ＤＮＡの凝縮を検出する方法
【課題】 ＤＮＡの凝縮をそのまま直接に簡便に解析でき、短時間に多検体のＤＮＡ凝縮を検出できる方法を提供する。
【解決手段】 蛍光標識つきＤＮＡにポリエチレングリコールおよびＭｇＣｌ2を混合し３０分間室温で静置する。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）または蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）でＤＮＡの並進拡散時間、明るさまたは数を測定する。
【解決手段】 蛍光標識つきＤＮＡにポリエチレングリコールおよびＭｇＣｌ2を混合し３０分間室温で静置する。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）または蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）でＤＮＡの並進拡散時間、明るさまたは数を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＤＮＡの凝縮をＦＣＳまたはＦＩＤＡを用いて検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの凝縮・凝集体の観察・検出は、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、レーザートラップ顕微鏡で行われている。
【０００３】
また、YOYOなどのインターカレーターを用いた蛍光顕微鏡でＤＮＡの凝縮を観察することや、特許文献１に記載されるように、クロマチンまたは染色体にこれらを分散・凝縮させるポリペプチドなどを加え、分散・凝縮の様子を位相差顕微鏡や蛍光顕微鏡で観察することが行われている。
【特許文献１】特表平9-510085号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、レーザートラップ顕微鏡などを用いた観察・検出では、ＤＮＡを固定するための専用基板を作成する工程やＤＮＡサンプルを乾燥する工程など、観察・検出までに作業工程と時間がかかる。また、蛍光顕微鏡を使ってオペレーターが観察する場合は、短時間に多くの検体を観察することは困難である。
【０００５】
本発明の目的は、ＤＮＡの凝縮をそのまま直接に簡便に解析でき、短時間に多検体のＤＮＡ凝縮を検出できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成する本発明の特徴は、ＤＮＡを凝縮させる物質を含むサンプル溶液と蛍光標識つきＤＮＡを含む溶液とを混合し、蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy）または蛍光強度分散分析法(FIDA: Fluorescence Intensity Distribution Analysis)により混合溶液中の蛍光標識を有するＤＮＡの大きさまたは明るさを求めることにある。蛍光標識つきＤＮＡには、クロマチンや染色体に蛍光分子を接続したものを用いる。
【０００７】
ＤＮＡが凝縮するとＤＮＡはひも状から球状へ変化する。それに伴ってＤＮＡ分子全体の大きさが減少する。ＤＮＡに蛍光分子を標識しておくと、ＤＮＡは蛍光分子を巻き込むようにして凝縮して球状となるため、蛍光分子の発光がＤＮＡによって遮られて、観察される明るさが著しく減少する。蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法でＤＮＡの大きさまたは明るさを求めて、その値からＤＮＡの凝縮を検出することができる。
【０００８】
従って、本発明の特徴によれば、原子力間顕微鏡などでの観察・測定で行うような固体基質への分子の固定作業などの煩雑な操作を行わずに、溶液中に浮遊したままのＤＮＡを利用してＤＮＡの凝縮・非凝縮反応試験を行うことができるとともに、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で反応溶液中の蛍光を発する分子の大きさまたは明るさを求めて、その値からＤＮＡの凝縮および非凝縮を知ることができるので、ＤＮＡとサンプル液との凝縮反応の有無を、簡便に短時間で精度良く検出することができる。
【０００９】
また、複数の蛍光標識つきＤＮＡが一体になって凝縮する分子間凝縮が生じる場合には、蛍光を発する分子の数が、凝縮反応の前後で減少するので、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で蛍光を発する分子の数を求めることにより、ＤＮＡの分子間凝縮を検出することができる。
【００１０】
また、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法は他の解析方法に比べて、蛍光標識つきＤＮＡおよびサンプル溶液ともごく少量で解析を行うことができるので、安価にＤＮＡの凝縮反応の有無を知ることができる。また、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法は、単独でも組み合わせて行ってもよい。組み合わせておくことによって、より精度よくＤＮＡの凝縮反応を検出することができる。
【００１１】
