本発明は、インフルエンザウイルスを中和するヒトのｓｃＦｖ抗体およびモノクローナル抗体を提供する。また、トリインフルエンザなどのインフルエンザ関連の疾患又は疾病の治療及び／又は予防方法を提供する。また、本発明はインフルエンザに対する患者の予防接種方法を提供する。また、インフルエンザ関連の疾患又は疾病の診断方法と試料中のインフルエンザの存在の検出方法も提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００７年１２月６日に出願のＵＳＳＮ６１／００５７２５及び２００８年８月２５日に出願のＵＳＳＮ６１／０９１５９９の優先権を主張するものであり、これらの内容は出典明記によって本明細書中に援用される。
【０００２】
（助成金支援）
本発明は、国立衛生研究所助成Ｕ０１ ＡＩ０７４５１８−０１の下で、米国政府支援により成された。米国政府は本発明の特定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、概して、抗ウイルス抗体並びにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザの世界的流行は、ヒトの健康に最も大きな急性感染の脅威の一つである。１９１８〜１９１９年のインフルエンザの世界的流行は米国の約５００，０００人の死を引き起こし、米国歴史上最も致命的な現象となった。高病原性鳥インフルエンザ(ＨＰＡＩ) Ｈ５Ｎ１インフルエンザはアジア全体に蔓延し、現在中東および北アフリカへ、新たな世界的流行の実質的なリスクとなっている。
自然変異(natural variation)並びに回避変異(escape mutant)は、ウイルスの継続した進化が菌株(一又は複数)を受動および能動的な免疫化に使うべきであるという決定に影響を与えうることを示唆する。多くの重要なエピトープマッピングおよび中和回避(neutralization escape)研究は新規の中和抗体を報告しているが、ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１に対する免疫化方策を開発するためには関連の構造的な研究が必要とされている。ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１に対する保護ワクチンを開発する試みは大変なものであり、常に変化する敵による人の感染を予防及び治療するためには新たな方策が必要である。受動的にも能動的にも保護的な宿主免疫を誘発するためには、治療的方策を急いで開発する必要がある。
ヒト抗体(Ａｂ)工学の分野は甚だしく進歩している。モノクローナル抗体(Ｍａｂ)ベースの免疫療法は現在、ＲＳＶを含む増えつつあるヒト疾患の標準的な治療となりつつある。デノボのヒトＭａｂ単離およびその臨床使用に対する推移は、現在、高い親和性及び特異性を有するヒト抗体を構築するために利用される新規な抗体ディスプレイおよび他のライブラリスクリーニング技術にある程度よるものである。ヒトＭａｂ免疫療法は、ヒトの疾患の臨床管理においてますます重要な役割を提供しうる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、インフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡウイルスを中和するモノクローナル抗体の発見に基づく。インフルエンザＡウイルスはＨ１クラスターインフルエンザウイルスのようなグループＩインフルエンザＡウイルスであり、Ｈ１クラスターインフルエンザウイルスはＨ１ａクラスター又はＨ１ｂクラスターである。モノクローナル抗体は完全にヒトである。様々な態様では、モノクローナル抗体は、二価抗体、一価抗体、単鎖抗体又はその断片である。具体的に、このようなモノクローナル抗体は、ＨＡ１又はＨＡ２ポリペプチドのような、ヘマグルチニンタンパク質(ＨＡ)のステム領域上のエピトープに結合する。エピトープは非線形である。
