ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物
【課題】ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたセンサーによるグルコースの測定において、酵素の安定性を担保し、実用性に優れたグルコース測定系を提供する。
【解決手段】宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないことを特徴とするピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物、あるいは、宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有する、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【解決手段】宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないことを特徴とするピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物、あるいは、宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有する、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物に関するものである。（以下ピロロキノリンキノンをＰＱＱ、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨともそれぞれ記載する。）
【背景技術】
【０００２】
血清、尿などの検体中のグルコース測定法として、ＰＱＱを補酵素として必要とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを使用する測定系が知られている（たとえば、非特許文献１）。この測定系は、溶液中の反応に適用することもできるが、一般に広く普及しているのはグルコースセンサーの形態である（たとえば、特許文献１）。このようなグルコースセンサーにおいて、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼなど反応に必要な成分は乾燥状態でセンサーに固定化されていることが多い。
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．８９ （１９８２） ｐ２０（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）
【特許文献１】特許公開２００３−２０７４７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一般的に酵素製剤には、その安定性の向上や維持等を目的に何らかの安定化剤が添加されており、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ製剤の場合も同様である。しかしながら、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの場合、酵素をセンサーに適用しようとすると、安定化剤は測定値に影響を与え正確性を損ねるなど不測の問題をひきおこす可能性がある。また、測定時において、反応に必要な成分の溶解性を考慮すると、同一活性を有する酵素製剤としては少量である方が望ましい。これらのことから、添加される安定化剤としては極力少量であることが望ましく、かつ酵素製剤さらにはセンサーとしての安定性と正確性を確保していることが望ましい。
本願発明の課題は、酵素製剤の安定性、と、センサーに適用した場合の測定の正確性を損なう要因の低減、を両立させることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者はＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化剤について、種々鋭意検討したところ、生体由来物質を使用しなくとも安定性を担保できる組成を見いだし、本発明に達した。
【０００５】
本発明の概要は以下の通りである。すなわち、
［項１］
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
［項２］
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有する、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
［項３］
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、ピロロキノリンキノン、及び緩衝剤のみを含有する、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
［項４］
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
［項５］
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項４に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
［項６］
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
［項７］
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項６に記載の安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
［項８］
請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースアッセイキット。
［項９］
請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースセンサー。
【発明の効果】
【０００６】
本願発明によれば、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたセンサーによるグルコースの測定において、酵素の安定性を担保し、実用性に優れたグルコース測定系を提供することができる。また、酵素の安定性と測定の正確性を両立させ、実用性に優れたグルコース測定系を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼとは、補酵素としてＰＱＱを配位する酵素であり、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
例えば微生物では、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｏｒ属細菌、あるいはＡｃｅｔｏｂａｃｔｏｒ属細菌などから生産される。
例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（例えば、特許文献１を参照。）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（例えば、非特許文献１および２を参照。）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（例えば、非特許文献３を参照。）等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例えば、非特許文献４を参照。）、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）などを挙げることができる。
また、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＮＣＩＭＢ１１５１７株、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＩＦＯ１２５５２株、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＬＭＤ７９．４１株などから生産される（特許文献２、３、４）。
【非特許文献１】Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２１２１（１９８８）
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，４３０（１９８９）
【非特許文献３】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１）
【非特許文献４】Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０）
【特許文献２】特開平１１−２４３９４９
【特許文献３】特開２００４−１７３５３８
【特許文献４】特表２００４−５１２０４７
【０００８】
本発明に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【０００９】
これらのＰＱＱＧＤＨは、当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に製造することが出来る。
