本発明は、組成物を哺乳類のコレステロール逆輸送に好適な提供する。該組成物は経口送付に適し、高コレステロール症、アテローム性動脈硬化症、心血管系統関連の疾患の治療および／または予防に有用である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高コレステロール血症およびそれに関連した循環器疾患を治療するためのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）のペプチドおよび小さな分子メディエータに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、高血清コレステロール（高コレステロール血症）がアテロームの発生、動脈内壁へのコレステロール蓄積の進行における原因となる因子であることは確実なことと認識されている。高コレステロール血症およびアテロームは、高血圧症、冠状動脈症、心臓発作および脳卒中をはじめとする循環器疾患の原因となる。合衆国だけでも毎年約１１０万の人々が心臓発作を患い、その費用は１１７０億ドルを超えると見られている。血中のコレステロール濃度を低下させる薬学的方法は数多くあるが、これらの多くは望ましくない副作用を有し、安全が懸念されている。さらに、コレステロール逆輸送、つまり体からコレステロールを取り除く重要な代謝経路を適切に刺激する市販薬治療は存在しない。
【０００３】
コレステロールの循環は、血漿リポタンパク質粒子、すなわち血中の脂質類を転送する錯体脂質とタンパク質組成物とによって行われる。低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）は主要なコレステロールキャリアである。ＬＤＬはコレステロールを肝臓（ここでコレステロールは合成あるいは食物源から得られる）から体内にある肝臓外の組織へ送り出すことに関与しているとみられている。用語「コレステロール逆輸送」は、コレステロールを肝臓外の組織から異化し除去する、コレステロールの肝臓への転送である。血漿ＨＤＬ粒子は細胞コレステロールのスカベンジャーとして作用し、逆輸送過程において大きな役割を果たすとみられている。
【０００４】
確固とした証拠によって、アテローム性動脈硬化部に沈着した脂質が血漿ＬＤＬから主に誘導されるという考えが支持され、したがって、ＬＤＬは一般には「悪玉」コレステロールとして知られるようになった。これとは対照的に、血漿ＨＤＬ濃度は、冠状動脈性心臓病と反比例の相関関係があり、実際、高ＨＤＬ血漿濃度は負の危険因子とされている。高濃度の血漿ＨＤＬは、冠状動脈症からの保護ばかりでなく、実際に冠状動脈性プラークの退化を引き起こし得ると仮定される（たとえば、Ｂａｄｉｍｏｎら、１９９２、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８６（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩＩ）：８６−９４参照）。したがってＨＤＬは一般には「善玉」コレステロールとして知られるようになった。
【０００５】
ＬＤＬから遊離される細胞内コレステロールの量が、細胞コレステロール代謝を制御する。ＬＤＬから誘導される細胞コレステロールの蓄積は３つの過程を統制している。
（１）コレステロール生合成経路における鍵酵素であるＨＭＧＣｏＡ還元酵素の合成を停止することによって細胞コレステロール合成が減らされ、
（２）次に入ってくるＬＤＬ誘導コレステロールが、ＬＣＡＴを活性化して、コレステロールの貯蔵を促進し、細胞酵素がコレステロールをコレステリルエステルに変換し、それが貯蔵液滴に沈着され、
（３）細胞内へのコレステロールの蓄積によって、新しいＬＤＬ受容体の細胞合成を抑制するフィードバックメカニズムが動く。したがって、細胞は、ＬＤＬ受容体のそれらの補体を調節し、負担をかけすぎることなく、それらの代謝に必要なだけのコレステロールがもたらされる。（概説として、Ｂｒｏｗｎ＆Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９０、 Ｃｈ．３６、ｐｐ８７４−８９６参照）。
【０００６】
コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）とは、体皮細胞コレステロールが、肝臓外の組織へ再循環するため、あるいは胆汁として腸へ分泌されるために肝臓へ戻されうる経路である。ＲＣＴ経路は、ほとんどの肝臓外の組織からコレステロールを除去する手段としての意味しかない。ＲＣＴは主に３つのステップからなる。（１）コレステロール流出、体皮細胞からのコレステロールの初期除去、（２）レシチン−コレステロールアシル移行酵素（ＬＣＡＴ）の作用によるコレステロールのエステル化、流出されたコレステロールの体皮細胞への再突入の阻止、そして（３）肝細胞へのＨＤＬコレステリルエステルの取り込み／送り出しである。ＬＣＡＴはＲＣＴ経路における鍵酵素であり、主に肝臓で産生され、そしてＨＤＬ画分と関連した血漿中で循環する。ＬＣＡＴはコレステロール誘導細胞を、ＨＤＬ中に隔離され除去されることになるコレステリルエステルに変換する。ＲＣＴ経路はＨＤＬによって伝達される。
【０００７】
ＨＤＬはリポタンパク質粒子の普通名詞であり、それらは高密度であるという特徴がある。ＨＤＬ複合体の主な脂質構成成分は、種々のリン脂質、コレステロール（エステル）およびトリグリセリドである。最も重要なアポリポタンパク質成分は、ＨＤＬの機能特性を決定するＡ−ＩおよびＡ−ＩＩである。
【０００８】
ＨＤＬ粒子は、それぞれアポリポタンパク質Ａ−１（アポＡ−Ｉ）のコピーを少なくとも１つ（通常２〜４個のコピー）を含む。アポＡ−Ｉは、急速に開裂して２４３個のアミノ酸残基を持つ成熟ポリペプチドを産生するプロ蛋白として分泌されるプレプロアポリポタンパク質として、肝臓と小腸とで合成される。アポＡ−Ｉは主に、６〜８個の異なる２２個のアミノ酸繰返しからなり、多くの場合プロリンであるリンカー部によって間隔をあけられており、時には、数個の残基で作られているストレッチからなる。アポＡ−Ｉは、脂質とともに３タイプの安定な複合体を形成する。すなわち、プレ−ベータ−１ＨＤＬと称される小さな貧脂肪複合体、プレ−ベータ−２ＨＤＬと称される、極性脂質（リン脂質とコレステロール）を含む扁平な円板状粒子、および球状あるいは成熟ＨＤＬ（ＨＤＬ₃およびＨＤＬ₂）と称される、極性、無極性脂質を両方含む球状粒子である。循環中のほとんどのＨＤＬはアポＡ−ＩとアポＡ−ＩＩとを両方含むが、アポＡ−Ｉ（ＡＩ−ＨＤＬ）だけを含むＨＤＬの画分がＲＣＴにおいては、より効果的であるように見える。疫学の研究がＡＩ−ＨＤＬは抗動脈硬化性であるという仮説を支持している（Ｐａｒｒａら、１９９２、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１２：７０１−７０７、Ｄｅｃｏｓｓｉｎら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７：２９９−３０７）。
【０００９】
インビボで得られたデータに基づいた証拠のうちのいくつかが、ＨＤＬおよびその主タンパク質成分であるアポＡ−Ｉを、アテローム性動脈硬化部の予防、そしてプラークの回帰の可能性に、すなわち治療行為のためにこれらの魅力的な標的を作ることに関係している。まず、ヒトにおいて、血清アポＡ−Ｉ（ＨＤＬ）濃度とアテローム発生との間には逆相関が存在する（Ｇｏｒｄｏｎ ＆ Ｒｉｆｋｉｎｄ、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：１３１１−１３１６、Ｇｏｒｄｏｎら、１９８９、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ７９：８−１５）。実際、ＨＤＬの特定の亜集団が、ヒトにおいて、アテロームの危険率を下げることに関連していた（Ｍｉｌｌｅｒ、１９８７、Ａｍｅｒ．Ｈｅａｒｔ１１３：５８９−５９７；Ｃｈｅｕｎｇら、１９９１、Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２：３８３−３９４）；Ｆｒｕｃｈａｒｔ ＆ Ａｉｌｈａｕｄ、１９９２、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８：７９）。
【００１０】
第２に、動物実験がアポＡ−Ｉ（ＨＤＬ）の保護の役割を裏付ける。アポＡ−ＩまたはＨＤＬを与えられたウサギのコレステロール処置で、コレステロールを与えられたウサギのプラーク（脂肪線条）の発生および進行を低減した（Ｋｏｉｚｕｍｉら、１９８８、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２９：１４０５−１４１５、Ｂａｄｉｍｏｎら、１９８９、Ｌ
ａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：４５５−４６１、Ｂａｄｉｍｏｎら、１９９０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１２３４−１２４１）。しかしながら、その効能はＨＤＬソースによってまちまちであった（Ｂｅｉｔｚら、１９９２、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ、Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ ａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ、４７：１４９−１５２；Ｍｅｚｄｏｕｒら、１９９５、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１１３：２３７−２４６）。
【００１１】
第３に、アポＡ−Ｉの役割に関する直接的な証拠が、トランスジェニック動物に関する実験から得られた。アポＡ−Ｉに関するヒト遺伝子の実験として、遺伝的に病気にかかりやすくされたマウスに、大動脈病巣の発生に対して保護する食物由来のアテロームを移植した（Ｒｕｂｉｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５３：２６５−２６７）。アポＡ−Ｉトランスジーンは、また、アポＥ−欠損マウスとアポ（ａ）トランスジェニックマウスにおけるアテロームを抑えることを示した（Ｐａｓｚｔｙら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｖｅｓｔ．、９４：８９９−９０３、Ｐｌｕｍｐら、１９９４、ＰＮＡＳ．ＵＳＡ９１：９６０７−９６１１、Ｌｉｕら、１９９４、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３５：２２６３−２２６６）。同様の結果が、ヒトアポＡ−Ｉが発現している、トランスジェニックウサギにおいて観察され（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ、１９９６、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９４：７１３−７１７、Ｄｕｖｅｒｇｅｒら、１９９６、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６：１４２４−１４２９）、そしてトランスジェニックラットにおいて、高いヒトアポＡ−Ｉ濃度が、アテロームに対し保護し、再狭窄、続いて起こるバルーン血管形成を抑制した（Ｂｕｒｋｅｙら、１９９２、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ、８６：Ｉ−４７２、Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１８７６；Ｂｕｒｋｅｙら、１９９５、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３６：１４６３−１４７３）。
【００１２】
高コレステロール血症および他の異常脂質血症に対する現行の治療
約２０年前、コレステロール症の化合物のＨＤＬおよびＬＤＬ調節因子への分離および血中のＬＤＬの濃度が下がることが望ましいことであるという認識が数多くの薬物の開発を先導した。しかしながら、これらの薬物の多くが望ましくない副作用を持ちおよび／または、特に他の薬物と混合して投与された場合、ある患者には禁忌である。たとえば、これらの薬物と治療方針は次の通りである。
（１）胆汁−酸−結合樹脂、これは、腸から肝臓への胆汁酸の再循環を妨害する。（たとえば、コレスチラミン（ＱＵＥＳＴＲＡＮ ＬＩＧＨＴ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）およびコレスチポール塩酸塩（ＣＯＬＥＳＴＩＤ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙ））
（２）スタチン、これは、ＨＭＧＣｏＡ（コレステロール生合成に関連する鍵酵素）をブロックすることによってコレステロール合成を抑制する。（たとえば、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ、 Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．）、アスペルギルス属の菌株に由来する天然物、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．）およびアトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ、Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ））
（３）ナイアシンは水溶性ビタミンＢ−複合体であって、ＶＬＤＬの生成を減少し、ＬＤＬ減少に効果的である。
（４）フィブリン酸類は、ＶＬＤＬ画分を低下させることによって、血清トリグリセリドを低下させるために使用され、いくつかの患者集団において同じメカニズムを経て血漿コレステロールの穏やかな低減をもたらすこともある。（たとえば、クロフィブレート（ＡＴＲＯＭＩＤ−Ｓ、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびジェムフィブロジル（ＬＯＰＩＤ、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ））
（５）エストロゲン補充療法は更年期後の女性のコレステロール濃度を下げ得る。
（６）長鎖α，ω−ジカルボン酸類は血清トリグリセリドとコレステロールを低下させると報告されている。（たとえば、Ｂｉｓｇａｉｅｒら、１９９８、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅ
ｓ．３９：１７−３０、国際公開９８／３０５３０号、米国特許第４，６８９，３４４号、国際公開９９／００１１６号、米国特許第５，７５６，３４４号、米国特許第３，７７３，９４６号、米国特許第４，６８９，３４４号、米国特許第４，６８９，３４４号、米国特許第４，６８９，３４４号および米国特許第３，９３０，０２４号参照）
（７）エーテルを始めとする他の化合物（たとえば、米国特許第４，７１１，８９６号、米国特許第５，７５６，５４４号、米国特許第６，５０６，７９９号参照）、ドリコールのリン酸塩（米国特許第４，６１３，５９３号）およびアゾリジンジオン誘導体（米国特許第４，２８７，２００号）は血清トリグリセリドとコレステロールの濃度を低下させると開示されている。）
これら現在入手しうる、コレステロールを低下する薬物は、どれもＨＤＬ濃度を充分に上昇させ、ＲＣＴを促進するものはない。実際、これら現在の治療方針のほとんどは、食事摂取量の調整と再循環とによるコレステロール転送経路、コレステロールの合成、およびＶＬＤＬ集団において行っているようだ。
【００１３】
高コレステロール血症の治療のためのアポＡ−１アゴニスト
動脈硬化症に対する保護におけるＨＤＬ、すなわちアポＡ−Ｉおよびそれに関連したリン脂質の両方の潜在的な役割に鑑みて、ＵＣＢ（ベルギー）によって、組替え技術により造られたアポＡ−Ｉを利用した、ヒトに対する臨床試験が始められ、中断され、そして再開されたらしい（Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ、１９９５年１０月２７日、ＩＭＳ Ｒ
＆ Ｄ Ｆｏｃｕｓ、１９９７年６月３０日、Ｄｒｕｇ Ｓｔａｔｕｓ Ｕｐｄａｔｅ、１９９７年、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ２（６）：２６１−２６５）、また、議会でのＭ．Ｅｒｉｋｓｓｏｎ、「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＨＤＬ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ」、１９９６年１１月７−９日、フォートワース、Ｌａｃｋｏ
＆ Ｍｉｌｌｅｒ、１９９７、Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．３８：１２６７−１２７３および国際公開９４／１３８１９号参照）、そしてバイオテクによっても始められ、中断された（Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ、１９８９年４月７日）。試験は、また、敗血症性ショックを治療するために、アポＡ−Ｉを使って試みられた（Ｏｐａｌ、「Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ＨＤＬ ａｓ ａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｓｅｐｓｉｓ」、ＩＢＣの第７回、敗血症国際会議、１９９７年４月２８−３０日、ワシントンＤ．Ｃ．、Ｇｏｕｎｉら、１９９３、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．９４：１３９−１４６、Ｌｅｖｉｎｅ、国際公開９６／０４９１６号）。しかしながら、アポＡ−１の製造および用途に関連して、これを薬物としては理想には満たないものにする多くの落とし穴がある。たとえば、アポＡ−Ｉは大きなタンパク質であり、製造が困難でかつ費用がかかり、製造および再現性にかかる克服しなければならない深刻な問題として、貯蔵時の安定性、活性生成物の配送、生体内での半減期がある。
【００１４】
これらの欠点に鑑みて、模倣アポＡ−Ｉであるペプチドの製造が試みられている。アポＡ−Ｉの重要な活性は、タンパク質中にある独特な第２構造的特性−クラスＡ両親媒性α−螺旋の複数の繰り返しの存在にある（Ｓｅｇｒｅｓｔ、１９７４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８：２４７−２５３、Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９９０、ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：１０３−１１７）ので、アポＡ−Ｉの活性を模倣するペプチドを設計するほとんどの努力は、クラスＡタイプ両親媒性α−螺旋ペプチドを形成するペプチドを設計することに焦点が当てられている。（たとえば、米国特許第６，３７６，４６４号および第６，５０６，７９９号の背景技術の説明を参照、なお、これら全ては参照として本明細書に組み込まれる）。
【００１５】
研究の１つとして、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａらは、等親水性−疎水性面で両親媒性α−螺旋を形成するように、周期的に配置されたＧｌｕ、ＬｙｓおよびＬｅｕ残基から構成される２２−残基ペプチド化合物を合成した（「ＥＬＫペプチド」）（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、１９７９、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０１（１３）：３７０３−３７０４、Ｆ
ｕｋｕｓｈｉｍａら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０６５１−１０６５７）。該ＥＬＫペプチドは、アポＡ−Ｉの１９８−２１９フラグメントを持つ４１％配列相同性を占める。該ＥＬＫペプチドはリン脂質と効果的と関連して、アポＡ−Ｉの物理特性、化学特性のいくつか模倣することが示された（Ｋａｉｓｅｒら、１９８３、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８０：１１３７−１１４０、Ｋａｉｓｅｒら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：２４９−２５５、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、１９８０、前述、Ｎａｋａｇａｗａら、１９８５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７−７０９２）。この２２−残基ペプチドの二量体は、後に、単量体よりアポＡ−Ｉにより近く類似することが発見され、これらの結果に基づいて、ヘリックス破壊剤（ＧｌｙかＰｒｏのいずれか）によって中央を断ち切られた４４−ｍｅｒ（アポＡ−Ｉにおける最小機能ドメインとして表される）であると示唆された（Ｎａｋａｇａｗａら、１９８５、前述）。
【００１６】
別の研究として、「ＬＡＰペプチド」と呼ばれるモデル両親媒性ペプチドがある（Ｐｏｗｎａｌｌら、１９８０、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７７（６）：３１５４−３１５８、Ｓｐａｒｒｏｗら、１９８１、Ｉｎ：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｈ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ、Ｅｄｓ．、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、ロックフォード、イスラエル、２５３−２５６）。天然アポリポタンパク質フラグメントについての脂質結合に関する研究に基づいて、数種のＬＡＰペプチドが設計され、ＬＡＰ−１６、ＬＡＰ−２０そしてＬＡＰ−２４（それぞれ１６、２０、２４個のアミノ酸残基含む）と名づけられた。これらのモデル両親媒性ペプチドは、アポリポタンパク質と配列相同性を共有せず、アポリポタンパク質と結合したクラスＡ型の両親媒性螺旋ドメインとは異なるように配列された親水性面を持つように設計された（Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９９２、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３３：１４１−１６６）。これらの研究から、著者らは、２０個の残基の最小長さは、脂質結合特性を参照する必要があり、両親媒性ペプチドに倣って形成されると結論づけた。
【００１７】
該配列において異なる位置にあるプロリン残基を含むＬＡＰ２０の突然変異体に関する研究によって、脂質結合とＬＣＡＴ活性との間に直接的な関係が存在するが、ペプチドだけの螺旋ではＬＣＡＴ活性を導く可能性はない（Ｐｏｎｓｉｎら、１９８６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（２０）：９２０２−９２０５）ことが指摘された。さらに、ペプチドの中央近くに存在するこのヘリックス破壊剤（Ｐｒｏ）が、ＬＣＡＴを活性化する能力とともにそのリポ脂質面の親和性をも低減した。ある種のＬＡＰペプチドがリン脂質に結合することが示された（Ｓｐａｒｒｏｗら、前述）が一方で、脂質の存在下ＬＡＰペプチドが螺旋であるということについては論争の余地がある（Ｂｕｃｈｋｏら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（６）：３０３９−３０４５、Ｚｈｏｎｇら、１９９４、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ７（２）：９９−１０６）。
【００１８】
ＳｅｇｒｅｓｔらがアポＡ−Ｉの螺旋と配列相同性を共有しない１８〜２４個のアミノ酸残基で構成されるペプチドを合成した（Ｋａｎｎｅｌｉｓら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（３）：１１４６４−１１４７２、Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９８３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２２９０−２２９５）。該配列は、疎水性モーメント（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ２９９：３７１−３７４）および電荷分布（Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ８：１０３−１１７、米国特許第４，６４３，９８８号）の点から、クラスＡ置換性アポリポタンパク質の両親媒性螺旋ドメインを模倣するように特別に設計された。１個の１８−残基ペプチド、「１８Ａ」ペプチドは、モデルクラス−Ａα−螺旋であるように設計された（Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９９０、前述）。これらのペプチドおよび「１８Ｒ」ペプチドのような逆電荷分布を持つ他のペプチドの研究によって、電荷分布が活性にとって重要であることが毅然として示された。逆電荷分布を持つペプチドが発現する脂質親和性は、前記１８Ａクラス−Ａ模倣体と比較して低下しており、脂質の存在下螺旋含有率はより低い値を示す（Ｋａｎｅｌｌｉｓら、
１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ：２５５：１１４６４−１１４７２、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０２４８−１０２５５、Ｃｈｕｎｇら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０２５６−１０２６２、Ｅｐａｎｄら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９３８９−９３９６、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら、１９９１、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２８５：１３１−１４０）。
【００１９】
ヒトアポＡ−Ｉの螺旋の配列に基づく２２−アミノ酸残基を含有する「コンセンサス」ペプチドもまた設計された（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら、１９９０、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１０（１）：９５−１０５、Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｐａｔｈｉら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｉｎｄｉａｎ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｂ：５８５−５９６）。該配列はヒトアポＡ−Ｉの仮定された螺旋の各位置で最も優勢な残基を同定することによって構成された。該ペプチドのように、このペプチドによって形成された螺旋は、正に帯電し親水性−疎水性界面で房になったアミノ酸残基と、負に帯電し親水性面の中央で房になったアミノ酸残基と、１８０未満の疎水角とを有する。このペプチドの二量体はＬＣＡＴを活性化するのにいくらか効果的であるが、単量体は脂質結合特性の発現が劣っていた（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｐａｔｈｉら、１９９１、前述）。
【００２０】
主として前記ペプチドに関する試験管内での研究に基づいてアポＡ−Ｉの機能を模倣するペプチドを設計するために、１組の「規則」が明らかになっている。注目すべきは、正に帯電し親水性−疎水性界面で房になったアミノ酸残基と、負に帯電し親水性面の中央で房になったアミノ酸残基とを持つ両親媒性α−螺旋とが、脂質親和性とＬＣＡＴ活性化に必要であると考えられていることである（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｐａｔｈｉら、１９９１、前述）。Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈらはまた、α−螺旋の疎水性面内に位置する、コンセンサス２２−ｍｅｒペプチドの１３位にある負に帯電したＧｌｕ残基が活性化において重要な役割を担うことを指摘した（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら、１９９１、前述）。さらに、Ｂｒａｓｓｅｕｒは疎水角（ｐｈｏ角）が１８０°未満であることが最適な脂質−アポリポタンパク質複合体の安定性のために必要であると指摘しており、また、脂質二重層の端の周りにペプチドを持つ円板状粒子が形成していると説明する（Ｂｒａｓｓｅｕｒ、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６６（２４）：１６１２０−１６１２７）。また、Ｒｏｓｓｅｎｅｕらは活性化のためには、疎水角は１８０°未満であることが必要であると断言している（国際公開９３／２５５８１号）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかしながら、アポＡ−Ｉアゴニストを設計するための「規則」の解明が進んでいるにもかかわらず、今日まで、最高のアポＡ−Ｉアゴニストでさえ、無傷アポＡ−Ｉの活性の４０％未満しか持たないことが報告されている。文献に記載のどのペプチドアゴニストも薬物として有用であることを示しているものはない。したがって、アポＡ−Ｉの活性を模倣する安定な分子であって、製造するのが比較的簡単でコスト効率の良いものの開発の必要性がある。候補となる化合物としては、ＲＣＴに間接あるいは直接介入するのが好ましい。そのような分子は現存するペプチドアゴニストより小さく、より広い機能的なスペクトルを有しているであろう。ＲＣＴの有効なメディエータを設計するための「規則」は充分に明らかにされておらず、アポＡ−Ｉの機能に関する有機分子の設計のための原則は知られていない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明のひとつの好ましい実施形態によれば、コレステロール逆輸送のメディエータであって、酸性領域と、親油性または芳香性領域と、塩基性領域とを含む分子を含むメディ
エータ（「分子モデル」）が開示される。最も単純な形での分子モデルは、酸性領域と塩基性領域とを親油性骨格とともに含む分子であり得る。該分子はＨＤＬおよび／またはＬＤＬコレステロールと複合するように構成された構造を持ち、それによってコレステロール逆輸送を増強する。
【００２３】
該コレステロール逆輸送のメディエータは、好ましくは、３〜１０個の間のアミノ酸残基、またはその類似体または塩基性基および酸性基と親油性骨格とを含む任意の非ペプチド化合物を持ち、そして配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（式中、Ｘ１は酸性アミノ酸であり、Ｘ２は芳香族または親油性アミノ酸であり、Ｘ３は塩基性アミノ酸であり、アミノ末端はさらに第１保護基を含み、カルボキシ末端はさらに第２保護基を含む）を含む。第１および第２保護基は、独立して、アセチル、フェニルアセチル、ピボリル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２−ナフチリック酸、ニコチン酸、ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−（式中、ｎは３〜２０の範囲である）、およびアセチル、フェニルアセチル、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリールおよび置換飽和ヘテロアリールのアミド等からなる群から選択される。前記Ｃ−末端は、ＲＮＨ₂（式中Ｒはジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリール、置換飽和ヘテロアリール等である）のようなアミンで覆われている。配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３は如何なる全ての可能な方法でスクランブルすることができ、分子モデルの基本的な特徴を保有する化合物を与え、３〜１０個のアミノ酸残基で構成され得る。
【００２４】
コレステロール逆輸送のアミノ酸誘導メディエータの実施形態ひとつにおいて、代謝的に安定な分子を与えるためには、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の１つ以上がＤ−アミノ酸残基または修飾された他の合成アミノ酸残基である。これはまた、疑似ペプチドアプローチ、たとえば骨格中のペプチド結合または類似した基を転換することによっても達成することができる。ある好ましい実施形態では、Ｘ２はビフェニルアラニンである。特に好ましい実施形態では、本発明のコレステロール逆輸送のメディエータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１７６の何れのものでもよく、また表５に示された化合物から選択されてもよい。ある好ましい実施形態では、コレステロール逆輸送のメディエータは配列ＥＦＲまたは配列ＲＦＥを含む。
【００２５】
動物においてＲＣＴを増強する方法が本発明の他の好ましい態様として開示される。該方法は、動物に有効量のアミノ酸誘導組成物を投与することを含み、該組成物は、配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３〔式中、Ｘｌは酸性アミノ酸であり、Ｘ２は芳香族または親油性アミノ酸であり、Ｘ３は塩基性アミノ酸であり、アミノ末端はさらに第１保護基を含み、カルボキシ末端はさらに第２保護基を含み、前記第１および第２保護基は独立して、アセチル、フェニルアセチル、ピボリル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２−ナフトエ酸、ニコチン酸、ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−（式中、ｎは３〜２０の範囲である）、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリール、および置換飽和ヘテロアリールなどからなる群から選択される〕を含む。前記Ｃ−末端は、ＲＮＨ₂（式中Ｒはジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリール、置換飽和ヘテロアリール等である）のようなアミンで覆われている。配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３は如何なる全ての可能な方法でスクランブルすることができ、分子モデルの塩基性特徴を保有する化合物を与え、３〜１０個のアミノ酸
残基で構成され得る。
【００２６】
本発明の他の態様によれば、哺乳動物における高コレステロール血症および／またはアテロームの治療および／または予防のための実質的に純粋なアミノ酸誘導物質が開示される。該物質は、アミノおよびカルボキシ末端を有し、酸性アミノ酸残基または修飾された合成アミノ酸のＬまたはＤ光学異性体、またはその誘導体、および親油性アミノ酸残基またはその誘導体のＬまたはＤ光学異性体またはその修飾された合成アミノ酸、および塩基性アミノ酸残基またはその誘導体のＬまたはＤ光学異性体またはその修飾された合成アミノ酸を含む。アミノ末端はさらに第１保護基を含み、カルボキシ末端はさらに第２保護基を含む。第１保護基および第２保護基は、独立して、アセチル、フェニルアセチル、ピボリル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２−ナフトエ酸、ニコチン酸、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリール、および置換飽和ヘテロアリールなどからなる群から選択される。Ｃ−末端は、ＲＮＨ₂（式中、Ｒは、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリール、置換飽和ヘテロアリールなどである）のようなアミンで覆われている。配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３は如何なる全ての可能な方法でスクランブルすることができ、分子モデルの塩基性特徴を保有する化合物を与え、３〜１０個のアミノ酸残基で構成され得る。
【００２７】
該物質は、下記の特徴を少なくとも１つ有する。（１）ＬＤＬおよびＨＤＬに結合するアポＡ−Ｉを模倣するＬＤＬおよびＨＤＬに結合する。（２）優先的に肝臓に結合する。（３）肝臓ＬＤＬ−受容体によるＬＤＬ取り込みを増強する。（４）ＬＤＬ、ＩＤＬおよびＶＬＤＬコレステロールの濃度を低下させる。（５）ＨＤＬコレステロールの濃度を上昇させる。（６）血漿リポタンパクのプロフィールを改善する。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、高コレステロール血症の症状の回復または予防のための経口投与に好適な組成物が開示される。該組成物は、酸性領域、親油性領域および塩基性領域を持つアミノ酸誘導分子を含む。アミノ酸誘導分子は、また、アミノ末端に結合された第１保護基とカルボキシ末端に結合された第２保護基とを持つ。アミノ酸誘導分子は任意で少なくとも１つのＤアミノ酸残基を含んでもよい。
【００２９】
本発明の他の態様によれば、ＲＣＴのペプチドメディエータが開示される。該メディエータは、配列：Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、Ｘａはアシル化アミノ酸残基、Ｘｂは０〜１０個の任意のアミノ酸残基、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３は、独立して、酸性アミノ酸残基またはその誘導体、親油性アミノ酸残基またはその誘導体、および塩基性アミノ酸残基またはその誘導体から選択され、Ｘａは０〜１０個の任意のアミノ酸残基、およびＸｄは、アミド化アミノ酸残基である）を含む。ペプチドメディエータは、１５個以下のアミノ酸残基を含むのが好ましく、任意で少なくとも１つのＤアミノ酸残基または修飾された合成アミノ酸を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、高コレステロール血症またはアテロームの治療および／または予防のための、酸性領域、親油性領域および塩基性領域を持つアミノ酸誘導分子を含む、経口投与に好適な組成物の投与が開示される。アミノ酸誘導する分子は、またアミノ末端に結合された第１保護基とカルボキシ末端に結合された第２保護基とを持つ。アミノ酸誘導分子は任意で少なくとも１つのＤアミノ酸残基を含んでもよい。
【００３１】
本発明の他の実施形態によれば、表５の合成化合物１〜９６からなる群から選択される
化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
【００３２】
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および１０７〜１１７からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２６−３６、４２、４５〜４７、５６〜５８、６８〜７０、７２〜７４、７６、８０、８１、８３〜９０および９２〜９５からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
【００３３】
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
【００３４】
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
【００３５】
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
【００３６】
本発明の他の実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８からなる群から選択される化合物を含むＲＣＴメディエータが開示される。
【００３７】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、高コレステロール血症および／またはアテロームの治療または予防方法が開示される。該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１７６（表３）および合成化合物１〜９６（表５）から選択される組成物を、それを必要とする哺乳動物に、ＲＣＴを増強するおよび／または現存するアテローム性動脈硬化部の回帰を起こすあるいは病変の形成を低減するのに充分な量投与することを含む。高コレステロール血症および／またはアテロームの治療または予防のための組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１１３、３４、８６、９１、９６、１４５、１４６および１１８からなる群から選ばれ、投与量は、ＲＣＴを増強するおよび／または現存するアテローム性動脈硬化部の回帰を起こすあるいは病変の形成を低減するのに充分な量であるのが、より好ましい。該方法の１つの変法において、投与するステップは、経口経路によって達成される。該方法の他の変法においては、投与するステップは、胆汁酸結合樹脂、ナイアシン、スタチンまたはこれらの混合物の投与と組み合わされる。
【００３８】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、インビボでコレステロール逆輸送を増強し得る試験化合物を同定する、インビトロスクリーニング方法が開示される。該方法は、インビトロで、試験化合物の存在下または非存在下、肝臓胞に蓄積したコレステロールを測定し、インビトロで、試験化合物の存在下または非存在下、ＡｃＬＤＬ負荷マクロファージ中のコレステロールの蓄積および／または流出を測定し、肝細胞中のコレステロール蓄積を増強し、マクロファージ中のコレステロール濃度を低減する試験化合物を同定することを含む。
【００３９】
該スクリーニング方法の変法において、コレステロール濃度は、また、インビトロで、試験化合物の存在下または非存在下、ＯｘＬＤＬ負荷血管平滑筋細胞中で測定される。従って、試験化合物の同定のステップは、さらに、肝細胞中のコレステロール蓄積を増強し、マクロファージ中のコレステロール濃度を低減および／または血管平滑筋細胞中のコレステロール濃度を低減する化合物を同定することを含む。
【００４０】
スクリーニング方法の１つの実施形態において、肝細胞はヒトＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞である。他の実施形態において、マクロファージはヒトＴＨＰ−１細胞である。他の実施形態において、血管平滑筋細胞は主要大動脈主要大動脈平滑筋細胞である。
【００４１】
他の変法において、インビトロスクリーニング方法は、インビトロで、試験化合物の存在下または非存在下、肝細胞内のコレステロール蓄積を測定するステップと、インビトロで、試験化合物の存在下または非存在下、ＡｃＬＤＬ負荷血管平滑筋細胞内のコレステロール濃度を測定するステップと、肝細胞内のコレステロール蓄積を増強し、血管平滑筋細胞内のコレステロール濃度を低減する試験化合物を同定するステップと、を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明の好ましい実施形態におけるＲＣＴのメディエータは、アポＡ−Ｉの機能および活性を模倣する。広い態様において、これらのメディエータは、３つの領域、すなわち、酸性領域、親油性（たとえば、芳香性）領域および塩基性領域を含む分子である。好ましくは、該分子は正に帯電した領域、負に帯電した領域、および帯電していない親油性領域を含む。お互いに関連する該領域の配置は、分子間で様々であり得る。したがって、好ましい実施形態においては、各分子内の３つの領域の位置関係にかかわりなく、該分子はＲＣＴに介在する。ある好ましい実施形態においては、分子鋳型またはモデルは、酸性アミノ酸誘導残基、親油性アミノ酸誘導残基および塩基性アミノ酸誘導残基を含み、任意の順序でも結合し、ＲＣＴのメディエータを形成する一方で、他の好ましい実施形態においては、分子モデルは、酸性、親油性および塩基性領域を持つ、たとえば、アミノ酸、フェニルアラニン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７）のような単一残基によって具現化され得る。
【００４３】
いくつかの好ましい実施形態において、ＲＣＴの分子メディエータは、天然Ｄ−またはＬ−アミノ酸類、アミノ酸類似体（合成または半合成）およびアミノ酸誘導体の三量体を含む。たとえば、三量体として酸性アミノ酸残基またはその類似体、芳香族または親油性アミノ酸残基またはその類似体、および塩基性アミノ酸残基、またはその類似体が挙げられ、該残基はペプチドまたはアミド結合によってつなぎ合わせられている。たとえば、該三量体配列ＥＦＲは、酸性残基（グルタミン酸）、芳香族残基（フェニルアラニン）および塩基性アミノ酸残基（アルギニン）を含む。本発明の他の好ましい態様において、分子メディエータは、１つ以上のアミノ酸三量体を含む大きなアミノ酸系化合物でもよい。たとえば、デカペプチド、ＹＥＦＲＤＲＭＲＴＨは、上記した、酸性−芳香性−塩基性三量体配列、ＥＦＲ、またはｅｆｒあるいはｒｆｅ、すなわち、ｄ−アミノ酸残基またはＥ−（４−フェニル）−ＦＲ、または修飾、合成あるいは半合成アミノ酸残基を含む。
【００４４】
ＲＣＴの分子メディエータは、経路を直接および／または間接的に増強（たとえば、コレステロール流出物の増加）して血清コレステロールを減少させるという共通の態様を共にしているが、好ましいメディエータは、とりわけ、１つ以上の下記特定の機能的属性を発現してもよい。すなわち、脂質の存在下あるいは非存在下で両親媒性螺旋構造またはそのサブ構造を形成する能力、脂質類を結び付ける能力、プレ−β−様またはＨＤＬ−様複合体を形成する能力、ＬＣＡＴを活性化する能力、および、血清ＨＤＬ濃度を上昇させる能力である。
【００４５】
今日まで、アポＡ−Ｉアゴニストを設計する努力は、２２−ｍｅｒ単位構造に向けられてきた。たとえば、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈらの「コンセンサス２２−ｍｅｒ」、１９９０、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０（１）：９５−１０５；Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｐａｔｈｉら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｉｎｄｉａｎ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｂ：５８５−５９６、があり、これは、脂質の存在下で、両親媒性α−螺旋を形成することができる（たとえば、米国特許第６，３７６，４６４号はコンセンサス２２−ｍｅｒの修飾体からペプチド模倣剤を誘導することに関する項参照）。本発明の好ましい態様によれば、複数の原型アポＡ−Ｉのα−螺旋状ドメインの任意のものからでも誘導される、比較的短い（約１０個未満のアミノ酸残基）両親媒性α−螺旋状のサブ構造が合成され、ＲＣＴのメディエータとしてテストされた。２２−ｍｅｒを超えるものと比較するとこのような比較的短いペプチドを使用すると、いくつかの利点がある。たとえば、ＲＣＴのより短いメディエータは、製造するのが簡単でかつ費用がかからない。これらは化学的および構造的により安定である。好ましい構造体は比較的固さを保っている。ペプチド鎖の中で分子内相互作用がほとんどあるいは全くない。より短いペプチドは、経口での可能性がより高い。これらのより短いペプチドの複数のコピーが、より抑制された大きなペプチドと同じ効果を生むＨＤＬやＬＤＬに結合された。アポＡ−Ｉ多機能性は、その複数のα−螺旋状のドメインに寄与するところであろうが、例えアポＡ−Ｉの単一の機能、たとえばＬＣＡＴ活性化、であっても、１つ以上のα−螺旋状のドメインによる冗長な方法で介在することができるということも可能である。したがって本発明の好ましい態様おいて、アポＡ−Ｉの複数の機能は、単一サブドメインに関する、開示されたＲＣＴのメディエータによって模倣されてもよい。
【００４６】
アポＡ−Ｉの３つの機能的特長が、アポＡ−Ｉアゴニスト設計のための主たる判断基準として広く受け入れられている。（１）リン脂質と結合する能力、（２）ＬＣＡＴを活性化する能力、および（３）細胞からのコレステロールの流出を助長する能力である。コレステロール転送および代謝経路のいくつかを図３０に示す。本発明のいくつかの態様によるＲＣＴ分子メディエータは、最後の機能的特長、すなわちＲＣＴを増強する能力だけを発揮してもよい。しかし、よく見過ごされるが、アポＡ−Ｉの極めて少ない他の特徴は、アポＡ−Ｉを治療行為のための特に興味をそそる標的とする。たとえば、アポＡ−Ｉは、受容体−介在プロセスによって肝臓からのコレステロール流出を導き、そしてドレイン反応によるプレ−ｐ−ＨＤＬ（抹消組織からのコレステロールの第１受容体）産生の調子を整える。しかしながら、これらの特徴は、アポＡ−Ｉ模倣分子の将来有用性を広げることを可能にする。このアポＡ−Ｉの模倣機能の観察への全く新しい取組みが、ここで開示される、ペプチドまたはアミノ酸誘導小分子の用途を、間接ＲＣＴ（たとえば、肝臓への流出先を変更することによって、循環からＬＤＬを途中で押え除去する）ばかりでなく、直接ＲＣＴ（ＨＤＬ経路を経由する）をも促進することを可能にする。たとえば図３０参照。間接ＲＣＴの増強を可能にするために、本発明の分子メディエータは、好ましくは（たとえば、肝臓リポタンパク質結合サイト用のリガンドとしての役目をはたすために）、リン脂質と連合でき、肝臓に結合できるであろう。
【００４７】
したがって、本発明へ導く研究努力の目的は、優先的な脂質結合の確認を発揮し、直接および／または間接コレステロール逆輸送を助長することによって、肝臓へのコレステロールの流出を増加し、血漿リポタンパク質プロフィールを改善し、次いでアテローム性動脈硬化部の進行を予防しおよび／または回帰さえ進めさせる短い（約１０個未満のアミノ酸残基）、安定なＲＣＴのペプチドメディエータの同定、設計および合成であった。
【００４８】
我々のペプチド設計戦略は、（１）アポＡ−Ｉの両親媒性α−螺旋ドメイン内の比較的短い（３〜１５個のアミノ酸残基）相互領域を決定すること、（２）我々の最初のペプチドの産生を正確なアポＡ−Ｉ配列に置くこと、（３）アポＡ−Ｉの両親媒性α−螺旋ドメ
インの究明から浮かび上がる一般規則に従って、ペプチドを設計すること、（４）インビトロおよびインビボで、両親媒性α−螺旋状の第２構造とアポＡ−Ｉ活性の両方をまだ発揮する最も短いペプチド中のペプチド配列長さの下限、臨界的なアミノ酸残基、および正確なトポグラフィを定義すること、（５）定義された物理的・化学的特性を、より小さな小分子−様ペプチドおよび／または上記した分子モデルに関わる他の小さい分子の設計に組み入れることであった。
【００４９】
本発明のＲＣＴメディエータは、安定な固まりまたは単位錠剤で製造することができ、たとえば、凍結乾燥製品は、生体内で使用される前にあるいは改質する前に再構成できる。本発明は、医薬製剤および、高脂血症、高コレステロール血症、冠状動脈性心臓病、アテローム、などの他、敗血症性ショックを引き起こす内毒素症のような状態の治療における使用も含む。
【００５０】
本発明のＲＣＴメディエータが、血漿のＨＤＬおよびＬＤＬ成分と結びつき、ＨＤＬおよびプレ−β−ＨＤＬ粒子の濃度を増やすことができ、ＬＤＬの血漿濃度を低下することができることを実証する実施例によって、本発明を説明する。したがって、ＲＣＴを直接および間接に増強する。本発明のＲＣＴメディエータは、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２細胞）中のヒトＬＤＬ介在コレステロール蓄積を増やす（図２４に示すように）。該ＲＣＴのメディエータは、ＰＬＴＰを活性化し、したがってプリ−β−ＨＤＬ粒子の形成を進める点においてもまた効果的である。ＨＤＬコレステロールの増加は、ＲＣＴにおいてＬＣＡＴが関与しているという間接的な証拠となった。（ＬＣＡＴ活性化は直接示されていない（試験管内））。動物モデルにおける、本発明のＲＣＴメディエータの生体内での使用は、血清ＨＤＬ濃度を上昇する結果となる。
【００５１】
以下、ＲＣＴのメディエータの組成および構造、構造的および機能的特長；固まりあるいは単位錠剤の製造方法、および使用方法を説明することによって、本発明をさらに詳しく説明する。
【００５２】
ペプチド構造および機能
本発明のＲＣＴメディエータは、一般的に、ペプチドまたはその類似体であり、アポＡ−Ｉの活性を模倣する。該ＲＣＴのメディエータは、約１０未満のアミノ酸残基またはその類似体で構成される。いくつかの実施形態において、ペプチド内の少なくとも１つのアミン結合が置換アミド、アミドの同配体またはアミド模倣体と置換している。さらに、１つ以上のアミド結合が、ペプチドの構造および活性には重篤な支障は与える部分ではないが、ペプチド模倣薬またはアミド模倣薬部分と置換しても良い。適切なアミド模倣薬部分として、たとえば、Ｏｌｓｏｎら、１９９３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３０３９−３０４９に記載されたものが挙げられる。
【００５３】
ペプチド好ましい特徴は、両親媒性α−螺旋またはサブ構造を形成する能力を持つことである。両親媒性とは、α−螺旋が、その長軸に沿って配向する対立する親水性面と疎水性面を持つ、すなわち、螺旋の一面は主に親水性側鎖を突出させ、一方反対の面は主に疎水性側鎖を突出させていることを意味する。
【００５４】
後にさらに詳しく説明するが、ペプチドの変質体あるいは変異体と併せて、特定のアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基と置換することができ、ペプチドによって形成されている螺旋の親水性面および疎水性面が、それぞれ完全な親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸を構成していなくてもよい。したがって、本発明のペプチドによって形成された両親媒性α−螺旋という場合、用語「親水性面」というのは、総合的なネット親水性特性を持つ螺旋の面のことを言うと理解すべきである。特定の説によって拘束されるつもりはないが、ペプチドによって形成された、両親媒性の螺旋状構造の特定の構造および／または物理的
特性は、それらの活性に影響を与え得ると見られている。これらの特性として、両親媒性の程度、総合的な疎水性、平均疎水性、疎水角と親水角、疎水性モーメント、平均疎水性モーメントおよびα−螺旋の正味荷電などが挙げられる。両親媒性の程度（疎水性の非対称性の度合い）は、螺旋の疎水性モーメント（μ_H）を計算することによって、従来の方法で計量することができる。特定のペプチド配列のｐＨを計算する方法は当業界で周知であり、たとえば、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９８４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：５９５−６２３に記載された方法がある。特定のペプチドで得られる実際のｐＨは、ペプチドを構成するアミノ酸残基の総数に依るであろう。従って、違う長さのペプチドのｐＨを直接比較するのは概して有益ではない。
【００５５】
異なる長さを持つペプチドの両親媒性は平均疎水性モーメント（＜μ_H＞）を使用して、直接比較することもできる。平均疎水性モーメントは、螺旋内の残基の数によってｐＨを割ることで求めることができる（すなわち、＜μ_H＞＝μ_H／Ｎ）。一般的に、好ましいペプチドは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規に合意された疎水性スケール（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９８４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２）を使用して測定した＜μ_H＞が、０．４５から０．６５の範囲を示し、本発明の範囲内に入ると考えられる。＜μ_H＞の好ましい範囲は、０．５０〜０．６０である。
【００５６】
ペプチドの総合的あるいは合計疎水性（Ｈｏ）は、ペプチド中の各アミノ酸残基の疎水性の代数和を取って、簡単に計算することができる。
【００５７】
【数１】