本発明の他の特徴は、蛍光標識つきDNAを含む溶液とサンプル溶液とをマイクロプレートのウエル内で混合し、ウエル内の混合溶液について蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法により混合溶液中のＤＮＡの大きさ、明るさまたは数を求めることにある。この特徴によれば、混合から反応および測定までをすべて同一の容器内で行うことができ、ウエル数の混合溶液についてＤＮＡの大きさ、明るさまたは数を簡便に短時間で精度良く得ることができ、これらの値からＤＮＡの凝縮反応の有無を検出することができるので、一度に多種のサンプルとの反応試験を行い、反応液を精製せずにそのままで、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法をもちいてＤＮＡとサンプル液との反応の有無を簡便にかつ短時間で検出することができる。多検体についての反応試験を短時間で行うのに有効である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の特徴によれば、溶液中に浮遊したままのＤＮＡを利用してＤＮＡの凝縮・非凝縮反応試験を行うことができるとともに、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で反応溶液中の蛍光を発する分子の大きさまたは明るさを求めて、その値からＤＮＡの凝縮および非凝縮を知ることができるので、ＤＮＡとサンプル液との凝縮反応の有無を、簡便に短時間で精度良く検出することができる。
【００１３】
また、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で蛍光を発する分子の数を求めることにより、ＤＮＡの分子間凝縮を検出することができる。
【００１４】
また、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法は他の解析方法に比べて、蛍光標識つきＤＮＡおよびサンプル溶液とも少量で解析を行うことができるので、安価にＤＮＡの凝縮反応の有無を知ることができる。
【００１５】
本発明の他の特徴によれば、混合から反応および測定までをすべて同一の容器内で行うことができ、ウエル数の混合溶液についてＤＮＡの大きさ、明るさまたは数を簡便に短時間で精度良く得ることができ、これらの値からＤＮＡの凝縮反応の有無を検出することができるので、一度に多種のサンプルとの反応試験を行い、反応液を精製せずにそのままで、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法をもちいてＤＮＡとサンプル液との反応の有無を簡便にかつ短時間で検出することができる。多検体についての反応試験を短時間で行うのに有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（ＦＣＳ計測とＦＩＤＡ計測）
ＤＮＡが凝縮するとＤＮＡはひも状から球状へ変化する。それに伴ってＤＮＡ分子全体の大きさが減少する。ＤＮＡ１に蛍光分子２を標識しておくと、ＤＮＡ１は蛍光分子２を巻き込むようにして凝縮して球状となるため、蛍光分子２の発光がＤＮＡ１によって遮られて、観察される明るさが著しく減少する（図８を参照）。蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法でＤＮＡの大きさまたは明るさを求めて、その値からＤＮＡの凝縮を検出することができる。
【００１７】
１分子蛍光分析装置を使って、マイクロプレートのウエル中の反応液について蛍光相関分光法(ＦＣＳ：Fluorescence Correlation Spectroscopy)または蛍光強度分布解析法（FIDA：Fluorescence Intensity Distribution Analysis）で蛍光解析を行う。蛍光相関分光法による蛍光解析（ＦＣＳ計測）と蛍光強度分布解析法による蛍光解析（ＦＩＤＡ計測）のうち、どちらか一方でも反応の有無を知ることができるが、両方の計測を行えば、より精度よく反応の有無を知ることができる。
【００１８】
ＦＣＳ測定では、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを測定し、得られた情報に基づいて並進拡散時間(Diffusion Time)と明るさを求める。並進拡散時間の大小は分子の大きさの大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子の大きさの変化がわかる。すなわち、並進拡散時間の増加はＤＮＡが伸びたこと、並進拡散時間の減少はＤＮＡが縮んだことを示す。従って、蛍光標識ＤＮＡとサンプルとの反応の前後で、蛍光標識されたＤＮＡの並進拡散時間の変化を検出することにより、サンプルによる蛍光標識ＤＮＡの凝縮反応を検出することができる。
【００１９】
ＦＩＤＡ測定では、微小領域内の蛍光を発している分子の明るさを測定する。明るさの減少はＤＮＡが縮んだことを示す。従って、蛍光標識ＤＮＡとサンプルとの反応の前後で、蛍光標識されたＤＮＡの明るさの変化を検出することにより、サンプルによる蛍光標識ＤＮＡの凝縮反応を検出することができる。
【００２０】
以下に、本発明の実施例を説明する。実施例１では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：Polyethylene glycol）と塩化マグネシウムによるＤＮＡの凝縮の検出、実施例２では、スペルミジンによるＤＮＡの凝縮の検出を説明する。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
本実施例では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：Polyethylene glycol）と塩化マグネシウムによるＤＮＡの凝縮の検出を、実験１〜３で行う。
【００２２】
（実験1）
