インターロイキン−１５アンタゴニストペプチド
本発明は、分子薬学の分野、特にインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）配列に属するペプチドであって、該分子及びそのペプチドの類似体又は模倣体の生物活性を阻害することができる上記ＩＬ−１５配列に関連する。本発明においては、該ペプチドが、受容体（ＩＬ−１５Ｒ）のαサブユニットに結合すると、ＩＬ−１５誘導Ｔ細胞増殖とＴＮＦ媒介アポトーシスを阻害することが示される。本発明はまた、異常なＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒ発現が病気の進行に関連した病因の治療における該ペプチドの使用にも関連する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子薬学の分野、特に受容体アルファサブユニットに結合するインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を阻害し；それにより、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαの異常発現に関連する疾病の治療に有用なインターロイキン１５由来のペプチドに関連する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１５として知られるサイトカインは、Ｔ細胞活性化因子として２つのグループにより同時に確認された１４−１５ｋＤａの糖タンパク質である（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，２６４，９６５；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９４，９１，４９３５）。ＩＬ−１５のｍＲＮＡは異なる細胞や組織で広く発現されているが、翻訳段階および細胞間交通でのその発現の強力な転写後調節により、これらの細胞の中に、又は細胞上清中に、本タンパク質を見出すことは難しい（Ｂａｒｍｆｏｒｄ ＲＮ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６０：４４１８−４４２６；Ｋｕｒｙｓ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５：３０６５３−３０６５９）。さらに、ＩＬ−１５は活性状態で膜タンパク質として存在する可能性が示されており（Ｍｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９９，Ｖｏｌ．９３，Ｎｏ １０（Ｍａｙ １５），：ｐｐ３５３１−３５３９）、最近、本経路を介して、炎症性サイトカインの分泌を誘導するリガンドまたは受容体として機能する可能性が知られている（Ｂｕｄａｌｇｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２００４，ｖｏｌ ２７９，Ｎｏ ４０：ｐｐ ４２１９２−４２２０１）。
【０００３】
可溶型タンパク質の高い発現レベルは、自己免疫疾患および炎症疾患の病因に関連する。クローン病（Ｋｉｒｍａｎ Ｉ．，１９９６，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９１，１７８９）、乾癬（Ｒｕｃｋｅｒｔ Ｒ．２０００，１６５：２２４０−２２５０）、白血病（Ｙａｍａｄａ Ｙ．１９９９，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，３５（１−２）：３７−４５）及びリューマチ関節炎（ＲＡ）（Ｍｃｌｎｎｅｓ Ｉ．Ｂ．１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１９，７５−７９）を含むいくつかの疾患で、ＩＬ−１５が検出されている。Ｔ細胞受容体へのリガンドの結合は、ＩＬ−１５Ｒαの発現と、ＣＤ６９、ＣＤ２５そしてＴＮＦＲＩＩのようないくつかの活性化抗原の発現を誘引する。ＩＬ−１５もまた、ヒト血中Ｔリンパ球の誘引化学物質である（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ １９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１，１２２５０−１２５９）。これらのデータは全て、抗原提示細胞により発現したＩＬ−１５が炎症部位の初期のＴ細胞活性化において重要である、ということを示唆している。
【０００４】
Ｍｃｌｎｎｅｓらは、本疾患におけるＩＬ−１５の発現異常、髄液中の高濃度ＩＬ−１５、及び髄膜でのＩＬ−１５発現を見出した。彼らは、サイトカインカスケードにおいてＩＬ−１５がＴＮＦαに先行することを示唆し、細胞接触に依存する機構を提案し、そこでは、ＩＬ−１５に活性化されたＴ細胞が、マクロファージによるＴＮＦα合成を誘引するとしている。さらに、ＩＬ−１５は髄液中へのＴ細胞の移行に関する重要な因子として作用することが提唱されている（Ｍｃｌｎｎｅｓ，１９９７，Ｎａｔ Ｍｅｄ，３：１８９−１９５）。
【０００５】
Ｚｉｏｋｏｗｓｋａらは、ＩＬ−１５がＲＡ患者の関節において、ＩＬ−１７の発現を誘引することを報告しており、本サイトカインが、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、及びプロスタグランジンＥ２といったいくつかの炎症伝達物質の滑膜細胞からの遊離を誘引し、このことがＩＬ−１５に対しＲＡ病因における重要な役割を示唆することは既に知られている（Ｚｉｏｌｋｏｗｓｋａ ｙ ｃｏｌ ２０００，Ｊ ｉｍｍｕｎｏｌ，１６４：２８３２−２８３８）。
【０００６】
Ｔ細胞の漸増と活性化は、ＩＬ−１５の局所的合成の結果として生じうる。そのような非特異的活性化は、結果として、絶え間ない炎症を引き起こしうる。これら全てから、他の自己免疫疾患および炎症疾患と同様に、ＩＬ−１５阻害による本疾病の治療可能性を有しうることが示唆される。
【０００７】
ＩＬ−１５の生物学的効果は、３つのサブユニットα、βおよびγから構成される細胞膜受容体に結合することで仲介される。ＩＬ−１５Ｒαは、このサイトカインに対してＫｄ １０−１１という非常に高い親和性で結合する特有のサブユニットであり、膜受容体として又は可溶型として見出されうる（Ｂｕｄａｇｉａｎ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２００４，２７９，３９：４０３６８−４０７３５；Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００４，１７３：１６８１−１６８８）。
【０００８】
サブユニットβとγは、ＩＬ−１５と高い構造的相同性を有するサイトカイン、ＩＬ−２によって共有される。以前より、ＩＬ−１５分子におけるＡｓｐ５６が受容体βサブユニットとの結合に重要であり、Ｇｌｎ１５６は受容体γサブユニットとの結合に重要であると、言われている。
【０００９】
突然変異タンパク質は、受容体αサブユニットに結合したＩＬ−１５アンタゴニスト分子のように振る舞い、β及びγサブユニットを介したシグナル伝達を阻害する。これらのアミノ酸を認識する抗体もまた、ＩＬ−１５アンタゴニストのように作用する（ＵＳ６１７７０７９，ＵＳ６１６８７８３，ＵＳ６０１３４８０，ＵＳ６００１９７３，ＵＳ９７０６９３１，ＷＯ９７４１２３２）。
【００１０】
Ｒｕｃｈａｔｚらは、ネズミα受容体サブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）の可溶型断片を生成し、この断片の注射により、ＤＢＡ／１マウスにおけるコラーゲン−誘導型関節炎（ＣＩＡ）が阻害されることを実証した（Ｒｕｃｈａｔｚ Ｈ．１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５６５４−５６６０）。
【００１１】
Ｇｅｎｍａｂ社は、ＩＬ−１５に対して特異的なヒト抗体の特許、ＷＯ０３０１７９３５、を有しており、そこでは、４種の抗体について述べられているが、そのうちの２種、１４６Ｂ７と１４６Ｈ５は、受容体γサブユニット相互作用部位においてＩＬ−１５に結合し、ＣＴＬＬ２細胞系およびＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）においてＩＬ−１５誘導型細胞増殖を抑制すること、抗体４０４Ａ８と４０４Ｅ４は増殖を抑制しないこと、が述べられている。ＡＭＧ７１４という名で呼ばれている１４６Ｂ７抗体（Ａｍｇｅｎ）は、リュウマチ関節炎臨床試験のフェーズＩＩにある。
【００１２】
