５−アミノレブリン酸の不飽和アルキルエステル、その製法及びその用途
【課題】５−アミノレブリン酸の不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩、その製法及びその用途を提供する。
【解決手段】本発明は、下記化学式Ｉの５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩、その製法及びその用途に関する：
【化１】
前記化学式（Ｉ）で、Ｒは２−プロペニル基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、ｃｉｓ−２−ペンテニル基、ｃｉｓ−３−ヘキセニル基、ｃｉｓ−４−ヘキセニル基及びｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル基を表わす。
本発明は、５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩の製法及び化合物を含有した光線力学療法による皮膚疾患治療用の薬学的組成物に関する発明であって、本発明の実施によって経皮吸収が容易で細胞毒性の少ない化合物を提供し、アミノ基の保護過程を経ないことによって、収率を高めた製法を提供することを特徴とする。
【解決手段】本発明は、下記化学式Ｉの５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩、その製法及びその用途に関する：
【化１】
前記化学式（Ｉ）で、Ｒは２−プロペニル基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、ｃｉｓ−２−ペンテニル基、ｃｉｓ−３−ヘキセニル基、ｃｉｓ−４−ヘキセニル基及びｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル基を表わす。
本発明は、５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩の製法及び化合物を含有した光線力学療法による皮膚疾患治療用の薬学的組成物に関する発明であって、本発明の実施によって経皮吸収が容易で細胞毒性の少ない化合物を提供し、アミノ基の保護過程を経ないことによって、収率を高めた製法を提供することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記化学式Ｉの５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩、その製法及びその用途に関する。
【０００２】
【化１】
前記化学式Ｉで、Ｒは２−プロペニル基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、ｃｉｓ−２−ペンテニル基、ｃｉｓ−３−ヘキセニル基、ｃｉｓ−４−ヘキセニル基及びｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル基を表わす。
【０００３】
また、本発明は、前記化学式（Ｉ）の化合物及びそれの薬学的に許容されるその塩を有効成分として含むにきび治療用の薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
５−アミノレブリン酸（５−ａｍｉｎｏｌｅｃｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ、ＡＬＡ）は、光線力学療法（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ、ＰＤＴ）に使われる光敏感物質の前駆物質である。
【０００５】
ＡＬＡが塗布や貼布などを通じて皮膚に吸収されれば、細胞内に移動したＡＬＡがポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）の生合成過程を通じてプロトポルフィリンＩＸ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎＩＸ、ＰｐＩＸ）という光線力学療法に利用される実質的な光敏感剤に変わる。
【０００６】
ＡＬＡは、同じ条件で正常細胞や正常組職よりは、非正常細胞や非正常組職にさらに早く吸収されて光敏感剤であるプロトポルフィリンに転換される。
【０００７】
プロトポルフィリン（ＰｐＩＸ）は、可視光線領域（４５０〜６５０ｎｍ）の光を吸収すれば蛍光を表わすが、この蛍光は、周辺酸素分子にエネルギーを供給して安全な酸素を活性酸素の一つであるｓｉｇｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎに転換させて、周辺にある細胞や組職を破壊する毒素として作用する。
【０００８】
したがって、プロトポルフィリンを高濃度で蓄積させた非正常細胞または非正常組職（皮膚）に光を照射すれば、さまざまな治療効果を表わす。
【０００９】
しかし、ＡＬＡは、新水性は強く、疎水性が弱くて皮膚の角質層及び細胞壁のような障壁を容易に通過することができないために、細胞内へのＡＬＡの蓄積に時間がかかるか、所望の治療効果を奏し得ない短所がある。
【００１０】
このような点のために、ＡＬＡを細胞内に効果的に伝達する方法でＡＬＡをメチルエステル（ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）やブチルエステル（ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒ）などの誘導体で作って使う方法がある。この方法は、カルボン酸より親水性が大きく減少して脂質層が存在する皮膚の角質層と細胞壁のような障害物を通過するのに非常に効果的であるが、この化合物は使用範囲が狭く、制限的な短所を有する。
【００１１】
また、前述したエステルの誘導体合成法は、アミノ作用基を保護する保護基を導入し、これを再び除去しなければならない複雑な過程を通さなければならないために、生産効率が低くて、実用化には難点があった。
【００１２】
したがって、本発明は、ＡＬＡを細胞内に効果的に伝達しながら幅広くに使うことができる不飽和アルキル基を有したエステルなどの誘導体を作って使う方法を開発するようになり、このような不飽和アルキル基を有したエステルはいまだに報告された例がない。
【００１３】
また、ＡＬＡでアミノ保護基を使わずにエステルを合成する方法は、いろいろ他のエステルを開発して研究するのに有用であるので、本発明では、アミノ保護基を使わずにエステルを合成して収率の高いＡＬＡエステルの製法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、前記問題点を改善するために案出されたものであって、本発明は、経皮吸収が容易な形態である５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩を提供することにその目的がある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記化合物を高収率で得ることができる製法を提供することである。
【００１６】
本発明のまた他の目的は、前記化合物を含んだ皮膚疾患治療用の薬学的組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の目的は、前述した目的に制限されず、言及されていないまた他の目的は、下記の記載から当業者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の利点及び特徴、そして、それらを果たす方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、相異なる多様な形態に具現可能であり、単に本実施例は、本発明の開示を完全にさせ、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、特許請求の範疇によって定義されるだけである。明細書全体に亘って同じ参照符号は、同じ構成要素を指称する。
【００１９】
前記目的を果たすために、本発明は、下記化学式（Ｉ）で表示される５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩を提供する：
【００２０】
【化２】
前記化学式（Ｉ）で、Ｒは２−プロペニル基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、ｃｉｓ−２−ペンテニル基、ｃｉｓ−３−ヘキセニル基、ｃｉｓ−４−ヘキセニル基及びｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル基を表わす。
【００２１】
また、他の目的を果たすために、本発明は、（ａ）下記化学式（ＩＩ）化合物を塩化チオニル及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと反応させる段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で得られた物質をアリルアルコール、３−ブテノール（３−ｂｕｔｅｎｏｌ）、４−ペンテノール（４−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）、５−ヘキセノール（５−ｈｅｘｅｎｏｌ）、シス−２−ペンテノール（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）、シス−３−ヘキセノール（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｏｌ）、シス−４−ヘキセノール（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｏｌ）及びトランス−２−ヘキセノール（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｏｌ）からなる群から選択された不飽和アルコールと反応させる段階と、を含む前記５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩の製法を提供する：
【００２２】
【化３】
また、また他の目的を果たすために、本発明は、前記５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩を有効成分として含む皮膚疾患治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２３】
この際、本発明で皮膚疾患は、局部的な皮膚疾患の治療に使うことができるが、具体的に、にきびまたは皮膚癌の皮膚疾患治療に使うことができ、このうち皮膚癌は、詳細に光線角化症や砒素角化症などの皮膚前駆癌や基底細胞癌の皮膚癌治療に使うことができる。
本発明は、化合物とその製法及び光線力学療法に前記化合物を含有した治療用の薬学的組成物に関する発明であって、本発明の実施によって経皮吸収が容易で細胞毒性の少ない化合物を提供し、アミノ基の保護過程を経ないことによって、収率を高めた製法を提供することを特徴とする。
【００２４】
本発明による皮膚疾患治療用の薬学的組成物は、レミントン薬剤学ハンドブック（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ，Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）などの公知された方法によって、有効成分である本発明の５−アミノレブリン酸アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩を薬学的に許容された担体と混合して、皮膚に局所的に塗るか塗布することができるクリーム、軟膏、ローションまたはパッチ（ｐａｔｃｈ）の剤型で製造することができる。望ましくは、本発明の５−アミノレブリン酸アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩は、薬学的組成物総重量基準に約１５％（ｗ／ｖ）または１５％（ｗ／ｗ）を使う。
【００２５】
前記担体は、塩水、緩衝剤、デクストロース、水、グリセロール、リンゲル液、ラクトース、スクロース、珪酸カルシウム、メチルセルロース、エタノール及びこれらの混合物などを使うことができる。但し、本発明の担体が、前述した担体に限定されるものではない。
【００２６】
それ以外に、本発明による皮膚疾患治療用の組成物の剤型に充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んで製造することができる。
【００２７】
本発明の５−アミノレブリン酸アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩の有効量は、使用目的及び患者の疾患軽重によって当業者によって決めることができるが、具体的に、一回使用時に薬学的組成物基準に１ｇを超えないようにすることが望ましい。
本発明の薬学的組成物は、患者の病変皮膚に均等に塗布するか貼布するが、投与して４時間を超過しないようにする。
【００２８】
本発明の薬学的組成物を塗布した皮膚の局所部位は、光敏感反応を示すことができるために、塗布した部位は光を遮断しなければならない。
【００２９】
光線力学療法で治療した部位には、最小４８時間光線遮断剤（ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ）をさらに塗布して光を遮断させることが望ましい。
【００３０】
また、本発明は、経皮吸収が容易で細胞毒性の少ない化合物を提供し、アミノ基の保護過程を経ないことによって、収率を高めた製法を提供することを特徴とする。
【００３１】
本発明の化合物及び薬学的に許容されたその塩を製造する方法は、次の通りである。
【００３２】
１．５−アミノレブリン酸 ２−プロペニル塩酸塩［（５−アミノレブリン酸アリル塩酸塩）２−ｐｒｏｐｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、（ＡＬＡ ａｌｌｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）］
【００３３】
【化４】
