ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓＮＲＲＬＢ−３０６５６に基づく生物高分子、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓＮＲＲＬの培養方法、ならびに、本生物高分子の産生方法
土壌から単離され、１種の Lactococcus lactis 株 NRRL B-30656 として同定され、これは、蔗糖を含有する培地において成育すると、細胞外転移酵素を産生し、これは、精製され、蔗糖を有する培地において、温度およびｐＨの適切な条件において、ブドウ糖（グルコース）と果糖（フルクトース）との生物高分子を産生する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．本発明の分野
本発明は、ブドウ糖（グルコース）および果糖（フルクトース）の高分子、ならびに、その調製方法に関し、これは Lactococcus lactis 株を使用する。細胞外多糖は、ブドウ糖および果糖の天然高分子である。これら高分子は、諸種の植物や微生物に含まれ、食品および医薬品業界で、乳化剤、粘稠剤、および界面活性剤として利用される。
【背景技術】
【０００２】
２．背景技術の記述
フルクタンは天然に一般的に、果糖の分子間結合の型により異なる二形態で産出する。イヌリンは、植物に含まれる形では、果糖分子の列で形成され、ベータ（β）２−１結合による単位である。レバンは、微生物産物としての形では、β２−６結合により単位とされる果糖分子の列を持つ。植物フルクタンはより小さいが（約１００残基）、微生物レバンは３，０００，０００以上の残基を含有する（Pontis et al., 1985, Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants, In: Dey and Dixon (eds.) Ch,5, p.205. New York, Academic Press）。
【０００３】
微生物レバンは、蔗糖を基礎とする基質と共に、種々の微生物により産生される。
Acetobacters（Loewenberg, et al., 1957, Can. J. Microbiol., Vol.3, p.643）
Achromobacter sp.（Lindberg, G. 1957, Nature, Vol.180, p.1141）
Aerobacter aerogenes（Srinivasan, et al., 1958, Science, Vol.127, p.143）
Phytobacterium vitrosum（Belval, et al., 1947. 1948, Compt. Rend, Vol.224, p.847 および Vol.226, p.1859）
Xanthomonas pruni（Cooper, et al., 1935, Biochem, J. Vol.29, p.2267）
Bacillus subtilis（Dedonder, R., 1966, Meth, Enzymol., Vol.8, p.500 および Tanka, et al., 1979, J. Biochem., Vol.85, p.287）
Bacillus polymyxa（Hestrin et al., 1943, Biochem. J., Vol.3, p.450）
Aerobacter levanicum（Hestrin, et al., Ibid.）
Streptococcus sp.（Corrigen et al., 1979, Infect. immun., Vol.26, p.387）
Pseudomonas sp.（Fuchs, A., 1956, Nature, Vol.178, p.92）
Corynebacterium laevaniformans（Dias et al., 1962, Antonie Van Leewenhoeck, Vol.28, p.63）
【０００４】
産業に利用される目的での、非常に低濃度および低純度のレバンの産生に関する、別の報告がある。
【０００５】
キサンタンおよびデキストリンゴムのような他の生物高分子が広範に、エマルションおよびアイスクリームのような発泡体における、サラダのドレッシングにおける安定剤などとして、食品業界において利用されてきた（Sharma, S.C., 1981, １月，J. Food Tech., p.59）。微生物により産生された細胞外多糖には諸種の利用法があり、そのコストは潜在的に低い。
【０００６】
一般的に、Actinomyces viscosus 又は Aerobacter levanicum 株を使用しての蔗糖の醗酵により、少量のレバンを産生する。Bacillus polymixa は一般的に、諸種の形の高分子のヘテロ多糖を産生する。遺伝子的に修飾された E. coli 株が、レバンを産生させる為に利用されてきた（Gay, P. et al., 1983, J. Bacteriol., Vol.153, p.1424）。また、好気性醗酵を用いる他の方法も、レバンの産生に利用されてきた（Jeanes, et al., 米国特許第2,673,828号明細書；Gaffor, et al., 米国特許第3,879,545号明細書；Ayerbe, et al., 米国特許第4,399,221号明細書）。これらの過程（方法）は、低収率な産生および混入の問題を発生させる不都合があるので、より高い生産性を可能にする産業用過程（プロセス）が必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明の主な目的は、転移酵素により産生される生物高分子を調製することであり、これは、ブドウ糖および果糖に関する転移酵素活性を持ち、Lactococcus lactis NRRL B-30656 株から産生され、その高い転移活性により特徴付けられ、これは、進捗が簡潔で容易な産生方法により該生物高分子を得ることを可能にする。その産生は、次の段階（経過）からなる。
第一相：この微生物の成育に適した培養培地において、Lactococcus lactis NRRL B-30656 株を用いての醗酵。
第二相：遠心又は超微細濾過による、細胞外酵素の回収。
第三相：基質および酵素抽出物として蔗糖を利用する醗酵反応による、該生物高分子の産生。
第四相：溶媒を使う沈殿、又は、超微細濾過による、該生物高分子の精製、その後のこの産物の乾燥。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の目的は、多糖の混入のない、純粋な生物高分子を生産することである。該生物高分子は、土壌から単離された Lactococcus lactis 株によって産生される高分子として記述される。この株は高い転移活性を有し、これは簡潔な過程により、該生物高分子を得ることを可能にし、９５％以上の純度を有する。
【０００９】
本微生物
本発明では、Lactococcus lactis NRRL B-30656 株は、炭素源としての蔗糖を含有した培地を利用した選択的過程によって土壌から単離されたが、ここでは、転移酵素を産生するこれら微生物がこの基質を利用でき、そのコロニーに粘液質の外観を与えている高分子を産生できる。この培地から、この特徴を有する微生物が選択され、連続的な稀釈およびプレート中での単離による単離技術により、精製される。この株から、本発明において用いられる Lactococcus lactis NRRL B-30656 株が得られた。
【００１０】
この発明に関して、Lactococcus lactis NRRL B-30656 株は、ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＳＥＲＶＩＣＥ ＰＡＴＥＮＴ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ ＮＲＲＬ寄託銀行（機関）に寄託されており、登録番号 NRRL B-30656 と帰属されたものである。この株は、ブドウ糖２〜６Ｕ／ｍＬの転移活性を持つ酵素を産生し、蔗糖を基質に用いて、ブドウ糖と果糖との重量分子量９００〜１，１００キロダルトンを有する高分子を産生する。
【００１１】
該株は、NRRL B-30656 と命名された。この株は単離され、コロンビア国立大学バイオテクノロジー部門（ＩＢＵＮ）において、特徴付けられた。該株は４℃において、培養培地を有するペトリ皿に保存され、その組成は：
蔗糖 １０〜４０ｇ／Ｌ
イースト抽出物 ７〜３０ｇ／Ｌ
リン酸カリウム ５〜２０ｇ／Ｌ、０．０５〜０５ｇ／Ｌ
鉱物塩 １０〜１００ｐｐｍ
であり、ｐＨ５〜９である。
【００１２】
この微生物は、グラム染色を利用しながら光学顕微鏡、および、酢酸ウランおよびクエン酸鉛を用いた陽性染色を利用しながら透過電子顕微鏡により、特徴付けられた。その生化学的な特徴は、コンピューターシステムＭｉｃｒｏＳｃａｎを用いて、Ｂｅｒｇｅｙ（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｗ．；Ｓｈａｒｐｅ，Ｅ．；Ｈｏｌｔ，Ｊ．，１９９４，Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｌｉａｍ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）により決められた微生物学マニュアル中の記述に従って実施された。
