ＨＩＶ−１複製の活性化は、酸化ストレスを誘発し、次いでＨＩＶ−１複製を増強する。本発明の化合物における共通の基盤は、Ａ）ＨＩＶ−１を潜伏から再活性化する能力、およびＢ）酸化ストレスの効果を制限するように活性化する細胞機構に対抗する能力である。この方法においては、酸化ストレスを増強することが可能であり、かつ「連鎖反応」が誘発される。この「連鎖反応」は、ＨＩＶ−１の潜伏からのより効率的な再活性化を誘発し、いくつかの場合、感染細胞の選択的殺滅を誘発する。作用Ａ）およびＢ）は、両方の効果を発揮する１つの薬剤によって行われ得るか、あるいは異なる薬剤の併用によって得られる。酸化ストレスに対抗する２つの主要な細胞機構、すなわちチオレドキシン（Ｔｒｘ）、チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）系およびグルタチオンが存在する。本明細書中では、２つの機構のいずれかを遮断することによって作用Ｂ）を発揮する能力がある薬剤戦略について提示する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、潜伏ウイルスレゼルボア、特にＨＩＶ−１の処置における特定の化合物または化合物の組み合わせの使用に関する。ウイルスレゼルボアの処置は、酸化ストレスの利用、すなわち薬剤リポジショニングアプローチによるものである。化合物は、金含有化合物、例えばオーラノフィン、ヒ素含有化合物、例えば三酸化ヒ素、およびＢＳＯと併用されるＨＤＡＣ阻害剤を含む。
【背景技術】
【０００２】
序論
身体からのＨＩＶ−１感染の根絶は、現行の抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）によって標的化されることも免疫系によって認識される可能性もない、主にメモリーＣＤ４^＋Ｔリンパ球によって表される潜伏ウイルスレゼルボアの存在下で、極めて困難な状況に直面している。このため、いわゆる「ショックおよび殺滅（shock and kill）」戦略が、ａ）ウイルス発現に起因するウイルス拡散を抑制するための、増強されたＡＲＴの存在下での潜伏感染細胞内でのウイルス抗原発現の刺激（すなわち「ショック」段階）と、ｂ）免疫系または他の手段による潜伏感染細胞の殺滅（すなわち「殺滅」段階）とに基づいて提起されている［Hamer、２００４年］。これらの段階の各々においては、有効な薬剤が広く探索されている。
【０００３】
従来の薬剤発見は、標的の発見および検証、ハイスループットスクリーニングによるリードの同定、ならびに医薬品化学によるリードの最適化を含む。他の薬剤開発戦略は、非感染性疾患の治療用に既に認可されており、かつ、その標的が特に治療法の探索過程にある疾患に興味深い、確立された薬剤の利用である［Duenas-Gonzalezら、２００８年］。この戦略は、薬剤リポジショニング（drug repositioning)、または適応変更（indication switch）とも称される［Duenas-Gonzalezら、２００８年］。薬剤リポジショニングの１つの成功例が、クロロキンによって示される。クロロキンは、抗マラリア剤としての使用に加え、関節リウマチなどの自己免疫疾患の処置において使用されており、現在、特定のタイプの癌およびウイルス感染の処置における有望な薬剤として臨床試験中である［Savarinoら、２００６年；Savarinoら、２００７年］。
【０００４】
ＨＩＶ−１根絶戦略の「ショック」段階に関し、現在抗癌剤として臨床試験中であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣＩ）が提案されている［Demonteら、２００４年；Maiら、２００９年］。残念ながら、静止状態からのＨＩＶ−１活性化に対して現在使用可能な化合物の効果は毒性と関連している［Duvergerら、２００９年］。最近、クラスおよびアイソフォームに特異的なものである、潜伏からのＨＩＶ−１回避を誘発するエピジェネティック薬である新ＨＤＡＣＩ）が発見されている［Maiら、２００９年］。これらの化合物は、クラスＩ群に属するヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を特異的に阻害し、ＨＩＶ−１潜伏の維持に特異的に関与する。しかし、毒性は大きな懸念として残る。さらに、これらの薬剤は、クラスに非特異的な前の世代のＨＤＡＣｉと同様、潜伏感染細胞集団内の細胞のすべてにおいて、ＨＩＶ−１活性化を誘発することができるわけではない。これは、異なる細胞内でＨＩＶ−１潜伏を維持する異なるクロマチン環境が存在することを示唆している。したがって、ＨＩＶ−１をレゼルボアから効率的に除去するために、様々な刺激が必要となる。
【０００５】
これに関して、酸化ストレスは、ウイルス／宿主相互作用における重要な領域であると考えられる。金属イオン、および他のチオール−反応性化学種は、酸化ストレスの発生において重要な役割を果たし得る。フェントン反応を通じてヒドロキシルラジカルを生成することが示されている金属イオンの鉄は、生産的ＨＩＶ−１感染細胞内で増加し、インビトロでＨＩＶ−１複製を促進することが見出された［Savarinoら、１９９９年］。しかし現在、この金属は、インビボでのその投与の副作用および複雑性に起因し、ＨＩＶ−１再活性化戦略において場を見出す可能性は低い。この金属は、鉄担体の吸着および生体内分布が少ないことを考慮すると、潜伏レゼルボアからの効率的なＨＩＶ−１活性化にとって十分な血漿レベルに達する可能性は低い。
【０００６】
鉄以外の金属が酸化ストレスを誘発することがある。かかる金属の１つが金である［Sannellaら、２００９年］。金含有化合物は、関節リウマチの処置において有用であることが示されており［Patai、１９９９年］、また抗癌戦略において検討されている。抗癌治療におけるそれらの提示された有用性は、それらの抗増殖特性に起因する。抗腫瘍活性のある金錯体におけるリード構造は、オーラノフィンであり（図１）、その金（Ｉ）中心原子ならびにトリエチルホスフィンおよび炭水化物リガンドによって特徴づけられる。しかし、オーラノフィンは、ＨＩＶ活性化を休止させること、すなわち潜伏性を維持することが示されている（Jeonら、２０００年；Traberら、１９９９年）。
【発明の概要】
【０００７】
ＨＩＶ−１複製の活性化は、酸化ストレスを誘発し、次いでＨＩＶ−１複製を増強することは周知である。本発明の化合物における共通の基盤は、Ａ）ＨＩＶ−１を潜伏から再活性化する能力、およびＢ）酸化ストレスの効果を制限するように活性化する細胞機構に対抗する能力である。この方法では、酸化ストレスを増強することが可能であり、ある種の「連鎖反応」が引き起こされる。この「連鎖反応」はＨＩＶ−１の潜伏からのより効率的な再活性化を誘発し、いくつかの場合、感染細胞の選択的殺滅を誘発する。作用Ａ）およびＢ）は、両方の効果を発揮する１つの薬剤によってなされ得るか、あるいは異なる薬剤の併用によって得られる。酸化ストレスに対抗する２つの主要な細胞機構、すなわちチオレドキシン（Ｔｒｘ）チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）系およびグルタチオンが存在する。本明細書中では、２つの機構のいずれかを遮断することによって作用Ｂ）を発揮する能力がある薬剤戦略について示す。
【０００８】
オーラノフィンが、ＨＩＶ−１静止の細胞系モデルにおいて、ＨＩＶ−１を活性化し得るか否か、またそれをいかにして活性化し得るかを試験するために実験を行った。驚くべきことに、金（Ｉ）含有化合物オーラノフィンが静止状態からのＨＩＶ−１活性化の強力な誘発剤であり、それ故にＨＩＶ−１根絶にとって有用であることを示している。オーラノフィンは、潜伏レトロウイルスのレゼルボアの活性化において顕著な活性を示す。そこで、これは、レトロウイルス感染を低減または除去するための治療法において、既知の抗レトロウイルス療法または治療（ＡＲＴ）と併用し得る。オーラノフィンのＨＩＶ−１再活性化に対する効果は、別の個所で考察されるように、この薬剤が逆に作用する（ＨＩＶを休止させる）と考えられていたことから、特に驚くべきことである。
【０００９】
詳細には、オーラノフィンは、（前記レトロウイルスの）潜伏レゼルボアからのレトロウイルスの複製を刺激することが見出されており、従来の抗レトロウイルス療法と併用して、これらのレゼルボアを低減または除去することが可能である。さらに、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、鉄ニトリロアセテートおよびブチオニンスルホキシミンはそれぞれ、オーラノフィンのＨＩＶ−１潜伏に対抗する能力を実質的に増強することが見出されている。
【００１０】
驚くべきことに、ヒ素含有化合物と、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）などのグルタチオン合成阻害剤との併用が、潜伏感染細胞の処置においても有効であることも見出している。特に、該活性剤は、非感染細胞ではなく感染細胞を標的化し、選択的に殺滅することが可能である。
【００１１】
したがって、特定の酸化ストレス誘導剤は、レトロウイルスレゼルボアの処置において有用である。
【００１２】
したがって、第１の態様では、レトロウイルスレゼルボアの処置における酸化ストレス誘発剤の使用が提供され、ここでの酸化ストレス誘発剤は、非鉄金属薬であるエピジェネティック調節剤（epigeneitic modulator）である。
【００１３】
誘発剤は、非鉄金属薬のエピジェネティック（epigeneitic）調節剤、例えば金含有化合物、例えばオーラノフィン、またはヒ素含有化合物、例えば三酸化ヒ素、またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とブチオニンスルホキシミンなどのグルタチオン合成阻害剤との併用である。例えば、シスプラチンは、金属薬であるが、エピジェネティック特性を有しない。酸化ストレス誘発剤は、酸化促進剤分子であってもよい。
【００１４】
本金属薬は、金属イオンを含み、かつ、生物学的活性を有する化合物である。これらの金属薬は、細胞内部での遺伝子発現特性の再編成を誘発することが可能な金属を含む。これを利用し、潜伏からのＨＩＶ−１活性化を誘発することが可能である。本金属薬は、特定の化学特性も有し得る。一般に、それらは１価の正電荷を有するイオンを放出できることが好ましい。任意選択により、それらは特定のステアリン酸の要件も満たし得る。
【００１５】
例えば、金（Ｉ）含有化合物は、これらの基準を十分に満たす。これらの化合物は、放出される、有機担体および金（Ｉ）イオンから構成され得る。本発明は任意の特定の機序に関連しないが、金の原子サイズ（約１７４ｐｍ）は、このタンパク質の生物学的活性にとって基本的なシステイン／セレノシステインとの複合体を形成するためのＴｒｘＲの活性部位における挿入を可能にする。三次元構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ内に認められ得る（登録番号：３Ｈ４Ｋ）。このようにして、ＴｒｘＲの活性が阻害される。
【００１６】
本金属薬の活性イオンは、金（Ｉ）イオンを再現することができる非金属イオンであってもよい。これに関連して、いくつかの半金属を含有する薬剤、例えば三酸化ヒ素（Ａｓ_２Ｏ_３）は、エピジェネティック金属薬として考慮してもよい。三酸化ヒ素は、１価の正電荷を有する一酸化ヒ素イオンを放出し、レダクターゼ中に存在するシステインまたはセレノシステインと共有結合付加体を形成するための構造的要件を満たす（ヒ素の原子サイズ：１１５ｐｍ；酸素の原子サイズ：６０ｐｍ）。Ｔｒｘスーパーファミリーメンバーとの複合体における酸化ヒ素の構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋにおいて見ることができる（登録：１Ｊ９Ｂ）。この構造は、１つの類似する付加体がチオレドキシンレダクターゼで形成されることを強く示唆している。
【００１７】
したがって、本金属薬によって放出されるイオンは、酸化によって専らＰｔ（ＩＩ）もしくはＯｐｔ（ＩＶ）イオンが得られることとなる白金、またはＦｅ（ＩＩ）もしくはＦｅ（ＩＩＩ）イオンが得られる鉄に由来しなくてもよく、金に対してより小さい原子サイズを有してもよい。したがって、鉄イオンまたは白金イオンを含む金属薬は、本発明から除外され、本発明の上記の金属薬のうち１つと組み合わされる場合に限って検討される。特に好ましい例が、金、好ましくは金（Ｉ）、またはヒ素イオンを含む化合物である。好ましい金含有化合物は、金塩または金誘導体を含む。オーラノフィンは特に好ましい。好ましいヒ素含有化合物は、酸化ヒ素などのヒ素を含み、白色ヒ素（Ａｓ_２Ｏ_３であるが、Ａｓ_４Ｏ_６としても見出され得る）を含む。三酸化ヒ素（Ａｓ_２Ｏ_３）は特に好ましい。金（Ｉ）含有化合物および三酸化ヒ素によって共有される別の一般的活性は、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体として作用する能力であり、それによってラジカル酸素種（ＲＯＳ）の細胞内生成を促進する。ＲＯＳは、ＨＩＶ−１を潜伏から活性化することで広く知られている。
【００１８】
エピジェネティック調節剤は、ＤＮＡメチル化およびクロマチン再構成、すなわちＤＮＡ巻き込み（winding)および／または巻き戻し（unwinding)の役割を発揮し、それにより遺伝子発現を調節することは当該技術分野で既知である。
【００１９】
非鉄金属薬のエピジェネティック調節剤は、酸化ストレスを誘発する能力がある。それはまた、好ましくは、チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）を阻害し、および／またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）模倣体として作用する能力がある。金属薬は、好ましくは、チオレドキシンレダクターゼをその活性部位を遮断することによって阻害する。これは、これらのタンパク質の還元活性にとって重要であることが知られるセレノシステイン残基と直接複合化することによって達成できる。金属薬は、ＴｒｘＲの合成をも抑制し得る。
【００２０】
酸化促進剤分子、特にグルタチオン合成経路における制限酵素であるγ−グルタミルシステインシンテターゼの阻害剤も企図される［Anderson、１９９８年］。この酵素の好ましい阻害剤は、不可逆阻害剤であるブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）を含む。したがって、ＢＳＯはグルタチオン合成阻害剤であり、このような阻害剤も好ましい。阻害剤は、最も好ましくはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）との併用で提供される。
【００２１】
本発明の化合物（グルタチオン合成阻害剤とＨＤＡＣｉなどの併用を含んでもよい）は、選択的殺滅を行う能力がある。これは、非感染細胞ではなく潜伏感染細胞を標的化し、破壊する能力である。換言すれば、ウイルスレゼルボアを含む細胞は標的化されるが、非感染細胞は破壊されず、有利にも副作用の低下がもたらされる。標的細胞が移行性（transitional）メモリーＴ−ＣＤ４^＋細胞（Ｔ_ＴＭｓ）またはセントラルメモリーＴ−ＣＤ４^＋細胞（Ｔ_ＣＭＳ）であることは好ましい。これらは、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）下でありかつ低いＣＤ４カウントを示す個体における、ＨＩＶ−１潜伏における主要なレゼルボアである［Chomontら、２００９年］。セントラルメモリーＴ ＣＤ４^＋細胞（Ｔ_ＣＭＳ）は、Ｔ_ＴＭＳの前駆体であり、より安定したＨＩＶ−１レゼルボアを示す。したがって、本発明は、ウイルスレゼルボアを有する患者、特に低いＣＤ４カウントを示す患者の処置において特に有用である。抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）は、これが他の細胞に感染する新たに形成されるウイルスの阻止に役立ち得ることから、前記患者であれば、これを受診中であるか、または受診したことがあるはずである。
【００２２】
レトロウイルスレゼルボアを有すると疑われる患者を処置する方法であって、前記患者に、本明細書中に規定される酸化ストレス誘発剤（非鉄金属薬のエピジェネティック調節剤またはＨＤＡＣｉとグルタチオン合成阻害剤、例えばブチオニンスルホキシミンとの併用を含み得る）を投与する工程を含む方法も提供する。本方法は、（さらなる）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、ＢＳＯ、金含有化合物、例えばオーラノフィン、ヒ素含有化合物、例えば三酸化ヒ素（Ａｓ_２Ｏ_３）および／または鉄ニトリロアセテートもしくは硫酸第一鉄のうち少なくとも１つを投与する工程をさらに含んでもよい。
