Ｎｏｘ１ポリペプチドに対する抗体、Ｎｏｘ１遺伝子を利用したガン診断方法、及びガン増殖抑制物質のスクリーニング方法
（課題） 突然変異Ｒａｓガン遺伝子と関連するＮｏｘ１遺伝子を利用したガン診断方法、ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、及びガン治療に用いる医薬組成物を提供する。（解決手段） Ｎｏｘ１遺伝子がコードするポリペプチド、そのホモログ、及びこれらのペプチド断片を含む、抗体製造用組成物、Ｎｏｘ１遺伝子がコードするポリペプチドに対する抗体、これらの抗体、又はＮｏｘ１を発現したｍＲＮＡを検出する方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ガン関連遺伝子、及び該遺伝子にコードされたポリペプチドに基づく、ガン診断方法、ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、及び医薬組成物に関するものである。さらに詳細に述べると、突然変異Ｒａｓガン遺伝子と関連するＮｏｘ１遺伝子、該遺伝子にコードされたポリペプチド、及び該ポリペプチド特異的抗体を用いるガン診断方法、ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、及びガン治療に用いる医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
従来から、突然変異Ｒａｓガン遺伝子は、哺乳動物細胞のガン化、及びその進行に大きな影響を与えることが知られている（非特許文献１）。例えば、突然変異Ｒａｓガン遺伝子は、その主要な下流経路の１つであるＲａｆ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路を介して、動物細胞をガン化し、進行させると考えられている（非特許文献２）。
そして、このような知見に基づき、Ｎ−ｒａｓ腫瘍サプレッサーが欠損しているガン細胞を対象として、ｐ９４ＲＢをコードする遺伝子を含む発現ベクター遺伝子を投与する腫瘍抑制遺伝子治療法（特許文献１）や、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ及びＮ−ｒａｓの発ガン遺伝子を利用して腫瘍抑制遺伝子を同定する方法（特許文献２）などが開発されてきた。
近年の研究により、突然変異Ｒａｓ遺伝子により形質転換された細胞で、スーパーオキシド、Ｈ２Ｏ２などの活性酸素種（ＲＯＳ）が生成されることが報告された（非特許文献３）。そして、細胞内の低レベルＲＯＳは、増殖因子で誘導される細胞増殖において、シグナル分子としての役割を演じていることから（非特許文献４及び５）、突然変異Ｒａｓ遺伝子に関連したＲＯＳ生成の上昇は、動物細胞の異常増殖の原因になると考えられるようになった。
しかし、突然変異Ｒａｓ遺伝子によるガン化、ガンの進行促進などに関与する、活性酸素産生酵素はこれまで知られていなかった。
【特許文献１】特表平０８−５０８１６６号公報
【特許文献２】特表平１０−５０４４４８号公報
【非特許文献１】Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２，８５１−８９１（１９９３）
【非特許文献２】ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｆ．ＴＣＢ．９，Ｍ５３−Ｍ５６（１９９９）
【非特許文献３】Ｉｒａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，１６４９−１６５２（１９９７）
【非特許文献４】Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０，２９６−２９９（１９９５）
【非特許文献５】Ｂａｅ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２１７−２２１（１９９７）
【発明の開示】
本発明は、突然変異Ｒａｓガン遺伝子と関連するＮｏｘ１遺伝子、該遺伝子にコードされたポリペプチド、及び該ポリペプチド特異的抗体を用いるガン診断方法、ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、及びガン治療に用いる医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、研究の結果、突然変異Ｒａｓガン遺伝子が、ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路において、スーパーオキシドを生成するＮＡＤＰＨ酸化酵素の触媒サブユニットのホモログＮｏｘ１（１、２及び３）の発現を著しく上昇させ、かつ該Ｎｏｘ１遺伝子のｓｉＲＮＡが、細胞接着依存性の増殖、その形態変化、無胸腺マウスにおける腫瘍の形成など、突然変異Ｒａｓ遺伝子の表現型を効果的に抑えるという知見を得た。本発明者らは、当該知見に基づき前記課題を解決し、本発明を達成した。
したがって、本発明は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（２）配列番号２のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド；又は（３）（１）又は（２）のポリペプチドの部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド断片を含む、抗体製造用組成物を提供する。
また、本発明は、前記抗体製造用組成物を、哺乳類に投与することを含む、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の製造方法を提供する。
さらに、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体を提供する。
さらに、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体を、生物試料と接触させることを含む、ガンの診断方法を提供する。
さらに、本発明は、前記抗体を含む、ガン診断用組成物、及びガン治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片を検出することを特徴とする、ガン診断方法を提供する。該検出は、ポリメラーゼ連鎖反応、又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により該ポリヌクレオチド、又はその断片を検出することにより行うのが好ましい。
さらに、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡを提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡを含む、ガン治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡによって形質転換された細胞を含む、ガン治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、Ｎｏｘ１遺伝子を標的とするガン細胞増殖抑制物質のスクリーニング方法であって、（１）Ｎｏｘ１遺伝子でトランスフェクションし、該形質転換細胞をスクリーニング対象物質と接触させた後、Ｎｏｘ１活性の不活化を検出（１次スクリーニング）し、かつ（２）そのＮｏｘ１を不活化する物質が、がん細胞増殖を抑制するか否かを調べることにより（２次スクリーニング）、Ｎｏｘ１遺伝子の発現、及びＮｏｘ１活性の不活化を検出することを含む、該スクリーニング方法を提供する。
（定義）
本明細書における「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸配列の一次構造、該一次構造のポリペプチド断片、立体構造を伴う生物活性を有するポリペプチド、又はタンパク質を意味する。
本明細書における「Ｎｏｘ１ポリペプチド」とは、Ｎｏｘ１遺伝子にコードされているポリペプチドをいい、全長ポリペプチド、及びポリペプチド断片の双方を含む。
本明細書における「ホモログ」という用語は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はタンパク質と、アミノ酸配列が相同性を有し、かつ共通の生物活性又は抗原性を有するポリペプチドをいう。
本明細書における「ｓｉＲＮＡ」という用語は、特定の遺伝子の発現を抑制する短ＲＮＡ断片、又は該ＲＮＡ断片とその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。
本明細書における「突然変異Ｒａｓ遺伝子」とは、腫瘍の形成に関与する状態に突然変異したヒトＲａｓ遺伝子をいう。例えば、ヒト膵臓ガンで多いＫ−Ｒａｓの１２番目のグリシンからアスパラギン酸への突然変異、又はバリンやアルギニンへの突然変異、さらに肺ガンで見られる１２番目、その他１３番目、６１番目に起きる変異を有するヒトＲａｓ遺伝子である。
本明細書における、ポリペプチドの「アミノ酸配列の部分配列」とは、該アミノ酸配列に含まれる、少なくとも８個以上の連続するアミノ酸残基を含む配列をいう。
本明細書における「オリゴヌクレオチド」とは、通常、塩基を１００個未満、好ましくは６〜９９個を含むヌクレオチドをいう。
【図面の簡単な説明】
図１（ａ）は、実施例１におけるリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子発現の解析を行った結果を示すグラフである。
図１（ｂ）、（ｃ）及び（中は、実施例２において、実施例１と同じ方法でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、Ｎｏｘ１の発現を検出した結果を示す。
図２は、実施例４において、ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）を持続的にトランスフェクトされた細胞株における、形質転換の結果を、Ｍ１３Ｆ及び３．０ＲｅｖをプライマーとしてＰＣＲで確認した電気泳動像である。
図３は、実施例４における、Ｎｏｘ１遺伝子が関与する細胞の形態の変化を比較した写真を示す。
図４は、実施例４において、細胞の形質転換を、足場非依存性の増殖能により調べるため、ソフトアガー培養において示された細胞株の接着依存的細胞増殖を測定し、その結果を示したグラフである。
図５は、実施例４において、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１（ｎｅｇ−１）、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７（ｉ（１）−７）、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９（ｉ（３）−１９）、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７（ｉ（５）−７）の各細胞の数を液体倍地中で計測した、その増殖曲線を示すグラフである。
図６は、実施例５において、処理された細胞を可溶化し、５１０ｎｍにおける吸光度を測定してＮＢＴの減少を定量した結果を示すグラフである。
図７は、実施例６において、ＧＦＰとｒａｔＮｏｘ１の融合ポリペプチドが産生されたこと、そしてＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）の共発現は、これらのベクターの量依存的にＧＦＰ−ｒａｔＮｏｘ１融合蛋白質の生産を抑えること（左パネル）、また該ＲＮＡｉコンストラクトは，標的遺伝子に対する特異性が高いこと（右パネル）を示すグラフである。
図８は、実施例６において、内在性のＮｏｘ１のｍＲＮＡ発現が、各細胞において、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１に比べて抑制されていることを、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した電気泳動像である。
図９は、実施例７において、使用したｓｉＲＮＡがＧＦＰ、またはＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１の発現を抑制しないことを、実施例６と同様の手法によりイムノブロッティングすることにより示した像である。
図１０は、実施例７において、ｓｉＲＮＡにより一度抑制されたＮｏｘ１を回復することによる細胞への影響をＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞の形状変化により示す写真である。
図１１は、ｓｉＲＮＡにより一度抑制されたＮｏｘ１を回復することによる細胞への影響を、細胞の増殖速度により示すグラフである。
図１２は、ｓｉＲＮＡにより一度抑制されたＮｏｘ１を回復することによる細胞への影響を、足場非依存性増殖能により調べるため、ソフトアガー培養法を用いて細胞の接着依存的増殖能を検討した結果を示すグラフである。
図１３は、実施例９における、突然変異Ｒａｓの形質転換に対するＮｏｘ１遺伝子の発現の影響の検討で、細胞の形態変化を観察した結果を示すグラフである。
図１４は、実施例９における、突然変異Ｒａｓによる腫瘍形成に対するｓｉＲＮＡの影響を、ヌードマウスの腫瘍形成を１ヶ月間に渡り観察し、かつ腫瘍の体積を測定することにより示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の抗体製造用組成物は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（２）配列番号２のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド；又は（３）（１）又は（２）のポリペプチドの部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド断片を含むものである。
なお、本発明の抗体製造用組成物は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、特に好ましくは９５％の相同性を有するポリペプチドを含んでいてもよい。本明細書におけるアミノ酸配列の相同性とは、一線上に並べた場合における、基準となるアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列との同一性（％）をいう。該相同性は、塩基配列やアミノ酸配列の相同性検索を行うための標準のプログラムである、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−６９）等の解析ソフトで、デフォルト（初期設定）のパラメータを用いて計算することができる。
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、Ｎｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチドであり、該ポリペプチドの産生を検出することにより、検査対象の組織のガン化、及びガンの進行をスクリーニングできる。なお、該組成物で製造された抗体は、ヒトＮｏｘ１ポリペプチドに特異的であるが、さらに非ヒト動物が産生する該ポリペプチドのホモログにも特異性を有する場合、非ヒト動物のガン化、及びガン進行のスクリーニングにも使用できる。したがって、該抗体製造用組成物は、ヒトガン細胞検出用抗体、及びヒトＮｏｘ１ポリペプチドのホモログを産生し得る哺乳類のガン化、及びガン進行のスクリーニング用抗体の製造にも使用することができる。
また、配列番号２のアミノ酸配列の部分配列とは、該アミノ酸配列に含まれる、少なくとも８個以上の連続するアミノ酸配列をであって、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導するエピトープとなるものをいう。なお、該部分配列をエピトープとして用いる場合、適当なキャリアータンパク質を組み合わせて用いることができる。
また、本発明のポリペプチド断片は、前記ポリペプチド（１）及び（２）の断片であって、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導するものである。
また該ペプチド断片の長さは、特に限定されるものではないが、通常２０個〜２００個、好ましくは２０個〜１００個、さらに好ましくは２０〜７０個のアミノ酸残基長である。
本明細書において、ポリペプチド、該ホモログ及び該ポリペプチドの断片（以下、必要な場合はポリペプチドと略す。）は、標準的標記法に従い、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。該ポリペプチド等は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）とすることもできる。このエステルの側鎖Ｒの例を挙げると、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基、又はα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのアルキル基などがある。
また、本発明のポリペプチド等は、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が、ホルミル基、アセチル基などの保護基、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基で保護されたもの、又は糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
また、本発明のポリペプチド等は、生理学的に許容し得る無機又は有機酸付加塩として用いることができる。該無機酸付加塩の例を挙げると、塩酸、リン酸、臭化水素酸、及び硫酸の塩があり、また有機酸付加塩の例を挙げると、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、及びベンゼンスルホン酸などの塩がある。
すなわち、本発明の抗体製造用組成物は、前記ポリペプチド、そのホモログ、これらのペプチド断片、又はこれらの酸付加塩を含むものである。また、必要に応じて、該組成物はベヒクル、希釈剤、アジュバンドなどの成分を含んでいてもよい。
本発明では、前記抗体製造用組成物を用いて、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモログ、又は該ペプチド断片に特異的な抗体を製造する方法を提供する。
本発明の方法で製造する抗体は、本発明の目的に応じて使用できるものであれば特に制限されないが、例を挙げると、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体などがある。ここで、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは、全抗体中に数％のマウス由来抗体を含むものをいい、ヒト抗体とは１００％ヒト由来の抗体からなるものをいい、キメラ・ヒト抗体とは、マウス由来抗体を１０〜２０％含むものをいう。また、該抗体は、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、次の方法で製造することができる。まず、前記抗体製造用組成物を非ヒト哺乳動物に投与する。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行う。該非ヒト哺乳動物の例を挙げると、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリがあり、一般に好ましいのはマウス、又はラットである。
前記組成物で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生が認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓、又はリンパ節に含まれる抗体産生細胞採取し、同種、又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する。抗血清中の抗体価の測定は、標識化タンパク質と抗血清とを反応させ、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行う。また細胞融合は、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）などの常法で行うことができる。融合促進剤として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどを用いることができる。
