２種類の流体間の薄い固相界面上における撮像方法
本明細書においては、光学顕微鏡検査ツール用の流体セルについて記載する。この顕微鏡検査ツールは、 第１側と、第２の対向する側とを有する固相メンブレンと、メンブレンの第１側に配置された第１流体チェンバであって、第１屈折率を有する第１流体を収容する、第１流体チェンバと、メンブレンの第２側に配置された第２流体チェンバであって、第２屈折率を有する第２流体を収容する第２流体チェンバとを有し、第１屈折率が第１屈折率とは異なる。また、本明細書には、１つ１つの生体分子を撮像する方法についても記載する。この方法は、異なる屈折率を有する第１流体と第２流体との間にある固相メンブレンにおいて、消衰照明の場を発生するステップと、固相メンブレンにおいて、１つ１つの生体分子に結合されている光検出器によって放出される光を検出するステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互引用
[0001] 本願は、２００９年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／２１１，２６０号に対して、法によって与えられるいずれの権利をも、そして全ての権利を主張する。
政府援助
[0002] 本発明は、米国国立衛生研究所によって裁定された契約第ＨＧ−００４１２８号の下で、政府支援によって行われた。
発明の分野
[0003] 本発明は、光学顕微鏡の分野に関する。特に、本発明は、生体分子の撮像改良のために、２種類の流体間にある薄い固相界面を利用する。
【背景技術】
【０００２】
[0004] 最初の参照人ゲノム配列の完成は、ゲノム異変が直接薬剤の発見や医学的治療に影響を及ぼす時代の幕開けを印した。この新たな枠組みのために、費用がかからず非常に高速なＤＮＡ配列決定方法が早急に必要となった。近い将来、開業医は、薬剤を処方する前に、臨床設備(clinical setting)において個々の患者のＤＮＡを日常的に分析し、あらゆる薬剤に関するゲノム情報が文書化されているオンライン・データベースとそれらを照合することが可能になるであろう。加えて、手の届く範囲の配列決定技術が、比較ゲノム学および分子生物学における研究の様相を一変させ、科学者が細胞異体(cell variants)からゲノム全体の配列を素早く決定できるようになるであろう。超高速でしかも安価なＤＮＡ配列決定を実現するためには、サンガーのジディオキシ・プロトコルに基づく古典的な方法に取って代わる新たな技術が必要とされる。これらの新たな技術は、２つの主要な障害に取り組まなければならない。（１）サンプル・サイズを最小にまで縮小し、１つのＤＮＡ細胞または少数のコピーからの配列読み出しを可能にしなければならない。（２）読み出し速度は、現在の技術的現状と比較して、数桁上昇させなければならない。
【０００３】
[0005] 窒化シリコン、酸化シリコン、およびその他のような固相面が、再生医学、埋め込み可能なデバイス、および基本的な研究コンテキストを含む、種々の生化学用途において用いられている。薄い固相面は、例えば、生物検知(biosensing)およびＤＮＡ配列決定の用途において用いられるナノスリットやナノポア(nanopore)アレイのような、異なるミクロおよびナノ構造デバイスのコンテキストにおいて用いられている。窒化シリコン・メンブレンは、最近になって、生体分子検出およびＤＮＡ配列決定というような用途に合った固相ナノポアを作成するのに適した基板となることが示された。ＤＮＡ転座の単一分子光学検出を必要とし、固相ナノポアを介して解決する固相デバイスが、生物検知およびゲノム配列決定にはきわめて重大であると考えられている。これらのデバイスによる光信号の単一分子生体内測定には、顕微鏡検査の消衰モード(evanescent mode)を用いることが有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0006] 生物医学研究および医療用デバイスの分野においては、対象の材料を通した撮像によって分子、細胞、および組織を研究できることが望ましい。このような撮像技法の１つに、全内部反射蛍光顕微鏡検査（ＴＩＲＦＭまたはＴＩＲＦ）がある。しかしながら、これらのコンテキストにおいて用いられてきた固相材料は、ＴＩＲＦのような技術的現状の顕微鏡検査方法とは適合性がない。既存の技法では、これらの固相材料面を、ガラス・カバースリップのような、他の表面の消衰場(evanescent field)内に持ち込むことが難しく、更に、窒化シリコン・メンブレンおよび生体サンプルをＴＩＲＦ消衰場領域(regime)に持ち込むのは、とても厄介である。更に、粒子の固有密度（クリーン・ルーム環境においても）のために、これらの窒化シリコン・チップの処理最中に発生する粒子、およびこれらの窒化シリコン・メンブレン・チップの温度制約という制限のために、これらのナノポアを窒化シリコン面で密閉するのは、難しい作業となる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0007] 本発明の実施形態は、固相メンブレン（ナノポア・デバイスまたは他の生体サンプルを保持する）を挟む２つの媒体間における屈折率整合ＴＩＲＦＭ (全内部反射蛍光顕微鏡検査）によって、これらの固相メンブレンにおいて消衰モード励起を達成する。これによって、メンブレン上における１つ以上の生体分子の高分解能、高コントラスト、および高感度画像の取り込みが可能となる。
【０００６】
[0008] 本発明の一態様によれば、光学顕微鏡検査ツール用流体セルが開示される。この流体セルは、第１側と、第２の対向する側とを有する固相メンブレンと、メンブレンの第１側に配置された第１流体チェンバであって、第１屈折率を有する第１流体を収容する、第１流体チェンバと、メンブレンの第２側に配置された第２流体チェンバであって、第２屈折率を有する第２流体を収容する第２流体チェンバとを含み、第１屈折率が第２屈折率よりも高い。
【０００７】
[0009] 固相メンブレンは、窒化シリコン、酸化シリコン、酸化アルミニウム、酸化チタン、またはその他の誘電体材料とするとよい。
【０００８】
[0010] 固相メンブレンは、シリコン・ウェハ上に堆積された窒化シリコン層を含むことができる。窒化シリコン層の厚さは、５〜６０ｎｍとするとよい。シリコン・ウェハは、ウィンドウを含むことができ、窒化シリコン層がウィンドウを覆うか、またはこのウィンドウを横切って広がる。
【０００９】
[0011] 第１流体は、水性緩衝溶液または水とすることができる。第２流体は、細胞流体(cellular fluid)、細胞メンブレン、またはグリセロールとすることができる。第１流体は、第１流体は、濃縮尿素溶液またはＣｓＣｌとしてもよい。
【００１０】
[0012] 光学的バイオマーカに結合された生体分子が、メンブレンの第２側に供給することができる。この生体分子は、ＤＮＡ分子とすることができる。この生体分子は、タンパク質分子であってもよい。光学的バイオマーカは、励起可能な蛍光体とすることができる。
【００１１】
[0013] 第１流体チェンバは、マイクロチャネルとすることができる。
【００１２】
[0014] 固相メンブレンは、少なくとも１つのナノポアをを含むことができ、実施形態によっては、複数のナノポアを含んでもよい。複数のナノポアは、円形または多角形アレイに配列することができる。
【００１３】
[0015] 本発明の他の態様によれば、１つ１つのＤＮＡ分子を撮像するための光学顕微鏡検査ツールが開示される。この光学顕微鏡検査ツールは、シリコン・ウェハのウィンドウを覆う固相メンブレンと、固相メンブレンの一方側にある第１流体チェンバと、第１流体チェンバの中にあり第１屈折率を有する第１流体と、メンブレンの他方側にある第２流体チェンバと、第２流体チェンバの中にあり、第１屈折率よりも低い第２屈折率を有する第２流体とを備えている流体セルと、ガラス・カバースリップであって、このガラス・カバースリップが第１流体チェンバの底面を形成するように、流体セルが実装されている、カバースリップと、対物レンズと、対物レンズとガラス・カバースリップとの間にある浸入油と、対物レンズにおいて光を誘導するように構成されている光源であって、固相メンブレンが覆うウィンドウよりも小さい消衰照明の場を発生するように、対物レンズが光を合焦するように構成されている、光源と、固相メンブレンにおいて１つ１つのＤＮＡ分子によって放出される光を検出する撮像検出器とを含む。
【００１４】
[0016] 光源は、少なくとも１つの励起レーザを含むことができ、実施形態によっては、異なる波長のレーザ・ビームを生成する複数のレーザを含むことができ、撮像検出器は、電子倍増電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ、または光検出器を含むことができる。
【００１５】
[0017] １つ１つのＤＮＡ分子を固相メンブレン上に不動化するために、ビオチン−ストレプトアビジン化学薬品を用いることができる。
【００１６】
[0018] 本発明の更に他の態様によれば、１つ１つの生体分子を撮像するための光学顕微鏡検査ツールが開示される。この光学顕微鏡検査ツールは、異なる屈折率を有する第１流体と第２流体との間にある固相メンブレンにおいて消衰照明の場を発生する手段と、固相メンブレンにおいて１つ１つの生体分子に結合されている光検出器によって放出される光を検出する手段とを含む。
【００１７】
[0019] 固相メンブレンにおいて消衰照明の場を発生する手段は、励起レーザと対物レンズとを含むことができる。光学的マーカによって放出された光を検出する手段は、光検出器、または電子倍増ＣＣＤカメラを含むことができる。
【００１８】
[0020] また、光学顕微鏡検査ツールは、更に、１つ１つの生体分子を固相メンブレン上に不動化する手段を含むこともできる。
【００１９】
[0021] 消衰照明の場は、固相メンブレンの寸法よりも小さくするとよい。
【００２０】
[0022] 本発明の更に他の態様によれば、単体の生体分子を撮像する方法が開示される。この方法は、異なる屈折率を有する第１流体と第２流体との間にある固相メンブレンにおいて、消衰照明の場を発生するステップと、固相メンブレンにおいて、１つ１つの生体分子に結合されている光検出器によって放出される光を検出するステップとを含む。
【００２１】
[0023] また、この方法は、１つ１つの生体分子を固相メンブレン上に不動化するステップも含む。
【００２２】
[0024] 検出された光から、画像を発生する。
【００２３】
[0025] 本発明の更にまた他の態様によれば、単体ＤＮＡ分子を撮像する方法が開示される。この方法は、光学顕微鏡検査ツールの対物レンズに光を誘導するステップと、第１流体を通過するように光を誘導するステップと、第２流体において消衰照明の場を発生するために、窒化シリコン・メンブレンにおいて光を反射させるステップと、消衰照明の場によって励起され単体ＤＮＡ分子に結合されている光学的バイオマーカによって放出される光を、撮像検出器に誘導するステップとを含む。
【００２４】
[0026] 消衰照明の場は、第２流体内において発生することができる。単体ＤＮＡ分子は、第２流体内において、窒化シリコン・メンブレン上に不動化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態による流体セル(fluid cell)の模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態による流体セルの界面の斜視図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態による、界面におけるＴＩＲを示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態による光学顕微鏡測定ツールの模式図である。
【図５】図５は、本発明の一実施形態にしたがってＴＩＲＦ下で撮像された１つのＤＮＡ分子の蛍光画像である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態によるＤＮＡ配列決定手法を示す模式図である。
【図７】図７は、本発明の一実施形態にしたがって、１ビット（ａ）および２ビット（ｂ）読み出し値を用いた、同時電気光学検出を示す模式図である。
【図８】図８は、本発明の一実施形態による多色光学顕微鏡検査ツールの設定の模式図である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態によるポア局限カウンタ・ヒストグラムである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、本発明の一実施形態による、多数のポアからの同時読み出しを含むマルチポア検出における追加ステップの図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、本発明の一実施形態による、多数のビットからの同時読み出しを含むマルチポア検出における追加ステップの図である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態による流体セルの模式図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、本発明の一実施形態による図１１の流体セルの詳細な模式図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、本発明の一実施形態による図１１の界面の詳細な模式図である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態にしたがってＴＩＲＦの下で撮像した１つのＤＮＡ分子の蛍光画像である。
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態による分析ハードウェアのブロック図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本発明の一実施形態による電気信号および光信号の同期を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本発明の一実施形態による電気信号および光信号の同期を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、本発明の一実施形態による電気信号および光信号の同期を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、本発明の一実施形態による、ナノポアを通したＤＮＡ分子のスレッディング(threading)を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本発明の一実施形態による、ナノポアを通したＤＮＡ分子のスレッディング(threading)を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、図１５Ａのスレッディング・イベント中における電気信号および光信号の同期を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１５Ｂのスレッディング・イベント中における電気信号および光信号の同期を示す。
【図１７】図１７は、本発明の一実施形態による、界面におけるＴＩＲを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
[0046] 本発明の実施形態は、厚さがナノメートル単位の固相メンブレンを介した１つ１つの分子および生体材料双方の撮像方法に関する。この方法が優位であるのは、１つ１つの分子および生体材料の、従来からの電気的測定に加えて、光学的（例えば、蛍光）測定を可能にするからである。一実施形態では、２種類の混和性／非混和性流体間における薄い固相界面を介して、消衰モードで、１つの分子または生体材料を撮像する。流体セルが、屈折率が異なる２つの混和性流体間に、固相界面を形成する。この固相界面は、厚さが数ナノメートルから数十ナノメートル程度とすることができ、そして窒化シリコン、参加シリコン、および／またはその他で作ることができる。
【００２７】
[0047] 固相界面におけるナノポアまたはナノポア・アレイを介した生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）の転座のために、２つの流体に電位を印加することができる。ＤＮＡ転座では、単一撚り合わせ(single-stranded)ＤＮＡ分子が、一列状にナノポアを通り抜けるように電気泳動的に駆動される。この実施形態では、ターゲットＤＮＡ配列の各塩基(base)は、生化学変換によって、最初に２または４ユニット・コード、２ １０−２０ｂｐヌクレオチド配列上にマッピングされる。これら２−ユニットまたは４−ユニット・コードは、次に、交雑されて、相補的な、蛍光標識が付いた(fluorescently labeled)、そして自己消滅型分子ビーコン(self-quenching molecular beacon)となる。ナノポアを介した転座の間に分子ビーコンが順次解決されるに連れて、これらの蛍光タグが消されなくなり、単一色、または多色（例えば、２つ以上の色）全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡によって読み取られる。結果的に得られた単色光信号または多色光信号は、次に、ターゲットＤＮＡ配列に相関付けられる。
【００２８】
[0048] 本発明の実施形態に優位性があるのは、固相界面上で不動にさせられ、「厚い」水性流体層（即ち、屈折率が大きい流体）上に位置付けられた１つ１つの生体分子または生体材料の、高分解能および高感度画像の取り込みを可能にするからである。更に具体的には、この「厚い」流体層内深くに消衰場を実現することによって、薄い固相界面における分子または生体材料の高コントラスト光学検出を、１つ１つの生体分子または生体材料を撮像するために用いることができる。
【００２９】
[0049] 図１は、本発明の一実施形態による流体セルを示す。図１に示すように、流体セル１００は、第１チェンバ１０４と第２チェンバ１０８とを含む。第１流体１１２が第１チェンバ１０４の中にあり、第２流体１１６が第２チェンバ１０８の中にある。２種類の流体１１２、１１６は、これらが異なる屈折率を有するように選択される。第１流体１１２は、第２流体１１６よりも屈折率が高くなるように選択される。２種類の流体１１２、１１６の屈折率は、界面１２０において全内部反射（ＴＩＲ）を生ずるように選択されている。例えば、第１流体１１２は細胞質（ｎ＝１．３６）またはセル・メンブレン（ｎ＝１．４７）とするとよく、第２流体１１６は、水性緩衝液（ｎ＝１．３３）とするとよい。他の例では、第１流体１１２は塩を含有する。流体１１２、１１６の双方は、水溶液である。
【００３０】
[0050] また、流体セル１００は、界面１２０も含む。界面１２０は、固相メンブレン１２４を含む。界面１２０は、第１チェンバ１０４と第２チェンバ１０８との間に、２種類の流体１１２、１１６を分離するように配置されている。２種類の流体１１２、１１６間の界面１２０は、全内部反射（ＴＩＲ）が発生するのを可能にする。即ち、ＴＩＲ照明が固相メンブレン（例えば、ＳｉＮメンブレン）１２４において発生し、第１チェンバ１０４において消衰波を生成する。界面１２０、特にメンブレン１２４は、生体分子相互作用のための基板を形成する。
【００３１】
[0051] 図２は、界面１２０の詳細な図である。図２に示すように、界面２２０は、ウィンドウ２２４を有するチップ２２８を含む。チップ２２８は、ウィンドウ２２４を覆う固相メンブレンを支持する枠として作用する。このチップの寸法の一例では、５ｍｍ×５ｍｍ×３００μｍとすることができ、メンブレンの寸法の一例では、５０μｍ×５０μｍ×５〜５０ｎｍとすることができる。界面２２０は、化学蒸着（ＣＶＤ）、ウェット・エッチング、およびフォトリソグラフィを含む従来の技法を用いて、適合性のある固相材料（例えば、シリコン系材料）であればいずれでも形成することができる。
【００３２】