場合によって、エピトープはＨＡ-１およびＨＡ-２を含む。エピトープは非線形である。いくつかの実施態様では、エピトープは、ＨＡ１ポリペプチドのアミノ酸位１８、３８、４０、２９１と、ＨＡ２ポリペプチドのアミノ酸位１８、１９、２０、２１、３８、４１、４２、４５、４９、５２、５３および５６を含む。
例示的なモノクローナル抗体には、モノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０又はＨ９８、または、Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０又はＨ９８と同じエピトープに結合する抗体が含まれる。
【０００６】
本発明のモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０又はＨ９８の結合親和性を有しうる。あるいは、結合親和性は、およそ１ｐＭ〜およそ２００ｍＭであってよい。本発明のモノクローナル抗体は、ウイルスと細胞の膜融合を阻害するように機能する。
モノクローナル抗体は、配列番号：２、６、１２、１８、２４、２８、３２および３６を含む重鎖可変アミノ酸配列および／または配列番号：４、８、１４、１６、２０、２２、２６、３０、３４および３８を含む軽鎖可変アミノ酸配列とを有する。
モノクローナル抗体は、配列番号：１、５、１３、１５、２１、２３、２９、３３、３７及び４０を含む重鎖可変核酸配列、及び又は配列番号：３、９、１１、１７、１９、２５、２７、３１、３５、３９および４２を含む軽鎖可変核酸配列を有する。
また、モノクローナル抗-インフルエンザヘマグルチニンタンパク質抗体又はその断片であって、 該抗体が、アミノ酸配列ＳＹＡＦＳ、ＴＮＡＦＳ、ＡＹＡＦＴ、ＳＦＡＩＳ、ＳＹＡＩＳ、ＧＹＹＩＨ、ＭＴＡＦＴ又はＤＮＡＩＳを有するＶ_Ｈ ＣＤＲ１領域；アミノ酸配列ＧＩＩＰＭＦＧＴＰＮＹＡＱＫＦＱＧ、ＧＶＩＰＬＦＲＴＡＳＹＡＱＮＶＱＧ、ＧＩＩＧＭＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ、ＧＩＳＰＭＦＧＴＰＮＹＡＱＫＦＱＧ、ＧＩＩＧＶＦＧＶＰＫＹＡＱＫＦＱＧ、ＷＩＮＰＭＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＶ、ＧＩＳＰＩＦＲＴＰＫＹＡＱＫＦＱＧ又はＧＩＩＰＩＦＧＫＰＮＹＡＱＫＦＱＧを有するＶ_Ｈ ＣＤＲ２領域；アミノ酸配列ＳＳＧＹＹＹＧＧＧＦＤＶ、ＳＳＧＹＨＦＧＲＳＨＦＤＳ、ＧＬＹＹＹＥＳＳＬＤＹ、ＳＰＳＹＩＣＳＧＧＴＣＶＦＤＨ、ＥＰＧＹＹＶＧＫＮＧＦＤＶ、ＧＡＳＶＬＲＹＦＤＷＱＰＥＡＬＤＩ、ＴＬＳＳＹＱＰＮＮＤＡＦＡＩ又はＤＳＤＡＹＹＹＧＳＧＧＭＤＶを有するＶ_Ｈ ＣＤＲ３領域；アミノ酸配列ＴＧＳＳＳＮＩＧＮＹＶＡ、ＴＧＳＳＳＮＩＡＡＮＹＶＱ、ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＳＶＳ、ＴＧＮＳＮＮＶＧＮＱＧＡＡ、ＴＧＤＳＮＮＶＧＨＱＧＴＡ、ＧＧＮＮＩＧＧＹＳＶＨ、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＳＬＳＳＫＹＬＡ、ＴＧＳＳＳＮＩＧＮＹＶＡ、ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ又はＴＬＳＳＧＨＳＮＹＩＩＡを有するＶ_Ｌ ＣＤＲ１領域 ；アミノ酸配列ＳＮＳＤＲＰＳ、ＥＤＤＲＲＰＳ、ＥＶＴＫＲＰＳ、ＲＮＮＤＲＰＳ、ＲＮＧＮＲＰＳ、ＤＤＫＤＲＰＳ、ＤＡＳＮＲＡＴ、ＧＡＳＳＲＡＴ、ＳＮＮＱＲＰＳ、ＡＡＳＳＬＱＲ、ＳＮＥＱＲＰＳ又はＶＮＳＤＧＳＨＴＫＧＤを有するＶ_Ｌ ＣＤＲ２領域、および／またはアミノ酸配列ＱＳＹＤＳＬＳＡＹＶ、ＱＳＹＤＴＮＮＨＡＶ、ＣＳＹＡＧＨＳＡＹＶ、ＳＴＷＤＳＳＬＳＡＶＶ、ＳＶＷＤＳＳＬＳＡＷＶ、ＱＶＷＤＳＧＮＤＲＰＬ、ＱＱＹＧＳＳＰＱＶ、ＱＱＹＤＧＶＰＲＴ、ＱＳＹＤＳＲＬＳＡＳＬ、ＱＱＹＤＳＳＰＹＴ、ＡＳＷＤＤＮＬＳＧＷＶ又はＥＴＷＤＴＫＩＨＶを有するＶ_Ｌ ＣＤＲ３領域を有する抗体又は断片が本発明によって提供される。
