の量のインヒビターで、５セットの固形飼料を作製した：０ｍｇ／ｋｇ／日、１００または１０００ｍｇ／ｋｇ／日の脱保護（極性）インヒビター、および１００または１０００ｍｇ／ｋｇ／日の保護（非極性）インヒビター。これらの数は、６週齢のラットは１日あたり約２５ｇの餌を食べることを示す、以前の研究から得られたデータに基づく。次いで１０匹の５週齢の健康なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（食餌１セットあたり２匹）に、３日間ラット固形飼料を給餌した。次いで動物を屠殺し、そして上記で記載したように組織を採取し、ホモジナイズし、そして分析した。
【０１４６】
５．３．２ 経口利用能の結果
ラットに、２つの異なる投与量の保護（非極性）および脱保護（極性）形態のインヒビター９ｃを３日間給餌した。ウェスタンブロット分析は、両方の形態のインヒビター９ｃの経口投与が、様々な組織型においてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに影響を与えることを示した（図１２）。脳組織のサンプル（図１２Ａ）は、ラットに１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量の保護または脱保護形態のインヒビター９ｃのいずれかを給餌した場合、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルに顕著な増加があったことを示した。脳組織内でのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルは、ラットにより高い投与量の１０００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量の保護または脱保護形態のいずれかのインヒビター９ｃを給餌した場合、さらに高かった。これは、インヒビター９ｃが、経口的に投与された場合でも、脳細胞の内部に容易に入り、そこで用量依存的な様式でＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ機能を阻害するよう作用することを示す。筋肉、膵臓、脂肪、および脾臓を含む他の型の組織サンプルに関して、同様の結果が観察された（図１２Ｂ−１２Ｅ）。
【０１４７】
前述の開示にかんがみて当業者に明らかであるように、本発明の実施において、その意図または範囲から離れることなく、多くの変更および修飾が可能である。
【０１４８】
（参考文献）
【０１４９】
【化４６】
【０１５０】
【化４７】
【０１５１】
【化４８】
【０１５２】
【化４９】
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの３つの可能性のある触媒メカニズムの説明である。経路Ａ；単一工程反転メカニズム：経路Ｂ；共有結合性のグリコシル酵素中間体の形成および分解を含む二重置換保持（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）メカニズム；経路Ｃ；二環性オキサゾリン中間体の形成および分解を含む二重置換保持（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）メカニズム。
【図２】図２は、ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃのＮ−フルオロアセチル誘導体の存在下での、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよびβ−ヘキソサミニダーゼの活性を説明する。（Ａ）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃのＮ−フルオロアセチル誘導体の、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼが触媒する加水分解の初速度；（黒塗りの菱形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ（５）、（黒塗りの逆三角形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆ（５ａ）、（黒塗りの四角形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２（５ｂ）、（黒塗りの円）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃＦ３（５ｃ）。挿入図：軸の交点におけるプロットの領域の詳細。（Ｂ）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃのＮ−フルオロアセチル誘導体の、ヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅが触媒する加水分解の初速度；（黒塗りの菱形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ（５）、（黒塗りの逆三角形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆ（５ａ）、（黒塗りの四角形）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆ２（５ｂ）、（黒塗りの円）ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃＦ３（５ｃ）。挿入図：軸の交点におけるプロットの領域の詳細。（Ｃ）（黒塗りの円）Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅおよび（白抜きの四角形）β−ヘキソサミニダーゼを用いて、パネルＡおよびＢにおいて示したように各基質に関して測定したｌｏｇＶｍａｘ［Ｅ］０／ＫＭ値に対して、ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ基質アナログのＮ−フルオロアセチル置換基のＴａｆｔパラメーター（Ｔａｆｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）（σ＊）をプロットした線形自由エネルギー分析。
【図３】図３は、ＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）の存在下で、ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃのヒトＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅが触媒する加水分解の競合的阻害パターンを説明する。使用した９ａの濃度（ｍＭ）は、０．００（黒塗りの菱形）、０．０３３（△）、０．１００（黒塗りの円）、０．３００（Ｘ）、０．９００（黒塗りの四角形）、および３．０４（○）であった。挿入図：ＮＡＧ−チアゾリン（９ａ）濃度に対する見かけのＫＭのプロットからの、ＫＩの図による分析。
【図４】図４は、チアゾリンインヒビターのパネルによる、β−ヘキソサミニダーゼよりもＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの阻害に対する選択性を説明するグラフである。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（黒塗り）およびβ−ヘキソサミニダーゼ（網掛け）が触媒するＭＵ−ＧｌｃＮＡｃの加水分解の阻害に関して測定された、チアゾリンインヒビターパネル（９ａ−ｆ）のＫＩ値の棒グラフ。