【００２３】
本発明はまた、レトロウイルスによって潜伏感染される細胞を選択的に標的化する方法であって、細胞を前記酸化ストレス誘発剤と接触させる工程を含む方法を提供する。
【００２４】
したがって、ＨＩＶ−１を潜伏から活性化させるだけでなく、ＨＩＶ−１を静止状態で維持する細胞の抗酸化機構に対抗することが可能な戦略を提供する。エピジェネティック金属薬の場合、両活性は、同じ薬剤によって発揮される（ＨＩＶ−１複製を活性化するＲＯＳの誘導および細胞の抗酸化剤タンパク質ＴｒｘＲの阻害）。ＨＤＡＣＩとＢＳＯの併用の場合、これらの効果は、別々の薬剤（エピジェネティックＨＩＶ−１再活性化を誘発するＨＤＡＣｉと、細胞の還元ペプチドであるグルタチオンの合成を阻害するＢＳＯ）によって発揮される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】オーラノフィン［金（１＋）；３，４，５−トリアセチルオキシ−６−（アセチルオキシメチル）オキサン−２−チオラート；トリエチルホスファニウム］の構造。
【図２】ＡＣＨ−２細胞内でのオーラノフィンによるＨＩＶ−１複製の用量依存性刺激。グラフは、薬剤とのインキュベーションの３日目の、ＡＣＨ−２細胞内でのＨＩＶ−１ ｐ２４生成の濃度依存性刺激を示す。ｘ軸：薬剤濃度；ｙ軸：ＨＩＶ−１ ｐ２４における増加倍数（非処置培養物でのベースラインレベルの百分率の対数変換）。直線または曲線、データ点の最適なフィッティングが示される。
【図３】Ｕ１細胞内でのＨＩＶ−１複製に対するオーラノフィン（０．２５μＭ）とＭＣ２１１３（１μＭ）の併用効果。Ｕ１細胞は、単独薬剤または併用薬剤のいずれかとともにインキュベートされ、ｐ２４生成は治療の２４時間後に評価した。この場合、相乗効果が明らかであったので、それは相乗作用表面の百分率を用いる分析を必要としなかった。
【図４】オーラノフィンによる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＬＴＲ制御発現の用量依存性誘発。Jordanら（２００３年）によって確立された、静止感染Ｔリンパ球性Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンを使用した。このクローン（すなわち８．４）は、ＬＴＲの制御下でありかつＧＦＰ遺伝子置換（GFP gene replacing）ｎｅｆを示す全ＨＩＶ−１ゲノムを有する。８．４細胞は、ＧＦＰ発現の非有意な基礎レベルを示す。細胞は、異なる治療薬とともにインキュベートされ、７２時間後、標準のフローサイトメトリー技術により、開口型（gated）生細胞内でのＧＦＰ発現を監視した。結果は、蛍光ヒストグラムとして示される。各ヒストグラムは、非感染Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて確立された閾値を超える蛍光細胞の百分率を報告する。
【図５】オーラノフィンおよびクラスＩヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＭＣ２１１３）による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＬＴＲ制御発現の誘発。静止感染Ｊｕｒｋａｔ８．４細胞は、臨床的に意義のある濃度のオーラノフィン（０．２５μＭ）もしくは１μＭのＭＣ２１１３またはその双方で処置された。データは図４などにおいて示される。
【図６】異なるインキュベーション時間でのオーラノフィンによるＮＦ−κＢ（ｐ６５／ｐ５０）核輸送の誘発。静止感染Ｊｕｒｋａｔ８．４細胞は、オーラノフィン、すなわち臨床的に意義のある濃度のオーラノフィン（０．２５μＭ）とともにインキュベートされ、核抽出物中でのｐ６５の存在が、核因子比色分析アッセイによって定量された。結果は、ＴＮＦ−αとともに１．５時間インキュベートされた細胞に由来する核抽出物中で得られるシグナルの百分率として示される。
【図７】ＡＣＨ−２細胞内でのＨＩＶ−１複製の相乗刺激をもたらすオーラノフィンおよびＦｅＮＴＡの併用効果。３Ｄ表面は、薬剤間の相乗作用を示す（ｘ、ｙ軸：薬剤濃度；ｚ軸：２つの薬剤間の相乗作用の百分率）。相乗作用値の百分率は、次のように計算される、薬剤併用の効果と同等の濃度で個別投与されるオーラノフィンおよびＦｅＮＴＡの効果の合計との間のパーセント差異を表す。ＰＳ＝１００・［Ｅ_{ｄｒｕｇＡ＋ｄｒｕｇＢ}−（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）］／（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）（式中、ＰＳは相乗作用の百分率でありかつＥは薬剤濃度の効果であり、ｐ２４生成における増加倍数として表される）
【図８】ＡＣＨ−２細胞内でＨＩＶ−１複製の相乗刺激をもたらす、オーラノフィンとブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）の併用効果。図面の解釈においては、読者は図７の説明に注意されたい。
【図９】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）による細胞殺滅。パネルＡ〜Ｂ：ＨＤＡＣｉで処置された潜伏感染ＡＣＨ−２（パネルＡ）およびＵ１（パネルＢ）細胞におけるＨＩＶ−１ ｐ２４生成と、感染細胞生存度の阻害との間の相関。細胞は試験化合物（１μＭ）とともにインキュベートされ、細胞培養上清中でのｐ２４生成がＥＬＩＳＡによって測定された。上清の回収後、細胞生存度が高度に標準化されたメチルテトラゾリウム（ＭＴＴ）法によって測定された。ｘ軸：ＨＩＶ−１ ｐ２４における増加倍数；データは非処置培養物中のベースラインレベルの百分率の対数変換として示された。ｙ軸：同様の条件下でインキュベートされた非処置対照に対する、細胞生存度における百分率の減少。パネルＣ〜Ｄ：ＭＣ１８５５によるＨＩＶ−１に感染されたリンパ球性（パネルＣ）および単球性（パネルＤ）細胞培養物の選択的殺滅。非感染Ｈ９、およびＵ９３７、およびＨＩＶ−１感染Ｈ９_ＩＩＩＢ、ＡＣＨ−２、およびＵ１細胞は、試験化合物とともに数日間インキュベートされ、細胞生存度が上記のように測定された。ｘ軸：薬剤濃度、ｙ軸：非処置対照に対する、細胞生存度における百分率の減少。
【図１０】ＡＣＨ−２細胞内でのＭＳ２７５によるＨＩＶ−１複製の用量依存性刺激。グラフは、薬剤とのインキュベーションの３日目におけるＡＣＨ−２細胞内でのＨＩＶ−１ ｐ２４生成の濃度依存性刺激を示す。ｘ軸：薬剤濃度；ｙ軸：ＨＩＶ−１ ｐ２４における増加倍数（非処置培養物中でのベースラインレベルの百分率の対数変換）。必要な場合、適切な変換を行い、データを正規化した。直線または曲線、データ点の最適なフィッティングが示される。
【図１１】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）とブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）との相乗作用。三次元（３Ｄ）グラフは、ＨＤＡＣｉおよびＢＳＯのそれぞれの間の相乗作用の３Ｄ表面を示す。ｘ、ｙ軸：薬剤濃度；ｚ軸：２つの薬剤の間の相乗作用の百分率。相乗作用値の百分率は、次のように計算される、薬剤併用の効果と同等の濃度で個別投与されるＭＳ２７５およびＢＳＯの効果の合計との間のパーセント差異を表す。ＰＳ＝１００・［Ｅ_{ｄｒｕｇＡ＋ｄｒｕｇＢ}−（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）］／（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）（式中、ＰＳは相乗作用の百分率でありかつＥは薬剤濃度の効果であり、ｐ２４生成における増加倍数として表される）
【図１２】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）とブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）との相乗作用。三次元（３Ｄ）グラフは、ＨＤＡＣｉおよびＢＳＯのそれぞれの間の相乗作用の３Ｄ表面を示す。ｘ、ｙ軸：薬剤濃度；ｚ軸：２つの薬剤の間の相乗作用の百分率。相乗作用値の百分率は、次のように計算される、薬剤併用の効果と同等の濃度で個別投与されるＭＳ２７５およびＢＳＯの効果の合計との間のパーセント差異を表す。ＰＳ＝１００・［Ｅ_{ｄｒｕｇＡ＋ｄｒｕｇＢ}−（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）］／（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）（式中、ＰＳは相乗作用の百分率でありかつＥは薬剤濃度の効果であり、ｐ２４生成における増加倍数として表される）
【図１３】単独のまたはＪｕｒｋａｔ細胞クローン（Ａ１）と併用される、ＭＳ−２７５およびブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＨＩＶ−１ ＬＴＲ制御発現の刺激。潜伏ＨＩＶ−１感染のためのモデルとしてJordanらによって確立された、Ｔリンパ球性Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のＡ１細胞クローン。このクローンは、ＨＩＶ−１ ＬＴＲの制御下で組み込まれたＧＦＰ／Ｔａｔコンストラクトを有し、ＨＩＶ−１プロモーターを活性化する刺激の後に増加するＧＦＰ発現細胞の基本的比例を示す。Ａ１細胞を異なる治療薬とともに７２時間インキュベートし、ＧＦＰ発現を標準のフローサイトメトリー技術によって監視し、対照非形質移入Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用して確立された閾値を超える（各ヒストグラムにおいて示される）蛍光細胞の百分率として評価した。３つのうち１つの実験で同様の結果が得られた。二重薬剤（double-drug）治療から得られたヒストグラムは、同等の濃度での単一薬剤による処置から得られたものとは有意に異なる（Ｐ＜０．０１）ことが見出された（コルモゴロフ−スミルノフ統計）。
【図１４】単独のまたは併用される、ＨＤＡＣ阻害剤、ＭＳ−２７５およびブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）の効果。細胞生存度値は、メチルテトラゾリウム（ＭＴＴ）法による測定として、インキュベーションの７２時間後に示される。ＡＣＨ−２細胞（Ａ）、Ｊｕｒｋａｔ６．３細胞（Ｂ）、非感染Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｃ）。結果は、バックグラウンドを差し引いた非処置対照における吸光度の百分率（λ＝５５０）として示される（平均±ＳＥＭ；３つの実験）。アスタリスクは、ＢＳＯ処置と、ＢＳＯの不在下での同等の処置との間で見出される有意な差異を示す（^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。反復測定、ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニのポストテストを使用し、必要な場合、正規性を回復するための適切な変換に従って、統計的有意性を計算した。
【図１５】三酸化ヒ素による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＬＴＲ制御発現の用量依存性誘発。この実験では、ＨＩＶ−１ ＬＴＲの制御下で組み込まれたＧＦＰ／Ｔａｔコンストラクトを有するＴリンパ球性Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンＡ１を使用した。細胞を異なる治療薬とともにインキュベートし、７２時間後、標準のフローサイトメトリー技術により、ゲート生細胞内でのＧＦＰ発現を監視した。結果は、蛍光ヒストグラムとして示される。各ヒストグラムは、非感染Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用して確立された閾値を超える蛍光細胞の百分率を報告する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
一態様では、レトロウイルスレゼルボアの処置における金含有化合物の使用が提供される。
【００２７】
金含有化合物は、前記レトロウイルスのレゼルボアの認定されたモデルにおいてレトロウイルス複製を誘発する能力があることが好ましい。ＨＩＶ−１の場合、このモデルは、例えばＵ１およびＡＣＨ−２から選択してもよい。本発明の化合物は、約５００％の増加倍数（％）に関する添付の実験セクションにおける下記のＵ１アッセイにおいて最小の活性を有することがさらに好ましい。
【００２８】
好ましいレトロウイルスは、サルまたはヒトレンチウイルス、例えばＨＩＶであり、例えばＨＩＶ−１は本発明の好ましい標的である。
【００２９】
好ましくは、金含有化合物はオーラノフィンであり（図１）、これは、その金（Ｉ）中心原子ならびにトリエチルホスフィンおよび炭水化物リガンドによって特徴づけられる。他の関連の好ましい金錯体は、例えばクロロ類似体のＥｔ３ＰＡｕＣｌおよび金チオマレートを含む。これらは、いまだに研究中である複数の作用形式を有してもよい。オーラノフィンは最近、細胞内レドックス電位の酸化促進剤側への変化を誘発することが示された［Sannellaら、２００８年］。活性種は、金イオン自体であることが多く、リガンドは、作用剤の生体内分布および動力学的特性に対してより関連性がある。ＨＩＶ−１根絶戦略にとっての理想的な候補は、（ＨＩＶ−１感染個体にとって有害な［Savarinoら、２０００年］）免疫活性化を誘発しないものである。したがって、有機金塩に抗炎症特性が与えられることは有利である。
【００３０】
したがって、金（Ｉ）もしくは（ＩＩ）イオンは生物学的利用が可能である。金含有化合物は錯体とも称され得ることは理解されるであろう。金含有化合物は、金をその（Ｉ）もしくは（ＩＩ）酸化状態で含む場合があり、（Ｉ）が特に好ましい。本発明の金含有化合物は、金のイオン化合物または有機金化合物である。
【００３１】
好ましくは、金含有化合物は、単独使用するか、またはＨＤＡＣｉ、ＢＳＯおよび／または鉄ニトリロアセテート(iron nitoloacetate)の少なくとも１つと併用してもよい。ＢＳＯとの併用は好ましく、少なくとも１つのＨＤＡＣｉとの併用は特に好ましい。
【００３２】
本発明はまた、レトロウイルスレゼルボアの処置において、非鉄金属薬エピジェネティック調節剤である酸化ストレス誘発剤と少なくとも１つのＨＤＡＣｉとの併用を提供する。酸化ストレス誘発剤は、最も好ましくは、金もしくはヒ素含有化合物、例えばオーラノフィンもしくは三酸化ヒ素、またはグルタチオン合成阻害剤、例えばＢＳＯである。鉄ニトリロアセテートは、ＨＤＡＣｉとの併用も企図される。
【００３３】
ＨＤＡＣｉが酸化ストレス誘導剤と考え得る限りでは、上述の酸化ストレス誘発剤は非ＨＤＡＣｉ酸化ストレス誘発剤である。換言すれば、本発明は、レトロウイルスレゼルボアの処置において、少なくとも１つのＨＤＡＣと少なくとも１つの他の（非ＨＤＡＣｉ）酸化ストレス誘発剤との併用を提供することが可能である。他の（非ＨＤＡＣｉ）酸化ストレス誘発剤は、例えば、オーラノフィンまたはＢＳＯ、鉄ニトリロアセテートまたは硫酸第一鉄であってもよい。
【００３４】
本使用に対応する治療の方法も企図される。
【００３５】
鉄ニトリロアセテートに対する本明細書中での参照が、インビトロまたはインビボで同様の活性を有する鉄含有化合物の範囲にまで適用されることは理解されるであろう。別の好適な例が硫酸第一鉄である。したがって、同用語は、特に明確でない場合、交換可能である。
【００３６】
酸化ストレスは、酸化ストレスを誘発するＨＩＶ−１複製およびＨＩＶ−１を静止状態から活性化する酸化ストレスとの二元相互作用により、ＨＩＶ−１複製に関連することが示された［IsraelおよびGougerot-Pocidalo、１９９７年］。酸化ストレスに誘発される静止状態からのＨＩＶ−１活性化の背後にある機序は極めて多く、いまだにあまり検討されていない。酸化ストレスは、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）とヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）の活性の間のバランスをＨＡＴ活性の増大に向かわせることが示された［Rahmanら、２００４年］。これは、ＤＮＡ巻き戻しおよびＨＩＶ−１プロウイルスを含む数種の遺伝子の転写を支持する。それに対し、酸化ストレス誘導剤とＨＤＡＣｉの併用については検討されていない。
