間葉幹細胞またはその培養液を含む神経疾患の予防または治療用の組成物
【要約書】
本発明は、間葉幹細胞、間葉幹細胞の培養液、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、神経疾患の予防または治療のための医薬組成物及びそのための方法を提供する。
本発明は、間葉幹細胞、間葉幹細胞の培養液、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、神経疾患の予防または治療のための医薬組成物及びそのための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉幹細胞、間葉幹細胞の培養液、間葉幹細胞の培養液に含まれた蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系刺激因子を含む、神経突起(neurites)の損傷に関連した、アルツハイマー病の予防または治療に関する。
また、本発明は、間葉幹細胞、間葉幹細胞の培養液、間葉幹細胞の培養液に含まれた蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系刺激因子を含む神経突起の損傷と関連した疾病の予防または治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、アミロイドベータ蛋白質の破壊的蓄積により脳細胞を破壊する脳疾患であって、主に老化と共に進み、言語障害及び認知障害をもたらす深刻な疾病である。アルツハイマー病は、段階別に進み、次第に記憶力、推理、判断力、言語、さらに非常に単純な業務能力までも破壊する。結局、感情の調節の喪失は、人間の生の破壊をもたらす。まだアルツハイマー病を根本的に治療する方法はなく、症状を緩和する薬物のみが臨床に使われている。しかし、患者にそれらの薬物の効果は制限的である。アルツハイマー病患者の半分程度が初期薬物治療から治癒されない。たとえ前記初期薬物治療が成功したとしても、症状の緩い緩和のみを示すだけである。したがって、 医療需要を満たす新たな治療法の開発が要求されており、アルツハイマー病の治療法の開発による経済的かつ社会的な効果は非常に大きいであろう。アルツハイマー病は、病気が進みつつ、脳の皮質と海馬体（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）とが消失すれば、再生が不可能であり、治療方法がほぼないものと知られている。
【０００３】
アルツハイマー病についての研究は、二つの蛋白質、すなわち、タウ（ｔａｕ）とアミロイド前駆体蛋白質（Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）に焦点が合わせられてきた（Ｓｔｕａｒｔ Ｍ．及びＭａｒｋ Ｐ．Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２巻 第４号、第３９２−３９３ページ、２００６）。それらは、アルツハイマー病にかかった患者の脳で非正常的な形態に蓄積される。タウは、過剰燐酸化され、ＡＰＰは、セクレターゼにより切断されてアミロイド・ベータ（Ａβ）を生成し、アミロイド・ベータは、脳内にアミロイドプラークとして凝集される。プラークが蓄積された脳領域は、典型的にシナプスの数が減少し、神経突起が損傷される。これは、アミロイド・ベータがシナプスと神経突起(neurite)とを損傷させるということを暗示する（Ｍａｒｋ Ｐ．Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ、第４３０号、第６３１−６３９ページ、２００４）。
【０００４】
アルツハイマー病の治療のために、病因メカニズムについての研究が活発に進められた。特に、アミロイドベータ蛋白質を生成するベータ・セクレターゼ及び／またはガンマ・セクレターゼの阻害剤を開発する研究、蓄積されたアミロイドベータ蛋白質を分解する蛋白質分解酵素についての研究、及びアセチルコリンの分解を担当するアセチルコリンエステラーゼの阻害剤を開発する研究が強力に進められている。また、アルツハイマー病が老化関連の慢性炎症性疾患であるため、炎症抑制剤を利用したアルツハイマー病の治療についての研究も進められている。
【０００５】
脳内のアミロイド・ベータの量は、その生成反応と除去反応との均衡により決定される。したがって、 除去作用が減少すれば、アミロイド・ベータの量が増加する。アミロイド・ベータを分解する活性を有する酵素であるネプリリシン（ＮＥＰ）の欠乏は、細胞外のアミロイドの蓄積を加速化させる（Ｋａｎａｅ ｌｉｊｉｍａ−Ａｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２８３号、第２７巻、第１９０６６−１９０７６ページ、２００８）。
【０００６】
神経細胞の細胞体から突出した神経突起の異常は、神経疾患と関連する。 前記神経疾患の例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん(epilepsy)、多発性硬化症(multiple sclerosis)及び躁病（ｍａｎｉａ）である。特に、てんかんの場合、人間の脳の海馬体の神経細胞死と神経膠症（ｇｌｉｏｓｉｓ）とによって生じる。細胞死による神経突起の切断が起こる。多発性硬化症は、脳に生じる慢性自家免疫疾患であって、やはりＮｏｇｏ Ａという神経突起の過成長の阻害蛋白質の異常により発病する。うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、Ｍ６ａという神経突起の過成長関連の蛋白質の異常により発病する脳疾患である。躁病の症状の緩和が、ラットで神経突起の過成長を促進する信号伝達経路を活性化した時、報告された。
【０００７】
間葉幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、及び筋肉細胞のような中胚葉性細胞(mesodermal lineage cells)、または神経細胞のような外胚葉性細胞(ectodermal lineage cells)に分化する能力を有する多分化能幹細胞(multipotent stem cell)である。最近、間葉幹細胞が脳で神経膠細胞に分化する潜在力を有しており、間葉幹細胞を神経細胞に分化させる試みがあった（韓国公開特許第１０−２００４−００１６７８５号公報、２００４．２．２５）。
【０００８】
間葉幹細胞のうち、骨髄由来の間葉幹細胞は、患者から得られる。前記骨髄由来の間葉幹細胞が自家移植される場合、免疫拒否反応 がないので、患者に臨床的に使用される。しかし、骨髄由来の間葉幹細胞の採取は、色々な段階の施術が要求されるため、骨髄寄贈は時間消費的であり、精神的及び肉体的に苦痛であり、高価である。しかし、臍帯血由来の間葉幹細胞は、臍帯から簡単に得られ、臍帯血の保管産業が活発に開発されており、供与者が臍帯血インフラストラクチャ(infrastructure)を通じて容易に発見されるため、間葉幹細胞が容易に得られる。 さらに、他家由来の臍帯血から得た間葉幹細胞の場合にも、移植後に免疫反応を起こさず、免疫学的安定性を有する。
【０００９】
本発明の明細書に引用される先行文献の内容は、いずれも本明細書に参照により導入される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００４−００１６７８５号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｔｕａｒｔ Ｍ．及びＭａｒｋ Ｐ．Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２巻 第４号、第３９２−３９３ページ、２００６
【非特許文献２】Ｍａｒｋ Ｐ．Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ、第４３０号、第６３１−６３９ページ、２００４
【非特許文献３】Ｋａｎａｅ ｌｉｊｉｍａ−Ａｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２８３号、第２７巻、第１９０６６−１９０７６ページ、２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来方法によれば、幹細胞を利用した神経疾患の治療のためには、幹細胞を神経細胞に分化させるステップが先決されるか、または幹細胞を神経細胞に分化させる物質を幹細胞と共に投与するステップが必要であった。
【００１３】
本発明の一つ以上の具体例は、幹細胞を神経細胞に分化させるステップを含まない神経疾患の細胞治療方法を含む。
【００１４】
本発明の一つ以上の具体例は、 幹細胞を含む神経疾患の予防及び治療のための組成物を含む。
【００１５】
本発明の一つ以上の具体例は、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性の抑制、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化抑制、神経突起の損傷抑制及び神経細胞及びミクログリア細胞(microglial cells)内のネプリリシンの発現誘導方法を含む。本発明の一つ以上の具体例は、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性の抑制、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化抑制、神経突起の損傷抑制及び神経細胞及びミクログリア細胞(microglial cells)内のネプリリシンの発現誘導のためのキットを含む
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、間葉幹細胞、その培養液または前記培養液中に含まれる蛋白質をアミロイドベータが処理されたまたは処理されない神経細胞またはミクログリア細胞と共同培養する場合、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化及び神経突起の損傷が抑制され、神経細胞またはミクログリア細胞内のネプリリシンの発現が誘導されること発見した。
【発明の効果】
【００１７】
間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を神経細胞またはミクログリア細胞と共同培養すれば、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性が抑制され、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化が抑制され、神経突起の損傷が抑制され、神経細胞またはミクログリア細胞内にネプリリシンの発現が誘導される。
【００１８】
本発明の間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を含む組成物は、神経疾患の予防または治療用の効果的な細胞治療組成物として使われる。
【００１９】
また、 間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を使用して、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性の抑制、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化抑制、神経突起の損傷抑制及び神経細胞内のネプリリシンの発現誘導方法及びこのためのキットを提供する。
本発明の前記した特徴、他の特徴及び利点は、添付された図面を参照して、本発明の具体例として詳細に記述することで、さらに明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アミロイド・ベータと２４時間処理または処理しない生きている神経細胞の光学顕微鏡イメージを表す。
【図２】アミロイド・ベータが処理された神経細胞をヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養するための共同培養システムを示す図面である。
【図３】アミロイド・ベータ（Ａβ４２）による神経細胞死滅に対するヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と神経細胞の共同培養の効果を表す蛍光染色の結果を表す。
【図４】Ａβ４２による神経細胞死滅に対するヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と神経細胞の共同培養の効果を説明する、死滅神経細胞の百分率で示したグラフである。
【図５】Ａβ４２による神経細胞死滅に対するヒト骨髄由来の間葉幹細胞と神経細胞 の共同培養の効果を表す蛍光染色の結果を表す。
【図６】抗ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕ抗体を利用して染色された神経細胞を表す。
【図７】Ａβ４２処理され、間葉幹細胞と共同培養され、 免疫蛍光染色を使用して染色された神経細胞を表す。
【図８】Ａβ４２処理され 、骨髄由来の間葉幹細胞または臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養された神経細胞中の、ネプリリシンの発現を表す。
【図９】Ａβ４２処理された神経細胞及びミクログリア細胞と間葉幹細胞とを共同培養された場合、 神経細胞及びミクログリア細胞中のネプリリシンの発現を表す。
【図１０】Ａβ４２処理され、間葉幹細胞から分泌される蛋白質と共同培養された、死んだ神経細胞の百分率 を示すグラフである。
【図１１】Ａβ４２及び間葉幹細胞から分泌された蛋白質と神経細胞の神経突起の長さを 示すグラフである。
【図１２】ミクログリア細胞とＵＣＢ−ＭＳＣとを共同培養した後、ＵＣＢ−ＭＳＣから分離された総ＲＮＡをテンプレートとして使用してＲＴ−ＰＣＲした結果を表す。
【図１３】ＩＬ−４の存在下で神経細胞及びミクログリア細胞を培養する場合、ＮＥＰ発現が増加することを示すウェスタンブロッティング結果を表す。
【図１４】Ｔｈｉｏ−Ｓ染色法を利用して染色された海馬体と皮質(cerebral cortex)とを含む脳組織中のアミロイドベータ蛋白質の沈着物 (plaque)のイメージを表す。
【図１５】図１４のイメージ中のアミロイド沈着物の総面積を示すグラフである。
【図１６】実験に使われたマウスの脳で生成されたアミロイドベータ蛋白質の変化を示す免疫ブロッティング結果を表す。
【図１７】正常及びアルツハイマー病を有するように形質転換されたマウスで、海馬体と皮質とを含む脳組織でＮＥＰ発現程度を示す図面である。
【図１８】Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）ソフトウェアを利用して測定した図１７のＮＥＰバンドの強度を示すグラフである。
【図１９】間葉幹細胞及びＩＬ−４が投与されたマウスで、海馬体及び皮質を含む脳組織でＮＥＰ発現程度を示す図面である。
【図２０】臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４が投与されたマウスのミクログリア細胞でＮＥＰ発現を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の具体例によれば、間葉幹細胞を神経細胞に分化させず、アミロイド・ベータにより損傷した神経細胞と共同培養すれば、間葉幹細胞と神経細胞との直接的な接触なしにアミロイド・ベータにより誘発される神経細胞の損傷が抑制または回復される。また、本発明の発明者らは、間葉幹細胞の培養液や前記培養液中に含まれた特定の蛋白質を神経細胞と培養しても、アミロイド・ベータによる神経細胞の損傷が抑制または回復されるということを発見した。
【００２２】
アミロイドベータ４２（Ａβ４２）１０μＭを２４時間神経細胞に処理（図１及び図３のＣｔ＋Ａβ）した場合と、処理していない細胞（図３のＣｔ）の場合とを比較する時、アミロイドベータを処理した場合、ほとんどの神経細胞が細胞死した。しかし、このように損傷した神経細胞をＵＣＢ（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ）−由来間葉幹細胞と共同培養すれば、神経細胞の死滅が阻害し、神経細胞の成熟が増加した（図３のＣｔ＋Ａβ＋ＭＳＣ及び図４）。前記のようなＵＣＢ−間葉幹細胞のアミロイド・ベータによる神経細胞の死滅抑制効果は、骨髄由来の間葉幹細胞でも観察される（図５の皮質/Ａβ/ＢＭ−ＭＳＣ）。Ａβ４２存在下で大脳皮質由来の神経細胞と間葉幹細胞とを２４時間同じ培地で共同培養しても、図３のＣｔ＋Ａβ＋ＭＳＣに示したような結果が得られた。これは、神経細胞をＭＳＣと共同培養する場合、Ａβ４２により損傷した神経細胞を復帰させ、Ａβ４２により神経細胞が予防できるということを表す。
【００２３】
また、 Ａβ４２により急激に燐酸化されるタウ蛋白質の燐酸化が、タウ蛋白質・ヒト臍帯血間葉幹細胞の共同培養により燐酸化が抑制される（図６）。
【００２４】
神経細胞の標識であるチューブリンβＩＩＩ及びＭＡＰ２に対する抗体を使用して 神経細胞を観察した結果、Ａβ４２を処理した神経細胞では毒性により、神経突起が損傷して切断され、神経細胞形態が凝縮された。しかし、前記神経細胞と臍帯血由来の間葉幹細胞とを共同培養すれば、神経細胞中の神経突起が維持され、神経細胞の分化成熟が促進される（図７）。
【００２５】
Ａβ４２を分解して除去する蛋白質であると知られたネプリリシン（ＮＥＰ）の発現を観察した結果、ＮＥＰの発現は、Ａβ４２で処理された神経細胞では減少した。しかし、前記神経細胞を臍帯血由来の間葉幹細胞を共同培養すれば、ＮＥＰの発現が蛋白質とｍＲＮＡとのレベルで増加する（図８のＡ）。図８のＢは、抗ＮＥＰ抗体を利用して染色された神経細胞を表す。前記神経細胞にＡβ４２を処理すれば、赤く染色された部分が顕著に減少して、ＮＥＰの発現が神経細胞で減ることを表す。しかし、神経細胞と間葉幹細胞とを共同培養すれば、ＮＥＰの発現が増加した。かかる実験結果は、臍帯血由来の間葉幹細胞だけでなく、骨髄由来の間葉幹細胞でも 観察された（図８のＣ）。したがって、Ａβ42で処理または処理されていない神経細胞を間葉幹細胞と共同培養する場合、前記神経細胞でＮＥＰの発現は、ｍＲＮＡレベルだけでなく、蛋白質レベルでも増加した。前記間葉幹細胞は、臍帯血由来の間葉幹細胞及び骨髄由来の間葉幹細胞を含む。
【００２６】
また、臍帯血由来の間葉幹細胞が神経細胞(neurons)だけでなく、脳の大食細胞(macrophage)と呼ばれ、脳に蓄積された毒性物質、例えば、アルツハイマー病のＡβを除去するものと知られたミクログリア細胞(microglial cells)でも、ＮＥＰの発現を誘導することを確認した（図９）。
【００２７】
間葉幹細胞と神経細胞とを直接的な接触なしに共同培養することで、前記効果が表れたので、間葉幹細胞で分泌される物質により前記効果が表れたものと判断される。間葉幹細胞を単独に培養する場合に発現されないか、またはほぼ発現されないが、神経細胞と間葉幹細胞とを共同培養する場合、間葉幹細胞で発現が増加した分泌された蛋白質を分析した。その結果、総１４個の蛋白質がＡβ４２により惹起された毒性の抑制と神経細胞分化成熟とに関与していることを確認した。１４個の蛋白質は、アクチビンＡ、ＰＦ４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ ４）、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）、グリピカン３、ＭＦＲＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＩＣＡＭ５（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５）、ＩＧＦＢＰ７（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｈｔ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ７）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ）、ＳＰＡＲＣＬ１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１（ｗｎｔ−１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）及びプログラニュリンである。間葉幹細胞の代わりに、それらの蛋白質をそれぞれ神経細胞にＡβ４２と共に処理した結果、神経細胞の細胞死が顕著に減少し、Ａβ４２のみを処理した神経細胞に比べて、神経突起の長さが顕著に増加した（図１０及び図１１）。かかる意味において、前記１４種の蛋白質は、さらに詳細に説明される 。
【００２８】
アクチビンＡは、インヒビンベータＡ（インヒビンβＡ：ＩＮＨＢＡ）とも知られている蛋白質のホモダイマーである。人間において、ＩＮＨＢＡは、ＩＮＨＢＡ遺伝子によりコーディングされるものと知られる。ＩＮＨＢＡはＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００２１８３（配列番号１）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００２９】
血小板因子４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ ４：ＰＦ４）は、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド４（C-X-C motif ligand 4: ＣＸＣＬ４）とも知られている、ＣＸＣケモカインファミリに属する小さいサイトカインである。人間ＰＦ４遺伝子は、染色体４番に位置する。ＰＦ４はＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００２６１０（配列番号２）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３０】
デコリンは、平均分子量が約９０ないし１約４０ｋＤａのプロテオグリカンである。デコリンは、小さいロイシンリッチプロテオグリカン（small leucine-rich proteoglycan:ＳＬＲＰ）ファミリに属し、コンドロイチン硫酸（chondrointin sulfate: ＣＳ）またはデルマタン硫酸（dermatan sulfate: ＤＳ）から構成されたグリコースアミノグリカン（glycosaminoglycan: ＧＡＧ）を有するロイシン反復(leucine repeats)を含む蛋白質コアを含む。デコリンはＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００１９１１（配列番号３）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３１】
ガレクチン３は、ＬＧＡＬ３（ｌｅｃｔｉｎ，ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ，ｓｏｌｕｂｌｅ ３）とも知られており、ベータ・ガラクトシドに結合するレクチンの一種である。ガレクチン３は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿９１９３０８（配列番号４）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３２】
成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ１５：ＧＤＦ１５）は、マクロファージ阻害サイトカイン１（macrophage inhibitory cytokine 1: ＭＩＣ１）とも知られている、傷組織及び疾病過程で炎症経路（inflammatory pathway）及び細胞死経路を調節する役割を行う形質転換成長因子ベータ(transforming growth factor beta)スーパーファミリに属する蛋白質である。ＧＤＦ１５は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００４８５５（配列番号５）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３３】
グリピカン３は、グリピカンファミリに属する蛋白質であり、ＧＰＣ３とも知られている。グリピカン３は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００４４７５（配列番号６）のアミノ酸配列を有するものでありうる。グリピカンは、へパラン硫酸プロテオグリカン(heparin sulfate proteoglycan)のファミリであり、グリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinositol: ＧＰＩ）に共有結合を通じて細胞の表面に付着される。
【００３４】
膜フリズル関連蛋白質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＦＲＰ）は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿１１３６２１（配列番号７）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３５】
細胞間付着分子５（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５：ＩＣＡＭ５）は、テレンセファリンとも知られたＩＣＡＭファミリの一員である。ＩＣＡＭは、タイプＩ経皮糖蛋白質(type 1 transmembrane glycoprotein)であり、２ないし９個の免疫グロブリン類似Ｃ２タイプドメイン(immunoglobulin pseudo C2 type domains)を含み、白血球付着ＬＦＡ−１(lymphocyte function-associated antigen-1)蛋白質に結合する。ＩＣＡＭ５は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００３２５０（配列番号８）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３６】
インシュリン類似成長因子結合蛋白質７（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ７：ＩＧＦＢＰ７）は、ＩＧＦ(insulin-like growth factor)に特異的に結合するＩＧＦＢＰファミリの一員である。ＩＧＦＢＰ７は、ＩＧＦＢＰ−ｒｐ１（ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１）とも知られている。ＩＧＦＢＰ７は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００１５４４（配列番号９）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３７】
血小板由来成長因子ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＡＡ：ＰＤＧＦ−ＡＡ）は、ＰＤＧＦの一員である。ＰＤＧＦ−ＡＡは、二つのＰＤＧＦＡとも知られているＰＤＧＦアルファポリペプチドを含むホモダイマー糖蛋白質である。ＰＤＧＦは、細胞成長及び分裂を調節する蛋白質である。ＰＤＧＦは、また、血管の形成に関与する。ＰＤＧＦＡは、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＸＰ＿００１１２６４４１（配列番号１０）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３８】
分泌された酸性システインリッチ蛋白質類似蛋白質１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ−ｌｉｋｅ１：ＳＰＡＲＣＬ１）は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００４６７５（配列番号１１）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３９】
トロンボスポンジン１（thrombospondin 1: ＴＳＰ１）は、ジスルファイド結合により連結されたホモトリマー蛋白質である。トロンボスポンジン１は、細胞と細胞、細胞とマトリックスとの相互作用を媒介する付着性の糖蛋白質である。トロンボスポンジン１は、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ラミニン及びタイプＶコラーゲンに結合しうる。トロンボスポンジン１は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００３２３７（配列番号１２）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００４０】
ＷＮＴ１誘導性信号伝達蛋白質１（ＷＮＴ１ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １：ＷＩＳＰ１）は、ＣＣＮ４とも知られており、ＷＩＳＰ蛋白質サブファミリの一員であり、結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）ファミリに属する。ＷＮＴ１は、多様な発生過程を媒介するシステインリッチ、グリコシル化された信号蛋白質の一員である。ＣＴＧＦファミリの構成員は、４個の保存されたシステインリッチドメイン:ＩＧＦ結合ドメイン、ｖＷＦタイプＣモジュール、トロンボスポンジンドメイン及びＣ−末端システインノット類似（ｋｎｏｔ−ｌｉｋｅ）ドメインにより特徴付けられる。ＷＩＳＰ１は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００３８７３（配列番号１３）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００４１】
プログラニュリン（ＰＧＮ）は、グラニュリンの前駆体である。プログラニュリンは、高度に保存された１２−システイングラニュリン／エピテリンモチーフの７．５反復(repeats)を有する単一の前駆体蛋白質であり、グラニュリン（granulin: ＧＲＮ）は、前記プログラニュリンからカットされて分泌された、グリコシル化されたペプチドのファミリである。プログラニュリンは、プロエピテリン及びＰＣ細胞由来成長因子ともいう。プログラニュリンは、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００１０１２４９７（配列番号１４）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００４２】
また、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下で、ミクログリア細胞及び神経細胞をそれぞれ培養する場合、ミクログリア細胞及び神経細胞でそれぞれＮＥＰの発現が増加することを確認した。また、アルツハイマー病を有するマウスにＵＣＢ−ＭＳＣまたはＩＬ−４を投与する場合、アミロイド蛋白質プラークが減少することを確認した。また、アルツハイマー病を有するマウスにＵＣＢ−ＭＳＣまたはＩＬ−４を投与する場合、海馬体及び／または皮質を含む脳組織でＮＥＰの発現が増加することを確認した。また、アルツハイマー病を有したマウスにＵＣＢ−ＭＳＣまたはＩＬ−４を投与する場合、脳組織のミクログリア細胞でＮＥＰの発現が増加することを確認した。
【００４３】
インターロイキン-4（ＩＬ−４）は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）のＴｈ２細胞への分化を誘導するサイトカインである。ＩＬ−４により活性化される場合、Ｔｈ２細胞は、さらにＩＬ−４を生産する。ＩＬ−４は、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿０００５８０（配列番号３０）またはＮＰ＿０６７２５８のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００４４】
前記１４個の蛋白質は、人間由来だけでなく、他の哺乳動物由来の蛋白質も含む。例えば、齧歯類を含む。前記齧歯類には、マウスまたはラットが含まれる。
【００４５】
