G−CSF部位特異的モノコンジュゲート
顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の新規な部位特異的モノコンジュゲートについて、その類縁体および誘導体と共に本明細書に記述するが、こうしたものは前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する。これらのコンジュゲートは、トランスグルタミナーゼを用いて、天然のヒトG−CSF配列およびその類縁体の単一グルタミン残基に、非免疫原性の親水性ポリマーを共有結合で部位特異的に結合して得られた。これらの新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、溶液中で安定であり、顕著なin vitro生物活性を示し、非コンジュゲートタンパク質と比較して血流半減期が長く、その結果長期の薬理活性を示すので、治療用途に推奨される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の新規な部位特異的モノコンジュゲート、ならびにその類縁体および誘導体を本明細書に記述する。これらのコンジュゲートは、トランスグルタミナーゼを用いて、天然のヒトG−CSFポリペプチド配列およびその類縁体の単一グルタミン残基に、親水性の非免疫原性ポリマーを共有結合で部位特異的に結合して得られている。これらの新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、溶液中で安定であり、顕著なin vitro生物活性を示し、非コンジュゲートタンパク質と比較して血流半減期が長く、その結果長期の薬理活性を示すので、治療用途に推奨される。
【背景技術】
【0002】
ヒト顆粒球コロニー刺激因子(h−G−CSF)は、間質細胞、マクロファージ、線維芽細胞および単球により自然に産生される20kDaの糖タンパク質である。その産生は、内毒素に曝した際および感染中に増加する。G−CSFは、好中球前駆細胞上に発現するG−CSF受容体(G−CSFR)に高い親和性で結合する骨髄において、該細胞の増殖および抗感染性成熟好中球への分化を誘発するが、他の血液細胞系にはさしたる造血作用を及ぼさずに作用する。
【0003】
主たる天然G−CSFアイソフォームは、2個のジスルフィド結合に用いられた4個のシステイン残基、17位の遊離システイン残基、および133位にあるスレオニン残基側鎖の酸素上のグリコシル化部位(O−連結グリコシル化)を有する、174個のアミノ酸ポリペプチドである。グリコシル化は、効率的な受容体との結合の確立またはG−CSF生物活性にとって必要ではない(例えば、非特許文献1参照)が、単一O−糖鎖の存在によりG−CSFの物理的および酵素的安定性が改善されることが報告されている(例えば、非特許文献2、非特許文献3参照)。遺伝子工学技法によるヒトG−CSF産生によって、原発性、続発性双方の数種の好中球減少症を処置する新しい治療法が開発されてきた。特に、組換えG−CSF化合物は、以下の治療法:
骨髄毒性抗腫瘍薬または骨髄機能廃絶療法に続く骨髄移植で処置されている危険性の高い患者における、好中球減少症と、感染性および発熱性関連現象の期間短縮、
骨髄抑制または骨髄機能廃絶療法と、場合によりそれに続く骨髄移植を受けている患者における、自家細胞移植にて使用する末梢血前駆細胞の動員、
先天性または特発性好中球減少症に罹り、好中球原形質濃度の激減、ならびに感染症および発熱を示す患者の処置、
後期HIV感染症患者に発現する、好中球減少症および細菌感染症の処置
のために病院環境で処方される。
【0004】
各種の好中球減少症に罹った患者のG−CSFによる処置の際に示された特別の関心から、哺乳動物、細菌双方の細胞系で産生される組換え化合物の開発が盛んに行われてきた。
【0005】
実際、組換えG−CSFの少なくとも3種の変異型:
哺乳動物細胞に発現し、天然タンパク質ポリペプチド鎖と同一のアミノ酸174個のポリペプチド鎖として作製され、133位のスレオニン残基上にO−連結オリゴ糖部分を含んだ、レノグラスチムと称するグリコシル化型、
N末端にある追加のメチオニル残基以外は、天然タンパク質と同一のアミノ酸175個のポリペプチド鎖(met−G−CSF)として細菌細胞中に発現する、フィルグラスチムと称する非グリコシル化型、
N末端にある追加のメチオニル残基、ならびにThr2、Leu4、Gly5、Pro6およびCys18の残基のAla、Thr、Tyr、ArgおよびSer各残基による置換が、天然タンパク質ポリペプチド鎖と異なるアミノ酸175個のポリペプチド鎖(met−G−CSF)として細菌細胞中に発現する、ナルトグラスチムと称する非グリコシル化型
が、治療用途のために数カ国で入手可能である。
【0006】
様々な組換えG−CSF誘導体の臨床応用で熟知されている制約は、非経口投与後の血流における薬物動態半減期(t1/2)が3〜4時間という短い循環永続性である。その結果、例えば、非骨髄性腫瘍を有し、骨髄抑制化学療法を受けている患者において感染症の発現を低減するための組換えG−CSFの処方投薬量は、化学療法サイクルの期間に対するG−CSF5μg/kg/日の皮下注射を、サイクル当たり注射10〜14回に及んで毎日投与することからなる。
【0007】
G−CSFの薬物動態プロファイルは、大多数のサイトカイン同様に、G−CSF受容体を発現する細胞により媒介される、インターナリゼーションおよび部分的分解の特異的で可飽和性の機構以外に、非特異的で非可飽和性の腎クリアランス機構(およびそれ程ではないが、肝クリアランス)によって調節される。
【0008】
腎クリアランスはタンパク質分子のサイズに関係するので、腎限外ろ過を減少させる方法の1つは、分子サイズおよび/または流体力学的体積を増加させることである。
【0009】
これは、治療タンパク質の分野における非常に一般的な問題であり、幾つかの解決策として、治療タンパク質の担体タンパク質(例えば、免疫グロブリンまたはアルブミン)との融合、徐放性ポリマーのナノスフェアおよびミクロスフェア中への活性成分の組込み、ならびに生体適合性の高分子量ポリマーとのタンパク質の共有結合性コンジュゲーションが提案されてきた。
【0010】
特にタンパク質−ポリマーの共有結合性コンジュゲーション領域では、いわゆるPEG化が広範に採用されてきており、この場合、選択されたタンパク質は、1000〜2000Daから20000〜40000Daまたはそれ以上に及ぶ分子量を有し、1本または複数の線状または分岐ポリ(エチレングリコール)(PEG)に共有結合される。一般にPEG化タンパク質は、腎クリアランス速度の低下、ならびに安定性の向上および免疫原性の減少を示す。PEGがポリペプチドに適切に結合されると、その流体力学的体積および物理化学的性質が変化する一方、in vitro活性または受容体認識などの基本的な生物学的機能は、未変化のままか、僅かな減少を受けるか、場合によっては完全に抑制されることもある。PEGコンジュゲーションは、タンパク質表面をマスキングし、分子サイズを増加させ、したがって腎限外ろ過を減少させ、抗体または抗原提示細胞の結合を防止し、タンパク分解酵素による分解を低減する。最終的に、PEGコンジュゲーションは、PEGの物理化学的性質を付与し、そのためペプチド兼ノンペプチド薬物の生体分布および溶解性は、同様に変化する。タンパク質コンジュゲーション用のPEG代替物として、デキストラン、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリロイルモルホリン)または多糖類などその他の生体適合性の線状または分岐ポリマーを使用してもよい。
【0011】
一般に使用される化学的PEG化法およびその結果を概観するには、非特許文献4および非特許文献5が参考となる。
【0012】
生体適合性高分子量ポリマーとの共有結合性G−CSFコンジュゲーションは、例えば、幾つかの科学論文および特許に記載されており、その一部を以下に簡単に要約する。
【0013】
特許文献1には、ポリ(エチレングリコール)またはポリ(プロピレングリコール)のポリマー鎖に化学的にコンジュゲートし、生物活性を維持し、血流半減期の増加を示すG−CSF遺伝的変異型が記載されている。
【0014】
特許文献2には、アミノ酸側鎖のアミノ基およびカルボキシル基の化学的結合によるPEG鎖でのG−CSF修飾によって、半減期の長いPEG−G−CSFコンジュゲートを産生することが記載されている。
【0015】
特許文献3には、ポリマーPEG鎖1〜15本に化学結合し、in vivo投与後の安定性、溶解性および血流循環が改善されたG−CSF誘導体が記載されている。
【0016】
特許文献4には、異なった構造的、物理化学的および生物学的性質を示すPEG−G−CSF化学コンジュゲートが記載されている。
【0017】
G−CSFのアミノ基またはカルボキシル基による非選択的コンジュゲーションで主に得られる以上のコンジュゲートは、通常、アイソフォームのコンジュゲート混合物であるが、下記に報告するような本質的に部位特異的なモノコンジュゲート誘導体を産生することを目的とした、G−CSF化学コンジュゲートが開発されてきた。
【0018】
特許文献5には、ポリマーと該タンパク質とのアミド結合、および好ましくは還元的アルキル化反応を介したポリマーと該タンパク質とのアミン結合の双方により得ることができる、ポリペプチド鎖のN末端アミノ酸残基のα−アミノ基に対するポリマー化合物のコンジュゲーションに対する方法が記載されている(例えば、非特許文献6を参照)。したがって、この技術の適用によって、N末端メチオニルのα−アミノ基上で20kDaの線状PEGにコンジュゲートしたmet−G−CSFの開発が、プロピオンアルデヒドで官能化したモノメトキシPEG鎖を用いたpH5での還元的アルキル化反応により可能となった。この生成物は、PEG−フィルグラスチムの国際的一般名およびNeulasta(登録商標)の登録商品名で市販されてきた(例えば、非特許文献7を参照)。
【0019】
部位特異的コンジュゲートを潜在的に生じることができる別のタンパク質残基は、チオールラジカルと共有結合を形成する残基で官能化されたPEG分子に対する高反応性部分である、システインチオール基である(例えば、非特許文献8を参照)。大部分のタンパク質は遊離システイン残基(即ち、ジスルフィド結合に関与していない)を有していないので、部位特異的な変異誘発を介して、ポリペプチド鎖の中にシステイン残基を挿入し、次いで、官能化されたポリマーを用いたその反応性システインチオール基との反応を可能にすることにより、ポリマーおよびタンパク質を部位特異的にコンジュゲートすることが可能であるが、それについては一連のG−CSF変異体に対して記載されている(例えば、非特許文献9を参照)。部分的に代替的な手法に従って、特許文献6には、そのままでは疎水性ポケット中にマスクされてしまう遊離−SH部分を溶媒に曝すように部分的にタンパク質変性をした後、ジスルフィド結合(Cys17)に関与しないその天然システインチオール基上でr−h−G−CSFをコンジュゲーションすることが記載されている。
【0020】
以上の多様な化学的コンジュゲーション法だけでなく、酵素的手順も、ポリマーおよびタンパク質を結合するために記載されている。こうした手順は、原核性、真核性双方のトランスグルタミナーゼ酵素の使用によって、対象とするポリペプチド鎖中に自然に存在する、または部位特異的な変異誘発反応により挿入したグルタミン残基のアシル基に対する、一級アミノ基で官能化したポリマーの転移を触媒することに基づいている(例えば、非特許文献10を参照)。
【0021】
したがって、例えば、特許文献7および特許文献8の双方には、微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)の使用によって、アミノ酸配列中に少なくとも1個のグルタミン残基を有するペプチドおよびタンパク質中に、ポリマー鎖を挿入することが記載されている。これらの特許では、幾つかのモデルタンパク質上での一置換に関する実施例を示しているが、複数置換も部位特異的であるのか明らかではなく、すなわち、複数置換が単一の分子形態を産生するのか、あるいは一置換ではあっても、ポリマー鎖が異なるグルタミンに結合している位置異性体混合物を産生することを意味しているのかが明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0022】
【特許文献1】国際公開第89/06546号パンフレット
【特許文献2】国際公開第90/06952号パンフレット
【特許文献3】国際公開第00/44785号パンフレット
【特許文献4】欧州特許第0335423号明細書
【特許文献5】米国特許第5985265号明細書
【特許文献6】国際公開第2005/099769A2号パンフレット
【特許文献7】欧州特許第785276号明細書
【特許文献8】米国特許第6010871号明細書
【非特許文献】
【0023】
【非特許文献1】N. A. Nicola, "Hemopoietic Cell Growth Factors and their Receptors", Ann. Rev. Biochem., 58, 45-77, 1989
【非特許文献2】M. Oheda et al., "O-linked Sugar Chain of Human Granulocyte Stimulating Factor Protects it against Polymerization and Denaturation Allowing it to Retain its Biological Activity", J. Biol. Chem., 265, 11432-11435, 1990
【非特許文献3】C. R. D. Carter et al., "Human Serum Inactivates Non-Glycosylated but not Glycosylated Granulocyte Colony Stimulating Factor by a Protease Dependent Mechanism: Significance of Carbohydrates on the Glycosylated Molecule", Biologicals, 32, 37-47, 2004
【非特許文献4】S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Adv. Drug Deliv. Rev., 16, 157-182, 1995
【非特許文献5】F.M. Veronese, Peptide and Protein PEGylation: a Review of Problems and Solutions, Biomaterials, 22, 405-417, 2001
【非特許文献6】O. Kinstler et al., Mono-N-terminal Poly-(Ethylen Glycol)-Protein Conjugates, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 477-485, 2002
【非特許文献7】O. Kinstler et al., Characterization and Stability of N-terminally PEGylated rhG-CSF, Pharmac. Res., 13, 996-1002, 1996
【非特許文献8】M.J. Roberts et al., Chemistry for Peptide and Protein PEGylation, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 459-476, 2002
【非特許文献9】M.S. Rosendahl et al., Site-specific Protein PEGylation. Application to Cysteine Analogs of Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor, BioProcess Internat., 3(4), 52-60, 2005
【非特許文献10】H. Sato, Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation of Proteins, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 487-504, 2002
【非特許文献11】J.F. Reidhaar-Olson et al., Identification of Residues Critical to the Activity of Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor, Biochemistry, 35, 9034-9041, 1996
【非特許文献12】D.C. Young et al., Characterization of the Receptor Binding Determinants of Granulocyte Colony Stimulating Factor, Prot. Sci., 6, 1228-1236, 1997
【非特許文献13】M. Griffin et al., Transglutaminases: Nature's Biological Glues, Biochem. J., 368, 377-396, 2002
【非特許文献14】P.M. Nielsen, Reactions and Potential Industrial Applications of Transglutaminase. Review of Literature and Patent, Food Biotechnol., 9, 119-156, 1995
【非特許文献15】P. Cousson et al., Factors that Govern the Specificity of Transglutaminase-Catalyzed Modification of Proteins and Peptides, Biochem. J., 282, 929-930, 1992
【非特許文献16】T. Ohtsuka et al., Comparison of Substrate Specificities of Transglutaminase Using Synthetic Peptides as Acyl Donors, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2608-2613, 2000
