Ｆｍｏｃをベースとした加水分解性リンカーの調製方法
Ｆｍｏｃ（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−をベースとした化合物を製造する新規な方法であって、フルオレン環系の９−ヒドロキシメチル基のための保護基を使用する方法を提供する。これらの化合物は、タンパク質およびペプチド系の薬物の修飾に有用である。一つの実施形態において、本発明の化合物を、フルオレン環系の９−ヒドロキシメチル基のための保護基を用いる、複数ステップの手順によって調製する。これらの誘導体をさらに改変して、スクシンイミジルエステルなどの活性化されたエステルを得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／９３７，１２５号への優先権を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質およびペプチド系の薬物の修飾に有用な加水分解性リンカーの作製に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ほとんどのペプチドおよびタンパク質系薬物は寿命が短く、しばしば、インビボで短い循環半減期を有する。ペプチドおよびタンパク質系薬物が経口で吸収されないことを考慮すると、循環系において治療活性のある薬物を長く保持することは、臨床的重要性の点で明らかに望ましい特徴である。
【０００４】
タンパク質またはペプチド系薬物の臨床的特性を改善するための好ましい方策は、タンパク質またはペプチド系薬物を、ポリマー、例えばポリアルキレンオキシド（非特許文献１）、またはポリシアル酸（非特許文献２）、デキストランまたはヒドロキシルエチルスターチなどの多糖で修飾することである。しばらくの間、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いた修飾が知られていた。しかし、ＰＥＧを用いたタンパク質の修飾はしばしば、タンパク質の活性の低下をもたらす。したがって、加水分解性または分解性の化学的リンカーを用いたタンパク質またはペプチド系薬物とのポリマーの解放可能な結合を可能にする代替の系が開発されてきた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。タンパク質−ポリマーコンジュゲートはプロドラッグと見なすことができ、タンパク質の活性は、制御放出機序によってコンジュゲートから放出させることができる。この考え方を用いて、薬物の薬物動態特性の改善を行うことができる（非特許文献３）。したがって、特許文献３は加水分解性ＰＥＧ−リンカーの使用を提案している。（本明細書で引用したすべての文献を参照により本明細書に組み込む）。
【０００５】
Ｔｓｕｂｅｒｙら、（非特許文献４）は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレンイルメチルカルバメート）基をベースとしたタンパク質の誘導体化のための加水分解性ＰＥＧ−リンカーを示している。フルオレン基を、マレイミドプロピオン酸無水物およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、これを、そのアミノ基で、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびタンパク質とさらに反応させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，５１５，１００号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１２２，１８９号明細書
【特許文献３】国際公開第０４／０８９２８０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０６／１３８５７２号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖａｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ．第５４巻、４５９〜４７６頁（２００２年）
【非特許文献２】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、第１３４１巻、２６〜３４頁（１９９７年）
【非特許文献３】Ｚｈａｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第１７巻、３４１〜３５１頁（２００６年）
【非特許文献４】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．第２７９巻、３８１１８〜３８１２４頁（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ（９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミド−プロピオネート）−７−スルホフルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート）と称される加水分解性リンカーの合成は、収率が低く、再現性が劣ることが問題である。Ｔｓｕｂｅｒｙらによる合成法の重要な問題点は、９−ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレンのマレイミドプロピオン酸無水物との反応によるマレイミド基の導入にある。このステップで、９の位置でのＯＨ基のエステル化などの望ましくない副反応が起こる。したがって、ＯＨ基の保護のための追加のステップを含む改善された合成法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、一般式１の化合物を合成するための新規な方法を提供する。
【００１０】
【化１】
ここで、ＰＧは保護基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合している。
【００１１】
ＹはＮ−マレイミジル部分を含む基である。
【００１２】
Ｙ基と結合していることに加えて、式１の化合物は任意選択で、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基と結合していてもよい。
【００１３】
Ｘは−ＳＯ３−Ｒ３である。
【００１４】
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−Ｒ４からなる群から選択される。
【００１５】
Ｒ４はポリマーである。
【００１６】
本発明の化合物を、フルオレン環系の９−ヒドロキシメチル基のための保護基を用いる、複数ステップの手順によって調製する。これらの誘導体をさらに改変して、スクシンイミジルエステルなどの活性化されたエステルを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、式１の化合物を得るために保護基を使用する合成法によって上記問題の克服を可能にする。式１の化合物は、活性なマレイミド（ＭＡＬ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳＵ＝ＮＨＳ）基を含むＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵならびに他のＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＳＵ誘導体などの加水分解性リンカーを生成する後続の反応ステップに適した前駆体であり、高い収率と純度で所望の生成物を提供する。これらのリンカーは１つまたは複数のポリマーでさらに改変することができ、したがって、ペプチドまたはタンパク質系薬物を修飾するのに用いることができる。
【００１８】
式１の化合物はアミノ置換フルオレンから出発して調製することができる。新規な合成手順では、以下に示す手順のステップ４におけるフルオレンの位置９において、ヒドロキシルメチル基のための保護基を導入する。以下の合成スキームは、例として式１の化合物の調製を示す。
【００１９】
【化２】
【００２０】
【化３】
ステップ１：
第１のステップ（上記スキーム参照）では、アミノ置換フルオレンのアミン基を、例えばＢＯＣ無水物などを用いた反応により、ＢＯＣ基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）で保護する。アミンのための他の適切な任意の保護基（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９年））を使用することができる。他の例はＺ（ベンジルオキシカルボニル）基である。
【００２１】
１、２、３、４、５、６、７または８の位置に２個以上のＹ基を有する式１の化合物を合成するために、同様の反応において、複数アミノ置換フルオレン誘導体を用いることができる。
【００２２】
ステップ２：
第２のステップでは、例えば、ＮａＨまたはリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）およびギ酸エチルとの反応、続くＭｅＯＨ中でのＮａＢＨ４、またはＤＩＢＡＬ（ジイソブチルアルミニウムヒドリド）などの他の還元剤との反応によって、ヒドロキシメチル基を、フルオレンコアの位置９に導入する。
【００２３】
ステップ３：
第３のステップでは、ＢＯＣ保護基を、例えばＨＣｌ ＣＦ３ＣＯＯＨまたはｐ−トルオールスルホン酸で開裂させる。
【００２４】
ステップ４：
第４のステップでは、例えば、ｔＢＤＭＳ−Ｃｌ（Ｃｏｒｅｙら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．第９４巻、６１９０〜６１９１頁（１９７２年））または４，４’−トリメトキシトリチルクロリドなどのシリルハロゲン化物との反応によって９−ヒドロキシメチル基を保護する。
【００２５】