最近、幹細胞を利用した組織再生の薬についての研究と共に、アルツハイマー病のような退行性脳疾患の治療の可能性が提起されたが、現在の利用可能な幹細胞の技術は、アルツハイマー病のように広範囲の脳記憶喪失に適用するのには十分ではない。しかし、 本発明者らは間葉幹細胞がアミロイドベータによる神経細胞毒性を減少させ、脳中にある神経幹細胞の分化及び増殖を促進させることを発見したしたがって、アルツハイマー病及びその他の神経疾患の治療用細胞組成物(cellular preparation)の開発に希望を持たせた。また、間葉幹細胞が分泌する複数の蛋白質がアルツハイマー病のような神経疾患の治療効果を有しており、前記疾患の予防及び治療において可能性を高めることを発見した。
【００４６】
本発明は、間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中に含まれた蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を含む神経疾患の予防及び治療のための医薬組成物を提供する。前記神経疾患は、神経突起の損傷により引き起こされる神経疾患でありうる。前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症、躁病及びそれらの組み合わせありうる。
【００４７】
神経心理検査を通じて軽度認知障害(mild cognitive impairment)を表す痴呆前段階症状(pre-dementia syndrome) 経心理検査を通じて診断される。１年間軽度認知障害を有した患者のdir１２％がアルツハイマー病に進展するという報告がある。驚いたことに、軽度認知障害を有した患者がそのまま６年間放置されれば、約８０％がアルツハイマー病に進展される。したがって、軽度認知障害と診断された患者に本発明の医薬組成物を投与すれば、アルツハイマー病への進行が防止されるか、遅延される。
【００４８】
また、本発明は、間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を利用して、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でアミロイドベータによる神経細胞毒性の抑制、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化抑制、神経突起の損傷抑制及び神経細胞内のネプリリシンの発現誘導方法及びこのためのキットを提供する。前記キットは、神経細胞のの培養のために必要な成分をさらに含んでもよい。
【００４９】
本発明の間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を含む医薬組成物は、さらにアルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症、躁病などの予防または治療効果のある他の活性成分と共に投与できる。
【００５０】
前記医薬組成物は、有効成分以外に薬学的に許容される添加剤をさらに含み、薬学的分野で通常の方法によって、患者の身体内の投与に適した単位投与型の製剤に剤形化させることができる。かかる目的のために、 注射剤または局所投与用製剤のような非経口投与(parenteral administration)製剤が使われる。例えば、必要に応じて、水あるいはその他の薬剤学的に許容できる溶媒を使用した無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤のような非経口投与のための剤形が使われる。単位投与剤形(unit dosage formulation)は、例えば、薬剤学的に許容される担体あるいは媒体、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビークル(vehicle)、防腐剤及び合剤を使用して製造される。
【００５１】
前記製剤は、通常の方法によって非経口的に投与される。前記非経口投与は、局部的または全身的投与を含む。前記局部的投与は、直接的に病変またはその周辺に投与すること、例えば、病変である脳または脊髄、その周辺またはその反対側部位に直接投与するのでありうる。前記全身的投与は、脊髄液、静脈または動脈に投与することを含む。前記脊髄液は、脳脊髓液を含む。前記動脈は、病変に血液を供給する部位でありうる。また、前記投与は、例えば、Ｄｏｕｇｌａｓ Ｋｏｎｄｚｉｏｌｋａ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５５，ｐｐ．５６５−５６９，２０００に記載された方法によって行われる。すなわち、まず、対象の頭蓋骨を約直径１ｃｍの孔を設けるように切開した後、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ′ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と混合された間葉幹細胞懸濁液を 注入するこの時、細胞懸濁液の注入は、長針のついた注射器と、脳の内部に目的とする細胞溶液を正位置に挿入するための枠(stereotactic frame)とを利用して行われる。
【００５２】
前記間葉幹細胞の１日投与量は、１×１０４ないし１×１０７細胞／ｋｇ体重、例えば、５×１０５ないし５×１０６細胞／ｋｇ体重でありうる。投与回数は、１回または数回に分けて投与できる。しかし、本発明の間葉幹細胞、例えば、臍帯血由来の間葉幹細胞の実際投与量は、疾患のタイプ、疾患の重症度、選択された投与経路、患者の体重、年齢及び性別などの色々な関連因子を考慮して 決定されるべきであるものと理解される。
【００５３】
本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００５４】
前記方法において、投与は、局部または全身投与でありうる。前記投与は、前記疾患を予防または治療するための有効量を投与するものでありうる。かかる有効な量は、前記疾患の条件によって変わりうるということは当業者に自明である。
【００５５】
前記方法に使われた前記医薬組成物は、前記した 前記組成物と同じである。前記方法において、前記医薬組成物に含まれた前記間葉幹細胞は、患者本人から採取されたもの(autologous cells)だけでなく、他人または他の医療用の動物由来の細胞(allogeneic cells)から採集される。細胞は、冷凍保存したものであってもよい。本発明の治療方法は、 人間に限定されない。通常、間葉幹細胞は、人間以外の哺乳動物においてもされる。
【００５６】
前記方法において、前記神経疾患は、アミロイドベータ、タウ蛋白質の過燐酸化、ネプリリシンの過少発現及び神経突起の損傷からなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患でありうる。前記神経疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病から構成された群から選択されるものでありうる。
【００５７】
本明細書において、アミロイドベータ（Ａβ）とは、アルツハイマー病を有した患者の脳に存在するアミロイドプラークの主要成分を意味する。前記アミロイドベータ（Ａβ）は、膜通過糖蛋白質であるアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）のＣ−末端から由来したアミノ酸を含むペプチドでありうる。前記Ａβは、ＡＰＰからβ−及びγ−セクレターゼの連続作用により生成される。 例えば、前記Ａβは、３９ないし４３個、例えば、４０ないし４２個のアミノ酸を含む。前記Ａβは人間アミロイドA4蛋白質イソフォーム前駆体（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ Ａ４ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ: ＡＰＰ）のＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿０００４７５（配列番号１９）のアミノ酸配列の６７２−７１３残基（Ａβ４２）または６７２−７１１残基（Ａβ４０）を含む。前記アミロイドベータ（Ａβ）は、哺乳動物由来のものでありうる。例えば、人間またはマウス由来のものでありうる。本明細書において、“タウ蛋白質”とは、中枢神経系の神経細胞で発見された微小管関連蛋白質(microtubule-associated protein: MAP)を表す。タウ蛋白質は、チューブリンと相互作用して微小管を安定化させ、微小管のチューブリンアセンブリを促進する。脳組織には、６個の相異なるタウイソフォームを含むものと知られている。タウ蛋白質の過燐酸化は、アルツハイマー病の発生と関連したものと知られている。タウ蛋白質は、高い溶解性を有する微小管関連蛋白質である。人間では、タウ蛋白質は、非神経細胞に比べて主に神経細胞に存在する。タウ蛋白質の機能のうち一つは、軸索微小管(axonal microtubule)の安定化を調節するものである。タウ蛋白質は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００５９０１（配列番号２０）のアミノ酸配列を有する微小管関連蛋白質タウイソフォーム２でありうる。前記タウ蛋白質は、哺乳動物由来のものでありうる。例えば、人間またはマウス由来のものでありうる。
【００５８】
本明細書において、ネプリリシンは、多くの小さい分泌されたペプチドを分解する亜鉛依存性のメタロプロテアーゼ酵素である。ネプリリシンはアミロイドベタが神経組織において非正常的にミスフォールディング及び凝集される場合、アルツハイマー病を引き起こすアミロイドベータペプチドを分解する。ネプリリシンは、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿０００８９３（配列番号２１）のアミノ酸配列を有しうる。前記ネプリリシンは、哺乳動物由来のものでありうる。例えば、人間またはマウス由来のものでありうる。
【００５９】
また、本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法を提供する。
【００６０】
前記方法において、 神経細胞のような神経組織は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）培養される。前記試験管内培養は、当業界に知られた間葉幹細胞及び／または神経細胞の培養培地で行われる。 前記間葉幹細胞と神経細胞のような神経組織とが互いに直接的な接触があるか、またはない状態で培養するものでありうる。例えば、 前記間葉幹細胞と神経細胞のような神経組織とがポアを有する膜により隔離された状態で培養されるものでありうる。前記膜は、前記間葉幹細胞の培養液中の生理活性物質が透過でき、細胞は透過できないポアサイズ及び配置を有するものでありうる。前記生理活性物質は、例えば、蛋白質、糖及び核酸でありうる。 前記膜は、前記膜の上部には、前記間葉幹細胞を培養し、膜の下部には、前記神経細胞を培養して、重力により前記生理活性物質が膜を透過して下部に移動できるように配置される。
【００６１】
前記生体内培養は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を個体に投与するステップをさらに含む。前記投与は、局部または全身投与でありうる。前記投与は、前記プラークの量を減少させるための有効量を投与するものでありうる。かかる有効な量は、選択される疾患の条件によって当業者が容易に選択できる。前記個体は、哺乳動物を含む。前記哺乳動物は、人間、マウスまたはラットを含む。
【００６２】
神経組織中のアミロイドプラークの前記減少は、間葉幹細胞及びその培養液の不在下で神経細胞のような神経組織を培養したものに比べて、神経組織内のアミロイドプラークの量を減少させるものでありうる。
【００６３】
本明細書において、“アミロイドプラーク(amyloid plaque)”とは、アミロイドベータを含む不溶性繊維蛋白質凝集体でありうる。前記アミロイドプラークは、細胞内、細胞膜上に及び細胞間の空間に存在しうる。
【００６４】
本明細書に使われた前記”神経組織(neural tissues)”は、中枢神経系、例えば、脳組織を含む。前記脳組織は、 大脳組織(cerebral tissues)と海馬体とを含む。前記大脳組織は、大脳皮質(cerebral cortex)を含む。前記神経組織は、神経細胞(neural cells)だけでなく、神経組織自体を含む。前記神経細胞は、神経細胞(neuronal cells)及び／またはミクログリア細胞を含む。前記神経組織を培養することは、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で神経細胞(neuronal cells)及び/またはミクログリア細胞のような神経細胞(neural cells)を培養することを含む。
【００６５】
また、本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、 神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法を提供する。
【００６６】
前記培養は、神経細胞内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。
【００６７】
神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の前記減少は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養したものに比べて、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の量を減少させるものでありうる。
【００６８】
また、本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養するステップを含む、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させる方法を提供する。
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現の前記増加は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養したものに比べて、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させるものでありうる。
【００６９】
また、本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、神経細胞の神経突起成長を増加させる方法を提供する。
【００７０】
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。前記神経細胞は、正常神経細胞または 損傷した、例えば、Ａβにより誘導された損傷した、神経突起を有している神経細胞 でありうる。神経細胞の神経突起成長の前記増加は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養するものに比べて、神経細胞の神経突起成長を増加させるものでありうる。
【００７１】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００７２】
前記方法において、投与は、局部または全身投与でありうる。前記投与は、前記疾患を予防または治療するための有効量を投与するものでありうる。有効な量は、前記疾患の条件によって変わりうるということは当業者に自明である。
【００７３】
前記方法に使われた前記医薬組成物は、前記した 説明した通りである。
【００７４】
前記方法において、前記神経疾患は、アミロイドベータ、タウ蛋白質の過燐酸化、ネプリリシンの過少発現及び神経突起損傷からなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患でありうる。前記神経疾患は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病ありうる。
【００７５】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の存在下で神経組織を培養するステップを含む、 神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法を提供する。
【００７６】
前記方法において、神経細胞のような前記神経組織は、 試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で培養される。前記生体内培養は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上を個体に投与するステップをさらに含む。前記投与は、局部または全身投与でありうる。前記投与は、前記プラークの量を減少させるための有効量を投与するものでありうる。有効な量は、前記疾患の条件によって変わりうるということは当業者に自明である。例えば, アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つそれぞれは、約1ng/kg体重ないし約100mg/kg体重、例えば、約10ng/kg体重ないし約50mg/kg体重の量で投与される。 投与される形態は、水、培地、バッファまたは賦形剤のような添加剤をさらに含む。前記個体は、その神経組織からアミロイドプラークを減少させる必要がある任意の動物でありうる。前記動物は、哺乳動物を含む。前記哺乳動物は、人間、マウスまたはラットを含む。
【００７７】
前記アミロイドプラークは、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養するものに比べて、 その存在下で神経細胞を培養する場合に減少する。
【００７８】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法を提供する。
【００７９】
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の前記減少は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養するものに比べて、その存在下で神経細胞を培養する場合に減少する。
【００８０】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養するステップを含む、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させる方法を提供する。
【００８１】
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養するものに比べて、その存在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養する場合に増加する。
【００８２】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、神経細胞の神経突起成長を増加させる方法を提供する。
【００８３】
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。前記神経細胞は、正常神経細胞または損傷した神経突起、例えば、Ａβにより誘導された損傷した神経突起を有している神経細胞でありうる。神経細胞の神経突起の前記成長は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養するものに比べて、その存在下で神経細胞を培養する場合に増加する。
【００８４】
本明細書で使われる“間葉幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)”は、哺乳動物、例えば、人間, 胚嚢(human embryonic yolk sac)、胎盤(placenta)、臍帯(umbilical cord)、臍帯血(umbilical cord blood)、皮膚(skin)、末梢血液(peripheral blod)、骨髄(bone marrow)、脂肪組織(adipose tissue)、筋肉(muscle)、肝臓(liver)、神経組織(neural tissue)、骨膜(periosteum)、胎児膜(fetal membrane)、滑液膜(synovial membrane)、滑液(synovial fluid)、羊膜(amniotic membrane)、半月状軟骨(meniscus)、前十字靭帯(anterior cruciate ligament)、関節軟骨細胞(articular chondrocytes)、乳歯(deciduous teeth)、血管周囲細胞(pericyte)、支柱骨（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）、膝蓋骨下脂肪塊(infra patellar fat pad)、脾臓(speen)、胸腺(thymus)及びその他の間葉幹細胞を含む組織からなる群から選択された一つ以上から分離された間葉幹細胞 または前記分離された間葉幹細胞培養させて増殖された間葉幹細胞でありうる。
【００８５】
本明細書で使われる“臍帯血(umbilical cord blood)”は、人間を含む哺乳動物で、胎盤と胎児とを連結する臍帯静脈から採取された血液を表す。本明細書で使われる“臍帯血由来の間葉幹細胞(umbilical cord blood-derived MSC)”は、哺乳動物、例えば、人間の臍帯血から分離された間葉幹細胞及び前記分離された臍帯血由来の間葉幹細胞を培養して増殖された間葉幹細胞を意味する。
【００８６】
本明細書で使われた用語“治療(treating)”は、まだ疾患または障害 を保有していると診断されていないが、かかる傾向がある動物、例えば、人間を含む哺乳動物の疾病または障害が発生することの予防；疾患の進展の抑制；及び疾患の軽減を意味する。
【００８７】
本明細書で取り立てて定義されていない用語は、本発明が属する技術分野で通常的に使われる意味を有する。
【００８８】
臍帯血から間葉幹細胞を含む単核細胞を分離するためには、あらゆる公知の方法,例えば、 韓国登録特許第４８９２４８号に記載された方法が 使用される。例えば、フィコール・ハイパック密度勾配分離法(Ficoll-Hypaque density gradient method)が使用されるが、これに制限されない。具体的に、分娩後に胎盤が剥離される前に、臍静脈(umbilical cord vein)から採取した臍帯血をフィコール・ハイパック勾配で遠心分離して単核細胞を収得した。前記 単核細胞を数回洗浄して不純物を除去する。このように分離された単核細胞は、間葉幹細胞の分離及び培養に利用するか、または超低温冷凍させて長期間保管後に使用できる。
【００８９】
任意の知られた方法が前記臍帯血から間葉幹細胞を分離・培養するために使われる(韓国公開特許第２００３−００６９１１５号公報及びＰｉｔｔｉｎｇｅｒ ＭＦら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１４３−７，１９９９；及びＬａｚａｒｕｓ ＨＭら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１６：５５７−６４，１９９５）。
【００９０】
まず、採取された臍帯血を、フィコール・ハイパック濃度勾配を利用して遠心分離することで、造血母細胞(hematopoietic stem cell)及び間葉幹細胞を含む単核細胞を分離した後、数回洗浄して異物を除去する。適切な密度で単核細胞を培養容器で培養する。次に、前記単核細胞を増殖させて単一層を形成する。前記単核細胞のうち、位相差顕微鏡で観察される形態が同質性であり、かつ紡錘状(spindle-shaped)の長い形態の細胞の集落（ｃｏｌｏｎｙ）形態に増殖する細胞が間葉幹細胞である。前記成長された細胞を反復的にサブ培養して、必要なほどの細胞数を得る。
【００９１】
本発明の組成物に含まれる細胞は 公知の方法によって冷凍保管される （Ｃａｍｐｏｓら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３５：９２１−９２４，１９９５）。冷凍時に使われる培地は、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）, 及び１０ないし２０％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）,ヒト末梢血液または臍帯血の血漿または血清のうち一つを含む。前記細胞は、培地１ｍＬに約１×１０６ないし５×１０６個の細胞が存在するように懸濁できる。
【００９２】
前記細胞懸濁液を低温冷凍用のガラスまたはプラスチック材質のアンプルに分配し、それを密封して、予め温度条件が整えられたプログラム冷凍器に入れる。 したがって、例えば、−１℃／分で冷凍速度を調節する冷凍プログラムを利用して解凍間の細胞の損傷を最小化させる。一旦アンプルの温度が−９０℃以下に達すれば、液体窒素タンク中に移動させて−１５０℃以下に維持させる。
【００９３】
前記細胞を解凍するために、前記アンプルを液体窒素保存タンクから速かに３７℃水槽に移動させる。アンプル内に解凍された細胞は、滅菌状態下で培養培地が入っている培養容器に 速く移動させる。
【００９４】
本発明において、間葉幹細胞の分離・培養に使用される培養培地は、１０％ないし３０％のＦＢＳ,ヒト末梢血液または臍帯血の血漿または血清を含む当業界によく知られた任意の一般的な細胞培養用の培地でありうる。例えば、前記培養培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）,α−ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙｓ ５Ａ培地、イーグルス基本培地（ｅａｇｌｅ′ｓ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、ＣＭＲＬ（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）培地、Ｇｌａｓｇｏｗ最小必須培地、Ｈａｍ′ｓ Ｆ−１２培地、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ）、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ′ Ｌ−１５培地、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地であり、例えば、ＤＭＥＭでありうる。前記細胞は、前記培地１ｍＬ当たり約５×１０３ないし２×１０４個の細胞が存在するように 懸濁される。
【００９５】
また、本発明の前記細胞培養用の培地は、 一つ以上の補助成分を さらに含む。前記補助成分は、胎児牛 血清 、馬 血清 または人間 血清;及び微生物の汚染を防止するためのペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン(streptomycin sulfate)及びゲンタマイシン(gentamycin)のような抗生物質;アンホテリシンＢ(amphotericin B)及びナイスタチン(nystatin)のような抗真菌剤;及びそれらの混合物でありうる。
【００９６】
臍帯血由来の間葉幹細胞は、組織や器官(organ)の移植で拒否反応を起こす最も重要な原因である組織適合抗原ＨＬＡ−ＤＲ（ｃｌａｓｓ ＩＩ）を発現しない（Ｌｅ Ｂｌａｎｃ，ＫＣ，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，３１：８９０−８９６，２００３；及びＴｓｅ ＷＴら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７５：３８９−３９７，２００３）。移植後の免疫反応、例えば、移植された組織または器官の拒否を最小化できるため、自家由来の臍帯血及び他家由来の臍帯血が使われる。冷凍された細胞も使われる。
【００９７】
本発明の間葉幹細胞の培養液は、哺乳動物、例えば、人間の骨髄由来の間葉幹細胞、臍帯血由来の間葉幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞、胚嚢(embryonic yolk sac)由来の間葉幹細胞、胎盤由来の間葉幹細胞、皮膚由来の間葉幹細胞、末梢血液由来の間葉幹細胞、筋肉由来の間葉幹細胞、肝臓由来の間葉幹細胞、神経組織由来の間葉幹細胞、骨膜由来の間葉幹細胞、臍帯由来の間葉幹細胞、胎児膜由来の間葉幹細胞、滑液膜由来の間葉幹細胞、滑液由来の間葉幹細胞、羊膜由来の間葉幹細胞、半月状軟骨由来の間葉幹細胞、前十字靭帯由来の間葉幹細胞、関節軟骨細胞由来の間葉幹細胞、乳歯由来の間葉幹細胞、血管周囲細胞由来の間葉幹細胞、支柱骨由来の間葉幹細胞、膝蓋骨下脂肪塊由来の間葉幹細胞、脾臓由来の間葉幹細胞、胸腺由来の間葉幹細胞、及び間葉幹細胞が存在するその他の組織から分離及び／または培養された間葉幹細胞 を培養するために使われた培養溶液でありうる。
【００９８】
前記培養培地は、例えば、ＦＢＳまたはヒト末梢血液または臍帯血の血漿または血清を含む細胞培養用の培地でありうる。前記細胞培養用の培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ,α−ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙｓ ５Ａ培地、イーグルス基本培地(Eagle‘s basal medium)、ＣＭＲＬ培地、Ｇｌａｓｇｏｗ最小必須培地、Ｈａｍ′ｓ Ｆ−１２培地、ＩＭＤＭ(Iscove‘s modified Dulbecco‘s medium)、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ′ Ｌ−１５培地、及びＲＰＭＩ １６４０培地を含むが、これらに制限されるものではない。
【００９９】
本発明の間葉幹細胞の培養液は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン, IL-4またはそれらのうち一つ以上の発現を誘導する因子から構成された群から選択された一つ以上を含む。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、及びプログラニュリン、IL-4, または前記蛋白質のうち一つ以上を誘導する因子から構成された群から選択された一つ以上を活性成分として含む。
【０１０１】
前記蛋白質のうち一つ以上を誘導する前記因子は、信号伝達体系の刺激因子及び任意の知られた因子ありうる。前記因子は。前記因子は次の例でありうるが、これらに制限されるものではない。ガレクチン３を誘導する因子はホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（phorbol 12-myristate 13-acetate: ＰＭＡ）及び変形されたリポ蛋白質から構成された群から選択された一つ以上を含む。前記ＰＭＡまたは前記リポ蛋白質は、蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、ミトーゲン活性化された蛋白質キナーゼ１，２（ＭＡＰＫ−１，２）及びｐ３８キナーゼを経由して、ガレクチン３を誘導するものと知られている。ＰＤＧＦ−ＡＡを誘導する因子は、Ｅｔｓ−１（ａｖｉａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｅ２６（ｖ ｅｔｓ） ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）及びリソホスファチジルコリンからなる群から選択された一つ以上を含む。リソホスファチジルコリンは、ＭＡＰＫ−１，２を経由してＰＤＧＦ−ＡＡを誘導するものと知られている。
【０１０２】
あらゆる引用文献は、参照として本明細書にそれ全体として含まれる。
【実施例】
【０１０３】
本発明を下記実施例を参照して、さらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明を例示するだけであり、本発明の範囲が下記実施例により限定されるものではない。
【０１０４】
実施例
実施例１：神経幹細胞の分離及び培養