[0052] 一実施形態では、チップ２２８はシリコンであり、窒化シリコン・メンブレンで覆われている。尚、このメンブレンは、薄膜に形成することができる誘電体材料であればいずれでもよいことは認められよう。他のメンブレン材料の例には、酸化シリコン、酸化アルミニウム、酸化チタン等が含まれる。他のチップ材料の例には、ガラス、溶融シリカ、クオーツ等が含まれる。
【００３３】
[0053] 本明細書において記載する固相メンブレンは、約５〜６０ｎｍの厚さとすることができる。例えば、固相メンブレンは約１０ｎｍとするとよい。しかしながら、メンブレンの厚さは、２種類の混和性液体間においてＴＩＲ照明から生成される消衰波の所望のサイズおよび減衰を得るために選択することができ、５ｎｍよりも薄くするかまたは６０ｎｍよりも厚くしてもよいことは認められよう。メンブレンの厚さをナノメートル単位にすると、ＴＩＲが発生する、２種類の液体間の界面に、鋭い境界を定めるのに資する。
【００３４】
[0054] 尚、実施形態によっては、固相メンブレンがナノポア、ナノスリット、またはナノポア・アレイを含んでもよいことは認められよう。これらのナノポア（１〜１００ｎｍ）またはナノポア・アレイは、界面を横切る流体を接続する。固相ナノポアは、調節可能な寸法を有し、広範囲の温度、ｐＨ、および化学的異変に耐えることができる。ナノポア（１つまたは複数）は、例えば、Ａｒイオン・ビームまたは電子ビーム彫刻を用いて、あるいは反応性イオン・エッチングによって製作することができる。
【００３５】
[0055] 図３は、光学顕微鏡検査ツールを用いたＴＩＲに基づく測定のために、通常の顕微鏡ガラス・カバースリップ２４０上に実装された流体セル１００を示す。カバースリップ２４０は、対物レンズ２３６上に実装されており、カバースリップ２４０と対物レンズ２３６との間には、浸入油２３８が供給される。１つ以上の生体分子または生体材料が、蛍光体のような光学的バイオマーカに連結され、撮像のためにメンブレン２２４上で不動化されている。
【００３６】
[0056] 光学的バイオマーカは、消衰波への露出に応答して放射線を照明または放出する材料であればいずれでも可能である。光学的バイオマーカの例には、蛍光プロパン(fluorescent propane)または蛍光共振エネルギ転移（ＦＲＥＴ：fluorescence resonance energy transfer）タグ（例えば、蛍光体）、量子ドット(quantum dot)、および有機化合物が含まれる。当業者であれば認められるであろうが、光学的バイオマーカには、周知の技法によって、例えば、共有結合のまたは非共有結合の連携(association)によって、対象の生体分子と関連付けることができる。本発明の一実施形態では、光学的マーカを化学的に共役させることができる。本発明の代替実施形態では、再結合融合(recombinant fusion)、例えば、細胞受容体または信号分子によって、生体分子を光学的マーカと関連付けることができる。
【００３７】
[0057] レーザ光２４２は、対物レンズ２３６の背後焦点面において合焦されている。浸入油２３８およびガラス・カバースリップ２４０の屈折率一致のために、光は屈折して媒体１ ２１６に入る。メンブレン２２４において、光は、２種類の液体２１２、２１６の屈折率が一致していないために、全内部反射する（２４６）。光は、屈折率が高い方（密度が濃い）の媒体から屈折率が低い方（密度が薄い）の媒体に通過するときに、屈折して表面に対する法線から離れて行く。２種類の媒体の界面における入射角が臨界角よりも大きい場合、光は全内部反射して、密度が濃い方の媒体に入る。消衰波２４６が、密度の薄い方の媒体において発生する。この消衰波は、指数的に減衰する強度を有し、メンブレン２２４の表面において蛍光体を励起させることができる（通例、励起光の「浸透」厚さは数十ｎｍ程度である）。励起された蛍光体２５０によって生成された光は、ガラス・カバースリップ２４０の下に位置付けられている対物レンズ２３６によって合焦することができ、撮像デバイス、例えば、ＣＣＤカメラまたは光検出器によって測定することができる。
【００３８】
[0058] 一実施形態では、消衰波２４６の面積がメンブレン２２４の面積よりも小さくなるように、光を発生する。他の実施形態では、消衰波２４６の面積がメンブレン２２４の面積と同じサイズとなるように、光を発生する。
【００３９】
[0059] 尚、実施形態によっては、種々の刺激薬を用いて、生きた細胞の表面を局所的に刺激するために、メンブレン内においてナノポア、ナノスリット、またはナノポア・アレイを用いることができることは認められよう。これらの刺激に対する応答は、本明細書において記載する消衰モード撮像を用いて、細胞メンブレン上の遠端において測定することができる。
【００４０】
[0060] 生体分子または生体材料（例えば、細胞）は、メンブレン２２４の上に直接位置付けて撮像することができる。あるいは、薄い緩衝層または中間層を、メンブレン２２４と撮像しようとする生体分子または生体材料との間に設けてもよい。例えば、有機ポリマー分子の薄膜を中間層として用いることもできる。
【００４１】
[0061] 図４は、本発明の実施形態による光学顕微鏡検査ツールの一例４００を示す。尚、顕微鏡検査ツール４００のコンポーネントおよびこれらコンポーネントの配置は、図４に示すものとは異なっていてもよいことは認められよう。顕微鏡検査ツール４００は、レーザ源４０２、ｘ−軸平行移動ステージ４０６、レンズ４１４、レンズ４１８、白色光源４２２、偏光ビーム・スプリッタ（ＰＢＳ）４２６、レンズ４３０、対物レンズ４３６、ダイクロイック・ミラー（ＤＭ）４６８、フィルタ４７２、ミラー４７６、レンズ４８０、およびＣＣＤのような検出器４８４を含む。第１流体４１２、第１流体４１２とは異なる屈折率を有する第２流体４１６、および固相メンブレン４２４を含む流体セルが、ガラス・カバースリップ４４０上に位置付けられている。浸入油が、ガラス・カバースリップ４４０と対物レンズ４３６との間に供給される。
【００４２】
[0062] 図示した顕微鏡検査ツール４００では、レーザ光または白色光を用いて、全内部反射蛍光顕微鏡検査を行うことができる。一実施形態では、レーザ光４１０がレーザ源４０２によって発生され、レンズ４１４、４１８によって誘導され整形される。レンズ４３０は、レーザ・ビームのサイズを縮小するように構成されている。尚、レンズ４１４、４１８がレーザ・ビームのサイズを縮小してもよいことは認められよう。ｘ−軸平行移動ステージ４０６を用いてｘ−軸に沿ってレーザ・ファイバ・カプラを移動させることによって、光をずらして光軸から外れるようにしてもよい。他の実施形態では、白色光源４２２によって白色光を発生する。更に他の実施形態では、白色光およびレーザ光双方を用いて、全内部反射蛍光顕微鏡検査を行うこともできる。ビーム・スプリッタ４２６は、レーザおよび／または白色光源４２２によって発生した光を、第１流体４１２の中にあるサンプル（例えば、生物分子（１つまたは複数）に向けて誘導するように構成されている。更に他の実施形態では、多数のレーザ波長を同時に、または一度に１つずつ用いて、単色または多色蛍光体を励起させることができる。
【００４３】
[0063] レンズ４３０およびダイクロイック・ミラー４６８を通過した後、発生した光は、全内部反射が生ずるのに十分な光がサンプルに誘導されるように、対物レンズ４３６によって絞られる。尚、対物レンズ４３６は、更に、レーザ・ビームのサイズも縮小できることは認められよう。レーザ・ビームのサイズは、直径が約０．５ｍｍ〜１ｍｍであるとよいことは認められよう。レンズ４１４、４１８、４３０、および／または４３６は、このビームがシリコン・メンブレンにおいて、直径が約５μｍからメンブレン４２４のほぼ面積までのスポット・サイズ(sot size)を形成するように、ビームを収束する。例えば、メンブレン４２４が５０×５０μｍ２である場合、５〜５０μｍのスポット・サイズを形成することができる。
【００４４】
[0064] 光４４２は、固相メンブレン４２４において、ガラス・カバースリップ４４０に向かって全内部反射し、第２流体４１６内に消衰場が発生する。固相メンブレン４２４の近傍に配置された蛍光体が、消衰波によって励起され、これによって蛍光体に蛍光光線(fluorescent light)を放出させる。この蛍光光線および反射光４５２は、次いで、ダイクロイック・ミラー４６８によってフィルタ４７２に向けて誘導させられる。ダイクロイック・ミラー４６８およびフィルタ４７２は、蛍光光線放出のみを通過させるように、光を濾波する。ミラー４７６は、蛍光光線を誘導して、レンズ４８０を通過させ、検出器４８４に向かわせる。
【００４５】
[0065] 検出器４８４は、北アイルランド、ベルファストに本社があるAndor Technology plc.(Andor)から入手可能なiXon BV887のような、ＥＭＣＣＤカメラとすることができる。他の検出器４８４の例には、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）および光倍増管（ＰＭＴ）が含まれる。検出器４８４は、Microsoft Windows系パーソナル・コンピュータ、およびSolisソフトウェア（これもAndorから入手可能）のような撮像ソフトウェアといった、しかるべき撮像システムに接続して、検出器４８４が発生したデータ信号を処理して、画像または一連の画像を生成することができる。データ信号を分析し、蛍光放出を検出し、試験対象の生体分子または生体材料の配列あるいは他の特性を判定するために、カスタム・ソフトウェアを用いることができる。
【００４６】
[0066] 尚、界面におけるＴＩＲ励起のエリアは、励起ビーム特性に依存することは認められよう。レーザ・ビームは、周知のレーザ・ビーム整形技法を用いて整形し、ＴＩＲモードにおけるレーザ照明の場を制御することができる。つまり、ビームのサイズは、所望に応じて、その直径を延長または縮小したり、細長くすることができる。
【００４７】
[0067] 図５は、顕微鏡検査ツール４００のような顕微鏡検査ツールを用いて発生した画像の例を示す。図５では、サンプル例のＴＩＲＦ照明５０４の視野が示されている。また、図５は、２種類の代表的流体、具体的には、７Ｍ ＣｓＣｌ（ｎ＝１．４１６）および８Ｍ Ｕｒｅａ（ｎ＝１．４１６）によって、顕微鏡検査ツールを用いて撮像された単体蛍光ＤＮＡ分子５０８も示す。しかしながら、本発明の実施形態にしたがって１つ１つの生体分子を撮像するためには、他の流体を用いてもよいことは認められよう。図５では、単体ＤＮＡ分子は、窒化シリコン・メンブレン上において、毎秒５フレームの画像取り込みで、２．５までの信号対バックグラウンド比(signal to background ratio)を用いて撮像された。
【００４８】
[0068] 図６から図１０Ｂは、メンブレン１２４がナノポア６００を含む本発明の一実施形態を示す。図６に示すように、ナノポア６００を有するメンブレン１２４を含む実施形態は、特に、ＤＮＡ転座を用いるＤＮＡ配列決定に適用可能である。尚、メンブレン１２４がナノポア６１０を含む実施形態は、ＤＮＡ転座を用いるＤＮＡ配列決定に限定されるのではないことは認められよう。例えば、本実施形態は、遺伝子型決定(genotyping)、生体分子撮像、および生体分子選別にも適用可能であると考えられる。他の例では、ナノポア６００を介して、タンパク質を撮像することもできる。
【００４９】
[0069] ＤＮＡ転座では、単一螺旋ＤＮＡ分子が、電気泳動的に駆動され、一列になってナノポア６００を通過する。尚、これらの実施形態では、流体セル１００が、更に、ＤＮＡ分子を電気泳動的に駆動してナノポア６００を通過させるために、流体１１２、１１６に印加される電位を発生するように構成されているエネルギ源に結合されている電極も含むことは認められよう。
【００５０】
[0070] 図６において、光学的マーカに結合(link)された検出対象の１つの生体分子は、オリゴヌクレオチドであり、交雑して(hybridize)ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、またはＧを表す配列コードになる。一実施形態では、特定的にＤＮＡ配列について報告する光学的マーカは蛍光マーカである。標識化手順の一例では、元のＤＮＡが１群のヌクレオチド（各塩基型が３〜１６ヌクレオチドの一意の配列と入れ替えられる）と入れ替えられる。次いで、光学的マーカに結合されたオリゴヌクレオチドは、ナノポア配列決定の間に配列を決定されるコード化核酸配列(coded nucleic acid sequence)からの交雑オリゴヌクレオチドの解決(unzipping)時に検出することができる。
【００５１】
[0071] 例えば、ＤＮＡ変換手順の１つでは、元のＤＮＡ配列における各塩基は、２つの二進コード・ユニット（０および１が、それぞれ、白丸(open circle)および黒丸(solid circle)で表される）。この場合、０および１は、各々が「Ｓ０」および「Ｓ１」である１０個のヌクレオチドの一意のＤＮＡ配列として定義される。単一螺旋変換ＤＮＡは、２つのコード・ユニットに対して相補的な２タイプの分子ビーコンと交雑され、最小の断面を表示する。例えば、これらのビーコンの１つは、その５’末端に赤色蛍光体、そしてその３’末端に消光剤(quencher)Ｑを含有することができ、他方のビーコンは、その５’末端に緑色蛍光体、そしてその３’末端に同じ消光分子を含有することができる。広域スペクトル消光分子Ｑは、双方の蛍光体を消光する。２つの異なる色の蛍光体が、２つのビーコン間で区別することを可能にする。他のＤＮＡ変換手順では、元のＤＮＡ配列における各塩基は、４つの一意のコード（配列）の内１つによって表され、次いでこれら４つの一意のコードは、対応する４色分子ビーコンと交雑させられる。双方の手順において、変換されたＤＮＡ配列は、ビーコンが互いに隣接する配置を含むので、隣接するビーコン上にある消光剤は、蛍光放出を消光し、個々のコード・ユニットがＤＮＡから順次除去されるまで（最初のビーコンを除く）、ＤＮＡは「暗い」ままになっている。本発明と共に用いることができる蛍光体の例には、ＴＭＲおよびＣｙ５が含まれる。用いることができる他のタイプの蛍光分子には、ＣＰＭ、Invitrogenからの一連の蛍光マーカ、ローダミン族、およびTexas Redがある。当業者には周知の他の信号分子も、本発明の範囲に該当するものとする。本発明では、米国特許第６，５２８，２５８号においてリストに纏められているものを含む、多数の他の蛍光体も用いることができ、この特許をここで引用したことにより、その内容全体が本願にも含まれるものとする。本発明と共に用いることができる消光分子には、Dabcyl、Dabsyl、メチル・レッド、およびElle Quencherが含まれる。当業者には知られている他の消光分子も本発明の範囲内に該当することとする。これは、隣接する分子および溶液内の自由ビーコンからの蛍光バックグラウンドを大きく減らし、その結果信号対バックグラウンド比が高くなる。
【００５２】
[0072] 再度図６を参照すると、蛍光タグ付きオリゴヌクレオチドは、変換されたＤＮＡに対して相補的であり、交雑されて(hybridize)ＤＮＡとなり、その分子は電気泳動的にメンブレン１２４内のナノポア６００を介して供給される。ナノポア６００は、添加されている蛍光体から発生する異なる色の光の閃光が検出されている間に、変換されたＤＮＡ分子から、オリゴヌクレオチドを１つずつ順次剥離させる。分子がナノポアに導入されると、ビーコンが１つずつ引きはがされる。新たなビーコンが除去される毎に、新たな蛍光体が発生する(unquench)。放出されたビーコンは自動的に閉ざされ、それ自体の蛍光を消光し、そのときに拡散してナノポアの近傍から離れる。最初のビーコンの放出時に直ちに、２番目のビーコンからの新たな蛍光体が発光する。
【００５３】
[0073] ＤＮＡ転座速度は、ＤＮＡ解決動力学によって規制され、塩基間のコントラストは、光学プローブ（またはビーコン）の使用によって得られる。ＤＮＡをナノポア６００に入れると、イオン電流が急激に遮断レベルまで低下する。ＤＮＡが他方の側から出ると、開放ポアの電流レベルが復元される。ＤＮＡ解決時間（例えば、１〜１０ｍｓ）を調節するには、しかるべき電圧を用いることができる。例えば、１０−ｂｐヘアピンでは、１２０ｍＶ電位により、約１０ｍｓの解決時間(unzipping time)が得られる。この時間は、電界強度によって、信号対バックグラウンド・レベルを最適化するように調整される。
【００５４】
[0074] このようにして、いずれの核酸の配列でも判定することができる。配列を決定すべき核酸のコード化配列への変換、コード化システム、およびナノポア配列決定の詳細な説明は、Soni and Meller (Soni G.V. and Meller A., Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores（固相ナノポアを用いた超高速ＤＮＡ配列決定に向けての進歩）、clinical Chemistry 53, 11(2007)、Meller et al., 2009（米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号）、およびMeller and Weng（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ ＵＳ２００９／０３４２９６号）において見いだすことができる。これらの参考文献をここで引用したことにより、その全体が本願にも含まれるものとする。尚、この方法はナノポア・アレイによって並列に用いることができることは認められよう。
【００５５】
[0075] 図７は、（ａ）において１ビット、そして（ｂ）において「２ビット」を用いてコード化したナノポア配列決定を示す。図７に示すように、本明細書において記載するデバイスおよび方法によって、１および２ビットＤＮＡ読み出しの同時電気および光学的検出を、高い信号／ノイズ比で、そして１回の蛍光体解明(resolution)で行うことが可能になることが示されている。
【００５６】
[0076] ２ビット・カラー・コード化は、図８に示す多色ＴＩＲＦ顕微鏡のような、多色光学顕微鏡検査ツールを用いて行うことができる。図８に示す実施形態では、波長が異なる２つのレーザ源８０２ａ、８０２ｂを個別にまたは同時に照明させて、異なる光学的バイオマーカの個別または同時励起のために、波長が異なる２つの消衰波を生成することができる。同様に、３色以上のコード・システムでは、波長が異なる３つまたは４つのレーザ源を個別にまたは同時に照明させて、異なる光学的バイオマーカの個別または同時励起のために、波長が異なる３つ以上の消衰波を生成することができる。
【００５７】
[0077] 図８に示すように、第１レーザ源８０２ａは第１レーザ・ビーム８１０ａを発生し、第２レーザ源８０２ｂは第２レーザ・ビーム８１０ｂを発生する。これらのレーザ・ビーム８１０ａ、８１０ｂは、レンズＬによって整形され対物レンズ８３６に誘導される。レンズＬは、レーザ源８０２ａ、８０２ｂによって発生したレーザ・ビーム８１０ａ、８１０ｂのサイズを縮小するように構成されている。一実施形態では、レーザ源８０２ａ、８０２ｂは、青色および赤色ダイオード・レーザ（４８８ｎｍおよび６４０ｎｍ）の組み合わせであり、サンプルを照明するために用いることができる。図４を参照して先に説明したように、光８０２ａ、８０２ｂは、メンブレン１２４において全内部反射し、消衰場が発生して、流体セルにおいて撮像しようとする生体分子に結合されている蛍光体を励起する。図８に示す実施形態では、メンブレン１２４は、先に説明したようなＤＮＡ転座を可能にするナノポア６００を含む。
【００５８】
[0078] 蛍光光線８５０は、次に、対物レンズ８３６を用いて集光され、ダイクロイック・ミラーＤＭおよびフィルタＦによって濾波され、撮像用のフレーム転送冷却式電子倍増電荷結合デバイス・カメラ、または光検出器のような、検出器８８４に誘導される。検出器８８４は、Microsoft Windows系パーソナル・コンピュータ、およびSolisソフトウェア（これもAndorから入手可能）のような撮像ソフトウェアといった、しかるべき撮像システムに接続して、検出器8８４が発生したデータ信号を処理して、画像または一連の画像を生成することができる。データ信号を分析し、蛍光放出を検出し、試験対象の生体分子（例えば、ＤＮＡ）の配列あるいは他の特性を判定するために、カスタム・ソフトウェアを用いることができる。