例えば、上記のＰＱＱＧＤＨを生産する天然の微生物、あるいは、天然のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上記工程と前後して、全ＧＤＨ酵素タンパク質に対するホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合を向上させるために、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃の加熱処理を行っても良い。
【００１０】
上記のようにして製造されたＰＱＱＧＤＨは、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を実質的に含有しない。
あるいは、たとえば東洋紡績製ＧＬＤ−３２１など市販の酵素を同様に精製することにより宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないＰＧＧＧＤＨを製造することができる。
【００１１】
本発明の組成物は、上記のようにして製造された宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないＰＱＱＧＤＨに、さらに「宿主由来のタンパク質を加えること」以外の工程を経ることにより得ることができる。例えば、ＰＱＱＧＤＨに何も加えなくても良いし、宿主由来のタンパク質成分以外の種々の成分を添加することによっても得ることができる。
組成物の形態は、液状などの水性組成物（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができるが特に限定されない。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
【００１２】
あるいは、本発明の組成物は、上記酵素とカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る。また、これらを含有した上で、ピロロキノリンキノン、アミノ酸、糖類あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。また、本発明の酵素組成物は、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
カルシウムの供給形態としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩を挙げることができる。中でも塩化カルシウムが好ましい。また、粉末組成物において、カルシウムの含有量（Ｗ／Ｗ）は、０．０５％〜５％であることが望ましく、さらに好ましくは０．１％〜０．５％である。
緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。但し、リン酸バッファーのようにカルシウムと不溶性の塩を形成するものは好ましくない。またトリスアミノメタンのようにアミノ基末端を有するものは、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのＰＱＱ結合を不安定とするために好ましくない。このため、緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。中でもｐＨ６〜７に緩衝能をもつＰＩＰＥＳなどが好ましい。また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましく、さらに好ましくは５％〜１０％である。
アミノ酸としては特に限定されないが、グリシルグリシン、ジメチルグリシン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミンなどまたはそれらの塩が好ましいものとして挙げられる。アミノ酸の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
有機酸としては特に限定されないが、αケトグルタル酸、ピルビン酸、Ｌ−リンゴ酸、グルクロン酸、αケトグルコン酸などあるいはそれらの塩が好ましいものとして挙げられる。有機酸の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
糖類としては特に限定されないが、αシクロデキストリンなどが好ましいものとして挙げられる。糖類の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
ピロロキノリンキノンの含有量（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
さらに、上記のうち２以上の組み合わせであっても良い。好ましい組合わせとしては、図１および図２に記載の組み合わせなどが挙げられる。組合わせた物質の含有量の合計（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
なお、上記の試薬類はいずれも市販品などを用いることができる。
【００１３】
さらに本発明は、該組成物を含むグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーである。これらにおいてＰＱＱＧＤＨ組成物に係る部分は、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
【００１４】
グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００１５】
グルコースセンサー
本発明のグルコースセンサーは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＰＱＱＧＬＤを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００１６】
本発明は、例えば上記に記載した手段により、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法である。
【００１７】
また、本発明は、例えば上記に記載した手段により、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法である。
【００１８】
なお、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は、次の方法に従った。５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５ ２５．５ｍｌ、３．０ｍＭ ＰＭＳ ２．０ｍｌ、６．６ｍＭ ＮＴＢ １．０ｍｌおよび１Ｍ グルコースを含む６．３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．９ｍｌを混合する。この混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、酵素液を０．１ｍｌ添加し、混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で５７０ｎｍの吸光度変化を４〜５分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求める。１分間に１マイクロモルのグルコースを酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００１９】
さらに詳しくは、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性は以下の方法により測定できる。
ＰＱＱＧＤＨ酵素活性の測定方法
（１）測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
（２）単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：１．０Ｍ（１．８ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ2， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１． ０．９ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２５．５ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース ３０ｍＭ
ＰＭＳ ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ ０．２２ｍＭ
２．３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加 温した。
３．０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
４．５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５ 分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト） 。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り 返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト − ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．１ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例１