一実施形態では、シリルハロゲン化物はｔＢＤＭＳ−Ｃｌ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド）である。ｔＢＤＭＳ−Ｃｌとの反応は、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中のイミダゾールを用いて実施することが好ましい。シリル保護基を使用することによって、分子はより親油性になり、したがって、２個以上のＹ基と結合した化合物の調製が容易になる。
【００２６】
ステップ５：
第５ステップでは、例えば、アミノ基をマレイミドアルキル酸またはマレイミドアルキル酸無水物と反応させることによってＮ−マレイミジル部分を導入する。
【００２７】
マレイミジル基はチオール基に対して反応性がある。したがって、ＰＥＧ−ＳＨなどの改変ポリマーを、加水分解性リンカーと共有結合させてポリマー改変加水分解性リンカーを得ることができる。
【００２８】
ステップ６：
この任意選択のステップでは、フルオレン環系にＸ基（−ＳＯ３Ｒ３）を導入する。この酸性基により化合物はより親水性になり、水性溶媒中での後続のカップリング反応が実施できるようになる。さらに、スルホン酸基は、ポリマーのＯＨ基によるエステル化により、第２のポリマーのカップリングを可能にする。
【００２９】
この手順により、Ｘ基を導入して、１、２、３、４、５、６、７または８の位置のＹ基に加えて、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基も含む式１の化合物を得ることが可能になる。
【００３０】
一実施形態では、少なくとも１つのＸ基は２、４、５および／または７の位置で結合している。他の実施形態では、Ｘ基は７の位置で結合している。
【００３１】
他の実施形態では、ステップ４の後で、Ｘ基（−ＳＯ３Ｒ３）をフルオレン環系に導入する。−ＳＯ３Ｒ３が−ＳＯ３Ｈである場合、−ＳＯ３Ｈ基は、エステル化により保護することができる。
【００３２】
さらなる反応ステップ：
マレイミドアルキル酸と縮合した後、保護基（ＰＧ）を取り除くことによって９−ヒドロキシメチルを脱保護して式２の化合物を得ることができる。脱保護は、ＢＦ３、例えばＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（ボロントリフルオリドエーテレート）を用いて実施することが好ましい。
【００３３】
【化４】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵまたはその誘導体は、式２の化合物をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、またはＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートなどのその誘導体と反応させて合成することができる。スクシンイミジルエステルの生成のための反応条件は当業界でよく知られている。式２のためのスクシンイミジル改変化合物を、ＳＨ−ポリマーと反応させ、続いてペプチドまたはタンパク質系薬物のアミノ基と反応させることによってさらに改変して、ポリマーを含む加水分解性リンカーを有するペプチドまたはタンパク質系薬物のコンジュゲートを得ることができる。
【００３４】
上記に例示した手順によって式１の化合物：
【００３５】
【化５】
が得られる。
【００３６】
ここで、ＰＧは保護基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合している。
【００３７】
ＹはＮ−マレイミジル含有部分である。
【００３８】
少なくとも１つのＹ基で置換された式１の化合物は、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基と結合していてもよい。
【００３９】
Ｘは−ＳＯ３−Ｒ３である。
【００４０】
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−Ｒ４からなる群から独立に選択される。
【００４１】
「Ｃ１〜Ｃ８−アルキル」は、１〜８個の炭素原子を有する一価アルキル基を指す。
【００４２】
この用語の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシルなどの基である。直鎖状および分岐状アルキルが含まれる。
【００４３】
Ｒ４はポリマーである。ポリマーの例は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルスターチ（ＨＡＳ）などである。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、ＰＧがシリル基である式１の化合物に関する。シリル基の例はトリメチルシリル、トリエチルシリルまたはｔ−ブチルジフェニルシリルである。
【００４５】
他の実施形態では、ＰＧはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。
【００４６】
一実施形態では、Ｙは
【００４７】
【化６】
である。
【００４８】
Ｒ１はその出現ごとに独立に（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルである。
【００４９】
一実施形態では、Ｒ１はその出現ごとに独立に、メチル、エチル、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群から選択される。
【００５０】
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲからなる群から独立に選択される。ここで、Ｒは、独立に水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキルである。
【００５１】
一実施形態では、Ｒ２は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【００５２】
他の実施形態では、Ｒ２は−ＮＨＣ（Ｏ）−である。
【００５３】
一実施形態では、式１の化合物は、１、２、３または４の位置の少なくとも１つでＹ基と結合している。
【００５４】
他の実施形態では、式１の化合物は、１、２、３または４の位置の少なくとも１つでＹ基と結合しており、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基とさらに結合している。
【００５５】
他の実施形態では、２または３の位置の少なくとも１つでＹ基と結合している式１の化合物は、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基と結合することもできる。
【００５６】
少なくとも１つのＹ基で置換されている式１の化合物の他の実施形態では、Ｘ基は位置７と結合している。
【００５７】
他の実施形態では、式１の化合物は２および７の位置でＹ基と結合している。
【００５８】
他の実施形態では、式１の化合物は、２および７の位置で、Ｙ基およびＸ基とそれぞれ結合している。
【００５９】
他の実施形態では、式１の化合物は、
【００６０】
【化７】
【００６１】
【化８】
【００６２】
【化９】
である。
【００６３】
本発明を、以下の実施例により説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ分子は、以下の手順（実施例１〜８）によって合成することができる。
【００６５】
（実施例１）
２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンの合成（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏら、Ｓｙｎｔｈ Ｃｏｍｍｕｎ．第３１巻、２２５〜３２頁（２００１年））
【００６６】
【化１０】
氷浴で冷却した１４５ｍｌのジオキサン−Ｈ２Ｏ（２：１／容積：容積）と４２．５ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨ混合液の中に、緩やかに攪拌しながら２−アミノフルオレン（１４．４ｇ、７９．７ミリモル）の懸濁液を調製した。次いでＢｏｃ２Ｏ（１９．１ｇ、８７．７ミリモル、１．１当量）を加え、攪拌を２５℃で続行した。反応の進行はＴＬＣ［２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンについてＲｆ＝０．７５。ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＨＯＡｃ（９５：５：３）］で追跡し、２Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨを９〜１０に保持した。２４時間後、ＴＬＣ分析により２−アミノフルオレン［Ｒｆ＝０．６０、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＨＯＡｃ（９５：５：３）］の存在が確認されたので、５．２ｇのＢｏｃ２Ｏ（２３．８ミリモル、０．３当量）をさらに加え、出発物質が完全に消失するまで、反応をさらに３時間続行した。懸濁液を１Ｍ ＫＨＳＯ４でｐＨ３に酸性化した。固体をろ過し、３０ｍｌの冷Ｈ２Ｏ、３０ｍｌのジオキサン−Ｈ２Ｏ（２：１）、３０ｍｌのヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥した。生成物の淡黄色粉末（３０．１ｇ、９０％収率）はＴＬＣ［Ｒｆ＝０．７５；ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ９５：５：３］により純粋であることが示された。これをＮＭＲで特性評価した。
【００６７】
【化１１】
（実施例２）