実験1では、大きさの異なるＤＮＡにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）を添加し、ＦＣＳ測定で並進拡散時間と明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮を検出する。
【００２３】
（１）ＤＮＡの調整
大きさが、５０、１００、２００、４００、８００、２０００、４０００、６０００、１００００ｂｐである９種類のＤＮＡを以下の方法で作成する。
【００２４】
まず、５’末端に蛍光色素ＴＡＭＲＡ（carboxytetramethylrhodamine、励起極大：555nm、蛍光極大：580nm）を付けたプライマー（フォワード、Ｆプライマー）、未標識プライマー（リバース）および鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲ法にてＤＮＡを増幅する。各プライマーの増幅には、鋳型ＤＮＡとしてλファージＤＮＡ（48,502bp）を使用する。
【００２５】
各プライマーのDNA配列を表１に示す。表中のＲプライマーはリバースプライマーを、Ｆプライマーはフォワードプライマーを示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
次に、増幅したＤＮＡをアニーリングさせた後、ＰＣＲ反応液100μlに対して、エキソヌクレアーゼＩ（Exonuclease I, EPICENTRE X40501K)を１μlおよび1ＭのＭｇＣｌ2を1μl添加して37℃で1〜2時間反応させ、ＰＣＲ反応液中に存在する一本鎖ＤＮＡを断片消化する。その後、大きさが５０および１００ｂｐのＤＮＡはＤＮＡ精製・抽出キット（MERmaid SPIN Kit, BIO 101)で、それ以上の大きさのＤＮＡはＰＣＲ精製キット（Quagen）で精製する。最後に、蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence Correlation Spectroscopy）で測定し、粒子数を２０程度（ＦＣＳ装置の測定領域の体積である1フェムトリットルあたり）に調整する。
【００２８】
（２）ＰＥＧおよびＭｇＣｌ2の混合
各大きさの１ｎＭの蛍光標識ＤＮＡ、１０ｍＭのＭＯＰＳ（3-Morpholinopropanesulfonic acid）バッファー、６０ｍｇ／ｍＬの平均分子量が６０００であるＰＥＧ (以後ＰＥＧ６０００と略す)および濃度０または濃度100ｍＭのＭｇＣｌ2を混合し３０分間室温で静置する。
【００２９】
（３）ＦＣＳ測定
混合液について、蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence Correlation Spectroscopy）でＤＮＡの並進拡散時間と明るさを測定した。ＦＣＳ測定はレーザー５４３ｎｍ励起２５０μＷで、１サンプルあたり５０秒５回の測定を行った。
【００３０】
ＦＣＳ測定の結果を表２に示す。このうち、ＤＮＡの大きさごとの並進拡散時間を図１に、明るさを図２に示す。図１では800ｂｐのＤＮＡを境にして並進拡散時間が著しく減少しており、ＤＮＡの大きさが小さくなっていることが確認できた。また、図２でも800ｂｐのＤＮＡを境にして、明るさ（CPP)も減少していることが確認できた。したがって、ＦＣＳ測定で並進拡散時間と明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮が検出できた。
【００３１】
【表２】
【００３２】
（実験２）
実験２では、大きさの異なるＤＮＡにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と塩化マグネシウムを添加し、ＦＩＤＡ測定で明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮を検出する。
【００３３】
実験１と同様に（１）ＤＮＡの調整および（２）ＰＥＧ６０００およびＭｇＣｌ2の混合を行う。そして得られた混合液について、（３）蛍光強度分散分析法(ＦＩＤＡ: Fluorescence Intensity Distribution Analysis)でＤＮＡの明るさを測定した。ＦＩＤＡ測定はレーザー５４３ｎｍ励起２５０μＷで、１サンプルあたり２秒５回の測定を行った。
【００３４】
図３に、ＦＩＤＡ測定によるＤＮＡの大きさごとの明るさを示す。実験３でも実験1と同様に800ｂｐのＤＮＡを境にして明るさ（CPP)が減少していることが確認できた。したがって、ＦＩＤＡ測定で明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮が検出できた。
【００３５】
（実験３）
実験３では、実験１で調整したＤＮＡのうち、６ｋｂｐのＤＮＡを使って、ＰＥＧ６０００の濃度およびＭｇＣｌ2の濃度がＤＮＡの凝縮に及ぼす影響を調べた。
【００３６】
１ｎＭの蛍光標識ＤＮＡ（６ｋｂｐ）、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー（3-Morpholinopropanesulfonic acid）、０〜100ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ６０００および０〜２００ｍＭのＭｇＣｌ2を混合し３０分間室温で静置した。その後、実験１と同様にＦＣＳ測定を行った。
【００３７】
図４に、ＦＣＳ測定によるＰＥＧ６０００およびＭｇＣｌ2の濃度ごとの並進拡散時間を示す。図４から、ＰＥＧ６０００の濃度が４０mg/ml以上、かつ、ＭｇＣｌ2の濃度が４０ｍＭ以上のときに、６ｋｂｐのＤＮＡに凝縮が起こることが検出できた。
【００３８】
