アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素、及びこの酵素をコーディングする遺伝子
本発明は、アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素、及びこの酵素をコーディングする遺伝子に関する。本発明者らは、初めてこの活性を有する新しい型のタンパク質を分離、純化し、これをアフラトキシン解毒酵素（Aflatoxin-detofizyme，ＡＤＴＺ）と命名した。本発明では、純化及び配列解析によって、ＡＤＴＺの遺伝子特異性プラスミドが得られ、ナラタケモドキ（Armillariella tabescens）の総ＲＮＡから、クローンしたコーディングＡＤＴＺの遺伝子が得られ、遺伝子工学技術を用いて、多数の発現系の中で組換えＡＤＴＺタンパク質が発現、純化される。本発明の解毒酵素は、ＡＦＢ１を転化する生物活性を有し、ＡＦＢ１の異常（aberration）作用を低下させることができ、将来の飼料加工、食品加工及び抗癌薬の開発において、優れた基礎を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素、及びこの酵素をコーディングする遺伝子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アフラトキシン（Aflatoxin，ＡＦＴ）は毒性が非常に強い真菌毒素であって、毒性を引き起こすラジカルが同じく、且つ構成が類似であるアフラトキシンＢ１（Aflatoxin Ｂ１，ＡＦＢ１）、アフラトキシンＭ１（Aflatoxin Ｍ１，ＡＦＭ１）、アフラトキシンＧ１（Aflatoxin Ｇ１，ＡＦＧ１）等を含み、有毒菌株アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・パラジチカス及び他のかび菌（例えば、アスペルギルス・ウェンティ−）等から発生する。アフラトキシンは、穀物、飼料、食品に広く存在し、人類に対して、（１）ＡＦＴに汚染された食品をもし食用する前にＡＦＴを除去しなかったら、食べた者に直接損害を与え、或いは、ＡＦＴが汚染された飼料を通じてフードチェーンを経由して鳥類・家畜肉、乳製品等を食べる人間に間接損害を与えて、直接または間接的に急性中毒を起こしたり或いは人類の癌を誘発する；（２）鳥類・家畜が汚染された飼料を摂取したら、軽い結果としては中毒され、直接な結果としては動物の体重の低下を引き起こしたり、或いは他の病気を誘発し、間接な結果としてはフードチェーンを通じて人類の慢性中毒を起こして、癌を誘発し、重い場合は死亡を起こす；（３）ＡＦＴに汚染された食糧、穀物を食べ又は飼養することができないので、廃棄処分しなければならない、等の主な危害を与える。
【０００３】
アフラトキシンがこのような危害があるので、長い間、ＡＦＴの解毒技術が人々に注目されてきた。ＡＦＴの転化方法として下記方法がある。例えば、（１）アンモニア処理法：水を含む飼料に用いるが、処理した後で多量のアンモニアが食品に残存するので、米国ＦＤＡではこの方法で食品加工を行うことを禁止し、飼料中にも多量のアンモニアが含まれたので利用に影響を与えた。（２）ＮａＯＨ法（植物油粗製でＡＦＴを取り除くために用いる）：設備の投資が大きく、燃費が大きく、コストが高いので、現在次第に淘汰される。（３）白土吸着方法：労働強度が強く、白土のほこりと燃費及び環境汚染等の問題があるので、現在は大体淘汰された。（４）混合溶媒抽出法：この方法は落花生の粉や綿実等の固形食品からＡＦＴを取り除くために用いるが、抽出、溶媒の回収と処理際の費用が非常に高いので、広める価値がない。（５）高温法：この方法は処理されたサンプルを２６８℃以上に加熱することによりＡＦＴを破壊するが、通常の加熱法であるとこの温度に達成しにくく、また、温度が高すぎると、食品の他の栄養成分を破壊する問題があって、実際にあまり応用しない。（６）生物学的方法：この方法はカッキン（活菌）或いは固定化細菌を利用してＡＦＴを分解するが、カッキンにより原料の栄養成分が分解され、更に分解した新しい生成物及びこの生成物の毒性が明らかでないため、この方法は僅かの飼料と落花生油の解毒だけに用いられる。例えば、１９９６年の広東微生物所からの報告によると、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）菌を固形発酵した後のものを用いて解毒に適用するＢＤＡ生物製剤を製造したことがある。（７）紫外線法：紫外線の強い酸化作用を利用してＡＦＴを破壊するが、効果が不安定で、且つエネルギーの消耗も大きい。（８）超濾過法：このような方法は非均相だけに用いられ、均相、酸性化の牛乳については無効で、更に高い技術を要し、設備の費用が非常に高いので、今まで実際的な応用価値がない。（９）生物酵素法：ある学者からの報告（Brown DWら，Proc．Natl．Acad．Sc.，ＵＳＡ，１９９６）によると、大腸桿菌の中で肝チトクロームＰ４５０酸化酵素をクローン（clone）発現して、アフラトキシンの代謝を強める酸化酵素を用いて、体内に入って活性化されたＡＦＴに対して転化解毒作用を行い、これにより体内に入ったＡＦＢ１を低減する目的を実現する。
【０００４】
これらの処理方法において、物理化学的な手段でＡＦＴを転化する方法は強いため、処理された穀類、飼料、食品等の利用価値が小さくなり、効率も比較的に低く、コストの視点から言っても工業上に適用される方法ではない。また、体内でＰ４５０酸化酵素を高める方法はＡＦＢ１の代謝を強めることができるが、従って人に対する危険性も増加した。生物酵素触媒法は、もっと強い専一性、高転化効率という特徴を具備したので、ＡＦＴを直接に転化させる生物酵素の開発を検討している。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素、及びこの酵素をコーディングする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
このような酵素を得るために、本発明者は篩い分けにより得た１株のかび菌から、ＡＦＢ１を転化する生物酵素を純化し、またＤＮＡの組換え技術を介して、１種の形質転換体の中で、ＡＦＢ１を転化する活性を有するタンパク質を製造した。従って、本発明者は、初めて前記活性の有する新型のタンパク質を分離、純化して、アフラトキシン解毒酵素（Aflatoxin-detofizyme，ＡＤＴＺ）と命名した。
【０００７】
本発明は、純化と配列解析を介してアフラトキシン解毒酵素（Aflatoxin-detofizyme，ＡＤＴＺ）の遺伝子の特異性プライマーを得、ナラタケモドキ（Armillariella tabescens）の総ＲＮＡから、クローンによって、ＡＤＴＥをコーディングし、且つ今まで報告したことがない新遺伝子を得ており、更に遺伝子工学技術を用いて、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）発現系の中に組換えＡＤＴＺタンパク質を発現、純化する。選ばれた真菌はArmillariella tabescensで、中国普通微生物菌種保蔵管理中心から取り出したものである。
【０００８】
ＡＤＴＺの純化：先ず、菌体をつぶし、硫酸アンモニウム沈殿法によってタンパク質沈澱を行い、沈殿サンプルは高速タンパク質液相クロマトグラムによって目的ピークを得る。
ＡＤＴＺ短鎖Ｎ末端のアミノ酸配列の獲得：目的ピークに対して質量スペクトル解析を行って、短鎖ペプチドＮ末端のアミノ酸配列を得る。
【０００９】
本発明において、Armillariella tabescensの総ＲＮＡの抽出を行う。上述の短鎖ペプチドＮ末端のアミノ酸配列によってプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲとＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥを行い、得られたＡＤＴＺ遺伝子の配列の長さは約２．３ｋｂで、分析によると、配列には完全なオープン・リーディング・フレームと、３’末端及び５’末端の非翻訳領域とが含まれる。ＡＤＴＺ成熟ペプチドの全長ｃＤＮＡ２０８８個のヌクレオチドをコーディングし、６９５個のアミノ酸をコーディングし、それの分子量が約７３〜７７ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法）で、等電点（ｐＩ）が５．３〜６．８の間である（等電点電気泳動）。アミノ酸及びＤＮＡ配列は配列表に示す通りである。例えば一部のアミノ酸を除いて、置換して、修飾し、又は付加した後生成した産物等の修飾産物も、本発明のタンパク質の範囲に含まれる。
【００１０】
また、本発明の他の目的として、上述のような遺伝子を含む発現ベクター及び該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより得られる形質転換体を提供する。更に、形質転換体を培養する工程と、発現されたアフラトキシン解毒酵素を回収する工程を備えるアフラトキシン解毒酵素の製造方法も提供する。
【００１１】
本発明において、一対のプライマーを設計することによって、Armillariella tabescensのｃＤＮＡからＡＤＴＺ成熟ペプチドをコーディングする遺伝子を増幅し、真核組込型分泌発現ベクターにクローンする。例えば、ｐＨＩＬ−Ｓ１に基づいて発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺを構成し、また、組換え発現ベクターをPichia Pastoris ＧＳ１１５に形質転換する。該発現ベクターは、ＡＯＸをプロモーターとする。培養時間と誘導時間の探査によると、ＡＤＴＺの発現量は培地総タンパク質の２５％以上を占め、可溶の状態になる。
【００１２】
本発明で用いた真核発現ベクターは、例えば、ＰＡＯ８１５、ＰＰＩＣ３Ｋ、ＰＰＩＣＺ、ＰＨＷＯ１０、ＰＧＡＰＺ、又は分泌型ベクター、及びＰＰＩＣ９Ｋ、ＰＰＩＣＺα、ＰＧＡＰＺα、又は市販の同種のベクター等の細胞内型ベクターから選ぶことができる。なお、本発明で用いた真核発現菌株も、Pichia Pastoris ＫＭ７１、ＭＣ１００−３、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６５、ＳＭＤ１１６３等から選んで宿主細胞とする。
【００１３】
本発明は、原核発現系を用いても実現でき、ｐＥＴ、ｐＵＣＨ３３等、或いは市販の同類のベクターから何れかを選んで発現ベクターとし、大腸菌ＢＬ２１、大腸菌ＪＭ１０９等から何れかの原核発現菌株を選んで宿主細胞とする。
【００１４】
発現ベクターの複製方法：Sambrookらの方法（Sambrookら，２００２，Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）を参照し、ＣａＣｌ２法に応じてコンピテント細胞E.Coli ＤＨ５αを調製、形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む培地で細胞を培養してから、塩基法でプラスミドを抽出する。
【００１５】
本発明では、組換えＡＤＴＺの純化条件も探査した。発酵もろみ液を硫酸アンモニウム沈殿した後、疏水クロマトグラフィーと金属親和クロマトグラフィーの二段階純化法を利用して組換えＡＤＴＺを得て、組換えタンパク質の純度が９５％以上に至る。
【００１６】
本発明の他の目的として、飼料及び食品の製造中に前記アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いて脱毒するアフラトキシンの脱毒品を提供する。現在の飼料と食品の加工プロセスに合わせて、本発明で述べたようなアフラトキシンを転化する活性の有する解毒酵素を、脱毒剤として飼料中に添加することにより飼料の脱毒を行い、或いは固定化酵素に調製して、落花生油の脱毒に用いる。
【００１７】
本発明のまた他の目的として、調製中に前記アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いたアフラトキシンによる癌を予防と治療する薬物提供する。現在の抗癌薬のプロセスに合わせて、本発明で述べたアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を添加することによって、アフラトキシンが誘発した癌の予防と治療に用いる薬物を得る。
本発明において、発明者は、初めてこのタンパク質をコーディングする遺伝子を分離、偏析した。また、発明者はこの遺伝子を一種の発現ベクターに組み込んで、一種の形質転換体を生成し、更に、この形質転換体に基づいて、ＡＤＴＺタンパク質の製造を成功的に実現することができた。活性鑑定実験によれば、組換えＡＤＴＺが天然ＡＤＴＺと類似なアフラトキシンを転化する生物活性を有することが証明される。組換えＡＤＴＺのＡＦＢ１解毒生物活性に対する鑑定実験によれば、組換えＡＤＴＺが、ＡＦＢ１の異常（aberration）作用を低下させ、ＡＦＢ１が引き起こす突然変異を抑制する生物活性作用を有することが証明される。本発明は、これからの飼料加工、食品加工及び抗癌薬の開発において、優れた基礎を築いた。
【実施例】
【００１８】
〔実施例１：ＡＤＴＺの獲得及び純化〕
（Ｉ）菌体の発酵培養：
１）菌種：Armillariella tabescens
２）前記菌種を液体培地（馬鈴薯抽出液１Ｌ、グルコース２０．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．５ｇ、微量のビタミン、ｐＨ６．６）で合計２５日培養して、一級〜三級をそれぞれ６日、４日、４日培養し、四級は１１日培養し、培養温度を２４〜２８℃として、菌体を収集した。
【００１９】
（ＩＩ）アフラトキシン解毒酵素（ＡＤＴＺ）の抽出：
新鮮な菌体を液体窒素凍結した後に小さい塊に打って、１：１（Ｗ／Ｖ）の比例でリン酸塩緩衝液を加えて、氷浴の中でホモジネートし、超音波で細胞を滅裂した後に、１１０００〜１２０００ｇ遠心力で遠心分離法により沈殿物を除去し、それから２０〜８０％飽和の硫酸アンモニウムで分別沈殿し、最後に沈殿物を取り出す。ｐＨ６．０，０．０２mol／Ｌのリン酸緩衝液で溶解懸濁して、ブラッドフォードタンパク質分析（Bradford法）し、また、ＡＦＢ１ ＥＬＩＳＡキットでタンパク質の成分の酵素活性を検査して、アフラトキシン解毒酵素（ＡＤＴＺ）を含む酵素液を得る。
【００２０】
（ＩＩＩ）ＡＤＴＺの純化：
（１）酵素サンプルの準備：
粗酵素液を４０倍体積のリン酸緩衝液（ｐＨ６.０，０．０２mol／Ｌ）で透析脱塩し、ポリエチレン・グリコール−２００００で透析濃縮して、また、０．４５μｍマイクロフィルムで濾過してから、ブラッドフォードタンパク質分析する（Bradford法）。
【００２１】
（２）高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）純化酵素：
文献（Ion Exchange Chromatography principles and methods，Pharmacia Co.編，Pharmacia Co.，１９８４，pp.２９〜３１；及びChromatofocusing with PolybufferTM and PBETM，6．Experimental，Pharmacia Co.編，Pharmacia Co.，１９８４，pp.１１〜２４）記載の方法によって、イオン交換クロマトグラムと、等電点電気泳動法クロマトグラフィーカラム填料と、緩衝液とを選んで、操作請求に従って、イオン交換クロマトグラム及びフォーカスクロマトグラムを、すべてFPLC System（Pharmacia Biotech Co.，米国）により行う。詳細は以下の通りである。
【００２２】
（ｉ）陰イオン交換クロマトグラム：
１）試薬：
ｐＨ６．０，０．２mol／Ｌリン酸塩貯蔵緩衝液
Ａ液：ｐＨ６．０，０．０２mol／Ｌのリン酸緩衝液
Ｂ液：ｐＨ６．０，０．０２mol／Ｌ＋１Ｎ ＮａＣｌのリン酸緩衝液
【００２３】
２）カラムの準備：
DEAE-Sephadex ５０ｍＬを、２倍の体積のリン酸塩緩衝液と十分に攪拌洗浄した後に、２０分間静置し、そして小型真空ポンプで上清を引出して、相同な操作をして洗浄を繰り返し、また、相同の条件で５回繰り返して洗浄した後に、０．６ｍＬ／分の流速で規格が２０×３０ｃｍであるカラムに充填する。
【００２４】
基線が０付近に安定するようＡ液で当該カラムを平衡化する。酵素サンプル２０ｍＬ（２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含む）を予めカラムに通導して、DEAE-Sephadexイオン交換カラムを通過させる。塩化ナトリウム勾配溶出：Ａ液で２時間溶出して、またＡ液及び０〜８０％のＢ液で５時間溶出した後に、１００％のＢ液で２時間溶出する。且つ流速を０．６ｍＬ/分とする。そして、フラクションコレクターで収集する。紫外線ＯＤ280nmモニターする。ポリエチレン・グリコール−２００００で透析濃縮して脱塩してから、ブラッドフォードタンパク質分析し（Bradford法）、別々に各タンパク質成分の転化ＡＦＢ１活性を測定して、活性成分を受け取る。以上の操作を繰り返して、活性成分を収集する。
【００２５】
（ｉｉ）フォーカスクロマトグラフィー：
１）試薬：
溶出液：PolybufferTM 74（Pharmacia Co.製），２５０ｍＬ包装。１００ｍＬを取って純水を添加して１０００ｍＬまで薄め、４℃の条件に保存して予備用とする。
最初緩衝液：ｐＨ７.４，０．０２５mol／Ｌのイミダゾール−ＨＣＬ緩衝液
２）カラム：
Mono-ｐTM ＰＢＥ９４，５×２０ｃｍ予め装填カラム（Pharmacia Co.製）。
【００２６】
Polybuffer 74で、前記イオン交換クロマトグラム純化を経由した後の酵素液６ｍＬ（タンパク質３ｍｇ／ｍＬを含む）を平衡化させる（平衡化した後は６.５ｍＬである）。最初緩衝液でMono-ｐカラムを２時間平衡化させ、Polybuffer 74溶離液でカラムを通過させて、２ｍＬ酵素液サンプルを通導し、またPolybuffer 74溶離液で１０時間溶離する。且つ流速を０．２ｍＬ／分とする。紫外線ＯＤ280nmモニターを施してクロマトグラムを記録し、また、フラクションコレクターで受け取って、２ｍＬ／管（即ち、１０分／管）に設定する。ブラッドフォードタンパク質分析し（Bradford法）、各タンパク質成分の転化ＡＦＢ１活性を別々に測定する。活性成分を収集する。
【００２７】
ＡＵ値が０に返るまで、０．１mol／Ｌのリン酸でカラムを洗って、再びＡＵ値が０に返るまで、１mol／ＬのＮａＣｌでカラムを洗って、また、最初緩衝液でカラムを平衡化させて一晩おく。前記の条件でフォーカスクロマトグラム操作を繰り返して、活性成分を収集する。
【００２８】
（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡ法による活性成分の検査：