【００５８】
（式中、Ｎはペプチド中のアミノ酸残基の数であり、Ｈ_iはアミノ酸残基の疎水性である。）平均疎水性（＜Ｈo＞）は、疎水性をアミノ酸残基の数で割った値である（すなわち、＜Ｈ_o＞＝Ｈ_o／Ｎ）。一般的に、ペプチドは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規に合意された疎水性スケール（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９８４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２）を使用して測定した平均疎水性が−０．０５０から−０．０７０の範囲内を示し、本発明の範囲内に入り、好ましい平均疎水性の範囲は−０．０３０から−０．０５５である。
【００５９】
両親媒性螺旋の疎水性面（Ｈ_o^pho）の合計疎水性は、下記の式で表される疎水角に分類される、疎水性アミノ酸残基の疎水性の合計を取ることによって得ることができる。
【００６０】
【数２】

【００６１】
（式中、Ｈ_iは先に定義した通り、Ｎ_Hは疎水性面の疎水性アミノ酸の合計数である。）疎水性面の平均疎水性（＜Ｈ_o^Pho＞）は、Ｈ_o^Pho／Ｎ_H（式中、Ｎ_Hは上で定義した通り）である。一般的に、ペプチドは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの合意された疎水性スケール（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９８４、前述、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９８２、前述）を使用して測定した＜Ｈ_o^Pho＞が０．９０〜１．２０の範囲を示し、本発明の範囲内に入ると考えられる。＜Ｈ_o^Pho＞の好ましい範囲は０．９４〜１．１０である。
【００６２】
疎水角（ｐｈｏ角）は、一般的に、ペプチドがＳｃｈｉｆｆｅｒ−Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎ螺旋円板図（すなわち、円盤上にある隣接する疎水性残基の数×２０°）中に配置されている時、最長のひと続きの疎水性アミノ酸残基が覆う角または円弧であると定義される。親水角（ｐｈｉ角）は３６０°とｐｈｏ角との差である（すなわち、３６０°−ｐｈｏ角）。当業者であれば、ペプチドのアミノ酸残基の数において、ｐｈｏ角とｐｈｉ角は、幾分依存するであろうことは理解するであろう。
【００６３】
酸性、芳香性および塩基性領域を持つ両親媒性ペプチドと分子メディエータは、本発明の好ましい態様に従って、それらの疎水性面が脂質部位のアルキル鎖の方角を示すことにより、リン脂質を結合することが期待される。疎水性クラスタは、本発明のペプチドのための充分に強い脂質結合親和性を生み出すと見られている。また、脂質結合は、ＬＣＡＴ活性化にとって必要条件であるので、疎水性クラスタはＬＣＡＴ活性を増強する得るとみられている。さらに、芳香族残基は、しばしば、脂質へのペプチドおよびタンパク質の固着を改善することが見受けられる（Ｄｅ Ｋｒｕｉｊｆｆ、１９９０、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．１０：１２７−１３０、Ｏ’ＮｅｉｌとＤｅ Ｇｒａｄｏ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０：６４５−６５１、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２０２：３３１−３３６）。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドと脂質との間の相互作用が、ペプチド−脂質複合体の形成へと導く。得られる複合体のタイプは（コミ細胞、円盤、小胞または多層）は、脂質：ペプチドモル比によって決まり、コミ細胞は、一般的に低い脂質：ペプチドモル比で、円盤および小胞または多層複合体は、増加する脂質：ペプチドモル比で形成される。この特徴は、両親媒性ペプチド（Ｅｐａｎｄ、Ｔｈｅ Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ
Ｈｅｌｉｘ、１９９３）およびアポＡ−Ｉ（Ｊｏｎｅｓ、１９９２、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、第８章、ｐｐ．２１７−２５０）として記載がある。該脂質：ペプチドモル比は、また、複合体の大きさおよび組成も決定する。
【００６５】
アポＡ−Ｉの一般的に受け入れられている構造モデルにおいて、両親媒性α−螺旋は、ＨＤＬの円盤状の端の周りに密集している。このモデルにおいて、螺旋は、その疎水性面を脂質アシル鎖の方角を向いて一直線に並んでいると推測される（Ｂｒａｓｓｅｕｒら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｌａｙｓ．Ａｃｔａ１０４３：２４５−２５２）。螺旋は、逆平行で並び、螺旋どうしの間の共同的効果が、円盤状のＨＤＬ複合体の安定性に寄与していると考えられる（Ｂｒａｓｓｅｕｒら、前述）。ＨＤＬの円盤状複合体の安定性に寄与しているひとつの要因は、アポＡ−Ｉ中の酸性残基と塩基性残基との間のイオン性相互作用の存在による分子間塩架橋の形成、または逆平行螺旋に隣接する残基間の水素結合であると提案されているが、このような分子間相互作用は分子メディエータの活性に必ずしも必要ではない。したがって、ＲＣＴのいくつかのメディエータの付加的な特徴として、疎水性面が同じ方向を向いて整列している場合、メディエータが脂質に結合している場合のように、互いに分子間水素結合を形成する能力が挙げられる。
【００６６】
分子間水素結合、またはそれぞれ螺旋のｉおよびｉ＋３の位置で起こっている酸性および塩基性残基間の塩架橋形成は、螺旋構造を安定化する（Ｍａｒｑｕｓｅｅら、１９８５、ＰＮＡＳ．ＵＳＡ８４（２４）：８８９８−８９０２）ことは広く支持されている。しかしながら、このような分子間相互作用は、本発明の比較的小さな分子メディエータにおいてはわずかである。
【００６７】
以下で用いられているように、遺伝的にコードされたＬ−光学異性体アミノ酸の略語は、従来式のものであり、以下の通りである。Ｄ−アミノ酸は小文字、たとえば、Ｄ−アラ
ニン＝ａと指定する。
【００６８】
【表１】