９−ヒドロキシメチル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンの合成（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏら、Ｓｙｎｔｈ Ｃｏｍｍｕｎ．第３１巻、２２５〜３２頁（２００１年））
【００６８】
【化１２】
１４０ｍｌの無水ＴＨＦ（ナトリウムを用いて新たに蒸留した）中の２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（１３．４９ｇ、４７．９ミリモル）の溶液を、アルゴン雰囲気下で２０ｍｌの無水ＴＨＦ中の６．３ｇの６０％ＮａＨ（１６０ミリモル、３．３当量）の懸濁液に注意深く加えた。ガスの発生が観察され、同時に発熱が観察された。２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンを完全に加え終わった後、反応混合物を４０℃で１時間攪拌した。次いで反応混合物を室温に冷却し、水素による激しい発泡を避けるように９．７ｍｌのギ酸エチル（１２０ミリモル、２．５当量）を徐々に加えた。最初粘稠で淡褐色であった懸濁液は、ギ酸エチルを加えると急速に透明化して暗褐色溶液になった。これを１時間攪拌した。反応の進行はＴＬＣ［中間生成物についてＲｆ＝０．５２、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＨＯＡｃ（９５：５：３）］で追跡した。反応を氷片と１００ｍｌのＨ２Ｏでクエンチし、有機溶媒を回転式蒸発器で除去した。水相に１０ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨを加え、これを３×５０ｍｌのジエチルエーテルで洗浄し、氷浴中で冷却し、２５ｍｌの氷酢酸でｐＨ５に酸性化した。生成した灰白色沈殿物を３００ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解した。水相を５０ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出し、有機相を２×７５ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３および１×７５ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去した。
【００６９】
９−ホルミル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンを１００ｍｌのメタノールに懸濁させ、２．０ｇのＮａＢＨ４［５２．９ミリモル、出発の２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンに対して１．１当量］を滴下した。急速に透明になった懸濁液を、マグネチックスターラーで、出発物質が消失するまで室温で４時間攪拌した［ＴＬＣ、Ｒｆ＝０．５７、ＰＥ：ＭＴＢＥ（１：２）］。反応混合物を３００ｍｌのＨ２Ｏで希釈し、１５ｍｌの氷酢酸でｐＨ５．０に酸性化し、沈殿物を１５０ｍｌのＥｔＯＡｃに直接溶解させた。有機相を３×５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３および１×５０ｍｌの塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を回転式蒸発器にかけて固体を得た。これは、さらに精製することなく使用することができる。生成物をＮＭＲで分析した（１３．１ｇ、８８％収率）。
【００７０】
【化１３】
（実施例３）
９−ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレンの合成
【００７１】
【化１４】
１３．０ｇの９−ヒドロキシメチル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンを１１０ｍｌのアセトニトリルに溶解し、還流下で攪拌した。４２ｍｌの２Ｎ ＨＣｌ（２．０当量、８４ミリモル）を滴下した。反応混合物を還流下で４５分間攪拌した。反応混合物を室温に冷却し、反応をＴＬＣ［Ｒｆ＝０．１ ＰＥ−ＭＴＢＥ（１：２）］で監視した。回転式蒸発器で溶媒を一部除去し、残留物を７０ｍｌの２Ｎ ＨＣｌに溶解させた。その溶液を２×５０ｍｌのＭＴＢＥで注意深く洗浄した。水相をＮａ２ＣＯ３でｐＨ９に調節し、２×７０ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を５０ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。回転式蒸発器で溶媒を除去した。生成物をさらに精製することなく使用した。ＮＭＲにより構造の同定を行った（８．７６ｇ、９９％収率）。
【００７２】
【化１５】
（実施例４）
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２−アミノフルオレンの合成
【００７３】
【化１６】
５．９１ｇのイミダゾール（８６．８ミリモル、２．１当量）を、２４ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、氷浴中、アルゴン雰囲気下で１０分間攪拌した。無水ＤＭＦに溶解した７．４７ｇのｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（４９．６ミリモル、１．２当量）を加えた。氷上で１５分間攪拌した後、４０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解した８．７３ｇの９−ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレン（４１．３ミリモル）をアルゴン雰囲気下で冷却しながら滴下した。反応を、氷上で、続いて室温で１５分間続行した。反応をＴＬＣ［表記生成物Ｒｆ＝０．６、ＰＥ−ＭＴＢＥ（１：２）］で監視した。２時間後、出発物質［Ｒｆ＝０．１ ＰＥ−ＭＴＢＥ（１：２）］は消失した。反応混合物を４００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１００ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３を加えた。有機相を５×２００ｍｌのＨ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。回転式蒸発器でＣＨ２Ｃｌ２を除去し、ＤＭＦをトルエンとの共沸蒸留により除去した。残留する褐色油状物（１３．４ｇ、９９％収率）をＮＭＲで分析し、さらに精製することなく使用した。
【００７４】
【化１７】
（実施例５）
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンの合成
【００７５】
【化１８】
無水ＴＨＦ（ナトリウムを用いて新たに蒸留した）中の１３．５ｇの９−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシメチル−２−アミノフルオレン（４１．５ミリモル）の溶液に、９．４２ｇのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７５．７ミリモル、１．１当量）および６５１ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４．８ミリモル、０．１当量）を加えた。１３．５ｇ（４１．５ミリモル、１．１当量）の３−マレイミドプロピオン酸を５０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解し、滴下した。反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で終夜攪拌し、生成物の生成をＴＬＣ［出発原料Ｒｆ＝０．６、表記生成物Ｒｆ＝０．１８、ＰＥ−ＭＴＢＥ（１：２）］で監視した。
【００７６】
出発原料が検出されなくなったら直ちにジシクロヘキシル尿素をろ別し、ＴＨＦを回転式蒸発器で除去した。残留固形物を２００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３および５０ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。褐色結晶を２０ｍｌのＭＴＢＥの中でディジェレート（ｄｉｇｅｒａｔｅ）した。ろ過した後、洗浄液が無色に保たれるまで、残留物を少量に分けたＭＴＢＥで洗浄した。黄色結晶（１０．５ｇ、５３％収率）をＮＭＲで分析した。
【００７７】
【化１９】
（実施例６）
９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンの合成
【００７８】
【化２０】
１０．３ｇのｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレン（２１．６ミリモル）をアルゴン雰囲気下で２３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。３５ｍｌのボロントリフルオリドエーテレートを３０分間かけて滴下した。反応をＴＬＣ［出発原料Ｒｆ＝０．６、表記生成物Ｒｆ＝０．３８、ＣＨ２Ｃｌ２−メタノール（１０：１）］で監視した。出発原料が消失したら直ちに、溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で加水分解した。得られた結晶をろ過した。母液の有機相を蒸発させた。この残留物とろ過ケーキを、２５０ｍｌのＥｔＯＡｃおよび１２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３に再溶解させた。有機相を、１×５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３、５０ｍｌのＨ２Ｏおよび５０ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を回転式蒸発器で除去した。生成物の構造をＮＭＲと質量分析により検証した。