近年、受容体αサブユニットへのＩＬ−１５の結合配列が２種、アミノ酸４４から５２およびアミノ酸６４から６８に見つかった（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２００４，２７９（２３），２４３１３−２４３２２）。彼らは、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして作用する突然変異タンパク質について述べている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
今日までに、ＩＬ−１５アンタゴニストペプチドについては、述べられてきていない。ＩＬ−１５アンタゴニストとしての長さの短いペプチド（１０ａａ）の使用は、受容体αサブユニットへのＩＬ−１５結合を選択的に遮断し、ＩＬ−１５−受容体相互作用のためＩＬ−１５の影響を仲介又は阻害するという利点を有する。例えば、本発明でも述べるように、Ｓｅｃ Ｎｏ．１と名づけたペプチドは、我々が受容体αサブユニットとの相互作用部位として同定したＩＬ−１５の１０アミノ酸領域にわたる（図１）。そのようなペプチドは、ＥＬＩＳＡおよびテンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ）レジンアッセイにおいて、ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質と結合し（図２）、ＩＬ−１５に依存したＣＴＬＬ−２細胞系の増殖を阻害し（図３ａと図３ｂ）、ＴＮＦα誘導のアポトーシスから保護するが（図４）、本効果はＩＬ−１５の受容体α鎖への結合が仲介している。後者の効果より、アポトーシス経路を阻害することが必要な疾患への使用が考えられる。同様に、本発明において述べるような本ペプチドの可溶型α鎖への結合は、膜結合ＩＬ−１５よって仲介される逆シグナル伝達を阻害しうる（Ｂｕｄａｌｇｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２００４，ｖｏｌ ２７９，Ｎｏ ４０：ｐｐ ４２１９２−４２２０１）。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、特に、ＩＬ−１５Ｒαサブユニットに結合できるＩＬ−１５領域の同定に関する。本願で、Ｓｅｃ．Ｎｏ．１と名づけられた本領域を含むペプチドは、化学的に合成されており、ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃへの結合能を有し（図２）、ＩＬ−１５誘導のＣＴＬＬ２増殖を阻害し、ＴＮＦα誘導のＤＮＡ断片化から保護する（図４）。
【００１５】
本発明はまた、組み換え又は合成的方法によって得られた前者のペプチドの相同体又は相同的変異体のいずれについてもと同様に、それらを含有するいずれの処方についても含む。
【００１６】
同様に、本発明はまた、前述のペプチドの単独、又は他の適切な分子、例えば、抗炎症ステロイド薬（コルチコステロイド）、疾病調節薬（メトトレキサート）、若しくは他のリュウマチ関節炎治療で使用されるサイトカインアンタゴニストとの組み合わせ、での使用と、可溶型での又は膜結合型での受容体αサブユニットへのＩＬ−１５の結合を阻害するための該ペプチドの使用についても包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明におけるペプチドは、線形（ｌｉｎｅａｌ）構造を有し、主に、ＩＬ−１５に対するアンタゴニスト化する能力により、特徴付けられる。一方、本発明におけるペプチドによってもたらされるインビトロでの効果については、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイおよびＴＮＦα誘導アポトーシス阻害アッセイによって実証される。
【００１８】
前述のペプチドの確定のため、５つの重複アミノ酸を有した１０ ａａ連続ペプチド中にＩＬ−１５の完全な配列を含むセルロースフィルター上でのマップ化技術を利用した。
【００１９】
本発明において、Ｓｅｃ．Ｎｏ．１（配列番号１）は、固相法を用い化学的に合成され、ＨＰＬＣにより精製され、質量分析により分析され、最終的にそのＩＬ−１５活性への影響の点から評価された。
【００２０】
本発明において示される結果により、１０ ａａのペプチド（Ｓｅｃ．Ｎｏ．１）として同定し、合成した領域は、受容体αサブユニットと相互作用するＩＬ−１５領域に相当し、そのため、受容体へのＩＬ−１５の結合を抑制し、そのＩＬ−１５誘導型Ｔ細胞増殖活性を阻害することが示される。
【００２１】
ＩＬ−１５Ｒαと相互作用するＩＬ−１５のアミノ酸を含むペプチド（Ｓｅｃ．Ｎｏ．１）は、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合によって介されるＴＮＦαアポトーシス（Ｂｕｌｆｏｎｅ−Ｐａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ Ｖｏｌ．１３）のＩＬ−１５防御効果を模倣する。
【００２２】
ここで得られた結果は、前述のＩＬ−１５アンタゴニストの使用が正当化されるＩＬ−１５高発現性関連の疾病の治療において、及び可溶型ＩＬ−１５Ｒαの高発現性に関連する病理においてと同様、アポトーシス防御効果が必要とされる病理において、治療方法としての使用を提案する。このように、ＩＬ−１５におけるＳｅｃ．Ｎｏ．１に含まれる領域を認識する抗体は、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合を阻害し、そのような受容体サブユニットへの分子の結合を阻害することによって、ＩＬ−１５アンタゴニスト活性を示すであろう。このことからも、キャリアー分子又はＭＡＰ（マルチ抗原性ペプチド）化学結合体に結合したペプチドは、ＩＬ−１５アンタゴニスト抗体を得るために用いることができる。
【００２３】
本発明の目的は、また、前述のペプチドのＤＮＡコード化へも適用される。本発明におけるペプチドをコードしたＤＮＡを含むベクターは、ペプチド配列の発現に替わる他の方法としても用いることができる。
【００２４】
ここで説明されているペプチドは、他の抗炎症および炎症抑制剤、又は、リュウマチ関節炎、乾癬、クローン病等で使用されている他のサイトカインアンタゴニストと組み合わせて、使用することができる。
【００２５】
前述のペプチドは、抗ＩＬ−１５体液性応答を示す治療用ワクチンにも含まれ得る。
【００２６】
本発明は、受容体αサブユニットと相互作用するＩＬ−１５配列（Ｓｅｃ．Ｎｏ．１）の同定にある。線形（ｌｉｎｅａｌ）の１０アミノ酸ペプチドとして合成された配列は、Ｔ細胞増殖の誘導に関してはＩＬ−１５アンタゴニスト能を示し、ＴＮＦα誘導アポトーシスからの保護に関してはアゴニスト効果を示す。
【実施例】
【００２７】
本発明の実施態様を例証するため、以下の例を提供する。
【００２８】
（実施例１）
Ａ．ＩＬ−１５Ｒαに対する結合領域の同定
セルロース支持体上でのＩＬ−１５のアミノ酸配列に相当する１０−ｍｅｒペプチドの合成
ＩＬ−１５Ｒα結合に関与するＩＬ−１５領域の同定のため、Ｆｒａｎｋらが以前に述べているように、ペプチドスポット合成法を利用した。乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）とＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）とを使用して、最初のアンカー成分、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨのエステル化により、ワットマン５４０紙の誘導体化を実行した。セルロース膜上のスポットアレイ（ａｒｒａｙ）は、１０−ｍｅｒペプチドの要求数（２２ペプチド、５残基が重複、ＩＬ−１５配列の１１４アミノ酸）にしたがい、事前に印をつけた部分上でのＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨの固定化（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）によって決定された。そのうえで、関連の無い１０アミノ酸ペプチドについて、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨだけが固定化する（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）スポット２３とスポット２４において、コントロールとして両方とも合成した。これら全分子の集合について、標準的なＦｍｏｃ−／ｔＢｕ化学反応が使用された。合成の最終的なサイクルの後、全てのペプチドのＮ末端と側鎖は、脱保護された。
【００２９】
セルロース支持体上で合成されたペプチドへの抗ＩＬ−１５抗体の結合