【００６９】
ペプチドメディエータ中の特定のアミノ酸残基は、重大な害を与えることなく、他のアミノ酸残基と置換することができ、多くの場合、ペプチドの活性を増強さえする。したがって、構造体内の少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基またはその誘導体および／または類似体で置換ＲＣＴのペプチドメディエータの変化体あるいは突然変異体も、本発明によって予期しえる。本発明のペプチドの活性に影響を与える特徴のひとつとして、両親媒性および前記他の特性を発現する、脂質の存在下でα−螺旋を形成する能力が挙げられ、本発明の好ましい実施形態において、アミノ酸置換は通例のもの、すなわち、アミノ酸残基の置換はアミノ酸残基が置換されるのと似た物理特性および化学特性を持つことになることは理解されるであろう。
【００７０】
通例のアミノ酸置換を決定する目的のために、アミノ酸は便宜上２つのメインカテゴリー、アミノ酸側鎖の物理−化学的特長による親水性および疎水性に分類される。これら２つのカテゴリーは、さらに、アミノ酸側鎖の特徴をよりはっきりと定義するサブカテゴリーに分類できる。たとえば、親水性アミノ酸のクラスとして、さらに、酸性、塩基性および極性アミノ酸に再分類できる。疎水性アミノ酸のクラスとして、さらに、非極性および芳香族アミノ酸に再分割できる。アポＡ−Ｉを定義するアミノ酸の種々のカテゴリーの定義は以下の通りである。
【００７１】
用語「親水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の規格化された合意疎水性が０未満の疎水性を発現するアミノ酸をいう。遺伝的にコードされた親水性アミノ酸として、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｉｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＡｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００７２】
用語「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の規格化された合意疎水性が０を超える値を持つ疎水性を発現するアミノ酸をいう。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸として、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＴｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００７３】
用語「酸性アミノ酸」は、側鎖のｐＫ値が７未満である親水性アミノ酸をいう。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンを失ったことによる生理学的ｐＨで、負に帯電した側鎖を持つ。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸として、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＡｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００７４】
用語「塩基性アミノ酸」は、側鎖のｐＫ値が７を超える値を持つ親水性アミノ酸をいう。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンの関連による生理的ｐＨで、正に帯電した側鎖を持つ。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸として、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）およびＬｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００７５】
用語「極性アミノ酸」は、生理的ｐＨで帯電していない側鎖を持つが、２つの原子によって共有されている電子対が、前記原子中の１つによってより近くに保たれている結合を少なくとも１つ持つ親水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされた極性アミノ酸として、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｉｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）およびＴｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００７６】
用語「非極性アミノ酸」は、生理的ｐＨで帯電していない側鎖を持ち、２つの原子によって共有されている電子対が、一般的に、２つの原子（たとえば側鎖が極性でない）のどちらかによって同等に保たれている構造を持つ疎水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされた非極性アミノ酸として、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＡｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００７７】
用語「芳香族アミノ酸」は、芳香族またはヘテロ芳香族環を少なくとも１つ有する側鎖を持つ疎水性アミノ酸をいう。芳香族またはヘテロ芳香族環として、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ₂、−ＮＯ、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＯ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなど〔式中、各Ｒは独立して、（Ｃ_l−Ｃ₆）アルキル、置換（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルケニル、置換（Ｃ_l−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ_l−Ｃ₆）アルキニル、置換（Ｃ_l−Ｃ₆）アルキニル、（Ｃ₅−Ｃ₂₀）アリール、置換（Ｃ₅−Ｃ₂₀）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₂₆）アルカリール、置換（Ｃ₆−Ｃ₂₆）アルカリール、５〜２０員環ヘテロアリール、置換５〜２０員環ヘテロアリール、６〜２６員環アルクヘテロアリールまたは置換６〜２６員環アルクヘテロアリールである〕のような置換基の１つ以上が挙げられる。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸として、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）およびＴｒｐ（Ｗ）が挙げられる。
【００７８】
用語「脂肪族アミノ酸」は、脂肪族炭化水素側鎖を持つ疎水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸として、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）およびＩｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
【００７９】
アミノ酸残基Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＣｙｓ（Ｃ）残基または他のスファニル含有アミノ酸とともにジスルフィド結合を形成できるという点で異例である。還元された、遊離−ＳＨまたは酸化されたジスルフィド結合形成体中のペプチド中に存在するＣｙｓ（Ｃ）残基（および他の−ＳＨ含有側鎖を持つアミノ酸）の能力は、Ｃｙｓ（Ｃ）残基がネット疎水性または親水性特性をペプチドに与えるかどうかに影響する。Ｃｙｓ（Ｃ）が正規に合意
された疎水性スケール（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４、ｓｕｐｒａ）による疎水性が０．２９を発揮しても、本発明の目的に関して、前記一般の分類にかかわらず、Ｃｙｓ（Ｃ）は、極性親水性アミノ酸として分類されると理解される。
【００８０】
当業者には認識されているであろうが、上記のカテゴリーは相互に排除しあうものではない。したがって、２以上の物理−化学特性を発揮する側鎖を持つアミノ酸は、両方のカテゴリーに含まれうる。たとえば、芳香族部位をもつアミノ酸側鎖であって、さらにＴｙｒ（Ｙ）のような極性置換基で置換されているものは、芳香性・疎水性特性と、極性または親水性特性とを両方発揮し、したがって、芳香族と極性の両方のカテゴリーに含まれる。どのようなアミノ酸でも当業者であれば、特に本明細書の詳細な説明に従って、適切なカテゴリー化を認識するであろう。
【００８１】
「螺旋破壊」アミノ酸と呼ばれる特定のアミノ酸残基は、螺旋の内部に含まれる場合、α−螺旋の構造を崩壊する傾向がある。そのような螺旋崩壊特性を発揮するアミノ酸残基は、当業界ではよく知られており（たとえば、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６参照）、Ｐｒｏ（Ｐ）およびＧｌｙ（Ｇ）が挙げられ、さらに、全てのＤ−アミノ酸も可能性がある（Ｌ−ペプチド内に含まれる場合、逆に言えば、Ｌ−アミノ酸がＤ−ペプチド内に含まれる場合、螺旋構造を崩壊する）。これらの螺旋崩壊アミノ酸残基は、Ｇｌｙ（Ｇ）を除き上記したカテゴリーに分類されるが、これらの置換基は、一般的に、螺旋内部位置にあるアミノ酸残基を置換するためには使用されず、一般的に、ペプチドのＮ−末端および／またはＣ−末端の１〜３個のアミノ酸残基を置換するために使用される。
【００８２】
上記カテゴリーは遺伝的にコードされたアミノ酸の観点から例示したが、アミノ酸置換基は、遺伝的にコードされたアミノ酸に限定される必要はなく、特定の実施形態においては、限定されないのが好ましい。実際、好ましいＲＣＴのペプチドメディエータの多くが、遺伝的にコードされていないアミノ酸を含む。したがって、天然素材である遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、ＲＣＴのペプチドメディエータにおけるアミノ酸残基は、天然素材であるがコードされていないアミノ酸および合成アミノ酸で置換されてもよい。
【００８３】
ＲＣＴのペプチドメディエータの有用な置換基を提供する、いくつかの一般的なアミノ酸として、β−アラニン（β−Ａｌａ）および３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸などの他のω−アミノ酸；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；e−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；d−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロへキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；４−フェニルフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルフォキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ₂））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）およびホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモプロリン（ｈＰｒｏ）、Ｎ−メチル化アミノ酸およびペプトイド（Ｎ−置換グリシン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
本明細書に特に記載しない他のアミノ酸残基は、本明細書で規定した定義に照らし、該残基の観察される物理的および化学的特性に基づいて、容易に分類することができる。
【００８５】
前に定義したカテゴリーに従った一般的にコードされたアミノ酸および一般的にはコードされていないアミノ酸の分類を下記表２にまとめる。表２は、説明のためだけにあるものであり、本明細書に記載のＲＣＴのペプチドメディエータを置換するために使用し得る、余すところのないアミノ酸残基および誘導体のリストを意味するものではないことは、理解すべきである。
【００８６】
【表２】

【００８７】
本明細書で特に記載していない他のアミノ酸残基も、ここで記載した定義に照らし、観察されるそれらの物理的および化学的特性に基づいて容易に分類できる。
【００８８】
ほとんどの場合、ＣＴのペプチドメディエータアミノ酸は、Ｌ−光学異性体アミノ酸で置換されるであろうが、置換基はＬ−光学異性体アミノ酸に限定されない。したがって、「変異」または「変質」型の定義において、Ｌ−アミノ酸が、相当するＤ−アミノ酸（たとえば、Ｌ−Ａｒｇ(R)Ｄ−Ａｒｇ）、あるいは同じカテゴリーまたはサブカテゴリーのＤ−アミノ酸（たとえば、Ｌ−Ａｒｇ Ｄ−Ｌｙｓ）で置き換わった置換基、およびその逆も含む。実際、被験動物への経口投与に適する好ましい実施形態において、ペプチドが少なくとも１つのＤ−光学異性体アミノ酸で構成されたものが有利である。Ｄ−アミノ酸を含むペプチドは、口腔、内臓または血清における分解が、Ｌ−アミノ酸だけで構成されたペプチドより、より適切であると考えられる。
【００８９】
前述の如く、Ｄ−アミノ酸は、内部位置にα−螺旋状Ｌ−ペプチドとともに含まれる場合、α−螺旋を崩壊する傾向がある。さらに、ＲＣＴのペプチドメディエータのＤ−アミノ酸全体を構成する特定の変異体は、本明細書で記載するアッセイにおいて、ＬＣＡＴ活性のかなりの低下を発現することが観察されている。結果として、Ｄ−アミノ酸は、一般的に、内部Ｌ−アミノ酸を置換するためには使用されず、Ｄ−アミノ酸置換基は、一般的に、ペプチドのＮ−末端および／またはＣ−末端で、１〜３個のアミノ酸残基に限定される。小さなｄ−アミノ酸ペプチドにおいてこの規則は、ＲＣＴに必要な立体構造を獲得するために、ＨＤＬまたはＬＤＬ関連し得るペプチドの複数のコピーのように、当てはまらない可能性がある。
【００９０】
前述の如く、アミノ酸Ｇｌｙ（Ｇ）は、ペプチドの内部位置に含まれている場合、一般
的にα−螺旋−崩壊残基として作用する。したがって、Ｇｌｙ（Ｇ）は、一般的に、α−螺旋−崩壊残基として考えられているが、ＲＣＴのペプチドメディエータの内部位置では、アミノ酸を置換するために使用することができる。好ましくは、ペプチドの中心の約±１螺旋以内に位置する内部残基（特に偶数のアミノ酸で構成されるペプチド）が、Ｇｌｙ（Ｇ）で置換されている。さらに、ペプチド中の内部アミノ酸残基の１個のみのＧｌｙ（Ｇ）で置換されているのも好ましい。
【００９１】
アポＡ−Ｉの天然構造体は、脂質結合と関連するほうに作用すると考えられている（Ｎａｋａｇａｗａら．、１９８５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７−７０９２、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０２４８−１０２６２、Ｖａｎｌｏｏら、１９９１、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２：１２５３−１２６４、Ｍｅｎｄｅｚら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１６９８−１７０５、Ｐａｌｇｕｎａｒｉら、１９９６、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６：３２８−３３８；Ｄｅｍｏｏｒら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：７４−８４）螺旋状の単位である。したがって、本発明には、本明細書で記載されている螺旋状のドメインの、二量体、三量体、四量体およびより高いオーダーのポリマー（「多重体」）で構成されているＲＣＴのメディエータもまた含まれる。そのような多量体として、ネットワークが分岐されたタンデム繰り返しの形、またはその混合物が挙げられる。ＲＣＴのペプチドメディエータは、他のものと直接接してもよいし、１個以上のリンカーで分離されていてもよく、あるいは、独立して使用され、多重体化学量論的に、脂質と結びついてもよい（たとえば、メディエータ：脂質が２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、これ以上高い化学量論的比も可能である）。
【００９２】
多重体を構成するＲＣＴのペプチドメディエータは、アポＡ−Ｉのペプチド配列の領域、アポＡ−Ｉ配列の類似体、アポＡ−Ｉの変異体、アポＡ−Ｉの切取られたまたは内部的に削除された型、アポＡ−Ｉの拡張型および／またはこれらの混合物で構成されてもよい。ＲＣＴのペプチドメディエータの切取られた型は、ＲＣＴのメディエータのＮ−および／またはＣ−末端から１つ以上のアミノ酸を削除して得る。内部的に削除された型は、ＲＣＴのペプチドメディエータ内の内部位置から１つ以上のアミノ酸を削除して得る。内部アミノ酸残基は、従来の残基であってもよいし、従来の残基でなくてもよい。当業者であれば、ＲＣＴのペプチドメディエータからの内部アミノ酸残基削除は、螺旋の親水性−疎水性界面の削除点での回転を起こさせることは理解するであろう。このような回転は結果として得られる螺旋の両親媒性特性を大きく変化させ得るので、本発明の好ましい実施形態において、アミノ酸残基は、螺旋の長軸全体に沿った親水性−疎水性界面の配置を実質的に保つように削除される。
【００９３】
リンカー
ＲＣＴのペプチドメディエータは、頭−尾形（すなわち、Ｎ−末端とＣ−末端）、頭−頭形（すなわち、Ｎ−末端とＮ−末端）、尾−尾形（すなわち、Ｃ−末端とＣ−末端）、あるいはこれらの混合の形で結合あるいはリンクすることができる。リンカーＬＬは、２つのペプチドを他の１つに共有結合的に結合しうる２官能性の分子であればすべて使用しうる。したがって、適切なリンカーとして、官能基がペプチドのＮ−および／またはＣ−末端に共有結合で付加可能である２官能性単量体が挙げられる。ペプチドのＮ−またはＣ−末端の結合として好ましい官能基、同様にこのような共有結合形成に効果的な化学薬品は、当業界でよく知られている。
【００９４】
リンカーは、多量体の所望の特性に応じて可撓性、剛性、半剛性であってもよい。適切なリンカーとして、たとえば、ＰｒｏまたはＧｌｙ、または約２〜約５、１０、１５、２０またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドセグメントのようなアミノ酸残基、Ｈ₂Ｎ（
ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ（式中、ｎは１から１２の整数である）のような２官能性有機化合物などが挙げられる。そのようなリンカーの例示、そのようなリンカーの製造方法、およびそのようなリンカーのペプチドへの導入方法は、当業界でよく知られている（たとえば、Ｈｕｎｉｇら、１９７４、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１００：３０３９−３０４４、Ｂａｓａｋら、１９９４、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５（４）：３０１−３０５）参照）。
【００９５】
選択的に開裂され得るペプチドおよびオリゴヌクレオチドリンカー、および該リンカーの開裂方法はよく知られ、当業者には容易に明らかになるであろう。選択的に開裂し得る適切な有機化合物リンカーも、当業者に容易に明らかになるであろう。たとえば、本明細書の記載ばかりでなく、国際公開９４／０８０５１号記載のものも含まれる。
【００９６】
充分な長さおよび可撓性を持つリンカーとして、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ、Ｈ₂Ｎ−（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ（式中、ｎは１〜１２、好ましくは４〜６）、Ｈ₂Ｎ−アリール−ＣＯＯＨ、および炭水化物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
あるいは、天然アポリポタンパク質は逆平行螺旋状のセグメント間の共同的結合を容認するので、一次配列において、天然アポリポタンパク質の隣接する螺旋に結合するペプチドセグメントに対応するペプチドリンカー、たとえば、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩ、アポＡ−ＩＶ、アポＣ−Ｉ、アポＣ−ＩＩ、アポＣ−ＩＩＩ、アポＤ、アポＥおよびアポＪが、便宜上ペプチドを結合するのに用いられる。これらの配列は当業界ではよく知られている（たとえば、Ｒｏｓｓｅｎｅｕら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｃｈ．６、１５９−１８３、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９２参照）。
【００９８】
逆平行螺旋状セグメントの分子間水素結合または塩橋の形成を容認する他のリンカーとして、β−ターンおよびγ−ターンのようなペプチドリバースターン、ペプチドβ−ターンおよび／またはγ−ターンの構造を模倣する有機分子が挙げられる。一般的に、リバースターンは、単一ポリペプチド鎖を、逆平行性のβ−シートまたは逆平行性のα−螺旋状の構造の領域に適合させるように、ポリペプチドの方向を逆転させるペプチドのセグメントである。β−ターンは一般的に４個のアミノ酸残基で、γ−ターンは一般的に３個のアミノ酸残基で構成される。
【００９９】
あるいは、リンカー（ＬＬ）は、ペプチドβ−ターンまたはγ−ターンの構造を模倣する有機分子または部位を含んでもよい。そのようなβ−ターンおよび／またはγ−ターンは模倣部位、およびそのような部位を含むペプチドの合成方法は、当業界でよく知られ、なかでも、Ｇｉａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｋｏｌｔｅｒ、１９９３、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．３２：１２４４−１２６７、Ｋａｈｎら、１９８８、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ１：７５−７９、Ｋａｈｎら、１９８７、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：１６２３−１６２６に記載されているものが含まれる。．
単一リンク部位に結合する螺旋状のセグメントは、同様の末端を介して結合する必要はない。実際、いくつかの実施形態において、螺旋状のセグメントは単一リンク部位に結合し、逆平行の形において配列されている。すなわち、螺旋のいくつかはそのＮ−末端介して、他はＣ−末端を介して結合している。
【０１００】
螺旋状の部位は、リンク部位に直接結合することもでき、また、前記の如く、１つ以上の２官能性リンカー（ＬＬ）を用いてリンク部位から間を空けてもよい。
【０１０１】
ネットワークのノード数は、一般的に、螺旋状セグメントの所望の総数に依るが、典型的には、約１〜２である。もちろん、所望の螺旋状セグメントおよびネットワークがより高いオーダのリンク部位を持つものは、所定の数が数ノードになることは受け入れられるであろう。
【０１０２】
ネットワークは、同一のオーダ、すなわち、全てのノードがたとえば、３官能あるいは４官能リンク部位であるネットワークであってもよいし、ノードがたとえば、３官能性と４官能性リンク部位の混合物であるネットワークであってもよい。もちろん、単一オーダネットワークにおいてさえ、リンク部位は同一である必要はないことは理解される。第３オーダネットワークは、たとえば、２、３、４またはそれ以上の異なった３官能性リンク部位を使用してもよい。
【０１０３】
線状多重体と同様に、分岐状ネットワークを含む螺旋状セグメントも同一であってもよいが、その必要はない。
【０１０４】
構造および機能の分析
該多量体も含む本発明のＲＣＴメディエータの構造と機能は、活性化合物を選択するために分析されうる。たとえば、ペプチドまたはペプチド類似体は、α−螺旋を形成する能力、脂質に結合する能力、脂質と複合体を形成する能力、ＬＣＡＴを活性化する能力、コレステロール流出を進める能力が分析されうる。
【０１０５】
ペプチドの構造および／または機能を分析する方法およびアッセイは、当業界でよく知られている。好ましい方法を以下の実施例に記載する。たとえば、後述する円偏光二色性（ＣＤ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析は、ペプチドまたはペプチド類似体の構造、特に脂質の存在下でのヘリシティの度合いを分析するために使用することができる。脂質に結合する能力は、後述する光分光測定法を使用して測定することができる。ペプチドおよび／またはペプチド類似体のＬＣＡＴを活性化する能力は、後述するＬＣＡＴ活性化を使用して容易に測定することができる。後述するインビトロおよびインビボアッセイは、半減期、分布、コレステロール流出およびＲＣＴ上の効果を評価するために使用することができる。
【０１０６】
好ましい実施形態
本発明のＲＣＴメディエータを好ましい実施形態を用いてさらに説明する。
【０１０７】
１つの好ましい実施形態において、３つの独立した領域：酸性領域、芳香性または親油性領域、および塩基性領域を持つアミノ酸系組成物を含む分子がある。したがって、ＥＦＲ、またはｅｒｆあるいはｆｒｅのような、この好ましい実施形態による三量体ペプチドは、酸性アミノ酸残基、芳香族または親油性残基および塩基性残基を含む。特定の領域の他の領域に関する相対的位置は、分子メディエータ間で変化し、該分子は各分子内の３つの領域の位置にかかわらず、ＲＣＴを介在する。ＥＦＲまたはｅｆｒのような三量体ペプチドを含むメディエータにおいては、該三量体は、天然Ｄ−またはＬ−アミノ酸、アミノ酸類似体およびアミノ酸誘導体で構成されていてもよい。
【０１０８】
他の好ましい実施形態において、三量体の芳香性領域は酸性または塩基性側鎖を持つニコチン酸で構成されていてもよい。
【０１０９】
他の好ましい実施形態において、三量体の芳香性領域は、４−フェニルフェニルアラニンで構成されていてもよい。
【０１１０】
他の好ましい変異体において、アミノ酸系三量体の構造を含む分子メディエータは、ＲＣＴの分子メディエータの物理化学的特性を改善し、脂肪または親油性材料の体への自然なあるいは活性化した転送（吸収）システムを巧みに利用するために、任意で、一端または両端のアミノまたはカルボキシ末端上の親油性基で覆われ得る。覆う基は、ＤまたはＬ光学異性体または非−光学異性体分子または基でもよい。好ましい実施形態において、Ｎ−末端を覆う基は、アセチル、フェニルアセチル、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリール、置換飽和ヘテロアリールなどからなる群から選択される。Ｃ−末端は、ＲＮＨ₂（式中、Ｒは、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリール、置換飽和ヘテロアリールなどである）のようなアミンで覆われているのが好ましい。
【０１１１】
１つの好ましい実施形態において、本発明のＲＣＴメディエータは、下記表３に記載するペプチドおよびペプチド 誘導体からなる群から選択される。表中、（特に断らない限り）ペプチドは全てＮ−末端上のアセチル基およびＣ−末端上のアミドによって覆われている。
【０１１２】
【表３】

