インターロイキン−１５のアンタゴニスト
【課題】同種移植片拒絶反応および移植片対宿主疾患を治療する薬剤組成物の提供。
【解決手段】哺乳類のインターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）のアンタゴニストが開示され、そしてそれには各々がＩＬ−１５Ｒ α−サブユニットに結合することが可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介してシグナルを伝達することが不可能な、ＩＬ−１５の突然変異体および改変ＩＬ−１５分子。さらに、ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介するシグナル伝達を実施することを阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体。
【解決手段】哺乳類のインターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）のアンタゴニストが開示され、そしてそれには各々がＩＬ−１５Ｒ α−サブユニットに結合することが可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介してシグナルを伝達することが不可能な、ＩＬ−１５の突然変異体および改変ＩＬ−１５分子。さらに、ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介するシグナル伝達を実施することを阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的には、本明細書でインターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）として引用される哺乳類上皮由来Ｔ細胞因子ポリペプチドのアンタゴニストに関する。本発明はより具体的には、ＩＬ−１５の突然変異体、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体、およびＩＬ−１５複合体に関し、これらは各々インビトロＣＴＬＬアッセイにおいてＴ−リンパ球の増殖を刺激化するＩＬ−１５の能力を有意に減少させる。ＩＬ−１５活性の減少が所望される、哺乳類の様々な疾患状態を治療するための方法も本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インターロイキン−１５はＩＬ−２依存性細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖を支援することができる既知のＴ−細胞増殖因子である。ＩＬ−１５はGrabsteinらにより、Science, 264:965 (1994) に、１１４アミノ酸の成熟蛋白質をもたらす、４８アミノ酸リーダー配列を含む１６２アミノ酸前駆体ポリペプチドを含む分泌型サイトカインとして初めて報告された。 Grabsteinらは更に、３１６ｂｐの５’非コーディング領域および４８６ｂｐの読み取り枠（もしくは停止コドン用の３ｂｐを含む場合には４８９ｂｐの読み取り枠）、および４００ｂｐの３’非コーディング領域を含む、１６２アミノ酸前駆体をコードする全長ヒトｃＤＮＡのクローニングも記載している。
【０００３】
ＩＬ−１５はＩＬ−２と多くの性質を共有している。これらの性質には、ヒトおよびマウスのＴ細胞の増殖および活性化、リンホカインにより活性化されたキラー細胞（ＬＡＫ）活性、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）活性、および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性の誘導、ならびにＢ細胞の増殖と分化との同時刺激化がある。
【０００４】
それに加えＩＬ−１５とＩＬ−２とは、Ｔ細胞膜表面上の少なくとも３つの異なるレセプターサブユニットに結合することが可能な構造的に相同な分子である。ＩＬ−２レセプターは少なくとも３つのサブユニット、すなわちα、β、およびγを含む（Toshikazu et al., Science, 257:379 (1992)）。ＩＬ−１５とＩＬ−２の両方共は共通のβ−γサブユニット複合体への結合性を共有している一方で、ＩＬ−１５とＩＬ−２の各々が特異的α−レセプターサブユニット（各々、ＩＬ−１５Ｒα およびＩＬ−２Ｒα）に結合する。最近ではＩＬ−１５Ｒαが発見され、かつ同時係属中の米国特許出願第08/300,903号の主題となっている。ＩＬ−２レセプターのα−鎖に対する抗体（抗−ＩＬ−２Ｒα）はＩＬ−１５結合には何の効果も有さない（Grabstein et al., 前述）。ＩＬ−２レセプターのβ−サブユニットに対する抗体、すなわちＴＵ２７、ＴＵ１１、もしくはＭｉｋβ１はしかしながらＩＬ−１５の活性を遮断することが可能であり、このことによりＩＬ−１５がシグナル伝達のためにβ−サブユニットを用いることが示唆される。同様に、ＩＬ−２レセプターのγ−鎖がシグナル伝達に必要とされる（Giri et al., EMBO J., 13:2822 (1944)）。ＩＬ−１５レセプター複合体のβおよびγ−サブユニットの組合せはトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞上のＩＬ−１５に結合するが、ただし、いずれのサブユニットも単独では結合を生じない。
【０００５】
所定の疾患状態および生理学的状態はＴ細胞により媒介される。このような疾患には、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、自己免疫疾患、リューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、皮膚障害、インシュリン依存性糖尿病、眼障害、および突発性ネフローゼ症候群／突発性膜性腎症が含まれる。実際のところ、同種移植片拒絶反応および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）はＩＬ−２レセプター発現の増加に関連している。外来性組織適合性抗原に応答して活性化されるＴ細胞がＩＬ−２レセプター複合体を発現するようである。様々な治療法が提案および研究されている。例えば、Tinubuら（J. Immunol.,153:4330 (1994)）は、抗ＩＬ−２Ｒβモノクローナル抗体であるＭｉｋβ１が霊長類の心臓同種移植片の生残期間を延長させることを報告した。急性同種移植片拒絶反応に関連してＣＤ４−およびＣＤ８−発現性細胞上にはＩＬ−２Ｒβサブユニット発現が増加し、このことによりＩＬ−２Ｒβサブユニット発現が同種反応性Ｔ細胞では増加するように思えることが示唆される。例えば、Nigumaら，Transplantation, 52:296 (1991)、を参照されたい。
【０００６】
しかしながら本発明以前には、ＧＶＨＤを治療するための手段として、または、同種移植生残率を亢進させるための、ＩＬ−１５リガンド−レセプター相互作用に焦点を当てた治療法は全く存在しなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＩＬ−１５アンタゴニスト並びにヒト疾患の治療のためにそのアンタゴニストを用いる方法に関する。具体的にはそのような治療法には哺乳類における同種移植片の生残率を亢進させること、およびＧＶＨＤを治療することが含まれる。ＩＬ−１５アンタゴニストは、ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介して細胞へシグナルを伝達することを防ぎ、よってＩＬ−１５の生物学的活性を拮抗することにより効力を発揮する。本発明の所定のアンタゴニストはＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットに結合することを妨害する一方で、 ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合は実質的には妨害しない。
【０００８】
本発明のアンタゴニストには、成熟ＩＬ−１５もしくは天然のＩＬ−１５の突然変異体が含まれ、この場合ＩＬ−１５には、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットへの結合の際に機能する、一つもしくは複数のアミノ酸残基または領域に突然変異を生じさせてある。このような突然変異体は ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持しながらも、ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介して細胞にシグナルを伝達することを阻害する。典型的にはこのような突然変異体は重要な位置（例えば、各々が配列番号１および２に示されるサルおよびヒトのＩＬ−１５のＡｓｐ５６もしくはＧｌｎ１５６である）での追加、欠失、もしくは置換により作製される。Ａｓｐ５６がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−サブユニットとの結合に影響を及ぼし、そしてＧｌｎ１５６がそのγ−サブユニットとの結合に影響を及ぼすものと考えられる。
【０００９】
さらに、本発明は、成熟ＩＬ−１５と免疫反応し、かつＩＬ−１５レセプター複合体へのシグナル伝達を阻害するモノクローナル抗体を含む。
ＩＬ−１５Ｒαに結合する能力を保持するが、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／またはγ−サブユニットに対する親和性が実質的に減少しているかもしくはそのような親和性を全く有さない改変ＩＬ−１５分子も更に本発明の範囲内に含まれる。改変ＩＬ−１５分子は、結合が妨害もしくは妨げられるような様式で（通常は標的結合部位もしくはその近傍での改変）その改変が作製されている限り、いかなる形態でもよい。このような改変ＩＬ−１５分子の例には、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５レセプター結合を立体的に妨害する一つもしくは複数の化学基に共有結合により複合体形成させられる成熟ＩＬ−１５もしくはＩＬ−１５の突然変異体がある。例えば成熟ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持しながらも、そのＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−鎖に対するＩＬ−１５の結合を阻害することができるＩＬ−１５分子上の特異的部位に部位特異的グリコシル化を含ませてもよく、あるいは例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リシンもしくはポリヒスチジン）、アルブミン、ゼラチン等の基に共有結合により結合させてもよい。その基の立体障害特性を利用することにより、特異的レセプターサブユニットへの結合を拮抗することができる。ＰＥＧ鎖を、例えばＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、アスパラギナーゼ、免疫グロブリン、ヘモグロブリン、およびその他のもののような蛋白質に対して複合体形成させることのの他の利点は、当該技術分野に知られている。例えば、ＰＥＧがインビボでの循環半減期を延長させること（例えば、Delgado, et al., Crit. Rev. Ther. Drug. Carr. Syst., 9:249 (1992)、を参照されたい）、溶解度を高めること（例えば、Katre, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:1487 (1987)、を参照されたい）、および免疫原性を減少させること（例えば、Katre, N.V., Immunol. 144:209 (1990)、を参照されたい）が知られている。
【００１０】
本発明は更に、Ｔ細胞上でのＩＬ−１５活性の減少が所望される疾患もしくは症状を治療する方法における上記アンタゴニストの使用にも関する。そのような疾患には、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、自己免疫疾患、リューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、皮膚疾患、インシュリン依存性糖尿病、眼疾患、および突発性ネフローゼ症候群／突発性膜性腎症が含まれる。。具体的には同種移植片拒絶反応の際には、ＩＬ−１５活性はその移植片に対する宿主免疫応答を、そして最終的には拒絶反応をもたらすことがある。同様にＧＶＨＤでは、移植片（典型的には、骨髄移植片）は宿主に対する免疫応答をもたらす。本発明のＩＬ−１５アンタゴニストによるこのような活性の抑制は、移植片残存を亢進および延長させるという点、ならびにＧＶＨＤを治療するという点で有利でありうる。
【００１１】
様々な研究者らが、例えば抗ヒトＩＬ−２α−レセプターモノクローナル抗体、抗−ＴＡＣのような抗体を用いることによる移植片生残の延長を報告している。例えば、Reedら，Transplantation, 47:55-59 (1989) を参照されたい（この文献では、抗−ＴＡＣは霊長類の腎臓同種移植片移を改善したことが示されている）。更にBrownら、Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2663 (1991) は、霊長類の心臓同種移植片生残を延長させる際のヒューマナイズド抗−ＴＡＣの使用を記載している。Kirkmanら、Transplantation, 51:107 (1991)、もやはり初期同種移植片拒絶反応を回避させる際の抗−ＴＡＣを必要とする臨床試験を記載している。ＩＬ−１５はＩＬ−２に類似する多くの生物学的活性を保持し、そして実際にＩＬ−２と所定のレセプターサブユニットを共有するため、疾患状態におけるＩＬ−１５の有害活性の妨害が顕著な治療的可能性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１５レセプター複合体を介するＩＬ−１５のシグナル伝達を妨害するＩＬ−１５活性のアンタゴニストに関する。具体的には、本発明のＩＬ−１５アンタゴニストは、（ａ）ＩＬ−１５レセプターのα−サブユニットへの結合が可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／もしくはγ−サブユニットを介するシグナルの伝達が不可能である成熟ＩＬ−１５もしくは天然ＩＬ−１５の突然変異体；（ｂ） ＩＬ−１５が、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／もしくはγ−サブユニットを介してシグナル伝達を実施することを阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体；ならびに（ｃ）ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介してシグナル伝達を実施するＩＬ−１５の能力を妨害するが、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の結合は妨害しないような、ある化学基に共有結合により連結されているＩＬ−１５分子、を含む群から選択される。先に記載される突然変異体をコードするＤＮＡも本発明の範囲内に含まれる。
【００１３】
本明細書に用いられる際には「組換えＤＮＡ技術」もしくは「組換え」は、異種ペプチドの生合成を可能にさせるためにクローン化ＤＮＡ配列もしくは合成ＤＮＡ配列で形質転換もしくはトランスフェクトさせてある微生物（例えば、細菌、昆虫、もしくは酵母）または哺乳類細胞もしくは生物体（例えば、トランスジェニック体）から特異的ポリペプチドを産生するための技術および方法を意味する。天然のグリコシル化パターンは哺乳類細胞発現システムを用いてのみ達成されるであろう。酵母によっては特有のグリコシル化パターンが提供される。原核生物細胞発現（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ））は一般的にはグリコシル化されていないポリペプチドを産生するであろう。
【００１４】
「核酸配列」は、個別の断片の形態をとるか、あるいは大きめのＤＮＡ構築物の構成成分としてのポリヌクレオチドを意味し、このポリヌクレオチドは少なくとも一旦実質的に純粋な形態をとり（すなわち、混入している内因性物質を含まない）かつ標準的な生化学的方法（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、に概要が記載されている方法）による同定、操作、および回収を可能とさせる量もしくは濃度で単離されたＤＮＡもしくはＲＮＡから取得されている。このような配列は、真核生物遺伝子内に典型的に存在する内部非翻訳配列もしくはイントロンにより妨害されていない読み取り枠の形態で提供されることが好ましい。非翻訳化ＤＮＡの配列は読み取り枠から見て５’もしくは３’の位置に存在してもよく、この場合、同配列はコーディング領域の操作もしくは発現を妨害しない。
【００１５】
「組換え発現ベクター」は、（１）遺伝子発現の際に調節的役割を担う遺伝子要素（一つもしくは複数）（例えば、プロモーターもしくはエンハンサー）、（２）ＩＬ−１５もしくはＩＬ−１５突然変異体をコードする構造配列もしくはコーディング配列、ならびに（３）適切な転写および翻訳開始配列、ならびに所望により停止配列のアセンブリーを含む転写単位を含むプラスミドを意味する。用いることができる様々な調節要素の代表例が以下に論議される（「組換えＤＮＡ技術」を参照されたい）。酵母発現系における使用が意図される構造要素ハ、酵母宿主細胞による翻訳されたポリペプチドの細胞外分泌を可能にさせるリーダー配列を含むことが好ましい。別法では、細菌性発現系では、組換えポリペプチドがＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。このＮ−末端メチオニン残基はその後、発現された組換えポリペプチドから開裂され、更なる精製に適した産物を提供することができる。
【００１６】
「組換え微生物性発現系」は、染色体ＤＮＡ内に組換え転写単位を安定に組み込ませてあるか、もしくは内在性プラスミドの構成成分としての組換え転写単位を保持する、例えば細菌（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、または酵母（例えば、Ｓ．セルビジエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））のような適切な宿主微生物の実質的に均質な単一培養物を意味する。一般的には組換え微生物性発現系を含む宿主細胞は単一祖先の形質転換細胞の子孫である。組換え微生物発現系は、発現予定の構造的ヌクレオチド配列に連結された調節要素の誘導の際に異種ポリペプチドを発現するであろう。
【００１７】
「ＩＬ−１５突然変異体（IL-15 mutein）」もしくは「ＩＬ−１５の突然変異体（muteins of IL-15）」は、ＩＬ−１５のアンタゴニストを産生する目的で、本発明に従って突然変異を生じさせてある、配列番号１のアミノ酸４９〜１６２の配列を有するサルＩＬ−１５分子、または配列番号２のアミノ酸４９〜１６２の配列を有するヒトＩＬ−１５分子（いずれも成熟した分子もしくは天然の分子である）を意味する。このようなＩＬ−１５突然変異体は、ＩＬ−１５αサブユニットに結合することは可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することは不可能である。
【００１８】
ＩＬ−１５の調製
ヒトもしくはサルのＩＬ−１５は、Grabsteinら（Science, 264;965 (1994)）（これは引用により本明細書に取り込まれる）により記載される方法に従うか、もしくは例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような常法により取得することができる。ヒトＩＬ−１５ ｃＤＮＡの寄託は１９９３年２月１９日にthe American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) に行われ、かつ受託番号６９２４５が割り振られている。この寄託物は「Ｉ４１−ｈＥＴＦ」と命名されている。この寄託はブタペスト条約の規定に従って実施された。
【００１９】
ＩＬ−１５突然変異体
アンタゴニストを産生することができる多くの可能なＩＬ−１５の突然変異が存在する。このような突然変異はβ−もしくはγ−サブユニットのシグナル伝達に関与すると考えられる特異的アミノ酸部位で作製することができるか；あるいは突然変異を、β−もしくはγ−サブユニットのシグナル伝達にとって必要であると考えられるＩＬ−１５の全領域にわたって作製することができる。典型的には、突然変異はアミノ酸残基の添加、置換、もしくは欠失として作製することができる。好ましくは置換もしくは欠失突然変異体が好ましく、置換突然変異体が最も好ましい。
【００２０】