【図５】図５は、５０μＭの異なるチアゾリンインヒビターの存在下または非存在下で４０時間培養したＣＯＳ−７細胞由来のタンパク質のウェスタンブロットである。ＣＯＳ−７細胞のチアゾリンインヒビターとのインキュベーションは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルの増加を引き起こす。レーン１、チアゾリン９ａ；レーン２、チアゾリン９ｃ；レーン３、チアゾリン９ｇ；レーン４、インヒビターなし。（Ａ）抗Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ ＭＡｂ ＣＴＤ１１０．６に続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を用いた、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルのウェスタンブロット分析。（Ｂ）抗βアクチンｍＡｂクローンＡＣ−４０に続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体で処理した、（Ａ）でロードしたサンプルのウェスタンブロットは、各サンプルにおいてβアクチンレベルが同等であることを明らかにする。
【図６】図６は、５０μＭのチアゾリンインヒビター（９ｃ）の存在下または非存在下で４０時間以上培養したＣＯＳ−７細胞由来のタンパク質のウェスタンブロットである。ＣＯＳ−７細胞のチアゾリンインヒビター（９ｃ）とのインキュベーションは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルの時間依存的な増加を引き起こす。（Ａ）抗Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ ＭＡｂ ＣＴＤ １１０．６に続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を用いた、インヒビター（９ｃ）への曝露後の時間の関数としての、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルのウェスタンブロット分析。（Ｂ）抗βアクチンｍＡｂクローンＡＣ−４０に続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体で処理した、（Ａ）でロードしたサンプルのウェスタンブロットは、各サンプルにおいてβアクチンレベルが同等であることを明らかにする。（Ｃ）インヒビターの非存在下における、時間の関数としての、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質の細胞レベルのウェスタンブロット分析は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルが、コンフルエンスの関数として有意に変化しないことを示す。０時間において、プレートは約２５％コンフルエントであり、そして４０時間後プレートは約９０％コンフルエントであった。（Ｄ）パネル（Ｂ）と同様に処理した、（Ｃ）でロードしたサンプルのウェスタンブロットは、両方のサンプルにおいてβアクチンレベルが同等であることを明らかにする。
【図７】図７は、Ｄ２Ｏにおけるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の分解を説明する。Ｄ２Ｏに溶解したＳＴＺを、２４時間以上の期間モニターした。アステリスク（＊）をつけた共鳴は、ＳＴＺのα−アノマーのＨ−１由来である。スペクトルを、新しくＤ２Ｏに溶解したＳＴＺ（約１０ｍＭ）のサンプルから室温で収集した。ＮＭＲスペクトルを、ＳＴＺを溶解後、Ａ）５分、Ｂ）２０分、Ｃ）４０分、Ｄ）２時間、Ｅ）４時間およびＦ）２４時間後に収集した。
【図８】図８は、ＳＴＺはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの時間依存的な不活性化もβ−ヘキソサミニダーゼの時間依存的な不活性化も示さないことを説明するグラフである。Ａ）Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（０．０１６ｍｇ／ｍＬ）を、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ６．５の存在下で、１０ｍＭのＳＴＺとインキュベートした。いくつかの時間間隔で、不活性化混合物およびコントロールの酵素活性をアッセイした。アッセイ混合物中で１．２ｍＭのＳＴＺの最終濃度を生ずるために、Ｍｕ−ＧｌｃＮＡｃ（５．７ｍＭ）を含むアッセイ混合物（全部で２５μＬ）へ、酵素のアリコート（３μＬ）と共にある程度のＳＴＺが移されたので、これらの値は均一でない。実際、ＳＴＺがＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの競合的インヒビター（ＫＩ＝１．５ｍＭ）として作用すると仮定して計算した、コントロールおよび実験に関するアッセイの反応速度の期待される比（ＶＣｏｎｔｒｏｌ／ＶＳＴＺ）は、１．１７であり、ここで６時間以上測定された値と全体的に一致する。Ｂ）β−ヘキソサミニダーゼ（０．０３６ｍｇ／ｍＬ）を、５０ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ４．２５の存在下で、１０ｍＭのＳＴＺとインキュベートした。いくつかの時間間隔で、不活性化混合物およびコントロールの酵素活性を、方法および材料で記載されたようにアッセイした。アッセイ混合物中で１．２ｍＭのＳＴＺの最終濃度を生ずるために、Ｍｕ−ＧｌｃＮＡｃ（５．７ｍＭ）を含むアッセイ混合物（全部で２５μＬ）へ、酵素のアリコート（３μＬ）と共にある程度のＳＴＺが移されたので、これらの値は正確には均一でない。実際、ＳＴＺがβ−ヘキソサミニダーゼの競合的インヒビター（ＫＩ＝４７ｍＭ）として作用すると仮定して計算した、コントロールおよび実験に関するアッセイの反応速度の期待される比（ＶＣｏｎｔｒｏｌ／ＶＳＴＺ）は、１．０１であり、ここで６時間以上測定された値と一致する。
【図９】図９は、様々な投与量のインヒビター９ｃを注射したラットの脳、筋肉、および肝臓組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。４匹のラットを、異なる投与量のインヒビター９ｃまたは緩衝液コントロールの尾静脈注射によって処置した。約１８時間離して２回の連続的な注射を行い、そして次いでラットを最初の注射の２４時間後に屠殺した。α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析は、インヒビター９ｃが、脳（Ａ）、筋肉（Ｂ）および肝臓（Ｃ）を含む様々な組織へ、容易に入ることを明らかに示し、そして５０ｍｇ／ｋｇのように低い投与量が、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルの最大の増加を誘発するのにほぼ十分であることを示す。
【図１０】図１０は、ラットにおいて行われた静脈内グルコース負荷試験の結果を説明する。（Ａ）８匹のラットを、そのうち４匹に５０ｍｇ／ｋｇのインヒビター９ｃの尾静脈注射に曝して、グルコースを除去する能力に関して試験した。静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）を、これも尾静脈から送達された１ｇ／ｋｇのグルコースの負荷によって行った。エラーバーは、各条件下で使用した４匹のラットの間の分散を示す。（Ｂ）α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析は、ＩＶＧＴＴにおいてインヒビターで処置した４匹のラットにおいて、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のレベルが増加したことを示す。
【図１１】図１１は、様々な時間でインヒビター９ｃを注射したラットの脳および筋肉組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。数匹のラットを、５０ｍｇ／ｋｇのインヒビター９ｃを尾静脈に注射することによって処置し、そして注射の後特定の時間に屠殺して、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルが時間につれてどのように変化するのかを観察した。α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析を用いて、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃレベルをモニターした。脳（Ａ）および筋肉（Ｂ）組織は、インヒビターが迅速に組織へ到達し得、そこで迅速にＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルを上昇させるよう作用することを示した（＜３時間）。約２４−３２時間以内に、インヒビター９ｃは組織から排出され、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃレベルは正常に戻る。時間０および３２（−）は、０時間および３２時間における未処置コントロール動物を示す。