また、骨髄腫細胞の例を挙げると、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／Ｏ、及びＡＰ−１などの非ヒト哺乳動物の骨髄腫細胞があり、特にＰ３Ｕ１が好ましい。融合に用いる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０程度であり、ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００を１０〜８０％度の濃度で添加し、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、種々の方法で行うことができる。例えば、抗原を直接、又は担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）と、ハイブリドーマ培養上清を接触させ、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体を含む溶液を接触させ、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体などを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を接触させ、次いで放射性物質や酵素などで標識したタンパク質の溶液と接触させ、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがある。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選別は常法で行うことができる。例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地に、１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））、又はハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は２０〜４０℃、培養時間は、通常５日〜３週間で、培養は、通常５％炭酸ガス存在下で行う。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
また、得られたモノクローナル抗体の分離精製は、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、及び電気泳動法などの免疫グロブリンの分離精製法、イオン交換体（ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相、又はプロテインＡ活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などの常法で行うことができる。
また、本発明のポリクローナル抗体は、免疫抗原である前記ポリペプチド等、又は該そのペプチド断片とキャリアータンパク質との複合体で、非ヒト哺乳動物を免疫し、その後、血清などの抗体含有成分を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
該免疫抗原とキャリアータンパク質との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率よく産生されるように決定する。例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で用いることができる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等を用いることができる。
該複合体抗原は、単独で、又は担体、希釈剤、さらに抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントとともに投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回行う。該ポリクローナル抗体は、免疫された哺乳動物の血液、腹水、卵黄などから採取する。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。また、ポリクローナル抗体の分離精製は、前記モノクローナル抗体の分離精製と同様に行うことができる。
本発明のガン診断用キットは、このようにして得られたポリクローナル、又はモノクローナル抗体を含む。また、該診断用キットは、必要に応じて、免疫反応用ウェル、染色剤、検出用の酵素標識抗体、洗浄液、抗体希釈液、検体希釈液、酵素基質、酵素基質液希釈液、その他の試薬を含むものである。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、Ｎｏｘ１遺伝子にコードされている特異的タンパク質の発現を抑制するものであるから、ガン化の予防、進行遅延、及び治療に使用することができる。
該抗体は、経口的に、又は非経口的に投与することができ、さらに該非経口的投与は、組織への局所的な投与を含む。
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、汎用されている担体などの製剤用成分、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、緩衝剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、コーティング剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、滑沢剤及び賦形剤などを用いることができる。また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの添加剤を用いてもよい。
製薬用成分の具体的な例を挙げると、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤、水、エタノール、単シロツプ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラツク、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖などの崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩等の滑沢剤などである。さらに必要に応じて、上記の各剤形について公知のドラッグデリバリーシステムの技術を採用し徐放化、局所適用化（トローチ、バッカル剤、舌下錠等）、薬物放出制御、腸溶性化、胃溶性化などを施すことができる。
また、非経口投与する場合、点滴、静脈注射、皮下注射、筋肉注射などの注射による投与、油脂製坐剤、水溶性坐剤、座剤による直腸投与などの形態とすることができる。該調剤は、製薬分野における通常の担体を用い、常法により容易に行うことができる。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、例えば、ヒト、その他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。その投与量は、対象の状態、投与ルートなどにより適宜変わるが、例えば、経口投与する場合、一般的に、体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜４０００ｍｇ、好ましくは約２０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ｓｉＲＮＡの１回投与量は投与対象、肝臓ガンの状況などによっても異なるが、例えば、注射剤の形で体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜２０００ｍｇ程度、好ましくは約２０〜１０００ｍｇ程度、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ程度を静脈から投与するのが好ましい。
また、本発明の抗体を、生物試料と接触させることを含む、免疫化学的測定法によって、生体組織や体液中のＮｏｘ１遺伝子の検出・定量を行い、ガンを診断することができる。
この免疫化学的測定法を行う場合、本発明の抗体を担体に保持する。該測定方法で用いる担体の例を挙げると、アガロースゲル（セファロース４Ｂ、及びセファロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社））、デキストランゲル（セファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−１００、及びセファデックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカル社））、ポリアクリルアミドゲル（バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、及びバイオゲルＰ−１００（バイオラッド・ラボラトリーズ社））、セルロース粒子（アビセル（旭化成））などのゲル粒子、ジエチルアミノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどのイオン交換セルロース、ガラス、シリコン片、ステンレス系樹脂などの物質的吸着剤、イムノアッセイ用プレート（ヌンク社）、弱塩基性陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダウエックス３（ダウケミカル社））などがある。
担体に抗体を保持させるには、ブロムシアン法、及びグルタルアルデヒド法などの常法による行うことができる。また、より簡便な方法として物理的に抗体表面に吸着させてもよい。標識剤を結合させた抗体における標識剤としては、放射性同位元素、酵素、螢光物質、発光物質などが挙げられるが、酵素を用いるのが好ましい。
該酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼを用いることができ、特にペルオキシダーゼが好ましい。
本発明の免疫化学的測定系における被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液等の体液、又は、動物細胞やその培養上清がある。本発明の免疫化学的測定方法を行う場合、担体に保持された抗体に、測定すべきＮｏｘ１ポリペプチドなど分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後、標識剤と抗Ｎｏｘ１抗体との結合物を加えて反応させる。得られた反応生成物に標識剤、例えば酵素の基質を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定することにより該反応生成物の酵素活性を知ることができる。これを既知量の標識剤、例えば酵素の標準溶液に対してあらかじめ行い、Ｎｏｘ１ポリペプチドなどとの吸光度、又は蛍光強度との関係を標準曲線として作成しておき、未知量のＮｏｘ１ポリペプチドを含む分析対象物（被検試料）について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線と比較し、分析対象物中のＮｏｘ１ポリペプチド等の量を測定する。
また、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片を検出することを特徴とする、ガン診断方法を提供する。該ポリヌクレオチド、又はその断片の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により常法で行うことができる。
該ポリメラーゼ連鎖反応、又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応において、配列番号１のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライマーとして、アンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして用いる。該フォワードプライマーの長さは、特に制限する必要はないが、通常１４〜６０ベースであり、かつリバースプライマーの長さも特に制限する必要はないが、通常１４〜６０ベースとするのが好ましい。また、本発明のガン診断方法で用いるフォワードプライマー、及びリバースプライマーの例を挙げると下記のものがある。
また、前記リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う場合に用いる、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びＴａｑＭａｎプローブの例を挙げると下記のものがある。
本発明における、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡは、Ｎｏｘ１遺伝子の発現を抑制し、Ｎｏｘ１ポリペプチドの産生を低下させる。したがって、該ｓｉＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドを用いることにより、突然変異Ｒａｓ遺伝子に誘導される細胞のガン化、又はガンの進行を抑制することができるであろう。
なお、本発明のｓｉＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドとは、配列番号１の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に相補的なヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドをいう。
本発明のｓｉＲＮＡは、また、配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応するものであってもよい。また、該ｓｉＲＮＡの長さは、１００ｂｐ未満、好ましくは８〜９９ｂｐ、特に好ましくは１０〜３０ｂｐである。また、好ましいｓｓｉの例を挙げると下記のものがある。
また、本発明のｓｉＲＮＡは、治療対象に直接投与するか、治療対象から細胞を取り出した後、インフェクションさせて該細胞を治療対象に戻すか、又は発現ベクターに組み込んだ後、該ベクターを治療対象に投与して発現させることにより使用することができる。
したがって、本発明では、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡを含む、ガン治療用医薬組成物を提供する。
該医薬組成物は、先に記載した抗体を含む医薬組成物と同じく、従来使用されている医薬用の材料を使用し、かつ常法で製剤することができる。また、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、例えば、ヒト、その他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。その投与量は、対象の状態、投与ルートなどにより適宜変わるが、例えば、経口投与する場合、一般的に、体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜４０００ｍｇ、好ましくは約２０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ｓｉＲＮＡの１回投与量は投与対象、対象ガンの状況などによっても異なるが、例えば、注射剤の形で体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜２０００ｍｇ程度、好ましくは約２０〜１０００ｍｇ程度、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ程度を静脈から投与するのが好ましい。
また、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡによって形質転換された細胞を含む、ガン治療用医薬組成物を提供する。
ここで該形質転換される細胞は、第三者から提供を受けた細胞であっても、治療対象の患者から取り出された細胞であってもよい。また、該形質転換した細胞をガン治療用細胞として使用することができる。
また、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列、又は該部分配列の少なくとも１塩基が付加、欠失、又は置換された変異ヌクレオチド配列からなり、かつ、ヒト細胞のＮｏｘ１ポリペプチドの発現を抑制するＲＮＡ分子を提供する。該ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）は、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻、４９４頁、２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列をもとに設計することができる。
なお、本発明のＲＮＡ分子をＩｎ ｖｉｖｏ又はＩｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合、該ＲＮＡ分子とその相補的ＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡ分子とする。この場合、該二本鎖ＲＮＡ分子が細胞内で分解しないよう、又は一本鎖に解離しないよう処理するのが好ましい。例えば、該ＲＮＡ分子の３’−末端に水酸基付加する、二本鎖の両末端をチオホスホリル基によって化学結合させる、又各鎖の間に紫外線、ビス（２−クロロメチル）アミン、４−チオウラシル、ソラレンなどの二官能基により化学結合を誘導するなどの方法で処理することである。本発明の該ＲＮＡ分子は、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に伴うＮｏｘ１遺伝子の発現を抑制するものであるから、細胞のガン化防止、ガンの進行抑制、治療用の医薬組成物として使用することができる。
また、本発明は、Ｎｏｘ１遺伝子を標的とするガン細胞増殖抑制物質のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法において、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞や、Ｎｏｘ１遺伝子でトランスフェクションした正常細胞を、スクリーニング対象物質と接触させた後、Ｎｏｘ１遺伝子の発現とその酵素活性の不活化を検出する。次に、該形質転換細胞を、スクリーニング対象物質とともに培養して増殖抑制能を調べる。
また、スクリーニング対象化合物によるＮｏｘ１遺伝子発現への影響は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるｍＲＮＡ発現増減の検出、抗体によるＮｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチド、又はそのペプチド断片の検出、又はその形質転換細胞の形態変化を観察することで行うことができる。
該スクリーニング方法で使用する、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞は特に制限されないが、例えば、Ｈ−Ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞、又は膵臓癌細胞などを使用することができる。また、Ｎｏｘ１遺伝子の導入に用いるベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（コントロール）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｎｏｘ１などを用いることができ、さらに、ｓｉＲＮＡを発現させるベクターとして、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒを用いることができる。
なお、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はＮＲＫ細胞にｐＥＧＦ−Ｃ１−Ｎｏｘ１ベクターをリポフェクタミン法を用いて持続的にトランスフェクトして、Ｎｏｘ１を高発現する細胞株を樹立することができる。あるいは、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する膵臓癌細胞を利用することもできる。該膵臓癌細胞は、ヒト膵臓癌患者より、分離・樹立したものを用いるのが好ましい。これらの細胞を、ＣＯ２５％の存在下、標準培養液（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、牛胎仔血清（ＦＢＳ）１０％含有）中で培養する。スクリーニングは、マルチプレート（９６穴、４８穴）に細胞を培養して、スクリーニング対象物質を加え、大量、迅速に処理することができる。
【実施例１】
突然変異Ｒａｓ遺伝子によるＮｏｘ１遺伝子の発現上昇の確認
本発明者らは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮｏｘ１遺伝子の過剰発現が、スーパーオキシドの生成と細胞増殖を上昇させることから（１及び２）、Ｎｏｘ１が特定のがん遺伝子の形質発現と関連すると考えた。そこで、Ｋ−Ｒａｓ Ｖａｌ１２ガン遺伝子で形質転換した細胞を用いて、Ｒａｓガン遺伝子によるＮｏｘ１遺伝子発現の上昇を確認した。