Ａｓｐ５６がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−サブユニットとの結合に影響を及ぼし、そしてＧｌｎ１５６がγ−サブユニットとの結合に影響を及ぼすものと考えられる。部位Ａｓｐ５６およびＧｌｎ１５６の近傍もしくはその位置で天然に存在する他のアミノ酸残基を添加もしくは置換することは、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかもしくは両方に対するＩＬ−１５の結合に影響を及ぼすことができる。実際、陰性に帯電しているアスパラギン酸残基を除去し、そしてそれを陰性に帯電している別の残基に置換することでは、アスパラギン酸が例えばアルギニンのような陽性に帯電しているアミノ酸、または例えばセリンもしくはシステインのような帯電していない残基で置換された場合と同じようにはレセプター結合を遮断する効力は発揮されないことがある。
【００２１】
ＩＬ−１５突然変異体の組換え産生は、まずＩＬ−１５突然変異体をコードするＤＮＡクローン（すなわち、ｃＤＮＡ）の単離を必要とする。ｃＤＮＡクローンは哺乳類ＩＬ−１５ポリペプチドを発現する初期細胞もしくは細胞株に由来する。最初に細胞の全ｍＲＮＡを単離し、その後に逆転写によりそのｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。本明細書内に提供されるＤＮＡ配列情報を用いて前述したように種間ハイブリダイゼーションプローブもしくはＰＣＲプライマーを設計し、ｃＤＮＡクローンを単離および同定することができる。このようなｃＤＮＡクローンは配列番号１および配列番号２の核酸１〜４８６の配列を有する。
【００２２】
単離されたｃＤＮＡは内部非翻訳配列もしくはイントロンにより中断されない読み取り枠の形態をとることが好ましい。哺乳類ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列を含むゲノムＤＮＡも、コーディング配列を構築する際に有用な遺伝子情報の源として用いることができる。単離されたｃＤＮＡを当該技術分野に知られる技術を利用して突然変異を生じさせて、ＩＬ−１５アンタゴニスト活性を提供することができる。以下の実施例１はＩＬ−１５突然変異体を調製するのに用いることができる具体的方法を記載する。
【００２３】
活性に必要とされないような、アミノ酸残基もしくは配列の様々な追加もしくは置換、あるいは末端もしくは内部の残基もしくは配列の欠失をコードする同等のＤＮＡ構築物も本発明により包含される。例えば、ＩＬ−１５内のＮ−グリコシル化部位をグリコシル化を妨げるように改変させて、哺乳類および酵母の発現系において炭化水素類似体の減少した発現を行わせることもできる。真核生物のポリペプチド内のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙを特徴とし、先の式中、ＸはＰｒｏ以外のいずれかのアミノ酸であり、そしてＹはＳｅｒもしくはＴｈｒである。サルのＩＬ−１５蛋白質はこのようなトリプレットを、配列番号１のアミノ酸１２７〜１２９および１６０〜１６２の２カ所に含む。ヒトＩＬ−１５蛋白質はこのようなトリプレットを、配列番号２のアミノ酸１１９〜１２１、１２７〜１２９、および１６０〜１６２の３カ所に含む。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、追加、もしくは欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭化水素残基の結合の阻害をもたらすであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸により置換されるように選択された単一ヌクレオチドの変化はＮ−グリコシル化部位を不活化させるに十分である。蛋白質中のＮ−グリコシル化部位を不活化するための既知の方法には、引用により本明細書に取り込まれる米国特許第５，０７１，９７２号および欧州特許出願第２７６，８４６号がある。
【００２４】
組換え発現ベクターには、ＩＬ−１５突然変異体をコードする合成ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片がある。 ＩＬ−１５突然変異体をコードするＤＮＡは、例えば哺乳類、微生物、ウイルス、もしくは昆虫の遺伝子に由来するもののような適切な転写もしくは翻訳調節用または構造ヌクレオチド配列に機能可能なように連結される。調節配列の例には例えば、遺伝子発現の際に調節的役割を果たす遺伝子配列（例えば、転写プロモーターもしくはエンハンサー）、転写を調節するための所望によるオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の開始および停止を制御する適切な配列が含まれる。その調節配列が機能的に構造遺伝子に関連している際には、ヌクレオチド配列は機能可能なように連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌用リーダー）のためのＤＮＡ配列は、そのシグナルペプチドが前駆体アミノ酸配列の一部として発現され、かつＩＬ−１５突然変異体の分泌に関与する場合には、ＩＬ−１５突然変異体のための構造遺伝子ＤＮＡ配列に機能可能なように連結されうる。更には、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列が構造遺伝子ヌクレオチド配列の転写を制御する場合には、コーディング配列（例えば、構造遺伝子ＤＮＡ）に機能可能なように連結される。その上更に、リボソーム結合部位は、そのリボソーム結合部位が翻訳を促すようにベクター内に配置される場合には、構造遺伝子ヌクレオチドコーディング配列（例えば、ＩＬ−１５突然変異体）に機能可能なように連結されうる。
【００２５】
ＩＬ−１５突然変異体の発現に適する宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下に置かれる原核生物、酵母、もしくは高等真核生物細胞が含まれる。原核生物は、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）もしくは桿菌等のグラム陰性もしくはグラム陽性の生物体を含む。形質転換に適する原核生物宿主細胞には例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、サルモネラ ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内に含まれる様々な他の種が含まれる。以下に一層詳細に論議されるように、適切な宿主細胞の例には、例えばＳ． セレビジエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Overy (CHO)）細胞等の哺乳類細胞系、もしくは昆虫細胞が含まれる。本明細書に開示されるＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてＩＬ−１５突然変異体を産生するには無細胞翻訳系も利用することができる。細菌、昆虫、酵母、および哺乳類細胞性宿主を用いる使用法のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えばPouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985、に記載されている。
【００２６】
ＩＬ−１５突然変異体が酵母宿主細胞内で発現される場合には、ＩＬ−１５突然変異体をコードするヌクレオチド配列（例えば、構造遺伝子）はリーダー配列を含んでもよい。このリーダー配列は、翻訳されたポリペプチドの酵母宿主細胞による細胞外分泌の改善を可能にし得る。
【００２７】
ＩＬ−１５突然変異体は酵母宿主細胞（好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ． セレビジエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））からのもの）内で発現してもよい。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）もしくはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）等の他の属の酵母を利用してもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、および転写停止用の配列を含むであろう。酵母ベクターが複製起点および選択用マーカーを含むことが好ましい。酵母ベクターに適するプロモーター配列は、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980）、もしくは他の解糖酵素（Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; and Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978）（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）のためのプロモーターを含む。酵母発現の際の使用のための他の適切なベクターおよびプロモーターは、Hitzemanの欧州特許出願公開第７３，６５７号に更に詳細に記載されている。
【００２８】
酵母ベクターは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内での選択および複製のために、例えばｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を用いて組み立てることができる。酵母発現構築物内に含まれることができる他の酵母ＤＮＡ配列には、グルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む。ＡＤＨ２プロモーターはRussellら（J. Biol. Chem. 258:2674, 1982）およびBeierら（Nature 300:724, 1982）により記載されている。酵母のα−因子リーダー配列は異種ポリペプチドの分泌を指令する。このα−因子リーダー配列はプロモーター配列と構造遺伝子配列との間に挿入されることがしばしばである。例えば、Kurjanら、Cell 30:933, 1982；およびBitterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984、を参照されたい。このリーダー配列をその３’末端付近で改変し、一つもしくは複数の制限部位を含ませてもよい。このことにより構造遺伝子へのリーダー配列の融合が容易になるであろう。
【００２９】
酵母の形質転換プロトコールは当業者に知られている。このようなプロトコールの一つがHinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75: 1929, 1978により記載されている。Hinnenらのプロトコールは選択培地中でＴｒｐ＋形質転換体を選択し、その選択培地は０．６７％の酵母窒素塩基、０．５％のカザミノ酸、２％のグルコース、１０ｍｇ／ｍｌのアデニン、および２０ｍｇ／ｍｌのウラシルでできている。
【００３０】
発現を誘導させるために、ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の一例は、８０ｍｇ／ｍｌのアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌのウラシルを添加した、１％酵母エキストラクト、２％ペプトン、および１％グルコースからできた培地である。ＡＤＨ２プロモーターの抑制は、グルコースが培地から消費された時点で失われる。
【００３１】
あるいは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）等の原核生物宿主細胞内ではＩＬ−１５突然変異体は、原核生物宿主細胞内の組換えポリペプチドの発現を容易にさせるためにＮ−末端メチオニン残基を含むことがあってよい。このＮ−末端Ｍｅｔは発現された組換えＩＬ−１５突然変異体から開裂されてよい。
【００３２】
組換えＩＬ−１５突然変異体構造遺伝子ヌクレオチド配列を保持する組換え発現ベクターを適切な宿主微生物もしくは哺乳類細胞株内にトランスフェクトもしくは形質転換させる。
【００３３】
原核生物宿主細胞内にトランスフェクトされた発現ベクターは一般的には一つもしくは複数の表現型選択用マーカーを含む。表現型選択用マーカーは例えば、抗生物質耐性を付与するかもしくは独立栄養性の要件を共給する蛋白質をコードする遺伝子、およびその宿主内での増幅を確実に実施させるためにその宿主により認識される複製起点である。原核生物宿主細胞にとっての他の有用な発現ベクターは、市販品として入手可能なプラスミドに由来する細菌起源の選択用マーカーを含む。この選択用マーカーはクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子要素を含むことができる。ｐＢＲ３２２はアンピリシンとテトラサイクリンに対する耐性のための遺伝子を含み、そしてそのため形質転換させた細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２の「主鎖」部分を適切なプロモーターおよびＩＬ−１５突然変異体構造遺伝子配列と連結させる。他の市販品として入手可能なベクターには例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals社, Uppsala, Sweden）およびｐＧＥＭ１（Promega Biotec社，Madison, WI, USA）がある。
【００３４】
プロモーター配列は組換え原核生物宿主細胞発現ベクターについて一般に用いられる。一般のプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Chang et al., Nature 275:615, 1978; and Goeddel et al., Nature 281:544, 1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980；および欧州特許出願公開第３６，７７６号）、およびｔａｃプロモーター（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)）が含まれる。特に有用な原核生物宿主細胞発現系はλファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ不耐熱性リプレッサー配列を利用する。λＰＬプロモーターの誘導体を取り込む、the American Type Culture Collectionから取得することができるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ ３７０９２）内に存在する）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＲＲ１（ＡＴＣＣ ５３０８２）内に存在する）が含まれる。
【００３５】
哺乳類もしくは昆虫の宿主細胞培養系も組換えＩＬ−１５突然変異体を発現させるのに利用することができる。適切な哺乳類宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（Gluzman et al., Cell 23:175, (1981); ATCC CRL 1651）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株がある。適切な哺乳類発現ベクターは、例えば複製起点、プロモーター配列、構造遺伝子に連結されているエンハンサー、５’もしくは３’に近接する他の転写されない配列、例えばリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供給部位および受容部位、ならびに転写停止配列のような転写されない要素を含む。
【００３６】
哺乳類宿主細胞発現ベクター中の転写および翻訳制御配列はウイルス源から提供されうる。例えば、一般に用いられる哺乳類細胞のプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマ（Polyoma）、アデノウイルス２（Adenovirus 2）、サル ウイルス４０（Simian Virus 40）（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスから取得される。
【００３７】
ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位）を用いて哺乳類宿主細胞内の構造遺伝子配列の発現に必要とされる他の遺伝子要素を提供してもよい。ウイルスの初期および後期プロモーターが特に有用である。なぜなら、両者ともがウイルスの複製起点も含み得る断片としてウイルスゲノムから容易に取得されるためである（Fiers et al., Nature 273:113, 1978）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位内に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位にまでに亙る約２５０ｂｐの配列が含まれる限り、より小さい、またはより大きいＳＶ４０断片も用いることができる。
【００３８】
例示的哺乳類発現ベクターは、OkayamaおよびBerg（Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983）により記載される要領で構築することができる。更なる有用な哺乳類発現ベクターは、１９９０年２月１４日に出願された米国特許出願第０７／４８０，６９４号および米国特許５，３５０，６８３号に記載されている。
【００３９】
組換えＩＬ−１５突然変異体の精製
一般的に、ＩＬ−１５突然変異体ポリペプチドは、形質転換させた宿主細胞をＩＬ−１５突然変異体ポリペプチドを発現させるのに必要な培養条件下で培養することにより調製することができる。得られる発現突然変異体をその後、培養培地もしくは細胞抽出物から精製することができる。ＩＬ−１５突然変異体は、例えばAmicon社もしくはMillipore Pellicon社の限外濾過装置のような市販品として入手可能な蛋白質濃縮用フィルターを用いて濃縮することができる。濃縮段階を含む場合も、もしくは含まない場合も、その培養培地を例えば疎水性クロマトグラフィー媒質のような精製用マトリックスに適用させることができる。フェニルセファロース（Phenyl Sepharose）（登録商標）ＣＬ−４Ｂ（Pharmacia社）が好ましい媒質である。別法では、陰イオン交換樹脂を用いることができ、例えば、遊離の（pendant）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスもしくは基質を用いることができる。このマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、もしくは蛋白質精製の際に共通して利用される他のタイプのものもよい。別法ではゲル濾過用媒質を用いることもできる。
【００４０】
最終的には、例えば、遊離のブチル基もしくは他の脂肪族基を有するシリカゲルのような疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質を利用する、一つもしくは複数の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を利用して、ＩＬ−１５突然変異体を更に精製することができる。Ｓセファロース（Pharmaciａ社）の陽イオン交換カラムを最終緩衝液交換工程として用いてもよい。更には、前述の慣用化された精製工程の内の幾つかもしくは全てを様々な組合せで利用して、実質的に均一な組換え蛋白質を提供することもできる。
【００４１】
細菌培養物内で産生される組換え蛋白質は通常、始めの宿主細胞破壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドの場合の細胞ペレットからの抽出あるいは可溶性ポリペプチドの場合の上清からの抽出、そしてその後の１回もしくは複数回の、濃縮、塩析、イオン交換もしくはサイズ排除クロマトグラフィーの段階により単離される。最終的にはＲＰ−ＨＰＬＣを最終精製段階用に利用することができる。微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用を初めとするいずれかの常法により破壊することができる。
【００４２】
形質転換させた酵母宿主細胞を利用して、分泌ポリペプチドとしてＩＬ−１５突然変異体を発現させることが好ましい。酵母宿主細胞発酵物からの分泌組換えポリペプチドは、Urdalら（J. Chromatog. 296:171, 1984）により開示されたものと類似する方法により精製することができる。Urdalらは、準備されたＨＰＬＣカラム上での組換えヒトＩＬ−２の精製のための２つの連続的逆相ＨＰＬＣ段階を記載している。
【００４３】