２．５−アミノレブリン酸 ３−ブテニル塩酸塩（３−ｂｕｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３４】
【化５】
３．５−アミノレブリン酸 ４−ペンテニル塩酸塩（４−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３５】
【化６】
４．５−アミノレブリン酸 ５−ヘキセニル塩酸塩（５−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３６】
【化７】
５．５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−２−ペンテニル塩酸塩（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３７】
【化８】
６．５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−３−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３８】
【化９】
７．５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−４−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３９】
【化１０】
８．５−アミノレブリン酸 ｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル塩酸塩（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００４０】
【化１１】
【発明の効果】
【００４１】
本発明によるＡＬＡエステルは、細胞毒性が少なく、経皮吸収が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明は、当業者において、本発明の技術的思想を外れない範囲内でさまざまな置き換え、変形及び変更が可能であるので、実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
５−アミノレブリン酸 ２−プロペニル塩酸塩［５−アミノレブリン酸アリル塩酸塩）２−ｐｒｏｐｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、（ＡＬＡ ａｌｌｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）］の製造
【００４４】
【化１２】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、５−アミノレブリン酸塩酸塩（ＡＬＡ．ＨＣｌ、２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてアリルアルコールを入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ２−プロペニル塩酸塩［（５−アミノレブリン酸アリル塩酸塩）２−ｐｒｏｐｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、（ＡＬＡ ａｌｌｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）］を７３％の収率で得た。
【００４５】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．５７（ｓ、３Ｈ）、６．２〜６．０９（ｍ、１Ｈ）、５．５７〜５．４１（ｍ、２Ｈ）、４．７７（ｄｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、１．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．１５（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、３．０５（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．８１（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．８、１５２．６３、１４３．２２、１３２．６２、１１７．５８、６４．３６、３１．７８、２８．８６。
【００４６】
〔実施例２〕
５−アミノレブリン酸 ３−ブテニル塩酸塩（３−ｂｕｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ）の製造
【００４７】
【化１３】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させて３−ブテノール（３−ｂｕｔｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ３−ブテニル塩酸塩（３−ｂｕｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を７７％の収率で得た。
【００４８】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．２４（ｓ、３Ｈ）、５．８０〜５．７４（ｍ、１Ｈ）、５．１６〜５．０４（ｍ、２Ｈ）、４．０６（ｔ、Ｊ＝６．６３Ｈｚ、２Ｈ）、２．８０（ｔ、Ｊ＝６．６３Ｈｚ、２Ｈ）、２．５２（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．３３（ｑ、Ｊ＝６．５４、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７２．０７、１５２．６４、１４３．２０、１３４．４３、１１７．０７、６２．８８、３２．５２、３１．９０、２８．９１。
【００４９】
〔実施例３〕
５−アミノレブリン酸 ４−ペンテニル塩酸塩（４−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００５０】
【化１４】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させて４−ペンテノール（４−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて減圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ４−ペンテニル塩酸塩、４−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを４７％の収率で得た。
【００５１】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．２７（ｓ、３Ｈ）、５．８４〜５．７３（ｍ、１Ｈ）、５．０６〜４．９４（ｍ、２Ｈ）、４．０（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．９７（ｓ、２Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．５４（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０６（ｑ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．６５（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７２．０９、１５２．６７、１４３．１８、１３７．６８、１１５．２０、６３．２０、３１．９１、２９．３９、２８．９１、２７．１８。
【００５２】
〔実施例４〕
５−アミノレブリン酸 ５−ヘキセニル塩酸塩（５−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００５３】
【化１５】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、５−アミノレブリン酸塩酸塩（ＡＬＡ．ＨＣｌ、２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させて５−ヘキセノール（５−ｈｅｘｅｎｏｌ）を入れる。反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ５−ヘキセニル塩酸塩（５−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を８９％の収率で得た．
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．３３（ｓ、３Ｈ）、５．８５〜５．７１（ｍ、１Ｈ）、５．０４〜４．９２（ｍ、２Ｈ）、３．９９（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．９３（ｓ、２Ｈ）、２．７８（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．５３（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、１．５６（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２０２．６６、１７２．０５、１３８．４１、１１５．０２、６３．９２、４６．５２、３４．２６、３２．６９、２７．５６、２７．０８、２４．５５。
【００５４】
〔実施例５〕
５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−２−ペンテニル塩酸塩（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００５５】
【化１６】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてシス−２−ペンテノール（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−２−ペンテニル塩酸塩（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を６８％の収率で得た。
【００５６】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．３７（ｓ、３Ｈ）、５．６２〜５．５８（ｍ、１Ｈ）、５．４７〜５．４１（ｍ、１Ｈ）、４．５６（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．９３（ｓ、２Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．５３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０６（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、０．９２（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．９４、１５２．６２、１４３．１８、１３６．３０、１２３．０３、５９．６０、３１．９０、２８．９１、２０．２７、１３．８６。
【００５７】
〔実施例６〕
５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−３−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００５８】
【化１７】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてシス−３−ヘキセノール（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−３−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を７２％の収率で得た。
【００５９】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．４２（ｂｒ ｓ、３Ｈ）、５．４３−５．３５（ｍ、２Ｈ）、３．９７（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、３．９１（ｓ、２Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．５０（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、１．５９（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、１．５６（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ２０２．５９、１７２．８１、１３４．７８、１２３．８３、６４．６５、４８．２５、３５．２１、２７．７２、２６．８５、２０．８３、１４．４５。
【００６０】
〔実施例７〕
５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−４−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００６１】
【化１８】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてシス−４−ヘキセノール（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−４−ヘキセニル塩酸塩、ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを９０％の収率で得た。