まず、ラット腎臓細胞（ＮＲＫ）及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞（Ｋｉｒｓｔｅｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＮＲＫ ｃｅｌｌｓ）を準備した。なお、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫは、ＡＴＣＣから購入した。
まず、ラット腎臓細胞（ＮＲＫ）及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞におけるＮｏｘ１の発現の有無を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出した。該リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応では、配列番号１５のフォワードプライマー、及び配列番号１６のリバースプライマー、及び配列番号１７のＴａｑＭａｎＭＧＢプローブを使用した。
なお、該リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（アプライド・バイオシステムズ）を用い、反応条件はデオフォルト設定で行った。解析値の標準化にはｒＲＮＡ１８Ｓを用いた。
該リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子発現の解析を行った結果、図１（ａ）のグラフに示されているように、Ｋ−Ｒａｓガン遺伝子で形質転換したＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞において、Ｎｏｘ１遺伝子の発現は上昇していた。
【実施例２】
突然変異Ｒａｓ遺伝子による一過的トランスフェクションによるＮｏｘ１遺伝子の発現上昇の確認
突然変異Ｒａｓ遺伝子の一過性のトランスフェクションによる影響を解析するため、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（空ベクター）、及びｐｃＤＮＡ３．１担持Ｒａｓ Ｖａｌ１２ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１ ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｒａｓ Ｖａｌ１２ ｖｅｃｔｏｒｓ）を使用して、ＮＲＫ細胞に一過的にトランスフェクションし、４８時間後、Ｎｏｘ１の発現を検出するため、実施例１と同じ方法でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行った。その結果、図１（ｂ）に示すように、コントロールベクターを用いた場合の発現と比較して、Ｈ−Ｒａｓ Ｖａｌ１２を一過的にトランスフェクションしたＮＲＫ細胞においても、Ｎｏｘ１遺伝子の発現は、増加していた。なお、トランスフェクションしたＲａｓ Ｖ１２の発現は、ウサギ抗Ｒａｓ抗体を用いるイムノブロッティング（ＩＢ）で確認した。
なお、該イムノブロッティングは、試料細胞１×１０５個を、２×サンプルバッファー（０．１Ｍ トリスＣｌ、ｐＨ６．８、グリセロール２０％、ＳＤＳ４％、ＤＴＴ３．１％、ＢＰＢ０．００１％）で可溶化し、該ポリペプチドをＳＤＳゲル電気泳動により分離し、続いてイムノブロッティングにより解析した。
タンパク質をトランスファーバッファー（２５ｍＭ トリスＣｌ ｐＨ８．３、９２ｍＭグリシン、メタノール２０％）中で電気的にニトロセルロース膜に移し、抗−Ｒａｓ抗体（１次抗体）と、ＨＲＰ−結合抗ウサギ−ＩｇＧ抗体に反応させ、化学発行（ＥＣＬ）法で検出した。
このように実施例１及び２の結果から、Ｎｏｘ１遺伝子発現の上昇は突然変異Ｒａｓガン遺伝子の働きによることが示された。
なお、無血清状態で一晩培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、血清（３０％）又は上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）５０ｎｇ／ｍｌで促進処理を行ったのち、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により解析した。その結果、図１（ｃ）、及び（ｄ）に示すように培養開始から１２時間以内にＮｏｘ１遺伝子の発現が６〜２０倍に上昇した。つまり、Ｎｏｘ１遺伝子の発現は、細胞増殖を促進する因子と関連しており、これは、血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）とアンジオテンシンＩＩの両方がスーパーオキシド形成、及び血管平滑筋細胞のＮｏｘ１遺伝子の発現を誘導するという報告と一致している（１、４）。
【実施例３】
突然変異Ｒａｓ遺伝子によるＮｏｘ１遺伝子発現を起こすシグナル経路の解析
突然変異Ｒａｓ遺伝子によるＮｏｘ１遺伝子の発現上昇を起こす、Ｒａｓシグナル経路の下流を解析するため、一連の実験を行った。実施例１および２において、細胞にＭＡＰＫＫの阻害剤であるＰＤ９８０５９（ＰＤ：２０μＭ、１００μＭ）を１２時間処理し、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞におけるＮｏｘ−１の発現、血清、ＥＧＦによるＮｏｘ１の発現誘導をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により解析した。
その結果、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞におけるＮｏｘ−１の発現はＰＤ９８０５９により濃度依存性に抑制された（図１（ａ））。また、血清、ＥＧＦによるＮｏｘ１の発現誘導もそれぞれＰＤ９８０５９ ２０μＭで抑制された（図１（ｃ）及び（ｄ））。
一方、コントロールの実験において、ＰＩ３キナーゼの阻害剤であるウォルトマニン（ｗｏｒｔｍａｎｉｎ：１００ｎＭ）は、Ｈ−Ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮｏｘ１の発現上昇を阻害しなかった（データ示さず）。これらの結果から、突然変異Ｒａｓ遺伝子とその増殖因子のシグナルが、ＰＩ３Ｋを介する経路ではなく、Ｒａｓ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫを介してＮｏｘ１の発現を誘導していることが示された。
【実施例４】
突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与
オリゴヌクレオチド１−Ｓ、１−ＡＳをアニーリングさせ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ，Ｈ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）にサブクローニングし、ＲＮＡｉ（１）とした。同様にオリゴヌクレオチド３−Ｓ、３−ＡＳをアニーリングさせ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ，Ｈ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）にサブクローニングし、ＲＮＡｉ（３）とした。さらにオリゴヌクレオチド５−Ｓ、５−ＡＳをアニーリングさせ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ，Ｈ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）にサブクローニングし、ＲＮＡｉ（５）とした。また、コントロールベクターとして、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用した。
ＲＮＡｉ（１）は、配列番号３の２２３位から２４１位を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクションである。ＲＮＡｉ（３）は、配列番号３の５７８位から５９６位を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクションである。ＲＮＡｉ（５）は、配列番号３の１２２４位から１２４２位を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクションである。
なお、各オリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである。
該ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）、およびｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄ各４μｇを、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ：Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いて、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞１×１０６個にそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞は、選択を行うため、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％とＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢを４００μｇ／ｍｌとなるように加えたＤＭＥＭ培地を用い、ＣＯ２５％の湿潤環境下において３７℃で２〜３週間培養した。培養後、生き残ったコロニーを単離した。
ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）を持続的にトランスフェクトされた細胞株それぞれ３クローンずつ（Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１５；Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１７，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６；Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−２，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−３，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７）、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄを持続的にトランスフェクトされた細胞を２クローン（Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−２）選択した。これらのコンストラクションのトランスフェクションは、Ｍ１３Ｆ及び３．０ＲｅｖをプライマーとしてＰＣＲで確認した（図２）。ＰＣＲの温度条件は、９４℃２分、（９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分）を３０サイクル、７２℃１０分、とし、サーマルサイクラー装置はＴａｋａｒａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（宝酒造株式会社）を用いた。
次に、Ｎｏｘ１遺伝子が関与する細胞の形態の変化を比較した。その結果、図３に示すように、ＲＮＡｉ（１）−（３）をトランスフェクトされたＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞が伸張したのに対し、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ ＮｅｇａｔｉｖｅコントロールプラスミドをトランスフェクトされたＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞は、導入前の細胞で観察されたように、形態は丸いままだった。
次に、細胞の形質転換を、足場非依存性の増殖能を見ることにより調べるため、軟寒天培地アッセイを行った。細胞増殖に必要な栄養素を含んだ寒天０．５３％を含むアガーロースレイヤーを直径６ｃｍの培養皿に入れて固め、その上に寒天０．３％とＦＢＳ１０％を含んだＤＭＥＭ倍地に懸濁した細胞を、培養皿一枚当たりの細胞最終濃度が１．５×１０４個になるように重層した。次いで、ＣＯ２５％の湿潤環境下、３７℃で培養し、細胞コロニーの出現を３週間にわたり観察した。ソフトアガー培養において示された細胞株の接着依存的細胞増殖を測定し、その３回の＋／−平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を図４に示した。その結果、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞およびｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ Ｎｅｇａｔｉｖｅコントロールプラスミド（ｎｅｇ−１とｎｅｇ−２）のトランスフェクションでは、多くのコロニー形成が見られたが、ＲＮＡｉ（１）−（５）のトランスフェクションではコロニー形成が著明に抑制された。
さらに、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１（ｎｅｇ−１）、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７（ｉ（１）−７）、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９（ｉ（３）−１９）、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｉ（５）−７（ｉ（５）−７）の各細胞を、培養皿から１０４個ずつ、培養液に移し、ＣＯ２５％存在下、標準培養液（ＤＭＥＭ、ＦＢＳ（１０％））中で６日間、液体培養した。次いで、液体倍地中の細胞数を計測して、その増殖曲線を図５に示した。その結果、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）１９、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７の各細胞は、液体培養でも増殖率が減少したが、対照的に、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１では増殖阻害効果は確認できなかった。
【実施例５】
Ｎｏｘ１遺伝子がコードするＮＡＤＰＨ酸化酵素によるスーパーオキシド産生の確認
本発明者らは、突然変異Ｒａｓが誘導するスーパーオキシド産生におけるＮｏｘ１の役割を評価するため、実施例４の形質転換細胞を用いて、スーパーオキシドの産生をＮＢＴ還元解析で測定した。本実施例では、ＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）解析にＳｕｈらの方法を用いた（１）。すなわち、ＮＢＴ０．２５％を含むハンクス（Ｈａｎｋｓ）溶液０．２ｍｌに、活性酸素を消化する酵素、スーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ）を４０単位加えた溶液と加えない溶液を用意し、２×１０５個の細胞を懸濁し３７℃で８分間処理した。処理された細胞を低速度遠心で分離し、ピリジン０．５ｍｌを加えて可溶化し、５１０ｎｍにおける吸光度を測定してＮＢＴの減少を定量した（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ １１，０００／Ｍ／ｃｍ）。得られたデータは、図６に３回の＋／−ｓ．ｅ．ｍ．で示した。
該解析の結果、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫおよびＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１は、ＮＢＴの還元を増加させ、これはスーパーオキシドジスムターゼ処理により、ＮＲＫと比較し阻害された。対照的に、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７は、Ｋ−Ｒａｓがん遺伝子のＲＯＳ生産刺激効果をＮＲＫ細胞レベルまで低下させ（図６）、Ｎｏｘ１が、突然変異Ｒａｓ形質転換細胞における、スーパーオキシド生産の上昇に関与することが示された。
【実施例６】
ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）による、Ｎｏｘ１発現の減少の確認
本発明者らは、ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）によりＮｏｘ１発現が減少することを確認するため、次の手順で解析を行った。すなわち、ＧＦＰ−ｒａｔＮｏｘ１の発現におけるＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）の阻害効果を評価するために、ＧＦＰ−ｒａｔＮｏｘ１を、ＲＮＡｉ（１）−（５）それぞれとともに、共トランスフェクションし、実施例２と同様にイムノブロッティング解析を行った。図７左のパネルに示されるように、予想されるＧＦＰとｒａｔＮｏｘ１の融合ポリペプチドが産生されたこと、そしてＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）の共発現は、これらのベクターの量依存的にＧＦＰ−ｒａｔＮｏｘ１融合蛋白質の生産を抑えることを明らかにした。なお、図７左のパネルにおけるＧＦＰ−Ｎｏｘ１の発現は、抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロッティングにより定量的に決定したものであり、図７左のパネルの数字はトランスフェクションしたＤＮＡの量（μｇ）を示している。また、ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（５）は、どれもラットのＮｏｘ１をターゲットとしている。図７左のパネルと同様の手法を用いて、ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（５）がヒトのＮｏｘ１を抑制しない、すなわち、該ＲＮＡｉコンストラクションは、標的遺伝子に対する特異性が高いことを図７右のパネルに示す。
また、内在性のＮｏｘ１のｍＲＮＡ発現が、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７の各細胞において、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１に比べて確かに抑制されていることを、ＲＴ−ＰＣＲによりで示した。その結果を図８に示す。
実施例６で用いたＰＣＲ用プライマーの配列
本実施例における結果は、細胞骨格と接着蛋白質の構成変化による形態変化と同様に、Ｎｏｘ１遺伝子の発現率の上昇と突然変異Ｒａｓによる形質転換が関連していることを示している。
【実施例７】
ｓｉＲＮＡにより一度抑制されたＮｏｘ１を回復することによる細胞への影響
Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７に、実施例４と同一手法によってｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＧＦＰ）、ｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１（ＧＦＰ−Ｎｏｘ１）をそれぞれトランスフェクトし、実施例６と同様の手法によりイムノブロッティングした（図９）。実施例６、図７右のパネルで示したように、ＲＮＡｉ（１）およびＲＮＡｉ（５）はどちらもヒトＮｏｘ１の発現を抑制しない。そのため、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７細胞にｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１をトランスフェクトしても、これがｓｉＲＮＡによって抑制されることはない。
図１０に示したように、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にコントロールベクターを入れただけ（ｉ（１）−７＋ＧＦＰ）ではｓｉＲＮＡを解除できず細胞は扁平だが、ｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１をトランスフェクトすることにより（ｉ（１）−７＋ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−３）、形態は、以前のＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞に近い窮状の形態に戻った（図１０）。