ＩＬ−１５（配列番号１に示されるアミノ酸残基４９〜１６２の配列を有するサルのＩＬ−１５、もしくは配列番号２に示されるアミノ酸残基４９〜１６２の配列を有するヒトのＩＬ−１５）のアミノ酸残基Ａｓｐ５６もしくはＧｌｎ１５６の内の少なくとも一つが欠失しているか、もしくは天然に存在する異なるアミノ酸残基で置換されているＩＬ−１５の突然変異体を用いることが好ましい。置換および／または欠失のいかなる組合せも作製することができる。例えばＡｓｐ５６を欠失させる一方で、Ｇｌｎ１５６をいずれかの他のアミノ酸で置換させでもよく、あるいはＡｓｐ５６とＧｌｎ１５６の両方を各々同一もしくは異なるアミノ酸部分で置換させてもよい。更にはＡｓｐ５６をいずれかのアミノ酸で置換させる一方で、Ｇｌｎ１５６を欠失させてもよい。一般的には置換突然変異体が好ましく、そしてＩＬ−１５分子の天然の折り畳み構造に著しく影響を及ぼさないものが一層好ましい。置換突然変異体は好ましくは以下のものを含む：Ａｓｐ５６がセリンもしくはシステインにより置換されているもの；Ｇｌｎ１５６がセリンもしくはシステインにより置換されているもの、あるいはＡｓｐ５６とＧｌｎ１５６の両方共が各々セリンもしくはシステインにより置換されているもの。欠失突然変異体の例は以下のものを含む：成熟ＩＬ−１５のＡｓｐ５６とＧｌｎ１５６とが両方共欠失しているもの；Ａｓｐ５６のみが欠失しているもの；あるいはＧｌｎ１５６のみが欠失しているもの。Ａｓｐ５６とＧｌｎ１５６のいずれかの領域内の他のアミノ酸残基を置換もしくは欠失させ、かつその突然変異体がなおＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかもしくは両方を介するシグナル伝達を阻害する効果を有するということが可能である。従って本発明は更に、Ａｓｐ５６とＧｌｎ１５６の領域内に含まれるアミノ酸残基が置換もしくは欠失のいずれかを受けており、かつＩＬ−１５アンタゴニスト活性を保持する突然変異体を包含する。このような突然変異体は本明細書に記載される方法を用いて作製することができ、そして常法を用いてＩＬ−１５アンタゴニスト活性についてアッセイすることができる。本発明に従ってＩＬ−１５突然変異体を作製するために用いることができる方法の更に詳細な記述が実施例１に提供される。
【００４４】
複合体形成させたＩＬ−１５分子およびＩＬ−１５突然変異体
本明細書に開示される成熟ＩＬ−１５ポリペプチド（配列番号１に示されるアミノ酸４９〜１６２の配列を含む成熟したサルのＩＬ−１５、および配列番号２に示されるアミノ酸残基４９〜１６２の配列を有する成熟したヒトのＩＬ−１５）、ならびにＩＬ−１５突然変異体を、他の化学部分との共有結合性複合体もしくは凝集性複合体を形成させることにより改変してもよい。このような部分は、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持しながらＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−鎖へのＩＬ−１５の結合を阻害することができる、ＩＬ−１５分子上の特異的部位における、ＰＥＧ、ｍＰＥＧ、デキストラン、ＰＶＰ、ＰＶＡ、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リシンもしくはポリヒスチジン）、アルブミン、およびゼラチンを含むことができる。さらに、ＩＬ−１５を、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持しながら、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−鎖へのＩＬ−１５の結合を阻害することができる部位で特異的にグリコシル化することもできる。複合体形成用の好ましい基は、ＰＥＧ、デキストラン、およびＰＶＰである。本発明における使用に最も好ましいものはＰＥＧであり、このＰＥＧの分子量は約１，０００〜約２０，０００の間であることが好ましい。約５０００の分子量がＩＬ−１５の複合体形成を実施するには好ましいが、他の分子量のＰＥＧ分子も同様に適切であろう。多種多様のＰＥＧ形態が本発明の使用に適する。例えばＰＥＧをスクシンイミジルコハク酸ＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）（このＳＳ−ＰＥＧはインビボでの加水分解的開裂に感受性を示すエステル結合を提供する）、スクシンイミジル炭酸ＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）（このＳＣ−ＰＥＧはウレタン結合が提供し、かつインビボでの加水分解的開裂に安定である）、スクシンイミジルプロピオン酸ＰＥＧ（ＳＰＡ−ＰＥＧ）（このＳＰＡ−ＰＥＧは、インビボで安定なエーテル結合を提供する）、ビニルスルホンＰＥＧ（ＶＳ−ＰＥＧ）、およびマレイミドＰＥＧ（Ｍａｌ−ＰＥＧ）の形態で用いられることができ、これら全てはShearwater Polymers, Inc. 社（Huntsville, AL）から市販品として入手することができる。一般的には、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、およびＳＰＡ−ＰＥＧはポリペプチド中のリシン残基と特異的に反応する一方で、ＶＳ−ＰＥＧおよびＭａｌ−ＰＥＧの各々は遊離のシステイン残基と反応する。しかしながらＭａｌ−ＰＥＧはアルカリ性ｐＨではリシン残基と反応する傾向にある。ＳＣ−ＰＥＧおよびＶＳ−ＰＥＧが好ましく、かつそのインビボでの安定性およびリシン残基に対する特異性のためＳＣ−ＰＥＧが最も好ましい。
【００４５】
ＰＥＧ部分はＰＥＧの巨大分子サイズを利用すると、ＩＬ−１５の攻略的部位に結合させることができる。先に記載したようにＰＥＧ部分は蛋白質内に天然に存在するリシンもしくはシステイン残基を利用することによるか、または部位特異的ＰＥＧ結合化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）によりＩＬ−１５に結合させることができる。部位特異的ＰＥＧ結合化（PEGylation）の一方法は、システインもしくはリシン残基が特異的アミノ酸位置でＩＬ−１５に取り込まれる蛋白質工学の方法を介する。ＩＬ−１５に複合体結合される巨大分子サイズのＰＥＧ鎖（一つもしくは複数）はＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／もしくはγ−サブユニットには結合するが、α−サブユニットには結合しないＩＬ−１５の領域を遮断するものと考えられる。複合体形成は、ＩＬ−１５を含む塩基性溶液にＰＥＧを添加するという簡潔な添加反応により実施することができる。典型的にはＰＥＧ結合化（PEGylation）は、（１）ｐＨ約９．０かつ約１：１〜１００：１もしくはそれを上回るリシン残基に対するＳＣ−ＰＥＧの分子的比率で；あるいは（２）ｐＨ約７．０かつ約１：１〜１００：１もしくはそれを上回るシステイン残基に対するＶＳ−ＰＥＧの分子的比率でかのいずれかで実施される。
【００４６】
複合体形成され、ＰＥＧ結合化（PEGylation）を受けたＩＬ−１５分子の特徴決定は、Novex Corp. 社、San Diego, Californiaから入手することができる４〜２０％の密度勾配ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施することができる。慣用化され銀染色を利用してもよく、あるいは銀染色によっては容易に可視化されない高度にＰＥＧ結合化（PEGylation）された蛋白質については慣用化されたウエスタンブロット技術を利用することもできる。ＰＥＧ結合化（PEGylation）されたＩＬ−１５分子の精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、限外濾過、もしくは親和性精製を用いて実施することができる。
【００４７】
ＰＥＧ結合化（PEGylation）されたＩＬ−１５の改変および不均質性の程度は、レーザー脱離イオン化質量分析法（laser desorption ionization mass spectrometry）（ＭＡＬＤＩ）の助けを借りて慣用化されたマトリックスを用いて決定することができる。ヒトＩＬ−１５は約１３，０００の分子量を有するため、そして５０００の分子量を有するＰＥＧを用いることにより、ＭＡＬＤＩによって１３，０００の分子量と測定される調製物はＰＥＧ結合化（PEGylation）されてはおらず、１８，０００の分子量と測定される調製物は１分子のＩＬ−１５が一つのＰＥＧ分子に結合しており、２３，０００の分子量と測定される調製物は一つのＩＬ−１５分子が２つのＰＥＧ分子に結合している、等が示唆される。
【００４８】
ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体
あるいは、本発明のアンタゴニストは、 ＩＬ−１５レセプター複合体のα−、β−、もしくはγ−サブユニットの内のいずれかに対するＩＬ−１５の結合を阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体の形態をとることができる。本発明の一つの態様では、ＩＬ−１５（その誘導体を含む）ならびに例えばＩＬ−１５ペプチドのようなそれらの蛋白質の部分もしくは断片を用いてＩＬ−１５に特異的に結合する抗体を調製することができる。本発明では用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片のようなそれらの断片、ならびに組換え的に産生させた結合用パートナーを含むものと理解されるべきである。モノクローナル抗体もしくは結合用パートナーの親和性は当業者により容易に決定することができる（Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51: 660-672 (1949) を参照されたい）。このようなモノクローナル抗体の具体例が本明細書の実施例２に提供される。
【００４９】
一般的にはＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体は以下の方法を用いて作製することができる。精製されたＩＬ−１５、その断片、合成ペプチド、もしくはＩＬ−１５を発現する細胞を用い、それ自体既知の技術（例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に記載される技術）を用いてＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体を作製することができる。簡潔に述べると、完全フロイト（Freund's）アジュバントもしくはＲＩＢＩアジュバント（RIBI Corp.社, Hamilton, Montana）内に乳化させたＩＬ−１５を免疫原としてマウスを免役し、かつＩＬ−１５の１０〜１００μｇの範囲の量を皮下的もしくは腹腔内に注射した。１０〜１２日後に免疫化させた動物に不完全フロイト（Freund's）アジュバント内に乳化させた追加的ＩＬ−１５で追加免疫する。マウスにはその後毎週一回もしくは２週間に１回の免疫化スケジュールで追加免疫を施す。血清試料を眼窩後出血もしくは尾末端切開により周期的に採取してドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素抗原免疫吸着アッセイ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay））、もしくはＣＴＬＬ−２細胞上でのＩＬ−１５活性の阻害によりＩＬ−１５抗体についての検査を実施する。
【００５０】
適切な抗体力値の検出の後には、陽性動物に食塩水中のＩＬ−１５の追加的静脈内注射を行う。３〜４日後にその動物を屠殺し、脾臓細胞を回収し、そして脾臓細胞を例えばＮＳ１もしくは好ましくはＰ３（６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）のようなマウス骨髄腫細胞株（myeloma cell line）に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が作製され、これを複数のマイクロタイタープレート内のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）選択用培地内でプレート培養させて非融合骨髄腫細胞および骨髄腫同士のハイブリッドの増殖を阻害させる。
【００５１】
このハイブリドーマ細胞を、Engvallら、Immunochem. 8:871、1971、および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適用により、精製されたＩＬ−１５に対する反応についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術はBeckmannら（J. Immunol 144: 4212, 1990）に記載される抗体捕獲技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウス内に腹腔内注射して、高濃度の抗−ＩＬ−１５モノクローナル抗体を含む腹水を産生することができる。別法ではハイブリドーマ細胞を様々な技術によりフラスコもしくはローラーボトル内でインビトロで増殖させることができる。マウス腹水内に産生されたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿およびその後のゲル排除クロマトグラフィーにより精製することができる。別法では、プロテインＡもしくはプロテインＧに対する抗体の結合を基にする親和性クロマトグラフィー、そして同様にＩＬ−１５への結合を基にする親和性クロマトグラフィーも用いることもできる。
【００５２】
他の「抗体」も本明細書に提供される開示を利用して調製することができ、従って、それらの抗体は本発明の範囲内に含まれる。ヒト化抗体を作製するのに用いられる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号および国際公開第９４／１０３３２号に見いだすことができ：微生物体を作製するための方法は国際公開第９４／０９８１７号に見いだすことができ：そしてトランスジェニック抗体を作製するための方法は英国特許第２ ２７２ ４４０号において見いだすことができ、これら全ては引用により本明細書に取り込まれる。
【００５３】
どのモノクローナル抗体がアンタゴニストであるかを決定するためには、スクリーニングアッセイの使用が好ましい。ＣＴＬＬ−２増殖アッセイがこの目的のためには好ましい。GillisおよびSmith, Nature 268:154 (1977)、を参照されたい（これは引用により本明細書に取り込まれる）。
【００５４】
本発明のアンタゴニストについては、先に記載されるように、かつ以降より詳細に記載されるように、同種移植片の生残率を亢進させる際、および移植片対宿主疾患を患う患者を治療する際の使用が見いだされた。当該アンタゴニストについての他の確かな使用法には、後期ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウイルス）Ｉ−誘導性成人Ｔ細胞白血病リンパ腫の治療がある。Burtonら、Proc. Natl. Acad. Sci., 91:4935 (1994)、を参照されたい。他の確かな使用法には、インビトロでのＢ細胞もしくはＴ細胞刺激を妨げる能力、レセプター−リガンド相互作用の調査、胃腸管の感染性疾患および障害用の診断用キットでの使用が含まれる。本発明のアンタゴニストの活性のために、所定の疾患を治療する新方法が本発明の範囲内に含まれる。例えば、同種移植片を必要とする患者での同種移植片拒絶反応を予防するための方法、および同種移植片を必要とする患者でのＧＶＨＤを治療する方法が開示され、各方法は、ＩＬ−１５活性を阻害するのに効果的な量のＩＬ−１５アンタゴニストおよび薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む薬剤組成物を投与する段階を含む。標的細胞（疾患状態もしくはその疾患状態の症状の主原因であると考えられる細胞）がＩＬ−１５レセプター複合体を発現し、かつＩＬ−１５レセプターのβ−もしくはγ−サブユニットを介するシグナル伝達の遮断もしくは阻害が所望される同様の方法も他の疾患を治療するのに有用である。このような疾患状態は、標的細胞がＩＬ−１５レセプター複合体を発現するということがわかった際には本発明のアンタゴニストで治療することが可能でありうる。実際、ＧＶＨＤおよび同種移植片拒絶反応に加え、このような疾患状態は例えばリンパ腫、癌、白血病、横紋肉腫、および例えばリューマチ性関節炎のような所定の自己免疫疾患を含んでよい。標的細胞が必要とされるＩＬ−１５レセプター複合体を発現する全ての疾患状態を、前述のリストは網羅し尽くしてはいない、という事実をもって本発明の範囲を限定するとして見なすべきではない。
【００５５】
先に記載されるように、本発明の他の態様は、本発明のＩＬ−１５突然変異体をコードする核酸である。このような核酸は、配列番号１の１４４〜４８６および配列番号２の１４４〜４８６のヌクレオチド配列を有するＲＮＡもしくはｃＤＮＡのいずれかを含む。ＩＬ−１５突然変異体をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターおよびそのような発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせた宿主細胞も更に本発明の範囲に含まれる。形質転換させた宿主細胞とは、標準技術を用いて組換え発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせてある細胞である。発現される哺乳類ＩＬ−１５は宿主細胞内に存在する、および／または培養上清内に分泌され、これは宿主細胞およびその宿主細胞内に挿入された遺伝子構築物の性質に依存する。既述のＩＬ−１５アンタゴニストの内のいずれかを含む薬剤組成物も本発明に包含される。
【００５６】
ＩＬ−１５のアンタゴニストの投与
本発明は、適切な希釈剤もしくは担体中に有効量のＩＬ−１５アンタゴニストを含む薬剤組成物を用いる方法を提供する。本発明のＩＬ−１５アンタゴニストは、薬剤学的に有用な組成物を調製するために用いられる既知の方法に従って処方することができる。ＩＬ−１５アンタゴニストを、単一の活性物質としてかもしくは他の既知の活性物質と一緒にかのいずれかの状態で、混合剤として、薬剤学的に適切な希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、保存料（例えば、チメロサル（Thimerosal）、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント、および／または担体と組み合わせることができる。適切な担体およびそれらの製剤法はRemington s Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co.に記載されている。それに加え、このような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体形成しているか、もしくは例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのような重合性化合物内に取り込まれているか、あるいはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多重層のベシクル、赤血球ゴースト、またはスフェロブラスト内に取り込まれるＩＬ−１５アンタゴニストを含むことができる。このような組成物はＩＬ−１５アンタゴニストの物理的状態、溶解度、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでの浄化速度に影響を及ぼすであろう。更にはＩＬ−１５アンタゴニストを、組織特異的レセプター、リガンドもしくは抗原に対する抗体に複合体形成させるか、または組織特異的レセプターのリガンドに連結させることもできる。
【００５７】
本発明のＩＬ−１５アンタゴニストを、局所的、非経口的、直腸的に投与するか、または吸入により投与することができる。用語「非経口的」には皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射、もしくは注入技術がある。これらの組成物は典型的には有効量のＩＬ−１５アンタゴニストを単独でか、もしくは有効量の他のいずれかの活性物質と組み合わせて含むであろう。組成物中に含まれる、このような服用量および所望される薬剤濃度は、意図される使用法、患者の体重および年齢、ならびに投与経路を初めとする多くの因子に依存して変化してよい。予備用量は動物実験に従って決定することができ、そしてヒト投与のための用量計測は当該技術に許容される常法に従って実施することができる。
【００５８】
先に加え、以下の実施例が特定の態様を詳細に説明するために提供され、かつこれらの実施例は本発明の範囲は制限しない。
【実施例】
【００５９】
実施例１
ＩＬ−１５の突然変異体
この実施例は、ＩＬ−１５のアンタゴニストとして機能する、成熟ＩＬ−１５もしくは天然のＩＬ−１５の突然変異体を取得するための方法を記載する。ＩＬ−１５はＩＬ−２同様、ＩＬ−２Ｒβγ複合体に結合し、そしてその複合体を通してシグナル伝達を行うことができ、そしてそれ自体ＩＬ−２と構造的類似性を共有することが提案されている。ＩＬ−２においてＩＬ−２Ｒ β−およびγ−鎖（Zurawski et al., EMBO J., 12 (13):5113 (1993)）との相互作用にとって重要であることが既に示されている残基と等価のＬ−１５中の残基をベストフィット配列アラインメントにより、β−鎖についてはアスパラギン酸（残基５６（Ａｓｐ））であり、そしてγ−鎖についてはグルタミン（残基１５６（Ｇｌｎ））であることを決定した（アミノ酸の番号付けは、配列番号１および２のアミノ酸残基１〜１６２により示されるペプチドの配列に基づく）。
【００６０】
