金微粒子とその製造方法、およびその用途
【課題】特定の有機物が結合したロッド形状の金微粒子と、該金微粒子を目標部位へ集積させる方法とその応用技術を提供する。
【解決手段】分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的物質と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているナノサイズのロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）、および、ペプチドが標的物質により認識され、特異的に結合することにより、標的物質の発現している特定部位に該金微粒子を凝集させる方法、および該方法を利用した治療方法等。
【解決手段】分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的物質と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているナノサイズのロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）、および、ペプチドが標的物質により認識され、特異的に結合することにより、標的物質の発現している特定部位に該金微粒子を凝集させる方法、および該方法を利用した治療方法等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微子（金ナノロッド）と、その製造方法と、その集積方法、およびその用途に関する。
【０００２】
本発明は、より具体的には、分散媒に相溶する部位を含み分子量の異なる２種の高分子で金ナノロッドを修飾して分散媒中で金ナノロッドを安定に分散するものであり、分子量の大きな高分子にペプチドを導入しておくことで、高分子中へのペプチド部位の埋没を防ぎ、ペプチドが標的物質から認識される確率を高めた金ナノロッドとその製造方法であり、標的物質に結合し金ナノロッドが集積することを利用した標的物質の検出方法と金ナノロッドの標的部位への集積方法、金ナノロッドが集積した部位のフォトサーマル治療やバイオイメージング、そして標的物質が存在する部位への薬物輸送方法として有用である。
【背景技術】
【０００３】
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：ＬＳＰＲ）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０ｎｍ程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは形状の変化や凝集状態変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献２、３、４）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。
【０００５】
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズの金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第四級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４）。
【０００６】
近年、金ナノロッドにアビジン−ビオチン、抗原−抗体などの相互作用による目的物質への特異的な吸着反応を利用した研究が報告されており、抗体を介してがん細胞に金ナノロッドを取り込ませることによって、金ナノロッドの二光子発光によるがん細胞のイメージングが可能であることが報告されている（非特許文献５）。
【０００７】
また、αｖβ3インテグリンに特異的に認識されるペプチドについて、環状ＲＧＤ（アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ））ペプチドが高い選択性を示すことが報告されている（非特許文献６、特許文献５、６、７、８、９、１０）。さらに、金微粒子、ＲＧＤペプチド、インテグリンの組成物が報告されている（特許文献１１）。
【０００８】
さらに、α−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコールを修飾した金ナノロッドをバイオマーカーとしてマウスに注入し、一定時間経過後に血中や各器官を分別採取しそれぞれの部位における金ナノロッドの濃度を測定することによって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾した金ナノロッドの血液中での分散安定性が報告されている（非特許文献７）。また、チオプロニン保護した金微粒子にＰＥＧ部位を有する分子鎖を介してＲＧＤ配列を含むＧＲＧＤＳＰペプチドを導入し、分子鎖の化学構造の違いによる細胞への結合挙動が報告されている（非特許文献８）。
【非特許文献１】S.Link,M.B.Mohamed,M.A.El-Sayed,J.Phys.Chem.B,103,p3073（1999）
【非特許文献２】K.Honda,Y.Niidome,N.Nakashima,H.Kawazumi,S.Yamada,Chem.Lett.,35,p854（2006）
【非特許文献３】Y.Niidome,H.Takahashi,S.Urakawa,K.Nishioka,S.Yamada,Chem.Lett.,33,p454（2004）
【非特許文献４】S.Link,M.A.El-Sayed,J.Phys.Chem.B,109,p10531（2005）
【非特許文献５】N.J.Durr,T.Larson,D.K.Smith,B.A.Korgel,K.Sokolov,A.Ben-Yakar,Nano Letters,7,p941（2007）
【非特許文献６】S.Oishi,YAKUGAKU ZASSHI,124,p269(2004)
【非特許文献７】T.Niidome,M.Yamagata,Y.Okamoto,Y.Akiyama,H.Takahashi,T.Kawano,Y.Katayama,Y.Niidome,J.Control.Release,114,p343(2006)
【非特許文献８】J.M.de la Fuente,C.C.Berry,M.O.Riehle,A.S.G.Curtis,Langmuir,22,p3286(2006)
【特許文献１】特開２００４−２９２６２７号公報
【特許文献２】特開２００５−９７７１８号公報
【特許文献３】特開２００６−１６９５４４号公報
【特許文献４】特開２００６−１１８０３６号公報
【特許文献５】特表２００８−５３１６７７号公報
【特許文献６】特表２００８−５０４２３５号公報
【特許文献７】特表２００６−５２８１６８号公報
【特許文献８】特表２００７−５３７２４３号公報
【特許文献９】特表２００５−５３２２５２号公報
【特許文献１０】特表２００１−５２６５７０号公報
【特許文献１１】ＷＯ２００５／０７３３８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１〜４などの方法で合成された金ナノロッドはＣＴＡＢに被覆された状態で水中に分散しているが、特定部位で集積する機能は有していない。
【００１０】
非特許文献５は、金ナノロッドをポリスチレンスルホネートで表面処理後に抗体と結合させているが、金ナノロッドの二光子発光を測定するための処理方法であり、金ナノロッドのＬＳＰＲをセンシング技術やバイオイメージングに応用したものではない。
【００１１】
非特許文献６と特許文献５〜１０は、αｖβ3インテグリンが特異的に環状ＲＧＤペプチドを認識することを報告したものであり、金微粒子の分散安定性を保持しつつ、環状ＲＧＤペプチドを修飾する方法は報告していない。また、金微粒子に修飾された環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンに認識されやすいよう設計する技術は報告していない。
【００１２】
非特許文献７は、ＰＥＧ修飾による金ナノロッドは血液中で分散安定性が高まることが報告されているが、ＰＥＧ鎖中に反応性の官能基がないため、他の化合物と反応させることはできない。
【００１３】
特許文献１１の組成物は、ＤＮＡなどの細胞への導入効率を上昇させるための組成物であって、金微粒子へＲＧＤペプチドを修飾する技術や、インテグリンとＲＧＤペプチドの特異的結合を金微粒子の集積に利用した技術を報告したものではない。
【００１４】
非特許文献８は、近赤外域における金微粒子のＬＳＰＲによるバイオイメージングを検討した技術ではない。また、金微粒子に修飾された環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンに認識されやすいよう設計する技術は報告されていない。
【００１５】
本発明は従来の上記技術では知られていない金ナノロッドの新規技術を提供する。具体的には、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ吸着するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）であって、ペプチドが標的物質によって高い確率で認識される金微粒子と、その製造方法、その集積方法、およびその用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子に関する。
〔１〕分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的物質と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子。
〔２〕有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量が、有機物(Ａ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量より２０００以上大きい上記[１]の金微粒子。
〔３〕分散媒に相溶する部位が水溶性高分子である上記[１]または上記[２]の金微粒子。
〔４〕有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである上記[１]〜上記[３]の何れかに記載する金微粒子。
〔５〕リンカーがチオール基であることを特徴であることをする上記[１]〜上記[４]に記載する金微粒子。
〔６〕標的物質に特異的に結合するペプチドが環状ＲＧＤペプチドである上記[１]〜上記[５]の何れかに記載する金微粒子。
〔７〕標的物質がインテグリンであることを特徴とする上記[６]に記載する金微粒子。
〔８〕インテグリンがαｖβ3インテグリンであることを特徴とする上記[７]に記載する金微粒子。
〔９〕環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンにより特異的に認識され、αｖβ3インテグリンの発現している特定部位に該金微粒子が集積することを特徴とする上記[１]〜上記[８]の何れかに記載する金微粒子。
〔１０〕長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である上記[１]〜上記[９]の何れかに記載する金微粒子。
【００１７】
また、本発明は、以下に示す構成を有する上記金微粒子の製造に関する。
〔１１〕分散媒に相溶する部位とペプチドを含む有機物を合成し、該有機物にリンカーを導入し、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)を合成する工程、該有機物(Ｂ)と、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に結合させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