ペプチド間の疎水的相互作用の可能性を回避するため、セルロースシートをエタノールに浸漬した。連続的な洗浄によって、エタノールをトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６）に置換した。１０ｍＬのＴＢＳ阻害緩衝液（５％粉末状乳入りＴＢＳ）中で膜を一晩インキュベートすることにより、非特異的結合を阻害した。次に、シートをＩＬ−１５α−受容体と３時間インキュベートし、１０ｍＬのＴ−ＴＢＳ試料緩衝液（５％粉末乳および０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０入りＴＢＳ）に希釈した。血清に対し、希釈率１：５０が使用された。ＩＬ−１５α−受容体は、同じ緩衝液中において、５μｇ／ｍＬに調製した。セルロースシートは４回Ｔ−ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。そして、アルカリホスファターゼ結合抗ＩｇＧ（Ｆｃ 特異的）（Ｓｉｇｍａ）が添加され、Ｔ−ＴＢＳ試料緩衝液中で１時間希釈された（ＩＬ−１５α受容体アッセイにおける抗ヒトＩｇＧに対し希釈率１：２５０００）。セルロースシートは再度Ｔ−ＴＢＳで４回洗浄し、膜と基質緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭｍｇＣｌ２、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９）中の０．５ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ ４−クロロ ３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）（Ｓｉｇｍａ）とをインキュベートすることにより、結合したペプチドの検出を達成した。陽性のスポットは青／紫色を発色した。ＰＢＳでの洗浄により、染色を終了した。セルロースシートは、前述（Ｆｒａｎｋ，Ｒ．（１９９２） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８，９２１７）のように、他のアッセイのため最終的に再生された。我々は、８と７の二つのペプチドの認識を観察した。実験のコントロールとして、膜をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含むヒト化モノクローナル抗体とインキュベートした。その場合には、我々は、膜上にいかなるペプチドの認識も観察しなかった。
【００３０】
ペプチドのＩＬ−１５Ｒαへの結合を実証するビーズ比色アッセイ
ペプチドＳｅｃ．Ｎｏ．１のＮＨ２−テンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ）−Ｓレジン上での合成
レジンＮＨ２−テンタゲル−Ｓ（０．２４ｍＭｏｌ／ｇ）は、何回かジクロロメタン（ＤＣＭ）とメタノールで洗浄した。それから１０分間、３０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液中でインキュベートし；何回かＤＣＭで洗浄し、５％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）入りＤＣＭ中にて１分間インキュベートした。この処置により、ＮＨ２基は、合成のため活性化した。その後、ＤＣＭで洗浄し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中にて５分間、ペプチドを合成するためインキュベートした。従来どおりのＦｍｏｃ／ｔＢｕ合成法を用いた。カップリング反応はニンヒドリン試験により追跡した。一度ペプチドＳｅｃ．Ｎｏ．１配列が完成すると、アミノ酸側鎖を脱保護し、Ｃ末端をレジンに固定化させた。
【００３１】
ビーズ上でのアッセイ
ペプチドを固定化したレジンビーズは、生理食塩溶液（ＰＢＳ）で数回洗浄した。非特異的相互作用は、１時間、室温のＰＢＳ中のＢＳＡ（１％）にて阻害した。次いで、５μｇ／ｍＬのＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ １４７−ＩＲ）入りＢＳＡ（１％／ＰＢＳ）中において、４°Ｃで１６時間インキュベートした。その後、ビーズを、５分間３倍希釈ＰＢＳ中で、振とうして洗浄し、それからＢＳＡ（１％／ＰＢＳ）中で１：２５０００に希釈された抗−Ｆｃ ＩｇＧヒト−ホスファターゼ結合体と、室温で３時間インキュベートした。その後、さらに生理食塩溶液（ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０、１％）にて洗浄し、約３０分間、ＢＣＩＰ（０．４５ｍｇ／ｍＬ）含有の基質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９；１００ｍＭ ＮａＣｌ；２ｍＭｍｇＣｌ２）中にてインキュベートした。反応を止めるため、ＰＢＳで４回（ｆｏｕｒ ｆｏｌｄ）洗浄した。Ｓｅｃ．Ｎｏ．１ペプチドを含有するレジンをＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃタンパク質とインキュベートしたときのみ強い青色が観察され、関連性の無いペプチドを含有するレジンとＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃとをインキュベートしたときには観察されなかった。そのような場合、色素の元となる基質は沈殿せず、また、色を発しない。同様に、過剰のヒトＩＬ−１５の存在によっては色を観察しなかった。
【００３２】
ペプチド合成
０．５４ｍＭｏｌ／ｇのＦｍｏｃ−ＡＭ−ＭＢＨＡレジンと、機械的振動を有する合成プロトコールを利用し、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法によってペプチドは合成された。ＴＦＡ処置の後、ペプチドは凍結乾燥され、ＨＰＬＣ−ＭＳによって検査された。
【００３３】
（実施例２）
上記ペプチドのＣＴＬＬ２細胞系増殖への効果
ＩＬ−１５存在下で、サイトカイン依存型細胞系ＣＴＬＬ−２は増殖する。シグナル伝達依存型受容体の阻害分子を結合したＩＬ−１５は、この細胞系の増殖を妨害する。
【００３４】
本発明のペプチドの中和能を評価するため、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＲＰＭＩ媒体（Ｇｉｂｃｏ）２５μＬ容が入った９６穴ウェル（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）で、それらの段階希釈を実施した。事前に洗浄したＣＴＬＬ−２細胞を、１ウェル当り５×１０３細胞で添加し、３０分間インキュベートした。それから、３００ｐｇのＩＬ−１５がそれぞれのウェルに添加された。プレートは、７２時間、５％ＣＯ２、３７°Ｃでインキュベートされた。結果を、図３ｂに示す。我々は、Ｓｅｃ Ｎｏ．１としたペプチドが、ＩＬ−１５が誘導する増殖を、１３０μＭというＩＣ５０で阻害することを観察した。増殖を測定するため、ＭＴＴミトコンドリア染色を使用した（Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：７６８−７７１）。我々は、また、異なるＩＬ−１５濃度での本ペプチド２６０μＭのアンタゴニスト効果について評価した（図３ａ）。ペプチドの阻害効果は、ＩＬ−１５投与量に依存した。
【００３５】
（実施例３）
Ｌ９２９細胞系におけるアポトーシス誘導
ＤＮＡ断片化アッセイ（ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）は、細胞のＴＮＦ−アルファによる処置によって分解したＤＮＡ量を決定することができる。放射活性の３Ｈ−チミジンをＤＮＡ中に取り込むよう、３Ｈ−チミジン存在下で細胞が成長することにより、細胞のＤＮＡは放射活性にラベル化された。２４時間後、細胞はＴｒｉｓｐｉｎ／ＥＤＴＡで処理、洗浄され、９６穴プレートに１ウェル当り５０００個ずつ撒かれた。次いで、ラベル化された細胞は、ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍＬ）、ペプチド（２６０μＭ）又はＴＮＦαと異なるペプチドとの組み合わせと共に、インキュベートされた。
【００３６】
このインキュベーション中に、添加した薬剤（ａｇｅｎｔ）（例えば、ＴＮＦα）は、アポトーシスによる細胞死を引き起こし、次に、未処置の細胞のＤＮＡが無傷の状態である間にＤＮＡの断片化を引き起こす。２４時間後、細胞は回収され；回収の間、細胞は２回蒸留した水（ｂｉｄｅｓｔｉｌａｔｅｄ）で９６穴プレートのウェルから洗い出され；細胞とオルガネラは破壊され、細胞のＤＮＡは遊離した。細胞フラグメントとＤＮＡはフィルター膜（ガラスフィルター）を通過した。１．５μＭより小さい粒子だけがフィルターを通過しうる。そのため、無傷のＤＮＡ（ミリメートル又はセンチメートルの範囲内の長さの断片である）は、フィルターを通過できず、フィルター膜上に収集される。約５０００ｂｐ以下の断片に解裂／分解したＤＮＡは、フィルターのポアを通過する程度に十分小さく、フィルター上には収集されない。フィルター膜は乾燥され、放射線量（無傷のＤＮＡ量に相当）が、シンチレーションカウンターで定量された。ＤＮＡ断片のパーセンテージは、薬剤未処理の細胞の計測された放射活性（カウント／分＝ｃｐｍ）と、薬剤処理済みの細胞のｃｐｍを比較して計算した。結果として、我々は、ペプチドＳｅｃ．Ｎｏ．１はＴＮＦ誘導アポトーシスから防護することが観察された。