【００１３】
本培養培地
Lactococcus lactis NRRL B-30656 株を用いた発酵用の本培養培地のデザイン（構成）および最適化のために、その炭素源、窒素源、および所定の微量元素の間でバランスをとった。本培養培地は本微生物に、前記酵素を増加させ産生させるのに必要とされる栄養を供給する。
【００１４】
本培養培地組成の評価結果として、以降の濃度が確立された。
【００１５】
【表１】
【００１６】
ｐＨは塩酸により、ｐＨ５〜９に合わせる。培地は１２１℃において、１５分間無菌化される。
【００１７】
醗酵
予備接種は、該接種量の５〜２０％に対応し、グリセロール２０％を有する培地に−７０℃にて保存された純粋株から活性化させる。接種時間は１０〜３６時間を超えず、この間に、該予備接種の純度を検証するべきである（証明しなくてはならない）。この培養は、攪拌（振とう）フラスコ中で実施され、全容積の５〜２０％を占めており、２０〜４０℃にて、１００〜４００ｒｐｍの攪拌で、軌道攪拌機中でインキュベートされる。培養器の数と大きさとにより、必要な接種数が決められる。
【００１８】
該酵素の成育および産生条件は：
温度２０〜４０℃
攪拌１００〜４００ｒｐｍ（醗酵の進展次第である）
である。
【００１９】
通風
該醗酵を促進する微生物は好気性であるから、その培養は、０．１〜１通気量／培地量／分（ｖｖｍ）で通気されねばならず、そのｐＨは該醗酵中５〜９に保たれる。この産生過程の結果として、成分が組み合わさった培養培地が得られ、バイオマス最終濃度１０〜３０ｇ／Ｌ（湿ったままの重量）に到達し、転移活性２〜６Ｕ／ｍＬを有し、これは６〜２４時間後に達成される。
【００２０】
酵素の回収
本細胞外酵素は、３，０００〜１０，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心により、もしくは、該バイオマスを分離する濾過により、回収される。このようにして、該酵素抽出物は、転移酵素活性２〜６Ｕ／ｍＬを有する。
【００２１】
生物高分子産生
酵素反応
該反応条件は、次の通りである。
反応培地：
５０〜３００ｍＭホスフェートバッファー（緩衝液）：ｐＨ５〜９
基 質：５〜４０％の蔗糖
酵 素 量：１０〜４０％ｖ／ｖ酵素抽出物
反応時間：１２〜４８時間
攪 拌：１００〜４００ｒｐｍ
【００２２】
本生物高分子の回収および精製
該酵素反応以後、温度を４℃に下げ、本生物高分子を２種の形で回収できる。
【００２３】
ａ）溶媒を使った沈殿
冷たくした反応混合物に、９６％エタノールを、攪拌しながら加える。エタノール量は、反応混合物体積の１．２〜２．０倍のエタノール量に対応する。
【００２４】
沈殿した生物高分子は、脱イオン化し蒸留した半量の水に再び溶解され、反応混合物体積の１．２〜２．０倍量のエタノールを用いて、新たに沈殿される。
【００２５】
沈殿した生物高分子は、１／３量の水に再び溶解され、凍結乾燥又は６０℃での強制送風による乾燥により、湿度５〜６％まで乾燥される。
【００２６】
ｂ）超微細濾過
該反応混合物は、残ったブドウ糖および果糖を除き終えるまで、１０，０００ダルトン
以上の大きさの孔を有する再生セルロース膜での超微細濾過プロセスに付される。その後
、本生物高分子は、アスピレーションによる乾燥過程に付される。
【００２７】
本生物高分子は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および、３０℃での１０
％溶液粘度により、特徴付けられる。本生物高分子は、SC1011 Shodex カラム、７０℃、
流速０．６ｍＬ／分、移動相としてＨＰＬＣ級（ＨＰＬＣグレード）の水を用いると、保
持時間７〜７．５分を有する。
【００２８】
３０℃での１０％溶液粘度は、粘度計 ViscoEasy, Serie L, Schott, Ref.28.541.120
L2軸, 50 rpm を用いると、４００〜８００センチポイズ（ｃＰ）の範囲中にある。
【００２９】
粒子の平均的な大きさ＜＜ｄｖｓ＞＞（直径／体積／表面積）は、２２４ミクロンである。本生物高分子は、蔗糖のものに近い真の密度を持つ（１．５ｍｇ／ｍＬ）。粒子間の高い多孔性４８％を有する物質（材料）である。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例が、本発明を例示する。
【００３１】
実施例１
本生物高分子産生微生物の単離および同定
生物高分子産生バクテリアが、土壌から単離され、Lactococcus lactis NRRL B-30656 として同定された。１０ｇのサンプルが、該土壌から再び選択され、炭素源として蔗糖を含有する１００ｍＬの液体培地において成育され、３０℃において攪拌しながら、２４時間インキュベートされた。成育したら、生理食塩水中、１：１０稀釈液を４つ調製し、その１／４（つまり１つの）稀釈液に接種する。この培養は、同一組成を有する固形培地において同様に行われ、高分子産生を提示したコロニーが、選択的に単離される。その後、該培養は新鮮培地に移され、２４時間培養された。一旦単離されると、該微生物は、２０％グリセロールを有する蔗糖培地中に、−７０℃において、凍結乾燥により、１０％脱脂粉乳と共に保存される。
【００３２】
単離され、蔗糖固形培地において培養された株は、顕微鏡による以下の特徴を提示した。
丸いコロニー
ゴム状の様相
画定された境界線（縁）
およそ２〜３ｍｍの直径（２４時間の培養で）
透明なクリーム色
顕微鏡レベルで、グラム染色を通じてグラム陽性菌が観察され、これらは時折個別に見られるが、一般的にはまとまりを形成しているのが見られる。
【００３３】
透過電子顕微鏡による特徴付けは、その細胞壁を区別できる細胞の周囲の細胞を観察できるようにするが、電子密度顆粒、鞭毛、線毛等のような特定構造は観察されない。
【００３４】
本発明の株は、Lactococcus lactis NRRL B-30656 であり、微生物ＧＲＡＳＳとしてカタログに載っており、以下の生化学的特徴を有する。
【００３５】
【表２】
【００３６】
実施例２
本酵素産生
１．醗酵
ａ）本微生物の活性化
本転移酵素を得るには、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を使用する。このバクテリアは、−７０℃の冷凍保存溶液（グリセロール）中で保存された。この株は、常温で徐々に解凍され、蔗糖培地５０ｍＬ中で、３０℃の温度で１２時間、１８０ｒ．ｐ．ｍの攪拌で、活性化された。この培養液５ｍＬを用いて、２種の接種が実施され、第１では、蔗糖寒天中、３０℃にて２４時間インキュベートし、粘液質の特徴を観察し、４℃にて保存し、第２では、１００ｍＬの蔗糖液中、３０℃にて１２時間インキュベートし、これが最終的に、１ｍＬ容れる遠心管中に配分され、２０％Ｖ／Ｖのグリセロールと共に−７０℃にて貯蔵し、その後の醗酵に利用された。最初の培養の残りの４５ｍＬを、凍結乾燥によって５ｍＬのバイアル中に保存し、無菌脱脂粉乳を養分として利用しつつ、１０％濃度とし、４℃にて保存する。
【００３７】
ｂ）予備接種および接種の準備
このロットに該当している同一組成の培地で、予備接種を準備する。蔗糖固形培地中で
貯蔵された微生物を採取し、１（単位）体積の液体培地中で、接種体積の５〜２０％まで
接種し、２５〜３５℃において、１００〜４００ｒ．ｐ．ｍで攪拌しながら、１２〜２４
時間培養する。
【００３８】
【表３】
【００３９】
該微生物は、該発酵体積の５〜１０％播種され、前段階の培地の肉眼での密度０．７ｕ．ａ．まで、稀釈度１：１０において成育され、６００ｎｍにおいて読み取られ、無菌培養培地がブランクとして利用される。
【００４０】
該発酵中、予備接種および接種を、これが実施される発酵機の容積に鑑みて実施することが必要であり、最終接種におけるような形で（産生用該発酵機に入れられた培養培地の１０％）、細胞のこの反応機中での潜伏相を避けるための必要量を得、該予備接種と先立つ接種との間の体積１：１０の関係、もしくは、接種するために充分な細胞密度を保存するよう試みながら、その純度における厳密な制御、および、接種もしくは予備接種として用いられる培養の栄養状態を維持する。
【００４１】
ｃ）培養用および接種用の培地の調製
該培養培地のｐＨが、ｐＨ７．０に調整される。該予備接種を準備するための培地を有する長頸フラスコが、１２１℃１５分間の無菌化に付される。
【００４２】
ｄ）操作条件
活性成分産生は、この確立した培地を利用しているロットにおける発酵により実施される。その操作条件が、以下の表中にある。
【００４３】
【表４】
【００４４】
２．本酵素の回収
ａ）遠心
本細胞外酵素は、５，０００ｒｐｍ１５分間の遠心で回収され、バイオマスを分離させる。酵素抽出物は、２〜６Ｕ／ｍＬのブドウ糖転移酵素活性を有する。
【００４５】
ｂ）超微細濾過