実施例４と同手法による増殖曲線でも、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にコントロールベクターを入れたもの（ＧＦＰ−５９）やＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７にコントロールベクターを入れたもの（ＧＦＰ−７８）に比べ、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１を入れたもの（ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−３）やＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７にｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１を入れたもの（ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−１１）では、増殖が早くなった（図１１）。また、実施例４と同様の軟寒天培地アッセイでも、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にコントロールベクターを入れたもの（ｉ（１）−７＋ＧＦＰ−５９、ｉ（１）−７＋ＧＦＰ−６０）にくらべ、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１を入れたもの（ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−２、ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−３）では、もとのＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞と同程度までコロニー形成が回復した（図１２）。
【実施例８】
突然変異Ｒａｓの形質転換に対するＮｏｘ１遺伝子の発現の影響
Ｎｏｘ１の阻害剤であるジフェニレンヨードニウム（Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ｉｏｄｏｎｉｕｍ：ＤＰＩ）を用いて、Ｎｏｘ１遺伝子の発現による、突然変異Ｒａｓによる形質転換細胞の形態に及ぼす影響を調べた。すなわち、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞、及びＮＲＫ細胞を、ＤＰＩ２０μＭ又はＰＤ９８０５９ ３０μＭを含む培地中で、ＣＯ２５％を含む湿潤環境下において３７℃で一晩培養し、形態変化を観察した。図１３に細胞形態を記録した写真を示す。
図１３に示すように、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞を、フラボタンパク質阻害剤であるＤＰＩ、又は抗酸化剤ｎ−アセチルシステイン（ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）１０ｍＭ（データ示さず）で、一晩処理した場合、該細胞が一過的に平たい形態を帯び、ＮＲＫ細胞に近い形態になった。さらに、図１３に示すように、ＰＤ９８０５９で処理されたＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞においても、このような形態の変化が観察された。したがって、Ｎｏｘ１遺伝子発現の上昇が、Ｒａｓ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路による突然変異Ｒａｓの形質転換促進に必須であることが示された。
【実施例９】
突然変異Ｒａｓによる腫瘍形成に対する、ｓｉＲＮＡの影響
Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６およびＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−２を無胸腺マウスに移植し、腫瘍形成を観察した。すなわち該細胞１０６個をＰＢＳ０．２ｍｌに懸濁した後、ヌードマウス（無胸腺：Ｎｕ／Ｎｕ）の皮下に移植した。その後、該全ヌードマウスの腫瘍形成を１ヶ月間に渡り観察し、かつ腫瘍の体積を測定した。その結果を図１４に示した。図１４において、黒塗りのバーは腫瘍の体積であり、誤差のバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示し、また分数は使用した全マウスに対する、腫瘍を許容したマウスの割合（腫瘍／合計）を示している。
図１４に示すように、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１は、２週間以内に活発な腫瘍を形成した。対照的に、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６は、腫瘍の増殖が著しく抑えられていた。解剖により組織学的観察すると、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１で形成された腫瘍は、血管が増加していた。これは、Ｎｏｘ１遺伝子が、血管内皮増殖因子の産生増加による血管新生を誘導する可能性と一致している（１）。また、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６で形成された、小さな腫瘍では、大部分の細胞でネクローシスの兆候が示されていた（データ示さず）。
これまでの実験結果から、突然変異Ｒａｓ（ガン遺伝子）は、分裂促進性酸化酵素Ｎｏｘ１をＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路を介して上昇させ、一方、Ｎｏｘ１遺伝子の発現は、該Ｒａｓによる細胞の形質転換、ガン形成、及びその進行に必須である。すなわち、本発明者らの研究により、突然変異Ｒａｓによる形質転換において、Ｎｏｘ１ポリペプチドがレドックスシグナル分子として必須の役割を果たしているという分子機構が明らかになった。
Ｇｐ９１ｐｈｏｘのホモログであるＮｏｘファミリータンパク質Ｎｏｘ１〜５は、非貪食細胞から同定され、それぞれ様々な細胞プロセスにおいて特異的な機能を果たしていると報告されている（１及び５−９）。それらの中で、Ｎｏｘ１遺伝子は増殖因子（１及び４）やガン遺伝子による、分裂促進性シグナルを仲介する、膜貫通型酸化酵素をコードしている点で特異である。
ＲＯＳが腫瘍の増殖促進に関係すること、及び悪性ガン細胞においてＲＯＳ産生がＲＯＳ生産酵素を誘導する可能性を考慮すると（７）、Ｎｏｘ１遺伝子及びそのポリペプチドは、ガン進行を抑制し、その治療を可能にする標的分子にできると考えられる。
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
（配列番号：１） ヒトＮｏｘ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：２） ヒトＮｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
（配列番号：３） ラットＮｏｘ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４） ラットＮｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
（配列番号：５） ヒトガン診断方法で用いるＮｏｘ１遺伝子に対するフォワードプライマーの塩基配列を示す。
（配列番号：６） ヒトガン診断方法で用いるＮｏｘ１遺伝子に対するリバースプライマーの塩基配列を示す。
（配列番号：７） ヒトのＮｏｘ１遺伝子をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う場合に用いるフォワードプライマーの配列を示す。
（配列番号：８） ヒトのＮｏｘ１遺伝子をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う場合に用いるリバースプライマーの配列を示す。
（配列番号：９） ヒトのＮｏｘ１遺伝子をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う場合に用いるＴａｑＭａｎプローブの配列を示す。
（配列番号：１０） 本発明のヒトＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１１） 本発明のヒトＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１２） 本発明のラットＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１３） 本発明のラットＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１４） 本発明のラットＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１５） 実施例１において、Ｎｏｘ１の発現の有無を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出するために用いたフォワードプライマーのヌクレオチド配列である。
（配列番号：１６） 実施例１において、Ｎｏｘ１の発現の有無を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出するために用いたリバースプライマーのヌクレオチド配列である。
（配列番号：１７） 実施例１において、Ｎｏｘ１の発現の有無を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出するために用いたＴａｑＭａｎＭＧＢプローブのヌクレオチド配列である。
（配列番号：１８） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：１９） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２０） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２１） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２２） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２３） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２４） 実施例４における、Ｎｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡのコンストラクションのトランスフェクションを確認するために用いたＭ１３プライマーのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２５） 実施例４における、Ｎｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡのコンストラクションのトランスフェクションを確認するために用いた３．０Ｒｅｖプライマーのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２６） 実施例６において、Ｎｏｘ１発現の減少を確認するために用いたフォワードプライマーのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：２７） 実施例６において、Ｎｏｘ１発現の減少を確認するために用いたリバースプライマーのヌクレオチド配列を示す。
（参考文献）
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【技術分野】
本発明は、ガン関連遺伝子、及び該遺伝子にコードされたポリペプチドに基づく、ガン診断方法、ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、及び医薬組成物に関するものである。さらに詳細に述べると、突然変異Ｒａｓガン遺伝子と関連するＮｏｘ１遺伝子、該遺伝子にコードされたポリペプチド、及び該ポリペプチド特異的抗体を用いるガン診断方法、ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、及びガン治療に用いる医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
従来から、突然変異Ｒａｓガン遺伝子は、哺乳動物細胞のガン化、及びその進行に大きな影響を与えることが知られている（非特許文献１）。例えば、突然変異Ｒａｓガン遺伝子は、その主要な下流経路の１つであるＲａｆ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路を介して、動物細胞をガン化し、進行させると考えられている（非特許文献２）。
そして、このような知見に基づき、Ｎ−ｒａｓ腫瘍サプレッサーが欠損しているガン細胞を対象として、ｐ９４ＲＢをコードする遺伝子を含む発現ベクター遺伝子を投与する腫瘍抑制遺伝子治療法（特許文献１）や、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ及びＮ−ｒａｓの発ガン遺伝子を利用して腫瘍抑制遺伝子を同定する方法（特許文献２）などが開発されてきた。
近年の研究により、突然変異Ｒａｓ遺伝子により形質転換された細胞で、スーパーオキシド、Ｈ２Ｏ２などの活性酸素種（ＲＯＳ）が生成されることが報告された（非特許文献３）。そして、細胞内の低レベルＲＯＳは、増殖因子で誘導される細胞増殖において、シグナル分子としての役割を演じていることから（非特許文献４及び５）、突然変異Ｒａｓ遺伝子に関連したＲＯＳ生成の上昇は、動物細胞の異常増殖の原因になると考えられるようになった。
しかし、突然変異Ｒａｓ遺伝子によるガン化、ガンの進行促進などに関与する、活性酸素産生酵素はこれまで知られていなかった。
【特許文献１】特表平０８−５０８１６６号公報
【特許文献２】特表平１０−５０４４４８号公報
【非特許文献１】Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２，８５１−８９１（１９９３）
【非特許文献２】ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｆ．ＴＣＢ．９，Ｍ５３−Ｍ５６（１９９９）
【非特許文献３】Ｉｒａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，１６４９−１６５２（１９９７）
【非特許文献４】Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０，２９６−２９９（１９９５）
【非特許文献５】Ｂａｅ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２１７−２２１（１９９７）
【発明の開示】
本発明は、突然変異Ｒａｓガン遺伝子と関連するＮｏｘ１遺伝子、該遺伝子にコードされたポリペプチド、及び該ポリペプチド特異的抗体を用いるガン診断方法、ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、及びガン治療に用いる医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、研究の結果、突然変異Ｒａｓガン遺伝子が、ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路において、スーパーオキシドを生成するＮＡＤＰＨ酸化酵素の触媒サブユニットのホモログＮｏｘ１（１、２及び３）の発現を著しく上昇させ、かつ該Ｎｏｘ１遺伝子のｓｉＲＮＡが、細胞接着依存性の増殖、その形態変化、無胸腺マウスにおける腫瘍の形成など、突然変異Ｒａｓ遺伝子の表現型を効果的に抑えるという知見を得た。本発明者らは、当該知見に基づき前記課題を解決し、本発明を達成した。
したがって、本発明は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（２）配列番号２のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド；又は（３）（１）又は（２）のポリペプチドの部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド断片を含む、抗体製造用組成物を提供する。
また、本発明は、前記抗体製造用組成物を、哺乳類に投与することを含む、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の製造方法を提供する。
さらに、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体を提供する。
さらに、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体を、生物試料と接触させることを含む、ガンの診断方法を提供する。
さらに、本発明は、前記抗体を含む、ガン診断用組成物、及びガン治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片を検出することを特徴とする、ガン診断方法を提供する。該検出は、ポリメラーゼ連鎖反応、又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により該ポリヌクレオチド、又はその断片を検出することにより行うのが好ましい。
さらに、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡを提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡを含む、ガン治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡによって形質転換された細胞を含む、ガン治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、Ｎｏｘ１遺伝子を標的とするガン細胞増殖抑制物質のスクリーニング方法であって、（１）Ｎｏｘ１遺伝子でトランスフェクションし、該形質転換細胞をスクリーニング対象物質と接触させた後、Ｎｏｘ１活性の不活化を検出（１次スクリーニング）し、かつ（２）そのＮｏｘ１を不活化する物質が、がん細胞増殖を抑制するか否かを調べることにより（２次スクリーニング）、Ｎｏｘ１遺伝子の発現、及びＮｏｘ１活性の不活化を検出することを含む、該スクリーニング方法を提供する。
（定義）
本明細書における「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸配列の一次構造、該一次構造のポリペプチド断片、立体構造を伴う生物活性を有するポリペプチド、又はタンパク質を意味する。
本明細書における「Ｎｏｘ１ポリペプチド」とは、Ｎｏｘ１遺伝子にコードされているポリペプチドをいい、全長ポリペプチド、及びポリペプチド断片の双方を含む。
本明細書における「ホモログ」という用語は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はタンパク質と、アミノ酸配列が相同性を有し、かつ共通の生物活性又は抗原性を有するポリペプチドをいう。
本明細書における「ｓｉＲＮＡ」という用語は、特定の遺伝子の発現を抑制する短ＲＮＡ断片、又は該ＲＮＡ断片とその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。
本明細書における「突然変異Ｒａｓ遺伝子」とは、腫瘍の形成に関与する状態に突然変異したヒトＲａｓ遺伝子をいう。例えば、ヒト膵臓ガンで多いＫ−Ｒａｓの１２番目のグリシンからアスパラギン酸への突然変異、又はバリンやアルギニンへの突然変異、さらに肺ガンで見られる１２番目、その他１３番目、６１番目に起きる変異を有するヒトＲａｓ遺伝子である。
本明細書における、ポリペプチドの「アミノ酸配列の部分配列」とは、該アミノ酸配列に含まれる、少なくとも８個以上の連続するアミノ酸残基を含む配列をいう。
本明細書における「オリゴヌクレオチド」とは、通常、塩基を１００個未満、好ましくは６〜９９個を含むヌクレオチドをいう。
【図面の簡単な説明】
図１（ａ）は、実施例１におけるリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子発現の解析を行った結果を示すグラフである。
図１（ｂ）、（ｃ）及び（中は、実施例２において、実施例１と同じ方法でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、Ｎｏｘ１の発現を検出した結果を示す。
図２は、実施例４において、ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）を持続的にトランスフェクトされた細胞株における、形質転換の結果を、Ｍ１３Ｆ及び３．０ＲｅｖをプライマーとしてＰＣＲで確認した電気泳動像である。