収集した各成分について別々にＡＦＢ１を取り扱い、ＥＬＩＳＡ法によって処理をしたサンプルの中のＡＦＢ１の量を検査し、１００℃の条件で１０分間沸騰した同じ成分を対照するが、ＡＦＢ１を減少させることができる成分が活性の成分である。詳細は以下の通りである。
【００２９】
１）サンプルの準備：
不活性化酵素液群：ＡＦＢ１ ２００ｕｌ（濃度２．５ｎｇ／ｍＬメタノール）＋不活性化酵素液２００ｕｌ（１．２ｍｇ／ｍＬ）
活性酵素液群：ＡＦＢ１ ２００ｕｌ（濃度２．５ｎｇ／ｍＬメタノール）＋活性酵素液２００ｕｌ（１．２ｍｇ／ｍＬ）
質量制御群：ＡＦＢ１ ２００ｕｌ（濃度２．５ｎｇ／ｍＬメタノール）＋緩衝液２００ｕｌ（１．２ｍｇ／ｍＬ）
不活性化酵素液の調製：成分を１００℃で１０分間煮沸させる。
【００３０】
均等に混合して、３０℃の条件で３０分間反応させ、また１５分間煮沸させて５分間３０００ｇ遠心力で沈殿物を除去し、サンプルを調製した後にＥＬＩＳＡキット（AgraQuantTM Total Aflatoxin Assay 4/40，ROMER社製，米国）の操作仕様書によって操作し、標準曲線によって処理した後の産物の中に含まれているＡＦＢ１を算出する。収集した各成分を検査して、サンプルの中のＡＦＢ１が減少させ得る成分が活性のある成分となる。検査結果：活性のある成分の活性酵素液処理のサンプルの中で、ＡＦＢ１は１．２３０±０．５０８ｎｇ／ｍＬであり、活性のある成分の不活性化酵素液処理のサンプルの中で、ＡＦＢ１は２．４３６±０．３２６ｎｇ／ｍＬであり、質量制御群は２．５０８±０．２０３ｎｇ／ｍＬである。
【００３１】
活性ピークは、非還元性条件の下に電気泳動（ＰＡＧＥ）するが、これは単一のバンドであることを表明する。結果は図１の通りである。
得られたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した結果、分子量が約７３〜７６ｋＤａであり、等電点電気泳動によって分析した結果、等電点（ｐＩ）が約５．３〜６．８である。
【００３２】
〔実施例２：純化したＡＤＴＺ活性の鑑定〕
（Ｉ）ＡＤＴＺでＡＦＢ１を転化する活性の鑑定：
中国予防医学科学院の標準処点（食品衛生国家標準集，中国予防医学科学院標準処編，北京，中国標準的出版社，１９９８年版，pp.４１０〜４１５）及び▲ジェー▼永信（薄層クロマトグラフの食品分析への応用，▲ジェー▼永信，陸氷真編集，北京大学出版社，１９９１年版，pp.１１８〜１２３）が報告した方法に従って、薄層クロマトグラフ法により、ＡＤＴＺで処理したＡＦＢ１に対して検査・測定を行って、純化したＡＤＴＺ活性を鑑定する。具体的な方法は次の通りである。
【００３３】
（１）実験群：
１．５ｍＬの遠心管一つを取って、１μＬのＡＦＢ１溶液（ＡＦＢ１メタノール溶液：０．５μｇ／μＬ，アフラトキシンＢ１，Alexis Biochemicals Inc.，スイス）を添加して、窒素ガスを蒸着する。別々にＡＤＴＺ酵素の液体（タンパク質の含有量：０．１ｍｇ／ｍＬ）３００μＬ、ＭｇＳＯ４ ０．５μＬ、ＰＥＧ２００ １０μＬを添加して、十分に混ぜる。３０℃の水浴の中で１時間反応させて、試験管の内のＡＦＢ１総量が２μｇになるように、以降毎時間ずつ各容器へ０．５μＬのＡＦＢ１溶液を添加する。添加を完了した後、更に２時間反応させる。
【００３４】
（２）対照群：
１．５ｍＬの遠心管一つを取って対照群１と表記し、１μＬのＡＦＢ１溶液を添加してから、窒素ガスを蒸着する。別々に、３００μＬの酵素溶液（前もって１００℃水浴で５分間非活性化する）、ＭｇＳＯ４ ０．５μＬ、ＰＥＧ２００ １０μＬを添加した後、十分に混ぜる。１．５ｍＬの別の遠心管を取って対照群２と表記し、１μＬのＡＦＢ１溶液を添加してから、窒素ガスを蒸着する。別々に、３３００μＬのＰＢＳ緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ６．６）、ＭｇＳＯ４ ０．５μＬ、ＰＥＧ２００ １０μＬを添加して十分に混ぜる。後続操作は実験群と同じである。
【００３５】
以上のように、実験群と対照群の反応を行った後に、それぞれ２倍体積のクロロホルムを添加して二回抽出する。また、４５℃の条件と窒素の下で抽出物を蒸着して、１ｍＬのメタノールを添加して抽出物を十分に溶解させる。こうして、実験群サンプル（活性酵素群）、対照群１（修飾酵素群）、対照群２（緩衝液対象群）を得た。
【００３６】
（３）薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）で反応産物を検査する：
新しく活性化（１００℃，２時間）したプレハブシリカゲルの薄層板（１０×１０ｃｍ，６０Å，Whatman，ＵＳＡ）を取って、薄層板の上でサンプルをポイントして、ポイントをへりから１ｃｍ離れ、ポイントの間隔を１ｃｍとする。左から右に：第１ポイントは１０μＬ，２５μｇ／ｍＬのＡＦＢ１クロロホルム溶液であり；第２、３ポイントはそれぞれ１０μＬの対照群２であり；第４ポイントは１０μＬ，２号の対照群１であり；第５ポイントは１０μＬの実験群であり；第６ポイントは１０μＬ ２５μｇ／ｍＬのＡＦＢ１クロロホルム溶液である。
【００３７】
展開：展開溝の内に１０ｍＬの無水エーテルを展開して、取り出して揮発乾燥する。
観察：波長が３６５ｎｍである紫外線の下で蛍光を観察して、写真を撮る。結果は図２に示す通りである。
結果によると、ＡＦＢ１の標準品（１、６）と酵素の非活性化対照（４）とＰＢＳ緩衝液対照（２、３）について、エーテルが展開する時すべてただ微小な移動のみが発生したが、ＡＤＴＺ処理を行った後のＡＦＢ１産物のＲｆ値は１に近づいている（＝０．９５）。これで、解毒処理をした後のＡＦＢ１が、その極性が著しく減少して、ＡＦＢ１と明らかに異なり、純化して得たＡＤＴＺがＡＦＢ１を転化する活性を有することを説明する。
【００３８】
（ＩＩ）ＡＦＢ１に対するＡＤＴＺの解毒生物活性の鑑定：
エームス・ネズミチフス菌バイオアッセイ試験（Ames実験）は中華人民共和国衛生部薬政局の公布する方法（中華人民共和国の衛生部薬政局が編集、新薬（西洋式薬）の臨床研究指導集（薬学、薬理学、毒理学），１９９３年７月）に従って行う。具体的な方法は次の通りである。
【００３９】
（１）菌株のテスト：
ヒスチジンの栄養欠陥型のネズミのチフスサルモネラ菌株ＴＡ９８（衛生部薬品生物製品検定所から引用）であり、−８５℃（零下８５℃）の低温の冷蔵庫で保存して、テストの前で採用の菌の株に対して遺伝子型鑑定及び自発回変数の測定を行って、生物学の鑑定は合格で、実験要求に符合する。
【００４０】
（２）肝Ｓ９の調製：
（ｉ）ＳＤラット誘導：ＳＤラットを一周間検疫して病気がないことを確定して、ポリ塩化ビフェニルでトウモロコシ油を混濁し、腹腔注射（５００ｍｇ／ｋｇ体重）して、５日後の死刑を決め、死刑に処する前に１２時間断食する。
（ｉｉ）Ｓ９成分の調製：上述のように誘導したＳＤラットに対して首を切って血を落ち、また、無菌の条件で肝臓を取って、重さを量り、肝臓を冷たい０．１５mol／Ｌ（以下同じ）ＫＣｌにより洗浄する。１ｇ肝臓に３ｍＬの割合で添加してホモジナイザーで均質化してから、各組織の均質化時間を一致させる。均質液を０℃で、９０００ｇ遠心力で２０分間遠心して、上清液を取る。無菌を証明した後に−８５℃の冷蔵庫に貯蔵して備え付けておく。
【００４１】
（３）Ｓ９混合液の調製：
下記Ａ、Ｂ、Ｃ液とＳ９成分を混合して、４℃の条件で保存して４時間以内に使う。
Ａ液：（０．２mol／Ｌ，補酵素ＩＩ，濾過滅菌）０．２ｍＬ
Ｂ液：（０．２mol／Ｌ，グルコース６−リン酸，濾過滅菌）０．２５ｍＬ
Ｃ液：８．５５ｍＬ
Ｃ液組成（０．４mol／Ｌ ＭｇＣｌ２ ２０ｍＬ，１．６５mol／Ｌ ＫＣｌ ２０ｍＬ，０．２mol／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５００ｍＬ，蒸留水３１５ｍＬ，混ぜた後に濾過滅菌する）。
Ｓ９成分：１．００ｍＬ
【００４２】
（４）試験サンプルの調製：
３０ｍＬの反応体系において、ＡＤＴＺ濃度が０．２ｍｇ／ｍＬで、ＡＦＢ１の濃度が０．２ｍｇ／ｍＬで、ｐＨ値が６．０であるが、２８℃の下で１２０分間反応して、体系を１０倍拡大する。反応後に、同等体積のクロロホルムでアフラトキシンＢ１副産物と未反応の残留物を３回抽出して、有機相を合併し、更に、４０℃で減圧してクロロホルムを揮発乾燥する。また、３．７５と３ｍＬのＤＭＳＯで抽出物（活性酵素処理反応群）を洗浄し、活性ＡＤＴＺの代わりに予めクロロホルムで非活性化させたＡＤＴＺによって、同等の条件下にアフラトキシンＢ１（非活性化する酵素処理対照群）を処理する；活性ＡＤＴＺ酵素液の代わりに緩衝液により、同等の条件下にアフラトキシンＢ１（緩衝液処理対照群）を処理する。以上のサンプルを全部−１５℃の条件で保存する。
【００４３】
（５）エームス・ネズミチフス菌バイオアッセイ試験：
サンプルのＤＭＳＯ溶液と一夜培養した菌液及びＳ９を上層寒天培養基の中に添加して均一に混ぜる。また、４０℃の条件で下層Vogel選択培地に倒れて置き、凝固した後に３７℃のインキュベーターで７２時間培養して、培養皿毎に現れる復帰突然変異コロニーの数を算出する。
群毎にテストする時、各群の抽出液及び陰陽性対照を全部３つの平皿に設けて、１回繰り返す。各群の抽出液の結果は、２回６群の平均値である。実験結果は、復帰コロニーの数、突然変異率（ＭＲ＝サンプル復帰コロニーの数／陰性対照復帰コロニーの数）、及び抑制率（％）［＝｛１−（被験サンプル復帰コロニーの数−陰性対照群復帰コロニーの数）／（ＡＦＢ１対照群復帰コロニーの数−陰性対照群復帰コロニーの数）｝−１００％］によって表示される。
【００４４】
（６）結果評価基準：
溶剤対照群が正常な範囲内であれば、受検物は３個濃度以上に陽性用量反応があり、最大の増加値は溶剤対照値の２倍（即ちＭＲ≧２）であって、致突然変異陽性と考えられる。
【００４５】
（７）結果：
活性ＡＤＴＺ処理反応群の細菌復帰突然変異コロニーの数は、陰性対照群（ＤＭＳＯ対照群）に近づいている（ＭＲ値が全部２より小さい）。緩衝液処理対照群と不活性化ＡＤＴＺ処理対照群の細菌復帰突然変異コロニーの数は、陰性対照群（ＭＲ値が全部２より大きい）より顕著に高い、陽性対照（アフラトキシンＢ１対照）の細菌復帰突然変異コロニーの数に比べて顕著な相違がない。これは活性ＡＤＴＺ処理反応群の被試験物が誘発遺伝子突然変異作用を有しないことを表明している。ＡＤＴＺはＡＦＢ１の突然変異を抑制する生物活性作用を有することを表す。結果は次の表の通りである。
【００４６】
【表１】
【００４７】
以上の表によると：突然変異誘発実験はラットの肝臓Ｓ−９混合物を含むSalmonella typhimuriurmn ＴＡ９８を試験菌として行う。突然変異実験に用いるＡＦＢ１対照群の濃度は０．８ｍｇ／５０ｍＬ ＤＭＳＯ／平板である。また、ＡＦＢ１酵素処理後のサンプルは毎板に対しても、ＡＢＦ１と同様な量に相当する量で実験を行って、そして同様な量のＤＭＳＯを維持する。平板に２８時間培養した後に、数を数えて、結果を４つの平板の平均値±ＳＤで表示する。
【００４８】
〔実施例３：ＡＤＴＺ短鎖ペプチドアミノ酸配列の獲得〕
実施例１で純化して得られた活性成分のピークの先を収集して、或いは活性成分をＰＡＧＥ電気泳動して、目的バンドを収集し、Ｑ−ＴＯＦ２（電子スプレー−４極竿飛行時間−タンデム質量スペクトル解析）機器（イギリスMicromass社，軍事医学科学院器具テスト分析センターから提供）を採用してＡＤＴＺ短鎖ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列を測定する。得られたアミノ酸配列は次の通りである。
Ｍ１：ＥＡＷＥＧＦＴＡＬＶＤＫ
Ｍ２：ＮＫＬＬＱＤＡＮＧＥＬＥＮＬＹＶＲ
【００４９】
本発明のＡＤＴＺ短鎖ペプチドアミノ酸配列は前記説明したものに限定されず、他の短鎖ペプチドアミノ酸配列フラグメントを含むことができる。該フラグメントがＭＡＬＤＩ−ＭＳ−ＴＯＦ或いは他の化学方法等によってＡＤＴＺを測定して獲得したものであればよい。
【００５０】
〔実施例４：酵素菌の総ＲＮＡの抽出〕
酵素を生成する菌の菌体の組織をプレクーリングしたモルタルの中に入れて、サンプルが粉末状になるように液体の窒素を添加して研磨する。また、１００ｍｇ程度のサンプルを取って１．５ｍＬの遠心管の中に移して、１ｍＬのTrizolを添加し、振動して均一に混ぜて、室温に５分間置く。また、２００ｍＬクロロホルムを添加して、２分間振動して均一に混ぜて、氷浴に５分間置いて、２〜８℃の条件で、１２０００×ｇで１５分間遠心してから、上清を別の１１．５ｍＬの遠心管に転移する。プレクーリングした５００ｍＬのイソプロピルアルコールを添加して、氷浴に２０分間置いて、２〜８℃の条件で、１２０００×ｇで１０分間遠心する。更に、上清を捨てて、プレクーリングした１ｍＬの７５％アルコールを添加して、沈殿及び遠心管壁を洗浄する。２〜８℃の条件で、７５００×ｇで５分間遠心して、上清を捨てて、空気で５〜１０分間乾燥させてから、５０μＬのＤＥＰＣ無菌水を完全溶解するように添加する。紫外分光光度法と電気泳動の検査（１．１％ Agarose／ＥＢ、１００Ｖ、２０分）を行って、サンプルは−８０℃で保存する。結果は図３に示すように、電気泳動の検査の結果から２８ｓ ｒＲＮＡと１８ｓ ｓＲＮＡの二つの特徴バンドがはっきりして、光度比は２：１に近づいていることにより、総ＲＮＡが分解しなかったことを説明する。
【００５１】
〔実施例５：ＡＤＴＺ遺伝子特異性プライマーの獲得〕
実施例３で得たＡＤＴＺ短鎖ペプチドアミノ酸配列から二つのプライマー（Ｐ１、Ｐ２とＧ１、Ｇ２）を設計する。ＡＤＴＺ遺伝子部分の配列の産物を得るように、QIAGEN OneStep RT-PCR Kit（QIAGEN Inc.，米国）手帳を参照してＲＴ−ＰＣＲを行う。ゴムを切ってＲＴ−ＰＣＲ産物を回収して、そして通常の方法によってＴＡクローンを行う。HindIIIとEcoRIでＴＡクローンの組換えプラスミドを酵素切断して鑑定して、１．５％アガロースゲル電気泳動で酵素切断結果を検査する。組換えプラスミドに対して配列解析を行って、ＡＤＴＺ遺伝子のｃＤＮＡフラグメントＥ１を得る。具体的な方法は次の通りである。
【００５２】
プライマー対１：
Ｐ１：５’−ＴＧＧＧＡＲＧＧＮＴＴＹＡＣＮＧＣ−３’
Ｐ２：５’−ＴＣＮＣＣＲＴＴＮＧＣＲＴＣＹＴＧ−３’
プライマー対２：
Ｇ１：５’−ＣＡＲＧＡＹＧＣＮＡＡＹＧＧＮＧＡ−３’
Ｇ２：５’−ＧＣＮＧＴＲＡＡＮＣＣＹＴＣＣＣＡ−３’
【００５３】
本発明の増幅したＡＤＴＺ遺伝子特異性プライマーのプライマーセットは以上のＰ１及びＰ２、Ｇ１及びＧ２に限定されず、他のプライマー対を含むことができ、該プライマー対が上記方法で獲得したＡＤＴＺ短鎖ペプチドアミノ酸配列によって設計されたものであればよい。
【００５４】
（Ｉ）ＲＴ−ＰＣＲの順序：
１）テンプレートの総ＲＮＡ（実施例４から獲得する）を７５℃で５分間変性させて、迅速に氷の中に挿入して冷却する。
【００５５】
２）マスターミックス（Master Mix）（総体系８０μＬ）の準備：
【表２】
吸い込んで均一に混ぜて、短時間遠心する。
【００５６】
３）下表に示す順序で各成分を０．５ｍＬの無菌遠心管の中に添加する（単位：μＬ）。
【表３】
【００５７】
４）ＰＣＲ循環プログラム：
・逆転写（Reverse transcription）：５０℃，３０分
・Initial PCR activation step：５０℃，１５分
・３ステップサイクル（3-step cycling）
・１５サイクル：９４℃，４０秒
６５℃，１分（−１℃／サイクル）
７２℃，１分
・２５サイクル：９４℃，４０秒
５０℃，１分
７２℃，１分
・Final extension：７０℃，１０分
【００５８】
５）循環が終わった後に、５μＬサンプルを取って、電気泳動検査を行う。
【００５９】
（ＩＩ）ゴムを切ってＲＴ−ＰＣＲ産物を回収する：
１）ＴＡＥ電気泳動緩衝液を調合して、また、０．８％アガロースゲルを調合する。
２）５０μＬのＲＴ−ＰＣＲの産物と１０×loading bufferを割合によって混合して、サンプルを加える。
３）１００Ｖ，２０分間の電気泳動。
４）電気泳動が終わった後に、紫外灯を用いてバンドの位置を観察して、目的帯を切って、新しい滅菌した１．５ｍＬの遠心管へ転移する。
５）８００μＬのバッファーＮＴ１を添加する。
６）NucleoTrap Suspensionを渦巻振動して、小珠が完全に浮遊させた後に、１０μＬを取って遠心管に加入する。
７）遠心管を５０℃水浴に６分間置いて、その間に２分毎に短い時間渦巻振動する。
８）室温下で、１００００×ｇで、３０秒遠心して、上清を捨てる。
９）５００μＬのバッファーＮＴ２を加入して、短時間渦巻振動し、室温の条件で、一００００×ｇで、３０秒間遠心して、上清を捨てる。次に、このステップを１回繰り返す。
１０）５００μＬのバッファーＮＴ３を加入して、短時間渦巻振動し、室温の条件で、１００００×ｇで、３０秒間遠心して、上清を捨てる。次に、このステップを一回繰り返す。
１１）再度１００００×ｇで、３０秒間遠心して、上清を捨て、空気の条件で１０〜１５分乾燥する。
１２）３０μＬのＴＥバッファー（ｐＨ８．０）を加入して、沈殿物を再び懸濁する。回収のフラグメントを“Ｅ１”と命名する。ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動検査を行う。結果は図４に示すように、プライマー対Ｐ１とＰ２の反応の結果から１つのバンドを獲得したことを明示しており、条帯位置はおよそ８００ｂｐ程度であり、これをＥ１フラグメントと命名する。
【００６０】
（ＩＩＩ）ＴＡクローンと配列解析：
（１）連結：
１．５ｍＬの新しい滅菌した遠心管に下記の成分を加入する。
１μＬ ｐＵＣｍ−Ｔベクター
３μＬ Ｅ１フラグメント（ＲＴ−ＰＣＲ回収産物）
１μＬ １０×バッファー
１μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
４ｍＬの無菌水を添加して総体積を１０ｍＬに補充する。
吸い込んで均一に混ぜて、短時間遠心して、２２℃水浴で４時間以上置く。
【００６１】
（２）ＣａＣｌ２でE.coli ＤＨ５αコンピテント細胞の調製：
ＤＨ５αモノクローンを選び取って２ｍＬのＬＢ液体培地の中に添加し、３７℃の条件で振動して一夜培養する。活性化した新鮮なＤＨ５α菌液の中から５０μＬを取って５ｍＬのＬＢ液体培地の中に接種して、３７℃の条件で振動して１．５〜２時間培養する。また、氷浴に３０分置いて、菌液を無菌遠心管の中に転移して、５０００ｒｐｍで５分遠心して、上清を捨てる。１．５ｍＬ氷浴した無菌ＣａＣｌ２を遠心管に添加して、菌体を浮遊して、氷浴に１０分置いて、５０００ｒｐｍで５分遠心して、上清を捨てる。２００μＬの氷浴した無菌ＣａＣｌ２を遠心管に添加して、菌体を浮遊して、４℃の条件で保存しておく。
【００６２】
（３）ＤＨ５αコンピテント細胞の形質転換：