ヒトＩＬ−１５を増幅し、かつ残基５６もしくは１５６のいずれかでセリンもしくはシステインのいずれかをコードするコドンを誘導するようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。２回の別個のＰＣＲ増幅周期を各突然変異体の構築のために実施した（以下の略図を参照されたい）。初回ＰＣＲ反応では増幅は適切な突然変異を導入するか、もしくは成熟配列を増幅するかのいずれかを実施するプライマー対を用いた。二次ＰＣＲ反応では第一周期からの物質を、ｐαＡＤＨ２酵母発現ベクターｐＩＸＹ４５６内にクローニングするための制限酵素を組み込ませるプライマー対を用いて再増幅させた。Priceら、Gene, 55:287 (1987)およびPriceら、Meth. Enzym. 185:308 (1990)、を参照されたい。
【００６１】
【化１】
【００６２】
以下の表は各突然変異体の初回増幅のために用いられたオリゴヌクレオチドプライマー対を列挙する。オリゴヌクレオチドＮＴＦＩＬ１５Ｂ（５’プライマー）およびＮＣＴＦＩＬ１５Ｆ（３’プライマー）を、成熟配列の維持が所望される場合の初回増幅用に用いた。
【００６３】
【表１】
【００６４】
あるいは、オリゴヌクレオチドＮＴＦＩＬ１５ＢをオリゴヌクレオチドＩＬ１５ＰＩＸＹＦ５と置換することができ、かつオリゴヌクレオチドＮＣＴＦＩＬ１５ＦをオリゴヌクレオチドＩＬ１５ＰＩＸＹ３と置換することができる。初回ＰＣＲ増幅は、２５０μＭ ｄＮＴＰおよび５０ｐモルの５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーを含む１００μｌの１Ｘ Ｔａｑ ポリメラーゼ緩衝液（Boehringer社）中で実施した。用いたＤＮＡ鋳型は約５０ｎｇのｐＩＸＹ７６４であった。ベクターｐＩＸＹ７６４は既述のベクターｐＩＸＹ４５６に類似しており、そのｐＩＸＹ４５６はヒトｆｌａｇ ＩＬ−１５をコードするＤＮＡ含み、このＤＮＡではヒトＩＬ−１５のＮ−結合型グリコシル化部位が先に記載される方法を用いて不活化されている。反応混合物にミネラルオイルを重層し、そしてサーマルサイクラー中で９４℃にまで５分間加熱してから、２単位のＴａｑ ポリメラーゼ（Boehringer社）の添加およびサーマルサイクリングの開始を行った。サイクリング条件は９４℃４５秒間の変性、４５℃４５秒間のアニーリング、および７２℃１分間の伸長、を総計３０サイクルであった。
【００６５】
初回増殖からの約２０ｎｇのゲル精製産物を二次ＰＣＲ増幅用の鋳型として用いた。全構築物は以前と同一の緩衝液条件を用い、ＩＬ１５ＰＩＸＹＦ５およびＩＬ１５ＰＩＸＹ３で増幅させた。サイクリング条件は、９４℃４５秒間の変性、６０℃４５秒間のアニーリング、および７２℃１分間の伸長を、総計２０周期であった。
【００６６】
増幅産物をゲル精製し、そしてＡｓｐ７１８（Boehringer社）およびＮｃｏＩ（New England Biolabs社）を用い、１Ｘ Boehringer緩衝液Ｂ中、３７℃で一晩消化させた。この制限産物を、Ａｓｐ７１６およびＮｃｏＩで消化させてあるｐＩＸＹ４５６酵母発現ベクター内に連結させた。このＤＮＡを用いて電気穿孔によりＤＨ１０β大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞を形質転換させた。
【００６７】
単一形質転換体からのプラスミドＤＮＡの配列決定を実施して配列の完全性を確認し、そしてこれを用いてＸＶ２１８１ Ｓ．セルビジエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換させた。生物学的活性は３０時間の誘導後の酵母上清を用いてアッセイした。
【００６８】
これらの実験は、突然変異誘発部位がＩＬ−１５遺伝子の両末端付近に位置しているため、突然変異誘発用のＰＣＲを基にする攻略法を利用した。しかしながらこれらの突然変異、および他のいずれかの単一もしくは複数の点突然変異は、通常の部位特異的突然変異誘発技術により組み込ませることもできる。
【００６９】
実施例２
ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体
この実施例は、ＩＬ−１５のアンタゴニストとして機能する３つの抗ＩＬ−１５モノクローナル抗体を取得するのに用いられた方法を記載する。用いられた全方法は注釈がなされている以外は常法である。
【００７０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＲＩＢＩアジュバント（RIBI Corp.社、Hamilton, Montana）の存在下で１０μｇの酵母由来のヒトＩＬ−１５を３週間の間隔を開けて２度腹腔内に注射した。その後にマウス血清を、通常のドットブロット技術、抗体捕獲（ＡＢＣ）、および中和アッセイ（ＣＴＬＬ−２アッセイ）によりアッセイして、どの動物が融合に最適であるかを決定した。３週間後にマウスに、滅菌ＰＢＳ中に懸濁させた３μｇのヒトＩＬ−１５の静脈内ブースター注射を施した。３日後にマウスを屠殺し、そして確立されたプロトコールに従い脾臓細胞をＡｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と融合させた。簡潔に述べると、Ａｇ８．６５３細胞を無血清培地中で数回洗浄し、そしてマウス脾臓細胞に、一つの骨髄腫細胞に対して３つの脾臓細胞の割合で融合させた。融合剤は５０％ＰＥＧ：１０％ＤＭＳＯ（Sigma社）であった。融合物を、ＨＡＴを補足したＤＭＥＭ培地を含む２０枚の９６ウエル平底プレート（Corning社）内でプレート培養させ、そして８日間増殖させた。得られたハイブリドーマからの上清を回収し、そしてヤギ抗マウスＩｇで最初にコーティングしてある９６ウエルのプレートに６０分間添加した。洗浄後に、１２５Ｉ−ＩＬ−１５を各ウエルに添加し、室温で６０分間インキュベートし、そして４回洗浄した。その後に陽性ウエルを、Kodak X-Omat Ｓフィルムを用いて−７０℃下でオートラジオグラフィーにより検出した。陽性クローンをバルク培養物として増殖させ、そしてその後に上清をプロテイン（Protein）Ａカラム（Pharmacia社）にかけて精製した。その後にはＭ１１０、Ｍ１１１、およびＭ１１２と表示されるクローンのアイソタイプを各々ＩｇＧ１モノクローナル抗体と決定した。モノクローナル抗体Ｍ１１０、Ｍ１１１、およびＭ１１２を産生するハイブリドーマは、１９９６年３月１３日に、the American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC)に寄託してあり、そして各々受託番号ＨＢ−１２０６１、ＨＢ−１２０６２、およびＨＢ−１２０６３を割り当てられている。全寄託物はブタペスト条約の規定に従って実施した。
【００７１】
産生されたモノクローナル抗体を、Gillisら（前述）により本質的に記載されるＣＴＬＬ−２アッセイを用いてＩＬ−１５アンタゴニスト活性についてアッセイすることができる。
【００７２】
実施例３
改変ＩＬ−１５分子
この実施例は、ＩＬ−１５アンタゴニストとして機能する改変ＩＬ−１５分子を取得するための方法を記載する。
【００７３】
ＰＥＧ化させた（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＩＬ−１５
全複合体形成反応は、Shearwater Polymers, Inc. 社（Huntsville, AL）からスクシンイミジルコハク酸ＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）、スクシンイミジル炭酸ＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）、ＶＳ−ＰＥＧ、およびＭａｌ−ＰＥＧの形態で取得した分子量５０００のＰＥＧを用いて実施した。 ＳＳ−ＰＥＧとＳＣ−ＰＥＧとの両方はリシンのε−アミノ基と反応し、 ＳＳ−ＰＥＧの場合には加水分解に対して不安定なエステル結合を形成し、そしてＳＣ−ＰＥＧの場合には加水分解に対して安定なウレタン結合を形成する。ＰＥＧ化（PEGylation）は、ＳＳ−ＰＥＧとＳＣ−ＰＥＧについてはｐＨ９．０で５０ｎＭ ＮａＨ２ＰＯ４中で；そしてＶＳ−ＰＥＧとＭａｌ−ＰＥＧを含む反応物についてはｐＨ７．０で実施した。これらの反応は１００μｇ／ｍｌ、０．５ｍｌの容積で進行させた。各反応で、ＰＥＧを、１：１、３：１、１０：１、および１００：１のリシンに対するＰＥＧのモル比率で反応混合物に添加した（サルの各ＩＬ−１５分子中には９つのリシン残基が存在する）。これらの反応を４℃下で一晩進行させた。
【００７４】
ＰＥＧ化させた（PEGylated）サルのＩＬ−１５の特徴決定は、４〜２０％の密度勾配ポリアクリルアミドゲル（Novex 社、San Diego, California）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施した。約０．５μｇ／ラインでゲルにのせた改変させていないＩＬ−１５蛋白質については通常の銀染色技術を用いた。高度にＰＥＧ化された（PEGylated）サルＩＬ−１５蛋白質は、可視化させるためにゲルに多めの蛋白質をのせる必要があった。高度にＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５の特徴を決定するためにはウエスタン（Western）ブロットも用いた。これらの実験ではＰＥＧ化された（PEGylated）サルＩＬ−１５をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、ニトロセルロース膜に移し、モノクローナル抗体 Ｍ１１１と共にインキュベートし、その後にヤギ抗マウスＨＲＰと共にインキュベートし、そして最後に4CN Membrane Peroxidase Substrate System（Kirkegaard & Perry Laboratories社、Gaithersburg, MD）を用いて可視化させた。ＰＥＧ化された（PEGylated）サルＩＬ−１５は更に慣用化された技術に従い、Biosil SEC-250サイズ決定用カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣにより性質決定を行った。
【００７５】
ＳＣ−ＰＥＧ化された（ＳＣ−PEGylated）ＦＬＡＧ−サルＩＬ−１５を、細胞膜表面にＩＬ−１５のα−、もしくはβ−およびγ−レセプターサブユニットを発現するトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に結合する能力について検査した。ＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５Ｒ α−サブユニットを発現するＣＯＳ細胞への放射ラベル化されたＩＬ−１５の結合を阻害し、このことによりＰＥＧ化された（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＩＬ−１５がＩＬ−１５Ｒ α−サブユニット結合に関して競合することが示された。更にＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５はβ−およびγ−レセプターサブユニットを発現するＣＯＳ細胞への放射ラベル化されたＩＬ−１５の結合は阻害せず、このことによりＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／またはγ−レセプターサブユニットには結合しないことが示された。従って、ＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５は、内因性ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−およびγ−レセプターサブユニットを介するシグナル伝達に影響を及ぼすことを妨げる。
【００７６】
実施例４
ＣＴＬＬ−２アッセイにおけるＩＬ−１５活性の阻害
この実施例は更に、本発明のアンタゴニストによる、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−およびγ−レセプターサブユニットを介するＩＬ−１５のシグナル伝達の阻害を決定するための方法を詳細に説明する。
【００７７】
モノクローナル抗体、ＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５、およびＩＬ−１５突然変異体のアンタゴニスト活性は、改変させたＣＴＬＬ−２細胞３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ（Gills et al., 上述）を用いてアッセイすることができる。アンタゴニストの連続希釈物を、９６−ウエルの平底組織培養用プレート（Costar社、Cambridge, MA）で、ＤＭＥＭ培地（５％ＦＣＳ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸Ｎａ、ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２−ｍｅ、ＰＳＧが補足してある）中、５０μｌの最終容積で作製することができる。その後、試料の連続希釈後かつ細胞の添加前に、至適下量のＩＬ−１５（２０〜４０ｐｇ／ｍｌの最終濃度）を全アッセイウエルに添加する（５μｌ／ウエル）。洗浄したＣＴＬＬ−２細胞を添加し（５０μｌ中、約２０００／ウエル）、そしてそれらのプレートを空気中１０％ＣＯ２の湿潤化させた大気中、３７℃で２４時間インキュベートする。この後に０．５μＣｉの３Ｈ−チミジン（２５Ｃｉ／ｍモル（Ｍｏｌ）、Amersham社、Arlington Heights, IL）と共に５時間インキュベートさせた。その後にそれらの培養物をガラス繊維性フィルター上で回収し、そしてマルチディテクターダイレクトベータカウンター(multidetector direct beta counter)(Matrix 96、Packard Instrument Company社、Meridien, CT) もしくはベータシンチレーションカウンターのいずれかでアバランシェガス電離により計数する。このアッセイにより生じるカウント／分（ＣＰＭ）をパーセント阻害率に変換し、そして滴定を行ったアンタゴニスト試料各々のパーセント阻害率の値を用いて単位／ｍｌでのアンタゴニスト活性を算出する。
【００７８】
ＣＴＬＬ阻害アッセイ中で４０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１５を中和するのに必要とされる濃度を示すデータが以下の表Ｉに提供される。以下の表ＩＩは、ＣＴＬＬおよびＣＴＬＬ阻害アッセイにおけるＩＬ−１５（アゴニスト活性）およびＩＬ−１５アンタゴニストの活性を示す。
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的には、本明細書でインターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）として引用される哺乳類上皮由来Ｔ細胞因子ポリペプチドのアンタゴニストに関する。本発明はより具体的には、ＩＬ−１５の突然変異体、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体、およびＩＬ−１５複合体に関し、これらは各々インビトロＣＴＬＬアッセイにおいてＴ−リンパ球の増殖を刺激化するＩＬ−１５の能力を有意に減少させる。ＩＬ−１５活性の減少が所望される、哺乳類の様々な疾患状態を治療するための方法も本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インターロイキン−１５はＩＬ−２依存性細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖を支援することができる既知のＴ−細胞増殖因子である。ＩＬ−１５はGrabsteinらにより、Science, 264:965 (1994) に、１１４アミノ酸の成熟蛋白質をもたらす、４８アミノ酸リーダー配列を含む１６２アミノ酸前駆体ポリペプチドを含む分泌型サイトカインとして初めて報告された。 Grabsteinらは更に、３１６ｂｐの５’非コーディング領域および４８６ｂｐの読み取り枠（もしくは停止コドン用の３ｂｐを含む場合には４８９ｂｐの読み取り枠）、および４００ｂｐの３’非コーディング領域を含む、１６２アミノ酸前駆体をコードする全長ヒトｃＤＮＡのクローニングも記載している。
【０００３】
ＩＬ−１５はＩＬ−２と多くの性質を共有している。これらの性質には、ヒトおよびマウスのＴ細胞の増殖および活性化、リンホカインにより活性化されたキラー細胞（ＬＡＫ）活性、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）活性、および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性の誘導、ならびにＢ細胞の増殖と分化との同時刺激化がある。
【０００４】
それに加えＩＬ−１５とＩＬ−２とは、Ｔ細胞膜表面上の少なくとも３つの異なるレセプターサブユニットに結合することが可能な構造的に相同な分子である。ＩＬ−２レセプターは少なくとも３つのサブユニット、すなわちα、β、およびγを含む（Toshikazu et al., Science, 257:379 (1992)）。ＩＬ−１５とＩＬ−２の両方共は共通のβ−γサブユニット複合体への結合性を共有している一方で、ＩＬ−１５とＩＬ−２の各々が特異的α−レセプターサブユニット（各々、ＩＬ−１５Ｒα およびＩＬ−２Ｒα）に結合する。最近ではＩＬ−１５Ｒαが発見され、かつ同時係属中の米国特許出願第08/300,903号の主題となっている。ＩＬ−２レセプターのα−鎖に対する抗体（抗−ＩＬ−２Ｒα）はＩＬ−１５結合には何の効果も有さない（Grabstein et al., 前述）。ＩＬ−２レセプターのβ−サブユニットに対する抗体、すなわちＴＵ２７、ＴＵ１１、もしくはＭｉｋβ１はしかしながらＩＬ−１５の活性を遮断することが可能であり、このことによりＩＬ−１５がシグナル伝達のためにβ−サブユニットを用いることが示唆される。同様に、ＩＬ−２レセプターのγ−鎖がシグナル伝達に必要とされる（Giri et al., EMBO J., 13:2822 (1944)）。ＩＬ−１５レセプター複合体のβおよびγ−サブユニットの組合せはトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞上のＩＬ−１５に結合するが、ただし、いずれのサブユニットも単独では結合を生じない。
【０００５】
所定の疾患状態および生理学的状態はＴ細胞により媒介される。このような疾患には、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、自己免疫疾患、リューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、皮膚障害、インシュリン依存性糖尿病、眼障害、および突発性ネフローゼ症候群／突発性膜性腎症が含まれる。実際のところ、同種移植片拒絶反応および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）はＩＬ−２レセプター発現の増加に関連している。外来性組織適合性抗原に応答して活性化されるＴ細胞がＩＬ−２レセプター複合体を発現するようである。様々な治療法が提案および研究されている。例えば、Tinubuら（J. Immunol.,153:4330 (1994)）は、抗ＩＬ−２Ｒβモノクローナル抗体であるＭｉｋβ１が霊長類の心臓同種移植片の生残期間を延長させることを報告した。急性同種移植片拒絶反応に関連してＣＤ４−およびＣＤ８−発現性細胞上にはＩＬ−２Ｒβサブユニット発現が増加し、このことによりＩＬ−２Ｒβサブユニット発現が同種反応性Ｔ細胞では増加するように思えることが示唆される。例えば、Nigumaら，Transplantation, 52:296 (1991)、を参照されたい。
【０００６】
しかしながら本発明以前には、ＧＶＨＤを治療するための手段として、または、同種移植生残率を亢進させるための、ＩＬ−１５リガンド−レセプター相互作用に焦点を当てた治療法は全く存在しなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＩＬ−１５アンタゴニスト並びにヒト疾患の治療のためにそのアンタゴニストを用いる方法に関する。具体的にはそのような治療法には哺乳類における同種移植片の生残率を亢進させること、およびＧＶＨＤを治療することが含まれる。ＩＬ−１５アンタゴニストは、ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介して細胞へシグナルを伝達することを防ぎ、よってＩＬ−１５の生物学的活性を拮抗することにより効力を発揮する。本発明の所定のアンタゴニストはＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットに結合することを妨害する一方で、 ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合は実質的には妨害しない。
【０００８】