【００６２】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．２５（ｓ、３Ｈ）、５．５１〜５．４５（ｍ、１Ｈ）、５．３９〜５．３３（ｍ、１Ｈ）、４．２８（ｓ、２Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．９２（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．６５（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．１０（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．６７（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、１．８０（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２０２．３５、１７２．６０、１２９．０５、１２４．９２、６４．４９、４７．９１、３４．９６、２８．３２、２７．４９、２３．１２、１２．７３。
【００６３】
〔実施例８〕
５−アミノレブリン酸 ｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル塩酸塩（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎ−ａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００６４】
【化１９】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてトランス−２−ヘキセノール（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル塩酸塩（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を７０％の収率で得た。
【００６５】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．２１（ｓ、３Ｈ）、５．８１〜５．７１（ｍ、１Ｈ）、５．５８〜５．４９（ｍ、１Ｈ）、４．５０（ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．２７（ｓ、２Ｈ）、２．９２（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．６６（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２（ｑ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．４０（ｓｉｘｔｅｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、０．９（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．８４、１５２．６２、１４３．１９、１３５．１３、１２４．１９、６４．３７、３３．５８、３１．８８、２８．９１、２１．５０、１３．４１。
【００６６】
〔実験例〕
１．公示材料
ア．細胞株
人体表皮角質形成細胞株（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨＥＫ）、
人体真皮線維細胞株（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ｈＦ）
扁平細胞癌細胞株：Ａ４３１（ＫＣＬＢ Ｎｏ．８０００５）
悪性黒色腫細胞株：ＴＸＭ１３（ＫＣＬＢ Ｎｏ．８００２９）
イ．動物
ＩＣＲマウス（大韓バイオリンク、韓國生命工學研究院、韓国）７〜８株の雌（ｆｅｍａｌｅ；♀）
ウ．光源照射器
光源照射器は、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）光源器を利用し、最大波長４１０ｎｍ（波長帯；４００〜４３０ｎｍ）であるｂｌｕｅ ｌｉｇｈｔ（青色）及び６３５ｎｍ（波長帯；６１５〜６４５ｎｍ）である赤色ＬＥＤ（Ｌｕｘｅｏｎ、Ｌｕｍｉｌｅｄｓ Ｌｉｇｈｔ）を用いて５−３０Ｊ／ｃｍ２の光源量を照射した。
【００６７】
２．溶解度検査
本実験は、前記実施例で製造された本発明のＡＬＡエステル（粉末）の溶媒別の溶解度検査を実行した。
【００６８】
その結果を下記表１に表わした。
【００６９】
【表１】
前述した結果、本発明のＡＬＡエステルは、アルコール、水、ＤＭＳＯなどの溶媒に易しく溶解される特性を有していることが分かった。
【００７０】
したがって、本発明のＡＬＡエステルは、局所用の外用軟膏剤などの剤型化で水溶性または油溶性媒介剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）をいずれも使うことができる。
【００７１】
３．細胞毒性検査（細胞生存率検査）
本実験は、細胞毒性検査であるＭＴＴ ａｓｓａｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を通じて次のような細胞毒性検査を実行した。
【００７２】
細胞株は、各ｗｅｌｌ当たり３×１０４個の細胞株が含まれるように９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ Ｄｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に種まきした。
約２４時間経過後、細胞が培養容器の底を６０〜７０％程度覆った時、ＡＬＡ及びＡＬＡ−ｅｓｔｅｒを濃度別に含有した無血清培養液１００ｕｌずつ交換して２４時間さらに培養した。
【００７３】
培養液にＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）をｗｅｌｌ当たり１０ｕｌずつ添加して４時間反応してＦｏｍａｚａｎ結晶体を形成させた後、発色溶液（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ｗｉｔｈ ０．０４ Ｎ ＨＣｌ）を１００ｕｌずつ入れて不溶性であるＦｏｍａｚａｎ結晶体を溶解させた。
【００７４】
溶解物の吸光度は、５７０ｎｍ波長下にＥＬＩＳＡ判読器（ＥＭＡＸ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）で測定した。
【００７５】
（１）人体表皮角質形成細胞株（ＨＥＫ）
ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを処理した人体角質形成細胞（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）で細胞生存率の結果を対照区（ＡＬＡ）と比べて、下記表１及び表２に表わした。この際、表１と表２は、相異なる時期に実験して異なる数値方法で表わしたものである。
【００７６】
【表２】
【００７７】
【表３】
（２）人体真皮線維細胞株（ｈＦ）
【００７８】
【表４】
（３）扁平細胞癌細胞株（Ａ４３１）
【００７９】
【表５】
（４）悪性黒色腫細胞株（ＴＭＸ１３）
【００８０】
【表６】
前述した表１ないし表５に表わしたように、ＡＬＡ及びＡＬＡエステルは、１ｍＭ以下の濃度では人体表皮角質形成細胞株であるＨＥＫを除外したすべての細胞生存率が７０％以上を保持することが分かった。これは、本発明の不飽和アルキル基を有したＡＬＡエステルは、ＡＬＡと比べて毒性反応を有さないことを示したものである。
【００８１】
４．蛍光分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）
蛍光分光法を通じてＡＬＡ及び不飽和アルキル基を有したＡＬＡエステルによるＰｐＩＸの合成量を細胞及び皮膚組職で定量化した。
【００８２】
ＰｐＩＸ合成量は、蛍光分光器（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｕｖｉｋｏｎ、ｍｏｄｅｌ９４３）を用いて測定した。この際、蛍光測定は、浮き上がり波長を４０８ｎｍにして測定した。
【００８３】
ア．細胞株
２×１０５個の各細胞株は、１０ｃｍ２のｄｉｓｈｅｓ（Ｆａｌｃｏｎ）に分周させて、７０〜８０％の融合された状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｓｔａｔｅ）になった時、ＡＬＡ及びＡＬＡエステルを濃度別（０．００１〜１ｍＭ）に含有した無血清培養液を添加して４時間培養した。
【００８４】
培養物は、ＰＢＳで一回水洗した後、１Ｍ次亜塩素酸（ＨＣｌＯ４）が含有された５０％メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）溶液を入れてコスターセルスクレーパー（Ｃｏｓｔａｒｃｅｌｌ ｓｃｒａｐｅｒ）で掻き出した（ｓｃｒａｐｉｎｇ）。
【００８５】
セルスクレーパーで回収した細胞は、５分間培養し、遠心分離して上澄み液を分離した。
【００８６】
分離された上澄み液は、蛍光分光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて興奮波長が４０５ｎｍであり、放出波長が６０５ｎｍにして測定した。
【００８７】
その結果は、図１及び図２に図示した。
【００８８】
前記測定結果、本発明のＡＬＡエステル、すなわち、ＡＬＡ−１、４、６は、ＡＬＡと比較時、Ａ４３１細胞株内でＰｐＩＸ合成がさらに高いことが分かった（図１）。
【００８９】
また、すべての細胞株でＰｐＩＸ合成量は、０．０１〜１ｍＭのＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルの処理濃度と比例して増加することが分かった。また、同一の細胞株でＰｐＩＸ合成量を観察した結果、本発明のＡＬＡエステル、すなわち、５−アミノレブリン酸の不飽和アルキルエステルは、ＡＬＡと比較時、効果的に細胞内でＰｐＩＸを合成することができることが分かった（図２）。この際、図２で、（Ａ）は人体角質形成細胞（ＨＥＫ）、（Ｂ）は人体真皮線維細胞株（ｈＦ）、（Ｃ）は扁平細胞癌細胞株（Ａ４３１）及び（Ｄ）は悪性黒色腫（ＴＸＭ１３）を表わしたものである。
【００９０】
前述した結果、本発明のＡＬＡエステルは、正常細胞及び癌細胞でＰｐＩＸを合成できることを示す。
【００９１】
イ．組職
（１）軟膏剤の製造
ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを含有した軟膏剤は、ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステル粉末とオクタデシルアルコール、ポリエチレングリコール、精製水などで組成されている水溶性ベース（ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｂａｓｅ）である水溶性軟膏基剤（ＳＡＭＡＢＡＳＥ、韓国）を混合して製造した。この際、ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルの混合比率は、それぞれ５％、１０％及び１５％（ｗ／ｗ）にした。
【００９２】
（２）臨床
前記製造した濃度別の軟膏剤は、毛が除去されたＩＣＲマウスの背中（ｂａｃｋ）に一定量（０．２５ｇ）を塗布させた。
【００９３】
塗布１時間及び４時間が経た後、ＩＣＲマウスは頸部を脱骨させて殺した後、ＩＣＲマウスなどの皮膚を採取した。
【００９４】
採取した皮膚５００ｍｇは、トリプシン／ＥＤＴＡ（ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ）溶液２ｍｌに入れた後、３０，０００ｒｐｍ及び５分間組職均質器（ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で均質化した。
【００９５】
均質物は、暗室（Ｄａｒｋｒｏｏｍ）に入れて３７℃で１時間タンパク質分解反応を実行し（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚｅｄ）、１Ｍ過塩素酸（ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）を含有した５０％（ｗ／ｗ）メタノール２ｍｌを添加した後、遠心分離して上澄み液を収得した。
【００９６】
分離された上澄み液は、蛍光分光度計を用いて興奮波長が４０５ｎｍであり、放出波長が６０５ｎｍにして測定した。
【００９７】
その結果は、図３及び図４に図示した。
【００９８】
前述した蛍光分光法を利用した測定結果、ＡＬＡと同様に本発明のＡＬＡエステルも吸収されてＰｐＩＸを合成できることが分かり、本発明のＡＬＡエステルがＡＬＡに比較時、さらに細胞壁をより容易に通過して光敏感剤であるＰｐＩＸ物質をさらに多く合成できることが分かった（図３）。
【００９９】
また、皮膚組職で吸収された本発明のＡＬＡエステルは、ＡＬＡと比べて皮膚角質の脂質層をより容易に通過して光敏感剤であるＰｐＩＸ物質をさらに多く合成できることが分かり、生体でのＰｐＩＸ合成は、塗布時間と量とによって左右されることが分かった（図４）。
【０１００】
５．蛍光顕微鏡観察法
前記本発明のＡＬＡエステルを含んだ軟膏剤は、前記同一の方法で各細胞株及びＩＣＲマウスの皮膚組職に処理し、該処理した細胞株と皮膚組職で合成されたＰｐＩＸの発現部位とを蛍光顕微鏡で観察した。
【０１０１】
ア．細胞株
本実験は、本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡを正常細胞株である人体角質形成細胞（ＨＥＫ）と人体真皮線維細胞株（ｈＫ）及び癌細胞である扁平細胞癌細胞株であるＡ４３１（Ｃ）と悪性黒色腫細胞株であるＴＸＭ１３（Ｄ）の培養液に＊＊ｍＭで処理した後、各細胞の細胞質で合成されるＰｐＩＸの蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。
【０１０２】
図５に図示したように、本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡを正常細胞株である人体角質形成細胞（Ａ）と人体真皮線維細胞株（Ｂ）、扁平細胞癌細胞株（Ａ４３１）と及び悪性黒色腫（ＴＸＭ１３）に処理した場合、すべての細胞の細胞質でいずれもＰｐＩＸが合成されて蓄積されていることが分かった（図５）。これは、正常細胞及び癌細胞でＡＬＡだけではなく、ＡＬＡエステルによってＰｐＩＸを合成できることを示す。
【０１０３】
イ．皮膚組職
本実験は、本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡを含んだ軟膏剤をＩＰＣマウス皮膚に塗布した後、１時間、２時間及び３時間後に発現されるＰｐＩＸを蛍光顕微鏡で測定した。