２００μＬのコンピテント細胞を取って、１０μＬの連結物を含む遠心管に添加して、均一に混ぜる。氷浴に３０分置き、４２℃の水浴に９０秒置いて、直ちに氷浴に３〜５分置く。８００μＬ ＬＢ液体培地に添加して、３７℃で４０〜６０分培養し；９０ｍｍ平板毎に２００μＬの量で、形質転換されたコンピテント細胞をAmpとＩＰＴＧ／Ｘ−galを含むＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で１２〜１６時間振動培養する。
【００６３】
（４）塩基によるプラスミドＤＮＡの抽出：
形質転換した単菌落を選び取って、２ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地の中に接種して、３７℃で激しく振動して一夜培養する。１．５ｍＬ菌液を取って微量遠心管に添加して、１２０００ｒｐｍで２分遠心して、上清を捨てる。４００μＬのＳＴＥ溶液を取って菌体を洗浄して、渦巻き振動して均一に混ぜて、１２０００ｒｐｍで２分遠心して、上清を捨てる。沈殿した菌体に１００μＬのプレクーリングした溶液Ｉを添加して、激しく振動して均一に混ぜる。２００μＬの新鮮に調合した溶液ＩＩを添加して、直ちに急速に転倒させて混ぜて、氷浴に３分置く。１５０μＬのプレクーリングした溶液ＩＩＩを添加して、転倒させて混ぜることを繰り返して、氷浴に５分間置く。１２０００ｒｐｍで５分間遠心して、上清は別の管の中へ移す。同等体積のフェノールを添加して、転倒して均一に混ぜる。１２０００ｒｐｍで５分遠心する。気をつけて上清を吸収して別の管の中へ転移する。２倍体積のプレクーリングした無水アルコールを添加して、転倒にて均一に混ぜて、室温で静かに４０〜６０分置く。１２０００ｒｐｍで１０分遠心させて、上清を捨てる。２００μＬの７０％アルコールを添加して、沈殿物を洗浄して、１２０００ｒｐｍで１分間遠心させて、上清を捨てる。キャップを開けて、空気の中で５〜１０分乾燥して、３０μＬのデオキシリボヌクレアーゼを含まないリボヌクレアーゼのＴＥを添加し、溶解沈殿し、３７℃で１時間培養する。−２０℃の条件で貯蔵する。
【００６４】
（５）組換えプラスミドｐＴＥ１に対する酵素切断鑑定：
HindIIIとEcoRI酵素でＴＡクローンのリコンを酵素切断鑑定して、次の通り表す（単位：ｍＬ）。
【表４】
【００６５】
３７℃で４時間以上、酵素切断を行う。１．５％アガロースゲル電気泳動で酵素切断した結果、図５のように、組換えベクターｐＴＥ１の酵素切断鑑定によれば、HindIII＋EcoRI双酵素切断（１号サンプル）とHindIII単酵素切断（３号サンプル）は皆４００ｂｐ以上のバンドを切った。また、前者の光度は後者より高く、EcoRI単酵素切断はリコンを線形（２号サンプル）に切る。これは、Ｅ１フラグメント中央位置に一つのHindIII酵素認識部位が存在することを示す。
【００６６】
（６）配列解析：
組換えプラスミドＰＥＧ純化法（Sambrookら，１９８９，Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）によって、プラスミドＤＮＡを抽出する。Ｔ７とＳＰ６をシークエンシングプライマーとして、ABI377 DNA Sequencer ＤＮＡ自動配列計（上海博雅公司から提供）で、表裏方向で測定を行って、Ｅ１フラグメントの核酸配列を得る。測定結果：配列はプライマーＰ１とプライマーＰ２の配列を含み、その中の位置にHindIII酵素認識部位（ａａｇｃｔｔ）が現れる。
【００６７】
〔実施例６：コードＡＤＴＺ全長ｃＤＮＡ序列の獲得〕
実施例５で獲得したＡＤＴＺ遺伝子の部分の配列Ｅ１フラグメントによって、プライマーを設計する。
Ｓ１（５’−ＴＡＧＧＣＧＡＡＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡ−３’）
Ｓ３（５’−ＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＧＴ−３’）
【００６８】
それぞれ３’ＲＡＣＥと５’ＲＡＣＥのプライマーとして、SMARTTM RACE cDNA amplification Kit（COLONTECH Laboratories，Inc．Cat．No．K1811-2）手帳によって、３’ＲＡＣＥと５’ＲＡＣＥを行う。ゴムを切ってＲＡＣＥ産物を回収して、そして通常の方法によってＴＡクローンを行う。HindIIIとEcoRIでＴＡクローンのリコンを酵素切断鑑定して、１．５％アガロースゲル電気泳動で酵素切断結果を検査する。組換えプラスミドをシークエンシング会社へ送って配列解析を行なって、二つのフラグメントＥ２、Ｅ３を得て、ＮＣＢＩのVecScreen（BLASTN2.2.5）のプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen.html）を利用してベクターの配列を識別し取り除く。また、DNAMANプログラム（米国Lynnon BioSoft社のソフトウェア）を用いてＥ１、Ｅ２、Ｅ３を繋ぎ合わせて、得た配列をＮＣＢＩのORF Finderプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）を利用し、オープン・リーディング・フレーム分析を行って、コーディングＡＤＴＺ成熟ペプチドのＡＤＴＺ遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を得た。具体的には次の通りである。
プライマーＳ１：５’−ＴＡＧＧＣＧＡＡＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡ−３’
プライマーＳ３：５’−ＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＧＴ−３’
【００６９】
（Ｉ）３’ＲＡＣＥ：
（１）３’RACE-Ready ｃＤＮＡの調製：
１）テンプレートの総ＲＮＡを７５℃で５分間変性して、迅速に氷の中に挿入して冷却する。
２）０．５ｍＬの滅菌遠心管の中に下記の試薬を添加する。
１μＬ 変性したテンプレートの総ＲＮＡ
１μＬ ３’−ＣＤＳプライマーＡ
３μＬのリボヌクレアーゼを含まない無菌水を添加して体積を５ｍＬまで補充する。
３）吸い込んで均一に混ぜて、そして短い時間で遠心させて混合液が管底に位置するようにする。
４）７０℃で、温浴で２分置く。
５）氷浴で２分置いて、少し遠心させて下記の試薬を添加する。
【表５】
６）試薬をそっと吸い込んで均一に混ぜて、少し遠心させる。
７）インキュベーターの中で、４２℃で１．５時間温浴する。
８）１００ｍＬのTricine−ＥＤＴＡバッファーで産物を希釈する。
９）７２℃で７分間培養する。
１０）サンプルは−２０℃で貯蔵する。
【００７０】
（２）３’ＲＡＣＥのステップ：
１）マスターミックス（Master Mix）（総体系１００μＬ）の準備：
【表６】
吸い込んで均一に混ぜて、短い時間で遠心する。
【００７１】
２）下表に示す順序で各成分を０．５ｍＬの無菌遠心管の中に添加する（単位：μＬ）。
【表７】
【００７２】
３）ＰＣＲ循環プログラム：
・５サイクル：９４℃，５秒
７２℃，３分
・５サイクル：９４℃，５秒
７０℃，１０秒
７２℃，３分
・３５サイクル：９４℃，５秒
６８℃，１０秒
７２℃，３分
【００７３】
４）循環が終わった後に５ｍＬのサンプルを取って電気泳動検査する。結果は図６に示すように、３’ＲＡＣＥが一つの一バンドの産物を獲得したことを明示して、産物バンドは、分子量が約８００ｂｐに位置して、Ｅ２フラグメントと命名する。
【００７４】
（３）ゴムを切って３’のＲＡＣＥ産物を回収し、ＴＡクローンして、ＣａＣｌ２法によってE.coli ＤＨ５αコンピテント細胞を調製する。ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、塩基でプラスミドＤＮＡを抽出する（実験操作は前記の実施例５の内容と同じである）。
【００７５】
（４）組換えプラスミドｐＴＥ２に対する酵素切断鑑定：
HindIIIとEcoRI酵素でＴＡクローンのリコンを酵素切断鑑定して、次の通り表す（単位：ｍＬ）。
【表８】
【００７６】
３７℃で４時間以上、酵素切断を行う。１．５％アガロースゲル電気泳動法で酵素切断した結果を検査した。図７のように、組換えベクターｐＴＥ２の酵素切断鑑定によると、HindIII＋EcoRI双酵素（１号サンプル）から切った２つのバンドは、それぞれ６００ｂｐと３００〜４００ｂｐ左右に位置して、HindIII単酵素（３号サンプル）から切った一つのバンドは約３００〜４００ｂｐであり、EcoRI単酵素はリコンを線形（２号サンプル）に切る。そして、Ｅ２フラグメントの中に一つのHindIII酵素認識部位が存在して、その位置はフラグメントの一方の側に近い。
【００７７】
（５）配列解析：
組換えプラスミドＰＥＧ純化法（Sambrookら，１９８９，Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）によって、プラスミドＤＮＡを抽出し、Ｔ７とＳＰ６をシークエンシングプライマーとして、ABI377 DNA Sequencer ＤＮＡ自動配列計（上海博雅公司から提供）で、表裏方向で測定を行って、２つのフラグメントの核酸配列を得る。得られたＥ２配列は、３’に偏る位置に一つのＡＡＧＣＴＴのHindIII酵素認識部位がある。
【００７８】
（ＩＩ）５’ＲＡＣＥ：
（１）５’RACE-Ready ｃＤＮＡの調製：
１）テンプレートの総ＲＮＡを取って、７５℃で５分間変性させて、迅速に氷の中に挿入して冷却する。
２）０．５ｍＬの滅菌遠心管の中に下記の試薬を添加する。
１μＬ 変性したテンプレートの総ＲＮＡ
１μＬ ５’−ＣＤＳプライマーＡ
１μＬ SMART IIA Oligonucleotide
２μＬのリボヌクレアーゼを含まない無菌水を添加して体積を５ｍＬまで補充する。
２）吸い込んで均一に混ぜて、そして短時間遠心して混合液が管底に位置するようにする。
３）７０℃で、温浴で２分置く。
４）氷浴で２分置いて、少し遠心させて下記の試薬を添加する。
【表９】
５）試薬をそっと抽出して均一に混ぜて、少し遠心させる。
６）インキュベーターの中で、４２℃で１．５時間温浴する。
７）１００ｍＬのTricine−ＥＤＴＡバッファーで産物を希釈する。
８）７２℃で、７分間培養する。
９）サンプルは−２０℃で貯蔵する。
【００７９】
（２）５’ＲＡＣＥステップ：
１）マスターミックス（Master Mix）（総体系１１０μＬ）の準備：
【表１０】
吸い込んで均一に混ぜて、短い時間で遠心する。
【００８０】
２）下表に示す順序で各成分を０．５ｍＬの無菌遠心管の中に添加する（単位：μＬ）。
【表１１】
【００８１】
３）ＰＣＲ循環プログラム：
・９４℃，１分
・５サイクル：９４℃，３０秒
７２℃，４分
・５サイクル：９４℃，３０秒
７０℃，４分
・２５サイクル：９４℃，３０秒
６８℃，４分
・７２℃，１０分
【００８２】
４）循環が終わった後に、５μＬのサンプルを取って、電気泳動検査を行って、５’ＲＡＣＥ産物であるＥ３を得る。結果は図８に示すように、５’ＲＡＣＥで一つの単一のバンドの産物を得たことを明示しており、バンドの位置はおよそ１４００〜１８００ｂｐ程度であり、これをＥ３フラグメントと命名する。
【００８３】
（３）ゴムを切って５’のＲＡＣＥ産物を回収して、ＴＡクローンし、ＣａＣｌ２法によってE.coli ＤＨ５αコンピテント細胞を調製する。ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、塩基でプラスミドＤＮＡを抽出する（実験操作は実施例５の内容と同じである）。
【００８４】
（４）組換えプラスミドｐＴＥ３に対する酵素切断鑑定：
HindIIIとEcoRI酵素でＴＡクローンのリコンを酵素切断鑑定して、次の通り表す（単位：ｍＬ）。
【表１２】
【００８５】
３７℃で４時間以上、酵素切断を行う。１．５％アガロースゲル電気泳動で酵素切断した結果、図９に示すように、組換えベクターｐＴＥ３の酵素切断鑑定によれば、HindIII＋EcoRI双酵素（１号サンプル）で、それぞれ１４００〜１０００ｂｐと３００〜４００ｂｐ左右に位置する二つのバンドが現れた。HindIII単酵素（３号サンプル）に約１４００〜１０００ｂｐである一つのバンドが現れた。また、Ｅ３フラグメントの中に一つのHindIII酵素認識部位が存在することが分かる。
【００８６】
（５）配列解析：
組換えプラスミドＰＥＧ純化法（Sambrookら，１９８９，Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）によって、プラスミドＤＮＡを取り出す。Ｔ７とＳＰ６をシークエンシングプライマーとして、ABI377 DNA Sequencer ＤＮＡ自動配列計（上海博雅公司から提供）で、表裏方向で測定を行って、Ｅ３フラグメントの核酸配列を得る。得られたＥ３フラグメントに、５’に偏る位置に一つのHindIII酵素認識部位が存在し、３’の端部に一つのHindIII酵素認識部位が存在する。
【００８７】
（ＩＩＩ）ＡＤＴＺ ｃＤＮＡ配列の接合：
ＮＣＢＩのVecscreenプログラムによりベクター配列を認識して取り除いた後、DNAMANプログラムでＥ１、Ｅ２、Ｅ３を繋ぎ合わせ、得られた配列を、ＮＣＢＩのORF Finderプログラムによってオープン・リーディング・フレーム分析を行い、長さが２．３ｋｂで、完璧なオープン・リーディング・フレームがあり、また３’末端のポリ（Ａ）尾部及び５’末端と３’末端の非翻訳領域を含む配列を得た。その結果は配列表の配列番号２に示す。ＡＤＴＺヌクレオチド配列と推定されたアミノ酸配列に対して、インターネットによって、例えばプログラムBLASTとBLASTX（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）、BLASTA配列との類似性を調べて、ＡＤＴＺが新たな遺伝子であり、更に、これによって推算されたコーディングＡＤＴＺの成熟ペプチドのアミノ酸配列と同じ配列がGENEBANKにないので、新しいアミノ酸配列であることが分かる。
【００８８】
コーディングＡＤＴＺ全長ｃＤＮＡ配列の取得は実施例６の方法に限定されず、ＡＤＴＺ短鎖ペプチドのアミノ酸配列を用いて作ったプローブによって、Armillariella tabescensのｃＤＮＡデータベースからこの配列をクローンする方法も含まれる。
【００８９】
〔実施例７：コーディングＡＤＴＺの成熟ペプチドｃＤＮＡ生成物の取得〕
実施例６で得られたコーディングＡＤＴＺ全長ｃＤＮＡ配列の両端配列を分析し、開始コドンから終止コドンまでのＡＤＴＺオープン・リーディング・フレームを得られ、更にプライマーに制限酵素認識部位EcoRI（ＧＡＡＴＴＣ）とBamHI（ＧＧＡＴＣＣ）をそれぞれ添加するように、プライマー一対を設計する。
Ｐ３：５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＣ−３’
Ｐ４：３’−ＧＴＡＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＧＧＧＡＣ−５’
【００９０】
常法によってＰＣＲ増幅を行い、ゲルから切って、ＰＣＲ生成物を回収する。詳細は以下の通りである。
【００９１】
１）マスターミックス（Master Mix）（総体系１００μＬ）の準備：
【表１３】
吸い込んで均一に混合した後、短時間の遠心分離を施す。
【００９２】
２）各成分を下表に示す順序に従って、０．５ｍＬの無菌遠心分離管に添加する（単位：μＬ）。
【表１４】
【００９３】
３）ＰＣＲサイクルプログラム：
・９４℃，１分
・５サイクル：９４℃，３０秒
７２℃，４分
・５サイクル：９４℃，３０秒
７０℃，４分
・３５サイクル：９４℃，３０秒
６８℃，４分
・７２℃，１０分
【００９４】
４）サイクルが済んだ後、サンプル５ｍＬを取って電気泳動で検査した。その結果、図１０に示すように、ＰＣＲが１８００ｂｐ付近に一つのバンドのような生成物が得られ、ＡＤＴＺ’フラグメントと命名する。
【００９５】
５）ゲルから切って、ＰＣＲ生成物を回収する。
ＰＣＲ生成物を回収する常法に従って、コーディングＡＤＴＺ成熟ペプチドのｃＤＮＡを得た。このフラグメントをＡＤＴＺ’と命名する。
【００９６】
〔実施例８：組換えプラスミドであるＡＤＴＺ発現プラスミドの組立て〕
遺伝子クローンは常法（Sambrookら，２００１，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）で行って、実施例７で得られたＡＤＴＺ’をｐＨＩＬ−Ｓ１にクローンして、発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺを組み立てた。クローンした後の標的遺伝子は酵素で切って、配列解析をする。詳しくは、操作は以下の通りである。
【００９７】
図１４に示すように、遺伝子ＡＤＴＺを含む組換えプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１の組立ては、プラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１と標的フラグメントＡＤＴＺに対して、二つ酵素EcoRI及びBamHIで切り、得られた生成物について０．８％のアガロースゲルで電気泳動を行った後、ゲルを切って回収する。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを利用し、プラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１と標的フラグメントＡＤＴＺとの結合を完成する。ＣａＣｌ２法によって、E.coli ＤＨ５αコンピテント細胞を調製した後、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を篩分けて、アルカリでプラスミドを抽出する。組換えプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺを、EcoRI＋BamHI、HindIII、SacI酵素で切ることにより確認する。組換えプラスミドを取り出し、ＰＥＧ純化法（Sambrookら，２００１，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）によって、プラスミドＤＮＡを抽出する。Ｔ７とＳＰ６を配列解析するプライマーとし、ABI377 DNA Sequencer 自動ＤＮＡシーケンサー（上海博雅公司製）を採用して、両端から同時に測定を行う。その結果、図１１に示すように、酵素切断による組換えベクターｐＳＡの確認において、EcoRIとBamHI二つ酵素が（サンプル１）２０００ｂｐ付近にあるバンドを切り出し、HindIII酵素だけが（サンプル２）１４００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐにある三つのバンドを切り出し、SacI酵素だけが（サンプル３）組換えプラスミドを切ってリニアーになり、挿しいれるフラグメントにSacI酵素認識部位がないことが分かった。