本発明のアンタゴニストには、成熟ＩＬ−１５もしくは天然のＩＬ−１５の突然変異体が含まれ、この場合ＩＬ−１５には、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットへの結合の際に機能する、一つもしくは複数のアミノ酸残基または領域に突然変異を生じさせてある。このような突然変異体は ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持しながらも、ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介して細胞にシグナルを伝達することを阻害する。典型的にはこのような突然変異体は重要な位置（例えば、各々が配列番号１および２に示されるサルおよびヒトのＩＬ−１５のＡｓｐ５６もしくはＧｌｎ１５６である）での追加、欠失、もしくは置換により作製される。Ａｓｐ５６がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−サブユニットとの結合に影響を及ぼし、そしてＧｌｎ１５６がそのγ−サブユニットとの結合に影響を及ぼすものと考えられる。
【０００９】
さらに、本発明は、成熟ＩＬ−１５と免疫反応し、かつＩＬ−１５レセプター複合体へのシグナル伝達を阻害するモノクローナル抗体を含む。
ＩＬ−１５Ｒαに結合する能力を保持するが、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／またはγ−サブユニットに対する親和性が実質的に減少しているかもしくはそのような親和性を全く有さない改変ＩＬ−１５分子も更に本発明の範囲内に含まれる。改変ＩＬ−１５分子は、結合が妨害もしくは妨げられるような様式で（通常は標的結合部位もしくはその近傍での改変）その改変が作製されている限り、いかなる形態でもよい。このような改変ＩＬ−１５分子の例には、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５レセプター結合を立体的に妨害する一つもしくは複数の化学基に共有結合により複合体形成させられる成熟ＩＬ−１５もしくはＩＬ−１５の突然変異体がある。例えば成熟ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持しながらも、そのＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−鎖に対するＩＬ−１５の結合を阻害することができるＩＬ−１５分子上の特異的部位に部位特異的グリコシル化を含ませてもよく、あるいは例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リシンもしくはポリヒスチジン）、アルブミン、ゼラチン等の基に共有結合により結合させてもよい。その基の立体障害特性を利用することにより、特異的レセプターサブユニットへの結合を拮抗することができる。ＰＥＧ鎖を、例えばＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、アスパラギナーゼ、免疫グロブリン、ヘモグロブリン、およびその他のもののような蛋白質に対して複合体形成させることのの他の利点は、当該技術分野に知られている。例えば、ＰＥＧがインビボでの循環半減期を延長させること（例えば、Delgado, et al., Crit. Rev. Ther. Drug. Carr. Syst., 9:249 (1992)、を参照されたい）、溶解度を高めること（例えば、Katre, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:1487 (1987)、を参照されたい）、および免疫原性を減少させること（例えば、Katre, N.V., Immunol. 144:209 (1990)、を参照されたい）が知られている。
【００１０】
本発明は更に、Ｔ細胞上でのＩＬ−１５活性の減少が所望される疾患もしくは症状を治療する方法における上記アンタゴニストの使用にも関する。そのような疾患には、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、自己免疫疾患、リューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、皮膚疾患、インシュリン依存性糖尿病、眼疾患、および突発性ネフローゼ症候群／突発性膜性腎症が含まれる。。具体的には同種移植片拒絶反応の際には、ＩＬ−１５活性はその移植片に対する宿主免疫応答を、そして最終的には拒絶反応をもたらすことがある。同様にＧＶＨＤでは、移植片（典型的には、骨髄移植片）は宿主に対する免疫応答をもたらす。本発明のＩＬ−１５アンタゴニストによるこのような活性の抑制は、移植片残存を亢進および延長させるという点、ならびにＧＶＨＤを治療するという点で有利でありうる。
【００１１】
様々な研究者らが、例えば抗ヒトＩＬ−２α−レセプターモノクローナル抗体、抗−ＴＡＣのような抗体を用いることによる移植片生残の延長を報告している。例えば、Reedら，Transplantation, 47:55-59 (1989) を参照されたい（この文献では、抗−ＴＡＣは霊長類の腎臓同種移植片移を改善したことが示されている）。更にBrownら、Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2663 (1991) は、霊長類の心臓同種移植片生残を延長させる際のヒューマナイズド抗−ＴＡＣの使用を記載している。Kirkmanら、Transplantation, 51:107 (1991)、もやはり初期同種移植片拒絶反応を回避させる際の抗−ＴＡＣを必要とする臨床試験を記載している。ＩＬ−１５はＩＬ−２に類似する多くの生物学的活性を保持し、そして実際にＩＬ−２と所定のレセプターサブユニットを共有するため、疾患状態におけるＩＬ−１５の有害活性の妨害が顕著な治療的可能性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１５レセプター複合体を介するＩＬ−１５のシグナル伝達を妨害するＩＬ−１５活性のアンタゴニストに関する。具体的には、本発明のＩＬ−１５アンタゴニストは、（ａ）ＩＬ−１５レセプターのα−サブユニットへの結合が可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／もしくはγ−サブユニットを介するシグナルの伝達が不可能である成熟ＩＬ−１５もしくは天然ＩＬ−１５の突然変異体；（ｂ） ＩＬ−１５が、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／もしくはγ−サブユニットを介してシグナル伝達を実施することを阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体；ならびに（ｃ）ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介してシグナル伝達を実施するＩＬ−１５の能力を妨害するが、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の結合は妨害しないような、ある化学基に共有結合により連結されているＩＬ−１５分子、を含む群から選択される。先に記載される突然変異体をコードするＤＮＡも本発明の範囲内に含まれる。
【００１３】
本明細書に用いられる際には「組換えＤＮＡ技術」もしくは「組換え」は、異種ペプチドの生合成を可能にさせるためにクローン化ＤＮＡ配列もしくは合成ＤＮＡ配列で形質転換もしくはトランスフェクトさせてある微生物（例えば、細菌、昆虫、もしくは酵母）または哺乳類細胞もしくは生物体（例えば、トランスジェニック体）から特異的ポリペプチドを産生するための技術および方法を意味する。天然のグリコシル化パターンは哺乳類細胞発現システムを用いてのみ達成されるであろう。酵母によっては特有のグリコシル化パターンが提供される。原核生物細胞発現（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ））は一般的にはグリコシル化されていないポリペプチドを産生するであろう。
【００１４】
「核酸配列」は、個別の断片の形態をとるか、あるいは大きめのＤＮＡ構築物の構成成分としてのポリヌクレオチドを意味し、このポリヌクレオチドは少なくとも一旦実質的に純粋な形態をとり（すなわち、混入している内因性物質を含まない）かつ標準的な生化学的方法（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、に概要が記載されている方法）による同定、操作、および回収を可能とさせる量もしくは濃度で単離されたＤＮＡもしくはＲＮＡから取得されている。このような配列は、真核生物遺伝子内に典型的に存在する内部非翻訳配列もしくはイントロンにより妨害されていない読み取り枠の形態で提供されることが好ましい。非翻訳化ＤＮＡの配列は読み取り枠から見て５’もしくは３’の位置に存在してもよく、この場合、同配列はコーディング領域の操作もしくは発現を妨害しない。
【００１５】
「組換え発現ベクター」は、（１）遺伝子発現の際に調節的役割を担う遺伝子要素（一つもしくは複数）（例えば、プロモーターもしくはエンハンサー）、（２）ＩＬ−１５もしくはＩＬ−１５突然変異体をコードする構造配列もしくはコーディング配列、ならびに（３）適切な転写および翻訳開始配列、ならびに所望により停止配列のアセンブリーを含む転写単位を含むプラスミドを意味する。用いることができる様々な調節要素の代表例が以下に論議される（「組換えＤＮＡ技術」を参照されたい）。酵母発現系における使用が意図される構造要素ハ、酵母宿主細胞による翻訳されたポリペプチドの細胞外分泌を可能にさせるリーダー配列を含むことが好ましい。別法では、細菌性発現系では、組換えポリペプチドがＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。このＮ−末端メチオニン残基はその後、発現された組換えポリペプチドから開裂され、更なる精製に適した産物を提供することができる。
【００１６】
「組換え微生物性発現系」は、染色体ＤＮＡ内に組換え転写単位を安定に組み込ませてあるか、もしくは内在性プラスミドの構成成分としての組換え転写単位を保持する、例えば細菌（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、または酵母（例えば、Ｓ．セルビジエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））のような適切な宿主微生物の実質的に均質な単一培養物を意味する。一般的には組換え微生物性発現系を含む宿主細胞は単一祖先の形質転換細胞の子孫である。組換え微生物発現系は、発現予定の構造的ヌクレオチド配列に連結された調節要素の誘導の際に異種ポリペプチドを発現するであろう。
【００１７】
「ＩＬ−１５突然変異体（IL-15 mutein）」もしくは「ＩＬ−１５の突然変異体（muteins of IL-15）」は、ＩＬ−１５のアンタゴニストを産生する目的で、本発明に従って突然変異を生じさせてある、配列番号１のアミノ酸４９〜１６２の配列を有するサルＩＬ−１５分子、または配列番号２のアミノ酸４９〜１６２の配列を有するヒトＩＬ−１５分子（いずれも成熟した分子もしくは天然の分子である）を意味する。このようなＩＬ−１５突然変異体は、ＩＬ−１５αサブユニットに結合することは可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することは不可能である。
【００１８】
ＩＬ−１５の調製
ヒトもしくはサルのＩＬ−１５は、Grabsteinら（Science, 264;965 (1994)）（これは引用により本明細書に取り込まれる）により記載される方法に従うか、もしくは例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような常法により取得することができる。ヒトＩＬ−１５ ｃＤＮＡの寄託は１９９３年２月１９日にthe American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) に行われ、かつ受託番号６９２４５が割り振られている。この寄託物は「Ｉ４１−ｈＥＴＦ」と命名されている。この寄託はブタペスト条約の規定に従って実施された。
【００１９】
ＩＬ−１５突然変異体
アンタゴニストを産生することができる多くの可能なＩＬ−１５の突然変異が存在する。このような突然変異はβ−もしくはγ−サブユニットのシグナル伝達に関与すると考えられる特異的アミノ酸部位で作製することができるか；あるいは突然変異を、β−もしくはγ−サブユニットのシグナル伝達にとって必要であると考えられるＩＬ−１５の全領域にわたって作製することができる。典型的には、突然変異はアミノ酸残基の添加、置換、もしくは欠失として作製することができる。好ましくは置換もしくは欠失突然変異体が好ましく、置換突然変異体が最も好ましい。
【００２０】
Ａｓｐ５６がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−サブユニットとの結合に影響を及ぼし、そしてＧｌｎ１５６がγ−サブユニットとの結合に影響を及ぼすものと考えられる。部位Ａｓｐ５６およびＧｌｎ１５６の近傍もしくはその位置で天然に存在する他のアミノ酸残基を添加もしくは置換することは、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかもしくは両方に対するＩＬ−１５の結合に影響を及ぼすことができる。実際、陰性に帯電しているアスパラギン酸残基を除去し、そしてそれを陰性に帯電している別の残基に置換することでは、アスパラギン酸が例えばアルギニンのような陽性に帯電しているアミノ酸、または例えばセリンもしくはシステインのような帯電していない残基で置換された場合と同じようにはレセプター結合を遮断する効力は発揮されないことがある。
【００２１】
ＩＬ−１５突然変異体の組換え産生は、まずＩＬ−１５突然変異体をコードするＤＮＡクローン（すなわち、ｃＤＮＡ）の単離を必要とする。ｃＤＮＡクローンは哺乳類ＩＬ−１５ポリペプチドを発現する初期細胞もしくは細胞株に由来する。最初に細胞の全ｍＲＮＡを単離し、その後に逆転写によりそのｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。本明細書内に提供されるＤＮＡ配列情報を用いて前述したように種間ハイブリダイゼーションプローブもしくはＰＣＲプライマーを設計し、ｃＤＮＡクローンを単離および同定することができる。このようなｃＤＮＡクローンは配列番号１および配列番号２の核酸１〜４８６の配列を有する。
【００２２】
単離されたｃＤＮＡは内部非翻訳配列もしくはイントロンにより中断されない読み取り枠の形態をとることが好ましい。哺乳類ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列を含むゲノムＤＮＡも、コーディング配列を構築する際に有用な遺伝子情報の源として用いることができる。単離されたｃＤＮＡを当該技術分野に知られる技術を利用して突然変異を生じさせて、ＩＬ−１５アンタゴニスト活性を提供することができる。以下の実施例１はＩＬ−１５突然変異体を調製するのに用いることができる具体的方法を記載する。
【００２３】
活性に必要とされないような、アミノ酸残基もしくは配列の様々な追加もしくは置換、あるいは末端もしくは内部の残基もしくは配列の欠失をコードする同等のＤＮＡ構築物も本発明により包含される。例えば、ＩＬ−１５内のＮ−グリコシル化部位をグリコシル化を妨げるように改変させて、哺乳類および酵母の発現系において炭化水素類似体の減少した発現を行わせることもできる。真核生物のポリペプチド内のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙを特徴とし、先の式中、ＸはＰｒｏ以外のいずれかのアミノ酸であり、そしてＹはＳｅｒもしくはＴｈｒである。サルのＩＬ−１５蛋白質はこのようなトリプレットを、配列番号１のアミノ酸１２７〜１２９および１６０〜１６２の２カ所に含む。ヒトＩＬ−１５蛋白質はこのようなトリプレットを、配列番号２のアミノ酸１１９〜１２１、１２７〜１２９、および１６０〜１６２の３カ所に含む。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、追加、もしくは欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭化水素残基の結合の阻害をもたらすであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸により置換されるように選択された単一ヌクレオチドの変化はＮ−グリコシル化部位を不活化させるに十分である。蛋白質中のＮ−グリコシル化部位を不活化するための既知の方法には、引用により本明細書に取り込まれる米国特許第５，０７１，９７２号および欧州特許出願第２７６，８４６号がある。
【００２４】
組換え発現ベクターには、ＩＬ−１５突然変異体をコードする合成ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片がある。 ＩＬ−１５突然変異体をコードするＤＮＡは、例えば哺乳類、微生物、ウイルス、もしくは昆虫の遺伝子に由来するもののような適切な転写もしくは翻訳調節用または構造ヌクレオチド配列に機能可能なように連結される。調節配列の例には例えば、遺伝子発現の際に調節的役割を果たす遺伝子配列（例えば、転写プロモーターもしくはエンハンサー）、転写を調節するための所望によるオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の開始および停止を制御する適切な配列が含まれる。その調節配列が機能的に構造遺伝子に関連している際には、ヌクレオチド配列は機能可能なように連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌用リーダー）のためのＤＮＡ配列は、そのシグナルペプチドが前駆体アミノ酸配列の一部として発現され、かつＩＬ−１５突然変異体の分泌に関与する場合には、ＩＬ−１５突然変異体のための構造遺伝子ＤＮＡ配列に機能可能なように連結されうる。更には、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列が構造遺伝子ヌクレオチド配列の転写を制御する場合には、コーディング配列（例えば、構造遺伝子ＤＮＡ）に機能可能なように連結される。その上更に、リボソーム結合部位は、そのリボソーム結合部位が翻訳を促すようにベクター内に配置される場合には、構造遺伝子ヌクレオチドコーディング配列（例えば、ＩＬ−１５突然変異体）に機能可能なように連結されうる。
【００２５】
ＩＬ−１５突然変異体の発現に適する宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下に置かれる原核生物、酵母、もしくは高等真核生物細胞が含まれる。原核生物は、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）もしくは桿菌等のグラム陰性もしくはグラム陽性の生物体を含む。形質転換に適する原核生物宿主細胞には例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、サルモネラ ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内に含まれる様々な他の種が含まれる。以下に一層詳細に論議されるように、適切な宿主細胞の例には、例えばＳ． セレビジエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Overy (CHO)）細胞等の哺乳類細胞系、もしくは昆虫細胞が含まれる。本明細書に開示されるＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてＩＬ−１５突然変異体を産生するには無細胞翻訳系も利用することができる。細菌、昆虫、酵母、および哺乳類細胞性宿主を用いる使用法のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えばPouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985、に記載されている。
【００２６】
ＩＬ−１５突然変異体が酵母宿主細胞内で発現される場合には、ＩＬ−１５突然変異体をコードするヌクレオチド配列（例えば、構造遺伝子）はリーダー配列を含んでもよい。このリーダー配列は、翻訳されたポリペプチドの酵母宿主細胞による細胞外分泌の改善を可能にし得る。
【００２７】
ＩＬ−１５突然変異体は酵母宿主細胞（好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ． セレビジエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））からのもの）内で発現してもよい。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）もしくはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）等の他の属の酵母を利用してもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、および転写停止用の配列を含むであろう。酵母ベクターが複製起点および選択用マーカーを含むことが好ましい。酵母ベクターに適するプロモーター配列は、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980）、もしくは他の解糖酵素（Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; and Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978）（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）のためのプロモーターを含む。酵母発現の際の使用のための他の適切なベクターおよびプロモーターは、Hitzemanの欧州特許出願公開第７３，６５７号に更に詳細に記載されている。