図３は、実施例４における、Ｎｏｘ１遺伝子が関与する細胞の形態の変化を比較した写真を示す。
図４は、実施例４において、細胞の形質転換を、足場非依存性の増殖能により調べるため、ソフトアガー培養において示された細胞株の接着依存的細胞増殖を測定し、その結果を示したグラフである。
図５は、実施例４において、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１（ｎｅｇ−１）、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７（ｉ（１）−７）、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９（ｉ（３）−１９）、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７（ｉ（５）−７）の各細胞の数を液体倍地中で計測した、その増殖曲線を示すグラフである。
図６は、実施例５において、処理された細胞を可溶化し、５１０ｎｍにおける吸光度を測定してＮＢＴの減少を定量した結果を示すグラフである。
図７は、実施例６において、ＧＦＰとｒａｔＮｏｘ１の融合ポリペプチドが産生されたこと、そしてＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）の共発現は、これらのベクターの量依存的にＧＦＰ−ｒａｔＮｏｘ１融合蛋白質の生産を抑えること（左パネル）、また該ＲＮＡｉコンストラクトは，標的遺伝子に対する特異性が高いこと（右パネル）を示すグラフである。
図８は、実施例６において、内在性のＮｏｘ１のｍＲＮＡ発現が、各細胞において、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１に比べて抑制されていることを、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した電気泳動像である。
図９は、実施例７において、使用したｓｉＲＮＡがＧＦＰ、またはＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１の発現を抑制しないことを、実施例６と同様の手法によりイムノブロッティングすることにより示した像である。
図１０は、実施例７において、ｓｉＲＮＡにより一度抑制されたＮｏｘ１を回復することによる細胞への影響をＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞の形状変化により示す写真である。
図１１は、ｓｉＲＮＡにより一度抑制されたＮｏｘ１を回復することによる細胞への影響を、細胞の増殖速度により示すグラフである。
図１２は、ｓｉＲＮＡにより一度抑制されたＮｏｘ１を回復することによる細胞への影響を、足場非依存性増殖能により調べるため、ソフトアガー培養法を用いて細胞の接着依存的増殖能を検討した結果を示すグラフである。
図１３は、実施例９における、突然変異Ｒａｓの形質転換に対するＮｏｘ１遺伝子の発現の影響の検討で、細胞の形態変化を観察した結果を示すグラフである。
図１４は、実施例９における、突然変異Ｒａｓによる腫瘍形成に対するｓｉＲＮＡの影響を、ヌードマウスの腫瘍形成を１ヶ月間に渡り観察し、かつ腫瘍の体積を測定することにより示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の抗体製造用組成物は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（２）配列番号２のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド；又は（３）（１）又は（２）のポリペプチドの部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド断片を含むものである。
なお、本発明の抗体製造用組成物は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、特に好ましくは９５％の相同性を有するポリペプチドを含んでいてもよい。本明細書におけるアミノ酸配列の相同性とは、一線上に並べた場合における、基準となるアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列との同一性（％）をいう。該相同性は、塩基配列やアミノ酸配列の相同性検索を行うための標準のプログラムである、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−６９）等の解析ソフトで、デフォルト（初期設定）のパラメータを用いて計算することができる。
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、Ｎｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチドであり、該ポリペプチドの産生を検出することにより、検査対象の組織のガン化、及びガンの進行をスクリーニングできる。なお、該組成物で製造された抗体は、ヒトＮｏｘ１ポリペプチドに特異的であるが、さらに非ヒト動物が産生する該ポリペプチドのホモログにも特異性を有する場合、非ヒト動物のガン化、及びガン進行のスクリーニングにも使用できる。したがって、該抗体製造用組成物は、ヒトガン細胞検出用抗体、及びヒトＮｏｘ１ポリペプチドのホモログを産生し得る哺乳類のガン化、及びガン進行のスクリーニング用抗体の製造にも使用することができる。
また、配列番号２のアミノ酸配列の部分配列とは、該アミノ酸配列に含まれる、少なくとも８個以上の連続するアミノ酸配列をであって、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導するエピトープとなるものをいう。なお、該部分配列をエピトープとして用いる場合、適当なキャリアータンパク質を組み合わせて用いることができる。
また、本発明のポリペプチド断片は、前記ポリペプチド（１）及び（２）の断片であって、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導するものである。
また該ペプチド断片の長さは、特に限定されるものではないが、通常２０個〜２００個、好ましくは２０個〜１００個、さらに好ましくは２０〜７０個のアミノ酸残基長である。
本明細書において、ポリペプチド、該ホモログ及び該ポリペプチドの断片（以下、必要な場合はポリペプチドと略す。）は、標準的標記法に従い、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。該ポリペプチド等は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）とすることもできる。このエステルの側鎖Ｒの例を挙げると、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基、又はα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのアルキル基などがある。
また、本発明のポリペプチド等は、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が、ホルミル基、アセチル基などの保護基、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基で保護されたもの、又は糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
また、本発明のポリペプチド等は、生理学的に許容し得る無機又は有機酸付加塩として用いることができる。該無機酸付加塩の例を挙げると、塩酸、リン酸、臭化水素酸、及び硫酸の塩があり、また有機酸付加塩の例を挙げると、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、及びベンゼンスルホン酸などの塩がある。
すなわち、本発明の抗体製造用組成物は、前記ポリペプチド、そのホモログ、これらのペプチド断片、又はこれらの酸付加塩を含むものである。また、必要に応じて、該組成物はベヒクル、希釈剤、アジュバンドなどの成分を含んでいてもよい。
本発明では、前記抗体製造用組成物を用いて、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモログ、又は該ペプチド断片に特異的な抗体を製造する方法を提供する。
本発明の方法で製造する抗体は、本発明の目的に応じて使用できるものであれば特に制限されないが、例を挙げると、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体などがある。ここで、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは、全抗体中に数％のマウス由来抗体を含むものをいい、ヒト抗体とは１００％ヒト由来の抗体からなるものをいい、キメラ・ヒト抗体とは、マウス由来抗体を１０〜２０％含むものをいう。また、該抗体は、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、次の方法で製造することができる。まず、前記抗体製造用組成物を非ヒト哺乳動物に投与する。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行う。該非ヒト哺乳動物の例を挙げると、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリがあり、一般に好ましいのはマウス、又はラットである。
前記組成物で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生が認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓、又はリンパ節に含まれる抗体産生細胞採取し、同種、又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する。抗血清中の抗体価の測定は、標識化タンパク質と抗血清とを反応させ、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行う。また細胞融合は、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）などの常法で行うことができる。融合促進剤として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどを用いることができる。
また、骨髄腫細胞の例を挙げると、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／Ｏ、及びＡＰ−１などの非ヒト哺乳動物の骨髄腫細胞があり、特にＰ３Ｕ１が好ましい。融合に用いる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０程度であり、ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００を１０〜８０％度の濃度で添加し、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、種々の方法で行うことができる。例えば、抗原を直接、又は担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）と、ハイブリドーマ培養上清を接触させ、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体を含む溶液を接触させ、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体などを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を接触させ、次いで放射性物質や酵素などで標識したタンパク質の溶液と接触させ、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがある。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選別は常法で行うことができる。例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地に、１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））、又はハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は２０〜４０℃、培養時間は、通常５日〜３週間で、培養は、通常５％炭酸ガス存在下で行う。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
また、得られたモノクローナル抗体の分離精製は、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、及び電気泳動法などの免疫グロブリンの分離精製法、イオン交換体（ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相、又はプロテインＡ活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などの常法で行うことができる。
また、本発明のポリクローナル抗体は、免疫抗原である前記ポリペプチド等、又は該そのペプチド断片とキャリアータンパク質との複合体で、非ヒト哺乳動物を免疫し、その後、血清などの抗体含有成分を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
該免疫抗原とキャリアータンパク質との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率よく産生されるように決定する。例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で用いることができる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等を用いることができる。
該複合体抗原は、単独で、又は担体、希釈剤、さらに抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントとともに投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回行う。該ポリクローナル抗体は、免疫された哺乳動物の血液、腹水、卵黄などから採取する。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。また、ポリクローナル抗体の分離精製は、前記モノクローナル抗体の分離精製と同様に行うことができる。
本発明のガン診断用キットは、このようにして得られたポリクローナル、又はモノクローナル抗体を含む。また、該診断用キットは、必要に応じて、免疫反応用ウェル、染色剤、検出用の酵素標識抗体、洗浄液、抗体希釈液、検体希釈液、酵素基質、酵素基質液希釈液、その他の試薬を含むものである。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、Ｎｏｘ１遺伝子にコードされている特異的タンパク質の発現を抑制するものであるから、ガン化の予防、進行遅延、及び治療に使用することができる。
該抗体は、経口的に、又は非経口的に投与することができ、さらに該非経口的投与は、組織への局所的な投与を含む。
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、汎用されている担体などの製剤用成分、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、緩衝剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、コーティング剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、滑沢剤及び賦形剤などを用いることができる。また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの添加剤を用いてもよい。
製薬用成分の具体的な例を挙げると、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤、水、エタノール、単シロツプ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラツク、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖などの崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩等の滑沢剤などである。さらに必要に応じて、上記の各剤形について公知のドラッグデリバリーシステムの技術を採用し徐放化、局所適用化（トローチ、バッカル剤、舌下錠等）、薬物放出制御、腸溶性化、胃溶性化などを施すことができる。
また、非経口投与する場合、点滴、静脈注射、皮下注射、筋肉注射などの注射による投与、油脂製坐剤、水溶性坐剤、座剤による直腸投与などの形態とすることができる。該調剤は、製薬分野における通常の担体を用い、常法により容易に行うことができる。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、例えば、ヒト、その他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。その投与量は、対象の状態、投与ルートなどにより適宜変わるが、例えば、経口投与する場合、一般的に、体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜４０００ｍｇ、好ましくは約２０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ｓｉＲＮＡの１回投与量は投与対象、肝臓ガンの状況などによっても異なるが、例えば、注射剤の形で体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜２０００ｍｇ程度、好ましくは約２０〜１０００ｍｇ程度、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ程度を静脈から投与するのが好ましい。
また、本発明の抗体を、生物試料と接触させることを含む、免疫化学的測定法によって、生体組織や体液中のＮｏｘ１遺伝子の検出・定量を行い、ガンを診断することができる。
この免疫化学的測定法を行う場合、本発明の抗体を担体に保持する。該測定方法で用いる担体の例を挙げると、アガロースゲル（セファロース４Ｂ、及びセファロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社））、デキストランゲル（セファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−１００、及びセファデックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカル社））、ポリアクリルアミドゲル（バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、及びバイオゲルＰ−１００（バイオラッド・ラボラトリーズ社））、セルロース粒子（アビセル（旭化成））などのゲル粒子、ジエチルアミノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどのイオン交換セルロース、ガラス、シリコン片、ステンレス系樹脂などの物質的吸着剤、イムノアッセイ用プレート（ヌンク社）、弱塩基性陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダウエックス３（ダウケミカル社））などがある。
担体に抗体を保持させるには、ブロムシアン法、及びグルタルアルデヒド法などの常法による行うことができる。また、より簡便な方法として物理的に抗体表面に吸着させてもよい。標識剤を結合させた抗体における標識剤としては、放射性同位元素、酵素、螢光物質、発光物質などが挙げられるが、酵素を用いるのが好ましい。
該酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼを用いることができ、特にペルオキシダーゼが好ましい。