【００３７】
オーラノフィンは、酸化ストレスを介してＨＩＶ−１の再活性化を必ずしも誘発することはなく、他の機序を介して作用し得る。本発明者らは、オーラノフィンがおそらくは新規機序によって静止状態からのＨＩＶ−１活性化を誘発することを示している。この薬剤がＨＩＶ−１を静止状態から活性化するという証拠は、ＬＴＲ駆動性遺伝子発現が誘発可能な４つの異なる細胞系におけるその再現可能な効果から得られる。オーラノフィンが新規機序によってＨＩＶ−１遺伝子発現を活性化するという見解は、十分に特徴づけられた異なる機序によってＨＩＶ−１遺伝子転写を活性化することで知られる薬剤と組み合わされるその効果によって示唆され、その細胞内標的に対する現存する文献によって支持されている［Rigobelloら、２００２年；Rigobelloら、２００５年；Omataら、２００６年；Talbotら、２００８年］。
【００３８】
オーラノフィンは、細胞内レドックスのホメオスタシスの維持に関与するセレノプロテインであるＴｒｘＲの阻害剤であることが示された［Rigobelloら、２００２年；Rigobelloら、２００５年；Omataら、２００６年］。オーラノフィンはまた、ＴｒｘＲの合成を阻害することが示された［Talbotら、２００８年］。ＴｒｘＲは、２つの主なアイソフォームである細胞質（ＴｒｘＲ１）およびミトコンドリア（ＴｒｘＲ２）の中に見出される［LuおよびHolmgren、２００９年］。ＴｒｘＲは、チオレドキシンを主とする数種類の物質を有する（Ｔｒｘ１は細胞アイソフォーム；Ｔｒｘ２はミトコンドリアアイソフォーム）。ＴｒｘＲは、Ｔｒｘを還元状態で維持し、次いで数種類の細胞内タンパク質を還元する。Ｔｒｘは別として、ＴｒｘＲは、ＴｒｘＲの作用によって不活性化されるＨＩＶ−１ Ｔａｔを含む他の標的も還元する（Kalantariら、２００８年）。
【００３９】
この証拠に照らして、ＨＩＶ−１再活性化に対するオーラノフィンの効果がＴａｔによって媒介され得ることを推測することができるであろう。しかし、オーラノフィンは、不完全なＴａｔ／ＴＡＲ軸を有するＡＣＨ−２およびＵ１などの細胞系においてＨＩＶ−１誘発効果を発揮し、したがって、このことは他の標的がオーラノフィンのＨＩＶ−１誘発効果に関与することを示唆している。事実、オーラノフィンは、複数の細胞内標的に対して作用することが示された。この薬剤は、セレノプロテインに対するその効果以外に、タンパク質キナーゼＣ［Danielら、１９９５年］、カテプシン［ChircorianおよびBarrios、２００４年］などのいくつかのキナーゼを阻害することが見出された。
【００４０】
本発明者らの研究では、オーラノフィンは、フェントン反応を通じて反応性酸素種（ＲＯＩ）を生成するＦｅＮＴＡのＨＩＶ−１活性化効果を強力に促進した。さらに、オーラノフィンの効果は、グルタチオンの減少を誘発し、それ故に細胞が酸化ストレスに対抗する能力を低下させる化合物であるＢＳＯによって促進された。他の筆者（Sannellaら、２００９年）が報告するように、オーラノフィンが酸化促進剤効果を誘発する場合、その機序は、ＦｅＮＴＡおよびＢＳＯなどの他の酸化促進剤分子の場合と異なる可能性がある。オーラノフィン単独のＨＩＶ−１活性化効果は、本明細書中でそのＮＦ−κＢ活性化効果によって支持されている。酸化ストレスは、ＮＦ−κＢ（ｐ６５／ｐ５０）核転座を誘発することが示された［Rahmanら、２００４年］。この核因子は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ上の特定の部位に結合し、プロウイルスゲノムの転写を促進する［Williamsら、２００７年］。
【００４１】
これに関連し、本発明者らは本試験において、オーラノフィンが、ＨＩＶ−１複製を誘発する場合と同様の条件下でＮＦ−κＢ核転座およびＤＮＡ結合を誘発することを見出している。これは、前報［Jeonら、２０００年；Traberら、１９９９年］を踏まえると、実に驚くべき実験結果であった。本発明者らの結果と、ＮＦ−κＢ活性化に対するオーラノフィンおよび他の金含有化合物の阻害効果を示す先の試験の結果との明らかな差異［Jeonら、２０００年；Traberら、１９９９年］は、採用された異なる薬剤濃度を考慮することによって調整することが可能である。ＮＦ−κＢ阻害を示すための先の試験において採用されたオーラノフィン濃度は、本試験において採用された濃度よりも約２桁高かった。関節リウマチの処置における臨床的に実現可能な濃度より高いかかる薬剤濃度は、本発明者らの細胞系に対して毒性があった（データは示さず）。代わりに、本発明者らは、オーラノフィンがＨＩＶのサイレンシング、すなわち活性化に対して逆の効果を有することができることを示した。これは特に、当業者によって容易に決定されることになる好適な濃度での場合である。しかし、指針によると、関節リウマチの処置の間に認められる平均血漿レベルに近似する０．１２５〜０．５μＭの濃度範囲を使用することが好ましい［Bennら、１９９１年、参照により本明細書中に援用される］。他の好ましい範囲は、０．１〜０．６、０．１２５〜０．３、０．２〜０．６、０．２〜０．７、０．１２５〜０．２および０．１２５〜０．１７５μＭを含む。
【００４２】
当業者は、これらをヒト用量にまで拡大してもよいが、次の範囲、すなわち０．０２５〜０．２ｍｇ／ｋｇ／日、０．０２〜０．３ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１〜０．３ｍｇ／ｋｇ／日、０．００５〜０．３ｍｇ／ｋｇ／日、０．０３〜０．２ｍｇ／ｋｇ／日、０．０３〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日、０．０２５〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日および０．０２〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日の任意の１つが好ましいことを理解するであろう。０．０２５〜０２ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲が特に好ましい。
【００４３】
オーラノフィン誘発性ＮＦ−κＢの核転座は、オーラノフィンが酸化ストレスの誘発によってＨＩＶ−１を静止状態から活性化するという見解をさらに支持するが、ＮＦ−κＢを、ＨＩＶ−１複製に対するオーラノフィンの効果における主要なエフェクターとして示す証拠として把握することはできない。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ上で潜在的に活性を示すいくつかの他の転写因子が、酸化ストレスによって活性化される［Wuら、２００４年］。さらに、酸化ストレスは、ＨＡＴの活性を増大させる方向でＨＤＡＣおよびＨＡＴの活性の間のバランスを変化させる。これに関連して、オーラノフィンとＨＤＡＣＩとの相乗効果を見出している。
【００４４】
金イオン（ＩおよびＩＩ）単独は弱いフェントン触媒であるが、金の有機複合体は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）模倣体として作用することによりＦｅ^２＋によって触媒されるフェントン反応を促進し得る［Huangら、２００５年］。ＳＯＤ模倣体は、超酸化物／過酸化物変換を触媒することにより、フェントン触媒によって消費される細胞内過酸化水素プールを補充し、それにより新しい基質をフェントン反応に提供し得る。ＳＯＤ模倣およびＴｒｘＲ阻害は、必ずしも互いに排他的ではなく、共通のバックグラウンドを有し得る。したがって、両方の機序が連携してＨＩＶ−１を静止状態から活性化させると仮定することは可能である。最後に、いまだ探索されていない機序として他のものがオーラノフィンのＨＩＶ−１活性化効果の基盤となり得ることを除外することはできない。
【００４５】
本試験の結果は、静止状態からのＨＩＶ−１活性化の誘発における既存の薬剤に対する新たな用途を示唆する。それはまた、非毒性薬剤濃度でＨＩＶ−１を活性化する２薬併用に基づく新規の戦略を示唆する。オーラノフィンは、関節リウマチおよび白血病の処置に有効に使用される薬剤であり、本試験において、十分に特徴づけられ、ヒトの健康を脅かさないことが示されている毒性特性を有する臨床的に実現可能な濃度で静止状態からのＨＩＶ−１活性化を誘発することが見出された。さらに、有効なオーラノフィン濃度を、異なる機序によって作用するＨＤＡＣＩなどの他のＨＩＶ−１活性化剤の併用により、さらに減少させることが可能であることを示す。
【００４６】
本発明者らの結果は、オーラノフィンが、関節リウマチの処置の間に認められる平均血漿レベルに近似する０．１２５〜０．５μＭの濃度範囲内で、時間および用量依存性のＨＩＶ−１再活性化を誘発することを示した（Ｐ＝０．０２９５、回帰におけるｔ検定；図５Ｂ）［Bennら、１９９１年］。ＨＩＶ−１活性化を誘発するその能力と一致して、オーラノフィンは、ＨＩＶ−１における重要な転写因子であるＮＦ−κＢの核転座を誘発した。静止状態からのＨＩＶ−１活性化に対するオーラノフィンの効果は、ＨＩＶ−１複製を促進する他の化合物の効果に相加的または相乗的であった。これらは、ＤＮＡ巻き戻しのエピジェネティック調節によってＨＩＶ−１転写を支持するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣＩ）、反応性酸素種（ＲＯＩ）の細胞内生成によってＨＩＶ−１転写を促進する鉄ニトリロアセテート、および細胞の酸化ストレスに対抗する能力を低下させるグルタチオン合成阻害剤であるブチオニンスルホキシミンを含む。これらの併用効果は、非感染細胞に対して毒性を示さない濃度での両オーラノフィンと上記薬剤の各々との併用を可能にする。
【００４７】
ウイルスを身体から根絶できるＨＩＶ−１／ＡＩＤＳに対する有望な治療を見出すことは、２１世紀における主要な科学的課題である。本発明者らのさらなる検討手段は、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）にもかかわらず存続する潜伏ＨＩＶ−１レゼルボアの除去に有用な、有望な薬剤および薬剤の組み合わせを検討することを目的とする。これは、潜伏感染Ｔ細胞内でのＨＩＶ複製を誘発する一方、同時にＡＲＴを施すことによって非感染細胞に対する新規に生成されるビリオンの拡散を阻止することによって潜伏障壁を克服することを含む。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、ＨＩＶ−１根絶戦略における潜在的に有用なツールであることが仮定されており［Demonteら、２００４年］、また、相対的に弱いＨＤＡＣｉであるバルプロ酸（ＶＡ）が、抗レトロウイルス療法と組み合わせて、インビトロで潜伏からのＨＩＶ−１回避を促進し、インビボで潜伏感染メモリーＣＤ４^＋細胞の数を減少させることが示された［Lehrmanら、２００５年；Smith、２００５年］。かかる戦略は「ショックおよび殺滅」と称されている［Hamer、２００４年］。ＶＡ（ミリモル範囲内でのＥＣ５０）の低い効力は、ＨＩＶ−１根絶を誘発できないことに寄与している可能性が高い。
【００４８】
新規でより強力なＨＤＡＣｉは、腫瘍における分化を誘発することを目的として開発されている［MottetおよびCastronovo、２００８年］。しかし、新しい作用剤の多くは、細胞周期において重要な役割を様々に発揮するＨＤＡＣのあらゆるタイプに対する非特定の阻害剤である［Dokmanovicら、２００７年］。クラスＩのＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ１〜３および８を含み、主に核酵素であり、かつ偏在的に発現される［Annemiekeら、２００３年］。クラスＩＩ ＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ４〜７，９および１０を含み、かつ核と細胞質の間を往復する［Annemiekeら、２００３年］。ＨＤＡＣ１は、ｃ−ＭｙｃとＬＴＲとの多重分子複合体中で作用することにより、ＨＩＶ−１潜伏を維持する可能性が高い［Williamsら、２００６年；Jiangら、２００７年］。
【００４９】
Ｔ細胞活性化に対抗する天然物質のプロストラチン（その機構はこれまで広く探索されていない）およびジアシルグリセロールラクトンの使用を含む、潜伏からのＨＩＶ−１回避を誘発するための他の戦略が探索されている［Hezareth、２００５年；Hamer；２００４年］。
【００５０】
酸化ストレスは、ＨＩＶ−１複製を促進する別の強力な手段である［Hulganら、２００３年；Savarinoら；１９９９年；Garaciら、１９９７年；Palamaraら、１９９６年］。反応性酸素中間体は、高濃度のグルタチオンおよび他の抗酸化剤によって阻害され得る［Palamaraら１９９６年］、ＨＩＶ−１転写および複製を促進する転写因子である核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化および核転座を促進する［BowieおよびO’Neill、２０００年］。小分子のレドックス状態調節剤はこれまで、そのＨＩＶ−１根絶の可能性についてはあまり探索されていない。
【００５１】
驚くべきことに、今や、ＨＤＡＣｉ阻害剤の２つのタイプであるベンズアミドおよびヒドロキサム酸が、好ましくはグルタチオン合成阻害剤、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）と併用して、潜伏レトロウイルスのレゼルボアの活性化において顕著な活性を示すことを見出している。これを治療において既知の抗レトロウイルス療法または治療（ＡＲＴ）と併用することで、レトロウイルス感染を低下または除去することが可能である。
【００５２】
詳細には、ヒストン脱アセチル化酵素のベンズアミドおよびヒドロキサム酸阻害剤は、その潜伏レゼルボアからレトロウイルスの複製を刺激することが見出されており、これを従来の抗レトロウイルス療法と併用することで、これらのレゼルボアを低下または除去し得る。さらに、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）は、ベンズアミドＨＤＡＣｉの抗レトロウイルス活性を実質的に増強することが見出されている。ＢＳＯの類似体も好ましい。
【００５３】
本発明の一態様では、レトロウイルスレゼルボアの処置において、ベンズアミドまたはヒドロキサム酸種のいずれかのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）の使用が提供される。ＨＤＡＣｉはＢＳＯと併用されるのが特に好ましい。
【００５４】
阻害剤が、前記レトロウイルスのレゼルボアの認定されたモデルにおいてレトロウイルス複製を誘発する能力があることは好ましい。ＨＩＶ−１の場合、このモデルは、例えばＵ１およびＡＣＨ−２から選択してもよい。本発明の化合物が、添付の実験セクションにおける下記のＵ１アッセイにおける８００倍増加（％）の最小の活性を有することがさらに好ましい。
【００５５】
金含有化合物のように、好ましいレトロウイルスは、例えばＨＩＶ−１などのサルまたはヒトレンチウイルスであり、ＨＩＶ−１は好ましい標的である。
【００５６】
したがって、ＨＤＡＣｉは、本発明の多くの態様においては、例えば酸化ストレス誘導剤と併用し得る。酸化ストレス誘発剤は、金含有化合物、例えばオーラノフィン、ヒ素化合物、例えば三酸化ヒ素、またはグルタチオン合成阻害剤、例えばＢＳＯを含んでもよい。本発明のすべての態様における使用を目的とする好ましいＨＤＡＣｉは下記に示される。
【００５７】
いわゆる「古典的（classical）」ＨＤＩは、クラスＩおよびクラスＩＩヒストン脱アセチル化酵素に対して作用する。古典的ＨＤＡＣｉは、ＨＤＡＣの亜鉛含有触媒ドメインに結合する。これらの古典的ＨＤＩは、いくつかの集団に分類される。これらは、ヒドロキサム酸、例えばトリコスタチンＡ；環状テトラペプチド（トラポキシンＢなど）、およびデプシペプチド；ベンズアミド；求電子性ケトン；ならびにフェニル酪酸およびバルプロ酸などの脂肪族酸化合物を含む。いわゆる「第２世代」ＨＤＩは、ＳＡＨＡ／ボリノスタット、ベリノスタット／ＰＸＤ１０１、ＭＳ２７５、ＬＡＱ８２４／ＬＢＨ５８９、ＣＩ９９４、およびＭＧＣＤ０１０３を含む。サーチュインクラスＩＩＩ ＨＤＡＣは、ＮＡＤ＋依存性であり、それ故、ＮＡＤ、ジヒドロクマリン、ナフトピラノン、および２−ヒドロキシナフトアルデヒドの誘導体と同様、ニコチンアミドによって阻害される。特に、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、特にオーラノフィンなどの金含有化合物との併用が好ましい。
【００５８】
特に好ましいＨＤＡＣｉは、ベンズアミドＨＤＡＣｉである。これらは、式
【化１】

