ＨＩＶＮＣ蛋白質の新規な用途
本発明はＨＩＶのＮＣ蛋白質の新規な用途に関するものにして、より詳細には、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むＡＩＤＳ予防及び治療用組成物及び前記ポリペプチドを利用したＨＩＶ増殖抑制方法に関するものである。本発明のＨＩＶＮＣ蛋白質を含むポリペプチドは過発現時ＨＩＶの増殖を抑制する効果を有する。従って、本発明はＨＩＶの増殖を抑制する新たな手段を提供するのみならず、ＡＩＤＳ予防及び治療の為の新たな方法を提供する効果がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＨＩＶのＮＣ蛋白質の新規用途に関わるものにして、より詳細には、ＨＩＶＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むＡＩＤＳ予防又は治療用組成物、ＨＩＶＮＣ蛋白質をこれを必要とする個体に有効な量で投与することを含むＡＩＤＳ予防又は治療方法、ＡＩＤＳ治療剤を製造する為のＨＩＶＮＣ蛋白質の用途及び前記ポリペプチドを利用したＨＩＶ増殖抑制方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳ（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：後天的免疫不全症候群）は１９８０年代初期に初めて発見されて以来、世界的に重要な疾病の一つである。今まで開発されたＡＩＤＳの治療剤は、主にプロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えばサキナビル、インジナビル、リトナビル等、および逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）抑制剤、例えばＡＺＴ，ｄｄＩ，ｄｄＣ，ｄ４Ｔ，３ＴＣ，ナビラフィン等の逆転写酵素抑制剤がある。これらの治療剤は単独で使用する場合には、別段の効果が無いものの、ＡＺＴ，３ＴＣ等二つの逆転写酵素抑制剤と、一つのプロテアーゼ抑制剤を複合処方する場合、高水準の治療効果を呈するものとして知られた。
【０００３】
しかしながら、複合処方を受けた全ての患者の病勢が好転されるものではなく、高価で嘔吐、高熱等深刻な副作用があって、これらの薬剤に対する抵抗性を有する変種ウィルスが現れる等の問題点があった。
【０００４】
従って、より良い治療法の為、薬効がはるかに強力で毒性が少ない新たな系統の治療剤開発の必要性が求められている。
【０００５】
ＡＩＤＳはＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）の感染により発生し、ＨＩＶにより感染されると３〜６週後、感冒および疲労のような症状を１〜２週程度患って回復し、その後症状がない潜伏期が１０年余り持続される。長い潜伏期間の間ＨＩＶウィルスは感染者の免疫細胞を破壊しながら持続的に増殖することから、患者の免疫機能が漸次損傷され潜伏期末期にはＡＩＤＳ症状が現れる。
【０００６】
ＨＩＶの蛋白質の内、ヌクレオキャプシド蛋白質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ，以下、“ＮＣ”と命名する）はウィルス個体形成の為の構造的役割のみならず、ウィルスの生活周期（ｖｉｔａｌ ｌｉｆｅ ｃｙｃｉｅ）に対しても機能的にも重要な役割をする。ＨＩＶ ＮＣ蛋白質の主要機能を察すれば、第１に、ＮＣ蛋白質はウィルスのゲノミック エンキャプシデーション（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に関与する。このような機能は独特なＣｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｈｉｓ−Ｘ４−Ｃｙｓ モチーフ（ＣＣＨＣモチーフ）で構成される２個のジンクフィンガードメインから起因し、前記ドメインは全てのレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）において高い保存性を示し、ＨＩＶ ＲＮＡパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）と感染性ウイルス生産に必須的なものとして知られている。第２に、ＮＣ蛋白質はウイルスの逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ＲＴ）の間、ｔＲＮＡプライマーアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）とストランド トランスファー（ｓｔｒａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を促進するとして知られており、これよりＮＣ蛋白質がウイルス複製（ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に重要な機能をすることが分かる。第３に、ＮＣ蛋白質はウイルスの生活周期に必要な核酸チャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）活性を有し、最近ではウイルスＤＮＡが宿主細胞染色体に挿入される時にもＮＣ蛋白質が所定の役割を担当するとして報告されている。
【０００７】
従って、このようなＮＣ蛋白質に対する研究はＨＩＶ生活周期において、ＮＣ蛋白質が有する生物学的機能を究明するばかりでなく、核心的なＨＩＶ蛋白質に対する効果的な抗ウイルス剤を開発する面においても極めて重要であると言い得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ここに、本発明者等はＨＩＶ ＮＣ蛋白質の生理学的活性の研究を重ねている中、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質及びＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドがＨＩＶの増殖を抑制することを究明し、ＡＩＤＳの予防及び治療用組成物として利用し得る点を究明して本発明を完成した。 従って、本発明の目的はＨＩＶ ＮＣ蛋白質の新規な用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の目的を達成する為に、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むＡＩＤＳ予防及び治療用組成物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明の他の目的を達成する為に、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を増加させることによる、ＨＩＶ増殖抑制方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらに他の目的を達成する為に、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を増加させる候補物質を同定することを含むＡＩＤＳの予防及び治療物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の組成物は、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質自体又はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする。前記ＨＩＶのＮＣ蛋白質は、ＡＩＤＳを引起こす病原体であるＨＩＶのヌクレオキャプシド蛋白質を意味し、この蛋白質はウイルスゲノムＲＮＡに強く結合してリボ核酸蛋白質コア複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。
【００１３】
好ましくは、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質は配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有することができ、Genbank Accession No. P03349, P03366,P04585, P03367, P12497, P03369, P04587, P04584, P35963, P24740, P05961, P04591,Q73368, P20892, P20875, P12498, P05888, P12493, Q9QBZ5, Q9QBY3, Ｏ89940, Q9WC63, Q9WC54, Q75002, P24736, Q9QBZ1, Ｏ89290, Q9QBZ6, Q9QBY4, P12499, P05959, P18802, P04588, P04589,P05960, Q70622, P20889, P12494, P03347, Q9QSR3, Q9Q720, Q9IDV9, Q9WC62, Q9WC53,Q9Q721, Q74230, Q73367, Ｏ12157, P35962, P18800, P04592,P20873, P05887, P03348, P04593, Q89928, Q79666, Q77373, Ｏ41798, Ｏ93215, Ｏ91080,P05962, Q9QBZ2, Q9QC00, Ｏ89291, P05891, P15833, P17757,P18096, Q9QSR4, Q9IDV8, Q75001, Ｏ89939, P18095, P05890,P04594, P12495, Q76634, P20876, P18042, P0C1K7, Q79665, Q77372, Ｏ93182, Ｏ91079, P05889, P12451, P24107,Q76633, P12450, P18041, P15832, P24106, P17756, Q69383, Q74120, Q74119, P20874,P04590, P03363, Q0R5R2, Q1A268, Q1A250, Q1A267, P03353, Q0R5R3, Q1A249に記載されたＮＣ蛋白質であることができ、例えば、Ｐ０３３４９の場合３８０乃至４３４番目のアミノ酸配列でもあり得る。
【００１４】
さらに、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドは、これに限定はされないものの、ＨＩＶのｇａｇ欠失突然変異体でも有り得る。好ましくは、配列番号２乃至配列番号７のアミノ酸配列を有し得る。
【００１５】
本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質は細胞内で発現する際、ＨＩＶの増殖を効果的に抑制することができ、（実施例１参照）、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むｇａｇ欠失突然変異体もやはり細胞内で発現する際、ＨＩＶの増殖を効果的に抑制した（実施例２参照）。このような事実は本発明者等により最初に究明されたのである。従って、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むＡＩＤＳ予防及び治療用組成物を提供する。
【００１６】
本発明の他の薬学的組成物は、薬学的に有効な量のＨＩＶ ＮＣ蛋白質自体又はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを単独で含むか、又は１つ以上の薬学的に許容される担体を共に含み得る。前記にて“薬学的に有効な量”とは、対照群に比べて同等以上の反応を示す量を言い、好ましくは、ＡＩＤＳを治療又は予防するに十分な量を言う。
【００１７】
本発明のＨＩＶＮＣ蛋白質又はＨＩＶＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの薬学的に有効な量は０．０００１乃至１００ｍｇ／日／体重ｋｇ、好ましくは、０．０１乃至１ｍｇ／日／体重ｋｇである。しかしながら、前記薬学的に有効な量は疾患及びこれらの重症程度、患者の年令、体重、健康状態、性別、投与時間、投与経路及び治療期間等のような多様な因子により適宜変化し得る。
【００１８】
前記にて“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容され、人間に投与された際、活性成分の作用を阻害せず通常的に胃腸障碍、眩気症のようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を引起こさないことをいう。前記担体には全ての種類の溶媒、分散剤、水中油又は油中水エマルジョン、水性組成物、リポソム、マイクロビード及びマイクロソームが含まれる。