【００５９】
[0079] 図９は、ＤＮＡ解決のときに、図８の多色光学顕微鏡検査ツールのポア局限カウンタ・ヒストグラム(pore localization counter histogram)の例を示す。
【００６０】
[0080] 尚、ナノポア・アレイの光学的可視化は、本明細書において記載した実施形態を用いても行えることは認められよう。例えば、本明細書において記載する光学的可視化は、図１０Ａに示すような、多数のポアからの同時読み出し、および／または図１０Ｂに示すような多数のビットの同時読み出しに用いることができる。
【００６１】
[0081] また、本発明の実施形態は、例えば、ＳｉＮメンブレンのような固相材料を用いて、細胞毒性および生体適合性を研究するために、細胞および組織癒着(adhesion)を可視化するために用いることもできる。
【００６２】
[0082] また、本発明の実施形態は、ナノポア、ナノスリット、またはナノポア・アレイを介して界面を横切る媒体内において刺激によって細胞を局所的に励起させるため、そしてメンブレンを介して光学顕微鏡検査を用いて細胞の応答を測定するためにも用いることができる。新たな生体材料（ＳｉＮメンブレンのような生体材料）との接触または刺激物に対する応答は、細胞メンブレン上にあるバイオマーカの蛍光読み出しによって測定することができる。
【００６３】
[0083] 本発明の実施形態は、固相メンブレンにおいて製作されたナノポア内におけるその通行(transit)または一時的滞留(temporal lodging)の間、単分子解明によって、蛍光標識またはバイオポリマーが付けられた核酸を撮像するために用いることができる。
【００６４】
[0084] また、本発明の実施形態は、転座し一時的にナノポアに滞留するＤＮＡのような、バイオポリマー上に化学量論的に結合され、蛍光標識が付けられたタンパク質の化学量論を検出するために用いることもできる。
【００６５】
[0085] 本発明の実施形態は、多色検出に用いることができ、したがって、ＤＮＡ上に結合された生物学的に別個のタンパク質の空間的局限を検出するために用いることもできる。
【００６６】
[0086] 本発明の実施形態は、ナノポアおよび高スループット薬剤スクリーニングによるＤＮＡ配列決定に用いることができる。
【００６７】
[0087] 尚、ＴＩＲ照明の場のサイズは、入射レーザ・ビームのビーム径および／または形状を変化させることによって、用途に応じて変化させることができることは認められよう。
【００６８】
[0088] 一実施形態では、図１７に示すように、対物レンズ２３６ａを、トランス・チェンバ２０４の下ではなく、シス・チェンバ(cis chamber)２０８の上に配置することができ、対物レンズ２３６ａを撮像に用いることができる。この構成では、対物レンズ２３６ａではなくレンズ２３６ｂを用いて、レーザ・ビーム２４２をメンブレン２２４に合焦させることができる。図３を参照して先に説明したように、浸入油２３８およびガラス・カバースリップ２４０の屈折率一致のために、レーザからの光２４２（レンズ２３６ｂを通過した）は屈折して媒体１ ２１６に入る。メンブレン２２４において、光は、２種類の液体２１２、２１６の屈折率が一致しないことのために、全内部反射し（２４６）、消衰波２４６が、密度の低い方の媒体、即ち、媒体１ ２１６において発生する。消衰波２４６は、指数的に減衰する強度を有し、メンブレン２２４の表面（励起光の典型的な「浸透」深さは数十ｎｍである）において、蛍光体を励起することができる。励起された蛍光体によって生成された光は、シス・チェンバ２０８上に位置付けられた対物レンズ２３６ａによって合焦し、ＣＣＤカメラ４８４または光検出器によって測定することができる。
実施例
実施例１
サンプルの外形形状
[0089] 中央に厚さが２０〜５０ｎｍの自立窒化シリコン・ウィンドウ［５０μｍ×５０μｍ］を有するシリコン・チップ［５ｍｍ×５ｍｍ×３００μｍ］を、標準的なフォトリソグラフ法によって、シリコン・ウェア上のＬＰＣＶＤ被覆ＳｉＮ層上に作成した。ガラス・カバースリップ上にこれらのチップを実装し、図３に示したように、チップとガラス・カバースリップとの間に、厚さ２〜１０μｍのマイクロチャネルを形成するために、二部ＰＴＦＥ／ＣＴＦＥ流体セルを設計した。このマイクロチャネル、即ち、トランス・チェンバ２０４を、屈折率がより高い流体（７０％グリセロール［ｎ＝１．４２］）で満たし、シス・チェンバ２０８を、サンプル緩衝水溶液［ｎ＝１．３３］で満たした。
ＴＩＲＦの設定および光路図
[0090] 全内部反射［ＴＩＲ］顕微鏡検査を、図４に示したように設定した。レーザ・ビーム・サイズを０．７ｍｍに縮小し、市販の倒立顕微鏡（Olympus IX-71）の特別設計したバック・ポートに発射し、外部に取り付けられた２００ｍｍ焦点長のレンズを通じて、６０×１．４５ＮＡ油浸入ＴＩＲＦ対物レンズの背後焦点面において合焦させた。レーザ・ファイバ・カプラをＸ−軸に沿って動かすことによって、レーザ点を光軸から外れるようにずらした。光が窒化シリコン・メンブレンにおいてグリセロール−水界面に達するまで、光が油、ガラス・カバースリップ、および７０％グリセロールを通ってトランス・チェンバ内で屈折するように、ガラス［ｎ＝１．５２］、７０％グリセロール［ｎ＝１．４２］、およびサンプル緩衝剤［ｎ＝１．３３］の屈折率を選択した。この界面におけるＴＩＲモードの臨界角は、スネルの法則によって記述されるように、ガラス−水界面と同じである。
【００６９】
【数１】
【００７０】
ここで、ｎはガラス、グリセロール７０％、または水の屈折率を表し、θはそれぞれの界面における入射角である。視野の中心を、屈折率が高い流体層の厚さに応じて、光伝搬方向にずらす。蛍光放出は、外部レンズによって３倍に拡大され、同じ対物レンズによって収集され、しかるべき光学フィルタを通過した後に、市販のＥＭＣＣＤカメラ（Andor iXon BV887）上で撮像した。撮像は、販売業者が提供したAndor Solisソフトウェアによって、または特注で書かれたソフトウェアを用いて行われた。
サンプル不動化
[0091] ５’末端にビオチン共役があり、５’末端から２０番目の位置にアミン修飾チミン塩基があるＤＮＡ分子［５７ｂｐ］をIDT Techから購入した。ＤＮＡ分子に、販売業者のプロトコルを用いて、ATTO647N染料分子［ＡＴＴＯ−ｔｅｃｈ］で標識を付けた。ストレプトアビジン・ビオチン(streptavidin-biotin)化学薬品によって、窒化シリコン上でＤＮＡ分子を不動化した。新たに用意したピラニア溶液(Piranha solution)において表面を浄化し（硫酸および過酸化水素の７：３ｖ／ｖ溶液において１５分）、次いでＤＩ水において徹底的に洗浄した。０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ−ビオチンにおいて一晩表面を培養し、結合緩衝剤[１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＬ、ｐＨ８．５]で洗浄し、ストレプタビディンにおいて３０〜６０分培養し、結合緩衝剤において洗浄し、次いでビオチンで標識を付けたＤＮＡで１５〜３０分培養した。次いで、流体セルに表面を装填した。７０％グリセロールを、ガラス・カバースリップとシリコン・チップとの間にあるトランス・マイクロチャネルに充填し、結合緩衝剤をシス・チェンバに充填した。次いで、ＴＩＲＦＭによって窒化シリコン界面において表面を撮像した。
結果
[0092] 図４に示したように、窒化シリコン・メンブレン（例えば、サイズが２０×４０μｍ２、厚さが２０ｎｍ）を、ガラス・カバースリップ上に装填した。トランス・チェンバおよびシス・チェンバにおける２種類の流体を、それぞれ、グリセロール７０％（ｖ／ｖ）（ｎ＝１．４２）および水（ｎ＝１．３３）に選択した。
【００７１】
[0093] 励起レーザ・ビームを、図５に示したように、メンブレンの寸法よりも小さい消衰照明の場を形成するように整形した。ビーム径を０．７ｍｍに縮小することによって、スポット・サイズがＳｉＮメンブレン・サイズよりも小さくなった。
【００７２】
[0094] 対物レンズ（ｎ＝１．５５）に入射した光は伝搬して、浸入油（ｎ＝１．５２）、ガラス・カバースリップ（ｎ＝１．５５）、液体２（７０％グリセロール）（ｎ＝１．４２）を通過し、界面を横切り、最後に水（ｎ＝１．３３）を通過した。光は、グリセロールを水から分離する界面において、全内部反射を発生した。
【００７３】
[0095] 励起場の形状を較正するために、メンブレンのシス側に２０ｎｍＴＭＲビーズを吸着させ、ＴＩＲＦモードで撮像した。これらのＴＭＲビーズをＸ軸およびＹ軸に沿って移動させ、撮像光学素子の倍率を用いることによって、消衰照明の場が約１０×２０μｍ２までであると計算した。
【００７４】
[0096] この例では、３’末端においてビオチン化され、５’末端においてＡＴＴＯ６４７Ｎ標識が付けられた１つ１つのＤＮＡ分子が、ビオチン−ストレプトアビジン化学薬品を用いて、窒化シリコン表面のシス側で不動化された（即ち、方法および材料）。
実施例２
ＴＩＲＦの設定
[0097] 実験において、ナノポア６００を有する自立ＳｉＮメンブレン（２０×２０μｍ２）１１２４を内蔵するシリコン・チップ１１２８を、界面として用いた。シリコン・チップ１１２８をガラス・カバースリップ１１４０上に装填し、ガラス・カバースリップ１１４０を、特注で製作したクロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥポリマー）流体セル１１３８上に装填し、図１１に示したような、微小流体トランス・チェンバ１１００を作成した。流体セル１１３８は、シリコン・チップ１１２８を保持するインサート１１３８ａと、流体チェンバを形成する外側セル１１３８ｂとを含む。高速硬化ポリジメトリシロキサン（ＰＤＭＳ：polydimethlysiloxane）を用いて、シリコン・チップ１１２８をＣＴＦＥインサート１１３８ａに接合し、ガラス・カバースリップ１１４０を外側セル１１３８ｂに接合した。インサート１１３８ａを有する流体チェンバはシス・チェンバであり、シリコン・チップ１１２８とガラス・カバースリップ１１４０との間の空間がトランス・チェンバとなる。流入−流出フロー・チャネルを用いて、トランス・チェンバに、屈折率緩衝剤１１１２を充填した。電気的測定のために、フロー・チャネルの側面開口内にトランス電極１１４０ａを設け、インサート（Ａｇ／ＡｇＣｌ双方）１１１６において緩衝剤の中にシス電極１１４０ｂを埋没させた。ナノポア６００を用いて、図１１Ａに示すように、光学可視化および測定のために、流体セル１１００を倒立顕微鏡１１３６に対して一直線上に揃えた。
【００７５】
[0098] シス・チェンバ ｎｗ≒１．３３（水緩衝剤、１Ｍ ＫＣｌおよび１０ｍＭトリス、ｐＨ＝８．５）およびトランス・チェンバ（高い屈折率ｎＣｓを有する水性緩衝溶液） において用いた緩衝剤の屈折率は、ガラスの屈折率ｎｇ＝１．５よりも小さかった（ｎｗ＜ｎＣｓ＜ｎｇ）。即ち、７Ｍ ＣｓＣｌおよび１０ｍＭトリス、ｐＨ＝８．５（「Ｃｓ７Ｍ」、ｎ＝１．４１）を含有する塩緩衝溶液を、シス・チェンバにおける緩衝剤として用いた。
【００７６】
[0099] ガラス・カバースリップ側から、ガラス／トランス・チェンバ界面の反射臨界角より小さいがトランス／シス臨界角よりは多少大きな角度θｇで、平行光ビームを導入し、図１１Ｂに示すように、ＳｉＮメンブレンにおいてＴＩＲ励起を生じさせた。高開口数（ＮＡ）の対物レンズ（Olympus 60X/1.45）を用いて、入射レーザ・ビームをその背後焦点面（ｄ）における軸外れ点(off axis point)に合焦させることによって、ＴＩＲを行い、入射角θｇを制御した。ＴＩＲ励起領域の面内位置を、距離ｄ＝ｈｔａｎ（θＣｓ）だけ変位させる。ここで、ｈはトランス・チェンバの高さである。
【００７７】
[00100] 焦点距離が長く色収差を補正した二重レンズ（２００ｍｍ）を用いて、ＳｉＮメンブレン上において照明される面積が約１０×２０μｍ２となるように、入射するレーザ・ビームの幅を整形した。単一モード偏光保存光ファイバ(single-mode polarization-preserving optical fiber)を介して、６４０ｎｍレーザ（２０ｍＷ）（iFlex2000, Point-Source, Hamble, UK)をシステムに結合し、直径が０．７ｍｍの平行ガウス・レーザ・ビームを生成した。この高品質のビームによって、対物レンズの入射面にぴったり合焦したスポットを確保し、こうして望ましくない散乱を最小に抑える。普通の手順を用いて、メンブレン表面のシス側に、ストレプトアビジンを被覆した。短いビオチン化ＤＮＡオリゴに、各々、１つのＡＴＴＯ６４６Ｎ蛍光体で標識を付け、メンブレン表面上で不動化し、最大ＥＭ利得および１０ｍｓ積算(integration)で動作する電子倍増ＣＣＤカメラ上に蛍光光線を投射することによって撮像した。電子倍増電荷結合デバイス（ＥＭＣＣＤ）カメラ（Andor, iXon DU-860）を用いて、メンブレン表面からの蛍光画像を記録した。図１２は、本発明の一実施形態にしたがって、ＴＩＲＦの下で撮像されたメンブレン表面上で不動化された１つ１つの分子の３つの典型的な画像を表示する。図１２に示すように、１つ１つの蛍光体が、高いコントラストで解明されており、これ以上の画像処理を必要としない。
【００７８】
[00101] 入射角が大きくなると、ＴＩＲの臨界角のために、メンブレンのシス側から観察されていたレーザ光の突然の消失、（２）顕微鏡の接眼レンズを用いて対物レンズの背後焦点面において可視化された、変位ＴＩＲレーザ・ビームの出現、そして（３）バックグラウンド強度の急減による、信号分子撮像のためのバックグラウンドへの信号（信号対バックグラウンド比）の増大が生ずる。２倍以上の信号対バックグラウンドの増加が、エピ照明(epi-illumination)（サンプルの一方側からの照明および検出）によって、ＳｉＮメンブレン上で不動化された１つ１つの蛍光体の画像において達成された。
【００７９】
光学および電気信号の同期検出
[00102] 光学信号および電気信号の同期検出のために、ハードウェア（例えば、Microsoft WindowsまたはLinux互換パーソナル・コンピュータ）とLABVIEWソフトウェアとの組み合わせを設計した。図１３は、取り込みハードウェアを模式的に示す。Axopath200B増幅器１３８６（Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA）を、Ag/AgCl電極にヘッドステージ１３８８を介して接続し、ナノポアを横切るイオン電流信号を増幅する。外部四極バターワース・フィルタ１３９０を用いて、このイオン電流信号に５０ＫＨｚでロー・パス・フィルタをかけ、画像取り込みボード１３９４（Andor iXon取り込みボード）を介してＣＣＤカメラから画像データを受け取った 同じＰＣ内にある多機能データ取り込みボード１３９２に入力する。多機能データ取り込みＤＡＱボード１３９２（National Instruments, PCI-6154）を用いて、１６ビット・アナログ／デジタル変換分解能で、イオン電流信号を取り込んだ。ＥＭ−ＣＣＤカメラ１３８４からの「発火」パルス（各露出の開始を印すＴＴＬパルス）が、イオン電流の取り込みをトリガし、カウンタ・ボード（National Instruments, PCI-6602）上において高精度のタイム・スタンプを生成するために用いられた。カウンタ・ボードは、クロック・レートが２５０ＫＨｚのＲＴＳＩバスを用いて、内部でＤＡＱボードと同期を取られていた。したがって、組み合わされたデータ・ストリームは、イオン電流のサンプリングと同期を取られているＣＣＤフレームの各々の開始時における一意のタイム・スタンプを含んでいた。転座イベントが、イオン電流の落下によって検出されたとき、ソフトウェア１３９６は、カウンタ情報の中で対応するフレーム番号を検索し、この番号に対応する実際の画像をセーブした。カメラ・フレーム・レートは、約１ＫＨｚ（発火パルス・レート）に設定した。
【００８０】
[00103] 図１４Ａから図１４Ｃは、電気信号および光信号の同期を示す。長さがミリ秒単位の電気パルスを、ファンクション・ジェネレータ(function generator)から発生し、増幅器のヘッドステージに電気的に結合した。これらの電流パルスは、ナノポア信号と形状および時間メモリが同様である。同じ信号を用いて励起レーザをＯＮ／ＯＦＦ変調し、光および電気パルスの同期源を設けた。同期検査のために、蛍光ビーズをメンブレン上で不動化し、前述のようなカメラを用いて撮像した。
【００８１】
[00104] ２つの様式を組み合わせて、ナノポアを介したＤＮＡ転座の間に同期光および電気信号を測定した。最初に、メンブレン上においてポアの位置を特定した。ポアからの蛍光信号は、位置が固定であり、電気信号との同期時(in-sync)に発光(light up)する。つまり、ポアの位置に対応する画素は、ときの経過と共に、最も高い傾向の強度を蓄積し、画像の総和によって、ＣＣＤ上のポア位置に対応するピークを明らかにする。一旦ポア位置が特定されたなら、このポアに対応する画素からの強度を、更なるデータ分析のために用いた。
実施例３
[00105] ４ｎｍポアを介して転座する蛍光標識付きｄｓＮＤＡを検出するために、同時光学および電気的測定を行った。この実験におけるサンプル濃度は、０．１ｎＭ〜０．２ｎＭであった。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ポアの形状、および約４ｎｍのポア例のＴＥＭ画像を模式的に示す。４２１ｂｐ断片（ＤＮＡ−Ａ１６４７）に、Alexa647蛍光体で標識を付け、重合連鎖反応（ＰＣＲ）反応、それに続くアミン反応染料との共役の間、低濃度のアミノ修飾チミン塩基の合体によって用いられる。
【００８２】
[00106] 図１６Ａおよび図１６Ｂに示すように、９つの代表的イオン電流およびそれらの対応する蛍光強度イベントが、ＤＮＡ−Ａ１６４７分子をポアのシス側に添加した後に示される（２００ｍＶのバイアスによって４ｎＡの開放ポア電流が発生し、最大ＥＭ利得で１ｍｓの蓄積毎に画像を取り込んだ）。ナノポアの位置を、前述のように判定した。図示する蛍光強度は、ナノポアを中心に配されたＣＣＤ上の３×３画素エリアから抽出されたものである。尚、電流および光データの同期取り込みが、イベント毎に内部バックグラウンド閾値を定めるのに役立つことは認められよう。電気的イベントの約５ｍｓ前のポア位置における強度を、そのイベントのバックグラウンド値として用いた。ポア位置における強度が少なくとも１標準偏差だけその対応するバックグラウンドよりも高かった光学イベントのみが分析において含められ、そのイベントが有意なバックグラウンド閾値を有し、疑似信号を排除することを確保する。
【００８３】
[00107] 尚、以上の詳細な説明および以下の例は、例示に過ぎず、本発明の範囲に対する限定と見なしてはならないことは言うまでもない。開示した実施形態に対する種々の変更や修正も、当業者には明白であり、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。更に、特定した全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書において引用したことにより、例えば、本発明と関連付けて用いることができるそのような刊行物に記載されている方法を記載および開示するために、その内容が本願にも明示的に含まれるものとする。これらの刊行物は、本願の出願日よりも前に、それらの開示のためにのみ提供されたものである。これに関していかなるものも、先願発明のためであってもまたは他のいかなる理由であっても、本発明者がこのような開示よりも先行する資格を本発明者が有さないことの承認として解釈してはならない。日付についてのあらゆる言明またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していかなる承認をも構成することはない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互引用