（式中、Ｙは、各々が不飽和または部分不飽和で、かつ、複素環式または単環式であり、２〜８個の連結原子を有する、１つもしくは２つの６員環を含み、連結原子または環のいずれかはアミノ基およびカルボニル基を含む。）
を有してもよい。
【００５９】
より好ましいベンズアミドは、ＭＣ２２１１として同定される化合物の類似体であり、下記のＭＣ２１１３およびＭＳ２７５は特に好ましく、ＭＳ２１１３は最も好ましい。
【００６０】
ＭＣ２２１１は、
【化２】

である。
【００６１】
ＭＣ２１１３は、
【化３】

である。
【００６２】
ＭＳ２７５すなわちＮ−（２−アミノフェニル）−４−［Ｎ−（ピリジン−３−イルメトキシカルボニル）アミノメチル］−ベンズアミド）は、ＥＰ１６２６７１９号に開示されており、構造
【化４】

を有する。
【００６３】
好ましいヒドロキサム酸ＨＤＡＣｉは、
【化５】

を有し、式中、Ｒは、直接結合またはエチレンもしくはエテニレン基、Ｘは、＝ＣＨ−もしくは＝Ｎ−、Ｒ^１は、アリールまたはヘテロアリールであり、かつ、単環式もしくは二環式であり、Ｒ^２は、直鎖もしくは分枝鎖アルキルであって、任意選択により単環式もしくは二環式アリールまたはヘテロアリール基によって置換されている。好ましくは、Ｒ^２は、非置換のアルキル、好ましくはメチル、エチル、またはイソプロピルである。Ｒ^１は、好ましくはフェニルまたはナフチルである。Ｒは、好ましくはエテニレンである。Ｘは、好ましくは＝ＣＨ−である。好ましいＨＤＡＣｉは、クラスＩのＨＤＡＣｉである。
【００６４】
スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）などのヒドロキサム酸ＨＤＡＣｉも好ましい。これはヒドロキサム酸を含有するハイブリッド極性分子であり、ヒストン脱アセチル化酵素に特異的に結合し、その活性を阻害する。ＳＡＨＡは、腫瘍の生存を調節する遺伝子の発現を増大させることによって抗腫瘍効果を示し、かつインビボおよびインビトロで炎症誘発性サイトカインの産生を低下させるものとして当該技術分野で既知である（Mascagniら、"The antitumor histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid exhibits antiinflammatory properties via suppression of cytokines" PNAS March 5, 2002 vol. 99 no. 5 2995-3000）。
【００６５】
レトロウイルスレゼルボアの処置におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）の使用も企図される。阻害剤は、本明細書中に開示されるＨＤＡＣｉ、および好ましくは、
ａ）式
【化６】

（式中、Ｙは、各々が不飽和または部分不飽和で、かつ、複素環式または単環式であり、２〜８個の連結原子を有する、１つもしくは２つの６員環を含み、該連結原子または環のいずれかはアミノ基およびカルボニル基を含む。）
を有するベンズアミドＨＤＡＣ阻害剤、または
ｂ）式
【化７】

（式中、Ｒは、直接結合またはエチレンもしくはエテニレン基、Ｘは、＝ＣＨ−もしくは＝Ｎ−、Ｒ^１は、アリールまたはヘテロアリールでありかつ単環式もしくは二環式であり、Ｒ^２は、直鎖もしくは分枝鎖アルキルであって、任意選択により単環式もしくは二環式アリールまたはヘテロアリール基によって置換されている。）
を有するヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤から選択してもよい。好ましくは、ＨＤＡＣｉは、クラスＩのＨＤＡＣｉである。
【００６６】
好ましくは、阻害剤は、前記レトロウイルスのレゼルボアの認定されたモデルにおいて、レトロウイルス複製を誘発する能力がある。レトロウイルスは、ＨＩＶウイルス、好ましくはＨＩＶ−１であってもよく、モデルはＵ１およびＡＣＨ−２細胞モデルから選択してもよい。
【００６７】
好ましくは、ベンズアミドは、本明細書中のＭＣ２２１１およびＭＳ２７５として同定された化合物のうちの１つの類似体である。阻害剤は、式
【化８】

を有する化合物であってもよい。
【００６８】
好ましくは、Ｒ^２は、非置換のアルキル、好ましくはメチル、エチル、またはイソプロピルである。好ましくは、Ｒ^１は、フェニルまたはナフチルである。Ｒは、好ましくはエテニレンである。Ｘは、好ましくは＝ＣＨ−である。
【００６９】
阻害剤はクラスＩ阻害剤であり、非特異的でないことが好ましい。好ましくは、処置は抗レトロウイルス療法をさらに含む。
【００７０】
レトロウイルスレゼルボアの処置においては、特にベンズアミド種のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣＩ）とグルタチオン合成阻害剤、例えばＢＳＯ（ブチオニンスルホキシミン）との併用も提供される。好ましくは、阻害剤は、Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［Ｎ−（ピリジン−３−イルメトキシカルボニル）アミノメチル］−ベンズアミド）である。ＢＳＯおよびベンズアミドＨＤＡＣｉは併用投与されることが好ましい。
【００７１】
添付の実施例２は、本発明のＨＤＡＣ化合物のいずれのクラスが阻害するかを確立するための好適な技術を提供する。本発明のＨＤＡＣｉは非特異的なＨＤＡＣｉでないことが特に好ましい。
【００７２】
本発明のＨＤＡＣｉは、レトロウイルスの潜伏レゼルボアを有すると疑われる患者の処置において使用することは可能である。かかるレトロウイルスは、本明細書中でＨＩＶ−１と称されることになるが、これは便宜上であって、すべてのかかる参照は、文脈から特に明確でない場合、他のレトロウイルスに対する参照を含むことは理解されるであろう。
【００７３】
処置は、好ましくはレトロウイルスの任意の潜伏レゼルボアを除去するように意図される。しかし、あまり好ましくないが、かかる処置が潜伏レトロウイルスを制御するために使用可能であることは理解されるであろう。個体が、例えばレゼルボアからの感染を特に繰り返し受けやすい場合、これは有利であり得る。
【００７４】
潜伏レゼルボアは、静止状態にあるか、または低速で、例えば通常速度の５％未満で複製するレトロウイルスを有する１つまたは複数の細胞であって、細胞は、ある期間ウイルスを保護するように作用可能であり、かつ通常の抗レトロウイルス処置の終了後の数週間から数か月間、しばしば生存ビリオンを放出するだけであり、したがって、このようなレゼルボアを介して感染が再発する場合、個体の継続的処置が必要となる。
【００７５】
上述の「通常の」抗レトロウイルス処置は、ＨＩＶ−１感染個体に投与され、一般に、異なるクラスに属する少なくとも３つの異なる薬剤の組み合わせからなり、それらは一般に、ヌクレオシド系／ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）から選択される。融合阻害剤も、処置の一部を形成し得る。最近、さらなる薬剤クラスであるインテグラーゼ阻害剤が、抗レトロウイルス薬に加えられている。一般に、抗レトロウイルス薬の併用は進行中のウイルス複製を遮断する能力を示すが、ウイルスを身体から根絶する潜在可能性を有していない。
【００７６】
レトロウイルスレゼルボアの除去においては、現行の戦略は、例えば、当該技術分野で周知のように、また上記のように、ＨＤＡＣｉ、特にクラスＩのＨＤＡＣｉと、従来の抗レトロウイルス療法との併用を前提とする［Savarinoら、２００９年］。
【００７７】
国際公開第２００７／１２１４２９号（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、国際公開第０３／０５３４６８号（Ｕｎｉｖ Ｌｉｂｒｅ Ｂｒｕｘｅｌｌｅｓ）は、ＨＤＡＣｉの使用に関する。様々なＨＤＡＣｉ構造が、国際公開第２００４／０６９８２３号（Ｍｅｔｈｙｌｇｅｎｅ，Ｉｎｃ）および国際公開第２００４／１０３３６９号（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）において開示されている。Munier Sら（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３、２００５年１１月、２：７３）は、２つの候補遺伝子ＮＣｏＡ３およびＩＲＦ８の特徴づけ（ＨＩＶ−１潜伏の制御に関与し得る）について述べている。Garaciら（Journal of Leukocyte Biology, July 1997, VoI 62, No.1 , pp 54-59）は、ＢＳＯの特定の使用について述べている。
【００７８】
ＨＤＡＣｉは、当業者または医師によって決定し得る、任意の好適な医薬的に許容できる媒体で、かつ、任意の好適な経路により、患者に直接投与してもよい。ＨＤＡＣｉは、例えば注射または経皮パッチとして投与してもよく、遊離溶液であってもよく、または担体に結合してもよい。他の製剤、例えば錠剤、坐剤、クリームおよびスプレーは、一般にあまり有用でないが、適切であると見なされる場合には使用してもよい。
【００７９】
好適な媒体は、好適な抗体を担持する標的化されたリポソームを含んでよいが、感染潜伏細胞は主に循環に関連することから、静脈内注射による投与が特に好ましい経路である。
【００８０】
本発明はまた、表１の新規化合物と、独立して、添付の実験セクションで例示されるように、これを作製するための方法を提供する。
【００８１】
本発明は、本発明の新規化合物の医薬的に許容できる製剤をさらに提供する。
【００８２】
本発明は、潜伏感染細胞の選択的除去のための方法をさらに提供し、ここで、細胞は、レンチウイルス、特にＨＩＶ−１による潜伏的感染を受けており、前記処置は、抗レトロウイルス療法と組み合わせて、前記細胞を本発明のＨＤＡＣｉと接触させる工程を含む。
【００８３】
特に驚くべきことは、本発明の好ましいベンズアミドＨＤＡＣｉが、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）によって最大８００％のレベルで増強されることが見出されていることである。ＢＳＯとしてのこの特に驚くべきことは、抗ＨＩＶ−１活性はあまり有しないが、例えばＭＳ２７５と、潜伏ＨＩＶ−１感染を有する細胞を殺滅するその能力を極めて実質的に増強するまで相乗作用を発揮できる。
【００８４】
この増強は、患者の処置において必要とされるＨＤＡＣｉおよびＢＳＯの量を低減するという更なる利点を有する。例えば、ＭＳ２７５およびＢＳＯの双方は、ヒトにおける安全性について既に試験されており、癌治療用に使用されるＭＳ２７５の量は、一般に本発明によって提供される処置に必要な場合より多い。ＭＳ２７５にとって好ましい用量範囲は、週１回で約０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内であるか、または医師によって処方されるものである。ＢＳＯは、０．１〜０．３ｍｇ／ｋｇの好ましい用量でＭＳ２７５と同時投与してもよく、継続投与（好ましくは合計で３〜５）は、１日に１回もしくは２回、好ましくは１２時間ごとに投与してもよい。
【００８５】
したがって、本発明は、レトロウイルスレゼルボアの処置における、好ましくはベンズアミド種のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とブチオニンスルホキシミンとの併用をさらに提供する。
【００８６】
潜伏感染細胞の選択的除去のための上記の方法は、さらに好ましくは、前記細胞を、前記ＨＤＡＣｉと併用されるＢＳＯと、好ましくは本明細書中に記載のタイミングで接触させる工程を含む。
【００８７】
ＢＳＯおよびＨＤＡＣｉは、相乗効果を発揮するがいずれも毒性がなく、二者は、双方がインビボで、特に好ましくは相乗作用量で存在することを条件に、併用してまたは個別投与してもよい。ＢＳＯは、ベンズアミドとともに製剤化してもよく、あるいは、例えば、２つの活性成分を製剤化することに何らかの問題がある場合または一方における安定条件が他方と合致しない場合には、個別投与してもよい。
【００８８】
上記のように、一般に、クラスＩ選択的ＨＤＡＣｉが非選択的化合物より低い毒性を示し、ＨＩＶ−１感染Ｕ１、ＡＣＨ−２、およびＨ９_ＩＩＩＢ細胞の、それらの感染を受けていない対応物に対する選択的殺滅を誘発することが見出されている（Ｐ＜０．０１、傾きに対するｔ検定）。
【００８９】
非感染細胞系及び潜伏感染細胞系におけるＢＳＯ＋ＨＤＡＣｉの併用での毒性を比較した。結果は、ＢＳＯとＨＤＡＣｉを併用すると、インキュベーションの７２時間後、非感染細胞培養物中ではなく潜伏感染細胞内で著明な細胞毒性が認められることを示した（図１４）。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の効果を高めることは別として、本試験の結果は、ＢＳＯなどの酸化促進剤をＨＤＡＣｉと併用する本発明者らの戦略により、潜伏感染細胞の選択的殺滅を誘発することが可能であるという仮説を立てることができる。
【００９０】
この戦略は、念願であった「ショックおよび殺滅」戦略の１つであると考えられる。これらの戦略は、（ウイルスの拡散を遮断するための）ＡＲＴの存在下での薬剤による静止状態からのＨＩＶ−１活性化の誘発（すなわち「ショック」段階）と、その後の、自然的手段（例えば、免疫応答、ウイルス細胞病原性）または人工的手段（例えば、薬剤、モノクローナル抗体など）のいずれかによる感染細胞の除去（すなわち「殺滅」段階）からなる［Hamer DH、２００４年］。当然、本発明者らの戦略は、潜伏感染細胞内でＨＩＶ−１複製を活性化する（すなわち「ショック」段階）ＨＤＡＣｉと、ＨＤＣＡｉ応答を高め、かつ還元グルタチオンの細胞内レベルでのＨＩＶ−１誘発性破壊に起因する細胞傷害を誘発する（すなわち「殺滅」段階）ＢＳＯなどの酸化促進剤との併用に基づく。かかる効果を発揮可能な薬剤併用の探索は、これまでＡＩＤＳ研究における「聖杯（Ｈｏｌｙ Ｇｒａｉｌ）」であった。
【００９１】
金含有化合物が本発明の処置において有用であることを本明細書中で示している。驚くべきことに、ヒ素含有化合物が同様に有用であることも見出している。
【００９２】
したがって、本発明はまた、レトロウイルスレゼルボアの処置におけるヒ素含有化合物の使用を提供する。好ましくは、本化合物は、前記レトロウイルスのレゼルボアの認定されたモデルにおいて、レトロウイルス複製を誘発する能力がある。レトロウイルスはＨＩＶ−１であってもよく、モデルはＵ１およびＡＣＨ−２細胞モデルから選択してもよい。レトロウイルスは、好ましくはＨＩＶウイルスである。好ましくは、ヒ素含有化合物は、酸化ヒ素、例えばＡｓ_４Ｏ_６であるが、三酸化ヒ素（Ａｓ_２Ｏ_３）が特に好ましい。
【００９３】
好ましくは、本使用は、少なくとも１つのさらなる酸化ストレス誘発剤、例えば非鉄金属薬エピジェネティック調節剤、例えば金含有化合物、例えばオーラノフィン；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）；酸化促進剤分子、例えばＢＳＯなどのグルタチオン合成阻害剤；および／あるいは鉄ニトリロアセテートまたは硫酸第一鉄の使用をさらに含んでもよい。ＨＤＡＣｉは、好ましくは、上で規定される任意のもの、特にクラスＩのＨＤＡＣｉに由来するものである。
【００９４】
ＨＤＡＣｉは、式
【化９】