【非特許文献17】T. Ohtsuka et al., Substrate Specificities of Microbial Transglutaminase for Primary Amines, J. Agric. Food Chem., 48, 6230-6233, 2000
【非特許文献18】T. Kashiwagi et al., Crystal Structure of Microbial Transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense, J. Biol. Chem., 277, 44252-44260, 2002
【非特許文献19】C.P. Hill et al., The Structure of Granulocyte Colony-Stimulating Factor and its Relationship to Other Growth Factors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5167-5171, 1993
【非特許文献20】M.J. Treuheit et al., Inverse Relationship of Protein Concentration and Aggregation, Pharmac. Res., 19, 511-516, 2002
【非特許文献21】R.S. Rajan et al., Modulation of Protein Aggregation by Polyethylene Glycol Conjugation: G-CSF a Case Study, Prot. Sci., 15, 1063-1075, 2006
【非特許文献22】N. Shirafuji et al., A New Bioassay for Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor Using Murine Myeloblastic NFS-60 Cells as Targets and Estimation of Its Level in Sera from Normal Healthy Persons and Patients with Infectious and Haematological Disorders, Exp. Hematol., 17, 116-119, 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0024】
本発明は、高いクリアランス速度およびその結果としての血中半減期の減少、タンパク質分解感受性、ならびに潜在的な免疫原性反応などの医薬活性タンパク質に関連する共通欠点を克服するように設計した、治療用途のためのヒトG−CSFの新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体およびその類縁体に関する。
【課題を解決するための手段】
【0025】
本発明のG−CSF部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、均一な物理化学プロファイルならびに最適な薬物動態学的および薬力学的挙動を示すコンジュゲート誘導体を得るために、該タンパク質の構造的およびコンホメーション的変化を最小とするように設計されている。
【発明の効果】
【0026】
前記性質を有する新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、通常利用している治療化合物の持続型に相当にするものとして、投与頻度を減らして(例えば、毎日の代わりに毎週)使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、G−CSFとPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図2】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、G−CSFとPEG20kDaとの反応混合物の室温、16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図3】Gln134上にPEG化されたG−CSFの精製後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図4】PEG20kDaでGln134上にPEG化されたG−CSFのV8加水分解物のゲル電気泳動を示す図である。
【図5】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、met−G−CSF変異体(Gln135→Asn135)とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図6】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、met−G−CSF変異体(Gln135→Asn135)とPEG20kDaとの反応混合物の室温、16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図7】非微生物トランスグルタミナーゼ(モルモットおよびヒトケラチノサイト)存在下における、G−CSFとPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図8】非微生物トランスグルタミナーゼ(モルモットおよびヒトケラチノサイト)存在下における、G−CSFとPEG20kDaとの反応混合物の室温、16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図9】in vitro生物活性:M−NFS60細胞の増殖曲線を示す図である。
【図10】ラットにおける薬物動態プロファイルを示す図である。
【図11】met−G−CSF、Gln159Asn met−G−CSF、およびGln159Asn/Gln135Asn met−G−CSFのPEG化速度を示す図である。
【図12】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、met−G−CSF(フィルグラスチム)とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図13】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、met−G−CSF(フィルグラスチム)とPEG20kDaとの反応混合物の16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図14】met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa(フィルグラスチム−Gln135−PEG20kDa)の精製後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図15】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、Gln135Asn met−G−CSF変異体とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図16】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、Gln135Asn met−G−CSF変異体とPEG20kDaとの反応混合物の16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図17】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、Gln135Asn−Thr134Gln met−G−CSF変異体とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図18】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、Gln135Asn−Thr134Gln met−G−CSF変異体とPEG20kDaとの反応混合物の16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図19】微生物トランスグルタミナーゼ(250mU/mgタンパク質)存在下における、met−G−CSF(フィルグラスチム)とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図20】微生物トランスグルタミナーゼ(250mU/mgタンパク質)存在下における、met−G−CSF(フィルグラスチム)とPEG20kDaとの反応混合物の2時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0028】
この手法の結果、本発明の新規なG−CSFコンジュゲート誘導体に関する限定的な態様は、以下のもの:
ポリペプチド鎖置換変異を導入すること、および/またはポリペプチド鎖の部分変性もしくは完全変性を用いることが不要であることを理由とした、治療に既に利用されているG−CSF誘導体の1種に対応するポリペプチド鎖を有するタンパク質のコンジュゲーション反応における使用、
分子量範囲が5kDaから60kDaの生体適合性の線状または分岐の水溶性ポリマーとのコンジュゲーション、
a)受容体相互作用に関わる残基の1つではなく、またはその1つに近接しておらず、更にb)アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFにおいて、オリゴ糖鎖にコンジュゲートしている133位のスレオニン残基、またはアミノ酸175個のメチオニルG−CSF誘導体の対応するスレオニン134残基、またはG−CSF類縁体上の対応するスレオニン残基に、隣接または近接した位置にポリペプチド鎖上で配置されている単一で特異的なアミノ酸残基上の単一ポリマー鎖に、G−CSFを結合するコンジュゲーション技法の使用
である。
【0029】
G−CSFは、好中球前駆細胞、好中球および幾種かの白血病細胞系の膜上に主に発現する特異的受容体(G−CSFR)と相互作用をした後、その機能を明らかにする。G−CSFのその受容体との結合(化学量論的には、G−CSFR2分子毎にG−CSF2分子として起こる)は、受容体の二量化を誘発し、細胞増殖および非増殖的分化を刺激する一連の細胞内反応を活性化する。G−CSF分子上には、受容体の二量化に関与する主な連結部位が2箇所あり、受容体結合に関わる残基が以下のように特定されている。即ち、結合部位1に関連するアミノ酸残基としてLys40、Phe144、Val48およびLeu49であり、結合部位2に関連するアミノ酸残基としてGlu19、Leu15、Asp112およびLeu124である(例えば、非特許文献11および非特許文献12を参照)。
【0030】
タンパク質において、ポリマー鎖への化学的コンジュゲーションに最も利用される反応性基は、リシンのε−アミノ基、およびポリペプチド鎖のN末端アミノ酸のα−アミノ基である。実際こうした基は、高めまたは低めの比率(%)であらゆるタンパク質配列中に出現する。G−CSFに関する限り、アミノ基への化学的連結によるPEGコンジュゲーション(NH2末端およびリシン性アミン)について記載した論文および特許が幾つかある。例えば、特許文献3には、PEG鎖がリシンまたはアミノN末端残基に結合したG−CSF−PEGコンジュゲートが記載されている。G−CSFでは、4個のリシン(Lys16、Lys23、Lys34、Lys40)ならびにポリペプチド鎖のN末端の遊離α−アミノ基があり、その上、これらの荷電官能基が普通、水性溶媒に接触できるので、このコンジュゲーションが可能となる。
【0031】
G−CSFの場合、化学的コンジュゲーションの生成物は、1〜4個のPEG鎖が異なった位置に連結している数種のコンジュゲートの混合物であり、治療に適性とするには、これを分離して、最良の活性、薬物動態プロファイルおよび毒性プロファイルを示す1種または複数の異性体を単離しなければならない。
【0032】
既述のように、いわゆる部位特異的コンジュゲーションにより単一コンジュゲートの形成をもたらす周知の化学的コンジュゲーション技法があるが、その形成は、N末端アミノ酸のα−アミノ基上、天然G−CSF分子の遊離システイン残基上、または部位特異的変異誘発によりポリペプチド鎖中に挿入されたシステイン残基上でしか可能でない。第1の場合(特許文献5に記載されるような場合で、前記のPEG−フィルグラスチム化合物)には、N末端アミノ基の反応選択性は、約5のpH値で化学反応を実施することにより改善され、こうした条件では、リシンのε−アミノ基は軽度な求核性(約9.5のpKa)に過ぎないが、α−N末端基は依然として反応性であり、それより低いpKa値を有する。
【0033】
前記のシステインコンジュゲーションでは、部位特異的変異誘発を用いたシステイン残基の挿入によりG−CSF一次配列を改変すること(例えば、M.S.Rosendahl等、2005年の場合)、または天然G−CSF Cys17を露出させ、反応させるためにG−CSFの変性を用いること(例えば、特許文献6で言及している)が必要である。
【0034】
したがって、従来の化学的コンジュゲーション手順は、本発明に記載の特性を示す部位特異的モノコンジュゲート誘導体の調製には適切でないと想定することができる。
【0035】
トランスグルタミナーゼが触媒する酵素的コンジュゲーション反応でG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体を調製するためには、予備分析により、潜在的に有用な酵素種およびそれらの性質、特に基質特異性に関する性質が確認されるであろう。
【0036】
哺乳動物では、トランスグルタミナーゼ(TGase)は、その産物が、各種組織中(特に表皮組織、血液および前立腺中)に発現する、構造的、機能的に相関した9種のアイソザイム(TG−1からTG−7、因子XIIIA、バンド4.2)として区分される、一群の遺伝子によりコードされる。それらは、Ca2+イオンの存在下、生理的タンパク質および異常タンパク質の翻訳後修飾反応を触媒する(例えば、非特許文献13を参照)。
【0037】
最近、様々な微生物から単離された、特に、Streptoverticillium属細菌種およびBacillus属細菌種に関連する微生物TGase(これらの酵素は、それぞれ細胞外レベルで、胞子内に局在している)についての記載がなされている。微生物TGaseは、対応する真核生物酵素と反対にCa2+イオンによる活性化を必要としない。その上、Streptoverticillium属細菌種に由来し、MTG(微生物トランスグルタミナーゼ)と通称される微生物TGaseは、肉、チーズおよびそれらの誘導品の質感を改善するために、食品産業においても用途が見出されている(例えば、非特許文献14を参照)。
【0038】
哺乳類および微生物双方のTGaseは、ポリペプチド鎖のグルタミン残基のアシルアクセプターであるγ−カルボキサミド基に特異的に作用する。現在までのところ、特定のコンセンサス部位は同定されていないが、微生物または哺乳類TGaseは、ポリペプチド鎖の柔軟で溶媒接触可能な部位に位置するグルタミン残基だけを認識すると、一般に考えられている。しかし、グルタミン残基の前方または後方に、正荷電または立体障害性の側鎖を有するアミノ酸残基が存在すると、該酵素による認識が正の影響を受けることができるという兆候がある(例えば、非特許文献15および非特許文献16を参照)。アシルドナー部分に関しては、微生物および哺乳類双方のTGaseは非選択的である。実際に該TGaseは、タンパク質鎖上のリシン残基のε−アミノ基と反応するだけでなく、アミン一般または一級脂肪族アルキルアミンとも反応することができ、線状鎖上にある少なくとも炭素原子4個の一級脂肪族アミンに対して特異的選択性を有している(例えば、非特許文献17を参照)。
【0039】
微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)の原型と見なすことができる、Streptoverticillium mobaraenseのトランスグルタミナーゼは、哺乳類TGaseより小さい。前者トランスグルタミナーゼの一次配列および三次構造(例えば、非特許文献18を参照)を決定した結果、活性部位周辺のアミノ酸構造の違いが目立ったが、このことから、微生物TGaseは哺乳類TGaseほど特異的ではないと推測される。これらの構造研究に基づいて、微生物トランスグルタミナーゼの特異性は、グルタミン基質残基に関して、活性部位の間隙を形成するタンパク質構造の柔軟性がより大きいために、哺乳類トランスグルタミナーゼの特異性ほど厳密ではないと想定されている。その上、より小さいために、標的タンパク質のグルタミン基質残基との微生物トランスグルタミナーゼの相互作用が恐らく促進されている。
【0040】
結論として、前記の従来法によれば、タンパク質ポリペプチド鎖上のグルタミン残基が微生物または哺乳類トランスグルタミナーゼの潜在的基質になる主要件は、柔軟で溶媒接触可能なタンパク質ドメイン中、または露出したポリペプチド鎖上に配置されていることである。G−CSFポリペプチド鎖中のアミノ酸10個中約1個は、グルタミンであり、合計では17残基になる。こうした残基は全て、推定上のトランスグルタミナーゼ基質と見なすことができるが、タンパク質の三次元構造が、グルタミン残基のほんの2〜3個しか該酵素に接触できなくする上で基本的な役割を演じている。
【0041】
X線結晶解析で決定した(例えば、非特許文献19を参照)場合のG−CSF三次元構造に基づいて、G−CSFグルタミン残基17個それぞれの側鎖表面の溶媒接触性が、分子ドッキング法を用いて計算されている。
【0042】
表1(表中、Gln残基の記数は、アミノ酸174個の天然G−CSFを指示している)に示すように、グルタミン残基6個、特に70位、173位、131位、119位、90位および11位のGln残基は、側鎖表面の少なくとも40%が溶媒に接触でき、したがって最も有力なトランスグルタミナーゼ基質と見なすことができる。