【００９８】
〔実施例９：組換えＡＤＴＺの発現〕
組換えプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺとプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１をSacI酵素で切り、得られた生成物について０．８％のアガロースゲルで電気泳動を行った後、ゲルを切って、得られたリニアー組換えプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺとプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１を回収した。Pichia Expression Kit（Invitrogen Inc.，米国）に記載するプロトプラスト法に従って、Pichia Pastoris ＧＳ１１５を形質転換して、Mut＋形質転換体を篩分けた。メタノールを単一炭素源として、組換え菌に対して誘導性発現（Pichia Expression Kitに従って操作する）を行う場合、培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析することにより、形質転換体が誘導性発現された後、培養液の上清に著しい標的タンパクバードが検出された。しかし、標的遺伝子を含まない空プラスミドを対照菌に形質転換したのち、同様な条件下で９６時間誘導すると、上清に標的タンパクバードが検出されなかった。その結果、図１２に示すように、形質転換体がメタノールで誘導性発現された後、培養液の上清に著しい標的タンパクバードが検出されたが、標的遺伝子を含まない空プラスミドを形質転換した陰性対照菌に対して、同様な条件下で誘導すると、上清に標的タンパクバードが検出されなかった。
詳しくは以下の通りである。
【００９９】
（Ｉ）組換え型とPichia pastorisの相同的組換え：
（１）リニアープラスミド：
組換えプラスミドｐＳＡとプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１をSacI酵素で切りながら、リニアープラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１を後述の実験の対照（control）とした。
酵素ｐＳＡで切る（総体系１２０）：１２ｍＬバッファーＬ＋８ｍＬ SacI＋１００ｍＬ ｐＳＡ
酵素ｐＨＩＬ−Ｓ１で切る（総体系１２０）：１２ｍＬバッファーＬ＋８ｍＬ SacI＋１００ｍＬ ｐＨＩＬ−Ｓ１
酵素で切ったサンプルについて０．８％のアガロースゲルで電気泳動を行って、ゲルを切って、得られたリニアー組換えプラスミドｐＳＡとプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１を回収した。
【０１００】
（２）プロトプラスト形質転換に用いるPichia Pastoris ＧＳ１１５の培養：
１）平板から一つのＧＳ１１５単一クローンを取って、１０ｍＬのＹＰＤ中に接種した後、１５０ｍＬの三角フラスコで、３０℃下、２５０〜３００ｒｐｍで振動して、一晩培養した。
２）昨日培養した１０ｍＬのＹＰＤ菌液からそれぞれ５、１０、２０μＬを取り出して、２００ｍＬのＹＰＤ中に接種した後、５００ｍＬの三角フラスコで、３０℃下、２５０〜３００ｒｐｍで振動して、一晩培養した。
３）三つの三角フラスコに菌液のＯＤ600を検査して、ＯＤ600＝０．２〜０．３の菌液を取って、遠心管に移行し、室温下１５００×ｇで５分遠心して、上清を捨てて、細胞を収集しプロトプラスト形質転換に用いた。
【０１０１】
（３）Pichia Pastoris ＧＳ１１５のプロトプラスト形質転換：
１）収集した培養の細胞を２００ｍＬの無菌水に懸濁して、１０ｍＬの遠心管二つに移行した。
２）室温下、１５００×ｇで５分遠心して、上清を捨てた。
３）調製したばかりのＳＥＤ １０ｍＬで沈殿を洗った後、室温下、１５００×ｇで５分遠心して、上清を捨てた。
４）１Ｍソルビトール液１０ｍＬで沈殿を洗った後、室温下、１５００×ｇで５分遠心して、上清を捨てた。
５）ＳＣＥ １０ｍＬで沈殿を懸濁した。
６）Zymolyase一管を取って、氷結した後管壁を軽く打って、溶液を均一に混合した。
７）Zymolyase ７．５μＬを取って管に加えて、３０℃の温度で３０分育てた。
８）室温下、７５０×ｇで１０分遠心し、菌体を収集して、上清を捨てた。
９）１Ｍソルビトール液１０ｍＬでプロトプラストを洗った後、沈殿を分散するように管壁を軽く打って、室温下、７５０×ｇで１０分遠心し、菌体を収集して、上清を捨てた。
１０）１０ｍＬのＣａＳで菌体を洗った後、室温下、７５０×ｇで１０分遠心し、菌体を収集して、上清を捨てた。
１１）沈殿を０．６ｍＬのＣａＳに懸濁して、このプロトプラストは必ず３０分以内に使わなければならない。
【０１０２】
（４）プロトプラスト法によるPichia Pastoris ＧＳ１１５の形質転換：
１）それぞれ１００μＬのPichia Pastorisプロトプラストを取って、Ａ、Ｂ、Ｃ三つの１５ｍＬ無菌遠心管に添加した。
２）Ａ管にＤＮＡを加えずに陰性対照とし、Ｂ管に線状化した本来のプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１ ３０μＬを加えて、Ｃ管に線状化した組換えプラスミドｐＳＡ ３０μＬを加えて、室温で１０分育て、この間に新鮮なＰＥＧ／ＣａＴ ３ｍＬを調製して備える。
３）各管に調製したばかりのＰＥＧ／ＣａＴを１ｍＬそれぞれ添加して、軽く振動し均一に混ぜて，室温で１０分育てた。
４）室温下、７５０×ｇで１０分遠心し、上清を捨てて、乾燥まで置いた。
５）沈殿を１５０μＬのＳＯＳに懸濁して、室温で２０分育てた。
６）各管に１Ｍソルビトール液を１０ｍＬそれぞれ添加して、プレートの塗装を準備した。
７）ＲＤ固体培地をプレートごと２００μＬ塗布して、２８〜３０℃で反転置いて培養し、４〜６日後、形質転換体が出現した。
【０１０３】
（５）Mut＋形質転換体の篩分け：
１）無菌楊枝でHis＋形質転換体を取って、プレートＭＭとＭＤに一対一に菌を点在させながら、ＧＳ１１５／His＋MutｓAlbumin分とＧＳ１１５／His＋Mut＋β−galとも点在させて、対照とした。
２）２８〜３０℃で反転置いて二日培養した。
３）二日後、プレートＭＭとＭＤを対照して、いずれのプレートにも良く成長したのがMut＋で、プレートＭＤに良く成長したが、プレートＭＭに少し成長した、或いは成長しなかったのがMutｓである。
【０１０４】
（６）組換え菌の誘導性発現：
１）His＋Mut＋形質転換体の一つの単一クローンを取って、２５ｍＬのＢＭＧに接種して、２５０ｍＬの三角フラスコで、２８〜３０℃下、２５０〜３００ｒｐｍでＯＤ600＝２〜６（約１６〜１８時間）まで振動しながら培養した。
２）１５００〜３０００×ｇで５分遠心して、細胞を収集して、上清を捨てた後、細胞をＢＭＭにＯＤ600＝１．０（約１００〜２００ｍＬ ＢＭＭを要する）まで懸濁して、１Ｌの三角フラスコで、２８〜３０℃下、２５０〜３００ｒｐｍで振動し、引き続き培養した。
３）２４時間毎に１００％メタノールを添加し、最終の濃度を０．５％とし、誘導性発現を維持した。
４）誘導性発現を９６時間続けた。培養液を２〜３分遠心して、上清を取って−８０℃で保存して、発現生成物の純化に用いる。
９６時間で誘導培養した上清中に総タンパク質量は０．２３ｍｇ／ｍＬであった。標的タンパクの分子量はBioEditソフトウェア（http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html）で予測した理論値７６．９５ｋＤａと一致した。
【０１０５】
〔実施例１０：組換えＡＤＴＺの純化〕
誘導発現の発酵液が７０％の飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４で沈殿して、沈殿から粗酵素サンプルを得た。粗酵素サンプルは同じ体積のＰＢＳで溶解し、遠心した後、上清を取って疎水クロマトグラフPhenyl sepharoseカラムに通導し、連続的な勾配の溶出液により溶出し、標的ピークを収集した。透析脱塩し、ＰＢＳ溶液で平衡化した後、濃縮した。濃縮した酵素液が金属キレート親和クロマトグラフChelating Sepharoseカラムに通導し、ｐＨ７．５〜６．０の非連続的な勾配の溶出液により溶出し、標的ピークを収集した。具体的には次の通りである。
【０１０６】
（１）硫酸アンモニウムで沈殿し、粗酵素を収集した。
４０％の飽和度になるまで組換え発現発酵液に（ＮＨ４）２ＳＯ４粉末を加え、４℃下、１００００ｇで２０分間遠心し、更に上清に（ＮＨ４）２ＳＯ４粉末を添加し７０％の飽和度になされ、４℃下、１００００ｇで２０分間遠心して、粗酵素サンプルを得た。
【０１０７】
（２）疎水クロマトグラフ：同じ体積の０．０２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ：６．０）溶液にＡＤＴＺ粗酵素サンプルを溶解し、４０００ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を取って、Phenyl sepharoseカラム［Phenyl sepharose 6 Fast flow（high sub），Pharmacia Biotech，Inc.］に通導し、基線まで溶液（０．０２Ｍ ＰＢＳ＋３０％飽和硫酸アンモニウム，ｐＨ：６．０）で洗った後、連続的な勾配の溶出緩衝液［Ａ液（０．０２Ｍ ＰＢＳ＋１０％飽和硫酸アンモニウム，ｐＨ：６．０）＋Ｂ液（０．０２Ｍ ＰＢＳ，ｐＨ：６．０）］により溶出し、活性ピークを収集した。透析脱塩し、Ｆ液（０．０２Ｍ ＰＢＳ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ：７．５）で平衡化した後、タンパク質の濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【０１０８】
（３）金属キレート親和クロマトグラフ：Chelating Sepharose［Chelating Sepharose Fast Flow，Pharmacia Biotech，Inc.］を予め０．２Ｍ ＣｕＣｌ２溶液で飽和させ、純水で基線まで洗った後、更にＦ液（０．０２Ｍ ＰＢＳ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ:７．５）で洗って基線に安定させた。疎水クロマトグラフを行った標的ピークサンプルをカラムに通導し、別々に非連続的なｐＨ勾配の緩衝液Ｇ液［０．０２Ｍ ＰＢＳ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ:７．５〜６．０の非連続的なｐＨ勾配の緩衝液（０．５のｐＨ単位毎に増加させた）］により溶出し、標的ピークを収集した。標的ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で鑑定した。
【０１０９】
その結果、誘導性発現をした１Ｌの発酵液が以上の純化をした後、純化した組換えＡＤＴＺが５８ｍｇ得られた。純度は９５％以上になる。
【０１１０】
〔実施例１１：組換えＡＤＴＺの活性の鑑定〕
組換えＡＤＴＺの活性の鑑定は実施例２の方法Ｉに従って行った。反応系：（１）活性化酵素群：１μＬのＡＦＢ１溶液（ＡＦＢ１メタノール溶液：０．５μｇ／μＬ、窒素ガスで揮発した）＋組換え発現ＡＤＴＺ酵素液（タンパク質の含有量：０．１ｍｇ／ｍＬ）３００μＬ＋０．５μＬ ＭｇＳＯ４＋１０μＬ ＰＥＧ２００；（２）不活性化酵素群：１μＬのＡＦＢ１溶液（ＡＦＢ１メタノール溶液：０．５μｇ／μＬ、窒素ガスで揮発した）＋不活性化した組換え発現ＡＤＴＺ酵素液（タンパク質の含有量：０．１ｍｇ／ｍＬ、予め１００℃で５分間水浴した）３００μＬ＋０．５μＬ ＭｇＳＯ４＋１０μＬ ＰＥＧ２００；（３）緩衝液対照群：１μＬのＡＦＢ１溶液（ＡＦＢ１メタノール溶液：０．５μｇ／μＬ、窒素ガスで揮発した）＋ＰＢＳ緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ：６．６）３００μＬ＋０．５μＬ ＭｇＳＯ４＋１０μＬ ＰＥＧ２００；反応系を均一に混合して、３０℃で１時間水浴した後、管内のＡＦＢ１総量が２μｇになるまで、１時間毎にＡＦＢ１を０．５μＬそれぞれ添加した。その後、引き続き６時間反応させた。反応が済んだ後、実施例２の方法Ｉに従って点板展開し検査した。
【０１１１】
その結果は、組換えＡＤＴＺで処理したＡＦＢ１生成物のＲｆ値が１（＝０．９３）に近づき、天然ＡＤＴＺの結果と似て、組換えＡＤＴＺがＡＦＢ１を転化する活性を有することである。結果を図１３に示す。組換えＡＤＴＺで処理すると、ＡＦＢ１生成物のＲｆ値が１（＝０．９３）に近づき、天然ＡＤＴＺの結果と似て、組換えＡＤＴＺがＡＦＢ１を転化する活性を有することが分かった。
【０１１２】
〔実施例１２：組換えＡＤＴＺのＡＦＢ１に対する解毒生物活性の鑑定〕
組換えＡＤＴＺの活性の鑑定は実施例２の方法ＩＩに従って行った。天然ＡＤＴＺの代わりに組換え発現ＡＤＴＺを用いた以外、他の群が同様な設計と操作で、試験を受けたサンプルを調製した。その結果、活性組換えＡＤＴＺで処理した群の細菌復帰突然変異コロニーの数は陰性対照群（ＤＭＳＯ対照群）と近似していた（いずれのＭＲ値も２未満）。緩衝液処理対照群と不活性化組換えＡＤＴＺ処理群は、細菌復帰突然変異コロニーの数が陰性対照群（いずれのＭＲ値も２以上）より著しく高いが、陽性対照群（アフラトキシンＢ１対照）と著しい差がなかった。組換えＡＤＴＺはＡＦＢ１に引き起された突然変異を抑制する生物活性作用を有することが分かった。結果を下表に示す。
【０１１３】
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】純化したＡＤＴＺのＰＡＧＥ電気泳動の結果である。Ｍ：標準分子量タンパク質；１，２：ＢＳＡ（小牛の血清アルブミン）；３：硫酸アンモニウムで沈殿した粗酵素成分；４：純化したＡＤＴＺ。
【図２】純化したＡＤＴＺのＡＦＢ１を転化する作用の薄層クロマトグラフで検査した結果である。１：ＡＦＢ１標準品；２，３：ＰＢＳ緩衝液対照群；４：不活性化のＡＤＴＺでＡＦＢ１を処理する対照群；５：ＡＤＴＺでＡＦＢ１を処理する群；６：ＡＦＢ１標準品。
【図３】Armillariella tabescensの総ＲＮＡを電気泳動した結果である。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲ生成物の電気泳動結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；Ｅ１：ＲＴ−ＰＣＲ生成物。
【図５】組換えベクターｐＴＥ１の酵素切断鑑定した結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；１：Pte1/HindIII＋EcoRI；２：pTE1/EcoRI；３：pTE1/HindIII。
【図６】３’ＲＡＣＥ生成物の電気泳動による検査結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；Ｅ２：３’ＲＡＣＥ生成物。
【図７】組換えベクターｐＴＥ２の酵素切断鑑定した結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；１：pTE2/HindIII＋EcoRI；２：pTE2/EcoRI；３：pTE2/HindIII。
【図８】５’ＲＡＣＥ生成物の電気泳動による検査結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；Ｅ３：５’ＲＡＣＥ生成物。
【図９】組換えベクターｐＴＥ３の酵素切断鑑定した結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；１：pTE3/HindIII＋EcoRI；２：pTE3/EcoRI；３：pTE3/HindIII。
【図１０】End to end ＰＣＲ生成物の電気泳動による検査結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；ＡＤＴＺ’：ＰＣＲ生成物。
【図１１】組換えベクターｐＳＡの酵素切断鑑定した結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；１：pSA/BamHI＋EcoRI；２：pSA/HindIII；３：pSA/SacI。
【図１２】発現生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。１：９６時間で誘導した陰性対照菌；２：標準分子量タンパク質；３：ＢＳＡ（小牛の血清アルブミン）；４：２４時間で誘導した組換え菌；５：４８時間で誘導した組換え菌；６：７２時間で誘導した組換え菌；７：９６時間で誘導した組換え菌。
【図１３】組換えＡＤＴＺのＡＦＢ１を転化する活性をＴＬＣで検査した結果である。１：ＡＦＢ１標準品対照；２：組換えＡＤＴＺ処理ＡＦＢ１群のサンプル；３：不活性化の組換えＡＤＴＺ処理ＡＦＢ１対照群のサンプル；４：緩衝液対照。
【図１４】ＡＤＴＺ組換え型の組立て、及びそれとPichia pastorisの相同的組換えのフローチャートである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素、及びこの酵素をコーディングする遺伝子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アフラトキシン（Aflatoxin，ＡＦＴ）は毒性が非常に強い真菌毒素であって、毒性を引き起こすラジカルが同じく、且つ構成が類似であるアフラトキシンＢ１（Aflatoxin Ｂ１，ＡＦＢ１）、アフラトキシンＭ１（Aflatoxin Ｍ１，ＡＦＭ１）、アフラトキシンＧ１（Aflatoxin Ｇ１，ＡＦＧ１）等を含み、有毒菌株アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・パラジチカス及び他のかび菌（例えば、アスペルギルス・ウェンティ−）等から発生する。アフラトキシンは、穀物、飼料、食品に広く存在し、人類に対して、（１）ＡＦＴに汚染された食品をもし食用する前にＡＦＴを除去しなかったら、食べた者に直接損害を与え、或いは、ＡＦＴが汚染された飼料を通じてフードチェーンを経由して鳥類・家畜肉、乳製品等を食べる人間に間接損害を与えて、直接または間接的に急性中毒を起こしたり或いは人類の癌を誘発する；（２）鳥類・家畜が汚染された飼料を摂取したら、軽い結果としては中毒され、直接な結果としては動物の体重の低下を引き起こしたり、或いは他の病気を誘発し、間接な結果としてはフードチェーンを通じて人類の慢性中毒を起こして、癌を誘発し、重い場合は死亡を起こす；（３）ＡＦＴに汚染された食糧、穀物を食べ又は飼養することができないので、廃棄処分しなければならない、等の主な危害を与える。