【図１２−１】図１２は、２つの異なる形態および投与量のインヒビター９ｃを給餌したラットの脳、筋肉、膵臓、脂肪、および脾臓組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。ラットに、異なる量の脱保護（極性）または保護（非極性）インヒビター９ｃを含むか、またはインヒビターを全く含まない食餌を３日間与えた。組織におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃのレベルを、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析によって評価した。脳（Ａ）、筋肉（Ｂ）、膵臓（Ｃ）、脂肪（Ｄ）および脾臓（Ｅ）組織において、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって判断されるように、１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量が、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを阻害し、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を大きく増加させるために十分である。１０００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のわずかにより大きな増加を引き起こす。αアクチン抗体によるコントロールブロットまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプルのローディングが等量であったことを示す。
【図１２−２】図１２は、２つの異なる形態および投与量のインヒビター９ｃを給餌したラットの脳、筋肉、膵臓、脂肪、および脾臓組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。ラットに、異なる量の脱保護（極性）または保護（非極性）インヒビター９ｃを含むか、またはインヒビターを全く含まない食餌を３日間与えた。組織におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃのレベルを、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析によって評価した。脳（Ａ）、筋肉（Ｂ）、膵臓（Ｃ）、脂肪（Ｄ）および脾臓（Ｅ）組織において、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって判断されるように、１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量が、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを阻害し、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を大きく増加させるために十分である。１０００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のわずかにより大きな増加を引き起こす。αアクチン抗体によるコントロールブロットまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプルのローディングが等量であったことを示す。
【図１２−３】図１２は、２つの異なる形態および投与量のインヒビター９ｃを給餌したラットの脳、筋肉、膵臓、脂肪、および脾臓組織由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。ラットに、異なる量の脱保護（極性）または保護（非極性）インヒビター９ｃを含むか、またはインヒビターを全く含まない食餌を３日間与えた。組織におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃのレベルを、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＣＴＤ１１０．６）を用いたウェスタンブロット分析によって評価した。脳（Ａ）、筋肉（Ｂ）、膵臓（Ｃ）、脂肪（Ｄ）および脾臓（Ｅ）組織において、α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって判断されるように、１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量が、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを阻害し、そしてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を大きく増加させるために十分である。１０００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質のわずかにより大きな増加を引き起こす。αアクチン抗体によるコントロールブロットまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプルのローディングが等量であったことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般的な化学式（Ｉ）：
【化１】
を有する化合物およびその薬学的に受容可能な塩であって、ここで
Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６は、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換カルバメートもしくは非置換カルバメート、置換尿素もしくは非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびヘテロ原子を含むこれらの誘導体からなる群より選択され、該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得、そして
Ｒ２およびＲ４は、ＣＨ２、ＣＨＲ１、ＮＨ、ＮＲ１、または任意のヘテロ原子であり、そして
Ｒ１は、Ｈ、エーテル、アミン、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択される、
化合物およびその薬学的に受容可能な塩。
【請求項２】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２はＳであり、Ｒ１はＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択され、そしてＲ４はＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１がＣＨ２ＣＨ３であり、そしてＲ４がＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１が（ＣＨ２）２ＣＨ３であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１が（ＣＨ２）３ＣＨ３であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１が（ＣＨ２）４ＣＨ３であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１がＣＨ（ＣＨ３）２であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１がＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