【００３７】
（実施例４）
モノクローナル抗体調製
モノクローナル抗体は、Ｇｅｏｒｇｅｓ ＫｏｈｌｅｒとＣｅｓａｒ Ｍｉｌｓｔｅｉｎによる記述（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５）にしたがって得られた。ＫＬＨに結合したペプチドＳｅｃ Ｎｏ．１又は本ペプチド４分子を含む化学結合体は、ＩＬ−１５の結合と阻害の活性よりは、モノクローナル抗体の活性化（ｒａｉｓｅ）のために用いられた。
【００３８】
マウスは、フロイントアジュヴァント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）で１０から１００μｇの量で乳化して注射用に調製した結合ペプチドにより、皮下にて免疫性を与えられ、次いで隔週ごとに、不完全フロイントアジュヴァント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）内のペプチドによる皮下への免疫性付与を続けた。ＩＬ−１５に対する免疫性応答は、ＥＬＩＳＡによってモニターされた。犠牲となって脾臓を除去する３日前に、十分な力価の抗ＩＬ−１５免疫グロブリンを有するマウスは、静脈内追加免疫された。ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、我々は、Ｎａｔｕｒｅ（２５６：４９５−４９７，１９７５）に発表されている審査プロトコールを利用した。結果物のハイブリドーマは、ＩＬ−１５又はペプチドに特異的な抗体の産生に関して、ＥＬＩＳＡにより、及びＣＴＬＬ−２アッセイにおけるＩＬ−１５活性への阻害効果により、スクリーニングした。陽性のクローンは、腹水腫瘍を産生させるため同系マウスの腹膜腔内に接種させ、結果物のモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿と黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来タンパク質Ａへの抗体結合に基づいた、アフィニティークロマトグラフィーで精製された。
【００３９】
（実施例５）
カニクイザル（Ｍａｃａｃｕｓ ｉｒｕｓ）における中和抗体生成についてのＳｅｃ．Ｎｏ．１ペプチドの評価
３グループがサルの免疫性付与のスキームにより評価され、キャリアータンパク質に結合したペプチド、化学結合で４量体となったペプチド（ＭＡＰ）；及びプラセボにより免疫性が付与された。タンパク質は、フロイントアジュヴァント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）中に１接種当たり１００μｇから２００μｇの量が投与された。二回目の免疫性付与は１ヵ月後、三回目の免疫性付与は２ヵ月後に実施された。二回目と三回目の免疫性付与のそれぞれ二週間後に、血液がサル血清中の抗ＩＬ−１５抗体レベルを評価するために抽出された。サルの血清に存在する抗体の中和能は、ＩＬ−１５の３００ｐｇの存在でＣＴＬＬ−２アッセイによって試験された。
【００４０】
提案された解決の利点
Ｓｅｃ Ｎｏ．１ペプチドは、選択的にＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合を阻害する。ペプチドＳｅｃ Ｎｏ．１は、Ｔ細胞（ＣＴＬＬ−２細胞）上でのＩＬ−１５誘導増殖効果に対するアンタゴニストとなるが、さらに、ＴＮＦα−誘導アポトーシス感受性細胞でのＩＬ−１５アポトーシス保護効果のアゴニストである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】セルロースフィルター上でのＩＬ−１５Ｒマッピング ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃは、Ｓｅｃ Ｎｏ．１に相当するペプチド８と、より狭い範囲のペプチド７を認識している。
【図２】テンタゲルＳビーズ（Ｔｅｎｔａｇｅｌ Ｓ Ｂｅａｄｓ）上での比色アッセイ ５μｇ／ｍＬのＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）とインキュベートしたＳｅｃ Ｎｏ．１ペプチドを含有するビーズにおいて、発色が観察された。 ２ａ）ａ）関連性のないペプチド、又はｂ）Ｓｅｃ Ｎｏ．１ペプチドを含むレジンの、１５Ｒα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）でインキュベートされたレジンを含有するインキュベーション。 ２ｂ）ａ）Ｓｅｃ Ｎｏ．１ペプチドとＩＬ１５Ｒα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）、又はｂ）過剰なＩＬ−１５の存在下でのＳｅｃ Ｎｏ．１ペプチドとＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）を含むレジンのインキュベーション。
【図３】１０８ ＵＩ／ｍｇの特異的活性を有するヒトＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ）によるＣＴＬＬ−２増殖アッセイ ３ａ）異なる濃度のＩＬ−１５と固定化ペプチド濃度２６０μＭでの、ＣＴＬＬ−２アッセイ。 ３ｂ）異なる濃度のＳｅｃ Ｎｏ．１ペプチド濃度と固定化ＩＬ−１５濃度３００ｐｇ／ｍＬでの、ＣＴＬＬ−２アッセイ。
【図４】Ｌ９２９細胞系におけるアポトーシス誘導アッセイ ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍＬ）のみ、又はＳｅｃ Ｎｏ．１ペプチドと組み合わせてインキュベートされた細胞。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子薬学の分野、特に受容体アルファサブユニットに結合するインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を阻害し；それにより、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαの異常発現に関連する疾病の治療に有用なインターロイキン１５由来のペプチドに関連する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１５として知られるサイトカインは、Ｔ細胞活性化因子として２つのグループにより同時に確認された１４−１５ｋＤａの糖タンパク質である（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，２６４，９６５；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９４，９１，４９３５）。ＩＬ−１５のｍＲＮＡは異なる細胞や組織で広く発現されているが、翻訳段階および細胞間交通でのその発現の強力な転写後調節により、これらの細胞の中に、又は細胞上清中に、本タンパク質を見出すことは難しい（Ｂａｒｍｆｏｒｄ ＲＮ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６０：４４１８−４４２６；Ｋｕｒｙｓ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５：３０６５３−３０６５９）。さらに、ＩＬ−１５は活性状態で膜タンパク質として存在する可能性が示されており（Ｍｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９９，Ｖｏｌ．９３，Ｎｏ １０（Ｍａｙ １５），：ｐｐ３５３１−３５３９）、最近、本経路を介して、炎症性サイトカインの分泌を誘導するリガンドまたは受容体として機能する可能性が知られている（Ｂｕｄａｌｇｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２００４，ｖｏｌ ２７９，Ｎｏ ４０：ｐｐ ４２１９２−４２２０１）。
【０００３】