【0043】
【表1】
【0044】
グルタミン基質周辺のアミノ酸残基(特に、正荷電および極性の残基)は、誘導体化部位の決定において寄与因子と見なされている(例えば、非特許文献10を参照)。例えば、IL−2の酵素的PEG化は、74位(−VLNLAQ74SK−)で選択的に起こる。G−CSFでは、相対的に小さいが、なお相当な溶媒接触性表面を有するGln145残基(−SAFQ145RRAG)が、上記規準に含まれ、別の潜在的TGase基質と見なすことができる。
【0045】
一般に、推定上の微生物TGase基質として潜在的に挙動し、G−CSF構造にある相対的に多数のグルタミンは、一級アミノ基官能化ポリマーでモノコンジュゲートした部位特異的誘導体をもたらすTGase触媒反応を複雑化させると思われる。
【0046】
メチオニル−G−CSFが、微生物トランスグルタミナーゼで触媒された20kDaモノメトキシ−PEG−アミンとのコンジュゲーション反応を受けると、グルタミン135残基上で部位特異的にモノコンジュゲートした、高収率のメチオニル−G−CSF−PEG20kDaが得られることが、意外にも発見されたのであり、それは本発明の特定の主題である。
【0047】
新規で生物活性なモノコンジュゲートG−CSF誘導体は、本明細書に記載され、本発明の主題の1つであり、一級アミノ基で官能化された非免疫原性親水性ポリマー(例えば、モノメトキシ−PEG−アルキルアミンもしくはモノメトキシ−PEG−アミンの誘導体、またはその類縁体)の線状鎖または分岐鎖が、トランスグルタミナーゼ酵素触媒反応により共有結合アミド結合を介して、天然G−CSFにおけるオリゴ糖鎖にコンジュゲートしているスレオニン残基に隣接した、単一のグルタミン残基のアシル部分に部位特異的に連結されている。
【0048】
特に、本発明に従って調製されるモノコンジュゲート誘導体は、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFポリペプチド鎖の132から137、好ましくは132から134の範囲の位置にあり、非免疫原性親水性ポリマーに共有結合で連結されたグルタミン残基を有することを特徴とする。より好ましくは、該グルタミン残基は、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFではGln134残基で表わされ、アミノ酸175個のメチオニル−G−CSFではGln135残基で表わされ、生物活性G−CSF変異体の場合には、ポリペプチド鎖上の対応位置にあるグルタミン残基で表わされる。
【0049】
本発明の一実施形態によれば、該水溶性ポリマーは、線状または分岐状のポリ(エチレングリコール)、ポリ(オキシプロピレン)、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマー、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリロイルモルホリン)、多糖類、またはアミノカルバミルポリ(エチレングリコール)から選択される。
【0050】
本発明の別の実施形態によれば、該親水性ポリマーは、分子量範囲が5kDaから40kDa、好ましくは15kDaから25kDaの線状または分岐状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであり、一層より好ましくは分子量が約20kDaの線状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンである。例えば、それは次式:
NH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3
[式中nの範囲が約112から907、好ましくは約339から566、より好ましくは約453である]
の線状モノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであってもよい。
【0051】
別の実施形態によれば、該親水性ポリマーは、分子量範囲が5kDaから40kDa、好ましくは15kDaから25kDa、より好ましくは20kDaのアミノカルバミルポリエチレングリコールである。例えば、それは次式:
【0052】
【化1】
【0053】
[式中nの範囲が約109から904、好ましくは約336から563、より好ましくは約450である]
のO−[メチル−ポリ(エチレングリコール)]−N−[2−(3−アミノプロポキシ)エトキシ]エチルカルバメートであってもよい。
【0054】
本発明の別の主題は、前駆細胞の増殖および成熟好中球へのその分化に対して刺激活性を有し、前パラグラフに記載され、本発明のために利用できる部位特異的なモノコンジュゲート酵素反応により誘導体化されたG−CSF分子であり、その分子には、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSF分子、N末端にメチオニル残基が追加されているアミノ酸175個のmet−G−CSF(フィルグラスチム)、または天然G−CSF配列と比較して、1個から15個のアミノ酸残基が置換、除去もしくは付加されている他の類似のヒトG−CSF変異型が含まれる。
【0055】
本発明に従って部位特異的モノコンジュゲートを調製するために使用できるG−CSFアミノ酸配列を、以下に2例示す。
【0056】
【表2】
【0057】
表中、n=0または1は、それぞれ、174個のアミノ酸の天然G−CSFおよび175個のアミノ酸のmet−G−CSFに言及し、該ポリマーに共有結合しているグルタミン残基は、太字で下線が付されている。
【0058】
特に、n=0のときはその配列が配列番号1、即ち、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSF配列であり、n=1のときはその配列が配列番号2、即ち、フィルグラスチムに相当する、N末端にメチオニル残基が追加されているアミノ酸175個のmet−G−CSFである。
【0059】
微生物トランスグルタミナーゼ(例えば、Streptoverticillium mobaraenseのMTG酵素)を利用する酵素的コンジュゲーション手順には、本明細書に説明用の例として記載する以下のステップ:
A)pHの範囲6から8の緩衝溶液中へのG−CSF、またはその類縁体もしくは誘導体の溶解、
B)少なくとも1個の一級アミノ官能基を示す親水性ポリマー(例えば、メトキシ−PEG−アミン)の添加、
C)MTGの添加、および15から35℃の範囲の温度、好ましくは25℃での1〜24時間の反応、
D)部位特異的モノコンジュゲートG−CSFの、好ましくはカラムクロマトグラフィーによる任意選択の精製
が含まれる。
【0060】
一実施形態によれば、該酵素は、1〜300mU/mgの間で変化するG−CSF量、好ましくは約250mU/mg G−CSF量で使用され、その反応は1〜6時間実施される。
【0061】
別の実施形態によれば、該酵素は、1〜20mU/mgの間で変化するG−CSF量、好ましくは約10mU/mg G−CSF量で使用され、その反応は12〜24時間実施される。
【0062】
タンパク質の溶解は、リン酸緩衝液その他のpH6〜8の緩衝液中で、好ましくはpH7.4で実施することができる。該反応は、NaClその他の無機もしくは有機塩(1〜200mMの濃度)、あるいは濃度が0.001〜2%の界面活性剤などの添加剤の存在下で実施することができる。
【0063】
アミノ酸174個のG−CSFおよびPEG−アミン−20kDaを用いて反応を実施したとき(下記の実施例1に報告するとおり)、G−CSF−PEG20kDaモノPEG化誘導体の収率は80%を超えていた。
【0064】
コンジュゲート誘導体の特性決定は、ペプチドマッピング分析に従って実施した。生成ペプチドの配列により、アミノ基で官能化したPEGとの天然G−CSFのコンジュゲーションが、Gln134残基上で選択的に起こり、部位特異的モノコンジュゲートが産生することが確認された。グルタミン134上で選択的にモノコンジュゲートされたG−CSF誘導体は、in vitroで相当な生物活性を有し、天然G−CSFと比較して、in vivo投与後の薬理活性の延長を示した。その上、グルタミン135上で選択的にモノコンジュゲートされたmet−G−CSF(met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa)は、基準の市販製品Neulasta(登録商標)(メチオニルアミノ末端上での化学的PEG化で得られるモノPEG化met−G−CSFで製造される)と比較して、高いin vitro生物活性および同等の薬物動態プロファイルを示した。
【0065】
微生物トランスグルタミナーゼで触媒される、アミノ酸174個の天然G−CSFのGln134残基、またはアミノ酸175個のメチオニル−G−CSFのGln135残基、またはG−CSF類縁体の対応Gln残基に対するモノPEG化反応の特異性および選択性は、1個または複数のグルタミン残基が、部位特異的変異誘発によりアスパラギン残基で置換されたmet−G−CSF変異体に関して実施したPEG化試験によって確認された。大腸菌(E.coli)中に発現し、少なくとも95%まで精製した変異体は、非変異基準タンパク質と比較したin vitro生物活性試験により示されたように、適正な構造的コンホメーションを維持していた。
【0066】
met−G−CSFおよびその変異体2種(Gln159AsnおよびGln135Asn/Gln159Asn)に対して同一反応条件で行い、そのプロファイルを図11に示すPEGコンジュゲーションにより、アスパラギン残基で置換するとmet−G−CSFのPEG化反応が本質的に阻害されるので、グルタミン135だけがトランスグルタミナーゼ基質として挙動することが確認された。
【0067】
その上、G−CSF、および化学的コンジュゲーション(例えばPEG化)で得られるその誘導体は共に、水溶液中に保存すると容易に可溶性または不溶性凝集体を発生し、コンジュゲート誘導体の場合、不安定性は、位置およびコンジュゲーション法、タンパク質濃度および保存条件の関数として増加する(例えば、非特許文献20および非特許文献21を参照)。本発明に記載の新規なコンジュゲート誘導体(例えば、アミノ酸174個の天然G−CSFのGln134上でPEG化した誘導体)は、界面活性剤の存在下および非存在下で、濃度5mg/ml、10mg/mlのいずれでも凝集に対して安定であった。
【0068】
本発明の別の主題は、単一の特異的なグルタミン残基上で非免疫原性親水性ポリマーにモノコンジュゲートされた、G−CSF誘導体およびその類縁体の医薬製剤であって、調製済み滅菌溶液、または使用のために適当な溶媒で液戻しする滅菌凍結乾燥粉末を含み得る医薬製剤を包含する。
【0069】
第1の例(調製済み滅菌溶液)では、濃度範囲1から10mg/ml、好ましくは5から10mg/mlのG−CSFコンジュゲート誘導体(例えば、天然G−CSFのGln134にコンジュゲートしたモノPEG化誘導体)だけでなく、例えばスクロース、ラクトース、マンニトールまたはソルビトールの中から選択される等張化剤、および溶液pHを4または5(好ましくは5)に調節する適切な緩衝剤も含んでもよい。場合により、この製剤の別の成分は、Tween20またはTween80などの非イオン界面活性剤であり得る。
【0070】
使用のために液戻しすることになる滅菌した凍結乾燥粉末製剤の場合、その成分の1種は、マンニトール、トレハロース、ソルビトールまたはグリシンなどの膨張剤、および必要であればトレハロースまたはマンニトールなどの凍結保護剤でもよい。液戻し用の溶媒は、注射用の化合物に対して、pHを4から5に調節するための緩衝剤塩を含んだ、または含まない水であり得る。
【0071】
本発明の目的において、
用語「G−CSF相同体」とは、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFのアミノ酸配列との相同性が、少なくとも90%のアミノ酸配列を有する任意のタンパク質を指す。G−CSF相同体のアミノ酸配列の変化は、アミノ酸174個の該天然ヒト配列のアミノ酸1個または複数の付加、サブトラクション、置換または化学修飾に起因し得、
用語「ヒトG−CSF類縁体」とは、前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する天然ヒトG−CSFの活性を有し、そのアミノ酸配列は、配列番号1に従うが、アミノ酸1から15個が除去され、または他のアミノ酸で置換されているポリペプチドを指し、
用語「ヒトG−CSF誘導体」とは、前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する天然ヒトG−CSFの活性を有し、そのアミノ酸配列は、配列番号1に報告されているが、該配列のアミノ酸1個または複数が他の分子に連結されているポリペプチドを指し、G−CSF誘導体の代表例は、グリコシル化G−CSFのフィルグラスチム、具体的には、N末端にメチオニル残基を有する配列番号2のポリペプチドであるが、前記用語同士は、アミノ酸1個または複数が他の分子に結合しているG−CSF類縁体も本発明のために使用できるので、相互に排他的ではなく、
用語「非免疫原性」とは、酵素的コンジュゲーション反応に使用されるポリマーを指し、その同じポリマーを全身経路を介して投与したとき、免疫系の活性化を誘発することもなく、特異的な抗ポリマー抗体をさほど生じることもないことを意味する。
【実施例】
【0072】
本発明の好ましい実施形態を、それだけに限らないが以下の実施例により例示する。
(実施例1)
部位特異的なモノPEG化G−CSF−Gln134−PEG20kDa誘導体の調製
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−G−CSFをpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度で添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の完了後、その溶液をpH4.0の20mM酢酸ナトリウム緩衝液を用いて希釈し、線形勾配(15カラム容積中、0から500mM NaCl)で溶出するカラムクロマトグラフィー(CM Sepharose)で精製した。モノPEG化G−CSFを含有する画分のプールを濃縮し、pH4.0の20mM酢酸ナトリウム緩衝液を用いて溶出する、Sephadex G−25カラム上でのゲルろ過で処理した。
【0073】
この工程の最後に、Gln134残基(rec−h−G−CSF−Cln134−PEG20kDa)上で選択的にモノPEG化された誘導体を、pH4の20mM酢酸ナトリウム緩衝液中、約1mg/mlの濃度で得た。
【0074】
調製および精製の各段階で、試料をSE−HPLCカラム上で分析し、反応収率、精製度およびタンパク質濃度を決定した。開始時および室温での16時間のインキュベーション後の反応混合物、ならびに134位でモノPEG化された精製誘導体のクロマトグラムを、それぞれ図1、2および3に示す。
【0075】
(実施例2)
rec−h−G−CSF−Gln134−PEG20kDaのコンジュゲーション部位の決定
精製したrec−h−G−CSF−Gln134−PEG20kDa化合物を、エンドプロテイナーゼGlucCを用いて酵素的に加水分解した。それを120mMのNH4HCO3緩衝液中、pH8.8、温度37℃で18時間インキュベートした。
【0076】
分解後、ペプチド混合物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、3つの電気泳動バンドが以下のように分離した(図4を参照):(I)分子量4000Da未満のタンパク質に相当する移動帯、(II)分子量約40000Daのタンパク質に相当する移動帯、(III)分子量約60000Daのタンパク質に相当する移動帯。最後のものは、分子量計算値38798Da(20000+18798)を有する非加水分解PEG化タンパク質の残留物である。その高分子量化は、PEG20kDaに繋がったものに属するとみなさなければならず、サイズ2倍の球状タンパク質(40kDa)に相当する。バンドIIは、ヨウ化バリウムで処理した後、強い陽性反応を示し、したがってPEG化ペプチドの存在を示している。バンドIIは、PVDF膜上にウェスタンブロットし、自動エドマン分解を用いて分析することにより、アミノ酸配列を決定した(表2を参照)。
【0077】
【表3】
【0078】
上記に示した結果から、PEG化は、エンドプロテイナーゼGlucCによる加水分解から生じるLeu124〜Ala141ペプチド上、より具体的には、Leu124〜Ala141ペプチドN末端配列の11番アミノ酸に相当するGln134残基上で特異的に起こることが明確に推定することができる。
【0079】
(実施例3)
Gln159AsnおよびGln159Asn/Gln135Asn met−G−CSF変異体の微生物TGaseによるPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化変異体各々をpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム溶液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度で添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時に、反応混合物のアリコートをSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。
【0080】
単一変異体Gln159Asnとは対照的に、二重変異体Gln159Asn/Gln135AsnがPEG化生成物を全く産生しなかったという事実から、コンジュゲーションは、135位のグルタミン上で特異的に行なわれ、上記に示したアミノ酸配列データが確認されることが分かる。室温でのインキュベーションの開始時、および16時間後の反応混合物のクロマトグラムを、それぞれ図5および6に示す。
【0081】
(実施例4)
モルモットTGaseによるmet−G−CSFのPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−G−CSFをpH7.5の100mM トリス緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。モルモットトランスグルタミナーゼ(Sigma)を0.3U/ml反応溶液の濃度まで、および10mM CaCl2を添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時に、反応混合物の試料をSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。