本発明の実験に使われた神経幹細胞は、次のように分離した。 神経幹細胞は、胎生１４日（以下、‘Ｅ１４’と略称する）となるＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（オリエントバイオ社製、韓国）の大脳皮質及び海馬体から分離した。まず、妊娠中であるラットの腹を切り、はさみと鉗子とを利用して胚芽を分離した。前記胚芽を切除用ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ′ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄した後、氷で冷たくなった(ice-cold)ＨＢＳＳを含む皿に置いた。微細顕微鏡下で注射針と鉗子とを利用してＥ１４胚芽の大脳皮質と海馬体とを分離した。前記分離した大脳皮質を無血清神経細胞培養液(serum free culture solution)で、ピペットで約１０ないし２０回ピペッティングして、細胞を単一細胞にした。前記単一細胞(single cells)をポリ−Ｌ−オルニチン（１５μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で３７℃で１６時間処理した後、 ２時間以上フィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）でコーティングしたカバースリップに塗抹した。前記単一細胞(single cells)を２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）とＢ２７無血清補強剤（Ｂ−２７ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）とが含まれた無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）培地下で、培養皿の底部の約７０％を細胞が満たすまで（７０ないし８０％コンフルエンス(confluence)）約２ないし４日間培養した。ｂＦＧＦを除去し、４ないし６日間神経細胞分化を誘導させた。分化間に、前記細胞を５％のＣＯ２培養器で３７℃で培養しつつ、二日に一回ずつ培地とＢ２７補強剤とを交換し、ｂＦＧＦは毎日添加した。このように分化された神経細胞を以下の実施例で使用した。
【０１０５】
実施例２：臍帯血由来の間葉幹細胞の分離及び増幅
臍帯血サンプルは、産婦の同意を得て出産時に臍静脈から収得した。具体的に、４４ｍＬのＣＰＤＡ−１（ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ−１）抗凝固剤（緑十字社製、韓国）を含む臍帯血収集バッグの１６−ゲージの注射針を臍静脈に挿入して、臍帯血を重力により収集バッグに集めた。前記収集された臍帯血(umbilical cord blood: UCB)は、採取後４８時間内に処理し、 単核細胞細胞の生存率は、９０％以上であった。臍帯血収得物をフィコール・ハイパック勾配（密度：１．０７７ｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ社製）で遠心分離して、単核細胞を収得した後、数回洗浄して不純物を除去した。１０％ないし２０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含有した最小基本培地（α−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を添加して、細胞を懸濁させた。前記細胞を適当な濃度で１０％ないし２０％のＦＢＳを含有した最小基本培地に分注した後、５％の二酸化炭素が供給される３７℃で細胞培養器で一週間に二回ずつ培地を交換して培養した。培養された細胞が単一層を形成すれば、位相差顕微鏡を利用して紡錘状に増殖された間葉幹細胞を確認した後、前記間葉幹細胞が十分に増殖されるまで継代培養を反復した。 臍帯血由来の間葉幹細胞(UCB-MSCs)は、１０ないし２０％のＦＢＳを含有するα−ＭＥＭで培養した。
【０１０６】
実施例３：アミロイドベータ蛋白質の毒性
アルツハイマー病の発病のための理想的な環境を作るために、アルツハイマー病を引き起こすものと知られたアミロイドベータ（Ａβ；ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ １−４２（Ｓｉｇｍａ、Ａ９８１０）：以下、Ａβ４２ともいう）１０μＭを含むｂＦＧＦとＢ２７とがない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地中で、実施例１に記載されたように 分化させた神経細胞を培養した。 神経幹細胞を約３ないし４日分化させた後、神経幹細胞の形態学的特性を顕微鏡で観察した。神経細胞に分化されたことが確認されれば、前記神経細胞にアミロイドベータを２４時間処理した。
【０１０７】
図１は、神経細胞の形態学的変化を測定するために、アミロイドベータと２４時間処理または処理されない生きている神経細胞の光学顕微鏡イメージを表す。アミロイドベータの濃度が高いほど、神経細胞の死滅が増加した。図１において、対照群は、アミロイドベータが含まれていない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で神経細胞を培養したものであり、Ａβ−１μＭ、Ａβ−５μＭ及びＡβ−１０μＭは、それぞれアミロイドベータを１μＭ、５μＭ及び１０μＭの濃度含む培地で、神経細胞を２４時間培養した結果を示すものである。
【０１０８】
実施例４：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とアミロイド・ベータを処理した神経細胞との共同培養が神経細胞死滅に及ぼす影響
アミロイド・ベータを処理した神経細胞とヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とを共同培養した時、アミロイド・ベータのような毒性物質により損傷した神経細胞を観察した。
【０１０９】
具体的に、Ｅ１４胚芽の大脳皮質幹細胞及び海馬体幹細胞を前記実施例１のように分離し、分離された神経幹細胞を増殖させて神経細胞に分化させ、実施例３に示したようにアミロイド・ベータ１０μＭを処理した。アミロイド・ベータを処理してから１２時間後、アミロイド・ベータが処理された神経細胞をアミロイド・ベータの存在下でヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間共同培養して、前記神経細胞をアミロイド・ベータの存在下で総２４時間培養した。共同培養は、図２に示したような共同培養システムで行われた。図２は、アミロイド・ベータが処理された神経細胞をヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養するための共同培養システムを示す。図２に示したように、共同培養システム１００は、上部チャンバー１０と下部チャンバー４０とを備え、前記上部チャンバー１０の底部は、孔隙が約１μｍのサイズである微細膜(microporous membrane)３０を備える。上部チャンバー１０には、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞２０を培養し、下部チャンバー４０には、大脳皮質幹細胞あるいは海馬体幹細胞から分化された神経細胞５０を培養した。前記上部チャンバー１０と下部チャンバー４０とは分離可能であり、前記上部チャンバー１０の底部の下部面と、下部チャンバー４０の底部の上部面とは、約１ｍｍの距離ほど離隔されている。共同培養は、下部チャンバー４０と上部チャンバー１０とで細胞をそれぞれ培養した後、上部チャンバー１０を下部チャンバー４０の培地に添加することで行われた。
【０１１０】
大脳皮質及び海馬体由来の神経細胞にアミロイド・ベータ処理を行わずに培養したもの、大脳皮質及び海馬体由来の神経細胞にアミロイド・ベータを処理したもの、アミロイド・ベータが処理されていない大脳皮質及び海馬体由来の神経細胞に間葉幹細胞を共同培養したものも培養及び観察した。損傷した大脳皮質及び海馬体由来の神経細胞及びヒト臍帯血由来の間葉幹細胞は、アミロイド・ベータを処理してから２４時間後共同培養し、神経細胞の損傷程度を顕微鏡で観察 した。前記培養は、ｂＦＧＦとＢ２７とがない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地（ＧＩＢＣＯ）を使用して実施した。
【０１１１】
神経細胞にアミロイド・ベータを処理する時、誘導される細胞死滅程度を定量的に測定するために、蛍光染色分析により生きている細胞と死んだ細胞とを測定した。細胞毒性の分析は、動物細胞のためのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ生存性／細胞毒性分析キット（Ｓｉｇｍａ、Ｌ３２２４）を使用した。前記キットは、カルセインＡＭとエチジウムホモダイマーとを含み、カルセインＡＭは、生きている細胞を確認するのに使われ、エチジウムホモダイマーは、死んだ細胞を確認するために使われる。カルセインＡＭは、非蛍光性の細胞透過性の染料であり、生きている細胞内に入れば、細胞内のエステラーゼの触媒活性によるアセトキシメチルエステルの加水分解反応により、緑色蛍光物質であるカルセインに転換される。エチジウムホモダイマーは、生きている細胞膜は通過できないが、損傷した細胞膜は透過し、細胞内の核酸に結合して赤色蛍光を発する。
【０１１２】
前記共同培養システムの下部チャンバー40内で、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβ４２を含有する培地中で培養して、Ａβ４２を直接神経細胞に処理した。生存／死亡細胞染色(live/dead staining)を通じて、死んだ細胞は、赤い色で染色され、生きている細胞は、緑色で観察した結果、Ａβ４２を１０μＭの濃度で２４時間処理した細胞（図３のＣｔ＋Ａβ）と、処理していない細胞（図３のＣｔ）とを比較する時、Ａβ４２を処理した場合、緑色蛍光が顕著に減り、赤い蛍光染色部分が広範囲に観察された。これは、ほとんどの神経細胞がＡβ４２により細胞死したということを表す。しかし、このように損傷した神経細胞に、図２に示したような共同培養システムを利用して臍帯血由来の間葉幹細胞を共同培養すれば、神経細胞の死滅が防止され、神経細胞の成熟がさらに増加した（図３のＣｔ＋Ａβ＋ＭＳＣ）。これは、Ａβ４２により既に損傷した神経細胞をＵＣＢ−ＭＳＣと共同培養する場合、損傷した神経細胞を損傷しない状態に復帰させるということを表す。また、図３において、Ｃｔ＋Ａβ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を１０μＭの濃度で含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間共同培養した結果である。また、下部チャンバー40で、１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で、無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を培養すると共に、上部チャンバー10で、臍帯血由来の間葉幹細胞を２４時間同じ培地で共同培養しても、図３のＣｔ＋Ａβ＋ＭＳＣに示したような結果が得られた。これは、神経細胞をＵＣＢ−ＭＳＣと共同培養する場合、Ａβ４２により既に損傷した神経細胞を損傷しない状態に復帰させるだけでなく、Ａβ４２により神経細胞が損傷しないように予防できるということを表す。
【０１１３】
図３において、Ｃｔは、Ａβ４２を含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を２４時間培養した結果であり、Ｃｔ＋Ａβは、Ａβ４２を１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を２４時間培養した結果であり、Ｃｔ＋Ａβ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間共同培養した結果であり、Ｃｔ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間共同培養した結果を表す。
【０１１４】
図４は、図３の結果を死んだ細胞の百分率で表示したものである。図４において、Ｃｏｒｔｅｘは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ42を含まない培地で培養した対照群結果を表し、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ42を１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβ＋ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ42を１０μＭの濃度に含む培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに培養した結果を表し、Ｃｏｒｔｅｘ＋ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ42を含まない培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間さらに培養した結果を表す。
【０１１５】
実施例５：ヒト骨髄由来の間葉幹細胞とアミロイド・ベータを処理した神経細胞との共同培養時に、神経細胞死滅に及ぼす影響
寄贈された骨髄から採取した骨髄由来の間葉幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を使用して、実施例４のような方法で実験を行った。Ａβが処理された神経細胞に骨髄由来の間葉幹細胞を共同培養すれば、実施例４の臍帯血由来の間葉幹細胞を共同培養した場合と同様に、神経細胞の死滅が抑制された（図５のＣｔ＋Ａβ＋ＢＭ−ＭＳＣ）。
【０１１６】
図５は、Ａβ４２による神経細胞死滅についての神経細胞とヒト骨髄由来の間葉幹細胞との共同培養の効果を表す蛍光染色の結果である。図５において、Ｃｔは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で培養した対照群結果を表し、Ｃｔ＋Ａβは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ｃｔ＋Ａβ＋ＢＭ−ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で１２時間培養した後、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに培養した結果を表し、Ｃｔ＋ＢＭ−ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で１２時間培養した後、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞と１２時間さらに培養した結果を表す。
【０１１７】
実施例６：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とアミロイド・ベータを処理した神経細胞との共同培養時に、タウ蛋白質の燐酸化に及ぼす影響
図６は、Ａβ４２により燐酸化されたｔａｕに結合する抗体である 抗−ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕ抗体を利用して神経細胞を 表すものであって、 tau蛋白質は、神経細胞の死亡を誘発する蛋白質と知られた。前記抗−ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕ抗体とｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕとの結合を可視化するために、抗−ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕ抗体は、赤い蛍光を有するＣｙ３と接合させた。
【０１１８】
図６において、第１列は、Ｃｙ３が接合された抗−ｐｈｏｓphor−ｔａｕ抗体で染色した 神経細胞を表し、第２列は、４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した神経細胞を表す。図６の第１列において、Ｃｔは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で培養した対照群結果を表し、Ａβ４２は、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ａβ４２／ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに培養した結果を表し、ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間さらに培養した結果を表す。図６の第１列に示したように、神経細胞でタウ蛋白質は、Ａβ４２により急激に燐酸化されたが、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞の共同培養により脱燐酸化された（Ａβ４２及びＡβ４２／ＭＳＣ参照）。
【０１１９】
図６の第２列に示したように、ＤＡＰＩ染色は、図６の第１列で抗−ｐｈｏｓphor−ｔａｕ抗体で染色されない 大脳皮質由来の神経細胞が維持されていることを表す。ＤＡＰＩ染色は、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤＴＭ（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を使用し、ＤＡＰＩが含まれた搭載媒質(mounting medium)を細胞のあるスライドガラスに顕微鏡観察直前に添加して使用した。
【０１２０】
実施例７：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とアミロイド・ベータを処理した神経細胞との共同培養時に、免疫蛍光染色法を利用した分化された神経細胞分析
神経細胞の分化マーカーとして知られた微小管関連蛋白質（ＭＡＰ２）とチューブリンβＩＩＩとに特異的に結合する抗体を利用して、大脳皮質と海馬体幹細胞とから由来した神経細胞を染色した。
【０１２１】
免疫蛍光染色を 次の通りで行った。神経細胞を４％のパラホルムアルデヒドで、常温で２０分間１２ウェルプレートのウェルに固定し、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ４回洗浄する。洗浄後、１０％のＮＧＳ（ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳを含む溶液を添加し、常温で３０分ないし４５分間反応させて非特異反応を遮断させた。一次抗体を含む１０％のＮＧＳ及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を前記ウェルに添加し、４℃で一晩反応させた。０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ３回洗浄した。二次抗体及び二次抗体に結合する試薬を含む０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて常温で４分間反応させた後、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分間４回洗浄した。一次抗体は、マウスで生産された単一クローン抗-チューブリンβＩＩＩ (anti-tubulin βＩＩＩ antibody)（Ｓｉｇｍａ）及びうさぎ多クローン抗-ＭＡＰ２ (anti-microtubule associated protein 2 antibody)（ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をそれぞれ１：５００及び１：２００に緩衝溶液中に希釈して準備した。二次抗体は、ビオチン化された抗−マウス抗体及びビオチン化された抗−うさぎ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）をそれぞれ１：２００に緩衝溶液中に希釈して準備した。二次抗体に結合する試薬は、ジクロロトリアジニルフルオレセイン(dichlorotriazinyl fluorescein)（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して準備した。
【０１２２】
Ａβ４２を処理した神経細胞（大脳皮質及び海馬体由来の細胞）では、毒性により神経突起が切断され、神経細胞模様が凝縮された。一方、臍帯血由来の間葉幹細胞を共同培養した神経細胞では、神経突起が維持され、神経細胞の成熟が促進された（図７A, 7B及び7C）。
【０１２３】
図７は、Ａβ４２処理され、臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養し、抗チューブリンβＩＩＩ及び抗ＭＡＰ２及びウェスタンブロッティングを利用して、免疫蛍光染色法で 染色された神経細胞を表す。
【０１２４】
図７Ａは、大脳皮質由来の神経細胞を表し、図7Ｂは、海馬体由来の神経細胞を表す。ＭＡＰ２及びＴｕｂｕｌｉｎβＩＩＩは、それぞれ抗ＭＡＰ２及び抗チューブリンβＩＩＩを利用して、免疫蛍光染色した結果を示す。対照群(control)は、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した対照群結果を表し、Ａβ４２は、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ａβ４２／ＭＳＣは、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに培養した結果を表し、ＭＳＣは、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間さらに培養した結果を表す。
【０１２５】
図７Ｃは、Ａβ４２処理された大脳皮質由来の神経細胞を臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養し、培養された神経細胞を抗ＭＡＰ２抗体を利用してウェスタンブロッティングした結果を示す図面である。まず、培養された神経細胞の膜をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれた溶解バッファで、超音波破砕器を使用して 粉砕し、蛋白質を抽出した。抽出された蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に適用し、電気泳動して蛋白質サイズによって分離した。電気泳動後、分離された蛋白質を電気的性質を利用してニトロセルロース膜に移し、３％の脱脂粉乳が含まれたＰＢＳに希釈された抗ＭＡＰ２抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃｈｅｍ社製）を添加して反応させた。次いで、//ストレプトアビジン(streptavidin)に接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）が接合された抗うさぎ抗体を添加して反応させ、酵素の基質であるＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）溶液を処理してＸ−ｒａｙフィルムで現像した。図７Ｃにおいて、対照群、Ａβ、Ａβ＋ＭＳＣ及びＭＳＣは、前記した通りである。図７Ｃにおいて、２００は、バンドに該当する分子量２００ｋＤａを表す。
【０１２６】
実施例８：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞による神経細胞及びミクログリア細胞内のネプリリシン発現の誘導
ネプリリシン（ＮＥＰ）は、インシュリン分解酵素（ＩＤＥ）と共に生体内でＡβ４２を分解して除去できる蛋白質と知られている。また、マウスでＮＥＰをノックアウトさせれば、アルツハイマー病の症状が観察されることが報告された。本実施例では、前記実施例４ないし７で得られた神経細胞を収穫して溶解させた後、蛋白質を抽出した。蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して分離し、分離された蛋白質を抗ネプリリシン抗体を利用してウェスタンブロッティングして、ＮＥＰ蛋白質の発現程度を測定した。また、ＮＥＰ特異プライマーを利用して、ＮＥＰのｍＲＮＡ発現程度をＲＴ−ＰＣＲで測定した。また、抗ＮＥＰ抗体で培養された細胞を染色した。
【０１２７】
まず、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで常温で２０分間１２ウェルプレートのウェルに固定し、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ４回洗浄する。洗浄後、１０％のＮＧＳ、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳを含む溶液を添加し、常温で３０分ないし４５分間反応させて、非特異反応を遮断させた。一次抗体を含む１０％のＮＧＳ及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を前記ウェルに添加し、４℃で一晩反応させた。０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ３回洗浄し、二次抗体及び二次抗体に結合する試薬を含む０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて、常温で４０分間反応させた後、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分間４回洗浄した。一次抗体は、マウスで生産された単一クローン抗-ＮＥＰ（Ｓｉｇｍａ）を１：５００に緩衝溶液中に希釈して使用した。二次抗体は、ビオチン化された抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。二次抗体に結合する試薬としては、ストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。
【０１２８】
図８は、Ａβ４２処理されたラット由来の神経細胞と、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞またはヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とを共同培養する時、ラット由来の神経細胞でネプリリシンの発現程度を観察した結果である。
【０１２９】
図８のＡの上端は、培養されたラットの大脳皮質由来の神経細胞を、ウェスタンブロッティングした結果を表す。Ｎｅｕｒｏｎは、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した対照群結果を表し、Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβは、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ＋ＭＳＣは、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに共同培養した結果を表し、Ｎｅｕｒｏｎ＋ＭＳＣは、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間さらに共同培養した結果を表す。
【０１３０】
図８のＡの下端は、培養されたラットの神経細胞から分離されたｍＲＮＡをテンプレートにしてＲＴ−ＰＣＲした結果を表す。使われたＰＣＲプライマーは、配列番号１５及び１６のラットのＮＥＰ遺伝子の特異的プライマーを使用し、β−ａｃｔｉｎ遺伝子の特異的プライマーは、配列番号１７及び１８のプライマーを使用した。ＰＣＲ結果、ＮＥＰ遺伝子に対して４２２ｂｐ、β−ａｃｔｉｎ遺伝子に対して３００ｂｐの増幅産物が得られた。Ｎｅｕｒｏｎ，Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ，Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ＋ＭＳＣ及びＮｅｕｒｏｎ＋ＭＳＣは、前述した通りである。
図８のＡに示したように、ラット由来の神経細胞にＡβ４２を処理した場合、ＮＥＰの発現は減り、Ａβ４２が処理されたラット由来の神経細胞をヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養する場合、ＮＥＰの発現が蛋白質とｍＲＮＡ段階で増加することを確認した。これは、ヒト間葉幹細胞がラット由来の神経細胞を刺激して神経細胞のＮＥＰの生成を増加させ、Ａβ４２毒性蛋白質を除去できることを証明する結果といえる。
【０１３１】
図８のＢにおいて、Ｃｔ，Ａβ，Ａβ＋ＭＳＣ及びＭＳＣは、前述したようなＮｅｕｒｏｎ，Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ，Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ＋ＭＳＣ及びＮｅｕｒｏｎ＋ＭＳＣにそれぞれ対応する。
【０１３２】
細胞の染色過程は、次の通りである。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで、常温で２０分間１２ウェルプレートのウェルに固定し、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ４回洗浄する。洗浄後、１０％のＮＧＳ、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳを含む溶液を添加し、常温で３０分ないし４５分間反応させて、非特異反応を遮断させた。一次抗体を含む１０％のＮＧＳ及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を前記ウェルに添加し、４℃で一晩反応させた。０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ３回洗浄し、二次抗体及び二次抗体に結合する試薬を含む０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて常温で４０分間反応させた後、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分間４回洗浄した。一次抗体は、マウスで生産された単一クローン抗-ＮＥＰ（Ｓｉｇｍａ） 抗体 を１：５００に緩衝溶液中に希釈して使用した。二次抗体は、ビオチン化された抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。二次抗体に結合する試薬としては、ストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。
【０１３３】
図８のＢに示したように、神経細胞にＡβ４２を処理すれば、赤く染色された部分が顕著に減少して、ＮＥＰの発現がラット由来の神経細胞で減ったことを表す。しかし、前記神経細胞と人間由来の間葉幹細胞とを共同培養すれば、ラット由来の神経細胞でＮＥＰの発現が再び回復された。
【０１３４】
また、図８のＣは、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を利用して同一実験を行って、ラット由来の神経細胞内のＮＥＰの発現が増加することをＲＴ−ＰＣＲで確認したものである。
【０１３５】
ＮＥＰとβ−ａｃｔｉｎとのＲＴ−ＰＣＲは、図８のＡで説明した//ものと 同様プライマーを使用して、 同様条件で行った。図８のＣにおいて、レーン１は、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した対照群結果を表し、レーン２及び３は、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ１及びＢＭ−ＭＳＣ２）と１２時間さらに共同培養した結果を表す。ここで、ＢＭ−ＭＳＣ１及びＢＭ−ＭＳＣ２は、相異なる供与者から得た細胞を表す。 図８Ｃに示した結果は、ラットの大脳皮質由来の神経細胞をヒト骨髄由来の間葉幹細胞と共同培養する場合、mRNAレベルでラットの大脳皮質由来の神経細胞でNEP発現の増加を表す。さらに、ウェスタンブロッティング及び免疫ブロッティング結果、蛋白質レベルでもＢＭ−ＭＳＣをラット由来の神経細胞と共同培養する場合、前記神経細胞でＮＥＰの発現が増加することが確認された。