[0001] 本願は、２００９年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／２１１，２６０号に対して、法によって与えられるいずれの権利をも、そして全ての権利を主張する。
政府援助
[0002] 本発明は、米国国立衛生研究所によって裁定された契約第ＨＧ−００４１２８号の下で、政府支援によって行われた。
発明の分野
[0003] 本発明は、光学顕微鏡の分野に関する。特に、本発明は、生体分子の撮像改良のために、２種類の流体間にある薄い固相界面を利用する。
【背景技術】
【０００２】
[0004] 最初の参照人ゲノム配列の完成は、ゲノム異変が直接薬剤の発見や医学的治療に影響を及ぼす時代の幕開けを印した。この新たな枠組みのために、費用がかからず非常に高速なＤＮＡ配列決定方法が早急に必要となった。近い将来、開業医は、薬剤を処方する前に、臨床設備(clinical setting)において個々の患者のＤＮＡを日常的に分析し、あらゆる薬剤に関するゲノム情報が文書化されているオンライン・データベースとそれらを照合することが可能になるであろう。加えて、手の届く範囲の配列決定技術が、比較ゲノム学および分子生物学における研究の様相を一変させ、科学者が細胞異体(cell variants)からゲノム全体の配列を素早く決定できるようになるであろう。超高速でしかも安価なＤＮＡ配列決定を実現するためには、サンガーのジディオキシ・プロトコルに基づく古典的な方法に取って代わる新たな技術が必要とされる。これらの新たな技術は、２つの主要な障害に取り組まなければならない。（１）サンプル・サイズを最小にまで縮小し、１つのＤＮＡ細胞または少数のコピーからの配列読み出しを可能にしなければならない。（２）読み出し速度は、現在の技術的現状と比較して、数桁上昇させなければならない。
【０００３】
[0005] 窒化シリコン、酸化シリコン、およびその他のような固相面が、再生医学、埋め込み可能なデバイス、および基本的な研究コンテキストを含む、種々の生化学用途において用いられている。薄い固相面は、例えば、生物検知(biosensing)およびＤＮＡ配列決定の用途において用いられるナノスリットやナノポア(nanopore)アレイのような、異なるミクロおよびナノ構造デバイスのコンテキストにおいて用いられている。窒化シリコン・メンブレンは、最近になって、生体分子検出およびＤＮＡ配列決定というような用途に合った固相ナノポアを作成するのに適した基板となることが示された。ＤＮＡ転座の単一分子光学検出を必要とし、固相ナノポアを介して解決する固相デバイスが、生物検知およびゲノム配列決定にはきわめて重大であると考えられている。これらのデバイスによる光信号の単一分子生体内測定には、顕微鏡検査の消衰モード(evanescent mode)を用いることが有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0006] 生物医学研究および医療用デバイスの分野においては、対象の材料を通した撮像によって分子、細胞、および組織を研究できることが望ましい。このような撮像技法の１つに、全内部反射蛍光顕微鏡検査（ＴＩＲＦＭまたはＴＩＲＦ）がある。しかしながら、これらのコンテキストにおいて用いられてきた固相材料は、ＴＩＲＦのような技術的現状の顕微鏡検査方法とは適合性がない。既存の技法では、これらの固相材料面を、ガラス・カバースリップのような、他の表面の消衰場(evanescent field)内に持ち込むことが難しく、更に、窒化シリコン・メンブレンおよび生体サンプルをＴＩＲＦ消衰場領域(regime)に持ち込むのは、とても厄介である。更に、粒子の固有密度（クリーン・ルーム環境においても）のために、これらの窒化シリコン・チップの処理最中に発生する粒子、およびこれらの窒化シリコン・メンブレン・チップの温度制約という制限のために、これらのナノポアを窒化シリコン面で密閉するのは、難しい作業となる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0007] 本発明の実施形態は、固相メンブレン（ナノポア・デバイスまたは他の生体サンプルを保持する）を挟む２つの媒体間における屈折率整合ＴＩＲＦＭ (全内部反射蛍光顕微鏡検査）によって、これらの固相メンブレンにおいて消衰モード励起を達成する。これによって、メンブレン上における１つ以上の生体分子の高分解能、高コントラスト、および高感度画像の取り込みが可能となる。
【０００６】
[0008] 本発明の一態様によれば、光学顕微鏡検査ツール用流体セルが開示される。この流体セルは、第１側と、第２の対向する側とを有する固相メンブレンと、メンブレンの第１側に配置された第１流体チェンバであって、第１屈折率を有する第１流体を収容する、第１流体チェンバと、メンブレンの第２側に配置された第２流体チェンバであって、第２屈折率を有する第２流体を収容する第２流体チェンバとを含み、第１屈折率が第２屈折率よりも高い。
【０００７】
[0009] 固相メンブレンは、窒化シリコン、酸化シリコン、酸化アルミニウム、酸化チタン、またはその他の誘電体材料とするとよい。
【０００８】
[0010] 固相メンブレンは、シリコン・ウェハ上に堆積された窒化シリコン層を含むことができる。窒化シリコン層の厚さは、５〜６０ｎｍとするとよい。シリコン・ウェハは、ウィンドウを含むことができ、窒化シリコン層がウィンドウを覆うか、またはこのウィンドウを横切って広がる。
【０００９】
[0011] 第１流体は、水性緩衝溶液または水とすることができる。第２流体は、細胞流体(cellular fluid)、細胞メンブレン、またはグリセロールとすることができる。第１流体は、第１流体は、濃縮尿素溶液またはＣｓＣｌとしてもよい。
【００１０】
[0012] 光学的バイオマーカに結合された生体分子が、メンブレンの第２側に供給することができる。この生体分子は、ＤＮＡ分子とすることができる。この生体分子は、タンパク質分子であってもよい。光学的バイオマーカは、励起可能な蛍光体とすることができる。
【００１１】
[0013] 第１流体チェンバは、マイクロチャネルとすることができる。
【００１２】
[0014] 固相メンブレンは、少なくとも１つのナノポアをを含むことができ、実施形態によっては、複数のナノポアを含んでもよい。複数のナノポアは、円形または多角形アレイに配列することができる。
【００１３】
[0015] 本発明の他の態様によれば、１つ１つのＤＮＡ分子を撮像するための光学顕微鏡検査ツールが開示される。この光学顕微鏡検査ツールは、シリコン・ウェハのウィンドウを覆う固相メンブレンと、固相メンブレンの一方側にある第１流体チェンバと、第１流体チェンバの中にあり第１屈折率を有する第１流体と、メンブレンの他方側にある第２流体チェンバと、第２流体チェンバの中にあり、第１屈折率よりも低い第２屈折率を有する第２流体とを備えている流体セルと、ガラス・カバースリップであって、このガラス・カバースリップが第１流体チェンバの底面を形成するように、流体セルが実装されている、カバースリップと、対物レンズと、対物レンズとガラス・カバースリップとの間にある浸入油と、対物レンズにおいて光を誘導するように構成されている光源であって、固相メンブレンが覆うウィンドウよりも小さい消衰照明の場を発生するように、対物レンズが光を合焦するように構成されている、光源と、固相メンブレンにおいて１つ１つのＤＮＡ分子によって放出される光を検出する撮像検出器とを含む。
【００１４】
[0016] 光源は、少なくとも１つの励起レーザを含むことができ、実施形態によっては、異なる波長のレーザ・ビームを生成する複数のレーザを含むことができ、撮像検出器は、電子倍増電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ、または光検出器を含むことができる。
【００１５】
[0017] １つ１つのＤＮＡ分子を固相メンブレン上に不動化するために、ビオチン−ストレプトアビジン化学薬品を用いることができる。
【００１６】
[0018] 本発明の更に他の態様によれば、１つ１つの生体分子を撮像するための光学顕微鏡検査ツールが開示される。この光学顕微鏡検査ツールは、異なる屈折率を有する第１流体と第２流体との間にある固相メンブレンにおいて消衰照明の場を発生する手段と、固相メンブレンにおいて１つ１つの生体分子に結合されている光検出器によって放出される光を検出する手段とを含む。
【００１７】
[0019] 固相メンブレンにおいて消衰照明の場を発生する手段は、励起レーザと対物レンズとを含むことができる。光学的マーカによって放出された光を検出する手段は、光検出器、または電子倍増ＣＣＤカメラを含むことができる。
【００１８】
[0020] また、光学顕微鏡検査ツールは、更に、１つ１つの生体分子を固相メンブレン上に不動化する手段を含むこともできる。
【００１９】
[0021] 消衰照明の場は、固相メンブレンの寸法よりも小さくするとよい。
【００２０】
[0022] 本発明の更に他の態様によれば、単体の生体分子を撮像する方法が開示される。この方法は、異なる屈折率を有する第１流体と第２流体との間にある固相メンブレンにおいて、消衰照明の場を発生するステップと、固相メンブレンにおいて、１つ１つの生体分子に結合されている光検出器によって放出される光を検出するステップとを含む。
【００２１】
[0023] また、この方法は、１つ１つの生体分子を固相メンブレン上に不動化するステップも含む。
【００２２】
[0024] 検出された光から、画像を発生する。
【００２３】
[0025] 本発明の更にまた他の態様によれば、単体ＤＮＡ分子を撮像する方法が開示される。この方法は、光学顕微鏡検査ツールの対物レンズに光を誘導するステップと、第１流体を通過するように光を誘導するステップと、第２流体において消衰照明の場を発生するために、窒化シリコン・メンブレンにおいて光を反射させるステップと、消衰照明の場によって励起され単体ＤＮＡ分子に結合されている光学的バイオマーカによって放出される光を、撮像検出器に誘導するステップとを含む。
【００２４】
[0026] 消衰照明の場は、第２流体内において発生することができる。単体ＤＮＡ分子は、第２流体内において、窒化シリコン・メンブレン上に不動化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態による流体セル(fluid cell)の模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態による流体セルの界面の斜視図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態による、界面におけるＴＩＲを示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態による光学顕微鏡測定ツールの模式図である。
【図５】図５は、本発明の一実施形態にしたがってＴＩＲＦ下で撮像された１つのＤＮＡ分子の蛍光画像である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態によるＤＮＡ配列決定手法を示す模式図である。
【図７】図７は、本発明の一実施形態にしたがって、１ビット（ａ）および２ビット（ｂ）読み出し値を用いた、同時電気光学検出を示す模式図である。
【図８】図８は、本発明の一実施形態による多色光学顕微鏡検査ツールの設定の模式図である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態によるポア局限カウンタ・ヒストグラムである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、本発明の一実施形態による、多数のポアからの同時読み出しを含むマルチポア検出における追加ステップの図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、本発明の一実施形態による、多数のビットからの同時読み出しを含むマルチポア検出における追加ステップの図である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態による流体セルの模式図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、本発明の一実施形態による図１１の流体セルの詳細な模式図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、本発明の一実施形態による図１１の界面の詳細な模式図である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態にしたがってＴＩＲＦの下で撮像した１つのＤＮＡ分子の蛍光画像である。
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態による分析ハードウェアのブロック図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本発明の一実施形態による電気信号および光信号の同期を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本発明の一実施形態による電気信号および光信号の同期を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、本発明の一実施形態による電気信号および光信号の同期を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、本発明の一実施形態による、ナノポアを通したＤＮＡ分子のスレッディング(threading)を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本発明の一実施形態による、ナノポアを通したＤＮＡ分子のスレッディング(threading)を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、図１５Ａのスレッディング・イベント中における電気信号および光信号の同期を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１５Ｂのスレッディング・イベント中における電気信号および光信号の同期を示す。
【図１７】図１７は、本発明の一実施形態による、界面におけるＴＩＲを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
[0046] 本発明の実施形態は、厚さがナノメートル単位の固相メンブレンを介した１つ１つの分子および生体材料双方の撮像方法に関する。この方法が優位であるのは、１つ１つの分子および生体材料の、従来からの電気的測定に加えて、光学的（例えば、蛍光）測定を可能にするからである。一実施形態では、２種類の混和性／非混和性流体間における薄い固相界面を介して、消衰モードで、１つの分子または生体材料を撮像する。流体セルが、屈折率が異なる２つの混和性流体間に、固相界面を形成する。この固相界面は、厚さが数ナノメートルから数十ナノメートル程度とすることができ、そして窒化シリコン、参加シリコン、および／またはその他で作ることができる。
【００２７】
[0047] 固相界面におけるナノポアまたはナノポア・アレイを介した生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）の転座のために、２つの流体に電位を印加することができる。ＤＮＡ転座では、単一撚り合わせ(single-stranded)ＤＮＡ分子が、一列状にナノポアを通り抜けるように電気泳動的に駆動される。この実施形態では、ターゲットＤＮＡ配列の各塩基(base)は、生化学変換によって、最初に２または４ユニット・コード、２ １０−２０ｂｐヌクレオチド配列上にマッピングされる。これら２−ユニットまたは４−ユニット・コードは、次に、交雑されて、相補的な、蛍光標識が付いた(fluorescently labeled)、そして自己消滅型分子ビーコン(self-quenching molecular beacon)となる。ナノポアを介した転座の間に分子ビーコンが順次解決されるに連れて、これらの蛍光タグが消されなくなり、単一色、または多色（例えば、２つ以上の色）全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡によって読み取られる。結果的に得られた単色光信号または多色光信号は、次に、ターゲットＤＮＡ配列に相関付けられる。
【００２８】
[0048] 本発明の実施形態に優位性があるのは、固相界面上で不動にさせられ、「厚い」水性流体層（即ち、屈折率が大きい流体）上に位置付けられた１つ１つの生体分子または生体材料の、高分解能および高感度画像の取り込みを可能にするからである。更に具体的には、この「厚い」流体層内深くに消衰場を実現することによって、薄い固相界面における分子または生体材料の高コントラスト光学検出を、１つ１つの生体分子または生体材料を撮像するために用いることができる。
【００２９】
[0049] 図１は、本発明の一実施形態による流体セルを示す。図１に示すように、流体セル１００は、第１チェンバ１０４と第２チェンバ１０８とを含む。第１流体１１２が第１チェンバ１０４の中にあり、第２流体１１６が第２チェンバ１０８の中にある。２種類の流体１１２、１１６は、これらが異なる屈折率を有するように選択される。第１流体１１２は、第２流体１１６よりも屈折率が高くなるように選択される。２種類の流体１１２、１１６の屈折率は、界面１２０において全内部反射（ＴＩＲ）を生ずるように選択されている。例えば、第１流体１１２は細胞質（ｎ＝１．３６）またはセル・メンブレン（ｎ＝１．４７）とするとよく、第２流体１１６は、水性緩衝液（ｎ＝１．３３）とするとよい。他の例では、第１流体１１２は塩を含有する。流体１１２、１１６の双方は、水溶液である。
【００３０】
[0050] また、流体セル１００は、界面１２０も含む。界面１２０は、固相メンブレン１２４を含む。界面１２０は、第１チェンバ１０４と第２チェンバ１０８との間に、２種類の流体１１２、１１６を分離するように配置されている。２種類の流体１１２、１１６間の界面１２０は、全内部反射（ＴＩＲ）が発生するのを可能にする。即ち、ＴＩＲ照明が固相メンブレン（例えば、ＳｉＮメンブレン）１２４において発生し、第１チェンバ１０４において消衰波を生成する。界面１２０、特にメンブレン１２４は、生体分子相互作用のための基板を形成する。
【００３１】
[0051] 図２は、界面１２０の詳細な図である。図２に示すように、界面２２０は、ウィンドウ２２４を有するチップ２２８を含む。チップ２２８は、ウィンドウ２２４を覆う固相メンブレンを支持する枠として作用する。このチップの寸法の一例では、５ｍｍ×５ｍｍ×３００μｍとすることができ、メンブレンの寸法の一例では、５０μｍ×５０μｍ×５〜５０ｎｍとすることができる。界面２２０は、化学蒸着（ＣＶＤ）、ウェット・エッチング、およびフォトリソグラフィを含む従来の技法を用いて、適合性のある固相材料（例えば、シリコン系材料）であればいずれでも形成することができる。
【００３２】
[0052] 一実施形態では、チップ２２８はシリコンであり、窒化シリコン・メンブレンで覆われている。尚、このメンブレンは、薄膜に形成することができる誘電体材料であればいずれでもよいことは認められよう。他のメンブレン材料の例には、酸化シリコン、酸化アルミニウム、酸化チタン等が含まれる。他のチップ材料の例には、ガラス、溶融シリカ、クオーツ等が含まれる。
【００３３】
[0053] 本明細書において記載する固相メンブレンは、約５〜６０ｎｍの厚さとすることができる。例えば、固相メンブレンは約１０ｎｍとするとよい。しかしながら、メンブレンの厚さは、２種類の混和性液体間においてＴＩＲ照明から生成される消衰波の所望のサイズおよび減衰を得るために選択することができ、５ｎｍよりも薄くするかまたは６０ｎｍよりも厚くしてもよいことは認められよう。メンブレンの厚さをナノメートル単位にすると、ＴＩＲが発生する、２種類の液体間の界面に、鋭い境界を定めるのに資する。
【００３４】