【０００３】
アフラトキシンがこのような危害があるので、長い間、ＡＦＴの解毒技術が人々に注目されてきた。ＡＦＴの転化方法として下記方法がある。例えば、（１）アンモニア処理法：水を含む飼料に用いるが、処理した後で多量のアンモニアが食品に残存するので、米国ＦＤＡではこの方法で食品加工を行うことを禁止し、飼料中にも多量のアンモニアが含まれたので利用に影響を与えた。（２）ＮａＯＨ法（植物油粗製でＡＦＴを取り除くために用いる）：設備の投資が大きく、燃費が大きく、コストが高いので、現在次第に淘汰される。（３）白土吸着方法：労働強度が強く、白土のほこりと燃費及び環境汚染等の問題があるので、現在は大体淘汰された。（４）混合溶媒抽出法：この方法は落花生の粉や綿実等の固形食品からＡＦＴを取り除くために用いるが、抽出、溶媒の回収と処理際の費用が非常に高いので、広める価値がない。（５）高温法：この方法は処理されたサンプルを２６８℃以上に加熱することによりＡＦＴを破壊するが、通常の加熱法であるとこの温度に達成しにくく、また、温度が高すぎると、食品の他の栄養成分を破壊する問題があって、実際にあまり応用しない。（６）生物学的方法：この方法はカッキン（活菌）或いは固定化細菌を利用してＡＦＴを分解するが、カッキンにより原料の栄養成分が分解され、更に分解した新しい生成物及びこの生成物の毒性が明らかでないため、この方法は僅かの飼料と落花生油の解毒だけに用いられる。例えば、１９９６年の広東微生物所からの報告によると、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）菌を固形発酵した後のものを用いて解毒に適用するＢＤＡ生物製剤を製造したことがある。（７）紫外線法：紫外線の強い酸化作用を利用してＡＦＴを破壊するが、効果が不安定で、且つエネルギーの消耗も大きい。（８）超濾過法：このような方法は非均相だけに用いられ、均相、酸性化の牛乳については無効で、更に高い技術を要し、設備の費用が非常に高いので、今まで実際的な応用価値がない。（９）生物酵素法：ある学者からの報告（Brown DWら，Proc．Natl．Acad．Sc.，ＵＳＡ，１９９６）によると、大腸桿菌の中で肝チトクロームＰ４５０酸化酵素をクローン（clone）発現して、アフラトキシンの代謝を強める酸化酵素を用いて、体内に入って活性化されたＡＦＴに対して転化解毒作用を行い、これにより体内に入ったＡＦＢ１を低減する目的を実現する。
【０００４】
これらの処理方法において、物理化学的な手段でＡＦＴを転化する方法は強いため、処理された穀類、飼料、食品等の利用価値が小さくなり、効率も比較的に低く、コストの視点から言っても工業上に適用される方法ではない。また、体内でＰ４５０酸化酵素を高める方法はＡＦＢ１の代謝を強めることができるが、従って人に対する危険性も増加した。生物酵素触媒法は、もっと強い専一性、高転化効率という特徴を具備したので、ＡＦＴを直接に転化させる生物酵素の開発を検討している。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素、及びこの酵素をコーディングする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
このような酵素を得るために、本発明者は篩い分けにより得た１株のかび菌から、ＡＦＢ１を転化する生物酵素を純化し、またＤＮＡの組換え技術を介して、１種の形質転換体の中で、ＡＦＢ１を転化する活性を有するタンパク質を製造した。従って、本発明者は、初めて前記活性の有する新型のタンパク質を分離、純化して、アフラトキシン解毒酵素（Aflatoxin-detofizyme，ＡＤＴＺ）と命名した。
【０００７】
本発明は、純化と配列解析を介してアフラトキシン解毒酵素（Aflatoxin-detofizyme，ＡＤＴＺ）の遺伝子の特異性プライマーを得、ナラタケモドキ（Armillariella tabescens）の総ＲＮＡから、クローンによって、ＡＤＴＥをコーディングし、且つ今まで報告したことがない新遺伝子を得ており、更に遺伝子工学技術を用いて、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）発現系の中に組換えＡＤＴＺタンパク質を発現、純化する。選ばれた真菌はArmillariella tabescensで、中国普通微生物菌種保蔵管理中心から取り出したものである。
【０００８】
ＡＤＴＺの純化：先ず、菌体をつぶし、硫酸アンモニウム沈殿法によってタンパク質沈澱を行い、沈殿サンプルは高速タンパク質液相クロマトグラムによって目的ピークを得る。
ＡＤＴＺ短鎖Ｎ末端のアミノ酸配列の獲得：目的ピークに対して質量スペクトル解析を行って、短鎖ペプチドＮ末端のアミノ酸配列を得る。
【０００９】
本発明において、Armillariella tabescensの総ＲＮＡの抽出を行う。上述の短鎖ペプチドＮ末端のアミノ酸配列によってプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲとＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥを行い、得られたＡＤＴＺ遺伝子の配列の長さは約２．３ｋｂで、分析によると、配列には完全なオープン・リーディング・フレームと、３’末端及び５’末端の非翻訳領域とが含まれる。ＡＤＴＺ成熟ペプチドの全長ｃＤＮＡ２０８８個のヌクレオチドをコーディングし、６９５個のアミノ酸をコーディングし、それの分子量が約７３〜７７ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法）で、等電点（ｐＩ）が５．３〜６．８の間である（等電点電気泳動）。アミノ酸及びＤＮＡ配列は配列表に示す通りである。例えば一部のアミノ酸を除いて、置換して、修飾し、又は付加した後生成した産物等の修飾産物も、本発明のタンパク質の範囲に含まれる。
【００１０】
また、本発明の他の目的として、上述のような遺伝子を含む発現ベクター及び該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより得られる形質転換体を提供する。更に、形質転換体を培養する工程と、発現されたアフラトキシン解毒酵素を回収する工程を備えるアフラトキシン解毒酵素の製造方法も提供する。
【００１１】
本発明において、一対のプライマーを設計することによって、Armillariella tabescensのｃＤＮＡからＡＤＴＺ成熟ペプチドをコーディングする遺伝子を増幅し、真核組込型分泌発現ベクターにクローンする。例えば、ｐＨＩＬ−Ｓ１に基づいて発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺを構成し、また、組換え発現ベクターをPichia Pastoris ＧＳ１１５に形質転換する。該発現ベクターは、ＡＯＸをプロモーターとする。培養時間と誘導時間の探査によると、ＡＤＴＺの発現量は培地総タンパク質の２５％以上を占め、可溶の状態になる。
【００１２】
本発明で用いた真核発現ベクターは、例えば、ＰＡＯ８１５、ＰＰＩＣ３Ｋ、ＰＰＩＣＺ、ＰＨＷＯ１０、ＰＧＡＰＺ、又は分泌型ベクター、及びＰＰＩＣ９Ｋ、ＰＰＩＣＺα、ＰＧＡＰＺα、又は市販の同種のベクター等の細胞内型ベクターから選ぶことができる。なお、本発明で用いた真核発現菌株も、Pichia Pastoris ＫＭ７１、ＭＣ１００−３、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６５、ＳＭＤ１１６３等から選んで宿主細胞とする。
【００１３】
本発明は、原核発現系を用いても実現でき、ｐＥＴ、ｐＵＣＨ３３等、或いは市販の同類のベクターから何れかを選んで発現ベクターとし、大腸菌ＢＬ２１、大腸菌ＪＭ１０９等から何れかの原核発現菌株を選んで宿主細胞とする。
【００１４】
発現ベクターの複製方法：Sambrookらの方法（Sambrookら，２００２，Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）を参照し、ＣａＣｌ２法に応じてコンピテント細胞E.Coli ＤＨ５αを調製、形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む培地で細胞を培養してから、塩基法でプラスミドを抽出する。
【００１５】
本発明では、組換えＡＤＴＺの純化条件も探査した。発酵もろみ液を硫酸アンモニウム沈殿した後、疏水クロマトグラフィーと金属親和クロマトグラフィーの二段階純化法を利用して組換えＡＤＴＺを得て、組換えタンパク質の純度が９５％以上に至る。
【００１６】
本発明の他の目的として、飼料及び食品の製造中に前記アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いて脱毒するアフラトキシンの脱毒品を提供する。現在の飼料と食品の加工プロセスに合わせて、本発明で述べたようなアフラトキシンを転化する活性の有する解毒酵素を、脱毒剤として飼料中に添加することにより飼料の脱毒を行い、或いは固定化酵素に調製して、落花生油の脱毒に用いる。
【００１７】
本発明のまた他の目的として、調製中に前記アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いたアフラトキシンによる癌を予防と治療する薬物提供する。現在の抗癌薬のプロセスに合わせて、本発明で述べたアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を添加することによって、アフラトキシンが誘発した癌の予防と治療に用いる薬物を得る。
本発明において、発明者は、初めてこのタンパク質をコーディングする遺伝子を分離、偏析した。また、発明者はこの遺伝子を一種の発現ベクターに組み込んで、一種の形質転換体を生成し、更に、この形質転換体に基づいて、ＡＤＴＺタンパク質の製造を成功的に実現することができた。活性鑑定実験によれば、組換えＡＤＴＺが天然ＡＤＴＺと類似なアフラトキシンを転化する生物活性を有することが証明される。組換えＡＤＴＺのＡＦＢ１解毒生物活性に対する鑑定実験によれば、組換えＡＤＴＺが、ＡＦＢ１の異常（aberration）作用を低下させ、ＡＦＢ１が引き起こす突然変異を抑制する生物活性作用を有することが証明される。本発明は、これからの飼料加工、食品加工及び抗癌薬の開発において、優れた基礎を築いた。
【実施例】
【００１８】
〔実施例１：ＡＤＴＺの獲得及び純化〕
（Ｉ）菌体の発酵培養：
１）菌種：Armillariella tabescens
２）前記菌種を液体培地（馬鈴薯抽出液１Ｌ、グルコース２０．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．５ｇ、微量のビタミン、ｐＨ６．６）で合計２５日培養して、一級〜三級をそれぞれ６日、４日、４日培養し、四級は１１日培養し、培養温度を２４〜２８℃として、菌体を収集した。
【００１９】
（ＩＩ）アフラトキシン解毒酵素（ＡＤＴＺ）の抽出：
新鮮な菌体を液体窒素凍結した後に小さい塊に打って、１：１（Ｗ／Ｖ）の比例でリン酸塩緩衝液を加えて、氷浴の中でホモジネートし、超音波で細胞を滅裂した後に、１１０００〜１２０００ｇ遠心力で遠心分離法により沈殿物を除去し、それから２０〜８０％飽和の硫酸アンモニウムで分別沈殿し、最後に沈殿物を取り出す。ｐＨ６．０，０．０２mol／Ｌのリン酸緩衝液で溶解懸濁して、ブラッドフォードタンパク質分析（Bradford法）し、また、ＡＦＢ１ ＥＬＩＳＡキットでタンパク質の成分の酵素活性を検査して、アフラトキシン解毒酵素（ＡＤＴＺ）を含む酵素液を得る。
【００２０】
（ＩＩＩ）ＡＤＴＺの純化：
（１）酵素サンプルの準備：
粗酵素液を４０倍体積のリン酸緩衝液（ｐＨ６.０，０．０２mol／Ｌ）で透析脱塩し、ポリエチレン・グリコール−２００００で透析濃縮して、また、０．４５μｍマイクロフィルムで濾過してから、ブラッドフォードタンパク質分析する（Bradford法）。
【００２１】
（２）高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）純化酵素：
文献（Ion Exchange Chromatography principles and methods，Pharmacia Co.編，Pharmacia Co.，１９８４，pp.２９〜３１；及びChromatofocusing with PolybufferTM and PBETM，6．Experimental，Pharmacia Co.編，Pharmacia Co.，１９８４，pp.１１〜２４）記載の方法によって、イオン交換クロマトグラムと、等電点電気泳動法クロマトグラフィーカラム填料と、緩衝液とを選んで、操作請求に従って、イオン交換クロマトグラム及びフォーカスクロマトグラムを、すべてFPLC System（Pharmacia Biotech Co.，米国）により行う。詳細は以下の通りである。
【００２２】
（ｉ）陰イオン交換クロマトグラム：
１）試薬：
ｐＨ６．０，０．２mol／Ｌリン酸塩貯蔵緩衝液
Ａ液：ｐＨ６．０，０．０２mol／Ｌのリン酸緩衝液
Ｂ液：ｐＨ６．０，０．０２mol／Ｌ＋１Ｎ ＮａＣｌのリン酸緩衝液
【００２３】
２）カラムの準備：
DEAE-Sephadex ５０ｍＬを、２倍の体積のリン酸塩緩衝液と十分に攪拌洗浄した後に、２０分間静置し、そして小型真空ポンプで上清を引出して、相同な操作をして洗浄を繰り返し、また、相同の条件で５回繰り返して洗浄した後に、０．６ｍＬ／分の流速で規格が２０×３０ｃｍであるカラムに充填する。
【００２４】
基線が０付近に安定するようＡ液で当該カラムを平衡化する。酵素サンプル２０ｍＬ（２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含む）を予めカラムに通導して、DEAE-Sephadexイオン交換カラムを通過させる。塩化ナトリウム勾配溶出：Ａ液で２時間溶出して、またＡ液及び０〜８０％のＢ液で５時間溶出した後に、１００％のＢ液で２時間溶出する。且つ流速を０．６ｍＬ/分とする。そして、フラクションコレクターで収集する。紫外線ＯＤ280nmモニターする。ポリエチレン・グリコール−２００００で透析濃縮して脱塩してから、ブラッドフォードタンパク質分析し（Bradford法）、別々に各タンパク質成分の転化ＡＦＢ１活性を測定して、活性成分を受け取る。以上の操作を繰り返して、活性成分を収集する。
【００２５】
（ｉｉ）フォーカスクロマトグラフィー：
１）試薬：
溶出液：PolybufferTM 74（Pharmacia Co.製），２５０ｍＬ包装。１００ｍＬを取って純水を添加して１０００ｍＬまで薄め、４℃の条件に保存して予備用とする。
最初緩衝液：ｐＨ７.４，０．０２５mol／Ｌのイミダゾール−ＨＣＬ緩衝液
２）カラム：
Mono-ｐTM ＰＢＥ９４，５×２０ｃｍ予め装填カラム（Pharmacia Co.製）。
【００２６】
Polybuffer 74で、前記イオン交換クロマトグラム純化を経由した後の酵素液６ｍＬ（タンパク質３ｍｇ／ｍＬを含む）を平衡化させる（平衡化した後は６.５ｍＬである）。最初緩衝液でMono-ｐカラムを２時間平衡化させ、Polybuffer 74溶離液でカラムを通過させて、２ｍＬ酵素液サンプルを通導し、またPolybuffer 74溶離液で１０時間溶離する。且つ流速を０．２ｍＬ／分とする。紫外線ＯＤ280nmモニターを施してクロマトグラムを記録し、また、フラクションコレクターで受け取って、２ｍＬ／管（即ち、１０分／管）に設定する。ブラッドフォードタンパク質分析し（Bradford法）、各タンパク質成分の転化ＡＦＢ１活性を別々に測定する。活性成分を収集する。
【００２７】
ＡＵ値が０に返るまで、０．１mol／Ｌのリン酸でカラムを洗って、再びＡＵ値が０に返るまで、１mol／ＬのＮａＣｌでカラムを洗って、また、最初緩衝液でカラムを平衡化させて一晩おく。前記の条件でフォーカスクロマトグラム操作を繰り返して、活性成分を収集する。
【００２８】
（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡ法による活性成分の検査：
収集した各成分について別々にＡＦＢ１を取り扱い、ＥＬＩＳＡ法によって処理をしたサンプルの中のＡＦＢ１の量を検査し、１００℃の条件で１０分間沸騰した同じ成分を対照するが、ＡＦＢ１を減少させることができる成分が活性の成分である。詳細は以下の通りである。
【００２９】
１）サンプルの準備：
不活性化酵素液群：ＡＦＢ１ ２００ｕｌ（濃度２．５ｎｇ／ｍＬメタノール）＋不活性化酵素液２００ｕｌ（１．２ｍｇ／ｍＬ）
活性酵素液群：ＡＦＢ１ ２００ｕｌ（濃度２．５ｎｇ／ｍＬメタノール）＋活性酵素液２００ｕｌ（１．２ｍｇ／ｍＬ）
質量制御群：ＡＦＢ１ ２００ｕｌ（濃度２．５ｎｇ／ｍＬメタノール）＋緩衝液２００ｕｌ（１．２ｍｇ／ｍＬ）
不活性化酵素液の調製：成分を１００℃で１０分間煮沸させる。
【００３０】
均等に混合して、３０℃の条件で３０分間反応させ、また１５分間煮沸させて５分間３０００ｇ遠心力で沈殿物を除去し、サンプルを調製した後にＥＬＩＳＡキット（AgraQuantTM Total Aflatoxin Assay 4/40，ROMER社製，米国）の操作仕様書によって操作し、標準曲線によって処理した後の産物の中に含まれているＡＦＢ１を算出する。収集した各成分を検査して、サンプルの中のＡＦＢ１が減少させ得る成分が活性のある成分となる。検査結果：活性のある成分の活性酵素液処理のサンプルの中で、ＡＦＢ１は１．２３０±０．５０８ｎｇ／ｍＬであり、活性のある成分の不活性化酵素液処理のサンプルの中で、ＡＦＢ１は２．４３６±０．３２６ｎｇ／ｍＬであり、質量制御群は２．５０８±０．２０３ｎｇ／ｍＬである。
【００３１】
活性ピークは、非還元性条件の下に電気泳動（ＰＡＧＥ）するが、これは単一のバンドであることを表明する。結果は図１の通りである。
得られたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した結果、分子量が約７３〜７６ｋＤａであり、等電点電気泳動によって分析した結果、等電点（ｐＩ）が約５．３〜６．８である。
【００３２】
〔実施例２：純化したＡＤＴＺ活性の鑑定〕
（Ｉ）ＡＤＴＺでＡＦＢ１を転化する活性の鑑定：
中国予防医学科学院の標準処点（食品衛生国家標準集，中国予防医学科学院標準処編，北京，中国標準的出版社，１９９８年版，pp.４１０〜４１５）及び▲ジェー▼永信（薄層クロマトグラフの食品分析への応用，▲ジェー▼永信，陸氷真編集，北京大学出版社，１９９１年版，pp.１１８〜１２３）が報告した方法に従って、薄層クロマトグラフ法により、ＡＤＴＺで処理したＡＦＢ１に対して検査・測定を行って、純化したＡＤＴＺ活性を鑑定する。具体的な方法は次の通りである。
【００３３】
（１）実験群：