【0082】
予想通り、この酵素はPEGコンジュゲートを全く産生しなかった。
【0083】
室温でのインキュベーションの開始時、および16時間後の反応混合物のクロマトグラムを、それぞれ図7および8に示す。
【0084】
(実施例5)
ヒトケラチノサイトTGaseによるmet−G−CSFのPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−G−CSFをpH7.5の100mM トリス緩衝液中に溶解し、その濃度を約26.5μMに相当するタンパク質0.5mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1にまで添加した。ヒトケラチノサイトトランスグルタミナーゼ(組換えヒトケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、N−Zyme)を0.5U/ml反応溶液の濃度まで、および10mM CaCl2を添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時に、反応混合物のアリコートをSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。
【0085】
予想通り、この酵素はPEGコンジュゲートを全く産生しなかった。
【0086】
(実施例6)
met−G−CSF−Gln135−PEG20kDaのin vitro生物活性の決定
G−CSFの存在下で増殖活性を増加させるマウス骨髄芽細胞系M−NFS60を用いる増殖アッセイで、met−G−CSF−Gln135−PEG20kDaの生物活性をin vitroで試験した(非特許文献22を参照)。
【0087】
M−NFS60細胞を、met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa(1〜30ng/ml)、標準G−CSF(0.001〜5ng/ml)およびN末端PEG化met−G−CSF(1〜30ng/ml)の増加していく濃度を含有する培地(RPMI 1640、10%FBS)200μl中、細胞104個/ウェルの濃度で96−ウェルプレート中に分配した。
【0088】
各プレートを5%CO2雰囲気中、37℃でインキュベートした。48時間後、WST1試薬20μlを添加し、同じ条件で更に4時間インキュベーションを継続した。
【0089】
各試料の吸光度を、ELISAマイクロプレートリーダーを用いて(白い)バックグランドに対して波長範囲420〜480nmで測定した。標準増殖曲線を用いて、試験した試料の生物活性を計算し、EC50値(最大増殖の50%を誘導する濃度)として表わした。
【0090】
アッセイの結果を、表3および図9に示す。
【0091】
【表4】
【0092】
その結果、グルタミン135にモノコンジュゲートしたmet−G−CSF−Gln135−PEG20kDa誘導体は、天然タンパク質の約20%のin vitro残存活性を有し、これは、N末端PEG化h−G−CSF(met−G−CSF−NH−PEG20kDa)の残存活性よりやや高いことが示された。
【0093】
(実施例7)
met−G−CSF−Gln135−PEG20kDaの薬物動態プロファイルの決定
この実験では、グルタミン135上で選択的にモノPEG化されたmet−G−CSF−Gln135−PEG20kDaをラットの皮下に投与し、血清タンパク質濃度の経時評価によってその持続作用を調べた。
【0094】
体重300〜350gのSprague−Dawley雄性ラット4匹からなる3群について、天然G−CSF、N末端PEG化G−CSF(met−G−CSF−NH−PEG20kDa)およびmet−G−CSF−Gln135−PEG20kDaを、ラットの背部の皮下に注射した。
【0095】
第1群の各4匹は、10mM酢酸緩衝液を含むpH5の緩衝塩水溶液に溶解したG−CSF0.1mg/kg用量の接種を受けた。
【0096】
第2群の各4匹には、met−G−CSF−NH−PEG20kDa(10mM酢酸緩衝液を含むpH5の緩衝塩水溶液に溶解した)をG−CSF相当量として計算した用量0.1mg/kgで投与した。
【0097】
第3群の各4匹には、met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa(10mM酢酸緩衝液を含むpH5の緩衝塩水溶液に溶解した)をG−CSF相当量として計算した用量0.1mg/kgで投与した。
【0098】
投与直後ならびに1、2、4、8、24、32、48および72時間後に、血液試料0.5mlを採取した。血液試料を処理して血清を取得し、これを、ELISAタンパク質免疫アッセイ(ELISAキット:ヒトG−CSFアッセイキット;cod.JP27131;IBL Co.Ltd.)で、h−G−CSFを投与したラットから得た血清の標準としてh−G−CSFを、第2群のラットから得た血清の標準としてmet−G−CSF−NH−PEG20kDaを、met−G−CSF−Gln135−PEG20kDaで処置したラットに対するラット血清投薬量の標準としてmet−G−CSF−Gln135−PEG20kDaを用いて試験した。
【0099】
血清濃度の値を用いて、図10に報告したように薬物動態プロファイルを計算し、AUC(曲線下面積)、TmaxおよびCmax(ピークの時間および濃度)およびT1/2(半減期)を決定した。その結果を表4に示す。
【0100】
【表5】
【0101】
(実施例8)
部位特異的モノPEG化met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa(フィルグラスチム−Gln135−PEG20kDa)誘導体の調製
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−met−G−CSF(フィルグラスチム)をpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度まで添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の終了時、その溶液をpH4.0の20mM酢酸ナトリウム緩衝液で希釈し、線形勾配(15カラム容積中、0から500mM NaCl)で溶出するカラムクロマトグラフィー(CM Sepharose)で精製した。モノPEG化G−CSFを含有する画分のプールを濃縮し、pH4.0の20mM酢酸ナトリウム緩衝液で溶出する、Sephadex G−25カラム上でのゲルろ過で処理した。
【0102】
この工程の終了時、誘導体は、pH4の20mM酢酸ナトリウム緩衝液中、約1mg/mlの濃度で、Gln135残基上に選択的にモノPEG化されていた(rec−h−met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa)。
【0103】
調製および精製の各段階の試料をSE−HPLCカラム上で分析し、反応収率、精製率および濃度を決定した。開始時および室温での16時間のインキュベーション後の反応混合物、ならびに135位(Gln135)でモノPEG化された精製誘導体のクロマトグラムを、それぞれ図12、13および14に示す。
【0104】
(実施例9)
Gln135Asn met−G−CSF変異体の微生物TGaseによるPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化Gln135Asn met−G−CSFをpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度まで添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時、反応混合物の試料をSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。
【0105】
反応の開始前に記録したクロマトグラム(図15)および16時間後に記録したクロマトグラム(図16)は、非コンジュゲートタンパク質に相当する保持時間に1本のピークを有することを特徴としており、したがってこのGln135Asn変異体はPEG化されなかった。
【0106】
(実施例10)
Gln135Asn−Thr134Gln met−G−CSF変異体の微生物TGaseによるPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化Gln135Asn−Thr134Gln変異体をpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度まで添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時、反応混合物の試料をSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。met−G−CSF−Gln134−PEG20kDa変異体のPEG化収率計算値は60%である。
【0107】
反応の開始前に採取した試料のクロマトグラム(図17)は、タンパク質に相当する単一ピークを示した。25℃で16時間インキュベーションした後、保持時間が短縮された(したがってMWが増加した)新しいピークが認められ、これは、反応の終了時に採取した試料のクロマトグラムにも示された(図18)。
【0108】
(実施例11)
微生物TGase(250mU/mgタンパク質)の使用によるMet−G−CSF(フィルグラスチム)のPEG20kDa−NH2へのPEG化
この実施例は、250mU MTgase/mgフィルグラスチムの比率でMTGaseを用いると、僅か2時間の反応時間後にフィルグラスチムのPEG化を定量的に得ることが可能であることを示している。
【0109】
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−met−G−CSF(フィルグラスチム)をpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。次いで、微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.25U/ml反応溶液の濃度まで反応混合物に添加した。その反応を、軽く撹拌しながら室温で2時間実施した。試料を採取し、SE−HPLCカラム上で分析することにより、反応収率を決定した。開始時、および室温で2時間後の反応混合物のクロマトグラムを、それぞれ図19および20に示す。
【技術分野】
【0001】
前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の新規な部位特異的モノコンジュゲート、ならびにその類縁体および誘導体を本明細書に記述する。これらのコンジュゲートは、トランスグルタミナーゼを用いて、天然のヒトG−CSFポリペプチド配列およびその類縁体の単一グルタミン残基に、親水性の非免疫原性ポリマーを共有結合で部位特異的に結合して得られている。これらの新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、溶液中で安定であり、顕著なin vitro生物活性を示し、非コンジュゲートタンパク質と比較して血流半減期が長く、その結果長期の薬理活性を示すので、治療用途に推奨される。
【背景技術】
【0002】
ヒト顆粒球コロニー刺激因子(h−G−CSF)は、間質細胞、マクロファージ、線維芽細胞および単球により自然に産生される20kDaの糖タンパク質である。その産生は、内毒素に曝した際および感染中に増加する。G−CSFは、好中球前駆細胞上に発現するG−CSF受容体(G−CSFR)に高い親和性で結合する骨髄において、該細胞の増殖および抗感染性成熟好中球への分化を誘発するが、他の血液細胞系にはさしたる造血作用を及ぼさずに作用する。
【0003】
主たる天然G−CSFアイソフォームは、2個のジスルフィド結合に用いられた4個のシステイン残基、17位の遊離システイン残基、および133位にあるスレオニン残基側鎖の酸素上のグリコシル化部位(O−連結グリコシル化)を有する、174個のアミノ酸ポリペプチドである。グリコシル化は、効率的な受容体との結合の確立またはG−CSF生物活性にとって必要ではない(例えば、非特許文献1参照)が、単一O−糖鎖の存在によりG−CSFの物理的および酵素的安定性が改善されることが報告されている(例えば、非特許文献2、非特許文献3参照)。遺伝子工学技法によるヒトG−CSF産生によって、原発性、続発性双方の数種の好中球減少症を処置する新しい治療法が開発されてきた。特に、組換えG−CSF化合物は、以下の治療法:
骨髄毒性抗腫瘍薬または骨髄機能廃絶療法に続く骨髄移植で処置されている危険性の高い患者における、好中球減少症と、感染性および発熱性関連現象の期間短縮、
骨髄抑制または骨髄機能廃絶療法と、場合によりそれに続く骨髄移植を受けている患者における、自家細胞移植にて使用する末梢血前駆細胞の動員、
先天性または特発性好中球減少症に罹り、好中球原形質濃度の激減、ならびに感染症および発熱を示す患者の処置、
後期HIV感染症患者に発現する、好中球減少症および細菌感染症の処置
のために病院環境で処方される。
【0004】
各種の好中球減少症に罹った患者のG−CSFによる処置の際に示された特別の関心から、哺乳動物、細菌双方の細胞系で産生される組換え化合物の開発が盛んに行われてきた。
【0005】
実際、組換えG−CSFの少なくとも3種の変異型:
哺乳動物細胞に発現し、天然タンパク質ポリペプチド鎖と同一のアミノ酸174個のポリペプチド鎖として作製され、133位のスレオニン残基上にO−連結オリゴ糖部分を含んだ、レノグラスチムと称するグリコシル化型、
N末端にある追加のメチオニル残基以外は、天然タンパク質と同一のアミノ酸175個のポリペプチド鎖(met−G−CSF)として細菌細胞中に発現する、フィルグラスチムと称する非グリコシル化型、
N末端にある追加のメチオニル残基、ならびにThr2、Leu4、Gly5、Pro6およびCys18の残基のAla、Thr、Tyr、ArgおよびSer各残基による置換が、天然タンパク質ポリペプチド鎖と異なるアミノ酸175個のポリペプチド鎖(met−G−CSF)として細菌細胞中に発現する、ナルトグラスチムと称する非グリコシル化型
が、治療用途のために数カ国で入手可能である。
【0006】
様々な組換えG−CSF誘導体の臨床応用で熟知されている制約は、非経口投与後の血流における薬物動態半減期(t1/2)が3〜4時間という短い循環永続性である。その結果、例えば、非骨髄性腫瘍を有し、骨髄抑制化学療法を受けている患者において感染症の発現を低減するための組換えG−CSFの処方投薬量は、化学療法サイクルの期間に対するG−CSF5μg/kg/日の皮下注射を、サイクル当たり注射10〜14回に及んで毎日投与することからなる。
【0007】
G−CSFの薬物動態プロファイルは、大多数のサイトカイン同様に、G−CSF受容体を発現する細胞により媒介される、インターナリゼーションおよび部分的分解の特異的で可飽和性の機構以外に、非特異的で非可飽和性の腎クリアランス機構(およびそれ程ではないが、肝クリアランス)によって調節される。
【0008】
腎クリアランスはタンパク質分子のサイズに関係するので、腎限外ろ過を減少させる方法の1つは、分子サイズおよび/または流体力学的体積を増加させることである。
【0009】
これは、治療タンパク質の分野における非常に一般的な問題であり、幾つかの解決策として、治療タンパク質の担体タンパク質(例えば、免疫グロブリンまたはアルブミン)との融合、徐放性ポリマーのナノスフェアおよびミクロスフェア中への活性成分の組込み、ならびに生体適合性の高分子量ポリマーとのタンパク質の共有結合性コンジュゲーションが提案されてきた。
【0010】
特にタンパク質−ポリマーの共有結合性コンジュゲーション領域では、いわゆるPEG化が広範に採用されてきており、この場合、選択されたタンパク質は、1000〜2000Daから20000〜40000Daまたはそれ以上に及ぶ分子量を有し、1本または複数の線状または分岐ポリ(エチレングリコール)(PEG)に共有結合される。一般にPEG化タンパク質は、腎クリアランス速度の低下、ならびに安定性の向上および免疫原性の減少を示す。PEGがポリペプチドに適切に結合されると、その流体力学的体積および物理化学的性質が変化する一方、in vitro活性または受容体認識などの基本的な生物学的機能は、未変化のままか、僅かな減少を受けるか、場合によっては完全に抑制されることもある。PEGコンジュゲーションは、タンパク質表面をマスキングし、分子サイズを増加させ、したがって腎限外ろ過を減少させ、抗体または抗原提示細胞の結合を防止し、タンパク分解酵素による分解を低減する。最終的に、PEGコンジュゲーションは、PEGの物理化学的性質を付与し、そのためペプチド兼ノンペプチド薬物の生体分布および溶解性は、同様に変化する。タンパク質コンジュゲーション用のPEG代替物として、デキストラン、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリロイルモルホリン)または多糖類などその他の生体適合性の線状または分岐ポリマーを使用してもよい。
【0011】
一般に使用される化学的PEG化法およびその結果を概観するには、非特許文献4および非特許文献5が参考となる。
【0012】
生体適合性高分子量ポリマーとの共有結合性G−CSFコンジュゲーションは、例えば、幾つかの科学論文および特許に記載されており、その一部を以下に簡単に要約する。
【0013】
特許文献1には、ポリ(エチレングリコール)またはポリ(プロピレングリコール)のポリマー鎖に化学的にコンジュゲートし、生物活性を維持し、血流半減期の増加を示すG−CSF遺伝的変異型が記載されている。
【0014】
特許文献2には、アミノ酸側鎖のアミノ基およびカルボキシル基の化学的結合によるPEG鎖でのG−CSF修飾によって、半減期の長いPEG−G−CSFコンジュゲートを産生することが記載されている。
【0015】
特許文献3には、ポリマーPEG鎖1〜15本に化学結合し、in vivo投与後の安定性、溶解性および血流循環が改善されたG−CSF誘導体が記載されている。