下記成分を水道水６Ｌに溶解し、ｐＨを７．０に調整した後、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌して、培地を得た。
グルコース ６０ｇポリペプトン １８０ｇ酵母エキス ３０ｇＮａＣｌ ６０ｇ上記培地の入った１０Ｌジャーファーメンターに、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＮＣＩＭＢ１１５１７（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ， Ａｂａｄｅｅｎ Ｓｃｏｔｌａｎｄ） を接種し、３０℃で２０時間通気攪拌培養後、遠心分離して菌体を取得した。得られた菌体をダイノミルにより破砕し、ＰＥＩ処理、硫安分画、フェニルセファロースクロマトグラフィーおよびＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーによる精製、及び蒸留水への緩衝液置換を実施し、６００ＵのＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを得た。
【００２１】
実施例２
得られた酵素溶液に下記化合物を添加後、凍結乾燥を実施し、酵素粉末を取得した。各酵素粉末を３７℃、１週間保存した後、ＧＬＤ活性を測定し、保存前と比較した残存活性を求めた。結果を図１に記載する。
従来から知られているＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等の生体由来物質を使用せずとも、有機酸やアミノ酸で同等以上の安定性を示すことが確認された。
【００２２】
実施例３
得られた酵素溶液に下記化合物を添加後、凍結乾燥を実施し、酵素粉末を取得した。各酵素粉末を３７℃、１週間保存した後、ＧＬＤ活性を測定し、保存前と比較した残存活性を求めた。結果を図２に記載する。
緩衝剤のみでは安定化効果は少ないが、少なくともカルシウム塩を添加することで、一定の安定性を担保可能であることが確認された。また、従来から知られているＢＳＡ等のタンパク成分を添加しなくても安定性を担保可能であることも確認された。なお、カルシウム塩と緩衝剤からなる組成にさらにＰＱＱを添加しても問題はなく、むしろ更なる安定化効果が確認された。
【００２３】
実施例４
グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨ（ホロ型）をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることによりグルコースセンサーを作製する。作製時には、ウシ血清アルブミン添加（Ａ）、無添加（Ｂ）の両方で行う。次いで、得られたセンサーを用いて、１００ｍｇ／ｄｌ（濃度）のグルコース水溶液を２０回測定する。同時再現性および正確性（理論値との差）は（Ｂ）の方が優れている。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明により、グルコースセンサーへの適用上優れたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例２の各組成における保存後のグルコースデヒドロゲナーゼ残存活性の比較
【図２】実施例３の各組成における保存後のグルコースデヒドロゲナーゼ残存活性の比較
【技術分野】
【０００１】
本発明は安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物に関するものである。（以下ピロロキノリンキノンをＰＱＱ、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨともそれぞれ記載する。）
【背景技術】
【０００２】
血清、尿などの検体中のグルコース測定法として、ＰＱＱを補酵素として必要とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを使用する測定系が知られている（たとえば、非特許文献１）。この測定系は、溶液中の反応に適用することもできるが、一般に広く普及しているのはグルコースセンサーの形態である（たとえば、特許文献１）。このようなグルコースセンサーにおいて、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼなど反応に必要な成分は乾燥状態でセンサーに固定化されていることが多い。
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．８９ （１９８２） ｐ２０（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）
【特許文献１】特許公開２００３−２０７４７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一般的に酵素製剤には、その安定性の向上や維持等を目的に何らかの安定化剤が添加されており、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ製剤の場合も同様である。しかしながら、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの場合、酵素をセンサーに適用しようとすると、安定化剤は測定値に影響を与え正確性を損ねるなど不測の問題をひきおこす可能性がある。また、測定時において、反応に必要な成分の溶解性を考慮すると、同一活性を有する酵素製剤としては少量である方が望ましい。これらのことから、添加される安定化剤としては極力少量であることが望ましく、かつ酵素製剤さらにはセンサーとしての安定性と正確性を確保していることが望ましい。
本願発明の課題は、酵素製剤の安定性、と、センサーに適用した場合の測定の正確性を損なう要因の低減、を両立させることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者はＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化剤について、種々鋭意検討したところ、生体由来物質を使用しなくとも安定性を担保できる組成を見いだし、本発明に達した。
【０００５】
本発明の概要は以下の通りである。すなわち、
［項１］
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
［項２］
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有する、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
［項３］
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、ピロロキノリンキノン、及び緩衝剤のみを含有する、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
［項４］
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
［項５］
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項４に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
［項６］
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
［項７］
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項６に記載の安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
［項８］
請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースアッセイキット。
［項９］
請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースセンサー。
【発明の効果】
【０００６】
本願発明によれば、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたセンサーによるグルコースの測定において、酵素の安定性を担保し、実用性に優れたグルコース測定系を提供することができる。また、酵素の安定性と測定の正確性を両立させ、実用性に優れたグルコース測定系を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼとは、補酵素としてＰＱＱを配位する酵素であり、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
例えば微生物では、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｏｒ属細菌、あるいはＡｃｅｔｏｂａｃｔｏｒ属細菌などから生産される。