（実施例２）
本実施例では、ポリアミンであるスペルミジンによるＤＮＡの凝縮の検出を、実験４および５で行う。
【００３９】
（実験４）
実験４では、大きさの異なるＤＮＡにスペルミジンを添加し、ＦＣＳ測定で並進拡散時間と明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮を検出する。
【００４０】
（１）ＤＮＡの調整
実験１と同様に、５０、１００、２００、４００、８００、２０００、４０００、６０００、１００００ｂｐである９種類のＤＮＡを調製する。
【００４１】
（２）スペルミジンの混合
各大きさの１ｎＭの蛍光標識ＤＮＡ、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー（3-Morpholinopropanesulfonic acid）、濃度０または濃度１６０μＭのスペルミジンを混合し２時間室温で静置する。
【００４２】
（３）ＦＣＳ測定
実験１と同様に（３）混合液について、蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence Correlation Spectroscopy）でＤＮＡの並進拡散時間と明るさを測定した。ＦＣＳ測定はレーザー５４３ｎｍ励起２５０μＷで、１サンプルあたり５０秒５回の測定を行った。
【００４３】
図５にＤＮＡの大きさごとの並進拡散時間を示す。図５では大きさが５０ｂｐ〜１０ｋｂｐのＤＮＡは、１６０μＭのスペルミジンを添加することにより並進拡散時間が著しく減少しており、ＤＮＡの大きさが小さくなっていることが確認できた。したがって、ＦＣＳ測定で並進拡散時間と明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮が検出できた。
【００４４】
（実験５）
実験５では、実験４で調整したＤＮＡのうち、６ｋｂｐのＤＮＡを使って、スペルミジンの濃度がＤＮＡの凝縮に及ぼす影響を調べた。
【００４５】
１ｎＭの蛍光標識ＤＮＡ（６ｋｂｐ）、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー（3-Morpholinopropanesulfonic acid）、濃度が０、４０、８０、１２０、１６０、２００μＭのスペルミジンを混合し２時間静置した。その後、実験４と同様にＦＣＳ測定を行った。
【００４６】
ＦＣＳ測定の結果を表３に示す。このうち、スペルミジンの濃度ごとのＤＮＡの並進拡散時間を図６に、蛍光を発する分子の数を図７に示す。図６から、スペルミジンの濃度が６０μＭ前後で、６ｋｂｐのＤＮＡが完全凝縮することが検出できた。また、図６に示した並進拡散時間の変化と同様に、図７は蛍光標識つきDNAの数が減少していることを示している。これは、１つのDNAだけで凝縮が生じているのではなく、複数のDNAが一体に凝縮する分子間凝縮が生じていることを示す。したがって、ＦＣＳ測定で並進拡散時間を測定することによってＤＮＡの凝縮が検出でき、蛍光を発する分子の数を測定することによって、DNAの分子間凝縮を検出することができた。
【００４７】
【表３】
【００４８】
ＦＣＳ測定またはＦＩＤＡ測定を行う際には、溶液の混合、反応および計測をマイクロプレートのウエル中で行うとよい。ウエル数の検体を用意し、測定を行うことによって、一度に多量の検体を簡便にかつハイスループットにスクリーニングすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、ＤＮＡの凝縮・非凝縮・分散に関する物質のスクリーニングのためのアッセイに適用でき、汎用性が高く、簡単、迅速および低コストにアッセイを行うことができる。ＤＮＡの凝縮・非凝縮・分散に関する物質は、クロマチン/染色体分析、特定の受精能力評価における生殖、受精不能の診断および治療に利用が期待される。さらにグロビュール（球状）化された取扱いやすいＤＮＡは遺伝子治療等に広く利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実験１のＦＣＳ測定によるＤＮＡの大きさごとの並進拡散時間を示す図。
【図２】実験１のＦＣＳ測定によるＤＮＡの大きさごとの明るさを示す図。
【図３】実験２のＦＩＤＡ測定によるＤＮＡの大きさごとの明るさを示す図。
【図４】実験３のＦＣＳ測定によるＰＥＧ６０００およびＭｇＣｌ2の濃度ごとの並進拡散時間を示す図。
【図５】実験４のＦＣＳ測定によるＤＮＡの大きさごとの並進拡散時間を示す図。
【図６】実験５のＦＣＳ測定によるスペルミジンの濃度ごとの並進拡散時間を示す図。
【図７】実験５のＦＣＳ測定によるスペルミジンの濃度ごとの蛍光を発する分子の数を示す図。
【図８】蛍光標識付きＤＮＡが凝縮する様子を示す図。
【符号の説明】
【００５１】
１…ＤＮＡ、２…蛍光分子。
【技術分野】
【０００１】
ＤＮＡの凝縮をＦＣＳまたはＦＩＤＡを用いて検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの凝縮・凝集体の観察・検出は、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、レーザートラップ顕微鏡で行われている。
【０００３】
また、YOYOなどのインターカレーターを用いた蛍光顕微鏡でＤＮＡの凝縮を観察することや、特許文献１に記載されるように、クロマチンまたは染色体にこれらを分散・凝縮させるポリペプチドなどを加え、分散・凝縮の様子を位相差顕微鏡や蛍光顕微鏡で観察することが行われている。