〔１２〕保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含むポリエチレングリコールのＮＨＳと環状ＲＧＤペプチドのアミノ基を反応して、環状ＲＧＤペプチドとポリエチレングリコールを含む有機物を合成し、該有機物の脱保護したアミノ基と、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを反応して２−ピリジル−ジスルフィド基を導入し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断して得られた有機物(Ｂ)と、有機物(Ｂ)のポリエチレングリコールより重合平均分子量の小さなポリエチレングリコールを含む方末端がチオール基の有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に表面処理する上記[１１]に記載する表面修飾金微粒子の製造方法。
【００１８】
さらに本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子の集積方法、およびこれを利用した検出方法、治療方法などに関する。
〔１３〕上記[９]に記載する集積によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
〔１４〕上記[９]または上記[１３]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルで検出物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
〔１５〕上記[９]または上記[１３]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
〔１６〕上記[９]または上記[１３]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
〔１７〕上記[９]または上記[１３]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位を含む分子量の異なる２種の有機物(Ａ)(Ｂ)で修飾されており、ペプチドが導入されている有機物(Ｂ)の分子量を大きくすることによって、金微粒子の分散安定性を損なうことなく高分子中へのペプチド部位の埋没を防止できるため、標的物質に認識される確率を高めることができる。
【００２０】
本発明の金微粒子の製造方法は上記有機物(Ａ)(Ｂ)を金微粒子（金ナノロッド）に修飾する方法であり、金ナノロッドに結合するリンカーとして、例えば、末端にチオール基を有するものを用いることによって、チオール基末端から優先的に金ナノロッドに結合させることができる。
【００２１】
本発明の金微粒子に修飾されたペプチドは、標的物質から高い確率で認識され標的物質へ特異的に結合するため、標的物質が存在する部位へ集積することができる。
【００２２】
本発明の金微粒子は、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲の金ナノロッドを用いているので、集積によってＬＳＰＲの分光特性が変化することを利用して、ペプチドと特異的に結合する標的物質を検出することができる。
【００２３】
さらに、金ナノロッドは光熱変換機能を有するので、金ナノロッドを集積させた標的部位周辺組織へのフォトサーマル治療、バイオイメージング、そしてドラックデリバリーシステムの構築が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。
【００２５】
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物がリンカーで結合していることを特徴とする金微粒子である。
【００２６】
本発明の集積方法は、上記金ナノロッドを修飾している有機物に導入されたペプチドの標的物質への特異的結合を利用したものであり、ペプチドが標的物質に認識されると金ナノロッドが標的物質の存在する部位に集積することを利用したものである。
【００２７】
本発明の標的物質の検出方法は、上記金ナノロッドの集積方法を利用したものであり、金ナノロッドの集積によってＬＳＰＲの分光特性や散乱光強度が変化することを利用して標的物質を検出するものである。
【００２８】
本発明のフォトサーマル治療は、上記金ナノロッドがＬＰＳＲに相当する光を吸収して熱に変換する光熱変換機能を利用し、該金ナノロッドが集積している標的物質が存在する部位周辺の細胞（腫瘍細胞など）を発生した熱で死滅させるものである。本発明のＤＤＳは、上記金ナノロッドに薬物を担持させて生体内に投与し、標的物質が存在する部位で金ナノロッドが集積するのを利用して特定部位に薬物を集中投与するシステムである。
【００２９】
また、本発明のバイオイメージングは、上記金ナノロッドが集積している部位を金ナノロッドのＬＳＰＲを測定して画像化することによって確認するものである。なお、本発明における吸収スペクトルの変化とは、金ナノロッドの集積に伴うＬＳＰＲの最大吸収波長の吸光度の低下や吸収スペクトル形状の変化を意味する。また、本発明のＲＧＤとは、アミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ））をいう。
【００３０】
〔修飾有機物〕
本発明の金微粒子（金ナノロッド）は２種の有機物(Ａ)(Ｂ)によって修飾されたものである。有機物(Ａ)は、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する。有機物(Ｂ)は、分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有し、該有機物(Ｂ)の分散媒相溶部位の重量平均分子量は有機物(Ａ)の分散媒相溶部位の重量平均分子量より大きいものが用いられる。
【００３１】
分散媒に相溶する部位としては水溶性高分子を用いることができる。また、リンカーとしては、チオール基を用いることができる。ペプチドとしては、環状ＲＧＤペプチドを用いることができる。金ナノロッドとしては、長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲の金ナノロッドが使用できる。
【００３２】
金ナノロッドに結合させる上記有機物(Ａ)(Ｂ)において、分散媒に相溶する部位の水溶性高分子としては、水と相溶して金ナノロッドを分散媒中で安定に分散させることができるような水溶性高分子であれば制限なく使用でき、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セルロース、ポリアクリル酸などが挙げられる。以下では、ＰＥＧの例について説明する。
【００３３】
分散媒に相溶する部位に使用するＰＥＧとしては、重量平均分子量４００００以下のＰＥＧを使用することができる。ＰＥＧの重合平均分子量は１０００〜２００００のものが好ましい。重合平均分子量が１０００より小さいと分散媒中での分散安定性が不足し、一方、重合平均分子量が４００００より大きいと分散安定性に変化はなく、コスト的に不利である。
【００３４】
本発明の有機物(Ｂ)に用いるＰＥＧの重合平均分子量は、有機物(Ａ)に用いるＰＥＧよりも大きな重合平均分子量であることが適当である。ペプチドが導入されている有機物(Ｂ)に用いるＰＥＧの重合平均分子量の方が大きいため、ＰＥＧ鎖中にペプチド部位が埋没するのを防止することができ、ペプチドが標的物質により高い確率で認識され、特異的に結合することが可能となるため、標的物質が存在する特定部位へ効率よく金ナノロッドを集積させることができる。両有機物のＰＥＧの重合平均分子量の差は、少なくとも２０００以上が好ましい。重合平均分子量が２０００未満の場合、ペプチド部位がＰＥＧ中へ埋没する確立が高くなり、ペプチドが標的物質から認識され難い。
【００３５】
本発明の有機物(Ａ)の一方の末端は、金ナノロッドへ結合するリンカーを有しており、リンカーとしてはチオール基を使用できる。チオール基は金と共有結合を形成するので、有機物(Ａ)はチオール基末端から優先的に金ナノロッドに結合する。有機物(Ａ)の他方の末端は金と結合を起こさない化学構造であるメトキシ基が好ましい（ｍＰＥＧ−ＳＨ）。
【００３６】
本発明の有機物(Ｂ)の一方の末端は、標的物質から認識され特異的に結合するペプチドを有しており、他方の末端は金ナノロッドへ結合するリンカーを有しており、リンカーとしてはチオール基を使用できる。チオール基は金と共有結合を形成するので、有機物(Ｂ)はチオール基末端から優先的に金ナノロッドに結合する。
【００３７】
本発明の金ナノロッドに結合させる有機物(Ｂ)に使用するＲＧＤペプチドとしては、ＲＧＤ配列（アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ））を有するペプチドを使用できる。特に標的物質であるインテグリンはＲＧＤ配列を認識するため、ＲＧＤペプチドを修飾した金ナノロッドは、インテグリンが発現している部位で認識され、特異的結合が得られる。特に、αｖβ3インテグリンは環状構造を有するＲＧＤペプチドを強く認識するため、環状ＲＧＤペプチドを修飾した金ナノロッドはαｖβ3インテグリンが発現している部位（腫瘍細胞など）で高い集積効果が得られる。環状ＲＧＤペプチドは、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸を連続的に含む環状構造を有するペプチドであり、Ｆｍｏｃ固相合成法などによって合成することができる。
【００３８】
〔有機物(Ｂ)の合成〕
本発明の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金ナノロッドへ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)は、保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含むＰＥＧ（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を用いて合成できる。炭酸水素ナトリウム溶液に溶解したＢｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳと環状ＲＧＤペプチド（ｃＲＧＤ）を混合して攪拌すると、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳはｃＲＧＤのアミノ基とアミド結合を形成し、ＰＥＧとｃＲＧＤを含む有機物（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）が得られる。Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを凍結乾燥し、トリフルオロ酢酸によりアミノ基の脱保護を行い（ＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）、得られたＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、アセトニトリルに溶解したＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと混合して攪拌すると、脱保護したアミノ基とスクシンイミジル基が反応して、２−ピリジル−ジスルフィド基がアミド結合を介して導入される（ＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）。得られたＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断すると、ｃＲＧＤとチオール基を末端に有する有機物(Ｂ)が得られる（ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）。