【０１３６】
脳には、神経細胞だけでなく、ミクログリア細胞(microglial cell)があるが、ミクログリア細胞は、脳の大食細胞と呼ばれ、脳に蓄積された毒性物質を除去する細胞と知られている。 前記ミクログリア細胞は、アルツハイマー病でＡβを除去する。 最近、報告によれば、ミクログリア細胞でネプリリシンの発現が減少すれば、アルツハイマー病の進行が促進されるという報告があった。したがって、ヒト臍帯血細胞によりNEPの発現の回復は、免疫蛍光染色法を使用して神経細胞及びミクログリア細胞で確認した（図９）。図９は、Ａβ４２処理された神経細胞と間葉幹細胞とを共同培養した後、ネプリリシンの発現程度を神経細胞とミクログリア細胞とで確認した結果である。
【０１３７】
図９の第１列は、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ42存在下で１２時間さらに共同培養した後、神経細胞マーカーであるＭＡＰ２とＮＥＰとにそれぞれ特異的に結合する抗体で二重染色した結果を表す図面である。染色過程は、ＭＡＰ２に対する１次抗体としてうさぎ由来の抗ＭＡＰ２抗体、前記一次抗体に結合する二次抗体としてビオチン化された抗うさぎ抗体、及びMAP2に対する二次抗体に結合する試薬としてストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、ＮＥＰに対する一次抗体としてマウス単一クローン抗ＮＥＰ体抗(anti-NEP antibody)（Ｓｉｇｍａ）、二次抗体としてビオチン化された抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）、及び二次NEPに対する抗体に結合する試薬としてストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した点を除いては、前記図８のＢと同じ過程により染色した。図９の第１列において、ＭＡＰ２とＮＥＰとは、同じ細胞を抗ＭＡＰ２と抗ＮＥＰ抗体とでそれぞれ染色した結果を表し、ＭＡＰ２＋ＮＥＰは、同じ細胞を抗ＭＡＰ２と抗ＮＥＰ抗体とでそれぞれ染色した結果のイメージを重なったイメージを表す。ＤＡＰＩは、図６の第２列と同じ過程によりＤＡＰＩ染色した結果を表す。
【０１３８】
図９の第１列に示したように、ＭＡＰ２及びＮＥＰ いずれも染色されることからみて、前記細胞は、ＭＡＰ２及びＮＥＰをいずれも発現するものと確認された。また、イメージ重複結果（ＭＡＰ２＋ＮＥＰ）、ＭＡＰ２及びＮＥＰは、いずれも同じ領域で発現されるものと確認され、これは、前記神経細胞がＭＡＰ２及びＮＥＰいずれも発現するということを表す。ＤＡＰＩ染色結果、神経細胞で染色され、これは、前記神経細胞が正常に維持されていることを表す。
【０１３９】
図９の第２列は、大脳皮質由来の神経細胞(neuron)の代わりに、ミクログリア細胞を使用し、ＭＡＰ２及びＮＥＰに対して染色する代わりに、ミクログリア細胞のマーカーであるＣＤ４０及びＮＥＰに対して染色した点を除いては、図９の第１列と同様 に実験した結果を表した図面である。ＣＤ４０に対する染色は、ＣＤ４０に対する一次抗体としてヤギ由来の抗ＣＤ４０抗体、前記一次抗体に結合する二次抗体としてビオチンが接合された抗ヤギ抗体、及び二次抗体に結合する試薬としてストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。
【０１４０】
図９の第２列に示したように、ＣＤ４０及びＮＥＰでいずれも染色されることからみて、前記ミクログリア細胞は、ＣＤ４０及びＮＥＰをいずれも発現するものと確認された。また、イメージ重複結果（ＣＤ４０＋ＮＥＰ）、ＣＤ４０及びＮＥＰは、いずれも同じ領域で発現されるものと確認され、これは、前記ミクログリア細胞がＣＤ４０及びＮＥＰいずれも発現するということを表す。ＤＡＰＩ染色結果、ミクログリア細胞で染色され、これは、前記ミクログリア細胞が正常に維持されていることを表す。
【０１４１】
図９の第１列及び第２列の結果から、 神経細胞とミクログリア細胞とを臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養する場合、Ａβで処理された神経細胞とミクログリア細胞とでいずれもＮＥＰの発現が誘導されるということが確認された。
【０１４２】
実施例９：間葉幹細胞が分泌して、Ａβ４２の毒性を抑制する分泌蛋白質の同定及び効果検証
実施例４ないし８の結果、Ａβ４２で処理された神経細胞を間葉幹細胞と直接的な接触のない状態で共同培養する場合、前記神経細胞でＡβ４２の毒性活性が抑制されるということが確認された。これは、間葉幹細胞から分泌された物質が前記神経細胞に相互作用して、Ａβ４２の毒性活性を抑制するものと予測できる。
【０１４３】
本実施例では、間葉幹細胞から分泌された物質のうち、Ａβ４２の毒性活性を抑制する物質を探索して確認した。
【０１４４】
（１）間葉幹細胞由来のＡβ４２の毒性活性を抑制する物質探索
まず、細胞を次のような色々な条件で培養した。
培養群１：大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した。
培養群２：大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した。
培養群３：大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ42存在下で１２時間さらに共同培養した。
培養群４：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した。
培養群５及び６：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞を無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した。
【０１４５】
次いで、前記培養群１ないし６から培地を収穫し、培地中のサイトカイン及び蛋白質を分析及び比較して、幹細胞を単独に培養する場合に発現されないか、またはほぼ発現されないが、幹細胞と神経細胞とを共同培養する場合、発現が増加したサイトカインまたは蛋白質を選別した。サイトカインの分析は、ＲａｙＢｉｏＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｉ Ｇ ｓｅｒｉｅｓ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）を使用して行われ、蛋白質の分析は、ＲａｙＢｉｏＴＭＨｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｉ Ｇ ｓｅｒｉｅｓ／Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌ Ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｉ Ｇ ｓｅｒｉｅｓ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）を使用して行われた。前記二つのアレイは、総５４，５０４種類の蛋白質を分析できる。
【０１４６】
分析結果、得られたデータを比較して、幹細胞を単独で培養する場合に発現されないか、またはほぼ発現されないが、幹細胞と神経細胞とを共同培養する場合、発現が増加した蛋白質を選別した。その結果、下記のような１４種類の蛋白質が確認された：
アクチビンＡ、血小板因子４（ＰＦ４）、デコリン、ガレクチン３、成長分化因子１５（ＧＤＦ１５）、グリピカン３、膜タイプのフリズル関連蛋白質（ＭＦＲＰ）、細胞間付着分子５（ＩＣＡＭ５）、インシュリン類似成長因子結合蛋白質７（ＩＧＦＢＰ７）、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、分泌された酸性システインリッチ蛋白質１（ＳＰＡＲＣＬ１）、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）、ＷＮＴ１誘導性分泌された蛋白質１（ＷＩＳＰ１）及びプログラニュリン（ＰＧＮ）であった。
前記１４種類の蛋白質がＡβ処理された神経細胞で毒性を抑制し、神経細胞の分化と成熟とを促進するものと推定した。
【０１４７】
（２）探索された１４種の蛋白質の活性確認
探索された１４種の蛋白質の組み替え蛋白質を購入した（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）。次いで、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ及び前記１４種の蛋白質それぞれをアクチビンＡ ２５ｎｇ／ｍｌ、ＰＦ４ ２５ｎｇ／ｍｌ、ガレクチン３ ３ｎｇ／ｍｌ、デコリン１００ｎｇ／ｍｌ、ＧＤＦ１５ ５０ｎｇ／ｍｌ、グリピカン３ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＭＦＲＰ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＣＡＭ５ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦＢＰ７ ３０ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦ−ＡＡ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＰＡＲＣＬ１ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＳＰ１ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＷＩＳＰ１ ５０ｎｇ／ｍｌ及びプログラニュリン５０ｎｇ／ｍｌの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地に添加し、２４時間培養した。培養後、死んだ細胞と生存可能な細胞とは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ生存性／細胞毒性分析キット（Ｓｉｇｍａ，Ｌ３２２４）を使用した蛍光染色を通じて測定した。測定された死んだ細胞と生存可能な細胞との数に基づいて、Ａβにより誘導された神経細胞の細胞死程度を計算した。細胞死は、全体の細胞数に対する死んだ細胞の割合で計算した。
【０１４８】
図１０は、間葉幹細胞の培養時に分泌される蛋白質と、Ａβ４２処理された神経細胞とを培養する時、百分率で表示した神経細胞死を表した図面である。図１０において、Ｃｏｒｔｅｘは、Ａβ４２を含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を２４時間培養したものであり、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβは、Ａβ４２を１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を２４時間培養したものであり、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ42存在下で１２時間共同培養したものであり、Ｃｏｒｔｅｘ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間共同培養した結果を表す。Ａβは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ４２及び前記１４種の蛋白質それぞれを前記した濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養したものである（図１０において、ｐ＜０．０３，ｐ＜０．０１は、ｔ−ｔｅｓｔ結果、誤差範囲がそれぞれ３％及び１％未満であるということを表す）。
【０１４９】
図１０に示したように、１４個の蛋白質それぞれは、Ａβ４２による神経細胞の細胞死を抑制した。細胞死の抑制程度は、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβ＋ＭＳＣ、ガレクチン３、ＷＩＳＰ１及びＭＦＲＰの順に高かった。これは、臍帯血由来の幹細胞の共同培養、すなわち、１４個の蛋白質の組み合わせで最も強い抑制効果があるということを暗示する。
【０１５０】
また、１４個の蛋白質が神経細胞の成熟に及ぼす影響を調べるために、培養された神経細胞の神経突起の長さを測定した。培養条件は、図１０に示したように培養した。神経突起の長さ測定は、１００個の細胞を各培養群当たりランダムに選択し、ｉ−ｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（ｉＭＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を利用して神経突起の長さを測定した。
【０１５１】
図１１は、間葉幹細胞の培養時に分泌される蛋白質と、Ａβ４２処理された神経細胞とを培養する時、神経細胞の神経突起の長さを測定した結果である。図１１において、培養群は、図１０に示した通りであり、 神経突起の長さは、平均長を表す。図１１に示したように、１４個の蛋白質それぞれは、単独または組み合わせてＡβ４２処理された神経細胞に比べて神経突起の長さを顕著に増加させた。
【０１５２】
実施例１０：間葉幹細胞から分泌されて、ミクログリア細胞でネプリリシンの発現を誘導するサイトカインの同定
本実施例では、実施例４に説明されたような共同培養システム100を使用した。下部チャンバー40にミクログリア細胞、ＢＶ２細胞を培養し、上部チャンバー10には、臍帯血由来の間葉幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）を培養した。ＢＶ２細胞は、培養されたマウスミクログリア細胞をｖ−ｒａｆ／ｖ−ｍｙｃ組み替えレトロウイルスで感染させて不滅化されたものであって、活性化されたミクログリア細胞の特性を発現する。共同培養は、下部チャンバー40で５％のＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地でＢＶ２細胞を培養した後、５％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で培養された臍帯血由来の間葉幹細胞を上部チャンバー10に添加し、培地を無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間共同培養した。その後、上部チャンバー10のＭＳＣを回収して、トリゾール試薬を使用して総ＲＮＡを得て、得られた総ＲＮＡをテンプレートにしてＲＴ−ＰＣＲを行った。使われたプライマーは、ＩＬ−４（配列番号２２及び２３）、ＩＬ−６（配列番号２４及び２５）、ＩＬ−８（配列番号２６及び２７）及びＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）（配列番号２８及び２９）遺伝子を特異的に増幅させるプライマーを使用した。ＰＣＲ対照群として、配列番号１７及び１８のプライマーを使用してβ−アクチンを増幅した。対照群としては、ＢＶ２細胞と共同培養されていないものを除いては、同じ条件で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣを使用した。
【０１５３】
図１２は、ミクログリア細胞とＵＣＢ−ＭＳＣとを共同培養した後、ＵＣＢ−ＭＳＣから分離された総ＲＮＡをテンプレートにしてＲＴ−ＰＣＲした産物を示す図面である。図１２に示したように、ミクログリア細胞とＵＣＢ−ＭＳＣとを共同培養する場合、ＵＣＢ−ＭＳＣでＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−８及びＭＣＰ−１の発現が増加した。
【０１５４】
ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−８及びＭＣＰ−１それぞれの存在下で、ミクログリア細胞、ＢＶ２細胞、神経細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ社製）を培養し、ＢＶ２細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を回収した。回収された細胞を溶解し、細胞溶解物から蛋白質をサイズ別に分離した後、抗ＮＥＰ抗体を使用してウェスタンブロッティングした。その結果、ＩＬ−４の存在下でＢＶ２細胞及びＳＨＹ−５Ｙ細胞を培養する場合、ＩＬ−４の不在下で培養する場合に比べて、ＮＥＰの発現が経時的に増加した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨから由来したトリスクローンされたニューロブラストーマである。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、神経細胞を表す。
【０１５５】
図１３は、ＩＬ−４の存在下で神経細胞及びミクログリア細胞を培養する場合、ＮＥＰの発現が増加することを表すウェスタンブロッティング結果を示す図面である。図１３のＡは、ミクログリア細胞であるＢＶ２細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した結果である。図１３のＢは、神経細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含むα−ＭＥＭ培地で２４時間培養した結果である。
【０１５６】
実施例１１：アルツハイマー病の形質転換マウスの海馬体及び皮質内の臍帯血由来の間葉幹細胞の投与によるアミロイド蛋白質プラークの減少（チオフラビンＳ染色法及び免疫ブロッティング）
治療効果の増進のために、アルツハイマー病の形質転換マウス１０ヶ月齢にＰＢＳ、ＰＢＳ中の１×１０４の臍帯血間葉幹細胞、及びＰＢＳ中のＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）２００μｇ／ｋｇそれぞれを、定位フレーム(stereotactic frame)を利用して海馬体に投与した。１０日が経過してからマウスを犠牲にした後、脳組織を海馬体と皮質とから得た。得た脳組織を切片に作り、チオ硫酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）の染色を通じてアミロイドベータ蛋白質の沈着程度を染色した結果を確認した。プラークを確認するために、５０％のエタノールに溶かしたＳｉｇｍａ社製のチオフラビン溶液に組織を５分間反応させた。反応後、組織の切片を５０％のエタノール及び水で５分間洗浄した。この組織の切片を蛍光顕微鏡下で観察して、組織内のアミロイド蛋白質プラークを確認した。
【０１５７】
図１４は、海馬体と皮質とを含む脳組織で、アミロイドベータ蛋白質の沈着を、Ｔｈｉｏ−Ｓ染色法を利用して確認結果を示す図面である。図１４に示したように、臍帯血間葉幹細胞の投与群とＩＬ−４投与群とで、アミロイドベータ蛋白質の沈着が顕著に減少するということが分かった。図１４において、ＰＢＳ、ＭＳＣ及びＩＬ−４は、それぞれＰＢＳ、臍帯血由来の間葉幹細胞及びインターロイキン−４を投与した群を表す。
【０１５８】
図１５は、図１４の染色写真でアミロイドの沈着の総面積を示す図面である。沈着面積は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を利用して測定した。図１５に示したように、ＭＳＣ及びＩＬ−４投与群で対照群に比べてアミロイド沈着が顕著に減少した。
【０１５９】
図１６は、実験に使われたマウスの脳で生成されたアミロイドベータ蛋白質の変化を示す免疫ブロッティング結果を表す。図１６の結果は、次のような過程により得られた。まず、 マウスの海馬体及び皮質を含む脳組織を得て、超音波破砕器（Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を利用して蛋白質抽出物を得た。次いで、前記抽出物に対して電気泳動を実施して、蛋白質をサイズによって分離した。分離された蛋白質を、電位差を利用してニトロセルロース膜に移した後、Ａβ４２を特異的に検出できる抗体を使用して免疫ブロッティングを行った。染色は、クマシーブルーを使用して染色した。図１６に示したように、Ａβ４２蛋白質は、ＰＢＳ投与群に比べて臍帯血間葉幹細胞の投与群とＩＬ−４投与群とでその量が顕著に減少するということが分かった。図１６において、Ｌｉｔｔｅｒは、ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅを表すものであって、形質転換マウスの正常同腹子を表し、ＡＰＰ／ＰＳ１ ｍｉｃｅは、アルツハイマー病の形質転換マウスを表す。また、ＰＢＳ、ＭＳＣ及びＩＬ−４は、それぞれＰＢＳ、ＭＳＣ及びＩＬ−４を投与した群を表す。
【０１６０】
実施例１２：臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４がネプリリシンの発現に及ぼす影響
（１）正常及びアルツハイマー病の形質転換動物の脳組織でのネプリリシン蛋白質の発現
それぞれ６，９，１２及び１８ヶ月間飼育された正常マウスと、アルツハイマー病の形質転換マウスとの脳組織を得た後、実施例１１と同じ方法で蛋白質抽出物を得て電気泳動で分離した。分離された蛋白質をニトロセルロール膜に移した後、抗ネプリリシン抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と反応させてＮＥＰ蛋白質の発現如何を分析した。
【０１６１】
図１７は、正常及びアルツハイマー病の形質転換マウスで、海馬体と皮質とを含む脳組織でＮＥＰの発現程度を示す図面である。図１７に示したように、ネプリリシンの発現は、アルツハイマー病の形質転換マウスの脳で減少した。図１７において、Ｌｉｔｔｅｒ及びＡＰＰ／ＰＳ１ ｍｉｃｅは、図１６に示したものと同一である。また、レーン６，９，１２及び１８は、それぞれ６，９，１２及び１８ヶ月（Ｍ：ｍｏｎｔｈ）を飼育した群を表す。
【０１６２】
図１８は、 Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）ソフトウェアを利用して測定した図１７のＮＥＰバンドの強度を示す図面である。 バンドの強度は、 、相対的なバンド強度を表す。図１８に示したように、ネプリリシンの発現は、正常マウスに比べて、アルツハイマー病の形質転換マウスの脳で減少した。
【０１６３】
（２）臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４がネプリリシンの発現に及ぼす影響
アルツハイマー病の形質転換マウス１０ヶ月齢に、ＰＢＳ、ＰＢＳ中の１×１０４の臍帯血間葉幹細胞、及びＰＢＳ中のＩＬ−4２００μｇ／ｋｇ体重を海馬体に投与し、１０日が経過してからマウスを犠牲にした後、海馬体及び皮質を含む脳組織を得た。得られた各脳組織で蛋白質抽出物を得た後、電気泳動して免疫ブロッティングによりネプリリシンの発現量を分析した。
【０１６４】
図１９は、間葉幹細胞及びＩＬ−４が投与されたマウスで、海馬体及び皮質を含む脳組織でＮＥＰの発現程度を示す図面である。染色は、クマシーブルーを使用して染色した(下段)。図１９に示したように、（１）で観察した結果のように、ＰＢＳ投与群のネプリリシンの発現は、正常的なマウスに比べて減少したが、臍帯血間葉幹細胞とＩＬ−４投与群では、その発現量が正常マウスに比べて類似して発現された。
【０１６５】
実施例１３：臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４がミクログリア細胞におけるネプリリシンに及ぼす影響
実施例８において、間葉幹細胞、神経細胞及びミクログリア細胞をそれぞれ共同培養する場合、神経細胞及びミクログリア細胞でそれぞれネプリリシンが過発現されることを確認した。
本実施例では、動物モデルでかかる効果を確認した。実施例１２に記載のＰＢＳ投与群、臍帯血間葉幹細胞投与群及びＩＬ−４投与群の脳の海馬体組織を実施例８に記載の図８のＢの染色過程と同一に染色した。染色は、抗ＮＥＰ抗体及びミクログリア細胞のマーカーである抗ＣＤ４０抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）に重複染色して統合した。抗ＮＥＰ抗体の染色の場合、２次抗体及びそれに結合する試薬は、実施例８に記載された通りであり、抗ＣＤ４０抗体の染色の場合、２次抗体及びそれに結合する試薬は、実施例８と同じものを使用した。
【０１６６】
図２０は、臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４が投与されたマウスのミクログリア細胞で、ＮＥＰの発現を示す図面である。図２０に示したように、動物モデルに臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４を投与する場合、ミクログリア細胞でネプリリシンの過発現が誘導された。
【０１６７】
本発明は、例示的な具体例を参照して説明されたが、形態及び細部事項における多様な変化が特許請求の範囲に定義されたような本発明の精神及び範囲から逸脱せずに行われるということは当業者に理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉幹細胞、間葉幹細胞の培養液、間葉幹細胞の培養液に含まれた蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系刺激因子を含む、神経突起(neurites)の損傷に関連した、アルツハイマー病の予防または治療に関する。
また、本発明は、間葉幹細胞、間葉幹細胞の培養液、間葉幹細胞の培養液に含まれた蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系刺激因子を含む神経突起の損傷と関連した疾病の予防または治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、アミロイドベータ蛋白質の破壊的蓄積により脳細胞を破壊する脳疾患であって、主に老化と共に進み、言語障害及び認知障害をもたらす深刻な疾病である。アルツハイマー病は、段階別に進み、次第に記憶力、推理、判断力、言語、さらに非常に単純な業務能力までも破壊する。結局、感情の調節の喪失は、人間の生の破壊をもたらす。まだアルツハイマー病を根本的に治療する方法はなく、症状を緩和する薬物のみが臨床に使われている。しかし、患者にそれらの薬物の効果は制限的である。アルツハイマー病患者の半分程度が初期薬物治療から治癒されない。たとえ前記初期薬物治療が成功したとしても、症状の緩い緩和のみを示すだけである。したがって、 医療需要を満たす新たな治療法の開発が要求されており、アルツハイマー病の治療法の開発による経済的かつ社会的な効果は非常に大きいであろう。アルツハイマー病は、病気が進みつつ、脳の皮質と海馬体（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）とが消失すれば、再生が不可能であり、治療方法がほぼないものと知られている。
【０００３】
アルツハイマー病についての研究は、二つの蛋白質、すなわち、タウ（ｔａｕ）とアミロイド前駆体蛋白質（Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）に焦点が合わせられてきた（Ｓｔｕａｒｔ Ｍ．及びＭａｒｋ Ｐ．Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２巻 第４号、第３９２−３９３ページ、２００６）。それらは、アルツハイマー病にかかった患者の脳で非正常的な形態に蓄積される。タウは、過剰燐酸化され、ＡＰＰは、セクレターゼにより切断されてアミロイド・ベータ（Ａβ）を生成し、アミロイド・ベータは、脳内にアミロイドプラークとして凝集される。プラークが蓄積された脳領域は、典型的にシナプスの数が減少し、神経突起が損傷される。これは、アミロイド・ベータがシナプスと神経突起(neurite)とを損傷させるということを暗示する（Ｍａｒｋ Ｐ．Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ、第４３０号、第６３１−６３９ページ、２００４）。
【０００４】
アルツハイマー病の治療のために、病因メカニズムについての研究が活発に進められた。特に、アミロイドベータ蛋白質を生成するベータ・セクレターゼ及び／またはガンマ・セクレターゼの阻害剤を開発する研究、蓄積されたアミロイドベータ蛋白質を分解する蛋白質分解酵素についての研究、及びアセチルコリンの分解を担当するアセチルコリンエステラーゼの阻害剤を開発する研究が強力に進められている。また、アルツハイマー病が老化関連の慢性炎症性疾患であるため、炎症抑制剤を利用したアルツハイマー病の治療についての研究も進められている。
【０００５】
脳内のアミロイド・ベータの量は、その生成反応と除去反応との均衡により決定される。したがって、 除去作用が減少すれば、アミロイド・ベータの量が増加する。アミロイド・ベータを分解する活性を有する酵素であるネプリリシン（ＮＥＰ）の欠乏は、細胞外のアミロイドの蓄積を加速化させる（Ｋａｎａｅ ｌｉｊｉｍａ−Ａｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２８３号、第２７巻、第１９０６６−１９０７６ページ、２００８）。
【０００６】
神経細胞の細胞体から突出した神経突起の異常は、神経疾患と関連する。 前記神経疾患の例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん(epilepsy)、多発性硬化症(multiple sclerosis)及び躁病（ｍａｎｉａ）である。特に、てんかんの場合、人間の脳の海馬体の神経細胞死と神経膠症（ｇｌｉｏｓｉｓ）とによって生じる。細胞死による神経突起の切断が起こる。多発性硬化症は、脳に生じる慢性自家免疫疾患であって、やはりＮｏｇｏ Ａという神経突起の過成長の阻害蛋白質の異常により発病する。うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、Ｍ６ａという神経突起の過成長関連の蛋白質の異常により発病する脳疾患である。躁病の症状の緩和が、ラットで神経突起の過成長を促進する信号伝達経路を活性化した時、報告された。
【０００７】
間葉幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、及び筋肉細胞のような中胚葉性細胞(mesodermal lineage cells)、または神経細胞のような外胚葉性細胞(ectodermal lineage cells)に分化する能力を有する多分化能幹細胞(multipotent stem cell)である。最近、間葉幹細胞が脳で神経膠細胞に分化する潜在力を有しており、間葉幹細胞を神経細胞に分化させる試みがあった（韓国公開特許第１０−２００４−００１６７８５号公報、２００４．２．２５）。
【０００８】
間葉幹細胞のうち、骨髄由来の間葉幹細胞は、患者から得られる。前記骨髄由来の間葉幹細胞が自家移植される場合、免疫拒否反応 がないので、患者に臨床的に使用される。しかし、骨髄由来の間葉幹細胞の採取は、色々な段階の施術が要求されるため、骨髄寄贈は時間消費的であり、精神的及び肉体的に苦痛であり、高価である。しかし、臍帯血由来の間葉幹細胞は、臍帯から簡単に得られ、臍帯血の保管産業が活発に開発されており、供与者が臍帯血インフラストラクチャ(infrastructure)を通じて容易に発見されるため、間葉幹細胞が容易に得られる。 さらに、他家由来の臍帯血から得た間葉幹細胞の場合にも、移植後に免疫反応を起こさず、免疫学的安定性を有する。
【０００９】
本発明の明細書に引用される先行文献の内容は、いずれも本明細書に参照により導入される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００４−００１６７８５号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｔｕａｒｔ Ｍ．及びＭａｒｋ Ｐ．Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２巻 第４号、第３９２−３９３ページ、２００６
【非特許文献２】Ｍａｒｋ Ｐ．Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ、第４３０号、第６３１−６３９ページ、２００４