【特許文献１】特表平9-510085号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、レーザートラップ顕微鏡などを用いた観察・検出では、ＤＮＡを固定するための専用基板を作成する工程やＤＮＡサンプルを乾燥する工程など、観察・検出までに作業工程と時間がかかる。また、蛍光顕微鏡を使ってオペレーターが観察する場合は、短時間に多くの検体を観察することは困難である。
【０００５】
本発明の目的は、ＤＮＡの凝縮をそのまま直接に簡便に解析でき、短時間に多検体のＤＮＡ凝縮を検出できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成する本発明の特徴は、ＤＮＡを凝縮させる物質を含むサンプル溶液と蛍光標識つきＤＮＡを含む溶液とを混合し、蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy）または蛍光強度分散分析法(FIDA: Fluorescence Intensity Distribution Analysis)により混合溶液中の蛍光標識を有するＤＮＡの大きさまたは明るさを求めることにある。蛍光標識つきＤＮＡには、クロマチンや染色体に蛍光分子を接続したものを用いる。
【０００７】
ＤＮＡが凝縮するとＤＮＡはひも状から球状へ変化する。それに伴ってＤＮＡ分子全体の大きさが減少する。ＤＮＡに蛍光分子を標識しておくと、ＤＮＡは蛍光分子を巻き込むようにして凝縮して球状となるため、蛍光分子の発光がＤＮＡによって遮られて、観察される明るさが著しく減少する。蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法でＤＮＡの大きさまたは明るさを求めて、その値からＤＮＡの凝縮を検出することができる。
【０００８】
従って、本発明の特徴によれば、原子力間顕微鏡などでの観察・測定で行うような固体基質への分子の固定作業などの煩雑な操作を行わずに、溶液中に浮遊したままのＤＮＡを利用してＤＮＡの凝縮・非凝縮反応試験を行うことができるとともに、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で反応溶液中の蛍光を発する分子の大きさまたは明るさを求めて、その値からＤＮＡの凝縮および非凝縮を知ることができるので、ＤＮＡとサンプル液との凝縮反応の有無を、簡便に短時間で精度良く検出することができる。
【０００９】
また、複数の蛍光標識つきＤＮＡが一体になって凝縮する分子間凝縮が生じる場合には、蛍光を発する分子の数が、凝縮反応の前後で減少するので、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で蛍光を発する分子の数を求めることにより、ＤＮＡの分子間凝縮を検出することができる。
【００１０】
また、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法は他の解析方法に比べて、蛍光標識つきＤＮＡおよびサンプル溶液ともごく少量で解析を行うことができるので、安価にＤＮＡの凝縮反応の有無を知ることができる。また、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法は、単独でも組み合わせて行ってもよい。組み合わせておくことによって、より精度よくＤＮＡの凝縮反応を検出することができる。
【００１１】
本発明の他の特徴は、蛍光標識つきDNAを含む溶液とサンプル溶液とをマイクロプレートのウエル内で混合し、ウエル内の混合溶液について蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法により混合溶液中のＤＮＡの大きさ、明るさまたは数を求めることにある。この特徴によれば、混合から反応および測定までをすべて同一の容器内で行うことができ、ウエル数の混合溶液についてＤＮＡの大きさ、明るさまたは数を簡便に短時間で精度良く得ることができ、これらの値からＤＮＡの凝縮反応の有無を検出することができるので、一度に多種のサンプルとの反応試験を行い、反応液を精製せずにそのままで、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法をもちいてＤＮＡとサンプル液との反応の有無を簡便にかつ短時間で検出することができる。多検体についての反応試験を短時間で行うのに有効である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の特徴によれば、溶液中に浮遊したままのＤＮＡを利用してＤＮＡの凝縮・非凝縮反応試験を行うことができるとともに、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で反応溶液中の蛍光を発する分子の大きさまたは明るさを求めて、その値からＤＮＡの凝縮および非凝縮を知ることができるので、ＤＮＡとサンプル液との凝縮反応の有無を、簡便に短時間で精度良く検出することができる。
【００１３】
また、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で蛍光を発する分子の数を求めることにより、ＤＮＡの分子間凝縮を検出することができる。
【００１４】
また、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法は他の解析方法に比べて、蛍光標識つきＤＮＡおよびサンプル溶液とも少量で解析を行うことができるので、安価にＤＮＡの凝縮反応の有無を知ることができる。
【００１５】