【００７９】
【化２１】
【００８０】
【化２２】
（実施例７）
９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートの合成
【００８１】
【化２３】
７．３ｍｌの無水ＴＨＦ中の１．８ｇのピリジンの溶液から、１．７ｍｌ（５．１ミリモル）を、７５ｍｌの無水ＴＨＦ（ナトリウムを用いて新たに蒸留した）中の０．９３ｇの９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレン（２．６ミリモル）および１．１ｇのトリホスゲン（３．６ミリモル、１．４当量）の攪拌溶液に滴下した。４０分後、沈殿したピリジン塩酸塩をセライト（ｃｅｌｉｔｅ）でろ別し、ＴＨＦを回転式蒸発器で除去した。得られた油状物を、１．１ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１３．６ミリモル、５．３当量）とともに７５ｍｌの無水テトラヒドロフランに溶解した。次いで２．６ｍｌのピリジン溶液（８．２ミリモル）を加え、溶液を４０分間攪拌した。いくらかの追加の沈殿ピリジン塩酸塩をセライトでろ別し、ＴＨＦを回転式蒸発器で除去した。得られた油状物を７０ｍｌのクロロホルムに溶解し、４×４０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌ、３×５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、次いで１×４０ｍｌ水、４０ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。クロロホルムを回転式蒸発器で除去した。ＮＭＲおよび質量分析により構造の特定を実施した。
【００８２】
【化２４】
【００８３】
【化２５】
（実施例８）
９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）−７−スルホフルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートの合成
【００８４】
【化２６】
６０ｍｌのトリフルオロ酢酸中の１．２ｇの９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート（２．１ミリモル）の溶液に７ｍｌのクロロスルホン酸を加えた。３０分後、反応混合物を４℃に冷却し、３５０ｍｌの冷ジエチルエーテルを加えた。沈殿した生成物をろ過し、ジエチルエーテルで２回洗浄し、真空下で乾燥した。
【００８５】
質量分析により構造の特定を実施した。
【００８６】
ＥＳＩ−ＭＳ（実測値）：（Ｍ＋Ｈ）＋：５８３．９
ＥＳＩ−ＭＳ（計算値）：（Ｍ＋Ｈ）＋：５８３。
【００８７】
２，７ジアミノフルオレンから出発したＭＡＬ２−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕの合成を実施例９に示す。
【００８８】
（実施例９）
９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートの合成
【００８９】
【化２７】
実施例１〜８で説明した条件下で、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートを調製する。Ａｌｂｅｒｉｃｉｏら、Ｓｙｎｔｈ Ｃｏｍｍｕｎ．第３１巻、２２５〜３２頁（２００１年）に記載されているようにして、２，７−ジアミノフルオレンのアミノ基をＢｏｃ２Ｏで保護する。次いで、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）およびギ酸エチルとの反応によって、位置９にホルミル基を導入する。得られたアルデヒドを、水素化ホウ素ナトリウムで還元し、対応するアルコールにして９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンを得る。続いて、ＢＯＣ保護基をＣＨ３ＣＮ中の２Ｎ ＨＣｌで開裂させ、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジアミノフルオレンを得る。次いで、実施例５に記載したようにしてｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドとの反応によりＯＨ基を保護して、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２，７−ジアミノフルオレンを得る。次いで、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で、遊離アミノ基とマレイミドプロピオン酸の反応を実施し、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンを得る。９の位置のＯＨ基をボロントリフルオリドエーテレートで脱保護すると、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンが得られる。最後に、トリホスゲンおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応を実施し、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートを得る。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／９３７，１２５号への優先権を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質およびペプチド系の薬物の修飾に有用な加水分解性リンカーの作製に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ほとんどのペプチドおよびタンパク質系薬物は寿命が短く、しばしば、インビボで短い循環半減期を有する。ペプチドおよびタンパク質系薬物が経口で吸収されないことを考慮すると、循環系において治療活性のある薬物を長く保持することは、臨床的重要性の点で明らかに望ましい特徴である。
【０００４】
タンパク質またはペプチド系薬物の臨床的特性を改善するための好ましい方策は、タンパク質またはペプチド系薬物を、ポリマー、例えばポリアルキレンオキシド（非特許文献１）、またはポリシアル酸（非特許文献２）、デキストランまたはヒドロキシルエチルスターチなどの多糖で修飾することである。しばらくの間、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いた修飾が知られていた。しかし、ＰＥＧを用いたタンパク質の修飾はしばしば、タンパク質の活性の低下をもたらす。したがって、加水分解性または分解性の化学的リンカーを用いたタンパク質またはペプチド系薬物とのポリマーの解放可能な結合を可能にする代替の系が開発されてきた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。タンパク質−ポリマーコンジュゲートはプロドラッグと見なすことができ、タンパク質の活性は、制御放出機序によってコンジュゲートから放出させることができる。この考え方を用いて、薬物の薬物動態特性の改善を行うことができる（非特許文献３）。したがって、特許文献３は加水分解性ＰＥＧ−リンカーの使用を提案している。（本明細書で引用したすべての文献を参照により本明細書に組み込む）。
【０００５】
Ｔｓｕｂｅｒｙら、（非特許文献４）は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレンイルメチルカルバメート）基をベースとしたタンパク質の誘導体化のための加水分解性ＰＥＧ−リンカーを示している。フルオレン基を、マレイミドプロピオン酸無水物およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、これを、そのアミノ基で、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびタンパク質とさらに反応させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，５１５，１００号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１２２，１８９号明細書
【特許文献３】国際公開第０４／０８９２８０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０６／１３８５７２号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖａｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ．第５４巻、４５９〜４７６頁（２００２年）
【非特許文献２】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、第１３４１巻、２６〜３４頁（１９９７年）
【非特許文献３】Ｚｈａｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第１７巻、３４１〜３５１頁（２００６年）