【００２８】
酵母ベクターは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内での選択および複製のために、例えばｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を用いて組み立てることができる。酵母発現構築物内に含まれることができる他の酵母ＤＮＡ配列には、グルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む。ＡＤＨ２プロモーターはRussellら（J. Biol. Chem. 258:2674, 1982）およびBeierら（Nature 300:724, 1982）により記載されている。酵母のα−因子リーダー配列は異種ポリペプチドの分泌を指令する。このα−因子リーダー配列はプロモーター配列と構造遺伝子配列との間に挿入されることがしばしばである。例えば、Kurjanら、Cell 30:933, 1982；およびBitterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984、を参照されたい。このリーダー配列をその３’末端付近で改変し、一つもしくは複数の制限部位を含ませてもよい。このことにより構造遺伝子へのリーダー配列の融合が容易になるであろう。
【００２９】
酵母の形質転換プロトコールは当業者に知られている。このようなプロトコールの一つがHinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75: 1929, 1978により記載されている。Hinnenらのプロトコールは選択培地中でＴｒｐ＋形質転換体を選択し、その選択培地は０．６７％の酵母窒素塩基、０．５％のカザミノ酸、２％のグルコース、１０ｍｇ／ｍｌのアデニン、および２０ｍｇ／ｍｌのウラシルでできている。
【００３０】
発現を誘導させるために、ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の一例は、８０ｍｇ／ｍｌのアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌのウラシルを添加した、１％酵母エキストラクト、２％ペプトン、および１％グルコースからできた培地である。ＡＤＨ２プロモーターの抑制は、グルコースが培地から消費された時点で失われる。
【００３１】
あるいは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）等の原核生物宿主細胞内ではＩＬ−１５突然変異体は、原核生物宿主細胞内の組換えポリペプチドの発現を容易にさせるためにＮ−末端メチオニン残基を含むことがあってよい。このＮ−末端Ｍｅｔは発現された組換えＩＬ−１５突然変異体から開裂されてよい。
【００３２】
組換えＩＬ−１５突然変異体構造遺伝子ヌクレオチド配列を保持する組換え発現ベクターを適切な宿主微生物もしくは哺乳類細胞株内にトランスフェクトもしくは形質転換させる。
【００３３】
原核生物宿主細胞内にトランスフェクトされた発現ベクターは一般的には一つもしくは複数の表現型選択用マーカーを含む。表現型選択用マーカーは例えば、抗生物質耐性を付与するかもしくは独立栄養性の要件を共給する蛋白質をコードする遺伝子、およびその宿主内での増幅を確実に実施させるためにその宿主により認識される複製起点である。原核生物宿主細胞にとっての他の有用な発現ベクターは、市販品として入手可能なプラスミドに由来する細菌起源の選択用マーカーを含む。この選択用マーカーはクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子要素を含むことができる。ｐＢＲ３２２はアンピリシンとテトラサイクリンに対する耐性のための遺伝子を含み、そしてそのため形質転換させた細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２の「主鎖」部分を適切なプロモーターおよびＩＬ−１５突然変異体構造遺伝子配列と連結させる。他の市販品として入手可能なベクターには例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals社, Uppsala, Sweden）およびｐＧＥＭ１（Promega Biotec社，Madison, WI, USA）がある。
【００３４】
プロモーター配列は組換え原核生物宿主細胞発現ベクターについて一般に用いられる。一般のプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Chang et al., Nature 275:615, 1978; and Goeddel et al., Nature 281:544, 1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980；および欧州特許出願公開第３６，７７６号）、およびｔａｃプロモーター（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)）が含まれる。特に有用な原核生物宿主細胞発現系はλファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ不耐熱性リプレッサー配列を利用する。λＰＬプロモーターの誘導体を取り込む、the American Type Culture Collectionから取得することができるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ ３７０９２）内に存在する）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＲＲ１（ＡＴＣＣ ５３０８２）内に存在する）が含まれる。
【００３５】
哺乳類もしくは昆虫の宿主細胞培養系も組換えＩＬ−１５突然変異体を発現させるのに利用することができる。適切な哺乳類宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（Gluzman et al., Cell 23:175, (1981); ATCC CRL 1651）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株がある。適切な哺乳類発現ベクターは、例えば複製起点、プロモーター配列、構造遺伝子に連結されているエンハンサー、５’もしくは３’に近接する他の転写されない配列、例えばリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供給部位および受容部位、ならびに転写停止配列のような転写されない要素を含む。
【００３６】
哺乳類宿主細胞発現ベクター中の転写および翻訳制御配列はウイルス源から提供されうる。例えば、一般に用いられる哺乳類細胞のプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマ（Polyoma）、アデノウイルス２（Adenovirus 2）、サル ウイルス４０（Simian Virus 40）（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスから取得される。
【００３７】
ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位）を用いて哺乳類宿主細胞内の構造遺伝子配列の発現に必要とされる他の遺伝子要素を提供してもよい。ウイルスの初期および後期プロモーターが特に有用である。なぜなら、両者ともがウイルスの複製起点も含み得る断片としてウイルスゲノムから容易に取得されるためである（Fiers et al., Nature 273:113, 1978）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位内に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位にまでに亙る約２５０ｂｐの配列が含まれる限り、より小さい、またはより大きいＳＶ４０断片も用いることができる。
【００３８】
例示的哺乳類発現ベクターは、OkayamaおよびBerg（Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983）により記載される要領で構築することができる。更なる有用な哺乳類発現ベクターは、１９９０年２月１４日に出願された米国特許出願第０７／４８０，６９４号および米国特許５，３５０，６８３号に記載されている。
【００３９】
組換えＩＬ−１５突然変異体の精製
一般的に、ＩＬ−１５突然変異体ポリペプチドは、形質転換させた宿主細胞をＩＬ−１５突然変異体ポリペプチドを発現させるのに必要な培養条件下で培養することにより調製することができる。得られる発現突然変異体をその後、培養培地もしくは細胞抽出物から精製することができる。ＩＬ−１５突然変異体は、例えばAmicon社もしくはMillipore Pellicon社の限外濾過装置のような市販品として入手可能な蛋白質濃縮用フィルターを用いて濃縮することができる。濃縮段階を含む場合も、もしくは含まない場合も、その培養培地を例えば疎水性クロマトグラフィー媒質のような精製用マトリックスに適用させることができる。フェニルセファロース（Phenyl Sepharose）（登録商標）ＣＬ−４Ｂ（Pharmacia社）が好ましい媒質である。別法では、陰イオン交換樹脂を用いることができ、例えば、遊離の（pendant）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスもしくは基質を用いることができる。このマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、もしくは蛋白質精製の際に共通して利用される他のタイプのものもよい。別法ではゲル濾過用媒質を用いることもできる。
【００４０】
最終的には、例えば、遊離のブチル基もしくは他の脂肪族基を有するシリカゲルのような疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質を利用する、一つもしくは複数の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を利用して、ＩＬ−１５突然変異体を更に精製することができる。Ｓセファロース（Pharmaciａ社）の陽イオン交換カラムを最終緩衝液交換工程として用いてもよい。更には、前述の慣用化された精製工程の内の幾つかもしくは全てを様々な組合せで利用して、実質的に均一な組換え蛋白質を提供することもできる。
【００４１】
細菌培養物内で産生される組換え蛋白質は通常、始めの宿主細胞破壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドの場合の細胞ペレットからの抽出あるいは可溶性ポリペプチドの場合の上清からの抽出、そしてその後の１回もしくは複数回の、濃縮、塩析、イオン交換もしくはサイズ排除クロマトグラフィーの段階により単離される。最終的にはＲＰ−ＨＰＬＣを最終精製段階用に利用することができる。微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用を初めとするいずれかの常法により破壊することができる。
【００４２】
形質転換させた酵母宿主細胞を利用して、分泌ポリペプチドとしてＩＬ−１５突然変異体を発現させることが好ましい。酵母宿主細胞発酵物からの分泌組換えポリペプチドは、Urdalら（J. Chromatog. 296:171, 1984）により開示されたものと類似する方法により精製することができる。Urdalらは、準備されたＨＰＬＣカラム上での組換えヒトＩＬ−２の精製のための２つの連続的逆相ＨＰＬＣ段階を記載している。
【００４３】
ＩＬ−１５（配列番号１に示されるアミノ酸残基４９〜１６２の配列を有するサルのＩＬ−１５、もしくは配列番号２に示されるアミノ酸残基４９〜１６２の配列を有するヒトのＩＬ−１５）のアミノ酸残基Ａｓｐ５６もしくはＧｌｎ１５６の内の少なくとも一つが欠失しているか、もしくは天然に存在する異なるアミノ酸残基で置換されているＩＬ−１５の突然変異体を用いることが好ましい。置換および／または欠失のいかなる組合せも作製することができる。例えばＡｓｐ５６を欠失させる一方で、Ｇｌｎ１５６をいずれかの他のアミノ酸で置換させでもよく、あるいはＡｓｐ５６とＧｌｎ１５６の両方を各々同一もしくは異なるアミノ酸部分で置換させてもよい。更にはＡｓｐ５６をいずれかのアミノ酸で置換させる一方で、Ｇｌｎ１５６を欠失させてもよい。一般的には置換突然変異体が好ましく、そしてＩＬ−１５分子の天然の折り畳み構造に著しく影響を及ぼさないものが一層好ましい。置換突然変異体は好ましくは以下のものを含む：Ａｓｐ５６がセリンもしくはシステインにより置換されているもの；Ｇｌｎ１５６がセリンもしくはシステインにより置換されているもの、あるいはＡｓｐ５６とＧｌｎ１５６の両方共が各々セリンもしくはシステインにより置換されているもの。欠失突然変異体の例は以下のものを含む：成熟ＩＬ−１５のＡｓｐ５６とＧｌｎ１５６とが両方共欠失しているもの；Ａｓｐ５６のみが欠失しているもの；あるいはＧｌｎ１５６のみが欠失しているもの。Ａｓｐ５６とＧｌｎ１５６のいずれかの領域内の他のアミノ酸残基を置換もしくは欠失させ、かつその突然変異体がなおＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかもしくは両方を介するシグナル伝達を阻害する効果を有するということが可能である。従って本発明は更に、Ａｓｐ５６とＧｌｎ１５６の領域内に含まれるアミノ酸残基が置換もしくは欠失のいずれかを受けており、かつＩＬ−１５アンタゴニスト活性を保持する突然変異体を包含する。このような突然変異体は本明細書に記載される方法を用いて作製することができ、そして常法を用いてＩＬ−１５アンタゴニスト活性についてアッセイすることができる。本発明に従ってＩＬ−１５突然変異体を作製するために用いることができる方法の更に詳細な記述が実施例１に提供される。
【００４４】
複合体形成させたＩＬ−１５分子およびＩＬ−１５突然変異体
本明細書に開示される成熟ＩＬ−１５ポリペプチド（配列番号１に示されるアミノ酸４９〜１６２の配列を含む成熟したサルのＩＬ−１５、および配列番号２に示されるアミノ酸残基４９〜１６２の配列を有する成熟したヒトのＩＬ−１５）、ならびにＩＬ−１５突然変異体を、他の化学部分との共有結合性複合体もしくは凝集性複合体を形成させることにより改変してもよい。このような部分は、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持しながらＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−鎖へのＩＬ−１５の結合を阻害することができる、ＩＬ−１５分子上の特異的部位における、ＰＥＧ、ｍＰＥＧ、デキストラン、ＰＶＰ、ＰＶＡ、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リシンもしくはポリヒスチジン）、アルブミン、およびゼラチンを含むことができる。さらに、ＩＬ−１５を、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持しながら、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−鎖へのＩＬ−１５の結合を阻害することができる部位で特異的にグリコシル化することもできる。複合体形成用の好ましい基は、ＰＥＧ、デキストラン、およびＰＶＰである。本発明における使用に最も好ましいものはＰＥＧであり、このＰＥＧの分子量は約１，０００〜約２０，０００の間であることが好ましい。約５０００の分子量がＩＬ−１５の複合体形成を実施するには好ましいが、他の分子量のＰＥＧ分子も同様に適切であろう。多種多様のＰＥＧ形態が本発明の使用に適する。例えばＰＥＧをスクシンイミジルコハク酸ＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）（このＳＳ−ＰＥＧはインビボでの加水分解的開裂に感受性を示すエステル結合を提供する）、スクシンイミジル炭酸ＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）（このＳＣ−ＰＥＧはウレタン結合が提供し、かつインビボでの加水分解的開裂に安定である）、スクシンイミジルプロピオン酸ＰＥＧ（ＳＰＡ−ＰＥＧ）（このＳＰＡ−ＰＥＧは、インビボで安定なエーテル結合を提供する）、ビニルスルホンＰＥＧ（ＶＳ−ＰＥＧ）、およびマレイミドＰＥＧ（Ｍａｌ−ＰＥＧ）の形態で用いられることができ、これら全てはShearwater Polymers, Inc. 社（Huntsville, AL）から市販品として入手することができる。一般的には、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、およびＳＰＡ−ＰＥＧはポリペプチド中のリシン残基と特異的に反応する一方で、ＶＳ−ＰＥＧおよびＭａｌ−ＰＥＧの各々は遊離のシステイン残基と反応する。しかしながらＭａｌ−ＰＥＧはアルカリ性ｐＨではリシン残基と反応する傾向にある。ＳＣ−ＰＥＧおよびＶＳ−ＰＥＧが好ましく、かつそのインビボでの安定性およびリシン残基に対する特異性のためＳＣ−ＰＥＧが最も好ましい。
【００４５】
ＰＥＧ部分はＰＥＧの巨大分子サイズを利用すると、ＩＬ−１５の攻略的部位に結合させることができる。先に記載したようにＰＥＧ部分は蛋白質内に天然に存在するリシンもしくはシステイン残基を利用することによるか、または部位特異的ＰＥＧ結合化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）によりＩＬ−１５に結合させることができる。部位特異的ＰＥＧ結合化（PEGylation）の一方法は、システインもしくはリシン残基が特異的アミノ酸位置でＩＬ−１５に取り込まれる蛋白質工学の方法を介する。ＩＬ−１５に複合体結合される巨大分子サイズのＰＥＧ鎖（一つもしくは複数）はＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／もしくはγ−サブユニットには結合するが、α−サブユニットには結合しないＩＬ−１５の領域を遮断するものと考えられる。複合体形成は、ＩＬ−１５を含む塩基性溶液にＰＥＧを添加するという簡潔な添加反応により実施することができる。典型的にはＰＥＧ結合化（PEGylation）は、（１）ｐＨ約９．０かつ約１：１〜１００：１もしくはそれを上回るリシン残基に対するＳＣ−ＰＥＧの分子的比率で；あるいは（２）ｐＨ約７．０かつ約１：１〜１００：１もしくはそれを上回るシステイン残基に対するＶＳ−ＰＥＧの分子的比率でかのいずれかで実施される。
【００４６】
複合体形成され、ＰＥＧ結合化（PEGylation）を受けたＩＬ−１５分子の特徴決定は、Novex Corp. 社、San Diego, Californiaから入手することができる４〜２０％の密度勾配ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施することができる。慣用化され銀染色を利用してもよく、あるいは銀染色によっては容易に可視化されない高度にＰＥＧ結合化（PEGylation）された蛋白質については慣用化されたウエスタンブロット技術を利用することもできる。ＰＥＧ結合化（PEGylation）されたＩＬ−１５分子の精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、限外濾過、もしくは親和性精製を用いて実施することができる。
【００４７】
ＰＥＧ結合化（PEGylation）されたＩＬ−１５の改変および不均質性の程度は、レーザー脱離イオン化質量分析法（laser desorption ionization mass spectrometry）（ＭＡＬＤＩ）の助けを借りて慣用化されたマトリックスを用いて決定することができる。ヒトＩＬ−１５は約１３，０００の分子量を有するため、そして５０００の分子量を有するＰＥＧを用いることにより、ＭＡＬＤＩによって１３，０００の分子量と測定される調製物はＰＥＧ結合化（PEGylation）されてはおらず、１８，０００の分子量と測定される調製物は１分子のＩＬ−１５が一つのＰＥＧ分子に結合しており、２３，０００の分子量と測定される調製物は一つのＩＬ−１５分子が２つのＰＥＧ分子に結合している、等が示唆される。
【００４８】
ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体