醗酵上清を回収するもう１つ別の方式は、０．４５〜２ミクロンの孔の大きさを有する
超微細濾過膜の使用による。
【００４６】
実施例３
本生物高分子の産生および回収
ａ）酵素反応
該反応条件は、次の通りである。
反応培地：
５０〜２００ｍＭホスフェート緩衝液のｐＨ：５〜７
基質 ：蔗糖８〜２０％
酵素量 ：酵素抽出物１０〜３０％ｖ／ｖ（２００〜５００Ｕ／Ｌ）
反応時間 ：２０〜４０時間
攪拌 ：１００〜４００ｒｐｍ
【００４７】
本酵素は遠心で分離され、８〜２０％の蔗糖を含有する培地において、ｐＨ５〜８、温度２５〜３５℃にて２０〜３０時間置かれ、３０〜６０ｇ／Ｌの濃縮高分子を得、その基質に関し４０〜６０％の収率に対応している。報告されたその他の過程（方法、プロセス）では、該高分子産生に５〜１０日かかる。報告された微生物は、より低濃縮の高分子を産生する（表１）。
【００４８】
ｂ）本生物高分子の精製
該酵素反応後、温度を４℃に下げ、該生物高分子が、２つの形で回収され得る。
＃溶媒を用いた沈殿
冷たい反応混合物に、攪拌しながら、９６％エタノールを加える。加えられるエタノール量は、反応混合物体積につき、エタノール１．０〜３．０体積に対応する。
沈殿した生物高分子を、脱イオン化し蒸留した半量の水に再溶解させ、新たに、反応混合物体積につき１．０〜３．０体積のエタノールで沈殿させる。
沈殿した生物高分子を、１／３体積の水に再溶解させ、凍結乾燥により、もしくは、６０〜８０℃の強制送風による乾燥により、湿度５〜１０％まで乾燥させる。
【００４９】
【表５】
【００５０】
＃超微細濾過
該反応混合物は、１０，０００ダルトンより大きな孔の大きさを有する再生セルロース膜において、グルコース残渣およびフルクトース残渣の除去の終了まで、超微細濾過プロセスに付される。後に、該生物高分子は、アスピレーションによる乾燥プロセスに付される。
【００５１】
この微生物に関しての本生物高分子産生は基質濃度に依り、８〜２４％にて最適であり、そのより高い収率と共に、より高い純度を有する生物高分子を産生する（表２）。
【００５２】
【表６】
【００５３】
ｃ）乾燥
得られた最終生成物は白い粉（白色粉末）であり、凍結乾燥か、もしくは、８０℃以下の温度での乾燥熱によって乾燥され得る。
【００５４】
実施例４
本生物高分子の特徴付け
１．可溶性
該生成物は水溶性生物高分子で、最高５０％濃度まで、水性ゲルタイプの均一な分散体を形成し得る。１．０ｇの生物高分子は、３２ｍＬの５％塩酸、５０ｍＬの１０％水酸化ナトリウム、３０ｍＬの氷酢酸に溶ける。
【００５５】
エタノール、イソプロパノール、アセトン、鉱油、植物油、およびポリエチレングリコールには溶けない。
【００５６】
該生成物は沸点にて、０．５％蓚酸にやや溶ける。
【００５７】
２．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
＃浸透クロマトグラフィーで、１．５％の生物高分子溶液は、重量分子量９００〜１，１００ＫＤａを有し、カラム Shodex OHPak KB-803 で求められた。該クロマトグラフィー条件は、次の通りであった。
温 度：５５℃
移動相：ＮａＣｌ ０．１Ｍ 溶液
流 速：０．９ｍＬ／分
【００５８】
＃該高分子の純度は９５％より高く、次の条件下で、ＨＰＬＣにおいて尖ったピークにより証明される。カラム商品名ＳｈｏｄｅｘＳＣ１０１１。
移動相：蒸留し脱イオン化した水
流 速：０．６ｍＬ／分
温 度：７０℃
備 品：Waters510、屈折率検出器付き、商品名Waters2410
【００５９】
これらの条件下で、該生物高分子は、保持時間７〜７．５分を有する。
【００６０】
利用された比較基準は、分析用試薬級（グレード）の、ブドウ糖（グルコース）、果糖（フルクトース）、蔗糖、およびレバンであった。
【００６１】
＃該生物高分子は、ｐＨ２〜９の緩衝液との該高分子の接触後、ＨＰＬＣにより証明され
たｐＨ範囲の幅の中では安定である。
【００６２】
３．粘度
１０％溶液の粘度を３０℃おいて求め、粘度計 ViscoEasy, Serie L, Schott, Ref.28.541.120, Ｌ２軸, ５０ｒｐｍを用いた。分析したサンプルは、１，０００〜３，０００センチポイズ（ｃＰ）の範囲中の粘度を有した。擬似可塑性の振る舞い（挙動）を呈した（カッティングすると痩せる）。該生物高分子溶液の粘度は、カッターもしくは剪断機の速度を上げると減少し、温度を下げると増加する。
【００６３】
４．寸法の特徴
該生物高分子は、蔗糖のそれ（１．５ｍｇ／ｍＬ）に近い真の密度を持つ。粒子間で４８％の高い多孔性を有する物質（材料）である。粒子の平均的大きさ＜＜ｄｖｓ＞＞（直径／容積／表面積）は、２２４ミクロンである。
【００６４】
５．湿気の吸収
水分吸収能は、相対湿度に依り、６．１２ｍｇ／ｇ〜３５３．２０ｍｇ／ｇの間を上下する。このことはこれを、やや吸湿性の材料にする。高分子であり親水性であるその構造のために、該生物高分子は、水に触れると限りなく多孔性（スポンジ状）になることができ、含む水の量によって変化できる仕組みのシステムを形成することができ、果ては、その高粘度により特徴付けられる水っぽい分散体の形成に至る。
【００６５】
６．湿気
６０℃の真空炉（オーブン）中での乾燥で、１０％以下の水分が失われる。
【００６６】
７．熱的特徴
該生物高分子は、２点のガラス転移温度を有する。第１は２０℃〜３０℃で、第２は１９０℃〜２２０℃である。走査差動カロリー計によって、求められる。
【００６７】
８．微生物学的性質
該生物高分子は、次の微生物学的検体数を有する。
【００６８】
【表７】
【００６９】
９．使用
ａ）該生物高分子は、医薬産業において、稠密剤、粘稠剤、安定剤、拡散剤、皮膜形成剤、分解剤、代用血漿、潤滑剤、および抗生物質前駆体として、用いられ得る。
【００７０】
ｂ）該生物高分子は、食品産業において、粘稠剤、稠密剤、安定剤、拡散剤、繊維、ならびに、脂、油、および、エーテルおよびエステル主体の炭水化物の代用品として、用いられ得る。
【００７１】
ｃ）該生物高分子は、押出しにより得られる製品において、柔軟で生分解性の包装を生産するのに適したフィルムを形成するために、ならびに、水処理用凝固剤生産における射出もしくはモールドにより得られる生分解性製品を得ることにおいて、用いられ得る。
【技術分野】
【０００１】
１．本発明の分野
本発明は、ブドウ糖（グルコース）および果糖（フルクトース）の高分子、ならびに、その調製方法に関し、これは Lactococcus lactis 株を使用する。細胞外多糖は、ブドウ糖および果糖の天然高分子である。これら高分子は、諸種の植物や微生物に含まれ、食品および医薬品業界で、乳化剤、粘稠剤、および界面活性剤として利用される。
【背景技術】
【０００２】
２．背景技術の記述
フルクタンは天然に一般的に、果糖の分子間結合の型により異なる二形態で産出する。イヌリンは、植物に含まれる形では、果糖分子の列で形成され、ベータ（β）２−１結合による単位である。レバンは、微生物産物としての形では、β２−６結合により単位とされる果糖分子の列を持つ。植物フルクタンはより小さいが（約１００残基）、微生物レバンは３，０００，０００以上の残基を含有する（Pontis et al., 1985, Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants, In: Dey and Dixon (eds.) Ch,5, p.205. New York, Academic Press）。
【０００３】
微生物レバンは、蔗糖を基礎とする基質と共に、種々の微生物により産生される。
Acetobacters（Loewenberg, et al., 1957, Can. J. Microbiol., Vol.3, p.643）
Achromobacter sp.（Lindberg, G. 1957, Nature, Vol.180, p.1141）
Aerobacter aerogenes（Srinivasan, et al., 1958, Science, Vol.127, p.143）
Phytobacterium vitrosum（Belval, et al., 1947. 1948, Compt. Rend, Vol.224, p.847 および Vol.226, p.1859）
Xanthomonas pruni（Cooper, et al., 1935, Biochem, J. Vol.29, p.2267）
Bacillus subtilis（Dedonder, R., 1966, Meth, Enzymol., Vol.8, p.500 および Tanka, et al., 1979, J. Biochem., Vol.85, p.287）
Bacillus polymyxa（Hestrin et al., 1943, Biochem. J., Vol.3, p.450）
Aerobacter levanicum（Hestrin, et al., Ibid.）
Streptococcus sp.（Corrigen et al., 1979, Infect. immun., Vol.26, p.387）