本発明の他の特徴によれば、混合から反応および測定までをすべて同一の容器内で行うことができ、ウエル数の混合溶液についてＤＮＡの大きさ、明るさまたは数を簡便に短時間で精度良く得ることができ、これらの値からＤＮＡの凝縮反応の有無を検出することができるので、一度に多種のサンプルとの反応試験を行い、反応液を精製せずにそのままで、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法をもちいてＤＮＡとサンプル液との反応の有無を簡便にかつ短時間で検出することができる。多検体についての反応試験を短時間で行うのに有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（ＦＣＳ計測とＦＩＤＡ計測）
ＤＮＡが凝縮するとＤＮＡはひも状から球状へ変化する。それに伴ってＤＮＡ分子全体の大きさが減少する。ＤＮＡ１に蛍光分子２を標識しておくと、ＤＮＡ１は蛍光分子２を巻き込むようにして凝縮して球状となるため、蛍光分子２の発光がＤＮＡ１によって遮られて、観察される明るさが著しく減少する（図８を参照）。蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法でＤＮＡの大きさまたは明るさを求めて、その値からＤＮＡの凝縮を検出することができる。
【００１７】
１分子蛍光分析装置を使って、マイクロプレートのウエル中の反応液について蛍光相関分光法(ＦＣＳ：Fluorescence Correlation Spectroscopy)または蛍光強度分布解析法（FIDA：Fluorescence Intensity Distribution Analysis）で蛍光解析を行う。蛍光相関分光法による蛍光解析（ＦＣＳ計測）と蛍光強度分布解析法による蛍光解析（ＦＩＤＡ計測）のうち、どちらか一方でも反応の有無を知ることができるが、両方の計測を行えば、より精度よく反応の有無を知ることができる。
【００１８】
ＦＣＳ測定では、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを測定し、得られた情報に基づいて並進拡散時間(Diffusion Time)と明るさを求める。並進拡散時間の大小は分子の大きさの大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子の大きさの変化がわかる。すなわち、並進拡散時間の増加はＤＮＡが伸びたこと、並進拡散時間の減少はＤＮＡが縮んだことを示す。従って、蛍光標識ＤＮＡとサンプルとの反応の前後で、蛍光標識されたＤＮＡの並進拡散時間の変化を検出することにより、サンプルによる蛍光標識ＤＮＡの凝縮反応を検出することができる。
【００１９】
ＦＩＤＡ測定では、微小領域内の蛍光を発している分子の明るさを測定する。明るさの減少はＤＮＡが縮んだことを示す。従って、蛍光標識ＤＮＡとサンプルとの反応の前後で、蛍光標識されたＤＮＡの明るさの変化を検出することにより、サンプルによる蛍光標識ＤＮＡの凝縮反応を検出することができる。
【００２０】
以下に、本発明の実施例を説明する。実施例１では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：Polyethylene glycol）と塩化マグネシウムによるＤＮＡの凝縮の検出、実施例２では、スペルミジンによるＤＮＡの凝縮の検出を説明する。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
本実施例では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：Polyethylene glycol）と塩化マグネシウムによるＤＮＡの凝縮の検出を、実験１〜３で行う。
【００２２】
（実験1）
実験1では、大きさの異なるＤＮＡにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）を添加し、ＦＣＳ測定で並進拡散時間と明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮を検出する。
【００２３】
（１）ＤＮＡの調整
大きさが、５０、１００、２００、４００、８００、２０００、４０００、６０００、１００００ｂｐである９種類のＤＮＡを以下の方法で作成する。
【００２４】
まず、５’末端に蛍光色素ＴＡＭＲＡ（carboxytetramethylrhodamine、励起極大：555nm、蛍光極大：580nm）を付けたプライマー（フォワード、Ｆプライマー）、未標識プライマー（リバース）および鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲ法にてＤＮＡを増幅する。各プライマーの増幅には、鋳型ＤＮＡとしてλファージＤＮＡ（48,502bp）を使用する。
【００２５】
各プライマーのDNA配列を表１に示す。表中のＲプライマーはリバースプライマーを、Ｆプライマーはフォワードプライマーを示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
次に、増幅したＤＮＡをアニーリングさせた後、ＰＣＲ反応液100μlに対して、エキソヌクレアーゼＩ（Exonuclease I, EPICENTRE X40501K)を１μlおよび1ＭのＭｇＣｌ2を1μl添加して37℃で1〜2時間反応させ、ＰＣＲ反応液中に存在する一本鎖ＤＮＡを断片消化する。その後、大きさが５０および１００ｂｐのＤＮＡはＤＮＡ精製・抽出キット（MERmaid SPIN Kit, BIO 101)で、それ以上の大きさのＤＮＡはＰＣＲ精製キット（Quagen）で精製する。最後に、蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence Correlation Spectroscopy）で測定し、粒子数を２０程度（ＦＣＳ装置の測定領域の体積である1フェムトリットルあたり）に調整する。
