ＧＭ−９５物質を含む抗腫瘍効果増強剤、抗腫瘍用組み合わせ製剤及び抗腫瘍剤
下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、抗腫瘍性物質の抗腫瘍効果増強剤。
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、抗腫瘍性物質の抗腫瘍効果増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、２種以上の抗腫瘍作用を有する化合物を組み合わせて使用（併用）する抗腫瘍製剤に関する。より詳細には、複数個のオキサゾール環を有する抗腫瘍性化合物と他の抗腫瘍性物質とを併用した抗腫瘍製剤に関する。
【背景技術】
腫瘍細胞（癌細胞）は通常細胞より増殖速度が大きく、腫瘍細胞の死滅効果が増殖速度と同等又はそれ以下では癌の進行を抑える程度であり、癌の根本的な治療とはなりえない。また、各抗腫瘍剤には最適投与量があり、該投与量より多量の抗腫瘍剤を投与しても、それに比例して腫瘍細胞の死滅効果が上昇するというわけではなく、通常は僅かに上昇するに過ぎない。しかも多量投与による正常細胞の損傷等の悪影響の方が強く現れることが多く、１種類の抗腫瘍剤の多量投与による治療効果の増大は殆ど望めない。
このようなことから、抗腫瘍効果の向上及び副作用の軽減のため、或いは、腫瘍細胞が薬剤に対する耐性を獲得することを防止するために２種以上を組み合せた多剤併用療法が行なわれることが多い。
近年、新たな癌分子標的の一つとしてテロメラーゼが注目されている。テロメラーゼは、正常細胞では一部の組織を除き発現していないが、癌細胞では実に９０％以上にもおよぶ細胞において高頻度に再発現している。テロメア長は細胞の老化と密接に関係しており、癌細胞をテロメラーゼ阻害剤で処理することにより人工的に細胞老化を引き起こすことが期待される。一方、現在臨床で使用されている薬剤の４０％が、微生物代謝産物をはじめとする天然由来の化合物であり、今でも薬剤開発のソースとして広く用いられている。
以前に、本発明者らは、土壌分離放線菌（ストレプトマイセス属に属する３５３３−ＳＶ４株）が複数個のオキサゾール環を有する抗腫瘍性化合物（以下、「ＧＭ−９５物質」とも呼ぶ。）を産生することを見出し、その詳細について既に報告した（例えば、国際公開第００／２４７４７号パンフレット）。ＧＭ−９５物質は、現在報告されているテロメラーゼ阻害剤のうち、合成化合物も含め最も強力なものであった。ＧＭ−９５物質の数種の癌細胞に対する作用を検討した結果、テロメアの短縮を伴う細胞老化を誘導した。またこれらの老化細胞は、造腫瘍性が消失していたことから、抗腫瘍剤としての可能性が示唆された。
しかしながら、ＧＭ−９５物質等のテロメラーゼ阻害物質と他の抗腫瘍性物質とを併用した抗腫瘍医薬及びその併用効果については何ら知られていない。
【特許文献１】国際公開第００／２４７４７号パンフレット
【発明の開示】
本発明は、２種以上の抗腫瘍性物質を併用することにより抗腫瘍作用を相乗的に高めること、及びそのような抗腫瘍作用が相乗的に高められた抗腫瘍併用剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＧＭ−９５物質又はその誘導体と他の抗腫瘍物質とを併用すると、それぞれ単独で用いた場合と比較して顕著に抗腫瘍活性が高くなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗腫瘍効果増強剤。
（２）前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである前記（１）記載の抗腫瘍効果増強剤。
（３）前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである前記（１）記載の抗腫瘍効果増強剤。
（４）頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための前記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
（５）下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用する、前記式（１）の化合物と前記他の抗腫瘍性物質とを同時に、別々に又は順次投与するための抗腫瘍用組み合わせ製剤。
（６）前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである前記（５）記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
（７）前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである前記（５）記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
（８）頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための前記（５）〜（７）のいずれかに記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
（９）下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用する抗腫瘍剤。
（１０）前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである前記（９）記載の抗腫瘍剤。
（１１）前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである前記（９）記載の抗腫瘍剤。
（１２）頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
（１３）下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用するテロメラーゼ阻害剤。
本発明で用いられる化合物は下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）
で表される化合物である。
本明細書において炭素数１〜５のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基及びイソブチル基等の低級アルキルをいう。
置換基Ｒについてより具体的には以下のものが例示される。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル基等が挙げられる。ヘテロアリール基としては、イミダゾリル基、ピリジニル基等の含窒素芳香環基、チオフェン、チアゾール等の含硫黄芳香環基、フラン、オキサゾール等の含酸素芳香環基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
また、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩等の有機酸塩等の酸付加塩が挙げられる。
以下、本明細書において式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩を「テロメスタチン類」と呼ぶこともある。
上記式（１）において各Ｒが全て水素原子である化合物を「ＧＭ−９５物質」又は「テロメスタチン（ＴＭＳ）」と呼ぶ。ＧＭ−９５物質の物理化学的性質を以下に示す。
１）分子式：高分解能ファースト アトム ボンバードメント質量分析（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆａｓｔ ａｔｏｍｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｏｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で測定した時、測定値（Ｍ＋Ｈ）＋として、５８３．０７９０を示し、これと一致する分子式はＣ２６Ｈ１５Ｎ８０７Ｓである。
２）分子量：ファースト アトム ボンバードメント質量分析（ｆａｓｔ ａｔｏｍｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｏｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で測定すると、５８２．０７１２を示す。
３）融点：１３８〜１４３℃（分解）。
４）比旋光度：メタノール中、Ｃ＝０．１２９ｇ／１００ｍｌ（メタノール）の濃度で測定。
［α］Ｄ２０＝−９．３８°
５）紫外吸収スペクトル：図１に示す。
測定は、メタノール中（７．３９μＭ溶液）で行った。２５９．５ｎｍで最大吸収を示し、その時の吸光度は０．２８８であった。モル吸光係数（ε）は３８９８２である。
６）赤外線吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）：図２に示す。
νｍａｘ（ｃｍ−１）：３４２１，３１４７，２９５８，２９２３，２８５４，１７３３，１６７０，１６５０，１５４４，１４９６，１４３８，１３９２，１３５１，１３１５，１２６７，１１９９，１１７４，１１１８，１０８７，１０５８，１０３３，９７５，９４３，９２９，９１４，８８３，７９８
７）溶剤に対する溶解性：水、アセトンに不溶。クロロホルム：メタノール＝１：１に溶解する。
８）物質の色：淡黄色粉末（ｗｈｉｔｅ ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ ｐｏｗｄｅｒｓ）
９）核磁気共鳴スペクトル 重クロロホルム：重メタノール＝１：１の溶液中、２５℃で測定した５００ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図３に示す）及び１２５ＭＨｚ１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図４に示す）の化学シフトを下記に示す。
表１
１０）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）における保持時間（Ｒｔ）
下記の分析条件により６．１分にピークが検出される。
カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、株式会社センシュー科学製）
移動相：アセトニトリル／トリフルオロ酢酸／水（７０：０．１：３０Ｖ／Ｖ／Ｖ）
流 速：１ｍｌ／分
検 出：２５４ｎｍ
ＧＭ−９５物質は、例えば、本物質の生産能力を有する菌株（以下ＧＭ−９５物質生産菌と称する）を、以下に示すような適当な条件下で培養することによって製造することができる。
ＧＭ−９５物質生産菌としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株が挙げられる。ストレプトマイセス属に属する菌株の一例としては、ストレプトマイセス アニュレイタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｕｌａｔｕｓ）３５３３−ＳＶ４株又はその変異株が例示できる。ストレプトマイセス アニュレイタス３５３３−ＳＶ４株は、本発明者らが熊本県玉名郡天水町の土壌から新たに分離したストレプトマイセス属に属する菌株であり、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に住所を有する通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 経済産業省産業技術総合研究所 生命工学工業技術研究所 特許生物寄託センター）に、１９９８年８月１２日に、微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｕｌａｔｕｓ ３５３３−ＳＶ４（ＧＭ９５）」、（受託番号）「ＦＥＲＭ ＢＰ−６４６０」として寄託されている。
ストレプトマイセス アニュレイタス３５３３−ＳＶ４の同定及び菌学的性質は、ＩＳＰ（インターナショナル ストレプトマイセス プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）の方法に従って行った。ストレプトマイセス アニュレイタス３５３３−ＳＶ４株の菌学的性質は、次の通りである。
ａ）形態
本菌株は、ＩＳＰ Ｎｏ．２、３、４及び５培地で２７℃で１４日間培養した。結果は下記の通りである。
１）胞子形成の分枝法；単純分枝
２）胞子形成の形態；螺旋状、胞子形は筒状
３）胞子の数；１０〜５０又はそれ以上
４）胞子の表面構造；平滑
５）胞子の大きさ；０．３〜０．５×０．７〜１．０μｍ
６）鞭毛胞子の有無；無し
７）胞子嚢の有無；無し
８）胞子柄の着生位置；気菌糸
９）菌核形成性の有無；無し
ｂ）各種培地上における生育状態
各種培地における生育状態を表２に示す。表中に記載の培地性状に関する色調名は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカ（Ｃｏｎｔａｉｎｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の「ザ・カラー・ハーモニー・マニュアル」（Ｔｈｅ Ｃｏｌｏｒ Ｈａｒｍｏｎｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９５８年版）に基づいて示した。
表２
ｃ）生理的性質
１）生育温度範囲：２０〜３２℃最適温度；２０〜３０℃
２）ゼラチンの液化：＋
３）スターチの加水分解：＋
４）脱脂粉乳の凝固、ペプトン化：＋
５）メラニン様色素の生成
チロシン寒天培地：−
ペプトン・イースト鉄寒天培地：−
トリプトン・イースト・ブロス培地：＋
６）硝酸塩の還元：＋
７）炭素源の同化（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ Ｎｏ．９））
Ｌ−アラビノース＋；Ｄ−キシロース＋；Ｄ−グルコース＋；Ｄ−フラクトース＋；シュクロース＋；イノシトール＋；Ｌ−ラムノース＋；ラフィノース＋；Ｄ−マンニット＋
ｄ）菌体組成
日本放線菌学会編「放線菌の同定実験法−６−２−７０，１９８５年」に記載の薄層クロマトグラフィー法により全菌体の酸加水分解物を分析した結果，ＬＬ型のジアミノピメリン酸が検出された。
本菌株の基生薗糸は分断しない。気菌糸は長い主軸を形成し、それより不規則に分枝した先端に、１０〜５０個またはそれ以上からなる４〜９回転の螺旋状の胞子鎖を形成する。胞子は非運動性で、円柱形あるいは楕円形を呈し、幅０．３〜０．５、長さ０．７〜１．０μｍで、胞子表面は平滑である。菌核、胞子のう、その他の特殊形態は観察されない。細胞壁化学型は（Ｉ）型である。培養性状を表２に示す。気菌糸の色調は黄色系列である。基生菌糸の色調は不鮮明色を呈し、ｐＨで変化しない。拡散性色素は全体としては認められない。生理的性状を上記ｃ）に示す。本菌株は中温性である。本菌株の形態的性状と細胞壁化学型から、本菌株はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，以後、「Ｓ．」と略す。）属に位置する。
上述の諸性状を基に、「細菌名承認リスト、１９８０」及びそれ以後の有効名リストに記載されたＳ．属の種について検索し、近縁種を選出した。Ｓ．スフヱロイデス（Ｓ．ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）の診断的性状を比較すると、本菌株とＳ．スフヱロイデスの性状はよく一致しており、炭素源の同化のみ異なっている。
従って、本菌株はＳ．スフヱロイデスに最も近似な新菌株である。しかしながら、バージェィズ マニュアル オブ システマティク バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’Ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．４）において、ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）等は、Ｓ．スフヱロイデスはＳ．アニュレイタスのシノニム（異名）としている。従って、本菌株３５３３−ＳＶ４株は、Ｓ．アニュレイタスに含まれる一菌株と同定し、ストレプトマイセス アニュレイタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｕｌａｔｕｓ）３５３３−ＳＶ４株と称する。