【００３９】
本発明の金ナノロッドに結合させた有機物(Ｂ)に導入したｃＲＧＤは、標的物質であるαｖβ3インテグリンにより認識され、特異的に結合する。本発明の金ナノロッドは、αｖβ3インテグリンの他にもｃＲＧＤが認識され特異的結合を示す標的物質であれば、際限なく適用できる。
【００４０】
〔金ナノロッド〕
本発明で使用する金ナノロッド（ＮＲｓ）は、長軸の長さが４００nm未満であって、アスペクト比が１より大きいロッド形状の金微粒子が好ましい。具体的には、ＬＳＰＲの最大吸収波長が波長７００〜２０００ｎｍの範囲内にあるアスペクト比の金ナノロッドが適当である。また金ナノロッドの長軸長さは２００ｎｍ以下がより好ましい。長軸長さがこより長いと、金ナノロッドが沈降しやすくなる傾向があり、分散媒中での分散安定性が失われる。
【００４１】
金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イ
オンを還元することによって合成することができる。例えば、ｎ＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。この金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【００４２】
上記金ナノロッド水分散液は、水中に存在する余剰の界面活性剤ＣＴＡＢを除去して使用するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、ＣＴＡＢを含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰なＣＴＡＢを除去することができる。なお、ＣＴＡＢを過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。
【００４３】
〔表面処理〕
余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド（ＮＲｓ）水分散液と、有機物(Ａ、 ｍＰＥＧ−ＳＨ)と有機物(Ｂ、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＨ)を混合して攪拌すると、ｍＰＥＧ−ＳＨとｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＨがそれぞれのリンカー（チオール基）で金ナノロッドに結合し、溶媒に安定に分散し、ｃＲＧＤが導入された金ナノロッド（ｃＲＧＤ−ＮＲｓ）が得られる。金ナノロッドに未結合のｍＰＥＧ−ＳＨとＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＨは透析処理などで除去すればよい。
【００４４】
金ナノロッドに対するｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤの混合比は、適宜調整可能である。例えば、金１ｍｏｌに対し、ｍＰＥＧ−ＳＨが０．１ｍｏｌ、ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤが０．０１ｍｏｌとなるように混合すればよい。
【００４５】
〔金ナノロッドの集積〕
上記有機物(Ａ)と有機物(Ｂ)によって修飾されたｃＲＧＤ−ＮＲｓは、αｖβ3インテグリンによりｃＲＧＤペプチドが選択的に認識され特異的に結合するため、αｖβ3インテグリンが発現している部位で集積させることができる。
【００４６】
ｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液をαｖβ3インテグリンの発現している部位へ接触し、３７℃で２４時間以上インキュベートすることで、金ナノロッドの高い集積が得られる。インキュベートする時間が２４時間より短いと充分な金ナノロッドの集積が確認されない。
【００４７】
αｖβ3インテグリンの発現している量によっても金ナノロッドの集積量は変化する。αｖβ3インテグリンが発現している部位にｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液を接触した場合、αｖβ3インテグリンの発現量が多いと金ナノロッドの集積が確認され、αｖβ3インテグリンの発現量が少ないと金ナノロッドの集積が確認されない。
【００４８】
〔検出方法・治療方法等〕
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００ｎｍにＬＳＰＲの吸収ピークを有しており、金ナノロッドの集積はＬＳＰＲの吸収ピークを分光測定することで確認できる。例えば、金ナノロッドのＬＳＰＲの吸収ピークが９００ｎｍの場合、αｖβ3インテグリンの発現部位に一定量の金ナノロッドが集積すると、集積部位に９００ｎｍ付近のピークが分光特性として得られる。
【００４９】
この検出方法としては、金ナノロッドの吸収スペクトルの形状変化、吸光度の変化、散乱光強度の変化が挙げられる。特に波長８００nm〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態や凝集状態による分光特性の変化を測定することが可能であり、近赤外光分析システムやバイオイメージングシステム（特定酵素部位の画像処理化など）を構築することができる。
【００５０】
αｖβ3インテグリンの発現部位に集積させた金ナノロッドにＬＳＰＲに相当する光を照射すると、金ナノロッドの光熱変換機能により集積している部位周辺の温度が上昇する。特に、生体内で集積させた金ナノロッドに近赤外線を照射した場合、集積部位周辺の細胞（例えば腫瘍細胞）を発生した熱で死滅させることが可能であり、金ナノロッド集積部位をフォトサーマル治療用のターゲットマーカーとして使用することができる。
【００５１】
本発明の有機物で修飾した金ナノロッド（ｃＲＧＤ−ＮＲｓ）に薬物を担持させて、生体内に投与した場合、αｖβ3インテグリンの存在する特定部位で特異的に集積するため、薬物を効率よく輸送・放出することが可能である。例えば、αｖβ3インテグリンは腫瘍細胞で過剰発現しており、投与されたｃＲＧＤ−ＮＲｓは、腫瘍細胞部位のαｖβ3インテグリンにて認識され特異的に結合し、金ナノロッドが集積することにより、薬物を集中投与可能となるため、ｃＲＧＤ−ＮＲｓを薬物担持キャリアーとするＤＤＳが構築可能である。特に、金は生体に安全な材料であり、キャリアーとして有用である。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例は、金ナノロッドの主に９００ｎｍ付近の波長域におけるＬＳＰＲの吸収波長シフトを測定しているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２０００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。
【００５３】
〔ｃＲＧＤペプチドの合成〕
Ｆｍｏｃ固相合成法により、ＲＧＤのアミノ酸配列を含む環状ＲＧＤペプチドを合成した（分子量６０４；ｃｙｃｌｏ（−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−（アルギニン（Ａｒｇ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、リジン（Ｌｙｓ））。式１にｃＲＧＤの分子内環化反応を示す。反応終了後、エーテル沈殿を行い、逆相ＨＰＬＣにより精製して得られた。
【００５４】
〔ｃＲＧＤの合成スキーム〕
【化１】
【００５５】
〔金ナノロッド水分散液の調製〕
４００mMのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドは水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することにより余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドは水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド（ＣＴＡＢ−ＮＲｓ）水分散液を得た。吸光度から金ナノロッド水分散液中の金原子濃度を求めた。
【００５６】
〔有機物(Ａ)〕
有機物(Ａ)としては、ＰＥＧの重合平均分子量が約５０００であり、一方の末端がチオール基で、他方の末端はメトキシ基であるα−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＨ）を使用した。
【００５７】
〔有機物(Ｂ)の合成〕
有機物(Ｂ)としては、ＰＥＧの重合平均分子量が約１００００であり、一方の末端がチオール基で、他方の末端にｃＲＧＤである有機物を合成した。保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含む重合平均分子量１００００のＰＥＧ（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、ｃＲＧＤを混合して攪拌し、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳとｃＲＧＤのアミノ基をアミド結合して、ＰＥＧとｃＲＧＤを含む有機物（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）を合成した。Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを凍結乾燥し、トリフルオロ酢酸によりアミノ基の脱保護を行い（ＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）、得られたＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、アセトニトリルに溶解したＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと混合して攪拌し、脱保護したアミノ基とスクシンイミジル基を反応させ、２−ピリジル−ジスルフィド基を導入した（ＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ、式２）。得られたＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断し、ｃＲＧＤとチオール基を末端に有する有機物(Ｂ)を得た（ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）。
【００５８】
〔ＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤの合成スキーム〕
【化２】
【００５９】
金ナノロッド水分散液の分光特性は日本分光株式会社製品のＶ−６７０で測定した。ゼータ電位はMalverne社製測定器（Zeta-sizer Nano―ZS）を用いて測定した。
【００６０】