【００１９】
一方、本発明の薬学的組成物は投与経路により適合した担体と共に剤形化できる。前記本発明の薬学的組成物の投与経路はこれに限定はされないものの、経口的又は非経口的に投与できる。非経口的経路には例えば、経皮、鼻腔、腹腔、筋肉、皮下又は静脈等の多くの経路が含まれる。
【００２０】
本発明の薬学的組成物を経口投与する場合、本発明の薬学的組成物は適合した経口投与用担体と共に、当業界に公知された方法により粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウェハー等の形態で剤形化し得る。これの調製の際には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール及びマルチトール等を始めとする糖類と、トウモロコシ澱粉、及び小麦澱粉、米澱粉及び馬鈴薯澱粉等を始めとする澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルーセルロース等を始めとするセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等のような充填剤を含むことができる。さらに、場合によって架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はナトリウムアルギネート等を崩解剤として添加し得る。さらには、前記薬学的組成物は抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等を追加的に含むことができる。
【００２１】
さらに、非経口的に投与する場合、本発明の薬学的組成物は適切な非経口用担体と共に、注射剤、経皮投与剤及び鼻腔吸込み剤の形態で当業界に公知された方法により剤形化でき得る。前記注射剤の場合には、必ず滅菌されなければならずバクテリア及び真菌のような微生物の汚染から保護されなければならない。注射剤の場合、適切な担体の例にはこれに限定はされないものの、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの混合物及び／又は植物油を始めとする溶媒又は分散媒質を含むことができる。さらに好ましくは、適切な担体はハンクス溶液、リンゲル溶液、トリエタノールアミンを含有するＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）又は注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコール及び５％デキストロースのような等浸透圧溶液等を使用できる。前記注射剤を微生物汚染から保護する為には、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等のような多様な抗菌剤及び抗真菌剤を追加して含め得る。さらに、前記注射剤は大部分の場合、糖又は食塩のような等浸透圧剤を追加して含むことができる。
【００２２】
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、ペースト剤、リニメント剤、エアロゾル剤等の形態が含まれる。前記にて経皮投与は薬学的組成物を極所的に皮膚に投与して薬学的組成物に含まれた有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。これらの剤形は製薬化学に一般的に公知された処方書である文献（Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania）に記述されている。
【００２３】
鼻腔内投与剤の場合、本発明により使用される化合物は適切な推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又は他の適切な気体を使用して、加圧パック又は煙霧器からエアロゾルスプレー形態で便利に伝達できる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は計量された量を伝達する弁を提供して決定することができる。例えば、吸込み器又は取込み器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは、化合物及びラクトース又は澱粉のような適切な粉末混合物を含有するように剤形化することができる。
【００２４】
その他の薬学的に許容される担体としては、下記の文献に記載されているものがあげられる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。この文献の記載は、その全てが参照され、本明細書の一部とされる。
【００２５】
さらに、本発明に伴う薬学的組成物は１つ以上の緩衝剤（例えば、生理食塩水又はＰＢＳ）、カーボハイドレート（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、懸濁剤、濃化剤及び／又は保存剤を追加して含むことができる。
【００２６】
さらに、本発明の薬学的組成物は哺乳動物に与えられ、活性成分の迅速な、連続した、又は遅延された放出を提供できるように当業界に公知の方法を使用して剤形化することができる。
【００２７】
さらに、本発明の薬学的組成物はＡＩＤＳを予防又は治療する効果を有する公知の化合物と併用して投与できる。
【００２８】
一方、本発明はプロモータ及び、プロモータと機能発現可能に連結されたＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクトルを有効成分として含むＡＩＤＳの予防及び治療用組成物を提供する。この際、前記ポリヌクレオチドは配列番号８乃至配列番号１４からなる群より選ばれた配列で表示される塩基配列を有することができ、好ましくは、前記発現ベクトルはｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルでもありことができる。
【００２９】
一方、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を増加させ、ＨＩＶウイルスの増殖を抑制する方法を提供する。
【００３０】
前記細胞内量とは、細胞内に存在する量を意味し、これは当業者に公知された多様な方法で調節でき得る。例えば、これに限定はされないものの、細胞内量は転写段階を介して調節できる。転写段階における調節は当業者に公知された遺伝子の発現を増進させる為の方法、例えば、プロモータ、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質自身又はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号８乃至配列番号１４で表示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが連結された発現ベクトルで細胞を形質転換する方法等により行える。前記細胞内量の増加方法のさらなる例として、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを、目的とする細胞に伝達する方法が利用できる。このような伝達方法は通常の遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）で使用される方法等を本願発明に符合するように修正した方法により行うことができ、これに対しては当業者等に広く知られている。
【００３１】
プロモータとしては、標的蛋白質の発現を常時誘導する構成的プロモータを使用できる。それらの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２，１９８５），Ｒｓｙｎ７プロモータ（米国特許出願第０８／９９１，６０１号）、ライスアクチン（ｒｉｃｅ ａｃｔｉｎ）プロモータ（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３−１７１，１９９０）、ユビキチンプロモータ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２，１９８９），ＡＬＳプロモータ（米国特許出願第０８／４０９，２９７号）等がある。この他にも米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号、第５，６０４，１２１号、第５，５６９，５９７号、第５，４６６，７８５号、第５，３９９，６８０号、第５，２６８，４６３号及び第５，６０８，１４２号等に開示されたプロモータ等が使用できる。
【００３２】
前記プロモータとは、特定の宿主細胞中で機能発現可能に連結された核酸配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、機能発現可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）とは、一つの核酸断片が他の核酸断片と結合され、その機能又は発現が他の核酸断片により影響を受けることを言う。従って、転写を調節する為の任意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソム結合部位をコーデイングする配列及び転写及び解読の終結を調節する配列を追加して含むことができる。前記プロモータは全ての時間帯で常時的に目的遺伝子の発現を誘導する構成的プロモータ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）又は特定した位置、時期に目的遺伝子の発現を誘導する誘導性プロモータ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を使用することができ、その例としてはＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ（Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０８：１９３−１９９，１９９１；Ｍｏｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：２４−３０，２０００），ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２，１９８５），Ｒｓｙｎ７プロモータ（米国特許出願第０８／９９１，６０１号）、ライスアクチン（ｒｉｃｅ ａｃｔｉｎ）プロモータ（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３−１７１，１９９０）、ユビキチンプロモータ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２，１９８９），ＡＬＳプロモータ（米国特許出願第０８／４０９，２９７号）等がある。この他にも米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号、第５，６０４，１２１号、第５，５６９，５９７号、第５，４６６，７８５号、第５，３９９，６８０号、第５，２６８，４６３号及び第５，６０８，１４２号等に開示されたプロモータ等も使用できる。
【００３３】
本発明の発現ベクトルはプラスミドベクトル、コスミドベクトル、バクテリオファージベクトル及びウィルスベクトル等を含むもののこれに限定されない。適切な発現ベクトルはプロモータ、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びインハンサのような遺伝子発現調節エレメント等を含むことができ、目的によって多様に製造できる。好ましくは本発明の発現ベクトルはｐＬＰ１／ＯｐｔｉＮＣベクトルであってもよい。
【００３４】