【非特許文献４】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．第２７９巻、３８１１８〜３８１２４頁（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ（９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミド−プロピオネート）−７−スルホフルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート）と称される加水分解性リンカーの合成は、収率が低く、再現性が劣ることが問題である。Ｔｓｕｂｅｒｙらによる合成法の重要な問題点は、９−ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレンのマレイミドプロピオン酸無水物との反応によるマレイミド基の導入にある。このステップで、９の位置でのＯＨ基のエステル化などの望ましくない副反応が起こる。したがって、ＯＨ基の保護のための追加のステップを含む改善された合成法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、一般式１の化合物を合成するための新規な方法を提供する。
【００１０】
【化１】
ここで、ＰＧは保護基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合している。
【００１１】
ＹはＮ−マレイミジル部分を含む基である。
【００１２】
Ｙ基と結合していることに加えて、式１の化合物は任意選択で、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基と結合していてもよい。
【００１３】
Ｘは−ＳＯ３−Ｒ３である。
【００１４】
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−Ｒ４からなる群から選択される。
【００１５】
Ｒ４はポリマーである。
【００１６】
本発明の化合物を、フルオレン環系の９−ヒドロキシメチル基のための保護基を用いる、複数ステップの手順によって調製する。これらの誘導体をさらに改変して、スクシンイミジルエステルなどの活性化されたエステルを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、式１の化合物を得るために保護基を使用する合成法によって上記問題の克服を可能にする。式１の化合物は、活性なマレイミド（ＭＡＬ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳＵ＝ＮＨＳ）基を含むＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵならびに他のＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＳＵ誘導体などの加水分解性リンカーを生成する後続の反応ステップに適した前駆体であり、高い収率と純度で所望の生成物を提供する。これらのリンカーは１つまたは複数のポリマーでさらに改変することができ、したがって、ペプチドまたはタンパク質系薬物を修飾するのに用いることができる。
【００１８】
式１の化合物はアミノ置換フルオレンから出発して調製することができる。新規な合成手順では、以下に示す手順のステップ４におけるフルオレンの位置９において、ヒドロキシルメチル基のための保護基を導入する。以下の合成スキームは、例として式１の化合物の調製を示す。
【００１９】
【化２】
【００２０】
【化３】
ステップ１：
第１のステップ（上記スキーム参照）では、アミノ置換フルオレンのアミン基を、例えばＢＯＣ無水物などを用いた反応により、ＢＯＣ基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）で保護する。アミンのための他の適切な任意の保護基（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９年））を使用することができる。他の例はＺ（ベンジルオキシカルボニル）基である。
【００２１】
１、２、３、４、５、６、７または８の位置に２個以上のＹ基を有する式１の化合物を合成するために、同様の反応において、複数アミノ置換フルオレン誘導体を用いることができる。
【００２２】
ステップ２：
第２のステップでは、例えば、ＮａＨまたはリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）およびギ酸エチルとの反応、続くＭｅＯＨ中でのＮａＢＨ４、またはＤＩＢＡＬ（ジイソブチルアルミニウムヒドリド）などの他の還元剤との反応によって、ヒドロキシメチル基を、フルオレンコアの位置９に導入する。
【００２３】
ステップ３：
第３のステップでは、ＢＯＣ保護基を、例えばＨＣｌ ＣＦ３ＣＯＯＨまたはｐ−トルオールスルホン酸で開裂させる。
【００２４】
ステップ４：
第４のステップでは、例えば、ｔＢＤＭＳ−Ｃｌ（Ｃｏｒｅｙら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．第９４巻、６１９０〜６１９１頁（１９７２年））または４，４’−トリメトキシトリチルクロリドなどのシリルハロゲン化物との反応によって９−ヒドロキシメチル基を保護する。
【００２５】
一実施形態では、シリルハロゲン化物はｔＢＤＭＳ−Ｃｌ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド）である。ｔＢＤＭＳ−Ｃｌとの反応は、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中のイミダゾールを用いて実施することが好ましい。シリル保護基を使用することによって、分子はより親油性になり、したがって、２個以上のＹ基と結合した化合物の調製が容易になる。
【００２６】
ステップ５：
第５ステップでは、例えば、アミノ基をマレイミドアルキル酸またはマレイミドアルキル酸無水物と反応させることによってＮ−マレイミジル部分を導入する。
【００２７】
マレイミジル基はチオール基に対して反応性がある。したがって、ＰＥＧ−ＳＨなどの改変ポリマーを、加水分解性リンカーと共有結合させてポリマー改変加水分解性リンカーを得ることができる。
【００２８】
ステップ６：
この任意選択のステップでは、フルオレン環系にＸ基（−ＳＯ３Ｒ３）を導入する。この酸性基により化合物はより親水性になり、水性溶媒中での後続のカップリング反応が実施できるようになる。さらに、スルホン酸基は、ポリマーのＯＨ基によるエステル化により、第２のポリマーのカップリングを可能にする。
【００２９】
この手順により、Ｘ基を導入して、１、２、３、４、５、６、７または８の位置のＹ基に加えて、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基も含む式１の化合物を得ることが可能になる。
【００３０】
一実施形態では、少なくとも１つのＸ基は２、４、５および／または７の位置で結合している。他の実施形態では、Ｘ基は７の位置で結合している。
【００３１】
他の実施形態では、ステップ４の後で、Ｘ基（−ＳＯ３Ｒ３）をフルオレン環系に導入する。−ＳＯ３Ｒ３が−ＳＯ３Ｈである場合、−ＳＯ３Ｈ基は、エステル化により保護することができる。
【００３２】
さらなる反応ステップ：
マレイミドアルキル酸と縮合した後、保護基（ＰＧ）を取り除くことによって９−ヒドロキシメチルを脱保護して式２の化合物を得ることができる。脱保護は、ＢＦ３、例えばＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（ボロントリフルオリドエーテレート）を用いて実施することが好ましい。
【００３３】
【化４】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵまたはその誘導体は、式２の化合物をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、またはＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートなどのその誘導体と反応させて合成することができる。スクシンイミジルエステルの生成のための反応条件は当業界でよく知られている。式２のためのスクシンイミジル改変化合物を、ＳＨ−ポリマーと反応させ、続いてペプチドまたはタンパク質系薬物のアミノ基と反応させることによってさらに改変して、ポリマーを含む加水分解性リンカーを有するペプチドまたはタンパク質系薬物のコンジュゲートを得ることができる。
【００３４】
上記に例示した手順によって式１の化合物：
【００３５】
【化５】
が得られる。
【００３６】
ここで、ＰＧは保護基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合している。
【００３７】
ＹはＮ−マレイミジル含有部分である。
【００３８】
少なくとも１つのＹ基で置換された式１の化合物は、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基と結合していてもよい。
【００３９】
Ｘは−ＳＯ３−Ｒ３である。
【００４０】
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−Ｒ４からなる群から独立に選択される。
【００４１】
「Ｃ１〜Ｃ８−アルキル」は、１〜８個の炭素原子を有する一価アルキル基を指す。
【００４２】
この用語の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシルなどの基である。直鎖状および分岐状アルキルが含まれる。
【００４３】
Ｒ４はポリマーである。ポリマーの例は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルスターチ（ＨＡＳ）などである。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、ＰＧがシリル基である式１の化合物に関する。シリル基の例はトリメチルシリル、トリエチルシリルまたはｔ−ブチルジフェニルシリルである。
【００４５】
他の実施形態では、ＰＧはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。
【００４６】
一実施形態では、Ｙは
【００４７】
【化６】
である。
【００４８】
Ｒ１はその出現ごとに独立に（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルである。