本菌株と近縁種との比較を以下に示す。
表３
ＧＭ−９５物質は、例えば上記３５３３−ＳＶ４株又は上記の菌学的性質を有する３５３３−ＳＶ４株の変異株などの、例えば、ストレプトマイセス属に属する各種のＧＭ−９５物質生産菌を、適当な培地で培養し、次に培養液から本発明物質を含む粗抽出物を分離し、更に、粗抽出物からＧＭ−９５物質を単離、精製することにより製造することができる。培養液には、培養濾液や菌体固形分が含まれる。
上記微生物の培養は、原則的に一般の微生物の培養に準じて行われるが、通常、液体培養による振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行うのが好ましい。培養に用いられる培地としては、ＧＭ−９５物質生産菌が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、天然培地等をいずれも用いることができる。培地の炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、コーン・スティープ・リカー、有機酸等を、単独又は二種以上組み合わせたものが；窒素源としては、ファーマメディア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を、単独又は二種以上組み合わせたものが用いられる。また、培地には、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、その他の重金属塩などが必要に応じて適宜添加される。
なお、培養中発泡の著しい時は、例えば大豆油、亜麻仁油等の植物油、オクタデカノール、テトラデカノール、ヘプタデカノール等の高級アルコール類、各種シリコン化合物などの消泡剤を、適宜培地中に添加することもできる。
培地のｐＨは、中性付近とするのが好ましい。培養温度はＧＭ−９５物質生産菌が良好に生育する温度、通常２０〜３２℃、特に２５〜３０℃付近に保つのがよい。培養時間は、液体振盪培養及び通気攪拌培養のいずれの場合も、２〜６日間程度が好ましい。
上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、またそれぞれに応じて、上記範囲から最適条件を適宜選択、調節することができる。
培養液からのＧＭ−９５物質を含む粗抽出物の分離は、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができ、例えば溶媒抽出、クロマトグラフィー、結晶化等の通常の手段を、単独又は二種以上を任意の順序に組み合わせて用いることができる。
より詳しくは、以下の方法を用いることができる。すなわち、上記培養により生産されるＧＭ−９５物質は、主として培養濾液及び菌体中に存在するので、常法に従い、まず培養液を濾過、遠心分離等を行って、培養濾液と菌体固形分とを分離し、得られたＧＭ−９５物質を含む菌体固形分について、メタノール、アセトン等の溶媒を用いてＧＭ−９５物質の溶出を行う。次いで、減圧下に溶媒を留去すれば、ＧＭ−９５物質を含む粗濃縮液を得ることができる。この粗濃縮液に、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール等の水と混合しない有機溶媒を加えて、ＧＭ−９５物質を有機溶媒層に転溶させ、得られた溶媒層に芒硝を加えて脱水した後、溶媒を減圧下で留去すれば、ＧＭ−９５物質を含む粗抽出物を得ることができる。更に、培養濾液についても有機溶媒層に転溶させる前述と同様の操作をすれば、粗抽出物を得ることができる。また、必要に応じて、水酸化ナトリウム又は塩酸にてｐＨを調節したり、工業用食塩を加えることにより、抽出効率を高くしたり、エマルジョン生成防止などの方法を講じることができる。
更に、粗抽出物からＧＭ−９５物質を単離、精製するためには、通常の脂溶性低分子物質の単離、精製手段、例えば、活性炭、シリカゲル、アルミナ、マクロポーラス非イオン系吸着樹脂等の吸着剤による種々の吸着クロマトグラフィー、又はＯＤＳ−結合型シリカゲル等を用いる逆相クロマトグラフィー等が使用できる。これらのうち、溶出溶媒にクロロホルム、クロロホルム／酢酸エチル、クロロホルム／メタノール、クロロホルム／アセトン、ベンゼン／アセトン等の混合溶媒系を用いるシリカゲルクロマトグラフィー、及びアセトニトリル又はメタノール／０．０５％トリフルオロ酢酸又は１０ｍＭリン酸一カリウム等の混合溶媒系を溶出に用いる逆相クロマトグラフィーが、特に好ましい。また、更に精製を必要とする場合には、上記クロマトグラフィーを繰り返し行うか、または溶出溶媒としてクロロホルム、メタノール等を用いたセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）によるカラムクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行うことにより、高純度のＧＭ−９５物質を得ることができる。
なお、精製工程中のＧＭ−９５物質の確認は、薄層クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを用いて検出する方法とを併用して行うのがよい。
また、公知の化学合成技術等を用いて、上記のＧＭ−９５物質からその他のテロメスタチン類（例えば、式（１）中のＲが、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−であって、前記Ｒ’が炭素数１〜５のアルキル基である化合物）を容易に得ることができる。
本発明で用いられるテロメスタチン類は、非常に強いテロメラーゼ阻害活性を有することが分かっており、該酵素の活性を阻害することにより広いスペクトルを有する抗腫瘍剤として有用である。例えば、ＧＭ−９５物質について、常法に準じてテロメラーゼを含む細胞抽出物を用いたテロメラーゼ阻害活性試験を行い、細胞抽出物中のテロメラーゼ活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を求めたところ、ＩＣ５０は５０ｎＭであった。テロメラーゼは正常体細胞にはほとんど存在せず、広範な悪性腫瘍に存在する（皮膚、乳房、肺、胃、膵臓、卵巣、頸部、子宮、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、中枢神経系（ＣＮＳ）、網膜及び血液腫瘍細胞系を含めた全ての悪性腫瘍のうち８５％以上でテロメラーゼが見出されている。）。
本発明者らの研究によれば、テロメスタチン類と他の抗腫瘍性物質とを併用することにより、それぞれ単独で用いた場合よりも抗腫瘍活性が顕著に向上することが見出された。すなわち、式（１）のテロメスタチン類は他の抗腫瘍性物質とを併用して、その抗腫瘍効果を相乗的に増強するための化合物として有用である。
テロメスタチン類を含有する本発明の抗腫瘍効果増強剤は、他の抗腫瘍性物質を投与する前又は後に、或いは同時に投与することができる。それらを同時に投与する場合には、例えば、本発明の抗腫瘍効果増強剤に、さらに、他の抗腫瘍性物質を含ませて混合製剤の形態としてもよい。
また、式（１）のテロメスタチン類と他の抗腫瘍製物質とを併用した抗腫瘍用組み合わせ製剤又は抗腫瘍剤等の併用剤として用いてもよい。
ここで、本明細書において「併用剤」とは、式（１）のテロメスタチン類と他の抗腫瘍性物質とを含む均一混合物とする形態だけでなく、式（１）のテロメスタチン類と他の抗腫瘍性物質とを、同時に、別々に、又は順次投与（使用・服用）するためにそれぞれ独立した別個の製剤を組み合わせた形態も含む意味である。したがって、本発明の抗腫瘍用組み合わせ製剤及び抗腫瘍剤は、テロメスタチン類と他の抗腫瘍性物質との均一混合製剤の形態であってもよいし、それらを別個に投与するためにそれぞれ独立に別個の製剤に調製したものを組み合わせた組み合わせ製剤の形態のいずれであってもよい。
本発明で用いることのできる他の抗腫瘍性物質としては特に限定されるものではなく、一般に抗腫瘍活性を有する物質であればいずれのものでも用いることができる。抗腫瘍性物質はその化学構造、作用機序又は由来等により様々なタイプのものに分類され、大別すると、アルキル化剤系化合物、代謝拮抗剤系化合物、植物アルカロイド系化合物、抗癌抗生物質系化合物、白金錯体系化合物、ホルモン剤等及び前記以外以外のタイプの抗腫瘍性化合物に分類される。具体的には下記に示すような化合物及びその塩（塩酸塩、硫酸塩等の酸付加塩、アルカリ金属塩等の金属塩）が挙げられる。
アルキル化剤系抗腫瘍化合物としては、例えば、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）及びカルボコン（Ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）等が挙げられる。
代謝拮抗剤系抗腫瘍化合物としては、葉酸代謝拮抗剤、プリン代謝拮抗剤、ピリミジン代謝拮抗剤等が挙げられ、具体的には、例えば６−メルカプトプリン（６−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、５−フルオロウラシル（５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール（Ｔｅｇａｆｕｒ）、エノシタビン（Ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）及びシタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）等が挙げられる。
微小管阻害薬系抗腫瘍化合物としては、ビンカアルカロイド系、ポドフィリン系、タキサン系等が挙げられ、より具体的には、例えばビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）及びビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）等が挙げられる。
抗生物質系抗腫瘍化合物としては、例えば、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（Ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、アクラルビシン（Ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン（Ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）及びエピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）等が挙げられる。
白金錯体系抗腫瘍化合物としては、例えば、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）及びネダプラチン等が挙げられる。
トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、イリノテカン、ノギテカン、エトポシド及びダウノルビシン等が挙げられる。
上記以外の抗腫瘍性物質として、例えば、ニムスチン（Ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ホルモン剤、、生物製剤、分子標的治療剤、マスタード薬、ニトロソウレア系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、インターフェロン及びインターロイキン等が挙げられる。
本発明では、式（１）の化合物と併用する抗腫瘍性物質としては、白金錯体系抗腫瘍化合物、トポイソメラーゼ阻害剤又は抗生物質系抗腫瘍化合物が好ましく、アントラサイクリン系抗腫瘍化合物、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬又は白金錯体系抗腫瘍化合物が特に好ましい。式（１）の化合物と他の抗腫瘍性物質との重量比については、併用する抗腫瘍性物質の種類や患者の症状にもよるが、通常は１：１〜１：１００であり、好ましくは、１：１〜１：１０である。
抗腫瘍効果増強剤、抗腫瘍用組み合わせ製剤又は抗腫瘍剤等の本発明の製剤を使用する際の薬学的投与形態としては、目的に応じて各種の薬学的投与形態を採用でき、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、液剤、丸剤、乳剤、懸濁剤等の経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、硬膏剤、貼付剤、エアゾール剤、点眼剤等の非経口剤のいずれでもよく、これら投与形態は、それぞれ当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。
経口用固形製剤を調製する場合には、有効成分（即ち、テロメスタチン類及び／又は前記他の抗腫瘍性物質）に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤等を製造することができる。賦形剤としては、例えば乳糖、蔗糖、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、シェラック、白糖等が、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が使用できる。その他、着色剤、矯臭剤等は通常公知のものを用いることができる。なお、錠剤は、必要に応じ周知の方法により通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、その他、二重錠、多層錠とすることができる。
経口用液体製剤を調製する場合は、有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合、矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が使用できる。
注射剤を調製する場合には、有効成分に、希釈剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により静脈内、筋肉内、皮下、皮内並びに腹腔内用注射剤を製造できる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。ｐＨ調製剤及び緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸等が使用できる。等張化剤としては塩化ナトリウム、ブドウ糖等が、局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が使用できる。
坐剤を調製する場合には、有効成分に基剤、さらに必要に応じて界面活性剤等を加えた後、常法により坐剤を製造することができる。基剤としては、例えばマクロゴール、ラノリン、カカオ油、脂肪酸トリグリセライド、ウィテップゾール（ダイナマイト ノーベルズ社製）等の油性基剤を用いることができる。
軟膏剤を調製する場合は、有効成分に通常使用される基剤、安定化剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が、保存剤としてはパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が使用できる。
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に有効成分と前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが使用できる。
更に、上記各製剤には、必要に応じて、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有せしめてもよい。