Pseudomonas sp.（Fuchs, A., 1956, Nature, Vol.178, p.92）
Corynebacterium laevaniformans（Dias et al., 1962, Antonie Van Leewenhoeck, Vol.28, p.63）
【０００４】
産業に利用される目的での、非常に低濃度および低純度のレバンの産生に関する、別の報告がある。
【０００５】
キサンタンおよびデキストリンゴムのような他の生物高分子が広範に、エマルションおよびアイスクリームのような発泡体における、サラダのドレッシングにおける安定剤などとして、食品業界において利用されてきた（Sharma, S.C., 1981, １月，J. Food Tech., p.59）。微生物により産生された細胞外多糖には諸種の利用法があり、そのコストは潜在的に低い。
【０００６】
一般的に、Actinomyces viscosus 又は Aerobacter levanicum 株を使用しての蔗糖の醗酵により、少量のレバンを産生する。Bacillus polymixa は一般的に、諸種の形の高分子のヘテロ多糖を産生する。遺伝子的に修飾された E. coli 株が、レバンを産生させる為に利用されてきた（Gay, P. et al., 1983, J. Bacteriol., Vol.153, p.1424）。また、好気性醗酵を用いる他の方法も、レバンの産生に利用されてきた（Jeanes, et al., 米国特許第2,673,828号明細書；Gaffor, et al., 米国特許第3,879,545号明細書；Ayerbe, et al., 米国特許第4,399,221号明細書）。これらの過程（方法）は、低収率な産生および混入の問題を発生させる不都合があるので、より高い生産性を可能にする産業用過程（プロセス）が必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明の主な目的は、転移酵素により産生される生物高分子を調製することであり、これは、ブドウ糖および果糖に関する転移酵素活性を持ち、Lactococcus lactis NRRL B-30656 株から産生され、その高い転移活性により特徴付けられ、これは、進捗が簡潔で容易な産生方法により該生物高分子を得ることを可能にする。その産生は、次の段階（経過）からなる。
第一相：この微生物の成育に適した培養培地において、Lactococcus lactis NRRL B-30656 株を用いての醗酵。
第二相：遠心又は超微細濾過による、細胞外酵素の回収。
第三相：基質および酵素抽出物として蔗糖を利用する醗酵反応による、該生物高分子の産生。
第四相：溶媒を使う沈殿、又は、超微細濾過による、該生物高分子の精製、その後のこの産物の乾燥。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の目的は、多糖の混入のない、純粋な生物高分子を生産することである。該生物高分子は、土壌から単離された Lactococcus lactis 株によって産生される高分子として記述される。この株は高い転移活性を有し、これは簡潔な過程により、該生物高分子を得ることを可能にし、９５％以上の純度を有する。
【０００９】
本微生物
本発明では、Lactococcus lactis NRRL B-30656 株は、炭素源としての蔗糖を含有した培地を利用した選択的過程によって土壌から単離されたが、ここでは、転移酵素を産生するこれら微生物がこの基質を利用でき、そのコロニーに粘液質の外観を与えている高分子を産生できる。この培地から、この特徴を有する微生物が選択され、連続的な稀釈およびプレート中での単離による単離技術により、精製される。この株から、本発明において用いられる Lactococcus lactis NRRL B-30656 株が得られた。
【００１０】
この発明に関して、Lactococcus lactis NRRL B-30656 株は、ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＳＥＲＶＩＣＥ ＰＡＴＥＮＴ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ ＮＲＲＬ寄託銀行（機関）に寄託されており、登録番号 NRRL B-30656 と帰属されたものである。この株は、ブドウ糖２〜６Ｕ／ｍＬの転移活性を持つ酵素を産生し、蔗糖を基質に用いて、ブドウ糖と果糖との重量分子量９００〜１，１００キロダルトンを有する高分子を産生する。
【００１１】
該株は、NRRL B-30656 と命名された。この株は単離され、コロンビア国立大学バイオテクノロジー部門（ＩＢＵＮ）において、特徴付けられた。該株は４℃において、培養培地を有するペトリ皿に保存され、その組成は：
蔗糖 １０〜４０ｇ／Ｌ
イースト抽出物 ７〜３０ｇ／Ｌ
リン酸カリウム ５〜２０ｇ／Ｌ、０．０５〜０５ｇ／Ｌ
鉱物塩 １０〜１００ｐｐｍ
であり、ｐＨ５〜９である。
【００１２】
この微生物は、グラム染色を利用しながら光学顕微鏡、および、酢酸ウランおよびクエン酸鉛を用いた陽性染色を利用しながら透過電子顕微鏡により、特徴付けられた。その生化学的な特徴は、コンピューターシステムＭｉｃｒｏＳｃａｎを用いて、Ｂｅｒｇｅｙ（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｗ．；Ｓｈａｒｐｅ，Ｅ．；Ｈｏｌｔ，Ｊ．，１９９４，Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｌｉａｍ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）により決められた微生物学マニュアル中の記述に従って実施された。
【００１３】
本培養培地
Lactococcus lactis NRRL B-30656 株を用いた発酵用の本培養培地のデザイン（構成）および最適化のために、その炭素源、窒素源、および所定の微量元素の間でバランスをとった。本培養培地は本微生物に、前記酵素を増加させ産生させるのに必要とされる栄養を供給する。
【００１４】
本培養培地組成の評価結果として、以降の濃度が確立された。
【００１５】
【表１】
【００１６】
ｐＨは塩酸により、ｐＨ５〜９に合わせる。培地は１２１℃において、１５分間無菌化される。
【００１７】
醗酵
予備接種は、該接種量の５〜２０％に対応し、グリセロール２０％を有する培地に−７０℃にて保存された純粋株から活性化させる。接種時間は１０〜３６時間を超えず、この間に、該予備接種の純度を検証するべきである（証明しなくてはならない）。この培養は、攪拌（振とう）フラスコ中で実施され、全容積の５〜２０％を占めており、２０〜４０℃にて、１００〜４００ｒｐｍの攪拌で、軌道攪拌機中でインキュベートされる。培養器の数と大きさとにより、必要な接種数が決められる。
【００１８】
該酵素の成育および産生条件は：
温度２０〜４０℃
攪拌１００〜４００ｒｐｍ（醗酵の進展次第である）
である。
【００１９】
通風
該醗酵を促進する微生物は好気性であるから、その培養は、０．１〜１通気量／培地量／分（ｖｖｍ）で通気されねばならず、そのｐＨは該醗酵中５〜９に保たれる。この産生過程の結果として、成分が組み合わさった培養培地が得られ、バイオマス最終濃度１０〜３０ｇ／Ｌ（湿ったままの重量）に到達し、転移活性２〜６Ｕ／ｍＬを有し、これは６〜２４時間後に達成される。
【００２０】
酵素の回収
本細胞外酵素は、３，０００〜１０，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心により、もしくは、該バイオマスを分離する濾過により、回収される。このようにして、該酵素抽出物は、転移酵素活性２〜６Ｕ／ｍＬを有する。
【００２１】
生物高分子産生
酵素反応
該反応条件は、次の通りである。
反応培地：
５０〜３００ｍＭホスフェートバッファー（緩衝液）：ｐＨ５〜９
基 質：５〜４０％の蔗糖
酵 素 量：１０〜４０％ｖ／ｖ酵素抽出物
反応時間：１２〜４８時間
攪 拌：１００〜４００ｒｐｍ
【００２２】
本生物高分子の回収および精製
該酵素反応以後、温度を４℃に下げ、本生物高分子を２種の形で回収できる。
【００２３】
ａ）溶媒を使った沈殿
冷たくした反応混合物に、９６％エタノールを、攪拌しながら加える。エタノール量は、反応混合物体積の１．２〜２．０倍のエタノール量に対応する。
【００２４】
沈殿した生物高分子は、脱イオン化し蒸留した半量の水に再び溶解され、反応混合物体積の１．２〜２．０倍量のエタノールを用いて、新たに沈殿される。
【００２５】
沈殿した生物高分子は、１／３量の水に再び溶解され、凍結乾燥又は６０℃での強制送風による乾燥により、湿度５〜６％まで乾燥される。
【００２６】
ｂ）超微細濾過
該反応混合物は、残ったブドウ糖および果糖を除き終えるまで、１０，０００ダルトン
以上の大きさの孔を有する再生セルロース膜での超微細濾過プロセスに付される。その後
、本生物高分子は、アスピレーションによる乾燥過程に付される。
【００２７】
本生物高分子は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および、３０℃での１０