本発明の免疫化学的測定系における被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液等の体液、又は、動物細胞やその培養上清がある。本発明の免疫化学的測定方法を行う場合、担体に保持された抗体に、測定すべきＮｏｘ１ポリペプチドなど分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後、標識剤と抗Ｎｏｘ１抗体との結合物を加えて反応させる。得られた反応生成物に標識剤、例えば酵素の基質を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定することにより該反応生成物の酵素活性を知ることができる。これを既知量の標識剤、例えば酵素の標準溶液に対してあらかじめ行い、Ｎｏｘ１ポリペプチドなどとの吸光度、又は蛍光強度との関係を標準曲線として作成しておき、未知量のＮｏｘ１ポリペプチドを含む分析対象物（被検試料）について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線と比較し、分析対象物中のＮｏｘ１ポリペプチド等の量を測定する。
また、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片を検出することを特徴とする、ガン診断方法を提供する。該ポリヌクレオチド、又はその断片の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により常法で行うことができる。
該ポリメラーゼ連鎖反応、又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応において、配列番号１のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライマーとして、アンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして用いる。該フォワードプライマーの長さは、特に制限する必要はないが、通常１４〜６０ベースであり、かつリバースプライマーの長さも特に制限する必要はないが、通常１４〜６０ベースとするのが好ましい。また、本発明のガン診断方法で用いるフォワードプライマー、及びリバースプライマーの例を挙げると下記のものがある。
また、前記リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う場合に用いる、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びＴａｑＭａｎプローブの例を挙げると下記のものがある。
本発明における、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡは、Ｎｏｘ１遺伝子の発現を抑制し、Ｎｏｘ１ポリペプチドの産生を低下させる。したがって、該ｓｉＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドを用いることにより、突然変異Ｒａｓ遺伝子に誘導される細胞のガン化、又はガンの進行を抑制することができるであろう。
なお、本発明のｓｉＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドとは、配列番号１の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に相補的なヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドをいう。
本発明のｓｉＲＮＡは、また、配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応するものであってもよい。また、該ｓｉＲＮＡの長さは、１００ｂｐ未満、好ましくは８〜９９ｂｐ、特に好ましくは１０〜３０ｂｐである。また、好ましいｓｓｉの例を挙げると下記のものがある。
また、本発明のｓｉＲＮＡは、治療対象に直接投与するか、治療対象から細胞を取り出した後、インフェクションさせて該細胞を治療対象に戻すか、又は発現ベクターに組み込んだ後、該ベクターを治療対象に投与して発現させることにより使用することができる。
したがって、本発明では、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡを含む、ガン治療用医薬組成物を提供する。
該医薬組成物は、先に記載した抗体を含む医薬組成物と同じく、従来使用されている医薬用の材料を使用し、かつ常法で製剤することができる。また、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、例えば、ヒト、その他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。その投与量は、対象の状態、投与ルートなどにより適宜変わるが、例えば、経口投与する場合、一般的に、体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜４０００ｍｇ、好ましくは約２０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ｓｉＲＮＡの１回投与量は投与対象、対象ガンの状況などによっても異なるが、例えば、注射剤の形で体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜２０００ｍｇ程度、好ましくは約２０〜１０００ｍｇ程度、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ程度を静脈から投与するのが好ましい。
また、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡによって形質転換された細胞を含む、ガン治療用医薬組成物を提供する。
ここで該形質転換される細胞は、第三者から提供を受けた細胞であっても、治療対象の患者から取り出された細胞であってもよい。また、該形質転換した細胞をガン治療用細胞として使用することができる。
また、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列、又は該部分配列の少なくとも１塩基が付加、欠失、又は置換された変異ヌクレオチド配列からなり、かつ、ヒト細胞のＮｏｘ１ポリペプチドの発現を抑制するＲＮＡ分子を提供する。該ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）は、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻、４９４頁、２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列をもとに設計することができる。
なお、本発明のＲＮＡ分子をＩｎ ｖｉｖｏ又はＩｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合、該ＲＮＡ分子とその相補的ＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡ分子とする。この場合、該二本鎖ＲＮＡ分子が細胞内で分解しないよう、又は一本鎖に解離しないよう処理するのが好ましい。例えば、該ＲＮＡ分子の３’−末端に水酸基付加する、二本鎖の両末端をチオホスホリル基によって化学結合させる、又各鎖の間に紫外線、ビス（２−クロロメチル）アミン、４−チオウラシル、ソラレンなどの二官能基により化学結合を誘導するなどの方法で処理することである。本発明の該ＲＮＡ分子は、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に伴うＮｏｘ１遺伝子の発現を抑制するものであるから、細胞のガン化防止、ガンの進行抑制、治療用の医薬組成物として使用することができる。
また、本発明は、Ｎｏｘ１遺伝子を標的とするガン細胞増殖抑制物質のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法において、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞や、Ｎｏｘ１遺伝子でトランスフェクションした正常細胞を、スクリーニング対象物質と接触させた後、Ｎｏｘ１遺伝子の発現とその酵素活性の不活化を検出する。次に、該形質転換細胞を、スクリーニング対象物質とともに培養して増殖抑制能を調べる。
また、スクリーニング対象化合物によるＮｏｘ１遺伝子発現への影響は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるｍＲＮＡ発現増減の検出、抗体によるＮｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチド、又はそのペプチド断片の検出、又はその形質転換細胞の形態変化を観察することで行うことができる。
該スクリーニング方法で使用する、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞は特に制限されないが、例えば、Ｈ−Ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞、又は膵臓癌細胞などを使用することができる。また、Ｎｏｘ１遺伝子の導入に用いるベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（コントロール）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｎｏｘ１などを用いることができ、さらに、ｓｉＲＮＡを発現させるベクターとして、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒを用いることができる。
なお、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はＮＲＫ細胞にｐＥＧＦ−Ｃ１−Ｎｏｘ１ベクターをリポフェクタミン法を用いて持続的にトランスフェクトして、Ｎｏｘ１を高発現する細胞株を樹立することができる。あるいは、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する膵臓癌細胞を利用することもできる。該膵臓癌細胞は、ヒト膵臓癌患者より、分離・樹立したものを用いるのが好ましい。これらの細胞を、ＣＯ２５％の存在下、標準培養液（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、牛胎仔血清（ＦＢＳ）１０％含有）中で培養する。スクリーニングは、マルチプレート（９６穴、４８穴）に細胞を培養して、スクリーニング対象物質を加え、大量、迅速に処理することができる。
【実施例１】
突然変異Ｒａｓ遺伝子によるＮｏｘ１遺伝子の発現上昇の確認
本発明者らは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮｏｘ１遺伝子の過剰発現が、スーパーオキシドの生成と細胞増殖を上昇させることから（１及び２）、Ｎｏｘ１が特定のがん遺伝子の形質発現と関連すると考えた。そこで、Ｋ−Ｒａｓ Ｖａｌ１２ガン遺伝子で形質転換した細胞を用いて、Ｒａｓガン遺伝子によるＮｏｘ１遺伝子発現の上昇を確認した。
まず、ラット腎臓細胞（ＮＲＫ）及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞（Ｋｉｒｓｔｅｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＮＲＫ ｃｅｌｌｓ）を準備した。なお、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫは、ＡＴＣＣから購入した。
まず、ラット腎臓細胞（ＮＲＫ）及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞におけるＮｏｘ１の発現の有無を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出した。該リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応では、配列番号１５のフォワードプライマー、及び配列番号１６のリバースプライマー、及び配列番号１７のＴａｑＭａｎＭＧＢプローブを使用した。
なお、該リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（アプライド・バイオシステムズ）を用い、反応条件はデオフォルト設定で行った。解析値の標準化にはｒＲＮＡ１８Ｓを用いた。
該リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子発現の解析を行った結果、図１（ａ）のグラフに示されているように、Ｋ−Ｒａｓガン遺伝子で形質転換したＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞において、Ｎｏｘ１遺伝子の発現は上昇していた。
【実施例２】
突然変異Ｒａｓ遺伝子による一過的トランスフェクションによるＮｏｘ１遺伝子の発現上昇の確認
突然変異Ｒａｓ遺伝子の一過性のトランスフェクションによる影響を解析するため、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（空ベクター）、及びｐｃＤＮＡ３．１担持Ｒａｓ Ｖａｌ１２ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１ ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｒａｓ Ｖａｌ１２ ｖｅｃｔｏｒｓ）を使用して、ＮＲＫ細胞に一過的にトランスフェクションし、４８時間後、Ｎｏｘ１の発現を検出するため、実施例１と同じ方法でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行った。その結果、図１（ｂ）に示すように、コントロールベクターを用いた場合の発現と比較して、Ｈ−Ｒａｓ Ｖａｌ１２を一過的にトランスフェクションしたＮＲＫ細胞においても、Ｎｏｘ１遺伝子の発現は、増加していた。なお、トランスフェクションしたＲａｓ Ｖ１２の発現は、ウサギ抗Ｒａｓ抗体を用いるイムノブロッティング（ＩＢ）で確認した。
なお、該イムノブロッティングは、試料細胞１×１０５個を、２×サンプルバッファー（０．１Ｍ トリスＣｌ、ｐＨ６．８、グリセロール２０％、ＳＤＳ４％、ＤＴＴ３．１％、ＢＰＢ０．００１％）で可溶化し、該ポリペプチドをＳＤＳゲル電気泳動により分離し、続いてイムノブロッティングにより解析した。
タンパク質をトランスファーバッファー（２５ｍＭ トリスＣｌ ｐＨ８．３、９２ｍＭグリシン、メタノール２０％）中で電気的にニトロセルロース膜に移し、抗−Ｒａｓ抗体（１次抗体）と、ＨＲＰ−結合抗ウサギ−ＩｇＧ抗体に反応させ、化学発行（ＥＣＬ）法で検出した。
このように実施例１及び２の結果から、Ｎｏｘ１遺伝子発現の上昇は突然変異Ｒａｓガン遺伝子の働きによることが示された。
なお、無血清状態で一晩培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、血清（３０％）又は上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）５０ｎｇ／ｍｌで促進処理を行ったのち、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により解析した。その結果、図１（ｃ）、及び（ｄ）に示すように培養開始から１２時間以内にＮｏｘ１遺伝子の発現が６〜２０倍に上昇した。つまり、Ｎｏｘ１遺伝子の発現は、細胞増殖を促進する因子と関連しており、これは、血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）とアンジオテンシンＩＩの両方がスーパーオキシド形成、及び血管平滑筋細胞のＮｏｘ１遺伝子の発現を誘導するという報告と一致している（１、４）。
【実施例３】
突然変異Ｒａｓ遺伝子によるＮｏｘ１遺伝子発現を起こすシグナル経路の解析
突然変異Ｒａｓ遺伝子によるＮｏｘ１遺伝子の発現上昇を起こす、Ｒａｓシグナル経路の下流を解析するため、一連の実験を行った。実施例１および２において、細胞にＭＡＰＫＫの阻害剤であるＰＤ９８０５９（ＰＤ：２０μＭ、１００μＭ）を１２時間処理し、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞におけるＮｏｘ−１の発現、血清、ＥＧＦによるＮｏｘ１の発現誘導をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により解析した。
その結果、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞におけるＮｏｘ−１の発現はＰＤ９８０５９により濃度依存性に抑制された（図１（ａ））。また、血清、ＥＧＦによるＮｏｘ１の発現誘導もそれぞれＰＤ９８０５９ ２０μＭで抑制された（図１（ｃ）及び（ｄ））。
一方、コントロールの実験において、ＰＩ３キナーゼの阻害剤であるウォルトマニン（ｗｏｒｔｍａｎｉｎ：１００ｎＭ）は、Ｈ−Ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮｏｘ１の発現上昇を阻害しなかった（データ示さず）。これらの結果から、突然変異Ｒａｓ遺伝子とその増殖因子のシグナルが、ＰＩ３Ｋを介する経路ではなく、Ｒａｓ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫを介してＮｏｘ１の発現を誘導していることが示された。
【実施例４】
突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与
オリゴヌクレオチド１−Ｓ、１−ＡＳをアニーリングさせ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ，Ｈ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）にサブクローニングし、ＲＮＡｉ（１）とした。同様にオリゴヌクレオチド３−Ｓ、３−ＡＳをアニーリングさせ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ，Ｈ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）にサブクローニングし、ＲＮＡｉ（３）とした。さらにオリゴヌクレオチド５−Ｓ、５−ＡＳをアニーリングさせ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ，Ｈ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）にサブクローニングし、ＲＮＡｉ（５）とした。また、コントロールベクターとして、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用した。
ＲＮＡｉ（１）は、配列番号３の２２３位から２４１位を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクションである。ＲＮＡｉ（３）は、配列番号３の５７８位から５９６位を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクションである。ＲＮＡｉ（５）は、配列番号３の１２２４位から１２４２位を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクションである。
なお、各オリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである。
該ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）、およびｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄ各４μｇを、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ：Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いて、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞１×１０６個にそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞は、選択を行うため、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％とＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢを４００μｇ／ｍｌとなるように加えたＤＭＥＭ培地を用い、ＣＯ２５％の湿潤環境下において３７℃で２〜３週間培養した。培養後、生き残ったコロニーを単離した。
ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）を持続的にトランスフェクトされた細胞株それぞれ３クローンずつ（Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１５；Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１７，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６；Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−２，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−３，Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７）、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄを持続的にトランスフェクトされた細胞を２クローン（Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−２）選択した。これらのコンストラクションのトランスフェクションは、Ｍ１３Ｆ及び３．０ＲｅｖをプライマーとしてＰＣＲで確認した（図２）。ＰＣＲの温度条件は、９４℃２分、（９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分）を３０サイクル、７２℃１０分、とし、サーマルサイクラー装置はＴａｋａｒａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（宝酒造株式会社）を用いた。
次に、Ｎｏｘ１遺伝子が関与する細胞の形態の変化を比較した。その結果、図３に示すように、ＲＮＡｉ（１）−（３）をトランスフェクトされたＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞が伸張したのに対し、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ ＮｅｇａｔｉｖｅコントロールプラスミドをトランスフェクトされたＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞は、導入前の細胞で観察されたように、形態は丸いままだった。
次に、細胞の形質転換を、足場非依存性の増殖能を見ることにより調べるため、軟寒天培地アッセイを行った。細胞増殖に必要な栄養素を含んだ寒天０．５３％を含むアガーロースレイヤーを直径６ｃｍの培養皿に入れて固め、その上に寒天０．３％とＦＢＳ１０％を含んだＤＭＥＭ倍地に懸濁した細胞を、培養皿一枚当たりの細胞最終濃度が１．５×１０４個になるように重層した。次いで、ＣＯ２５％の湿潤環境下、３７℃で培養し、細胞コロニーの出現を３週間にわたり観察した。ソフトアガー培養において示された細胞株の接着依存的細胞増殖を測定し、その３回の＋／−平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を図４に示した。その結果、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞およびｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ｈｙｇｒｏ Ｎｅｇａｔｉｖｅコントロールプラスミド（ｎｅｇ−１とｎｅｇ−２）のトランスフェクションでは、多くのコロニー形成が見られたが、ＲＮＡｉ（１）−（５）のトランスフェクションではコロニー形成が著明に抑制された。
さらに、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１（ｎｅｇ−１）、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７（ｉ（１）−７）、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９（ｉ（３）−１９）、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｉ（５）−７（ｉ（５）−７）の各細胞を、培養皿から１０４個ずつ、培養液に移し、ＣＯ２５％存在下、標準培養液（ＤＭＥＭ、ＦＢＳ（１０％））中で６日間、液体培養した。次いで、液体倍地中の細胞数を計測して、その増殖曲線を図５に示した。その結果、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）１９、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７の各細胞は、液体培養でも増殖率が減少したが、対照的に、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１では増殖阻害効果は確認できなかった。
【実施例５】
Ｎｏｘ１遺伝子がコードするＮＡＤＰＨ酸化酵素によるスーパーオキシド産生の確認
本発明者らは、突然変異Ｒａｓが誘導するスーパーオキシド産生におけるＮｏｘ１の役割を評価するため、実施例４の形質転換細胞を用いて、スーパーオキシドの産生をＮＢＴ還元解析で測定した。本実施例では、ＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）解析にＳｕｈらの方法を用いた（１）。すなわち、ＮＢＴ０．２５％を含むハンクス（Ｈａｎｋｓ）溶液０．２ｍｌに、活性酸素を消化する酵素、スーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ）を４０単位加えた溶液と加えない溶液を用意し、２×１０５個の細胞を懸濁し３７℃で８分間処理した。処理された細胞を低速度遠心で分離し、ピリジン０．５ｍｌを加えて可溶化し、５１０ｎｍにおける吸光度を測定してＮＢＴの減少を定量した（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ １１，０００／Ｍ／ｃｍ）。得られたデータは、図６に３回の＋／−ｓ．ｅ．ｍ．で示した。
該解析の結果、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫおよびＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１は、ＮＢＴの還元を増加させ、これはスーパーオキシドジスムターゼ処理により、ＮＲＫと比較し阻害された。対照的に、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７は、Ｋ−Ｒａｓがん遺伝子のＲＯＳ生産刺激効果をＮＲＫ細胞レベルまで低下させ（図６）、Ｎｏｘ１が、突然変異Ｒａｓ形質転換細胞における、スーパーオキシド生産の上昇に関与することが示された。
【実施例６】
ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）による、Ｎｏｘ１発現の減少の確認
本発明者らは、ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）によりＮｏｘ１発現が減少することを確認するため、次の手順で解析を行った。すなわち、ＧＦＰ−ｒａｔＮｏｘ１の発現におけるＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）の阻害効果を評価するために、ＧＦＰ−ｒａｔＮｏｘ１を、ＲＮＡｉ（１）−（５）それぞれとともに、共トランスフェクションし、実施例２と同様にイムノブロッティング解析を行った。図７左のパネルに示されるように、予想されるＧＦＰとｒａｔＮｏｘ１の融合ポリペプチドが産生されたこと、そしてＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（３）、ＲＮＡｉ（５）の共発現は、これらのベクターの量依存的にＧＦＰ−ｒａｔＮｏｘ１融合蛋白質の生産を抑えることを明らかにした。なお、図７左のパネルにおけるＧＦＰ−Ｎｏｘ１の発現は、抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロッティングにより定量的に決定したものであり、図７左のパネルの数字はトランスフェクションしたＤＮＡの量（μｇ）を示している。また、ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（５）は、どれもラットのＮｏｘ１をターゲットとしている。図７左のパネルと同様の手法を用いて、ＲＮＡｉ（１）、ＲＮＡｉ（５）がヒトのＮｏｘ１を抑制しない、すなわち、該ＲＮＡｉコンストラクションは、標的遺伝子に対する特異性が高いことを図７右のパネルに示す。
また、内在性のＮｏｘ１のｍＲＮＡ発現が、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７の各細胞において、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ、及びＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１に比べて確かに抑制されていることを、ＲＴ−ＰＣＲによりで示した。その結果を図８に示す。
実施例６で用いたＰＣＲ用プライマーの配列
本実施例における結果は、細胞骨格と接着蛋白質の構成変化による形態変化と同様に、Ｎｏｘ１遺伝子の発現率の上昇と突然変異Ｒａｓによる形質転換が関連していることを示している。
【実施例７】
ｓｉＲＮＡにより一度抑制されたＮｏｘ１を回復することによる細胞への影響
Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７に、実施例４と同一手法によってｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＧＦＰ）、ｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１（ＧＦＰ−Ｎｏｘ１）をそれぞれトランスフェクトし、実施例６と同様の手法によりイムノブロッティングした（図９）。実施例６、図７右のパネルで示したように、ＲＮＡｉ（１）およびＲＮＡｉ（５）はどちらもヒトＮｏｘ１の発現を抑制しない。そのため、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７細胞にｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１をトランスフェクトしても、これがｓｉＲＮＡによって抑制されることはない。
図１０に示したように、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にコントロールベクターを入れただけ（ｉ（１）−７＋ＧＦＰ）ではｓｉＲＮＡを解除できず細胞は扁平だが、ｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１をトランスフェクトすることにより（ｉ（１）−７＋ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−３）、形態は、以前のＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞に近い窮状の形態に戻った（図１０）。
実施例４と同手法による増殖曲線でも、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にコントロールベクターを入れたもの（ＧＦＰ−５９）やＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７にコントロールベクターを入れたもの（ＧＦＰ−７８）に比べ、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１を入れたもの（ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−３）やＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−７にｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１を入れたもの（ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−１１）では、増殖が早くなった（図１１）。また、実施例４と同様の軟寒天培地アッセイでも、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にコントロールベクターを入れたもの（ｉ（１）−７＋ＧＦＰ−５９、ｉ（１）−７＋ＧＦＰ−６０）にくらべ、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７にｐＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎＮｏｘ１を入れたもの（ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−２、ＧＦＰ−Ｎｏｘ１−３）では、もとのＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞と同程度までコロニー形成が回復した（図１２）。
【実施例８】
突然変異Ｒａｓの形質転換に対するＮｏｘ１遺伝子の発現の影響
Ｎｏｘ１の阻害剤であるジフェニレンヨードニウム（Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ｉｏｄｏｎｉｕｍ：ＤＰＩ）を用いて、Ｎｏｘ１遺伝子の発現による、突然変異Ｒａｓによる形質転換細胞の形態に及ぼす影響を調べた。すなわち、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞、及びＮＲＫ細胞を、ＤＰＩ２０μＭ又はＰＤ９８０５９ ３０μＭを含む培地中で、ＣＯ２５％を含む湿潤環境下において３７℃で一晩培養し、形態変化を観察した。図１３に細胞形態を記録した写真を示す。
図１３に示すように、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞を、フラボタンパク質阻害剤であるＤＰＩ、又は抗酸化剤ｎ−アセチルシステイン（ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）１０ｍＭ（データ示さず）で、一晩処理した場合、該細胞が一過的に平たい形態を帯び、ＮＲＫ細胞に近い形態になった。さらに、図１３に示すように、ＰＤ９８０５９で処理されたＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞においても、このような形態の変化が観察された。したがって、Ｎｏｘ１遺伝子発現の上昇が、Ｒａｓ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路による突然変異Ｒａｓの形質転換促進に必須であることが示された。
【実施例９】
突然変異Ｒａｓによる腫瘍形成に対する、ｓｉＲＮＡの影響
Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６およびＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（５）−２を無胸腺マウスに移植し、腫瘍形成を観察した。すなわち該細胞１０６個をＰＢＳ０．２ｍｌに懸濁した後、ヌードマウス（無胸腺：Ｎｕ／Ｎｕ）の皮下に移植した。その後、該全ヌードマウスの腫瘍形成を１ヶ月間に渡り観察し、かつ腫瘍の体積を測定した。その結果を図１４に示した。図１４において、黒塗りのバーは腫瘍の体積であり、誤差のバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示し、また分数は使用した全マウスに対する、腫瘍を許容したマウスの割合（腫瘍／合計）を示している。
図１４に示すように、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１は、２週間以内に活発な腫瘍を形成した。対照的に、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６は、腫瘍の増殖が著しく抑えられていた。解剖により組織学的観察すると、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ｎｅｇ−１で形成された腫瘍は、血管が増加していた。これは、Ｎｏｘ１遺伝子が、血管内皮増殖因子の産生増加による血管新生を誘導する可能性と一致している（１）。また、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−７、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（１）−１２、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−１９、Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＲＮＡｉ（３）−９６で形成された、小さな腫瘍では、大部分の細胞でネクローシスの兆候が示されていた（データ示さず）。
これまでの実験結果から、突然変異Ｒａｓ（ガン遺伝子）は、分裂促進性酸化酵素Ｎｏｘ１をＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路を介して上昇させ、一方、Ｎｏｘ１遺伝子の発現は、該Ｒａｓによる細胞の形質転換、ガン形成、及びその進行に必須である。すなわち、本発明者らの研究により、突然変異Ｒａｓによる形質転換において、Ｎｏｘ１ポリペプチドがレドックスシグナル分子として必須の役割を果たしているという分子機構が明らかになった。
Ｇｐ９１ｐｈｏｘのホモログであるＮｏｘファミリータンパク質Ｎｏｘ１〜５は、非貪食細胞から同定され、それぞれ様々な細胞プロセスにおいて特異的な機能を果たしていると報告されている（１及び５−９）。それらの中で、Ｎｏｘ１遺伝子は増殖因子（１及び４）やガン遺伝子による、分裂促進性シグナルを仲介する、膜貫通型酸化酵素をコードしている点で特異である。
ＲＯＳが腫瘍の増殖促進に関係すること、及び悪性ガン細胞においてＲＯＳ産生がＲＯＳ生産酵素を誘導する可能性を考慮すると（７）、Ｎｏｘ１遺伝子及びそのポリペプチドは、ガン進行を抑制し、その治療を可能にする標的分子にできると考えられる。
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
（配列番号：１） ヒトＮｏｘ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：２） ヒトＮｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
（配列番号：３） ラットＮｏｘ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４） ラットＮｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
（配列番号：５） ヒトガン診断方法で用いるＮｏｘ１遺伝子に対するフォワードプライマーの塩基配列を示す。
（配列番号：６） ヒトガン診断方法で用いるＮｏｘ１遺伝子に対するリバースプライマーの塩基配列を示す。
（配列番号：７） ヒトのＮｏｘ１遺伝子をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う場合に用いるフォワードプライマーの配列を示す。
（配列番号：８） ヒトのＮｏｘ１遺伝子をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う場合に用いるリバースプライマーの配列を示す。
（配列番号：９） ヒトのＮｏｘ１遺伝子をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う場合に用いるＴａｑＭａｎプローブの配列を示す。
（配列番号：１０） 本発明のヒトＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１１） 本発明のヒトＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１２） 本発明のラットＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１３） 本発明のラットＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１４） 本発明のラットＮｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
（配列番号：１５） 実施例１において、Ｎｏｘ１の発現の有無を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出するために用いたフォワードプライマーのヌクレオチド配列である。
（配列番号：１６） 実施例１において、Ｎｏｘ１の発現の有無を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出するために用いたリバースプライマーのヌクレオチド配列である。