ｐＬＰ１／ＯｐｔｉＮＣベクトルは下記のような方法により製造された。配列番号１５のコドン最適化されたＨＩＶ ＮＣ遺伝子（ＯｐｔｉＮＣ ＤＮＡ）をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理した後、前記制限酵素処理された断片をｐＵＣ５７ベクトル（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ，米国）にクローニングし、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理した。得られたベクトルをｐＵＣ５７／ＯｐｔｉＮＣと命名した。前記ｐＵＣ５７／ＯｐｔｉＮＣと、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理し、互いにライゲーションしてｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＯｐｔｉＮＣを製作した。前記ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＯｐｔｉＮＣをＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで処理して切断されたＨＩＶ ＮＣ遺伝子が含まれたＤＮＡ断片をクリナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片と重合して平滑末端とした。ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ベクトル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，米国）もＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで処理し、切断されたＤＮＡ断片をクリナウと重合して平滑末端を得た。前記クリナウ断片で処理された二つの断片を互いにライゲーションして得られたベクトルをｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣと命名した。ｐＬＰ１ベクトル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、ＰｍｌＩ／ＡｖｒＩＩ／ＢｓｐＥＩで処理して、ＧＡＧ−ＰＯＬ遺伝子を取り出し、ＯｐｔｉＮＣポリヌクレオチドはＸｍａＩ／ＥｃｏＲＩで処理され、ｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣベクトルにライゲーションした。前記ｐＬＰ１ベクトルとＯｐｔｉＮＣポリヌクレオチドは全てクリナウ断片と重合して平滑末端を作り、平滑末端ライゲーション（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）して、得られたベクトルをｐＬＰ１／ＯｐｔｉＮＣと命名した。
【００３５】
一方、本発明で使用された標準組替えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該分野で広く公知であり、下記文献に記載されている（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY(1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)）。
【００３６】
さらに、本発明で究明した通り、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質及びＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの発現がＨＩＶの増殖を抑制する活性を有する。従って本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質及びＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの発現を増加させる物質を探索して、ＡＩＤＳの予防及び治療物質のスクリーニング方法を提供する。
【００３７】
具体的に本発明のスクリーニング方法は、
（ａ）ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを発現する組替え細胞と候補物質とを培養する段階及び；
（ｂ）ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量増加に及ぼす効果を測定する段階を含むことを特徴とする。
【００３８】
前記にてＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量増加とは、前記ポリペプチドをエンコードする遺伝子の発現が増加されることを介して、細胞内に存在する前記ポリペプチドの量が増加することを意味する。従って、本発明における候補物質は前記ポリペプチドの発現を促進する特性を有する物質である。前記候補物質は蛋白質ばかりでなく、天然で分離されるか又は化学的に合成された化合物又は抽出物を含む。
【００３９】
ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を測定する方法は、当業界に公知の多様な方法を使用できる。例えば、これに限定はされないものの、共−免疫沈澱法（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ），ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及びフルオレセンス アクティベイティドセルソーティング法（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【００４０】
さらに、本発明のポリペプチドを標的としたスクリーニング方法は、高効率スクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ＨＴＳ）を適用できる。ＨＴＳは多数の候補物質を同時に試験し、多数の候補物質の生物学的活性に対して同時に又は殆ど同時にスクリーニングする方法である。特定様態として９６−ウェルマイクロタイタープレート又は１９２−ウェルマイクロタイタープレートで細胞株を培養し、ここに複数個の候補物質を処理して、免疫化学的方法によりＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの発現程度を測定できる。このフォーマットでは９６回の独立的な試験を９６個の反応ウェルを含む単一の８ｃｍ×１２ｃｍプラスチックプレートの上で同時に行える。前記ウェルは典型的に５０μｌ乃至５００μｌに至る検定容積を必要とする。プレートに加え、９６フォーマットを広範囲な均一系及び不均一系検定に適合するようにする為に、多数のゲージ、器具、ピペッタ、ロボット、プレート洗滌器及びプレート判読器が商業的に利用可能である。
【００４１】
本発明の一実施例では２９３ＦＴ細胞に、ＨＩＶウイルスを生産できるベクトルであるｐＮＬ４−３ＧＦＰ及びＨＩＶ ＮＣ蛋白質を発現するｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルを導入して形質転換し、前記形質転換された２９３ＦＴ細胞で増殖されるＨＩＶウイルスの数を確認した。その結果、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を発現する細胞では、そうでない細胞に比べて約１００倍以上のＨＩＶ増殖抑制効果があることが分かった（実施例１及び図１参照）。
【００４２】
本発明の他の実施例では、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むｇａｇ欠失突然変異体を発現する６種のベクトルを製造し、これを２９３ＦＴ細胞にｐＮＬ４−３ＧＦＰベクトルと共に形質転換した後、前記形質転換された２９３ＦＴ細胞で増殖されるＨＩＶウイルスの数を確認した。その結果、前記欠失突然変異体を発現する細胞では、そうでない細胞に比べて約５倍乃至７０倍以上のＨＩＶ増殖抑制効果があることが分かった（実施例２及び図５参照）。
【００４３】
前記のような本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質の効果を基に、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質をこれを必要とする個体に有効な量で投与することを含むＡＩＤＳの予防又は治療方法を提供する。
【００４４】
本発明で“有効な量”とは、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質が投与対象である個体内でＡＩＤＳの予防又は治療する効果を示す量を言い、前記“個体”とは、哺乳動物、特に人間を含む動物を意味する。前記個体は治療が必要な患者でもあり得る。
【００４５】
本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質は前記記載した効果の内、望む効果が導出されるまで投与することができ、当業界に公知された方法により多様な経路で投与し得る。つまり、経口又は非経口、例えば、口腔、筋肉内、静脈内、皮内、動脈内、骨髄内、隔膜内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下又は皮下投与されるか又は胃腸管、粘膜又は呼吸器に投与し得る。
【００４６】
さらに、本発明はＡＩＤＳ治療剤を製造する為の、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質の用途を提供する。ＡＩＤＳ、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質及びこれの効果に対しては前記にて記載した通りである。
【００４７】
さらに、本発明はプロモータ、及びプロモータと機能発現可能に連結されたＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクトルを、これを必要とする個体に有効な量で投与することを含むＡＩＤＳ予防又は治療方法を提供する。また本発明は、ＡＩＤＳ治療剤を製造する為のプロモータ、及びプロモータと機能発現可能に連結されたＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクトルの用途を提供する。前記ポリヌクレオチド、発現ベクトル、個体、有効な量及びＡＩＤＳに対しては前記にて記載した通りである。
【発明の効果】
【００４８】
従って、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドは、過発現の際、ＨＩＶの増殖を抑制する効果を有する。従って、本発明はＨＩＶの増殖を抑制する新たな手段を提供するばかりでなく、ＡＩＤＳの予防又は治療の為の新たな方法を提供する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１はＨＩＶ ＮＣ蛋白質のＨＩＶ増殖抑制効果を示した図である。
【図２】図２は本発明のｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣ発現ベクトルの製作過程を示した模式図である。
【図３】図３は本発明のｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣ発現ベクトルの製作過程を示した模式図である。
【図４】図４はＨＩＶＮＣ蛋白質を含む６種のｇａｇ欠失突然変異体を示したものであり、この時、ＨＩＶｇａｇ蛋白質を構成する各ドメインの略称は下記の通りである：ＭＡ（マトリックス：Ｍａｔｒｉｘ），ＣＡ（キャプシド：Ｃａｐｓｉｄ），Ｐ２（Ｐ２ドメイン：ｄｏｍａｉｎ），ＮＣ（ヌクレワキャプシド：Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ），Ｐ１（Ｐ１ドメイン：ｄｏｍａｉｎ），Ｐ６（Ｐ６ドメイン：ｄｏｍａｉｎ）。
【図５】図５はＨＩＶＮＣ蛋白質を含む６種のｇａｇ欠失突然変異体のＨＩＶ増殖抑制効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記の実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
＜実施例１＞
ＮＣ蛋白質のＨＩＶ増殖抑制効果確認
＜１−１＞ＮＣ蛋白質を発現する形質転換細胞製作