本発明の製剤に含有されるべき有効成分（即ち、テロメスタチン類及び／又は前記他の抗腫瘍性物質）の量は、特に限定されず広範囲より適宜選択されるが、通常それらの製剤中１〜７０重量％とするのがよい。
かくして得られる本発明の製剤の投与方法は、特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度等に応じて適宜決定される。例えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与などにより投与され得る。これは必要に応じてブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与することもできる。錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの固剤形態や経口投与用液剤形態の本発明の抗腫瘍剤は、経口投与又は経腸投与され得る。坐剤は直腸内投与できる。
上記の各投与単位形態中に配合されるべき有効成分の量は、これを適用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により適宜設定できるが、一般に投与単位形態あたり経口剤では約１〜１０００ｍｇ、注射剤では約０．１〜５００ｍｇ、坐剤では約５〜１０００ｍｇとするのが望ましい。
また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別、その他の条件等に応じて適宜選択されるが、通常成人１日あたり約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１〜１００ｍｇ／ｋｇとすれば良く、これを１日１回又は２〜４回程度に分けて投与することができる。
本発明の製剤を投与することにより治療できる腫瘍としては、特に制限はなく、例えば、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍等の固形の悪性腫瘍、悪性リンパ腫、白血病などが挙げられ、好ましくは固形の悪性腫瘍である。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００３−０５７６３２号の明細書に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＧＭ−９５物質の紫外吸収スペクトルである。
図２は、ＧＭ−９５物質の赤外線吸収スペクトルである。
図３は、ＧＭ−９５物質の５００ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
図４は、ＧＭ−９５物質の１２５ＭＨｚ１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
図５は、実施例３で測定したＭＣＦ−７細胞とＨＴ−２９細胞の増殖曲線（ＰＤＬ）である。
図６は、ＭＣＦ−７細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で４８時間培養したときの生存細胞数をＭＴＴ法により測定した結果を示すグラフである。
図７は、ＭＣＦ−７細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で７２時間培養したときの生存細胞数をＭＴＴ法により測定した結果を示すグラフである。
図８は、ＨＴ−２９細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド、シスプラチン、カンプトテシン又はアドリアマイシンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数をＭＴＴ法により測定した結果を示すグラフである。
図９は、ＳＫＯＶ−３細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１０は、ＳＫＯＶ−３細胞をＧＭ−９５物質とカンプトテシン又はアドリアマイシンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１１は、ＳＫＯＶ−３細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で４８時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１２は、ＳＫＯＶ−３細胞をＧＭ−９５物質とカンプトテシン又はアドリアマイシンとの存在下で４８時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１３は、ＨＴ１０８０細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１４は、ＨＴ１０８０細胞をＧＭ−９５物質とアドリアマイシンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１５は、ＧＭ−９５物質とイマニチブとの併用によるＫ５６２細胞に対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図１６は、ＧＭ−９５物質とダウノルビシン（ＤＮＲ）との併用によるＫ５６２細胞に対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図１７は、ＧＭ−９５物質とミトキサントロン（ＭＩＴ）との併用によるＫ５６２細胞に対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図１８は、ＧＭ−９５物質とビンクリスチン（ＶＣＲ）との併用によるＫ５６２細胞に対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図１９は、実施例５（Ａ）の結果を示すグラフである。
図２０は、実施例５（Ｂ）の結果を示すグラフである。
図２１は、実施例５（Ｃ）の結果を示すグラフである。
図２２は、実施例６（Ｄ）の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＧＭ−９５物質の製造
（ａ）培養工程
試験管（５０ｍｌ）に、可溶性澱粉１．０％、ポリペプトン１．０％、糖蜜１．０％、１．０％牛肉エキスよりなる培地（ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）（ｐＨ７．２）１５ｍｌを加え、滅菌後、ストレプトマイセス アニュレイタス３５３３−ＳＶ４菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４６０）を一白金耳量接種し、レシプロカルシェーカー上にて２７℃で２日間振盪培養した。
次に、グリセリン２．０％、糖蜜１．０％、カゼイン０．５％、ポリペプトン０．１％、炭酸カルシウム０．４％よりなる培地（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（ｐＨ７．２）を、５００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌずつ分注し、滅菌後（１２１℃、１５分）、上記種菌を２％（ｖ／ｖ）の割合で添加し、２７℃、３日間、回転振盪培養した（毎分２２０回、振幅７ｃｍ）。
次に、上記培地を３個の５０Ｌ用ジャーファーメンター（株式会社丸菱理化学装置研究所）に、それぞれ３０，０００ｍｌずつ分注した。消泡剤（ディスホーム（ＣＣ−１１８、日本油脂株式会社）１５ｍｌ、信越シリコーン（ＫＭ−６８−２Ｆ、信越化学工業株式会社）１５ｍｌ及びサラダオイル（味の素株式会社）１５ｍｌ）を加え、滅菌後（１２０℃、２０分）、上記種菌を２％（ｖ／ｖ）の割合で添加し、２７℃、３日間培養した（通気攪拌：４００ｒｐｍ（攪拌）、３０Ｌ／ｍｉｎ（通気））。
（ｂ）分離工程
上記手順により得られた培養液８４．０Ｌを採取し、培養菌体を遠心分離により分離した。上澄は捨て、培養菌体をアセトン１０．０Ｌで時々攪拌しながら２時間抽出する。抽出物を濾過し、再度アセトン５．０Ｌで抽出を繰り返し分離する。アセトン抽出液を合わせ、最終容量２Ｌになるまで蒸留濃縮する。減圧下、アセトンと水が完全になくなるまで溶媒を留去する。得られた油状の残渣をメタノール４５０ｍｌに溶解し、濾過後、減圧下蒸発乾固する。
（ｃ）単離精製工程
得られた油状の残渣を、クロロホルム：メタノール（２０：１）（ｖ／ｖ）から成る混合溶媒４００ｍｌに溶解する。シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００（粒径７５〜１５０μｍ）、内径６ｃｍ×４５ｃｍ）にふし、最初と同じクロロホルム−メタノール混合溶媒５Ｌで溶出させた。活性物質を含むフラクションは、クロロホルム：メタノール（１０：１ｖ／ｖ）で溶出した。活性物質を含むフラクションを集め、減圧下、蒸発乾固させる。次に、粗精製物をシリカゲルカラム（粒径７５〜１５０μｍ、内径３．６ｃｍ×３０ｃｍ）にふし、クロロホルム：メタノール：２９％アンモニア水溶液（７００：１００：１ｖ／ｖ／ｖ）の混合溶媒にて溶出させた。
活性物質を含む溶出液を、分取し、蒸発乾固した。残渣を前記１０ｍｌの移動相に溶解し、更にＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳカラム（株式会社センシュー科学、内径２０ｍｍ×２５０ｍｍ）（移動相をアセトニトリル：トリフルオロ酢酸：水（７０：０．１：３０ｖ／ｖ／ｖ）、流速を１０．０ｍｌ／分、２５４ｎｍ（０．５ｍｍ ＵＶセルで検出））を用いての高速液体クロマトグラフィーにふした。１回あたり抽出液０．８ｍｌをインジェクションした。ＧＭ−９５物質を含むフラクションを分取し、減圧下蒸発乾固した。
残渣を１０％メタノール水溶液に懸濁し、更にＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳカラム（株式会社センシュー科学、内径１．０ｃｍ×３ｃｍ）にふした。１０％メタノール水溶液で洗浄させた後、７０％メタノール水溶液で溶出させた。得られた溶出液を減圧下留去し、ＧＭ−９５物質を３．２ｍｇ得た。
なお、ＧＭ−９５物質を含むフラクションの検出は、精製の各段階においてＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳカラム（株式会社センシュー科学，内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（移動相をアセトニトリル：トリフルオロ酢酸：水（７０：０．１：３０ｖ／ｖ／ｖ）、流速を１．０ｍｌ／分）を用いての高速液体クロマトグラフィーを用いて行った。
ＧＭ−９５物質の物理化学的性質は下記の通りである。
１）分子式：高分解能ファースト アトム ボンバードメント質量分析（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆａｓｔ ａｔｏｍｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｏｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で測定した時、測定値（Ｍ＋Ｈ）＋として、５８３．０７９０を示し、これと一致する分子式はＣ２６Ｈ１５Ｎ８０７Ｓである。
２）分子量：ファースト アトム ボンバードメント質量分析（ｆａｓｔ ａｔｏｍｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｏｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で測定すると、５８２．０７１２を示す。
３）融点：１３８〜１４３℃（分解）。
４）比旋光度：メタノール中、Ｃ＝０．１２９ｇ／１００ｍｌ（メタノール）の濃度で測定。
［α］Ｄ２０＝−９．３８°
［α］Ｄ２０＝−９．３８°
５）紫外吸収スペクトル：図１に示す。
測定は、メタノール中（７．３９μＭ溶液）で行った。２５９．５ｎｍで最大吸収を示し、その時の吸光度は０．２８８であった。モル吸光係数（ε）は３８９８２である。
６）赤外線吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）：図２に示す。
νｍａｘ（ｃｍ−１）：３４２１，３１４７，２９５８，２９２３，２８５４，１７３３，１６７０，１６５０，１５４４，１４９６，１４３８，１３９２，１３５１，１３１５，１２６７，１１９９，１１７４，１１１８，１０８７，１０５８，１０３３，９７５，９４３，９２９，９１４，８８３，７９８
７）溶剤に対する溶解性：水、アセトンに不溶。クロロホルム：メタノール＝１：１に溶解する。
８）物質の色：淡黄色粉末（ｗｈｉｔｅ ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ ｐｏｗｄｅｒｓ）
９）核磁気共鳴スペクトル 重クロロホルム：重メタノール＝１：１の溶液中、２５℃で測定した５００ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図３に示す）及び１２５ＭＨｚ１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図４に示す）の化学シフトを下記に示す。
表４
１０）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）における保持時間（Ｒｔ）
下記の分析条件により６．１分にピークが検出される。
カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、株式会社センシュー科学製）
移動相：アセトニトリル／トリフルオロ酢酸／水（７０：０．１：３０ Ｖ／Ｖ／Ｖ）
流 速：１ｍｌ／分
検 出：２５４ｎｍ
上記物理科学的データからＧＭ−９５物質の化学構造は以下の様であると同定された。
実施例２：薬理試験（ＧＭ−９５物質及び５−フルオロウラシルの抗腫瘍作用）
表５に記載の腫瘍細胞を、１０％牛退治血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、培養プレート（３８ｍｍ）に各々２×１０３個ずつ播種し、３７℃１５％ＣＯ２条件下炭酸ガス培養器にて一晩培養した。その後、１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて種々の濃度に希釈した被験薬（ＧＭ−９５物質及び５−フルオロウラシル）を加え、更に７２時間培養した。培養終了後、細胞を２５％グルタールアルデヒドで１５分間固定し、水で３回洗浄した。次に、２０％メタノール水溶液に希釈した０．０５％クリスタルバイオレットで細胞を染色後、水で３回洗浄し、乾燥させた。０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム／エタノール（１／１（ｖ／ｖ））１００μＬでクリスタルバイオレットを抽出し、５４０ｎｍの吸光度を自動分光器にて測定した。ＩＣ５０はコントロールの吸光度に対し５０％減じるのに必要な濃度と定義した。結果を下記に示す。
表５
本発明化合物はインビトロにおける各種腫瘍細胞の発育を阻止することができた。
実施例３：ＧＭ−９５物質（テロメスタチン：Ｔｅｌｏｍｅｓｔａｔｉｎ）と他の抗腫瘍性物質との併用効果
抗腫瘍性物質
ＧＭ−９５物質と併用する抗腫瘍性物質として、エトポシド（ＥＴＰ；ブリストルマイヤーズスクイブ社製）、シスプラチン（ｃＤＤＰ；ブリストルマイヤーズスクイブ社製）、アドリアマイシン（Ａｄｒｅａｍｙｃｉｎ、ＡＤＭ；ＳＩＧＭＡ社製）及びカンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ、ＣＴＰ；ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
腫瘍細胞