【0016】
特許文献4には、異なった構造的、物理化学的および生物学的性質を示すPEG−G−CSF化学コンジュゲートが記載されている。
【0017】
G−CSFのアミノ基またはカルボキシル基による非選択的コンジュゲーションで主に得られる以上のコンジュゲートは、通常、アイソフォームのコンジュゲート混合物であるが、下記に報告するような本質的に部位特異的なモノコンジュゲート誘導体を産生することを目的とした、G−CSF化学コンジュゲートが開発されてきた。
【0018】
特許文献5には、ポリマーと該タンパク質とのアミド結合、および好ましくは還元的アルキル化反応を介したポリマーと該タンパク質とのアミン結合の双方により得ることができる、ポリペプチド鎖のN末端アミノ酸残基のα−アミノ基に対するポリマー化合物のコンジュゲーションに対する方法が記載されている(例えば、非特許文献6を参照)。したがって、この技術の適用によって、N末端メチオニルのα−アミノ基上で20kDaの線状PEGにコンジュゲートしたmet−G−CSFの開発が、プロピオンアルデヒドで官能化したモノメトキシPEG鎖を用いたpH5での還元的アルキル化反応により可能となった。この生成物は、PEG−フィルグラスチムの国際的一般名およびNeulasta(登録商標)の登録商品名で市販されてきた(例えば、非特許文献7を参照)。
【0019】
部位特異的コンジュゲートを潜在的に生じることができる別のタンパク質残基は、チオールラジカルと共有結合を形成する残基で官能化されたPEG分子に対する高反応性部分である、システインチオール基である(例えば、非特許文献8を参照)。大部分のタンパク質は遊離システイン残基(即ち、ジスルフィド結合に関与していない)を有していないので、部位特異的な変異誘発を介して、ポリペプチド鎖の中にシステイン残基を挿入し、次いで、官能化されたポリマーを用いたその反応性システインチオール基との反応を可能にすることにより、ポリマーおよびタンパク質を部位特異的にコンジュゲートすることが可能であるが、それについては一連のG−CSF変異体に対して記載されている(例えば、非特許文献9を参照)。部分的に代替的な手法に従って、特許文献6には、そのままでは疎水性ポケット中にマスクされてしまう遊離−SH部分を溶媒に曝すように部分的にタンパク質変性をした後、ジスルフィド結合(Cys17)に関与しないその天然システインチオール基上でr−h−G−CSFをコンジュゲーションすることが記載されている。
【0020】
以上の多様な化学的コンジュゲーション法だけでなく、酵素的手順も、ポリマーおよびタンパク質を結合するために記載されている。こうした手順は、原核性、真核性双方のトランスグルタミナーゼ酵素の使用によって、対象とするポリペプチド鎖中に自然に存在する、または部位特異的な変異誘発反応により挿入したグルタミン残基のアシル基に対する、一級アミノ基で官能化したポリマーの転移を触媒することに基づいている(例えば、非特許文献10を参照)。
【0021】
したがって、例えば、特許文献7および特許文献8の双方には、微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)の使用によって、アミノ酸配列中に少なくとも1個のグルタミン残基を有するペプチドおよびタンパク質中に、ポリマー鎖を挿入することが記載されている。これらの特許では、幾つかのモデルタンパク質上での一置換に関する実施例を示しているが、複数置換も部位特異的であるのか明らかではなく、すなわち、複数置換が単一の分子形態を産生するのか、あるいは一置換ではあっても、ポリマー鎖が異なるグルタミンに結合している位置異性体混合物を産生することを意味しているのかが明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0022】
【特許文献1】国際公開第89/06546号パンフレット
【特許文献2】国際公開第90/06952号パンフレット
【特許文献3】国際公開第00/44785号パンフレット
【特許文献4】欧州特許第0335423号明細書
【特許文献5】米国特許第5985265号明細書
【特許文献6】国際公開第2005/099769A2号パンフレット
【特許文献7】欧州特許第785276号明細書
【特許文献8】米国特許第6010871号明細書
【非特許文献】
【0023】
【非特許文献1】N. A. Nicola, "Hemopoietic Cell Growth Factors and their Receptors", Ann. Rev. Biochem., 58, 45-77, 1989
【非特許文献2】M. Oheda et al., "O-linked Sugar Chain of Human Granulocyte Stimulating Factor Protects it against Polymerization and Denaturation Allowing it to Retain its Biological Activity", J. Biol. Chem., 265, 11432-11435, 1990
【非特許文献3】C. R. D. Carter et al., "Human Serum Inactivates Non-Glycosylated but not Glycosylated Granulocyte Colony Stimulating Factor by a Protease Dependent Mechanism: Significance of Carbohydrates on the Glycosylated Molecule", Biologicals, 32, 37-47, 2004
【非特許文献4】S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Adv. Drug Deliv. Rev., 16, 157-182, 1995
【非特許文献5】F.M. Veronese, Peptide and Protein PEGylation: a Review of Problems and Solutions, Biomaterials, 22, 405-417, 2001
【非特許文献6】O. Kinstler et al., Mono-N-terminal Poly-(Ethylen Glycol)-Protein Conjugates, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 477-485, 2002
【非特許文献7】O. Kinstler et al., Characterization and Stability of N-terminally PEGylated rhG-CSF, Pharmac. Res., 13, 996-1002, 1996
【非特許文献8】M.J. Roberts et al., Chemistry for Peptide and Protein PEGylation, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 459-476, 2002
【非特許文献9】M.S. Rosendahl et al., Site-specific Protein PEGylation. Application to Cysteine Analogs of Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor, BioProcess Internat., 3(4), 52-60, 2005
【非特許文献10】H. Sato, Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation of Proteins, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 487-504, 2002
【非特許文献11】J.F. Reidhaar-Olson et al., Identification of Residues Critical to the Activity of Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor, Biochemistry, 35, 9034-9041, 1996
【非特許文献12】D.C. Young et al., Characterization of the Receptor Binding Determinants of Granulocyte Colony Stimulating Factor, Prot. Sci., 6, 1228-1236, 1997
【非特許文献13】M. Griffin et al., Transglutaminases: Nature's Biological Glues, Biochem. J., 368, 377-396, 2002
【非特許文献14】P.M. Nielsen, Reactions and Potential Industrial Applications of Transglutaminase. Review of Literature and Patent, Food Biotechnol., 9, 119-156, 1995
【非特許文献15】P. Cousson et al., Factors that Govern the Specificity of Transglutaminase-Catalyzed Modification of Proteins and Peptides, Biochem. J., 282, 929-930, 1992
【非特許文献16】T. Ohtsuka et al., Comparison of Substrate Specificities of Transglutaminase Using Synthetic Peptides as Acyl Donors, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2608-2613, 2000
【非特許文献17】T. Ohtsuka et al., Substrate Specificities of Microbial Transglutaminase for Primary Amines, J. Agric. Food Chem., 48, 6230-6233, 2000
【非特許文献18】T. Kashiwagi et al., Crystal Structure of Microbial Transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense, J. Biol. Chem., 277, 44252-44260, 2002
【非特許文献19】C.P. Hill et al., The Structure of Granulocyte Colony-Stimulating Factor and its Relationship to Other Growth Factors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5167-5171, 1993
【非特許文献20】M.J. Treuheit et al., Inverse Relationship of Protein Concentration and Aggregation, Pharmac. Res., 19, 511-516, 2002
【非特許文献21】R.S. Rajan et al., Modulation of Protein Aggregation by Polyethylene Glycol Conjugation: G-CSF a Case Study, Prot. Sci., 15, 1063-1075, 2006
【非特許文献22】N. Shirafuji et al., A New Bioassay for Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor Using Murine Myeloblastic NFS-60 Cells as Targets and Estimation of Its Level in Sera from Normal Healthy Persons and Patients with Infectious and Haematological Disorders, Exp. Hematol., 17, 116-119, 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0024】
本発明は、高いクリアランス速度およびその結果としての血中半減期の減少、タンパク質分解感受性、ならびに潜在的な免疫原性反応などの医薬活性タンパク質に関連する共通欠点を克服するように設計した、治療用途のためのヒトG−CSFの新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体およびその類縁体に関する。
【課題を解決するための手段】
【0025】
本発明のG−CSF部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、均一な物理化学プロファイルならびに最適な薬物動態学的および薬力学的挙動を示すコンジュゲート誘導体を得るために、該タンパク質の構造的およびコンホメーション的変化を最小とするように設計されている。
【発明の効果】
【0026】
前記性質を有する新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、通常利用している治療化合物の持続型に相当にするものとして、投与頻度を減らして(例えば、毎日の代わりに毎週)使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、G−CSFとPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図2】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、G−CSFとPEG20kDaとの反応混合物の室温、16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図3】Gln134上にPEG化されたG−CSFの精製後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図4】PEG20kDaでGln134上にPEG化されたG−CSFのV8加水分解物のゲル電気泳動を示す図である。
【図5】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、met−G−CSF変異体(Gln135→Asn135)とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図6】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、met−G−CSF変異体(Gln135→Asn135)とPEG20kDaとの反応混合物の室温、16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図7】非微生物トランスグルタミナーゼ(モルモットおよびヒトケラチノサイト)存在下における、G−CSFとPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図8】非微生物トランスグルタミナーゼ(モルモットおよびヒトケラチノサイト)存在下における、G−CSFとPEG20kDaとの反応混合物の室温、16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図9】in vitro生物活性:M−NFS60細胞の増殖曲線を示す図である。
【図10】ラットにおける薬物動態プロファイルを示す図である。
【図11】met−G−CSF、Gln159Asn met−G−CSF、およびGln159Asn/Gln135Asn met−G−CSFのPEG化速度を示す図である。
【図12】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、met−G−CSF(フィルグラスチム)とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図13】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、met−G−CSF(フィルグラスチム)とPEG20kDaとの反応混合物の16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図14】met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa(フィルグラスチム−Gln135−PEG20kDa)の精製後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図15】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、Gln135Asn met−G−CSF変異体とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図16】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、Gln135Asn met−G−CSF変異体とPEG20kDaとの反応混合物の16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図17】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、Gln135Asn−Thr134Gln met−G−CSF変異体とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図18】微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)存在下における、Gln135Asn−Thr134Gln met−G−CSF変異体とPEG20kDaとの反応混合物の16時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図19】微生物トランスグルタミナーゼ(250mU/mgタンパク質)存在下における、met−G−CSF(フィルグラスチム)とPEG20kDaとの反応混合物の0時間でのSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図20】微生物トランスグルタミナーゼ(250mU/mgタンパク質)存在下における、met−G−CSF(フィルグラスチム)とPEG20kDaとの反応混合物の2時間後のSE−HPLCクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0028】