形質転換に使用された２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）は１０％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ），１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％非必須アミノ酸を含有したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）培地で３７℃、５％ＣＯ2 の条件で培養した。２９３ＦＴ細胞を６−ｗｅｌｌプレートで２４時間培養後、ｐＮＬ４−３ＧＦＰベクトル及びｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルでリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）２０００プロトコルにより形質転換をさせた。この際、ＮＣ蛋白質を生産しない対照群としてｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルの代りにｐＬＰ１/０ベクトル（ｐＬＰ１ベクトルになにも挿入していないベクトル）を使用した。形質転換方法は下記の通りである：細胞を６−ｗｅｌｌプレートで約９０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）程度まで培養した。ｐＮＬ４／３ＧＦＰベクトル１μｇとｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトル２μｇとの混合物、ｐＮＬ４／３ＧＦＰベクトル１μｇとｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトル３μｇとの混合物、及び対照群としてｐＮＬ４／３ＧＦＰ１μｇとｐＬＰ１／０２μｇとの混合物をそれぞれ用意した後、２５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈した。これとは別に９μｌのリポフェクタミン２０００を２５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭに希釈した後、室温で５分間放置した。その後、希釈されたリポフェクタミン２０００を前記ベクトルの混合物に入れ、約３０分間放置した。６−ｗｅｌｌプレートで培養した細胞を５００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗滌した後、再度５００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地に入れた。前記にて混合したそれぞれのベクトルとリポフェクタミン２０００の混合物をそれぞれの培地に入れて３７℃、５％ＣＯ2 の条件で培養した。
【００５２】
形質転換に使用されたベクトルに対して説明すれば下記の通りである：ｐＮＬ４−３ＥＧＦＰベクトルはＮｅｆ遺伝子の半分がＥＧＦＰリポータ遺伝子で代替されたことを除いては、全てのＨＩＶ−１の遺伝子を含んでおり、組替えＨＩＶウイルスを生産できるベクトルである。このベクトルは公知の文献（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２３３：２８８−２９２）に詳細に記載されている。ｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルはＮＣ蛋白質を発現させる為のベクトルであり、ｐＬＰ１／０ベクトルは前記ｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルでＮＣ遺伝子に該当する部分が挿入されていないベクトルである。
【００５３】
＜１−２＞ＮＣの発現に伴うＨＩＶ増殖速度測定
前記実施例＜１−１＞で形質転換された２９３ＦＴ細胞の培地を、形質転換した後５乃至６時間経過後にピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）が含有されたＤＭＥＭ培地に代替した。その後、それぞれ６時間、１２時間、２４時間、３６時間、及び４８時間経過後、培地からサンプルを収得してウイルスの含有程度をＥＬＩＳＡ分析を介して測定した。
【００５４】
前記ＥＬＩＳＡ分析は、ビロノスチカＨＩＶ−１抗体ｐ２４ＥＬＩＳＡキット（Ｖｉｒｏｎｏｓｔｉｋａ ＨＩＶ−１ ａｎｔｉｇｅｎ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｓ，フランス）を利用して製造社の指針に従って行った：具体的にはそれぞれの培地サンプルをキットのウェルに移して培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）し、ホスフェートバッファ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，０．１７Ｍ ＫＨ2 ＰＯ4 、０．７２Ｍ Ｋ2 ＨＰＯ4 ）１００μｌを混合して３０秒間放置する方法で４回洗滌した。ここに、ｐ２４抗体を入れて、３７℃で１時間反応させ、再度ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体を入れ、３７℃で１時間反応させた。ここに、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ）を入れて、抗体複合体と１０分間接合させた。これを８０ｐｇ／ｍｌより５ｐｇ／ｍｌまで２倍段階希釈して、４５０ｎｍで吸光度を測定してそれぞれの試料内のウイルスの量を測定した。
【００５５】
その結果、図１及び下記表１（単位：ｐｇ／ｍｌ）に示された通り、ＮＣ蛋白質がＨＩＶウイルスの生産を濃度依存的に抑制することが分かった。特に、細胞の形質転換から４８時間経過時に３μｇのＮＣ蛋白質発現ベクトル（ｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトル）を添加した場合は、ＮＣを発現しない細胞に比べて約１００倍以上の増殖抑制効果を示した。このような結果は、ＮＣ蛋白質がＨＩＶの増殖を抑制する抗ウイルス製剤として利用できることを示している。
【００５６】
【表１】
【００５７】
＜実施例２＞ＮＣ蛋白質を含むＧａｇ欠失突然変異体のＨＩＶ増殖抑制効果確認
＜２−１＞Ｇａｇ欠失突然変異体の製造
ＮＣ蛋白質を含むＧａｇ欠失突然変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）がＨＩＶ増殖抑制に及ぼ影響を察する為、６種のＧａｇ欠失突然変異体を製造した。ｐＬＰ１の配列情報を利用して図２での通り、ＮＣ蛋白質を含むＧａｇ欠失突然変異体を製造する為に、下記表２の通りのＰＣＲプライマーをデザインした。
【００５８】
【表２】
【００５９】
６種の欠失突然変異体は前記表２のそれぞれのプライマー組合わせを利用し、ｐＬＰ１ベクトルを鋳型として下記のような条件でのＰＣＲにより増殖された：９５℃で５分間前変性、９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒の３５回増幅及び７２℃５分の延長（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）。増幅されたそれぞれのＰＣＲ産物は、ｐｍｌＩとＢｓｐＥＩで切断してｐＬＰ１のｐｍｌＩ及びＢｓｐＥＩ制限酵素部位にクローニングし、これをそれぞれｐＬＰ１−Ｄ１乃至ｐＬＰ１−Ｄ６とした。
【００６０】
＜２−２＞ＮＣ蛋白質発現に伴うＨＩＶ増殖速度測定
前記実施例＜２−１＞で製造されたそれぞれのＧａｇ欠失突然変異体の発現時ＨＩＶ増殖速度に及ぼす影響を測定する為に、ｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルの代りに前記突然変異体を発現するｐＬＰ１−Ｄ１乃至ｐＬＰ１−Ｄ６ベクトルを、それぞれ１μｇずつ使用したこと及び、ＤＭＥＭ培地に代替してから２４時間経過後に、培地からサンプルを収得して測定したこと以外には前記実施例＜１−１＞及び＜１−２＞の方法の通りにして測定した。
【００６１】
その結果、下記図５及び表３（単位：ｐｇ／ｍｌ）の通り、ＮＣ蛋白質を含む６種のＧａｇ欠失突然変異体全てＨＩＶウイルスの生産を抑制することが分った。このような結果は、ＮＣ蛋白質自体のみならず、ＮＣ蛋白質が含まれたペプチドがＨＩＶの増殖を抑制する効果があることを示した。
【００６２】
【表３】
＜産業上利用可能性＞
【００６３】
前記の通り、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドは、過発現時ＨＩＶの増殖を抑制する効果を有する。従って、本発明はＨＩＶの増殖を抑制する新たな手段を提供するばかりでなく、ＡＩＤＳ予防及び治療の為の新たな方法を提供する効果がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＨＩＶのＮＣ蛋白質の新規用途に関わるものにして、より詳細には、ＨＩＶＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むＡＩＤＳ予防又は治療用組成物、ＨＩＶＮＣ蛋白質をこれを必要とする個体に有効な量で投与することを含むＡＩＤＳ予防又は治療方法、ＡＩＤＳ治療剤を製造する為のＨＩＶＮＣ蛋白質の用途及び前記ポリペプチドを利用したＨＩＶ増殖抑制方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳ（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：後天的免疫不全症候群）は１９８０年代初期に初めて発見されて以来、世界的に重要な疾病の一つである。今まで開発されたＡＩＤＳの治療剤は、主にプロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えばサキナビル、インジナビル、リトナビル等、および逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）抑制剤、例えばＡＺＴ，ｄｄＩ，ｄｄＣ，ｄ４Ｔ，３ＴＣ，ナビラフィン等の逆転写酵素抑制剤がある。これらの治療剤は単独で使用する場合には、別段の効果が無いものの、ＡＺＴ，３ＴＣ等二つの逆転写酵素抑制剤と、一つのプロテアーゼ抑制剤を複合処方する場合、高水準の治療効果を呈するものとして知られた。
【０００３】
しかしながら、複合処方を受けた全ての患者の病勢が好転されるものではなく、高価で嘔吐、高熱等深刻な副作用があって、これらの薬剤に対する抵抗性を有する変種ウィルスが現れる等の問題点があった。
【０００４】
従って、より良い治療法の為、薬効がはるかに強力で毒性が少ない新たな系統の治療剤開発の必要性が求められている。
【０００５】
ＡＩＤＳはＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）の感染により発生し、ＨＩＶにより感染されると３〜６週後、感冒および疲労のような症状を１〜２週程度患って回復し、その後症状がない潜伏期が１０年余り持続される。長い潜伏期間の間ＨＩＶウィルスは感染者の免疫細胞を破壊しながら持続的に増殖することから、患者の免疫機能が漸次損傷され潜伏期末期にはＡＩＤＳ症状が現れる。
【０００６】
ＨＩＶの蛋白質の内、ヌクレオキャプシド蛋白質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ，以下、“ＮＣ”と命名する）はウィルス個体形成の為の構造的役割のみならず、ウィルスの生活周期（ｖｉｔａｌ ｌｉｆｅ ｃｙｃｉｅ）に対しても機能的にも重要な役割をする。ＨＩＶ ＮＣ蛋白質の主要機能を察すれば、第１に、ＮＣ蛋白質はウィルスのゲノミック エンキャプシデーション（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に関与する。このような機能は独特なＣｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｈｉｓ−Ｘ４−Ｃｙｓ モチーフ（ＣＣＨＣモチーフ）で構成される２個のジンクフィンガードメインから起因し、前記ドメインは全てのレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）において高い保存性を示し、ＨＩＶ ＲＮＡパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）と感染性ウイルス生産に必須的なものとして知られている。第２に、ＮＣ蛋白質はウイルスの逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ＲＴ）の間、ｔＲＮＡプライマーアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）とストランド トランスファー（ｓｔｒａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を促進するとして知られており、これよりＮＣ蛋白質がウイルス複製（ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に重要な機能をすることが分かる。第３に、ＮＣ蛋白質はウイルスの生活周期に必要な核酸チャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）活性を有し、最近ではウイルスＤＮＡが宿主細胞染色体に挿入される時にもＮＣ蛋白質が所定の役割を担当するとして報告されている。
【０００７】