[0054] 尚、実施形態によっては、固相メンブレンがナノポア、ナノスリット、またはナノポア・アレイを含んでもよいことは認められよう。これらのナノポア（１〜１００ｎｍ）またはナノポア・アレイは、界面を横切る流体を接続する。固相ナノポアは、調節可能な寸法を有し、広範囲の温度、ｐＨ、および化学的異変に耐えることができる。ナノポア（１つまたは複数）は、例えば、Ａｒイオン・ビームまたは電子ビーム彫刻を用いて、あるいは反応性イオン・エッチングによって製作することができる。
【００３５】
[0055] 図３は、光学顕微鏡検査ツールを用いたＴＩＲに基づく測定のために、通常の顕微鏡ガラス・カバースリップ２４０上に実装された流体セル１００を示す。カバースリップ２４０は、対物レンズ２３６上に実装されており、カバースリップ２４０と対物レンズ２３６との間には、浸入油２３８が供給される。１つ以上の生体分子または生体材料が、蛍光体のような光学的バイオマーカに連結され、撮像のためにメンブレン２２４上で不動化されている。
【００３６】
[0056] 光学的バイオマーカは、消衰波への露出に応答して放射線を照明または放出する材料であればいずれでも可能である。光学的バイオマーカの例には、蛍光プロパン(fluorescent propane)または蛍光共振エネルギ転移（ＦＲＥＴ：fluorescence resonance energy transfer）タグ（例えば、蛍光体）、量子ドット(quantum dot)、および有機化合物が含まれる。当業者であれば認められるであろうが、光学的バイオマーカには、周知の技法によって、例えば、共有結合のまたは非共有結合の連携(association)によって、対象の生体分子と関連付けることができる。本発明の一実施形態では、光学的マーカを化学的に共役させることができる。本発明の代替実施形態では、再結合融合(recombinant fusion)、例えば、細胞受容体または信号分子によって、生体分子を光学的マーカと関連付けることができる。
【００３７】
[0057] レーザ光２４２は、対物レンズ２３６の背後焦点面において合焦されている。浸入油２３８およびガラス・カバースリップ２４０の屈折率一致のために、光は屈折して媒体１ ２１６に入る。メンブレン２２４において、光は、２種類の液体２１２、２１６の屈折率が一致していないために、全内部反射する（２４６）。光は、屈折率が高い方（密度が濃い）の媒体から屈折率が低い方（密度が薄い）の媒体に通過するときに、屈折して表面に対する法線から離れて行く。２種類の媒体の界面における入射角が臨界角よりも大きい場合、光は全内部反射して、密度が濃い方の媒体に入る。消衰波２４６が、密度の薄い方の媒体において発生する。この消衰波は、指数的に減衰する強度を有し、メンブレン２２４の表面において蛍光体を励起させることができる（通例、励起光の「浸透」厚さは数十ｎｍ程度である）。励起された蛍光体２５０によって生成された光は、ガラス・カバースリップ２４０の下に位置付けられている対物レンズ２３６によって合焦することができ、撮像デバイス、例えば、ＣＣＤカメラまたは光検出器によって測定することができる。
【００３８】
[0058] 一実施形態では、消衰波２４６の面積がメンブレン２２４の面積よりも小さくなるように、光を発生する。他の実施形態では、消衰波２４６の面積がメンブレン２２４の面積と同じサイズとなるように、光を発生する。
【００３９】
[0059] 尚、実施形態によっては、種々の刺激薬を用いて、生きた細胞の表面を局所的に刺激するために、メンブレン内においてナノポア、ナノスリット、またはナノポア・アレイを用いることができることは認められよう。これらの刺激に対する応答は、本明細書において記載する消衰モード撮像を用いて、細胞メンブレン上の遠端において測定することができる。
【００４０】
[0060] 生体分子または生体材料（例えば、細胞）は、メンブレン２２４の上に直接位置付けて撮像することができる。あるいは、薄い緩衝層または中間層を、メンブレン２２４と撮像しようとする生体分子または生体材料との間に設けてもよい。例えば、有機ポリマー分子の薄膜を中間層として用いることもできる。
【００４１】
[0061] 図４は、本発明の実施形態による光学顕微鏡検査ツールの一例４００を示す。尚、顕微鏡検査ツール４００のコンポーネントおよびこれらコンポーネントの配置は、図４に示すものとは異なっていてもよいことは認められよう。顕微鏡検査ツール４００は、レーザ源４０２、ｘ−軸平行移動ステージ４０６、レンズ４１４、レンズ４１８、白色光源４２２、偏光ビーム・スプリッタ（ＰＢＳ）４２６、レンズ４３０、対物レンズ４３６、ダイクロイック・ミラー（ＤＭ）４６８、フィルタ４７２、ミラー４７６、レンズ４８０、およびＣＣＤのような検出器４８４を含む。第１流体４１２、第１流体４１２とは異なる屈折率を有する第２流体４１６、および固相メンブレン４２４を含む流体セルが、ガラス・カバースリップ４４０上に位置付けられている。浸入油が、ガラス・カバースリップ４４０と対物レンズ４３６との間に供給される。
【００４２】
[0062] 図示した顕微鏡検査ツール４００では、レーザ光または白色光を用いて、全内部反射蛍光顕微鏡検査を行うことができる。一実施形態では、レーザ光４１０がレーザ源４０２によって発生され、レンズ４１４、４１８によって誘導され整形される。レンズ４３０は、レーザ・ビームのサイズを縮小するように構成されている。尚、レンズ４１４、４１８がレーザ・ビームのサイズを縮小してもよいことは認められよう。ｘ−軸平行移動ステージ４０６を用いてｘ−軸に沿ってレーザ・ファイバ・カプラを移動させることによって、光をずらして光軸から外れるようにしてもよい。他の実施形態では、白色光源４２２によって白色光を発生する。更に他の実施形態では、白色光およびレーザ光双方を用いて、全内部反射蛍光顕微鏡検査を行うこともできる。ビーム・スプリッタ４２６は、レーザおよび／または白色光源４２２によって発生した光を、第１流体４１２の中にあるサンプル（例えば、生物分子（１つまたは複数）に向けて誘導するように構成されている。更に他の実施形態では、多数のレーザ波長を同時に、または一度に１つずつ用いて、単色または多色蛍光体を励起させることができる。
【００４３】
[0063] レンズ４３０およびダイクロイック・ミラー４６８を通過した後、発生した光は、全内部反射が生ずるのに十分な光がサンプルに誘導されるように、対物レンズ４３６によって絞られる。尚、対物レンズ４３６は、更に、レーザ・ビームのサイズも縮小できることは認められよう。レーザ・ビームのサイズは、直径が約０．５ｍｍ〜１ｍｍであるとよいことは認められよう。レンズ４１４、４１８、４３０、および／または４３６は、このビームがシリコン・メンブレンにおいて、直径が約５μｍからメンブレン４２４のほぼ面積までのスポット・サイズ(sot size)を形成するように、ビームを収束する。例えば、メンブレン４２４が５０×５０μｍ２である場合、５〜５０μｍのスポット・サイズを形成することができる。
【００４４】
[0064] 光４４２は、固相メンブレン４２４において、ガラス・カバースリップ４４０に向かって全内部反射し、第２流体４１６内に消衰場が発生する。固相メンブレン４２４の近傍に配置された蛍光体が、消衰波によって励起され、これによって蛍光体に蛍光光線(fluorescent light)を放出させる。この蛍光光線および反射光４５２は、次いで、ダイクロイック・ミラー４６８によってフィルタ４７２に向けて誘導させられる。ダイクロイック・ミラー４６８およびフィルタ４７２は、蛍光光線放出のみを通過させるように、光を濾波する。ミラー４７６は、蛍光光線を誘導して、レンズ４８０を通過させ、検出器４８４に向かわせる。
【００４５】
[0065] 検出器４８４は、北アイルランド、ベルファストに本社があるAndor Technology plc.(Andor)から入手可能なiXon BV887のような、ＥＭＣＣＤカメラとすることができる。他の検出器４８４の例には、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）および光倍増管（ＰＭＴ）が含まれる。検出器４８４は、Microsoft Windows系パーソナル・コンピュータ、およびSolisソフトウェア（これもAndorから入手可能）のような撮像ソフトウェアといった、しかるべき撮像システムに接続して、検出器４８４が発生したデータ信号を処理して、画像または一連の画像を生成することができる。データ信号を分析し、蛍光放出を検出し、試験対象の生体分子または生体材料の配列あるいは他の特性を判定するために、カスタム・ソフトウェアを用いることができる。
【００４６】
[0066] 尚、界面におけるＴＩＲ励起のエリアは、励起ビーム特性に依存することは認められよう。レーザ・ビームは、周知のレーザ・ビーム整形技法を用いて整形し、ＴＩＲモードにおけるレーザ照明の場を制御することができる。つまり、ビームのサイズは、所望に応じて、その直径を延長または縮小したり、細長くすることができる。
【００４７】
[0067] 図５は、顕微鏡検査ツール４００のような顕微鏡検査ツールを用いて発生した画像の例を示す。図５では、サンプル例のＴＩＲＦ照明５０４の視野が示されている。また、図５は、２種類の代表的流体、具体的には、７Ｍ ＣｓＣｌ（ｎ＝１．４１６）および８Ｍ Ｕｒｅａ（ｎ＝１．４１６）によって、顕微鏡検査ツールを用いて撮像された単体蛍光ＤＮＡ分子５０８も示す。しかしながら、本発明の実施形態にしたがって１つ１つの生体分子を撮像するためには、他の流体を用いてもよいことは認められよう。図５では、単体ＤＮＡ分子は、窒化シリコン・メンブレン上において、毎秒５フレームの画像取り込みで、２．５までの信号対バックグラウンド比(signal to background ratio)を用いて撮像された。
【００４８】
[0068] 図６から図１０Ｂは、メンブレン１２４がナノポア６００を含む本発明の一実施形態を示す。図６に示すように、ナノポア６００を有するメンブレン１２４を含む実施形態は、特に、ＤＮＡ転座を用いるＤＮＡ配列決定に適用可能である。尚、メンブレン１２４がナノポア６１０を含む実施形態は、ＤＮＡ転座を用いるＤＮＡ配列決定に限定されるのではないことは認められよう。例えば、本実施形態は、遺伝子型決定(genotyping)、生体分子撮像、および生体分子選別にも適用可能であると考えられる。他の例では、ナノポア６００を介して、タンパク質を撮像することもできる。
【００４９】
[0069] ＤＮＡ転座では、単一螺旋ＤＮＡ分子が、電気泳動的に駆動され、一列になってナノポア６００を通過する。尚、これらの実施形態では、流体セル１００が、更に、ＤＮＡ分子を電気泳動的に駆動してナノポア６００を通過させるために、流体１１２、１１６に印加される電位を発生するように構成されているエネルギ源に結合されている電極も含むことは認められよう。
【００５０】
[0070] 図６において、光学的マーカに結合(link)された検出対象の１つの生体分子は、オリゴヌクレオチドであり、交雑して(hybridize)ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、またはＧを表す配列コードになる。一実施形態では、特定的にＤＮＡ配列について報告する光学的マーカは蛍光マーカである。標識化手順の一例では、元のＤＮＡが１群のヌクレオチド（各塩基型が３〜１６ヌクレオチドの一意の配列と入れ替えられる）と入れ替えられる。次いで、光学的マーカに結合されたオリゴヌクレオチドは、ナノポア配列決定の間に配列を決定されるコード化核酸配列(coded nucleic acid sequence)からの交雑オリゴヌクレオチドの解決(unzipping)時に検出することができる。
【００５１】
[0071] 例えば、ＤＮＡ変換手順の１つでは、元のＤＮＡ配列における各塩基は、２つの二進コード・ユニット（０および１が、それぞれ、白丸(open circle)および黒丸(solid circle)で表される）。この場合、０および１は、各々が「Ｓ０」および「Ｓ１」である１０個のヌクレオチドの一意のＤＮＡ配列として定義される。単一螺旋変換ＤＮＡは、２つのコード・ユニットに対して相補的な２タイプの分子ビーコンと交雑され、最小の断面を表示する。例えば、これらのビーコンの１つは、その５’末端に赤色蛍光体、そしてその３’末端に消光剤(quencher)Ｑを含有することができ、他方のビーコンは、その５’末端に緑色蛍光体、そしてその３’末端に同じ消光分子を含有することができる。広域スペクトル消光分子Ｑは、双方の蛍光体を消光する。２つの異なる色の蛍光体が、２つのビーコン間で区別することを可能にする。他のＤＮＡ変換手順では、元のＤＮＡ配列における各塩基は、４つの一意のコード（配列）の内１つによって表され、次いでこれら４つの一意のコードは、対応する４色分子ビーコンと交雑させられる。双方の手順において、変換されたＤＮＡ配列は、ビーコンが互いに隣接する配置を含むので、隣接するビーコン上にある消光剤は、蛍光放出を消光し、個々のコード・ユニットがＤＮＡから順次除去されるまで（最初のビーコンを除く）、ＤＮＡは「暗い」ままになっている。本発明と共に用いることができる蛍光体の例には、ＴＭＲおよびＣｙ５が含まれる。用いることができる他のタイプの蛍光分子には、ＣＰＭ、Invitrogenからの一連の蛍光マーカ、ローダミン族、およびTexas Redがある。当業者には周知の他の信号分子も、本発明の範囲に該当するものとする。本発明では、米国特許第６，５２８，２５８号においてリストに纏められているものを含む、多数の他の蛍光体も用いることができ、この特許をここで引用したことにより、その内容全体が本願にも含まれるものとする。本発明と共に用いることができる消光分子には、Dabcyl、Dabsyl、メチル・レッド、およびElle Quencherが含まれる。当業者には知られている他の消光分子も本発明の範囲内に該当することとする。これは、隣接する分子および溶液内の自由ビーコンからの蛍光バックグラウンドを大きく減らし、その結果信号対バックグラウンド比が高くなる。
【００５２】
[0072] 再度図６を参照すると、蛍光タグ付きオリゴヌクレオチドは、変換されたＤＮＡに対して相補的であり、交雑されて(hybridize)ＤＮＡとなり、その分子は電気泳動的にメンブレン１２４内のナノポア６００を介して供給される。ナノポア６００は、添加されている蛍光体から発生する異なる色の光の閃光が検出されている間に、変換されたＤＮＡ分子から、オリゴヌクレオチドを１つずつ順次剥離させる。分子がナノポアに導入されると、ビーコンが１つずつ引きはがされる。新たなビーコンが除去される毎に、新たな蛍光体が発生する(unquench)。放出されたビーコンは自動的に閉ざされ、それ自体の蛍光を消光し、そのときに拡散してナノポアの近傍から離れる。最初のビーコンの放出時に直ちに、２番目のビーコンからの新たな蛍光体が発光する。
【００５３】
[0073] ＤＮＡ転座速度は、ＤＮＡ解決動力学によって規制され、塩基間のコントラストは、光学プローブ（またはビーコン）の使用によって得られる。ＤＮＡをナノポア６００に入れると、イオン電流が急激に遮断レベルまで低下する。ＤＮＡが他方の側から出ると、開放ポアの電流レベルが復元される。ＤＮＡ解決時間（例えば、１〜１０ｍｓ）を調節するには、しかるべき電圧を用いることができる。例えば、１０−ｂｐヘアピンでは、１２０ｍＶ電位により、約１０ｍｓの解決時間(unzipping time)が得られる。この時間は、電界強度によって、信号対バックグラウンド・レベルを最適化するように調整される。
【００５４】
[0074] このようにして、いずれの核酸の配列でも判定することができる。配列を決定すべき核酸のコード化配列への変換、コード化システム、およびナノポア配列決定の詳細な説明は、Soni and Meller (Soni G.V. and Meller A., Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores（固相ナノポアを用いた超高速ＤＮＡ配列決定に向けての進歩）、clinical Chemistry 53, 11(2007)、Meller et al., 2009（米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号）、およびMeller and Weng（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ ＵＳ２００９／０３４２９６号）において見いだすことができる。これらの参考文献をここで引用したことにより、その全体が本願にも含まれるものとする。尚、この方法はナノポア・アレイによって並列に用いることができることは認められよう。
【００５５】
[0075] 図７は、（ａ）において１ビット、そして（ｂ）において「２ビット」を用いてコード化したナノポア配列決定を示す。図７に示すように、本明細書において記載するデバイスおよび方法によって、１および２ビットＤＮＡ読み出しの同時電気および光学的検出を、高い信号／ノイズ比で、そして１回の蛍光体解明(resolution)で行うことが可能になることが示されている。
【００５６】
[0076] ２ビット・カラー・コード化は、図８に示す多色ＴＩＲＦ顕微鏡のような、多色光学顕微鏡検査ツールを用いて行うことができる。図８に示す実施形態では、波長が異なる２つのレーザ源８０２ａ、８０２ｂを個別にまたは同時に照明させて、異なる光学的バイオマーカの個別または同時励起のために、波長が異なる２つの消衰波を生成することができる。同様に、３色以上のコード・システムでは、波長が異なる３つまたは４つのレーザ源を個別にまたは同時に照明させて、異なる光学的バイオマーカの個別または同時励起のために、波長が異なる３つ以上の消衰波を生成することができる。
【００５７】
[0077] 図８に示すように、第１レーザ源８０２ａは第１レーザ・ビーム８１０ａを発生し、第２レーザ源８０２ｂは第２レーザ・ビーム８１０ｂを発生する。これらのレーザ・ビーム８１０ａ、８１０ｂは、レンズＬによって整形され対物レンズ８３６に誘導される。レンズＬは、レーザ源８０２ａ、８０２ｂによって発生したレーザ・ビーム８１０ａ、８１０ｂのサイズを縮小するように構成されている。一実施形態では、レーザ源８０２ａ、８０２ｂは、青色および赤色ダイオード・レーザ（４８８ｎｍおよび６４０ｎｍ）の組み合わせであり、サンプルを照明するために用いることができる。図４を参照して先に説明したように、光８０２ａ、８０２ｂは、メンブレン１２４において全内部反射し、消衰場が発生して、流体セルにおいて撮像しようとする生体分子に結合されている蛍光体を励起する。図８に示す実施形態では、メンブレン１２４は、先に説明したようなＤＮＡ転座を可能にするナノポア６００を含む。
【００５８】
[0078] 蛍光光線８５０は、次に、対物レンズ８３６を用いて集光され、ダイクロイック・ミラーＤＭおよびフィルタＦによって濾波され、撮像用のフレーム転送冷却式電子倍増電荷結合デバイス・カメラ、または光検出器のような、検出器８８４に誘導される。検出器８８４は、Microsoft Windows系パーソナル・コンピュータ、およびSolisソフトウェア（これもAndorから入手可能）のような撮像ソフトウェアといった、しかるべき撮像システムに接続して、検出器8８４が発生したデータ信号を処理して、画像または一連の画像を生成することができる。データ信号を分析し、蛍光放出を検出し、試験対象の生体分子（例えば、ＤＮＡ）の配列あるいは他の特性を判定するために、カスタム・ソフトウェアを用いることができる。
【００５９】
[0079] 図９は、ＤＮＡ解決のときに、図８の多色光学顕微鏡検査ツールのポア局限カウンタ・ヒストグラム(pore localization counter histogram)の例を示す。
【００６０】
[0080] 尚、ナノポア・アレイの光学的可視化は、本明細書において記載した実施形態を用いても行えることは認められよう。例えば、本明細書において記載する光学的可視化は、図１０Ａに示すような、多数のポアからの同時読み出し、および／または図１０Ｂに示すような多数のビットの同時読み出しに用いることができる。
【００６１】
[0081] また、本発明の実施形態は、例えば、ＳｉＮメンブレンのような固相材料を用いて、細胞毒性および生体適合性を研究するために、細胞および組織癒着(adhesion)を可視化するために用いることもできる。