【０１１３】
【表４】

【０１１４】
【表５】

【０１１５】
【表６】

【０１１６】
遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ−光学異性体の略語は、表１に示された１文字記号の小文字体である。たとえば、「Ｒ」はＬ−アルギニンを指し、「ｒ」はＤ−アルギニンを指す。特に断らない限り、（たとえば「ＯＨ」）、Ｎ−末端はアセチル化され、Ｃ−末端はアミド化されている。
【０１１７】
ＰｈＡｃはフェニルアセチル化を表す。
【０１１８】
Ｐｉｖはピボリル化を表す。
【０１１９】
１−Ｎａｐおよび２−Ｎａｐは、ナフトエ酸で覆われていることを表す。
【０１２０】
Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルで修飾されたＮ−末端を表す。
【０１２１】
ＮＡはニコチン酸を表す。
【０１２２】
ＢＩＰはビフェニルアラニンを表す。
【０１２３】
Ｉｓｏｘａｚｏｌｅは、５−メチル−イソオキサゾール−３−カルボ酸誘導体を表す。
【０１２４】
アミノ酸置換基は、遺伝的にコードされたアミノ酸にされる必要はなく、特定の実施形態においては好ましくない。したがって、自然に存在する遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、ＲＣＴのペプチドメディエータ中のアミノ酸残基は、自然に存在するコードされていないアミノ酸および合成アミノ酸で置換されてもよい。
【０１２５】
合成方法
本発明のペプチドは、事実上、任意の公知のペプチドの製造技術を使って製造してよい。たとえば、ペプチドは、従来の段階的溶液合成、固相ペプチド合成または組み換えＤＮＡ技術を使用して製造してもよい。
【０１２６】
ＲＣＴのペプチドメディエータは、従来の段階的溶液合成または固相合成（たとえば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｅｄｓ．、１９９７、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌａ．、 およびこれに挙げられている参考文献、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ａｔｈｅｒｔｏｎ ＆ Ｓｈｅｐｐａｒｄ、Ｅｄｓ．、１９８９、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、イングランドおよびこれに挙げられている参考文献参照）。図１参照。
【０１２７】
従来の固相合成において、第１アミノ酸の結合は、そのカルボキシ末端（Ｃ−末端）と誘導樹脂との化学的反応を伴い、オリゴペプチドのカルボキシ−末端を形成する。アミノ酸のアルファ−アミノ末端は、ｔ−ブトキシ−カルボニル基（ｔ−Ｂｏｃ）または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆ−Ｍｏｃ）で、典型的にブロックされ、アミノ基を保護している。さもなければ、これは、カップリング反応において反応してまう。アミノ酸の側鎖基がもし反応性であれば、これもまた、エーテル、チオエーテル、エステルおよびカルバメートの形の種々のベンジル誘導する保護基によってブロックされる（あるいは保護される）。
【０１２８】
次のステップおよび続いて起こる繰り返しサイクルは、アミノ−末端（Ｎ−末端）樹脂−結合アミノ酸（またはペプチド鎖の末端残基）の脱ブロックであり、これによりアルファ−アミノブロック基を取り除き、次のブロックされたアミノ酸の化学的結合（カップリング）に続く。この過程は、利益のある完全なペプチド鎖を合成するためには、何度となくサイクルの繰り返しが必要である。カップリングおよびブロッキング工程の後、それぞれ、樹脂−結合ペプチドは完全に洗浄され、次の工程に進む前に全ての残存する試薬は取り除かれる。固形の支持粒子は、任意の所定のステップでも試薬の除去を容易にし、樹脂および樹脂−結合ペプチドは、多孔性の開口部を持つカラムまたは装置に保持されながら、容易にろ過され、洗浄され得る。
【０１２９】
合成されたペプチドは酸触媒（典型的には、フッ化水素酸またはトリフルオロ酢酸を伴う）によって樹脂から分離され、ペプチドを開裂し、樹脂からそのＣ−末端アミノ酸上アミドまたはカルボキシ基を放つ。アシドリシス分解は、また、合成されたペプチド中のアミノ酸の側鎖から保護基を取り除くことも行う。最終的なペプチドは、次いで、様々な任意のクロマトグラフ法の中の１つによって精製され得る。
【０１３０】
好ましい実施形態によれば、ＲＣＴのペプチドおよびプチド誘導体メディエータは、Ｎ^a−Ｆｍｏｃ化学での固相合成方法によって合成された。Ｎ^a−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂およびＷａｎｇ樹脂はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ、カリフォルニア）またはＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｌ（ウッドデール、イリノイ）
から購入した。他の試薬および溶剤は、下記の供給源：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、アニソール、１，２−エタンジチオール、チオアニソール、ピペリジン、 無水酢酸、２−ナフトエ酸およびピバロイック酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、ミルウォーキー、ウィスコンシン）、ＨＯＢｔおよびＮＭＰ（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｌ、ウッドデール、イリノイ）、ジクロロメタン、メタノールおよびＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、ペンシルベニア）から入手したＨＰＬＣ等級溶剤から獲得した。ペプチドの純度は、ＬＣ／ＭＳによって調べた。ペプチドの精製は、分取ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１００シリーズ）を用い、Ｃ₁₈−結合シリカカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｐｅｃ分取カラム、ＯＤＳ−８０ＴＭ、寸法：２１．５ｍｍｘ３０ｃｍ）上で行った。ペプチドは、勾配系で溶離した（５０％〜９０％のＢ溶剤（アセトニトリル：水が６０：４０および０．１％ＴＦＡ）。
【０１３１】
全てのペプチドはＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．５−０．６６ｍｍｏｌ／ｇ）またはＷａｎｇ樹脂（１．２ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、固相方法で、段階的に合成した。側鎖の保護基は、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）およびＴｙｒ（ｔＢｕ）であった。Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸はそれぞれ保護アミノ酸の１．５から３倍を超える量を使用して、この樹脂にカップリングした。カップリング試薬は、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）であり、カップリングはニンヒドリン試験でモニターした。Ｆｍｏｃ基は、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンで、３０〜６０分処置して取り除いた後、ＣＨ₂Ｃｌ₂、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の１０％ＴＥＡ、メタノール、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂の順序で洗浄した。カップリング工程に続いて、アセチル化または要すれば別のカップリング基とともにアセチル化を行った。
【０１３２】
ＴＦＡ、チオアニソール、エタンジチオールおよびアニソール（９０：５：３：２、ｖ／ｖ）の混合物を使用（室温で４〜５時間）し、ペプチドをペプチド樹脂から開裂し、側鎖の保護基を全て取り除いた。粗ペプチド混合物を焼結ロートでろ過し、ＴＦＡで（２〜３回）洗浄した。ろ液を濃縮し、どろどろした濃縮ろ液とし、冷エーテルに加えた。冷凍室で一晩放置すると、ペプチドが白い固体状で析出し、これを遠心分離した。溶液をデカントし、固体をエーテルで充分洗浄した。得られた粗ペプチド緩衝液（アセトニトリル：水 ６０：４０、０．１％ＴＦＡ中）に溶解し、乾燥した。粗ペプチドは、分取Ｃ−１８カラム（逆相）を使用したＨＰＬＣによって、勾配系５０−９０％Ｂで４０分（緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含むアセトニトリル：水（６０：４０））精製した。純粋な画分は、Ｓｐｅｅｄｖａｃで濃縮した。収率は５％〜２０％であった。
【０１３３】
前記覆われている合成ペプチドを表４に示す。
【０１３４】
【表７】

【０１３５】
Ａｃはアセチル化を表す。
【０１３６】
Ｐｉｖはピボリル化を表す。
【０１３７】
１−Ｎａｐおよび２−Ｎａｐはナフトエ酸で覆われていることを示す。
【０１３８】
Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオキシカルボニルで修飾されたＮ−末端を表す。
【０１３９】
ＮＡはニコチン酸を表す。
【０１４０】
ＢＩＰはジフェニルアラニンを表す。
【０１４１】
Ｉｓｏｘａｚｏｌｅは５−メチル−イソオキサゾール−３−カルボン酸誘導体を表す。
【０１４２】
あるいは、本発明のペプチドは、小さな構成成分ペプチド鎖を一緒にして、より大きなペプチド鎖を形成する、セグメント縮合の方法で生成してもよい。これは、たとえば、Ｌｉｕら、１９９６、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７（７）：９３３−９３６、Ｂａｃａ、ら、１９９５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８８１−１８８７、Ｔａｍら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５：２０９−２１６、ＳｃｈｎｏｌｚｅｒおよびＫｅｎｔ、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：２２１−２２５、ＬｉｕおよびＴａｍ、１９９４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（１０）：４１４９−４１５３、ＬｉｕおよびＴａｍ、１９９４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ９１：６５８４−６５８８、ＹａｍａｓｈｉｒｏおよびＬｉ、１９８８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３１：３２２−３３４、Ｎａｋａｇａｗａ ら、１
９８５、Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７−７０８３、Ｎｏｋｉｈａｒａら、１９８９、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ１９８８：１６６−１６８、Ｋｎｅｉｂ−Ｃｏｒｄｏｎｎｉｅｒら、１９９０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：５２７−５３８（これらの開示は全て参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明のペプチドの他の有用な合成法が、Ｎａｋａｇａｗａら、１９８５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７−７０９２に記載されている。
【０１４３】
セグメント縮合によって生成されたペプチドについて、縮合工程におけるカップリング効率を、カップリング時間を増やすことによって著しく上げることができる。概して、カップリング時間を増やせば生成物のラセミ化が増える（Ｓｉｅｂｅｒら、１９７０；Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ：Ａｃｔａ５３：２１３５−２１５０）。しかしながら、グリシンは不斉中心を持たないので、ラセミ化は起こらない（プロリン残基も、立体障害のため、長いカップリング時間でもラセミ化はほとんどあるいは全く起こらない）。したがって、内部グリシン残基を含む実施形態は、グリシン残基はラセミ化されないという事実をうまく利用して構成成分を合成するセグメント縮合によって、高収率で大量に合成することができる。つまり、内部グリシン残基を含む実施形態は、大規模な大量生産に有益な重要な合成を提供する。
【０１４４】
Ｎ−および／またはＣ−末端ブロック基を含むＲＣＴメディエータは、有機化学の標準的な技術を使って製造することができる。たとえば、ペプチドのＮ−末端をアシル化する方法、ペプチドのＣ−末端をアミド化またはエステル化する方法は業界で周知である。Ｎ−および／またはＣ−末端の他の修飾を行う態様、同様に、末端ブロック基を結合させるのに必要であり得る、任意の側鎖官能性を保護する態様も当業者には明らかであろう。
【０１４５】
医薬的に許容しうる塩（対イオン）は、イオン交換クロマトグラフィーまたは他の分野で周知の方法で都合よく製造することができる。
【０１４６】
本発明の化合物の二量体は、合成の適切な工程でペプチド鎖にリンカーを加えることによって都合よく合成することができる。あるいは、螺旋状セグメントは合成することができ、各リンカーと反応した。もちろん、実際行う合成方法は、リンカーの組成によって決まる。適切な保護計画および化学反応は周知であり、当業者には明らかであろう。
【０１４７】
本発明化合物の分岐したネットワーク型のものは、三量体および四量体樹脂を用い、Ｔａｍ、１９８８、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８５：５４０９−５４１３およびＤｅｍｏｏｒら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：７４−８４に記載の化学反応により、都合よく合成することができる。合成樹脂の修飾、およびより高いあるいは低いオーダーの分岐ネットワークを合成する戦略（これには異なったペプチド螺旋状セグメントの混合物も含まれる）は、ペプチド化学および／または有機化学の業界の当業者には充分に対応できる範囲内である。
【０１４８】
所望により、ジスルフィド結合の形成は、普通、穏やかな酸化剤の存在下で行われる。化学酸化剤を使用してもよいし、化合物を単に大気中の酸素に曝露するだけで結合を達成してもよい。たとえば、Ｔａｍら、１９７９、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ９５５−９５７、Ｓｔｅｗａｒｔら、１９８４、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ２ｄ Ｅｄ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、Ａｈｍｅｄら、１９７５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：８４７７−８４８２、およびＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎら、１９９１、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ１９９０：１６４−１６６、ＧｉｒａｌｔおよびＡｎｄｒｅｕ、Ｅｄｓ．、ＥＳＣＯＭ Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに記載されているものを始めとして、種々の方法が業界では知られている。付加的な他の方法が、Ｋａｍｂｅｒら、１９８０、Ｈｅｌｖ．Ｃｌａｉｍ．Ａ
ｃｔａ６３：８９９−９１５によって記載されている。固体支持体上で行われる方法は、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ、１９８５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２６：９２−９７によって記載されている。これらの方法はどれも、本発明のペプチド中のジスルフィド結合を形成するために使用してもよい。さらに化学的に合成されたアミノ酸誘導化合物を下記表５に示す。
【０１４９】
【表８】