１，２−ジデオキシ−２’−エチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−プロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−ブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−ペンチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−イソプロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、および１，２−ジデオキシ−２’−イソブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、ならびにその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１に記載の１以上の化合物を含むプロドラッグ。
【請求項１１】
請求項１に記載の１以上の化合物を含むプロドラッグであって、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含む、プロドラッグ。
【請求項１２】
請求項１に記載の１以上の化合物と薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１０に記載の１以上のプロドラッグと薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の１以上の化合物と薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の１以上の化合物を投与する工程を包含する、グリコシダーゼを阻害する方法。
【請求項１６】
前記グリコシダーゼが、グリコシドヒドロラーゼを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記グリコシドヒドロラーゼが、ファミリー８４のグリコシドヒドロラーゼを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記グリコシドヒドロラーゼがＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の１以上の化合物を投与する工程を包含する、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの切断を選択的に阻害する方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載の１以上のプロドラッグを投与する工程を包含する、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの切断を選択的に阻害する方法。
【請求項２１】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損もしくは過剰発現、またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積もしくは枯渇に関連する疾患もしくは障害を研究するか、あるいはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損もしくは過剰発現、またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積もしくは枯渇に関連する疾患もしくは障害の処置を研究するための、動物モデルを開発する方法であって、請求項１に記載の化合物を動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記疾患または障害が、糖尿病、神経変性疾患、アルツハイマー病、および癌からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法にしたがって開発された動物モデル。
【請求項２４】
請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する、グリコシダーゼ阻害療法に応答性の障害を処置する方法。
【請求項２５】
請求項１０に記載のプロドラッグを投与する工程を包含する、グリコシダーゼ阻害療法に応答性の障害を処置する方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する、島β細胞の分化を促進する方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する、ストレスに細胞を備えさせる方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、該方法は：
ａ）ある範囲のアシル化剤を使用して２−アミノ−２−デオキシ−ｌ，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノースの塩をアシル化し、一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体を得る工程；
ｂ）該一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体のアミドを、対応するチオアミドに変換し、該チオアミドを環化して、一連の３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程；そして
ｃ）該チアゾリン化合物を脱アシル化して、一連の１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
選択的グリコシダーゼインヒビターを製造する方法であって、該方法は：
ａ）２種以上のグリコシダーゼまたはグリコシダーゼのクラスのインヒビターを選択する工程；
ｂ）該インヒビターの１以上の側鎖を拡張または縮小することによって該側鎖を改変する工程；そして
ｃ）該１種以上のグリコシダーゼの選択的阻害に関して、該改変されたインヒビターを試験する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の選択的グリコシダーゼインヒビターを製造する方法であって、該方法は：
ａ）以下：
【化２】
およびその薬学的に受容可能な塩から選択される一般式を有する、β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼのインヒビターを選択する工程であって、ここで
Ｘ１〜Ｘ６は、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１〜Ｒ５は、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換カルバメートもしくは非置換カルバメート、置換尿素もしくは非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびヘテロ原子を含むこれらの誘導体からなる群より選択され、該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、工程；
ｂ）該インヒビターのＲ１側鎖を拡張または縮小することによって、該鎖を改変する工程；そして
ｃ）１種以上のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼの選択的阻害について該改変されたインヒビターを試験する工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記インヒビターの側鎖が、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、官能族基、またはこれらのヘテロ原子誘導体を挿入することによって拡張される、請求項３０に記載の選択的グリコシダーゼインヒビターを製造する方法。
【請求項３２】
前記インヒビターの側鎖Ｒ１が、ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択される基を挿入することによって拡張される、請求項３１に記載の選択的グリコシダーゼインヒビターを製造する方法。
【請求項３３】
以下の構造：
【化３】
からなる群より選択される化合物を含む選択的グリコシダーゼインヒビターおよびその薬学的に受容可能な塩であって、ここで、