この手法の結果、本発明の新規なG−CSFコンジュゲート誘導体に関する限定的な態様は、以下のもの:
ポリペプチド鎖置換変異を導入すること、および/またはポリペプチド鎖の部分変性もしくは完全変性を用いることが不要であることを理由とした、治療に既に利用されているG−CSF誘導体の1種に対応するポリペプチド鎖を有するタンパク質のコンジュゲーション反応における使用、
分子量範囲が5kDaから60kDaの生体適合性の線状または分岐の水溶性ポリマーとのコンジュゲーション、
a)受容体相互作用に関わる残基の1つではなく、またはその1つに近接しておらず、更にb)アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFにおいて、オリゴ糖鎖にコンジュゲートしている133位のスレオニン残基、またはアミノ酸175個のメチオニルG−CSF誘導体の対応するスレオニン134残基、またはG−CSF類縁体上の対応するスレオニン残基に、隣接または近接した位置にポリペプチド鎖上で配置されている単一で特異的なアミノ酸残基上の単一ポリマー鎖に、G−CSFを結合するコンジュゲーション技法の使用
である。
【0029】
G−CSFは、好中球前駆細胞、好中球および幾種かの白血病細胞系の膜上に主に発現する特異的受容体(G−CSFR)と相互作用をした後、その機能を明らかにする。G−CSFのその受容体との結合(化学量論的には、G−CSFR2分子毎にG−CSF2分子として起こる)は、受容体の二量化を誘発し、細胞増殖および非増殖的分化を刺激する一連の細胞内反応を活性化する。G−CSF分子上には、受容体の二量化に関与する主な連結部位が2箇所あり、受容体結合に関わる残基が以下のように特定されている。即ち、結合部位1に関連するアミノ酸残基としてLys40、Phe144、Val48およびLeu49であり、結合部位2に関連するアミノ酸残基としてGlu19、Leu15、Asp112およびLeu124である(例えば、非特許文献11および非特許文献12を参照)。
【0030】
タンパク質において、ポリマー鎖への化学的コンジュゲーションに最も利用される反応性基は、リシンのε−アミノ基、およびポリペプチド鎖のN末端アミノ酸のα−アミノ基である。実際こうした基は、高めまたは低めの比率(%)であらゆるタンパク質配列中に出現する。G−CSFに関する限り、アミノ基への化学的連結によるPEGコンジュゲーション(NH2末端およびリシン性アミン)について記載した論文および特許が幾つかある。例えば、特許文献3には、PEG鎖がリシンまたはアミノN末端残基に結合したG−CSF−PEGコンジュゲートが記載されている。G−CSFでは、4個のリシン(Lys16、Lys23、Lys34、Lys40)ならびにポリペプチド鎖のN末端の遊離α−アミノ基があり、その上、これらの荷電官能基が普通、水性溶媒に接触できるので、このコンジュゲーションが可能となる。
【0031】
G−CSFの場合、化学的コンジュゲーションの生成物は、1〜4個のPEG鎖が異なった位置に連結している数種のコンジュゲートの混合物であり、治療に適性とするには、これを分離して、最良の活性、薬物動態プロファイルおよび毒性プロファイルを示す1種または複数の異性体を単離しなければならない。
【0032】
既述のように、いわゆる部位特異的コンジュゲーションにより単一コンジュゲートの形成をもたらす周知の化学的コンジュゲーション技法があるが、その形成は、N末端アミノ酸のα−アミノ基上、天然G−CSF分子の遊離システイン残基上、または部位特異的変異誘発によりポリペプチド鎖中に挿入されたシステイン残基上でしか可能でない。第1の場合(特許文献5に記載されるような場合で、前記のPEG−フィルグラスチム化合物)には、N末端アミノ基の反応選択性は、約5のpH値で化学反応を実施することにより改善され、こうした条件では、リシンのε−アミノ基は軽度な求核性(約9.5のpKa)に過ぎないが、α−N末端基は依然として反応性であり、それより低いpKa値を有する。
【0033】
前記のシステインコンジュゲーションでは、部位特異的変異誘発を用いたシステイン残基の挿入によりG−CSF一次配列を改変すること(例えば、M.S.Rosendahl等、2005年の場合)、または天然G−CSF Cys17を露出させ、反応させるためにG−CSFの変性を用いること(例えば、特許文献6で言及している)が必要である。
【0034】
したがって、従来の化学的コンジュゲーション手順は、本発明に記載の特性を示す部位特異的モノコンジュゲート誘導体の調製には適切でないと想定することができる。
【0035】
トランスグルタミナーゼが触媒する酵素的コンジュゲーション反応でG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体を調製するためには、予備分析により、潜在的に有用な酵素種およびそれらの性質、特に基質特異性に関する性質が確認されるであろう。
【0036】
哺乳動物では、トランスグルタミナーゼ(TGase)は、その産物が、各種組織中(特に表皮組織、血液および前立腺中)に発現する、構造的、機能的に相関した9種のアイソザイム(TG−1からTG−7、因子XIIIA、バンド4.2)として区分される、一群の遺伝子によりコードされる。それらは、Ca2+イオンの存在下、生理的タンパク質および異常タンパク質の翻訳後修飾反応を触媒する(例えば、非特許文献13を参照)。
【0037】
最近、様々な微生物から単離された、特に、Streptoverticillium属細菌種およびBacillus属細菌種に関連する微生物TGase(これらの酵素は、それぞれ細胞外レベルで、胞子内に局在している)についての記載がなされている。微生物TGaseは、対応する真核生物酵素と反対にCa2+イオンによる活性化を必要としない。その上、Streptoverticillium属細菌種に由来し、MTG(微生物トランスグルタミナーゼ)と通称される微生物TGaseは、肉、チーズおよびそれらの誘導品の質感を改善するために、食品産業においても用途が見出されている(例えば、非特許文献14を参照)。
【0038】
哺乳類および微生物双方のTGaseは、ポリペプチド鎖のグルタミン残基のアシルアクセプターであるγ−カルボキサミド基に特異的に作用する。現在までのところ、特定のコンセンサス部位は同定されていないが、微生物または哺乳類TGaseは、ポリペプチド鎖の柔軟で溶媒接触可能な部位に位置するグルタミン残基だけを認識すると、一般に考えられている。しかし、グルタミン残基の前方または後方に、正荷電または立体障害性の側鎖を有するアミノ酸残基が存在すると、該酵素による認識が正の影響を受けることができるという兆候がある(例えば、非特許文献15および非特許文献16を参照)。アシルドナー部分に関しては、微生物および哺乳類双方のTGaseは非選択的である。実際に該TGaseは、タンパク質鎖上のリシン残基のε−アミノ基と反応するだけでなく、アミン一般または一級脂肪族アルキルアミンとも反応することができ、線状鎖上にある少なくとも炭素原子4個の一級脂肪族アミンに対して特異的選択性を有している(例えば、非特許文献17を参照)。
【0039】
微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)の原型と見なすことができる、Streptoverticillium mobaraenseのトランスグルタミナーゼは、哺乳類TGaseより小さい。前者トランスグルタミナーゼの一次配列および三次構造(例えば、非特許文献18を参照)を決定した結果、活性部位周辺のアミノ酸構造の違いが目立ったが、このことから、微生物TGaseは哺乳類TGaseほど特異的ではないと推測される。これらの構造研究に基づいて、微生物トランスグルタミナーゼの特異性は、グルタミン基質残基に関して、活性部位の間隙を形成するタンパク質構造の柔軟性がより大きいために、哺乳類トランスグルタミナーゼの特異性ほど厳密ではないと想定されている。その上、より小さいために、標的タンパク質のグルタミン基質残基との微生物トランスグルタミナーゼの相互作用が恐らく促進されている。
【0040】
結論として、前記の従来法によれば、タンパク質ポリペプチド鎖上のグルタミン残基が微生物または哺乳類トランスグルタミナーゼの潜在的基質になる主要件は、柔軟で溶媒接触可能なタンパク質ドメイン中、または露出したポリペプチド鎖上に配置されていることである。G−CSFポリペプチド鎖中のアミノ酸10個中約1個は、グルタミンであり、合計では17残基になる。こうした残基は全て、推定上のトランスグルタミナーゼ基質と見なすことができるが、タンパク質の三次元構造が、グルタミン残基のほんの2〜3個しか該酵素に接触できなくする上で基本的な役割を演じている。
【0041】
X線結晶解析で決定した(例えば、非特許文献19を参照)場合のG−CSF三次元構造に基づいて、G−CSFグルタミン残基17個それぞれの側鎖表面の溶媒接触性が、分子ドッキング法を用いて計算されている。
【0042】
表1(表中、Gln残基の記数は、アミノ酸174個の天然G−CSFを指示している)に示すように、グルタミン残基6個、特に70位、173位、131位、119位、90位および11位のGln残基は、側鎖表面の少なくとも40%が溶媒に接触でき、したがって最も有力なトランスグルタミナーゼ基質と見なすことができる。
【0043】
【表1】
【0044】
グルタミン基質周辺のアミノ酸残基(特に、正荷電および極性の残基)は、誘導体化部位の決定において寄与因子と見なされている(例えば、非特許文献10を参照)。例えば、IL−2の酵素的PEG化は、74位(−VLNLAQ74SK−)で選択的に起こる。G−CSFでは、相対的に小さいが、なお相当な溶媒接触性表面を有するGln145残基(−SAFQ145RRAG)が、上記規準に含まれ、別の潜在的TGase基質と見なすことができる。
【0045】
一般に、推定上の微生物TGase基質として潜在的に挙動し、G−CSF構造にある相対的に多数のグルタミンは、一級アミノ基官能化ポリマーでモノコンジュゲートした部位特異的誘導体をもたらすTGase触媒反応を複雑化させると思われる。
【0046】
メチオニル−G−CSFが、微生物トランスグルタミナーゼで触媒された20kDaモノメトキシ−PEG−アミンとのコンジュゲーション反応を受けると、グルタミン135残基上で部位特異的にモノコンジュゲートした、高収率のメチオニル−G−CSF−PEG20kDaが得られることが、意外にも発見されたのであり、それは本発明の特定の主題である。
【0047】
新規で生物活性なモノコンジュゲートG−CSF誘導体は、本明細書に記載され、本発明の主題の1つであり、一級アミノ基で官能化された非免疫原性親水性ポリマー(例えば、モノメトキシ−PEG−アルキルアミンもしくはモノメトキシ−PEG−アミンの誘導体、またはその類縁体)の線状鎖または分岐鎖が、トランスグルタミナーゼ酵素触媒反応により共有結合アミド結合を介して、天然G−CSFにおけるオリゴ糖鎖にコンジュゲートしているスレオニン残基に隣接した、単一のグルタミン残基のアシル部分に部位特異的に連結されている。
【0048】
特に、本発明に従って調製されるモノコンジュゲート誘導体は、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFポリペプチド鎖の132から137、好ましくは132から134の範囲の位置にあり、非免疫原性親水性ポリマーに共有結合で連結されたグルタミン残基を有することを特徴とする。より好ましくは、該グルタミン残基は、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFではGln134残基で表わされ、アミノ酸175個のメチオニル−G−CSFではGln135残基で表わされ、生物活性G−CSF変異体の場合には、ポリペプチド鎖上の対応位置にあるグルタミン残基で表わされる。
【0049】
本発明の一実施形態によれば、該水溶性ポリマーは、線状または分岐状のポリ(エチレングリコール)、ポリ(オキシプロピレン)、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)ブロックコポリマー、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリロイルモルホリン)、多糖類、またはアミノカルバミルポリ(エチレングリコール)から選択される。
【0050】
本発明の別の実施形態によれば、該親水性ポリマーは、分子量範囲が5kDaから40kDa、好ましくは15kDaから25kDaの線状または分岐状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであり、一層より好ましくは分子量が約20kDaの線状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンである。例えば、それは次式:
NH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3
[式中nの範囲が約112から907、好ましくは約339から566、より好ましくは約453である]
の線状モノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであってもよい。
【0051】
別の実施形態によれば、該親水性ポリマーは、分子量範囲が5kDaから40kDa、好ましくは15kDaから25kDa、より好ましくは20kDaのアミノカルバミルポリエチレングリコールである。例えば、それは次式:
【0052】
【化1】
【0053】
[式中nの範囲が約109から904、好ましくは約336から563、より好ましくは約450である]
のO−[メチル−ポリ(エチレングリコール)]−N−[2−(3−アミノプロポキシ)エトキシ]エチルカルバメートであってもよい。
【0054】
本発明の別の主題は、前駆細胞の増殖および成熟好中球へのその分化に対して刺激活性を有し、前パラグラフに記載され、本発明のために利用できる部位特異的なモノコンジュゲート酵素反応により誘導体化されたG−CSF分子であり、その分子には、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSF分子、N末端にメチオニル残基が追加されているアミノ酸175個のmet−G−CSF(フィルグラスチム)、または天然G−CSF配列と比較して、1個から15個のアミノ酸残基が置換、除去もしくは付加されている他の類似のヒトG−CSF変異型が含まれる。
【0055】
本発明に従って部位特異的モノコンジュゲートを調製するために使用できるG−CSFアミノ酸配列を、以下に2例示す。
【0056】
【表2】
【0057】
表中、n=0または1は、それぞれ、174個のアミノ酸の天然G−CSFおよび175個のアミノ酸のmet−G−CSFに言及し、該ポリマーに共有結合しているグルタミン残基は、太字で下線が付されている。
【0058】
特に、n=0のときはその配列が配列番号1、即ち、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSF配列であり、n=1のときはその配列が配列番号2、即ち、フィルグラスチムに相当する、N末端にメチオニル残基が追加されているアミノ酸175個のmet−G−CSFである。
【0059】
微生物トランスグルタミナーゼ(例えば、Streptoverticillium mobaraenseのMTG酵素)を利用する酵素的コンジュゲーション手順には、本明細書に説明用の例として記載する以下のステップ:
A)pHの範囲6から8の緩衝溶液中へのG−CSF、またはその類縁体もしくは誘導体の溶解、
B)少なくとも1個の一級アミノ官能基を示す親水性ポリマー(例えば、メトキシ−PEG−アミン)の添加、
C)MTGの添加、および15から35℃の範囲の温度、好ましくは25℃での1〜24時間の反応、
D)部位特異的モノコンジュゲートG−CSFの、好ましくはカラムクロマトグラフィーによる任意選択の精製
が含まれる。
【0060】
一実施形態によれば、該酵素は、1〜300mU/mgの間で変化するG−CSF量、好ましくは約250mU/mg G−CSF量で使用され、その反応は1〜6時間実施される。
【0061】
別の実施形態によれば、該酵素は、1〜20mU/mgの間で変化するG−CSF量、好ましくは約10mU/mg G−CSF量で使用され、その反応は12〜24時間実施される。
【0062】
タンパク質の溶解は、リン酸緩衝液その他のpH6〜8の緩衝液中で、好ましくはpH7.4で実施することができる。該反応は、NaClその他の無機もしくは有機塩(1〜200mMの濃度)、あるいは濃度が0.001〜2%の界面活性剤などの添加剤の存在下で実施することができる。
【0063】
アミノ酸174個のG−CSFおよびPEG−アミン−20kDaを用いて反応を実施したとき(下記の実施例1に報告するとおり)、G−CSF−PEG20kDaモノPEG化誘導体の収率は80%を超えていた。
【0064】
コンジュゲート誘導体の特性決定は、ペプチドマッピング分析に従って実施した。生成ペプチドの配列により、アミノ基で官能化したPEGとの天然G−CSFのコンジュゲーションが、Gln134残基上で選択的に起こり、部位特異的モノコンジュゲートが産生することが確認された。グルタミン134上で選択的にモノコンジュゲートされたG−CSF誘導体は、in vitroで相当な生物活性を有し、天然G−CSFと比較して、in vivo投与後の薬理活性の延長を示した。その上、グルタミン135上で選択的にモノコンジュゲートされたmet−G−CSF(met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa)は、基準の市販製品Neulasta(登録商標)(メチオニルアミノ末端上での化学的PEG化で得られるモノPEG化met−G−CSFで製造される)と比較して、高いin vitro生物活性および同等の薬物動態プロファイルを示した。