１．５ｍＬの遠心管一つを取って、１μＬのＡＦＢ１溶液（ＡＦＢ１メタノール溶液：０．５μｇ／μＬ，アフラトキシンＢ１，Alexis Biochemicals Inc.，スイス）を添加して、窒素ガスを蒸着する。別々にＡＤＴＺ酵素の液体（タンパク質の含有量：０．１ｍｇ／ｍＬ）３００μＬ、ＭｇＳＯ４ ０．５μＬ、ＰＥＧ２００ １０μＬを添加して、十分に混ぜる。３０℃の水浴の中で１時間反応させて、試験管の内のＡＦＢ１総量が２μｇになるように、以降毎時間ずつ各容器へ０．５μＬのＡＦＢ１溶液を添加する。添加を完了した後、更に２時間反応させる。
【００３４】
（２）対照群：
１．５ｍＬの遠心管一つを取って対照群１と表記し、１μＬのＡＦＢ１溶液を添加してから、窒素ガスを蒸着する。別々に、３００μＬの酵素溶液（前もって１００℃水浴で５分間非活性化する）、ＭｇＳＯ４ ０．５μＬ、ＰＥＧ２００ １０μＬを添加した後、十分に混ぜる。１．５ｍＬの別の遠心管を取って対照群２と表記し、１μＬのＡＦＢ１溶液を添加してから、窒素ガスを蒸着する。別々に、３３００μＬのＰＢＳ緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ６．６）、ＭｇＳＯ４ ０．５μＬ、ＰＥＧ２００ １０μＬを添加して十分に混ぜる。後続操作は実験群と同じである。
【００３５】
以上のように、実験群と対照群の反応を行った後に、それぞれ２倍体積のクロロホルムを添加して二回抽出する。また、４５℃の条件と窒素の下で抽出物を蒸着して、１ｍＬのメタノールを添加して抽出物を十分に溶解させる。こうして、実験群サンプル（活性酵素群）、対照群１（修飾酵素群）、対照群２（緩衝液対象群）を得た。
【００３６】
（３）薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）で反応産物を検査する：
新しく活性化（１００℃，２時間）したプレハブシリカゲルの薄層板（１０×１０ｃｍ，６０Å，Whatman，ＵＳＡ）を取って、薄層板の上でサンプルをポイントして、ポイントをへりから１ｃｍ離れ、ポイントの間隔を１ｃｍとする。左から右に：第１ポイントは１０μＬ，２５μｇ／ｍＬのＡＦＢ１クロロホルム溶液であり；第２、３ポイントはそれぞれ１０μＬの対照群２であり；第４ポイントは１０μＬ，２号の対照群１であり；第５ポイントは１０μＬの実験群であり；第６ポイントは１０μＬ ２５μｇ／ｍＬのＡＦＢ１クロロホルム溶液である。
【００３７】
展開：展開溝の内に１０ｍＬの無水エーテルを展開して、取り出して揮発乾燥する。
観察：波長が３６５ｎｍである紫外線の下で蛍光を観察して、写真を撮る。結果は図２に示す通りである。
結果によると、ＡＦＢ１の標準品（１、６）と酵素の非活性化対照（４）とＰＢＳ緩衝液対照（２、３）について、エーテルが展開する時すべてただ微小な移動のみが発生したが、ＡＤＴＺ処理を行った後のＡＦＢ１産物のＲｆ値は１に近づいている（＝０．９５）。これで、解毒処理をした後のＡＦＢ１が、その極性が著しく減少して、ＡＦＢ１と明らかに異なり、純化して得たＡＤＴＺがＡＦＢ１を転化する活性を有することを説明する。
【００３８】
（ＩＩ）ＡＦＢ１に対するＡＤＴＺの解毒生物活性の鑑定：
エームス・ネズミチフス菌バイオアッセイ試験（Ames実験）は中華人民共和国衛生部薬政局の公布する方法（中華人民共和国の衛生部薬政局が編集、新薬（西洋式薬）の臨床研究指導集（薬学、薬理学、毒理学），１９９３年７月）に従って行う。具体的な方法は次の通りである。
【００３９】
（１）菌株のテスト：
ヒスチジンの栄養欠陥型のネズミのチフスサルモネラ菌株ＴＡ９８（衛生部薬品生物製品検定所から引用）であり、−８５℃（零下８５℃）の低温の冷蔵庫で保存して、テストの前で採用の菌の株に対して遺伝子型鑑定及び自発回変数の測定を行って、生物学の鑑定は合格で、実験要求に符合する。
【００４０】
（２）肝Ｓ９の調製：
（ｉ）ＳＤラット誘導：ＳＤラットを一周間検疫して病気がないことを確定して、ポリ塩化ビフェニルでトウモロコシ油を混濁し、腹腔注射（５００ｍｇ／ｋｇ体重）して、５日後の死刑を決め、死刑に処する前に１２時間断食する。
（ｉｉ）Ｓ９成分の調製：上述のように誘導したＳＤラットに対して首を切って血を落ち、また、無菌の条件で肝臓を取って、重さを量り、肝臓を冷たい０．１５mol／Ｌ（以下同じ）ＫＣｌにより洗浄する。１ｇ肝臓に３ｍＬの割合で添加してホモジナイザーで均質化してから、各組織の均質化時間を一致させる。均質液を０℃で、９０００ｇ遠心力で２０分間遠心して、上清液を取る。無菌を証明した後に−８５℃の冷蔵庫に貯蔵して備え付けておく。
【００４１】
（３）Ｓ９混合液の調製：
下記Ａ、Ｂ、Ｃ液とＳ９成分を混合して、４℃の条件で保存して４時間以内に使う。
Ａ液：（０．２mol／Ｌ，補酵素ＩＩ，濾過滅菌）０．２ｍＬ
Ｂ液：（０．２mol／Ｌ，グルコース６−リン酸，濾過滅菌）０．２５ｍＬ
Ｃ液：８．５５ｍＬ
Ｃ液組成（０．４mol／Ｌ ＭｇＣｌ２ ２０ｍＬ，１．６５mol／Ｌ ＫＣｌ ２０ｍＬ，０．２mol／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５００ｍＬ，蒸留水３１５ｍＬ，混ぜた後に濾過滅菌する）。
Ｓ９成分：１．００ｍＬ
【００４２】
（４）試験サンプルの調製：
３０ｍＬの反応体系において、ＡＤＴＺ濃度が０．２ｍｇ／ｍＬで、ＡＦＢ１の濃度が０．２ｍｇ／ｍＬで、ｐＨ値が６．０であるが、２８℃の下で１２０分間反応して、体系を１０倍拡大する。反応後に、同等体積のクロロホルムでアフラトキシンＢ１副産物と未反応の残留物を３回抽出して、有機相を合併し、更に、４０℃で減圧してクロロホルムを揮発乾燥する。また、３．７５と３ｍＬのＤＭＳＯで抽出物（活性酵素処理反応群）を洗浄し、活性ＡＤＴＺの代わりに予めクロロホルムで非活性化させたＡＤＴＺによって、同等の条件下にアフラトキシンＢ１（非活性化する酵素処理対照群）を処理する；活性ＡＤＴＺ酵素液の代わりに緩衝液により、同等の条件下にアフラトキシンＢ１（緩衝液処理対照群）を処理する。以上のサンプルを全部−１５℃の条件で保存する。
【００４３】
（５）エームス・ネズミチフス菌バイオアッセイ試験：
サンプルのＤＭＳＯ溶液と一夜培養した菌液及びＳ９を上層寒天培養基の中に添加して均一に混ぜる。また、４０℃の条件で下層Vogel選択培地に倒れて置き、凝固した後に３７℃のインキュベーターで７２時間培養して、培養皿毎に現れる復帰突然変異コロニーの数を算出する。
群毎にテストする時、各群の抽出液及び陰陽性対照を全部３つの平皿に設けて、１回繰り返す。各群の抽出液の結果は、２回６群の平均値である。実験結果は、復帰コロニーの数、突然変異率（ＭＲ＝サンプル復帰コロニーの数／陰性対照復帰コロニーの数）、及び抑制率（％）［＝｛１−（被験サンプル復帰コロニーの数−陰性対照群復帰コロニーの数）／（ＡＦＢ１対照群復帰コロニーの数−陰性対照群復帰コロニーの数）｝−１００％］によって表示される。
【００４４】
（６）結果評価基準：
溶剤対照群が正常な範囲内であれば、受検物は３個濃度以上に陽性用量反応があり、最大の増加値は溶剤対照値の２倍（即ちＭＲ≧２）であって、致突然変異陽性と考えられる。
【００４５】
（７）結果：
活性ＡＤＴＺ処理反応群の細菌復帰突然変異コロニーの数は、陰性対照群（ＤＭＳＯ対照群）に近づいている（ＭＲ値が全部２より小さい）。緩衝液処理対照群と不活性化ＡＤＴＺ処理対照群の細菌復帰突然変異コロニーの数は、陰性対照群（ＭＲ値が全部２より大きい）より顕著に高い、陽性対照（アフラトキシンＢ１対照）の細菌復帰突然変異コロニーの数に比べて顕著な相違がない。これは活性ＡＤＴＺ処理反応群の被試験物が誘発遺伝子突然変異作用を有しないことを表明している。ＡＤＴＺはＡＦＢ１の突然変異を抑制する生物活性作用を有することを表す。結果は次の表の通りである。
【００４６】
【表１】
【００４７】
以上の表によると：突然変異誘発実験はラットの肝臓Ｓ−９混合物を含むSalmonella typhimuriurmn ＴＡ９８を試験菌として行う。突然変異実験に用いるＡＦＢ１対照群の濃度は０．８ｍｇ／５０ｍＬ ＤＭＳＯ／平板である。また、ＡＦＢ１酵素処理後のサンプルは毎板に対しても、ＡＢＦ１と同様な量に相当する量で実験を行って、そして同様な量のＤＭＳＯを維持する。平板に２８時間培養した後に、数を数えて、結果を４つの平板の平均値±ＳＤで表示する。
【００４８】
〔実施例３：ＡＤＴＺ短鎖ペプチドアミノ酸配列の獲得〕
実施例１で純化して得られた活性成分のピークの先を収集して、或いは活性成分をＰＡＧＥ電気泳動して、目的バンドを収集し、Ｑ−ＴＯＦ２（電子スプレー−４極竿飛行時間−タンデム質量スペクトル解析）機器（イギリスMicromass社，軍事医学科学院器具テスト分析センターから提供）を採用してＡＤＴＺ短鎖ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列を測定する。得られたアミノ酸配列は次の通りである。
Ｍ１：ＥＡＷＥＧＦＴＡＬＶＤＫ
Ｍ２：ＮＫＬＬＱＤＡＮＧＥＬＥＮＬＹＶＲ
【００４９】
本発明のＡＤＴＺ短鎖ペプチドアミノ酸配列は前記説明したものに限定されず、他の短鎖ペプチドアミノ酸配列フラグメントを含むことができる。該フラグメントがＭＡＬＤＩ−ＭＳ−ＴＯＦ或いは他の化学方法等によってＡＤＴＺを測定して獲得したものであればよい。
【００５０】
〔実施例４：酵素菌の総ＲＮＡの抽出〕
酵素を生成する菌の菌体の組織をプレクーリングしたモルタルの中に入れて、サンプルが粉末状になるように液体の窒素を添加して研磨する。また、１００ｍｇ程度のサンプルを取って１．５ｍＬの遠心管の中に移して、１ｍＬのTrizolを添加し、振動して均一に混ぜて、室温に５分間置く。また、２００ｍＬクロロホルムを添加して、２分間振動して均一に混ぜて、氷浴に５分間置いて、２〜８℃の条件で、１２０００×ｇで１５分間遠心してから、上清を別の１１．５ｍＬの遠心管に転移する。プレクーリングした５００ｍＬのイソプロピルアルコールを添加して、氷浴に２０分間置いて、２〜８℃の条件で、１２０００×ｇで１０分間遠心する。更に、上清を捨てて、プレクーリングした１ｍＬの７５％アルコールを添加して、沈殿及び遠心管壁を洗浄する。２〜８℃の条件で、７５００×ｇで５分間遠心して、上清を捨てて、空気で５〜１０分間乾燥させてから、５０μＬのＤＥＰＣ無菌水を完全溶解するように添加する。紫外分光光度法と電気泳動の検査（１．１％ Agarose／ＥＢ、１００Ｖ、２０分）を行って、サンプルは−８０℃で保存する。結果は図３に示すように、電気泳動の検査の結果から２８ｓ ｒＲＮＡと１８ｓ ｓＲＮＡの二つの特徴バンドがはっきりして、光度比は２：１に近づいていることにより、総ＲＮＡが分解しなかったことを説明する。
【００５１】
〔実施例５：ＡＤＴＺ遺伝子特異性プライマーの獲得〕
実施例３で得たＡＤＴＺ短鎖ペプチドアミノ酸配列から二つのプライマー（Ｐ１、Ｐ２とＧ１、Ｇ２）を設計する。ＡＤＴＺ遺伝子部分の配列の産物を得るように、QIAGEN OneStep RT-PCR Kit（QIAGEN Inc.，米国）手帳を参照してＲＴ−ＰＣＲを行う。ゴムを切ってＲＴ−ＰＣＲ産物を回収して、そして通常の方法によってＴＡクローンを行う。HindIIIとEcoRIでＴＡクローンの組換えプラスミドを酵素切断して鑑定して、１．５％アガロースゲル電気泳動で酵素切断結果を検査する。組換えプラスミドに対して配列解析を行って、ＡＤＴＺ遺伝子のｃＤＮＡフラグメントＥ１を得る。具体的な方法は次の通りである。
【００５２】
プライマー対１：
Ｐ１：５’−ＴＧＧＧＡＲＧＧＮＴＴＹＡＣＮＧＣ−３’
Ｐ２：５’−ＴＣＮＣＣＲＴＴＮＧＣＲＴＣＹＴＧ−３’
プライマー対２：
Ｇ１：５’−ＣＡＲＧＡＹＧＣＮＡＡＹＧＧＮＧＡ−３’
Ｇ２：５’−ＧＣＮＧＴＲＡＡＮＣＣＹＴＣＣＣＡ−３’
【００５３】
本発明の増幅したＡＤＴＺ遺伝子特異性プライマーのプライマーセットは以上のＰ１及びＰ２、Ｇ１及びＧ２に限定されず、他のプライマー対を含むことができ、該プライマー対が上記方法で獲得したＡＤＴＺ短鎖ペプチドアミノ酸配列によって設計されたものであればよい。
【００５４】
（Ｉ）ＲＴ−ＰＣＲの順序：
１）テンプレートの総ＲＮＡ（実施例４から獲得する）を７５℃で５分間変性させて、迅速に氷の中に挿入して冷却する。
【００５５】
２）マスターミックス（Master Mix）（総体系８０μＬ）の準備：
【表２】
吸い込んで均一に混ぜて、短時間遠心する。
【００５６】
３）下表に示す順序で各成分を０．５ｍＬの無菌遠心管の中に添加する（単位：μＬ）。
【表３】
【００５７】
４）ＰＣＲ循環プログラム：
・逆転写（Reverse transcription）：５０℃，３０分
・Initial PCR activation step：５０℃，１５分
・３ステップサイクル（3-step cycling）
・１５サイクル：９４℃，４０秒
６５℃，１分（−１℃／サイクル）
７２℃，１分
・２５サイクル：９４℃，４０秒
５０℃，１分
７２℃，１分
・Final extension：７０℃，１０分
【００５８】
５）循環が終わった後に、５μＬサンプルを取って、電気泳動検査を行う。
【００５９】
（ＩＩ）ゴムを切ってＲＴ−ＰＣＲ産物を回収する：
１）ＴＡＥ電気泳動緩衝液を調合して、また、０．８％アガロースゲルを調合する。
２）５０μＬのＲＴ−ＰＣＲの産物と１０×loading bufferを割合によって混合して、サンプルを加える。
３）１００Ｖ，２０分間の電気泳動。
４）電気泳動が終わった後に、紫外灯を用いてバンドの位置を観察して、目的帯を切って、新しい滅菌した１．５ｍＬの遠心管へ転移する。
５）８００μＬのバッファーＮＴ１を添加する。
６）NucleoTrap Suspensionを渦巻振動して、小珠が完全に浮遊させた後に、１０μＬを取って遠心管に加入する。
７）遠心管を５０℃水浴に６分間置いて、その間に２分毎に短い時間渦巻振動する。
８）室温下で、１００００×ｇで、３０秒遠心して、上清を捨てる。
９）５００μＬのバッファーＮＴ２を加入して、短時間渦巻振動し、室温の条件で、一００００×ｇで、３０秒間遠心して、上清を捨てる。次に、このステップを１回繰り返す。
１０）５００μＬのバッファーＮＴ３を加入して、短時間渦巻振動し、室温の条件で、１００００×ｇで、３０秒間遠心して、上清を捨てる。次に、このステップを一回繰り返す。
１１）再度１００００×ｇで、３０秒間遠心して、上清を捨て、空気の条件で１０〜１５分乾燥する。
１２）３０μＬのＴＥバッファー（ｐＨ８．０）を加入して、沈殿物を再び懸濁する。回収のフラグメントを“Ｅ１”と命名する。ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動検査を行う。結果は図４に示すように、プライマー対Ｐ１とＰ２の反応の結果から１つのバンドを獲得したことを明示しており、条帯位置はおよそ８００ｂｐ程度であり、これをＥ１フラグメントと命名する。
【００６０】
（ＩＩＩ）ＴＡクローンと配列解析：
（１）連結：
１．５ｍＬの新しい滅菌した遠心管に下記の成分を加入する。
１μＬ ｐＵＣｍ−Ｔベクター
３μＬ Ｅ１フラグメント（ＲＴ−ＰＣＲ回収産物）
１μＬ １０×バッファー
１μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
４ｍＬの無菌水を添加して総体積を１０ｍＬに補充する。
吸い込んで均一に混ぜて、短時間遠心して、２２℃水浴で４時間以上置く。
【００６１】
（２）ＣａＣｌ２でE.coli ＤＨ５αコンピテント細胞の調製：
ＤＨ５αモノクローンを選び取って２ｍＬのＬＢ液体培地の中に添加し、３７℃の条件で振動して一夜培養する。活性化した新鮮なＤＨ５α菌液の中から５０μＬを取って５ｍＬのＬＢ液体培地の中に接種して、３７℃の条件で振動して１．５〜２時間培養する。また、氷浴に３０分置いて、菌液を無菌遠心管の中に転移して、５０００ｒｐｍで５分遠心して、上清を捨てる。１．５ｍＬ氷浴した無菌ＣａＣｌ２を遠心管に添加して、菌体を浮遊して、氷浴に１０分置いて、５０００ｒｐｍで５分遠心して、上清を捨てる。２００μＬの氷浴した無菌ＣａＣｌ２を遠心管に添加して、菌体を浮遊して、４℃の条件で保存しておく。
【００６２】
（３）ＤＨ５αコンピテント細胞の形質転換：
２００μＬのコンピテント細胞を取って、１０μＬの連結物を含む遠心管に添加して、均一に混ぜる。氷浴に３０分置き、４２℃の水浴に９０秒置いて、直ちに氷浴に３〜５分置く。８００μＬ ＬＢ液体培地に添加して、３７℃で４０〜６０分培養し；９０ｍｍ平板毎に２００μＬの量で、形質転換されたコンピテント細胞をAmpとＩＰＴＧ／Ｘ−galを含むＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で１２〜１６時間振動培養する。
【００６３】
（４）塩基によるプラスミドＤＮＡの抽出：
形質転換した単菌落を選び取って、２ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地の中に接種して、３７℃で激しく振動して一夜培養する。１．５ｍＬ菌液を取って微量遠心管に添加して、１２０００ｒｐｍで２分遠心して、上清を捨てる。４００μＬのＳＴＥ溶液を取って菌体を洗浄して、渦巻き振動して均一に混ぜて、１２０００ｒｐｍで２分遠心して、上清を捨てる。沈殿した菌体に１００μＬのプレクーリングした溶液Ｉを添加して、激しく振動して均一に混ぜる。２００μＬの新鮮に調合した溶液ＩＩを添加して、直ちに急速に転倒させて混ぜて、氷浴に３分置く。１５０μＬのプレクーリングした溶液ＩＩＩを添加して、転倒させて混ぜることを繰り返して、氷浴に５分間置く。１２０００ｒｐｍで５分間遠心して、上清は別の管の中へ移す。同等体積のフェノールを添加して、転倒して均一に混ぜる。１２０００ｒｐｍで５分遠心する。気をつけて上清を吸収して別の管の中へ転移する。２倍体積のプレクーリングした無水アルコールを添加して、転倒にて均一に混ぜて、室温で静かに４０〜６０分置く。１２０００ｒｐｍで１０分遠心させて、上清を捨てる。２００μＬの７０％アルコールを添加して、沈殿物を洗浄して、１２０００ｒｐｍで１分間遠心させて、上清を捨てる。キャップを開けて、空気の中で５〜１０分乾燥して、３０μＬのデオキシリボヌクレアーゼを含まないリボヌクレアーゼのＴＥを添加し、溶解沈殿し、３７℃で１時間培養する。−２０℃の条件で貯蔵する。
【００６４】
（５）組換えプラスミドｐＴＥ１に対する酵素切断鑑定：
HindIIIとEcoRI酵素でＴＡクローンのリコンを酵素切断鑑定して、次の通り表す（単位：ｍＬ）。
【表４】
【００６５】
３７℃で４時間以上、酵素切断を行う。１．５％アガロースゲル電気泳動で酵素切断した結果、図５のように、組換えベクターｐＴＥ１の酵素切断鑑定によれば、HindIII＋EcoRI双酵素切断（１号サンプル）とHindIII単酵素切断（３号サンプル）は皆４００ｂｐ以上のバンドを切った。また、前者の光度は後者より高く、EcoRI単酵素切断はリコンを線形（２号サンプル）に切る。これは、Ｅ１フラグメント中央位置に一つのHindIII酵素認識部位が存在することを示す。