【非特許文献３】Ｋａｎａｅ ｌｉｊｉｍａ−Ａｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２８３号、第２７巻、第１９０６６−１９０７６ページ、２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来方法によれば、幹細胞を利用した神経疾患の治療のためには、幹細胞を神経細胞に分化させるステップが先決されるか、または幹細胞を神経細胞に分化させる物質を幹細胞と共に投与するステップが必要であった。
【００１３】
本発明の一つ以上の具体例は、幹細胞を神経細胞に分化させるステップを含まない神経疾患の細胞治療方法を含む。
【００１４】
本発明の一つ以上の具体例は、 幹細胞を含む神経疾患の予防及び治療のための組成物を含む。
【００１５】
本発明の一つ以上の具体例は、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性の抑制、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化抑制、神経突起の損傷抑制及び神経細胞及びミクログリア細胞(microglial cells)内のネプリリシンの発現誘導方法を含む。本発明の一つ以上の具体例は、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性の抑制、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化抑制、神経突起の損傷抑制及び神経細胞及びミクログリア細胞(microglial cells)内のネプリリシンの発現誘導のためのキットを含む
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、間葉幹細胞、その培養液または前記培養液中に含まれる蛋白質をアミロイドベータが処理されたまたは処理されない神経細胞またはミクログリア細胞と共同培養する場合、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化及び神経突起の損傷が抑制され、神経細胞またはミクログリア細胞内のネプリリシンの発現が誘導されること発見した。
【発明の効果】
【００１７】
間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を神経細胞またはミクログリア細胞と共同培養すれば、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性が抑制され、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化が抑制され、神経突起の損傷が抑制され、神経細胞またはミクログリア細胞内にネプリリシンの発現が誘導される。
【００１８】
本発明の間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を含む組成物は、神経疾患の予防または治療用の効果的な細胞治療組成物として使われる。
【００１９】
また、 間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を使用して、アミロイドベータにより誘発された神経細胞毒性の抑制、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化抑制、神経突起の損傷抑制及び神経細胞内のネプリリシンの発現誘導方法及びこのためのキットを提供する。
本発明の前記した特徴、他の特徴及び利点は、添付された図面を参照して、本発明の具体例として詳細に記述することで、さらに明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アミロイド・ベータと２４時間処理または処理しない生きている神経細胞の光学顕微鏡イメージを表す。
【図２】アミロイド・ベータが処理された神経細胞をヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養するための共同培養システムを示す図面である。
【図３】アミロイド・ベータ（Ａβ４２）による神経細胞死滅に対するヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と神経細胞の共同培養の効果を表す蛍光染色の結果を表す。
【図４】Ａβ４２による神経細胞死滅に対するヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と神経細胞の共同培養の効果を説明する、死滅神経細胞の百分率で示したグラフである。
【図５】Ａβ４２による神経細胞死滅に対するヒト骨髄由来の間葉幹細胞と神経細胞 の共同培養の効果を表す蛍光染色の結果を表す。
【図６】抗ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕ抗体を利用して染色された神経細胞を表す。
【図７】Ａβ４２処理され、間葉幹細胞と共同培養され、 免疫蛍光染色を使用して染色された神経細胞を表す。
【図８】Ａβ４２処理され 、骨髄由来の間葉幹細胞または臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養された神経細胞中の、ネプリリシンの発現を表す。
【図９】Ａβ４２処理された神経細胞及びミクログリア細胞と間葉幹細胞とを共同培養された場合、 神経細胞及びミクログリア細胞中のネプリリシンの発現を表す。
【図１０】Ａβ４２処理され、間葉幹細胞から分泌される蛋白質と共同培養された、死んだ神経細胞の百分率 を示すグラフである。
【図１１】Ａβ４２及び間葉幹細胞から分泌された蛋白質と神経細胞の神経突起の長さを 示すグラフである。
【図１２】ミクログリア細胞とＵＣＢ−ＭＳＣとを共同培養した後、ＵＣＢ−ＭＳＣから分離された総ＲＮＡをテンプレートとして使用してＲＴ−ＰＣＲした結果を表す。
【図１３】ＩＬ−４の存在下で神経細胞及びミクログリア細胞を培養する場合、ＮＥＰ発現が増加することを示すウェスタンブロッティング結果を表す。
【図１４】Ｔｈｉｏ−Ｓ染色法を利用して染色された海馬体と皮質(cerebral cortex)とを含む脳組織中のアミロイドベータ蛋白質の沈着物 (plaque)のイメージを表す。
【図１５】図１４のイメージ中のアミロイド沈着物の総面積を示すグラフである。
【図１６】実験に使われたマウスの脳で生成されたアミロイドベータ蛋白質の変化を示す免疫ブロッティング結果を表す。
【図１７】正常及びアルツハイマー病を有するように形質転換されたマウスで、海馬体と皮質とを含む脳組織でＮＥＰ発現程度を示す図面である。
【図１８】Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）ソフトウェアを利用して測定した図１７のＮＥＰバンドの強度を示すグラフである。
【図１９】間葉幹細胞及びＩＬ−４が投与されたマウスで、海馬体及び皮質を含む脳組織でＮＥＰ発現程度を示す図面である。
【図２０】臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４が投与されたマウスのミクログリア細胞でＮＥＰ発現を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の具体例によれば、間葉幹細胞を神経細胞に分化させず、アミロイド・ベータにより損傷した神経細胞と共同培養すれば、間葉幹細胞と神経細胞との直接的な接触なしにアミロイド・ベータにより誘発される神経細胞の損傷が抑制または回復される。また、本発明の発明者らは、間葉幹細胞の培養液や前記培養液中に含まれた特定の蛋白質を神経細胞と培養しても、アミロイド・ベータによる神経細胞の損傷が抑制または回復されるということを発見した。
【００２２】
アミロイドベータ４２（Ａβ４２）１０μＭを２４時間神経細胞に処理（図１及び図３のＣｔ＋Ａβ）した場合と、処理していない細胞（図３のＣｔ）の場合とを比較する時、アミロイドベータを処理した場合、ほとんどの神経細胞が細胞死した。しかし、このように損傷した神経細胞をＵＣＢ（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ）−由来間葉幹細胞と共同培養すれば、神経細胞の死滅が阻害し、神経細胞の成熟が増加した（図３のＣｔ＋Ａβ＋ＭＳＣ及び図４）。前記のようなＵＣＢ−間葉幹細胞のアミロイド・ベータによる神経細胞の死滅抑制効果は、骨髄由来の間葉幹細胞でも観察される（図５の皮質/Ａβ/ＢＭ−ＭＳＣ）。Ａβ４２存在下で大脳皮質由来の神経細胞と間葉幹細胞とを２４時間同じ培地で共同培養しても、図３のＣｔ＋Ａβ＋ＭＳＣに示したような結果が得られた。これは、神経細胞をＭＳＣと共同培養する場合、Ａβ４２により損傷した神経細胞を復帰させ、Ａβ４２により神経細胞が予防できるということを表す。
【００２３】
また、 Ａβ４２により急激に燐酸化されるタウ蛋白質の燐酸化が、タウ蛋白質・ヒト臍帯血間葉幹細胞の共同培養により燐酸化が抑制される（図６）。
【００２４】
神経細胞の標識であるチューブリンβＩＩＩ及びＭＡＰ２に対する抗体を使用して 神経細胞を観察した結果、Ａβ４２を処理した神経細胞では毒性により、神経突起が損傷して切断され、神経細胞形態が凝縮された。しかし、前記神経細胞と臍帯血由来の間葉幹細胞とを共同培養すれば、神経細胞中の神経突起が維持され、神経細胞の分化成熟が促進される（図７）。
【００２５】
Ａβ４２を分解して除去する蛋白質であると知られたネプリリシン（ＮＥＰ）の発現を観察した結果、ＮＥＰの発現は、Ａβ４２で処理された神経細胞では減少した。しかし、前記神経細胞を臍帯血由来の間葉幹細胞を共同培養すれば、ＮＥＰの発現が蛋白質とｍＲＮＡとのレベルで増加する（図８のＡ）。図８のＢは、抗ＮＥＰ抗体を利用して染色された神経細胞を表す。前記神経細胞にＡβ４２を処理すれば、赤く染色された部分が顕著に減少して、ＮＥＰの発現が神経細胞で減ることを表す。しかし、神経細胞と間葉幹細胞とを共同培養すれば、ＮＥＰの発現が増加した。かかる実験結果は、臍帯血由来の間葉幹細胞だけでなく、骨髄由来の間葉幹細胞でも 観察された（図８のＣ）。したがって、Ａβ42で処理または処理されていない神経細胞を間葉幹細胞と共同培養する場合、前記神経細胞でＮＥＰの発現は、ｍＲＮＡレベルだけでなく、蛋白質レベルでも増加した。前記間葉幹細胞は、臍帯血由来の間葉幹細胞及び骨髄由来の間葉幹細胞を含む。
【００２６】
また、臍帯血由来の間葉幹細胞が神経細胞(neurons)だけでなく、脳の大食細胞(macrophage)と呼ばれ、脳に蓄積された毒性物質、例えば、アルツハイマー病のＡβを除去するものと知られたミクログリア細胞(microglial cells)でも、ＮＥＰの発現を誘導することを確認した（図９）。
【００２７】
間葉幹細胞と神経細胞とを直接的な接触なしに共同培養することで、前記効果が表れたので、間葉幹細胞で分泌される物質により前記効果が表れたものと判断される。間葉幹細胞を単独に培養する場合に発現されないか、またはほぼ発現されないが、神経細胞と間葉幹細胞とを共同培養する場合、間葉幹細胞で発現が増加した分泌された蛋白質を分析した。その結果、総１４個の蛋白質がＡβ４２により惹起された毒性の抑制と神経細胞分化成熟とに関与していることを確認した。１４個の蛋白質は、アクチビンＡ、ＰＦ４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ ４）、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）、グリピカン３、ＭＦＲＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＩＣＡＭ５（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５）、ＩＧＦＢＰ７（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｈｔ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ７）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ）、ＳＰＡＲＣＬ１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１（ｗｎｔ−１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）及びプログラニュリンである。間葉幹細胞の代わりに、それらの蛋白質をそれぞれ神経細胞にＡβ４２と共に処理した結果、神経細胞の細胞死が顕著に減少し、Ａβ４２のみを処理した神経細胞に比べて、神経突起の長さが顕著に増加した（図１０及び図１１）。かかる意味において、前記１４種の蛋白質は、さらに詳細に説明される 。
【００２８】
アクチビンＡは、インヒビンベータＡ（インヒビンβＡ：ＩＮＨＢＡ）とも知られている蛋白質のホモダイマーである。人間において、ＩＮＨＢＡは、ＩＮＨＢＡ遺伝子によりコーディングされるものと知られる。ＩＮＨＢＡはＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００２１８３（配列番号１）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００２９】
血小板因子４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ ４：ＰＦ４）は、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド４（C-X-C motif ligand 4: ＣＸＣＬ４）とも知られている、ＣＸＣケモカインファミリに属する小さいサイトカインである。人間ＰＦ４遺伝子は、染色体４番に位置する。ＰＦ４はＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００２６１０（配列番号２）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３０】
デコリンは、平均分子量が約９０ないし１約４０ｋＤａのプロテオグリカンである。デコリンは、小さいロイシンリッチプロテオグリカン（small leucine-rich proteoglycan:ＳＬＲＰ）ファミリに属し、コンドロイチン硫酸（chondrointin sulfate: ＣＳ）またはデルマタン硫酸（dermatan sulfate: ＤＳ）から構成されたグリコースアミノグリカン（glycosaminoglycan: ＧＡＧ）を有するロイシン反復(leucine repeats)を含む蛋白質コアを含む。デコリンはＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００１９１１（配列番号３）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３１】
ガレクチン３は、ＬＧＡＬ３（ｌｅｃｔｉｎ，ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ，ｓｏｌｕｂｌｅ ３）とも知られており、ベータ・ガラクトシドに結合するレクチンの一種である。ガレクチン３は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿９１９３０８（配列番号４）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３２】
成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ１５：ＧＤＦ１５）は、マクロファージ阻害サイトカイン１（macrophage inhibitory cytokine 1: ＭＩＣ１）とも知られている、傷組織及び疾病過程で炎症経路（inflammatory pathway）及び細胞死経路を調節する役割を行う形質転換成長因子ベータ(transforming growth factor beta)スーパーファミリに属する蛋白質である。ＧＤＦ１５は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００４８５５（配列番号５）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３３】
グリピカン３は、グリピカンファミリに属する蛋白質であり、ＧＰＣ３とも知られている。グリピカン３は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００４４７５（配列番号６）のアミノ酸配列を有するものでありうる。グリピカンは、へパラン硫酸プロテオグリカン(heparin sulfate proteoglycan)のファミリであり、グリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinositol: ＧＰＩ）に共有結合を通じて細胞の表面に付着される。
【００３４】
膜フリズル関連蛋白質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＦＲＰ）は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿１１３６２１（配列番号７）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３５】
細胞間付着分子５（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５：ＩＣＡＭ５）は、テレンセファリンとも知られたＩＣＡＭファミリの一員である。ＩＣＡＭは、タイプＩ経皮糖蛋白質(type 1 transmembrane glycoprotein)であり、２ないし９個の免疫グロブリン類似Ｃ２タイプドメイン(immunoglobulin pseudo C2 type domains)を含み、白血球付着ＬＦＡ−１(lymphocyte function-associated antigen-1)蛋白質に結合する。ＩＣＡＭ５は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００３２５０（配列番号８）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３６】
インシュリン類似成長因子結合蛋白質７（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ７：ＩＧＦＢＰ７）は、ＩＧＦ(insulin-like growth factor)に特異的に結合するＩＧＦＢＰファミリの一員である。ＩＧＦＢＰ７は、ＩＧＦＢＰ−ｒｐ１（ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１）とも知られている。ＩＧＦＢＰ７は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００１５４４（配列番号９）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３７】
血小板由来成長因子ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＡＡ：ＰＤＧＦ−ＡＡ）は、ＰＤＧＦの一員である。ＰＤＧＦ−ＡＡは、二つのＰＤＧＦＡとも知られているＰＤＧＦアルファポリペプチドを含むホモダイマー糖蛋白質である。ＰＤＧＦは、細胞成長及び分裂を調節する蛋白質である。ＰＤＧＦは、また、血管の形成に関与する。ＰＤＧＦＡは、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＸＰ＿００１１２６４４１（配列番号１０）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３８】
分泌された酸性システインリッチ蛋白質類似蛋白質１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ−ｌｉｋｅ１：ＳＰＡＲＣＬ１）は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００４６７５（配列番号１１）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００３９】
トロンボスポンジン１（thrombospondin 1: ＴＳＰ１）は、ジスルファイド結合により連結されたホモトリマー蛋白質である。トロンボスポンジン１は、細胞と細胞、細胞とマトリックスとの相互作用を媒介する付着性の糖蛋白質である。トロンボスポンジン１は、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ラミニン及びタイプＶコラーゲンに結合しうる。トロンボスポンジン１は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００３２３７（配列番号１２）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００４０】
ＷＮＴ１誘導性信号伝達蛋白質１（ＷＮＴ１ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １：ＷＩＳＰ１）は、ＣＣＮ４とも知られており、ＷＩＳＰ蛋白質サブファミリの一員であり、結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）ファミリに属する。ＷＮＴ１は、多様な発生過程を媒介するシステインリッチ、グリコシル化された信号蛋白質の一員である。ＣＴＧＦファミリの構成員は、４個の保存されたシステインリッチドメイン:ＩＧＦ結合ドメイン、ｖＷＦタイプＣモジュール、トロンボスポンジンドメイン及びＣ−末端システインノット類似（ｋｎｏｔ−ｌｉｋｅ）ドメインにより特徴付けられる。ＷＩＳＰ１は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００３８７３（配列番号１３）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００４１】
プログラニュリン（ＰＧＮ）は、グラニュリンの前駆体である。プログラニュリンは、高度に保存された１２−システイングラニュリン／エピテリンモチーフの７．５反復(repeats)を有する単一の前駆体蛋白質であり、グラニュリン（granulin: ＧＲＮ）は、前記プログラニュリンからカットされて分泌された、グリコシル化されたペプチドのファミリである。プログラニュリンは、プロエピテリン及びＰＣ細胞由来成長因子ともいう。プログラニュリンは、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００１０１２４９７（配列番号１４）のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００４２】
また、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下で、ミクログリア細胞及び神経細胞をそれぞれ培養する場合、ミクログリア細胞及び神経細胞でそれぞれＮＥＰの発現が増加することを確認した。また、アルツハイマー病を有するマウスにＵＣＢ−ＭＳＣまたはＩＬ−４を投与する場合、アミロイド蛋白質プラークが減少することを確認した。また、アルツハイマー病を有するマウスにＵＣＢ−ＭＳＣまたはＩＬ−４を投与する場合、海馬体及び／または皮質を含む脳組織でＮＥＰの発現が増加することを確認した。また、アルツハイマー病を有したマウスにＵＣＢ−ＭＳＣまたはＩＬ−４を投与する場合、脳組織のミクログリア細胞でＮＥＰの発現が増加することを確認した。
【００４３】
インターロイキン-4（ＩＬ−４）は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）のＴｈ２細胞への分化を誘導するサイトカインである。ＩＬ−４により活性化される場合、Ｔｈ２細胞は、さらにＩＬ−４を生産する。ＩＬ−４は、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿０００５８０（配列番号３０）またはＮＰ＿０６７２５８のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００４４】
前記１４個の蛋白質は、人間由来だけでなく、他の哺乳動物由来の蛋白質も含む。例えば、齧歯類を含む。前記齧歯類には、マウスまたはラットが含まれる。
【００４５】
最近、幹細胞を利用した組織再生の薬についての研究と共に、アルツハイマー病のような退行性脳疾患の治療の可能性が提起されたが、現在の利用可能な幹細胞の技術は、アルツハイマー病のように広範囲の脳記憶喪失に適用するのには十分ではない。しかし、 本発明者らは間葉幹細胞がアミロイドベータによる神経細胞毒性を減少させ、脳中にある神経幹細胞の分化及び増殖を促進させることを発見したしたがって、アルツハイマー病及びその他の神経疾患の治療用細胞組成物(cellular preparation)の開発に希望を持たせた。また、間葉幹細胞が分泌する複数の蛋白質がアルツハイマー病のような神経疾患の治療効果を有しており、前記疾患の予防及び治療において可能性を高めることを発見した。
【００４６】
本発明は、間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中に含まれた蛋白質及び／または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を含む神経疾患の予防及び治療のための医薬組成物を提供する。前記神経疾患は、神経突起の損傷により引き起こされる神経疾患でありうる。前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症、躁病及びそれらの組み合わせありうる。
【００４７】
神経心理検査を通じて軽度認知障害(mild cognitive impairment)を表す痴呆前段階症状(pre-dementia syndrome) 経心理検査を通じて診断される。１年間軽度認知障害を有した患者のdir１２％がアルツハイマー病に進展するという報告がある。驚いたことに、軽度認知障害を有した患者がそのまま６年間放置されれば、約８０％がアルツハイマー病に進展される。したがって、軽度認知障害と診断された患者に本発明の医薬組成物を投与すれば、アルツハイマー病への進行が防止されるか、遅延される。
【００４８】
また、本発明は、間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を利用して、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でアミロイドベータによる神経細胞毒性の抑制、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化抑制、神経突起の損傷抑制及び神経細胞内のネプリリシンの発現誘導方法及びこのためのキットを提供する。前記キットは、神経細胞のの培養のために必要な成分をさらに含んでもよい。
【００４９】
本発明の間葉幹細胞、その培養液、前記培養液中の蛋白質または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系の刺激因子を含む医薬組成物は、さらにアルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症、躁病などの予防または治療効果のある他の活性成分と共に投与できる。
【００５０】
前記医薬組成物は、有効成分以外に薬学的に許容される添加剤をさらに含み、薬学的分野で通常の方法によって、患者の身体内の投与に適した単位投与型の製剤に剤形化させることができる。かかる目的のために、 注射剤または局所投与用製剤のような非経口投与(parenteral administration)製剤が使われる。例えば、必要に応じて、水あるいはその他の薬剤学的に許容できる溶媒を使用した無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤のような非経口投与のための剤形が使われる。単位投与剤形(unit dosage formulation)は、例えば、薬剤学的に許容される担体あるいは媒体、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビークル(vehicle)、防腐剤及び合剤を使用して製造される。
【００５１】
前記製剤は、通常の方法によって非経口的に投与される。前記非経口投与は、局部的または全身的投与を含む。前記局部的投与は、直接的に病変またはその周辺に投与すること、例えば、病変である脳または脊髄、その周辺またはその反対側部位に直接投与するのでありうる。前記全身的投与は、脊髄液、静脈または動脈に投与することを含む。前記脊髄液は、脳脊髓液を含む。前記動脈は、病変に血液を供給する部位でありうる。また、前記投与は、例えば、Ｄｏｕｇｌａｓ Ｋｏｎｄｚｉｏｌｋａ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５５，ｐｐ．５６５−５６９，２０００に記載された方法によって行われる。すなわち、まず、対象の頭蓋骨を約直径１ｃｍの孔を設けるように切開した後、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ′ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と混合された間葉幹細胞懸濁液を 注入するこの時、細胞懸濁液の注入は、長針のついた注射器と、脳の内部に目的とする細胞溶液を正位置に挿入するための枠(stereotactic frame)とを利用して行われる。
【００５２】
前記間葉幹細胞の１日投与量は、１×１０４ないし１×１０７細胞／ｋｇ体重、例えば、５×１０５ないし５×１０６細胞／ｋｇ体重でありうる。投与回数は、１回または数回に分けて投与できる。しかし、本発明の間葉幹細胞、例えば、臍帯血由来の間葉幹細胞の実際投与量は、疾患のタイプ、疾患の重症度、選択された投与経路、患者の体重、年齢及び性別などの色々な関連因子を考慮して 決定されるべきであるものと理解される。
【００５３】
本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００５４】
前記方法において、投与は、局部または全身投与でありうる。前記投与は、前記疾患を予防または治療するための有効量を投与するものでありうる。かかる有効な量は、前記疾患の条件によって変わりうるということは当業者に自明である。
【００５５】
前記方法に使われた前記医薬組成物は、前記した 前記組成物と同じである。前記方法において、前記医薬組成物に含まれた前記間葉幹細胞は、患者本人から採取されたもの(autologous cells)だけでなく、他人または他の医療用の動物由来の細胞(allogeneic cells)から採集される。細胞は、冷凍保存したものであってもよい。本発明の治療方法は、 人間に限定されない。通常、間葉幹細胞は、人間以外の哺乳動物においてもされる。
【００５６】
前記方法において、前記神経疾患は、アミロイドベータ、タウ蛋白質の過燐酸化、ネプリリシンの過少発現及び神経突起の損傷からなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患でありうる。前記神経疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病から構成された群から選択されるものでありうる。
【００５７】