【０１５０】
【表９】

【０１５１】
【表１０】

【０１５２】
遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ−光学異性体の略語は、表１に示された１文字記号の小文字体である。たとえば、「Ｒ」はＬ−アルギニンを指し、「ｒ」はＤ−アルギニンを指す。
【０１５３】
Ａｃはアセチル化を表す。
【０１５４】
Ｐｉｖはピボリル化を表す。
【０１５５】
１−Ｎａｐおよび２−Ｎａｐは、ナフトエ酸で覆われていることを表す。
【０１５６】
Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルで修飾されたＮ−末端を表す。
【０１５７】
ＮＡはニコチン酸を表す。
【０１５８】
ＢＩＰはビフェニルアラニンを表す。
【０１５９】
Ｉｓｏｘａｚｏｌｅは、５−メチル−イソオキサゾール−３−カルボ酸誘導体を表す。
【０１６０】
ペプチドの全体または一部が遺伝子でコードされたアミノ酸で構成されている場合、該ペプチドあるいはそれに対応する部分は、従来の組み換え組み換え遺伝子工学の技術を用いて合成してもよい。
【０１６１】
組み換え製造については、ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、適切な発現ベヒクル、すなわち、挿入するコード配列の複写または翻訳に必要なエレメント、またＲＮＡウィルスベクターの場合は複写または翻訳に必要なエレメントを含むビヒクルを挿入する。発現ビヒクルは、その後適切な標的細胞にトランスフェクトされ、それがペプチドを発現する。使用する発現システムにも依るが、発現したペプチドはその後業界で定着した手順によって単離される。組み換えタンパク質およびペプチド製造方法は、業界で周知である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、参照、どちらも全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１６２】
製造効率を増加させるために、ポリヌクレオチドは、酵素的切断部位によって分離されたペプチドの複数単位をコードするように設計できる。すなわち、ホモポリマー（１種のペプチド単位の繰り返し）かヘテロポリマー（違う種類のペプチドが一緒につながっている）のどちらかをこの方法で設計することができる。得られたポリペプチドは、ペプチド単位を回収するために、開裂され得る（たとえば、適切な酵素による処置によって）。これは、単一のプロモータに動かされるペプチドの終了を増やすことができる。好ましい実施形態においては、ポリシストロンポリヌクレオチドは、単一ｍＲＮＡが転写され、それが複数のペプチドをコード（すなわち、ホモポリマーまたはヘテロポリマー）し、各コード領域はキャップ−インディペンデント翻訳制御配列、たとえば内部リポゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に動作可能に結合するように設計され得る。適切なウィルス発現システムで使用された場合、ｍＲＮＡによってコードされた各ペプチドの翻訳は、たとえばＩＲＥＳによって、転写物の内部に向かう。したがって、ポリシストロニック構造は、単一の大きなポリシストロニックｍＲＮＡの転写を方向づけ、これは次に、複数の個別のペプチドの翻訳を方向づける。この方法は、ポリタンパク質の製造および酵素的手順をなくし、単一プロモータによって動かされるペプチドの収量を著しく増加させる。
【０１６３】
種々のホスト−発現ベクターシステムが、本明細書で記載したペプチドを発現させるために利用されてもよい。これらには、適切なコード配列を持つ、組み換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで転換されたバクテリアのような微生物、適切なコード配列を含む組み換え酵母または菌類発現ベクターで転換でされた酵母または糸状菌、適切なコード配列を含む組み換えウィルス発現ベクターが感染した昆虫細胞システム（たとえば、バキュロウィルス）、適切なコード配列を含む、組み換えウィルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウィルスまたはタバコモザイクウィルス）に感染した、または組み換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）に感染したあるいは転換された植物細胞システム、動物細胞システムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６４】
発現システムの発現エレメントは、その強度および特異性において変化する。利用するホスト／ベクターシステムに依っては、構造性および誘導性プロモータを含む、数多くの適切な転写および翻訳エレメントのどれでも、その発現ベクターにおいて使用してよい。たとえば、細菌系においてクローン作成する場合、バクテリオファージlのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ）などのような誘導プロモータを、昆虫細胞システムにおいてクローン作成する場合、バキュロウィルスポリヒドロンプロモータのようなプロモータを、植物細胞システムにおいてクローン作成する場合、植物細胞の遺伝子から誘導されたプロモータ（たとえば、熱ショックプロモータ、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット用プロモータ、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質用プロモータ）または植物ウィルスから誘導されたプロモータ（たとえば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプロモータ、ＴＭＶの外皮タンパク質プロモータ）を、哺乳動物細胞システムにおいてクローン作成する場合、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモータ（たとえば、メタロチオネインプロモータ）、または哺乳動物ウィルスから誘導されたプロモータ（たとえば、アデノウィルス後期プロモータ、ワクシニアウィルス７．５Ｋプロモータ）を、発現産物の複数のコピーを含む細胞株で生成する場合、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−およびＥＢＶ−系ベクターを、適切な選択可能なマーカーとともに、使用してもよい。
【０１６５】
植物発現ベクターが使用される場合、本発明のペプチドをコードする配列の発現は、数
多くのどのプロモータによっても行われてよい。たとえば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡおよび１９ＳＲＮＡプロモータ（Ｂｒｉｓｓｏｎら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ３１０：５１１−５１４）のようなウィルスプロモータ、またはＴＭＶの外皮タンパク質プロモータ（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、１９８７、ＥＭＢＯＪ．６：３０７−３１１）を使用してもよく、あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４、ＥＭＢＯＪ．３：１６７１−１６８０、Ｂｒｏｇｌｉｅら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：８３８−８４３）または熱ショックプロモータ、たとえば、大豆ｈｓｐｌ７．５−Ｅまたはｈｓｐｌ７−３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙら．、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５）のような植物プロモータも使用してもよい。これらの構造は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウィルスベクター、直接ＤＮＡ転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して、植物細胞に導入することができる。このような技術の再検討のために、たとえば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈとＷｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、第ＶＩＩＩ項、ｐｐ．４２１−４６３、およびＧｒｉｅｒｓｏｎとＣｏｒｅｙ、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２ｄ Ｅｄ．、ブラッキー、ロンドン、Ｃｈ．７−９を参照。
【０１６６】
本発明のペプチドを生産するために使用されてもよい昆虫発現システムの１つにおいて、オウトグラファカリフォルニア核多汗症ウィルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するために、ベクターとして使用する。ウィルスはスポドブテラ・フルギペルダ細胞中で成長する。コード配列をウィルスの非必須領域（たとえばポリヒドロン遺伝子）にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモータ（たとえばポリヒドロンプロモータ）の制御のもとに置いてもよい。コード配列の挿入に成功すれば、ポリヒドロン遺伝子の非活性化および非閉寒性組み換えウィルス（すなわち、ポリヒドロン遺伝子によるコード化されたタンパク様外皮の欠けたウィルス）の生産という結果になるであろう。これらの組み換えウィルスは、その後、挿入された遺伝子が発現するスポドブテラ・フルギペルダ細胞を感染させるために使用される（たとえば、Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４、Ｓｍｉｔｈ、米国特許第４，２１５，０５１号を参照）。さらに、この発現システムの例を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ中に見つけてもよい。
【０１６７】
哺乳動物ホスト細胞においては、数多くのウィルス系の発現システムを使用してよい。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合、コード配列は、アデノウィルス転写／翻訳制御複合体、たとえば、後期のプロモータおよび３連先行配列に結紮されていてもよい。このキメラ遺伝子は、その後、インビトロまたはインビボ組み換えによって、アデノウィルス遺伝子に挿入されてもよい。ウィルス遺伝子の非必須領域（たとえば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染したホストにおいてペプチドを発現することのできる組み換えウィルスとなるであろう（たとえば、ＬｏｇａｎとＳｈｅｎｋ、１９８４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９参照）。あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモータを使用してもよい（たとえば、Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８２、ＰＮＡＳ ＵＳＡ７９：７４１５−７４１９、Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７−８６４、Ｐａｎｉｃａｌｉら、１９８２、ＰＮＡＳ ＵＳＡ７９：４９２７−４９３１参照）。
【０１６８】
他の本発明のペプチドを生産する発現システムは、当業者には明らかであろう。
【０１６９】
ペプチドの精製
本発明のペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（たとえば、上記のＮ^a−Ｆｍｏｃ化学反応での固相合成法により合成された粗ペプチドは、分取Ｃ−１８カラムを使用
した逆相ＨＰＬＣによって精製された）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーなどの当分野で知られている技術で精製することができる。特定のペプチドを精製するために使用される実際の条件は、部分的に、合成戦略および正味荷電、疎水性、親水性などの因子に依り変わり、当業者には明らかであろう。多量体分岐ペプチドも、たとえば、イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。
【０１７０】
親和性クロマトグラフィー精製に関して、ペプチドに特異的に結合する抗体は任意のものも使用してよい。抗体の製造に関して、ウサギ、マウス、ラットなど（これらに限定されない）を始めとする種々のホスト動物が、ペプチド注射によって免疫にされてもよい。ペプチドは、側鎖の官能基または側鎖の官能基に結合したリンカーによって、ＢＳＡのような適切なキャリアに結合する。種々のアジュバントが、フロイントアジュバント（完全、不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌）およびコリネバクテリウムパルブムのような潜在的に有用性のあるヒトアジュバント（これらに限定されない）などのホスト種によって決まる、免疫応答を改善するために、使用されてよい。
【０１７１】
ペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養液中の連続継代細胞系による抗体分子を製造する任意の技術を使って製造してよい。これらの技術として、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが最初に記載した技術、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７、または、Ｋａｐｒｏｗｓｋｉ、米国特許第４，３７６、１１０、これらは参照として本明細書に組み込まれる）、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ４：７２、Ｃｏｔｅら、１９８３、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８０：２０２６−２０３０）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術 （Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６）が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、適切な生物活性を持つヒト抗体からの遺伝子とともに、適切な抗原特異性を持つマウス抗体分子からの遺伝子からの遺伝子をつなぎ会わせることによる、「キメラ抗体」の製造のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８、Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２−４５４、Ｂｏｓｓ、米国特許第４，８１６，３９７号、Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６，５６７号、これらは参照として本明細書に組み込まれる）も使用することができる。あるいは、「ヒト化された」抗体を製造することもできる（たとえば、Ｑｕｅｅｎ、米国特許第５，５８５，０８９号参照。これは参照として本明細書に組み込まれる）。また、ペプチド−特定の一本鎖抗体を製造するために、一本鎖抗体の製造が記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）も適用することができる。
【０１７２】
特定の結合部位の欠失を含む抗体断片は、公知の技術によって生産されてよい。たとえば、そのような断片として、抗体分子のペプシン消化によって生産することができるＦ（ａｂ’）₂断片、およびＦ（ａｂ’）₂断片のジスルフィド架橋を還元することによって生産できるが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、関連するペプチドの所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ簡便に同定可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリを構築してもよい（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１）。
【０１７３】
所望のペプチドに対して特異的な抗体または抗体断片は、たとえばアガロースに結合することができ、抗体−アガロース複合体は、本発明のペプチドを精製するためにイムノク
ロマトグラフィーにおいて使用される。Ｓｃｏｐｅｓ、１９８４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、リビングストン、１９７４、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ３４：７２３−７３１を参照。
【０１７４】
医薬製剤および治療方法
本発明のＲＣＴメディエータは、動物、特にヒトを始めとする哺乳動物における任意の疾患を治療するために使用することができる。該メディエータは、血清コレステロールの低下に有益であり、状態に制限されることなく、血清ＨＤＬ濃度を上げ、ＬＣＡＴを活性化し、コレステロールの流出およびＲＣＴを増進するのに有益である。このような状態として、高脂質血症、特に高コレステロール血症、およびアテローム（アテロームの治療および予防を含む）および冠状動脈症のような循環器疾患、再狭窄（たとえば、冠状動脈性プラークの予防または治療、これはバルーン血管形成のような医療処置の結果として発症する）、さらに敗血症性ショックの結果としてたびたび起こる拒血および内毒素症のような他の疾患も挙げられる。ただしこれらに限定されない。
【０１７５】
ＲＣＴのメディエータは単独で、前記状態の治療に使用される他の薬物との混合療法として使用することができる。そのような療法として、薬物の同時または逐次投与があげられるが、これに限定されない。
【０１７６】
たとえば、高コレステロール血症あるいはアテロームの治療において、ＲＣＴの分子メディエータ製剤は、たとえば胆汁酸樹脂、ナイアシン、および／またはスタチンのような、現在使用されている１つ以上のコレステロール低下治療薬とともに投与されることができる。このような組合せの治療投与法は、コレステロール合成および転送において各薬物は異なった標的に作用するので、特に有益な治療効果を生み出すことがある。すなわち、胆汁酸樹脂はコレステロール再循環、カイロミクロンおよびＬＤＬ集団に影響し、ナイアシンは主としてＶＬＤＬおよびＬＤＬ集団に影響し、スタチンはコレステロール合成を抑制し、ＬＤＬ 集団を減少させ（そして、おそらく、ＬＤＬ受容体発現を増加させる）、一方ＲＣＴメディエータは、ＲＣＴに影響し、ＨＤＬを増加させ、ＬＣＡＴ活性を改善し、コレステロール流出を進める。
【０１７７】
ＲＣＴメディエータは、高脂質血症、高コレステロール血症および／またはアテロームのような循環器疾患の治療のために、フィブラートと共に使用してもよい。
【０１７８】
本発明のＲＣＴメディエータは、エンドトキシンによって引き起こされた敗血症性ショックを治療するために、現在使用されている抗菌薬および抗炎症薬とともに使用することができる。
【０１７９】
本発明のＲＣＴメディエータは、循環させるためにＲＣＴメディエータを肝臓に送る種々の方法、好ましくは経口投与によって、対象者に投与することのできるペプチド系組成物またはペプチド−脂質複合体として製剤化することができる。典型的な製剤および治療・投与法は後で述べる。
【０１８０】
本発明の他の好ましい実施形態において、高コレステロール血症および／またはアテロームの１つ以上の症状の回復および／または予防方法を提供する。該方法は、好ましくは、生物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに本発明のペプチド（あるいはそのようなペプチドの模倣物）を１つ以上投与することを含む。ペプチドは、本明細書で記載するように、注射、座薬、点鼻用スプレー、持続放出インプラント、経皮貼布など（ただし
これらに限定されない）、数多くの任意の標準的な方法によって投与することができる。１つの特に好ましい実施形態において、ペプチドは経口（たとえば、シロップ、カプセル、または錠剤として）投与する。
【０１８１】
前記方法は本発明の単一のポリペプチドの投与、または２種以上の異なったポリペプチドの投与も含む。ポリペプチドは、単量体、または２量体、オリゴマーまたはポリマーの形で提供される。特定の実施形態において、多量体の形には、関連した単量体（たとえば、イオン的にあるいは疎水性敵に結合した）を含んでもよく、一方他の特定の多量体の形は、共有結合した単量体（直接あるいはリンカーを介して結合）を含んでもよい。
【０１８２】
本発明はヒトにおける用途を記載するが、動物、たとえば獣医学的用途にも適切である。このような好ましい生物として、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ科の動物、ウマ科の動物、ネコ科の動物、ブタ科の動物、有蹄動物、ウサギ目、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本発明の方法は、高コレステロール血症および／またはアテローム（たとえば、高血圧症、プラーク形成および破裂、心臓発作、アンギナまたは脳卒中のような臨床兆候における減退、高濃度低比重リポタンパク質、高濃度低比重リポタンパク質、あるいは炎症性タンパク質など）の１つ以上の症状を示すヒトまたはヒト以外の動物に適用されるのに限らず、予防的な意味においても有用である。したがって、高コレステロール血症および／またはアテロームの１つ以上の症状の始まり／発症の予防のために、本発明のペプチド（その模倣薬）を生物に投与してもよい。この意味において得に好ましい対象は、１つ以上のアテローム危険因子（たとえば、家族歴高血圧症、肥満症、多量のアルコール摂取、喫煙、高血液コレステロール、高血液トリグリセリド、高血液ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬあるいは低ＨＤＬ、糖尿病あるいは家族歴糖尿病、高血液脂質、心臓発作、アンギナまたは脳卒中など）を示すものである。
【０１８４】
１つの好ましい実施形態において、ＲＣＴのペプチドメディエータは、ＲＣＴメディエータの合成および精製に関連する先の部分に記載された技術の任意のものを使って合成または製造することができる。長い保存寿命を持つ安定な製造物として、ペプチドを凍結乾燥することによって造られてもよく、または改質のために固まりであるいは個々のアリコートまたは投薬単位として製造してもよい。これらは、対象物に投与する前に、滅菌水あるいは適切な滅菌緩衝液による再水和によって再構成することができる。
【０１８５】
他の好ましい実施形態において、ＲＣＴのメディエータは、ペプチド−脂質複合体の形で製剤化され、投与されてもよい。この手段は、特に複合体がＨＤＬと類似した寸法および密度を持つ場合、とりわけプリ−β−ｌまたはプリ−β−２ＨＤＬ集団の場合、複合体は循環において保存寿命を引き伸ばすので、いくつかの利点がある。ペプチド−脂質複合体は、下記する数多くの方法の任意のものによっても都合よく製造することができる。長い保存寿命をもつ適切な製造法は、凍結乾燥によって造られてもよい。下記する共凍結乾燥の手段は好ましいものである。凍結乾燥されたペプチド−脂質複合体は、改質のために固まりであるいは個々のアリコートまたは投薬単位として製造してもよい。これらは、対象物に投与する前に、滅菌水あるいは適切な滅菌緩衝液による再水和によって再構成することができる。
【０１８６】
ペプチド−脂質小胞または複合体を製造するために、当業者に周知の数多くの方法を使用することができる。このため、リポソームあるいはプロテオリポソームを製造する、数多くの入手しうる技術を使用してもよい。たとえば、ペプチドは、適切な脂質とともに、共超音波破壊（バスまたはプローブ超音波処理器を使用して）し、複合体を形成することができる。あるいは、ペプチドは、プリフォームされた脂質小胞と組み合わせて、ペプチ
ド−脂質複合体の自発的形成を行うこともできる。また他の態様として、ペプチド−脂質複合体は、洗浄剤透析法によって形成することもできる。たとえば、ペプチド、脂質および洗浄剤の混合物を透析し洗浄剤を除き、ペプチド−脂質複合体を再構成または形成する（たとえば、Ｊｏｎａｓら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８：５５３−５８２参照）。
【０１８７】
今まで記載した手段は実現可能であるが、各方法にはそれぞれ、コスト、収量、再生産性、および安全性の点からそれ特有の製造上の問題がある。好ましい１つの方法において、ペプチドおよび脂質が、各成分が共溶解し凍結乾燥によって完全に除去される溶剤系で組み合わされる。このため、溶剤ペアは、両親媒性ペプチドと脂質の両方の共溶解性を確保するために注意深く選択されるべきである。１つの実施形態において、タンパク質、ペプチドまたはその誘導体／類似体（粒子に組み込まれる）を、水性または有機性溶剤または混合溶剤（溶剤１）に溶解することができる。（リン）脂質成分は、水性または有機性溶剤または混合溶剤（溶剤２）に溶解される。溶剤２は溶剤１と混和性があり、２つの溶駅は混合する。あるいは、ペプチドと脂質は、たとえば、混和性の溶剤の混合物のような共溶剤システムに組み込まれることができる。ペプチド（タンパク質）の脂質に対する適切な割合は、得られる複合体が適切な物理的および化学的特性を持つように、先ず経験的に決定され、通常（しかし必ずしもこうではないが）ＨＤＬのサイズと類似する。得られた混合物は冷凍され、凍結乾燥される。付加的な溶剤を混合物に加え、凍結乾燥を容易にしなければならない場合もある。この凍結乾燥製品は、長期間保存することができ、安定性を保つ。
【０１８８】
凍結乾燥製品は、ペプチド−脂質複合体の溶液または懸濁液を得るために再構成することができる。このため、凍結乾燥粉末は、適切な容積（しばしばペプチド５ｍｇ／ｍｌ、これは静脈注射に都合がよい量）の水溶液で再水和してもよい。好ましい実施形態において、凍結乾燥粉末は、リン酸緩衝生理食塩水または生理食塩水で再水和されてもよい。混合物は、再水和を容易にするために、撹拌あるいは渦を作ってもよい。ほとんどの場合、再構成工程は、複合体の脂質成分の相転移温度以上の温度で行われるべきである。数分以内に、再構成された脂質−タンパク質 複合体の透明の生成物が得られる。
【０１８９】
結果として得られた、再構成された製品のアリコートは、製品中の複合体が所望のサイズ分布、たとえば、ＨＤＬのサイズ分布、を持つことを確認するために、特徴づけられることができる。ゲルろ過クロマトグラフィーは、この目的のために使用し得る。たとえば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ＦＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィーシステムを使用することができる。使用される緩衝液は、５０ｍＭリン酸緩衝液中の１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含む。典型的なサンプル容積は、ペプチドを５ｍｇ／ｍｌ含む複合体、２０〜２００マイクロリットルである。カラム流速は、０．５ｍｌ／ｍｉｎである。好ましくは、一連のタンパク質の公知の分子量およびストークス径、さらにヒトＨＤが標準として使用し、カラムを調整する。タンパク質およびリポタンパク質複合体は、波長が２５４または２８０ｎｍの光の吸光または散乱によってモニターする。
【０１９０】
本発明のＲＣＴメディエータは、飽和、不飽和飽和、天然および合成脂質および／またはリン脂質を始めとする種々の脂質と複合体となりうる。適切な脂質として、これらに限定されないが、小アルキル鎖リン脂質、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、ｌ−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリンジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロールホスファチジルコリン、ホスファチ
ジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド類、セレブロシド類、ジラウリルホスファチジルコリン、（１、３）−Ｄ−マンノシル−（１，３）ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、３−コレステリル−６’−（グリコシルチオ）ヘキシルエーテルグリコ脂質、コレステロールおよびその誘導体が挙げられる。
【０１９１】
本発明の医薬製剤は、ＲＣＴのペプチドメディエータまたはペプチド−脂質複合体が、投与および生体内で送出のに好適な医薬的に許容しうるキャリア中に活性成分として含まれる。ペプチドは酸性および／または塩基性末端および／または側鎖を含んでもよいので、ペプチドは、製剤中に遊離した酸や塩基の形、あるいは医薬的に許容しうる塩の形のどちらの形で出に含まれ得る。
【０１９２】
注射製剤は、水性または油性賦形剤中に活性成分の無菌懸濁液、溶液または乳液を含む。組成物は、また、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような形成剤を含んでもよい。注射製剤は、たとえばアンプル中に単位用量剤型で置いておいてもよいし、複数回投与容器中に置いておいてもよい。また保存料を加えてもよい。
【０１９３】
あるいは、注射製剤は、使用前に発熱性物質除去蒸留水、緩衝液、デキストロース溶液など（これらに限定されない）の適切な賦形剤で再構成するために、粉末の形で共されてもよい。このため、ＲＣＴメディエータは凍結乾燥されてもよく、共凍結乾燥されたペプチド−脂質複合体を製造してもよい。貯蔵製剤は、単位用量剤型で供給され、生体内に使用する前に再構成されてもよい。
【０１９４】
長期に渡って送り出すため、活性成分は、移植による投与用のデボー製剤たとえば、皮下、真皮内または筋肉内注射として製剤化することもできる。従って、たとえば、活性成分は、適切な高分子または疎水性材料（たとえば、許容しうる油内のエマルジョンとして）あるいはイオン交換樹脂とともに、またはやや溶けにくい誘導体として、たとえばＲＣＴメディエータのやや溶けにくい塩の形で製剤化してもよい。
【０１９５】
あるいは、経皮吸収用の活性成分をゆっくり放出する付着盤あるいはパッチとして造られた経皮吸収システムを使用してもよい。このため、活性成分の経皮透過を容易にするために、透過増強剤が使用されてもよい。特に利益になる点は、虚血性心疾患と高コレステロール血症を患う患者に使用するために、本発明のＲＣＴメディエータまたはペプチド−脂質複合体をニトログリセリンパッチに組み込むことにより達成してもよいことである。
【０１９６】
経口投与に関して、医薬組成物は、たとえば、結合剤（たとえば、プレゼラチン化トウモロコシでんぷん、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、フィラー（たとえば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、錠剤崩壊剤（たとえば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウム澱粉）、または浸潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような医薬的に許容し得る医薬添加物とともに、従来の方法によって製造される錠剤またはカプセルの形をとってもよい。錠剤は、業界で公知
の方法によって被覆される。経口投与用の液状製剤は、たとえば、溶液、シロップまたは懸濁液の形をとってよく、または、乾燥製品として提供され、使用前に水や適切な賦形剤で構成されてもよい。このような液状製剤は、懸濁剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）、乳化剤（たとえば、レシチンまたはアカシア）、非水性賦形剤（たとえば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画野菜油）、および防腐剤（たとえば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの医薬的に許容しうる添加物とともに、従来の方法で製造することができる。製剤はまた、必要に応じて緩衝液塩、香料、着色料、甘味料を含んでもよい。経口投与用の製剤は適切に剤化し、活性化合物の徐放性が与えられてもよい。
【０１９７】
口腔投与に関して、組成物は従来の方法で、錠剤またはトローチ製剤の形で取る。直腸および膣経路投与は、活性成分を溶液剤（保持浣腸用）、座剤または軟膏剤として製剤化してもよい。
【０１９８】
吸入投与に関しては、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスなどの適切な推進剤を用いて、圧力のかかったパックまたは噴霧器から、活性成分をエーロゾル噴霧投与の形で、都合よく送り出すことができる。圧力のかかったエアゾールの場合、投薬単位は計量した量を送り出す弁を備え付けることによって判断してもよい。呼吸保護器または吸入器で使用する、たとえば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはスターチのような適切な粉末ベースを含んで製剤化してもよい。
【０１９９】
組成物は、所望であれば、活性成分を含む１単位以上の用量を含んでもよいパックまたはディスペンサー容器中に入っていてもよい。パックは、たとえば、ブリスターパックのような金属あるいはプラスチック箔で構成されていてもよい。パックあるいはディスペンサー容器は、投与指示書が一緒に付いていてもよい。
【０２００】
本発明のＲＣＴのペプチドメディエータおよび／またはペプチド−脂質複合体は、循環において生体利用効率を保障する、適切な任意の経路によって投与されてよい。これは静脈（ＩＶ）、筋肉（ＩＭ）、真皮内、皮下（ＳＣ）および腹腔内（ＩＰ）注射を始めとする非経口ルートによる投与によって達成することができる。しかしながら、他の投与経路を使用してもよい。たとえば、消化管を経由する吸収は、経口投与経路（たとえば、経口摂取、舌下および舌下腺経路が挙げられるがこれに限定されない）によって達成される。ただし、口腔粘膜、胃および／または小腸の苛酷環境においては、活性成分の分解を避けるまたは最小にするために、適切な形態（たとえば腸溶性コーティング）が使用される。経口投与は、使用しやすくしたがって、順応性が高められやすいという利点がある。あるいは、消化管における分解を避けるあるいは最小限にするために、膣および直腸経路などの粘膜組織を経由した投与が利用されてもよい。さらに他のものとして、本発明製剤は、経皮的に（たとえば経皮投与）または吸入投与してもよい。好ましい経路は被投与者の状態、年齢、コンプライアンスによって様々に変化してよいことは了解されるであろう。
【０２０１】
使用されるＲＣＴのペプチドメディエータまたはペプチド−脂質複合体の実際の用量は、投与の経路に応じて様々に変化し、循環血漿濃度１．０ｍｇ／１から２ｇ／ｌを達成するように調整されるべきである。本明細書に記載した動物モデルシステムにおいて得られたデータは、本発明のアポＡ−ＩアゴニストはＨＤＬ成分に結合し、予測される半減期は約５日であることを示す。したがって、１つの実施形態において、ＲＣＴのメディエータは、１週間につき１回０．５ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの用量の注射で投与することができる。他の実施形態においては、約０．１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒから１００ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの用量で、連続注入投与または間欠注入投与によって所望の血清濃度が保ち得る。
【０２０２】
ＲＣＴの種々のメディエータの毒性および治療効能は、ＬＤ₅₀（集団の５０％が死に至る量）およびＥＤ₅₀（集団の５０％が治療的に有効である量）を測定するための細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手順を使用して測定することができる。毒性と治療的効果との用量比は、治療インデックスであり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀比と表すことができる。大きな治療指数を示すアポＡ−Ｉペプチドアゴニストは好ましい。
【０２０３】
他の用途
本発明のＲＣＴアゴニストのメディエータは、インビトロで、たとえば、診断目的のために血清ＨＤＬを測定するアッセイにおいて使用することができる。ＲＣＴのメディエータは、血清のＨＤＬおよびＬＤＬ成分と結合するので、アゴニストは、ＨＤＬおよびＬＤＬ集団の「マーカー」として使用することができる。さらに、アゴニストは、ＲＣＴにおいて効果的なＨＤＬの亜集団のマーカーとしても使用することができる。この目的のために、アゴニストは患者の血清サンプルに加えるまたは混合することができ、適切な培養時間の後、組み込まれたＲＣＴのメディエータを測定することによってＨＤＬ成分をアッセイすることができる。これは、標識アゴニスト（たとえば、放射能標識、蛍光色素標識、酵素標識、染料など）を使用することによって、あるいはアゴニストを特定する抗体（あるいは抗体断片）を使用したイムノアッセイによって成就することができる。
【０２０４】
あるいは、標識アゴニストは、循環システムを視覚化するために、ＲＣＴをモニターするために、または、脂肪線条やアテローム性動脈硬化部およびその他（ここでＨＤＬは、コレステロール流出において活性であるべきである）でのＨＤＬの蓄積を視覚化するために、画像検査（たとえば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩスキャン）で使用することができる。
【０２０５】
コレステロール逆輸送メディエータの分析アッセイ
ＬＣＡＴ活性アッセイ
本発明の好ましい実施形態によるＲＣＴのメディエータは、潜在的な臨床効果を種々のインビトロアッセイによって評価することができる。たとえばインビトロＬＣＡＴ活性化能力をアッセイする。ＬＣＡＴアッセイにおいて、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）または１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）と放射能標識コレステロールから構成される基質小胞体（小単ラメラ小胞、「ＳＵＶｓ」）をペプチドまたはアポＡ−Ｉ（ヒト血漿からされた）と等価質量で培養する。反応はＬＣＡＴ（ヒト血漿から精製）を添加して始めた。陽性対照として用いられた天然アポＡ−Ｉは１００％ 活性として表す。分子メディエータの「比活性度」（すなわち、活性の単位（ＬＣＡＴ活性）／質量単位）は、最高ＬＣＡＴ活性を達成するメディエータの濃度として計算することができる。たとえば、一連のペプチド濃度（たとえば、限界希釈）はアッセイして、ペプチドの「比活性度」すなわち、アッセイ中のある特定の時間（たとえば１時間）の最高ＬＣＡＴ活性を達成する濃度（たとえば、コレステロールのコレステロールエステルへの変換比率）を測定することができる。ペプチド濃度に対する１時間でのコレステロールの変換比率をプロットすれば、「比活性度」は、プロットされた曲線上にプラトーを達成したペプチド濃度として同定することができる。
【０２０６】
基質小胞体の製造
ＬＣＡＴアッセイで使用される小胞体は、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）またはｌ−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）とコレステロールがモル比２０：１で構成されるＳＵＶである。４０回のアッセイに差し支えない小胞体ストック溶液を製造するために、７．７ｍｇのＥＰＣ（または７．６ｍｇのＰＯＰＣ、１０μｍｏｌ）、７８μｇ（０．２μｍｏｌ）の４−¹⁴Ｃ−コレステロール、および１１６μｇのコレステロール（０．３μｍｏｌ）をキシレン中に溶解し、凍結乾燥する。その後、４ｍｌのアッセイ緩衝液を該乾燥粉末に加え、４℃窒素雰囲気下で超音波分解する。超音波分解条件：Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波処理器、１０ｍｍチップ、６´５分、アッセイ
バッファ：１０ｍＭのトリスバッファ、０．１４ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４。超音波分解混合物は、毎回１４，０００ｒｐｍ（１６，０００´ｇ）、５分ずつ６回遠心分離し、チタニウム粒子を取り除く。得られた透明溶液を酵素アッセイに使用した。
【０２０７】
ＬＣＡＴの精製
ＬＣＡＴ精製は、ヒト血漿のデキストラン硫酸／Ｍｇ²⁺処理を使用してリポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ）を得、これをフェニルセファロース、アフィゲルブルー、コンカナバリンＡセファロースおよび抗−アポＡ−Ｉ親和性クロマトグラフィー上で逐次クロマトグラフィーに供した。
【０２０８】
ＬＰＤＳの精製
ＬＰＤＳを製造するため、５００ｍｌの血漿を５０ｍｌのデキストラン硫酸（ＭＷ＝５００，０００）溶液に加え、２０分撹拌した。４℃で３０００ｒｐｍ（１６，０００´ｇ）３０分遠心分離する。さらに精製するために、上澄み（ＬＰＤＳ）（約５００ｍｌ）を使用する。
【０２０９】
フェニルセファロースクロマトグラフィー
下記の材料および条件は、フェニルセファロースクロマトグラフィーのために使用された。固相：フェニルセファロース高速流通、高品質基質、ファルマシアカラム：ＸＫ２６／４０、ゲル床の高さ：３３ ｃｍ、Ｖ＝ｃａ、１７５ｍｌ流速：２００ｍｌ／ｈｒ（サンプル）洗浄：２００ｍｌ／ｈｒ（バッファ）溶離：８０ｍｌ／ｈｒ（蒸留水）バッファ：１０ｍＭトリスバッファ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ７．４、０．０１％アジ化ナトリウム。
【０２１０】
トリスバッファ−バッファ中でカラムを平衡にし、２９ｇのＮａＣＩを５００ｍｌのＬＰＤＳに加え、前記カラムに適用した。２８０ｎｍ波長での吸収がほぼベースラインになるまで、数体積のトリスバッファで洗浄し、その後蒸留水での溶離を始める。タンパク質を含む画分をプールし（プールサイズ：１８０ｍｌ）、アフィゲルブルークロマトグラフィーを行う。
【０２１１】
アフィゲルブルークロマトグラフィー
フェニルセファロースプールを、２０ｍＭトリスバッファ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．０１％アジ化ナトリウムに対して４℃で一晩透析する。プール体積を、限外ろ過（ＡｍｉｃｏｎＹＭ３０）によって５０〜６０ｍｌに減らし、アフィゲルブルーカラムに乗せる。固相：アフィゲルブルー、バイオラド、１５３−７３０１カラム、ＸＫ２６／２０、ゲル床の高さ：約１３ｃｍ、カラム体積：約７０ｍｌ、流速：負荷：１５ｍｌ／ｈ洗浄：５０ｍｌ／ｈ。トリスバッファ−バッファ中でカラムを平衡にし、フェニルセファロースプールをカラムに適用し、画分を収集するのと平行して、始める。トリスバッファ−バッファで洗浄する。プールされた画分（１７０ｍｌ）ｗｅｒｅはクロマトグラフィーに使用された。
【０２１２】
ＣｏｎＡクロマトグラフィー
アフィゲルブループールをＡｍｉｃｏｎ（ＹＭ３０）で、ＣｏｎＡ出発バッファ（１ｍＭトリスバッファＨＣ１ｐＨ７．４、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＭｎＣｌ₂、１ｍＭのＣａＣｌ₂、０．０１％アジ化ナトリウム）に対して４℃で一晩透析して３０〜４０ｍｌに減らした。固相：ＣｏｎＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム：ＸＫ２６／２０、ゲル床の高さ：１４ｃｍ（７５ｍｌ）。流速：負荷４０ｍｌ／ｈ洗浄（出発バッファで）：９０ｍｌ／ｈ溶離：５０ｍｌ／ｈ、１ｍＭトリスバッファ中の０．２Ｍメチル−a−Ｄ−マンノシド、ｐＨ７．４。マンノシド溶離液中のタンパク質画分を収集し（１１０
ｍｌ）、体積を限外ろ過（ＹＭ３０）によって４４ｍｌに減らした。ＣｏｎＡプールを２ｍｌアリコートに分け、それぞれ−２０°Ｃで保存する。
【０２１３】
抗−アポＡ−１親和性クロマトグラフィー
抗−アポＡ−Ｉ親和性クロマトグラフィーは、抗−アポＡ−Ｉ 腹筋が共有結合しているＡｆｆｉｇｅｌ−Ｈｚ材（バイオラボ）上で行った。カラム：ＸＫ１６／２０、Ｖ＝１６ｍｌ。カラムはＰＢＳｐＨ７．４で平衡にした。負荷をカラムにかける前に、２ｍｌのＣｏｎＡプールをＰＢＳに対して２時間透析した。流速：負荷：１５ｍｌ／ｈｏｕｒ洗浄（ＰＢＳ）４０ｍｌ／時間。プールされたタンパク質画分（Ｖ＝１４ｍｌ）はＬＣＡＴアッセイ用を使用する。カラムは０．１Ｍクエン酸塩バッファ（ｐＨ４．５）で再生し、結合Ａ−１（１００ｍｌ）を溶離し、この工程の直後に、ＰＢＳで再平衡する。
【０２１４】
ＲＣＴメディエータの薬物動態
以下の実験手順は、ＲＣＴのメディエータが循環において適切であり、血漿のＨＤＬ成分と結合することを示すために使用することができる。
【０２１５】
ペプチドアゴニストの合成および／または放射能標識
^l25Ｉ−ＬＤＬを、一塩化ヨウ素法によって５００〜９００ｃｐｍ／ｎｇの比活性度に製造した（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎとＢｒｏｗｎ１９７４Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５１５３−５１６２）。培養ヒト線維芽細胞による低比重リポタンパク質の結合および分解を、最終比活性度５００〜９００ｃｐｍ／ｎｇで測定した（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎとＢｒｏｗｎ１９７４Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５１５３−５１６２）。全てのケースで、＞９９％の放射能は、４℃、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）リポタンパク質の培養によって沈殿性であった。Ｔｙｒ残基は各ペプチドのＮ−末端に結合し、放射性ヨード化を可能にした。ペプチドは、ヨウ素ビーズのを使用しおよび製造業者プロトコルに従って、Ｎａ¹²⁵Ｉ（ＩＣＮ）で放射性ヨード化し（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、比活性度８００〜１０００ｃｐｍ／ｎｇを得た。透析後、ペプチドの沈殿性放射能（１０％ＴＣＡ）は常に＞９７％であった。
【０２１６】
あるいは、Ｎ−末端アミノ酸である¹⁴Ｃ−標識Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏをカップリングして放射性標識ペプチドは合成することができた。比活性度が９．２５ＧＢｑ／ｍｍｏｌであるＬ−〔Ｕ¹⁴−Ｃ〕Ｘを含む標識アゴニストの合成に使用することができる。合成は、Ｌａｐａｔｓａｎｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８３、６７１−１７３に従って行ってもよい。要約すると、２５０μＭ（２９．６ｍｇ）の標識されていないＬ−Ｘを２２５μｌの９％Ｎａ₂Ｃ０₃溶液に溶解し、これを９．２５ＭＢｑ（２５０μＭ）の¹⁴Ｃ−標識Ｌ−Ｘの溶液（９％Ｎａ₂Ｃ０₃）に加える。液を０℃に冷却し、０．７５ｍｌのＤＭＦ中の６００μＭ（２０２ｍｇ）の９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）と混合し、室温で４時間振盪する。その後、混合物をジエチルエーテル（２×５ｍｌ）およびクロロホルム（１´５ｍｌ）で抽出し、得られた水相を３０％ＨＣ１で酸性にし、クロロホルム（５×８ｍｌ）で抽出する。有機層をＮａ₂ＳＯ₄₁上で乾燥し、ろ過し、窒素流下で体積を５ｍｌに減らす。純度は、ＴＬＣ（ＣＨＣ１₃：ＭｅＯＨ：Ｈａｃが９：１：０．１、ｖ／ｖ／ｖ、固定相ＨＰＴＬＣシリカゲル６０、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ＵＶ検出法、たとえば放射化学純度：線型偏光器、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙで判定し、反応収量はほぼ９０％（ａＬＳＣによって測定）である。
【０２１７】
¹⁴Ｃ−ペプチドＸを含むクロロホルム溶液は、ペプチド合成のために直接使用される。アミノ酸２〜２２Ａを含むペプチド樹脂は、上記したような習慣の方法で合成することができ、合成のために使用される。ペプチドの配列は、エドマン分解によって測定した。カップリングは、ＴＢＴＵの代わりにＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−
イル）ｌ，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェイト）が好ましく使用される以外は、先に記載した方法により行う。標識されていないＦｍｏｃ−Ｌ−Ｘとの第２のカップリングは、マニュアルどおりに行われる。
【０２１８】
マウスにおける薬物動態
各実験において、３００〜５００μｇ／ｋｇ（０．３〜０．５ｍｇ／ｋｇ）（あるいはそれを超えるたとえば２．５ｍｇ／ｋ）の放射性標識ペプチドを、マウス用の通常食餌あるいはアテローム生成用のＴｈｏｍａｓ−Ｈａｒｃｒｏｆｔ修飾された食餌（結果としてＶＬＤＬとＩＤＬコレステロールが大幅に上昇する）を与えられたマウスに腹腔内注射する。血液サンプルを多重時間間隔で取り、血漿中の放射能を評価する。
【０２１９】
ヒト血清中の安定性
１００μｇの標識ペプチドを２ｍｌの新鮮なヒト血漿（３７℃）で混合し、即座に（コントロールサンプル）あるいは３７℃で８日間の培養後（試験サンプル）、脱脂質する。脱脂質は、脂質を等容積の２：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノールで抽出することによって行う。サンプルを、逆相Ｃ_l8ＨＰＬＣカラム上に乗せ、アセトニトリル（含０．１ｗｔ％ＴＦＡ）の直線勾配（２５−５８％、３３分を超える）で溶離する。次いで、溶離プロフィールをの吸光度（２２０ｎｍ）と放射能を測定する。
【０２２０】
Ｐｒｅ−β様粒子の形成
ヒトＨＤＬはＫＢｒ密度超遠心分離によって、密度ｄ＝１．２１ｇ／ｍｌで単離してトップ画分を得、次いで、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過クロマトグラフィーで他のリポタンパク質からＨＤＬを分離してもよい。単離されたＨＤＬは、ブラッドフォードタンパク質アッセイによって測定されたタンパク質含量に基づいて、最終濃度として１．０ｍｇ／ｍｌに調整する。３００μｌのアリコートは、単離されたＨＤＬ製剤から分離され、１００μｌの標識ペプチド（０．２〜１．０μｇ／μｌ）とともに、３７℃で２時間培養する。複数の分離培養物は、１００μｌの生理食塩水を含むブランクと４つの標識ペプチドの希釈物、たとえば、（ｉ）０．２０μｇ／μｌのペプチド：ＨＤＬ比＝１：１５、（ｉｉ）０．３０μｇ／μｌのペプチド：ＨＤＬ比＝１：１０、（ｉｉｉ）０．６０μｇ／μｌのプチド：ＨＤＬ比＝１：５および（ｉｖ）１．００μｇ／μｌのペプチド：ＨＤＬ比＝１：３で分析される。２時間の培養後、サンプルの２００μｌのアリコート（総体積＝４００μｌ）をリポタンパク質分離用のＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラムの上に乗せ、分析を行い、１００μｌを使用して乗っている総放射能を測定する。
【０２２１】
メディエータのヒトリポタンパク質との関連
ペプチドメディエータとヒトリポタンパク質画分との関連は、標識ペプチドと各リポタンパク質クラス（ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ）および違う種類のリポタンパク質クラスの混合物を培養することによって測定することができる。ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬはＫＢｒ密度勾配超遠心分離によって、密度ｄ＝１．２１ｇ／ｍｌで単離してＳｕｐｅｒｏｓｅ６Ｂカラムサイズ排除カラム（クロマトグラフィーは流速０．７ｍｌ／分および流バッファ、１ｍＭのトリスバッファ（ｐＨ８）、１１５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０％ＮａＮ₃で行われる）上のＦＰＬＣによって精製する。ヒトＨＤＬはトップ画分を得、次いで、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過クロマトグラフィーで他のリポタンパク質からＨＤＬを分離してもよい。標識ペプチドは、３７℃で２時間、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬとともにペプチド：リン脂質比が１：５（質量比）で培養される。リポタンパク質の定額（１０００μｇを得るのに必要な量を基にした体積）を０．２ｍｌのペプチドストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と混合し、該溶液を０．９％のＮａＣｌを使用して２．２ｍｌとする。
【０２２２】
３７℃で２時間培養した後、アリコート（０．１ｍｌ）を総放射能の測定（たとえば、
液体シンチレーションを使用して標識同位元素をカウントあるいはガンマカウントする）のために取り除き、残留培養混合物の密度をＫＢｒで１．２１ｇ／ｍｌに調整し、サンプルを、ベックマンテーブルトップ超遠心分離を使用したＴＬＡ１００．３ローター中、４℃で２時間、１００，０００ｒｐｍ（３００，０００ｇ）遠心分離する。得られた上澄みは、画分され、０．３ｍｌのアリコートを各サンプルの最上層から取り除き、全体で５画分を得、０．０５ｍｌの各画分をカウントのために使用する。最上層の２画分は浮遊リポタンパク質を含み、他の画分（３〜５）溶液中のタンパク質／ペプチドに対応する。
【０２２３】
ＨＤＬ脂質への選択的結合
ヒト血漿（２ｍｌ）を２０、４０、６０、８０、および１００μｇの標識ペプチドとともに２時間３７℃で培養した。リポタンパク質は密度を１．２１ｇ／ｍｌに調整することによって分離し、遠心分離をＴＬＡ１００．３ローター中、１００，０００ｒｐｍ（３００，０００ｇ）３６時間４℃で行った。最上層９００μｌ（画分３００μｌ中）を分析のため取る。各３００μｌ画分の５０μｌで放射能をカウントし、該画分の２００μｌをＦＰＬＣ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６／Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２混合カラム）によって分析する。
【０２２４】
動物モデルシステムにおけるコレステロール逆輸送のメディエータの用途
本発明のＲＣＴメディエータの効能は、ウサギまたは他の適切な動物モデルにおいて行うことができる。
【０２２５】
リン脂質／ペプチド複合体の製造
リン脂質（ＤＰＰＣ）とペプチドからなる小円板状の粒子を、以下のコール酸塩透析法によって製造する。リン脂質をクロロホルムに溶解し、窒素気流下で乾燥する。ペプチドをバッファ（生理食塩水）中に溶解し、濃度を１〜２ｍｇ／ｍｌとする。脂質フィルムを、コール酸塩を含むバッファに再溶解し（４３℃）、ペプチド溶液を加え、リン脂質／ペプチドの重量比を３：１とする。該混合物を４３℃一晩培養し、温度点で３倍のバッファ（大量）を変えながら、４３°℃（２４時間）、室温（２４時間）および４℃（２４時間）透析する。複合体は注射用にフィルター滅菌（０．２２μｍ）してもよく、４℃で保管される。
【０２２６】
ペプチド／リン脂質粒子の単離および特性分析
粒子はゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ）で分離してもよい。粒子を含むピークの位置は、各画分におけるリン脂質濃度を測定することによって同定する。溶離体積から、ストークス半径を測定することができる。複合体におけるペプチド濃度は、１６時間の酸加水分解の後、フェニルアラニン含量（ＨＰＬＣによって）を測定することによって決定する。
【０２２７】
ウサギにおける注射
オスのニュージーランド白ウサギ（２．５〜３ｋｇ）に、リン脂質／ペプチド複合体を、単一ボーラス注射が１０〜１５ｍｌを超えないで、１用量（５または１０ｍｇ／ｋｇ体重、ペプチドとして発現）静脈内注射する。動物は処置する前に少し鎮静化させる。血液サンプル（ＥＤＴＡ上で集められる）を注射の前に取り、注射をした後５、１５、３０、６０、２４０および１４４０分後に取る。ヘマトリック（Ｈｃｔ）を各サンプル毎に測定する。サンプルはアリコートとされ、分析前は−２０℃で保存する。
【０２２８】
ウサギの血清の分析
総血漿コレステロール、血漿トリグリセリドおよび血漿リン脂質を、市販のアッセイを使用して、たとえば、製造会社の手順（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、６９２８０、Ｍａｒｃｙ−Ｌ’ｅｔｏｉｌｅ、フランス）に従って酵素的に測定する。
【０２２９】
リポタンパク質画分への血漿の分離後に得られる画分の血漿リポタンパク質プロフィールは、ショ糖密度勾配中でのスピンニングによって測定してもよい。たとえば、画分を集め、リン脂質およびコレステロールの濃度を、ＶＬＤＬ、ＩＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬリポタンパク質密度に対応する画分において、従来の酵素分析によって測定することができる。
【０２３０】
実施例
短期間の目的は、肝臓へのＨＤＬ−介在コレステロール転送において機能するアポＡ−Ｉの化合物模倣のミミックの同定であった。長期の目的は、化合物を修飾し、それらを一部のリポタンパク質と相互に作用しあい、それらを肝臓への標的とし、コレステロールが豊富なリポタンパク質の異化代謝の速度（コレステロール逆輸送）を増幅することであった。抹消組織へのコレステロール転送を整える現在行われている治療（リシン、スタチン、フィブラート）と違い、ここで行われるアプローチは、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）濃度とコレステロールが豊富な低比重リポタンパク質の異化代謝を増大させることによってＲＣＴを増幅することを含む。このアプローチの論理的根拠は、長い間認知されているＲＣＴの速度と心血管系のリスクとの間の反比例関係である。
【０２３１】
リポタンパク質単離−ヒト血漿リポタンパク質を、正常なドナーから血漿交換によって得られた、新鮮な空腹時の血漿から単離した。ＬＤＬ（ｄ＝１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍｌ）を厳密な滅菌下、密度調整のためにＫＢｒを使用する逐次超遠心分離によってエンドトキシンのない条件で単離した。それを３ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１５ｍＭのＮａＣｌおよびプロブコールに対してｐＨ７．４で透析し、ろ過−滅菌し、４℃で保存した。
【０２３２】
放射性ヨード化−^l25Ｉ−標識ＬＤＬを、一塩化ヨウ素法によって、最終比活性度を約５００〜９００ｃｐｍ／ｎｇとして製造した（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎとＢｒｏｗｎ、１９７４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５１５３−５１６２）。培養されたヒト線維芽細胞による低比重リポタンパク質の結合および分解は、最終比活性度を約５００−９００ｃｐｍ／ｎｇとして行われた（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎとＢｒｏｗｎ、１９７４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５１５３−５１６２）。全てのケースで、＞９９％の放射能は、４℃、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）リポタンパク質の培養によって沈殿性であった。Ｔｙｒ残基は各ペプチドのＮ−末端に結合し、放射性ヨード化を可能にした。ペプチドは、ヨウ素ビーズを使用して、製造業者のプロトコルに従って、Ｎａ¹²⁵Ｉ（ＩＣＮ）で放射性ヨード化し（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、比活性度８００〜１０００ｃｐｍ／ｎｇを得た。透析後、ペプチドの沈殿性放射能（１０％ＴＣＡ）は常に＞９７％であった。
【０２３３】
ペプチドの血漿安定性およびリポタンパク質分布−この試験に用いたＬＤＬＲ−／−マウスは、オス、２ヶ月齢であり、固形飼料が与えられた。血液を非絶食マウスからヘパリン−外皮チューブを通して抜き、それを４℃で低速度遠心分離にかけ、血漿を得た。血漿安定性を測定するために、５〜６μｇの放射性ヨード化ペプチドを０．２５ｍｌの血漿に加えた。３７℃で培養後、アリコートを取り除き、１０％ＴＣＡで沈殿させた。血漿中のアポＡ−Ｉペプチドと、リポタンパク質および／または他のタンパク質との関連を試験するため、６〜８μｇの放射性ヨード化ペプチドを０．１２ｍｌのマウス血漿で３７℃２時間培養した。培養後、混合物を１％アガロースゲル（パラゴンシステム、Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で製造会社の指示に従って分離し、放射能をＬＤＬ、ＨＤＬ、およびアルブミンを示すバンド中で定量した。
【０２３４】
ペプチドの組織分布−１２μｇの放射性ヨード化ペプチドをアポＡ−１欠損マウスの尾部静脈にメトファン麻酔下で静脈内注射した。注射後４０分、マウスを屠殺し、血液をＰ
ＢＳの灌流によりカニューレを使い左心室へ動かした。４０分後マウスを後眼窩出血によりヘパリン化チューブに出血させた。
【０２３５】
メディエータ−ＬＤＬ複合体−ペプチド／リポタンパク質複合体を、２５℃２時間、モル比２５：１のＰＢＳで希釈したヒト血漿で過剰量の放射性標識ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）を培養することによって形成した。該複合体を、遊離ペプチドを取り除くために、透析液においてカウントされる放射能が４００〜６００ｃｐｍ／ｍｌ未満になるまで、少なくとも２時間、２０μＭのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含むＰＢＳに対して４℃で何度も透析した。形成された複合体は直ちに使用した。
【０２３６】
血漿クリアランスおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−ＬＤＬ複合体の組織分布−¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ（０．２ｎｍｏｌ）を、３７℃でＰＢＳ単独あるいは４ｎｍｏｌのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１との混合物中で培養した。２時間後、混合物を２０ｍＭのＢＨＴを含むＰＢＳに対して透析した。¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ単独またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１／¹²¹Ｉ−ＬＤＬ複合体を、メトファン麻酔下で、非絶食マウスの尾部静脈に静脈内注射した。マウスは、注射後ある時点で、ヘパリン化チューブへの後眼窩出血によって出血させた。血液を低速度遠心分離（１８００ｇ、４℃）にかけ、血漿の１０％ＴＣＡ沈殿性放射能を測定した。注射後４０分、マウスを屠殺し、血液および非特異的に結合した放射能を、冷ＰＢＳでカニューレを使い左心室へ動かした。下大静脈の切開術を行い、潅流液をきれいにした。１５分以内に、肝臓、腎臓、脾臓、および心臓を取り除き、きれいにし、重さを量り、¹²⁵Ｉ放射能をカウントした。肝臓を除き臓器全体をカウントし、肝臓は、粉にしてカウントした。臓器１個につきあるいは含水組織１ｇにつき測定した放射能は、注射した最初の総放射能に対するパーセントで示し、ＴＣＡ沈殿性を表す。
【０２３７】
血漿リポタンパク質プロフィールにおけるペプチドの単一ボーラス注入の効果−相違するリポタンパク質クラスの間の血漿コレステロール濃度におけるペプチドの効果とその分布をモニターするために、非放射性ヨード化遊離ペプチド（ＰＢＳ１００μｌ中の１００μｇ）を、非絶食Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（実験の前に高脂肪コール酸塩含有食を４日間与えた）の尾部静脈に静脈内注射した。血漿リポタンパク質プロフィールにおける外部および／または内部非特異的要因（取り扱い、麻酔、血液流出によるストレス）の効果を制御するために、マウスの類似のグループにＰＢＳだけを注射した。マウスの異なったグループを、注射の前と後の種々の時間に屠殺し、血液を後眼窩穿刺で流出させ、４℃で速遠心分離にかけ、血漿を得た。血漿サンプルを得、各グループ（４匹のマウス）内で組合せ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（ＨＲ１０／３０カラム、ＦＰＬＣ）上でゲルろ過クロマトグラフィーに供しコレステロールリポタンパク質分布をモニターし、アガロースゲル電気泳動（パラゴンシステム）でリン脂質リポタンパク質分布をモニターした。
【０２３８】
血漿リポタンパク質プロフィールにおける時間放出されるペプチドの効果−血漿リポタンパク質プロフィールにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびその誘導体の比較的長時間にわたる効果を決定するために、種々のペプチドまたはＰＢＳを含むＡｌｚｅｔ Ｍｉｎｉ浸透圧ポンプ（２２０μｌ）を、カニューレが挿入され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを与えられたマウスに、外科的に挿入した。前記ポンプを使用して、８μｌ／ｈｒと同じ流速でペプチドを２０時間連続注入した。また前記ポンプを使用して、１μｌ／ｈｒと同じ流速でペプチドを１６０時間連続注入した。終点で（ポンプの挿入から２０または１６０時間後）マウスを屠殺し、血液を後眼窩穿刺によって取り出し、４℃で低速遠心分離に供し、血漿を得た。インスリン用注射筒を使用して、胆汁を直ちに胆嚢から取り出し、使用するまで氷上で保存した。
【０２３９】
インフィニティ比色定量−酵素法（Ｓｉｇｍａ４０１−２５Ｐ）を使用して、示唆されていた３７℃の培養時間を１０分から１５分に変更した以外は、製造業者の指示に従って
、サンプル分析−総血清コレステロールおよびＨＤＬコレステロールを測定した。ＨＤＬコレステロールを測定するために、修正Ｂｕｒｓｔｅｉｎ−Ｓａｍａｉｌｌｅ法を使用して、試薬：水の比を４：１から４：２に変更した以外は、製造業者の指示（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ５４３００４）に従って、低比重リポタンパク質を血漿から析出した。胆嚢誘導胆汁を脱イオン水で２倍に希釈し、インフィニティ試薬を使用して、比色定量−酵素法（Ｓｉｇｍａ４５０）で、コレステロールを測定した。比色定量−酵素法（Ｓｉｇｍａ４５０）を使用して、３α−ヒドロキシ胆汁酸を定量した。
【０２４０】
異なるリポタンパク質クラスの間でコレステロール分布をモニターするために、血漿サンプルを各グループ（グループ毎に通常４〜６匹のマウス）内で組合せ、定組成１０ｍＭのトリスバッファ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡバッファシステムを使用して、流速０．１５ｍｌ／ｍｉｎで、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（ＨＲ１０／３０カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）におけるＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーに供した。画分（０．１５ｍｌ）を、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と２０ｍＭコール酸のナトリウム塩との１：１混合物０．０５５ｍｌを含む９６−ウェルプレートに集めた。Ｗ．Ｇａｍｂｌｅらの蛍光色素法（Ｇａｍｂｌｅら、１９７８、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｐｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、１６：１０６８−１０７０）を使用して、血漿画分中の総および遊離のコレステロールを測定した。９６−ウェルプレートを、二重走査マイクロプレート蛍光分光光度計Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で読んた。ユニコーンソフト（バージョン３．２１．０２）を使用して、リポタンパク質ピーク下の範囲を定量した。エステル化コレステロールの量は、総コレステロールから遊離コレステロールを差し引いて求めた。
【０２４１】
リポタンパク質クラスの間でリン脂質の分布をモニターするために、血漿サンプルを各グループ（グループ毎に通常４〜６匹のマウス）内で組合せ、アガロースゲル電気泳動に供した。該電気泳動は、Ｐａｒａｇｏｎシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用し、製造業者の指示に従って行い、次いでＰａｒａｇｏｎ Ｌｉｐｏ Ｓｔａｉｎ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ６５５９１０）染色を行った。一度乾燥し、ゲルはＰｅｒｓｏｎａｌ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＳＩ（分子運動学）上で走査し、バンドはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（登録商標）ソフト（バージョン５．２）を使用して定量した。
【０２４２】
ＰＬＴＰ活性におけるペプチドの効果−ＰＬＴＰ活性を、蛍光色素キットを使用して（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｐ７７００）測定した。ＰＬＴＰ源は、固形飼料を与えられまたは４日間食餌を含んだ高脂肪コール酸塩を続けたＣ５７ＢＬ／６Ｊオスの２ヶ月齢老マウスから得られた血清であった。１Ｘマウス血清を、ＲＴで３０分、ＰＢＳまたは０．４、２、５、および１０μｇのペプチドで、プレインキュベートした。プレインキュベートに次いで、混合物を１０倍に希釈し、１０μｌ（０．８nｌ巣血清）を直ちにアッセイシステム（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｐ７７００）を含む、予備冷却された９６−ウェルプレートの反応ウェルに混ぜ入れた。マイクロプレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ）中、３７℃、３０分間読ませた。
【０２４３】
ヒトＨｅｐＧ２細胞内のＬＤＬ介在コレステロール蓄積−ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ中３７℃で培養した。実験の２４時間前、細胞は、血清のない溶媒（１％ニュートリドーマ−ＨＵが補充されたＲＰＭＩ（Ｒｏｃｈｅ、９０３４５４３２１））５００μｌ中で、１ウェルにつき２．５´１０⁵密度の２４ウェルプレート中に置き、ＬＤＬ−受容体のアップレギュレーションを可能にした。実験の日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、室温で１時間ＰＢＳまたはペプチドでプレインキュベートされた、単離ヒトＬＤＬ（Ａｃａｄｅｍｙ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．、２０Ｐ−Ｌ１０１）２５μｇを５００μｌのＳＦＭ中の前記細胞に加え、３７℃で６時間培養した。培養後、溶媒
を取り除き、細胞を室温下、ＰＢＳで２回洗浄し、ヘキサン−イソプロパノール混合物（３：２）によって総コレステロールを抽出し、窒素ガス下で乾燥した。乾燥サンプルは、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と４ｍＭのコール酸ナトリウム塩とを含むＴＥバッファ（１０ｍＭのトリスバッファ−ＨＣＬ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）１６０μｌ中で可溶化した。サンプル中の総コレステロールおよび遊離コレステロールを、Ｗ．Ｇａｍｂｌｅらの蛍光色素法（Ｇａｍｂｌｅら、１９７８、Ｊｏｕｒｎａｌ ＬｉｐｉｄＲｅｓ．、１６：１０６８−１０７０）を使用して定量した。エステル化コレステロールの量は、総コレステロールから遊離コレステロールを差し引いて求めた。結果を図２４に示す。
【０２４４】
ヒトマクロファージ内のＡｃ−ＬＤＬ介在コレステロール蓄積−ＴＨＰ−１細胞を１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ中３７℃で培養した。負荷実験の４８時間前、細胞は、血清のない溶媒（１％ニュートリドーマ−ＨＵが補充されたＲＰＭＩ（Ｒｏｃｈｅ、ロット＃９０３４５４３２４））５００μｌ中、５´１０^-8ＭのＰＭＡの存在下、１ウェルにつき１´１０⁶密度の２４ウェルプレート中に置き、ＬＤＬ−受容体のアップレギュレーションを可能にした。実験の日、室温で１時間、ＰＢＳまたはペプチドでプレインキュベートしたＰＢＳまたは５０μｇのヒトアセチル化ＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．ＢＴ−９０６）を前記細胞に加えた。処理された細胞を、３７℃で２４時間、湿った５％Ｃ０₂インキュベータ内でインキュベートした。インキュベーション後、溶媒を取り除き、細胞を３７℃、ＰＢＳで２回洗浄し、ヘキサン−イソプロパノール（３：２）混合物を該細胞に加え、コレステロールを抽出した。３０分後、サンプルをガラスチューブに移し、窒素下で乾燥した。形成されたペレットを、０．ｌ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と４ｍＭのコール酸ナトリウム塩を含むＴＥバッファ（１０ｍＭのトリスバッファ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）１６０μｌ中で可溶化した。総コレステロールおよび遊離コレステロールを、Ｗ．Ｇａｍｂｌｅらの蛍光色素法（Ｇａｍｂｌｅら、１９７８、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、１６：１０６８−１０７０）を使用して定量した。エステル化コレステロールの量は、総コレステロールから遊離コレステロールを差し引いて求めた。結果を図２５に示す。
【０２４５】
ヒト血管平滑筋細胞内の酸化−ＬＤＬ介在コレステロール蓄積−血管平滑筋細胞を、５％ＦＢＳが補充されたＳｍＧｍ−２（Ｃａｍｂｒｅｘ、ｃｃ−３１８２）中３７℃で培養した。実験の２４時間前、細胞は、血清のないアッセイ溶媒（１％ニュートリドーマ−ＨＵが補充されたＳｍＧＭ−２（Ｒｏｃｈｅ、ロット＃９０３４５４３２１））５００μｌ中で、１ウェルにつき８５，０００密度の２４ウェルプレート中に置いた。実験の日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、室温で１時間ＰＢＳまたはペプチドでプレインキュベートされた、酸化ヒトＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．ＢＴ−９０６）２５μｇを５００μｌの血清のないアッセイ溶媒（ＳＦＭ）中の前記細胞に加た。処理された細胞を、３７℃で２４時間、湿った５％ＣＯ₂インキュベータ内でインキュベートした。インキュベーション後、溶媒を取り除き、細胞を３７℃、ＰＢＳで２回洗浄し、ヘキサン−イソプロパノール（３：２）混合物で、コレステロールを抽出した。サンプルを窒素下で乾燥した。乾燥サンプルを、０．ｌ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と４ｍＭのコール酸ナトリウム塩を含むＴＥバッファ（１０ｍＭのトリスバッファ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）１６０μｌ中で可溶化した。サンプル中の総コレステロールおよび遊離コレステロールを、Ｗ．Ｇａｍｂｌｅらの蛍光色素法（Ｇａｍｂｌｅら、１９７８、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、１６：１０６８−１０７０）を使用して定量した。エステル化コレステロールの量は、総コレステロールから遊離コレステロールを差し引いて求めた。結果を図２６に示す。
【０２４６】
Ａｃ−ＬＤＬがプレロードされたヒトマクロファージからのコレステロール効果−ＴＨＰ−１ 細胞を、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ中３７℃で培養した。負荷実験の４
８時間前、細胞は、血清のない溶媒（１％ニュートリドーマ−ＨＵが補充されたＲＰＭＩ（Ｒｏｃｈｅ、ロット＃９０３４５４３２１））５００μｌ中、５´１０^-8ＭのＰＭＡの存在下、１ウェルにつきｌ´１０⁶密度の２４ウェルプレート中に置いた。実験の日、ＰＢＳまたは５０μｇのヒトアセチル化ＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．ＢＴ−９０６）を、血清のない溶媒中、５´ｌ０^-8ＭのＰＭＡ存在下で前記細胞に加えた。処理された細胞を、３７℃で２４時間、湿った５％ＣＯ₂インキュベータ内でインキュベートした。インキュベーション後、溶媒を取り除き、細胞を３７℃、血清のない溶媒で２回洗浄し、ＰＢＳまたは化合物を血清のない溶媒（ＰＭＡなし）５００μｌ中の該細胞に加えた。処理された細胞を、３７℃でさらに４８時間、湿った５％ＣＯ₂インキュベータ内でインキュベートした。化合物を２４時間毎に補給した。インキュベーション後、溶媒を取り除き、細胞を３７°ＣでＰＢＳを用いて２回洗浄し、ヘキサン−イソプロパノール（３：２）混合物を該細胞に加え、コレステロールを抽出した。３０分後、サンプルをガラスチューブに移し、窒素下で乾燥した。形成されたペレットを、０．ｌ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と４ｍＭのコール酸ナトリウム塩を含むＴＥバッファ（１０ｍＭのトリスバッファ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）１６０μｌ中で可溶化した。総コレステロールおよび遊離コレステロールを、Ｗ．Ｇａｍｂｌｅらの蛍光色素法（Ｇａｍｂｌｅら、１９７８、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、１６：１０６８−１０７０）を使用して定量した。エステル化コレステロールの量は、総コレステロールから遊離コレステロールを差し引いて求めた。結果を図２７に示す。
【０２４７】
一連の化合物を設計するために、第１、第２および第３アポＡ−Ｉ構造を分析した。リポタンパク質代謝に影響する、優位の素質がある化合物としては、リポタンパク質に対し結合する能力と肝臓リポタンパク質結合部位に結合する能力とを発揮するものが好ましい。したがって、化合物全てを放射性標識し、生体内（マウス）での細胞組織分布とインビトロでのマウス血漿リポタンパク質への結合能力の検査を行った。
【０２４８】
インビトロにおけるＲＣＴのペプチドメディエータの特性−１２の化合物を放射性ヨード化し、ＬＤＬ−受容体（ＬＤＬＲ−／−）欠損マウスから得た血漿でインキュベートした。これらのマウスは、ヒトのリポタンパク質プロフィールと似たリポタンパク質プロフィールを持つ。３７℃で２時間のインキュベーション後、該混合物をアガロースゲルで分離し、放射能をＬＤＬ、ＨＤＬ、およびアルブミンを表すバンドで計量した。結果を図２にまとめる。これらの結果に基づくと、リポタンパク質に有意な関連を示す化合物は、またインビボでも特徴的であった。
【０２４９】
インビボにおけるＲＣＴのペプチドメディエータの特性−放射性標識された化合物をマウスに静脈内注射した。終点でマウスから血を抜き、大量の灌流を行い、循環（特定化していない）放射能を取り除いた。全血液と標的となりうる臓器収集し、カウントした。マウスの集めた臓器と全血液容積における総放射能を計算し、臓器に結合した放射能を、総放射能に対する比率として表した。注射後、臓器に結合した放射能の結果を図３に示す。これらのデータに基づいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１がさらなるインビボ特性を調べるために選ばれた。
【０２５０】
インビボにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のさらなる特性−図４はＳＥＱＩＤ ＮＯ：１の臓器分布を示す。この化合物は、他の臓器およびペプチドと比べ、劇的なまでに肝臓に優先的に関連したので、この化合物を研究の対象として選んだ。
【０２５１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１がヒトＬＤＬと結びつくことができるかどうか決定するため、¹²⁵Ｉ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と単離ヒトＬＤＬとの複合体の形成が試みられた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は安定な〔ＬＤＬ−^l25Ｉ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〕複合体、該複合体では約６から８コピーの〔^l25Ｉ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〕がＬＤＬ粒子１個につ
き結合していた、を形成することは明らかにされていた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１がリポタンパク質の肝臓への転送に影響するかどうか決定するため、^l25Ｉ−ＬＤＬ単独あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１をもつ複合体中の^l25Ｉ−ＬＤＬをＬＤＬＲ−／−マウス（ＬＤＬ−受容体なし）および機能的肝臓薬であるＬＤＬ−受容体を持つＡ−Ｉ−／−マウスに注射した。肝臓に関連した放射能を評価し、結果を図５に示す。両マウス遺伝子型において、注射前〔^l25Ｉ−ＬＤＬ〕とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の複合は、肝臓−結合〔^l25Ｉ−ＬＤＬ〕における有意な増加という結果になった。これらのデータは、〔^l25Ｉ−ＬＤＬ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〕複合体の増強された肝臓結合（〔^l25Ｉ−ＬＤＬ〕に比べて）（ａ）まだ知られていない肝臓リポタンパク質結合サイトおよび（ｂ）ＬＤＬ−受容体によって介在されるということを指摘している。ＬＤＬ−受容体単独の分布を評価するために、〔¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ〕と〔¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〕のＬＤＬＲ−／−マウスの肝臓への結合を、Ａ−Ｉ−／−マウスの肝臓へのそれらのそれぞれの結合から差し引き、データを含水組織１ｇあたりに正常化した。この引き算の結果を図６に示し、ＬＤＬ−受容体に結合する複合体が、〔^l25Ｉ−ＬＤＬ〕単独と比べてかなり増加していることを示す。これらのデータは、アポＡｌ−／−マウスに注射した場合、¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ単独と比べて¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１複合体の増強された血漿クリアランスとのよく一致していた（図７）。腎臓、脾臓、肺、心臓、睾丸、副腎、および前立腺への¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ結合におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果を図８に示す。心臓に対する¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１複合体の結合の増加は観察されなかったことは注目すべきである。
【０２５２】
リポタンパク質代謝（単一ボーラス注射）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果−高脂肪食餌（ＨＦＣ）を含むコール酸塩を与えられた、幾分高脂血症の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで、コレステロール代謝上におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果を試験した。マウスはコントロールと実験との２つのグループに分けた。それぞれのグループは４匹のマウスであった。実験マウスには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（１００ＬのＰＢＳ中１００ｇ）を静脈内注射し、一方コントロールグループにはＰＢＳ１００υｌを注射した。異なるグループのマウスから、注射後０分（注射なし）、３０、６０、９０、１２０、そして１８０分後に血を抜き、血漿を得、各グループ内で組み合わせ、ＦＰＬＣ分析に共した。異なるリポタンパク質クラスの間のコレステロール分布を評価し、データは、コレステロール含量（Ａｃｔ^*ｍｌ）または、それぞれＶＬＤＬピーク、ＩＤＬ／ＬＤＬピークおよびＨＤＬピーク下の範囲として表した。結果を、図９、１０および１１に示す。全時間経過を通してＶＬＤＬ濃度におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の有意な効果はなかったが、肝臓応答の動態は、ＰＢＳ コントロールに比べ著しく異なっていた（図９）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１注射の後９０、１２０、および１８０分でＩＤＬ／ＬＤＬ（プロアテローム生成およびアテローム生成リポタンパク質）の有意な低下が、観察された（図１０）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果は、１８０分まで持続し、２４０分の時点で完全に消滅した。これらのデータは、約２〜３時間という^l25Ｉ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の生体内半減期データと一致している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の単一ボーラス注射の後、わずかではあるが有意なＨＤＬ−Ｃ濃度の減少を観察し図１１）、これはＨＤＬクリアランスの増加の可能性を示唆する。単一ボーラス注射データの線形回帰分析を図１２〜１４に示す。これは、血漿濃度のプロアテロームおよびアテローム生成リポタンパク質（ＩＤＬおよびＬＤＬ）においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１効果が有意であることを示す。
【０２５３】
リポタンパク質代謝（単一ボーラス注射）における「フレームシフト」誘導ペプチドの硬化−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を（螺旋６、Ｐｒｏ１６６〜Ｐｒｏ１８８、前駆体タンパク質）から誘導する、マウスアポリポタンパク質Ａｌの全領域の機能的フレームシフトを行った。フレームシフトは両方向（Ｎ−末端からＣ−末端へ、およびＣ−末端からＮ−末端へ）で行った。１６個の（１６）ペプチドを設計し、合成し、高脂肪食餌（ＨＦＣ）を含むコール酸塩を与えられた、幾分高脂血症のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで、可能性のある
効果を試験した。マウスはコントロールと実験との２つのグループに分けた。それぞれのグループは４匹のマウスであった。実験マウスには、各ペプチド（１００μｌのＰＢＳ中１００μｇ）を静脈内注射し、一方コントロールグループにはＰＢＳ１００μｌを注射した。異なるグループのマウスから、注射後０分（注射なし）、９０、および１８０分後に血を抜き、血漿を得、各グループ内で組み合わせ、ＦＰＬＣ分析に共した。異なるリポタンパク質クラスの間のコレステロール分布を評価し、コレステロール含量（Ａｃｔ^*ｍｌ）または、それぞれＶＬＤＬピーク、ＩＤＬ／ＬＤＬピークおよびＨＤＬピーク下の範囲を定量した。データは、コントロール（ＰＢＳ注射）マウスに対する実験マウスのにおける、ＶＬＤＬ、 ＩＤＬ／ＬＤＬ、およびＨＤＬクラスの総コレステロール（ＴＣ）含量に対する変化の比率として示した。結果を表６および７に示す。表６および７から、螺旋６のＮ−末端部にあるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、他の配列に比べて、低比重リポタンパク質の血漿濃度において強い効果を持ち、一方、螺旋６のＣ−末端部にあるＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７は、マークされたＨＤＬ−Ｃ特性を上昇することが分かる。
【０２５４】
【表１１】