【００６６】
（６）配列解析：
組換えプラスミドＰＥＧ純化法（Sambrookら，１９８９，Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）によって、プラスミドＤＮＡを抽出する。Ｔ７とＳＰ６をシークエンシングプライマーとして、ABI377 DNA Sequencer ＤＮＡ自動配列計（上海博雅公司から提供）で、表裏方向で測定を行って、Ｅ１フラグメントの核酸配列を得る。測定結果：配列はプライマーＰ１とプライマーＰ２の配列を含み、その中の位置にHindIII酵素認識部位（ａａｇｃｔｔ）が現れる。
【００６７】
〔実施例６：コードＡＤＴＺ全長ｃＤＮＡ序列の獲得〕
実施例５で獲得したＡＤＴＺ遺伝子の部分の配列Ｅ１フラグメントによって、プライマーを設計する。
Ｓ１（５’−ＴＡＧＧＣＧＡＡＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡ−３’）
Ｓ３（５’−ＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＧＴ−３’）
【００６８】
それぞれ３’ＲＡＣＥと５’ＲＡＣＥのプライマーとして、SMARTTM RACE cDNA amplification Kit（COLONTECH Laboratories，Inc．Cat．No．K1811-2）手帳によって、３’ＲＡＣＥと５’ＲＡＣＥを行う。ゴムを切ってＲＡＣＥ産物を回収して、そして通常の方法によってＴＡクローンを行う。HindIIIとEcoRIでＴＡクローンのリコンを酵素切断鑑定して、１．５％アガロースゲル電気泳動で酵素切断結果を検査する。組換えプラスミドをシークエンシング会社へ送って配列解析を行なって、二つのフラグメントＥ２、Ｅ３を得て、ＮＣＢＩのVecScreen（BLASTN2.2.5）のプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen.html）を利用してベクターの配列を識別し取り除く。また、DNAMANプログラム（米国Lynnon BioSoft社のソフトウェア）を用いてＥ１、Ｅ２、Ｅ３を繋ぎ合わせて、得た配列をＮＣＢＩのORF Finderプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）を利用し、オープン・リーディング・フレーム分析を行って、コーディングＡＤＴＺ成熟ペプチドのＡＤＴＺ遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を得た。具体的には次の通りである。
プライマーＳ１：５’−ＴＡＧＧＣＧＡＡＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡ−３’
プライマーＳ３：５’−ＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＧＴ−３’
【００６９】
（Ｉ）３’ＲＡＣＥ：
（１）３’RACE-Ready ｃＤＮＡの調製：
１）テンプレートの総ＲＮＡを７５℃で５分間変性して、迅速に氷の中に挿入して冷却する。
２）０．５ｍＬの滅菌遠心管の中に下記の試薬を添加する。
１μＬ 変性したテンプレートの総ＲＮＡ
１μＬ ３’−ＣＤＳプライマーＡ
３μＬのリボヌクレアーゼを含まない無菌水を添加して体積を５ｍＬまで補充する。
３）吸い込んで均一に混ぜて、そして短い時間で遠心させて混合液が管底に位置するようにする。
４）７０℃で、温浴で２分置く。
５）氷浴で２分置いて、少し遠心させて下記の試薬を添加する。
【表５】
６）試薬をそっと吸い込んで均一に混ぜて、少し遠心させる。
７）インキュベーターの中で、４２℃で１．５時間温浴する。
８）１００ｍＬのTricine−ＥＤＴＡバッファーで産物を希釈する。
９）７２℃で７分間培養する。
１０）サンプルは−２０℃で貯蔵する。
【００７０】
（２）３’ＲＡＣＥのステップ：
１）マスターミックス（Master Mix）（総体系１００μＬ）の準備：
【表６】
吸い込んで均一に混ぜて、短い時間で遠心する。
【００７１】
２）下表に示す順序で各成分を０．５ｍＬの無菌遠心管の中に添加する（単位：μＬ）。
【表７】
【００７２】
３）ＰＣＲ循環プログラム：
・５サイクル：９４℃，５秒
７２℃，３分
・５サイクル：９４℃，５秒
７０℃，１０秒
７２℃，３分
・３５サイクル：９４℃，５秒
６８℃，１０秒
７２℃，３分
【００７３】
４）循環が終わった後に５ｍＬのサンプルを取って電気泳動検査する。結果は図６に示すように、３’ＲＡＣＥが一つの一バンドの産物を獲得したことを明示して、産物バンドは、分子量が約８００ｂｐに位置して、Ｅ２フラグメントと命名する。
【００７４】
（３）ゴムを切って３’のＲＡＣＥ産物を回収し、ＴＡクローンして、ＣａＣｌ２法によってE.coli ＤＨ５αコンピテント細胞を調製する。ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、塩基でプラスミドＤＮＡを抽出する（実験操作は前記の実施例５の内容と同じである）。
【００７５】
（４）組換えプラスミドｐＴＥ２に対する酵素切断鑑定：
HindIIIとEcoRI酵素でＴＡクローンのリコンを酵素切断鑑定して、次の通り表す（単位：ｍＬ）。
【表８】
【００７６】
３７℃で４時間以上、酵素切断を行う。１．５％アガロースゲル電気泳動法で酵素切断した結果を検査した。図７のように、組換えベクターｐＴＥ２の酵素切断鑑定によると、HindIII＋EcoRI双酵素（１号サンプル）から切った２つのバンドは、それぞれ６００ｂｐと３００〜４００ｂｐ左右に位置して、HindIII単酵素（３号サンプル）から切った一つのバンドは約３００〜４００ｂｐであり、EcoRI単酵素はリコンを線形（２号サンプル）に切る。そして、Ｅ２フラグメントの中に一つのHindIII酵素認識部位が存在して、その位置はフラグメントの一方の側に近い。
【００７７】
（５）配列解析：
組換えプラスミドＰＥＧ純化法（Sambrookら，１９８９，Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）によって、プラスミドＤＮＡを抽出し、Ｔ７とＳＰ６をシークエンシングプライマーとして、ABI377 DNA Sequencer ＤＮＡ自動配列計（上海博雅公司から提供）で、表裏方向で測定を行って、２つのフラグメントの核酸配列を得る。得られたＥ２配列は、３’に偏る位置に一つのＡＡＧＣＴＴのHindIII酵素認識部位がある。
【００７８】
（ＩＩ）５’ＲＡＣＥ：
（１）５’RACE-Ready ｃＤＮＡの調製：
１）テンプレートの総ＲＮＡを取って、７５℃で５分間変性させて、迅速に氷の中に挿入して冷却する。
２）０．５ｍＬの滅菌遠心管の中に下記の試薬を添加する。
１μＬ 変性したテンプレートの総ＲＮＡ
１μＬ ５’−ＣＤＳプライマーＡ
１μＬ SMART IIA Oligonucleotide
２μＬのリボヌクレアーゼを含まない無菌水を添加して体積を５ｍＬまで補充する。
２）吸い込んで均一に混ぜて、そして短時間遠心して混合液が管底に位置するようにする。
３）７０℃で、温浴で２分置く。
４）氷浴で２分置いて、少し遠心させて下記の試薬を添加する。
【表９】
５）試薬をそっと抽出して均一に混ぜて、少し遠心させる。
６）インキュベーターの中で、４２℃で１．５時間温浴する。
７）１００ｍＬのTricine−ＥＤＴＡバッファーで産物を希釈する。
８）７２℃で、７分間培養する。
９）サンプルは−２０℃で貯蔵する。
【００７９】
（２）５’ＲＡＣＥステップ：
１）マスターミックス（Master Mix）（総体系１１０μＬ）の準備：
【表１０】
吸い込んで均一に混ぜて、短い時間で遠心する。
【００８０】
２）下表に示す順序で各成分を０．５ｍＬの無菌遠心管の中に添加する（単位：μＬ）。
【表１１】
【００８１】
３）ＰＣＲ循環プログラム：
・９４℃，１分
・５サイクル：９４℃，３０秒
７２℃，４分
・５サイクル：９４℃，３０秒
７０℃，４分
・２５サイクル：９４℃，３０秒
６８℃，４分
・７２℃，１０分
【００８２】
４）循環が終わった後に、５μＬのサンプルを取って、電気泳動検査を行って、５’ＲＡＣＥ産物であるＥ３を得る。結果は図８に示すように、５’ＲＡＣＥで一つの単一のバンドの産物を得たことを明示しており、バンドの位置はおよそ１４００〜１８００ｂｐ程度であり、これをＥ３フラグメントと命名する。
【００８３】
（３）ゴムを切って５’のＲＡＣＥ産物を回収して、ＴＡクローンし、ＣａＣｌ２法によってE.coli ＤＨ５αコンピテント細胞を調製する。ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、塩基でプラスミドＤＮＡを抽出する（実験操作は実施例５の内容と同じである）。
【００８４】
（４）組換えプラスミドｐＴＥ３に対する酵素切断鑑定：
HindIIIとEcoRI酵素でＴＡクローンのリコンを酵素切断鑑定して、次の通り表す（単位：ｍＬ）。
【表１２】
【００８５】
３７℃で４時間以上、酵素切断を行う。１．５％アガロースゲル電気泳動で酵素切断した結果、図９に示すように、組換えベクターｐＴＥ３の酵素切断鑑定によれば、HindIII＋EcoRI双酵素（１号サンプル）で、それぞれ１４００〜１０００ｂｐと３００〜４００ｂｐ左右に位置する二つのバンドが現れた。HindIII単酵素（３号サンプル）に約１４００〜１０００ｂｐである一つのバンドが現れた。また、Ｅ３フラグメントの中に一つのHindIII酵素認識部位が存在することが分かる。
【００８６】
（５）配列解析：
組換えプラスミドＰＥＧ純化法（Sambrookら，１９８９，Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）によって、プラスミドＤＮＡを取り出す。Ｔ７とＳＰ６をシークエンシングプライマーとして、ABI377 DNA Sequencer ＤＮＡ自動配列計（上海博雅公司から提供）で、表裏方向で測定を行って、Ｅ３フラグメントの核酸配列を得る。得られたＥ３フラグメントに、５’に偏る位置に一つのHindIII酵素認識部位が存在し、３’の端部に一つのHindIII酵素認識部位が存在する。
【００８７】
（ＩＩＩ）ＡＤＴＺ ｃＤＮＡ配列の接合：
ＮＣＢＩのVecscreenプログラムによりベクター配列を認識して取り除いた後、DNAMANプログラムでＥ１、Ｅ２、Ｅ３を繋ぎ合わせ、得られた配列を、ＮＣＢＩのORF Finderプログラムによってオープン・リーディング・フレーム分析を行い、長さが２．３ｋｂで、完璧なオープン・リーディング・フレームがあり、また３’末端のポリ（Ａ）尾部及び５’末端と３’末端の非翻訳領域を含む配列を得た。その結果は配列表の配列番号２に示す。ＡＤＴＺヌクレオチド配列と推定されたアミノ酸配列に対して、インターネットによって、例えばプログラムBLASTとBLASTX（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）、BLASTA配列との類似性を調べて、ＡＤＴＺが新たな遺伝子であり、更に、これによって推算されたコーディングＡＤＴＺの成熟ペプチドのアミノ酸配列と同じ配列がGENEBANKにないので、新しいアミノ酸配列であることが分かる。
【００８８】
コーディングＡＤＴＺ全長ｃＤＮＡ配列の取得は実施例６の方法に限定されず、ＡＤＴＺ短鎖ペプチドのアミノ酸配列を用いて作ったプローブによって、Armillariella tabescensのｃＤＮＡデータベースからこの配列をクローンする方法も含まれる。
【００８９】
〔実施例７：コーディングＡＤＴＺの成熟ペプチドｃＤＮＡ生成物の取得〕
実施例６で得られたコーディングＡＤＴＺ全長ｃＤＮＡ配列の両端配列を分析し、開始コドンから終止コドンまでのＡＤＴＺオープン・リーディング・フレームを得られ、更にプライマーに制限酵素認識部位EcoRI（ＧＡＡＴＴＣ）とBamHI（ＧＧＡＴＣＣ）をそれぞれ添加するように、プライマー一対を設計する。
Ｐ３：５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＣ−３’
Ｐ４：３’−ＧＴＡＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＧＧＧＡＣ−５’
【００９０】
常法によってＰＣＲ増幅を行い、ゲルから切って、ＰＣＲ生成物を回収する。詳細は以下の通りである。
【００９１】
１）マスターミックス（Master Mix）（総体系１００μＬ）の準備：
【表１３】
吸い込んで均一に混合した後、短時間の遠心分離を施す。
【００９２】
２）各成分を下表に示す順序に従って、０．５ｍＬの無菌遠心分離管に添加する（単位：μＬ）。
【表１４】
【００９３】
３）ＰＣＲサイクルプログラム：
・９４℃，１分
・５サイクル：９４℃，３０秒
７２℃，４分
・５サイクル：９４℃，３０秒
７０℃，４分
・３５サイクル：９４℃，３０秒
６８℃，４分
・７２℃，１０分
【００９４】
４）サイクルが済んだ後、サンプル５ｍＬを取って電気泳動で検査した。その結果、図１０に示すように、ＰＣＲが１８００ｂｐ付近に一つのバンドのような生成物が得られ、ＡＤＴＺ’フラグメントと命名する。
【００９５】
５）ゲルから切って、ＰＣＲ生成物を回収する。
ＰＣＲ生成物を回収する常法に従って、コーディングＡＤＴＺ成熟ペプチドのｃＤＮＡを得た。このフラグメントをＡＤＴＺ’と命名する。
【００９６】
〔実施例８：組換えプラスミドであるＡＤＴＺ発現プラスミドの組立て〕
遺伝子クローンは常法（Sambrookら，２００１，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）で行って、実施例７で得られたＡＤＴＺ’をｐＨＩＬ−Ｓ１にクローンして、発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺを組み立てた。クローンした後の標的遺伝子は酵素で切って、配列解析をする。詳しくは、操作は以下の通りである。
【００９７】
図１４に示すように、遺伝子ＡＤＴＺを含む組換えプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１の組立ては、プラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１と標的フラグメントＡＤＴＺに対して、二つ酵素EcoRI及びBamHIで切り、得られた生成物について０．８％のアガロースゲルで電気泳動を行った後、ゲルを切って回収する。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを利用し、プラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１と標的フラグメントＡＤＴＺとの結合を完成する。ＣａＣｌ２法によって、E.coli ＤＨ５αコンピテント細胞を調製した後、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を篩分けて、アルカリでプラスミドを抽出する。組換えプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺを、EcoRI＋BamHI、HindIII、SacI酵素で切ることにより確認する。組換えプラスミドを取り出し、ＰＥＧ純化法（Sambrookら，２００１，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ＵＳＡ）によって、プラスミドＤＮＡを抽出する。Ｔ７とＳＰ６を配列解析するプライマーとし、ABI377 DNA Sequencer 自動ＤＮＡシーケンサー（上海博雅公司製）を採用して、両端から同時に測定を行う。その結果、図１１に示すように、酵素切断による組換えベクターｐＳＡの確認において、EcoRIとBamHI二つ酵素が（サンプル１）２０００ｂｐ付近にあるバンドを切り出し、HindIII酵素だけが（サンプル２）１４００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐにある三つのバンドを切り出し、SacI酵素だけが（サンプル３）組換えプラスミドを切ってリニアーになり、挿しいれるフラグメントにSacI酵素認識部位がないことが分かった。
【００９８】
〔実施例９：組換えＡＤＴＺの発現〕
組換えプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺとプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１をSacI酵素で切り、得られた生成物について０．８％のアガロースゲルで電気泳動を行った後、ゲルを切って、得られたリニアー組換えプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１−ＡＤＴＺとプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１を回収した。Pichia Expression Kit（Invitrogen Inc.，米国）に記載するプロトプラスト法に従って、Pichia Pastoris ＧＳ１１５を形質転換して、Mut＋形質転換体を篩分けた。メタノールを単一炭素源として、組換え菌に対して誘導性発現（Pichia Expression Kitに従って操作する）を行う場合、培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析することにより、形質転換体が誘導性発現された後、培養液の上清に著しい標的タンパクバードが検出された。しかし、標的遺伝子を含まない空プラスミドを対照菌に形質転換したのち、同様な条件下で９６時間誘導すると、上清に標的タンパクバードが検出されなかった。その結果、図１２に示すように、形質転換体がメタノールで誘導性発現された後、培養液の上清に著しい標的タンパクバードが検出されたが、標的遺伝子を含まない空プラスミドを形質転換した陰性対照菌に対して、同様な条件下で誘導すると、上清に標的タンパクバードが検出されなかった。
詳しくは以下の通りである。
【００９９】
（Ｉ）組換え型とPichia pastorisの相同的組換え：
（１）リニアープラスミド：
組換えプラスミドｐＳＡとプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１をSacI酵素で切りながら、リニアープラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１を後述の実験の対照（control）とした。
酵素ｐＳＡで切る（総体系１２０）：１２ｍＬバッファーＬ＋８ｍＬ SacI＋１００ｍＬ ｐＳＡ
酵素ｐＨＩＬ−Ｓ１で切る（総体系１２０）：１２ｍＬバッファーＬ＋８ｍＬ SacI＋１００ｍＬ ｐＨＩＬ−Ｓ１