腫瘍細胞として、ＭＣＦ−７（乳癌、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、ＳＫＯＶ−３（卵巣癌）、ＨＴ−２９（大腸癌）及びＨＴ１０８０（ザルコーマ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０１２）細胞を使用した。各細胞は東京大学分子細胞生物学研究所鶴尾研究室より分譲して戴いた。ＭＣＦ−７細胞についてはＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）培地に１０％ＦＣＳ、２０００００Ｕ／Ｌペニシリン、及び１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを添加した培地にて培養した。ＳＫＯＶ−３、ＨＴ１０８０及びＨＴ−２９細胞については、ＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ社製）培地に１０％ＦＣＳ、２０００００Ｕ／Ｌペニシリン、及び１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを添加した培地にて培養した。
ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質との存在下での腫瘍細胞の長期培養
上記細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製し、１２穴プレート又は６穴プレート（各ＳＵＭＩＴＯＭＯベークライト社製）にそれぞれ、５００μＬ及び１ｍＬずつ添加した。各細胞を、終濃度が２．０μＭ、１．０μＭ及び０．５μＭとなるようにＧＭ−９５物質を添加し、コンフルエントになるまで培養した。植え継ぎ時に各処理群の細胞数を計測し、増殖曲線（ＰＤＬ）を作製した（図５）。それぞれの細胞によってＧＭ−９５物質に対する感受性が異なるため、各週毎に細胞を回収し、それぞれの細胞について、テロメア長の測定及び各抗腫瘍性物質との併用効果を検討した。併用効果については、処理細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製した後、９６穴プレート（ＳＵＭＩＴＯＭＯベークライト社製）に１００μＬずつ分注し、１２〜１５時間インキュベートした後、ＧＭ−９５物質と上記各抗腫瘍性物質とを併用した抗腫瘍製剤を添加し２４時間毎に経時変化を追った。各時間ごとに生存細胞を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロミド）法により定量した。ＭＴＴ法は、次の通り行った。ＭＴＴ（ＳＩＧＭＡ社製）をＰＢＳで５ｇ／１００ｍＬとなるように調製し、各ウェルに１０μＬずつ添加し、産生されるホルマザンを検鏡にて観察しながら、十分にホルマザンが産生された時点で培地を吸引した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、撹拌後比色定量した。比色定量は、ＡＲＶＯ ＳＸ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、５７０ｎｍの吸光度を測定することで行った。ＧＭ−９５物質と上記各抗腫瘍性物質との併用効果の結果について図６〜１４に示した。なお、図中、「ＴＭＳ」はＧＭ−９５物質（テロメスタチン）を意味し、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照を意味する。
実施例４：ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質との併用によるＫ５６２細胞のアポトーシス誘導
Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手可能）をテロメスタチン（ＧＭ−９５物質；Ｔｅｌｏｍｅｓｔａｔｉｎ）２μＭの存在下で１０日間培養し、次いでそのテロメスタチン処理したＫ５６２細胞を各種の濃度のイマニチブ（Ｉｍａｎｉｔｉｂ）、ダウノルビシン（ＤＮＲ）、ミトキサントロン（ＭＩＴ）又はビンクリスチン（ＶＣＲ）とともに７２時間インキュベートした。アポトーシスの発現はＦＩＴＣコンジュゲートＡＰＯ２．７モノクローナル抗体（ミトコンドリア膜タンパク質（７Ａ６抗原）に対して産生され、アポトーシスが起こっている細胞で発現される）を用いるフローサイトメトリー分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）により測定した。その結果を図１５〜１８に示す。なお、図中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」、「ＴＭＳ」、「Ｉｍａｎｉｔｉｂ」、「ＤＮＲ」、「ＭＩＴ」及び「ＶＣＲ」は、それぞれ、対照、ＧＭ−９５物質（テロメスタチン）、イマニチブ、ダウノルビシン、ミトキサントロン及びビンクリスチンを意味する。
イマニチブ、ダウノルビシン、ミトキサントロン及びビンクリスチンはそれぞれ作用機序が異なる抗腫瘍性物質であるが、図１５〜１８の結果から明らかなように、テロメスタチン類は各種の抗腫瘍性物質と併用することによりそれらが相乗的に作用して腫瘍細胞のアポトーシス誘導効果が顕著に向上することが分かる。
実施例５：ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質との併用効果（ＨＴ１０８０細胞）
実施例３に準じて、ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍物質とを用いて以下の条件下で腫瘍細胞を培養し、一定期間経過後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
抗腫瘍性物質
ＧＭ−９５物質と併用する抗腫瘍性物質として、
塩酸ドキソルビシン（ＤＤＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０４０−２１５２１）；
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０６４−０１４０３）；
ｃｉｓ−ジアンミン−ジクロロ白金（ＩＩＩ）（ＣＴＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０４７−２２５１１）；
リン酸エトポシド（ＥＴＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０５８−０６３４１）；
を用いた。
腫瘍細胞
腫瘍細胞としてＨＴ１０８０細胞を用いた。なお以下の実験では、腫瘍細胞はＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ，Ｒ８７５８）に１０％ＦＢＳを添加した培地にて、ＣＯ２インキュベーター（温度３７℃、湿度１００％、二酸化炭素濃度５％）により培養した。
実験方法
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の条件でＨＴ１０８０細胞を培養し、培養終了後にＭＴＴ法により腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ａ）：０．５μＭのＧＭ−９５物質と所定濃度の上記抗腫瘍性物質とを同時に添加して腫瘍細胞を２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ｂ）：予め０．５μＭ又は１μＭのＧＭ−９５物質とともに腫瘍細胞を７日間培養し、次いでＧＭ−９５物質の非存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ｃ）：予め０．５μＭ又は１μＭのＧＭ−９５物質とともに腫瘍細胞を７日間又は１４日間培養し、次いでＧＭ−９５物質の存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した（なお、１μＭのＧＭ−９５物質で１４日間培養した細胞群は、生存細胞数が少ないため測定できなかった）。
結果
上記（Ａ）〜（Ｃ）での結果を、図１９〜図２１にそれぞれ示す。図１９〜図２１に示されるように、ＧＭ−９５物質と抗腫瘍性物質との併用（同時併用及び逐次的な併用のいずれにおいても）により抗腫瘍作用が増強されることが分かる。特に、（Ｂ）及び（Ｃ）の場合のように予めＧＭ−９５物質（０．５μＭ又は１μＭ）で７日間又は１４日間処理した場合では、ＧＭ−９５物質の存在下及び非存在下のいずれにおいても各種抗腫瘍性物質との併用効果が顕著であり、また、併用する抗腫瘍性物質が極低濃度であっても優れた併用効果を示した（図２０及び図２１）。なお、図１９〜図２１において、○は上記抗腫瘍性物質を単独で使用した場合の結果である。
実施例６：ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質との併用効果（ＭＣＦ−７細胞）
実施例５と同様にして、ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍物質とを用いて以下の条件下で腫瘍細胞を培養し、一定期間経過後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
抗腫瘍性物質
ＧＭ−９５物質と併用する抗腫瘍性物質として、
塩酸ドキソルビシン（ＤＤＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０４０−２１５２１）；
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０６４−０１４０３）；
ｃｉｓ−ジアンミン−ジクロロ白金（ＩＩＩ）（ＣＴＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０４７−２２５１１）；
リン酸エトポシド（ＥＴＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０５８−０６３４１）；
を用いた。
腫瘍細胞
腫瘍細胞としてＭＣＦ−７細胞を用いた。なお以下の実験では、腫瘍細胞はＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ，Ｄ６０４６）に１０％ＦＢＳを添加した培地にて、ＣＯ２インキュベーター（温度３７℃、湿度１００％、二酸化炭素濃度５％）により培養した。
実験方法
以下の（Ｄ）又は（Ｅ）の条件でＭＣＦ−７細胞を培養し、培養終了後にＭＴＴ法により腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ｄ）：予め１μＭ又は２μＭのＧＭ−９５物質とともに腫瘍細胞を７日間培養し、次いでＧＭ−９５物質の非存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ｅ）：予め１μＭ又は２μＭのＧＭ−９５物質とともに腫瘍細胞を１４日間培養し、次いでＧＭ−９５物質の非存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
結果
上記（Ｄ）及び（Ｅ）での結果を、図２２にそれぞれ示す。図２２に示されるように、ＭＣＦ−７細胞の場合においても、予めＧＭ−９５物質（１μＭ又は２μＭ）で７日間又は１４日間処理し、次いでＧＭ−９５物質の存在下／非存在下で上記抗腫瘍性物質と併用すると、抗腫瘍作用が増強されることが示された。なお、図２２において、○は上記抗腫瘍性物質を単独で使用した場合の結果である。
製剤例１：注射剤
下記の配合割合で常法により注射剤を調製することができる。
ＧＭ−９５物質 ５ｍｇ
シスプラチン ５ｍｇ
注射用蒸留水 ５ｍｌ
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
ＧＭ−９５（テロメスタチン）を用いる本発明の組み合わせ製剤は、特に抗腫瘍剤として有用である。
本発明の抗腫瘍効果増強剤、抗腫瘍用組み合わせ製剤又は抗腫瘍剤は、ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質とを併用することにより、該抗腫瘍性物質の抗腫瘍性効果が増強されて、又は抗腫瘍効果が相乗的に作用してそれぞれ単独で用いた場合と比較して顕著な抗腫瘍活性を示す。また、低用量で投与することが可能となるため安全性にも優れている。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【技術分野】
本発明は、２種以上の抗腫瘍作用を有する化合物を組み合わせて使用（併用）する抗腫瘍製剤に関する。より詳細には、複数個のオキサゾール環を有する抗腫瘍性化合物と他の抗腫瘍性物質とを併用した抗腫瘍製剤に関する。
【背景技術】
腫瘍細胞（癌細胞）は通常細胞より増殖速度が大きく、腫瘍細胞の死滅効果が増殖速度と同等又はそれ以下では癌の進行を抑える程度であり、癌の根本的な治療とはなりえない。また、各抗腫瘍剤には最適投与量があり、該投与量より多量の抗腫瘍剤を投与しても、それに比例して腫瘍細胞の死滅効果が上昇するというわけではなく、通常は僅かに上昇するに過ぎない。しかも多量投与による正常細胞の損傷等の悪影響の方が強く現れることが多く、１種類の抗腫瘍剤の多量投与による治療効果の増大は殆ど望めない。
このようなことから、抗腫瘍効果の向上及び副作用の軽減のため、或いは、腫瘍細胞が薬剤に対する耐性を獲得することを防止するために２種以上を組み合せた多剤併用療法が行なわれることが多い。
近年、新たな癌分子標的の一つとしてテロメラーゼが注目されている。テロメラーゼは、正常細胞では一部の組織を除き発現していないが、癌細胞では実に９０％以上にもおよぶ細胞において高頻度に再発現している。テロメア長は細胞の老化と密接に関係しており、癌細胞をテロメラーゼ阻害剤で処理することにより人工的に細胞老化を引き起こすことが期待される。一方、現在臨床で使用されている薬剤の４０％が、微生物代謝産物をはじめとする天然由来の化合物であり、今でも薬剤開発のソースとして広く用いられている。
以前に、本発明者らは、土壌分離放線菌（ストレプトマイセス属に属する３５３３−ＳＶ４株）が複数個のオキサゾール環を有する抗腫瘍性化合物（以下、「ＧＭ−９５物質」とも呼ぶ。）を産生することを見出し、その詳細について既に報告した（例えば、国際公開第００／２４７４７号パンフレット）。ＧＭ−９５物質は、現在報告されているテロメラーゼ阻害剤のうち、合成化合物も含め最も強力なものであった。ＧＭ−９５物質の数種の癌細胞に対する作用を検討した結果、テロメアの短縮を伴う細胞老化を誘導した。またこれらの老化細胞は、造腫瘍性が消失していたことから、抗腫瘍剤としての可能性が示唆された。
しかしながら、ＧＭ−９５物質等のテロメラーゼ阻害物質と他の抗腫瘍性物質とを併用した抗腫瘍医薬及びその併用効果については何ら知られていない。
【特許文献１】国際公開第００／２４７４７号パンフレット
【発明の開示】
本発明は、２種以上の抗腫瘍性物質を併用することにより抗腫瘍作用を相乗的に高めること、及びそのような抗腫瘍作用が相乗的に高められた抗腫瘍併用剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＧＭ−９５物質又はその誘導体と他の抗腫瘍物質とを併用すると、それぞれ単独で用いた場合と比較して顕著に抗腫瘍活性が高くなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗腫瘍効果増強剤。
（２）前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである前記（１）記載の抗腫瘍効果増強剤。
（３）前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである前記（１）記載の抗腫瘍効果増強剤。
（４）頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための前記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
（５）下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用する、前記式（１）の化合物と前記他の抗腫瘍性物質とを同時に、別々に又は順次投与するための抗腫瘍用組み合わせ製剤。