【０１０４】
その結果を図６及び図７に図示した。
【０１０５】
図６に図示されたように、ＩＰＣマウスの正常皮膚組職で経時的にＰｐＩＸの合成量が増加することが分かった。特に、皮膚組職の表皮と皮脂腺で経時的に強く発現された。この際、（Ａ）は１時間、（Ｂ）は２時間、（Ｃ）は３時間及びＣｏｎｔｒｏｌは、対照群を表わしたものである。
【０１０６】
図７に図示されたように、多様な皮膚疾患を表わす病変組職では、ＰｐＩＸが特定の癌細胞の部位から発現されることを観察できた。
【０１０７】
前述した結果から、本発明のＡＬＡエステルを含んだ軟膏剤は、特定病変組職の治療が可能であることを確認できた。
【０１０８】
６．細胞枯死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）及び細胞死（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）研究
ア．細胞株
流体細胞測定法（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＡＣＳ：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ、ＵＳＡ）を用いて６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに培養した各細胞株は、ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルで処理し、ＬＥＤ可視光線を照射した後、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ、ＢＤ）とで染色して、細胞枯死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を測定した。
【０１０９】
その結果は、図８に図示した。
【０１１０】
図８に図示したように、ＡＬＡ及び本発明の不飽和ＡＬＡアルキルエステルで処理していない細胞とＡＬＡ及びＡＬＡエステルを投与して可視光線を照射していない場合と可視光線である光源のみを照射（５−２０Ｊ／ｃｍ２）した場合、細胞は８５％以上の生存率を表わした（図８Ａ及び図８Ｂ）。しかし、１ｍＭ ＡＬＡと本発明のＡＬＡエステルを処理して光を照射した場合（５−２０Ｊ／ｃｍ２）に細胞は細胞枯死（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ−）や細胞枯死の末期段階（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ＋）に進行した（図８Ｃ及び図８Ｄ）。
【０１１１】
イ．皮膚組職
濃度別（５〜１５％）にＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを含有した軟膏剤は、毛が除去されたＩＣＲマウスの背中に一定量（０．２５ｇ）を塗布させた。
【０１１２】
１時間と４時間が経過した後、塗布された皮膚部位にＬＥＤ可視光線（照射量２５Ｊ／ｃｍ２）を照射した。
【０１１３】
２４時間、４８時間及び７２時間経過した後、マウスなどで皮膚組職を採取し、該採取された皮膚組職は、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ；Ｈ＆Ｅ）で染色して組職の細胞死を観察した。
【０１１４】
その結果を図９及び図１０に図示した。
【０１１５】
図９に図示したように、ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを皮膚に塗布して光線を照射したマウス群では、２４時間に皮膚組職の表皮が壊死または枯死が観察され（図９Ａ）、４８時間後には、皮膚組職の表皮が壊死と再生とが同時に観察された（図９Ｂ及び図９Ｃ）。この際、図９で（Ａ）は、ＡＬＡ塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射２４時間後を表わしたものであり、（Ｂ）は、ＡＬＡ−１（ＡＬＡ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射４８時間後を表わしたものであり、（Ｃ）は、ＡＬＡ−６（ＡＬＡ−ｈｅｘｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射４８時間後を表わしたものであり、（Ｄ）は、対照群で不飽和アルキルエステルを塗布した後、光線照射をしない場合を表わしたものである。
【０１１６】
図１０に図示されたように、皮脂腺が一部または全部破壊されるか萎縮されることが観察された。これは、皮脂腺が関与するにきび皮膚疾患の治療に関与することができることを示唆する。この際、（Ａ）は、ＡＬＡ塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射２４時間後を表わしたものであり、（Ｂ）は、ＡＬＡ−１（ＡＬＡ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射２４時間後を表わしたものであり、（Ｃ）は、ＡＬＡ−６（ＡＬＡ−ｈｅｘｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射２４時間後を表わしたものであり、（Ｄ）は、対照群で不飽和アルキルエステルを塗布した後、光線照射をしない場合を表わしたものである。
【０１１７】
７．貼布検査（ｐａｔｃｈ ｔｅｓｔ）
本実験例は、前記４−（イ）−（１）で製造した軟膏剤がアレルギー性及び原発性接触皮膚炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）を起こすかどうかを調べるのために、５０名の正常人を対象で貼布検査を施行した。
【０１１８】
正常ＩＣＲマウス（６０匹）の皮膚に５％、１０％及び１５％（ｗ／ｗ）濃度の軟膏剤を６時間と１２時間塗布した後、蒸溜水で軟膏を除去し、軟膏剤を塗らなかった対照群（２０匹）と比べて９０日間肉眼で皮膚を観察した。
【０１１９】
また、正常人体の皮膚に５％、１０％及び１５％濃度の軟膏剤を塗布して６時間、１２時間及び２４時間蜜閉した後に塗布部位を観察した。
【０１２０】
その結果、マウス（図示せず）や人体皮膚（図１１）にいずれも陰性所見を示した。
したがって、本発明のＡＬＡエステルを含んだ軟膏剤は、如何なるアレルギー性または一次的接触（光毒性）皮膚炎も引き起こさないことが分かった。
【０１２１】
８．本発明による軟膏剤の皮膚疾患治療効果
本実験は、１５％（ｗ／ｗ）のＡＬＡ−６（ＡＬＡ ｈｅｘｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）を含有した軟膏剤をにきび、光線角化症、砒素角化症及び基底細胞癌の患者に光線力学療法で治療して、治療効果があるか否かを確認しようとした。
【０１２２】
その結果、図１２ないし図１９に図示されたように、にきび、光線角化症、砒素角化症及び基底細胞癌治療に効果があるということが分かった。この際、図１２ないし図１７は、にきび治療効果を患者別に表わしたものであり、図１８は、光線角化症（Ａ）と砒素角化症（Ｂ）との治療効果を表わしたものであり、図１９は、基底細胞癌の治療効果を表わしたものである。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明では、ＡＬＡの効果的なエステルを開発して光線力学療法に利用される既存のＡＬＡより安全で効果的な光敏感物質として光線力学療法で皮膚疾患治療用の薬学的組成物に利用し、また、それら化合物を効率的に合成する製法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明のＡＬＡエステルを処理したＡ４３１細胞で形成されたＰｐＩＸの量を定量してグラフで表わしたものである。
【図２】本発明のＡＬＡエステルを処理した及び細胞株で形成されたＰｐＩＸの量を定量してグラフで表わしたものである。
【図３】同一の濃度のＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを塗布した皮膚で形成されたＰｐＩＸ定量を表わしたものである。
【図４】本発明のＡＬＡエステルを濃度別に塗布した皮膚で形成されたＰｐＩＸの定量を処理１時間後（Ａ）と４時間後（Ｂ）とに区分して表わしたものである。
【図５】本発明のＡＬＡエステルを正常細胞株に処理した後、各細胞の細胞質で合成されるＰｐＩＸの蛍光を表わしたものである。
【図６】本発明のＡＬＡエステルをＩＰＣマウス皮膚に塗布した後、１時間（Ａ）、２時間（Ｂ）及び３時間（Ｃ）後に発現されるＰｐＩＸを蛍光顕微鏡で表わしたものである。
【図７】ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルをにきび（Ａ、Ｂ）、乾癬（Ｃ、Ｄ）、乳房外ページェット病（Ｅ、Ｆ）、基底細胞癌（Ｇ、Ｈ）の病変に３時間塗布した後、病変の炎症及び癌細胞で合成されるＰｐＩＸを顕微鏡（Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧ）と組職染色（Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨ）で確認して表わしたものである。
【図８】本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡを培養細胞に処理した後、光線照射による細胞死結果をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｓｓａｙによるｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＣＳ）の結果で表わしたものである。
【図９】本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡをＩＣＲマウス皮膚で塗布した後、光線照射による皮膚表皮の壊死及び再生可否を表わしたものである。
【図１０】本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡをＩＣＲマウス皮膚で塗布した後、光線照射時間による皮膚組職内の毛嚢と皮脂腺との変化を表わしたものである。
【図１１】人体皮膚に対する本発明のＡＬＡエステルの安全性を貼布実験で表わしたものである。
【図１２】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１３】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１４】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１５】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１６】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１７】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１８】本発明による軟膏剤の光線角化症（Ａ）及び砒素角化症（Ｂ）の治療効果を表わしたものである。
【図１９】本発明による軟膏剤の基底細胞癌の治療効果を表わしたものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記化学式Ｉの５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩、その製法及びその用途に関する。
【０００２】
【化１】
前記化学式Ｉで、Ｒは２−プロペニル基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、ｃｉｓ−２−ペンテニル基、ｃｉｓ−３−ヘキセニル基、ｃｉｓ−４−ヘキセニル基及びｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル基を表わす。
【０００３】
また、本発明は、前記化学式（Ｉ）の化合物及びそれの薬学的に許容されるその塩を有効成分として含むにきび治療用の薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
５−アミノレブリン酸（５−ａｍｉｎｏｌｅｃｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ、ＡＬＡ）は、光線力学療法（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ、ＰＤＴ）に使われる光敏感物質の前駆物質である。
【０００５】
ＡＬＡが塗布や貼布などを通じて皮膚に吸収されれば、細胞内に移動したＡＬＡがポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）の生合成過程を通じてプロトポルフィリンＩＸ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎＩＸ、ＰｐＩＸ）という光線力学療法に利用される実質的な光敏感剤に変わる。
【０００６】
ＡＬＡは、同じ条件で正常細胞や正常組職よりは、非正常細胞や非正常組職にさらに早く吸収されて光敏感剤であるプロトポルフィリンに転換される。
【０００７】
プロトポルフィリン（ＰｐＩＸ）は、可視光線領域（４５０〜６５０ｎｍ）の光を吸収すれば蛍光を表わすが、この蛍光は、周辺酸素分子にエネルギーを供給して安全な酸素を活性酸素の一つであるｓｉｇｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎに転換させて、周辺にある細胞や組職を破壊する毒素として作用する。
【０００８】
したがって、プロトポルフィリンを高濃度で蓄積させた非正常細胞または非正常組職（皮膚）に光を照射すれば、さまざまな治療効果を表わす。
【０００９】
しかし、ＡＬＡは、新水性は強く、疎水性が弱くて皮膚の角質層及び細胞壁のような障壁を容易に通過することができないために、細胞内へのＡＬＡの蓄積に時間がかかるか、所望の治療効果を奏し得ない短所がある。