【０００７】
更なる態様では、本発明は、単離されたモノクローナル抗-インフルエンザヘマグルチニンタンパク質抗体又はその断片であって、 該抗体が、ＶＨ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ１-６９*０１によってコードされるＶＨアミノ酸配列と、以下の位置にアミノ酸を有し、ａ) ２７がバリンである；ｂ) ２８がスレオニンである；ｃ) ３０がセリンである；ｄ) ３１がセリンである；ｅ) ５４がメチオニンである；ｆ) ５５がフェニルアラニンである；ｇ) ５８がスレオニンである；ｈ) １００がプロリンである；ｉ) １０１がセリンである；ｊ) １０２がチロシンである；ｋ)１０３がイソロイシンであり、１０５がセリンである抗体又は断片を提供する。
他の態様では、本発明は、インフルエンザウイルスによって生じる疾患又は疾病を患うリスクにあるヒトに、治療的に有効量の本明細書中に記載のモノクローナル抗体又はｓｃＦＶ抗体を投与することによる、該疾患又は疾病の予防又は治療の方法を提供する。モノクローナル抗体又はｓｃＦＶ抗体は、インフルエンザウイルスを中和するために十分な用量で投与される。本発明の実施態様では、方法もまた、抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害薬又はウイルス接着阻害薬を投与することを含む。抗ウイルス薬は、ザナミビル又はオセルタミビルリン酸塩のようなノイラミニダーゼ阻害薬、ＨＡ阻害薬、シアル酸阻害薬、又はアマンタジン又はリマンタジンのようなＭ２イオンチャネルである。抗体はインフルエンザウイルスへの曝露の前又は後に投与される。
【０００８】
他の態様では、本発明は、試料を本明細書中に記載のモノクローナル抗体と接触させ、抗体−抗原複合体の有無を検出し、これによって試料中のインフルエンザの存在を検出することによって、試料中のインフルエンザウイルスの存在の検出方法を提供する。試験試料は一般に、血液、体毛、頬擦過物又は塗布物、唾液、生検、尿、糞便、痰、鼻吸引又は精液から得られる。
さらに、本発明は、ＨＡのステム領域の高く保存されたエピトープを標的とする広い中和ヒト抗体を生成するためのプロトコールの発見に基づく。可塑性(プラスチック)表面に吸着された無電荷のマンノースと短いＮ-グリカンを産生するバキュロウイルスに発現される三量体Ｈ５外部ドメインを用いると、正常に免疫優性球状ヘッドをマスキングしながら、ステムエピトープを優性に提示することができた。
【０００９】
したがって、本発明はまた、単鎖又はＦａｂ発現ライブラリをウイルスの膜融合タンパク質にさらし、該タンパク質を特異的に結合するライブラリ中の抗体を同定し、そしてライブラリから抗体を単離することによる、病原性エンベロープウイルスを特異的に結合する単離された抗体の製造方法も包含される。好ましくは、融合タンパク質は、固形表面、例えばプラスチックに固定される。様々な態様では、融合タンパク質は、野生型融合タンパク質と比較して変更したグリコシル化を有する。例えば、融合は、昆虫細胞などの非哺乳動物細胞内で産生される。融合タンパク質は、例えば三量体ヘマグルチニン(ＨＡ)タンパク質である。
本発明はさらに、生物学的に適合性のあるマトリックスにコートされたか又は包埋された膜融合タンパク質(例えば三量体ヘマグルチニン(ＨＡ)タンパク質)を被検体に投与することによる、インフルエンザウイルスなどの病原性エンベロープウイルスに対して被検体を予防接種する方法を提供する。様々な態様では、融合タンパク質は、野生型融合タンパク質と比較して変更したグリコシル化を有する。
他の態様では、本発明は、本明細書中に記載のモノクローナル抗体を含む組成物、及び一又は複数の容器内の組成物と使用のための指示書を具備するキットを提供する。
【００１０】