（６）前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである前記（５）記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
（７）前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである前記（５）記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
（８）頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための前記（５）〜（７）のいずれかに記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
（９）下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用する抗腫瘍剤。
（１０）前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである前記（９）記載の抗腫瘍剤。
（１１）前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである前記（９）記載の抗腫瘍剤。
（１２）頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
（１３）下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用するテロメラーゼ阻害剤。
本発明で用いられる化合物は下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）
で表される化合物である。
本明細書において炭素数１〜５のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基及びイソブチル基等の低級アルキルをいう。
置換基Ｒについてより具体的には以下のものが例示される。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル基等が挙げられる。ヘテロアリール基としては、イミダゾリル基、ピリジニル基等の含窒素芳香環基、チオフェン、チアゾール等の含硫黄芳香環基、フラン、オキサゾール等の含酸素芳香環基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
また、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩等の有機酸塩等の酸付加塩が挙げられる。
以下、本明細書において式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩を「テロメスタチン類」と呼ぶこともある。
上記式（１）において各Ｒが全て水素原子である化合物を「ＧＭ−９５物質」又は「テロメスタチン（ＴＭＳ）」と呼ぶ。ＧＭ−９５物質の物理化学的性質を以下に示す。
１）分子式：高分解能ファースト アトム ボンバードメント質量分析（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆａｓｔ ａｔｏｍｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｏｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で測定した時、測定値（Ｍ＋Ｈ）＋として、５８３．０７９０を示し、これと一致する分子式はＣ２６Ｈ１５Ｎ８０７Ｓである。
２）分子量：ファースト アトム ボンバードメント質量分析（ｆａｓｔ ａｔｏｍｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｏｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で測定すると、５８２．０７１２を示す。
３）融点：１３８〜１４３℃（分解）。
４）比旋光度：メタノール中、Ｃ＝０．１２９ｇ／１００ｍｌ（メタノール）の濃度で測定。
［α］Ｄ２０＝−９．３８°
５）紫外吸収スペクトル：図１に示す。
測定は、メタノール中（７．３９μＭ溶液）で行った。２５９．５ｎｍで最大吸収を示し、その時の吸光度は０．２８８であった。モル吸光係数（ε）は３８９８２である。
６）赤外線吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）：図２に示す。
νｍａｘ（ｃｍ−１）：３４２１，３１４７，２９５８，２９２３，２８５４，１７３３，１６７０，１６５０，１５４４，１４９６，１４３８，１３９２，１３５１，１３１５，１２６７，１１９９，１１７４，１１１８，１０８７，１０５８，１０３３，９７５，９４３，９２９，９１４，８８３，７９８
７）溶剤に対する溶解性：水、アセトンに不溶。クロロホルム：メタノール＝１：１に溶解する。
８）物質の色：淡黄色粉末（ｗｈｉｔｅ ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ ｐｏｗｄｅｒｓ）
９）核磁気共鳴スペクトル 重クロロホルム：重メタノール＝１：１の溶液中、２５℃で測定した５００ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図３に示す）及び１２５ＭＨｚ１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図４に示す）の化学シフトを下記に示す。
表１
１０）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）における保持時間（Ｒｔ）
下記の分析条件により６．１分にピークが検出される。
カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、株式会社センシュー科学製）
移動相：アセトニトリル／トリフルオロ酢酸／水（７０：０．１：３０Ｖ／Ｖ／Ｖ）
流 速：１ｍｌ／分
検 出：２５４ｎｍ
ＧＭ−９５物質は、例えば、本物質の生産能力を有する菌株（以下ＧＭ−９５物質生産菌と称する）を、以下に示すような適当な条件下で培養することによって製造することができる。
ＧＭ−９５物質生産菌としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株が挙げられる。ストレプトマイセス属に属する菌株の一例としては、ストレプトマイセス アニュレイタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｕｌａｔｕｓ）３５３３−ＳＶ４株又はその変異株が例示できる。ストレプトマイセス アニュレイタス３５３３−ＳＶ４株は、本発明者らが熊本県玉名郡天水町の土壌から新たに分離したストレプトマイセス属に属する菌株であり、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に住所を有する通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 経済産業省産業技術総合研究所 生命工学工業技術研究所 特許生物寄託センター）に、１９９８年８月１２日に、微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｕｌａｔｕｓ ３５３３−ＳＶ４（ＧＭ９５）」、（受託番号）「ＦＥＲＭ ＢＰ−６４６０」として寄託されている。
ストレプトマイセス アニュレイタス３５３３−ＳＶ４の同定及び菌学的性質は、ＩＳＰ（インターナショナル ストレプトマイセス プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）の方法に従って行った。ストレプトマイセス アニュレイタス３５３３−ＳＶ４株の菌学的性質は、次の通りである。
ａ）形態
本菌株は、ＩＳＰ Ｎｏ．２、３、４及び５培地で２７℃で１４日間培養した。結果は下記の通りである。
１）胞子形成の分枝法；単純分枝
２）胞子形成の形態；螺旋状、胞子形は筒状
３）胞子の数；１０〜５０又はそれ以上
４）胞子の表面構造；平滑
５）胞子の大きさ；０．３〜０．５×０．７〜１．０μｍ
６）鞭毛胞子の有無；無し
７）胞子嚢の有無；無し
８）胞子柄の着生位置；気菌糸
９）菌核形成性の有無；無し
ｂ）各種培地上における生育状態
各種培地における生育状態を表２に示す。表中に記載の培地性状に関する色調名は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカ（Ｃｏｎｔａｉｎｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の「ザ・カラー・ハーモニー・マニュアル」（Ｔｈｅ Ｃｏｌｏｒ Ｈａｒｍｏｎｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９５８年版）に基づいて示した。
表２
ｃ）生理的性質
１）生育温度範囲：２０〜３２℃最適温度；２０〜３０℃
２）ゼラチンの液化：＋
３）スターチの加水分解：＋
４）脱脂粉乳の凝固、ペプトン化：＋
５）メラニン様色素の生成
チロシン寒天培地：−
ペプトン・イースト鉄寒天培地：−
トリプトン・イースト・ブロス培地：＋
６）硝酸塩の還元：＋
７）炭素源の同化（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ Ｎｏ．９））
Ｌ−アラビノース＋；Ｄ−キシロース＋；Ｄ−グルコース＋；Ｄ−フラクトース＋；シュクロース＋；イノシトール＋；Ｌ−ラムノース＋；ラフィノース＋；Ｄ−マンニット＋
ｄ）菌体組成
日本放線菌学会編「放線菌の同定実験法−６−２−７０，１９８５年」に記載の薄層クロマトグラフィー法により全菌体の酸加水分解物を分析した結果，ＬＬ型のジアミノピメリン酸が検出された。
本菌株の基生薗糸は分断しない。気菌糸は長い主軸を形成し、それより不規則に分枝した先端に、１０〜５０個またはそれ以上からなる４〜９回転の螺旋状の胞子鎖を形成する。胞子は非運動性で、円柱形あるいは楕円形を呈し、幅０．３〜０．５、長さ０．７〜１．０μｍで、胞子表面は平滑である。菌核、胞子のう、その他の特殊形態は観察されない。細胞壁化学型は（Ｉ）型である。培養性状を表２に示す。気菌糸の色調は黄色系列である。基生菌糸の色調は不鮮明色を呈し、ｐＨで変化しない。拡散性色素は全体としては認められない。生理的性状を上記ｃ）に示す。本菌株は中温性である。本菌株の形態的性状と細胞壁化学型から、本菌株はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，以後、「Ｓ．」と略す。）属に位置する。
上述の諸性状を基に、「細菌名承認リスト、１９８０」及びそれ以後の有効名リストに記載されたＳ．属の種について検索し、近縁種を選出した。Ｓ．スフヱロイデス（Ｓ．ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）の診断的性状を比較すると、本菌株とＳ．スフヱロイデスの性状はよく一致しており、炭素源の同化のみ異なっている。
従って、本菌株はＳ．スフヱロイデスに最も近似な新菌株である。しかしながら、バージェィズ マニュアル オブ システマティク バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’Ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．４）において、ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）等は、Ｓ．スフヱロイデスはＳ．アニュレイタスのシノニム（異名）としている。従って、本菌株３５３３−ＳＶ４株は、Ｓ．アニュレイタスに含まれる一菌株と同定し、ストレプトマイセス アニュレイタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｕｌａｔｕｓ）３５３３−ＳＶ４株と称する。
本菌株と近縁種との比較を以下に示す。
表３
ＧＭ−９５物質は、例えば上記３５３３−ＳＶ４株又は上記の菌学的性質を有する３５３３−ＳＶ４株の変異株などの、例えば、ストレプトマイセス属に属する各種のＧＭ−９５物質生産菌を、適当な培地で培養し、次に培養液から本発明物質を含む粗抽出物を分離し、更に、粗抽出物からＧＭ−９５物質を単離、精製することにより製造することができる。培養液には、培養濾液や菌体固形分が含まれる。
上記微生物の培養は、原則的に一般の微生物の培養に準じて行われるが、通常、液体培養による振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行うのが好ましい。培養に用いられる培地としては、ＧＭ−９５物質生産菌が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、天然培地等をいずれも用いることができる。培地の炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、コーン・スティープ・リカー、有機酸等を、単独又は二種以上組み合わせたものが；窒素源としては、ファーマメディア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を、単独又は二種以上組み合わせたものが用いられる。また、培地には、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、その他の重金属塩などが必要に応じて適宜添加される。
なお、培養中発泡の著しい時は、例えば大豆油、亜麻仁油等の植物油、オクタデカノール、テトラデカノール、ヘプタデカノール等の高級アルコール類、各種シリコン化合物などの消泡剤を、適宜培地中に添加することもできる。
培地のｐＨは、中性付近とするのが好ましい。培養温度はＧＭ−９５物質生産菌が良好に生育する温度、通常２０〜３２℃、特に２５〜３０℃付近に保つのがよい。培養時間は、液体振盪培養及び通気攪拌培養のいずれの場合も、２〜６日間程度が好ましい。
上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、またそれぞれに応じて、上記範囲から最適条件を適宜選択、調節することができる。
培養液からのＧＭ−９５物質を含む粗抽出物の分離は、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができ、例えば溶媒抽出、クロマトグラフィー、結晶化等の通常の手段を、単独又は二種以上を任意の順序に組み合わせて用いることができる。
より詳しくは、以下の方法を用いることができる。すなわち、上記培養により生産されるＧＭ−９５物質は、主として培養濾液及び菌体中に存在するので、常法に従い、まず培養液を濾過、遠心分離等を行って、培養濾液と菌体固形分とを分離し、得られたＧＭ−９５物質を含む菌体固形分について、メタノール、アセトン等の溶媒を用いてＧＭ−９５物質の溶出を行う。次いで、減圧下に溶媒を留去すれば、ＧＭ−９５物質を含む粗濃縮液を得ることができる。この粗濃縮液に、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール等の水と混合しない有機溶媒を加えて、ＧＭ−９５物質を有機溶媒層に転溶させ、得られた溶媒層に芒硝を加えて脱水した後、溶媒を減圧下で留去すれば、ＧＭ−９５物質を含む粗抽出物を得ることができる。更に、培養濾液についても有機溶媒層に転溶させる前述と同様の操作をすれば、粗抽出物を得ることができる。また、必要に応じて、水酸化ナトリウム又は塩酸にてｐＨを調節したり、工業用食塩を加えることにより、抽出効率を高くしたり、エマルジョン生成防止などの方法を講じることができる。