【０２５５】
マウス血漿リポタンパク質プロフィールにおける、化学修飾された誘導ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と他のマウスアポＡ１領域から誘導されたペプチドとの効果（単一ボーラス注射）−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の疎水性を増すために、フェニルアセチルまたはピバリック酸を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ−末端Ｔｙｒ残基に結合し、またはＴｙｒ残基をＮ−末端からはずした。これらのペプチドのコレステロール代謝における可能性のある効果を、高脂肪食餌（ＨＦＣ）を含むコール酸塩を与えられた、幾分高脂血症のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで試験した。マウスはコントロールと実験との２つのグループに分けた。それぞれのグループは４匹のマウスであった。実験マウスには、各ペプチド（１００μｌのＰＢＳ中１００μｇ）を静脈内注射し、一方コントロールグループにはＰＢＳ１００μｌを注
射した。異なるグループのマウスから、注射後０分（注射なし）、９０、および１８０分後に血を抜き、血漿を得、各グループ内で組み合わせ、ＦＰＬＣ分析に共した。異なるリポタンパク質クラスの間のコレステロール分布を評価し、コレステロール含量（Ａｃｔ^*ｍｌ）または、それぞれＶＬＤＬピーク、ＩＤＬ／ＬＤＬピークおよびＨＤＬピーク下の範囲を定量した。データは、コントロール（ＰＢＳ注射）マウスに対する実験マウスにおける、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ／ＬＤＬ、およびＨＤＬクラスの総コレステロール（ＴＣ）含量に対する変化の比率として示した。結果を表８に示す。表から上記した修飾化合物は全てＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の有効性を増加していなかったことが分かる。マウスアポリポタンパク質Ａｌの他の領域にある少数のペプチドもこの方法で試験し、特筆すべき活性も何も示さなかった（表８）。
【０２５６】
【表１２】