【００４９】
一実施形態では、Ｒ１はその出現ごとに独立に、メチル、エチル、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群から選択される。
【００５０】
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲからなる群から独立に選択される。ここで、Ｒは、独立に水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキルである。
【００５１】
一実施形態では、Ｒ２は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【００５２】
他の実施形態では、Ｒ２は−ＮＨＣ（Ｏ）−である。
【００５３】
一実施形態では、式１の化合物は、１、２、３または４の位置の少なくとも１つでＹ基と結合している。
【００５４】
他の実施形態では、式１の化合物は、１、２、３または４の位置の少なくとも１つでＹ基と結合しており、５、６、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基とさらに結合している。
【００５５】
他の実施形態では、２または３の位置の少なくとも１つでＹ基と結合している式１の化合物は、７または８の位置の少なくとも１つでＸ基と結合することもできる。
【００５６】
少なくとも１つのＹ基で置換されている式１の化合物の他の実施形態では、Ｘ基は位置７と結合している。
【００５７】
他の実施形態では、式１の化合物は２および７の位置でＹ基と結合している。
【００５８】
他の実施形態では、式１の化合物は、２および７の位置で、Ｙ基およびＸ基とそれぞれ結合している。
【００５９】
他の実施形態では、式１の化合物は、
【００６０】
【化７】
【００６１】
【化８】
【００６２】
【化９】
である。
【００６３】
本発明を、以下の実施例により説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ分子は、以下の手順（実施例１〜８）によって合成することができる。
【００６５】
（実施例１）
２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンの合成（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏら、Ｓｙｎｔｈ Ｃｏｍｍｕｎ．第３１巻、２２５〜３２頁（２００１年））
【００６６】
【化１０】
氷浴で冷却した１４５ｍｌのジオキサン−Ｈ２Ｏ（２：１／容積：容積）と４２．５ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨ混合液の中に、緩やかに攪拌しながら２−アミノフルオレン（１４．４ｇ、７９．７ミリモル）の懸濁液を調製した。次いでＢｏｃ２Ｏ（１９．１ｇ、８７．７ミリモル、１．１当量）を加え、攪拌を２５℃で続行した。反応の進行はＴＬＣ［２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンについてＲｆ＝０．７５。ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＨＯＡｃ（９５：５：３）］で追跡し、２Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨを９〜１０に保持した。２４時間後、ＴＬＣ分析により２−アミノフルオレン［Ｒｆ＝０．６０、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＨＯＡｃ（９５：５：３）］の存在が確認されたので、５．２ｇのＢｏｃ２Ｏ（２３．８ミリモル、０．３当量）をさらに加え、出発物質が完全に消失するまで、反応をさらに３時間続行した。懸濁液を１Ｍ ＫＨＳＯ４でｐＨ３に酸性化した。固体をろ過し、３０ｍｌの冷Ｈ２Ｏ、３０ｍｌのジオキサン−Ｈ２Ｏ（２：１）、３０ｍｌのヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥した。生成物の淡黄色粉末（３０．１ｇ、９０％収率）はＴＬＣ［Ｒｆ＝０．７５；ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ９５：５：３］により純粋であることが示された。これをＮＭＲで特性評価した。
【００６７】
【化１１】
（実施例２）
９−ヒドロキシメチル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンの合成（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏら、Ｓｙｎｔｈ Ｃｏｍｍｕｎ．第３１巻、２２５〜３２頁（２００１年））
【００６８】
【化１２】
１４０ｍｌの無水ＴＨＦ（ナトリウムを用いて新たに蒸留した）中の２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（１３．４９ｇ、４７．９ミリモル）の溶液を、アルゴン雰囲気下で２０ｍｌの無水ＴＨＦ中の６．３ｇの６０％ＮａＨ（１６０ミリモル、３．３当量）の懸濁液に注意深く加えた。ガスの発生が観察され、同時に発熱が観察された。２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンを完全に加え終わった後、反応混合物を４０℃で１時間攪拌した。次いで反応混合物を室温に冷却し、水素による激しい発泡を避けるように９．７ｍｌのギ酸エチル（１２０ミリモル、２．５当量）を徐々に加えた。最初粘稠で淡褐色であった懸濁液は、ギ酸エチルを加えると急速に透明化して暗褐色溶液になった。これを１時間攪拌した。反応の進行はＴＬＣ［中間生成物についてＲｆ＝０．５２、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＨＯＡｃ（９５：５：３）］で追跡した。反応を氷片と１００ｍｌのＨ２Ｏでクエンチし、有機溶媒を回転式蒸発器で除去した。水相に１０ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨを加え、これを３×５０ｍｌのジエチルエーテルで洗浄し、氷浴中で冷却し、２５ｍｌの氷酢酸でｐＨ５に酸性化した。生成した灰白色沈殿物を３００ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解した。水相を５０ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出し、有機相を２×７５ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３および１×７５ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去した。
【００６９】
９−ホルミル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンを１００ｍｌのメタノールに懸濁させ、２．０ｇのＮａＢＨ４［５２．９ミリモル、出発の２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンに対して１．１当量］を滴下した。急速に透明になった懸濁液を、マグネチックスターラーで、出発物質が消失するまで室温で４時間攪拌した［ＴＬＣ、Ｒｆ＝０．５７、ＰＥ：ＭＴＢＥ（１：２）］。反応混合物を３００ｍｌのＨ２Ｏで希釈し、１５ｍｌの氷酢酸でｐＨ５．０に酸性化し、沈殿物を１５０ｍｌのＥｔＯＡｃに直接溶解させた。有機相を３×５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３および１×５０ｍｌの塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を回転式蒸発器にかけて固体を得た。これは、さらに精製することなく使用することができる。生成物をＮＭＲで分析した（１３．１ｇ、８８％収率）。
【００７０】
【化１３】
（実施例３）
９−ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレンの合成
【００７１】
【化１４】
１３．０ｇの９−ヒドロキシメチル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンを１１０ｍｌのアセトニトリルに溶解し、還流下で攪拌した。４２ｍｌの２Ｎ ＨＣｌ（２．０当量、８４ミリモル）を滴下した。反応混合物を還流下で４５分間攪拌した。反応混合物を室温に冷却し、反応をＴＬＣ［Ｒｆ＝０．１ ＰＥ−ＭＴＢＥ（１：２）］で監視した。回転式蒸発器で溶媒を一部除去し、残留物を７０ｍｌの２Ｎ ＨＣｌに溶解させた。その溶液を２×５０ｍｌのＭＴＢＥで注意深く洗浄した。水相をＮａ２ＣＯ３でｐＨ９に調節し、２×７０ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を５０ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。回転式蒸発器で溶媒を除去した。生成物をさらに精製することなく使用した。ＮＭＲにより構造の同定を行った（８．７６ｇ、９９％収率）。
【００７２】
【化１５】
（実施例４）
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２−アミノフルオレンの合成
【００７３】
【化１６】