可溶型タンパク質の高い発現レベルは、自己免疫疾患および炎症疾患の病因に関連する。クローン病（Ｋｉｒｍａｎ Ｉ．，１９９６，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９１，１７８９）、乾癬（Ｒｕｃｋｅｒｔ Ｒ．２０００，１６５：２２４０−２２５０）、白血病（Ｙａｍａｄａ Ｙ．１９９９，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，３５（１−２）：３７−４５）及びリューマチ関節炎（ＲＡ）（Ｍｃｌｎｎｅｓ Ｉ．Ｂ．１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１９，７５−７９）を含むいくつかの疾患で、ＩＬ−１５が検出されている。Ｔ細胞受容体へのリガンドの結合は、ＩＬ−１５Ｒαの発現と、ＣＤ６９、ＣＤ２５そしてＴＮＦＲＩＩのようないくつかの活性化抗原の発現を誘引する。ＩＬ−１５もまた、ヒト血中Ｔリンパ球の誘引化学物質である（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ １９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１，１２２５０−１２５９）。これらのデータは全て、抗原提示細胞により発現したＩＬ−１５が炎症部位の初期のＴ細胞活性化において重要である、ということを示唆している。
【０００４】
Ｍｃｌｎｎｅｓらは、本疾患におけるＩＬ−１５の発現異常、髄液中の高濃度ＩＬ−１５、及び髄膜でのＩＬ−１５発現を見出した。彼らは、サイトカインカスケードにおいてＩＬ−１５がＴＮＦαに先行することを示唆し、細胞接触に依存する機構を提案し、そこでは、ＩＬ−１５に活性化されたＴ細胞が、マクロファージによるＴＮＦα合成を誘引するとしている。さらに、ＩＬ−１５は髄液中へのＴ細胞の移行に関する重要な因子として作用することが提唱されている（Ｍｃｌｎｎｅｓ，１９９７，Ｎａｔ Ｍｅｄ，３：１８９−１９５）。
【０００５】
Ｚｉｏｋｏｗｓｋａらは、ＩＬ−１５がＲＡ患者の関節において、ＩＬ−１７の発現を誘引することを報告しており、本サイトカインが、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、及びプロスタグランジンＥ２といったいくつかの炎症伝達物質の滑膜細胞からの遊離を誘引し、このことがＩＬ−１５に対しＲＡ病因における重要な役割を示唆することは既に知られている（Ｚｉｏｌｋｏｗｓｋａ ｙ ｃｏｌ ２０００，Ｊ ｉｍｍｕｎｏｌ，１６４：２８３２−２８３８）。
【０００６】
Ｔ細胞の漸増と活性化は、ＩＬ−１５の局所的合成の結果として生じうる。そのような非特異的活性化は、結果として、絶え間ない炎症を引き起こしうる。これら全てから、他の自己免疫疾患および炎症疾患と同様に、ＩＬ−１５阻害による本疾病の治療可能性を有しうることが示唆される。
【０００７】
ＩＬ−１５の生物学的効果は、３つのサブユニットα、βおよびγから構成される細胞膜受容体に結合することで仲介される。ＩＬ−１５Ｒαは、このサイトカインに対してＫｄ １０−１１という非常に高い親和性で結合する特有のサブユニットであり、膜受容体として又は可溶型として見出されうる（Ｂｕｄａｇｉａｎ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２００４，２７９，３９：４０３６８−４０７３５；Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００４，１７３：１６８１−１６８８）。
【０００８】
サブユニットβとγは、ＩＬ−１５と高い構造的相同性を有するサイトカイン、ＩＬ−２によって共有される。以前より、ＩＬ−１５分子におけるＡｓｐ５６が受容体βサブユニットとの結合に重要であり、Ｇｌｎ１５６は受容体γサブユニットとの結合に重要であると、言われている。
【０００９】
突然変異タンパク質は、受容体αサブユニットに結合したＩＬ−１５アンタゴニスト分子のように振る舞い、β及びγサブユニットを介したシグナル伝達を阻害する。これらのアミノ酸を認識する抗体もまた、ＩＬ−１５アンタゴニストのように作用する（ＵＳ６１７７０７９，ＵＳ６１６８７８３，ＵＳ６０１３４８０，ＵＳ６００１９７３，ＵＳ９７０６９３１，ＷＯ９７４１２３２）。
【００１０】
Ｒｕｃｈａｔｚらは、ネズミα受容体サブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）の可溶型断片を生成し、この断片の注射により、ＤＢＡ／１マウスにおけるコラーゲン−誘導型関節炎（ＣＩＡ）が阻害されることを実証した（Ｒｕｃｈａｔｚ Ｈ．１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５６５４−５６６０）。
【００１１】
Ｇｅｎｍａｂ社は、ＩＬ−１５に対して特異的なヒト抗体の特許、ＷＯ０３０１７９３５、を有しており、そこでは、４種の抗体について述べられているが、そのうちの２種、１４６Ｂ７と１４６Ｈ５は、受容体γサブユニット相互作用部位においてＩＬ−１５に結合し、ＣＴＬＬ２細胞系およびＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）においてＩＬ−１５誘導型細胞増殖を抑制すること、抗体４０４Ａ８と４０４Ｅ４は増殖を抑制しないこと、が述べられている。ＡＭＧ７１４という名で呼ばれている１４６Ｂ７抗体（Ａｍｇｅｎ）は、リュウマチ関節炎臨床試験のフェーズＩＩにある。
【００１２】
近年、受容体αサブユニットへのＩＬ−１５の結合配列が２種、アミノ酸４４から５２およびアミノ酸６４から６８に見つかった（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２００４，２７９（２３），２４３１３−２４３２２）。彼らは、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして作用する突然変異タンパク質について述べている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
今日までに、ＩＬ−１５アンタゴニストペプチドについては、述べられてきていない。ＩＬ−１５アンタゴニストとしての長さの短いペプチド（１０ａａ）の使用は、受容体αサブユニットへのＩＬ−１５結合を選択的に遮断し、ＩＬ−１５−受容体相互作用のためＩＬ−１５の影響を仲介又は阻害するという利点を有する。例えば、本発明でも述べるように、Ｓｅｃ Ｎｏ．１と名づけたペプチドは、我々が受容体αサブユニットとの相互作用部位として同定したＩＬ−１５の１０アミノ酸領域にわたる（図１）。そのようなペプチドは、ＥＬＩＳＡおよびテンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ）レジンアッセイにおいて、ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質と結合し（図２）、ＩＬ−１５に依存したＣＴＬＬ−２細胞系の増殖を阻害し（図３ａと図３ｂ）、ＴＮＦα誘導のアポトーシスから保護するが（図４）、本効果はＩＬ−１５の受容体α鎖への結合が仲介している。後者の効果より、アポトーシス経路を阻害することが必要な疾患への使用が考えられる。同様に、本発明において述べるような本ペプチドの可溶型α鎖への結合は、膜結合ＩＬ−１５よって仲介される逆シグナル伝達を阻害しうる（Ｂｕｄａｌｇｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２００４，ｖｏｌ ２７９，Ｎｏ ４０：ｐｐ ４２１９２−４２２０１）。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、特に、ＩＬ−１５Ｒαサブユニットに結合できるＩＬ−１５領域の同定に関する。本願で、Ｓｅｃ．Ｎｏ．１と名づけられた本領域を含むペプチドは、化学的に合成されており、ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃへの結合能を有し（図２）、ＩＬ−１５誘導のＣＴＬＬ２増殖を阻害し、ＴＮＦα誘導のＤＮＡ断片化から保護する（図４）。
【００１５】
本発明はまた、組み換え又は合成的方法によって得られた前者のペプチドの相同体又は相同的変異体のいずれについてもと同様に、それらを含有するいずれの処方についても含む。
【００１６】
同様に、本発明はまた、前述のペプチドの単独、又は他の適切な分子、例えば、抗炎症ステロイド薬（コルチコステロイド）、疾病調節薬（メトトレキサート）、若しくは他のリュウマチ関節炎治療で使用されるサイトカインアンタゴニストとの組み合わせ、での使用と、可溶型での又は膜結合型での受容体αサブユニットへのＩＬ−１５の結合を阻害するための該ペプチドの使用についても包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明におけるペプチドは、線形（ｌｉｎｅａｌ）構造を有し、主に、ＩＬ−１５に対するアンタゴニスト化する能力により、特徴付けられる。一方、本発明におけるペプチドによってもたらされるインビトロでの効果については、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイおよびＴＮＦα誘導アポトーシス阻害アッセイによって実証される。
【００１８】
前述のペプチドの確定のため、５つの重複アミノ酸を有した１０ ａａ連続ペプチド中にＩＬ−１５の完全な配列を含むセルロースフィルター上でのマップ化技術を利用した。
【００１９】