％溶液粘度により、特徴付けられる。本生物高分子は、SC1011 Shodex カラム、７０℃、
流速０．６ｍＬ／分、移動相としてＨＰＬＣ級（ＨＰＬＣグレード）の水を用いると、保
持時間７〜７．５分を有する。
【００２８】
３０℃での１０％溶液粘度は、粘度計 ViscoEasy, Serie L, Schott, Ref.28.541.120
L2軸, 50 rpm を用いると、４００〜８００センチポイズ（ｃＰ）の範囲中にある。
【００２９】
粒子の平均的な大きさ＜＜ｄｖｓ＞＞（直径／体積／表面積）は、２２４ミクロンである。本生物高分子は、蔗糖のものに近い真の密度を持つ（１．５ｍｇ／ｍＬ）。粒子間の高い多孔性４８％を有する物質（材料）である。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例が、本発明を例示する。
【００３１】
実施例１
本生物高分子産生微生物の単離および同定
生物高分子産生バクテリアが、土壌から単離され、Lactococcus lactis NRRL B-30656 として同定された。１０ｇのサンプルが、該土壌から再び選択され、炭素源として蔗糖を含有する１００ｍＬの液体培地において成育され、３０℃において攪拌しながら、２４時間インキュベートされた。成育したら、生理食塩水中、１：１０稀釈液を４つ調製し、その１／４（つまり１つの）稀釈液に接種する。この培養は、同一組成を有する固形培地において同様に行われ、高分子産生を提示したコロニーが、選択的に単離される。その後、該培養は新鮮培地に移され、２４時間培養された。一旦単離されると、該微生物は、２０％グリセロールを有する蔗糖培地中に、−７０℃において、凍結乾燥により、１０％脱脂粉乳と共に保存される。
【００３２】
単離され、蔗糖固形培地において培養された株は、顕微鏡による以下の特徴を提示した。
丸いコロニー
ゴム状の様相
画定された境界線（縁）
およそ２〜３ｍｍの直径（２４時間の培養で）
透明なクリーム色
顕微鏡レベルで、グラム染色を通じてグラム陽性菌が観察され、これらは時折個別に見られるが、一般的にはまとまりを形成しているのが見られる。
【００３３】
透過電子顕微鏡による特徴付けは、その細胞壁を区別できる細胞の周囲の細胞を観察できるようにするが、電子密度顆粒、鞭毛、線毛等のような特定構造は観察されない。
【００３４】
本発明の株は、Lactococcus lactis NRRL B-30656 であり、微生物ＧＲＡＳＳとしてカタログに載っており、以下の生化学的特徴を有する。
【００３５】
【表２】
【００３６】
実施例２
本酵素産生
１．醗酵
ａ）本微生物の活性化
本転移酵素を得るには、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を使用する。このバクテリアは、−７０℃の冷凍保存溶液（グリセロール）中で保存された。この株は、常温で徐々に解凍され、蔗糖培地５０ｍＬ中で、３０℃の温度で１２時間、１８０ｒ．ｐ．ｍの攪拌で、活性化された。この培養液５ｍＬを用いて、２種の接種が実施され、第１では、蔗糖寒天中、３０℃にて２４時間インキュベートし、粘液質の特徴を観察し、４℃にて保存し、第２では、１００ｍＬの蔗糖液中、３０℃にて１２時間インキュベートし、これが最終的に、１ｍＬ容れる遠心管中に配分され、２０％Ｖ／Ｖのグリセロールと共に−７０℃にて貯蔵し、その後の醗酵に利用された。最初の培養の残りの４５ｍＬを、凍結乾燥によって５ｍＬのバイアル中に保存し、無菌脱脂粉乳を養分として利用しつつ、１０％濃度とし、４℃にて保存する。
【００３７】
ｂ）予備接種および接種の準備
このロットに該当している同一組成の培地で、予備接種を準備する。蔗糖固形培地中で
貯蔵された微生物を採取し、１（単位）体積の液体培地中で、接種体積の５〜２０％まで
接種し、２５〜３５℃において、１００〜４００ｒ．ｐ．ｍで攪拌しながら、１２〜２４
時間培養する。
【００３８】
【表３】
【００３９】
該微生物は、該発酵体積の５〜１０％播種され、前段階の培地の肉眼での密度０．７ｕ．ａ．まで、稀釈度１：１０において成育され、６００ｎｍにおいて読み取られ、無菌培養培地がブランクとして利用される。
【００４０】
該発酵中、予備接種および接種を、これが実施される発酵機の容積に鑑みて実施することが必要であり、最終接種におけるような形で（産生用該発酵機に入れられた培養培地の１０％）、細胞のこの反応機中での潜伏相を避けるための必要量を得、該予備接種と先立つ接種との間の体積１：１０の関係、もしくは、接種するために充分な細胞密度を保存するよう試みながら、その純度における厳密な制御、および、接種もしくは予備接種として用いられる培養の栄養状態を維持する。
【００４１】
ｃ）培養用および接種用の培地の調製
該培養培地のｐＨが、ｐＨ７．０に調整される。該予備接種を準備するための培地を有する長頸フラスコが、１２１℃１５分間の無菌化に付される。
【００４２】
ｄ）操作条件
活性成分産生は、この確立した培地を利用しているロットにおける発酵により実施される。その操作条件が、以下の表中にある。
【００４３】
【表４】
【００４４】
２．本酵素の回収
ａ）遠心
本細胞外酵素は、５，０００ｒｐｍ１５分間の遠心で回収され、バイオマスを分離させる。酵素抽出物は、２〜６Ｕ／ｍＬのブドウ糖転移酵素活性を有する。
【００４５】
ｂ）超微細濾過
醗酵上清を回収するもう１つ別の方式は、０．４５〜２ミクロンの孔の大きさを有する
超微細濾過膜の使用による。
【００４６】
実施例３
本生物高分子の産生および回収
ａ）酵素反応
該反応条件は、次の通りである。
反応培地：
５０〜２００ｍＭホスフェート緩衝液のｐＨ：５〜７
基質 ：蔗糖８〜２０％
酵素量 ：酵素抽出物１０〜３０％ｖ／ｖ（２００〜５００Ｕ／Ｌ）
反応時間 ：２０〜４０時間
攪拌 ：１００〜４００ｒｐｍ
【００４７】
本酵素は遠心で分離され、８〜２０％の蔗糖を含有する培地において、ｐＨ５〜８、温度２５〜３５℃にて２０〜３０時間置かれ、３０〜６０ｇ／Ｌの濃縮高分子を得、その基質に関し４０〜６０％の収率に対応している。報告されたその他の過程（方法、プロセス）では、該高分子産生に５〜１０日かかる。報告された微生物は、より低濃縮の高分子を産生する（表１）。
【００４８】
ｂ）本生物高分子の精製
該酵素反応後、温度を４℃に下げ、該生物高分子が、２つの形で回収され得る。
＃溶媒を用いた沈殿
冷たい反応混合物に、攪拌しながら、９６％エタノールを加える。加えられるエタノール量は、反応混合物体積につき、エタノール１．０〜３．０体積に対応する。
沈殿した生物高分子を、脱イオン化し蒸留した半量の水に再溶解させ、新たに、反応混合物体積につき１．０〜３．０体積のエタノールで沈殿させる。
沈殿した生物高分子を、１／３体積の水に再溶解させ、凍結乾燥により、もしくは、６０〜８０℃の強制送風による乾燥により、湿度５〜１０％まで乾燥させる。
【００４９】
【表５】
【００５０】
＃超微細濾過
該反応混合物は、１０，０００ダルトンより大きな孔の大きさを有する再生セルロース膜において、グルコース残渣およびフルクトース残渣の除去の終了まで、超微細濾過プロセスに付される。後に、該生物高分子は、アスピレーションによる乾燥プロセスに付される。
【００５１】
この微生物に関しての本生物高分子産生は基質濃度に依り、８〜２４％にて最適であり、そのより高い収率と共に、より高い純度を有する生物高分子を産生する（表２）。
【００５２】
【表６】
【００５３】
ｃ）乾燥
得られた最終生成物は白い粉（白色粉末）であり、凍結乾燥か、もしくは、８０℃以下の温度での乾燥熱によって乾燥され得る。
【００５４】
実施例４
本生物高分子の特徴付け
１．可溶性
該生成物は水溶性生物高分子で、最高５０％濃度まで、水性ゲルタイプの均一な分散体を形成し得る。１．０ｇの生物高分子は、３２ｍＬの５％塩酸、５０ｍＬの１０％水酸化ナトリウム、３０ｍＬの氷酢酸に溶ける。
【００５５】
エタノール、イソプロパノール、アセトン、鉱油、植物油、およびポリエチレングリコールには溶けない。
【００５６】
該生成物は沸点にて、０．５％蓚酸にやや溶ける。
【００５７】
２．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
＃浸透クロマトグラフィーで、１．５％の生物高分子溶液は、重量分子量９００〜１，１００ＫＤａを有し、カラム Shodex OHPak KB-803 で求められた。該クロマトグラフィー条件は、次の通りであった。
温 度：５５℃
移動相：ＮａＣｌ ０．１Ｍ 溶液
流 速：０．９ｍＬ／分
【００５８】
＃該高分子の純度は９５％より高く、次の条件下で、ＨＰＬＣにおいて尖ったピークにより証明される。カラム商品名ＳｈｏｄｅｘＳＣ１０１１。
移動相：蒸留し脱イオン化した水
流 速：０．６ｍＬ／分
温 度：７０℃
備 品：Waters510、屈折率検出器付き、商品名Waters2410
【００５９】
これらの条件下で、該生物高分子は、保持時間７〜７．５分を有する。
【００６０】
利用された比較基準は、分析用試薬級（グレード）の、ブドウ糖（グルコース）、果糖（フルクトース）、蔗糖、およびレバンであった。