５．９１ｇのイミダゾール（８６．８ミリモル、２．１当量）を、２４ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、氷浴中、アルゴン雰囲気下で１０分間攪拌した。無水ＤＭＦに溶解した７．４７ｇのｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（４９．６ミリモル、１．２当量）を加えた。氷上で１５分間攪拌した後、４０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解した８．７３ｇの９−ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレン（４１．３ミリモル）をアルゴン雰囲気下で冷却しながら滴下した。反応を、氷上で、続いて室温で１５分間続行した。反応をＴＬＣ［表記生成物Ｒｆ＝０．６、ＰＥ−ＭＴＢＥ（１：２）］で監視した。２時間後、出発物質［Ｒｆ＝０．１ ＰＥ−ＭＴＢＥ（１：２）］は消失した。反応混合物を４００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１００ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３を加えた。有機相を５×２００ｍｌのＨ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。回転式蒸発器でＣＨ２Ｃｌ２を除去し、ＤＭＦをトルエンとの共沸蒸留により除去した。残留する褐色油状物（１３．４ｇ、９９％収率）をＮＭＲで分析し、さらに精製することなく使用した。
【００７４】
【化１７】
（実施例５）
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンの合成
【００７５】
【化１８】
無水ＴＨＦ（ナトリウムを用いて新たに蒸留した）中の１３．５ｇの９−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシメチル−２−アミノフルオレン（４１．５ミリモル）の溶液に、９．４２ｇのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７５．７ミリモル、１．１当量）および６５１ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４．８ミリモル、０．１当量）を加えた。１３．５ｇ（４１．５ミリモル、１．１当量）の３−マレイミドプロピオン酸を５０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解し、滴下した。反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で終夜攪拌し、生成物の生成をＴＬＣ［出発原料Ｒｆ＝０．６、表記生成物Ｒｆ＝０．１８、ＰＥ−ＭＴＢＥ（１：２）］で監視した。
【００７６】
出発原料が検出されなくなったら直ちにジシクロヘキシル尿素をろ別し、ＴＨＦを回転式蒸発器で除去した。残留固形物を２００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３および５０ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。褐色結晶を２０ｍｌのＭＴＢＥの中でディジェレート（ｄｉｇｅｒａｔｅ）した。ろ過した後、洗浄液が無色に保たれるまで、残留物を少量に分けたＭＴＢＥで洗浄した。黄色結晶（１０．５ｇ、５３％収率）をＮＭＲで分析した。
【００７７】
【化１９】
（実施例６）
９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンの合成
【００７８】
【化２０】
１０．３ｇのｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレン（２１．６ミリモル）をアルゴン雰囲気下で２３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。３５ｍｌのボロントリフルオリドエーテレートを３０分間かけて滴下した。反応をＴＬＣ［出発原料Ｒｆ＝０．６、表記生成物Ｒｆ＝０．３８、ＣＨ２Ｃｌ２−メタノール（１０：１）］で監視した。出発原料が消失したら直ちに、溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で加水分解した。得られた結晶をろ過した。母液の有機相を蒸発させた。この残留物とろ過ケーキを、２５０ｍｌのＥｔＯＡｃおよび１２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３に再溶解させた。有機相を、１×５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３、５０ｍｌのＨ２Ｏおよび５０ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を回転式蒸発器で除去した。生成物の構造をＮＭＲと質量分析により検証した。
【００７９】
【化２１】
【００８０】
【化２２】
（実施例７）
９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートの合成
【００８１】
【化２３】
７．３ｍｌの無水ＴＨＦ中の１．８ｇのピリジンの溶液から、１．７ｍｌ（５．１ミリモル）を、７５ｍｌの無水ＴＨＦ（ナトリウムを用いて新たに蒸留した）中の０．９３ｇの９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレン（２．６ミリモル）および１．１ｇのトリホスゲン（３．６ミリモル、１．４当量）の攪拌溶液に滴下した。４０分後、沈殿したピリジン塩酸塩をセライト（ｃｅｌｉｔｅ）でろ別し、ＴＨＦを回転式蒸発器で除去した。得られた油状物を、１．１ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１３．６ミリモル、５．３当量）とともに７５ｍｌの無水テトラヒドロフランに溶解した。次いで２．６ｍｌのピリジン溶液（８．２ミリモル）を加え、溶液を４０分間攪拌した。いくらかの追加の沈殿ピリジン塩酸塩をセライトでろ別し、ＴＨＦを回転式蒸発器で除去した。得られた油状物を７０ｍｌのクロロホルムに溶解し、４×４０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌ、３×５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、次いで１×４０ｍｌ水、４０ｍｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。クロロホルムを回転式蒸発器で除去した。ＮＭＲおよび質量分析により構造の特定を実施した。
【００８２】
【化２４】
【００８３】
【化２５】
（実施例８）
９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）−７−スルホフルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートの合成
【００８４】
【化２６】
６０ｍｌのトリフルオロ酢酸中の１．２ｇの９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート（２．１ミリモル）の溶液に７ｍｌのクロロスルホン酸を加えた。３０分後、反応混合物を４℃に冷却し、３５０ｍｌの冷ジエチルエーテルを加えた。沈殿した生成物をろ過し、ジエチルエーテルで２回洗浄し、真空下で乾燥した。
【００８５】
質量分析により構造の特定を実施した。
【００８６】
ＥＳＩ−ＭＳ（実測値）：（Ｍ＋Ｈ）＋：５８３．９
ＥＳＩ−ＭＳ（計算値）：（Ｍ＋Ｈ）＋：５８３。
【００８７】
２，７ジアミノフルオレンから出発したＭＡＬ２−Ｆｍｏｃ−ＯＳｕの合成を実施例９に示す。
【００８８】
（実施例９）
９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートの合成
【００８９】
【化２７】
実施例１〜８で説明した条件下で、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートを調製する。Ａｌｂｅｒｉｃｉｏら、Ｓｙｎｔｈ Ｃｏｍｍｕｎ．第３１巻、２２５〜３２頁（２００１年）に記載されているようにして、２，７−ジアミノフルオレンのアミノ基をＢｏｃ２Ｏで保護する。次いで、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）およびギ酸エチルとの反応によって、位置９にホルミル基を導入する。得られたアルデヒドを、水素化ホウ素ナトリウムで還元し、対応するアルコールにして９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンを得る。続いて、ＢＯＣ保護基をＣＨ３ＣＮ中の２Ｎ ＨＣｌで開裂させ、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジアミノフルオレンを得る。次いで、実施例５に記載したようにしてｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドとの反応によりＯＨ基を保護して、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２，７−ジアミノフルオレンを得る。次いで、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で、遊離アミノ基とマレイミドプロピオン酸の反応を実施し、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−９−メチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンを得る。９の位置のＯＨ基をボロントリフルオリドエーテレートで脱保護すると、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンが得られる。最後に、トリホスゲンおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応を実施し、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオレンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートを得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１の化合物の調製方法であって、該方法は、