本発明において、Ｓｅｃ．Ｎｏ．１（配列番号１）は、固相法を用い化学的に合成され、ＨＰＬＣにより精製され、質量分析により分析され、最終的にそのＩＬ−１５活性への影響の点から評価された。
【００２０】
本発明において示される結果により、１０ ａａのペプチド（Ｓｅｃ．Ｎｏ．１）として同定し、合成した領域は、受容体αサブユニットと相互作用するＩＬ−１５領域に相当し、そのため、受容体へのＩＬ−１５の結合を抑制し、そのＩＬ−１５誘導型Ｔ細胞増殖活性を阻害することが示される。
【００２１】
ＩＬ−１５Ｒαと相互作用するＩＬ−１５のアミノ酸を含むペプチド（Ｓｅｃ．Ｎｏ．１）は、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合によって介されるＴＮＦαアポトーシス（Ｂｕｌｆｏｎｅ−Ｐａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ Ｖｏｌ．１３）のＩＬ−１５防御効果を模倣する。
【００２２】
ここで得られた結果は、前述のＩＬ−１５アンタゴニストの使用が正当化されるＩＬ−１５高発現性関連の疾病の治療において、及び可溶型ＩＬ−１５Ｒαの高発現性に関連する病理においてと同様、アポトーシス防御効果が必要とされる病理において、治療方法としての使用を提案する。このように、ＩＬ−１５におけるＳｅｃ．Ｎｏ．１に含まれる領域を認識する抗体は、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合を阻害し、そのような受容体サブユニットへの分子の結合を阻害することによって、ＩＬ−１５アンタゴニスト活性を示すであろう。このことからも、キャリアー分子又はＭＡＰ（マルチ抗原性ペプチド）化学結合体に結合したペプチドは、ＩＬ−１５アンタゴニスト抗体を得るために用いることができる。
【００２３】
本発明の目的は、また、前述のペプチドのＤＮＡコード化へも適用される。本発明におけるペプチドをコードしたＤＮＡを含むベクターは、ペプチド配列の発現に替わる他の方法としても用いることができる。
【００２４】
ここで説明されているペプチドは、他の抗炎症および炎症抑制剤、又は、リュウマチ関節炎、乾癬、クローン病等で使用されている他のサイトカインアンタゴニストと組み合わせて、使用することができる。
【００２５】
前述のペプチドは、抗ＩＬ−１５体液性応答を示す治療用ワクチンにも含まれ得る。
【００２６】
本発明は、受容体αサブユニットと相互作用するＩＬ−１５配列（Ｓｅｃ．Ｎｏ．１）の同定にある。線形（ｌｉｎｅａｌ）の１０アミノ酸ペプチドとして合成された配列は、Ｔ細胞増殖の誘導に関してはＩＬ−１５アンタゴニスト能を示し、ＴＮＦα誘導アポトーシスからの保護に関してはアゴニスト効果を示す。
【実施例】
【００２７】
本発明の実施態様を例証するため、以下の例を提供する。
【００２８】
（実施例１）
Ａ．ＩＬ−１５Ｒαに対する結合領域の同定
セルロース支持体上でのＩＬ−１５のアミノ酸配列に相当する１０−ｍｅｒペプチドの合成
ＩＬ−１５Ｒα結合に関与するＩＬ−１５領域の同定のため、Ｆｒａｎｋらが以前に述べているように、ペプチドスポット合成法を利用した。乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）とＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）とを使用して、最初のアンカー成分、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨのエステル化により、ワットマン５４０紙の誘導体化を実行した。セルロース膜上のスポットアレイ（ａｒｒａｙ）は、１０−ｍｅｒペプチドの要求数（２２ペプチド、５残基が重複、ＩＬ−１５配列の１１４アミノ酸）にしたがい、事前に印をつけた部分上でのＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨの固定化（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）によって決定された。そのうえで、関連の無い１０アミノ酸ペプチドについて、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨだけが固定化する（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）スポット２３とスポット２４において、コントロールとして両方とも合成した。これら全分子の集合について、標準的なＦｍｏｃ−／ｔＢｕ化学反応が使用された。合成の最終的なサイクルの後、全てのペプチドのＮ末端と側鎖は、脱保護された。
【００２９】
セルロース支持体上で合成されたペプチドへの抗ＩＬ−１５抗体の結合
ペプチド間の疎水的相互作用の可能性を回避するため、セルロースシートをエタノールに浸漬した。連続的な洗浄によって、エタノールをトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６）に置換した。１０ｍＬのＴＢＳ阻害緩衝液（５％粉末状乳入りＴＢＳ）中で膜を一晩インキュベートすることにより、非特異的結合を阻害した。次に、シートをＩＬ−１５α−受容体と３時間インキュベートし、１０ｍＬのＴ−ＴＢＳ試料緩衝液（５％粉末乳および０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０入りＴＢＳ）に希釈した。血清に対し、希釈率１：５０が使用された。ＩＬ−１５α−受容体は、同じ緩衝液中において、５μｇ／ｍＬに調製した。セルロースシートは４回Ｔ−ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。そして、アルカリホスファターゼ結合抗ＩｇＧ（Ｆｃ 特異的）（Ｓｉｇｍａ）が添加され、Ｔ−ＴＢＳ試料緩衝液中で１時間希釈された（ＩＬ−１５α受容体アッセイにおける抗ヒトＩｇＧに対し希釈率１：２５０００）。セルロースシートは再度Ｔ−ＴＢＳで４回洗浄し、膜と基質緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭｍｇＣｌ２、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９）中の０．５ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ ４−クロロ ３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）（Ｓｉｇｍａ）とをインキュベートすることにより、結合したペプチドの検出を達成した。陽性のスポットは青／紫色を発色した。ＰＢＳでの洗浄により、染色を終了した。セルロースシートは、前述（Ｆｒａｎｋ，Ｒ．（１９９２） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８，９２１７）のように、他のアッセイのため最終的に再生された。我々は、８と７の二つのペプチドの認識を観察した。実験のコントロールとして、膜をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含むヒト化モノクローナル抗体とインキュベートした。その場合には、我々は、膜上にいかなるペプチドの認識も観察しなかった。
【００３０】
ペプチドのＩＬ−１５Ｒαへの結合を実証するビーズ比色アッセイ
ペプチドＳｅｃ．Ｎｏ．１のＮＨ２−テンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ）−Ｓレジン上での合成
レジンＮＨ２−テンタゲル−Ｓ（０．２４ｍＭｏｌ／ｇ）は、何回かジクロロメタン（ＤＣＭ）とメタノールで洗浄した。それから１０分間、３０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液中でインキュベートし；何回かＤＣＭで洗浄し、５％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）入りＤＣＭ中にて１分間インキュベートした。この処置により、ＮＨ２基は、合成のため活性化した。その後、ＤＣＭで洗浄し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中にて５分間、ペプチドを合成するためインキュベートした。従来どおりのＦｍｏｃ／ｔＢｕ合成法を用いた。カップリング反応はニンヒドリン試験により追跡した。一度ペプチドＳｅｃ．Ｎｏ．１配列が完成すると、アミノ酸側鎖を脱保護し、Ｃ末端をレジンに固定化させた。
【００３１】
ビーズ上でのアッセイ