【００６１】
＃該生物高分子は、ｐＨ２〜９の緩衝液との該高分子の接触後、ＨＰＬＣにより証明され
たｐＨ範囲の幅の中では安定である。
【００６２】
３．粘度
１０％溶液の粘度を３０℃おいて求め、粘度計 ViscoEasy, Serie L, Schott, Ref.28.541.120, Ｌ２軸, ５０ｒｐｍを用いた。分析したサンプルは、１，０００〜３，０００センチポイズ（ｃＰ）の範囲中の粘度を有した。擬似可塑性の振る舞い（挙動）を呈した（カッティングすると痩せる）。該生物高分子溶液の粘度は、カッターもしくは剪断機の速度を上げると減少し、温度を下げると増加する。
【００６３】
４．寸法の特徴
該生物高分子は、蔗糖のそれ（１．５ｍｇ／ｍＬ）に近い真の密度を持つ。粒子間で４８％の高い多孔性を有する物質（材料）である。粒子の平均的大きさ＜＜ｄｖｓ＞＞（直径／容積／表面積）は、２２４ミクロンである。
【００６４】
５．湿気の吸収
水分吸収能は、相対湿度に依り、６．１２ｍｇ／ｇ〜３５３．２０ｍｇ／ｇの間を上下する。このことはこれを、やや吸湿性の材料にする。高分子であり親水性であるその構造のために、該生物高分子は、水に触れると限りなく多孔性（スポンジ状）になることができ、含む水の量によって変化できる仕組みのシステムを形成することができ、果ては、その高粘度により特徴付けられる水っぽい分散体の形成に至る。
【００６５】
６．湿気
６０℃の真空炉（オーブン）中での乾燥で、１０％以下の水分が失われる。
【００６６】
７．熱的特徴
該生物高分子は、２点のガラス転移温度を有する。第１は２０℃〜３０℃で、第２は１９０℃〜２２０℃である。走査差動カロリー計によって、求められる。
【００６７】
８．微生物学的性質
該生物高分子は、次の微生物学的検体数を有する。
【００６８】
【表７】
【００６９】
９．使用
ａ）該生物高分子は、医薬産業において、稠密剤、粘稠剤、安定剤、拡散剤、皮膜形成剤、分解剤、代用血漿、潤滑剤、および抗生物質前駆体として、用いられ得る。
【００７０】
ｂ）該生物高分子は、食品産業において、粘稠剤、稠密剤、安定剤、拡散剤、繊維、ならびに、脂、油、および、エーテルおよびエステル主体の炭水化物の代用品として、用いられ得る。
【００７１】
ｃ）該生物高分子は、押出しにより得られる製品において、柔軟で生分解性の包装を生産するのに適したフィルムを形成するために、ならびに、水処理用凝固剤生産における射出もしくはモールドにより得られる生分解性製品を得ることにおいて、用いられ得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
NRRL B-30656 のコードの下で寄託された Lactococcus lactis 株の代謝産物から得られた、ブドウ糖と果糖との生物高分子。
【請求項２】
前記代謝産物が、ブドウ糖転移酵素（グルコシルトランスフェラーゼ）と果糖転移酵素（フルクトシルトランスフェラーゼ）の２種の活性を有する酵素による、請求項１の生物高分子。
【請求項３】
ブドウ糖／果糖の割合０．２〜０．７を維持する組成を持つ、請求項１の生物高分子。
【請求項４】
以下の特性：
分子量９００〜１１，０００キロダルトン
第１のガラス転移温度が２０〜３０℃で、第２のガラス転移温度が１９０〜２２０℃の、２種のガラス転移温度
ｐＨ２〜９の値を有する水溶液中での安定性
温度３０℃で、水溶液中１０〜２０％の濃度となっている場合、１，０００〜３，０００センチポイズの粘度
非吸湿性
水中での高い溶解性、最高５０％重量／体積の濃度まで、水性ゲルタイプの均質な分散液を形成する能力
を有する、請求項１〜３のいずれか１項の生物高分子。
【請求項５】
Lactococcus lactis NRRL B-30656 株により産生される、ブドウ糖転移酵素と果糖転移酵素との２種の活性を有する酵素の産生方法であって：
ａ）炭素源としての蔗糖、窒素源としての蛋白質、および鉱物塩を含有する培地を用
いつつ、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を活性化させ；
ｂ）炭素源としての蔗糖、窒素源としての蛋白質、および鉱物塩を含有する培養培地
を用いつつ、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を醗酵させ；
ｃ）遠心もしくは超微細濾過を用いつつ、該酵素を該醗酵培地から分離する
ことからなる、酵素の産生方法。
【請求項６】
前記微生物を活性化させるステップにおいて、炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂
糖、およびその他蔗糖源）、窒素源としての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、
およびその他窒素源）、および鉱物塩を含有する培地に接種し、１０〜３６時間、２５℃
、１００〜４００ｒｐｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベートする、請求項５の酵
素の産生方法。
【請求項７】
前記微生物を醗酵させるステップにおいて、炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖
、およびその他蔗糖源）、窒素源としての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、お
よびその他窒素源）、および鉱物塩を含有する培養培地を用いつつ、１２〜３６時間、２
５℃、１００〜４００ｒｐｍ、１〜２ｖｖｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベート
して、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を培養する、請求項５の酵素の産生方
法。
【請求項８】
前記酵素を分離するステップにおいて、前記微生物の懸濁液を、３，０００〜７，０００ｒｐｍで遠心しつつ、もしくは、０．２２〜０．４５ミクロンの膜を用いて超微細濾過することにより、該酵素を、前記発酵培地から分離する、請求項５の酵素の産生方法。
【請求項９】
前記微生物を用いる醗酵ステップにおいて、炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖
、およびその他蔗糖源）、窒素源としての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、お
よびその他窒素源）、および鉱物塩を含有する培養培地を用いつつ、１２〜３６時間、２
５℃、１００〜４００ｒｐｍ、１〜２ｖｖｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベート
して、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を用いる予備接種が実施される、請求
項５の酵素の産生方法。
【請求項１０】
請求項２、５〜８のいずれか１項の、転移酵素活性を有する酵素の産生方法であって：
ａ．炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖、およびその他蔗糖源）を１０〜４０
ｇ／Ｌの濃度で、窒素源としての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、その他窒素
源）を７〜３０ｇ／Ｌの濃度で、および鉱物塩を含有する培地に接種して、１０〜３６時
間、２５℃、１００〜４００ｒｐｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベートして、微
生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を活性化させ；
ｂ．炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖、およびその他蔗糖源）、窒素源とし
ての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、およびその他窒素源）、および鉱物塩を
含有する培養培地を用いて、１２〜３６時間、２５℃、１００〜４００ｒｐｍ、１〜２ｖ
ｖｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベートして、微生物 Lactococcus lactis NRRL
B-30656 を用いて予備接種し；
ｃ．炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖、およびその他蔗糖源）、窒素源とし
ての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、およびその他窒素源）、および、鉱物塩
Ｋ２ＨＰＯ４、ＦｅＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４.Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２.