本明細書において、アミロイドベータ（Ａβ）とは、アルツハイマー病を有した患者の脳に存在するアミロイドプラークの主要成分を意味する。前記アミロイドベータ（Ａβ）は、膜通過糖蛋白質であるアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）のＣ−末端から由来したアミノ酸を含むペプチドでありうる。前記Ａβは、ＡＰＰからβ−及びγ−セクレターゼの連続作用により生成される。 例えば、前記Ａβは、３９ないし４３個、例えば、４０ないし４２個のアミノ酸を含む。前記Ａβは人間アミロイドA4蛋白質イソフォーム前駆体（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ Ａ４ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ: ＡＰＰ）のＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿０００４７５（配列番号１９）のアミノ酸配列の６７２−７１３残基（Ａβ４２）または６７２−７１１残基（Ａβ４０）を含む。前記アミロイドベータ（Ａβ）は、哺乳動物由来のものでありうる。例えば、人間またはマウス由来のものでありうる。本明細書において、“タウ蛋白質”とは、中枢神経系の神経細胞で発見された微小管関連蛋白質(microtubule-associated protein: MAP)を表す。タウ蛋白質は、チューブリンと相互作用して微小管を安定化させ、微小管のチューブリンアセンブリを促進する。脳組織には、６個の相異なるタウイソフォームを含むものと知られている。タウ蛋白質の過燐酸化は、アルツハイマー病の発生と関連したものと知られている。タウ蛋白質は、高い溶解性を有する微小管関連蛋白質である。人間では、タウ蛋白質は、非神経細胞に比べて主に神経細胞に存在する。タウ蛋白質の機能のうち一つは、軸索微小管(axonal microtubule)の安定化を調節するものである。タウ蛋白質は、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿００５９０１（配列番号２０）のアミノ酸配列を有する微小管関連蛋白質タウイソフォーム２でありうる。前記タウ蛋白質は、哺乳動物由来のものでありうる。例えば、人間またはマウス由来のものでありうる。
【００５８】
本明細書において、ネプリリシンは、多くの小さい分泌されたペプチドを分解する亜鉛依存性のメタロプロテアーゼ酵素である。ネプリリシンはアミロイドベタが神経組織において非正常的にミスフォールディング及び凝集される場合、アルツハイマー病を引き起こすアミロイドベータペプチドを分解する。ネプリリシンは、例えば、ＮＣＢＩ Accession No.：ＮＰ＿０００８９３（配列番号２１）のアミノ酸配列を有しうる。前記ネプリリシンは、哺乳動物由来のものでありうる。例えば、人間またはマウス由来のものでありうる。
【００５９】
また、本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法を提供する。
【００６０】
前記方法において、 神経細胞のような神経組織は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）培養される。前記試験管内培養は、当業界に知られた間葉幹細胞及び／または神経細胞の培養培地で行われる。 前記間葉幹細胞と神経細胞のような神経組織とが互いに直接的な接触があるか、またはない状態で培養するものでありうる。例えば、 前記間葉幹細胞と神経細胞のような神経組織とがポアを有する膜により隔離された状態で培養されるものでありうる。前記膜は、前記間葉幹細胞の培養液中の生理活性物質が透過でき、細胞は透過できないポアサイズ及び配置を有するものでありうる。前記生理活性物質は、例えば、蛋白質、糖及び核酸でありうる。 前記膜は、前記膜の上部には、前記間葉幹細胞を培養し、膜の下部には、前記神経細胞を培養して、重力により前記生理活性物質が膜を透過して下部に移動できるように配置される。
【００６１】
前記生体内培養は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を個体に投与するステップをさらに含む。前記投与は、局部または全身投与でありうる。前記投与は、前記プラークの量を減少させるための有効量を投与するものでありうる。かかる有効な量は、選択される疾患の条件によって当業者が容易に選択できる。前記個体は、哺乳動物を含む。前記哺乳動物は、人間、マウスまたはラットを含む。
【００６２】
神経組織中のアミロイドプラークの前記減少は、間葉幹細胞及びその培養液の不在下で神経細胞のような神経組織を培養したものに比べて、神経組織内のアミロイドプラークの量を減少させるものでありうる。
【００６３】
本明細書において、“アミロイドプラーク(amyloid plaque)”とは、アミロイドベータを含む不溶性繊維蛋白質凝集体でありうる。前記アミロイドプラークは、細胞内、細胞膜上に及び細胞間の空間に存在しうる。
【００６４】
本明細書に使われた前記”神経組織(neural tissues)”は、中枢神経系、例えば、脳組織を含む。前記脳組織は、 大脳組織(cerebral tissues)と海馬体とを含む。前記大脳組織は、大脳皮質(cerebral cortex)を含む。前記神経組織は、神経細胞(neural cells)だけでなく、神経組織自体を含む。前記神経細胞は、神経細胞(neuronal cells)及び／またはミクログリア細胞を含む。前記神経組織を培養することは、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で神経細胞(neuronal cells)及び/またはミクログリア細胞のような神経細胞(neural cells)を培養することを含む。
【００６５】
また、本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、 神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法を提供する。
【００６６】
前記培養は、神経細胞内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。
【００６７】
神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の前記減少は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養したものに比べて、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の量を減少させるものでありうる。
【００６８】
また、本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養するステップを含む、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させる方法を提供する。
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現の前記増加は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養したものに比べて、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させるものでありうる。
【００６９】
また、本発明は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、神経細胞の神経突起成長を増加させる方法を提供する。
【００７０】
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。前記神経細胞は、正常神経細胞または 損傷した、例えば、Ａβにより誘導された損傷した、神経突起を有している神経細胞 でありうる。神経細胞の神経突起成長の前記増加は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養するものに比べて、神経細胞の神経突起成長を増加させるものでありうる。
【００７１】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００７２】
前記方法において、投与は、局部または全身投与でありうる。前記投与は、前記疾患を予防または治療するための有効量を投与するものでありうる。有効な量は、前記疾患の条件によって変わりうるということは当業者に自明である。
【００７３】
前記方法に使われた前記医薬組成物は、前記した 説明した通りである。
【００７４】
前記方法において、前記神経疾患は、アミロイドベータ、タウ蛋白質の過燐酸化、ネプリリシンの過少発現及び神経突起損傷からなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患でありうる。前記神経疾患は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病ありうる。
【００７５】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の存在下で神経組織を培養するステップを含む、 神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法を提供する。
【００７６】
前記方法において、神経細胞のような前記神経組織は、 試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で培養される。前記生体内培養は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上を個体に投与するステップをさらに含む。前記投与は、局部または全身投与でありうる。前記投与は、前記プラークの量を減少させるための有効量を投与するものでありうる。有効な量は、前記疾患の条件によって変わりうるということは当業者に自明である。例えば, アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つそれぞれは、約1ng/kg体重ないし約100mg/kg体重、例えば、約10ng/kg体重ないし約50mg/kg体重の量で投与される。 投与される形態は、水、培地、バッファまたは賦形剤のような添加剤をさらに含む。前記個体は、その神経組織からアミロイドプラークを減少させる必要がある任意の動物でありうる。前記動物は、哺乳動物を含む。前記哺乳動物は、人間、マウスまたはラットを含む。
【００７７】
前記アミロイドプラークは、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養するものに比べて、 その存在下で神経細胞を培養する場合に減少する。
【００７８】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法を提供する。
【００７９】
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の前記減少は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養するものに比べて、その存在下で神経細胞を培養する場合に減少する。
【００８０】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養するステップを含む、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させる方法を提供する。
【００８１】
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養するものに比べて、その存在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養する場合に増加する。
【００８２】
また、本発明 は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養するステップを含む、神経細胞の神経突起成長を増加させる方法を提供する。
【００８３】
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。前記神経細胞は、正常神経細胞または損傷した神経突起、例えば、Ａβにより誘導された損傷した神経突起を有している神経細胞でありうる。神経細胞の神経突起の前記成長は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらの発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞を培養するものに比べて、その存在下で神経細胞を培養する場合に増加する。
【００８４】
本明細書で使われる“間葉幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)”は、哺乳動物、例えば、人間, 胚嚢(human embryonic yolk sac)、胎盤(placenta)、臍帯(umbilical cord)、臍帯血(umbilical cord blood)、皮膚(skin)、末梢血液(peripheral blod)、骨髄(bone marrow)、脂肪組織(adipose tissue)、筋肉(muscle)、肝臓(liver)、神経組織(neural tissue)、骨膜(periosteum)、胎児膜(fetal membrane)、滑液膜(synovial membrane)、滑液(synovial fluid)、羊膜(amniotic membrane)、半月状軟骨(meniscus)、前十字靭帯(anterior cruciate ligament)、関節軟骨細胞(articular chondrocytes)、乳歯(deciduous teeth)、血管周囲細胞(pericyte)、支柱骨（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）、膝蓋骨下脂肪塊(infra patellar fat pad)、脾臓(speen)、胸腺(thymus)及びその他の間葉幹細胞を含む組織からなる群から選択された一つ以上から分離された間葉幹細胞 または前記分離された間葉幹細胞培養させて増殖された間葉幹細胞でありうる。
【００８５】
本明細書で使われる“臍帯血(umbilical cord blood)”は、人間を含む哺乳動物で、胎盤と胎児とを連結する臍帯静脈から採取された血液を表す。本明細書で使われる“臍帯血由来の間葉幹細胞(umbilical cord blood-derived MSC)”は、哺乳動物、例えば、人間の臍帯血から分離された間葉幹細胞及び前記分離された臍帯血由来の間葉幹細胞を培養して増殖された間葉幹細胞を意味する。
【００８６】
本明細書で使われた用語“治療(treating)”は、まだ疾患または障害 を保有していると診断されていないが、かかる傾向がある動物、例えば、人間を含む哺乳動物の疾病または障害が発生することの予防；疾患の進展の抑制；及び疾患の軽減を意味する。
【００８７】
本明細書で取り立てて定義されていない用語は、本発明が属する技術分野で通常的に使われる意味を有する。
【００８８】
臍帯血から間葉幹細胞を含む単核細胞を分離するためには、あらゆる公知の方法,例えば、 韓国登録特許第４８９２４８号に記載された方法が 使用される。例えば、フィコール・ハイパック密度勾配分離法(Ficoll-Hypaque density gradient method)が使用されるが、これに制限されない。具体的に、分娩後に胎盤が剥離される前に、臍静脈(umbilical cord vein)から採取した臍帯血をフィコール・ハイパック勾配で遠心分離して単核細胞を収得した。前記 単核細胞を数回洗浄して不純物を除去する。このように分離された単核細胞は、間葉幹細胞の分離及び培養に利用するか、または超低温冷凍させて長期間保管後に使用できる。
【００８９】
任意の知られた方法が前記臍帯血から間葉幹細胞を分離・培養するために使われる(韓国公開特許第２００３−００６９１１５号公報及びＰｉｔｔｉｎｇｅｒ ＭＦら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１４３−７，１９９９；及びＬａｚａｒｕｓ ＨＭら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１６：５５７−６４，１９９５）。
【００９０】
まず、採取された臍帯血を、フィコール・ハイパック濃度勾配を利用して遠心分離することで、造血母細胞(hematopoietic stem cell)及び間葉幹細胞を含む単核細胞を分離した後、数回洗浄して異物を除去する。適切な密度で単核細胞を培養容器で培養する。次に、前記単核細胞を増殖させて単一層を形成する。前記単核細胞のうち、位相差顕微鏡で観察される形態が同質性であり、かつ紡錘状(spindle-shaped)の長い形態の細胞の集落（ｃｏｌｏｎｙ）形態に増殖する細胞が間葉幹細胞である。前記成長された細胞を反復的にサブ培養して、必要なほどの細胞数を得る。
【００９１】
本発明の組成物に含まれる細胞は 公知の方法によって冷凍保管される （Ｃａｍｐｏｓら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３５：９２１−９２４，１９９５）。冷凍時に使われる培地は、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）, 及び１０ないし２０％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）,ヒト末梢血液または臍帯血の血漿または血清のうち一つを含む。前記細胞は、培地１ｍＬに約１×１０６ないし５×１０６個の細胞が存在するように懸濁できる。
【００９２】
前記細胞懸濁液を低温冷凍用のガラスまたはプラスチック材質のアンプルに分配し、それを密封して、予め温度条件が整えられたプログラム冷凍器に入れる。 したがって、例えば、−１℃／分で冷凍速度を調節する冷凍プログラムを利用して解凍間の細胞の損傷を最小化させる。一旦アンプルの温度が−９０℃以下に達すれば、液体窒素タンク中に移動させて−１５０℃以下に維持させる。
【００９３】
前記細胞を解凍するために、前記アンプルを液体窒素保存タンクから速かに３７℃水槽に移動させる。アンプル内に解凍された細胞は、滅菌状態下で培養培地が入っている培養容器に 速く移動させる。
【００９４】
本発明において、間葉幹細胞の分離・培養に使用される培養培地は、１０％ないし３０％のＦＢＳ,ヒト末梢血液または臍帯血の血漿または血清を含む当業界によく知られた任意の一般的な細胞培養用の培地でありうる。例えば、前記培養培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）,α−ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙｓ ５Ａ培地、イーグルス基本培地（ｅａｇｌｅ′ｓ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、ＣＭＲＬ（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）培地、Ｇｌａｓｇｏｗ最小必須培地、Ｈａｍ′ｓ Ｆ−１２培地、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ）、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ′ Ｌ−１５培地、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地であり、例えば、ＤＭＥＭでありうる。前記細胞は、前記培地１ｍＬ当たり約５×１０３ないし２×１０４個の細胞が存在するように 懸濁される。
【００９５】
また、本発明の前記細胞培養用の培地は、 一つ以上の補助成分を さらに含む。前記補助成分は、胎児牛 血清 、馬 血清 または人間 血清;及び微生物の汚染を防止するためのペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン(streptomycin sulfate)及びゲンタマイシン(gentamycin)のような抗生物質;アンホテリシンＢ(amphotericin B)及びナイスタチン(nystatin)のような抗真菌剤;及びそれらの混合物でありうる。
【００９６】
臍帯血由来の間葉幹細胞は、組織や器官(organ)の移植で拒否反応を起こす最も重要な原因である組織適合抗原ＨＬＡ−ＤＲ（ｃｌａｓｓ ＩＩ）を発現しない（Ｌｅ Ｂｌａｎｃ，ＫＣ，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，３１：８９０−８９６，２００３；及びＴｓｅ ＷＴら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７５：３８９−３９７，２００３）。移植後の免疫反応、例えば、移植された組織または器官の拒否を最小化できるため、自家由来の臍帯血及び他家由来の臍帯血が使われる。冷凍された細胞も使われる。
【００９７】
本発明の間葉幹細胞の培養液は、哺乳動物、例えば、人間の骨髄由来の間葉幹細胞、臍帯血由来の間葉幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞、胚嚢(embryonic yolk sac)由来の間葉幹細胞、胎盤由来の間葉幹細胞、皮膚由来の間葉幹細胞、末梢血液由来の間葉幹細胞、筋肉由来の間葉幹細胞、肝臓由来の間葉幹細胞、神経組織由来の間葉幹細胞、骨膜由来の間葉幹細胞、臍帯由来の間葉幹細胞、胎児膜由来の間葉幹細胞、滑液膜由来の間葉幹細胞、滑液由来の間葉幹細胞、羊膜由来の間葉幹細胞、半月状軟骨由来の間葉幹細胞、前十字靭帯由来の間葉幹細胞、関節軟骨細胞由来の間葉幹細胞、乳歯由来の間葉幹細胞、血管周囲細胞由来の間葉幹細胞、支柱骨由来の間葉幹細胞、膝蓋骨下脂肪塊由来の間葉幹細胞、脾臓由来の間葉幹細胞、胸腺由来の間葉幹細胞、及び間葉幹細胞が存在するその他の組織から分離及び／または培養された間葉幹細胞 を培養するために使われた培養溶液でありうる。
【００９８】
前記培養培地は、例えば、ＦＢＳまたはヒト末梢血液または臍帯血の血漿または血清を含む細胞培養用の培地でありうる。前記細胞培養用の培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ,α−ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙｓ ５Ａ培地、イーグルス基本培地(Eagle‘s basal medium)、ＣＭＲＬ培地、Ｇｌａｓｇｏｗ最小必須培地、Ｈａｍ′ｓ Ｆ−１２培地、ＩＭＤＭ(Iscove‘s modified Dulbecco‘s medium)、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ′ Ｌ−１５培地、及びＲＰＭＩ １６４０培地を含むが、これらに制限されるものではない。
【００９９】
本発明の間葉幹細胞の培養液は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン, IL-4またはそれらのうち一つ以上の発現を誘導する因子から構成された群から選択された一つ以上を含む。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、及びプログラニュリン、IL-4, または前記蛋白質のうち一つ以上を誘導する因子から構成された群から選択された一つ以上を活性成分として含む。
【０１０１】
前記蛋白質のうち一つ以上を誘導する前記因子は、信号伝達体系の刺激因子及び任意の知られた因子ありうる。前記因子は。前記因子は次の例でありうるが、これらに制限されるものではない。ガレクチン３を誘導する因子はホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（phorbol 12-myristate 13-acetate: ＰＭＡ）及び変形されたリポ蛋白質から構成された群から選択された一つ以上を含む。前記ＰＭＡまたは前記リポ蛋白質は、蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、ミトーゲン活性化された蛋白質キナーゼ１，２（ＭＡＰＫ−１，２）及びｐ３８キナーゼを経由して、ガレクチン３を誘導するものと知られている。ＰＤＧＦ−ＡＡを誘導する因子は、Ｅｔｓ−１（ａｖｉａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｅ２６（ｖ ｅｔｓ） ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）及びリソホスファチジルコリンからなる群から選択された一つ以上を含む。リソホスファチジルコリンは、ＭＡＰＫ−１，２を経由してＰＤＧＦ−ＡＡを誘導するものと知られている。
【０１０２】
あらゆる引用文献は、参照として本明細書にそれ全体として含まれる。
【実施例】
【０１０３】
本発明を下記実施例を参照して、さらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明を例示するだけであり、本発明の範囲が下記実施例により限定されるものではない。
【０１０４】
実施例
実施例１：神経幹細胞の分離及び培養
本発明の実験に使われた神経幹細胞は、次のように分離した。 神経幹細胞は、胎生１４日（以下、‘Ｅ１４’と略称する）となるＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（オリエントバイオ社製、韓国）の大脳皮質及び海馬体から分離した。まず、妊娠中であるラットの腹を切り、はさみと鉗子とを利用して胚芽を分離した。前記胚芽を切除用ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ′ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄した後、氷で冷たくなった(ice-cold)ＨＢＳＳを含む皿に置いた。微細顕微鏡下で注射針と鉗子とを利用してＥ１４胚芽の大脳皮質と海馬体とを分離した。前記分離した大脳皮質を無血清神経細胞培養液(serum free culture solution)で、ピペットで約１０ないし２０回ピペッティングして、細胞を単一細胞にした。前記単一細胞(single cells)をポリ−Ｌ−オルニチン（１５μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で３７℃で１６時間処理した後、 ２時間以上フィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）でコーティングしたカバースリップに塗抹した。前記単一細胞(single cells)を２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）とＢ２７無血清補強剤（Ｂ−２７ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）とが含まれた無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）培地下で、培養皿の底部の約７０％を細胞が満たすまで（７０ないし８０％コンフルエンス(confluence)）約２ないし４日間培養した。ｂＦＧＦを除去し、４ないし６日間神経細胞分化を誘導させた。分化間に、前記細胞を５％のＣＯ２培養器で３７℃で培養しつつ、二日に一回ずつ培地とＢ２７補強剤とを交換し、ｂＦＧＦは毎日添加した。このように分化された神経細胞を以下の実施例で使用した。
【０１０５】
実施例２：臍帯血由来の間葉幹細胞の分離及び増幅
臍帯血サンプルは、産婦の同意を得て出産時に臍静脈から収得した。具体的に、４４ｍＬのＣＰＤＡ−１（ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ−１）抗凝固剤（緑十字社製、韓国）を含む臍帯血収集バッグの１６−ゲージの注射針を臍静脈に挿入して、臍帯血を重力により収集バッグに集めた。前記収集された臍帯血(umbilical cord blood: UCB)は、採取後４８時間内に処理し、 単核細胞細胞の生存率は、９０％以上であった。臍帯血収得物をフィコール・ハイパック勾配（密度：１．０７７ｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ社製）で遠心分離して、単核細胞を収得した後、数回洗浄して不純物を除去した。１０％ないし２０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含有した最小基本培地（α−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を添加して、細胞を懸濁させた。前記細胞を適当な濃度で１０％ないし２０％のＦＢＳを含有した最小基本培地に分注した後、５％の二酸化炭素が供給される３７℃で細胞培養器で一週間に二回ずつ培地を交換して培養した。培養された細胞が単一層を形成すれば、位相差顕微鏡を利用して紡錘状に増殖された間葉幹細胞を確認した後、前記間葉幹細胞が十分に増殖されるまで継代培養を反復した。 臍帯血由来の間葉幹細胞(UCB-MSCs)は、１０ないし２０％のＦＢＳを含有するα−ＭＥＭで培養した。
【０１０６】
実施例３：アミロイドベータ蛋白質の毒性
アルツハイマー病の発病のための理想的な環境を作るために、アルツハイマー病を引き起こすものと知られたアミロイドベータ（Ａβ；ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ １−４２（Ｓｉｇｍａ、Ａ９８１０）：以下、Ａβ４２ともいう）１０μＭを含むｂＦＧＦとＢ２７とがない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地中で、実施例１に記載されたように 分化させた神経細胞を培養した。 神経幹細胞を約３ないし４日分化させた後、神経幹細胞の形態学的特性を顕微鏡で観察した。神経細胞に分化されたことが確認されれば、前記神経細胞にアミロイドベータを２４時間処理した。
【０１０７】
図１は、神経細胞の形態学的変化を測定するために、アミロイドベータと２４時間処理または処理されない生きている神経細胞の光学顕微鏡イメージを表す。アミロイドベータの濃度が高いほど、神経細胞の死滅が増加した。図１において、対照群は、アミロイドベータが含まれていない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で神経細胞を培養したものであり、Ａβ−１μＭ、Ａβ−５μＭ及びＡβ−１０μＭは、それぞれアミロイドベータを１μＭ、５μＭ及び１０μＭの濃度含む培地で、神経細胞を２４時間培養した結果を示すものである。
【０１０８】
実施例４：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とアミロイド・ベータを処理した神経細胞との共同培養が神経細胞死滅に及ぼす影響
アミロイド・ベータを処理した神経細胞とヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とを共同培養した時、アミロイド・ベータのような毒性物質により損傷した神経細胞を観察した。
【０１０９】
具体的に、Ｅ１４胚芽の大脳皮質幹細胞及び海馬体幹細胞を前記実施例１のように分離し、分離された神経幹細胞を増殖させて神経細胞に分化させ、実施例３に示したようにアミロイド・ベータ１０μＭを処理した。アミロイド・ベータを処理してから１２時間後、アミロイド・ベータが処理された神経細胞をアミロイド・ベータの存在下でヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間共同培養して、前記神経細胞をアミロイド・ベータの存在下で総２４時間培養した。共同培養は、図２に示したような共同培養システムで行われた。図２は、アミロイド・ベータが処理された神経細胞をヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養するための共同培養システムを示す。図２に示したように、共同培養システム１００は、上部チャンバー１０と下部チャンバー４０とを備え、前記上部チャンバー１０の底部は、孔隙が約１μｍのサイズである微細膜(microporous membrane)３０を備える。上部チャンバー１０には、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞２０を培養し、下部チャンバー４０には、大脳皮質幹細胞あるいは海馬体幹細胞から分化された神経細胞５０を培養した。前記上部チャンバー１０と下部チャンバー４０とは分離可能であり、前記上部チャンバー１０の底部の下部面と、下部チャンバー４０の底部の上部面とは、約１ｍｍの距離ほど離隔されている。共同培養は、下部チャンバー４０と上部チャンバー１０とで細胞をそれぞれ培養した後、上部チャンバー１０を下部チャンバー４０の培地に添加することで行われた。
【０１１０】