Ｘ１〜Ｘ６はＯ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１〜Ｒ５は、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換カルバメートもしくは非置換カルバメート、置換尿素もしくは非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびヘテロ原子を含むこれらの誘導体からなる群より選択され、該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、
選択的グリコシダーゼインヒビターおよびその薬学的に受容可能な塩。
【請求項３４】
一般的な化学式（ＩＩ）：
【化４】
を有する化合物およびその薬学的に受容可能な塩であって、ここで、
Ｘ１〜Ｘ６はＯ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１〜Ｒ５は、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換カルバメートもしくは非置換カルバメート、置換尿素もしくは非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびヘテロ原子を含むこれらの誘導体からなる群より選択され、該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、
選択的グリコシダーゼインヒビターおよびその薬学的に受容可能な塩。
【請求項３５】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを選択的に阻害するインヒビターであって、該インヒビターは、請求項１および請求項３４に記載の化合物の群から選択される、インヒビター。
【請求項１】
一般的な化学式（Ｉ）：
【化１】
を有する化合物およびその薬学的に受容可能な塩であって、ここで
Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６は、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換カルバメートもしくは非置換カルバメート、置換尿素もしくは非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびヘテロ原子を含むこれらの誘導体からなる群より選択され、該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得、そして
Ｒ２およびＲ４は、ＣＨ２、ＣＨＲ１、ＮＨ、ＮＲ１、または任意のヘテロ原子であり、そして
Ｒ１は、Ｈ、エーテル、アミン、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択される、
化合物およびその薬学的に受容可能な塩。
【請求項２】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２はＳであり、Ｒ１はＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択され、そしてＲ４はＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１がＣＨ２ＣＨ３であり、そしてＲ４がＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１が（ＣＨ２）２ＣＨ３であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１が（ＣＨ２）３ＣＨ３であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１が（ＣＨ２）４ＣＨ３であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１がＣＨ（ＣＨ３）２であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＯＨであり、Ｒ２がＳであり、そしてＲ１がＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２であり、そしてＲ４がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
１，２−ジデオキシ−２’−エチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−プロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−ブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−ペンチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、１，２−ジデオキシ−２’−イソプロピル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、および１，２−ジデオキシ−２’−イソブチル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリン、ならびにその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１に記載の１以上の化合物を含むプロドラッグ。
【請求項１１】
請求項１に記載の１以上の化合物を含むプロドラッグであって、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含む、プロドラッグ。
【請求項１２】
請求項１に記載の１以上の化合物と薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１０に記載の１以上のプロドラッグと薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の１以上の化合物と薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の１以上の化合物を投与する工程を包含する、グリコシダーゼを阻害する方法。
【請求項１６】
前記グリコシダーゼが、グリコシドヒドロラーゼを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記グリコシドヒドロラーゼが、ファミリー８４のグリコシドヒドロラーゼを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記グリコシドヒドロラーゼがＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の１以上の化合物を投与する工程を包含する、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの切断を選択的に阻害する方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載の１以上のプロドラッグを投与する工程を包含する、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃの切断を選択的に阻害する方法。
【請求項２１】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損もしくは過剰発現、またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積もしくは枯渇に関連する疾患もしくは障害を研究するか、あるいはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの欠損もしくは過剰発現、またはＯ−ＧｌｃＮＡｃの蓄積もしくは枯渇に関連する疾患もしくは障害の処置を研究するための、動物モデルを開発する方法であって、請求項１に記載の化合物を動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記疾患または障害が、糖尿病、神経変性疾患、アルツハイマー病、および癌からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法にしたがって開発された動物モデル。