（式中、Ｙは、各々が不飽和または部分不飽和で、かつ、複素環式または単環式であり、２〜８個の連結原子を有する、１つもしくは２つの６員環を含み、該連結原子または環のいずれかはアミノ基およびカルボニル基を含む。）
を有するベンズアミドＨＤＡＣｉ；または式
【化１０】

（式中、Ｒは、直接結合またはエチレンもしくはエテニレン基、Ｘは、＝ＣＨ−もしくは＝Ｎ−、Ｒ^１は、アリールまたはヘテロアリールであり、かつ、単環式もしくは二環式であり、Ｒ^２は、直鎖もしくは分枝鎖アルキルであって、任意選択により単環式もしくは二環式アリールまたはヘテロアリール基によって置換されている。）
を有するヒドロキサム酸ＨＤＡＣｉであってもよい。
【００９５】
また、レトロウイルスレゼルボアを有すると疑われる患者を処置する方法であって、前記患者にヒ素含有化合物を投与する工程を含む方法が提供され、少なくとも１つのさらなる酸化ストレス誘発剤、例えば非鉄金属薬エピジェネティック調節剤、例えば金含有化合物、例えばオーラノフィン；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）；酸化促進剤分子、例えばＢＳＯなどのグルタチオン合成阻害剤；および／あるいは鉄ニトリロアセテートまたは硫酸第一鉄の投与を含んでもよい。低いＣＤ４カウントを示す患者は好ましい。患者は、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）を受けている最中であるか、既に受けていてもよい。
【００９６】
本発明のすべての態様は、すべてのレトロウイルス感染において存在するレトロウイルスの潜伏レゼルボアの処置において用いてもよい。本発明は、レトロウイルスの潜伏レゼルボアを有すると疑われる患者の処置に用いてもよい。かかるレトロウイルスは、本明細書中でＨＩＶ−１と称されることになるが、これは便宜上であって、すべてのかかる参照は、文脈から特に明確でない場合、他のレトロウイルスに対する参照を含むことは理解されるであろう。
【００９７】
処置は、好ましくはレトロウイルスの任意の潜伏レゼルボアを除去するように意図される。しかし、あまり好ましくないが、かかる処置が潜伏レトロウイルスを制御するためにも使用可能であることは理解されるであろう。個体が、例えばレゼルボアからの感染を特に繰り返し受けやすい場合、これは有利であり得る。上記の潜伏感染細胞の選択的殺滅は、特に有利である。
【００９８】
潜伏レゼルボアは、静止状態にあるか、または低速で、例えば通常速度の５％未満で複製するレトロウイルスを有する１つまたは複数の細胞であり、細胞は、ある期間、ウイルスを保護するように作用可能であり、かつ通常の抗レトロウイルス処置の終了後の数週間から数か月間、しばしば生存ビリオンを放出するだけであり、したがって、かかるレゼルボアを介して感染が再発する場合、個体の継続的処置が必要となる。
【００９９】
上述の「通常の」抗レトロウイルス処置は、ＨＩＶ−１感染個体に投与され、一般に、異なるクラスに属する少なくとも３つの異なる薬剤の組み合わせからなり、一般に、ヌクレオシド系／ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）から選択される。融合阻害剤またはケモカイン受容体遮断剤も、処置の一部を形成し得る。最近、さらなる薬剤クラスであるインテグラーゼ阻害剤が抗レトロウイルス薬に加えられている。一般に、抗レトロウイルス薬の併用は進行中のウイルス複製を遮断する能力を示すが、ウイルスを身体から根絶する潜在可能性を有していない。
【０１００】
本明細書中では、活性剤に対する参照がなされる。本明細書で考察されるように、これが酸化ストレス誘導剤を示すことは理解されるであろう。
【０１０１】
レトロウイルスレゼルボアの除去においては、本発明の処置では、例えば、当該技術分野で周知のように、また上記のように、本活性剤が従来の抗レトロウイルス療法と併用される。
【０１０２】
活性剤は、当業者または医師によって決定し得る、任意の好適な医薬的に許容できる媒体で、かつ、任意の好適な経路により、患者に直接投与してもよい。活性剤は、例えば、経口的に、あるいは注射としてまたは経皮パッチによって投与してもよく、遊離溶液であっても、または担体に結合してもよい。他の製剤、例えば錠剤、坐剤、クリームおよびスプレーは、一般にあまり有用でないが、適切であると見なされる場合には使用してもよい。
【０１０３】
好適な投与は、同時送達によるかまたは個別送達によるものであってもよい。好適な媒体は、好適な抗体を担持する標的化されたリポソームを含んでよいが、感染潜伏細胞は主に循環に関連することから静脈内注射による投与も考えられる。しかし、本発明のすべての化合物における好ましい投与経路は経口である。
【０１０４】
本発明は、潜伏感染細胞の選択的除去のための方法をさらに提供し、ここで、細胞は、レンチウイルス、特にＨＩＶ−１による潜伏的感染を受けており、前記処置は、抗レトロウイルス療法と組み合わせて、前記細胞を本発明のＨＤＡＣｉと接触させる工程を含む。
【０１０５】
増強（相乗効果）は、本発明の化合物の多くとＨＤＡＣｉとの間で示されている。これは、患者の処置において必要とされる活性剤の量を減少させるというさらなる利点を有する。
【０１０６】
さらに、これらの活性剤の多くが、ヒト投与を目的として既に認可されているか、または安全性について第１相臨床試験を通過している。
【０１０７】
したがって、本発明は、レトロウイルスレゼルボアの処置における潜伏感染細胞の選択的除去を目的とした本活性剤の使用をさらに提供する。
【０１０８】
本明細書中でのＢＳＯ、オーラノフィン、または三酸化ヒ素に対する参照は、その任意の類似体を含む。
【０１０９】
ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）などのグルタチオン合成阻害剤は、レトロウイルスレゼルボアの処置、すなわち潜伏感染細胞の処置において、好ましくは非感染細胞ではなく感染細胞を標的化し、選択的に殺滅することにより、単独で使用可能であると企図される。
【０１１０】
本明細書中に記載の酸化ストレス誘導剤（非鉄金属薬エピジェネティック調節剤）、グルタチオン合成阻害剤またはＨＤＡＣｉのいずれかの組み合わせを使用してもよい。
【０１１１】
ＨＤＡＣｉは、最も好ましくはクラスＩのＨＤＡＣｉである。Maiら２００９年において記載のものも好ましく、その開示内容は参照により本明細書中に援用される。
【０１１２】
以下の実験セクションは、あくまで例示目的とし、本発明に対して制限するものではない。
【０１１３】
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、それらが本発明の教示内容に抵触しない程度まで、参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【０１１４】
実施例１−オーラノフィン
方法
ＡＣＨ−２およびＵ１細胞内でのＨＩＶ−１の誘発。ＨＩＶ−１潜伏感染ＡＣＨ−２細胞を、標準の培養条件（ＲＰＭＩ培地、１０％胎児ウシ血清／ＦＢＳ、および適切な抗生物質、これらは薬剤耐性汚染細菌の選択を回避するように時々交換した）下、９６ウェルプレート内で化合物とともにインキュベートし、上清中のＨＩＶ−１ ｐ２４コア抗原の内容物を、インキュベーションの２４および７２時間後、ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（Perkin Elmers(Boston,MA)）により、製造業者の使用説明書に従って測定した。各処置において、上清の回収後、細胞生存度を次のように試験した。
【０１１５】
細胞生存度アッセイ。細胞生存度を、メチルテトラゾリウム（ＭＴＴ）法を用いて定量した。９６ウェルＥＬＩＳＡリーダーを使用して、５５０ｎｍの波長で吸光度値を生成し、細胞の不在下で細胞培地を使用してブランク値を差し引いた。試験化合物の存在下での細胞生存度を、非処置対照細胞培養物の細胞生存度の百分率として表した。
【０１１６】
２つの薬剤の併用効果を検出するための試験。相乗作用／拮抗作用／加算性の検出のため、細胞を異なる濃度の薬剤単独または併用される両薬剤のいずれかとともにインキュベートし、インキュベーションの３日目に再び、ウイルス複製をＥＬＩＳＡ試験によって定量した。
【０１１７】
フローサイトメトリー。Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＨＩＶ−１ ＬＴＲ制御発現を測定するため、細胞をプールし、ＮａＮ_３（０．０２％）およびウシ血清アルブミン（２％；ＰＢＳ Ａ／Ａ）を有する氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を１％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、洗浄し、ＰＢＳ Ａ／Ａ中に再懸濁した。次いで、蛍光をフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））によって取得した。蛍光データを４ディケード対数目盛上で収集し、相対蛍光強度を、非形質移入Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用して確立された閾値を超える蛍光細胞の百分率として示した。
【０１１８】
ＮＦ−κＢ核転座の検出。対照Ｊｕｒｋａｔ８．４細胞およびオーラノフィンで様々なインキュベーション時間で処置した細胞に由来する核抽出物を、核抽出キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を製造業者の使用説明書に従って使用することで得た。ＮＦ−κＢ核転座を、ｐ６５サブユニットに対する比色分析転写因子アッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して検出した。結果を、強力なＮＦ−κＢ刺激性サイトカインＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）とともに（ＮＦ−κＢの核転座がピークに達する）１．５時間インキュベートした細胞内で得られるシグナルの百分率として表した。
【０１１９】
データ分析。少なくとも２つの異なる場合に実験を行い、同様の結果を得て、結果を平均として示した。GraphPadソフトウェアを使用して分析を行った。濃度依存性曲線においては、対照値の百分率を異なる薬剤濃度に対してプロットした。必要な場合、適切な変換を適用し、正規性を回復させた。直線または曲線、データ点の最適なフィッティングを最小二乗法によって生成した。有意性における閾値は、線形回帰の場合、Ｐ＝０．０５であり、非線形回帰の場合、Ｒ^２＝０．７であると考えられた。非線形回帰は、Ｒ^２がより大きい場合、線形回帰よりも（後者が有意であった場合についても）好ましかった。薬剤濃度応答間の差異を、傾きに対するｔ検定を用いて分析した。
【０１２０】
相乗作用を、次のように計算される、薬剤併用の効果と同等の濃度で個別投与されるいずれかの薬剤の効果の合計との間のパーセント差異を表す相乗作用値の百分率によって分析した。
ＰＳ＝１００・［Ｅ_{ｄｒｕｇＡ＋ｄｒｕｇＢ}−（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）］／（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）
（式中、ＰＳは相乗作用の百分率であり、Ｅは、ｐ２４生成における増加倍数として表される薬剤の効果である）
【０１２１】
三次元（３Ｄ）ｘ、ｙ、ｚグラフを、（ｘおよびｙ軸における）使用される同等の薬剤濃度に対して相乗作用値の百分率（ｚ軸）をプロットすることによって生成した。Microsoft Excelを使用して３Ｄ表面を生成した。高い凸面は相乗作用を示す。平面は相加効果を示す一方、凹面は拮抗作用を示す。
【０１２２】
結果
Ｕ１およびＡＣＨ−２細胞内でのオーラノフィンによるＨＩＶ−１活性化
ＨＩＶ−１複製の組み込み後段階（post-integrational stage）が誘発可能である細胞系でのオーラノフィンのＨＩＶ−１活性化効果を予め評価するため、ＨＩＶ−１に感染されたＴリンパ球性ＡＣＨ−２および単球性Ｕ１細胞を高濃度の化合物とともにインキュベートし、ＨＩＶ−１複製を、インキュベーションの２４時間後（データは示さず）および７２時間後に測定した（図２はＡＣＨ−２細胞からのデータを示す）。ＨＩＶ−１複製をＮＦ−κＢ（ｐ６５／ｐ５０）活性化によって強力に促進するサイトカインである５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを、陽性対照として使用した。結果は、オーラノフィンがＨＩＶ−１複製を、関節リウマチの処置の間に認められる平均血漿レベルに近似する０．１２５〜０．５μＭの濃度範囲内で、時間および用量依存性に増強することを示した（Ｐ＝０．０２９５、回帰におけるｔ検定；図５Ｂ）［Bennら、１９９１年］。
【０１２３】
注目すべきことに、オーラノフィンのＨＩＶ−１活性化効果は、低毒性が与えられた本発明者らの機関のライブラリー由来のクラスＩのＨＤＡＣＩであるＭＣ２１１３の場合に対して相乗的であった［Rotiliら、２００９年］。これを、オーラノフィンをＵ１細胞にＭＣ２１１３と同時投与する実験において示した（図３）。効果は、インキュベーションの２４時間後すぐに見ることができた。
【０１２４】
オーラノフィン応答における細胞基盤
細胞集団内部のオーラノフィン応答を評価するため、Jordanらによって確立された潜伏感染Ｔリンパ球のＪｕｒｋａｔ細胞クローン８．４を使用した［Jordanら、２００３年］。この細胞クローンは、ＬＴＲの制御下の、ＧＦＰ遺伝子置換ｎｅｆを示す全ＨＩＶ−１ゲノムを有する。Ｕ１細胞と異なり、これらの細胞は、ＨＩＶ−１発現の非有意な基礎レベルを示し、機能的Ｔａｔ／ＴＡＲ軸を有する。８．４細胞において、オーラノフィンは蛍光中に用量依存性変化を誘発し（図４）、それはほとんどの場合、採用した最高濃度で明らかであった。ＨＤＡＣＩ／オーラノフィンの併用での相加効果における細胞基盤についても探求した。本発明者らは、オーラノフィンの添加が、ＨＤＡＣＩ非応答性細胞を応答性細胞集団に動員することを見出した（図５）。
【０１２５】
同様の結果が、ＨＩＶ−１ ＬＴＲの制御下でＧＦＰを発現し、かつ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）などの他のＨＤＡＣｉを使用する他の細胞系において得られた。Ｊｕｒｋａｔ Ａ１細胞は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を有し、それは一部の細胞集団内で静止している。これらの細胞を、臨床的に意義のある濃度のオーラノフィン（０．２５μＭ）または１μＭのＭＣ２１１３あるいはその双方で処置した。データを、非ＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用して確立された閾値を超える蛍光細胞の百分率として示した。このデータは、オーラノフィンおよびクラスに非特異的なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＳＡＨＡ）による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＬＴＲ制御発現の誘発を示した。