αｖβ3インテグリンはガラスボトムディッシュでＵ−８７ＭＧ（ヒトグリオブラストーマ：高αｖβ3インテグリン発現）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト乳がん細胞：中αｖβ3インテグリン発現）、そしてＭＣＦ−７（ヒト乳がん細胞：低αｖβ3インテグリン発現）をそれぞれ、５×１０4cell／ｍｌ播種し、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）を１０％と抗生物質を１％含む培地を与えて、３７℃で２４時間インキュベートして培養した。
【００６１】
標的物質とｃＲＧＤの特異的結合は、αｖβ3インテグリンを発現させたガラスボトムディッシュ（直径５０ｍｍ）に、ｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液を添加して行った。一定時間経過後、ＮＲｓ水分散液を除去して、ガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位について、マルチチャンネル分光器を用いて、露光時間１００ｍｓ、積算回数５０００回の条件で吸収スペクトルを測定した。なおベースラインは、５０％グリセリンで満たしたガラスボトムディッシュの底（ガラス）とした。
【００６２】
〔実施例１〕
ＣＴＡＢ−ＮＲｓ水分散液（金濃度１ｍＭ）１ｍｌに、金原子：ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ：ｍＰＥＧ−ＳＨ＝１：０．１：０．０１のモル比になるように、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを添加し、ボルテックスミキサーで２４時間攪拌した。攪拌終了後、透析処理によって金ナノロッドに未結合のｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを除去し、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤが結合した金ナノロッド（ｃＲＧＤ−ＮＲｓ）を得た。得られたｃＲＧＤ−ＮＲｓの分光特性を測定した結果、処理前の分光特性と大きな変化はなく、処理後も安定に分散可能であった（図１）。ｃＲＧＤ―ＮＲｓ水分散液のゼータ電位を測定したところ、処理前のゼータ電位は＋３８ｍＶであったが、処理後は−１．５ｍＶであり、ＣＴＡＢ由来の正電荷から、電荷をもたないｃＲＧＤやＰＥＧを構成部位とする有機物へ金ナノロッド表面が置換されたことが確認された。
【００６３】
〔実施例２〕
実施例１で得られたｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液（金濃度５ｍＭ）を、ＦＢＳと抗生物質を含むＤＭＥＭ（Dulbeccos Modified Eagles medium）で１０倍に希釈し、Ｕ−８７ＭＧを培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位に１ｍｌ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、ｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液を除去し、αｖβ3インテグリン発現部位をリン酸緩衝液で２回洗浄後、４％パラホルムアルデヒドを１ｍｌ添加し、室温で３０分間静置した。４％パラホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、５０％グリセリンで浸した。得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークが観察され、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓが特異的に結合したことが確認された（図２）。
【００６４】
〔比較例１〕
ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを添加しない以外は実施例１と同様に、ｍＰＥＧ−ＳＨのみが結合した金ナノロッド（ＰＥＧ−ＮＲｓ）を得た。得られたＰＥＧ−ＮＲｓを実施例２と同様にＵ−８７ＭＧを培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位に添加し、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されなかった（図３）。
【００６５】
〔比較例２〕
ＰＥＧ部位がなくチオール基を有するｃＲＧＤ（ＳＨ−ｃＲＧＤ）を用いて、ＣＴＡＢ−ＮＲｓ水分散液（金濃度１ｍＭ）１ｍｌに、金原子：ＳＨ−ｃＲＧＤ：ｍＰＥＧ−ＳＨ＝１：０．１：０．０１のモル比になるように、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ｃＲＧＤを添加し、ボルテックスミキサーで２４時間攪拌した。攪拌終了後、透析処理によって金ナノロッドに未結合のｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ｃＲＧＤを除去し、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ｃＲＧＤが結合した金ナノロッドを得た。得られた金ナノロッドを実施例２と同様にＵ−８７ＭＧを培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位に添加し、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されず、ｃＲＧＤ部位がＰＥＧ鎖に埋もれており、αｖβ3インテグリンにより認識されないことが確認された。
【００６６】
〔参考例１〕
３７℃で３時間インキュベートする以外は実施例２と同様に処理して、マルチチャンネル分光器で測定した。結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークが観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓが特異的に結合するための時間が不足していることが確認された（図４）。
【００６７】
〔参考例２〕
ＭＣＦ−７を培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位を用いる他は実施例２と同様に、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されなかった（図５）。
【００６８】
〔参考例３〕
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位を用いる他は実施例２と同様に、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されなかった（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】実施例１のＲＧＤ−ＮＲｓの分光特性（吸収スペクトル図）
【図２】実施例２のＵ−８７ＭＧの分光特性（吸収スペクトル図）
【図３】比較例１のＵ−８７ＭＧの分光特性（吸収スペクトル図）
【図４】参考例１のＵ−８７ＭＧの分光特性（吸収スペクトル図）
【図５】参考例２のＭＣＦ−７の分光特性（吸収スペクトル図）
【図６】参考例３のＭＤＡ−ＭＢ−４３５の分光特性（吸収スペクトル図）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微子（金ナノロッド）と、その製造方法と、その集積方法、およびその用途に関する。
【０００２】
本発明は、より具体的には、分散媒に相溶する部位を含み分子量の異なる２種の高分子で金ナノロッドを修飾して分散媒中で金ナノロッドを安定に分散するものであり、分子量の大きな高分子にペプチドを導入しておくことで、高分子中へのペプチド部位の埋没を防ぎ、ペプチドが標的物質から認識される確率を高めた金ナノロッドとその製造方法であり、標的物質に結合し金ナノロッドが集積することを利用した標的物質の検出方法と金ナノロッドの標的部位への集積方法、金ナノロッドが集積した部位のフォトサーマル治療やバイオイメージング、そして標的物質が存在する部位への薬物輸送方法として有用である。
【背景技術】
【０００３】
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：ＬＳＰＲ）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０ｎｍ程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは形状の変化や凝集状態変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献２、３、４）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。
【０００５】
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズの金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第四級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４）。
【０００６】
近年、金ナノロッドにアビジン−ビオチン、抗原−抗体などの相互作用による目的物質への特異的な吸着反応を利用した研究が報告されており、抗体を介してがん細胞に金ナノロッドを取り込ませることによって、金ナノロッドの二光子発光によるがん細胞のイメージングが可能であることが報告されている（非特許文献５）。
【０００７】
また、αｖβ3インテグリンに特異的に認識されるペプチドについて、環状ＲＧＤ（アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ））ペプチドが高い選択性を示すことが報告されている（非特許文献６、特許文献５、６、７、８、９、１０）。さらに、金微粒子、ＲＧＤペプチド、インテグリンの組成物が報告されている（特許文献１１）。
【０００８】
さらに、α−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコールを修飾した金ナノロッドをバイオマーカーとしてマウスに注入し、一定時間経過後に血中や各器官を分別採取しそれぞれの部位における金ナノロッドの濃度を測定することによって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾した金ナノロッドの血液中での分散安定性が報告されている（非特許文献７）。また、チオプロニン保護した金微粒子にＰＥＧ部位を有する分子鎖を介してＲＧＤ配列を含むＧＲＧＤＳＰペプチドを導入し、分子鎖の化学構造の違いによる細胞への結合挙動が報告されている（非特許文献８）。
【非特許文献１】S.Link,M.B.Mohamed,M.A.El-Sayed,J.Phys.Chem.B,103,p3073（1999）
【非特許文献２】K.Honda,Y.Niidome,N.Nakashima,H.Kawazumi,S.Yamada,Chem.Lett.,35,p854（2006）
【非特許文献３】Y.Niidome,H.Takahashi,S.Urakawa,K.Nishioka,S.Yamada,Chem.Lett.,33,p454（2004）
【非特許文献４】S.Link,M.A.El-Sayed,J.Phys.Chem.B,109,p10531（2005）