ペプチドを固定化したレジンビーズは、生理食塩溶液（ＰＢＳ）で数回洗浄した。非特異的相互作用は、１時間、室温のＰＢＳ中のＢＳＡ（１％）にて阻害した。次いで、５μｇ／ｍＬのＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ １４７−ＩＲ）入りＢＳＡ（１％／ＰＢＳ）中において、４°Ｃで１６時間インキュベートした。その後、ビーズを、５分間３倍希釈ＰＢＳ中で、振とうして洗浄し、それからＢＳＡ（１％／ＰＢＳ）中で１：２５０００に希釈された抗−Ｆｃ ＩｇＧヒト−ホスファターゼ結合体と、室温で３時間インキュベートした。その後、さらに生理食塩溶液（ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０、１％）にて洗浄し、約３０分間、ＢＣＩＰ（０．４５ｍｇ／ｍＬ）含有の基質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９；１００ｍＭ ＮａＣｌ；２ｍＭｍｇＣｌ２）中にてインキュベートした。反応を止めるため、ＰＢＳで４回（ｆｏｕｒ ｆｏｌｄ）洗浄した。Ｓｅｃ．Ｎｏ．１ペプチドを含有するレジンをＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃタンパク質とインキュベートしたときのみ強い青色が観察され、関連性の無いペプチドを含有するレジンとＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃとをインキュベートしたときには観察されなかった。そのような場合、色素の元となる基質は沈殿せず、また、色を発しない。同様に、過剰のヒトＩＬ−１５の存在によっては色を観察しなかった。
【００３２】
ペプチド合成
０．５４ｍＭｏｌ／ｇのＦｍｏｃ−ＡＭ−ＭＢＨＡレジンと、機械的振動を有する合成プロトコールを利用し、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法によってペプチドは合成された。ＴＦＡ処置の後、ペプチドは凍結乾燥され、ＨＰＬＣ−ＭＳによって検査された。
【００３３】
（実施例２）
上記ペプチドのＣＴＬＬ２細胞系増殖への効果
ＩＬ−１５存在下で、サイトカイン依存型細胞系ＣＴＬＬ−２は増殖する。シグナル伝達依存型受容体の阻害分子を結合したＩＬ−１５は、この細胞系の増殖を妨害する。
【００３４】
本発明のペプチドの中和能を評価するため、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＲＰＭＩ媒体（Ｇｉｂｃｏ）２５μＬ容が入った９６穴ウェル（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）で、それらの段階希釈を実施した。事前に洗浄したＣＴＬＬ−２細胞を、１ウェル当り５×１０３細胞で添加し、３０分間インキュベートした。それから、３００ｐｇのＩＬ−１５がそれぞれのウェルに添加された。プレートは、７２時間、５％ＣＯ２、３７°Ｃでインキュベートされた。結果を、図３ｂに示す。我々は、Ｓｅｃ Ｎｏ．１としたペプチドが、ＩＬ−１５が誘導する増殖を、１３０μＭというＩＣ５０で阻害することを観察した。増殖を測定するため、ＭＴＴミトコンドリア染色を使用した（Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：７６８−７７１）。我々は、また、異なるＩＬ−１５濃度での本ペプチド２６０μＭのアンタゴニスト効果について評価した（図３ａ）。ペプチドの阻害効果は、ＩＬ−１５投与量に依存した。
【００３５】
（実施例３）
Ｌ９２９細胞系におけるアポトーシス誘導
ＤＮＡ断片化アッセイ（ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）は、細胞のＴＮＦ−アルファによる処置によって分解したＤＮＡ量を決定することができる。放射活性の３Ｈ−チミジンをＤＮＡ中に取り込むよう、３Ｈ−チミジン存在下で細胞が成長することにより、細胞のＤＮＡは放射活性にラベル化された。２４時間後、細胞はＴｒｉｓｐｉｎ／ＥＤＴＡで処理、洗浄され、９６穴プレートに１ウェル当り５０００個ずつ撒かれた。次いで、ラベル化された細胞は、ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍＬ）、ペプチド（２６０μＭ）又はＴＮＦαと異なるペプチドとの組み合わせと共に、インキュベートされた。
【００３６】
このインキュベーション中に、添加した薬剤（ａｇｅｎｔ）（例えば、ＴＮＦα）は、アポトーシスによる細胞死を引き起こし、次に、未処置の細胞のＤＮＡが無傷の状態である間にＤＮＡの断片化を引き起こす。２４時間後、細胞は回収され；回収の間、細胞は２回蒸留した水（ｂｉｄｅｓｔｉｌａｔｅｄ）で９６穴プレートのウェルから洗い出され；細胞とオルガネラは破壊され、細胞のＤＮＡは遊離した。細胞フラグメントとＤＮＡはフィルター膜（ガラスフィルター）を通過した。１．５μＭより小さい粒子だけがフィルターを通過しうる。そのため、無傷のＤＮＡ（ミリメートル又はセンチメートルの範囲内の長さの断片である）は、フィルターを通過できず、フィルター膜上に収集される。約５０００ｂｐ以下の断片に解裂／分解したＤＮＡは、フィルターのポアを通過する程度に十分小さく、フィルター上には収集されない。フィルター膜は乾燥され、放射線量（無傷のＤＮＡ量に相当）が、シンチレーションカウンターで定量された。ＤＮＡ断片のパーセンテージは、薬剤未処理の細胞の計測された放射活性（カウント／分＝ｃｐｍ）と、薬剤処理済みの細胞のｃｐｍを比較して計算した。結果として、我々は、ペプチドＳｅｃ．Ｎｏ．１はＴＮＦ誘導アポトーシスから防護することが観察された。
【００３７】
（実施例４）
モノクローナル抗体調製
モノクローナル抗体は、Ｇｅｏｒｇｅｓ ＫｏｈｌｅｒとＣｅｓａｒ Ｍｉｌｓｔｅｉｎによる記述（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５）にしたがって得られた。ＫＬＨに結合したペプチドＳｅｃ Ｎｏ．１又は本ペプチド４分子を含む化学結合体は、ＩＬ−１５の結合と阻害の活性よりは、モノクローナル抗体の活性化（ｒａｉｓｅ）のために用いられた。
【００３８】
マウスは、フロイントアジュヴァント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）で１０から１００μｇの量で乳化して注射用に調製した結合ペプチドにより、皮下にて免疫性を与えられ、次いで隔週ごとに、不完全フロイントアジュヴァント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）内のペプチドによる皮下への免疫性付与を続けた。ＩＬ−１５に対する免疫性応答は、ＥＬＩＳＡによってモニターされた。犠牲となって脾臓を除去する３日前に、十分な力価の抗ＩＬ−１５免疫グロブリンを有するマウスは、静脈内追加免疫された。ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、我々は、Ｎａｔｕｒｅ（２５６：４９５−４９７，１９７５）に発表されている審査プロトコールを利用した。結果物のハイブリドーマは、ＩＬ−１５又はペプチドに特異的な抗体の産生に関して、ＥＬＩＳＡにより、及びＣＴＬＬ−２アッセイにおけるＩＬ−１５活性への阻害効果により、スクリーニングした。陽性のクローンは、腹水腫瘍を産生させるため同系マウスの腹膜腔内に接種させ、結果物のモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿と黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来タンパク質Ａへの抗体結合に基づいた、アフィニティークロマトグラフィーで精製された。
【００３９】
（実施例５）
カニクイザル（Ｍａｃａｃｕｓ ｉｒｕｓ）における中和抗体生成についてのＳｅｃ．Ｎｏ．１ペプチドの評価
３グループがサルの免疫性付与のスキームにより評価され、キャリアータンパク質に結合したペプチド、化学結合で４量体となったペプチド（ＭＡＰ）；及びプラセボにより免疫性が付与された。タンパク質は、フロイントアジュヴァント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）中に１接種当たり１００μｇから２００μｇの量が投与された。二回目の免疫性付与は１ヵ月後、三回目の免疫性付与は２ヵ月後に実施された。二回目と三回目の免疫性付与のそれぞれ二週間後に、血液がサル血清中の抗ＩＬ−１５抗体レベルを評価するために抽出された。サルの血清に存在する抗体の中和能は、ＩＬ−１５の３００ｐｇの存在でＣＴＬＬ−２アッセイによって試験された。
【００４０】
提案された解決の利点
Ｓｅｃ Ｎｏ．１ペプチドは、選択的にＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合を阻害する。ペプチドＳｅｃ Ｎｏ．１は、Ｔ細胞（ＣＴＬＬ−２細胞）上でのＩＬ−１５誘導増殖効果に対するアンタゴニストとなるが、さらに、ＴＮＦα−誘導アポトーシス感受性細胞でのＩＬ−１５アポトーシス保護効果のアゴニストである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】セルロースフィルター上でのＩＬ−１５Ｒマッピング ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃは、Ｓｅｃ Ｎｏ．１に相当するペプチド８と、より狭い範囲のペプチド７を認識している。