【００１０】
このような点のために、ＡＬＡを細胞内に効果的に伝達する方法でＡＬＡをメチルエステル（ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）やブチルエステル（ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒ）などの誘導体で作って使う方法がある。この方法は、カルボン酸より親水性が大きく減少して脂質層が存在する皮膚の角質層と細胞壁のような障害物を通過するのに非常に効果的であるが、この化合物は使用範囲が狭く、制限的な短所を有する。
【００１１】
また、前述したエステルの誘導体合成法は、アミノ作用基を保護する保護基を導入し、これを再び除去しなければならない複雑な過程を通さなければならないために、生産効率が低くて、実用化には難点があった。
【００１２】
したがって、本発明は、ＡＬＡを細胞内に効果的に伝達しながら幅広くに使うことができる不飽和アルキル基を有したエステルなどの誘導体を作って使う方法を開発するようになり、このような不飽和アルキル基を有したエステルはいまだに報告された例がない。
【００１３】
また、ＡＬＡでアミノ保護基を使わずにエステルを合成する方法は、いろいろ他のエステルを開発して研究するのに有用であるので、本発明では、アミノ保護基を使わずにエステルを合成して収率の高いＡＬＡエステルの製法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、前記問題点を改善するために案出されたものであって、本発明は、経皮吸収が容易な形態である５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩を提供することにその目的がある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記化合物を高収率で得ることができる製法を提供することである。
【００１６】
本発明のまた他の目的は、前記化合物を含んだ皮膚疾患治療用の薬学的組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の目的は、前述した目的に制限されず、言及されていないまた他の目的は、下記の記載から当業者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の利点及び特徴、そして、それらを果たす方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、相異なる多様な形態に具現可能であり、単に本実施例は、本発明の開示を完全にさせ、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、特許請求の範疇によって定義されるだけである。明細書全体に亘って同じ参照符号は、同じ構成要素を指称する。
【００１９】
前記目的を果たすために、本発明は、下記化学式（Ｉ）で表示される５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩を提供する：
【００２０】
【化２】
前記化学式（Ｉ）で、Ｒは２−プロペニル基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、ｃｉｓ−２−ペンテニル基、ｃｉｓ−３−ヘキセニル基、ｃｉｓ−４−ヘキセニル基及びｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル基を表わす。
【００２１】
また、他の目的を果たすために、本発明は、（ａ）下記化学式（ＩＩ）化合物を塩化チオニル及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと反応させる段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で得られた物質をアリルアルコール、３−ブテノール（３−ｂｕｔｅｎｏｌ）、４−ペンテノール（４−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）、５−ヘキセノール（５−ｈｅｘｅｎｏｌ）、シス−２−ペンテノール（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）、シス−３−ヘキセノール（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｏｌ）、シス−４−ヘキセノール（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｏｌ）及びトランス−２−ヘキセノール（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｏｌ）からなる群から選択された不飽和アルコールと反応させる段階と、を含む前記５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩の製法を提供する：
【００２２】
【化３】
また、また他の目的を果たすために、本発明は、前記５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩を有効成分として含む皮膚疾患治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２３】
この際、本発明で皮膚疾患は、局部的な皮膚疾患の治療に使うことができるが、具体的に、にきびまたは皮膚癌の皮膚疾患治療に使うことができ、このうち皮膚癌は、詳細に光線角化症や砒素角化症などの皮膚前駆癌や基底細胞癌の皮膚癌治療に使うことができる。
本発明は、化合物とその製法及び光線力学療法に前記化合物を含有した治療用の薬学的組成物に関する発明であって、本発明の実施によって経皮吸収が容易で細胞毒性の少ない化合物を提供し、アミノ基の保護過程を経ないことによって、収率を高めた製法を提供することを特徴とする。
【００２４】
本発明による皮膚疾患治療用の薬学的組成物は、レミントン薬剤学ハンドブック（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ，Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）などの公知された方法によって、有効成分である本発明の５−アミノレブリン酸アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩を薬学的に許容された担体と混合して、皮膚に局所的に塗るか塗布することができるクリーム、軟膏、ローションまたはパッチ（ｐａｔｃｈ）の剤型で製造することができる。望ましくは、本発明の５−アミノレブリン酸アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩は、薬学的組成物総重量基準に約１５％（ｗ／ｖ）または１５％（ｗ／ｗ）を使う。
【００２５】
前記担体は、塩水、緩衝剤、デクストロース、水、グリセロール、リンゲル液、ラクトース、スクロース、珪酸カルシウム、メチルセルロース、エタノール及びこれらの混合物などを使うことができる。但し、本発明の担体が、前述した担体に限定されるものではない。
【００２６】
それ以外に、本発明による皮膚疾患治療用の組成物の剤型に充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んで製造することができる。
【００２７】
本発明の５−アミノレブリン酸アルキルエステル及び薬学的に許容されるその塩の有効量は、使用目的及び患者の疾患軽重によって当業者によって決めることができるが、具体的に、一回使用時に薬学的組成物基準に１ｇを超えないようにすることが望ましい。
本発明の薬学的組成物は、患者の病変皮膚に均等に塗布するか貼布するが、投与して４時間を超過しないようにする。
【００２８】
本発明の薬学的組成物を塗布した皮膚の局所部位は、光敏感反応を示すことができるために、塗布した部位は光を遮断しなければならない。
【００２９】
光線力学療法で治療した部位には、最小４８時間光線遮断剤（ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ）をさらに塗布して光を遮断させることが望ましい。
【００３０】
また、本発明は、経皮吸収が容易で細胞毒性の少ない化合物を提供し、アミノ基の保護過程を経ないことによって、収率を高めた製法を提供することを特徴とする。
【００３１】
本発明の化合物及び薬学的に許容されたその塩を製造する方法は、次の通りである。
【００３２】
１．５−アミノレブリン酸 ２−プロペニル塩酸塩［（５−アミノレブリン酸アリル塩酸塩）２−ｐｒｏｐｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、（ＡＬＡ ａｌｌｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）］
【００３３】
【化４】
２．５−アミノレブリン酸 ３−ブテニル塩酸塩（３−ｂｕｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３４】
【化５】
３．５−アミノレブリン酸 ４−ペンテニル塩酸塩（４−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３５】
【化６】
４．５−アミノレブリン酸 ５−ヘキセニル塩酸塩（５−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３６】
【化７】
５．５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−２−ペンテニル塩酸塩（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３７】
【化８】
６．５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−３−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３８】
【化９】
７．５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−４−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００３９】
【化１０】
８．５−アミノレブリン酸 ｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル塩酸塩（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００４０】
【化１１】
【発明の効果】
【００４１】
本発明によるＡＬＡエステルは、細胞毒性が少なく、経皮吸収が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明は、当業者において、本発明の技術的思想を外れない範囲内でさまざまな置き換え、変形及び変更が可能であるので、実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
５−アミノレブリン酸 ２−プロペニル塩酸塩［５−アミノレブリン酸アリル塩酸塩）２−ｐｒｏｐｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、（ＡＬＡ ａｌｌｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）］の製造
【００４４】
【化１２】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、５−アミノレブリン酸塩酸塩（ＡＬＡ．ＨＣｌ、２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてアリルアルコールを入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ２−プロペニル塩酸塩［（５−アミノレブリン酸アリル塩酸塩）２−ｐｒｏｐｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、（ＡＬＡ ａｌｌｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）］を７３％の収率で得た。
【００４５】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．５７（ｓ、３Ｈ）、６．２〜６．０９（ｍ、１Ｈ）、５．５７〜５．４１（ｍ、２Ｈ）、４．７７（ｄｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、１．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．１５（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、３．０５（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．８１（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．８、１５２．６３、１４３．２２、１３２．６２、１１７．５８、６４．３６、３１．７８、２８．８６。
【００４６】
〔実施例２〕
５−アミノレブリン酸 ３−ブテニル塩酸塩（３−ｂｕｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ）の製造
【００４７】
【化１３】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させて３−ブテノール（３−ｂｕｔｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ３−ブテニル塩酸塩（３−ｂｕｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を７７％の収率で得た。