あるいは、本発明のアンタゴニストは、 ＩＬ−１５レセプター複合体のα−、β−、もしくはγ−サブユニットの内のいずれかに対するＩＬ−１５の結合を阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体の形態をとることができる。本発明の一つの態様では、ＩＬ−１５（その誘導体を含む）ならびに例えばＩＬ−１５ペプチドのようなそれらの蛋白質の部分もしくは断片を用いてＩＬ−１５に特異的に結合する抗体を調製することができる。本発明では用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片のようなそれらの断片、ならびに組換え的に産生させた結合用パートナーを含むものと理解されるべきである。モノクローナル抗体もしくは結合用パートナーの親和性は当業者により容易に決定することができる（Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51: 660-672 (1949) を参照されたい）。このようなモノクローナル抗体の具体例が本明細書の実施例２に提供される。
【００４９】
一般的にはＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体は以下の方法を用いて作製することができる。精製されたＩＬ−１５、その断片、合成ペプチド、もしくはＩＬ−１５を発現する細胞を用い、それ自体既知の技術（例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に記載される技術）を用いてＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体を作製することができる。簡潔に述べると、完全フロイト（Freund's）アジュバントもしくはＲＩＢＩアジュバント（RIBI Corp.社, Hamilton, Montana）内に乳化させたＩＬ−１５を免疫原としてマウスを免役し、かつＩＬ−１５の１０〜１００μｇの範囲の量を皮下的もしくは腹腔内に注射した。１０〜１２日後に免疫化させた動物に不完全フロイト（Freund's）アジュバント内に乳化させた追加的ＩＬ−１５で追加免疫する。マウスにはその後毎週一回もしくは２週間に１回の免疫化スケジュールで追加免疫を施す。血清試料を眼窩後出血もしくは尾末端切開により周期的に採取してドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素抗原免疫吸着アッセイ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay））、もしくはＣＴＬＬ−２細胞上でのＩＬ−１５活性の阻害によりＩＬ−１５抗体についての検査を実施する。
【００５０】
適切な抗体力値の検出の後には、陽性動物に食塩水中のＩＬ−１５の追加的静脈内注射を行う。３〜４日後にその動物を屠殺し、脾臓細胞を回収し、そして脾臓細胞を例えばＮＳ１もしくは好ましくはＰ３（６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）のようなマウス骨髄腫細胞株（myeloma cell line）に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が作製され、これを複数のマイクロタイタープレート内のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）選択用培地内でプレート培養させて非融合骨髄腫細胞および骨髄腫同士のハイブリッドの増殖を阻害させる。
【００５１】
このハイブリドーマ細胞を、Engvallら、Immunochem. 8:871、1971、および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適用により、精製されたＩＬ−１５に対する反応についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術はBeckmannら（J. Immunol 144: 4212, 1990）に記載される抗体捕獲技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウス内に腹腔内注射して、高濃度の抗−ＩＬ−１５モノクローナル抗体を含む腹水を産生することができる。別法ではハイブリドーマ細胞を様々な技術によりフラスコもしくはローラーボトル内でインビトロで増殖させることができる。マウス腹水内に産生されたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿およびその後のゲル排除クロマトグラフィーにより精製することができる。別法では、プロテインＡもしくはプロテインＧに対する抗体の結合を基にする親和性クロマトグラフィー、そして同様にＩＬ−１５への結合を基にする親和性クロマトグラフィーも用いることもできる。
【００５２】
他の「抗体」も本明細書に提供される開示を利用して調製することができ、従って、それらの抗体は本発明の範囲内に含まれる。ヒト化抗体を作製するのに用いられる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号および国際公開第９４／１０３３２号に見いだすことができ：微生物体を作製するための方法は国際公開第９４／０９８１７号に見いだすことができ：そしてトランスジェニック抗体を作製するための方法は英国特許第２ ２７２ ４４０号において見いだすことができ、これら全ては引用により本明細書に取り込まれる。
【００５３】
どのモノクローナル抗体がアンタゴニストであるかを決定するためには、スクリーニングアッセイの使用が好ましい。ＣＴＬＬ−２増殖アッセイがこの目的のためには好ましい。GillisおよびSmith, Nature 268:154 (1977)、を参照されたい（これは引用により本明細書に取り込まれる）。
【００５４】
本発明のアンタゴニストについては、先に記載されるように、かつ以降より詳細に記載されるように、同種移植片の生残率を亢進させる際、および移植片対宿主疾患を患う患者を治療する際の使用が見いだされた。当該アンタゴニストについての他の確かな使用法には、後期ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウイルス）Ｉ−誘導性成人Ｔ細胞白血病リンパ腫の治療がある。Burtonら、Proc. Natl. Acad. Sci., 91:4935 (1994)、を参照されたい。他の確かな使用法には、インビトロでのＢ細胞もしくはＴ細胞刺激を妨げる能力、レセプター−リガンド相互作用の調査、胃腸管の感染性疾患および障害用の診断用キットでの使用が含まれる。本発明のアンタゴニストの活性のために、所定の疾患を治療する新方法が本発明の範囲内に含まれる。例えば、同種移植片を必要とする患者での同種移植片拒絶反応を予防するための方法、および同種移植片を必要とする患者でのＧＶＨＤを治療する方法が開示され、各方法は、ＩＬ−１５活性を阻害するのに効果的な量のＩＬ−１５アンタゴニストおよび薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む薬剤組成物を投与する段階を含む。標的細胞（疾患状態もしくはその疾患状態の症状の主原因であると考えられる細胞）がＩＬ−１５レセプター複合体を発現し、かつＩＬ−１５レセプターのβ−もしくはγ−サブユニットを介するシグナル伝達の遮断もしくは阻害が所望される同様の方法も他の疾患を治療するのに有用である。このような疾患状態は、標的細胞がＩＬ−１５レセプター複合体を発現するということがわかった際には本発明のアンタゴニストで治療することが可能でありうる。実際、ＧＶＨＤおよび同種移植片拒絶反応に加え、このような疾患状態は例えばリンパ腫、癌、白血病、横紋肉腫、および例えばリューマチ性関節炎のような所定の自己免疫疾患を含んでよい。標的細胞が必要とされるＩＬ−１５レセプター複合体を発現する全ての疾患状態を、前述のリストは網羅し尽くしてはいない、という事実をもって本発明の範囲を限定するとして見なすべきではない。
【００５５】
先に記載されるように、本発明の他の態様は、本発明のＩＬ−１５突然変異体をコードする核酸である。このような核酸は、配列番号１の１４４〜４８６および配列番号２の１４４〜４８６のヌクレオチド配列を有するＲＮＡもしくはｃＤＮＡのいずれかを含む。ＩＬ−１５突然変異体をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターおよびそのような発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせた宿主細胞も更に本発明の範囲に含まれる。形質転換させた宿主細胞とは、標準技術を用いて組換え発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせてある細胞である。発現される哺乳類ＩＬ−１５は宿主細胞内に存在する、および／または培養上清内に分泌され、これは宿主細胞およびその宿主細胞内に挿入された遺伝子構築物の性質に依存する。既述のＩＬ−１５アンタゴニストの内のいずれかを含む薬剤組成物も本発明に包含される。
【００５６】
ＩＬ−１５のアンタゴニストの投与
本発明は、適切な希釈剤もしくは担体中に有効量のＩＬ−１５アンタゴニストを含む薬剤組成物を用いる方法を提供する。本発明のＩＬ−１５アンタゴニストは、薬剤学的に有用な組成物を調製するために用いられる既知の方法に従って処方することができる。ＩＬ−１５アンタゴニストを、単一の活性物質としてかもしくは他の既知の活性物質と一緒にかのいずれかの状態で、混合剤として、薬剤学的に適切な希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、保存料（例えば、チメロサル（Thimerosal）、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント、および／または担体と組み合わせることができる。適切な担体およびそれらの製剤法はRemington s Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co.に記載されている。それに加え、このような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体形成しているか、もしくは例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのような重合性化合物内に取り込まれているか、あるいはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多重層のベシクル、赤血球ゴースト、またはスフェロブラスト内に取り込まれるＩＬ−１５アンタゴニストを含むことができる。このような組成物はＩＬ−１５アンタゴニストの物理的状態、溶解度、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでの浄化速度に影響を及ぼすであろう。更にはＩＬ−１５アンタゴニストを、組織特異的レセプター、リガンドもしくは抗原に対する抗体に複合体形成させるか、または組織特異的レセプターのリガンドに連結させることもできる。
【００５７】
本発明のＩＬ−１５アンタゴニストを、局所的、非経口的、直腸的に投与するか、または吸入により投与することができる。用語「非経口的」には皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射、もしくは注入技術がある。これらの組成物は典型的には有効量のＩＬ−１５アンタゴニストを単独でか、もしくは有効量の他のいずれかの活性物質と組み合わせて含むであろう。組成物中に含まれる、このような服用量および所望される薬剤濃度は、意図される使用法、患者の体重および年齢、ならびに投与経路を初めとする多くの因子に依存して変化してよい。予備用量は動物実験に従って決定することができ、そしてヒト投与のための用量計測は当該技術に許容される常法に従って実施することができる。
【００５８】
先に加え、以下の実施例が特定の態様を詳細に説明するために提供され、かつこれらの実施例は本発明の範囲は制限しない。
【実施例】
【００５９】
実施例１
ＩＬ−１５の突然変異体
この実施例は、ＩＬ−１５のアンタゴニストとして機能する、成熟ＩＬ−１５もしくは天然のＩＬ−１５の突然変異体を取得するための方法を記載する。ＩＬ−１５はＩＬ−２同様、ＩＬ−２Ｒβγ複合体に結合し、そしてその複合体を通してシグナル伝達を行うことができ、そしてそれ自体ＩＬ−２と構造的類似性を共有することが提案されている。ＩＬ−２においてＩＬ−２Ｒ β−およびγ−鎖（Zurawski et al., EMBO J., 12 (13):5113 (1993)）との相互作用にとって重要であることが既に示されている残基と等価のＬ−１５中の残基をベストフィット配列アラインメントにより、β−鎖についてはアスパラギン酸（残基５６（Ａｓｐ））であり、そしてγ−鎖についてはグルタミン（残基１５６（Ｇｌｎ））であることを決定した（アミノ酸の番号付けは、配列番号１および２のアミノ酸残基１〜１６２により示されるペプチドの配列に基づく）。
【００６０】
ヒトＩＬ−１５を増幅し、かつ残基５６もしくは１５６のいずれかでセリンもしくはシステインのいずれかをコードするコドンを誘導するようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。２回の別個のＰＣＲ増幅周期を各突然変異体の構築のために実施した（以下の略図を参照されたい）。初回ＰＣＲ反応では増幅は適切な突然変異を導入するか、もしくは成熟配列を増幅するかのいずれかを実施するプライマー対を用いた。二次ＰＣＲ反応では第一周期からの物質を、ｐαＡＤＨ２酵母発現ベクターｐＩＸＹ４５６内にクローニングするための制限酵素を組み込ませるプライマー対を用いて再増幅させた。Priceら、Gene, 55:287 (1987)およびPriceら、Meth. Enzym. 185:308 (1990)、を参照されたい。
【００６１】
【化１】
【００６２】
以下の表は各突然変異体の初回増幅のために用いられたオリゴヌクレオチドプライマー対を列挙する。オリゴヌクレオチドＮＴＦＩＬ１５Ｂ（５’プライマー）およびＮＣＴＦＩＬ１５Ｆ（３’プライマー）を、成熟配列の維持が所望される場合の初回増幅用に用いた。
【００６３】
【表１】
【００６４】
あるいは、オリゴヌクレオチドＮＴＦＩＬ１５ＢをオリゴヌクレオチドＩＬ１５ＰＩＸＹＦ５と置換することができ、かつオリゴヌクレオチドＮＣＴＦＩＬ１５ＦをオリゴヌクレオチドＩＬ１５ＰＩＸＹ３と置換することができる。初回ＰＣＲ増幅は、２５０μＭ ｄＮＴＰおよび５０ｐモルの５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーを含む１００μｌの１Ｘ Ｔａｑ ポリメラーゼ緩衝液（Boehringer社）中で実施した。用いたＤＮＡ鋳型は約５０ｎｇのｐＩＸＹ７６４であった。ベクターｐＩＸＹ７６４は既述のベクターｐＩＸＹ４５６に類似しており、そのｐＩＸＹ４５６はヒトｆｌａｇ ＩＬ−１５をコードするＤＮＡ含み、このＤＮＡではヒトＩＬ−１５のＮ−結合型グリコシル化部位が先に記載される方法を用いて不活化されている。反応混合物にミネラルオイルを重層し、そしてサーマルサイクラー中で９４℃にまで５分間加熱してから、２単位のＴａｑ ポリメラーゼ（Boehringer社）の添加およびサーマルサイクリングの開始を行った。サイクリング条件は９４℃４５秒間の変性、４５℃４５秒間のアニーリング、および７２℃１分間の伸長、を総計３０サイクルであった。
【００６５】
初回増殖からの約２０ｎｇのゲル精製産物を二次ＰＣＲ増幅用の鋳型として用いた。全構築物は以前と同一の緩衝液条件を用い、ＩＬ１５ＰＩＸＹＦ５およびＩＬ１５ＰＩＸＹ３で増幅させた。サイクリング条件は、９４℃４５秒間の変性、６０℃４５秒間のアニーリング、および７２℃１分間の伸長を、総計２０周期であった。
【００６６】
増幅産物をゲル精製し、そしてＡｓｐ７１８（Boehringer社）およびＮｃｏＩ（New England Biolabs社）を用い、１Ｘ Boehringer緩衝液Ｂ中、３７℃で一晩消化させた。この制限産物を、Ａｓｐ７１６およびＮｃｏＩで消化させてあるｐＩＸＹ４５６酵母発現ベクター内に連結させた。このＤＮＡを用いて電気穿孔によりＤＨ１０β大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞を形質転換させた。
【００６７】
単一形質転換体からのプラスミドＤＮＡの配列決定を実施して配列の完全性を確認し、そしてこれを用いてＸＶ２１８１ Ｓ．セルビジエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換させた。生物学的活性は３０時間の誘導後の酵母上清を用いてアッセイした。
【００６８】
これらの実験は、突然変異誘発部位がＩＬ−１５遺伝子の両末端付近に位置しているため、突然変異誘発用のＰＣＲを基にする攻略法を利用した。しかしながらこれらの突然変異、および他のいずれかの単一もしくは複数の点突然変異は、通常の部位特異的突然変異誘発技術により組み込ませることもできる。
【００６９】
実施例２
ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体
この実施例は、ＩＬ−１５のアンタゴニストとして機能する３つの抗ＩＬ−１５モノクローナル抗体を取得するのに用いられた方法を記載する。用いられた全方法は注釈がなされている以外は常法である。
【００７０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＲＩＢＩアジュバント（RIBI Corp.社、Hamilton, Montana）の存在下で１０μｇの酵母由来のヒトＩＬ−１５を３週間の間隔を開けて２度腹腔内に注射した。その後にマウス血清を、通常のドットブロット技術、抗体捕獲（ＡＢＣ）、および中和アッセイ（ＣＴＬＬ−２アッセイ）によりアッセイして、どの動物が融合に最適であるかを決定した。３週間後にマウスに、滅菌ＰＢＳ中に懸濁させた３μｇのヒトＩＬ−１５の静脈内ブースター注射を施した。３日後にマウスを屠殺し、そして確立されたプロトコールに従い脾臓細胞をＡｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と融合させた。簡潔に述べると、Ａｇ８．６５３細胞を無血清培地中で数回洗浄し、そしてマウス脾臓細胞に、一つの骨髄腫細胞に対して３つの脾臓細胞の割合で融合させた。融合剤は５０％ＰＥＧ：１０％ＤＭＳＯ（Sigma社）であった。融合物を、ＨＡＴを補足したＤＭＥＭ培地を含む２０枚の９６ウエル平底プレート（Corning社）内でプレート培養させ、そして８日間増殖させた。得られたハイブリドーマからの上清を回収し、そしてヤギ抗マウスＩｇで最初にコーティングしてある９６ウエルのプレートに６０分間添加した。洗浄後に、１２５Ｉ−ＩＬ−１５を各ウエルに添加し、室温で６０分間インキュベートし、そして４回洗浄した。その後に陽性ウエルを、Kodak X-Omat Ｓフィルムを用いて−７０℃下でオートラジオグラフィーにより検出した。陽性クローンをバルク培養物として増殖させ、そしてその後に上清をプロテイン（Protein）Ａカラム（Pharmacia社）にかけて精製した。その後にはＭ１１０、Ｍ１１１、およびＭ１１２と表示されるクローンのアイソタイプを各々ＩｇＧ１モノクローナル抗体と決定した。モノクローナル抗体Ｍ１１０、Ｍ１１１、およびＭ１１２を産生するハイブリドーマは、１９９６年３月１３日に、the American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC)に寄託してあり、そして各々受託番号ＨＢ−１２０６１、ＨＢ−１２０６２、およびＨＢ−１２０６３を割り当てられている。全寄託物はブタペスト条約の規定に従って実施した。
【００７１】
産生されたモノクローナル抗体を、Gillisら（前述）により本質的に記載されるＣＴＬＬ−２アッセイを用いてＩＬ−１５アンタゴニスト活性についてアッセイすることができる。
【００７２】
実施例３
改変ＩＬ−１５分子
この実施例は、ＩＬ−１５アンタゴニストとして機能する改変ＩＬ−１５分子を取得するための方法を記載する。
【００７３】
ＰＥＧ化させた（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＩＬ−１５
全複合体形成反応は、Shearwater Polymers, Inc. 社（Huntsville, AL）からスクシンイミジルコハク酸ＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）、スクシンイミジル炭酸ＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）、ＶＳ−ＰＥＧ、およびＭａｌ−ＰＥＧの形態で取得した分子量５０００のＰＥＧを用いて実施した。 ＳＳ−ＰＥＧとＳＣ−ＰＥＧとの両方はリシンのε−アミノ基と反応し、 ＳＳ−ＰＥＧの場合には加水分解に対して不安定なエステル結合を形成し、そしてＳＣ−ＰＥＧの場合には加水分解に対して安定なウレタン結合を形成する。ＰＥＧ化（PEGylation）は、ＳＳ−ＰＥＧとＳＣ−ＰＥＧについてはｐＨ９．０で５０ｎＭ ＮａＨ２ＰＯ４中で；そしてＶＳ−ＰＥＧとＭａｌ−ＰＥＧを含む反応物についてはｐＨ７．０で実施した。これらの反応は１００μｇ／ｍｌ、０．５ｍｌの容積で進行させた。各反応で、ＰＥＧを、１：１、３：１、１０：１、および１００：１のリシンに対するＰＥＧのモル比率で反応混合物に添加した（サルの各ＩＬ−１５分子中には９つのリシン残基が存在する）。これらの反応を４℃下で一晩進行させた。