【０２５７】
リポタンパク質代謝におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果（２０時間ポンプ）−血漿リポタンパク質プロフィールにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の比較的長時間の効果を測定するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＰＢＳを含むＡｌｚｅｔ Ｍｉｎｉ浸透圧ポンプ（２２０μｌ）を、カニューレが挿入され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを与えられたマウスに、外科的に挿入した。ポンプ流速は８μｌ／ｈｒと同じで、これは、図９に示すような１時間あたりのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１量を送り出した。術後マウスを直ちにＨＦＣ食餌に切り替えた。２０時間後、血漿サンプルを得、各グループ（４〜６匹のマウス）内で組み合わせ、ＦＰＬＣ分析に供し、アガロースゲル電気泳動で、リポタンパク質クラスの間のコレステロールとリン脂質の分布を評価した。結果を図１５に示す。結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を受け取ったことを示す、マウスの血漿中の低比重リポタンパク質濃度の劇的な減少を明示し、一方これらのマウスの血漿ＨＤＬコレステロール濃度は上昇した。ＬＤＬ低下の効果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １ 濃度の上昇で弱められた。この減少は、肝臓リポタンパク質結合部位の遊離ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＬＤＬ−結合型のＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１の間の自己競争によって説明することができる。それにひきかえ、ＨＤＬコレステロール濃度は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１濃度に対し正の相互関連があった。血漿ＨＤＬ−Ｃにおける増加は、ＬＣＡＴ（レシチン：コレステロールアシル移行酵素）の活性の可能性を、またはアポＡ−Ｉの産生を増やすことを示唆する。一方、ＨＤＬ リン
脂質の血漿濃度の上昇（データ示さず）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１活性のメカニズムにおけるＰＬＴＰ（リン脂質移行タンパク質）の関与を示唆する。したがって、得られたデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の多機能性を示唆し、これがＨＤＬ経路およびＬＤＬ経路の両方にかかわっていることを示唆する。
【０２５８】
リポタンパク質代謝におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１構造誘導体の効果（３〜１３個のアミノ酸残基）（２０時間ポンプ）−血漿リポタンパク質プロフィールにおける比較的長時間の効果を測定するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＰＢＳを含むＡｌｚｅｔ Ｍｉｎｉ浸透圧ポンプを、カニューレが挿入され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを与えられたマウスに、外科的に挿入した。ポンプ流速は８μｌ／ｈｒと同じで、１時間あたり３０〜４０μｇのペプチドを肝臓に供給した。術後マウスを直ちにＨＦＣ食餌に切り替えた。２０時間後、血漿サンプルを得、各グループ（４〜６匹のマウス）内で組み合わせ、ＦＰＬＣ分析に供し、アガロースゲル電気泳動で、リポタンパク質クラスの間のコレステロールとリン脂質の分布を評価した。ＨＤＬ−Ｃのデータを図１６に示す。該データは、ペプチド処置されたマウスにおいて、低比重リポタンパク質の血漿濃度の有意な減少を明示している。一方、これらのマウス中の血漿ＨＤＬコレステロール濃度は上昇した。しかしながら、ほとんどのペプチド（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５および８７など）は反対の効果、すなわち、低比重リポタンパク質の血漿レベの上昇と、高比重リポタンパク質コレステロールおよびリン脂質の減少を起こした。この逆転効果は、ＳＡＲ目的にとっては、これらの「クリアランス結合する」ペプチドと「クリアランス増強する」ペプチドとの構造関係の点に照らして、貴重な情報である。血漿ＨＤＬ−Ｃの穏やかな増加は、ＬＣＡＴ（レシチン：コレステロールアシル移行酵素）の活性の可能性またはアポＡ−Ｉの産生の増加を示唆し得る。一方、ＨＤＬリン脂質の血漿濃度の上昇は、ペプチド活性のメカニズムにおいて、ＰＬＴＰ（リン脂質移行タンパク質）の関与を示唆する。したがって、得られたデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１誘導体が、ＨＤＬ経路およびＬＤＬ経路の両方にかかわっていることを示唆する。
【０２５９】
リポタンパク質代謝における、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４（「テンプレート」、３個のアミノ酸残基を持つペプチド）およびその修飾誘導体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８および９１）の長期効果（７日間ポンプ）−血漿リポタンパク質プロフィールにおけるこれらペプチドの長期効果を測定するため、ペプチドまたはＰＢＳを含むＡｌｚｅｔ Ｍｉｎｉ浸透圧ポンプを、カニューレが挿入され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを与えられたマウスに、外科的に挿入した。ポンプ流速は１μｌ／ｈｒと同じで、各ペプチドを１時間あたり図１７に示す量、肝臓に供給した。術後マウスを直ちにＨＦＣ食餌に切り替えた。１６０時間後、マウスを屠殺し、血漿サンプルを得、各グループ（４〜６匹のマウス）内で組み合わせ、ＦＰＬＣ分析に供し、アガロースゲル電気泳動で、リポタンパク質クラスの間のコレステロールとリン脂質の分布を評価した。胆汁を直ちに胆嚢から取り出し、総コレステロール／胆汁酸含量を記載した方法で測定した。データを図１７に示す。図は、ペプチド処置されたマウスにおける、低比重リポタンパク質の血漿濃度の有意な減少と、血漿ＨＤＬコレステロール（およびＨＤＬリン脂質−データ示さず）の上昇と、胆嚢総コレステロールと胆汁酸量の劇的な増加を示唆する。血漿ＨＤＬ−Ｃの穏やかな増加は、ＬＣＡＴ（レシチン：コレステロールアシル移行酵素）の活性の可能性またはアポＡ−Ｉの産生の増加を明示し、一方、ＨＤＬリン脂質の血漿濃度の上昇は、ペプチド活性のメカニズムにおいて、ＰＬＴＰ（リン脂質移行タンパク質）の関与を明示している。これは、血漿ＨＤＬ濃度の維持と新生ＨＤＬ粒子（第１コレステロール受容体）の発生とに関与するものとして知られている。図１７から、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、８６および９１のマウスへの投与は、ＨＤＬゾーンでのリン脂質の量の増加となり、これは通常、総コレステロールおよび胆嚢から回収される胆汁酸の増加を伴うことが理解し得る。血漿低比重リポタンパク質濃度（ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ）の減少とＨＤＬ濃度の増加に伴い、コレステロール／胆嚢における胆汁酸の量が増加することは、増強された「血漿＞肝臓＞胆嚢」コレステロールの流
れ、すなわち、図１７に示す、ペプチドの存在下、本発明の好ましい態様に従ったコレステロール逆輸送を示唆する。
【０２６０】
活性におけるペプチドの効果−ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３４、８６、９１および９６でマウス血漿を培養すると、ＰＬＴＰが活性化されることが図１８から理解できる。固形飼料を与えられたマウスおよび食餌を含む高脂肪コール酸塩を４日間与えられたマウスから得られたマウス血漿（酵素源）を、室温で３０分ＰＢＳまたはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３４、８６、９１および９６（０．４、２、５、および１０μｇ）のペプチドを使用して培養した。反応は、０．３μｌの血漿／ＰＢＳまたは血漿／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ混合物を、蛍光色素基質を含むアッセイ溶液を１００μｌに添加して始めた。ＰＬＴＰ活性は、３７℃２０分蛍光分光光度計上でモニターした。各バーが、３回の独立した実験から得られた平均ＳＥＭを表す。これらのデータは、マウス血漿ＨＤＬ濃度におけるこれらのペプチドの長期効果の研究の結果とよく一致しており（たとえば、図１７に示す７日間ポンプで得られた結果）、ペプチド活性の生体内メカニズムにおけるＰＬＴＰ 関与を支持する強い証拠を提供する。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３５および３６に対応するペプチドは、ＰＬＴＰ活性において有意な効果は持っていなかった。これら２つのペプチドは、また、マウスへの２０時間注入においても有意な活性を示さなかったことは注目すべきことである（図１６参照）。
【０２６１】
マウス血漿リポタンパク質プロフィールと胆汁中の胆汁酸／コレステロールにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９１（ＡＶＰ−２６２４９）の急性経口投与の効果−図１９に関連して、２．５および２０μｇを示すバーは、２回の独立した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ供給ＨＦＤ実験の平均±ＳＥＭを表し、５および１０μｇを示すバーは、３回の独立したＣ５７ＢＬ／６Ｊ供給ＨＦＤ実験の平均±ＳＥＭを表す。エラーバー単一実験はなし。効果は、ＰＢＳコントロール（０％）に対する変化の％として表す。
【０２６２】
血漿ＴＣ（総コレステロール）における、固形飼料供給アポ酵素−／−マウスへのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１（ＡＶＰ−２６２４９）のアドリブ経口投与の影響−図２０を参照し、２ヶ月老アポ酵素−／−オスのマウスに固形飼料食餌を与えた。実験の日、ＴＯ（時間０）でマウスから血を抜き（５０μｌ）、血漿ＴＣを測定し、マウスをＴＯグループの平均コレステロール値と似た値を持つグループに分けた（１グループ毎４匹のマウス）。コントロールマウスは飲料水を飲み、実験マウスは化合物の水溶液を飲んだ。マウスから７２〜９６時間毎に血を抜き、血漿コレステロールを定量した。各バーは、４匹の平均±ＳＥＭを表し、２週間毎に行われた１５回の測定の代表である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１の量は２４時間あたりに消費されたｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）として表す。
【０２６３】
高脂肪食餌を与えられたアポ酵素−／−マウス中の血漿コレステロール濃度における、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、１４５、１４６および１１８（それぞれＡＶＰ−２６２４９、２６４５１、２６４５２および２６３５５）の効果−図２１を参照して、３ヶ月老アポ酵素−／−オスのマウスに固形飼料食餌を与えた。０日、マウスから血を抜き、血漿ＴＣを測定し、マウスを平均コレステロール値と体重値が似た値を持つグループに分けた（１グループ毎４匹のマウス）。コントロールマウスは飲料水を飲み、実験マウスは化合物の水溶液を飲んだ。４週間後、マウスを高脂肪食餌に切り替えた。マウスから１０日に１回血を抜き、総血漿コレステロールを定量した。各バーは、４匹の平均±ＳＥＭを表し、７回の測定の代表である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの量は２４時間あたりに消費されたｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）として表す。
【０２６４】
高脂肪食餌を与えられたアポ酵素−／−マウスによって分泌されるコレステロール量における、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、１４５、１４６および１１８（それぞれ、ＡＶＰ−２６２４９、２６４５１、２６４５２および２６３５５）の効果−図２２を参照して、５
ヶ月老アポ酵素−／−オスのマウスの８つのグループ（各グループ毎に４匹のマウス）に固形飼料食餌を与えた。コントロールマウスは飲料水を飲み、一方、実験マウスは化合物の水溶液を「アドリブで」飲んだ。マウスを代謝ケージ中に一晩置いた。翌日、排出物を集め、７２時間乾燥し、重さを計り、総コレステロールを抽出し、定量した。各バーは、マウスに高脂肪食餌が与えられた後２．４週間および３．４週間行われた、２つの独立した「代謝ケージ」実験の平均±ＳＥＭを表す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの量は２４時間あたりに消費されたｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）として表す。
【０２６５】
最後に、図２〜２２および表６〜８にまとめられた結果は本発明の分子モデルに従って設計されたＲＣＴのペプチドメディエータを投与された高脂血症マウスは、静脈経路を経ても経口送達経路を経ても、血漿リポタンパク質プロフィールにかなりの改善を発揮し、それは、低密度（アテローム性）リポタンパク質の増強されたクリアランスと抗動脈硬化性高比重リポタンパク質の血漿濃度の上昇によるということを明示している。
【０２６６】
図２３を参照して、説明図は、スクリーニング法で試験化合物を同定するために使用された、生体内増強ＲＣＴで起こりそうなインビトロトライアングルを示す。培養マクロファージ細胞は、ａｃ−ＬＤＬコレステロール蓄積およびプリロードされたマクロファージ細胞からのコレステロール流出（泡沫細胞形成と冠状動脈性プラーク形成との原因となるコレステロールを蓄積するマクロファージ）の両方において、テストＲＣＴメディエータ化合物の効果を評価するために使用される。したがって、該トライアングルのこの区画は、ＲＣＴさらにアテロームの病因において、試験化合物の効果を評価するために使用される。培養された第１平滑筋細胞は、血管壁へのｏｘ−ＬＤＬ蓄積（また、泡沫細胞の形成とアテロームの進行に関係し得る）においてテストＲＣＴメディエータ化合物の効果を評価するために使用される。培養肝細胞は、肝臓によるコレステロール取り込みにおいて、テストＲＣＴメディエータ化合物の効果を評価するするために使用される。体皮細胞（肝細胞と組合せてマクロファージおよび／または平滑筋細胞）を使用することによって、ＲＣＴ−低減コレステロール蓄積と体皮細胞からの増強ｄコレステロール流出、さらに肝臓（代謝および排出のための）による取り込みのモニターを有利に提供する。
【０２６７】
ＨｅｐＧ２細胞中の総コレステロールのＬＤＬ介在蓄積における、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１および１４６（それぞれＡＶＰ−２６２４９およびＡＶＰ−２６４５２）の効果。図２４を参照して、ヒトＨｅｐＧ２細胞を、血清のない（リポタンパク質のない）アッセイ溶媒中、１ウェルあたり２．５´１０⁵の密度で２４ウェルプレート中に置いた。４８時間後、室温で１時間、ＰＢＳまたは化合物を使用してプレインキュベートしたヒトＬＤＬｄ２５μｇを、血清のない溶媒５００μｌ中の細胞に加えた。処理された細胞を、３７℃で２４時間、湿った５％ＣＯ₂インキュベータ内でインキュベートした。各バーは、２〜３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。
【０２６８】
総コレステロールおよびマクロファージ中のコレステリルエステルのＡｃ−ＬＤＬ介在蓄積におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１（ＡＶＰ−２６２４９）の効果。図２５を参照して、ヒトＴＨＰ−１細胞を、５×１０^-8ＭのＰＭＡの存在下、アッセイ溶媒中、１ウェルあたり１´１０⁶の密度で２４ウェルプレート中に置いた。４８時間後、室温で１時間、ＰＢＳ（コントロール）またはＡＶＰ−２６２４９を使用してプレインキュベートしたヒトＡｃＬＤＬ５０μｇを、アッセイ溶媒５００μｌ中の細胞に加えた。処理された細胞を、３７℃で２４時間、湿った５％ＣＯ₂インキュベータ内でインキュベートした。各バーは、３〜９回の反復試験の平均±ＳＥＭを表す。
【０２６９】
総コレステロールおよび血管平滑筋細胞中のコレステリルエステルのＯｘ−ＬＤＬ介在蓄積における、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：９１および１４６（それぞれ、ＡＶＰ−２６２４９および２６４５２）の効果。図２６を参照して、ヒト血管平滑筋細胞を血清のないアッ
セイ溶媒中、１ウェルあたり９ｘ１０⁴の密度で２４ウェルプレート中に置いた。２４時間後、室温で１時間、ＰＢＳまたは化合物を使用して、プレインキュベートしたＰＢＳ単独またはヒト酸化ＬＤＬを、アッセイ溶媒５００μｌ中の細胞に加えた。処理された細胞を、３７℃で２４時間、湿った５％ＣＯ₂インキュベータ内で培養した。各バーは、４〜７回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。
【０２７０】
ＡｃＬＤＬ−負荷マクロファージからのコレステロール流出におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１および１４６（それぞれ、ＡＶＰ−２６２４９およびＡＶＰ−２６４５２）の効果。図２７を参照して、ヒトＴＨＰ−１細胞を、５´１０^-8ＭのＰＭＡの存在下、アッセイ溶媒中、１ウェルあたり１ｘ１０⁶の密度で２４ウェルプレート中に置いた。４８時間後、５０μｇのヒトアセチル化ＬＤＬまたはＰＢＳをＰＭＡを含むアッセイ溶媒５００μｌ中の細胞に加えた。２４時間後、細胞を洗浄し、ＰＢＳまたは化合物を５００μｌのアッセイ溶媒中の細胞に加えた。各処置の前後で細胞を、３７℃で２４時間、湿った５％Ｃ０₂インキュベータ内でインキュベートした。各バーは、５〜６回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。
【０２７１】
１つの目的は、コレステロールクリアランスのために、コレステロールをマクロファージおよび大動脈細胞から肝臓へ動かすことである（図３０参照）。表３〜５に示す化合物のような試験化合物のひとつのＲＣＴに効果を及ぼす能力は、前記図２４〜２７に示すように行われるアッセイに基づいて、予測でき得る。すなわち、これら３種の細胞タイプが、生物内のコレステロールの状態のスナップショットを提供する。与えられた化合物の、（ＨｅｐＧ２細胞）のような肝細胞におけるコレステロール濃度を増大させながら、ＴＨＰ−１細胞や血管平滑筋細胞のようなマクロファージ細胞中のコレステロールやＣＥの濃度を減少させる能力は、生体内における有効性を予測する。したがって、本発明の１つの実施形態として、テスト化合物を、前記したマクロファージ、平滑筋および肝細胞ラインを使用してインビトロでアッセイし、生体内ＲＣＴの兆候を提供するスクリーニング方法を含む。
【０２７２】
アポ酵素−／−高脂肪食餌を与えられたマウスの大動脈内のアテローム性動脈硬化部進行におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１（ＡＶＰ−２６２４９）の効果。図２８を参照して、アポ酵素−／−オスのマウスに、固形飼料食餌を４週間続け、ＨＦＤ（１．２５％のコレステロール）上で９．３週間保った。マウスにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１（ＡＶＰ−２６２４９）を「アドリブ」で、飲料水から１３．３週間与えた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１の濃度は０（左のパネル）、１．４μｇ／ｋｇ（真ん中のパネル）および２．８μｇ／ｋｇ（右側のパネル）である。安楽死で動物にＰＢＳを灌流し、続いてホルマリン−ショ糖（ＰＢＳ中４％パラホルマリンアルデヒドおよび５％ショ糖、ｐＨ７．４）を灌流した。全マウス大動脈を、最も近い上行大動脈から回腸動脈の枝分かれ部へ解剖顕微鏡を使用して、解剖した。外膜脂肪を取り除き、動脈を縦方向に開き、黒の解剖ワックス上にピンで平らに止め、ＳｕｄａｎＩＶで着色し、所定の倍率で写真を撮った。写真はデジタル化し、デジタル映像を示す。総大動脈範囲と大動脈病巣範囲をＡｄｏｐｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ７．０とＮＩＨ Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトを使用して計算した（データは示さず）。
【０２７３】
アポ酵素−／−高脂肪食餌を与えられたマウスの大動脈内のアテローム性動脈硬化部進行におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６（ＡＶＰ−２６４５２）の効果図２９を参照して、アポ酵素−／−オスのマウスに、固形飼料食餌を４週間続け、ＨＦＤ（１．２５％のコレステロール）上で９．３週間保った。マウスにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６ （ＡＶＰ−２６４５２）を「アドリブ」で、飲料水から１３．３週間与えた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６の濃度は、０（左側のパネル）、１．４μｇ（真ん中のパネル）および２．８μｇ／ｋｇ（左側のパネル）である。
［引用文献]