【００６２】
[0082] また、本発明の実施形態は、ナノポア、ナノスリット、またはナノポア・アレイを介して界面を横切る媒体内において刺激によって細胞を局所的に励起させるため、そしてメンブレンを介して光学顕微鏡検査を用いて細胞の応答を測定するためにも用いることができる。新たな生体材料（ＳｉＮメンブレンのような生体材料）との接触または刺激物に対する応答は、細胞メンブレン上にあるバイオマーカの蛍光読み出しによって測定することができる。
【００６３】
[0083] 本発明の実施形態は、固相メンブレンにおいて製作されたナノポア内におけるその通行(transit)または一時的滞留(temporal lodging)の間、単分子解明によって、蛍光標識またはバイオポリマーが付けられた核酸を撮像するために用いることができる。
【００６４】
[0084] また、本発明の実施形態は、転座し一時的にナノポアに滞留するＤＮＡのような、バイオポリマー上に化学量論的に結合され、蛍光標識が付けられたタンパク質の化学量論を検出するために用いることもできる。
【００６５】
[0085] 本発明の実施形態は、多色検出に用いることができ、したがって、ＤＮＡ上に結合された生物学的に別個のタンパク質の空間的局限を検出するために用いることもできる。
【００６６】
[0086] 本発明の実施形態は、ナノポアおよび高スループット薬剤スクリーニングによるＤＮＡ配列決定に用いることができる。
【００６７】
[0087] 尚、ＴＩＲ照明の場のサイズは、入射レーザ・ビームのビーム径および／または形状を変化させることによって、用途に応じて変化させることができることは認められよう。
【００６８】
[0088] 一実施形態では、図１７に示すように、対物レンズ２３６ａを、トランス・チェンバ２０４の下ではなく、シス・チェンバ(cis chamber)２０８の上に配置することができ、対物レンズ２３６ａを撮像に用いることができる。この構成では、対物レンズ２３６ａではなくレンズ２３６ｂを用いて、レーザ・ビーム２４２をメンブレン２２４に合焦させることができる。図３を参照して先に説明したように、浸入油２３８およびガラス・カバースリップ２４０の屈折率一致のために、レーザからの光２４２（レンズ２３６ｂを通過した）は屈折して媒体１ ２１６に入る。メンブレン２２４において、光は、２種類の液体２１２、２１６の屈折率が一致しないことのために、全内部反射し（２４６）、消衰波２４６が、密度の低い方の媒体、即ち、媒体１ ２１６において発生する。消衰波２４６は、指数的に減衰する強度を有し、メンブレン２２４の表面（励起光の典型的な「浸透」深さは数十ｎｍである）において、蛍光体を励起することができる。励起された蛍光体によって生成された光は、シス・チェンバ２０８上に位置付けられた対物レンズ２３６ａによって合焦し、ＣＣＤカメラ４８４または光検出器によって測定することができる。
実施例
実施例１
サンプルの外形形状
[0089] 中央に厚さが２０〜５０ｎｍの自立窒化シリコン・ウィンドウ［５０μｍ×５０μｍ］を有するシリコン・チップ［５ｍｍ×５ｍｍ×３００μｍ］を、標準的なフォトリソグラフ法によって、シリコン・ウェア上のＬＰＣＶＤ被覆ＳｉＮ層上に作成した。ガラス・カバースリップ上にこれらのチップを実装し、図３に示したように、チップとガラス・カバースリップとの間に、厚さ２〜１０μｍのマイクロチャネルを形成するために、二部ＰＴＦＥ／ＣＴＦＥ流体セルを設計した。このマイクロチャネル、即ち、トランス・チェンバ２０４を、屈折率がより高い流体（７０％グリセロール［ｎ＝１．４２］）で満たし、シス・チェンバ２０８を、サンプル緩衝水溶液［ｎ＝１．３３］で満たした。
ＴＩＲＦの設定および光路図
[0090] 全内部反射［ＴＩＲ］顕微鏡検査を、図４に示したように設定した。レーザ・ビーム・サイズを０．７ｍｍに縮小し、市販の倒立顕微鏡（Olympus IX-71）の特別設計したバック・ポートに発射し、外部に取り付けられた２００ｍｍ焦点長のレンズを通じて、６０×１．４５ＮＡ油浸入ＴＩＲＦ対物レンズの背後焦点面において合焦させた。レーザ・ファイバ・カプラをＸ−軸に沿って動かすことによって、レーザ点を光軸から外れるようにずらした。光が窒化シリコン・メンブレンにおいてグリセロール−水界面に達するまで、光が油、ガラス・カバースリップ、および７０％グリセロールを通ってトランス・チェンバ内で屈折するように、ガラス［ｎ＝１．５２］、７０％グリセロール［ｎ＝１．４２］、およびサンプル緩衝剤［ｎ＝１．３３］の屈折率を選択した。この界面におけるＴＩＲモードの臨界角は、スネルの法則によって記述されるように、ガラス−水界面と同じである。
【００６９】
【数１】
【００７０】
ここで、ｎはガラス、グリセロール７０％、または水の屈折率を表し、θはそれぞれの界面における入射角である。視野の中心を、屈折率が高い流体層の厚さに応じて、光伝搬方向にずらす。蛍光放出は、外部レンズによって３倍に拡大され、同じ対物レンズによって収集され、しかるべき光学フィルタを通過した後に、市販のＥＭＣＣＤカメラ（Andor iXon BV887）上で撮像した。撮像は、販売業者が提供したAndor Solisソフトウェアによって、または特注で書かれたソフトウェアを用いて行われた。
サンプル不動化
[0091] ５’末端にビオチン共役があり、５’末端から２０番目の位置にアミン修飾チミン塩基があるＤＮＡ分子［５７ｂｐ］をIDT Techから購入した。ＤＮＡ分子に、販売業者のプロトコルを用いて、ATTO647N染料分子［ＡＴＴＯ−ｔｅｃｈ］で標識を付けた。ストレプトアビジン・ビオチン(streptavidin-biotin)化学薬品によって、窒化シリコン上でＤＮＡ分子を不動化した。新たに用意したピラニア溶液(Piranha solution)において表面を浄化し（硫酸および過酸化水素の７：３ｖ／ｖ溶液において１５分）、次いでＤＩ水において徹底的に洗浄した。０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ−ビオチンにおいて一晩表面を培養し、結合緩衝剤[１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＬ、ｐＨ８．５]で洗浄し、ストレプタビディンにおいて３０〜６０分培養し、結合緩衝剤において洗浄し、次いでビオチンで標識を付けたＤＮＡで１５〜３０分培養した。次いで、流体セルに表面を装填した。７０％グリセロールを、ガラス・カバースリップとシリコン・チップとの間にあるトランス・マイクロチャネルに充填し、結合緩衝剤をシス・チェンバに充填した。次いで、ＴＩＲＦＭによって窒化シリコン界面において表面を撮像した。
結果
[0092] 図４に示したように、窒化シリコン・メンブレン（例えば、サイズが２０×４０μｍ２、厚さが２０ｎｍ）を、ガラス・カバースリップ上に装填した。トランス・チェンバおよびシス・チェンバにおける２種類の流体を、それぞれ、グリセロール７０％（ｖ／ｖ）（ｎ＝１．４２）および水（ｎ＝１．３３）に選択した。
【００７１】
[0093] 励起レーザ・ビームを、図５に示したように、メンブレンの寸法よりも小さい消衰照明の場を形成するように整形した。ビーム径を０．７ｍｍに縮小することによって、スポット・サイズがＳｉＮメンブレン・サイズよりも小さくなった。
【００７２】
[0094] 対物レンズ（ｎ＝１．５５）に入射した光は伝搬して、浸入油（ｎ＝１．５２）、ガラス・カバースリップ（ｎ＝１．５５）、液体２（７０％グリセロール）（ｎ＝１．４２）を通過し、界面を横切り、最後に水（ｎ＝１．３３）を通過した。光は、グリセロールを水から分離する界面において、全内部反射を発生した。
【００７３】
[0095] 励起場の形状を較正するために、メンブレンのシス側に２０ｎｍＴＭＲビーズを吸着させ、ＴＩＲＦモードで撮像した。これらのＴＭＲビーズをＸ軸およびＹ軸に沿って移動させ、撮像光学素子の倍率を用いることによって、消衰照明の場が約１０×２０μｍ２までであると計算した。
【００７４】
[0096] この例では、３’末端においてビオチン化され、５’末端においてＡＴＴＯ６４７Ｎ標識が付けられた１つ１つのＤＮＡ分子が、ビオチン−ストレプトアビジン化学薬品を用いて、窒化シリコン表面のシス側で不動化された（即ち、方法および材料）。
実施例２
ＴＩＲＦの設定
[0097] 実験において、ナノポア６００を有する自立ＳｉＮメンブレン（２０×２０μｍ２）１１２４を内蔵するシリコン・チップ１１２８を、界面として用いた。シリコン・チップ１１２８をガラス・カバースリップ１１４０上に装填し、ガラス・カバースリップ１１４０を、特注で製作したクロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥポリマー）流体セル１１３８上に装填し、図１１に示したような、微小流体トランス・チェンバ１１００を作成した。流体セル１１３８は、シリコン・チップ１１２８を保持するインサート１１３８ａと、流体チェンバを形成する外側セル１１３８ｂとを含む。高速硬化ポリジメトリシロキサン（ＰＤＭＳ：polydimethlysiloxane）を用いて、シリコン・チップ１１２８をＣＴＦＥインサート１１３８ａに接合し、ガラス・カバースリップ１１４０を外側セル１１３８ｂに接合した。インサート１１３８ａを有する流体チェンバはシス・チェンバであり、シリコン・チップ１１２８とガラス・カバースリップ１１４０との間の空間がトランス・チェンバとなる。流入−流出フロー・チャネルを用いて、トランス・チェンバに、屈折率緩衝剤１１１２を充填した。電気的測定のために、フロー・チャネルの側面開口内にトランス電極１１４０ａを設け、インサート（Ａｇ／ＡｇＣｌ双方）１１１６において緩衝剤の中にシス電極１１４０ｂを埋没させた。ナノポア６００を用いて、図１１Ａに示すように、光学可視化および測定のために、流体セル１１００を倒立顕微鏡１１３６に対して一直線上に揃えた。
【００７５】
[0098] シス・チェンバ ｎｗ≒１．３３（水緩衝剤、１Ｍ ＫＣｌおよび１０ｍＭトリス、ｐＨ＝８．５）およびトランス・チェンバ（高い屈折率ｎＣｓを有する水性緩衝溶液） において用いた緩衝剤の屈折率は、ガラスの屈折率ｎｇ＝１．５よりも小さかった（ｎｗ＜ｎＣｓ＜ｎｇ）。即ち、７Ｍ ＣｓＣｌおよび１０ｍＭトリス、ｐＨ＝８．５（「Ｃｓ７Ｍ」、ｎ＝１．４１）を含有する塩緩衝溶液を、シス・チェンバにおける緩衝剤として用いた。
【００７６】
[0099] ガラス・カバースリップ側から、ガラス／トランス・チェンバ界面の反射臨界角より小さいがトランス／シス臨界角よりは多少大きな角度θｇで、平行光ビームを導入し、図１１Ｂに示すように、ＳｉＮメンブレンにおいてＴＩＲ励起を生じさせた。高開口数（ＮＡ）の対物レンズ（Olympus 60X/1.45）を用いて、入射レーザ・ビームをその背後焦点面（ｄ）における軸外れ点(off axis point)に合焦させることによって、ＴＩＲを行い、入射角θｇを制御した。ＴＩＲ励起領域の面内位置を、距離ｄ＝ｈｔａｎ（θＣｓ）だけ変位させる。ここで、ｈはトランス・チェンバの高さである。
【００７７】
[00100] 焦点距離が長く色収差を補正した二重レンズ（２００ｍｍ）を用いて、ＳｉＮメンブレン上において照明される面積が約１０×２０μｍ２となるように、入射するレーザ・ビームの幅を整形した。単一モード偏光保存光ファイバ(single-mode polarization-preserving optical fiber)を介して、６４０ｎｍレーザ（２０ｍＷ）（iFlex2000, Point-Source, Hamble, UK)をシステムに結合し、直径が０．７ｍｍの平行ガウス・レーザ・ビームを生成した。この高品質のビームによって、対物レンズの入射面にぴったり合焦したスポットを確保し、こうして望ましくない散乱を最小に抑える。普通の手順を用いて、メンブレン表面のシス側に、ストレプトアビジンを被覆した。短いビオチン化ＤＮＡオリゴに、各々、１つのＡＴＴＯ６４６Ｎ蛍光体で標識を付け、メンブレン表面上で不動化し、最大ＥＭ利得および１０ｍｓ積算(integration)で動作する電子倍増ＣＣＤカメラ上に蛍光光線を投射することによって撮像した。電子倍増電荷結合デバイス（ＥＭＣＣＤ）カメラ（Andor, iXon DU-860）を用いて、メンブレン表面からの蛍光画像を記録した。図１２は、本発明の一実施形態にしたがって、ＴＩＲＦの下で撮像されたメンブレン表面上で不動化された１つ１つの分子の３つの典型的な画像を表示する。図１２に示すように、１つ１つの蛍光体が、高いコントラストで解明されており、これ以上の画像処理を必要としない。
【００７８】
[00101] 入射角が大きくなると、ＴＩＲの臨界角のために、メンブレンのシス側から観察されていたレーザ光の突然の消失、（２）顕微鏡の接眼レンズを用いて対物レンズの背後焦点面において可視化された、変位ＴＩＲレーザ・ビームの出現、そして（３）バックグラウンド強度の急減による、信号分子撮像のためのバックグラウンドへの信号（信号対バックグラウンド比）の増大が生ずる。２倍以上の信号対バックグラウンドの増加が、エピ照明(epi-illumination)（サンプルの一方側からの照明および検出）によって、ＳｉＮメンブレン上で不動化された１つ１つの蛍光体の画像において達成された。
【００７９】
光学および電気信号の同期検出
[00102] 光学信号および電気信号の同期検出のために、ハードウェア（例えば、Microsoft WindowsまたはLinux互換パーソナル・コンピュータ）とLABVIEWソフトウェアとの組み合わせを設計した。図１３は、取り込みハードウェアを模式的に示す。Axopath200B増幅器１３８６（Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA）を、Ag/AgCl電極にヘッドステージ１３８８を介して接続し、ナノポアを横切るイオン電流信号を増幅する。外部四極バターワース・フィルタ１３９０を用いて、このイオン電流信号に５０ＫＨｚでロー・パス・フィルタをかけ、画像取り込みボード１３９４（Andor iXon取り込みボード）を介してＣＣＤカメラから画像データを受け取った 同じＰＣ内にある多機能データ取り込みボード１３９２に入力する。多機能データ取り込みＤＡＱボード１３９２（National Instruments, PCI-6154）を用いて、１６ビット・アナログ／デジタル変換分解能で、イオン電流信号を取り込んだ。ＥＭ−ＣＣＤカメラ１３８４からの「発火」パルス（各露出の開始を印すＴＴＬパルス）が、イオン電流の取り込みをトリガし、カウンタ・ボード（National Instruments, PCI-6602）上において高精度のタイム・スタンプを生成するために用いられた。カウンタ・ボードは、クロック・レートが２５０ＫＨｚのＲＴＳＩバスを用いて、内部でＤＡＱボードと同期を取られていた。したがって、組み合わされたデータ・ストリームは、イオン電流のサンプリングと同期を取られているＣＣＤフレームの各々の開始時における一意のタイム・スタンプを含んでいた。転座イベントが、イオン電流の落下によって検出されたとき、ソフトウェア１３９６は、カウンタ情報の中で対応するフレーム番号を検索し、この番号に対応する実際の画像をセーブした。カメラ・フレーム・レートは、約１ＫＨｚ（発火パルス・レート）に設定した。
【００８０】
[00103] 図１４Ａから図１４Ｃは、電気信号および光信号の同期を示す。長さがミリ秒単位の電気パルスを、ファンクション・ジェネレータ(function generator)から発生し、増幅器のヘッドステージに電気的に結合した。これらの電流パルスは、ナノポア信号と形状および時間メモリが同様である。同じ信号を用いて励起レーザをＯＮ／ＯＦＦ変調し、光および電気パルスの同期源を設けた。同期検査のために、蛍光ビーズをメンブレン上で不動化し、前述のようなカメラを用いて撮像した。
【００８１】
[00104] ２つの様式を組み合わせて、ナノポアを介したＤＮＡ転座の間に同期光および電気信号を測定した。最初に、メンブレン上においてポアの位置を特定した。ポアからの蛍光信号は、位置が固定であり、電気信号との同期時(in-sync)に発光(light up)する。つまり、ポアの位置に対応する画素は、ときの経過と共に、最も高い傾向の強度を蓄積し、画像の総和によって、ＣＣＤ上のポア位置に対応するピークを明らかにする。一旦ポア位置が特定されたなら、このポアに対応する画素からの強度を、更なるデータ分析のために用いた。
実施例３
[00105] ４ｎｍポアを介して転座する蛍光標識付きｄｓＮＤＡを検出するために、同時光学および電気的測定を行った。この実験におけるサンプル濃度は、０．１ｎＭ〜０．２ｎＭであった。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ポアの形状、および約４ｎｍのポア例のＴＥＭ画像を模式的に示す。４２１ｂｐ断片（ＤＮＡ−Ａ１６４７）に、Alexa647蛍光体で標識を付け、重合連鎖反応（ＰＣＲ）反応、それに続くアミン反応染料との共役の間、低濃度のアミノ修飾チミン塩基の合体によって用いられる。
【００８２】
[00106] 図１６Ａおよび図１６Ｂに示すように、９つの代表的イオン電流およびそれらの対応する蛍光強度イベントが、ＤＮＡ−Ａ１６４７分子をポアのシス側に添加した後に示される（２００ｍＶのバイアスによって４ｎＡの開放ポア電流が発生し、最大ＥＭ利得で１ｍｓの蓄積毎に画像を取り込んだ）。ナノポアの位置を、前述のように判定した。図示する蛍光強度は、ナノポアを中心に配されたＣＣＤ上の３×３画素エリアから抽出されたものである。尚、電流および光データの同期取り込みが、イベント毎に内部バックグラウンド閾値を定めるのに役立つことは認められよう。電気的イベントの約５ｍｓ前のポア位置における強度を、そのイベントのバックグラウンド値として用いた。ポア位置における強度が少なくとも１標準偏差だけその対応するバックグラウンドよりも高かった光学イベントのみが分析において含められ、そのイベントが有意なバックグラウンド閾値を有し、疑似信号を排除することを確保する。
【００８３】
[00107] 尚、以上の詳細な説明および以下の例は、例示に過ぎず、本発明の範囲に対する限定と見なしてはならないことは言うまでもない。開示した実施形態に対する種々の変更や修正も、当業者には明白であり、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。更に、特定した全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書において引用したことにより、例えば、本発明と関連付けて用いることができるそのような刊行物に記載されている方法を記載および開示するために、その内容が本願にも明示的に含まれるものとする。これらの刊行物は、本願の出願日よりも前に、それらの開示のためにのみ提供されたものである。これに関していかなるものも、先願発明のためであってもまたは他のいかなる理由であっても、本発明者がこのような開示よりも先行する資格を本発明者が有さないことの承認として解釈してはならない。日付についてのあらゆる言明またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していかなる承認をも構成することはない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学顕微鏡検査ツール用流体セルであって、
第１側と、第２の対向する側とを有する固相メンブレンと、
前記メンブレンの第１側に配置された第１流体チェンバであって、第１屈折率を有する第１流体を収容する、第１流体チェンバと、
前記メンブレンの第２側に配置された第２流体チェンバであって、第２屈折率を有する第２流体を収容し、前記第１屈折率が前記第２屈折率よりも高い、第２流体チェンバと、
を備えている、流体セル。
【請求項２】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、窒化シリコンで構成されている、流体セル。
【請求項３】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、単層誘電体材料で構成されている、流体セル。