従って、このようなＮＣ蛋白質に対する研究はＨＩＶ生活周期において、ＮＣ蛋白質が有する生物学的機能を究明するばかりでなく、核心的なＨＩＶ蛋白質に対する効果的な抗ウイルス剤を開発する面においても極めて重要であると言い得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ここに、本発明者等はＨＩＶ ＮＣ蛋白質の生理学的活性の研究を重ねている中、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質及びＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドがＨＩＶの増殖を抑制することを究明し、ＡＩＤＳの予防及び治療用組成物として利用し得る点を究明して本発明を完成した。 従って、本発明の目的はＨＩＶ ＮＣ蛋白質の新規な用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の目的を達成する為に、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むＡＩＤＳ予防及び治療用組成物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明の他の目的を達成する為に、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を増加させることによる、ＨＩＶ増殖抑制方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらに他の目的を達成する為に、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を増加させる候補物質を同定することを含むＡＩＤＳの予防及び治療物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の組成物は、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質自体又はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする。前記ＨＩＶのＮＣ蛋白質は、ＡＩＤＳを引起こす病原体であるＨＩＶのヌクレオキャプシド蛋白質を意味し、この蛋白質はウイルスゲノムＲＮＡに強く結合してリボ核酸蛋白質コア複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。
【００１３】
好ましくは、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質は配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有することができ、Genbank Accession No. P03349, P03366,P04585, P03367, P12497, P03369, P04587, P04584, P35963, P24740, P05961, P04591,Q73368, P20892, P20875, P12498, P05888, P12493, Q9QBZ5, Q9QBY3, Ｏ89940, Q9WC63, Q9WC54, Q75002, P24736, Q9QBZ1, Ｏ89290, Q9QBZ6, Q9QBY4, P12499, P05959, P18802, P04588, P04589,P05960, Q70622, P20889, P12494, P03347, Q9QSR3, Q9Q720, Q9IDV9, Q9WC62, Q9WC53,Q9Q721, Q74230, Q73367, Ｏ12157, P35962, P18800, P04592,P20873, P05887, P03348, P04593, Q89928, Q79666, Q77373, Ｏ41798, Ｏ93215, Ｏ91080,P05962, Q9QBZ2, Q9QC00, Ｏ89291, P05891, P15833, P17757,P18096, Q9QSR4, Q9IDV8, Q75001, Ｏ89939, P18095, P05890,P04594, P12495, Q76634, P20876, P18042, P0C1K7, Q79665, Q77372, Ｏ93182, Ｏ91079, P05889, P12451, P24107,Q76633, P12450, P18041, P15832, P24106, P17756, Q69383, Q74120, Q74119, P20874,P04590, P03363, Q0R5R2, Q1A268, Q1A250, Q1A267, P03353, Q0R5R3, Q1A249に記載されたＮＣ蛋白質であることができ、例えば、Ｐ０３３４９の場合３８０乃至４３４番目のアミノ酸配列でもあり得る。
【００１４】
さらに、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドは、これに限定はされないものの、ＨＩＶのｇａｇ欠失突然変異体でも有り得る。好ましくは、配列番号２乃至配列番号７のアミノ酸配列を有し得る。
【００１５】
本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質は細胞内で発現する際、ＨＩＶの増殖を効果的に抑制することができ、（実施例１参照）、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むｇａｇ欠失突然変異体もやはり細胞内で発現する際、ＨＩＶの増殖を効果的に抑制した（実施例２参照）。このような事実は本発明者等により最初に究明されたのである。従って、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むＡＩＤＳ予防及び治療用組成物を提供する。
【００１６】
本発明の他の薬学的組成物は、薬学的に有効な量のＨＩＶ ＮＣ蛋白質自体又はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを単独で含むか、又は１つ以上の薬学的に許容される担体を共に含み得る。前記にて“薬学的に有効な量”とは、対照群に比べて同等以上の反応を示す量を言い、好ましくは、ＡＩＤＳを治療又は予防するに十分な量を言う。
【００１７】
本発明のＨＩＶＮＣ蛋白質又はＨＩＶＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの薬学的に有効な量は０．０００１乃至１００ｍｇ／日／体重ｋｇ、好ましくは、０．０１乃至１ｍｇ／日／体重ｋｇである。しかしながら、前記薬学的に有効な量は疾患及びこれらの重症程度、患者の年令、体重、健康状態、性別、投与時間、投与経路及び治療期間等のような多様な因子により適宜変化し得る。
【００１８】
前記にて“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容され、人間に投与された際、活性成分の作用を阻害せず通常的に胃腸障碍、眩気症のようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を引起こさないことをいう。前記担体には全ての種類の溶媒、分散剤、水中油又は油中水エマルジョン、水性組成物、リポソム、マイクロビード及びマイクロソームが含まれる。
【００１９】
一方、本発明の薬学的組成物は投与経路により適合した担体と共に剤形化できる。前記本発明の薬学的組成物の投与経路はこれに限定はされないものの、経口的又は非経口的に投与できる。非経口的経路には例えば、経皮、鼻腔、腹腔、筋肉、皮下又は静脈等の多くの経路が含まれる。
【００２０】
本発明の薬学的組成物を経口投与する場合、本発明の薬学的組成物は適合した経口投与用担体と共に、当業界に公知された方法により粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウェハー等の形態で剤形化し得る。これの調製の際には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール及びマルチトール等を始めとする糖類と、トウモロコシ澱粉、及び小麦澱粉、米澱粉及び馬鈴薯澱粉等を始めとする澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルーセルロース等を始めとするセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等のような充填剤を含むことができる。さらに、場合によって架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はナトリウムアルギネート等を崩解剤として添加し得る。さらには、前記薬学的組成物は抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等を追加的に含むことができる。
【００２１】
さらに、非経口的に投与する場合、本発明の薬学的組成物は適切な非経口用担体と共に、注射剤、経皮投与剤及び鼻腔吸込み剤の形態で当業界に公知された方法により剤形化でき得る。前記注射剤の場合には、必ず滅菌されなければならずバクテリア及び真菌のような微生物の汚染から保護されなければならない。注射剤の場合、適切な担体の例にはこれに限定はされないものの、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの混合物及び／又は植物油を始めとする溶媒又は分散媒質を含むことができる。さらに好ましくは、適切な担体はハンクス溶液、リンゲル溶液、トリエタノールアミンを含有するＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）又は注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコール及び５％デキストロースのような等浸透圧溶液等を使用できる。前記注射剤を微生物汚染から保護する為には、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等のような多様な抗菌剤及び抗真菌剤を追加して含め得る。さらに、前記注射剤は大部分の場合、糖又は食塩のような等浸透圧剤を追加して含むことができる。
【００２２】
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、ペースト剤、リニメント剤、エアロゾル剤等の形態が含まれる。前記にて経皮投与は薬学的組成物を極所的に皮膚に投与して薬学的組成物に含まれた有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。これらの剤形は製薬化学に一般的に公知された処方書である文献（Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania）に記述されている。
【００２３】
鼻腔内投与剤の場合、本発明により使用される化合物は適切な推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又は他の適切な気体を使用して、加圧パック又は煙霧器からエアロゾルスプレー形態で便利に伝達できる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は計量された量を伝達する弁を提供して決定することができる。例えば、吸込み器又は取込み器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは、化合物及びラクトース又は澱粉のような適切な粉末混合物を含有するように剤形化することができる。
【００２４】
その他の薬学的に許容される担体としては、下記の文献に記載されているものがあげられる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。この文献の記載は、その全てが参照され、本明細書の一部とされる。
【００２５】
さらに、本発明に伴う薬学的組成物は１つ以上の緩衝剤（例えば、生理食塩水又はＰＢＳ）、カーボハイドレート（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、懸濁剤、濃化剤及び／又は保存剤を追加して含むことができる。
【００２６】
さらに、本発明の薬学的組成物は哺乳動物に与えられ、活性成分の迅速な、連続した、又は遅延された放出を提供できるように当業界に公知の方法を使用して剤形化することができる。
【００２７】
さらに、本発明の薬学的組成物はＡＩＤＳを予防又は治療する効果を有する公知の化合物と併用して投与できる。
【００２８】
一方、本発明はプロモータ及び、プロモータと機能発現可能に連結されたＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクトルを有効成分として含むＡＩＤＳの予防及び治療用組成物を提供する。この際、前記ポリヌクレオチドは配列番号８乃至配列番号１４からなる群より選ばれた配列で表示される塩基配列を有することができ、好ましくは、前記発現ベクトルはｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルでもありことができる。