例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（例えば、特許文献１を参照。）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（例えば、非特許文献１および２を参照。）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（例えば、非特許文献３を参照。）等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例えば、非特許文献４を参照。）、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）などを挙げることができる。
また、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＮＣＩＭＢ１１５１７株、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＩＦＯ１２５５２株、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＬＭＤ７９．４１株などから生産される（特許文献２、３、４）。
【非特許文献１】Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２１２１（１９８８）
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，４３０（１９８９）
【非特許文献３】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１）
【非特許文献４】Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０）
【特許文献２】特開平１１−２４３９４９
【特許文献３】特開２００４−１７３５３８
【特許文献４】特表２００４−５１２０４７
【０００８】
本発明に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【０００９】
これらのＰＱＱＧＤＨは、当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に製造することが出来る。
例えば、上記のＰＱＱＧＤＨを生産する天然の微生物、あるいは、天然のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上記工程と前後して、全ＧＤＨ酵素タンパク質に対するホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合を向上させるために、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃の加熱処理を行っても良い。
【００１０】
上記のようにして製造されたＰＱＱＧＤＨは、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を実質的に含有しない。
あるいは、たとえば東洋紡績製ＧＬＤ−３２１など市販の酵素を同様に精製することにより宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないＰＧＧＧＤＨを製造することができる。
【００１１】
本発明の組成物は、上記のようにして製造された宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないＰＱＱＧＤＨに、さらに「宿主由来のタンパク質を加えること」以外の工程を経ることにより得ることができる。例えば、ＰＱＱＧＤＨに何も加えなくても良いし、宿主由来のタンパク質成分以外の種々の成分を添加することによっても得ることができる。
組成物の形態は、液状などの水性組成物（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができるが特に限定されない。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
【００１２】
あるいは、本発明の組成物は、上記酵素とカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る。また、これらを含有した上で、ピロロキノリンキノン、アミノ酸、糖類あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。また、本発明の酵素組成物は、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
カルシウムの供給形態としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩を挙げることができる。中でも塩化カルシウムが好ましい。また、粉末組成物において、カルシウムの含有量（Ｗ／Ｗ）は、０．０５％〜５％であることが望ましく、さらに好ましくは０．１％〜０．５％である。
緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。但し、リン酸バッファーのようにカルシウムと不溶性の塩を形成するものは好ましくない。またトリスアミノメタンのようにアミノ基末端を有するものは、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのＰＱＱ結合を不安定とするために好ましくない。このため、緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。中でもｐＨ６〜７に緩衝能をもつＰＩＰＥＳなどが好ましい。また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましく、さらに好ましくは５％〜１０％である。
アミノ酸としては特に限定されないが、グリシルグリシン、ジメチルグリシン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミンなどまたはそれらの塩が好ましいものとして挙げられる。アミノ酸の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
有機酸としては特に限定されないが、αケトグルタル酸、ピルビン酸、Ｌ−リンゴ酸、グルクロン酸、αケトグルコン酸などあるいはそれらの塩が好ましいものとして挙げられる。有機酸の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
糖類としては特に限定されないが、αシクロデキストリンなどが好ましいものとして挙げられる。糖類の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
ピロロキノリンキノンの含有量（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
さらに、上記のうち２以上の組み合わせであっても良い。好ましい組合わせとしては、図１および図２に記載の組み合わせなどが挙げられる。組合わせた物質の含有量の合計（Ｗ／Ｗ）は、１０％〜８０％であることが望ましく、さらに好ましくは２０％〜７０％、さらに好ましくは３０％〜６０％である。
なお、上記の試薬類はいずれも市販品などを用いることができる。
【００１３】
さらに本発明は、該組成物を含むグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーである。これらにおいてＰＱＱＧＤＨ組成物に係る部分は、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
【００１４】
グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００１５】
グルコースセンサー
本発明のグルコースセンサーは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＰＱＱＧＬＤを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００１６】
本発明は、例えば上記に記載した手段により、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法である。
【００１７】
また、本発明は、例えば上記に記載した手段により、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法である。
【００１８】
なお、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は、次の方法に従った。５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５ ２５．５ｍｌ、３．０ｍＭ ＰＭＳ ２．０ｍｌ、６．６ｍＭ ＮＴＢ １．０ｍｌおよび１Ｍ グルコースを含む６．３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．９ｍｌを混合する。この混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、酵素液を０．１ｍｌ添加し、混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で５７０ｎｍの吸光度変化を４〜５分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求める。１分間に１マイクロモルのグルコースを酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００１９】