【非特許文献５】N.J.Durr,T.Larson,D.K.Smith,B.A.Korgel,K.Sokolov,A.Ben-Yakar,Nano Letters,7,p941（2007）
【非特許文献６】S.Oishi,YAKUGAKU ZASSHI,124,p269(2004)
【非特許文献７】T.Niidome,M.Yamagata,Y.Okamoto,Y.Akiyama,H.Takahashi,T.Kawano,Y.Katayama,Y.Niidome,J.Control.Release,114,p343(2006)
【非特許文献８】J.M.de la Fuente,C.C.Berry,M.O.Riehle,A.S.G.Curtis,Langmuir,22,p3286(2006)
【特許文献１】特開２００４−２９２６２７号公報
【特許文献２】特開２００５−９７７１８号公報
【特許文献３】特開２００６−１６９５４４号公報
【特許文献４】特開２００６−１１８０３６号公報
【特許文献５】特表２００８−５３１６７７号公報
【特許文献６】特表２００８−５０４２３５号公報
【特許文献７】特表２００６−５２８１６８号公報
【特許文献８】特表２００７−５３７２４３号公報
【特許文献９】特表２００５−５３２２５２号公報
【特許文献１０】特表２００１−５２６５７０号公報
【特許文献１１】ＷＯ２００５／０７３３８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１〜４などの方法で合成された金ナノロッドはＣＴＡＢに被覆された状態で水中に分散しているが、特定部位で集積する機能は有していない。
【００１０】
非特許文献５は、金ナノロッドをポリスチレンスルホネートで表面処理後に抗体と結合させているが、金ナノロッドの二光子発光を測定するための処理方法であり、金ナノロッドのＬＳＰＲをセンシング技術やバイオイメージングに応用したものではない。
【００１１】
非特許文献６と特許文献５〜１０は、αｖβ3インテグリンが特異的に環状ＲＧＤペプチドを認識することを報告したものであり、金微粒子の分散安定性を保持しつつ、環状ＲＧＤペプチドを修飾する方法は報告していない。また、金微粒子に修飾された環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンに認識されやすいよう設計する技術は報告していない。
【００１２】
非特許文献７は、ＰＥＧ修飾による金ナノロッドは血液中で分散安定性が高まることが報告されているが、ＰＥＧ鎖中に反応性の官能基がないため、他の化合物と反応させることはできない。
【００１３】
特許文献１１の組成物は、ＤＮＡなどの細胞への導入効率を上昇させるための組成物であって、金微粒子へＲＧＤペプチドを修飾する技術や、インテグリンとＲＧＤペプチドの特異的結合を金微粒子の集積に利用した技術を報告したものではない。
【００１４】
非特許文献８は、近赤外域における金微粒子のＬＳＰＲによるバイオイメージングを検討した技術ではない。また、金微粒子に修飾された環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンに認識されやすいよう設計する技術は報告されていない。
【００１５】
本発明は従来の上記技術では知られていない金ナノロッドの新規技術を提供する。具体的には、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ吸着するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）であって、ペプチドが標的物質によって高い確率で認識される金微粒子と、その製造方法、その集積方法、およびその用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子に関する。
〔１〕分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的物質と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子。
〔２〕有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量が、有機物(Ａ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量より２０００以上大きい上記[１]の金微粒子。
〔３〕分散媒に相溶する部位が水溶性高分子である上記[１]または上記[２]の金微粒子。
〔４〕有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである上記[１]〜上記[３]の何れかに記載する金微粒子。
〔５〕リンカーがチオール基であることを特徴であることをする上記[１]〜上記[４]に記載する金微粒子。
〔６〕標的物質に特異的に結合するペプチドが環状ＲＧＤペプチドである上記[１]〜上記[５]の何れかに記載する金微粒子。
〔７〕標的物質がインテグリンであることを特徴とする上記[６]に記載する金微粒子。
〔８〕インテグリンがαｖβ3インテグリンであることを特徴とする上記[７]に記載する金微粒子。
〔９〕環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンにより特異的に認識され、αｖβ3インテグリンの発現している特定部位に該金微粒子が集積することを特徴とする上記[１]〜上記[８]の何れかに記載する金微粒子。
〔１０〕長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である上記[１]〜上記[９]の何れかに記載する金微粒子。
【００１７】
また、本発明は、以下に示す構成を有する上記金微粒子の製造に関する。
〔１１〕分散媒に相溶する部位とペプチドを含む有機物を合成し、該有機物にリンカーを導入し、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)を合成する工程、該有機物(Ｂ)と、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に結合させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
〔１２〕保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含むポリエチレングリコールのＮＨＳと環状ＲＧＤペプチドのアミノ基を反応して、環状ＲＧＤペプチドとポリエチレングリコールを含む有機物を合成し、該有機物の脱保護したアミノ基と、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを反応して２−ピリジル−ジスルフィド基を導入し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断して得られた有機物(Ｂ)と、有機物(Ｂ)のポリエチレングリコールより重合平均分子量の小さなポリエチレングリコールを含む方末端がチオール基の有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に表面処理する上記[１１]に記載する表面修飾金微粒子の製造方法。
【００１８】
さらに本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子の集積方法、およびこれを利用した検出方法、治療方法などに関する。
〔１３〕上記[９]に記載する集積によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
〔１４〕上記[９]または上記[１３]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルで検出物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
〔１５〕上記[９]または上記[１３]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
〔１６〕上記[９]または上記[１３]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
〔１７〕上記[９]または上記[１３]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位を含む分子量の異なる２種の有機物(Ａ)(Ｂ)で修飾されており、ペプチドが導入されている有機物(Ｂ)の分子量を大きくすることによって、金微粒子の分散安定性を損なうことなく高分子中へのペプチド部位の埋没を防止できるため、標的物質に認識される確率を高めることができる。
【００２０】
本発明の金微粒子の製造方法は上記有機物(Ａ)(Ｂ)を金微粒子（金ナノロッド）に修飾する方法であり、金ナノロッドに結合するリンカーとして、例えば、末端にチオール基を有するものを用いることによって、チオール基末端から優先的に金ナノロッドに結合させることができる。
【００２１】
本発明の金微粒子に修飾されたペプチドは、標的物質から高い確率で認識され標的物質へ特異的に結合するため、標的物質が存在する部位へ集積することができる。
【００２２】
本発明の金微粒子は、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲の金ナノロッドを用いているので、集積によってＬＳＰＲの分光特性が変化することを利用して、ペプチドと特異的に結合する標的物質を検出することができる。
【００２３】
さらに、金ナノロッドは光熱変換機能を有するので、金ナノロッドを集積させた標的部位周辺組織へのフォトサーマル治療、バイオイメージング、そしてドラックデリバリーシステムの構築が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。
【００２５】
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物がリンカーで結合していることを特徴とする金微粒子である。
【００２６】
本発明の集積方法は、上記金ナノロッドを修飾している有機物に導入されたペプチドの標的物質への特異的結合を利用したものであり、ペプチドが標的物質に認識されると金ナノロッドが標的物質の存在する部位に集積することを利用したものである。
【００２７】
本発明の標的物質の検出方法は、上記金ナノロッドの集積方法を利用したものであり、金ナノロッドの集積によってＬＳＰＲの分光特性や散乱光強度が変化することを利用して標的物質を検出するものである。
【００２８】
本発明のフォトサーマル治療は、上記金ナノロッドがＬＰＳＲに相当する光を吸収して熱に変換する光熱変換機能を利用し、該金ナノロッドが集積している標的物質が存在する部位周辺の細胞（腫瘍細胞など）を発生した熱で死滅させるものである。本発明のＤＤＳは、上記金ナノロッドに薬物を担持させて生体内に投与し、標的物質が存在する部位で金ナノロッドが集積するのを利用して特定部位に薬物を集中投与するシステムである。
【００２９】
また、本発明のバイオイメージングは、上記金ナノロッドが集積している部位を金ナノロッドのＬＳＰＲを測定して画像化することによって確認するものである。なお、本発明における吸収スペクトルの変化とは、金ナノロッドの集積に伴うＬＳＰＲの最大吸収波長の吸光度の低下や吸収スペクトル形状の変化を意味する。また、本発明のＲＧＤとは、アミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ））をいう。
【００３０】
〔修飾有機物〕