【００７４】
ＰＥＧ化させた（PEGylated）サルのＩＬ−１５の特徴決定は、４〜２０％の密度勾配ポリアクリルアミドゲル（Novex 社、San Diego, California）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施した。約０．５μｇ／ラインでゲルにのせた改変させていないＩＬ−１５蛋白質については通常の銀染色技術を用いた。高度にＰＥＧ化された（PEGylated）サルＩＬ−１５蛋白質は、可視化させるためにゲルに多めの蛋白質をのせる必要があった。高度にＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５の特徴を決定するためにはウエスタン（Western）ブロットも用いた。これらの実験ではＰＥＧ化された（PEGylated）サルＩＬ−１５をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、ニトロセルロース膜に移し、モノクローナル抗体 Ｍ１１１と共にインキュベートし、その後にヤギ抗マウスＨＲＰと共にインキュベートし、そして最後に4CN Membrane Peroxidase Substrate System（Kirkegaard & Perry Laboratories社、Gaithersburg, MD）を用いて可視化させた。ＰＥＧ化された（PEGylated）サルＩＬ−１５は更に慣用化された技術に従い、Biosil SEC-250サイズ決定用カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣにより性質決定を行った。
【００７５】
ＳＣ−ＰＥＧ化された（ＳＣ−PEGylated）ＦＬＡＧ−サルＩＬ−１５を、細胞膜表面にＩＬ−１５のα−、もしくはβ−およびγ−レセプターサブユニットを発現するトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に結合する能力について検査した。ＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５Ｒ α−サブユニットを発現するＣＯＳ細胞への放射ラベル化されたＩＬ−１５の結合を阻害し、このことによりＰＥＧ化された（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＩＬ−１５がＩＬ−１５Ｒ α−サブユニット結合に関して競合することが示された。更にＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５はβ−およびγ−レセプターサブユニットを発現するＣＯＳ細胞への放射ラベル化されたＩＬ−１５の結合は阻害せず、このことによりＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−および／またはγ−レセプターサブユニットには結合しないことが示された。従って、ＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５は、内因性ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−およびγ−レセプターサブユニットを介するシグナル伝達に影響を及ぼすことを妨げる。
【００７６】
実施例４
ＣＴＬＬ−２アッセイにおけるＩＬ−１５活性の阻害
この実施例は更に、本発明のアンタゴニストによる、ＩＬ−１５レセプター複合体のβ−およびγ−レセプターサブユニットを介するＩＬ−１５のシグナル伝達の阻害を決定するための方法を詳細に説明する。
【００７７】
モノクローナル抗体、ＰＥＧ化された（PEGylated）ＩＬ−１５、およびＩＬ−１５突然変異体のアンタゴニスト活性は、改変させたＣＴＬＬ−２細胞３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ（Gills et al., 上述）を用いてアッセイすることができる。アンタゴニストの連続希釈物を、９６−ウエルの平底組織培養用プレート（Costar社、Cambridge, MA）で、ＤＭＥＭ培地（５％ＦＣＳ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸Ｎａ、ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２−ｍｅ、ＰＳＧが補足してある）中、５０μｌの最終容積で作製することができる。その後、試料の連続希釈後かつ細胞の添加前に、至適下量のＩＬ−１５（２０〜４０ｐｇ／ｍｌの最終濃度）を全アッセイウエルに添加する（５μｌ／ウエル）。洗浄したＣＴＬＬ−２細胞を添加し（５０μｌ中、約２０００／ウエル）、そしてそれらのプレートを空気中１０％ＣＯ２の湿潤化させた大気中、３７℃で２４時間インキュベートする。この後に０．５μＣｉの３Ｈ−チミジン（２５Ｃｉ／ｍモル（Ｍｏｌ）、Amersham社、Arlington Heights, IL）と共に５時間インキュベートさせた。その後にそれらの培養物をガラス繊維性フィルター上で回収し、そしてマルチディテクターダイレクトベータカウンター(multidetector direct beta counter)(Matrix 96、Packard Instrument Company社、Meridien, CT) もしくはベータシンチレーションカウンターのいずれかでアバランシェガス電離により計数する。このアッセイにより生じるカウント／分（ＣＰＭ）をパーセント阻害率に変換し、そして滴定を行ったアンタゴニスト試料各々のパーセント阻害率の値を用いて単位／ｍｌでのアンタゴニスト活性を算出する。
【００７８】
ＣＴＬＬ阻害アッセイ中で４０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１５を中和するのに必要とされる濃度を示すデータが以下の表Ｉに提供される。以下の表ＩＩは、ＣＴＬＬおよびＣＴＬＬ阻害アッセイにおけるＩＬ−１５（アゴニスト活性）およびＩＬ−１５アンタゴニストの活性を示す。
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介してシグナルを伝達することを阻害するＩＬ−１５のアンタゴニストであって、そのようなＩＬ−１５アンタゴニストがＩＬ−２レセプター複合体に対するモノクローナル抗体ではない上記アンタゴニスト。
【請求項２】
（ａ） ＩＬ−１５レセプターのα−サブユニットに結合することが可能であって、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することが不可能な天然のＩＬ−１５の突然変異体；
（ｂ）ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することを阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体；
（ｃ）成熟したＩＬ−１５が、ＰＥＧ、ｍＰＥＧ、ＰＶＰ、およびデキストリンからなる群より選択される巨大不活性部分に共有結合により連結されている複合体形成させてあるＩＬ−１５分子であって；ＩＬ−１５Ｒα−サブユニットに結合することが可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することが不可能である、上記複合体形成させてあるＩＬ−１５分子：
からなる群より選択される、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
アミノ酸残基Ａｓｐ５６もしくはＧｌｎ１５６のいずれかの内の少なくとも一つが欠失しているか、あるいは天然に存在する異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項２に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
Ａｓｐ５６およびＧｌｎ１５６のいずれかもしくは両方が各々セリンもしくはシステインで置換される、請求項３に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
Ａｓｐ５６がセリンもしくはシステインで置換される、請求項４に記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
Ｇｌｎ１５６がセリンもしくはシステインで置換される、請求項４に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することを妨害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体である、請求項２に記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
ＨＢ−１２０６１、ＨＢ−１２０６２およびＨＢ−１２０６３からなる群より選択されるＡＴＣＣ受託番号を有するハイブリドーマから取得されるモノクローナル抗体である、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
Ｍ１１０である、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
Ｍ１１１である、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項１１】
Ｍ１１２である、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項１２】
請求項２のＩＬ−１５の突然変異体をコードする単離された核酸。
【請求項１３】
ＩＬ−１５の突然変異体が、欠失しているかもしくは天然に存在する異なるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸残基Ａｓｐ５６もしくはＧｌｎ１５６の内の少なくとも一つを有する、請求項１２に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
Ａｓｐ５６およびＧｌｎ１５６のいずれかもしくは両方が各々セリンもしくはシステインで置換される、請求項１３に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
Ａｓｐ５６がセリンもしくはシステインで置換される、請求項１３に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
Ｇｌｎ１５６がセリンもしくはシステインで置換される、請求項１３に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１２の核酸を含む組換えベクター。
【請求項１８】
請求項１７のベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせてある宿主細胞。
【請求項１９】
請求項２に記載のＩＬ−１５突然変異体を産生する方法であって、そのようなＩＬ−１５の発現の助けとなる培養条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養することを含む、上記方法。
【請求項２０】
ＩＬ−１５活性を阻害するのに有効な量の請求項１に記載のアンタゴニスト、および薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２１】
アンタゴニストがＩＬ−１５Ｒα−サブユニットに結合することが可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することが不可能な天然のＩＬ−１５の突然変異体である、請求項２０に記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
アンタゴニストが、ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することを阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
アンタゴニストが、ＰＥＧに共有結合で連結されており、かつ ＩＬ−１５Ｒ α−サブユニットに結合することが可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することが不可能なＩＬ−１５分子であり、そしてそのアンタゴニストに加えて薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む、請求項２０に記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
請求項２０に記載の薬剤組成物を投与することを含む、移植片対宿主疾患の症状を有する患者を治療するための方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の薬剤組成物を投与することを含む、同種移植片の生残率をその移植片を必要とする患者内で延長させるための方法。
【請求項１】
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットのいずれかを介してシグナルを伝達することを阻害するＩＬ−１５のアンタゴニストであって、そのようなＩＬ−１５アンタゴニストがＩＬ−２レセプター複合体に対するモノクローナル抗体ではない上記アンタゴニスト。
【請求項２】
（ａ） ＩＬ−１５レセプターのα−サブユニットに結合することが可能であって、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することが不可能な天然のＩＬ−１５の突然変異体；
（ｂ）ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することを阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体；
（ｃ）成熟したＩＬ−１５が、ＰＥＧ、ｍＰＥＧ、ＰＶＰ、およびデキストリンからなる群より選択される巨大不活性部分に共有結合により連結されている複合体形成させてあるＩＬ−１５分子であって；ＩＬ−１５Ｒα−サブユニットに結合することが可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することが不可能である、上記複合体形成させてあるＩＬ−１５分子：
からなる群より選択される、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
アミノ酸残基Ａｓｐ５６もしくはＧｌｎ１５６のいずれかの内の少なくとも一つが欠失しているか、あるいは天然に存在する異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項２に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
Ａｓｐ５６およびＧｌｎ１５６のいずれかもしくは両方が各々セリンもしくはシステインで置換される、請求項３に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
Ａｓｐ５６がセリンもしくはシステインで置換される、請求項４に記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
Ｇｌｎ１５６がセリンもしくはシステインで置換される、請求項４に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することを妨害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体である、請求項２に記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
ＨＢ−１２０６１、ＨＢ−１２０６２およびＨＢ−１２０６３からなる群より選択されるＡＴＣＣ受託番号を有するハイブリドーマから取得されるモノクローナル抗体である、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
Ｍ１１０である、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
Ｍ１１１である、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項１１】
Ｍ１１２である、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項１２】
請求項２のＩＬ−１５の突然変異体をコードする単離された核酸。
【請求項１３】
ＩＬ−１５の突然変異体が、欠失しているかもしくは天然に存在する異なるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸残基Ａｓｐ５６もしくはＧｌｎ１５６の内の少なくとも一つを有する、請求項１２に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
Ａｓｐ５６およびＧｌｎ１５６のいずれかもしくは両方が各々セリンもしくはシステインで置換される、請求項１３に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
Ａｓｐ５６がセリンもしくはシステインで置換される、請求項１３に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
Ｇｌｎ１５６がセリンもしくはシステインで置換される、請求項１３に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１２の核酸を含む組換えベクター。
【請求項１８】
請求項１７のベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせてある宿主細胞。
【請求項１９】
請求項２に記載のＩＬ−１５突然変異体を産生する方法であって、そのようなＩＬ−１５の発現の助けとなる培養条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養することを含む、上記方法。
【請求項２０】
ＩＬ−１５活性を阻害するのに有効な量の請求項１に記載のアンタゴニスト、および薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２１】
アンタゴニストがＩＬ−１５Ｒα−サブユニットに結合することが可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することが不可能な天然のＩＬ−１５の突然変異体である、請求項２０に記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
アンタゴニストが、ＩＬ−１５がＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することを阻害する、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
アンタゴニストが、ＰＥＧに共有結合で連結されており、かつ ＩＬ−１５Ｒ α−サブユニットに結合することが可能であり、かつＩＬ−１５レセプター複合体のβ−もしくはγ−サブユニットを介してシグナルを伝達することが不可能なＩＬ−１５分子であり、そしてそのアンタゴニストに加えて薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む、請求項２０に記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
請求項２０に記載の薬剤組成物を投与することを含む、移植片対宿主疾患の症状を有する患者を治療するための方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の薬剤組成物を投与することを含む、同種移植片の生残率をその移植片を必要とする患者内で延長させるための方法。
【公開番号】特開２００８−１３３２７６（Ｐ２００８−１３３２７６Ａ）
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９３１６９（Ｐ２００７−２９３１６９）
【出願日】平成１９年１１月１２日（２００７．１１．１２）
【分割の表示】特願平８−５２５８５３の分割
【原出願日】平成８年２月２１日（１９９６．２．２１）
【出願人】（５９１１２３６０９）イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＥＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１２日（２００７．１１．１２）
【分割の表示】特願平８−５２５８５３の分割
【原出願日】平成８年２月２１日（１９９６．２．２１）
【出願人】（５９１１２３６０９）イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＥＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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