【0065】
微生物トランスグルタミナーゼで触媒される、アミノ酸174個の天然G−CSFのGln134残基、またはアミノ酸175個のメチオニル−G−CSFのGln135残基、またはG−CSF類縁体の対応Gln残基に対するモノPEG化反応の特異性および選択性は、1個または複数のグルタミン残基が、部位特異的変異誘発によりアスパラギン残基で置換されたmet−G−CSF変異体に関して実施したPEG化試験によって確認された。大腸菌(E.coli)中に発現し、少なくとも95%まで精製した変異体は、非変異基準タンパク質と比較したin vitro生物活性試験により示されたように、適正な構造的コンホメーションを維持していた。
【0066】
met−G−CSFおよびその変異体2種(Gln159AsnおよびGln135Asn/Gln159Asn)に対して同一反応条件で行い、そのプロファイルを図11に示すPEGコンジュゲーションにより、アスパラギン残基で置換するとmet−G−CSFのPEG化反応が本質的に阻害されるので、グルタミン135だけがトランスグルタミナーゼ基質として挙動することが確認された。
【0067】
その上、G−CSF、および化学的コンジュゲーション(例えばPEG化)で得られるその誘導体は共に、水溶液中に保存すると容易に可溶性または不溶性凝集体を発生し、コンジュゲート誘導体の場合、不安定性は、位置およびコンジュゲーション法、タンパク質濃度および保存条件の関数として増加する(例えば、非特許文献20および非特許文献21を参照)。本発明に記載の新規なコンジュゲート誘導体(例えば、アミノ酸174個の天然G−CSFのGln134上でPEG化した誘導体)は、界面活性剤の存在下および非存在下で、濃度5mg/ml、10mg/mlのいずれでも凝集に対して安定であった。
【0068】
本発明の別の主題は、単一の特異的なグルタミン残基上で非免疫原性親水性ポリマーにモノコンジュゲートされた、G−CSF誘導体およびその類縁体の医薬製剤であって、調製済み滅菌溶液、または使用のために適当な溶媒で液戻しする滅菌凍結乾燥粉末を含み得る医薬製剤を包含する。
【0069】
第1の例(調製済み滅菌溶液)では、濃度範囲1から10mg/ml、好ましくは5から10mg/mlのG−CSFコンジュゲート誘導体(例えば、天然G−CSFのGln134にコンジュゲートしたモノPEG化誘導体)だけでなく、例えばスクロース、ラクトース、マンニトールまたはソルビトールの中から選択される等張化剤、および溶液pHを4または5(好ましくは5)に調節する適切な緩衝剤も含んでもよい。場合により、この製剤の別の成分は、Tween20またはTween80などの非イオン界面活性剤であり得る。
【0070】
使用のために液戻しすることになる滅菌した凍結乾燥粉末製剤の場合、その成分の1種は、マンニトール、トレハロース、ソルビトールまたはグリシンなどの膨張剤、および必要であればトレハロースまたはマンニトールなどの凍結保護剤でもよい。液戻し用の溶媒は、注射用の化合物に対して、pHを4から5に調節するための緩衝剤塩を含んだ、または含まない水であり得る。
【0071】
本発明の目的において、
用語「G−CSF相同体」とは、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFのアミノ酸配列との相同性が、少なくとも90%のアミノ酸配列を有する任意のタンパク質を指す。G−CSF相同体のアミノ酸配列の変化は、アミノ酸174個の該天然ヒト配列のアミノ酸1個または複数の付加、サブトラクション、置換または化学修飾に起因し得、
用語「ヒトG−CSF類縁体」とは、前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する天然ヒトG−CSFの活性を有し、そのアミノ酸配列は、配列番号1に従うが、アミノ酸1から15個が除去され、または他のアミノ酸で置換されているポリペプチドを指し、
用語「ヒトG−CSF誘導体」とは、前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する天然ヒトG−CSFの活性を有し、そのアミノ酸配列は、配列番号1に報告されているが、該配列のアミノ酸1個または複数が他の分子に連結されているポリペプチドを指し、G−CSF誘導体の代表例は、グリコシル化G−CSFのフィルグラスチム、具体的には、N末端にメチオニル残基を有する配列番号2のポリペプチドであるが、前記用語同士は、アミノ酸1個または複数が他の分子に結合しているG−CSF類縁体も本発明のために使用できるので、相互に排他的ではなく、
用語「非免疫原性」とは、酵素的コンジュゲーション反応に使用されるポリマーを指し、その同じポリマーを全身経路を介して投与したとき、免疫系の活性化を誘発することもなく、特異的な抗ポリマー抗体をさほど生じることもないことを意味する。
【実施例】
【0072】
本発明の好ましい実施形態を、それだけに限らないが以下の実施例により例示する。
(実施例1)
部位特異的なモノPEG化G−CSF−Gln134−PEG20kDa誘導体の調製
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−G−CSFをpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度で添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の完了後、その溶液をpH4.0の20mM酢酸ナトリウム緩衝液を用いて希釈し、線形勾配(15カラム容積中、0から500mM NaCl)で溶出するカラムクロマトグラフィー(CM Sepharose)で精製した。モノPEG化G−CSFを含有する画分のプールを濃縮し、pH4.0の20mM酢酸ナトリウム緩衝液を用いて溶出する、Sephadex G−25カラム上でのゲルろ過で処理した。
【0073】
この工程の最後に、Gln134残基(rec−h−G−CSF−Cln134−PEG20kDa)上で選択的にモノPEG化された誘導体を、pH4の20mM酢酸ナトリウム緩衝液中、約1mg/mlの濃度で得た。
【0074】
調製および精製の各段階で、試料をSE−HPLCカラム上で分析し、反応収率、精製度およびタンパク質濃度を決定した。開始時および室温での16時間のインキュベーション後の反応混合物、ならびに134位でモノPEG化された精製誘導体のクロマトグラムを、それぞれ図1、2および3に示す。
【0075】
(実施例2)
rec−h−G−CSF−Gln134−PEG20kDaのコンジュゲーション部位の決定
精製したrec−h−G−CSF−Gln134−PEG20kDa化合物を、エンドプロテイナーゼGlucCを用いて酵素的に加水分解した。それを120mMのNH4HCO3緩衝液中、pH8.8、温度37℃で18時間インキュベートした。
【0076】
分解後、ペプチド混合物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、3つの電気泳動バンドが以下のように分離した(図4を参照):(I)分子量4000Da未満のタンパク質に相当する移動帯、(II)分子量約40000Daのタンパク質に相当する移動帯、(III)分子量約60000Daのタンパク質に相当する移動帯。最後のものは、分子量計算値38798Da(20000+18798)を有する非加水分解PEG化タンパク質の残留物である。その高分子量化は、PEG20kDaに繋がったものに属するとみなさなければならず、サイズ2倍の球状タンパク質(40kDa)に相当する。バンドIIは、ヨウ化バリウムで処理した後、強い陽性反応を示し、したがってPEG化ペプチドの存在を示している。バンドIIは、PVDF膜上にウェスタンブロットし、自動エドマン分解を用いて分析することにより、アミノ酸配列を決定した(表2を参照)。
【0077】
【表3】
【0078】
上記に示した結果から、PEG化は、エンドプロテイナーゼGlucCによる加水分解から生じるLeu124〜Ala141ペプチド上、より具体的には、Leu124〜Ala141ペプチドN末端配列の11番アミノ酸に相当するGln134残基上で特異的に起こることが明確に推定することができる。
【0079】
(実施例3)
Gln159AsnおよびGln159Asn/Gln135Asn met−G−CSF変異体の微生物TGaseによるPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化変異体各々をpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム溶液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度で添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時に、反応混合物のアリコートをSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。
【0080】
単一変異体Gln159Asnとは対照的に、二重変異体Gln159Asn/Gln135AsnがPEG化生成物を全く産生しなかったという事実から、コンジュゲーションは、135位のグルタミン上で特異的に行なわれ、上記に示したアミノ酸配列データが確認されることが分かる。室温でのインキュベーションの開始時、および16時間後の反応混合物のクロマトグラムを、それぞれ図5および6に示す。
【0081】
(実施例4)
モルモットTGaseによるmet−G−CSFのPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−G−CSFをpH7.5の100mM トリス緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。モルモットトランスグルタミナーゼ(Sigma)を0.3U/ml反応溶液の濃度まで、および10mM CaCl2を添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時に、反応混合物の試料をSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。
【0082】
予想通り、この酵素はPEGコンジュゲートを全く産生しなかった。
【0083】
室温でのインキュベーションの開始時、および16時間後の反応混合物のクロマトグラムを、それぞれ図7および8に示す。
【0084】
(実施例5)
ヒトケラチノサイトTGaseによるmet−G−CSFのPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−G−CSFをpH7.5の100mM トリス緩衝液中に溶解し、その濃度を約26.5μMに相当するタンパク質0.5mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1にまで添加した。ヒトケラチノサイトトランスグルタミナーゼ(組換えヒトケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、N−Zyme)を0.5U/ml反応溶液の濃度まで、および10mM CaCl2を添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時に、反応混合物のアリコートをSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。
【0085】
予想通り、この酵素はPEGコンジュゲートを全く産生しなかった。
【0086】
(実施例6)
met−G−CSF−Gln135−PEG20kDaのin vitro生物活性の決定
G−CSFの存在下で増殖活性を増加させるマウス骨髄芽細胞系M−NFS60を用いる増殖アッセイで、met−G−CSF−Gln135−PEG20kDaの生物活性をin vitroで試験した(非特許文献22を参照)。
【0087】
M−NFS60細胞を、met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa(1〜30ng/ml)、標準G−CSF(0.001〜5ng/ml)およびN末端PEG化met−G−CSF(1〜30ng/ml)の増加していく濃度を含有する培地(RPMI 1640、10%FBS)200μl中、細胞104個/ウェルの濃度で96−ウェルプレート中に分配した。
【0088】
各プレートを5%CO2雰囲気中、37℃でインキュベートした。48時間後、WST1試薬20μlを添加し、同じ条件で更に4時間インキュベーションを継続した。
【0089】
各試料の吸光度を、ELISAマイクロプレートリーダーを用いて(白い)バックグランドに対して波長範囲420〜480nmで測定した。標準増殖曲線を用いて、試験した試料の生物活性を計算し、EC50値(最大増殖の50%を誘導する濃度)として表わした。
【0090】
アッセイの結果を、表3および図9に示す。
【0091】
【表4】
【0092】
その結果、グルタミン135にモノコンジュゲートしたmet−G−CSF−Gln135−PEG20kDa誘導体は、天然タンパク質の約20%のin vitro残存活性を有し、これは、N末端PEG化h−G−CSF(met−G−CSF−NH−PEG20kDa)の残存活性よりやや高いことが示された。
【0093】
(実施例7)
met−G−CSF−Gln135−PEG20kDaの薬物動態プロファイルの決定
この実験では、グルタミン135上で選択的にモノPEG化されたmet−G−CSF−Gln135−PEG20kDaをラットの皮下に投与し、血清タンパク質濃度の経時評価によってその持続作用を調べた。
【0094】
体重300〜350gのSprague−Dawley雄性ラット4匹からなる3群について、天然G−CSF、N末端PEG化G−CSF(met−G−CSF−NH−PEG20kDa)およびmet−G−CSF−Gln135−PEG20kDaを、ラットの背部の皮下に注射した。
【0095】
第1群の各4匹は、10mM酢酸緩衝液を含むpH5の緩衝塩水溶液に溶解したG−CSF0.1mg/kg用量の接種を受けた。
【0096】
第2群の各4匹には、met−G−CSF−NH−PEG20kDa(10mM酢酸緩衝液を含むpH5の緩衝塩水溶液に溶解した)をG−CSF相当量として計算した用量0.1mg/kgで投与した。
【0097】
第3群の各4匹には、met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa(10mM酢酸緩衝液を含むpH5の緩衝塩水溶液に溶解した)をG−CSF相当量として計算した用量0.1mg/kgで投与した。
【0098】
投与直後ならびに1、2、4、8、24、32、48および72時間後に、血液試料0.5mlを採取した。血液試料を処理して血清を取得し、これを、ELISAタンパク質免疫アッセイ(ELISAキット:ヒトG−CSFアッセイキット;cod.JP27131;IBL Co.Ltd.)で、h−G−CSFを投与したラットから得た血清の標準としてh−G−CSFを、第2群のラットから得た血清の標準としてmet−G−CSF−NH−PEG20kDaを、met−G−CSF−Gln135−PEG20kDaで処置したラットに対するラット血清投薬量の標準としてmet−G−CSF−Gln135−PEG20kDaを用いて試験した。
【0099】
血清濃度の値を用いて、図10に報告したように薬物動態プロファイルを計算し、AUC(曲線下面積)、TmaxおよびCmax(ピークの時間および濃度)およびT1/2(半減期)を決定した。その結果を表4に示す。
【0100】
【表5】
【0101】
(実施例8)
部位特異的モノPEG化met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa(フィルグラスチム−Gln135−PEG20kDa)誘導体の調製
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−met−G−CSF(フィルグラスチム)をpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度まで添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の終了時、その溶液をpH4.0の20mM酢酸ナトリウム緩衝液で希釈し、線形勾配(15カラム容積中、0から500mM NaCl)で溶出するカラムクロマトグラフィー(CM Sepharose)で精製した。モノPEG化G−CSFを含有する画分のプールを濃縮し、pH4.0の20mM酢酸ナトリウム緩衝液で溶出する、Sephadex G−25カラム上でのゲルろ過で処理した。
【0102】
この工程の終了時、誘導体は、pH4の20mM酢酸ナトリウム緩衝液中、約1mg/mlの濃度で、Gln135残基上に選択的にモノPEG化されていた(rec−h−met−G−CSF−Gln135−PEG20kDa)。
【0103】
調製および精製の各段階の試料をSE−HPLCカラム上で分析し、反応収率、精製率および濃度を決定した。開始時および室温での16時間のインキュベーション後の反応混合物、ならびに135位(Gln135)でモノPEG化された精製誘導体のクロマトグラムを、それぞれ図12、13および14に示す。
【0104】
(実施例9)
Gln135Asn met−G−CSF変異体の微生物TGaseによるPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化Gln135Asn met−G−CSFをpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度まで添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時、反応混合物の試料をSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。
【0105】
反応の開始前に記録したクロマトグラム(図15)および16時間後に記録したクロマトグラム(図16)は、非コンジュゲートタンパク質に相当する保持時間に1本のピークを有することを特徴としており、したがってこのGln135Asn変異体はPEG化されなかった。