酵素で切ったサンプルについて０．８％のアガロースゲルで電気泳動を行って、ゲルを切って、得られたリニアー組換えプラスミドｐＳＡとプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１を回収した。
【０１００】
（２）プロトプラスト形質転換に用いるPichia Pastoris ＧＳ１１５の培養：
１）平板から一つのＧＳ１１５単一クローンを取って、１０ｍＬのＹＰＤ中に接種した後、１５０ｍＬの三角フラスコで、３０℃下、２５０〜３００ｒｐｍで振動して、一晩培養した。
２）昨日培養した１０ｍＬのＹＰＤ菌液からそれぞれ５、１０、２０μＬを取り出して、２００ｍＬのＹＰＤ中に接種した後、５００ｍＬの三角フラスコで、３０℃下、２５０〜３００ｒｐｍで振動して、一晩培養した。
３）三つの三角フラスコに菌液のＯＤ600を検査して、ＯＤ600＝０．２〜０．３の菌液を取って、遠心管に移行し、室温下１５００×ｇで５分遠心して、上清を捨てて、細胞を収集しプロトプラスト形質転換に用いた。
【０１０１】
（３）Pichia Pastoris ＧＳ１１５のプロトプラスト形質転換：
１）収集した培養の細胞を２００ｍＬの無菌水に懸濁して、１０ｍＬの遠心管二つに移行した。
２）室温下、１５００×ｇで５分遠心して、上清を捨てた。
３）調製したばかりのＳＥＤ １０ｍＬで沈殿を洗った後、室温下、１５００×ｇで５分遠心して、上清を捨てた。
４）１Ｍソルビトール液１０ｍＬで沈殿を洗った後、室温下、１５００×ｇで５分遠心して、上清を捨てた。
５）ＳＣＥ １０ｍＬで沈殿を懸濁した。
６）Zymolyase一管を取って、氷結した後管壁を軽く打って、溶液を均一に混合した。
７）Zymolyase ７．５μＬを取って管に加えて、３０℃の温度で３０分育てた。
８）室温下、７５０×ｇで１０分遠心し、菌体を収集して、上清を捨てた。
９）１Ｍソルビトール液１０ｍＬでプロトプラストを洗った後、沈殿を分散するように管壁を軽く打って、室温下、７５０×ｇで１０分遠心し、菌体を収集して、上清を捨てた。
１０）１０ｍＬのＣａＳで菌体を洗った後、室温下、７５０×ｇで１０分遠心し、菌体を収集して、上清を捨てた。
１１）沈殿を０．６ｍＬのＣａＳに懸濁して、このプロトプラストは必ず３０分以内に使わなければならない。
【０１０２】
（４）プロトプラスト法によるPichia Pastoris ＧＳ１１５の形質転換：
１）それぞれ１００μＬのPichia Pastorisプロトプラストを取って、Ａ、Ｂ、Ｃ三つの１５ｍＬ無菌遠心管に添加した。
２）Ａ管にＤＮＡを加えずに陰性対照とし、Ｂ管に線状化した本来のプラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１ ３０μＬを加えて、Ｃ管に線状化した組換えプラスミドｐＳＡ ３０μＬを加えて、室温で１０分育て、この間に新鮮なＰＥＧ／ＣａＴ ３ｍＬを調製して備える。
３）各管に調製したばかりのＰＥＧ／ＣａＴを１ｍＬそれぞれ添加して、軽く振動し均一に混ぜて，室温で１０分育てた。
４）室温下、７５０×ｇで１０分遠心し、上清を捨てて、乾燥まで置いた。
５）沈殿を１５０μＬのＳＯＳに懸濁して、室温で２０分育てた。
６）各管に１Ｍソルビトール液を１０ｍＬそれぞれ添加して、プレートの塗装を準備した。
７）ＲＤ固体培地をプレートごと２００μＬ塗布して、２８〜３０℃で反転置いて培養し、４〜６日後、形質転換体が出現した。
【０１０３】
（５）Mut＋形質転換体の篩分け：
１）無菌楊枝でHis＋形質転換体を取って、プレートＭＭとＭＤに一対一に菌を点在させながら、ＧＳ１１５／His＋MutｓAlbumin分とＧＳ１１５／His＋Mut＋β−galとも点在させて、対照とした。
２）２８〜３０℃で反転置いて二日培養した。
３）二日後、プレートＭＭとＭＤを対照して、いずれのプレートにも良く成長したのがMut＋で、プレートＭＤに良く成長したが、プレートＭＭに少し成長した、或いは成長しなかったのがMutｓである。
【０１０４】
（６）組換え菌の誘導性発現：
１）His＋Mut＋形質転換体の一つの単一クローンを取って、２５ｍＬのＢＭＧに接種して、２５０ｍＬの三角フラスコで、２８〜３０℃下、２５０〜３００ｒｐｍでＯＤ600＝２〜６（約１６〜１８時間）まで振動しながら培養した。
２）１５００〜３０００×ｇで５分遠心して、細胞を収集して、上清を捨てた後、細胞をＢＭＭにＯＤ600＝１．０（約１００〜２００ｍＬ ＢＭＭを要する）まで懸濁して、１Ｌの三角フラスコで、２８〜３０℃下、２５０〜３００ｒｐｍで振動し、引き続き培養した。
３）２４時間毎に１００％メタノールを添加し、最終の濃度を０．５％とし、誘導性発現を維持した。
４）誘導性発現を９６時間続けた。培養液を２〜３分遠心して、上清を取って−８０℃で保存して、発現生成物の純化に用いる。
９６時間で誘導培養した上清中に総タンパク質量は０．２３ｍｇ／ｍＬであった。標的タンパクの分子量はBioEditソフトウェア（http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html）で予測した理論値７６．９５ｋＤａと一致した。
【０１０５】
〔実施例１０：組換えＡＤＴＺの純化〕
誘導発現の発酵液が７０％の飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４で沈殿して、沈殿から粗酵素サンプルを得た。粗酵素サンプルは同じ体積のＰＢＳで溶解し、遠心した後、上清を取って疎水クロマトグラフPhenyl sepharoseカラムに通導し、連続的な勾配の溶出液により溶出し、標的ピークを収集した。透析脱塩し、ＰＢＳ溶液で平衡化した後、濃縮した。濃縮した酵素液が金属キレート親和クロマトグラフChelating Sepharoseカラムに通導し、ｐＨ７．５〜６．０の非連続的な勾配の溶出液により溶出し、標的ピークを収集した。具体的には次の通りである。
【０１０６】
（１）硫酸アンモニウムで沈殿し、粗酵素を収集した。
４０％の飽和度になるまで組換え発現発酵液に（ＮＨ４）２ＳＯ４粉末を加え、４℃下、１００００ｇで２０分間遠心し、更に上清に（ＮＨ４）２ＳＯ４粉末を添加し７０％の飽和度になされ、４℃下、１００００ｇで２０分間遠心して、粗酵素サンプルを得た。
【０１０７】
（２）疎水クロマトグラフ：同じ体積の０．０２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ：６．０）溶液にＡＤＴＺ粗酵素サンプルを溶解し、４０００ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を取って、Phenyl sepharoseカラム［Phenyl sepharose 6 Fast flow（high sub），Pharmacia Biotech，Inc.］に通導し、基線まで溶液（０．０２Ｍ ＰＢＳ＋３０％飽和硫酸アンモニウム，ｐＨ：６．０）で洗った後、連続的な勾配の溶出緩衝液［Ａ液（０．０２Ｍ ＰＢＳ＋１０％飽和硫酸アンモニウム，ｐＨ：６．０）＋Ｂ液（０．０２Ｍ ＰＢＳ，ｐＨ：６．０）］により溶出し、活性ピークを収集した。透析脱塩し、Ｆ液（０．０２Ｍ ＰＢＳ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ：７．５）で平衡化した後、タンパク質の濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【０１０８】
（３）金属キレート親和クロマトグラフ：Chelating Sepharose［Chelating Sepharose Fast Flow，Pharmacia Biotech，Inc.］を予め０．２Ｍ ＣｕＣｌ２溶液で飽和させ、純水で基線まで洗った後、更にＦ液（０．０２Ｍ ＰＢＳ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ:７．５）で洗って基線に安定させた。疎水クロマトグラフを行った標的ピークサンプルをカラムに通導し、別々に非連続的なｐＨ勾配の緩衝液Ｇ液［０．０２Ｍ ＰＢＳ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ:７．５〜６．０の非連続的なｐＨ勾配の緩衝液（０．５のｐＨ単位毎に増加させた）］により溶出し、標的ピークを収集した。標的ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で鑑定した。
【０１０９】
その結果、誘導性発現をした１Ｌの発酵液が以上の純化をした後、純化した組換えＡＤＴＺが５８ｍｇ得られた。純度は９５％以上になる。
【０１１０】
〔実施例１１：組換えＡＤＴＺの活性の鑑定〕
組換えＡＤＴＺの活性の鑑定は実施例２の方法Ｉに従って行った。反応系：（１）活性化酵素群：１μＬのＡＦＢ１溶液（ＡＦＢ１メタノール溶液：０．５μｇ／μＬ、窒素ガスで揮発した）＋組換え発現ＡＤＴＺ酵素液（タンパク質の含有量：０．１ｍｇ／ｍＬ）３００μＬ＋０．５μＬ ＭｇＳＯ４＋１０μＬ ＰＥＧ２００；（２）不活性化酵素群：１μＬのＡＦＢ１溶液（ＡＦＢ１メタノール溶液：０．５μｇ／μＬ、窒素ガスで揮発した）＋不活性化した組換え発現ＡＤＴＺ酵素液（タンパク質の含有量：０．１ｍｇ／ｍＬ、予め１００℃で５分間水浴した）３００μＬ＋０．５μＬ ＭｇＳＯ４＋１０μＬ ＰＥＧ２００；（３）緩衝液対照群：１μＬのＡＦＢ１溶液（ＡＦＢ１メタノール溶液：０．５μｇ／μＬ、窒素ガスで揮発した）＋ＰＢＳ緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ：６．６）３００μＬ＋０．５μＬ ＭｇＳＯ４＋１０μＬ ＰＥＧ２００；反応系を均一に混合して、３０℃で１時間水浴した後、管内のＡＦＢ１総量が２μｇになるまで、１時間毎にＡＦＢ１を０．５μＬそれぞれ添加した。その後、引き続き６時間反応させた。反応が済んだ後、実施例２の方法Ｉに従って点板展開し検査した。
【０１１１】
その結果は、組換えＡＤＴＺで処理したＡＦＢ１生成物のＲｆ値が１（＝０．９３）に近づき、天然ＡＤＴＺの結果と似て、組換えＡＤＴＺがＡＦＢ１を転化する活性を有することである。結果を図１３に示す。組換えＡＤＴＺで処理すると、ＡＦＢ１生成物のＲｆ値が１（＝０．９３）に近づき、天然ＡＤＴＺの結果と似て、組換えＡＤＴＺがＡＦＢ１を転化する活性を有することが分かった。
【０１１２】
〔実施例１２：組換えＡＤＴＺのＡＦＢ１に対する解毒生物活性の鑑定〕
組換えＡＤＴＺの活性の鑑定は実施例２の方法ＩＩに従って行った。天然ＡＤＴＺの代わりに組換え発現ＡＤＴＺを用いた以外、他の群が同様な設計と操作で、試験を受けたサンプルを調製した。その結果、活性組換えＡＤＴＺで処理した群の細菌復帰突然変異コロニーの数は陰性対照群（ＤＭＳＯ対照群）と近似していた（いずれのＭＲ値も２未満）。緩衝液処理対照群と不活性化組換えＡＤＴＺ処理群は、細菌復帰突然変異コロニーの数が陰性対照群（いずれのＭＲ値も２以上）より著しく高いが、陽性対照群（アフラトキシンＢ１対照）と著しい差がなかった。組換えＡＤＴＺはＡＦＢ１に引き起された突然変異を抑制する生物活性作用を有することが分かった。結果を下表に示す。
【０１１３】
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】純化したＡＤＴＺのＰＡＧＥ電気泳動の結果である。Ｍ：標準分子量タンパク質；１，２：ＢＳＡ（小牛の血清アルブミン）；３：硫酸アンモニウムで沈殿した粗酵素成分；４：純化したＡＤＴＺ。
【図２】純化したＡＤＴＺのＡＦＢ１を転化する作用の薄層クロマトグラフで検査した結果である。１：ＡＦＢ１標準品；２，３：ＰＢＳ緩衝液対照群；４：不活性化のＡＤＴＺでＡＦＢ１を処理する対照群；５：ＡＤＴＺでＡＦＢ１を処理する群；６：ＡＦＢ１標準品。
【図３】Armillariella tabescensの総ＲＮＡを電気泳動した結果である。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲ生成物の電気泳動結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；Ｅ１：ＲＴ−ＰＣＲ生成物。
【図５】組換えベクターｐＴＥ１の酵素切断鑑定した結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；１：Pte1/HindIII＋EcoRI；２：pTE1/EcoRI；３：pTE1/HindIII。
【図６】３’ＲＡＣＥ生成物の電気泳動による検査結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；Ｅ２：３’ＲＡＣＥ生成物。
【図７】組換えベクターｐＴＥ２の酵素切断鑑定した結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；１：pTE2/HindIII＋EcoRI；２：pTE2/EcoRI；３：pTE2/HindIII。
【図８】５’ＲＡＣＥ生成物の電気泳動による検査結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；Ｅ３：５’ＲＡＣＥ生成物。
【図９】組換えベクターｐＴＥ３の酵素切断鑑定した結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；１：pTE3/HindIII＋EcoRI；２：pTE3/EcoRI；３：pTE3/HindIII。
【図１０】End to end ＰＣＲ生成物の電気泳動による検査結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；ＡＤＴＺ’：ＰＣＲ生成物。
【図１１】組換えベクターｐＳＡの酵素切断鑑定した結果である。Ｍ：ＤＮＡマーカー；１：pSA/BamHI＋EcoRI；２：pSA/HindIII；３：pSA/SacI。
【図１２】発現生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。１：９６時間で誘導した陰性対照菌；２：標準分子量タンパク質；３：ＢＳＡ（小牛の血清アルブミン）；４：２４時間で誘導した組換え菌；５：４８時間で誘導した組換え菌；６：７２時間で誘導した組換え菌；７：９６時間で誘導した組換え菌。
【図１３】組換えＡＤＴＺのＡＦＢ１を転化する活性をＴＬＣで検査した結果である。１：ＡＦＢ１標準品対照；２：組換えＡＤＴＺ処理ＡＦＢ１群のサンプル；３：不活性化の組換えＡＤＴＺ処理ＡＦＢ１対照群のサンプル；４：緩衝液対照。
【図１４】ＡＤＴＺ組換え型の組立て、及びそれとPichia pastorisの相同的組換えのフローチャートである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素であって、等電点が５．３〜６．８、分子量が７３〜７７キロダルトンであり、配列表に示すようなアミノ酸配列を有することを特徴とする解毒酵素。
【請求項２】
アフラトキシンを転化する活性を有する請求項１に記載の解毒酵素をコーディングすることを特徴とする遺伝子。
【請求項３】
配列表に示すようなヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られることを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程と、発現されたアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を回収する工程と、を含む請求項１に記載の解毒酵素の調製方法。
【請求項７】
飼料及び食品中のアフラトキシンの脱毒品の製造に請求項１に記載のアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いることを特徴とする使用方法。
【請求項８】
アフラトキシンによる癌を予防及び治療する薬物の製造に請求項１に記載のアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いることを特徴とする使用方法。
【請求項１】
アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素であって、等電点が５．３〜６．８、分子量が７３〜７７キロダルトンであり、配列表に示すようなアミノ酸配列を有することを特徴とする解毒酵素。
【請求項２】
アフラトキシンを転化する活性を有する請求項１に記載の解毒酵素をコーディングすることを特徴とする遺伝子。
【請求項３】
配列表に示すようなヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られることを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程と、発現されたアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を回収する工程と、を含む請求項１に記載の解毒酵素の調製方法。
【請求項７】
飼料及び食品中のアフラトキシンの脱毒品の製造に請求項１に記載のアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いることを特徴とする使用方法。
【請求項８】
アフラトキシンによる癌を予防及び治療する薬物の製造に請求項１に記載のアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いることを特徴とする使用方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００８−５０９６８４（Ｐ２００８−５０９６８４Ａ）
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２６１６５（Ｐ２００７−５２６１６５）
【出願日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／００００５０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１７９６０
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０７０３４０１２）グアンツォウ コウ‐ウィン バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／００００５０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１７９６０
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０７０３４０１２）グアンツォウ コウ‐ウィン バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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