更に、粗抽出物からＧＭ−９５物質を単離、精製するためには、通常の脂溶性低分子物質の単離、精製手段、例えば、活性炭、シリカゲル、アルミナ、マクロポーラス非イオン系吸着樹脂等の吸着剤による種々の吸着クロマトグラフィー、又はＯＤＳ−結合型シリカゲル等を用いる逆相クロマトグラフィー等が使用できる。これらのうち、溶出溶媒にクロロホルム、クロロホルム／酢酸エチル、クロロホルム／メタノール、クロロホルム／アセトン、ベンゼン／アセトン等の混合溶媒系を用いるシリカゲルクロマトグラフィー、及びアセトニトリル又はメタノール／０．０５％トリフルオロ酢酸又は１０ｍＭリン酸一カリウム等の混合溶媒系を溶出に用いる逆相クロマトグラフィーが、特に好ましい。また、更に精製を必要とする場合には、上記クロマトグラフィーを繰り返し行うか、または溶出溶媒としてクロロホルム、メタノール等を用いたセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）によるカラムクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行うことにより、高純度のＧＭ−９５物質を得ることができる。
なお、精製工程中のＧＭ−９５物質の確認は、薄層クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを用いて検出する方法とを併用して行うのがよい。
また、公知の化学合成技術等を用いて、上記のＧＭ−９５物質からその他のテロメスタチン類（例えば、式（１）中のＲが、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−であって、前記Ｒ’が炭素数１〜５のアルキル基である化合物）を容易に得ることができる。
本発明で用いられるテロメスタチン類は、非常に強いテロメラーゼ阻害活性を有することが分かっており、該酵素の活性を阻害することにより広いスペクトルを有する抗腫瘍剤として有用である。例えば、ＧＭ−９５物質について、常法に準じてテロメラーゼを含む細胞抽出物を用いたテロメラーゼ阻害活性試験を行い、細胞抽出物中のテロメラーゼ活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を求めたところ、ＩＣ５０は５０ｎＭであった。テロメラーゼは正常体細胞にはほとんど存在せず、広範な悪性腫瘍に存在する（皮膚、乳房、肺、胃、膵臓、卵巣、頸部、子宮、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、中枢神経系（ＣＮＳ）、網膜及び血液腫瘍細胞系を含めた全ての悪性腫瘍のうち８５％以上でテロメラーゼが見出されている。）。
本発明者らの研究によれば、テロメスタチン類と他の抗腫瘍性物質とを併用することにより、それぞれ単独で用いた場合よりも抗腫瘍活性が顕著に向上することが見出された。すなわち、式（１）のテロメスタチン類は他の抗腫瘍性物質とを併用して、その抗腫瘍効果を相乗的に増強するための化合物として有用である。
テロメスタチン類を含有する本発明の抗腫瘍効果増強剤は、他の抗腫瘍性物質を投与する前又は後に、或いは同時に投与することができる。それらを同時に投与する場合には、例えば、本発明の抗腫瘍効果増強剤に、さらに、他の抗腫瘍性物質を含ませて混合製剤の形態としてもよい。
また、式（１）のテロメスタチン類と他の抗腫瘍製物質とを併用した抗腫瘍用組み合わせ製剤又は抗腫瘍剤等の併用剤として用いてもよい。
ここで、本明細書において「併用剤」とは、式（１）のテロメスタチン類と他の抗腫瘍性物質とを含む均一混合物とする形態だけでなく、式（１）のテロメスタチン類と他の抗腫瘍性物質とを、同時に、別々に、又は順次投与（使用・服用）するためにそれぞれ独立した別個の製剤を組み合わせた形態も含む意味である。したがって、本発明の抗腫瘍用組み合わせ製剤及び抗腫瘍剤は、テロメスタチン類と他の抗腫瘍性物質との均一混合製剤の形態であってもよいし、それらを別個に投与するためにそれぞれ独立に別個の製剤に調製したものを組み合わせた組み合わせ製剤の形態のいずれであってもよい。
本発明で用いることのできる他の抗腫瘍性物質としては特に限定されるものではなく、一般に抗腫瘍活性を有する物質であればいずれのものでも用いることができる。抗腫瘍性物質はその化学構造、作用機序又は由来等により様々なタイプのものに分類され、大別すると、アルキル化剤系化合物、代謝拮抗剤系化合物、植物アルカロイド系化合物、抗癌抗生物質系化合物、白金錯体系化合物、ホルモン剤等及び前記以外以外のタイプの抗腫瘍性化合物に分類される。具体的には下記に示すような化合物及びその塩（塩酸塩、硫酸塩等の酸付加塩、アルカリ金属塩等の金属塩）が挙げられる。
アルキル化剤系抗腫瘍化合物としては、例えば、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）及びカルボコン（Ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）等が挙げられる。
代謝拮抗剤系抗腫瘍化合物としては、葉酸代謝拮抗剤、プリン代謝拮抗剤、ピリミジン代謝拮抗剤等が挙げられ、具体的には、例えば６−メルカプトプリン（６−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、５−フルオロウラシル（５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール（Ｔｅｇａｆｕｒ）、エノシタビン（Ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）及びシタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）等が挙げられる。
微小管阻害薬系抗腫瘍化合物としては、ビンカアルカロイド系、ポドフィリン系、タキサン系等が挙げられ、より具体的には、例えばビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）及びビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）等が挙げられる。
抗生物質系抗腫瘍化合物としては、例えば、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（Ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、アクラルビシン（Ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン（Ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）及びエピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）等が挙げられる。
白金錯体系抗腫瘍化合物としては、例えば、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）及びネダプラチン等が挙げられる。
トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、イリノテカン、ノギテカン、エトポシド及びダウノルビシン等が挙げられる。
上記以外の抗腫瘍性物質として、例えば、ニムスチン（Ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ホルモン剤、、生物製剤、分子標的治療剤、マスタード薬、ニトロソウレア系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、インターフェロン及びインターロイキン等が挙げられる。
本発明では、式（１）の化合物と併用する抗腫瘍性物質としては、白金錯体系抗腫瘍化合物、トポイソメラーゼ阻害剤又は抗生物質系抗腫瘍化合物が好ましく、アントラサイクリン系抗腫瘍化合物、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬又は白金錯体系抗腫瘍化合物が特に好ましい。式（１）の化合物と他の抗腫瘍性物質との重量比については、併用する抗腫瘍性物質の種類や患者の症状にもよるが、通常は１：１〜１：１００であり、好ましくは、１：１〜１：１０である。
抗腫瘍効果増強剤、抗腫瘍用組み合わせ製剤又は抗腫瘍剤等の本発明の製剤を使用する際の薬学的投与形態としては、目的に応じて各種の薬学的投与形態を採用でき、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、液剤、丸剤、乳剤、懸濁剤等の経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、硬膏剤、貼付剤、エアゾール剤、点眼剤等の非経口剤のいずれでもよく、これら投与形態は、それぞれ当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。
経口用固形製剤を調製する場合には、有効成分（即ち、テロメスタチン類及び／又は前記他の抗腫瘍性物質）に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤等を製造することができる。賦形剤としては、例えば乳糖、蔗糖、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、シェラック、白糖等が、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が使用できる。その他、着色剤、矯臭剤等は通常公知のものを用いることができる。なお、錠剤は、必要に応じ周知の方法により通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、その他、二重錠、多層錠とすることができる。
経口用液体製剤を調製する場合は、有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合、矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が使用できる。
注射剤を調製する場合には、有効成分に、希釈剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により静脈内、筋肉内、皮下、皮内並びに腹腔内用注射剤を製造できる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。ｐＨ調製剤及び緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸等が使用できる。等張化剤としては塩化ナトリウム、ブドウ糖等が、局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が使用できる。
坐剤を調製する場合には、有効成分に基剤、さらに必要に応じて界面活性剤等を加えた後、常法により坐剤を製造することができる。基剤としては、例えばマクロゴール、ラノリン、カカオ油、脂肪酸トリグリセライド、ウィテップゾール（ダイナマイト ノーベルズ社製）等の油性基剤を用いることができる。
軟膏剤を調製する場合は、有効成分に通常使用される基剤、安定化剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が、保存剤としてはパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が使用できる。
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に有効成分と前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが使用できる。
更に、上記各製剤には、必要に応じて、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有せしめてもよい。
本発明の製剤に含有されるべき有効成分（即ち、テロメスタチン類及び／又は前記他の抗腫瘍性物質）の量は、特に限定されず広範囲より適宜選択されるが、通常それらの製剤中１〜７０重量％とするのがよい。
かくして得られる本発明の製剤の投与方法は、特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度等に応じて適宜決定される。例えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与などにより投与され得る。これは必要に応じてブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与することもできる。錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの固剤形態や経口投与用液剤形態の本発明の抗腫瘍剤は、経口投与又は経腸投与され得る。坐剤は直腸内投与できる。
上記の各投与単位形態中に配合されるべき有効成分の量は、これを適用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により適宜設定できるが、一般に投与単位形態あたり経口剤では約１〜１０００ｍｇ、注射剤では約０．１〜５００ｍｇ、坐剤では約５〜１０００ｍｇとするのが望ましい。
また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別、その他の条件等に応じて適宜選択されるが、通常成人１日あたり約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１〜１００ｍｇ／ｋｇとすれば良く、これを１日１回又は２〜４回程度に分けて投与することができる。
本発明の製剤を投与することにより治療できる腫瘍としては、特に制限はなく、例えば、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍等の固形の悪性腫瘍、悪性リンパ腫、白血病などが挙げられ、好ましくは固形の悪性腫瘍である。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００３−０５７６３２号の明細書に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＧＭ−９５物質の紫外吸収スペクトルである。
図２は、ＧＭ−９５物質の赤外線吸収スペクトルである。
図３は、ＧＭ−９５物質の５００ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
図４は、ＧＭ−９５物質の１２５ＭＨｚ１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
図５は、実施例３で測定したＭＣＦ−７細胞とＨＴ−２９細胞の増殖曲線（ＰＤＬ）である。
図６は、ＭＣＦ−７細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で４８時間培養したときの生存細胞数をＭＴＴ法により測定した結果を示すグラフである。
図７は、ＭＣＦ−７細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で７２時間培養したときの生存細胞数をＭＴＴ法により測定した結果を示すグラフである。
図８は、ＨＴ−２９細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド、シスプラチン、カンプトテシン又はアドリアマイシンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数をＭＴＴ法により測定した結果を示すグラフである。