特に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術的及び化学的用語は、本発明が属する分野の通常の技術者によって共通して理解される意味と同じである。本明細書において記述されるものに類似する方法及び材料又はその等価物が、本発明の実施又は試験に使われうるが、適切な方法および材料は後述する。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の文献は、出典明記によってその全体が本明細書中に援用される。紛争の場合、定義を含む本明細書は管理するであろう。さらに、材料、方法および実施例は例示のためだけのものであって、制限を目的とするものではない。
本発明の他の特徴および効果は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ１２０３／０４三量体の構造の例である。レセプター結合部位および抗原性変異部位を単量体上で強調して示す。
【図１Ｂ】ポジティブ選択下にあるＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡのアミノ酸残基の位置を示す例である。
【図２】Ｈ５Ｎ１の収束組合せ免疫療法の概略図である。
【図３】本発明の抗インフルエンザ抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域１−４(ＦＲ１−４)及び相補性決定領域１−３(ＣＤＲ１−３)のアミノ酸配列比較を示す例である。ＦＲおよびＣＤＲ領域はカバットデータベースを使用して定められる。ＶＨおよびＶＬの遺伝子名を右に示す(ＩＭＧＴデータベースを使用する)。点はコンセンサス配列に対する配列同一性を示す。ハイフンはギャップを表す。
【図４】抗Ｈ５抗体のインビトロ中和を示す。(ａ)(上パネル)１０のｎＡｂを可溶性ｓｃＦｖ-Ｆｃ(ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３に連結した可変領域の単鎖断片)に変換し、Ｈ５ＴＨ０４−偽型のウイルスに対する活性の中和について評価した。２つの濃度の中和割合を標準誤差バーにて示す。ｍＡｂ ８０Ｒ^１６をコントロール(Ｃｔｒｌ)として用いた。(中央及び下パネル)、プラーク減少アッセイを用いた３つの濃度の１０のｓｃＦｖ-Ｆｃによる野生型Ｈ５-ＶＮ０４及びＨ５-ＩＮ０５の中和。結果は、マイクロ中和アッセイから得られたデータと一致している(データは示さない)。(ｂ)交差サブタイプ中和。ｎＡｂ Ｄ８、Ｆ１０及びＡ６６すべてがＨ５-ＴＨ０４、Ｈ１-ＳＣ１９１８ ((Ａ/Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ/１/１９１８ (Ｈ１Ｎ１))、Ｈ１-ＰＲ３４ (Ａ/Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ/８/３４ (Ｈ１Ｎ１))、Ｈ２-ＪＰ５７ (Ａ/Ｊａｐａｎ/３０５/５７(Ｈ２Ｎ２))及びＨ６-ＮＹ９８ (Ａ/ｃｈｉｃｋｅｎ/Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ/１４６７７-１３/１９９８(Ｈ６Ｎ２))偽型ウイルスを中和した。(ｃ) マイクロ中和アッセイ。Ｈ５Ｎ１およびＣｔｒｌに対して生じたマウスｍＡｂ ２１Ｇ８.６と比較したときの、野生型Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１(Ａ／Ｏｈｉｏ／８３(「Ｈ１-ＯＨ８３」))およびＨ２Ｎ２(Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０(「Ｈ２-ＡＡ６０」))に対するＦ１０の中和力価。８０Ｒ(１ｍｇ／ｍＬ Ａｂ原液)。「＜」は２０未満の力価を示す。結果は２つの独立した実験を表す。