【０１２６】
オーラノフィン誘発性ＮＦ−κＢ核転座
酸化ストレスが、ＨＩＶ−１転写および複製にとって重要である［Williamsら、２００７年］、ＮＦ−κＢヘテロダイマーＲｅｌ Ａ（ｐ６５）／ｐ５０の活性化および核局在化を誘発する［Rahmanら、２００４年］ことは周知である。オーラノフィンが、標的細胞内で酸化ストレスを誘発することによってＨＩＶ−１を静止状態から活性化する場合、ＮＦ−κＢ（ｐ６５／ｐ５０）の核転座が現れるはずである。この仮説を試験するため、オーラノフィン（２５０μＭ）で処置したＪｕｒｋａｔ８．４細胞由来の一定分量の核抽出物を、ＮＦ−κＢのｐ６５（ＲｅｌＡ）サブユニットについて、比色分析アッセイを施した。結果は、核内部で時間依存性のＮＦ−κＢの蓄積を示した（図６）。オーラノフィンは、それがＨＩＶ−１を静止状態から活性化する場合と同様の条件下で、ＮＦ−κＢ（ｐ６５／ｐ５０）の活性化を誘発することを結論づける。
【０１２７】
オーラノフィンと他の酸化促進剤戦略との相乗効果
オーラノフィン誘発性の静止状態からのＨＩＶ−１活性化への洞察をいくらか得るため、薬剤の効果をいくつかの十分に特徴づけられた酸化促進剤分子、すなわち鉄ニトリロアセテート（ＦｅＮＴＡ）［Savarinoら、１９９９年］（フェントン反応を通じて酸化ストレスを促進する）、およびブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、グルタチオン合成経路における制限酵素であるγ−グルタミルシステインシンテターゼの不可逆阻害剤［Anderson、１９９８年］の存在下で試験した。結果は、オーラノフィンと同様、ＦｅＮＴＡがＡＣＨ−２細胞内でＨＩＶ−１複製を用量依存性に誘発する（データは示さず）一方、ＢＳＯ単独が最大５００μＭの濃度でＨＩＶ−１誘発効果に対して全く効果を有しない（データは示さず）ことを示した。オーラノフィンは、２つの薬剤のいずれかとの同時投与時、相乗作用の百分率のグラフにおいて高い凸面によって示されるように、相乗的なＨＩＶ−１活性化効果を発揮した（図７および８）。オーラノフィンは鉄誘発性ＨＩＶ−１活性化を増強し、この薬剤の効果はグルタチオンの減少によって促進されることを結論づける。
【０１２８】
参考文献（本明細書中に引用されるすべての参考文献は、本発明に抵触しない程度に本明細書中に援用される）。
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【０１２９】
実施例２−ＨＤＡＣｉ
ＨＩＶ−１に感染されたリンパ球性ＡＣＨ−２および単球様Ｕ１細胞（双方ともＨＩＶ−１複製の低いベースラインレベルを示す）は、ＨＩＶ−１潜伏における十分に確立された細胞系モデルである［Munierら、２００５年］。それらを、標準培養条件下、９６ウェルプレート内で、試験化合物とともにインキュベートし、インキュベーションの７２時間後、ＥＬＩＳＡ試験によってＨＩＶ−１複製を測定した。ＨＩＶ−１誘発に対する化合物の効力を、非処置対照において認められるベースラインレベルに対して、標準濃度１μＭの試験化合物（この濃度は一般にリード化合物の選択のための閾値として用いられる）の存在下で、ＨＩＶ−１複製における増加倍数として評価した。潜伏感染細胞内でＨＩＶ−１複製を誘発可能な数種の化合物が見出され、一般にＡＣＨ−２およびＵ１細胞における結果間で良好な一致があった。
【０１３０】
数種の化合物（クラスＩ選択的または非選択的ＨＤＡＣｉ）は、顕著なＨＩＶ−１刺激活性を示し（表１）、それは感染細胞殺滅（Ｕ１細胞：Ｐ＝０．０３７８；ＡＣＨ−２細胞：Ｐ＝０．００１７；スピアマンのノンパラメトリック検定（図９Ａ、Ｂ））と相関した。クラスＩ選択的化合物は、一般に非選択的化合物より低い毒性を示した（データは示さず）。さらに、ＨＩＶ−１再活性化を促進するいくつかのクラスＩ選択的ＨＤＡＣｉは、ＨＩＶ−１感染細胞の選択的殺滅を誘発した。これは、ＭＣ１８５５を使用するデータによって図示される（Ｐ＜０．０１；傾きにおけるｔ検定；図９Ｃ、Ｄ）。
【０１３１】
構造／活性の関係から、特定の要件が、潜伏からのＨＩＶ−１回避の効率的誘発について出現する。一般に、ＨＤＡＣｉは、一般的なファーマコフォアモデルを示し、触媒トンネルの縁、しばしばＣＡＰを疎水性スペーサー（ＨＳ）に連結する極性連結ユニット（polar connection unit）（ＣＵ）と相互作用可能なキャップ基（ＣＡＰ）を含み、それは分子をトンネル内部に位置づけさせる［Maiら、２００５ｂ］。最終的に、ＨＳは、空洞の底部でＺｎ^２＋と複合化可能なＺｎ^２＋結合基（ＺＢＧ）を末端に有する［Maiら、２００５ｂ］。一般に、ＺＢＧは、ヒドロキサム酸塩、カルボン酸塩、またはベンズアミドからなる。
【０１３２】
ＭＳ２７５は、癌治療のための臨床試験におけるクラスＩ選択的ＨＤＡＣｉである［Nishiokaら、２００８年；Hauschildら、２００８年］。この化合物は、試験化合物の中で潜伏からのＨＩＶ−１回避の最も強力な誘発剤であることが判明し、それはＡＣＨ−２（図１０）およびＵ１細胞（図示せず）においてナノモル範囲内（十分にインビボで実現可能な血漿濃度の範囲内）で活性を示した［Zhaoら、２００７年］。本発明者らのＳＡＲ試験は、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）とともに投与可能なＨＤＡＣｉの化学種を制限することを意図しておらず、ＨＤＡＣｉとＢＳＯとの相乗効果（下記参照）は全ＨＤＡＣｉクラスに拡張可能である。
【０１３３】
酸化ストレスを誘発するＢＳＯについても試験を行った。γグルタミルシステインシンテターゼ［Garaciら、１９９６年］（グルタチオン合成における制限酵素）の阻害剤であるＢＳＯは、細胞抗酸化剤の防御を低下させることにより、酸化ストレスを間接的に促進する［Anderson、１９９８年］。この化合物を、それが酸化環境内で促進されるＮＦ−κＢの活性化にとって好ましい可能性があることが理由で試験した。結果は、ＢＳＯがＡＣＨ−２またはＵ１細胞のいずれかにおいてＨＩＶ−１複製を有意に誘発しないことを示した（データは示さず）。これにもかかわらず、ＢＳＯを試験し、ＨＤＡＣｉの効果を増強し得るか否かを判定した。結果は、図１１および１２に示されるように、ＢＳＯが、２つのベンズアミドＨＤＡＣｉ、すなわちＭＳ２７５およびＭＣ２２１１のＨＩＶ−１促進効果を顕著に増強することを示した。ＡＣＨ−２細胞内での相乗作用の百分率グラフの鋭い凸型３Ｄ表面は、薬剤併用の相乗効果を示す。相乗効果を示すＢＳＯ濃度は、治療的に得られる［Lacretaら、１９９４年］。同様な効果がＵ１細胞において得られた（データは示さず）。
【０１３４】
クラスＩのＨＤＡＣ阻害がそれ自体でＨＩＶ−１再活性化にとって十分であるという実験結果は、特に有利である。
【０１３５】
方法
化学。融点をＢｕｃｈｉ５３０融点装置で測定し、校正していない。赤外線（ＩＲ）スペクトル（ＫＢｒ）をPerkin-Elmer Spectrum One装置で記録した。４００ＭＨｚでの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルをBruker AC 400分光計で記録し、内部参照のテトラメチルシラン（Ｍｅ_４Ｓｉ）に対するδ（ｐｐｍ）単位での化学シフトを報告する。すべての化合物を、ＴＬＣおよび^１Ｈ ＮＭＲによって定期的に点検した。ＴＬＣを、ＵＶ光によって可視化されたスポットを有するアルミニウム裏打ち（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｂａｃｋｅｄ）シリカゲルプレート（Merck DC、Alufolien Kieselgel 60 F₂₅₄）で行った。すべての溶媒は試薬グレードであり、必要な場合、標準的方法によって精製し、乾燥させた。反応および抽出後の溶液の濃縮は、約２０トールの減圧下で作動するロータリーエバポレーターの使用を含んだ。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。分析結果は、理論値の±０．４０％以内である。生物学的アッセイ用のＳＡＨＡ試料を、標準的方法に従って同様に調製した。すべての化学物質は、Aldrich Chimica(Milan(Italy))またはLancaster Synthesis GmbH(Milan(Italy))から購入し、それらは最高純度であった［Maiら、２００６年］。
【０１３６】
４−（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−６−置換−２−ピリミジニルチオ）ケイ皮酸メチルのエチルエステルの合成における一般的手順。例：４−（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−６−ベンジル−２−ピリミジニルチオ）ケイ皮酸メチルのエチルエステル。３ｍｌの無水ＤＭＦ中、６−ベンジル−４−ヒドロキシ−２−メルカプトピリミジン（６．８７ｍｍｏｌ、１．５ｇ）、粗エチル４−ブロモケイ皮酸メチル（７．５６ｍｍｏｌ、２．２ｇ）、および無水炭酸カリウム（７．５６ｍｍｏｌ、１．０ｇ）の混合物を、室温で１時間撹拌した。冷水（１００ｍＬ）での処理後、水相を酢酸エチル（３４０ｍＬ）で抽出した。有機相を塩水（３４０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、乾燥するまで蒸発させ、所望される粗化合物を得て、それをシリカゲルカラム上のクロマトグラフィーによって精製し、酢酸エチル／ヘキサン（１：１）混合物で溶出し、所望される生成物を白色固体（１．２ｇ）として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．３３（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_３）、３．８３（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ_２）、４．２６（ｑ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_３）、４．３８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２Ｓ）、５．９８（ｓ，１Ｈ，Ｃ_５−Ｈ）、６．４０（ｄ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨＣＯ）、７．３３（ｍ，９Ｈ，２つのベンゼン環）、７．６１（ｄ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨＣＯ）、１３．２０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。Ａｎａｌ．Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｓ［Maiら、２００６年］。
【０１３７】
６−（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−６−（非）置換−２−ピリミジニルチオ）−ヘキサン酸および４−（３，４−ジヒドロ−６−置換−４−オキソピリミジン−２−イルチオ）ケイ皮酸メチルの合成における一般的手順。例：６−（３，４−ジヒドロ−４−オキソピリミジン−２−イルチオ）ヘキサン酸。適切なエチルエステル（１．１ｍｍｏｌ、０．３ｇ）、２Ｎ ＫＯＨ（８．８ｍｍｏｌ、０．４９ｇ）、およびＥｔＯＨ（５ｍＬ）の混合物を、室温で１８時間撹拌した。溶液を、水（５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（２２０ｍＬ）で抽出した。ＨＣｌ（２Ｎ）をｐＨ５になるまで水層に添加し、沈殿物を濾過し、再結晶化し、表題化合物（０．２３ｇ）を純固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１．３２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ）、１．４９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、１．６１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ）、１．９３（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＯ）、３．０６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２Ｓ）、６．０７（ｓ，１Ｈ，Ｃ_５−Ｈ）、７．８３（ｓ，１Ｈ，Ｃ_５−Ｈ）、１２．２（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）。Ａｎａｌ．Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｓ［Maiら、２００６年］。
【０１３８】
Ｎ−ヒドロキシ−６−（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−６−（非）置換−２−ピリミジニルチオ）ヘキサンアミドおよび／Ｎ−ヒドロキシ−４−（３，４−ジヒドロ−６−置換−４−オキソピリミジン−２−イルチオ）−メチルシンナミルアミドの合成における一般的手順。例：Ｎ−ヒドロキシ−６−（３，４−ジヒドロ−４−オキソピリミジン−２−イルチオ）ヘキサンアミド。乾燥テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中、適切なカルボキシル酸（０．９ｍｍｏｌ、０．２２ｇ）の０℃に冷却した溶液に対して、クロロギ酸エチル（２．２ｍｍｏｌ、０．２１ｍＬ）およびトリエチルアミン（２．３ｍｍｏｌ、０．３３ｍＬ）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。固体を濾過分離し、濾過物に対してＯ−（２−メトキシ−２−プロピル）ヒドロキシルアミン（５．４ｍｍｏｌ、０．４ｍＬ）を添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、次いでそれを減圧下で蒸発させ、残留物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）で希釈した。Amberlyst15イオン交換樹脂（０．１８ｇ）をＯ−保護ヒドロキサム酸の溶液に添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、反応物を濾過し、濾過物を真空中で濃縮し、最終の粗生成物を得て、それを結晶化によって精製した。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ）、１．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、１．６０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ）、１．９０（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＯ）、３．０２（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２Ｓ）、６．１０（ｓ，１Ｈ，Ｃ_５−Ｈ）、７．８５（ｓ，１Ｈ，Ｃ_６−Ｈ）、８．６６（ｓ，１Ｈ，ＮＨＯＨ）、１０．３３（ｓ，１Ｈ，ＮＨＯＨ）、１２．５（ｓ，１Ｈ，ウラシルＮＨ）。Ａｎａｌ．Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｓ［Maiら、２００６年］。