【化２８】
（式中、ＰＧは保護基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合しており、
ＹはＮ−マレイミジル部分を含む基であり、
利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つは任意選択でＸ基と結合しており、
Ｘは−ＳＯ３−Ｒ３であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−Ｒ４からなる群から独立に選択され、
Ｒ４はポリマーである）
式２の化合物の９−ヒドロキシメチル基を、
【化２９】
（式中、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはアミンと結合している）
ＰＧを導入する保護試薬と反応させるステップと、
続いて、該化合物をＮ−マレイミジル誘導体と反応させるステップとを含む方法。
【請求項２】
前記保護試薬がシリルハロゲン化物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シリルハロゲン化物がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｔＢＤＭＳ−Ｃｌとの前記反応をＤＭＦ中のイミダゾールを用いて実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｎ−マレイミジル誘導体がマレイミドアルキル酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＧがシリル誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＰＧがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つが任意選択でＸ基と結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｙが、
【化３０】
であり、ここで、
Ｒ１はその出現ごとに独立に（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルであり、
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ（Ｒは、独立に水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキルである）からなる群から独立に選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
式１の化合物
【化３１】
（式中、ＰＧは保護基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合しており、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つは任意選択でＸ基と結合しており、
ＹはＮ−マレイミジル含有部分であり、
Ｘは−ＳＯ３−Ｒ３であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−Ｒ４からなる群から独立に選択される）。
【請求項１１】
ＰＧがシリル基であり、
Ｙが、
【化３２】
であり、
Ｒ１はその出現ごとに独立に（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルであり、
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ−（Ｒは、独立に水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキルである）からなる群から独立に選択される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
ＰＧがｔ−ブチルジメチルシリル基である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１】
式１の化合物の調製方法であって、該方法は、
【化２８】
（式中、ＰＧは保護基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合しており、
ＹはＮ−マレイミジル部分を含む基であり、
利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つは任意選択でＸ基と結合しており、
Ｘは−ＳＯ３−Ｒ３であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−Ｒ４からなる群から独立に選択され、
Ｒ４はポリマーである）
式２の化合物の９−ヒドロキシメチル基を、
【化２９】
（式中、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはアミンと結合している）
ＰＧを導入する保護試薬と反応させるステップと、
続いて、該化合物をＮ−マレイミジル誘導体と反応させるステップとを含む方法。
【請求項２】
前記保護試薬がシリルハロゲン化物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シリルハロゲン化物がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｔＢＤＭＳ−Ｃｌとの前記反応をＤＭＦ中のイミダゾールを用いて実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｎ−マレイミジル誘導体がマレイミドアルキル酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＧがシリル誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＰＧがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つが任意選択でＸ基と結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｙが、
【化３０】
であり、ここで、
Ｒ１はその出現ごとに独立に（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルであり、
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ（Ｒは、独立に水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキルである）からなる群から独立に選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
式１の化合物
【化３１】
（式中、ＰＧは保護基であり、１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つはＹ基と結合しており、利用可能な１、２、３、４、５、６、７または８の位置の少なくとも１つは任意選択でＸ基と結合しており、
ＹはＮ−マレイミジル含有部分であり、
Ｘは−ＳＯ３−Ｒ３であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−Ｒ４からなる群から独立に選択される）。
【請求項１１】
ＰＧがシリル基であり、
Ｙが、
【化３２】
であり、
Ｒ１はその出現ごとに独立に（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルであり、
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−および−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−ＮＲ−（Ｒは、独立に水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキルである）からなる群から独立に選択される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
ＰＧがｔ−ブチルジメチルシリル基である、請求項１１に記載の化合物。
【公表番号】特表２０１０−５３１３１７（Ｐ２０１０−５３１３１７Ａ）
【公表日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３７５１（Ｐ２０１０−５１３７５１）
【出願日】平成２０年６月２５日（２００８．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００５１６４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０００５２３
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２５日（２００８．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００５１６４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０００５２３
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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