【図５】中和メカニズムを示す。(ａ) Ｈ５-ＴＨ０４-偽型ＨＩＶ−１ウイルスの完全長ＨＡを用いたウイルス結合阻害アッセイ。Ａｂ処理群の細胞に対するウイルスの結合は、Ａｂがない場合の細胞への結合(１００％定める)と比較した。３つのｎＡｂ(Ｄ８、Ｆ１０及びＡ６６)はいずれも細胞へのウイルス結合を阻害しなかったが、赤血球凝集を阻害し、おそらくヘッドに結合するマウス抗Ｈ５ ｍＡｂである１７Ａ２.１.２とフェレット抗Ｈ５Ｎ１血清はいずれも有意に結合を低減した。(ｂ) ｎＡｂによるシンシチウム(合胞体)形成の阻害。ＨｅＬａ細胞にＨ５-ＴＨ０４発現プラスミドを形質移入した。ｐＨ５．０バッファに短時間さらすことによって誘導したシンシチウム形成は、２０μｇ／ｍｌのｎＡｂ Ｄ８、Ｆ１０及びＡ６６によって完全に阻害されたのに対して、同じ濃度のコントロール及び抗ＨＡ１ ｍＡｂ(２Ａ)は効果を示さなかった。
【図６】Ｈ５-Ｆ１０エピトープの構造と配列／構造の保存を示す。(ａ) Ｆ１０(ｓｃＦｖ)に結合したＨ５三量体の構造。Ｈ５は複合体化されなかった構造^２１に非常に類似している(２つの独立した三量体では、ペアワイズＲＭＳＤ(Ｃα)＝１．０及び０．６３Å)。ＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ２のαＡヘリックス、「融合ペプチド」(ＦＰ)およびＦ１０(ＶＨおよびＶＬ)を色分けして示す。第３のＦ１０はステムの後に隠れている。ＶＬはＨ５と接触しないことを注記する。(ｂ) 中央のステム領域の表面。１つの単量体を鎖ごとに色分けする。エピトープに沿ったＦＰの経路(赤)の輪郭を示す。結合に作用していない突然変異を青色とする。２つの単量体において融合ペプチド(ＦＰおよびＦＰ’)を可視化する。エピトープ残基は白色(ＨＡ２)又は黄色(ＨＡ１)で標識した。(ｃ) Ｆ１０の先端(赤リボン)と選択されたＣＤＲ側鎖を示すエピトープの拡大図。界面の１５００Å^２埋没表面の４３％は疎水的相互作用を伴う。(ｄ) ＨＡサブタイプのオーバーレイ：Ｈ１、Ｈ５およびＨ９(グループ１)を赤／黄色の影(１ＲＵ７、２ＩＢＸおよび１ＪＳＤ)で、Ｈ３およびＨ７(グループ２)を青の影(１ＭＱＬおよび１ＴＩ８)で示す。ペアワイズオーバレイのＲＭＳＤは０.５６±０.１１Å(観察範囲、グループ１)、０.７５Å(グループ２)、そしてグループ間では１.２１±０.１２Åである。グループ間の一貫した相違には、１８_１及び３８_１での側鎖方向を交替させるために連結されるＷ２１_２の配位、１７_１でのヒスチジン(グループ２)より大きなチロシン(グループ１)の埋没、そしてＷ２１_１に対して埋没したＨｉｓ１１１_２(グループ１)のパッキングが含まれる。他のエピトープ残基は丸で囲んだ数字で示す。Ｎ３８_１はＨ３およびＨ７クラスターにおいてグリコシル化される。(ｅ) １６のＨＡサブタイプの配列。円は算出結合エネルギーを示す。強＝青、中間＝橙、弱＝青、好ましくない＝黒。着色した強調表示は、クラスターおよびグループ内での配列の保存を示す。融合構造^２９を安定化させるヘリックス内接触のネットワークを配列の下に示す。
【図７】マウスの抗Ｈ５ ｎＡｂの予防及び治療的有効性を示す。マウスを、致死的ウイルス抗原投与の前又は後に異なる用量のｎＡｂにて処理する。予防有効性(ａ、ｂ、ｇ及びｈ)。マウスを、Ｈ５Ｎ１又はＨ１Ｎ１の１０半致死量(ＭＬＤ_５０)の鼻腔内投与(ｉ.ｎ.)により、致死的抗原投与の２４時間前に抗Ｈ５ ｎＡｂ又はコントロールｍＡｂにて処理した。(ａ)１０ｍｇ／ｋｇの３ついずれかのｎＡｂの腹腔内投与(ｉ.ｐ.)によりＨ５-ＶＮ０４(Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４(Ｈ５Ｎ１)、クレイド１)にて抗原刺激したマウスは完全に保護された。低用量の抗体(２．５ｍｇ／ｋｇ)でも非常に保護された。