【０１３９】
３−（４−アシルアミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−２−プロペンアミドの合成における一般的手順。例：３−［４−（２，３−ジフェニルプロピオニルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−２−プロペンアミド（ＭＣ１８９５）。
クロロギ酸エチル（１．２６ｍｍｏｌ、０．１２ｍＬ）およびトリエチルアミン（１．３７ｍｍｏｌ、０．１９ｍＬ）を、乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中、３−［４−（２，３−ジフェニルプロピオニルアミノ）フェニル］−２−プロペン酸（１．０５ｍｍｏｌ、０．３９ｇ）の冷却（０℃）溶液に添加し、混合物を１０分間撹拌した。固体を濾過分離し、Ｏ−（２−メトキシ−２−プロピル）ヒドロキシルアミン（３．１５ｍｍｏｌ、０．２３ｍＬ）を濾過物に添加した。溶液を０℃で１５分間撹拌し、次いで減圧下で蒸発させ、残留物をメタノール（１０ｍＬ）で希釈した。Amberlyst（登録商標）15イオン交換樹脂（１０５ｍｇ）を、Ｏ−保護ヒドロキサム酸の溶液に添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、反応物を濾過し、濾過物を真空中で濃縮し、粗ＭＣ１８９５を得て、それを結晶化によって精製した。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ３．０５（ｍ，１Ｈ，ＰｈＣＨ_２）、δ３．６０（ｍ，１Ｈ，ＰｈＣＨ_２）、δ３．７５（ｍ，１Ｈ，ＰｈＣＨＣＯ）、δ６．３６（ｄ，１Ｈ，ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＯＯＥｔ）、δ７．１５〜７．７０（ｍ，１５Ｈ，ベンゼンプロトンおよびＰｈＣＨ＝ＣＨＣＯＯＥｔ）、δ９．００（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、δ１０．２３（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨＰｈ）、δ１０．８５（ｓ，１Ｈ，ＮＨＯＨ）。Ａｎａｌ．Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ。
【０１４０】
インビトロでのトウモロコシＨＤ２、ＨＤ１−Ｂ、およびＨＤ１−Ａ酵素阻害。放射性標識したニワトリコアヒストンを、確立された手順に従い、酵素基質として使用した［Maiら、２００６年において参照］。酵素は基質からトリチウム化酢酸を遊離させ、それをシンチレーション計数によって定量した。ＩＣ_５０値は３通りの測定の結果である。（３０℃での）トウモロコシ酵素の５０μＬの試料を、１０μＬの［^３Ｈ］酢酸塩で予備標識したニワトリ全網状赤血球ヒストン（２ｍｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした（３０分）。反応を、３６μＬの１Ｍ ＨＣｌ／０．４Ｍ酢酸塩および８００μＬの酢酸エチルの添加によって停止させた。遠心分離（１００００ｇ、５分）後、６００μＬの一定分量の上層を、３ｍＬの液体シンチレーションカクテル中の放射能について計数した。化合物を４０μＭの初期濃度で試験し、活性物質をさらに希釈した。ＴＳＡおよびＳＡＨＡを参照化合物として使用し、ブランク溶媒を陰性対照として使用した［Maiら、２００６年］。
【０１４１】
マウスＨＤＡＣ１酵素アッセイ。阻害アッセイにおいては、マウス肝臓由来の部分精製ＨＤＡＣ１（アニオン交換クロマトグラフィー）を酵素源として使用した。ＨＤＡＣ活性を、基質として［^３Ｈ］酢酸塩で予め標識したニワトリ網状赤血球ヒストンを使用して測定した。マウスＨＤＡＣ１（５０μＬ）を、氷上で異なる濃度の化合物とともに１５分間インキュベートし、［^３Ｈ］酢酸塩で予め標識したニワトリ全網状赤血球ヒストン（２ｍｇ／ｍＬ）の１０μＬを添加し、４１μＭの濃度を得た。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。反応を、５０μＬの１Ｍ ＨＣｌ／０．４Ｍアセチル酢酸塩および１ｍＬの酢酸エチルの添加によって停止させた。１００００ｇで５分間遠心分離後、上層の６００μＬの一定分量を、３ｍＬの液体シンチレーションカクテル中の放射能について計数した［Maiら、２００６年］。
【０１４２】
細胞アッセイ。細胞系および培養物。Ｕ９３７細胞系を、１０％胎児牛血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２５０ｎｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２ｍＭグルタミンを有するＲＰＭＩ中で培養した。Ｕ９３７細胞を、２０００００個の細胞／ｍＬの一定濃度の培地で保持した。ヒト乳癌ＺＲ−７５．１細胞を、１０％胎児牛血清および抗生物質（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２５０ｎｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ）を補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。
【０１４３】
リガンドおよび材料。ＳＡＨＡを、ＤＭＳＯ中に溶解し、１もしくは５μＭで使用した。ＭＳ−２７５（Schering AGからの贈呈）を、エタノール中に溶解し、５μＭで使用した。ＵＢＨＡ化合物１ｄおよび１ｊを、ＤＭＳＯ中に溶解し、１もしくは５μＭで使用した。
【０１４４】
細胞に基づくヒトＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ４アッセイ。細胞（ＨＤＡＣ１アッセイ用のＵ９３７細胞およびＨＤＡＣ４アッセイ用のＺＲ７５．１細胞）を、氷中、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma）、１ｍＭ ＤＴＴ、および０．２ｍＭ ＰＭＳＦを有するＩＰ緩衝液（ｐＨ７．０での５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５％ ＮＰ−４０、１０％グリセリン、１．５ｍＭ ＭｇＣＬ_２、１ｍＭ ＮａＭＯ_４、および０．５ｍＭ ＮａＦ）中に１０分間で溶解し、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次いで、１０００μｇの抽出物を、ＩＰ緩衝液で１ｍＬまで希釈し、ロッキングテーブルで２０μＬのＡ／Ｇ＋アガロース（Santa Cruz）とともに４℃で３０分間〜１時間インキュベートすることによって予備洗浄した。上清を新しい管に移し、抗体（約３〜４μｇ）を加え、ＩＰをロッキングテーブル上で、４℃で一晩展開させておいた。使用した抗体は、ＨＤＡＣ１（Abcam）およびＨＤＡＣ４（Sigma）であった。陰性対照として、同量のタンパク質抽出物を、対応する精製ＩｇＧ（Santa Cruz）で免疫沈降させた。翌日、２０μＬのＡ／Ｇおよびアガロース（Santa Cruz）を各ＩＰに添加し、インキュベーションを２時間継続した。ビーズを、短時間の遠心分離によって回収し、冷却ＩＰ緩衝液で数回洗浄した。次いで、試料をＰＢＳで２回洗浄し、２０μＬの無菌ＰＢＳで再懸濁した。ＨＤＡＣアッセイを、供給業者の使用説明書（Upstate）に従って実施した。つまり、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ１または精製ＩｇＧで免疫沈降させた試料を、別々にプールし、すべての試料を均質化した。次いで、１０μＬのＩＰを、ストレプトアビジンアガロースビーズと結合させた予め標識した^３Ｈ−ヒストンＨ４ペプチド（Upstate）とともにインキュベートした。具体的には、１２００００ＣＰＭのＨ４−^３Ｈ−アセチル−ペプチドを各管において使用し、２００μＬの最終容量の場合、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下または不在下で、１０μＬの試料を有する１つのＨＤＡＣ緩衝液中でインキュベートした。それらの試料を、低速で回転させて、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、５０μＬの急冷溶液を添加し、短時間の遠心分離後、１００μＬの試料をシンチレーション計数管で２通りに計数した。実験は４通りに実施している［Maiら、２００６年］。
【０１４５】
化合物の保存。化合物を乾燥粉末として保存し、使用時にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再懸濁した。最終細胞培地中、２／１０００未満のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）で適切な薬剤濃度を得るため、ＤＭＳＯ溶液中の初期濃度を調節した。
【０１４６】
ＨＩＶ−１再活性化スクリーニング試験。潜伏ＨＩＶ−１感染ＡＣＨ−２細胞を、標準培養条件下（ＲＰＭＩ培地、１０％胎児ウシ血清／ＦＢＳ、および適切な抗生物質、薬剤耐性汚染菌の選択を回避するために時々交換）、９６ウェルプレート内で化合物とともにインキュベートし、インキュベーションの７２時間後、上清中のＨＩＶ−１ ｐ２４コア抗原の内容物を、ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（Perkin Elmer製）により、製造業者の使用説明書に従って測定した。潜伏からのＨＩＶ−１回避の誘発に対する化合物の効力を、非処置対照において認められるベースラインレベルに対する、１μＭの標準濃度の存在下でのＨＩＶ−１複製における増加倍数（％）として評価した。１μＭの濃度を、それがリード化合物の選択のための閾値であると一般に考えられることから選択した。上清の回収後、各処置における細胞生存度を以下のように試験した。
【０１４７】
細胞生存度アッセイ。細胞生存度を、高度に標準化されたメチルテトラゾリウム（ＭＴＴ）法（Savarino A, Calosso L, Piragino A, Martini C, Gennero L, Pescarmona GP, Pugliese A. Modulation of surface transferrin receptors in lymphoid cells de novo infected with human immunodeficiency virus type-1.Cell Biochem Funct. 1999 Mar;17(1):47-55に詳述）を用いて定量した。９６ウェルＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４５０ｎｍの波長での吸光度値を生成し、細胞の不在下で細胞培地を使用してブランク値を差し引いた。試験化合物の存在下での細胞生存度を、非処置対照細胞培養物の細胞生存度の百分率として表した。選択的殺滅の試験のため、非感染Ｈ９、およびＵ９３７、およびＨＩＶ−１感染Ｈ９_ＩＩＩＢ、ＡＣＨ−２、およびＵ１細胞を、試験化合物とともに７日間インキュベートし、細胞生存度を上記のように測定した。
【０１４８】
濃度−応答曲線。最適な活性を有する化合物について、細胞を減少濃度の化合物（０．００１〜１μＭ）とともにインキュベートすることにより、濃度−応答曲線を生成した。
【０１４９】
併用薬剤効果の検出についての試験。相乗／拮抗作用の検出については、細胞を、ＢＳＯ単独、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤単独、またはその双方の異なる組み合わせとともにインキュベートし、インキュベーションの３日後、再び、ウイルス複製をＥＬＩＳＡ試験によって定量した。
【０１５０】
データ分析。少なくとも２つの異なる場合に実験を行い、同様の結果を得て、結果を平均として示した。GraphPadソフトウェアを使用して分析を行った。細胞死／ＨＩＶ−１再活性化の間の相関を、各化合物についてＨＩＶ−１複製における増加倍数に対する細胞生存度の阻害の百分率をプロットすることによって評価した。相関の有意性を、Ｐ＝０．０５の有意性閾値を用いるスピアマンの相関係数を用いて評価した。濃度依存性曲線においては、増加倍数値を異なる濃度に対してプロットした。必要な場合、適切な変換を適用し、正規性を回復した。直線または曲線、データ点の最適なフィッティングを最小二乗法によって生成した。有意性の閾値は、線形回帰の場合、Ｐ＝０．０５であり、非線形回帰の場合、Ｒ^２＝０．７であると考えられた。相乗作用を、次のように計算される、薬剤併用の効果と同等の濃度で個別投与されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および酸化促進剤の効果の合計との間のパーセント差異を表す、相乗作用値の百分率によって分析した。
ＰＳ＝１００・［Ｅ_{ｄｒｕｇＡ＋ｄｒｕｇＢ}−（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）］／（Ｅ_{ｄｒｕｇＡ}＋Ｅ_{ｄｒｕｇＢ}）
（式中、ＰＳは相乗作用の百分率でありかつＥは薬剤濃度の効果であり、ｐ２４生成における増加倍数として表される）
【０１５１】
三次元（３Ｄ）ｘ、ｙ、ｚグラフを、（ｘおよびｙ軸における）使用される同等の薬剤濃度に対して相乗作用値の百分率（ｚ軸）をプロットすることによって生成した。Microsoft Excelを使用して３Ｄ表面を生成した。高い凸面は相乗作用を示す。平面は相加効果を示す一方、凹面は拮抗作用を示す。
【０１５２】
【表１】