【００２９】
一方、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を増加させ、ＨＩＶウイルスの増殖を抑制する方法を提供する。
【００３０】
前記細胞内量とは、細胞内に存在する量を意味し、これは当業者に公知された多様な方法で調節でき得る。例えば、これに限定はされないものの、細胞内量は転写段階を介して調節できる。転写段階における調節は当業者に公知された遺伝子の発現を増進させる為の方法、例えば、プロモータ、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質自身又はＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号８乃至配列番号１４で表示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが連結された発現ベクトルで細胞を形質転換する方法等により行える。前記細胞内量の増加方法のさらなる例として、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを、目的とする細胞に伝達する方法が利用できる。このような伝達方法は通常の遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）で使用される方法等を本願発明に符合するように修正した方法により行うことができ、これに対しては当業者等に広く知られている。
【００３１】
プロモータとしては、標的蛋白質の発現を常時誘導する構成的プロモータを使用できる。それらの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２，１９８５），Ｒｓｙｎ７プロモータ（米国特許出願第０８／９９１，６０１号）、ライスアクチン（ｒｉｃｅ ａｃｔｉｎ）プロモータ（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３−１７１，１９９０）、ユビキチンプロモータ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２，１９８９），ＡＬＳプロモータ（米国特許出願第０８／４０９，２９７号）等がある。この他にも米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号、第５，６０４，１２１号、第５，５６９，５９７号、第５，４６６，７８５号、第５，３９９，６８０号、第５，２６８，４６３号及び第５，６０８，１４２号等に開示されたプロモータ等が使用できる。
【００３２】
前記プロモータとは、特定の宿主細胞中で機能発現可能に連結された核酸配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、機能発現可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）とは、一つの核酸断片が他の核酸断片と結合され、その機能又は発現が他の核酸断片により影響を受けることを言う。従って、転写を調節する為の任意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソム結合部位をコーデイングする配列及び転写及び解読の終結を調節する配列を追加して含むことができる。前記プロモータは全ての時間帯で常時的に目的遺伝子の発現を誘導する構成的プロモータ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）又は特定した位置、時期に目的遺伝子の発現を誘導する誘導性プロモータ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を使用することができ、その例としてはＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ（Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０８：１９３−１９９，１９９１；Ｍｏｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：２４−３０，２０００），ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２，１９８５），Ｒｓｙｎ７プロモータ（米国特許出願第０８／９９１，６０１号）、ライスアクチン（ｒｉｃｅ ａｃｔｉｎ）プロモータ（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３−１７１，１９９０）、ユビキチンプロモータ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２，１９８９），ＡＬＳプロモータ（米国特許出願第０８／４０９，２９７号）等がある。この他にも米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号、第５，６０４，１２１号、第５，５６９，５９７号、第５，４６６，７８５号、第５，３９９，６８０号、第５，２６８，４６３号及び第５，６０８，１４２号等に開示されたプロモータ等も使用できる。
【００３３】
本発明の発現ベクトルはプラスミドベクトル、コスミドベクトル、バクテリオファージベクトル及びウィルスベクトル等を含むもののこれに限定されない。適切な発現ベクトルはプロモータ、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びインハンサのような遺伝子発現調節エレメント等を含むことができ、目的によって多様に製造できる。好ましくは本発明の発現ベクトルはｐＬＰ１／ＯｐｔｉＮＣベクトルであってもよい。
【００３４】
ｐＬＰ１／ＯｐｔｉＮＣベクトルは下記のような方法により製造された。配列番号１５のコドン最適化されたＨＩＶ ＮＣ遺伝子（ＯｐｔｉＮＣ ＤＮＡ）をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理した後、前記制限酵素処理された断片をｐＵＣ５７ベクトル（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ，米国）にクローニングし、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理した。得られたベクトルをｐＵＣ５７／ＯｐｔｉＮＣと命名した。前記ｐＵＣ５７／ＯｐｔｉＮＣと、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理し、互いにライゲーションしてｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＯｐｔｉＮＣを製作した。前記ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＯｐｔｉＮＣをＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで処理して切断されたＨＩＶ ＮＣ遺伝子が含まれたＤＮＡ断片をクリナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片と重合して平滑末端とした。ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ベクトル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，米国）もＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで処理し、切断されたＤＮＡ断片をクリナウと重合して平滑末端を得た。前記クリナウ断片で処理された二つの断片を互いにライゲーションして得られたベクトルをｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣと命名した。ｐＬＰ１ベクトル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、ＰｍｌＩ／ＡｖｒＩＩ／ＢｓｐＥＩで処理して、ＧＡＧ−ＰＯＬ遺伝子を取り出し、ＯｐｔｉＮＣポリヌクレオチドはＸｍａＩ／ＥｃｏＲＩで処理され、ｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣベクトルにライゲーションした。前記ｐＬＰ１ベクトルとＯｐｔｉＮＣポリヌクレオチドは全てクリナウ断片と重合して平滑末端を作り、平滑末端ライゲーション（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）して、得られたベクトルをｐＬＰ１／ＯｐｔｉＮＣと命名した。
【００３５】
一方、本発明で使用された標準組替えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該分野で広く公知であり、下記文献に記載されている（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY(1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)）。
【００３６】
さらに、本発明で究明した通り、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質及びＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの発現がＨＩＶの増殖を抑制する活性を有する。従って本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質及びＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの発現を増加させる物質を探索して、ＡＩＤＳの予防及び治療物質のスクリーニング方法を提供する。
【００３７】
具体的に本発明のスクリーニング方法は、
（ａ）ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを発現する組替え細胞と候補物質とを培養する段階及び；
（ｂ）ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量増加に及ぼす効果を測定する段階を含むことを特徴とする。
【００３８】
前記にてＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量増加とは、前記ポリペプチドをエンコードする遺伝子の発現が増加されることを介して、細胞内に存在する前記ポリペプチドの量が増加することを意味する。従って、本発明における候補物質は前記ポリペプチドの発現を促進する特性を有する物質である。前記候補物質は蛋白質ばかりでなく、天然で分離されるか又は化学的に合成された化合物又は抽出物を含む。
【００３９】
ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を測定する方法は、当業界に公知の多様な方法を使用できる。例えば、これに限定はされないものの、共−免疫沈澱法（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ），ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及びフルオレセンス アクティベイティドセルソーティング法（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【００４０】
さらに、本発明のポリペプチドを標的としたスクリーニング方法は、高効率スクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ＨＴＳ）を適用できる。ＨＴＳは多数の候補物質を同時に試験し、多数の候補物質の生物学的活性に対して同時に又は殆ど同時にスクリーニングする方法である。特定様態として９６−ウェルマイクロタイタープレート又は１９２−ウェルマイクロタイタープレートで細胞株を培養し、ここに複数個の候補物質を処理して、免疫化学的方法によりＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの発現程度を測定できる。このフォーマットでは９６回の独立的な試験を９６個の反応ウェルを含む単一の８ｃｍ×１２ｃｍプラスチックプレートの上で同時に行える。前記ウェルは典型的に５０μｌ乃至５００μｌに至る検定容積を必要とする。プレートに加え、９６フォーマットを広範囲な均一系及び不均一系検定に適合するようにする為に、多数のゲージ、器具、ピペッタ、ロボット、プレート洗滌器及びプレート判読器が商業的に利用可能である。