(ｂ)Ｈ５-ＨＫ９７(Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８３／９７(Ｈ５Ｎ１)、クレイド０)ウイルスからの予防的保護は、１０ｍｇ／ｋｇの３ついずれかのｎＡｂにて処置したマウスの８０〜１００％に観察された。(ｇ) ３ついずれかのｎＡｂ(１０ｍｇ／ｋｇの単回注射)により、Ｈ１-ＷＳＮ３３(Ａ／ＷＳＮ／１９３３(Ｈ１Ｎ１))ウイルスによる抗原刺激マウスが完全に保護された。(ｈ) １０ｍｇ／ｋｇを単回注射すると、Ｄ８およびＦ１０は、Ｈ１-ＰＲ３４(Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４(Ｈ１Ｎ１))にて抗原刺激したマウスを完全に保護した。２５ｍｇ／ｋｇの抗体が単回注射として投与されると、Ａ６６によりマウスが完全に保護された。治療有効性(ｃ−ｆ)。マウスは、Ｈ５-ＶＮ０４を接種し、２４、４８、７２ｈｐｉ(ｃ、ｅおよびｆ)のｎＡｂ、または、２４ｈｐｉのＨ５-ＨＫ９７を注入した(ｄ)。接種後２４時間目(ｈｐｉ)に１５ｍｇ／ｋｇ(ヒトの治療的に達成可能な用量)の３ついずれかのｎＡｂを腹腔内処置すると、Ｈ５-ＶＮ０４又はＨ５-ＨＫ９７ウイルスの１０倍のＭＬＤ_５０にて抗原刺激したマウスの８０〜１００％が保護された。
【図８】ＨＡタンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびゲル濾過分析を示す。(ａ) Ｈ５-ＴＨ０４のＨＡ１(残基１１−３２５)断片に対する個々のＨＡ１標的選別から抗体２Ａを得た(左パネル)。ライブラリ選別のために用いたＨ５ ＨＡ(Ｈ５-ＶＮ０４菌株)を右パネルに示す。(ｂ) Ｈ５-ＶＮ０４(Ｈ５)およびｓｃＦｖ Ｆ１０複合体。ＨＡ０は、フューリンとの同時発現によりＨＡ１およびＨＡ２に完全に切断された(左パネル)。複合体は、初めに１：１０のモル比でＨ５とＦ１０を混合することによって形成させ、次いでゲル濾過によって精製した。
【図９】ＥＬＩＳＡおよび競合ＥＬＩＳＡによる抗Ｈ５ ｓｃＦｖ-ＦｃのＨ５又はＨＡ１への結合を示す。(ａ) １μｇ／ｍｌの抗Ｈ５ ｓｃＦｖ-Ｆｃの後にＨＲＰ-抗ヒトＩｇＧ１を用いて、ＥＬＩＳＡプレート上にコートしたＨＡ１(Ｈ５-ＴＨ０４)又はＨ５(Ｈ５-ＶＮ０４)への抗Ｈ５ ｓｃＦｖ-Ｆｃの結合を検出した。ＨＡ１サブユニットに対して選別した抗体、ｍＡｂ ２Ａ ｓｃＦｖ-ＦｃはＨＡ１およびＨ５に結合した。１０の強力な中和ｓｃＦｖ-ＦｃはＨＡ１でなくＨ５に結合した。(ｂ) １０^１２ｐｆｕの抗Ｈ５ファージ-ｓｃＦｖを、５μｇ／ｍｌの抗Ｈ５ ｓｃＦｖ-Ｆｃと混合し、Ｈ５(Ｈ５-ＶＮ０４)-コートプレートに加え、洗浄して、その後ＨＲＰ-抗Ｍ１３にてＨ５に結合したファージ-ｓｃＦｖを検出した。ｍＡｂ ２Ａ-Ｆｃは１０のＨ５選別Ａｂによって認識されるエピトープと競合しなかった。すべてのＨ５選別ｓｃＦｖ-Ｆｃは交差競合した。これらのうち、Ｈ５三量体に結合するＡｂ Ｆ１０(ファージ-ｓｃＦｖ)は他のｓｃＦｖ-Ｆｃによる阻害が最も低かったことから、試験したＡｂすべての中で最も親和性が高いことを示す。
【図１０】ｎＡｂ Ｄ８、Ｆ１０およびＡ６６-ＩｇＧ１へのＨ５の結合の動態学的及び熱力学的特徴を示す。ｎＡｂは抗ヒトＩｇＧ１によりＣＭ４チップに捕獲された。様々な濃度(２０、１０、５、２.５、２.５、１.２５、０.６２５ｎＭ)の三量体Ｈ５(Ｈ５-ＶＮ０４)をチップ表面に注入した。結合動態は１:１ラングミュア結合モデルを用いて評価した。記録された結合曲線(ブランク対照を減算したもの)と算出されたカーブは、密接に重なり合った。各々のｋ_ａ、ｋ_ｄおよびＫ_Ｄ値は、３つの実験の平均および標準誤差を表す。