２Ｈ２Ｏ、ＮａＣｌを含有する培養培地を用いて、１２〜３６時間、２５℃、１００〜４
００ｒｐｍ、１〜２ｖｖｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベートし、微生物 Lacto
coccus lactis NRRL B-30656 を培養し；
ｄ．該微生物の懸濁液を、３，０００〜７，０００ｒｐｍで遠心して、もしくは、０．２２〜０．４５ミクロンの孔の大きさを有する膜を用いて超微細濾過することにより、該酵素を該醗酵培地から分離する
ことからなる、酵素の産生方法。
【請求項１１】
請求項１の、ブドウ糖と果糖との高分子の産生方法であって：
ａ）請求項１０による発酵により得られた転移酵素を、蔗糖源を含有する培地中で、前記生物高分子産生に適した、攪拌、温度、ｐＨ、酵素および基質の濃度、および反応時間条件下にインキュベートし；
ｂ）沈殿もしくは超微細濾過により、該生物高分子を回収し精製する
ことからなる、高分子の産生方法。
【請求項１２】
請求項１０による生物高分子の産生方法であって、前記酵素をインキュベートするステップが：
該酵素を、蔗糖源（葡萄酒、糖蜜、砂糖）を含有する培地中で、該生物高分子産生に適した、攪拌（１００〜４００ｒｐｍ）、温度、ｐＨ（５〜９）、酵素濃度（１０〜４０％ｖ／ｖ酵素抽出物）および基質濃度（５〜４０％）、および反応時間（１２〜４８時間）条件下にインキュベートする
ことからなる、高分子の産生方法。
【請求項１３】
請求項１０の酵素の産生方法であって、前記生物高分子を沈殿により回収し精製するステップが：
冷たい反応混合物に、９６％の１．２〜２．０体積のエタノールを、攪拌しながら加え（加えられるエタノール量は、エタノール／反応混合物体積に相当）；
沈殿した生物高分子を、脱イオン化され蒸留された半分の体積の水に溶解させ、新たに、反応混合物体積につき１．２〜２．０体積のエタノールを用いて沈殿させ；
沈殿した生物高分子を、１／３体積の水に溶解させ、凍結乾燥により、もしくは、５０〜８０℃の強制通風による乾燥により、湿度５〜６％まで乾燥させる
ことからなる、酵素の産生方法。
【請求項１４】
請求項１０の酵素の産生方法であって、前記生物高分子を、超微細濾過により回収し精製するステップが：
前記反応混合物を用い、１０，０００〜３０，０００ダルトン以上の孔の大きさを有する再生セルロース膜を用い、超微細濾過プロセスを、ブドウ糖残渣および果糖残渣を除去し終えるまで実施し、該生物高分子を、送風による乾燥プロセスに付す
ことからなる、酵素の産生方法。
【請求項１５】
コロンビアの土壌から単離され、コード NRRL B-30656 下に寄託されている Lactococcus lactis 株微生物。
【請求項１６】
請求項１４の微生物であって、ブドウ糖転移酵素と果糖転移酵素との２種の活性を有する酵素を産生する、微生物。
【請求項１７】
請求項１４の微生物であって、請求項１および４のいずれか１項の生物高分子を産生するために利用される、微生物。
【請求項１８】
請求項１４〜１６のいずれか１項の微生物の保存方法であって、該微生物の凍結乾燥からなり：
ａ）該微生物を、蔗糖液中で、２５〜３５℃において、１２〜２４時間培養し；
ｂ）該培養を、１０〜２０％ｖ／ｖの無菌脱脂粉乳と共に、１ｍＬ容量の遠心管に配分し；
ｃ）該培養を、凍結乾燥させる
ステップを含む、保存方法。
【請求項１９】
請求項１４〜１６のいずれか１項の微生物の保存方法であって、該微生物の冷凍からなり：
ａ）該微生物を、蔗糖液中で、２５〜３５℃において、１２〜２４時間培養し；
ｂ）該培養を、２０％ｖ／ｖのグリセロールと共に、１ｍＬ容量の遠心管に配分し、
−７０℃において保管する
ステップを含む、保存方法。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか１項の生物高分子であって、稠密剤、粘稠剤、安定剤、拡散剤、皮膜形成剤、分解剤、代用血漿、潤滑剤、および抗生物質前駆体として、医薬産業において利用される、生物高分子。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか１項の生物高分子であって、粘稠剤、稠密剤、安定剤、拡散剤、繊維、ならびに、脂、油、および、エーテルおよびエステル主体の炭水化物の代用品として、食品産業において利用される、生物高分子。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１項の生物高分子であって、押出しにより得られる製品において、柔軟で生分解性の包装を生産するのに適したフィルムを形成し、水処理用凝固剤生産における射出もしくはモールドにより得られる製品において利用される、生物高分子。
【請求項１】
NRRL B-30656 のコードの下で寄託された Lactococcus lactis 株の代謝産物から得られた、ブドウ糖と果糖との生物高分子。
【請求項２】
前記代謝産物が、ブドウ糖転移酵素（グルコシルトランスフェラーゼ）と果糖転移酵素（フルクトシルトランスフェラーゼ）の２種の活性を有する酵素による、請求項１の生物高分子。
【請求項３】
ブドウ糖／果糖の割合０．２〜０．７を維持する組成を持つ、請求項１の生物高分子。
【請求項４】
以下の特性：
分子量９００〜１１，０００キロダルトン
第１のガラス転移温度が２０〜３０℃で、第２のガラス転移温度が１９０〜２２０℃の、２種のガラス転移温度
ｐＨ２〜９の値を有する水溶液中での安定性
温度３０℃で、水溶液中１０〜２０％の濃度となっている場合、１，０００〜３，０００センチポイズの粘度
非吸湿性
水中での高い溶解性、最高５０％重量／体積の濃度まで、水性ゲルタイプの均質な分散液を形成する能力
を有する、請求項１〜３のいずれか１項の生物高分子。
【請求項５】
Lactococcus lactis NRRL B-30656 株により産生される、ブドウ糖転移酵素と果糖転移酵素との２種の活性を有する酵素の産生方法であって：
ａ）炭素源としての蔗糖、窒素源としての蛋白質、および鉱物塩を含有する培地を用
いつつ、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を活性化させ；
ｂ）炭素源としての蔗糖、窒素源としての蛋白質、および鉱物塩を含有する培養培地
を用いつつ、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を醗酵させ；
ｃ）遠心もしくは超微細濾過を用いつつ、該酵素を該醗酵培地から分離する
ことからなる、酵素の産生方法。
【請求項６】
前記微生物を活性化させるステップにおいて、炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂
糖、およびその他蔗糖源）、窒素源としての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、
およびその他窒素源）、および鉱物塩を含有する培地に接種し、１０〜３６時間、２５℃
、１００〜４００ｒｐｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベートする、請求項５の酵
素の産生方法。
【請求項７】
前記微生物を醗酵させるステップにおいて、炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖
、およびその他蔗糖源）、窒素源としての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、お
よびその他窒素源）、および鉱物塩を含有する培養培地を用いつつ、１２〜３６時間、２
５℃、１００〜４００ｒｐｍ、１〜２ｖｖｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベート
して、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を培養する、請求項５の酵素の産生方
法。
【請求項８】
前記酵素を分離するステップにおいて、前記微生物の懸濁液を、３，０００〜７，０００ｒｐｍで遠心しつつ、もしくは、０．２２〜０．４５ミクロンの膜を用いて超微細濾過することにより、該酵素を、前記発酵培地から分離する、請求項５の酵素の産生方法。
【請求項９】
前記微生物を用いる醗酵ステップにおいて、炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖
、およびその他蔗糖源）、窒素源としての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、お
よびその他窒素源）、および鉱物塩を含有する培養培地を用いつつ、１２〜３６時間、２
５℃、１００〜４００ｒｐｍ、１〜２ｖｖｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベート
して、微生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を用いる予備接種が実施される、請求
項５の酵素の産生方法。
【請求項１０】
請求項２、５〜８のいずれか１項の、転移酵素活性を有する酵素の産生方法であって：
ａ．炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖、およびその他蔗糖源）を１０〜４０
ｇ／Ｌの濃度で、窒素源としての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、その他窒素
源）を７〜３０ｇ／Ｌの濃度で、および鉱物塩を含有する培地に接種して、１０〜３６時
間、２５℃、１００〜４００ｒｐｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベートして、微
生物 Lactococcus lactis NRRL B-30656 を活性化させ；
ｂ．炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖、およびその他蔗糖源）、窒素源とし
ての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、およびその他窒素源）、および鉱物塩を
含有する培養培地を用いて、１２〜３６時間、２５℃、１００〜４００ｒｐｍ、１〜２ｖ
ｖｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベートして、微生物 Lactococcus lactis NRRL
B-30656 を用いて予備接種し；
ｃ．炭素源としての蔗糖（糖蜜、葡萄酒、砂糖、およびその他蔗糖源）、窒素源とし
ての蛋白質（イースト抽出物、硫安、肉抽出物、およびその他窒素源）、および、鉱物塩
Ｋ２ＨＰＯ４、ＦｅＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４.Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２.