本発明の金微粒子（金ナノロッド）は２種の有機物(Ａ)(Ｂ)によって修飾されたものである。有機物(Ａ)は、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する。有機物(Ｂ)は、分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有し、該有機物(Ｂ)の分散媒相溶部位の重量平均分子量は有機物(Ａ)の分散媒相溶部位の重量平均分子量より大きいものが用いられる。
【００３１】
分散媒に相溶する部位としては水溶性高分子を用いることができる。また、リンカーとしては、チオール基を用いることができる。ペプチドとしては、環状ＲＧＤペプチドを用いることができる。金ナノロッドとしては、長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲の金ナノロッドが使用できる。
【００３２】
金ナノロッドに結合させる上記有機物(Ａ)(Ｂ)において、分散媒に相溶する部位の水溶性高分子としては、水と相溶して金ナノロッドを分散媒中で安定に分散させることができるような水溶性高分子であれば制限なく使用でき、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セルロース、ポリアクリル酸などが挙げられる。以下では、ＰＥＧの例について説明する。
【００３３】
分散媒に相溶する部位に使用するＰＥＧとしては、重量平均分子量４００００以下のＰＥＧを使用することができる。ＰＥＧの重合平均分子量は１０００〜２００００のものが好ましい。重合平均分子量が１０００より小さいと分散媒中での分散安定性が不足し、一方、重合平均分子量が４００００より大きいと分散安定性に変化はなく、コスト的に不利である。
【００３４】
本発明の有機物(Ｂ)に用いるＰＥＧの重合平均分子量は、有機物(Ａ)に用いるＰＥＧよりも大きな重合平均分子量であることが適当である。ペプチドが導入されている有機物(Ｂ)に用いるＰＥＧの重合平均分子量の方が大きいため、ＰＥＧ鎖中にペプチド部位が埋没するのを防止することができ、ペプチドが標的物質により高い確率で認識され、特異的に結合することが可能となるため、標的物質が存在する特定部位へ効率よく金ナノロッドを集積させることができる。両有機物のＰＥＧの重合平均分子量の差は、少なくとも２０００以上が好ましい。重合平均分子量が２０００未満の場合、ペプチド部位がＰＥＧ中へ埋没する確立が高くなり、ペプチドが標的物質から認識され難い。
【００３５】
本発明の有機物(Ａ)の一方の末端は、金ナノロッドへ結合するリンカーを有しており、リンカーとしてはチオール基を使用できる。チオール基は金と共有結合を形成するので、有機物(Ａ)はチオール基末端から優先的に金ナノロッドに結合する。有機物(Ａ)の他方の末端は金と結合を起こさない化学構造であるメトキシ基が好ましい（ｍＰＥＧ−ＳＨ）。
【００３６】
本発明の有機物(Ｂ)の一方の末端は、標的物質から認識され特異的に結合するペプチドを有しており、他方の末端は金ナノロッドへ結合するリンカーを有しており、リンカーとしてはチオール基を使用できる。チオール基は金と共有結合を形成するので、有機物(Ｂ)はチオール基末端から優先的に金ナノロッドに結合する。
【００３７】
本発明の金ナノロッドに結合させる有機物(Ｂ)に使用するＲＧＤペプチドとしては、ＲＧＤ配列（アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ））を有するペプチドを使用できる。特に標的物質であるインテグリンはＲＧＤ配列を認識するため、ＲＧＤペプチドを修飾した金ナノロッドは、インテグリンが発現している部位で認識され、特異的結合が得られる。特に、αｖβ3インテグリンは環状構造を有するＲＧＤペプチドを強く認識するため、環状ＲＧＤペプチドを修飾した金ナノロッドはαｖβ3インテグリンが発現している部位（腫瘍細胞など）で高い集積効果が得られる。環状ＲＧＤペプチドは、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸を連続的に含む環状構造を有するペプチドであり、Ｆｍｏｃ固相合成法などによって合成することができる。
【００３８】
〔有機物(Ｂ)の合成〕
本発明の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金ナノロッドへ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)は、保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含むＰＥＧ（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を用いて合成できる。炭酸水素ナトリウム溶液に溶解したＢｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳと環状ＲＧＤペプチド（ｃＲＧＤ）を混合して攪拌すると、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳはｃＲＧＤのアミノ基とアミド結合を形成し、ＰＥＧとｃＲＧＤを含む有機物（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）が得られる。Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを凍結乾燥し、トリフルオロ酢酸によりアミノ基の脱保護を行い（ＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）、得られたＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、アセトニトリルに溶解したＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと混合して攪拌すると、脱保護したアミノ基とスクシンイミジル基が反応して、２−ピリジル−ジスルフィド基がアミド結合を介して導入される（ＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）。得られたＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断すると、ｃＲＧＤとチオール基を末端に有する有機物(Ｂ)が得られる（ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）。
【００３９】
本発明の金ナノロッドに結合させた有機物(Ｂ)に導入したｃＲＧＤは、標的物質であるαｖβ3インテグリンにより認識され、特異的に結合する。本発明の金ナノロッドは、αｖβ3インテグリンの他にもｃＲＧＤが認識され特異的結合を示す標的物質であれば、際限なく適用できる。
【００４０】
〔金ナノロッド〕
本発明で使用する金ナノロッド（ＮＲｓ）は、長軸の長さが４００nm未満であって、アスペクト比が１より大きいロッド形状の金微粒子が好ましい。具体的には、ＬＳＰＲの最大吸収波長が波長７００〜２０００ｎｍの範囲内にあるアスペクト比の金ナノロッドが適当である。また金ナノロッドの長軸長さは２００ｎｍ以下がより好ましい。長軸長さがこより長いと、金ナノロッドが沈降しやすくなる傾向があり、分散媒中での分散安定性が失われる。
【００４１】
金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イ
オンを還元することによって合成することができる。例えば、ｎ＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。この金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【００４２】
上記金ナノロッド水分散液は、水中に存在する余剰の界面活性剤ＣＴＡＢを除去して使用するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、ＣＴＡＢを含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰なＣＴＡＢを除去することができる。なお、ＣＴＡＢを過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。
【００４３】
〔表面処理〕
余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド（ＮＲｓ）水分散液と、有機物(Ａ、 ｍＰＥＧ−ＳＨ)と有機物(Ｂ、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＨ)を混合して攪拌すると、ｍＰＥＧ−ＳＨとｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＨがそれぞれのリンカー（チオール基）で金ナノロッドに結合し、溶媒に安定に分散し、ｃＲＧＤが導入された金ナノロッド（ｃＲＧＤ−ＮＲｓ）が得られる。金ナノロッドに未結合のｍＰＥＧ−ＳＨとＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＨは透析処理などで除去すればよい。
【００４４】
金ナノロッドに対するｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤの混合比は、適宜調整可能である。例えば、金１ｍｏｌに対し、ｍＰＥＧ−ＳＨが０．１ｍｏｌ、ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤが０．０１ｍｏｌとなるように混合すればよい。
【００４５】
〔金ナノロッドの集積〕
上記有機物(Ａ)と有機物(Ｂ)によって修飾されたｃＲＧＤ−ＮＲｓは、αｖβ3インテグリンによりｃＲＧＤペプチドが選択的に認識され特異的に結合するため、αｖβ3インテグリンが発現している部位で集積させることができる。
【００４６】
ｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液をαｖβ3インテグリンの発現している部位へ接触し、３７℃で２４時間以上インキュベートすることで、金ナノロッドの高い集積が得られる。インキュベートする時間が２４時間より短いと充分な金ナノロッドの集積が確認されない。
【００４７】
αｖβ3インテグリンの発現している量によっても金ナノロッドの集積量は変化する。αｖβ3インテグリンが発現している部位にｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液を接触した場合、αｖβ3インテグリンの発現量が多いと金ナノロッドの集積が確認され、αｖβ3インテグリンの発現量が少ないと金ナノロッドの集積が確認されない。
【００４８】
〔検出方法・治療方法等〕
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００ｎｍにＬＳＰＲの吸収ピークを有しており、金ナノロッドの集積はＬＳＰＲの吸収ピークを分光測定することで確認できる。例えば、金ナノロッドのＬＳＰＲの吸収ピークが９００ｎｍの場合、αｖβ3インテグリンの発現部位に一定量の金ナノロッドが集積すると、集積部位に９００ｎｍ付近のピークが分光特性として得られる。
【００４９】
この検出方法としては、金ナノロッドの吸収スペクトルの形状変化、吸光度の変化、散乱光強度の変化が挙げられる。特に波長８００nm〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態や凝集状態による分光特性の変化を測定することが可能であり、近赤外光分析システムやバイオイメージングシステム（特定酵素部位の画像処理化など）を構築することができる。