【００２８】
（２）ＰＥＧおよびＭｇＣｌ2の混合
各大きさの１ｎＭの蛍光標識ＤＮＡ、１０ｍＭのＭＯＰＳ（3-Morpholinopropanesulfonic acid）バッファー、６０ｍｇ／ｍＬの平均分子量が６０００であるＰＥＧ (以後ＰＥＧ６０００と略す)および濃度０または濃度100ｍＭのＭｇＣｌ2を混合し３０分間室温で静置する。
【００２９】
（３）ＦＣＳ測定
混合液について、蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence Correlation Spectroscopy）でＤＮＡの並進拡散時間と明るさを測定した。ＦＣＳ測定はレーザー５４３ｎｍ励起２５０μＷで、１サンプルあたり５０秒５回の測定を行った。
【００３０】
ＦＣＳ測定の結果を表２に示す。このうち、ＤＮＡの大きさごとの並進拡散時間を図１に、明るさを図２に示す。図１では800ｂｐのＤＮＡを境にして並進拡散時間が著しく減少しており、ＤＮＡの大きさが小さくなっていることが確認できた。また、図２でも800ｂｐのＤＮＡを境にして、明るさ（CPP)も減少していることが確認できた。したがって、ＦＣＳ測定で並進拡散時間と明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮が検出できた。
【００３１】
【表２】
【００３２】
（実験２）
実験２では、大きさの異なるＤＮＡにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と塩化マグネシウムを添加し、ＦＩＤＡ測定で明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮を検出する。
【００３３】
実験１と同様に（１）ＤＮＡの調整および（２）ＰＥＧ６０００およびＭｇＣｌ2の混合を行う。そして得られた混合液について、（３）蛍光強度分散分析法(ＦＩＤＡ: Fluorescence Intensity Distribution Analysis)でＤＮＡの明るさを測定した。ＦＩＤＡ測定はレーザー５４３ｎｍ励起２５０μＷで、１サンプルあたり２秒５回の測定を行った。
【００３４】
図３に、ＦＩＤＡ測定によるＤＮＡの大きさごとの明るさを示す。実験３でも実験1と同様に800ｂｐのＤＮＡを境にして明るさ（CPP)が減少していることが確認できた。したがって、ＦＩＤＡ測定で明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮が検出できた。
【００３５】
（実験３）
実験３では、実験１で調整したＤＮＡのうち、６ｋｂｐのＤＮＡを使って、ＰＥＧ６０００の濃度およびＭｇＣｌ2の濃度がＤＮＡの凝縮に及ぼす影響を調べた。
【００３６】
１ｎＭの蛍光標識ＤＮＡ（６ｋｂｐ）、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー（3-Morpholinopropanesulfonic acid）、０〜100ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ６０００および０〜２００ｍＭのＭｇＣｌ2を混合し３０分間室温で静置した。その後、実験１と同様にＦＣＳ測定を行った。
【００３７】
図４に、ＦＣＳ測定によるＰＥＧ６０００およびＭｇＣｌ2の濃度ごとの並進拡散時間を示す。図４から、ＰＥＧ６０００の濃度が４０mg/ml以上、かつ、ＭｇＣｌ2の濃度が４０ｍＭ以上のときに、６ｋｂｐのＤＮＡに凝縮が起こることが検出できた。
【００３８】
（実施例２）
本実施例では、ポリアミンであるスペルミジンによるＤＮＡの凝縮の検出を、実験４および５で行う。
【００３９】
（実験４）
実験４では、大きさの異なるＤＮＡにスペルミジンを添加し、ＦＣＳ測定で並進拡散時間と明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮を検出する。
【００４０】
（１）ＤＮＡの調整
実験１と同様に、５０、１００、２００、４００、８００、２０００、４０００、６０００、１００００ｂｐである９種類のＤＮＡを調製する。
【００４１】
（２）スペルミジンの混合
各大きさの１ｎＭの蛍光標識ＤＮＡ、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー（3-Morpholinopropanesulfonic acid）、濃度０または濃度１６０μＭのスペルミジンを混合し２時間室温で静置する。
【００４２】
（３）ＦＣＳ測定
実験１と同様に（３）混合液について、蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence Correlation Spectroscopy）でＤＮＡの並進拡散時間と明るさを測定した。ＦＣＳ測定はレーザー５４３ｎｍ励起２５０μＷで、１サンプルあたり５０秒５回の測定を行った。
【００４３】
図５にＤＮＡの大きさごとの並進拡散時間を示す。図５では大きさが５０ｂｐ〜１０ｋｂｐのＤＮＡは、１６０μＭのスペルミジンを添加することにより並進拡散時間が著しく減少しており、ＤＮＡの大きさが小さくなっていることが確認できた。したがって、ＦＣＳ測定で並進拡散時間と明るさを測定することによって、ＤＮＡの凝縮が検出できた。
【００４４】
（実験５）
実験５では、実験４で調整したＤＮＡのうち、６ｋｂｐのＤＮＡを使って、スペルミジンの濃度がＤＮＡの凝縮に及ぼす影響を調べた。
【００４５】