【図１１】ＨＡサブタイプの間の系統発生の関係および配列比較を示す。アミノ酸配列に基づくインフルエンザＡウイルスの１６のＨＡサブタイプの系統樹。ＨＡサブタイプの４つのクラスターを異なる色で示す。分析のために使用した配列は以下の通りであった。Ｈ１(Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８)、Ｈ２(Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７)、Ｈ３(Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８)、Ｈ４(Ａ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／５６)、Ｈ５(Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ１２０３／２００４)、Ｈ６(Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４３１／００)、Ｈ７(Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ／２１９／０３)、Ｈ８(Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８)、Ｈ９(Ａ／ｓｗｉｎｅ／ＨＫ／９／９８)、Ｈ１０(Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ４９)、Ｈ１１(Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６)、Ｈ１２(Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６)、Ｈ１３(Ａ／ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７)、Ｈ１４(Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｓｔｒａｋｈａｎ／２６３／１９８２)、Ｈ１５(Ａ／ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ／Ｗｅｓｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａ／２５７６／７９)およびＨ１６(Ａ／ｂｌａｃｋ-ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／２／９９)。
【図１２】Ｈ５-ＶＮ０４抗原投与後、抗Ｈ５ ｎＡｂにて処置したマウスの肺、脾臓および脳のウイルス力価を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス(ｎ＝５)は、１０ＭＬＤ_５０のＨ５-ＶＮ０４をｉ.ｎ.感染させた後、２４、４８又は７２時間目に１５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂを腹腔内注射した。ウイルス力価は、９６ｈｐｉに採取した肺、脳および脾臓において決定した。データは、ボックスが第２５から第７５のパーセンタイルまで伸び、中央値に水平線を示す、箱髭様式で表す。箱の上下の髭は極値を示す。スチューデントＴ検定統計分析の結果は、ｐ＜０．０５を１つの星(＊)、ｐ＜０．０１を２つの星(＊＊)を付して示す。Ｙ軸を越えた矢印は滴定の検出限界を示す。
【図１３】Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ１１、Ｈ１３およびＨ１６を含むすべてのＨ１クラスターＨＡへの抗Ｈ５ ｎＡｂ結合のＦＡＣＳ分析を示す。２９３Ｔ細胞に異なるＨＡ発現プラスミドを過渡的に形質移入し、ＨＡ発現細胞へのｍＡｂ結合をＦＡＣＳによって分析した。抗ＳＡＲＳ ｍＡｂ ８０Ｒをコントロールとして用いた。２Ａ-ＦｃはＨ５ ＨＡ特異的抗体である。グループ２ ＨＡ、Ｈ７への結合の欠如も示された。Ｈ１１、Ｈ１３およびＨ１６のウイルス株詳細は以下の通りである。Ｈ１１-ＭＰ７４(Ａ／Ｄｕｃｋ／ｍｅｍｐｈｉｓ／５４６／７４(Ｈ１１Ｎ９))、Ｈ１３-ＭＤ７７(Ａ／Ｇｕｌｌ／ＭＤ／７０４／７７(Ｈ１３Ｎ６))およびＨ１６-ＤＥ０６(Ａ／Ｓｈｏｒｅｂｉｒｄ／ＤＥ／１７２／０６(Ｈ１６Ｎ３))。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