【００５０】
αｖβ3インテグリンの発現部位に集積させた金ナノロッドにＬＳＰＲに相当する光を照射すると、金ナノロッドの光熱変換機能により集積している部位周辺の温度が上昇する。特に、生体内で集積させた金ナノロッドに近赤外線を照射した場合、集積部位周辺の細胞（例えば腫瘍細胞）を発生した熱で死滅させることが可能であり、金ナノロッド集積部位をフォトサーマル治療用のターゲットマーカーとして使用することができる。
【００５１】
本発明の有機物で修飾した金ナノロッド（ｃＲＧＤ−ＮＲｓ）に薬物を担持させて、生体内に投与した場合、αｖβ3インテグリンの存在する特定部位で特異的に集積するため、薬物を効率よく輸送・放出することが可能である。例えば、αｖβ3インテグリンは腫瘍細胞で過剰発現しており、投与されたｃＲＧＤ−ＮＲｓは、腫瘍細胞部位のαｖβ3インテグリンにて認識され特異的に結合し、金ナノロッドが集積することにより、薬物を集中投与可能となるため、ｃＲＧＤ−ＮＲｓを薬物担持キャリアーとするＤＤＳが構築可能である。特に、金は生体に安全な材料であり、キャリアーとして有用である。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例は、金ナノロッドの主に９００ｎｍ付近の波長域におけるＬＳＰＲの吸収波長シフトを測定しているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２０００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。
【００５３】
〔ｃＲＧＤペプチドの合成〕
Ｆｍｏｃ固相合成法により、ＲＧＤのアミノ酸配列を含む環状ＲＧＤペプチドを合成した（分子量６０４；ｃｙｃｌｏ（−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−（アルギニン（Ａｒｇ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、リジン（Ｌｙｓ））。式１にｃＲＧＤの分子内環化反応を示す。反応終了後、エーテル沈殿を行い、逆相ＨＰＬＣにより精製して得られた。
【００５４】
〔ｃＲＧＤの合成スキーム〕
【化１】
【００５５】
〔金ナノロッド水分散液の調製〕
４００mMのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドは水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することにより余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドは水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド（ＣＴＡＢ−ＮＲｓ）水分散液を得た。吸光度から金ナノロッド水分散液中の金原子濃度を求めた。
【００５６】
〔有機物(Ａ)〕
有機物(Ａ)としては、ＰＥＧの重合平均分子量が約５０００であり、一方の末端がチオール基で、他方の末端はメトキシ基であるα−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＨ）を使用した。
【００５７】
〔有機物(Ｂ)の合成〕
有機物(Ｂ)としては、ＰＥＧの重合平均分子量が約１００００であり、一方の末端がチオール基で、他方の末端にｃＲＧＤである有機物を合成した。保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含む重合平均分子量１００００のＰＥＧ（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、ｃＲＧＤを混合して攪拌し、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳとｃＲＧＤのアミノ基をアミド結合して、ＰＥＧとｃＲＧＤを含む有機物（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）を合成した。Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを凍結乾燥し、トリフルオロ酢酸によりアミノ基の脱保護を行い（ＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）、得られたＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、アセトニトリルに溶解したＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと混合して攪拌し、脱保護したアミノ基とスクシンイミジル基を反応させ、２−ピリジル−ジスルフィド基を導入した（ＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ、式２）。得られたＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断し、ｃＲＧＤとチオール基を末端に有する有機物(Ｂ)を得た（ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）。
【００５８】
〔ＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤの合成スキーム〕
【化２】
【００５９】
金ナノロッド水分散液の分光特性は日本分光株式会社製品のＶ−６７０で測定した。ゼータ電位はMalverne社製測定器（Zeta-sizer Nano―ZS）を用いて測定した。
【００６０】
αｖβ3インテグリンはガラスボトムディッシュでＵ−８７ＭＧ（ヒトグリオブラストーマ：高αｖβ3インテグリン発現）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト乳がん細胞：中αｖβ3インテグリン発現）、そしてＭＣＦ−７（ヒト乳がん細胞：低αｖβ3インテグリン発現）をそれぞれ、５×１０4cell／ｍｌ播種し、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）を１０％と抗生物質を１％含む培地を与えて、３７℃で２４時間インキュベートして培養した。
【００６１】
標的物質とｃＲＧＤの特異的結合は、αｖβ3インテグリンを発現させたガラスボトムディッシュ（直径５０ｍｍ）に、ｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液を添加して行った。一定時間経過後、ＮＲｓ水分散液を除去して、ガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位について、マルチチャンネル分光器を用いて、露光時間１００ｍｓ、積算回数５０００回の条件で吸収スペクトルを測定した。なおベースラインは、５０％グリセリンで満たしたガラスボトムディッシュの底（ガラス）とした。
【００６２】
〔実施例１〕
ＣＴＡＢ−ＮＲｓ水分散液（金濃度１ｍＭ）１ｍｌに、金原子：ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ：ｍＰＥＧ−ＳＨ＝１：０．１：０．０１のモル比になるように、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを添加し、ボルテックスミキサーで２４時間攪拌した。攪拌終了後、透析処理によって金ナノロッドに未結合のｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを除去し、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤが結合した金ナノロッド（ｃＲＧＤ−ＮＲｓ）を得た。得られたｃＲＧＤ−ＮＲｓの分光特性を測定した結果、処理前の分光特性と大きな変化はなく、処理後も安定に分散可能であった（図１）。ｃＲＧＤ―ＮＲｓ水分散液のゼータ電位を測定したところ、処理前のゼータ電位は＋３８ｍＶであったが、処理後は−１．５ｍＶであり、ＣＴＡＢ由来の正電荷から、電荷をもたないｃＲＧＤやＰＥＧを構成部位とする有機物へ金ナノロッド表面が置換されたことが確認された。
【００６３】
〔実施例２〕
実施例１で得られたｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液（金濃度５ｍＭ）を、ＦＢＳと抗生物質を含むＤＭＥＭ（Dulbeccos Modified Eagles medium）で１０倍に希釈し、Ｕ−８７ＭＧを培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位に１ｍｌ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、ｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液を除去し、αｖβ3インテグリン発現部位をリン酸緩衝液で２回洗浄後、４％パラホルムアルデヒドを１ｍｌ添加し、室温で３０分間静置した。４％パラホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、５０％グリセリンで浸した。得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークが観察され、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓが特異的に結合したことが確認された（図２）。
【００６４】
〔比較例１〕
ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを添加しない以外は実施例１と同様に、ｍＰＥＧ−ＳＨのみが結合した金ナノロッド（ＰＥＧ−ＮＲｓ）を得た。得られたＰＥＧ−ＮＲｓを実施例２と同様にＵ−８７ＭＧを培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位に添加し、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されなかった（図３）。
【００６５】
〔比較例２〕
ＰＥＧ部位がなくチオール基を有するｃＲＧＤ（ＳＨ−ｃＲＧＤ）を用いて、ＣＴＡＢ−ＮＲｓ水分散液（金濃度１ｍＭ）１ｍｌに、金原子：ＳＨ−ｃＲＧＤ：ｍＰＥＧ−ＳＨ＝１：０．１：０．０１のモル比になるように、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ｃＲＧＤを添加し、ボルテックスミキサーで２４時間攪拌した。攪拌終了後、透析処理によって金ナノロッドに未結合のｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ｃＲＧＤを除去し、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ｃＲＧＤが結合した金ナノロッドを得た。得られた金ナノロッドを実施例２と同様にＵ−８７ＭＧを培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位に添加し、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されず、ｃＲＧＤ部位がＰＥＧ鎖に埋もれており、αｖβ3インテグリンにより認識されないことが確認された。