【００４１】
本発明の一実施例では２９３ＦＴ細胞に、ＨＩＶウイルスを生産できるベクトルであるｐＮＬ４−３ＧＦＰ及びＨＩＶ ＮＣ蛋白質を発現するｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルを導入して形質転換し、前記形質転換された２９３ＦＴ細胞で増殖されるＨＩＶウイルスの数を確認した。その結果、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を発現する細胞では、そうでない細胞に比べて約１００倍以上のＨＩＶ増殖抑制効果があることが分かった（実施例１及び図１参照）。
【００４２】
本発明の他の実施例では、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むｇａｇ欠失突然変異体を発現する６種のベクトルを製造し、これを２９３ＦＴ細胞にｐＮＬ４−３ＧＦＰベクトルと共に形質転換した後、前記形質転換された２９３ＦＴ細胞で増殖されるＨＩＶウイルスの数を確認した。その結果、前記欠失突然変異体を発現する細胞では、そうでない細胞に比べて約５倍乃至７０倍以上のＨＩＶ増殖抑制効果があることが分かった（実施例２及び図５参照）。
【００４３】
前記のような本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質の効果を基に、本発明はＨＩＶ ＮＣ蛋白質をこれを必要とする個体に有効な量で投与することを含むＡＩＤＳの予防又は治療方法を提供する。
【００４４】
本発明で“有効な量”とは、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質が投与対象である個体内でＡＩＤＳの予防又は治療する効果を示す量を言い、前記“個体”とは、哺乳動物、特に人間を含む動物を意味する。前記個体は治療が必要な患者でもあり得る。
【００４５】
本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質は前記記載した効果の内、望む効果が導出されるまで投与することができ、当業界に公知された方法により多様な経路で投与し得る。つまり、経口又は非経口、例えば、口腔、筋肉内、静脈内、皮内、動脈内、骨髄内、隔膜内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下又は皮下投与されるか又は胃腸管、粘膜又は呼吸器に投与し得る。
【００４６】
さらに、本発明はＡＩＤＳ治療剤を製造する為の、ＨＩＶ ＮＣ蛋白質の用途を提供する。ＡＩＤＳ、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質及びこれの効果に対しては前記にて記載した通りである。
【００４７】
さらに、本発明はプロモータ、及びプロモータと機能発現可能に連結されたＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクトルを、これを必要とする個体に有効な量で投与することを含むＡＩＤＳ予防又は治療方法を提供する。また本発明は、ＡＩＤＳ治療剤を製造する為のプロモータ、及びプロモータと機能発現可能に連結されたＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクトルの用途を提供する。前記ポリヌクレオチド、発現ベクトル、個体、有効な量及びＡＩＤＳに対しては前記にて記載した通りである。
【発明の効果】
【００４８】
従って、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドは、過発現の際、ＨＩＶの増殖を抑制する効果を有する。従って、本発明はＨＩＶの増殖を抑制する新たな手段を提供するばかりでなく、ＡＩＤＳの予防又は治療の為の新たな方法を提供する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１はＨＩＶ ＮＣ蛋白質のＨＩＶ増殖抑制効果を示した図である。
【図２】図２は本発明のｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣ発現ベクトルの製作過程を示した模式図である。
【図３】図３は本発明のｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣ発現ベクトルの製作過程を示した模式図である。
【図４】図４はＨＩＶＮＣ蛋白質を含む６種のｇａｇ欠失突然変異体を示したものであり、この時、ＨＩＶｇａｇ蛋白質を構成する各ドメインの略称は下記の通りである：ＭＡ（マトリックス：Ｍａｔｒｉｘ），ＣＡ（キャプシド：Ｃａｐｓｉｄ），Ｐ２（Ｐ２ドメイン：ｄｏｍａｉｎ），ＮＣ（ヌクレワキャプシド：Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ），Ｐ１（Ｐ１ドメイン：ｄｏｍａｉｎ），Ｐ６（Ｐ６ドメイン：ｄｏｍａｉｎ）。
【図５】図５はＨＩＶＮＣ蛋白質を含む６種のｇａｇ欠失突然変異体のＨＩＶ増殖抑制効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記の実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
＜実施例１＞
ＮＣ蛋白質のＨＩＶ増殖抑制効果確認
＜１−１＞ＮＣ蛋白質を発現する形質転換細胞製作
形質転換に使用された２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）は１０％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ），１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％非必須アミノ酸を含有したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）培地で３７℃、５％ＣＯ2 の条件で培養した。２９３ＦＴ細胞を６−ｗｅｌｌプレートで２４時間培養後、ｐＮＬ４−３ＧＦＰベクトル及びｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルでリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）２０００プロトコルにより形質転換をさせた。この際、ＮＣ蛋白質を生産しない対照群としてｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルの代りにｐＬＰ１/０ベクトル（ｐＬＰ１ベクトルになにも挿入していないベクトル）を使用した。形質転換方法は下記の通りである：細胞を６−ｗｅｌｌプレートで約９０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）程度まで培養した。ｐＮＬ４／３ＧＦＰベクトル１μｇとｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトル２μｇとの混合物、ｐＮＬ４／３ＧＦＰベクトル１μｇとｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトル３μｇとの混合物、及び対照群としてｐＮＬ４／３ＧＦＰ１μｇとｐＬＰ１／０２μｇとの混合物をそれぞれ用意した後、２５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈した。これとは別に９μｌのリポフェクタミン２０００を２５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭに希釈した後、室温で５分間放置した。その後、希釈されたリポフェクタミン２０００を前記ベクトルの混合物に入れ、約３０分間放置した。６−ｗｅｌｌプレートで培養した細胞を５００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗滌した後、再度５００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地に入れた。前記にて混合したそれぞれのベクトルとリポフェクタミン２０００の混合物をそれぞれの培地に入れて３７℃、５％ＣＯ2 の条件で培養した。
【００５２】
形質転換に使用されたベクトルに対して説明すれば下記の通りである：ｐＮＬ４−３ＥＧＦＰベクトルはＮｅｆ遺伝子の半分がＥＧＦＰリポータ遺伝子で代替されたことを除いては、全てのＨＩＶ−１の遺伝子を含んでおり、組替えＨＩＶウイルスを生産できるベクトルである。このベクトルは公知の文献（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２３３：２８８−２９２）に詳細に記載されている。ｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルはＮＣ蛋白質を発現させる為のベクトルであり、ｐＬＰ１／０ベクトルは前記ｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルでＮＣ遺伝子に該当する部分が挿入されていないベクトルである。
【００５３】
＜１−２＞ＮＣの発現に伴うＨＩＶ増殖速度測定
前記実施例＜１−１＞で形質転換された２９３ＦＴ細胞の培地を、形質転換した後５乃至６時間経過後にピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）が含有されたＤＭＥＭ培地に代替した。その後、それぞれ６時間、１２時間、２４時間、３６時間、及び４８時間経過後、培地からサンプルを収得してウイルスの含有程度をＥＬＩＳＡ分析を介して測定した。
【００５４】
前記ＥＬＩＳＡ分析は、ビロノスチカＨＩＶ−１抗体ｐ２４ＥＬＩＳＡキット（Ｖｉｒｏｎｏｓｔｉｋａ ＨＩＶ−１ ａｎｔｉｇｅｎ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｓ，フランス）を利用して製造社の指針に従って行った：具体的にはそれぞれの培地サンプルをキットのウェルに移して培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）し、ホスフェートバッファ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，０．１７Ｍ ＫＨ2 ＰＯ4 、０．７２Ｍ Ｋ2 ＨＰＯ4 ）１００μｌを混合して３０秒間放置する方法で４回洗滌した。ここに、ｐ２４抗体を入れて、３７℃で１時間反応させ、再度ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体を入れ、３７℃で１時間反応させた。ここに、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ）を入れて、抗体複合体と１０分間接合させた。これを８０ｐｇ／ｍｌより５ｐｇ／ｍｌまで２倍段階希釈して、４５０ｎｍで吸光度を測定してそれぞれの試料内のウイルスの量を測定した。
【００５５】
その結果、図１及び下記表１（単位：ｐｇ／ｍｌ）に示された通り、ＮＣ蛋白質がＨＩＶウイルスの生産を濃度依存的に抑制することが分かった。特に、細胞の形質転換から４８時間経過時に３μｇのＮＣ蛋白質発現ベクトル（ｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトル）を添加した場合は、ＮＣを発現しない細胞に比べて約１００倍以上の増殖抑制効果を示した。このような結果は、ＮＣ蛋白質がＨＩＶの増殖を抑制する抗ウイルス製剤として利用できることを示している。
【００５６】
【表１】
【００５７】
＜実施例２＞ＮＣ蛋白質を含むＧａｇ欠失突然変異体のＨＩＶ増殖抑制効果確認
＜２−１＞Ｇａｇ欠失突然変異体の製造
ＮＣ蛋白質を含むＧａｇ欠失突然変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）がＨＩＶ増殖抑制に及ぼ影響を察する為、６種のＧａｇ欠失突然変異体を製造した。ｐＬＰ１の配列情報を利用して図２での通り、ＮＣ蛋白質を含むＧａｇ欠失突然変異体を製造する為に、下記表２の通りのＰＣＲプライマーをデザインした。
【００５８】
【表２】
【００５９】
６種の欠失突然変異体は前記表２のそれぞれのプライマー組合わせを利用し、ｐＬＰ１ベクトルを鋳型として下記のような条件でのＰＣＲにより増殖された：９５℃で５分間前変性、９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒の３５回増幅及び７２℃５分の延長（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）。増幅されたそれぞれのＰＣＲ産物は、ｐｍｌＩとＢｓｐＥＩで切断してｐＬＰ１のｐｍｌＩ及びＢｓｐＥＩ制限酵素部位にクローニングし、これをそれぞれｐＬＰ１−Ｄ１乃至ｐＬＰ１−Ｄ６とした。