【０１５３】
【表２】

【０１５４】
【表３】

【０１５５】
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【０１５６】
1. 実施例３−ＨＤＡＣＩ＋ＢＳＯに対するさらなる研究
ＨＤＡＣｉとＢＳＯとの間の相乗作用の細胞基盤を検討するため、ＨＩＶ−１静止のためのＪｕｒｋａｔモデルを使用した。これらの結果は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲの制御下で組み込まれたＧＦＰ／Ｔａｔコンストラクトを有するＡ１ Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンから得られ、それは大部分の細胞内で静止することから、フローサイトメトリーにより、単一の細胞レベルでのＬＴＲプロモーターの活性化を試験することを可能にする、［Jordan Aら、２００３年］。本発明者らの結果は、ＢＳＯがＨＤＡＣＩ感受性細胞を応答細胞集団に動員することを示した（図１３）。ＢＳＯ単独は、ＡＣＨ−２およびＵ１細胞内でのｐ２４の測定値から得られた結果と異なり、少数の細胞内でＬＴＲ活性化を誘発した。
【０１５７】
ＨＩＶ−１を複製する細胞培養物は、還元グルタチオンのレベルの低下を示す［Simon Gら、１９９４年］。非感染細胞系および潜伏感染細胞系において、ＢＳＯ＋ＨＤＡＣｉ併用の毒性を比較した。結果は、ＢＳＯとＨＤＡＣｉの併用により、インキュベーションの７２時間後、非感染細胞培養物でなく潜伏感染細胞培養物中で著明な細胞毒性が認められることを示した（図１４）。
【０１５８】
これは、非感染Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞クローン（６．３および８．４）（ＬＴＲの制御下で静止ＨＩＶ−１ゲノム（ＧＦＰ遺伝子を有する）を有する）における実験によって支持される［Jordan A、２００３年、下記］。６．３細胞クローンが、ＭＳ−２７５／ＢＳＯの併用に対して、その非感染対応物より容易に死滅することを見出した（図１４）。８．４クローンの場合、同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０１５９】
要するに、ＢＳＯの効果は、ＨＤＡＣｉに基づくＨＩＶ−１再活性化処置に対して応答する細胞の割合を高めることを可能にする。一般に、酸化ストレスは、増強されたＨＡＴ活性およびＤＮＡ巻き戻しへのＨＡＴ／ＨＤＡＣ活性のバランスを崩すことから、いくつかの転写因子の結合を促進する［Rahman Iら、２００４年］。これは、わずかな細胞集団だけが全体的シグナルに応答して活性化された活性化後の多様な表現が、Jordanら、２００４年［下記］によって示された（彼らはこの現象を異なる局所クロマチン環境に起因すると考えた）ことから、重要な臨床用途を示唆している。
【０１６０】
本試験の結果は、ＢＳＯなどの酸化促進剤をＨＤＡＣｉと併用するという本発明者らの戦略が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の効果を高めること以外に、潜伏感染細胞の選択的殺滅を誘発可能であるという仮説を立てることを可能にする。この戦略は、念願の「ショックおよび殺滅」戦略の１つであると考えることができる。これらの戦略は、（ウイルス拡散を遮断するための）ＡＲＴの存在下での薬剤による静止状態からのＨＩＶ−１活性化の誘発（すなわち「ショック」段階）と、その後の自然的手段（例えば、免疫応答、ウイルス細胞病原性）または人工的手段（例えば、薬剤、モノクローナル抗体など）のいずれかによる感染細胞の除去（すなわち「殺滅」段階）からなる［Hamer DH、２００４年］。当然、本発明者らの戦略は、潜伏感染細胞内でＨＩＶ−１複製を活性化する（すなわち「ショック」段階）ＨＤＡＣｉと、還元グルタチオンの細胞内レベルでのＨＩＶ−１誘発性破壊に起因する細胞傷害を拡大する（すなわち「殺滅」段階）ＢＳＯなどの酸化促進剤との併用に基づく。かかる効果を発揮可能な薬剤併用の探索は、これまでＡＩＤＳ研究における「聖杯」であった。
【０１６１】
実施例３における参考文献
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Hamer DH: Can HIV be Cured? Mechanisms of HIV persistence and strategies to combat it. Curr HIV Res 2004, 2:99-111.
【０１６２】
実施例４−三酸化ヒ素
金塩およびヒ素は、多数の生物学的効果を共有し、今や、いくつかの医療用途を有する潜在的に有望なエピジェネティック金属薬として新たな展望を提示している。他の病状におけるそれらの治療用途は、当然ながら古くからの伝統を有する。ヒ素は金属および非金属特性の双方を示す元素であると考えられるが、それは多くの局面において金属として振る舞う。その最も一般的な元素形態（灰色ヒ素）において、それは金属様の性質を有し、電気を通す。金塩と同様、ヒ素は、紀元前５世紀以来、治療で用いられている。ヒポクラテスは、潰瘍に対する治療薬として鶏冠石（Ａｓ_２Ｓ_２）および石黄（Ａｓ_２Ｓ_２）を使用した。伝統的中国医学では、ヒ素と金を併用することで、様々な症状が処置された。テーベのOlympiodorus（紀元５世紀）は、硫化ヒ素を焙焼し、白色ヒ素（Ａｓ_２Ｏ₃であるが、Ａｓ₄Ｏ₃としても見出され得る）を得た。金塩およびヒ素の双方は、後に、数ある用途の中でも、抗リウマチ、抗梅毒、および抗腫瘍における用途があることが見出された［Eisler、２００３年、Giordano、１８４４年、ChristisonおよびGriffith、１８４８年、CutlerおよびBradford、１８７８年、Waxmanら、２００１年、Parkら、２００８年］。ヒ素は、高用量で使用される場合には、毒薬としても知られている。
【０１６３】
三酸化ヒ素および金塩の使用は、前世紀には徐々に少なくなり、三酸化ヒ素の慢性前骨髄球性白血病への使用および金塩の関節リウマチへの使用が制限された。しかし、この１０年にわたり、これらのタイプの薬剤への関心は、それらのエピジェネティック効果、すなわちＤＮＡ構造の修飾を塩基の配列を改変することなく誘発する能力の発見のおかげで再燃している。巻き込み／巻き戻しなどのＤＮＡの構造的修飾は遺伝子発現を調節する。さらなる研究によると、三酸化ヒ素および金塩が、細胞レベルでのそれらの効果において重要な類似性を共有し、それは、両タイプの薬剤における、それらの歴史を通じて見出されてきた類似の治療用途を明らかにし得ることが示された。三酸化ヒ素と金塩の双方は、反応性酸素種（ＲＯＳ）を誘導する。
【０１６４】
酸化ストレスは、増強されるＨＡＴ活性およびＤＮＡ巻き戻しへのＨＡＴ／ＨＤＡＣ活性のバランスを崩すことから、いくつかの転写因子の結合を促進することが知られている［Rahmanら、２００４年］。興味深いことに、三酸化ヒ素および金含有化合物の双方は、チオレドキシンレダクターゼを阻害し、かつスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）模倣体として作用する。したがって、金化合物およびヒ素は、これらの効果およびＨＡＴ活性の誘発などの共通のエピジェネティック効果を踏まえ、独特な薬剤クラスとして検討され始めている［Talbotら、２００８年］。
【０１６５】
ヒ素および金含有化合物を含むこの薬剤クラスは、以降「エピジェネティック金属薬」（すなわちエピジェネティック効果を有する金属薬）と称されることになる。ＨＩＶ−１を潜伏から活性化することで知られる他の金属薬、例えば鉄含有化合物およびシスプラチン［Savarinoら、１９９８年；Spandidosら、１９９０年］は、金化合物およびヒ素の向分化（pro-differentiating）効果を示さない。
【０１６６】
さらに、金およびヒ素イオンは、チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の活性部位を、これらのタンパク質の還元活性にとって重要なセレノシステイン残基と直接複合化することによって遮断する能力を共有する。オーラノフィンのこの活性は、三酸化ヒ素と共有される［Liuら、２００７年］。金（Ｉ）誘導体および三酸化ヒ素は、チオレドキシンレダクターゼの極めて優れた阻害剤のように見られ、ナノモル範囲内のＩＣ_５０値を示す（ＩＣ_５０＜３００ｎＭ）一方、金属イオンおよび金属複合体はマイクロモル範囲内で活性がある（１９〜８０μＭ）［Bragadinら、２００４年；Luら、２００７年］。三酸化ヒ素およびオーラノフィンなどの金（Ｉ）誘導体によって共有される別の活性は、ＴｒｘＲの合成を抑制する独特の能力である［Talbotら、２００８年］。
【０１６７】
実施例１において、金含有化合物のオーラノフィンが、関節リウマチを有するヒトの血漿中に見出される場合を再現する濃度で、インビトロで潜伏からのＨＩＶ−１回避を誘発可能であることを示している。本発明者らの理論が正しい場合、潜伏からのＨＩＶ−１回避に対する金含有化合物オーラノフィンの効果はまた、ヒ素によって発揮されるものである。
【０１６８】
三酸化ヒ素は、文書で十分に立証されたエピジェネティックの潜在性、すなわち十分に記載された毒性特性を有し、またその臨床使用は、特定用量で比較的安全である。
【０１６９】
最初に、ＨＩＶ−１ ＬＴＲの制御下で組み込まれた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード遺伝子を有するＪｕｒｋａｔ細胞クローンにおける三酸化ヒ素に対する応答性を試験した［Jordanら、２００３年］。
【０１７０】
実施例１において詳述された技術に従って実験を行った。これらのＪｕｒｋａｔ細胞クローンでは、ＨＤＡＣＩによるＧＦＰの誘導は、わずかな細胞においてのみ明らかであり、三酸化ヒ素に応答して濃度依存性に増大した（図１５）。
【０１７１】
全ＨＩＶ−１ゲノムを有する細胞集団内部での三酸化ヒ素に対する応答を評価するため、Jordanらによって確立された、潜伏感染Ｔリンパ球Ｊｕｒｋａｔ細胞クローン６．３および８．４を使用した［Jordanら、２００３年］。この細胞クローンは、ＬＴＲの制御下の、ＧＦＰ遺伝子置換ｎｅｆを示す全ＨＩＶ−１ゲノムを有する。これらの細胞は、Ｕ１細胞に対して、非有意な基礎レベルのＨＩＶ−１発現を示し、機能的なＴａｔ／ＴＡＲ軸を有する。８．４細胞においては、三酸化ヒ素は、蛍光における用量依存性変化を誘発し（データは示さず）、それはほとんどの場合、採用した最高濃度で明らかであった。
【０１７２】
三酸化ヒ素の効果が、ＨＩＶ−１潜伏のための細胞系モデルにおけるオーラノフィンの効果を再現することを結論づける。オーラノフィンと同様、シスプラチンは、ナノモル範囲内の濃度で潜伏ＨＩＶ−１を活性化する能力があった。オーラノフィンおよび三酸化ヒ素は、濃度のナノモル範囲内ではなくマイクロモル内で静止ＨＩＶ−１を活性化する、シスプラチンなどの他の金属薬とそれらの効果を共有しない［Spandidosら、１９９０年］。したがって、本発明者らの結果は、金（Ｉ）誘導体および三酸化ヒ素が、エピジェネティック調節剤の独特の薬剤クラスに属するものとして見なされるべきであるという見解を支持する。三酸化ヒ素であれば、オーラノフィンと同様、ＨＩＶ−１をレゼルボアから除去するための「追い出し（smoking out）」戦略において用途が見出され得る。
【０１７３】
実施例２および３において、「ショックおよび殺滅」効果が、ＨＩＶ−１潜伏のための細胞系モデルにおいて、クラスＩヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣＩ）をブチオニンスルホキシミン（γ−グルタミルシステインシンテターゼ、すなわちグルタチオン合成用の制限酵素の阻害剤）と併用することによって得られることを示している［Savarinoら、２００９年］。
【０１７４】
グルタチオンは、疑いなく１つの重要な抗酸化防御であるが、ＢＳＯ単独は、潜伏からのＨＩＶ−１回避をわずかしか誘発することができなかった。これは、ＢＳＯは本質的に酸化ストレスを誘発しないが、その代わり、ＨＤＡＣＩによって誘発される酸化ストレスに対抗する細胞集団の能力を損なうという事実によって説明可能である［Palamaraら、未公開データ］。これに関連して、オーラノフィンおよび三酸化ヒ素は、おそらくそれらのスーパーオキシドジスムターゼ模倣効果を通じて本質的に酸化ストレスを誘発する能力があり、かつ、ＴｒｘＲを阻害することによって抗酸化防御に対抗する能力がある。これらの効果であれば、ＨＩＶ−１潜伏に対抗するための手段としての酸化ストレスの利用における先進の工程を示し得る。
【０１７５】
最近、Chomontらは、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）下でありかつ低いＣＤ４カウントを示す個体におけるＨＩＶ−１潜伏における主要なレゼルボアとして、移行性メモリーＴ−ＣＤ４^＋細胞（Ｔ_ＴＭｓ）を同定した［Chomontら、２００９年］。Ｔ_ＴＭｓは、セントラルメモリーＴ−ＣＤ４^＋細胞（Ｔ_ＣＭｓ）の前駆体であり、それはより安定なＨＩＶ−１レゼルボアを示し、長年にわたって生存する。Ｔ_ＴＭｓは、Ｔ_ＣＭｓに対し、あまり分化していない表現型を示し、幹細胞増殖を誘発するサイトカインであるＩＬ−７に応答して増殖する。低いＣＤ４カウントを有するＡＲＴで処置された個体からのＨＩＶ−１根絶を得るため、Chomontらは、ＡＲＴと併用して長期持続型Ｔ_ＣＭレゼルボアの生成を回避するため、Ｔ細胞増殖を阻害しかつ幹細胞性を低下させることが可能な「インテリジェント標的化（intelligent-targeted）化学療法」での処置を提唱している。しかし、筆者らは、好適な薬剤候補を同定することができなかった。しかし、（ウイルスの細胞病原性または免疫系によって感染細胞の除去を可能にする）三酸化ヒ素のＨＩＶ−１誘発効果であれば、リンパ球に対するその周知の抗芽球効果とその著明な向分化活性に加えて、この薬剤がＨＩＶ−１根絶の臨床試験における理想的な候補となる。
【０１７６】
実施例４における参考文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスレゼルボアの処置における酸化ストレス誘発剤の使用であって、前記酸化ストレス誘発剤は非鉄金属薬であり、前記金属薬はエピジェネティック調節剤である、使用。
【請求項２】
前記エピジェネティック調節剤は、金含有化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記金含有化合物は、オーラノフィンであり、任意選択によりスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）と併用される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記エピジェネティック調節剤は、ヒ素含有化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ヒ素含有化合物は、酸化ヒ素、例えば三酸化ヒ素（Ａｓ_２Ｏ_３）である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
レトロウイルスレゼルボアの処置における酸化ストレス誘発剤の使用であって、前記酸化ストレス誘発剤は、グルタチオン合成阻害剤、例えばブチオニンスルホキシミンと併用されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）である、使用。
【請求項７】
前記化合物は、前記レトロウイルスのレゼルボアの認定されたモデルにおいてレトロウイルス複製を誘発する能力がある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記レトロウイルスは、ＨＩＶ−１であり、前記モデルは、Ｕ１およびＡＣＨ−２細胞モデルから選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記レトロウイルスは、ＨＩＶウイルスである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、ＢＳＯおよび／または鉄ニトリロアセテートまたは硫酸第一鉄のうちの少なくとも１つの使用をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＨＤＡＣｉは、
ａ）式
【化１】

（式中、Ｙは、各々が不飽和または部分不飽和で、かつ、複素環式または単環式であり、２〜８個の連結原子を有する、１つまたは２つの６員環を含み、前記連結原子または環のいずれかは、アミノ基およびカルボニル基を含む。）
を有するベンズアミドＨＤＡＣ阻害剤、または
ｂ）式
【化２】

（式中、Ｒは、直接結合またはエチレンもしくはエテニレン基、Ｘは＝ＣＨ−もしくは＝Ｎ−であり、Ｒ^１は、アリールまたはヘテロアリールであり、かつ単環式もしくは二環式であり、Ｒ^２は直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、任意選択により単環式もしくは二環式アリールまたはヘテロアリール基によって置換されている。）
を有するヒドロキサム酸ＨＤＡＣｉ
から選択される、請求項５または請求項５に従属する請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ベンズアミドは、添付の表１中のＭＣ２２１１およびＭＳ２７５として同定された化合物の１つに近似の類似体である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記阻害剤は、式
【化３】

を有する化合物である、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記処置は、抗レトロウイルス療法をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用
【請求項１５】
前記阻害剤は、Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［Ｎ−（ピリジン−３−イルメトキシカルボニル）アミノメチル］−ベンズアミド）である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
ＢＳＯおよびベンズアミドＨＤＡＣｉは併用投与される、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
レトロウイルスレゼルボアを有すると疑われる患者を処置する方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に規定される酸化ストレス誘発剤を前記患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１８】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、ＢＳＯ、金含有化合物、例えばオーラノフィン、ヒ素含有化合物、例えば三酸化ヒ素（Ａｓ_２Ｏ_３）および／または鉄ニトリロアセテートまたは硫酸第一鉄のうちの少なくとも１つを投与する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
レトロウイルスが潜伏感染した細胞を選択的に標的化する方法であって、前記細胞を請求項１〜１６のいずれか一項に規定される酸化ストレス誘発剤と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２０】
レトロウイルスレゼルボアの処置における使用を目的とした、請求項１〜１６のいずれか一項に記載される酸化ストレス誘発剤。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【公表番号】特表２０１２−５０６８８４（Ｐ２０１２−５０６８８４Ａ）
【公表日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３３６３０（Ｐ２０１１−５３３６３０）
【出願日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７９５８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４９１８２
【国際公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０６１１９１３２）
【Ｆターム（参考）】