大脳皮質及び海馬体由来の神経細胞にアミロイド・ベータ処理を行わずに培養したもの、大脳皮質及び海馬体由来の神経細胞にアミロイド・ベータを処理したもの、アミロイド・ベータが処理されていない大脳皮質及び海馬体由来の神経細胞に間葉幹細胞を共同培養したものも培養及び観察した。損傷した大脳皮質及び海馬体由来の神経細胞及びヒト臍帯血由来の間葉幹細胞は、アミロイド・ベータを処理してから２４時間後共同培養し、神経細胞の損傷程度を顕微鏡で観察 した。前記培養は、ｂＦＧＦとＢ２７とがない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地（ＧＩＢＣＯ）を使用して実施した。
【０１１１】
神経細胞にアミロイド・ベータを処理する時、誘導される細胞死滅程度を定量的に測定するために、蛍光染色分析により生きている細胞と死んだ細胞とを測定した。細胞毒性の分析は、動物細胞のためのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ生存性／細胞毒性分析キット（Ｓｉｇｍａ、Ｌ３２２４）を使用した。前記キットは、カルセインＡＭとエチジウムホモダイマーとを含み、カルセインＡＭは、生きている細胞を確認するのに使われ、エチジウムホモダイマーは、死んだ細胞を確認するために使われる。カルセインＡＭは、非蛍光性の細胞透過性の染料であり、生きている細胞内に入れば、細胞内のエステラーゼの触媒活性によるアセトキシメチルエステルの加水分解反応により、緑色蛍光物質であるカルセインに転換される。エチジウムホモダイマーは、生きている細胞膜は通過できないが、損傷した細胞膜は透過し、細胞内の核酸に結合して赤色蛍光を発する。
【０１１２】
前記共同培養システムの下部チャンバー40内で、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβ４２を含有する培地中で培養して、Ａβ４２を直接神経細胞に処理した。生存／死亡細胞染色(live/dead staining)を通じて、死んだ細胞は、赤い色で染色され、生きている細胞は、緑色で観察した結果、Ａβ４２を１０μＭの濃度で２４時間処理した細胞（図３のＣｔ＋Ａβ）と、処理していない細胞（図３のＣｔ）とを比較する時、Ａβ４２を処理した場合、緑色蛍光が顕著に減り、赤い蛍光染色部分が広範囲に観察された。これは、ほとんどの神経細胞がＡβ４２により細胞死したということを表す。しかし、このように損傷した神経細胞に、図２に示したような共同培養システムを利用して臍帯血由来の間葉幹細胞を共同培養すれば、神経細胞の死滅が防止され、神経細胞の成熟がさらに増加した（図３のＣｔ＋Ａβ＋ＭＳＣ）。これは、Ａβ４２により既に損傷した神経細胞をＵＣＢ−ＭＳＣと共同培養する場合、損傷した神経細胞を損傷しない状態に復帰させるということを表す。また、図３において、Ｃｔ＋Ａβ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を１０μＭの濃度で含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間共同培養した結果である。また、下部チャンバー40で、１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で、無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を培養すると共に、上部チャンバー10で、臍帯血由来の間葉幹細胞を２４時間同じ培地で共同培養しても、図３のＣｔ＋Ａβ＋ＭＳＣに示したような結果が得られた。これは、神経細胞をＵＣＢ−ＭＳＣと共同培養する場合、Ａβ４２により既に損傷した神経細胞を損傷しない状態に復帰させるだけでなく、Ａβ４２により神経細胞が損傷しないように予防できるということを表す。
【０１１３】
図３において、Ｃｔは、Ａβ４２を含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を２４時間培養した結果であり、Ｃｔ＋Ａβは、Ａβ４２を１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を２４時間培養した結果であり、Ｃｔ＋Ａβ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間共同培養した結果であり、Ｃｔ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で、大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間共同培養した結果を表す。
【０１１４】
図４は、図３の結果を死んだ細胞の百分率で表示したものである。図４において、Ｃｏｒｔｅｘは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ42を含まない培地で培養した対照群結果を表し、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ42を１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβ＋ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ42を１０μＭの濃度に含む培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに培養した結果を表し、Ｃｏｒｔｅｘ＋ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ42を含まない培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間さらに培養した結果を表す。
【０１１５】
実施例５：ヒト骨髄由来の間葉幹細胞とアミロイド・ベータを処理した神経細胞との共同培養時に、神経細胞死滅に及ぼす影響
寄贈された骨髄から採取した骨髄由来の間葉幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を使用して、実施例４のような方法で実験を行った。Ａβが処理された神経細胞に骨髄由来の間葉幹細胞を共同培養すれば、実施例４の臍帯血由来の間葉幹細胞を共同培養した場合と同様に、神経細胞の死滅が抑制された（図５のＣｔ＋Ａβ＋ＢＭ−ＭＳＣ）。
【０１１６】
図５は、Ａβ４２による神経細胞死滅についての神経細胞とヒト骨髄由来の間葉幹細胞との共同培養の効果を表す蛍光染色の結果である。図５において、Ｃｔは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で培養した対照群結果を表し、Ｃｔ＋Ａβは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ｃｔ＋Ａβ＋ＢＭ−ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で１２時間培養した後、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに培養した結果を表し、Ｃｔ＋ＢＭ−ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で１２時間培養した後、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞と１２時間さらに培養した結果を表す。
【０１１７】
実施例６：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とアミロイド・ベータを処理した神経細胞との共同培養時に、タウ蛋白質の燐酸化に及ぼす影響
図６は、Ａβ４２により燐酸化されたｔａｕに結合する抗体である 抗−ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕ抗体を利用して神経細胞を 表すものであって、 tau蛋白質は、神経細胞の死亡を誘発する蛋白質と知られた。前記抗−ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕ抗体とｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕとの結合を可視化するために、抗−ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔａｕ抗体は、赤い蛍光を有するＣｙ３と接合させた。
【０１１８】
図６において、第１列は、Ｃｙ３が接合された抗−ｐｈｏｓphor−ｔａｕ抗体で染色した 神経細胞を表し、第２列は、４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した神経細胞を表す。図６の第１列において、Ｃｔは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で培養した対照群結果を表し、Ａβ４２は、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ａβ４２／ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに培養した結果を表し、ＭＳＣは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間さらに培養した結果を表す。図６の第１列に示したように、神経細胞でタウ蛋白質は、Ａβ４２により急激に燐酸化されたが、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞の共同培養により脱燐酸化された（Ａβ４２及びＡβ４２／ＭＳＣ参照）。
【０１１９】
図６の第２列に示したように、ＤＡＰＩ染色は、図６の第１列で抗−ｐｈｏｓphor−ｔａｕ抗体で染色されない 大脳皮質由来の神経細胞が維持されていることを表す。ＤＡＰＩ染色は、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤＴＭ（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を使用し、ＤＡＰＩが含まれた搭載媒質(mounting medium)を細胞のあるスライドガラスに顕微鏡観察直前に添加して使用した。
【０１２０】
実施例７：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とアミロイド・ベータを処理した神経細胞との共同培養時に、免疫蛍光染色法を利用した分化された神経細胞分析
神経細胞の分化マーカーとして知られた微小管関連蛋白質（ＭＡＰ２）とチューブリンβＩＩＩとに特異的に結合する抗体を利用して、大脳皮質と海馬体幹細胞とから由来した神経細胞を染色した。
【０１２１】
免疫蛍光染色を 次の通りで行った。神経細胞を４％のパラホルムアルデヒドで、常温で２０分間１２ウェルプレートのウェルに固定し、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ４回洗浄する。洗浄後、１０％のＮＧＳ（ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳを含む溶液を添加し、常温で３０分ないし４５分間反応させて非特異反応を遮断させた。一次抗体を含む１０％のＮＧＳ及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を前記ウェルに添加し、４℃で一晩反応させた。０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ３回洗浄した。二次抗体及び二次抗体に結合する試薬を含む０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて常温で４分間反応させた後、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分間４回洗浄した。一次抗体は、マウスで生産された単一クローン抗-チューブリンβＩＩＩ (anti-tubulin βＩＩＩ antibody)（Ｓｉｇｍａ）及びうさぎ多クローン抗-ＭＡＰ２ (anti-microtubule associated protein 2 antibody)（ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をそれぞれ１：５００及び１：２００に緩衝溶液中に希釈して準備した。二次抗体は、ビオチン化された抗−マウス抗体及びビオチン化された抗−うさぎ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）をそれぞれ１：２００に緩衝溶液中に希釈して準備した。二次抗体に結合する試薬は、ジクロロトリアジニルフルオレセイン(dichlorotriazinyl fluorescein)（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して準備した。
【０１２２】
Ａβ４２を処理した神経細胞（大脳皮質及び海馬体由来の細胞）では、毒性により神経突起が切断され、神経細胞模様が凝縮された。一方、臍帯血由来の間葉幹細胞を共同培養した神経細胞では、神経突起が維持され、神経細胞の成熟が促進された（図７A, 7B及び7C）。
【０１２３】
図７は、Ａβ４２処理され、臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養し、抗チューブリンβＩＩＩ及び抗ＭＡＰ２及びウェスタンブロッティングを利用して、免疫蛍光染色法で 染色された神経細胞を表す。
【０１２４】
図７Ａは、大脳皮質由来の神経細胞を表し、図7Ｂは、海馬体由来の神経細胞を表す。ＭＡＰ２及びＴｕｂｕｌｉｎβＩＩＩは、それぞれ抗ＭＡＰ２及び抗チューブリンβＩＩＩを利用して、免疫蛍光染色した結果を示す。対照群(control)は、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した対照群結果を表し、Ａβ４２は、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ａβ４２／ＭＳＣは、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに培養した結果を表し、ＭＳＣは、大脳皮質または海馬体由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間さらに培養した結果を表す。
【０１２５】
図７Ｃは、Ａβ４２処理された大脳皮質由来の神経細胞を臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養し、培養された神経細胞を抗ＭＡＰ２抗体を利用してウェスタンブロッティングした結果を示す図面である。まず、培養された神経細胞の膜をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれた溶解バッファで、超音波破砕器を使用して 粉砕し、蛋白質を抽出した。抽出された蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に適用し、電気泳動して蛋白質サイズによって分離した。電気泳動後、分離された蛋白質を電気的性質を利用してニトロセルロース膜に移し、３％の脱脂粉乳が含まれたＰＢＳに希釈された抗ＭＡＰ２抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃｈｅｍ社製）を添加して反応させた。次いで、//ストレプトアビジン(streptavidin)に接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）が接合された抗うさぎ抗体を添加して反応させ、酵素の基質であるＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）溶液を処理してＸ−ｒａｙフィルムで現像した。図７Ｃにおいて、対照群、Ａβ、Ａβ＋ＭＳＣ及びＭＳＣは、前記した通りである。図７Ｃにおいて、２００は、バンドに該当する分子量２００ｋＤａを表す。
【０１２６】
実施例８：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞による神経細胞及びミクログリア細胞内のネプリリシン発現の誘導
ネプリリシン（ＮＥＰ）は、インシュリン分解酵素（ＩＤＥ）と共に生体内でＡβ４２を分解して除去できる蛋白質と知られている。また、マウスでＮＥＰをノックアウトさせれば、アルツハイマー病の症状が観察されることが報告された。本実施例では、前記実施例４ないし７で得られた神経細胞を収穫して溶解させた後、蛋白質を抽出した。蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して分離し、分離された蛋白質を抗ネプリリシン抗体を利用してウェスタンブロッティングして、ＮＥＰ蛋白質の発現程度を測定した。また、ＮＥＰ特異プライマーを利用して、ＮＥＰのｍＲＮＡ発現程度をＲＴ−ＰＣＲで測定した。また、抗ＮＥＰ抗体で培養された細胞を染色した。
【０１２７】
まず、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで常温で２０分間１２ウェルプレートのウェルに固定し、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ４回洗浄する。洗浄後、１０％のＮＧＳ、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳを含む溶液を添加し、常温で３０分ないし４５分間反応させて、非特異反応を遮断させた。一次抗体を含む１０％のＮＧＳ及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を前記ウェルに添加し、４℃で一晩反応させた。０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ３回洗浄し、二次抗体及び二次抗体に結合する試薬を含む０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて、常温で４０分間反応させた後、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分間４回洗浄した。一次抗体は、マウスで生産された単一クローン抗-ＮＥＰ（Ｓｉｇｍａ）を１：５００に緩衝溶液中に希釈して使用した。二次抗体は、ビオチン化された抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。二次抗体に結合する試薬としては、ストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。
【０１２８】
図８は、Ａβ４２処理されたラット由来の神経細胞と、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞またはヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とを共同培養する時、ラット由来の神経細胞でネプリリシンの発現程度を観察した結果である。
【０１２９】
図８のＡの上端は、培養されたラットの大脳皮質由来の神経細胞を、ウェスタンブロッティングした結果を表す。Ｎｅｕｒｏｎは、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した対照群結果を表し、Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβは、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む培地で２４時間培養した結果を表し、Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ＋ＭＳＣは、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ４２存在下で１２時間さらに共同培養した結果を表し、Ｎｅｕｒｏｎ＋ＭＳＣは、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間さらに共同培養した結果を表す。
【０１３０】
図８のＡの下端は、培養されたラットの神経細胞から分離されたｍＲＮＡをテンプレートにしてＲＴ−ＰＣＲした結果を表す。使われたＰＣＲプライマーは、配列番号１５及び１６のラットのＮＥＰ遺伝子の特異的プライマーを使用し、β−ａｃｔｉｎ遺伝子の特異的プライマーは、配列番号１７及び１８のプライマーを使用した。ＰＣＲ結果、ＮＥＰ遺伝子に対して４２２ｂｐ、β−ａｃｔｉｎ遺伝子に対して３００ｂｐの増幅産物が得られた。Ｎｅｕｒｏｎ，Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ，Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ＋ＭＳＣ及びＮｅｕｒｏｎ＋ＭＳＣは、前述した通りである。
図８のＡに示したように、ラット由来の神経細胞にＡβ４２を処理した場合、ＮＥＰの発現は減り、Ａβ４２が処理されたラット由来の神経細胞をヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養する場合、ＮＥＰの発現が蛋白質とｍＲＮＡ段階で増加することを確認した。これは、ヒト間葉幹細胞がラット由来の神経細胞を刺激して神経細胞のＮＥＰの生成を増加させ、Ａβ４２毒性蛋白質を除去できることを証明する結果といえる。
【０１３１】
図８のＢにおいて、Ｃｔ，Ａβ，Ａβ＋ＭＳＣ及びＭＳＣは、前述したようなＮｅｕｒｏｎ，Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ，Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａβ＋ＭＳＣ及びＮｅｕｒｏｎ＋ＭＳＣにそれぞれ対応する。
【０１３２】
細胞の染色過程は、次の通りである。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで、常温で２０分間１２ウェルプレートのウェルに固定し、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ４回洗浄する。洗浄後、１０％のＮＧＳ、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳを含む溶液を添加し、常温で３０分ないし４５分間反応させて、非特異反応を遮断させた。一次抗体を含む１０％のＮＧＳ及び０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を前記ウェルに添加し、４℃で一晩反応させた。０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分ずつ３回洗浄し、二次抗体及び二次抗体に結合する試薬を含む０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて常温で４０分間反応させた後、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで５分間４回洗浄した。一次抗体は、マウスで生産された単一クローン抗-ＮＥＰ（Ｓｉｇｍａ） 抗体 を１：５００に緩衝溶液中に希釈して使用した。二次抗体は、ビオチン化された抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。二次抗体に結合する試薬としては、ストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。
【０１３３】
図８のＢに示したように、神経細胞にＡβ４２を処理すれば、赤く染色された部分が顕著に減少して、ＮＥＰの発現がラット由来の神経細胞で減ったことを表す。しかし、前記神経細胞と人間由来の間葉幹細胞とを共同培養すれば、ラット由来の神経細胞でＮＥＰの発現が再び回復された。
【０１３４】
また、図８のＣは、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を利用して同一実験を行って、ラット由来の神経細胞内のＮＥＰの発現が増加することをＲＴ−ＰＣＲで確認したものである。
【０１３５】
ＮＥＰとβ−ａｃｔｉｎとのＲＴ−ＰＣＲは、図８のＡで説明した//ものと 同様プライマーを使用して、 同様条件で行った。図８のＣにおいて、レーン１は、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した対照群結果を表し、レーン２及び３は、ラットの大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ１及びＢＭ−ＭＳＣ２）と１２時間さらに共同培養した結果を表す。ここで、ＢＭ−ＭＳＣ１及びＢＭ−ＭＳＣ２は、相異なる供与者から得た細胞を表す。 図８Ｃに示した結果は、ラットの大脳皮質由来の神経細胞をヒト骨髄由来の間葉幹細胞と共同培養する場合、mRNAレベルでラットの大脳皮質由来の神経細胞でNEP発現の増加を表す。さらに、ウェスタンブロッティング及び免疫ブロッティング結果、蛋白質レベルでもＢＭ−ＭＳＣをラット由来の神経細胞と共同培養する場合、前記神経細胞でＮＥＰの発現が増加することが確認された。
【０１３６】
脳には、神経細胞だけでなく、ミクログリア細胞(microglial cell)があるが、ミクログリア細胞は、脳の大食細胞と呼ばれ、脳に蓄積された毒性物質を除去する細胞と知られている。 前記ミクログリア細胞は、アルツハイマー病でＡβを除去する。 最近、報告によれば、ミクログリア細胞でネプリリシンの発現が減少すれば、アルツハイマー病の進行が促進されるという報告があった。したがって、ヒト臍帯血細胞によりNEPの発現の回復は、免疫蛍光染色法を使用して神経細胞及びミクログリア細胞で確認した（図９）。図９は、Ａβ４２処理された神経細胞と間葉幹細胞とを共同培養した後、ネプリリシンの発現程度を神経細胞とミクログリア細胞とで確認した結果である。
【０１３７】
図９の第１列は、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ42存在下で１２時間さらに共同培養した後、神経細胞マーカーであるＭＡＰ２とＮＥＰとにそれぞれ特異的に結合する抗体で二重染色した結果を表す図面である。染色過程は、ＭＡＰ２に対する１次抗体としてうさぎ由来の抗ＭＡＰ２抗体、前記一次抗体に結合する二次抗体としてビオチン化された抗うさぎ抗体、及びMAP2に対する二次抗体に結合する試薬としてストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、ＮＥＰに対する一次抗体としてマウス単一クローン抗ＮＥＰ体抗(anti-NEP antibody)（Ｓｉｇｍａ）、二次抗体としてビオチン化された抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）、及び二次NEPに対する抗体に結合する試薬としてストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した点を除いては、前記図８のＢと同じ過程により染色した。図９の第１列において、ＭＡＰ２とＮＥＰとは、同じ細胞を抗ＭＡＰ２と抗ＮＥＰ抗体とでそれぞれ染色した結果を表し、ＭＡＰ２＋ＮＥＰは、同じ細胞を抗ＭＡＰ２と抗ＮＥＰ抗体とでそれぞれ染色した結果のイメージを重なったイメージを表す。ＤＡＰＩは、図６の第２列と同じ過程によりＤＡＰＩ染色した結果を表す。
【０１３８】
図９の第１列に示したように、ＭＡＰ２及びＮＥＰ いずれも染色されることからみて、前記細胞は、ＭＡＰ２及びＮＥＰをいずれも発現するものと確認された。また、イメージ重複結果（ＭＡＰ２＋ＮＥＰ）、ＭＡＰ２及びＮＥＰは、いずれも同じ領域で発現されるものと確認され、これは、前記神経細胞がＭＡＰ２及びＮＥＰいずれも発現するということを表す。ＤＡＰＩ染色結果、神経細胞で染色され、これは、前記神経細胞が正常に維持されていることを表す。
【０１３９】
図９の第２列は、大脳皮質由来の神経細胞(neuron)の代わりに、ミクログリア細胞を使用し、ＭＡＰ２及びＮＥＰに対して染色する代わりに、ミクログリア細胞のマーカーであるＣＤ４０及びＮＥＰに対して染色した点を除いては、図９の第１列と同様 に実験した結果を表した図面である。ＣＤ４０に対する染色は、ＣＤ４０に対する一次抗体としてヤギ由来の抗ＣＤ４０抗体、前記一次抗体に結合する二次抗体としてビオチンが接合された抗ヤギ抗体、及び二次抗体に結合する試薬としてストレプトアビジンに接合されたジクロロトリアジニルフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：２００に緩衝溶液中に希釈して使用した。
【０１４０】
図９の第２列に示したように、ＣＤ４０及びＮＥＰでいずれも染色されることからみて、前記ミクログリア細胞は、ＣＤ４０及びＮＥＰをいずれも発現するものと確認された。また、イメージ重複結果（ＣＤ４０＋ＮＥＰ）、ＣＤ４０及びＮＥＰは、いずれも同じ領域で発現されるものと確認され、これは、前記ミクログリア細胞がＣＤ４０及びＮＥＰいずれも発現するということを表す。ＤＡＰＩ染色結果、ミクログリア細胞で染色され、これは、前記ミクログリア細胞が正常に維持されていることを表す。
【０１４１】
図９の第１列及び第２列の結果から、 神経細胞とミクログリア細胞とを臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養する場合、Ａβで処理された神経細胞とミクログリア細胞とでいずれもＮＥＰの発現が誘導されるということが確認された。
【０１４２】
実施例９：間葉幹細胞が分泌して、Ａβ４２の毒性を抑制する分泌蛋白質の同定及び効果検証
実施例４ないし８の結果、Ａβ４２で処理された神経細胞を間葉幹細胞と直接的な接触のない状態で共同培養する場合、前記神経細胞でＡβ４２の毒性活性が抑制されるということが確認された。これは、間葉幹細胞から分泌された物質が前記神経細胞に相互作用して、Ａβ４２の毒性活性を抑制するものと予測できる。
【０１４３】
本実施例では、間葉幹細胞から分泌された物質のうち、Ａβ４２の毒性活性を抑制する物質を探索して確認した。
【０１４４】
（１）間葉幹細胞由来のＡβ４２の毒性活性を抑制する物質探索
まず、細胞を次のような色々な条件で培養した。
培養群１：大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した。
培養群２：大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した。
培養群３：大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で１２時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ42存在下で１２時間さらに共同培養した。
培養群４：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞を、Ａβを１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した。
培養群５及び６：ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞を無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養した。
【０１４５】
次いで、前記培養群１ないし６から培地を収穫し、培地中のサイトカイン及び蛋白質を分析及び比較して、幹細胞を単独に培養する場合に発現されないか、またはほぼ発現されないが、幹細胞と神経細胞とを共同培養する場合、発現が増加したサイトカインまたは蛋白質を選別した。サイトカインの分析は、ＲａｙＢｉｏＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｉ Ｇ ｓｅｒｉｅｓ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）を使用して行われ、蛋白質の分析は、ＲａｙＢｉｏＴＭＨｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｉ Ｇ ｓｅｒｉｅｓ／Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌ Ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｉ Ｇ ｓｅｒｉｅｓ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）を使用して行われた。前記二つのアレイは、総５４，５０４種類の蛋白質を分析できる。