【００６０】
＜２−２＞ＮＣ蛋白質発現に伴うＨＩＶ増殖速度測定
前記実施例＜２−１＞で製造されたそれぞれのＧａｇ欠失突然変異体の発現時ＨＩＶ増殖速度に及ぼす影響を測定する為に、ｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣベクトルの代りに前記突然変異体を発現するｐＬＰ１−Ｄ１乃至ｐＬＰ１−Ｄ６ベクトルを、それぞれ１μｇずつ使用したこと及び、ＤＭＥＭ培地に代替してから２４時間経過後に、培地からサンプルを収得して測定したこと以外には前記実施例＜１−１＞及び＜１−２＞の方法の通りにして測定した。
【００６１】
その結果、下記図５及び表３（単位：ｐｇ／ｍｌ）の通り、ＮＣ蛋白質を含む６種のＧａｇ欠失突然変異体全てＨＩＶウイルスの生産を抑制することが分った。このような結果は、ＮＣ蛋白質自体のみならず、ＮＣ蛋白質が含まれたペプチドがＨＩＶの増殖を抑制する効果があることを示した。
【００６２】
【表３】
＜産業上利用可能性＞
【００６３】
前記の通り、本発明のＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドは、過発現時ＨＩＶの増殖を抑制する効果を有する。従って、本発明はＨＩＶの増殖を抑制する新たな手段を提供するばかりでなく、ＡＩＤＳ予防及び治療の為の新たな方法を提供する効果がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むＡＩＤＳ予防及び治療用組成物。
【請求項２】
前記ＨＩＶ ＮＣ蛋白質は配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項第１項記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドは配列番号２乃至配列番号７からなる群より選ばれたことを特徴とする請求項第１項記載の組成物。
【請求項４】
プロモータ、及び該プロモータと機能発現可能に連結されたＨＩＶ ＮＣ（蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクトルを有効成分として含むＡＩＤＳ予防及び治療用組成物。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは配列番号８乃至配列番号１４からなる群より選ばれた配列で表示される塩基配列を有することを特徴とする請求項第４項記載の組成物。
【請求項６】
前記発現ベクトルはｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣであることを特徴とする請求項第４項記載の組成物。
【請求項７】
ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を増加させることによりＨＩＶウイルスの増殖を抑制する方法。
【請求項８】
前記ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量の増加は、ＨＩＶ ＮＣ遺伝子を含むポリヌクレオチドの発現を増加させることによる請求項第７項記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＩＶ ＮＣ遺伝子を含むポリヌクレオチドの発現の増加は、プロモータ、及び該プロモータと機能発現可能に連結されたＮＣ蛋白質をエンコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含有する発現ベクトルで細胞を形質転換することにより行われることを特徴とする請求項第８項記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドは配列番号１乃至配列番号７からなる群より選ばれた配列で表示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項第７項乃至第９項の内いずれか１つの項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＩＶ ＮＣ遺伝子は配列番号８で表示される塩基配列を有することを特徴とする請求項第８項又は第９項記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドは配列番号８乃至配列番号１４からなる群より選ばれた配列で表示される塩基配列を有することを特徴とする請求項第８項乃至第９項記載の方法。
【請求項１３】
前記発現ベクトルはｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣであることを特徴とする請求項第９項記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを発現する組替え細胞と候補物質を培養する段階及び；
（ｂ）ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量増加に及ぼす効果を測定する段階を含むことを特徴とするＡＩＤＳの予防及び治療物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）段階のＨＩＶＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量の増加はＨＩＶＮＣ遺伝子を含むポリヌクレオチドの発現が増加することを特徴とする請求項第１４項記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量は共−免疫沈澱法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ），ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット及びフルオレセンス アクティベイティドセルソーティング法（ＦＡＣＳ）で測定することを特徴とする請求項第１４項記載の方法。
【請求項１７】
ＡＩＤＳ治療剤を製造する為のＨＩＶ ＮＣ蛋白質の用途。
【請求項１８】
有効量のＨＩＶ ＮＣ蛋白質を、必要とされる対象に投与することを含む、ＡＩＤＳの予防及び治療方法。
【請求項１】
ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを有効成分として含むＡＩＤＳ予防及び治療用組成物。
【請求項２】
前記ＨＩＶ ＮＣ蛋白質は配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項第１項記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドは配列番号２乃至配列番号７からなる群より選ばれたことを特徴とする請求項第１項記載の組成物。
【請求項４】
プロモータ、及び該プロモータと機能発現可能に連結されたＨＩＶ ＮＣ（蛋白質を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクトルを有効成分として含むＡＩＤＳ予防及び治療用組成物。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは配列番号８乃至配列番号１４からなる群より選ばれた配列で表示される塩基配列を有することを特徴とする請求項第４項記載の組成物。
【請求項６】
前記発現ベクトルはｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣであることを特徴とする請求項第４項記載の組成物。
【請求項７】
ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量を増加させることによりＨＩＶウイルスの増殖を抑制する方法。
【請求項８】
前記ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量の増加は、ＨＩＶ ＮＣ遺伝子を含むポリヌクレオチドの発現を増加させることによる請求項第７項記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＩＶ ＮＣ遺伝子を含むポリヌクレオチドの発現の増加は、プロモータ、及び該プロモータと機能発現可能に連結されたＮＣ蛋白質をエンコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含有する発現ベクトルで細胞を形質転換することにより行われることを特徴とする請求項第８項記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドは配列番号１乃至配列番号７からなる群より選ばれた配列で表示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項第７項乃至第９項の内いずれか１つの項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＩＶ ＮＣ遺伝子は配列番号８で表示される塩基配列を有することを特徴とする請求項第８項又は第９項記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドは配列番号８乃至配列番号１４からなる群より選ばれた配列で表示される塩基配列を有することを特徴とする請求項第８項乃至第９項記載の方法。
【請求項１３】
前記発現ベクトルはｐＬＰ１／ｏｐｔｉＮＣであることを特徴とする請求項第９項記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドを発現する組替え細胞と候補物質を培養する段階及び；
（ｂ）ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量増加に及ぼす効果を測定する段階を含むことを特徴とするＡＩＤＳの予防及び治療物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）段階のＨＩＶＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量の増加はＨＩＶＮＣ遺伝子を含むポリヌクレオチドの発現が増加することを特徴とする請求項第１４項記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＩＶ ＮＣ蛋白質を含むポリペプチドの細胞内量は共−免疫沈澱法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ），ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット及びフルオレセンス アクティベイティドセルソーティング法（ＦＡＣＳ）で測定することを特徴とする請求項第１４項記載の方法。
【請求項１７】
ＡＩＤＳ治療剤を製造する為のＨＩＶ ＮＣ蛋白質の用途。
【請求項１８】
有効量のＨＩＶ ＮＣ蛋白質を、必要とされる対象に投与することを含む、ＡＩＤＳの予防及び治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５２０８５８（Ｐ２０１０−５２０８５８Ａ）
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９５１８（Ｐ２００９−５４９５１８）
【出願日】平成２０年２月１３日（２００８．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／０００８２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０００６１
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０９１７６２１５）
【出願人】（５０９１７６２２６）エビクスジェン インク． (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１３日（２００８．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／０００８２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０００６１
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０９１７６２１５）
【出願人】（５０９１７６２２６）エビクスジェン インク． (2)
【Ｆターム（参考）】
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