（配列番号：１７） 実施例１において、Ｎｏｘ１の発現の有無を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出するために用いたＴａｑＭａｎＭＧＢプローブのヌクレオチド配列である。
（配列番号：１８） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：１９） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２０） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２１） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２２） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２３） 実施例４において、突然変異Ｒａｓ遺伝子による形質転換に対する、Ｎｏｘ１遺伝子の関与を調べるために用いたｓｉＲＮＡコンストラクションを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２４） 実施例４における、Ｎｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡのコンストラクションのトランスフェクションを確認するために用いたＭ１３プライマーのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２５） 実施例４における、Ｎｏｘ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡのコンストラクションのトランスフェクションを確認するために用いた３．０Ｒｅｖプライマーのヌクレオチド配列である。
（配列番号：２６） 実施例６において、Ｎｏｘ１発現の減少を確認するために用いたフォワードプライマーのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：２７） 実施例６において、Ｎｏｘ１発現の減少を確認するために用いたリバースプライマーのヌクレオチド配列を示す。
（参考文献）
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（２）配列番号２のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド；又は（３）（１）又は（２）のポリペプチドの部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド断片を含む、抗体製造用組成物。
【請求項２】
該抗体が、ヒトガン細胞検出用抗体である請求項１記載の該組成物。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１記載の該組成物。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列の部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチドを含む、請求項１記載の該組成物。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列の部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド断片を含む、請求項１記載の該組成物。
【請求項６】
請求項１記載の組成物を、哺乳類に投与することを含む、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の製造方法。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項８】
該抗体が、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト型抗体、又はヒト抗体である、請求項７記載の該抗体。
【請求項９】
該抗体が、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である、請求項７記載の該抗体。
【請求項１０】
請求項７記載の抗体を、生物試料と接触させることを含む、ガンの診断方法。
【請求項１１】
請求項７記載の抗体を含む、ガン診断用キット。
【請求項１２】
請求項７記載の抗体を含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項１３】
該抗体が、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト型抗体、又はヒト抗体である、請求項１２記載の該ガン治療用医薬組成物。
【請求項１４】
該抗体が、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である、請求項１２記載の該ガン治療用医薬組成物。
【請求項１５】
さらに適当なキャリアーを含む、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片を検出することを特徴とする、ガン診断方法。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により該ポリヌクレオチド、又はその断片を検出する、請求項１６記載のガン診断方法。
【請求項１８】
配列番号１のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライマーとして、配列番号１のアンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして用いＰＣＲにより検出を行う、請求項１７記載のガン診断方法。
【請求項１９】
前記フォワードプライマーの長さが１４〜６０ベースであり、かつ前記リバースプライマーの長さが１４〜６０ベースである、請求項１８記載のガン診断方法。
【請求項２０】
下記フォワードプライマー、及びリバースプライマーを用いる、請求項１８記載のガン診断方法：
【請求項２１】
配列番号１のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライマーとして、配列番号１のアンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして用いリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う、請求項１７記載のガン診断方法。
【請求項２２】
下記フォワードプライマー、リバースプライマー、及びＴａｑＭａｎプローブを用いる、請求項２１記載のガン診断方法：
【請求項２３】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ。
【請求項２４】
配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、請求項２３記載の該ｓｉＲＮＡ。
【請求項２５】
ヌクレオチド配列の長さが８〜３０ｂｐである、請求項２３記載の該ｓｉＲＮＡ。
【請求項２６】
下記配列番号１０〜１４のヌクレオチド配列からなる群から選ばれた、ヌクレオチド配列からなる、請求項２３記載のｓｉＲＮＡ：
及び
【請求項２７】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；及び配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡを含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項２８】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；及び配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡによって形質転換された細胞を含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項２９】
該形質転換される細胞が、治療対象の患者から取り出された細胞である、請求項２８記載の該ガン治療用医薬組成物。
【請求項３０】
ヒト細胞を準備し、かつ配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡによって形質転換することを含む、ガン治療用細胞の製造方法。
【請求項３１】
該ヒト細胞が、治療対象の患者から取り出された細胞である、請求項３０の該製造方法。
【請求項３２】
Ｎｏｘ１遺伝子を標的とするガン細胞増殖抑制物質のスクリーニング方法であって、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞を、Ｎｏｘ１遺伝子でトランスフェクションし、該形質転換細胞をスクリーニング対象物質と接触させた後、Ｎｏｘ１遺伝子の発現及びＮｏｘ１活性の不活化を検出することを含む、該スクリーニング方法。
【請求項３３】
該形質転換細胞を、スクリーニング対象物質とともに培養することを含む、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３４】
Ｎｏｘ１遺伝子の発現を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるｍＲＮＡの検出、又は抗体によるＮｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチド、又はそのペプチド断片の検出により行う、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３５】
Ｎｏｘ１遺伝子の発現を、その形質転換細胞の形態変化を観察することにより行う、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３６】
該突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞が、Ｈ−Ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞である、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３７】
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＧＦＰ）、又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｎｏｘ１（Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＧＦＰ−Ｎｏｘ１）を用いてＮｏｘ１遺伝子のトランスフェクションを行う、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３８】
Ｎｏｘ１遺伝子でトランスフェクションされた、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞。
【請求項１】
（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（２）配列番号２のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド；又は（３）（１）又は（２）のポリペプチドの部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド断片を含む、抗体製造用組成物。
【請求項２】
該抗体が、ヒトガン細胞検出用抗体である請求項１記載の該組成物。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１記載の該組成物。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列の部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチドを含む、請求項１記載の該組成物。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列の部分配列を有し、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド断片を含む、請求項１記載の該組成物。
【請求項６】
請求項１記載の組成物を、哺乳類に投与することを含む、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の製造方法。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項８】
該抗体が、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト型抗体、又はヒト抗体である、請求項７記載の該抗体。
【請求項９】
該抗体が、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である、請求項７記載の該抗体。
【請求項１０】
請求項７記載の抗体を、生物試料と接触させることを含む、ガンの診断方法。
【請求項１１】
請求項７記載の抗体を含む、ガン診断用キット。
【請求項１２】
請求項７記載の抗体を含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項１３】
該抗体が、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト型抗体、又はヒト抗体である、請求項１２記載の該ガン治療用医薬組成物。
【請求項１４】
該抗体が、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である、請求項１２記載の該ガン治療用医薬組成物。
【請求項１５】
さらに適当なキャリアーを含む、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片を検出することを特徴とする、ガン診断方法。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により該ポリヌクレオチド、又はその断片を検出する、請求項１６記載のガン診断方法。
【請求項１８】
配列番号１のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライマーとして、配列番号１のアンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして用いＰＣＲにより検出を行う、請求項１７記載のガン診断方法。
【請求項１９】
前記フォワードプライマーの長さが１４〜６０ベースであり、かつ前記リバースプライマーの長さが１４〜６０ベースである、請求項１８記載のガン診断方法。
【請求項２０】
下記フォワードプライマー、及びリバースプライマーを用いる、請求項１８記載のガン診断方法：
【請求項２１】
配列番号１のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライマーとして、配列番号１のアンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして用いリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う、請求項１７記載のガン診断方法。
【請求項２２】
下記フォワードプライマー、リバースプライマー、及びＴａｑＭａｎプローブを用いる、請求項２１記載のガン診断方法：
【請求項２３】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ。
【請求項２４】
配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、請求項２３記載の該ｓｉＲＮＡ。
【請求項２５】
ヌクレオチド配列の長さが８〜３０ｂｐである、請求項２３記載の該ｓｉＲＮＡ。
【請求項２６】
下記配列番号１０〜１４のヌクレオチド配列からなる群から選ばれた、ヌクレオチド配列からなる、請求項２３記載のｓｉＲＮＡ：
及び
【請求項２７】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；及び配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡを含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項２８】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；及び配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡによって形質転換された細胞を含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項２９】
該形質転換される細胞が、治療対象の患者から取り出された細胞である、請求項２８記載の該ガン治療用医薬組成物。
【請求項３０】
ヒト細胞を準備し、かつ配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡ；又は配列番号１の７１位〜１６１５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応する、ｓｉＲＮＡによって形質転換することを含む、ガン治療用細胞の製造方法。
【請求項３１】
該ヒト細胞が、治療対象の患者から取り出された細胞である、請求項３０の該製造方法。
【請求項３２】
Ｎｏｘ１遺伝子を標的とするガン細胞増殖抑制物質のスクリーニング方法であって、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞を、Ｎｏｘ１遺伝子でトランスフェクションし、該形質転換細胞をスクリーニング対象物質と接触させた後、Ｎｏｘ１遺伝子の発現及びＮｏｘ１活性の不活化を検出することを含む、該スクリーニング方法。
【請求項３３】
該形質転換細胞を、スクリーニング対象物質とともに培養することを含む、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３４】
Ｎｏｘ１遺伝子の発現を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるｍＲＮＡの検出、又は抗体によるＮｏｘ１遺伝子にコードされたポリペプチド、又はそのペプチド断片の検出により行う、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３５】
Ｎｏｘ１遺伝子の発現を、その形質転換細胞の形態変化を観察することにより行う、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３６】
該突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞が、Ｈ−Ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はＫ−Ｒａｓ−ＮＲＫ細胞である、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３７】
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＧＦＰ）、又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｎｏｘ１（Ｋ−Ｒａｓ−ＮＲＫ／ＧＦＰ−Ｎｏｘ１）を用いてＮｏｘ１遺伝子のトランスフェクションを行う、請求項３２記載の該スクリーニング方法。
【請求項３８】
Ｎｏｘ１遺伝子でトランスフェクションされた、突然変異Ｒａｓ遺伝子を有する細胞。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１７３９
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３４１８（Ｐ２００５−５１３４１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１６７３
【国際出願日】平成１６年８月６日（２００４．８．６）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【出願人】（５０３３１７０５０）
【出願人】（５０３３１７０６１）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１６７３
【国際出願日】平成１６年８月６日（２００４．８．６）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【出願人】（５０３３１７０５０）
【出願人】（５０３３１７０６１）
【Ｆターム（参考）】
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