【００４８】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．２４（ｓ、３Ｈ）、５．８０〜５．７４（ｍ、１Ｈ）、５．１６〜５．０４（ｍ、２Ｈ）、４．０６（ｔ、Ｊ＝６．６３Ｈｚ、２Ｈ）、２．８０（ｔ、Ｊ＝６．６３Ｈｚ、２Ｈ）、２．５２（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．３３（ｑ、Ｊ＝６．５４、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７２．０７、１５２．６４、１４３．２０、１３４．４３、１１７．０７、６２．８８、３２．５２、３１．９０、２８．９１。
【００４９】
〔実施例３〕
５−アミノレブリン酸 ４−ペンテニル塩酸塩（４−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００５０】
【化１４】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させて４−ペンテノール（４−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて減圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ４−ペンテニル塩酸塩、４−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを４７％の収率で得た。
【００５１】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．２７（ｓ、３Ｈ）、５．８４〜５．７３（ｍ、１Ｈ）、５．０６〜４．９４（ｍ、２Ｈ）、４．０（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．９７（ｓ、２Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．５４（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０６（ｑ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．６５（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７２．０９、１５２．６７、１４３．１８、１３７．６８、１１５．２０、６３．２０、３１．９１、２９．３９、２８．９１、２７．１８。
【００５２】
〔実施例４〕
５−アミノレブリン酸 ５−ヘキセニル塩酸塩（５−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００５３】
【化１５】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、５−アミノレブリン酸塩酸塩（ＡＬＡ．ＨＣｌ、２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させて５−ヘキセノール（５−ｈｅｘｅｎｏｌ）を入れる。反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ５−ヘキセニル塩酸塩（５−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を８９％の収率で得た．
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．３３（ｓ、３Ｈ）、５．８５〜５．７１（ｍ、１Ｈ）、５．０４〜４．９２（ｍ、２Ｈ）、３．９９（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．９３（ｓ、２Ｈ）、２．７８（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．５３（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、１．５６（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２０２．６６、１７２．０５、１３８．４１、１１５．０２、６３．９２、４６．５２、３４．２６、３２．６９、２７．５６、２７．０８、２４．５５。
【００５４】
〔実施例５〕
５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−２−ペンテニル塩酸塩（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００５５】
【化１６】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてシス−２−ペンテノール（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−２−ペンテニル塩酸塩（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を６８％の収率で得た。
【００５６】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．３７（ｓ、３Ｈ）、５．６２〜５．５８（ｍ、１Ｈ）、５．４７〜５．４１（ｍ、１Ｈ）、４．５６（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．９３（ｓ、２Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．５３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０６（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、０．９２（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．９４、１５２．６２、１４３．１８、１３６．３０、１２３．０３、５９．６０、３１．９０、２８．９１、２０．２７、１３．８６。
【００５７】
〔実施例６〕
５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−３−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００５８】
【化１７】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてシス−３−ヘキセノール（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−３−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を７２％の収率で得た。
【００５９】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．４２（ｂｒ ｓ、３Ｈ）、５．４３−５．３５（ｍ、２Ｈ）、３．９７（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、３．９１（ｓ、２Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．５０（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、１．５９（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、１．５６（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ２０２．５９、１７２．８１、１３４．７８、１２３．８３、６４．６５、４８．２５、３５．２１、２７．７２、２６．８５、２０．８３、１４．４５。
【００６０】
〔実施例７〕
５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−４−ヘキセニル塩酸塩（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００６１】
【化１８】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてシス−４−ヘキセノール（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ｃｉｓ−４−ヘキセニル塩酸塩、ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを９０％の収率で得た。
【００６２】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．２５（ｓ、３Ｈ）、５．５１〜５．４５（ｍ、１Ｈ）、５．３９〜５．３３（ｍ、１Ｈ）、４．２８（ｓ、２Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．９２（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．６５（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．１０（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．６７（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、１．８０（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２０２．３５、１７２．６０、１２９．０５、１２４．９２、６４．４９、４７．９１、３４．９６、２８．３２、２７．４９、２３．１２、１２．７３。
【００６３】
〔実施例８〕
５−アミノレブリン酸 ｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル塩酸塩（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎ−ａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の製造
【００６４】
【化１９】
塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＯＣｌ２）１ｍｌにＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）を３滴を入れてかき混ぜた後、ＡＬＡ．ＨＣｌ（２００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を入れて反応物を常温で１２時間かき混ぜた。前記反応物を感圧下で濃縮させてトランス−２−ヘキセノール（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｏｌ）を入れた。前記反応混合物を常温で１．５時間かき混ぜて感圧下で濃縮して、シリカゲルを用いて精製して５−アミノレブリン酸 ｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル塩酸塩（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｙｌ ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を７０％の収率で得た。
【００６５】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．２１（ｓ、３Ｈ）、５．８１〜５．７１（ｍ、１Ｈ）、５．５８〜５．４９（ｍ、１Ｈ）、４．５０（ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．２７（ｓ、２Ｈ）、２．９２（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．６６（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２（ｑ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．４０（ｓｉｘｔｅｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、０．９（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．８４、１５２．６２、１４３．１９、１３５．１３、１２４．１９、６４．３７、３３．５８、３１．８８、２８．９１、２１．５０、１３．４１。
【００６６】
〔実験例〕
１．公示材料
ア．細胞株
人体表皮角質形成細胞株（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨＥＫ）、
人体真皮線維細胞株（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ｈＦ）
扁平細胞癌細胞株：Ａ４３１（ＫＣＬＢ Ｎｏ．８０００５）
悪性黒色腫細胞株：ＴＸＭ１３（ＫＣＬＢ Ｎｏ．８００２９）
イ．動物
ＩＣＲマウス（大韓バイオリンク、韓國生命工學研究院、韓国）７〜８株の雌（ｆｅｍａｌｅ；♀）
ウ．光源照射器
光源照射器は、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）光源器を利用し、最大波長４１０ｎｍ（波長帯；４００〜４３０ｎｍ）であるｂｌｕｅ ｌｉｇｈｔ（青色）及び６３５ｎｍ（波長帯；６１５〜６４５ｎｍ）である赤色ＬＥＤ（Ｌｕｘｅｏｎ、Ｌｕｍｉｌｅｄｓ Ｌｉｇｈｔ）を用いて５−３０Ｊ／ｃｍ２の光源量を照射した。
【００６７】
２．溶解度検査
本実験は、前記実施例で製造された本発明のＡＬＡエステル（粉末）の溶媒別の溶解度検査を実行した。
【００６８】
その結果を下記表１に表わした。
【００６９】
【表１】
前述した結果、本発明のＡＬＡエステルは、アルコール、水、ＤＭＳＯなどの溶媒に易しく溶解される特性を有していることが分かった。
【００７０】
したがって、本発明のＡＬＡエステルは、局所用の外用軟膏剤などの剤型化で水溶性または油溶性媒介剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）をいずれも使うことができる。