１ｎＭの蛍光標識ＤＮＡ（６ｋｂｐ）、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー（3-Morpholinopropanesulfonic acid）、濃度が０、４０、８０、１２０、１６０、２００μＭのスペルミジンを混合し２時間静置した。その後、実験４と同様にＦＣＳ測定を行った。
【００４６】
ＦＣＳ測定の結果を表３に示す。このうち、スペルミジンの濃度ごとのＤＮＡの並進拡散時間を図６に、蛍光を発する分子の数を図７に示す。図６から、スペルミジンの濃度が６０μＭ前後で、６ｋｂｐのＤＮＡが完全凝縮することが検出できた。また、図６に示した並進拡散時間の変化と同様に、図７は蛍光標識つきDNAの数が減少していることを示している。これは、１つのDNAだけで凝縮が生じているのではなく、複数のDNAが一体に凝縮する分子間凝縮が生じていることを示す。したがって、ＦＣＳ測定で並進拡散時間を測定することによってＤＮＡの凝縮が検出でき、蛍光を発する分子の数を測定することによって、DNAの分子間凝縮を検出することができた。
【００４７】
【表３】
【００４８】
ＦＣＳ測定またはＦＩＤＡ測定を行う際には、溶液の混合、反応および計測をマイクロプレートのウエル中で行うとよい。ウエル数の検体を用意し、測定を行うことによって、一度に多量の検体を簡便にかつハイスループットにスクリーニングすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、ＤＮＡの凝縮・非凝縮・分散に関する物質のスクリーニングのためのアッセイに適用でき、汎用性が高く、簡単、迅速および低コストにアッセイを行うことができる。ＤＮＡの凝縮・非凝縮・分散に関する物質は、クロマチン/染色体分析、特定の受精能力評価における生殖、受精不能の診断および治療に利用が期待される。さらにグロビュール（球状）化された取扱いやすいＤＮＡは遺伝子治療等に広く利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実験１のＦＣＳ測定によるＤＮＡの大きさごとの並進拡散時間を示す図。
【図２】実験１のＦＣＳ測定によるＤＮＡの大きさごとの明るさを示す図。
【図３】実験２のＦＩＤＡ測定によるＤＮＡの大きさごとの明るさを示す図。
【図４】実験３のＦＣＳ測定によるＰＥＧ６０００およびＭｇＣｌ2の濃度ごとの並進拡散時間を示す図。
【図５】実験４のＦＣＳ測定によるＤＮＡの大きさごとの並進拡散時間を示す図。
【図６】実験５のＦＣＳ測定によるスペルミジンの濃度ごとの並進拡散時間を示す図。
【図７】実験５のＦＣＳ測定によるスペルミジンの濃度ごとの蛍光を発する分子の数を示す図。
【図８】蛍光標識付きＤＮＡが凝縮する様子を示す図。
【符号の説明】
【００５１】
１…ＤＮＡ、２…蛍光分子。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識つきＤＮＡを含む溶液とサンプル溶液とを混合するステップと、
蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy）または蛍光強度分散分析法(FIDA: Fluorescence Intensity Distribution Analysis)により混合溶液中の蛍光標識を有するＤＮＡの大きさまたは明るさを求めるステップとを有し、
前記サンプル溶液はＤＮＡを凝縮させる物質を含むことを特徴とするＤＮＡの凝縮反応を検出する方法。
【請求項２】
前記蛍光相関分光法または前記蛍光強度分散分析法により前記混合溶液中の蛍光標識を有するＤＮＡの数を求めるステップをさらに有することを特徴とする請求項１のＤＮＡの凝縮反応を検出する方法。
【請求項３】
前記混合するステップは、マイクロプレートのウエル中で溶液の混合を行うステップを有することを特徴とする請求項１または２のＤＮＡの凝縮反応を検出する方法。
【請求項１】
蛍光標識つきＤＮＡを含む溶液とサンプル溶液とを混合するステップと、
蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy）または蛍光強度分散分析法(FIDA: Fluorescence Intensity Distribution Analysis)により混合溶液中の蛍光標識を有するＤＮＡの大きさまたは明るさを求めるステップとを有し、
前記サンプル溶液はＤＮＡを凝縮させる物質を含むことを特徴とするＤＮＡの凝縮反応を検出する方法。
【請求項２】
前記蛍光相関分光法または前記蛍光強度分散分析法により前記混合溶液中の蛍光標識を有するＤＮＡの数を求めるステップをさらに有することを特徴とする請求項１のＤＮＡの凝縮反応を検出する方法。
【請求項３】
前記混合するステップは、マイクロプレートのウエル中で溶液の混合を行うステップを有することを特徴とする請求項１または２のＤＮＡの凝縮反応を検出する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−１０５９２８（Ｐ２００６−１０５９２８Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９６７０８（Ｐ２００４−２９６７０８）
【出願日】平成１６年１０月８日（２００４．１０．８）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月８日（２００４．１０．８）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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