【図２】テンタゲルＳビーズ（Ｔｅｎｔａｇｅｌ Ｓ Ｂｅａｄｓ）上での比色アッセイ ５μｇ／ｍＬのＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）とインキュベートしたＳｅｃ Ｎｏ．１ペプチドを含有するビーズにおいて、発色が観察された。 ２ａ）ａ）関連性のないペプチド、又はｂ）Ｓｅｃ Ｎｏ．１ペプチドを含むレジンの、１５Ｒα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）でインキュベートされたレジンを含有するインキュベーション。 ２ｂ）ａ）Ｓｅｃ Ｎｏ．１ペプチドとＩＬ１５Ｒα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）、又はｂ）過剰なＩＬ−１５の存在下でのＳｅｃ Ｎｏ．１ペプチドとＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）を含むレジンのインキュベーション。
【図３】１０８ ＵＩ／ｍｇの特異的活性を有するヒトＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ）によるＣＴＬＬ−２増殖アッセイ ３ａ）異なる濃度のＩＬ−１５と固定化ペプチド濃度２６０μＭでの、ＣＴＬＬ−２アッセイ。 ３ｂ）異なる濃度のＳｅｃ Ｎｏ．１ペプチド濃度と固定化ＩＬ−１５濃度３００ｐｇ／ｍＬでの、ＣＴＬＬ−２アッセイ。
【図４】Ｌ９２９細胞系におけるアポトーシス誘導アッセイ ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍＬ）のみ、又はＳｅｃ Ｎｏ．１ペプチドと組み合わせてインキュベートされた細胞。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１として記載したアミノ酸配列を含むことを特徴とするＩＬ−１５活性アンタゴニストペプチド。
【請求項２】
ＩＬ−１５Ｒα細胞サブユニット又はその可溶分画に結合することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性の阻害を特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドの配列と相同的な配列を含み、請求項２に記載のＩＬ−１５細胞受容体のサブユニットα又はその可溶画分に結合可能であり、請求項３に記載のペプチドの効果を模倣することが可能であることを特徴とするペプチド。
【請求項５】
細胞性のＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性を阻害することが可能な医薬製剤の活性成分であることを特徴とする請求項１〜４に記載のペプチド。
【請求項６】
遺伝子操作又は化学合成によって得られることを特徴とする請求項１〜５に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１のペプチドをコードし、その産生物がＩＬ１５Ｒα又はその可溶画分に結合することができ、ＩＬ−１５生物活性を阻害することを特徴とする核酸鎖。
【請求項８】
発現ベクターの一部であるが、ＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性を阻害することができることを特徴とする請求項７に記載の核酸鎖。
【請求項９】
ＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性を阻害することが可能な治療薬であり、請求項１〜６に記載のペプチドを単独で、結合して、又は組み合わせて含むことを特徴とする医薬製剤。
【請求項１０】
細胞性のＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性を阻害することが可能な治療薬であり、請求項８に記載の核酸鎖を含むことを特徴とする医薬製剤。
【請求項１１】
請求項１〜６に記載のペプチドを含み、細胞性のＩＬ−１５Ｒα型依存のＩＬ−１５生物活性の阻害応答を誘導することができる治療ワクチンであることを特徴とするワクチン製剤。
【請求項１２】
請求項１〜６に記載のペプチドのリュウマチ関節炎の治療における使用。
【請求項１３】
請求項１〜６に記載のペプチドのクローン病の治療における使用。
【請求項１４】
請求項１〜６に記載のペプチドの乾癬治療における使用。
【請求項１５】
請求項１〜６のペプチドを認識可能であることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載のモノクローナル抗体のリュウマチ関節炎、クローン病、及び乾癬の治療における使用。
【請求項１】
配列表の配列番号１として記載したアミノ酸配列を含むことを特徴とするＩＬ−１５活性アンタゴニストペプチド。
【請求項２】
ＩＬ−１５Ｒα細胞サブユニット又はその可溶分画に結合することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性の阻害を特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドの配列と相同的な配列を含み、請求項２に記載のＩＬ−１５細胞受容体のサブユニットα又はその可溶画分に結合可能であり、請求項３に記載のペプチドの効果を模倣することが可能であることを特徴とするペプチド。
【請求項５】
細胞性のＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性を阻害することが可能な医薬製剤の活性成分であることを特徴とする請求項１〜４に記載のペプチド。
【請求項６】
遺伝子操作又は化学合成によって得られることを特徴とする請求項１〜５に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１のペプチドをコードし、その産生物がＩＬ１５Ｒα又はその可溶画分に結合することができ、ＩＬ−１５生物活性を阻害することを特徴とする核酸鎖。
【請求項８】
発現ベクターの一部であるが、ＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性を阻害することができることを特徴とする請求項７に記載の核酸鎖。
【請求項９】
ＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性を阻害することが可能な治療薬であり、請求項１〜６に記載のペプチドを単独で、結合して、又は組み合わせて含むことを特徴とする医薬製剤。
【請求項１０】
細胞性のＩＬ−１５Ｒα依存型のＩＬ−１５生物活性を阻害することが可能な治療薬であり、請求項８に記載の核酸鎖を含むことを特徴とする医薬製剤。
【請求項１１】
請求項１〜６に記載のペプチドを含み、細胞性のＩＬ−１５Ｒα型依存のＩＬ−１５生物活性の阻害応答を誘導することができる治療ワクチンであることを特徴とするワクチン製剤。
【請求項１２】
請求項１〜６に記載のペプチドのリュウマチ関節炎の治療における使用。
【請求項１３】
請求項１〜６に記載のペプチドのクローン病の治療における使用。
【請求項１４】
請求項１〜６に記載のペプチドの乾癬治療における使用。
【請求項１５】
請求項１〜６のペプチドを認識可能であることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載のモノクローナル抗体のリュウマチ関節炎、クローン病、及び乾癬の治療における使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５１２９９４（Ｐ２００８−５１２９９４Ａ）
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３１５７５（Ｐ２００７−５３１５７５）
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００５／０００００７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２９５７８
【国際公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００５／０００００７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２９５７８
【国際公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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