【００７１】
３．細胞毒性検査（細胞生存率検査）
本実験は、細胞毒性検査であるＭＴＴ ａｓｓａｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を通じて次のような細胞毒性検査を実行した。
【００７２】
細胞株は、各ｗｅｌｌ当たり３×１０４個の細胞株が含まれるように９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ Ｄｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に種まきした。
約２４時間経過後、細胞が培養容器の底を６０〜７０％程度覆った時、ＡＬＡ及びＡＬＡ−ｅｓｔｅｒを濃度別に含有した無血清培養液１００ｕｌずつ交換して２４時間さらに培養した。
【００７３】
培養液にＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）をｗｅｌｌ当たり１０ｕｌずつ添加して４時間反応してＦｏｍａｚａｎ結晶体を形成させた後、発色溶液（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ｗｉｔｈ ０．０４ Ｎ ＨＣｌ）を１００ｕｌずつ入れて不溶性であるＦｏｍａｚａｎ結晶体を溶解させた。
【００７４】
溶解物の吸光度は、５７０ｎｍ波長下にＥＬＩＳＡ判読器（ＥＭＡＸ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）で測定した。
【００７５】
（１）人体表皮角質形成細胞株（ＨＥＫ）
ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを処理した人体角質形成細胞（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）で細胞生存率の結果を対照区（ＡＬＡ）と比べて、下記表１及び表２に表わした。この際、表１と表２は、相異なる時期に実験して異なる数値方法で表わしたものである。
【００７６】
【表２】
【００７７】
【表３】
（２）人体真皮線維細胞株（ｈＦ）
【００７８】
【表４】
（３）扁平細胞癌細胞株（Ａ４３１）
【００７９】
【表５】
（４）悪性黒色腫細胞株（ＴＭＸ１３）
【００８０】
【表６】
前述した表１ないし表５に表わしたように、ＡＬＡ及びＡＬＡエステルは、１ｍＭ以下の濃度では人体表皮角質形成細胞株であるＨＥＫを除外したすべての細胞生存率が７０％以上を保持することが分かった。これは、本発明の不飽和アルキル基を有したＡＬＡエステルは、ＡＬＡと比べて毒性反応を有さないことを示したものである。
【００８１】
４．蛍光分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）
蛍光分光法を通じてＡＬＡ及び不飽和アルキル基を有したＡＬＡエステルによるＰｐＩＸの合成量を細胞及び皮膚組職で定量化した。
【００８２】
ＰｐＩＸ合成量は、蛍光分光器（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｕｖｉｋｏｎ、ｍｏｄｅｌ９４３）を用いて測定した。この際、蛍光測定は、浮き上がり波長を４０８ｎｍにして測定した。
【００８３】
ア．細胞株
２×１０５個の各細胞株は、１０ｃｍ２のｄｉｓｈｅｓ（Ｆａｌｃｏｎ）に分周させて、７０〜８０％の融合された状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｓｔａｔｅ）になった時、ＡＬＡ及びＡＬＡエステルを濃度別（０．００１〜１ｍＭ）に含有した無血清培養液を添加して４時間培養した。
【００８４】
培養物は、ＰＢＳで一回水洗した後、１Ｍ次亜塩素酸（ＨＣｌＯ４）が含有された５０％メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）溶液を入れてコスターセルスクレーパー（Ｃｏｓｔａｒｃｅｌｌ ｓｃｒａｐｅｒ）で掻き出した（ｓｃｒａｐｉｎｇ）。
【００８５】
セルスクレーパーで回収した細胞は、５分間培養し、遠心分離して上澄み液を分離した。
【００８６】
分離された上澄み液は、蛍光分光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて興奮波長が４０５ｎｍであり、放出波長が６０５ｎｍにして測定した。
【００８７】
その結果は、図１及び図２に図示した。
【００８８】
前記測定結果、本発明のＡＬＡエステル、すなわち、ＡＬＡ−１、４、６は、ＡＬＡと比較時、Ａ４３１細胞株内でＰｐＩＸ合成がさらに高いことが分かった（図１）。
【００８９】
また、すべての細胞株でＰｐＩＸ合成量は、０．０１〜１ｍＭのＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルの処理濃度と比例して増加することが分かった。また、同一の細胞株でＰｐＩＸ合成量を観察した結果、本発明のＡＬＡエステル、すなわち、５−アミノレブリン酸の不飽和アルキルエステルは、ＡＬＡと比較時、効果的に細胞内でＰｐＩＸを合成することができることが分かった（図２）。この際、図２で、（Ａ）は人体角質形成細胞（ＨＥＫ）、（Ｂ）は人体真皮線維細胞株（ｈＦ）、（Ｃ）は扁平細胞癌細胞株（Ａ４３１）及び（Ｄ）は悪性黒色腫（ＴＸＭ１３）を表わしたものである。
【００９０】
前述した結果、本発明のＡＬＡエステルは、正常細胞及び癌細胞でＰｐＩＸを合成できることを示す。
【００９１】
イ．組職
（１）軟膏剤の製造
ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを含有した軟膏剤は、ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステル粉末とオクタデシルアルコール、ポリエチレングリコール、精製水などで組成されている水溶性ベース（ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｂａｓｅ）である水溶性軟膏基剤（ＳＡＭＡＢＡＳＥ、韓国）を混合して製造した。この際、ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルの混合比率は、それぞれ５％、１０％及び１５％（ｗ／ｗ）にした。
【００９２】
（２）臨床
前記製造した濃度別の軟膏剤は、毛が除去されたＩＣＲマウスの背中（ｂａｃｋ）に一定量（０．２５ｇ）を塗布させた。
【００９３】
塗布１時間及び４時間が経た後、ＩＣＲマウスは頸部を脱骨させて殺した後、ＩＣＲマウスなどの皮膚を採取した。
【００９４】
採取した皮膚５００ｍｇは、トリプシン／ＥＤＴＡ（ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ）溶液２ｍｌに入れた後、３０，０００ｒｐｍ及び５分間組職均質器（ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で均質化した。
【００９５】
均質物は、暗室（Ｄａｒｋｒｏｏｍ）に入れて３７℃で１時間タンパク質分解反応を実行し（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚｅｄ）、１Ｍ過塩素酸（ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）を含有した５０％（ｗ／ｗ）メタノール２ｍｌを添加した後、遠心分離して上澄み液を収得した。
【００９６】
分離された上澄み液は、蛍光分光度計を用いて興奮波長が４０５ｎｍであり、放出波長が６０５ｎｍにして測定した。
【００９７】
その結果は、図３及び図４に図示した。
【００９８】
前述した蛍光分光法を利用した測定結果、ＡＬＡと同様に本発明のＡＬＡエステルも吸収されてＰｐＩＸを合成できることが分かり、本発明のＡＬＡエステルがＡＬＡに比較時、さらに細胞壁をより容易に通過して光敏感剤であるＰｐＩＸ物質をさらに多く合成できることが分かった（図３）。
【００９９】
また、皮膚組職で吸収された本発明のＡＬＡエステルは、ＡＬＡと比べて皮膚角質の脂質層をより容易に通過して光敏感剤であるＰｐＩＸ物質をさらに多く合成できることが分かり、生体でのＰｐＩＸ合成は、塗布時間と量とによって左右されることが分かった（図４）。
【０１００】
５．蛍光顕微鏡観察法
前記本発明のＡＬＡエステルを含んだ軟膏剤は、前記同一の方法で各細胞株及びＩＣＲマウスの皮膚組職に処理し、該処理した細胞株と皮膚組職で合成されたＰｐＩＸの発現部位とを蛍光顕微鏡で観察した。
【０１０１】
ア．細胞株
本実験は、本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡを正常細胞株である人体角質形成細胞（ＨＥＫ）と人体真皮線維細胞株（ｈＫ）及び癌細胞である扁平細胞癌細胞株であるＡ４３１（Ｃ）と悪性黒色腫細胞株であるＴＸＭ１３（Ｄ）の培養液に＊＊ｍＭで処理した後、各細胞の細胞質で合成されるＰｐＩＸの蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。
【０１０２】
図５に図示したように、本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡを正常細胞株である人体角質形成細胞（Ａ）と人体真皮線維細胞株（Ｂ）、扁平細胞癌細胞株（Ａ４３１）と及び悪性黒色腫（ＴＸＭ１３）に処理した場合、すべての細胞の細胞質でいずれもＰｐＩＸが合成されて蓄積されていることが分かった（図５）。これは、正常細胞及び癌細胞でＡＬＡだけではなく、ＡＬＡエステルによってＰｐＩＸを合成できることを示す。
【０１０３】
イ．皮膚組職
本実験は、本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡを含んだ軟膏剤をＩＰＣマウス皮膚に塗布した後、１時間、２時間及び３時間後に発現されるＰｐＩＸを蛍光顕微鏡で測定した。
【０１０４】
その結果を図６及び図７に図示した。
【０１０５】
図６に図示されたように、ＩＰＣマウスの正常皮膚組職で経時的にＰｐＩＸの合成量が増加することが分かった。特に、皮膚組職の表皮と皮脂腺で経時的に強く発現された。この際、（Ａ）は１時間、（Ｂ）は２時間、（Ｃ）は３時間及びＣｏｎｔｒｏｌは、対照群を表わしたものである。
【０１０６】
図７に図示されたように、多様な皮膚疾患を表わす病変組職では、ＰｐＩＸが特定の癌細胞の部位から発現されることを観察できた。
【０１０７】
前述した結果から、本発明のＡＬＡエステルを含んだ軟膏剤は、特定病変組職の治療が可能であることを確認できた。
【０１０８】
６．細胞枯死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）及び細胞死（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）研究
ア．細胞株
流体細胞測定法（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＡＣＳ：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ、ＵＳＡ）を用いて６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに培養した各細胞株は、ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルで処理し、ＬＥＤ可視光線を照射した後、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ、ＢＤ）とで染色して、細胞枯死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を測定した。
【０１０９】
その結果は、図８に図示した。
【０１１０】
図８に図示したように、ＡＬＡ及び本発明の不飽和ＡＬＡアルキルエステルで処理していない細胞とＡＬＡ及びＡＬＡエステルを投与して可視光線を照射していない場合と可視光線である光源のみを照射（５−２０Ｊ／ｃｍ２）した場合、細胞は８５％以上の生存率を表わした（図８Ａ及び図８Ｂ）。しかし、１ｍＭ ＡＬＡと本発明のＡＬＡエステルを処理して光を照射した場合（５−２０Ｊ／ｃｍ２）に細胞は細胞枯死（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ−）や細胞枯死の末期段階（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ＋）に進行した（図８Ｃ及び図８Ｄ）。
【０１１１】
イ．皮膚組職
濃度別（５〜１５％）にＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを含有した軟膏剤は、毛が除去されたＩＣＲマウスの背中に一定量（０．２５ｇ）を塗布させた。
【０１１２】
１時間と４時間が経過した後、塗布された皮膚部位にＬＥＤ可視光線（照射量２５Ｊ／ｃｍ２）を照射した。
【０１１３】
２４時間、４８時間及び７２時間経過した後、マウスなどで皮膚組職を採取し、該採取された皮膚組職は、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ；Ｈ＆Ｅ）で染色して組職の細胞死を観察した。
【０１１４】
その結果を図９及び図１０に図示した。
【０１１５】
図９に図示したように、ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを皮膚に塗布して光線を照射したマウス群では、２４時間に皮膚組職の表皮が壊死または枯死が観察され（図９Ａ）、４８時間後には、皮膚組職の表皮が壊死と再生とが同時に観察された（図９Ｂ及び図９Ｃ）。この際、図９で（Ａ）は、ＡＬＡ塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射２４時間後を表わしたものであり、（Ｂ）は、ＡＬＡ−１（ＡＬＡ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射４８時間後を表わしたものであり、（Ｃ）は、ＡＬＡ−６（ＡＬＡ−ｈｅｘｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射４８時間後を表わしたものであり、（Ｄ）は、対照群で不飽和アルキルエステルを塗布した後、光線照射をしない場合を表わしたものである。