【0106】
(実施例10)
Gln135Asn−Thr134Gln met−G−CSF変異体の微生物TGaseによるPEG20kDa−NH2へのPEG化
大腸菌中に発現した非グリコシル化Gln135Asn−Thr134Gln変異体をpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.024U/ml反応溶液の濃度まで添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で16時間インキュベートした。反応の開始および終了時、反応混合物の試料をSE−HPLCカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。met−G−CSF−Gln134−PEG20kDa変異体のPEG化収率計算値は60%である。
【0107】
反応の開始前に採取した試料のクロマトグラム(図17)は、タンパク質に相当する単一ピークを示した。25℃で16時間インキュベーションした後、保持時間が短縮された(したがってMWが増加した)新しいピークが認められ、これは、反応の終了時に採取した試料のクロマトグラムにも示された(図18)。
【0108】
(実施例11)
微生物TGase(250mU/mgタンパク質)の使用によるMet−G−CSF(フィルグラスチム)のPEG20kDa−NH2へのPEG化
この実施例は、250mU MTgase/mgフィルグラスチムの比率でMTGaseを用いると、僅か2時間の反応時間後にフィルグラスチムのPEG化を定量的に得ることが可能であることを示している。
【0109】
大腸菌中に発現した非グリコシル化rec−met−G−CSF(フィルグラスチム)をpH7.4の10mMリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約53μMに相当するタンパク質1mg/mlとした。次いで、20kDaのモノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)アミン(メトキシポリ(エチレングリコール)アミン20000、Fluka)を、そのタンパク質溶液にPEG:G−CSFのモル比10:1になるまで添加した。次いで、微生物トランスグルタミナーゼ(Activa WM、味の素)を0.25U/ml反応溶液の濃度まで反応混合物に添加した。その反応を、軽く撹拌しながら室温で2時間実施した。試料を採取し、SE−HPLCカラム上で分析することにより、反応収率を決定した。開始時、および室温で2時間後の反応混合物のクロマトグラムを、それぞれ図19および20に示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFポリペプチド鎖配列の132番から137番の範囲の位置にあるグルタミン残基は、非免疫原性親水性ポリマーに共有結合で連結していることを特徴とする、ヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体、またはその類縁体および/または誘導体。
【請求項2】
前記グルタミン残基は、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFポリペプチド鎖の132番から134番の範囲の位置、またはアミノ酸175個のMet−G−CSF誘導体ポリペプチド鎖の133番から135番の範囲の位置、またはG−CSF相同体ポリペプチド鎖の対応する位置にあることを特徴とする、請求項1に記載のヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項3】
前記グルタミン残基は、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFポリペプチド鎖の134位、またはアミノ酸175個のMet−G−CSF誘導体ポリペプチド鎖の135位、またはG−CSF相同体ポリペプチド鎖の対応する位置にあることを特徴とする、請求項1に記載のヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項4】
前記コンジュゲート化親水性ポリマーは、少なくとも1個のアミノ基で官能化されていることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項5】
前記親水性ポリマーは、線状または分岐状のポリエチレングリコール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロイルモルホリン、多糖類、アミノカルバミルポリエチレングリコールの中から選択されることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項6】
前記親水性ポリマーは、分子量が5kDaから40kDaの範囲にある線状または分岐状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項7】
前記親水性ポリマーは、分子量が15kDaから25kDaの範囲にある線状または分岐状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項8】
前記親水性ポリマーは、分子量約20kDaの線状モノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項9】
前記親水性ポリマーは、分子量が5kDaから40kDa、好ましくは15kDaから25kDaの範囲にあるアミノカルバミルポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項10】
配列番号1に対応するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1に記載のヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項11】
配列番号2に対応するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1に記載のヒトG−CSF誘導体の部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項12】
医薬として許容可能な賦形剤および/または補助剤と共に、請求項1から11のいずれかに記載のヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体および/またはその類縁体および/または誘導体を、少なくとも1種含有することを特徴とする製剤。
【請求項13】
溶液または凍結乾燥粉末であることを特徴とする、請求項12に記載の製剤。
【請求項14】
非経口的に投与できることを特徴とする、請求項12に記載の製剤。
【請求項15】
好中球減少症を治療および/または予防するための、および/または哺乳類末梢血の造血前駆細胞を動員するための医薬製剤の調製における、請求項1から11のいずれかに記載の少なくとも1種の部位特異的モノコンジュゲート誘導体の使用。
【請求項16】
トランスグルタミナーゼ活性酵素の存在下、グルタミン残基と非免疫原性親水性ポリマーとのアミド結合反応の達成を含むことを特徴とする、請求項1から11のいずれかに記載の部位特異的モノコンジュゲート誘導体を調製する方法。
【請求項17】
前記酵素は細菌起源であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
前記酵素は、Streptoverticillium mobaraenseのトランスグルタミナーゼであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項19】
前記反応は、pHが6から8の範囲、好ましくは約7.4の緩衝塩水溶液中で実施されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項20】
前記反応は1〜24時間実施されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項21】
前記酵素は、1〜300mU/mg G−CSF、またはその類縁体および/または誘導体量、好ましくは約250mU/mg G−CSF、またはその類縁体および/または誘導体量で使用され、前記反応は、1〜6時間実施されることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項22】
前記酵素は、1〜20mU/mg G−CSF、またはその類縁体および/または誘導体量、好ましくは約10mU/mg G−CSF、またはその類縁体および/または誘導体量で使用され、前記反応は、12〜24時間実施されることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項23】
前記反応は、15から35℃の温度範囲、好ましくは約25℃で実施されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項24】
前記反応は、無機塩もしくは有機塩の存在下、および/または界面活性剤の存在下で実施されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項25】
前記無機塩および/または有機塩は、0から200mMの間で変化する濃度で存在し、前記界面活性剤は、0から2%の間で変化する濃度で存在することを特徴とする、請求項24に記載の方法。
【請求項26】
前記無機塩はNaClであることを特徴とする、請求項24に記載の方法。
【請求項27】
前記酵素、および/または前記のG−CSFまたはその類縁体および/または誘導体は、組換え体起源であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項1】
アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFポリペプチド鎖配列の132番から137番の範囲の位置にあるグルタミン残基は、非免疫原性親水性ポリマーに共有結合で連結していることを特徴とする、ヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体、またはその類縁体および/または誘導体。
【請求項2】
前記グルタミン残基は、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFポリペプチド鎖の132番から134番の範囲の位置、またはアミノ酸175個のMet−G−CSF誘導体ポリペプチド鎖の133番から135番の範囲の位置、またはG−CSF相同体ポリペプチド鎖の対応する位置にあることを特徴とする、請求項1に記載のヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項3】
前記グルタミン残基は、アミノ酸174個の天然ヒトG−CSFポリペプチド鎖の134位、またはアミノ酸175個のMet−G−CSF誘導体ポリペプチド鎖の135位、またはG−CSF相同体ポリペプチド鎖の対応する位置にあることを特徴とする、請求項1に記載のヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項4】
前記コンジュゲート化親水性ポリマーは、少なくとも1個のアミノ基で官能化されていることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項5】
前記親水性ポリマーは、線状または分岐状のポリエチレングリコール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロイルモルホリン、多糖類、アミノカルバミルポリエチレングリコールの中から選択されることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項6】
前記親水性ポリマーは、分子量が5kDaから40kDaの範囲にある線状または分岐状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項7】
前記親水性ポリマーは、分子量が15kDaから25kDaの範囲にある線状または分岐状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項8】
前記親水性ポリマーは、分子量約20kDaの線状モノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項9】
前記親水性ポリマーは、分子量が5kDaから40kDa、好ましくは15kDaから25kDaの範囲にあるアミノカルバミルポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項1に記載のG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項10】
配列番号1に対応するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1に記載のヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項11】
配列番号2に対応するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1に記載のヒトG−CSF誘導体の部位特異的モノコンジュゲート誘導体。
【請求項12】
医薬として許容可能な賦形剤および/または補助剤と共に、請求項1から11のいずれかに記載のヒトG−CSFの部位特異的モノコンジュゲート誘導体および/またはその類縁体および/または誘導体を、少なくとも1種含有することを特徴とする製剤。
【請求項13】
溶液または凍結乾燥粉末であることを特徴とする、請求項12に記載の製剤。
【請求項14】
非経口的に投与できることを特徴とする、請求項12に記載の製剤。
【請求項15】
好中球減少症を治療および/または予防するための、および/または哺乳類末梢血の造血前駆細胞を動員するための医薬製剤の調製における、請求項1から11のいずれかに記載の少なくとも1種の部位特異的モノコンジュゲート誘導体の使用。
【請求項16】
トランスグルタミナーゼ活性酵素の存在下、グルタミン残基と非免疫原性親水性ポリマーとのアミド結合反応の達成を含むことを特徴とする、請求項1から11のいずれかに記載の部位特異的モノコンジュゲート誘導体を調製する方法。
【請求項17】
前記酵素は細菌起源であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
前記酵素は、Streptoverticillium mobaraenseのトランスグルタミナーゼであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項19】
前記反応は、pHが6から8の範囲、好ましくは約7.4の緩衝塩水溶液中で実施されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項20】
前記反応は1〜24時間実施されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項21】
前記酵素は、1〜300mU/mg G−CSF、またはその類縁体および/または誘導体量、好ましくは約250mU/mg G−CSF、またはその類縁体および/または誘導体量で使用され、前記反応は、1〜6時間実施されることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項22】
前記酵素は、1〜20mU/mg G−CSF、またはその類縁体および/または誘導体量、好ましくは約10mU/mg G−CSF、またはその類縁体および/または誘導体量で使用され、前記反応は、12〜24時間実施されることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項23】
前記反応は、15から35℃の温度範囲、好ましくは約25℃で実施されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項24】
前記反応は、無機塩もしくは有機塩の存在下、および/または界面活性剤の存在下で実施されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項25】
前記無機塩および/または有機塩は、0から200mMの間で変化する濃度で存在し、前記界面活性剤は、0から2%の間で変化する濃度で存在することを特徴とする、請求項24に記載の方法。
【請求項26】
前記無機塩はNaClであることを特徴とする、請求項24に記載の方法。
【請求項27】
前記酵素、および/または前記のG−CSFまたはその類縁体および/または誘導体は、組換え体起源であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【公表番号】特表2010−500390(P2010−500390A)
【公表日】平成22年1月7日(2010.1.7)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−524158(P2009−524158)
【出願日】平成19年7月30日(2007.7.30)
【国際出願番号】PCT/EP2007/057824
【国際公開番号】WO2008/017603
【国際公開日】平成20年2月14日(2008.2.14)
【出願人】(508202418)バイオ−ケル ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (4)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成22年1月7日(2010.1.7)
【国際特許分類】
【出願日】平成19年7月30日(2007.7.30)
【国際出願番号】PCT/EP2007/057824
【国際公開番号】WO2008/017603
【国際公開日】平成20年2月14日(2008.2.14)
【出願人】(508202418)バイオ−ケル ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (4)
【Fターム(参考)】
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