図９は、ＳＫＯＶ−３細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１０は、ＳＫＯＶ−３細胞をＧＭ−９５物質とカンプトテシン又はアドリアマイシンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１１は、ＳＫＯＶ−３細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で４８時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１２は、ＳＫＯＶ−３細胞をＧＭ−９５物質とカンプトテシン又はアドリアマイシンとの存在下で４８時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１３は、ＨＴ１０８０細胞をＧＭ−９５物質とエトポシド又はシスプラチンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１４は、ＨＴ１０８０細胞をＧＭ−９５物質とアドリアマイシンとの存在下で２４時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図１５は、ＧＭ−９５物質とイマニチブとの併用によるＫ５６２細胞に対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図１６は、ＧＭ−９５物質とダウノルビシン（ＤＮＲ）との併用によるＫ５６２細胞に対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図１７は、ＧＭ−９５物質とミトキサントロン（ＭＩＴ）との併用によるＫ５６２細胞に対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図１８は、ＧＭ−９５物質とビンクリスチン（ＶＣＲ）との併用によるＫ５６２細胞に対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図１９は、実施例５（Ａ）の結果を示すグラフである。
図２０は、実施例５（Ｂ）の結果を示すグラフである。
図２１は、実施例５（Ｃ）の結果を示すグラフである。
図２２は、実施例６（Ｄ）の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＧＭ−９５物質の製造
（ａ）培養工程
試験管（５０ｍｌ）に、可溶性澱粉１．０％、ポリペプトン１．０％、糖蜜１．０％、１．０％牛肉エキスよりなる培地（ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）（ｐＨ７．２）１５ｍｌを加え、滅菌後、ストレプトマイセス アニュレイタス３５３３−ＳＶ４菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４６０）を一白金耳量接種し、レシプロカルシェーカー上にて２７℃で２日間振盪培養した。
次に、グリセリン２．０％、糖蜜１．０％、カゼイン０．５％、ポリペプトン０．１％、炭酸カルシウム０．４％よりなる培地（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（ｐＨ７．２）を、５００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌずつ分注し、滅菌後（１２１℃、１５分）、上記種菌を２％（ｖ／ｖ）の割合で添加し、２７℃、３日間、回転振盪培養した（毎分２２０回、振幅７ｃｍ）。
次に、上記培地を３個の５０Ｌ用ジャーファーメンター（株式会社丸菱理化学装置研究所）に、それぞれ３０，０００ｍｌずつ分注した。消泡剤（ディスホーム（ＣＣ−１１８、日本油脂株式会社）１５ｍｌ、信越シリコーン（ＫＭ−６８−２Ｆ、信越化学工業株式会社）１５ｍｌ及びサラダオイル（味の素株式会社）１５ｍｌ）を加え、滅菌後（１２０℃、２０分）、上記種菌を２％（ｖ／ｖ）の割合で添加し、２７℃、３日間培養した（通気攪拌：４００ｒｐｍ（攪拌）、３０Ｌ／ｍｉｎ（通気））。
（ｂ）分離工程
上記手順により得られた培養液８４．０Ｌを採取し、培養菌体を遠心分離により分離した。上澄は捨て、培養菌体をアセトン１０．０Ｌで時々攪拌しながら２時間抽出する。抽出物を濾過し、再度アセトン５．０Ｌで抽出を繰り返し分離する。アセトン抽出液を合わせ、最終容量２Ｌになるまで蒸留濃縮する。減圧下、アセトンと水が完全になくなるまで溶媒を留去する。得られた油状の残渣をメタノール４５０ｍｌに溶解し、濾過後、減圧下蒸発乾固する。
（ｃ）単離精製工程
得られた油状の残渣を、クロロホルム：メタノール（２０：１）（ｖ／ｖ）から成る混合溶媒４００ｍｌに溶解する。シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００（粒径７５〜１５０μｍ）、内径６ｃｍ×４５ｃｍ）にふし、最初と同じクロロホルム−メタノール混合溶媒５Ｌで溶出させた。活性物質を含むフラクションは、クロロホルム：メタノール（１０：１ｖ／ｖ）で溶出した。活性物質を含むフラクションを集め、減圧下、蒸発乾固させる。次に、粗精製物をシリカゲルカラム（粒径７５〜１５０μｍ、内径３．６ｃｍ×３０ｃｍ）にふし、クロロホルム：メタノール：２９％アンモニア水溶液（７００：１００：１ｖ／ｖ／ｖ）の混合溶媒にて溶出させた。
活性物質を含む溶出液を、分取し、蒸発乾固した。残渣を前記１０ｍｌの移動相に溶解し、更にＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳカラム（株式会社センシュー科学、内径２０ｍｍ×２５０ｍｍ）（移動相をアセトニトリル：トリフルオロ酢酸：水（７０：０．１：３０ｖ／ｖ／ｖ）、流速を１０．０ｍｌ／分、２５４ｎｍ（０．５ｍｍ ＵＶセルで検出））を用いての高速液体クロマトグラフィーにふした。１回あたり抽出液０．８ｍｌをインジェクションした。ＧＭ−９５物質を含むフラクションを分取し、減圧下蒸発乾固した。
残渣を１０％メタノール水溶液に懸濁し、更にＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳカラム（株式会社センシュー科学、内径１．０ｃｍ×３ｃｍ）にふした。１０％メタノール水溶液で洗浄させた後、７０％メタノール水溶液で溶出させた。得られた溶出液を減圧下留去し、ＧＭ−９５物質を３．２ｍｇ得た。
なお、ＧＭ−９５物質を含むフラクションの検出は、精製の各段階においてＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳカラム（株式会社センシュー科学，内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（移動相をアセトニトリル：トリフルオロ酢酸：水（７０：０．１：３０ｖ／ｖ／ｖ）、流速を１．０ｍｌ／分）を用いての高速液体クロマトグラフィーを用いて行った。
ＧＭ−９５物質の物理化学的性質は下記の通りである。
１）分子式：高分解能ファースト アトム ボンバードメント質量分析（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆａｓｔ ａｔｏｍｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｏｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で測定した時、測定値（Ｍ＋Ｈ）＋として、５８３．０７９０を示し、これと一致する分子式はＣ２６Ｈ１５Ｎ８０７Ｓである。
２）分子量：ファースト アトム ボンバードメント質量分析（ｆａｓｔ ａｔｏｍｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｏｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で測定すると、５８２．０７１２を示す。
３）融点：１３８〜１４３℃（分解）。
４）比旋光度：メタノール中、Ｃ＝０．１２９ｇ／１００ｍｌ（メタノール）の濃度で測定。
［α］Ｄ２０＝−９．３８°
［α］Ｄ２０＝−９．３８°
５）紫外吸収スペクトル：図１に示す。
測定は、メタノール中（７．３９μＭ溶液）で行った。２５９．５ｎｍで最大吸収を示し、その時の吸光度は０．２８８であった。モル吸光係数（ε）は３８９８２である。
６）赤外線吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）：図２に示す。
νｍａｘ（ｃｍ−１）：３４２１，３１４７，２９５８，２９２３，２８５４，１７３３，１６７０，１６５０，１５４４，１４９６，１４３８，１３９２，１３５１，１３１５，１２６７，１１９９，１１７４，１１１８，１０８７，１０５８，１０３３，９７５，９４３，９２９，９１４，８８３，７９８
７）溶剤に対する溶解性：水、アセトンに不溶。クロロホルム：メタノール＝１：１に溶解する。
８）物質の色：淡黄色粉末（ｗｈｉｔｅ ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ ｐｏｗｄｅｒｓ）
９）核磁気共鳴スペクトル 重クロロホルム：重メタノール＝１：１の溶液中、２５℃で測定した５００ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図３に示す）及び１２５ＭＨｚ１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図４に示す）の化学シフトを下記に示す。
表４
１０）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）における保持時間（Ｒｔ）
下記の分析条件により６．１分にピークが検出される。
カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、株式会社センシュー科学製）
移動相：アセトニトリル／トリフルオロ酢酸／水（７０：０．１：３０ Ｖ／Ｖ／Ｖ）
流 速：１ｍｌ／分
検 出：２５４ｎｍ
上記物理科学的データからＧＭ−９５物質の化学構造は以下の様であると同定された。
実施例２：薬理試験（ＧＭ−９５物質及び５−フルオロウラシルの抗腫瘍作用）
表５に記載の腫瘍細胞を、１０％牛退治血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、培養プレート（３８ｍｍ）に各々２×１０３個ずつ播種し、３７℃１５％ＣＯ２条件下炭酸ガス培養器にて一晩培養した。その後、１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて種々の濃度に希釈した被験薬（ＧＭ−９５物質及び５−フルオロウラシル）を加え、更に７２時間培養した。培養終了後、細胞を２５％グルタールアルデヒドで１５分間固定し、水で３回洗浄した。次に、２０％メタノール水溶液に希釈した０．０５％クリスタルバイオレットで細胞を染色後、水で３回洗浄し、乾燥させた。０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム／エタノール（１／１（ｖ／ｖ））１００μＬでクリスタルバイオレットを抽出し、５４０ｎｍの吸光度を自動分光器にて測定した。ＩＣ５０はコントロールの吸光度に対し５０％減じるのに必要な濃度と定義した。結果を下記に示す。
表５
本発明化合物はインビトロにおける各種腫瘍細胞の発育を阻止することができた。
実施例３：ＧＭ−９５物質（テロメスタチン：Ｔｅｌｏｍｅｓｔａｔｉｎ）と他の抗腫瘍性物質との併用効果
抗腫瘍性物質
ＧＭ−９５物質と併用する抗腫瘍性物質として、エトポシド（ＥＴＰ；ブリストルマイヤーズスクイブ社製）、シスプラチン（ｃＤＤＰ；ブリストルマイヤーズスクイブ社製）、アドリアマイシン（Ａｄｒｅａｍｙｃｉｎ、ＡＤＭ；ＳＩＧＭＡ社製）及びカンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ、ＣＴＰ；ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
腫瘍細胞
腫瘍細胞として、ＭＣＦ−７（乳癌、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、ＳＫＯＶ−３（卵巣癌）、ＨＴ−２９（大腸癌）及びＨＴ１０８０（ザルコーマ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０１２）細胞を使用した。各細胞は東京大学分子細胞生物学研究所鶴尾研究室より分譲して戴いた。ＭＣＦ−７細胞についてはＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）培地に１０％ＦＣＳ、２０００００Ｕ／Ｌペニシリン、及び１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを添加した培地にて培養した。ＳＫＯＶ−３、ＨＴ１０８０及びＨＴ−２９細胞については、ＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ社製）培地に１０％ＦＣＳ、２０００００Ｕ／Ｌペニシリン、及び１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを添加した培地にて培養した。
ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質との存在下での腫瘍細胞の長期培養
上記細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製し、１２穴プレート又は６穴プレート（各ＳＵＭＩＴＯＭＯベークライト社製）にそれぞれ、５００μＬ及び１ｍＬずつ添加した。各細胞を、終濃度が２．０μＭ、１．０μＭ及び０．５μＭとなるようにＧＭ−９５物質を添加し、コンフルエントになるまで培養した。植え継ぎ時に各処理群の細胞数を計測し、増殖曲線（ＰＤＬ）を作製した（図５）。それぞれの細胞によってＧＭ−９５物質に対する感受性が異なるため、各週毎に細胞を回収し、それぞれの細胞について、テロメア長の測定及び各抗腫瘍性物質との併用効果を検討した。併用効果については、処理細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製した後、９６穴プレート（ＳＵＭＩＴＯＭＯベークライト社製）に１００μＬずつ分注し、１２〜１５時間インキュベートした後、ＧＭ−９５物質と上記各抗腫瘍性物質とを併用した抗腫瘍製剤を添加し２４時間毎に経時変化を追った。各時間ごとに生存細胞を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロミド）法により定量した。ＭＴＴ法は、次の通り行った。ＭＴＴ（ＳＩＧＭＡ社製）をＰＢＳで５ｇ／１００ｍＬとなるように調製し、各ウェルに１０μＬずつ添加し、産生されるホルマザンを検鏡にて観察しながら、十分にホルマザンが産生された時点で培地を吸引した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、撹拌後比色定量した。比色定量は、ＡＲＶＯ ＳＸ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、５７０ｎｍの吸光度を測定することで行った。ＧＭ−９５物質と上記各抗腫瘍性物質との併用効果の結果について図６〜１４に示した。なお、図中、「ＴＭＳ」はＧＭ−９５物質（テロメスタチン）を意味し、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照を意味する。
実施例４：ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質との併用によるＫ５６２細胞のアポトーシス誘導
Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手可能）をテロメスタチン（ＧＭ−９５物質；Ｔｅｌｏｍｅｓｔａｔｉｎ）２μＭの存在下で１０日間培養し、次いでそのテロメスタチン処理したＫ５６２細胞を各種の濃度のイマニチブ（Ｉｍａｎｉｔｉｂ）、ダウノルビシン（ＤＮＲ）、ミトキサントロン（ＭＩＴ）又はビンクリスチン（ＶＣＲ）とともに７２時間インキュベートした。アポトーシスの発現はＦＩＴＣコンジュゲートＡＰＯ２．７モノクローナル抗体（ミトコンドリア膜タンパク質（７Ａ６抗原）に対して産生され、アポトーシスが起こっている細胞で発現される）を用いるフローサイトメトリー分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）により測定した。その結果を図１５〜１８に示す。なお、図中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」、「ＴＭＳ」、「Ｉｍａｎｉｔｉｂ」、「ＤＮＲ」、「ＭＩＴ」及び「ＶＣＲ」は、それぞれ、対照、ＧＭ−９５物質（テロメスタチン）、イマニチブ、ダウノルビシン、ミトキサントロン及びビンクリスチンを意味する。