【０１１６】
図１０に図示されたように、皮脂腺が一部または全部破壊されるか萎縮されることが観察された。これは、皮脂腺が関与するにきび皮膚疾患の治療に関与することができることを示唆する。この際、（Ａ）は、ＡＬＡ塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射２４時間後を表わしたものであり、（Ｂ）は、ＡＬＡ−１（ＡＬＡ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射２４時間後を表わしたものであり、（Ｃ）は、ＡＬＡ−６（ＡＬＡ−ｈｅｘｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）塗布後、光線２５Ｊ／ｃｍ２照射２４時間後を表わしたものであり、（Ｄ）は、対照群で不飽和アルキルエステルを塗布した後、光線照射をしない場合を表わしたものである。
【０１１７】
７．貼布検査（ｐａｔｃｈ ｔｅｓｔ）
本実験例は、前記４−（イ）−（１）で製造した軟膏剤がアレルギー性及び原発性接触皮膚炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）を起こすかどうかを調べるのために、５０名の正常人を対象で貼布検査を施行した。
【０１１８】
正常ＩＣＲマウス（６０匹）の皮膚に５％、１０％及び１５％（ｗ／ｗ）濃度の軟膏剤を６時間と１２時間塗布した後、蒸溜水で軟膏を除去し、軟膏剤を塗らなかった対照群（２０匹）と比べて９０日間肉眼で皮膚を観察した。
【０１１９】
また、正常人体の皮膚に５％、１０％及び１５％濃度の軟膏剤を塗布して６時間、１２時間及び２４時間蜜閉した後に塗布部位を観察した。
【０１２０】
その結果、マウス（図示せず）や人体皮膚（図１１）にいずれも陰性所見を示した。
したがって、本発明のＡＬＡエステルを含んだ軟膏剤は、如何なるアレルギー性または一次的接触（光毒性）皮膚炎も引き起こさないことが分かった。
【０１２１】
８．本発明による軟膏剤の皮膚疾患治療効果
本実験は、１５％（ｗ／ｗ）のＡＬＡ−６（ＡＬＡ ｈｅｘｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）を含有した軟膏剤をにきび、光線角化症、砒素角化症及び基底細胞癌の患者に光線力学療法で治療して、治療効果があるか否かを確認しようとした。
【０１２２】
その結果、図１２ないし図１９に図示されたように、にきび、光線角化症、砒素角化症及び基底細胞癌治療に効果があるということが分かった。この際、図１２ないし図１７は、にきび治療効果を患者別に表わしたものであり、図１８は、光線角化症（Ａ）と砒素角化症（Ｂ）との治療効果を表わしたものであり、図１９は、基底細胞癌の治療効果を表わしたものである。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明では、ＡＬＡの効果的なエステルを開発して光線力学療法に利用される既存のＡＬＡより安全で効果的な光敏感物質として光線力学療法で皮膚疾患治療用の薬学的組成物に利用し、また、それら化合物を効率的に合成する製法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明のＡＬＡエステルを処理したＡ４３１細胞で形成されたＰｐＩＸの量を定量してグラフで表わしたものである。
【図２】本発明のＡＬＡエステルを処理した及び細胞株で形成されたＰｐＩＸの量を定量してグラフで表わしたものである。
【図３】同一の濃度のＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルを塗布した皮膚で形成されたＰｐＩＸ定量を表わしたものである。
【図４】本発明のＡＬＡエステルを濃度別に塗布した皮膚で形成されたＰｐＩＸの定量を処理１時間後（Ａ）と４時間後（Ｂ）とに区分して表わしたものである。
【図５】本発明のＡＬＡエステルを正常細胞株に処理した後、各細胞の細胞質で合成されるＰｐＩＸの蛍光を表わしたものである。
【図６】本発明のＡＬＡエステルをＩＰＣマウス皮膚に塗布した後、１時間（Ａ）、２時間（Ｂ）及び３時間（Ｃ）後に発現されるＰｐＩＸを蛍光顕微鏡で表わしたものである。
【図７】ＡＬＡ及び本発明のＡＬＡエステルをにきび（Ａ、Ｂ）、乾癬（Ｃ、Ｄ）、乳房外ページェット病（Ｅ、Ｆ）、基底細胞癌（Ｇ、Ｈ）の病変に３時間塗布した後、病変の炎症及び癌細胞で合成されるＰｐＩＸを顕微鏡（Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧ）と組職染色（Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨ）で確認して表わしたものである。
【図８】本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡを培養細胞に処理した後、光線照射による細胞死結果をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｓｓａｙによるｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＣＳ）の結果で表わしたものである。
【図９】本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡをＩＣＲマウス皮膚で塗布した後、光線照射による皮膚表皮の壊死及び再生可否を表わしたものである。
【図１０】本発明のＡＬＡエステル及びＡＬＡをＩＣＲマウス皮膚で塗布した後、光線照射時間による皮膚組職内の毛嚢と皮脂腺との変化を表わしたものである。
【図１１】人体皮膚に対する本発明のＡＬＡエステルの安全性を貼布実験で表わしたものである。
【図１２】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１３】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１４】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１５】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１６】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１７】本発明による軟膏剤のにきび治療効果を表わしたものである。
【図１８】本発明による軟膏剤の光線角化症（Ａ）及び砒素角化症（Ｂ）の治療効果を表わしたものである。
【図１９】本発明による軟膏剤の基底細胞癌の治療効果を表わしたものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（Ｉ）で表示される５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステルまたは薬学的に許容されるその塩：
【化１】
前記化学式（Ｉ）で、Ｒは２−プロペニル基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、ｃｉｓ−２−ペンテニル基、ｃｉｓ−３−ヘキセニル基、ｃｉｓ−４−ヘキセニル基及びｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル基を表わす。
【請求項２】
薬学的に許容される塩は、塩酸塩であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（ａ）下記化学式（ＩＩ）化合物を塩化チオニル及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと反応させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階で得られた物質をアリルアルコール、３−ブテノール（３−ｂｕｔｅｎｏｌ）、４−ペンテノール（４−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）、５−ヘキセノール（５−ｈｅｘｅｎｏｌ）、シス−２−ペンテノール（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）、シス−３−ヘキセノール（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｏｌ）、シス−４−ヘキセノール（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｏｌ）及びトランス−２−ヘキセノール（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｏｌ）からなる群から選択された不飽和アルコールと反応させる段階と、を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステルまたは薬学的に許容されるその塩の製法：
【化２】
。
【請求項４】
請求項１または２に記載の５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステルまたは薬学的に許容されるその塩を有効成分として含むことを特徴とする皮膚疾患治療用の薬学的組成物。
【請求項５】
前記皮膚疾患は、
にきびまたは皮膚癌であることを特徴とする請求項４に記載の皮膚疾患治療用の薬学的組成物。
【請求項１】
下記化学式（Ｉ）で表示される５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステルまたは薬学的に許容されるその塩：
【化１】
前記化学式（Ｉ）で、Ｒは２−プロペニル基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、ｃｉｓ−２−ペンテニル基、ｃｉｓ−３−ヘキセニル基、ｃｉｓ−４−ヘキセニル基及びｔｒａｎｓ−２−ヘキセニル基を表わす。
【請求項２】
薬学的に許容される塩は、塩酸塩であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（ａ）下記化学式（ＩＩ）化合物を塩化チオニル及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと反応させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階で得られた物質をアリルアルコール、３−ブテノール（３−ｂｕｔｅｎｏｌ）、４−ペンテノール（４−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）、５−ヘキセノール（５−ｈｅｘｅｎｏｌ）、シス−２−ペンテノール（ｃｉｓ−２−ｐｅｎｔｅｎｏｌ）、シス−３−ヘキセノール（ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｏｌ）、シス−４−ヘキセノール（ｃｉｓ−４−ｈｅｘｅｎｏｌ）及びトランス−２−ヘキセノール（ｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎｏｌ）からなる群から選択された不飽和アルコールと反応させる段階と、を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステルまたは薬学的に許容されるその塩の製法：
【化２】
。
【請求項４】
請求項１または２に記載の５−アミノレブリン酸不飽和アルキルエステルまたは薬学的に許容されるその塩を有効成分として含むことを特徴とする皮膚疾患治療用の薬学的組成物。
【請求項５】
前記皮膚疾患は、
にきびまたは皮膚癌であることを特徴とする請求項４に記載の皮膚疾患治療用の薬学的組成物。
【図１】
【図２（Ａ）】
【図２（Ｂ）】
【図２（Ｃ）】
【図２（Ｄ）】
【図３】
【図４（Ａ）】
【図４（Ｂ）】
【図５（Ａ）】
【図５（Ｂ）】
【図５（Ｃ）】
【図５（Ｄ）】
【図６（Ａ）】
【図６（Ｂ）】
【図６Ｃ−１】
【図６Ｃ−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８（Ａ）】
【図１８（Ｂ）】
【図１９】
【図２（Ａ）】
【図２（Ｂ）】
【図２（Ｃ）】
【図２（Ｄ）】
【図３】
【図４（Ａ）】
【図４（Ｂ）】
【図５（Ａ）】
【図５（Ｂ）】
【図５（Ｃ）】
【図５（Ｄ）】
【図６（Ａ）】
【図６（Ｂ）】
【図６Ｃ−１】
【図６Ｃ−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８（Ａ）】
【図１８（Ｂ）】
【図１９】
【公表番号】特表２００９−５３９９７１（Ｐ２００９−５３９９７１Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１５３１６（Ｐ２００９−５１５３１６）
【出願日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３１４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００２０８７
【国際公開日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【出願人】（３０８０２６８６１）インダストリー ファウンデーション オブ チョンナム ナショナル ユニバーシティー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３１４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００２０８７
【国際公開日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【出願人】（３０８０２６８６１）インダストリー ファウンデーション オブ チョンナム ナショナル ユニバーシティー (9)
【Ｆターム（参考）】
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