【請求項４】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、多層誘電体材料で構成されている、流体セル。
【請求項５】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に堆積された窒化シリコン層で構成されている、流体セル。
【請求項６】
請求項５記載の流体セルにおいて、前記窒化シリコン層の厚さが、５から６０ｎｍである、流体セル。
【請求項７】
請求項５記載の流体セルにおいて、前記シリコン・ウェハがウィンドウを備えており、前記窒化シリコン層が前記ウィンドウを覆う、流体セル。
【請求項８】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記第１流体が、水性緩衝溶液、水、または尿素で構成されている、流体セル。
【請求項９】
請求項１記の流体セルにおいて、前記第２流体が、細胞流体(cellular fluid)、細胞メンブレン、グリセロール、およびＣｓＣｌから成る１群から選択される、流体セル。
【請求項１０】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記第１流体および前記第２流体が、水性緩衝剤である、流体セル。
【請求項１１】
請求項１記載の流体セルにおいて、光学的バイオマーカに結合された生体分子が、前記メンブレンの第２側に供給される、流体セル。
【請求項１２】
請求項１１記載の流体セルにおいて、前記生体分子が、ＤＮＡ分子で構成されている、流体セル。
【請求項１３】
請求項１１記載の流体セルにおいて、前記生体分子が、ＲＮＡ分子で構成されている、流体セル。
【請求項１４】
請求項１１記載の流体セルにおいて、前記生体分子が、タンパク質分子で構成されている、流体セル。
【請求項１５】
請求項１１記載の流体セルにおいて、前記光学的バイオマーカが、励起可能な蛍光体で構成されている、流体セル。
【請求項１６】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記第１流体チェンバが、マイクロチャネルである、流体セル。
【請求項１７】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノポアを備えている、流体セル。
【請求項１８】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、複数のナノポアを備えている、流体セル。
【請求項１９】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノスリットを備えている、流体セル。
【請求項２０】
請求項１７記載の流体セルであって、更に、前記ナノポアを通して撮像しようとする生体分子を駆動するために、前記第１流体および前記第２流体の両端間に電位を印加するように構成されている第１および第２電極を備えている、流体セル。
【請求項２１】
１つ１つのＤＮＡ分子を撮像するための光学顕微鏡検査ツールであって、
シリコン・ウェハのウィンドウを覆う固相メンブレンと、前記固相メンブレンの一方側にある第１流体チェンバと、前記第１流体チェンバの中にあり第１屈折率を有する第１流体と、前記メンブレンの他方側にある第２流体チェンバと、前記第２流体チェンバの中にあり、前記第１屈折率よりも低い第２屈折率を有する第２流体とを備えている流体セルと、
ガラス・カバースリップであって、このガラス・カバースリップが前記第１流体チェンバの底面を形成するように、前記流体セルが実装されている、カバースリップと、
対物レンズと、
前記ＴＩＲＦ対物レンズと前記ガラス・カバースリップとの間にある浸入油と、
前記対物レンズにおいて光を誘導するように構成されている光源であって、前記固相メンブレンが覆うウィンドウよりも小さい消衰照明の場を発生するように、前記対物レンズが前記光を合焦するように構成されている、光源と、
前記固相メンブレンにおいて１つ１つのＤＮＡ分子によって放出される光を検出する撮像検出器と、
を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２２】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、窒化シリコンで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２３】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、酸化シリコンで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２４】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に堆積された窒化シリコン層で構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２５】
請求項２４記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記窒化シリコン層の厚さが、５〜５０ｎｍである、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２６】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記第１流体が、水性緩衝溶液または水を含む、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２７】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記第２流体が、 細胞流体(cellular fluid)、細胞メンブレン、およびグリセロールから成る１群から選択される、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２８】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記光源が、励起レーザ・ビームで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２９】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、ビオチン−ストレプトアビジン化学薬品が、１つ１つのＤＮＡ分子を前記固相メンブレン上に不動化するために用いられる、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３０】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記１つ１つのＤＮＡ分子が、光学的バイオマーカに結合されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３１】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノポアを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３２】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、複数のナノポアを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３３】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、 前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノスリットを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３４】
請求項３１記載の光学顕微鏡検査ツールであって、更に、前記ナノポアを通して撮像しようとする生体分子を駆動するために、前記第１流体および前記第２流体の両端間に電位を印加するように構成されている第１および第２電極を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３５】
１つ１つの生体分子を撮像するための光学顕微鏡検査ツールであって、
異なる屈折率を有する第１流体と第２流体との間にある固相メンブレンにおいて消衰照明の場を発生する手段と、
前記固相メンブレンにおいて１つ１つの生体分子に結合されている光検出器によって放出される光を検出する手段と、
を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３６】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記１つ１つの生体分子がＤＮＡ分子で構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３７】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンにおいて消衰照明の場を発生する手段が、励起レーザと対物レンズとを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３８】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に体積された窒化シリコン層で構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３９】
請求項３８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記窒化シリコン層の厚さが、５〜５０ｎｍである、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４０】
請求項３８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記シリコン・ウェハが、ウィンドウと、このウィンドウを覆う前記窒化シリコン層とを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４１】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールであって、更に、前記１つ１つの生体分子を前記固相メンブレン上に不動化する手段を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４２】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記消衰照明の場が、前記固相メンブレンの寸法よりも小さい、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４３】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールであって、更に、前記固相メンブレンにおけるナノポアを介して、前記１つ１つの生体分子の少なくとも１つを転座させる手段を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４４】
単体の生体分子を撮像する方法であって、
異なる屈折率を有する第１流体と第２流体との間にある固相メンブレンにおいて、消衰照明の場を発生するステップと、
前記固相メンブレンにおいて、１つ１つの生体分子に結合されている光検出器によって放出される光を検出するステップと、
を備えている、方法。
【請求項４５】
請求項４４記載の方法において、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に体積された窒化シリコン層で構成されている、方法。
【請求項４６】
請求項４５記載の方法において、前記窒化シリコンの厚さが、５〜５０ｎｍである、方法。
【請求項４７】
請求項４５記載の方法において、前記シリコン・ウェハが、ウィンドウと、このウィンドウを覆う前記窒化シリコン層とを備えている、方法。
【請求項４８】
請求項４４記載の方法であって、更に、前記１つ１つの生体分子を前記固相メンブレン上に不動化するステップを備えている、方法。
【請求項４９】
請求項４４記載の方法において、前記消衰照明の場が、前記固相メンブレンの寸法よりも小さい、方法。
【請求項５０】
請求項４４記載の方法であって、更に、前記固相メンブレンにおけるナノポアを介して、前記１つ１つの生体分子の少なくとも１つを転座させる手段を備えている、方法。
【請求項５１】
請求項５０記載の方法において、前記少なくとも１つの単体生体分子がＤＮＡ分子であり、更に、
前記ＤＮＡ分子をＤＤＰに変換するステップと、
前記ＤＤＰを、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、またはＧを表す配列コードに、前記光検出器によって交雑するステップと、
前記ナノポアを介して、前記ヌクレオチドの少なくとも１つを電気泳動的に供給するステップと、
を備えている、方法。
【請求項５２】
単体ＤＮＡ分子を撮像する方法であって、
光学顕微鏡検査ツールの対物レンズに光を誘導するステップと、
第１流体を通過するように前記光を誘導するステップと、
第２流体において消衰照明の場を発生するために、窒化シリコン・メンブレンにおいて前記光を反射させるステップと、
前記消衰照明の場によって励起され前記単体ＤＮＡ分子に結合されている光学的バイオマーカによって放出される光を、撮像検出器に誘導するステップと、
を備えている、方法。
【請求項５３】
請求項５２記載の方法において、前記第１流体が、前記第２流体の屈折率よりも高い屈折率を有する、方法。
【請求項５４】
請求項５２記載の方法において、前記消衰照明の場が、前記第２流体内において発生される、方法。
【請求項５５】
請求項５２記載の方法において、前記単体ＤＮＡ分子が、前記窒化シリコン・メンブレン上に不動化される、方法。
【請求項５６】
請求項５５記載の方法において、前記単体ＤＮＡ分子が、前記第２流体内において、前記窒化シリコン・メンブレン上に不動化される、方法。
【請求項５７】
請求項５２記載の方法であって、更に、前記窒化シリコン・メンブレンの中にあるナノポアを介して、前記単体ＤＮＡ分子を転座させるステップを備えている、方法。
【請求項５８】
光学顕微鏡検査ツールであって、
シリコン・ウェハのウィンドウを覆う固相メンブレンと、前記固相メンブレンの一方側にある第１流体チェンバと、前記第１流体チェンバの中にあり第１屈折率を有する第１流体と、前記メンブレンの他方側にある第２流体チェンバと、前記第２流体チェンバの中にあり、前記第１屈折率よりも低い第２屈折率を有する第２流体とを備えている流体セルと、
ガラス・カバースリップであって、このガラス・カバースリップが前記第１流体チェンバの底面を形成するように、前記流体セルが実装されている、カバースリップと、
合焦レンズと、
前記合焦レンズにおいて光を誘導するように構成されている光源であって、前記レンズが、前記固相メンブレンが覆うウィンドウよりも小さい消衰照明の場を発生するように、前記レンズが前記光を合焦するように構成されている、光源と、
前記第２流体チェンバの上方に位置付けられており、前記光学的バイオマーカによって放出される光を前記固相メンブレンにおいて合焦するように構成されている、対物レンズと、
前記光学的バイオマーカによって放出される光を検出する撮像検出器と、
を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項５９】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、窒化シリコンで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６０】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、酸化シリコンで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６１】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に堆積された窒化シリコン層で構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６２】
請求項６１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記窒化シリコン層の厚さが、５〜５０ｎｍである、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６３】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記第１流体が、水性緩衝溶液または水を含む、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６４】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記第２流体が、細胞流体(cellular fluid)、細胞メンブレン、およびグリセロールから成る１群から選択される、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６５】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記光源が、励起レーザ・ビームで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６６】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、ビオチン−ストレプトアビジン化学薬品が、前記光学的バイオマーカに結合されている１つ１つのＤＮＡ分子を前記固相メンブレン上に不動化するために用いられる、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６７】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記光学的バイオマーカが、単体のＤＮＡ分子に結合されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６８】
請求項５８記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノポアを備えている、流体セル。
【請求項６９】
請求項５８記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、複数のナノポアを備えている、流体セル。
【請求項７０】
請求項５８記載の流体セルにおいて、 前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノスリットを備えている、流体セル。
【請求項７１】
請求項６８記載の流体セルであって、更に、前記ナノポアを通して撮像しようとする、前記光学的バイオマーカに結合されている生体分子を駆動するために、前記第１流体および前記第２流体の両端間に電位を印加するように構成されている第１および第２電極を備えている、流体セル。
【請求項１】
光学顕微鏡検査ツール用流体セルであって、
第１側と、第２の対向する側とを有する固相メンブレンと、
前記メンブレンの第１側に配置された第１流体チェンバであって、第１屈折率を有する第１流体を収容する、第１流体チェンバと、
前記メンブレンの第２側に配置された第２流体チェンバであって、第２屈折率を有する第２流体を収容し、前記第１屈折率が前記第２屈折率よりも高い、第２流体チェンバと、
を備えている、流体セル。
【請求項２】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、窒化シリコンで構成されている、流体セル。
【請求項３】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、単層誘電体材料で構成されている、流体セル。
【請求項４】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、多層誘電体材料で構成されている、流体セル。