イマニチブ、ダウノルビシン、ミトキサントロン及びビンクリスチンはそれぞれ作用機序が異なる抗腫瘍性物質であるが、図１５〜１８の結果から明らかなように、テロメスタチン類は各種の抗腫瘍性物質と併用することによりそれらが相乗的に作用して腫瘍細胞のアポトーシス誘導効果が顕著に向上することが分かる。
実施例５：ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質との併用効果（ＨＴ１０８０細胞）
実施例３に準じて、ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍物質とを用いて以下の条件下で腫瘍細胞を培養し、一定期間経過後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
抗腫瘍性物質
ＧＭ−９５物質と併用する抗腫瘍性物質として、
塩酸ドキソルビシン（ＤＤＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０４０−２１５２１）；
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０６４−０１４０３）；
ｃｉｓ−ジアンミン−ジクロロ白金（ＩＩＩ）（ＣＴＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０４７−２２５１１）；
リン酸エトポシド（ＥＴＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０５８−０６３４１）；
を用いた。
腫瘍細胞
腫瘍細胞としてＨＴ１０８０細胞を用いた。なお以下の実験では、腫瘍細胞はＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ，Ｒ８７５８）に１０％ＦＢＳを添加した培地にて、ＣＯ２インキュベーター（温度３７℃、湿度１００％、二酸化炭素濃度５％）により培養した。
実験方法
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の条件でＨＴ１０８０細胞を培養し、培養終了後にＭＴＴ法により腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ａ）：０．５μＭのＧＭ−９５物質と所定濃度の上記抗腫瘍性物質とを同時に添加して腫瘍細胞を２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ｂ）：予め０．５μＭ又は１μＭのＧＭ−９５物質とともに腫瘍細胞を７日間培養し、次いでＧＭ−９５物質の非存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ｃ）：予め０．５μＭ又は１μＭのＧＭ−９５物質とともに腫瘍細胞を７日間又は１４日間培養し、次いでＧＭ−９５物質の存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した（なお、１μＭのＧＭ−９５物質で１４日間培養した細胞群は、生存細胞数が少ないため測定できなかった）。
結果
上記（Ａ）〜（Ｃ）での結果を、図１９〜図２１にそれぞれ示す。図１９〜図２１に示されるように、ＧＭ−９５物質と抗腫瘍性物質との併用（同時併用及び逐次的な併用のいずれにおいても）により抗腫瘍作用が増強されることが分かる。特に、（Ｂ）及び（Ｃ）の場合のように予めＧＭ−９５物質（０．５μＭ又は１μＭ）で７日間又は１４日間処理した場合では、ＧＭ−９５物質の存在下及び非存在下のいずれにおいても各種抗腫瘍性物質との併用効果が顕著であり、また、併用する抗腫瘍性物質が極低濃度であっても優れた併用効果を示した（図２０及び図２１）。なお、図１９〜図２１において、○は上記抗腫瘍性物質を単独で使用した場合の結果である。
実施例６：ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質との併用効果（ＭＣＦ−７細胞）
実施例５と同様にして、ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍物質とを用いて以下の条件下で腫瘍細胞を培養し、一定期間経過後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
抗腫瘍性物質
ＧＭ−９５物質と併用する抗腫瘍性物質として、
塩酸ドキソルビシン（ＤＤＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０４０−２１５２１）；
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０６４−０１４０３）；
ｃｉｓ−ジアンミン−ジクロロ白金（ＩＩＩ）（ＣＴＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０４７−２２５１１）；
リン酸エトポシド（ＥＴＰ）（和光純薬工業株式会社、Ｎｏ．０５８−０６３４１）；
を用いた。
腫瘍細胞
腫瘍細胞としてＭＣＦ−７細胞を用いた。なお以下の実験では、腫瘍細胞はＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ，Ｄ６０４６）に１０％ＦＢＳを添加した培地にて、ＣＯ２インキュベーター（温度３７℃、湿度１００％、二酸化炭素濃度５％）により培養した。
実験方法
以下の（Ｄ）又は（Ｅ）の条件でＭＣＦ−７細胞を培養し、培養終了後にＭＴＴ法により腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ｄ）：予め１μＭ又は２μＭのＧＭ−９５物質とともに腫瘍細胞を７日間培養し、次いでＧＭ−９５物質の非存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
（Ｅ）：予め１μＭ又は２μＭのＧＭ−９５物質とともに腫瘍細胞を１４日間培養し、次いでＧＭ−９５物質の非存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して２日間培養し、培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
結果
上記（Ｄ）及び（Ｅ）での結果を、図２２にそれぞれ示す。図２２に示されるように、ＭＣＦ−７細胞の場合においても、予めＧＭ−９５物質（１μＭ又は２μＭ）で７日間又は１４日間処理し、次いでＧＭ−９５物質の存在下／非存在下で上記抗腫瘍性物質と併用すると、抗腫瘍作用が増強されることが示された。なお、図２２において、○は上記抗腫瘍性物質を単独で使用した場合の結果である。
製剤例１：注射剤
下記の配合割合で常法により注射剤を調製することができる。
ＧＭ−９５物質 ５ｍｇ
シスプラチン ５ｍｇ
注射用蒸留水 ５ｍｌ
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
ＧＭ−９５（テロメスタチン）を用いる本発明の組み合わせ製剤は、特に抗腫瘍剤として有用である。
本発明の抗腫瘍効果増強剤、抗腫瘍用組み合わせ製剤又は抗腫瘍剤は、ＧＭ−９５物質と他の抗腫瘍性物質とを併用することにより、該抗腫瘍性物質の抗腫瘍性効果が増強されて、又は抗腫瘍効果が相乗的に作用してそれぞれ単独で用いた場合と比較して顕著な抗腫瘍活性を示す。また、低用量で投与することが可能となるため安全性にも優れている。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗腫瘍効果増強剤。
【請求項２】
前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである請求の範囲第１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項３】
前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである請求の範囲第１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項４】
頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項５】
下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用する、前記式（１）の化合物と前記他の抗腫瘍性物質とを同時に、別々に又は順次投与するための抗腫瘍用組み合わせ製剤。
【請求項６】
前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである請求の範囲第５項記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
【請求項７】
前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである請求の範囲第５項記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
【請求項８】
頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための請求の範囲第５項〜第７項のいずれか１項記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
【請求項９】
下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用する抗腫瘍剤。
【請求項１０】
前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである請求の範囲第９項記載の抗腫瘍剤。
【請求項１１】
前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである請求の範囲第９項記載の抗腫瘍剤。
【請求項１２】
頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための請求の範囲第９項〜第１１項のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
【請求項１３】
下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを含むテロメラーゼ阻害剤。
【請求項１】
下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗腫瘍効果増強剤。
【請求項２】
前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである請求の範囲第１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項３】
前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである請求の範囲第１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項４】
頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項５】
下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用する、前記式（１）の化合物と前記他の抗腫瘍性物質とを同時に、別々に又は順次投与するための抗腫瘍用組み合わせ製剤。
【請求項６】
前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである請求の範囲第５項記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
【請求項７】
前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである請求の範囲第５項記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
【請求項８】
頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための請求の範囲第５項〜第７項のいずれか１項記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
【請求項９】
下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用する抗腫瘍剤。
【請求項１０】
前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌抗生物質、微小管阻害剤、ホルモン剤、白金錯体、トポイソメラーゼ阻害剤、生物製剤及び分子標的治療剤からなる群より選択されるものである請求の範囲第９項記載の抗腫瘍剤。
【請求項１１】
前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、ニトロソウレア系化合物、葉酸系化合物、ピリミジン系化合物、プリン系化合物、アントラサイクリン系化合物、ピンアルカロイド、タキサン、抗エストロゲン薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、分子標的治療薬、シスプラチン、カルボプラチン及びネダプラチンからなる群より選択されるものである請求の範囲第９項記載の抗腫瘍剤。
【請求項１２】
頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される疾患の治療のための請求の範囲第９項〜第１１項のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
【請求項１３】
下記式（１）：
（式中、各Ｒは、それぞれ独立に、水素原子、低級アルキル基、アリール基、アリル基、アラルキル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、Ｒ’Ｏ−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）−、Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又はＲ’Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。但し、Ｒ’は炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを含むテロメラーゼ阻害剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８７６４
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３１０４（Ｐ２００５−５０３１０４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２７４６
【国際出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（３９２０３３２８８）株式会社そーせい (3)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２７４６
【国際出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（３９２０３３２８８）株式会社そーせい (3)
【Ｆターム（参考）】
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