【請求項２４】
請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する、グリコシダーゼ阻害療法に応答性の障害を処置する方法。
【請求項２５】
請求項１０に記載のプロドラッグを投与する工程を包含する、グリコシダーゼ阻害療法に応答性の障害を処置する方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する、島β細胞の分化を促進する方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する、ストレスに細胞を備えさせる方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、該方法は：
ａ）ある範囲のアシル化剤を使用して２−アミノ−２−デオキシ−ｌ，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノースの塩をアシル化し、一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体を得る工程；
ｂ）該一連の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−Ｎ−アシル−β−Ｄ−グルコピラノース誘導体のアミドを、対応するチオアミドに変換し、該チオアミドを環化して、一連の３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，１−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程；そして
ｃ）該チアゾリン化合物を脱アシル化して、一連の１，２−ジデオキシ−２’−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノソ−［２，ｌ−ｄ］−Δ２’−チアゾリンを得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
選択的グリコシダーゼインヒビターを製造する方法であって、該方法は：
ａ）２種以上のグリコシダーゼまたはグリコシダーゼのクラスのインヒビターを選択する工程；
ｂ）該インヒビターの１以上の側鎖を拡張または縮小することによって該側鎖を改変する工程；そして
ｃ）該１種以上のグリコシダーゼの選択的阻害に関して、該改変されたインヒビターを試験する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の選択的グリコシダーゼインヒビターを製造する方法であって、該方法は：
ａ）以下：
【化２】
およびその薬学的に受容可能な塩から選択される一般式を有する、β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼのインヒビターを選択する工程であって、ここで
Ｘ１〜Ｘ６は、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１〜Ｒ５は、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換カルバメートもしくは非置換カルバメート、置換尿素もしくは非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびヘテロ原子を含むこれらの誘導体からなる群より選択され、該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、工程；
ｂ）該インヒビターのＲ１側鎖を拡張または縮小することによって、該鎖を改変する工程；そして
ｃ）１種以上のβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼの選択的阻害について該改変されたインヒビターを試験する工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記インヒビターの側鎖が、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、官能族基、またはこれらのヘテロ原子誘導体を挿入することによって拡張される、請求項３０に記載の選択的グリコシダーゼインヒビターを製造する方法。
【請求項３２】
前記インヒビターの側鎖Ｒ１が、ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択される基を挿入することによって拡張される、請求項３１に記載の選択的グリコシダーゼインヒビターを製造する方法。
【請求項３３】
以下の構造：
【化３】
からなる群より選択される化合物を含む選択的グリコシダーゼインヒビターおよびその薬学的に受容可能な塩であって、ここで、
Ｘ１〜Ｘ６はＯ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１〜Ｒ５は、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換カルバメートもしくは非置換カルバメート、置換尿素もしくは非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびヘテロ原子を含むこれらの誘導体からなる群より選択され、該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、
選択的グリコシダーゼインヒビターおよびその薬学的に受容可能な塩。
【請求項３４】
一般的な化学式（ＩＩ）：
【化４】
を有する化合物およびその薬学的に受容可能な塩であって、ここで、
Ｘ１〜Ｘ６はＯ、ＮＨ、ＮＲ１、ＣＨＲ１、ＣＨ２または任意のヘテロ原子であり、Ｒ１〜Ｒ５は、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、アルコール、エーテル、アミン、置換カルバメートもしくは非置換カルバメート、置換尿素もしくは非置換尿素、エステル、アミド、アルデヒド、カルボン酸、およびヘテロ原子を含むこれらの誘導体からなる群より選択され、該エステルおよびアミドは、分枝アルキル鎖、非分枝アルキル鎖、シクロアルキル基、芳香族基、およびこれらのヘテロ原子誘導体からなる群より選択されるアシル基を含み得る、
選択的グリコシダーゼインヒビターおよびその薬学的に受容可能な塩。
【請求項３５】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅを選択的に阻害するインヒビターであって、該インヒビターは、請求項１および請求項３４に記載の化合物の群から選択される、インヒビター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【公表番号】特表２００８−５３１６０４（Ｐ２００８−５３１６０４Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５７３００（Ｐ２００７−５５７３００）
【出願日】平成１８年３月１日（２００６．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００３００
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９２０４９
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０７２９３４１３）サイモン フレイザー ユニバーシティ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１日（２００６．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００３００
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９２０４９
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０７２９３４１３）サイモン フレイザー ユニバーシティ (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]