【０２７４】

【０２７５】

【０２７６】

【０２７７】

【図面の簡単な説明】
【０２７８】
【図１】固相ペプチド合成の概略図を示す。
【図２】本発明のアミノ酸誘導組成物のリポタンパク質およびアルブミンとの関連を説明する。放射性標識化合物は、ＬＤＬＲ−／−マウス血漿でＲＴ中２時間培養した。培養の後、混合物をアガロースゲル電気泳動に供した。ＬＤＬ、ＨＤＬおよびアルブミンを表すバンド中放射能で計量した。リポタンパク質およびアルブミンと結合した放射能の当てられた放射能に対する比率で表す。
【図３】アポＡｌ−／−オスのマウスにおいて、本発明のアミノ酸誘導組成物が肝臓に結合することを示す。アポＡｌ−／−オスのマウスに放射性標識化合物を１２μｇ／マウス注射した。３６分、肝臓を採取し、放射能定量し、含水組織１ｇ毎に調整した。肝臓に結合した放射能を合計ｃｐｍに対する％で表す。それぞれの棒グラフは４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。
【図４】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の組織分布と肝臓による優先的な取り込みを示す。アポＡｌ−／−オスのマウスに放射性標識ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を１２μｇ注射した。３６分後、組織を採取した。放射能定量し、含水組織１ｇ毎に調整した。それぞれの棒グラフは４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。
【図５】ヒト１２５１−ＬＤＬのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１への複合体化が肝臓への結合を改善したことを示す。肝臓へのＬＤＬ転送は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によって増強される。¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ単体またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と^l25Ｉ−ＬＤＬとの複合体を、指示する如く、欠損遺伝子型のオスのマウスに注射した。３６分後、肝臓を収集し、放射能定量した。肝臓に結合した放射能を注射した放射能に対する％として表す。それぞれの棒グラフは４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。
【図６】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−ＬＤＬ複合体が肝臓上のＬＤＬ受容体に結合することを示す。¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ単独またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と^l25Ｉ−ＬＤＬとの複合体のＬＤＬＲ−／−マウス肝臓への結合は、Ａ−Ｉ−／−マウスの肝臓へのそれぞれの結合からサブトラクションされた。サブトラクションの結果は、ＬＤＬ−受容体への複合体の結合の劇的な増加を示す。それぞれの棒グラフは４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。
【図７】アポＡ−Ｉ−欠損マウスの血液からのヒトＬＤＬの浄化におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果を示す。¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ単独またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と^l25Ｉ−ＬＤＬとの複合体をアポＡｌ−／−マウスに注射した。表示時点ごとに、血漿を得、１０％ＴＣＡ沈殿性放射能を測定した。１００％は注射後１０分で測定した血中の放射能に等しい。それぞれの値は４匹の動物の平均±１ＳＥＭを表す
【図８】アポＡ−Ｉ欠損およびＬＤＬ受容体欠損マウス中のＬＤＬ組織分布におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果を示す。放射能（％）＝（組織結合放射能／血液放射能）×１００％。検出された全放射能の約９０％（３６分時点で）が血液放射能である。
【図９】血漿ＶＬＤＬコレステロール濃度におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果を示す。マウスは２つのグループ（１グループについてそれぞれ４匹のマウス）に分けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＰＢＳを、実験またはコントロールマウスにそれぞれ静脈内注射した。表示時点ごとに血漿を得、それぞれのグループ内で組合せ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムに適用した。カーブ上のそれぞれの時点は、３個のクロマトグラフプロファイル以上から得られた平均±ＳＥＭを示す。
【図１０】血漿ＩＤＬ／ＬＤＬコレステロール濃度におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果を示す。マウスは２つのグループ（１グループにそれぞれ４匹のマウス）に分けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＰＢＳを、実験またはコントロールマウスにそれぞれ静脈内注射した。表示時点ごとに血漿を得、それぞれのグループ内で組合せ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムに適用した。カーブ上のそれぞれの時点は、３個以上のクロマトグラフプロファイルから得られた平均±ＳＥＭを示す。
【図１１】血漿ＨＤＬ濃度におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果を示す。マウスは２つのグループ（１グループにそれぞれ４匹のマウス）に分けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＰＢＳを、実験またはコントロールマウスにそれぞれ静脈内注射した。表示時点ごとに血漿を得、それぞれのグループ内で組合せ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムに適用した。カーブ上のそれぞれの時点は、３個のクロマトグラフプロファイル以上から得られた平均±ＳＥＭを示す。
【図１２】血漿ＶＬＤＬコレステロール濃度におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果の線形回帰分析を示す。
【図１３】血漿ＩＤＬ／ＬＤＬコレステロール濃度におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果の線形回帰分析を示す。
【図１４】血漿ＨＤＬ濃度におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果の線形回帰分析を示す。
【図１５】血漿リポタンパク質プロフィールにおける、徐々に放出されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の効果を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＰＢＳを含むポンプを、カニューレが挿入された固形飼料を与えられたマウスに外科的に挿入した。ポンプの流速は８ｕｌ／ｈｒ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を１時間に図に示す量与えた。動物に、術後直ちにＨＦＣ食をセットした。２０時間後、血漿を得、それぞれのグループ（４〜６匹のマウス）内で組合せ、ＦＰＬＣおよびアガロースゲル電気泳動に供し、異なるリポタンパク質クラスの間で、コレステロールおよびリン脂質分布をモニターした（明確にするために、リン脂質データは示さず）。効果は、ＰＢＳコントロールに対する変化の％として示す。
【図１６】血漿リポタンパク質プロフィールにおける、本発明の種々のアミノ酸誘導組成物の長時間（２０時間）にわたる導入による効果を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＰＢＳを含むポンプを、カニューレが挿入された固形飼料を与えられたマウスに外科的に挿入した。ポンプの流速は８ｕｌ／ｈｒ、１時間に３０〜４０ｕｇのペプチドを与えた。動物に、術後直ちにＨＦＣ食をセットした。２０時間後、血漿を得、それぞれのグループ（４〜６匹のマウス）内で組合せ、ＦＰＬＣおよびアガロースゲル電気泳動に供し、異なるリポタンパク質クラスの間で、コレステロールおよびリン脂質分布をモニターした。効果は、ＰＢＳコントロールに対する変化の％として示す。
【図１７】血漿リポタンパク質プロフィールにおける、本発明の種々のアミノ酸誘導組成物の長時間（１６０時間）にわたる導入による効果を示す。動物に術後直ちにＨＦＣ食をセットした。１６０時間後、血漿を得、それぞれのグループ（４〜６匹のマウス）内で組合せ、ＦＰＬＣおよびアガロースゲル電気泳動に供し、異なるリポタンパク質クラスの間で、コレステロールおよびリン脂質分布をモニターした（明確にするために、リン脂質データは示さず）。効果は、ＰＢＳコントロールに対する変化の％として示す。
【図１８】ＰＬＴＰ酵素活性における、本発明の種々のペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、８６、９１、９６、３５および３６）の効果を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、８６、９１および９６はＰＬＴＰを活性化した結果を示した。
【図１９】血漿リポタンパク質プロフィールと胆汁酸中のコレステロールの排出における、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１の経口投与急性効果を示す。
【図２０】固形飼料を与えられたアポ酵素−／−マウスの血漿リポタンパク質プロフィールにおける、ＡＶＰ−２６２４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）のアドリブ（飲料水を通じて）投与の効果を示す。
【図２１】高脂肪食が与えられたアポ酵素−／−マウスの血漿リポタンパク質プロフィールにおける、ＡＶＰ−２６２４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）、ＡＶＰ−２６４５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）、ＡＶＰ−２６４５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）およびＡＶＰ−２６３５５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）のアドリブ（飲料水を通じて）投与の効果を示す。
【図２２】高脂肪食が与えられたアポ酵素−／−マウスによって排出されたコレステロールの量における、ＡＶＰ−２６２４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）、ＡＶＰ−２６４５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）、ＡＶＰ−２６４５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）およびＡＶＰ−２６３５５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）のアドリブ（飲料水を通じて）投与の効果を示す。
【図２３】生体内でＲＣＴを増強し得る試験化合物のインビトロ細胞培養トライアングルスクリーニング方法を示す概略図である。
【図２４】ＨｅｐＧ２細胞内のコレステロールのＬＤＬ−介在蓄積における、ＡＶＰ−２６２４９（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：９１）およびＡＶＰ−２６４５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）の効果を示す。
【図２５】ヒトマクロファージ中のコレステロール（ＴＣ）およびコレステリルエステル（ＣＥ）のＡｃ−ＬＤＬ−介在蓄積における、ＡＶＰ−２６２４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）の効果を示す。
【図２６】ヒト血管平滑筋細胞中のコレステロール（ＴＣ）およびコレステリルエステル（ＣＥ）の酸化−ＬＤＬ（Ｏｘ−ＬＤＬ）介在蓄積におけるＡＶＰ−２６２４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）およびＡＶＰ−２６４５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）の効果を示す。
【図２７】あらかじめＡｃ−ＬＤＬ負荷ヒトマクロファージからのコレステロール流出における、ＡＶＰ−２６２４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）およびＡＶＰ−２６４５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）の効果を示す。
【図２８】アポ酵素−／−マウスの大動脈中のアテローム性動脈硬化部の発生おける、ＡＶＰ−２６２４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）の効果を示す。アポ酵素−／−オスのマウスは、固形飼料を４週間およびＨＦＤ（１．２５％のコレステロール）を９．３週間与え続けた。マウスは、飲料水を通じて０、１．４および２．８ｍｐｋの濃度のＡＶＰ−２６２４９を「アドリブに」１３．３週間受けた。実験の最後に、大動脈を分離し、アテローム性動脈硬化部の進行を評価した。
【図２９】アポ酵素−／−マウスの大動脈中のアテローム性動脈硬化部の発生における、ＡＶＰ−２６４５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）の効果を示す。アポ酵素−／−オスのマウスは、固形飼料を４週間およびＨＦＤ（１．２５％のコレステロール）を９．３週間与え続けた。マウスは、飲料水を通じて０、１．４および２．８ｍｐｋの濃度のＡＶＰ−２６４５２を「アドリブに」１３．３週間受けた。実験の最後に、大動脈を分離し、アテローム性動脈硬化部の進行を評価した。
【図３０】コレステロール転送および代謝における経路を示す概略図である。略語は、たとえば、ＣＥはコレステロールエステル、ＰＬＴＰはリン脂質転送タンパク質、ＴＧはトリグリセリド、ＬＤＬは低比重リポタンパク質、ＨＤＬは高比重リポタンパク質、ＩＤＬは中間比重リポタンパク質、ＬＣＡＴはレシチンコレステロールアシル移行酵素である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性領域と、親油性または芳香性領域と、塩基性領域とを含む分子を含み、前記分子はＨＤＬおよび／または低比重リポタンパク質−コレステロール（ＬＤＬ）と複合するように構成された構造を持ち、それによってコレステロール逆輸送を増強するコレステロール逆輸送のメディエータ。
【請求項２】
前記分子が３〜１０個のアミノ酸残基またはその類似体を有し、かつ配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３〔式中、Ｘ１は酸性アミノ酸であり、Ｘ２は親油性または芳香族アミノ酸であり、Ｘ３は塩基性アミノ酸であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は任意の配列順序で配列されていてもよく、アミノ末端はさらに、アセチル、フェニルアセチル、ピボリル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２−ナフトエ酸、ニコチン酸、ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−（式中、ｎは３〜２０の範囲である）、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリールおよび置換飽和ヘテロアリールからなる群から選択される第１保護基を含み、カルボキシ末端はさらに、ＲＮＨ₂（式中ＲはＨ、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリール、置換飽和ヘテロアリール）のようなアミンからなる群から選択される第２保護基を含む〕を含む、請求項１に記載のコレステロール逆輸送のメディエータ。
【請求項３】
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の１つ以上がＤ−アミノ酸残基である、請求項２に記載のコレステロール逆輸送のメディエータ。
【請求項４】
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の１つ以上が修飾された合成または半合成アミノ酸である、請求項２に記載のコレステロール逆輸送のメディエータ。
【請求項５】
該修飾された合成または半合成アミノ酸がビフェニルアラニンである、請求項４に記載のコレステロール逆輸送のメディエータ。
【請求項６】
哺乳動物における高コレステロール血症および／またはアテロームの治療および／または予防のための実質的に純粋なアミノ酸誘導物質であって、前記物質が、アミノおよびカルボキシ末端を持ち、酸性アミノ酸残基またはその誘導体のＬまたはＤ光学異性体と、親油性または芳香族アミノ酸残基またはその誘導体と、塩基性アミノ酸残基またはその誘導体のＬまたはＤ光学異性体と、を含み、該アミノ末端は、さらに、アセチル、フェニルアセチル、ピボリル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２−ナフトエ酸、ニコチン酸、ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−（式中、ｎは３〜２０の範囲である）、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリールおよび置換飽和ヘテロアリールなどからなる群から選択される第１保護基を含み、該カルボキシ末端は、さらに、ＲＮＨ₂（式中、ＲはＨ、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ｆ−ＭＯＣ、ビフェニル、置換フェニル、置換複素環類、アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、縮合シクロアルキル、飽和ヘテロアリール、および置換飽和ヘテロアリールなどである）のようなアミンからなる群から選択される第２保護基を含み、前記物質は、少なくとも１つの下記特性を有する、アミノ酸誘導物質：
（１）ＬＤＬおよびＨＤＬに結合するアポＡ−Ｉを模倣する、
（２）肝臓に優先的に結合する、
（３）肝臓ＬＤＬ−受容体によってＬＤＬ取り込みを増強する、
（４）ＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＶＬＤＬコレステロールの濃度を低下させる、
（５）ＨＤＬコレステロールの濃度を上昇させる、および
（６）血漿リポタンパク質プロフィールを増強する。
【請求項７】
高コレステロール血症の症状を回復または予防する経口投与に好適な組成物であって、前記組成物は、酸性領域と、親油性または芳香性領域と、塩基性領域とをもつアミノ酸誘導分子を含み、前記アミノ酸誘導分子は、アミノ末端に結合する第１保護基とカルボキシル末端に結合する第２保護基とを有し、前記アミノ酸誘導分子は任意に少なくとも１つのＤアミノ酸残基を含む、組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのＤアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
配列 ： Ｘａ−Ｘｂ− （Ｘｌ−Ｘ２−Ｘ３）−Ｘｃ−Ｘｄ、（式中、Ｘａは、アシル化アミノ酸残基であり、Ｘｂは、０〜１０個の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３は、独立して、酸性アミノ酸残基、親油性アミノ酸残基、および塩基性アミノ酸残基またはその誘導体から選択されるアミノ酸残基またはその誘導体、ただし、前記Ｘｌ、Ｘ２またはＸ３の１つは酸性残基、記Ｘ１、 Ｘ２またはＸ３の１つは親油性残基、およびＸ１、Ｘ２またはＸ３の１つは塩基性残基であり、Ｘｃは、０〜１０個の任意のアミノ酸残基、Ｘｄはアミド化アミノ酸残基である）を含み、１５個以上のアミノ酸残基および任意で少なくとも１個のＤアミノ酸残基を含む、ＲＣＴのペプチドメディエータ。
【請求項１０】
表５の合成化合物１〜９６からなる群から選択される化合物を含む、ＲＣＴメディエータ。
【請求項１１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および１０７〜１１７からなる群から選択される化合物を含む、ＲＣＴメディエータ。
【請求項１２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２６〜３６、４２、４５−４７、５６〜５８、６８−７０、７２〜７４、７６、８０、８１、８３〜９０および９２〜９５からなる群から選択される化合物を含む、ＲＣＴメディエータ。
【請求項１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
２０． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
高コレステロール血症および／またはアテロームの治療のための投与に好適な薬品の製
造の用途のための前述の請求項のいずれか１項に記載の記載の組成物。
【請求項２３】
前記薬品が経口投与に好適である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記薬品が、胆汁酸結合樹脂、ナイアシン、スタチンまたはこれらの混合物と組み合わされる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
インビボでコレステロール逆輸送を増強し得る試験化合物を同定するインビトロスクリーニング方法であって、インビトロで、試験化合物の存在下および非存在下、肝細胞内のコレステロール蓄積を測定し、インビトロで、試験化合物の存在下および非存在下、ＡｃＬＤＬ負荷マクロファージ中のコレステロール蓄積および／または流出を測定し、肝細胞中のコレステロール蓄積を増強し、マクロファージ中のコレステロール濃度を低減する試験化合物を同定することを含む、インビトロスクリーニング方法。
【請求項２６】
さらに、インビトロで、試験化合物の存在下および非存在下、ＯｘＬＤＬ負荷血管平滑筋細胞中のコレステロール濃度を測定することを含み、前記試験化合物を同定するステップは、さらに、肝細胞中のコレステロール蓄積を増強し、マクロファージ中のコレステロール濃度を低減および／または欠陥平滑筋細胞中のコレステロール濃度を低減する試験化合物を測定することを含む、請求項２５に記載のインビトロスクリーニング方法。
【請求項２７】
前記肝細胞がヒトＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞である、請求項２５に記載のインビトロスクリーニング方法。
【請求項２８】
前記マクロファージがヒトＴＨＰ−１細胞である、請求項２５に記載のインビトロスクリーニング方法。
【請求項２９】
前記血管平滑筋細胞が主要大動脈平滑筋細胞である、請求項２６に記載のインビトロスクリーニング方法。
【請求項３０】
インビボで、コレステロール逆輸送を増強し得る試験化合物を同定する、インビトロスクリーニング方法であって、
インビトロで、試験化合物の試験化合物の存在下および非存在下、肝細胞中のコレステロール蓄積を測定し、
インビトロで、試験化合物の試験化合物の存在下および非存在下、ＡｃＬＤＬ負荷血管平滑筋細胞中のコレステロール濃度を測定し、肝細胞中のコレステロール蓄積を増強し、血管平滑筋細胞中のコレステロール濃度を低減する試験化合物を同定すること、を含む、インビトロスクリーニング方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【公表番号】特表２００７−５３４６１２（Ｐ２００７−５３４６１２Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１３２２４（Ｐ２００６−５１３２２４）
【出願日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１２４４５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４４７１
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５００５３９０３３）アバニール・ファーマシューティカルズ (15)
【Ｆターム（参考）】