２Ｈ２Ｏ、ＮａＣｌを含有する培養培地を用いて、１２〜３６時間、２５℃、１００〜４
００ｒｐｍ、１〜２ｖｖｍ、およびｐＨ５〜９においてインキュベートし、微生物 Lacto
coccus lactis NRRL B-30656 を培養し；
ｄ．該微生物の懸濁液を、３，０００〜７，０００ｒｐｍで遠心して、もしくは、０．２２〜０．４５ミクロンの孔の大きさを有する膜を用いて超微細濾過することにより、該酵素を該醗酵培地から分離する
ことからなる、酵素の産生方法。
【請求項１１】
請求項１の、ブドウ糖と果糖との高分子の産生方法であって：
ａ）請求項１０による発酵により得られた転移酵素を、蔗糖源を含有する培地中で、前記生物高分子産生に適した、攪拌、温度、ｐＨ、酵素および基質の濃度、および反応時間条件下にインキュベートし；
ｂ）沈殿もしくは超微細濾過により、該生物高分子を回収し精製する
ことからなる、高分子の産生方法。
【請求項１２】
請求項１０による生物高分子の産生方法であって、前記酵素をインキュベートするステップが：
該酵素を、蔗糖源（葡萄酒、糖蜜、砂糖）を含有する培地中で、該生物高分子産生に適した、攪拌（１００〜４００ｒｐｍ）、温度、ｐＨ（５〜９）、酵素濃度（１０〜４０％ｖ／ｖ酵素抽出物）および基質濃度（５〜４０％）、および反応時間（１２〜４８時間）条件下にインキュベートする
ことからなる、高分子の産生方法。
【請求項１３】
請求項１０の酵素の産生方法であって、前記生物高分子を沈殿により回収し精製するステップが：
冷たい反応混合物に、９６％の１．２〜２．０体積のエタノールを、攪拌しながら加え（加えられるエタノール量は、エタノール／反応混合物体積に相当）；
沈殿した生物高分子を、脱イオン化され蒸留された半分の体積の水に溶解させ、新たに、反応混合物体積につき１．２〜２．０体積のエタノールを用いて沈殿させ；
沈殿した生物高分子を、１／３体積の水に溶解させ、凍結乾燥により、もしくは、５０〜８０℃の強制通風による乾燥により、湿度５〜６％まで乾燥させる
ことからなる、酵素の産生方法。
【請求項１４】
請求項１０の酵素の産生方法であって、前記生物高分子を、超微細濾過により回収し精製するステップが：
前記反応混合物を用い、１０，０００〜３０，０００ダルトン以上の孔の大きさを有する再生セルロース膜を用い、超微細濾過プロセスを、ブドウ糖残渣および果糖残渣を除去し終えるまで実施し、該生物高分子を、送風による乾燥プロセスに付す
ことからなる、酵素の産生方法。
【請求項１５】
コロンビアの土壌から単離され、コード NRRL B-30656 下に寄託されている Lactococcus lactis 株微生物。
【請求項１６】
請求項１４の微生物であって、ブドウ糖転移酵素と果糖転移酵素との２種の活性を有する酵素を産生する、微生物。
【請求項１７】
請求項１４の微生物であって、請求項１および４のいずれか１項の生物高分子を産生するために利用される、微生物。
【請求項１８】
請求項１４〜１６のいずれか１項の微生物の保存方法であって、該微生物の凍結乾燥からなり：
ａ）該微生物を、蔗糖液中で、２５〜３５℃において、１２〜２４時間培養し；
ｂ）該培養を、１０〜２０％ｖ／ｖの無菌脱脂粉乳と共に、１ｍＬ容量の遠心管に配分し；
ｃ）該培養を、凍結乾燥させる
ステップを含む、保存方法。
【請求項１９】
請求項１４〜１６のいずれか１項の微生物の保存方法であって、該微生物の冷凍からなり：
ａ）該微生物を、蔗糖液中で、２５〜３５℃において、１２〜２４時間培養し；
ｂ）該培養を、２０％ｖ／ｖのグリセロールと共に、１ｍＬ容量の遠心管に配分し、
−７０℃において保管する
ステップを含む、保存方法。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか１項の生物高分子であって、稠密剤、粘稠剤、安定剤、拡散剤、皮膜形成剤、分解剤、代用血漿、潤滑剤、および抗生物質前駆体として、医薬産業において利用される、生物高分子。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか１項の生物高分子であって、粘稠剤、稠密剤、安定剤、拡散剤、繊維、ならびに、脂、油、および、エーテルおよびエステル主体の炭水化物の代用品として、食品産業において利用される、生物高分子。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１項の生物高分子であって、押出しにより得られる製品において、柔軟で生分解性の包装を生産するのに適したフィルムを形成し、水処理用凝固剤生産における射出もしくはモールドにより得られる製品において利用される、生物高分子。
【公表番号】特表２００７−５１６３３５（Ｐ２００７−５１６３３５Ａ）
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４６３８４（Ｐ２００６−５４６３８４）
【出願日】平成１６年１２月２１日（２００４．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００４２２４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６４００３
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【出願人】（５０６２１７９７７）ユニヴァーシダッド・ナシオナル・デ・コロンビア (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤ ＮＡＣＩＯＮＡＬ ＤＥ ＣＯＬＯＭＢＩＡ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｃｔｏｒｉａ Ｇｅｎｅｒａｌ， Ｃｉｕｄａｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉａ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃｏｌｏｍｂｉａ， Ｂｏｇｏｔａ， ６ Ｃｏｌｏｍｂｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２１日（２００４．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００４２２４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６４００３
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【出願人】（５０６２１７９７７）ユニヴァーシダッド・ナシオナル・デ・コロンビア (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤ ＮＡＣＩＯＮＡＬ ＤＥ ＣＯＬＯＭＢＩＡ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｃｔｏｒｉａ Ｇｅｎｅｒａｌ， Ｃｉｕｄａｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉａ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃｏｌｏｍｂｉａ， Ｂｏｇｏｔａ， ６ Ｃｏｌｏｍｂｉａ
【Ｆターム（参考）】
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