【請求項５】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に堆積された窒化シリコン層で構成されている、流体セル。
【請求項６】
請求項５記載の流体セルにおいて、前記窒化シリコン層の厚さが、５から６０ｎｍである、流体セル。
【請求項７】
請求項５記載の流体セルにおいて、前記シリコン・ウェハがウィンドウを備えており、前記窒化シリコン層が前記ウィンドウを覆う、流体セル。
【請求項８】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記第１流体が、水性緩衝溶液、水、または尿素で構成されている、流体セル。
【請求項９】
請求項１記の流体セルにおいて、前記第２流体が、細胞流体(cellular fluid)、細胞メンブレン、グリセロール、およびＣｓＣｌから成る１群から選択される、流体セル。
【請求項１０】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記第１流体および前記第２流体が、水性緩衝剤である、流体セル。
【請求項１１】
請求項１記載の流体セルにおいて、光学的バイオマーカに結合された生体分子が、前記メンブレンの第２側に供給される、流体セル。
【請求項１２】
請求項１１記載の流体セルにおいて、前記生体分子が、ＤＮＡ分子で構成されている、流体セル。
【請求項１３】
請求項１１記載の流体セルにおいて、前記生体分子が、ＲＮＡ分子で構成されている、流体セル。
【請求項１４】
請求項１１記載の流体セルにおいて、前記生体分子が、タンパク質分子で構成されている、流体セル。
【請求項１５】
請求項１１記載の流体セルにおいて、前記光学的バイオマーカが、励起可能な蛍光体で構成されている、流体セル。
【請求項１６】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記第１流体チェンバが、マイクロチャネルである、流体セル。
【請求項１７】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノポアを備えている、流体セル。
【請求項１８】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、複数のナノポアを備えている、流体セル。
【請求項１９】
請求項１記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノスリットを備えている、流体セル。
【請求項２０】
請求項１７記載の流体セルであって、更に、前記ナノポアを通して撮像しようとする生体分子を駆動するために、前記第１流体および前記第２流体の両端間に電位を印加するように構成されている第１および第２電極を備えている、流体セル。
【請求項２１】
１つ１つのＤＮＡ分子を撮像するための光学顕微鏡検査ツールであって、
シリコン・ウェハのウィンドウを覆う固相メンブレンと、前記固相メンブレンの一方側にある第１流体チェンバと、前記第１流体チェンバの中にあり第１屈折率を有する第１流体と、前記メンブレンの他方側にある第２流体チェンバと、前記第２流体チェンバの中にあり、前記第１屈折率よりも低い第２屈折率を有する第２流体とを備えている流体セルと、
ガラス・カバースリップであって、このガラス・カバースリップが前記第１流体チェンバの底面を形成するように、前記流体セルが実装されている、カバースリップと、
対物レンズと、
前記ＴＩＲＦ対物レンズと前記ガラス・カバースリップとの間にある浸入油と、
前記対物レンズにおいて光を誘導するように構成されている光源であって、前記固相メンブレンが覆うウィンドウよりも小さい消衰照明の場を発生するように、前記対物レンズが前記光を合焦するように構成されている、光源と、
前記固相メンブレンにおいて１つ１つのＤＮＡ分子によって放出される光を検出する撮像検出器と、
を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２２】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、窒化シリコンで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２３】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、酸化シリコンで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２４】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に堆積された窒化シリコン層で構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２５】
請求項２４記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記窒化シリコン層の厚さが、５〜５０ｎｍである、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２６】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記第１流体が、水性緩衝溶液または水を含む、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２７】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記第２流体が、 細胞流体(cellular fluid)、細胞メンブレン、およびグリセロールから成る１群から選択される、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２８】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記光源が、励起レーザ・ビームで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項２９】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、ビオチン−ストレプトアビジン化学薬品が、１つ１つのＤＮＡ分子を前記固相メンブレン上に不動化するために用いられる、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３０】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記１つ１つのＤＮＡ分子が、光学的バイオマーカに結合されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３１】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノポアを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３２】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、複数のナノポアを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３３】
請求項２１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、 前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノスリットを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３４】
請求項３１記載の光学顕微鏡検査ツールであって、更に、前記ナノポアを通して撮像しようとする生体分子を駆動するために、前記第１流体および前記第２流体の両端間に電位を印加するように構成されている第１および第２電極を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３５】
１つ１つの生体分子を撮像するための光学顕微鏡検査ツールであって、
異なる屈折率を有する第１流体と第２流体との間にある固相メンブレンにおいて消衰照明の場を発生する手段と、
前記固相メンブレンにおいて１つ１つの生体分子に結合されている光検出器によって放出される光を検出する手段と、
を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３６】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記１つ１つの生体分子がＤＮＡ分子で構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３７】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンにおいて消衰照明の場を発生する手段が、励起レーザと対物レンズとを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３８】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に体積された窒化シリコン層で構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項３９】
請求項３８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記窒化シリコン層の厚さが、５〜５０ｎｍである、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４０】
請求項３８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記シリコン・ウェハが、ウィンドウと、このウィンドウを覆う前記窒化シリコン層とを備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４１】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールであって、更に、前記１つ１つの生体分子を前記固相メンブレン上に不動化する手段を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４２】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記消衰照明の場が、前記固相メンブレンの寸法よりも小さい、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４３】
請求項３５記載の光学顕微鏡検査ツールであって、更に、前記固相メンブレンにおけるナノポアを介して、前記１つ１つの生体分子の少なくとも１つを転座させる手段を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項４４】
単体の生体分子を撮像する方法であって、
異なる屈折率を有する第１流体と第２流体との間にある固相メンブレンにおいて、消衰照明の場を発生するステップと、
前記固相メンブレンにおいて、１つ１つの生体分子に結合されている光検出器によって放出される光を検出するステップと、
を備えている、方法。
【請求項４５】
請求項４４記載の方法において、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に体積された窒化シリコン層で構成されている、方法。
【請求項４６】
請求項４５記載の方法において、前記窒化シリコンの厚さが、５〜５０ｎｍである、方法。
【請求項４７】
請求項４５記載の方法において、前記シリコン・ウェハが、ウィンドウと、このウィンドウを覆う前記窒化シリコン層とを備えている、方法。
【請求項４８】
請求項４４記載の方法であって、更に、前記１つ１つの生体分子を前記固相メンブレン上に不動化するステップを備えている、方法。
【請求項４９】
請求項４４記載の方法において、前記消衰照明の場が、前記固相メンブレンの寸法よりも小さい、方法。
【請求項５０】
請求項４４記載の方法であって、更に、前記固相メンブレンにおけるナノポアを介して、前記１つ１つの生体分子の少なくとも１つを転座させる手段を備えている、方法。
【請求項５１】
請求項５０記載の方法において、前記少なくとも１つの単体生体分子がＤＮＡ分子であり、更に、
前記ＤＮＡ分子をＤＤＰに変換するステップと、
前記ＤＤＰを、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、またはＧを表す配列コードに、前記光検出器によって交雑するステップと、
前記ナノポアを介して、前記ヌクレオチドの少なくとも１つを電気泳動的に供給するステップと、
を備えている、方法。
【請求項５２】
単体ＤＮＡ分子を撮像する方法であって、
光学顕微鏡検査ツールの対物レンズに光を誘導するステップと、
第１流体を通過するように前記光を誘導するステップと、
第２流体において消衰照明の場を発生するために、窒化シリコン・メンブレンにおいて前記光を反射させるステップと、
前記消衰照明の場によって励起され前記単体ＤＮＡ分子に結合されている光学的バイオマーカによって放出される光を、撮像検出器に誘導するステップと、
を備えている、方法。
【請求項５３】
請求項５２記載の方法において、前記第１流体が、前記第２流体の屈折率よりも高い屈折率を有する、方法。
【請求項５４】
請求項５２記載の方法において、前記消衰照明の場が、前記第２流体内において発生される、方法。
【請求項５５】
請求項５２記載の方法において、前記単体ＤＮＡ分子が、前記窒化シリコン・メンブレン上に不動化される、方法。
【請求項５６】
請求項５５記載の方法において、前記単体ＤＮＡ分子が、前記第２流体内において、前記窒化シリコン・メンブレン上に不動化される、方法。
【請求項５７】
請求項５２記載の方法であって、更に、前記窒化シリコン・メンブレンの中にあるナノポアを介して、前記単体ＤＮＡ分子を転座させるステップを備えている、方法。
【請求項５８】
光学顕微鏡検査ツールであって、
シリコン・ウェハのウィンドウを覆う固相メンブレンと、前記固相メンブレンの一方側にある第１流体チェンバと、前記第１流体チェンバの中にあり第１屈折率を有する第１流体と、前記メンブレンの他方側にある第２流体チェンバと、前記第２流体チェンバの中にあり、前記第１屈折率よりも低い第２屈折率を有する第２流体とを備えている流体セルと、
ガラス・カバースリップであって、このガラス・カバースリップが前記第１流体チェンバの底面を形成するように、前記流体セルが実装されている、カバースリップと、
合焦レンズと、
前記合焦レンズにおいて光を誘導するように構成されている光源であって、前記レンズが、前記固相メンブレンが覆うウィンドウよりも小さい消衰照明の場を発生するように、前記レンズが前記光を合焦するように構成されている、光源と、
前記第２流体チェンバの上方に位置付けられており、前記光学的バイオマーカによって放出される光を前記固相メンブレンにおいて合焦するように構成されている、対物レンズと、
前記光学的バイオマーカによって放出される光を検出する撮像検出器と、
を備えている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項５９】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、窒化シリコンで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６０】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、酸化シリコンで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６１】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記固相メンブレンが、シリコン・ウェハ上に堆積された窒化シリコン層で構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６２】
請求項６１記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記窒化シリコン層の厚さが、５〜５０ｎｍである、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６３】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記第１流体が、水性緩衝溶液または水を含む、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６４】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記第２流体が、細胞流体(cellular fluid)、細胞メンブレン、およびグリセロールから成る１群から選択される、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６５】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記光源が、励起レーザ・ビームで構成されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６６】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、ビオチン−ストレプトアビジン化学薬品が、前記光学的バイオマーカに結合されている１つ１つのＤＮＡ分子を前記固相メンブレン上に不動化するために用いられる、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６７】
請求項５８記載の光学顕微鏡検査ツールにおいて、前記光学的バイオマーカが、単体のＤＮＡ分子に結合されている、光学顕微鏡検査ツール。
【請求項６８】
請求項５８記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノポアを備えている、流体セル。
【請求項６９】
請求項５８記載の流体セルにおいて、前記固相メンブレンが、複数のナノポアを備えている、流体セル。
【請求項７０】
請求項５８記載の流体セルにおいて、 前記固相メンブレンが、少なくとも１つのナノスリットを備えている、流体セル。
【請求項７１】
請求項６８記載の流体セルであって、更に、前記ナノポアを通して撮像しようとする、前記光学的バイオマーカに結合されている生体分子を駆動するために、前記第１流体および前記第２流体の両端間に電位を印加するように構成されている第１および第２電極を備えている、流体セル。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【公表番号】特表２０１２−５２２２２５（Ｐ２０１２−５２２２２５Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２２８８（Ｐ２０１２−５０２２８８）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８８４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１６０２
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（３０１０６９８５６）トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８８４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１６０２
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（３０１０６９８５６）トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ (15)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]