【００６６】
〔参考例１〕
３７℃で３時間インキュベートする以外は実施例２と同様に処理して、マルチチャンネル分光器で測定した。結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークが観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓが特異的に結合するための時間が不足していることが確認された（図４）。
【００６７】
〔参考例２〕
ＭＣＦ−７を培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位を用いる他は実施例２と同様に、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されなかった（図５）。
【００６８】
〔参考例３〕
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位を用いる他は実施例２と同様に、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されなかった（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】実施例１のＲＧＤ−ＮＲｓの分光特性（吸収スペクトル図）
【図２】実施例２のＵ−８７ＭＧの分光特性（吸収スペクトル図）
【図３】比較例１のＵ−８７ＭＧの分光特性（吸収スペクトル図）
【図４】参考例１のＵ−８７ＭＧの分光特性（吸収スペクトル図）
【図５】参考例２のＭＣＦ−７の分光特性（吸収スペクトル図）
【図６】参考例３のＭＤＡ−ＭＢ−４３５の分光特性（吸収スペクトル図）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的物質と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子。
【請求項２】
有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量が、有機物(Ａ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量より２０００以上大きい請求項１の金微粒子。
【請求項３】
分散媒に相溶する部位が水溶性高分子である請求項１または請求項２の金微粒子。
【請求項４】
有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである請求項１〜３の何れかに記載する金微粒子。
【請求項５】
リンカーがチオール基であることを特徴であることをする請求項１〜４に記載する金微粒子。
【請求項６】
標的物質に特異的に結合するペプチドが環状ＲＧＤペプチドである請求項１〜５の何れかに記載する金微粒子。
【請求項７】
標的物質がインテグリンであることを特徴とする請求項６に記載する金微粒子。
【請求項８】
インテグリンがαｖβ3インテグリンであることを特徴とする請求項７に記載する金微粒子。
【請求項９】
環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンにより特異的に認識され、αｖβ3インテグリンの発現している特定部位に該金微粒子が集積することを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載する金微粒子。
【請求項１０】
長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である請求項１〜９の何れかに記載する金微粒子。
【請求項１１】
分散媒に相溶する部位とペプチドを含む有機物を合成し、該有機物にリンカーを導入し、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)を合成する工程、該有機物(Ｂ)と、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に結合させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
【請求項１２】
保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含むポリエチレングリコールのＮＨＳと環状ＲＧＤペプチドのアミノ基を反応して、環状ＲＧＤペプチドとポリエチレングリコールを含む有機物を合成し、該有機物の脱保護したアミノ基と、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを反応して２−ピリジル−ジスルフィド基を導入し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断して得られた有機物(Ｂ)と、有機物(Ｂ)のポリエチレングリコールより重合平均分子量の小さなポリエチレングリコールを含む方末端がチオール基の有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に表面処理する請求項１１に記載する表面修飾金微粒子の製造方法。
【請求項１３】
請求項９に記載する集積によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
【請求項１４】
請求項９または請求項１３に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルで検出物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項１５】
請求項９または請求項１３に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
【請求項１６】
請求項９または請求項１３に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
【請求項１７】
請求項９または請求項１３に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
【請求項１】
分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的物質と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子。
【請求項２】
有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量が、有機物(Ａ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量より２０００以上大きい請求項１の金微粒子。
【請求項３】
分散媒に相溶する部位が水溶性高分子である請求項１または請求項２の金微粒子。
【請求項４】
有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである請求項１〜３の何れかに記載する金微粒子。
【請求項５】
リンカーがチオール基であることを特徴であることをする請求項１〜４に記載する金微粒子。
【請求項６】
標的物質に特異的に結合するペプチドが環状ＲＧＤペプチドである請求項１〜５の何れかに記載する金微粒子。
【請求項７】
標的物質がインテグリンであることを特徴とする請求項６に記載する金微粒子。
【請求項８】
インテグリンがαｖβ3インテグリンであることを特徴とする請求項７に記載する金微粒子。
【請求項９】
環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンにより特異的に認識され、αｖβ3インテグリンの発現している特定部位に該金微粒子が集積することを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載する金微粒子。
【請求項１０】
長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である請求項１〜９の何れかに記載する金微粒子。
【請求項１１】
分散媒に相溶する部位とペプチドを含む有機物を合成し、該有機物にリンカーを導入し、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)を合成する工程、該有機物(Ｂ)と、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に結合させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
【請求項１２】
保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含むポリエチレングリコールのＮＨＳと環状ＲＧＤペプチドのアミノ基を反応して、環状ＲＧＤペプチドとポリエチレングリコールを含む有機物を合成し、該有機物の脱保護したアミノ基と、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを反応して２−ピリジル−ジスルフィド基を導入し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断して得られた有機物(Ｂ)と、有機物(Ｂ)のポリエチレングリコールより重合平均分子量の小さなポリエチレングリコールを含む方末端がチオール基の有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に表面処理する請求項１１に記載する表面修飾金微粒子の製造方法。
【請求項１３】
請求項９に記載する集積によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
【請求項１４】
請求項９または請求項１３に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルで検出物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項１５】
請求項９または請求項１３に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
【請求項１６】
請求項９または請求項１３に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
【請求項１７】
請求項９または請求項１３に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−８３８０３（Ｐ２０１０−８３８０３Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５４６７５（Ｐ２００８−２５４６７５）
【出願日】平成２０年９月３０日（２００８．９．３０）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００３３２２）大日本塗料株式会社 (275)
【出願人】（０００００６２６４）三菱マテリアル株式会社 (4,417)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月３０日（２００８．９．３０）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００３３２２）大日本塗料株式会社 (275)
【出願人】（０００００６２６４）三菱マテリアル株式会社 (4,417)
【Ｆターム（参考）】
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