【０１４６】
分析結果、得られたデータを比較して、幹細胞を単独で培養する場合に発現されないか、またはほぼ発現されないが、幹細胞と神経細胞とを共同培養する場合、発現が増加した蛋白質を選別した。その結果、下記のような１４種類の蛋白質が確認された：
アクチビンＡ、血小板因子４（ＰＦ４）、デコリン、ガレクチン３、成長分化因子１５（ＧＤＦ１５）、グリピカン３、膜タイプのフリズル関連蛋白質（ＭＦＲＰ）、細胞間付着分子５（ＩＣＡＭ５）、インシュリン類似成長因子結合蛋白質７（ＩＧＦＢＰ７）、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、分泌された酸性システインリッチ蛋白質１（ＳＰＡＲＣＬ１）、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）、ＷＮＴ１誘導性分泌された蛋白質１（ＷＩＳＰ１）及びプログラニュリン（ＰＧＮ）であった。
前記１４種類の蛋白質がＡβ処理された神経細胞で毒性を抑制し、神経細胞の分化と成熟とを促進するものと推定した。
【０１４７】
（２）探索された１４種の蛋白質の活性確認
探索された１４種の蛋白質の組み替え蛋白質を購入した（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）。次いで、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ及び前記１４種の蛋白質それぞれをアクチビンＡ ２５ｎｇ／ｍｌ、ＰＦ４ ２５ｎｇ／ｍｌ、ガレクチン３ ３ｎｇ／ｍｌ、デコリン１００ｎｇ／ｍｌ、ＧＤＦ１５ ５０ｎｇ／ｍｌ、グリピカン３ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＭＦＲＰ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＣＡＭ５ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦＢＰ７ ３０ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦ−ＡＡ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＰＡＲＣＬ１ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＳＰ１ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＷＩＳＰ１ ５０ｎｇ／ｍｌ及びプログラニュリン５０ｎｇ／ｍｌの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地に添加し、２４時間培養した。培養後、死んだ細胞と生存可能な細胞とは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ生存性／細胞毒性分析キット（Ｓｉｇｍａ，Ｌ３２２４）を使用した蛍光染色を通じて測定した。測定された死んだ細胞と生存可能な細胞との数に基づいて、Ａβにより誘導された神経細胞の細胞死程度を計算した。細胞死は、全体の細胞数に対する死んだ細胞の割合で計算した。
【０１４８】
図１０は、間葉幹細胞の培養時に分泌される蛋白質と、Ａβ４２処理された神経細胞とを培養する時、百分率で表示した神経細胞死を表した図面である。図１０において、Ｃｏｒｔｅｘは、Ａβ４２を含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を２４時間培養したものであり、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβは、Ａβ４２を１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を２４時間培養したものであり、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を１０μＭの濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１０μＭの濃度のＡβ42存在下で１２時間共同培養したものであり、Ｃｏｒｔｅｘ＋ＭＳＣは、Ａβ４２を含まない無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で大脳皮質由来の神経細胞を１２時間培養した後、臍帯血由来の間葉幹細胞と１２時間共同培養した結果を表す。Ａβは、大脳皮質由来の神経細胞を、Ａβ４２及び前記１４種の蛋白質それぞれを前記した濃度に含む無血清ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地で２４時間培養したものである（図１０において、ｐ＜０．０３，ｐ＜０．０１は、ｔ−ｔｅｓｔ結果、誤差範囲がそれぞれ３％及び１％未満であるということを表す）。
【０１４９】
図１０に示したように、１４個の蛋白質それぞれは、Ａβ４２による神経細胞の細胞死を抑制した。細胞死の抑制程度は、Ｃｏｒｔｅｘ＋Ａβ＋ＭＳＣ、ガレクチン３、ＷＩＳＰ１及びＭＦＲＰの順に高かった。これは、臍帯血由来の幹細胞の共同培養、すなわち、１４個の蛋白質の組み合わせで最も強い抑制効果があるということを暗示する。
【０１５０】
また、１４個の蛋白質が神経細胞の成熟に及ぼす影響を調べるために、培養された神経細胞の神経突起の長さを測定した。培養条件は、図１０に示したように培養した。神経突起の長さ測定は、１００個の細胞を各培養群当たりランダムに選択し、ｉ−ｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（ｉＭＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を利用して神経突起の長さを測定した。
【０１５１】
図１１は、間葉幹細胞の培養時に分泌される蛋白質と、Ａβ４２処理された神経細胞とを培養する時、神経細胞の神経突起の長さを測定した結果である。図１１において、培養群は、図１０に示した通りであり、 神経突起の長さは、平均長を表す。図１１に示したように、１４個の蛋白質それぞれは、単独または組み合わせてＡβ４２処理された神経細胞に比べて神経突起の長さを顕著に増加させた。
【０１５２】
実施例１０：間葉幹細胞から分泌されて、ミクログリア細胞でネプリリシンの発現を誘導するサイトカインの同定
本実施例では、実施例４に説明されたような共同培養システム100を使用した。下部チャンバー40にミクログリア細胞、ＢＶ２細胞を培養し、上部チャンバー10には、臍帯血由来の間葉幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）を培養した。ＢＶ２細胞は、培養されたマウスミクログリア細胞をｖ−ｒａｆ／ｖ−ｍｙｃ組み替えレトロウイルスで感染させて不滅化されたものであって、活性化されたミクログリア細胞の特性を発現する。共同培養は、下部チャンバー40で５％のＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地でＢＶ２細胞を培養した後、５％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で培養された臍帯血由来の間葉幹細胞を上部チャンバー10に添加し、培地を無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間共同培養した。その後、上部チャンバー10のＭＳＣを回収して、トリゾール試薬を使用して総ＲＮＡを得て、得られた総ＲＮＡをテンプレートにしてＲＴ−ＰＣＲを行った。使われたプライマーは、ＩＬ−４（配列番号２２及び２３）、ＩＬ−６（配列番号２４及び２５）、ＩＬ−８（配列番号２６及び２７）及びＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）（配列番号２８及び２９）遺伝子を特異的に増幅させるプライマーを使用した。ＰＣＲ対照群として、配列番号１７及び１８のプライマーを使用してβ−アクチンを増幅した。対照群としては、ＢＶ２細胞と共同培養されていないものを除いては、同じ条件で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣを使用した。
【０１５３】
図１２は、ミクログリア細胞とＵＣＢ−ＭＳＣとを共同培養した後、ＵＣＢ−ＭＳＣから分離された総ＲＮＡをテンプレートにしてＲＴ−ＰＣＲした産物を示す図面である。図１２に示したように、ミクログリア細胞とＵＣＢ−ＭＳＣとを共同培養する場合、ＵＣＢ−ＭＳＣでＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−８及びＭＣＰ−１の発現が増加した。
【０１５４】
ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−８及びＭＣＰ−１それぞれの存在下で、ミクログリア細胞、ＢＶ２細胞、神経細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ社製）を培養し、ＢＶ２細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を回収した。回収された細胞を溶解し、細胞溶解物から蛋白質をサイズ別に分離した後、抗ＮＥＰ抗体を使用してウェスタンブロッティングした。その結果、ＩＬ−４の存在下でＢＶ２細胞及びＳＨＹ−５Ｙ細胞を培養する場合、ＩＬ−４の不在下で培養する場合に比べて、ＮＥＰの発現が経時的に増加した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨから由来したトリスクローンされたニューロブラストーマである。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、神経細胞を表す。
【０１５５】
図１３は、ＩＬ−４の存在下で神経細胞及びミクログリア細胞を培養する場合、ＮＥＰの発現が増加することを表すウェスタンブロッティング結果を示す図面である。図１３のＡは、ミクログリア細胞であるＢＶ２細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した結果である。図１３のＢは、神経細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含むα−ＭＥＭ培地で２４時間培養した結果である。
【０１５６】
実施例１１：アルツハイマー病の形質転換マウスの海馬体及び皮質内の臍帯血由来の間葉幹細胞の投与によるアミロイド蛋白質プラークの減少（チオフラビンＳ染色法及び免疫ブロッティング）
治療効果の増進のために、アルツハイマー病の形質転換マウス１０ヶ月齢にＰＢＳ、ＰＢＳ中の１×１０４の臍帯血間葉幹細胞、及びＰＢＳ中のＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）２００μｇ／ｋｇそれぞれを、定位フレーム(stereotactic frame)を利用して海馬体に投与した。１０日が経過してからマウスを犠牲にした後、脳組織を海馬体と皮質とから得た。得た脳組織を切片に作り、チオ硫酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）の染色を通じてアミロイドベータ蛋白質の沈着程度を染色した結果を確認した。プラークを確認するために、５０％のエタノールに溶かしたＳｉｇｍａ社製のチオフラビン溶液に組織を５分間反応させた。反応後、組織の切片を５０％のエタノール及び水で５分間洗浄した。この組織の切片を蛍光顕微鏡下で観察して、組織内のアミロイド蛋白質プラークを確認した。
【０１５７】
図１４は、海馬体と皮質とを含む脳組織で、アミロイドベータ蛋白質の沈着を、Ｔｈｉｏ−Ｓ染色法を利用して確認結果を示す図面である。図１４に示したように、臍帯血間葉幹細胞の投与群とＩＬ−４投与群とで、アミロイドベータ蛋白質の沈着が顕著に減少するということが分かった。図１４において、ＰＢＳ、ＭＳＣ及びＩＬ−４は、それぞれＰＢＳ、臍帯血由来の間葉幹細胞及びインターロイキン−４を投与した群を表す。
【０１５８】
図１５は、図１４の染色写真でアミロイドの沈着の総面積を示す図面である。沈着面積は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を利用して測定した。図１５に示したように、ＭＳＣ及びＩＬ−４投与群で対照群に比べてアミロイド沈着が顕著に減少した。
【０１５９】
図１６は、実験に使われたマウスの脳で生成されたアミロイドベータ蛋白質の変化を示す免疫ブロッティング結果を表す。図１６の結果は、次のような過程により得られた。まず、 マウスの海馬体及び皮質を含む脳組織を得て、超音波破砕器（Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を利用して蛋白質抽出物を得た。次いで、前記抽出物に対して電気泳動を実施して、蛋白質をサイズによって分離した。分離された蛋白質を、電位差を利用してニトロセルロース膜に移した後、Ａβ４２を特異的に検出できる抗体を使用して免疫ブロッティングを行った。染色は、クマシーブルーを使用して染色した。図１６に示したように、Ａβ４２蛋白質は、ＰＢＳ投与群に比べて臍帯血間葉幹細胞の投与群とＩＬ−４投与群とでその量が顕著に減少するということが分かった。図１６において、Ｌｉｔｔｅｒは、ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅを表すものであって、形質転換マウスの正常同腹子を表し、ＡＰＰ／ＰＳ１ ｍｉｃｅは、アルツハイマー病の形質転換マウスを表す。また、ＰＢＳ、ＭＳＣ及びＩＬ−４は、それぞれＰＢＳ、ＭＳＣ及びＩＬ−４を投与した群を表す。
【０１６０】
実施例１２：臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４がネプリリシンの発現に及ぼす影響
（１）正常及びアルツハイマー病の形質転換動物の脳組織でのネプリリシン蛋白質の発現
それぞれ６，９，１２及び１８ヶ月間飼育された正常マウスと、アルツハイマー病の形質転換マウスとの脳組織を得た後、実施例１１と同じ方法で蛋白質抽出物を得て電気泳動で分離した。分離された蛋白質をニトロセルロール膜に移した後、抗ネプリリシン抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と反応させてＮＥＰ蛋白質の発現如何を分析した。
【０１６１】
図１７は、正常及びアルツハイマー病の形質転換マウスで、海馬体と皮質とを含む脳組織でＮＥＰの発現程度を示す図面である。図１７に示したように、ネプリリシンの発現は、アルツハイマー病の形質転換マウスの脳で減少した。図１７において、Ｌｉｔｔｅｒ及びＡＰＰ／ＰＳ１ ｍｉｃｅは、図１６に示したものと同一である。また、レーン６，９，１２及び１８は、それぞれ６，９，１２及び１８ヶ月（Ｍ：ｍｏｎｔｈ）を飼育した群を表す。
【０１６２】
図１８は、 Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）ソフトウェアを利用して測定した図１７のＮＥＰバンドの強度を示す図面である。 バンドの強度は、 、相対的なバンド強度を表す。図１８に示したように、ネプリリシンの発現は、正常マウスに比べて、アルツハイマー病の形質転換マウスの脳で減少した。
【０１６３】
（２）臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４がネプリリシンの発現に及ぼす影響
アルツハイマー病の形質転換マウス１０ヶ月齢に、ＰＢＳ、ＰＢＳ中の１×１０４の臍帯血間葉幹細胞、及びＰＢＳ中のＩＬ−4２００μｇ／ｋｇ体重を海馬体に投与し、１０日が経過してからマウスを犠牲にした後、海馬体及び皮質を含む脳組織を得た。得られた各脳組織で蛋白質抽出物を得た後、電気泳動して免疫ブロッティングによりネプリリシンの発現量を分析した。
【０１６４】
図１９は、間葉幹細胞及びＩＬ−４が投与されたマウスで、海馬体及び皮質を含む脳組織でＮＥＰの発現程度を示す図面である。染色は、クマシーブルーを使用して染色した(下段)。図１９に示したように、（１）で観察した結果のように、ＰＢＳ投与群のネプリリシンの発現は、正常的なマウスに比べて減少したが、臍帯血間葉幹細胞とＩＬ−４投与群では、その発現量が正常マウスに比べて類似して発現された。
【０１６５】
実施例１３：臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４がミクログリア細胞におけるネプリリシンに及ぼす影響
実施例８において、間葉幹細胞、神経細胞及びミクログリア細胞をそれぞれ共同培養する場合、神経細胞及びミクログリア細胞でそれぞれネプリリシンが過発現されることを確認した。
本実施例では、動物モデルでかかる効果を確認した。実施例１２に記載のＰＢＳ投与群、臍帯血間葉幹細胞投与群及びＩＬ−４投与群の脳の海馬体組織を実施例８に記載の図８のＢの染色過程と同一に染色した。染色は、抗ＮＥＰ抗体及びミクログリア細胞のマーカーである抗ＣＤ４０抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）に重複染色して統合した。抗ＮＥＰ抗体の染色の場合、２次抗体及びそれに結合する試薬は、実施例８に記載された通りであり、抗ＣＤ４０抗体の染色の場合、２次抗体及びそれに結合する試薬は、実施例８と同じものを使用した。
【０１６６】
図２０は、臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４が投与されたマウスのミクログリア細胞で、ＮＥＰの発現を示す図面である。図２０に示したように、動物モデルに臍帯血間葉幹細胞及びＩＬ−４を投与する場合、ミクログリア細胞でネプリリシンの過発現が誘導された。
【０１６７】
本発明は、例示的な具体例を参照して説明されたが、形態及び細部事項における多様な変化が特許請求の範囲に定義されたような本発明の精神及び範囲から逸脱せずに行われるということは当業者に理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む神経疾患の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項２】
前記間葉幹細胞は、人間の胚嚢、胎盤、臍帯、臍帯血、皮膚、末梢血液、骨髄、脂肪組織、筋肉、肝臓、神経組織、骨膜、胎児膜、滑液膜、滑液、羊膜、半月状軟骨、前十字靭帯、関節軟骨細胞、乳歯、血管周囲細胞、支柱骨、膝蓋骨下脂肪塊、脾臓及び胸腺を含む間葉幹細胞が存在する組織から分離された間葉幹細胞 及び／またはそれから増殖された間葉幹細胞からなる群から選択された一つ以上である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記間葉幹細胞は、臍帯血由来の間葉幹細胞または骨髄由来の間葉幹細胞である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記培養液は、アクチビンＡ、 ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含有する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記神経疾患は、神経組織内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の損傷、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病からなる群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む神経疾患の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項８】
前記神経疾患は、神経細胞内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の異常、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病からなる群から選択される請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む、アミロイドベータによる神経細胞毒性を抑制するためのキット。
【請求項１１】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化を抑制するためのキット。
【請求項１２】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞及び／またはミクログリア細胞内にネプリリシンの発現を誘導するためのキット。
【請求項１３】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、アミロイドベータによる神経細胞毒性を抑制するためのキット。
【請求項１４】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化を抑制するためのキット。
【請求項１５】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞及び／またはミクログリア細胞内にネプリリシンの発現を誘導するためのキット。
【請求項１６】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法。
【請求項１７】
前記神経疾患は、神経細胞内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の異常、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法。
【請求項２０】
前記神経疾患は、神経細胞内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の異常、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症、躁病及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のアミロイドプラークの量を減少させるステップを含む、神経細胞内のアミロイドプラークを減少させる方法。
【請求項２３】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させるステップを含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法。
【請求項２４】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞のネプリリシンの発現を増加させるステップを含む、神経細胞のネプリリシン発現を増加させる方法。
【請求項２５】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞の神経突起の成長を増加させるステップを含む、神経細胞の神経突起の成長を増加させる方法。
【請求項２６】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のアミロイドプラークの量を減少させるステップを含む、神経細胞内のアミロイドプラークを減少させる方法。
【請求項２７】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させるステップを含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法。
【請求項２８】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養して、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させるステップを含む、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させる方法。
【請求項２９】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞の神経突起の成長を増加させるステップを含む、神経細胞の神経突起の成長を増加させる方法。
【請求項１】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む神経疾患の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項２】
前記間葉幹細胞は、人間の胚嚢、胎盤、臍帯、臍帯血、皮膚、末梢血液、骨髄、脂肪組織、筋肉、肝臓、神経組織、骨膜、胎児膜、滑液膜、滑液、羊膜、半月状軟骨、前十字靭帯、関節軟骨細胞、乳歯、血管周囲細胞、支柱骨、膝蓋骨下脂肪塊、脾臓及び胸腺を含む間葉幹細胞が存在する組織から分離された間葉幹細胞 及び／またはそれから増殖された間葉幹細胞からなる群から選択された一つ以上である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記間葉幹細胞は、臍帯血由来の間葉幹細胞または骨髄由来の間葉幹細胞である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記培養液は、アクチビンＡ、 ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含有する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記神経疾患は、神経組織内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の損傷、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病からなる群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む神経疾患の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項８】
前記神経疾患は、神経細胞内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の異常、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病からなる群から選択される請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む、アミロイドベータによる神経細胞毒性を抑制するためのキット。
【請求項１１】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化を抑制するためのキット。
【請求項１２】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞及び／またはミクログリア細胞内にネプリリシンの発現を誘導するためのキット。
【請求項１３】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、アミロイドベータによる神経細胞毒性を抑制するためのキット。
【請求項１４】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化を抑制するためのキット。
【請求項１５】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞及び／またはミクログリア細胞内にネプリリシンの発現を誘導するためのキット。
【請求項１６】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法。
【請求項１７】
前記神経疾患は、神経細胞内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の異常、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法。
【請求項２０】
前記神経疾患は、神経細胞内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の異常、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症、躁病及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のアミロイドプラークの量を減少させるステップを含む、神経細胞内のアミロイドプラークを減少させる方法。
【請求項２３】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させるステップを含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法。
【請求項２４】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞のネプリリシンの発現を増加させるステップを含む、神経細胞のネプリリシン発現を増加させる方法。
【請求項２５】
間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞の神経突起の成長を増加させるステップを含む、神経細胞の神経突起の成長を増加させる方法。
【請求項２６】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のアミロイドプラークの量を減少させるステップを含む、神経細胞内のアミロイドプラークを減少させる方法。
【請求項２７】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させるステップを含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法。
【請求項２８】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養して、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させるステップを含む、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させる方法。
【請求項２９】
アクチビンＡ、ＰＦ４、デコリン、ガレクチン３、ＧＤＦ１５、グリピカン３、ＭＦＲＰ、ＩＣＡＭ５、ＩＧＦＢＰ７、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＰＡＲＣＬ１、トロンボスポンジン１、ＷＩＳＰ１、プログラニュリン、ＩＬ−４、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞の神経突起の成長を増加させるステップを含む、神経細胞の神経突起の成長を増加させる方法。
【図２】
【図４】
【図１０】
【図１１】
【図１５】
【図１８】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【図４】
【図１０】
【図１１】
【図１５】
【図１８】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１２−５０８７３３（Ｐ２０１２−５０８７３３Ａ）
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６２５２（Ｐ２０１１−５３６２５２）
【出願日】平成２１年１１月１６日（２００９．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００６７１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５６０７５
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５１１１１９０５３）メディポスト カンパニー リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１６日（２００９．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００６７１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５６０７５
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５１１１１９０５３）メディポスト カンパニー リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]