さらに詳しくは、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性は以下の方法により測定できる。
ＰＱＱＧＤＨ酵素活性の測定方法
（１）測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
（２）単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：１．０Ｍ（１．８ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ2， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１． ０．９ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２５．５ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース ３０ｍＭ
ＰＭＳ ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ ０．２２ｍＭ
２．３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加 温した。
３．０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
４．５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５ 分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト） 。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り 返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト − ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．１ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例１
下記成分を水道水６Ｌに溶解し、ｐＨを７．０に調整した後、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌して、培地を得た。
グルコース ６０ｇポリペプトン １８０ｇ酵母エキス ３０ｇＮａＣｌ ６０ｇ上記培地の入った１０Ｌジャーファーメンターに、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＮＣＩＭＢ１１５１７（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ， Ａｂａｄｅｅｎ Ｓｃｏｔｌａｎｄ） を接種し、３０℃で２０時間通気攪拌培養後、遠心分離して菌体を取得した。得られた菌体をダイノミルにより破砕し、ＰＥＩ処理、硫安分画、フェニルセファロースクロマトグラフィーおよびＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーによる精製、及び蒸留水への緩衝液置換を実施し、６００ＵのＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを得た。
【００２１】
実施例２
得られた酵素溶液に下記化合物を添加後、凍結乾燥を実施し、酵素粉末を取得した。各酵素粉末を３７℃、１週間保存した後、ＧＬＤ活性を測定し、保存前と比較した残存活性を求めた。結果を図１に記載する。
従来から知られているＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等の生体由来物質を使用せずとも、有機酸やアミノ酸で同等以上の安定性を示すことが確認された。
【００２２】
実施例３
得られた酵素溶液に下記化合物を添加後、凍結乾燥を実施し、酵素粉末を取得した。各酵素粉末を３７℃、１週間保存した後、ＧＬＤ活性を測定し、保存前と比較した残存活性を求めた。結果を図２に記載する。
緩衝剤のみでは安定化効果は少ないが、少なくともカルシウム塩を添加することで、一定の安定性を担保可能であることが確認された。また、従来から知られているＢＳＡ等のタンパク成分を添加しなくても安定性を担保可能であることも確認された。なお、カルシウム塩と緩衝剤からなる組成にさらにＰＱＱを添加しても問題はなく、むしろ更なる安定化効果が確認された。
【００２３】
実施例４
グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨ（ホロ型）をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることによりグルコースセンサーを作製する。作製時には、ウシ血清アルブミン添加（Ａ）、無添加（Ｂ）の両方で行う。次いで、得られたセンサーを用いて、１００ｍｇ／ｄｌ（濃度）のグルコース水溶液を２０回測定する。同時再現性および正確性（理論値との差）は（Ｂ）の方が優れている。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明により、グルコースセンサーへの適用上優れたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例２の各組成における保存後のグルコースデヒドロゲナーゼ残存活性の比較
【図２】実施例３の各組成における保存後のグルコースデヒドロゲナーゼ残存活性の比較
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項２】
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有する、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項３】
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、ピロロキノリンキノン、及び緩衝剤のみを含有する、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項４】
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
【請求項５】
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項４に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
【請求項６】
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
【請求項７】
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項６に記載の安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースセンサー。
【請求項１】
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項２】
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有する、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項３】
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、ピロロキノリンキノン、及び緩衝剤のみを含有する、請求項１に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項４】
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
【請求項５】
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項４に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
【請求項６】
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
【請求項７】
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項６に記載の安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースセンサー。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１４９３７８（Ｐ２００６−１４９３７８Ａ）
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３０９６７６（Ｐ２００５−３０９６７６）
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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