インフルエンザＡ型は、１０のタンパク質をコードする８セグメントのゲノムを有するネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。それは、ヌクレオキャプシッドおよびマトリクスタンパク質の抗原性によって定義されるように、インフルエンザウイルスＡ、ＢおよびＣの属を含むファミリオルソミクソウイルス科に属する。概して、インフルエンザＡウイルスはヒトの重症疾患と関係している。インフルエンザＡウイルスはさらに、２つの表面タンパク質、細胞侵入のための宿主細胞にウィリオンを付着するヘマグルチニン(ＨＡ)と、プロジェニーウイルス又は細胞表面に付着した宿主シアル酸を切断することによってプロジェニーウイルスの拡散を促すノイラミニダーゼ(ＮＡ)によってサブタイプ分けされる。
１６のＨＡサブタイプと９のＮＡサブタイプがあり、ＨＡとＮＡの様々な組合せによってインフルエンザＡウイルスのすべてのサブタイプを成す。１６のＨＡと９のＮＡウイルスサブタイプのすべての組合せは水鳥に見られる。トリインフルエンザＡウイルスの何百もの菌株の中で、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７およびＨ９Ｎ２の４つだけがヒトの感染を引き起こすことが知られている。通常、これらのウイルスによるヒト感染は、軽度の症状であって重症な疾病をほとんど引き起こさない。唯一、Ｈ７Ｎ７によって引き起こされた肺炎の致命的な症例があるのみである。しかしながら、ヒトでは自然免疫がない、病原性の高いＨ５Ｎ１ウイルスは例外である。ＲＮＡポリメラーゼの不信および宿主免疫の選択圧は、突然変異の蓄積とこれらのタンパク質の表面抗原性の変化をもたらしうる。この抗原性変化は抗原ドリフトと呼ばれている。加えて、その分節されたゲノムの結果として、２つの異なるサブタイプのインフルエンザＡウイルスが同じ細胞を感染する場合、遺伝子セグメントのシャフリング(組み換え)が起こりうる。例えば、ヒトのＨ３Ｎ２ウイルスとトリＨ５Ｎ１ウイルスは共に、ヒト又は哺乳類種の他の類に感染し、このような現象は新しいＨ５Ｎ２を生じうる。次いで、この新規のウイルスは、ほとんどすべての遺伝子セグメントがヒトのウイルスから生じているので、ヒトからヒトへ効率よく伝達されうる。このような遺伝子再結合により主要な抗原変化、いわゆる抗原シフトが生じ、世界的な集団のほとんどが再構成ウイルスに対する中和抗体を持っていない。インフルエンザＨ５Ｎ１肺炎の高死亡率と加えて、このような状況は、公衆衛生の分野において最も恐れられる状況の一つである。
【００１３】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン(血球凝集素)(ＨＡ)は、インフルエンザウイルスの可変性の高い抗原であって、細胞へのウイルス侵入を担う。これは三量体前駆体ポリペプチドＨＡ０として合成され、単一ジスルフィド結合によって連結される２つのポリペプチドＨＡ１とＨＡ２に翻訳後切断される。ＨＡのＨＡ１鎖は細胞表面へのウイルスの接着の原因となる。ＨＡ２はウイルスとエンドソームの細胞膜との融合を媒介し、細胞質へのリボヌクレオタンパク質複合体の放出を可能とする。ＨＡ１とは対照的に、ＨＡ２分子はＨＡの相対的に保存された部分を表す。第二免疫原性インフルエンザタンパク質はノイラミニダーゼ(ＮＡ)である。この四量体糖タンパク質は、プロデューサー細胞上の表面シアル酸からウイルス粒子を放出する原因となり、また、気道の標的細胞への接触を促す際の役割を有しうる。ＮＡに対する中和抗体が動物およびヒトにおいて保護的であるにもかかわらず、その作用機構についての情報は不足している。Ｎ１ノイラミニダーゼの結晶構造についての最近の報告は、抗体を含む新規の抗インフルエンザ剤を開発するために利用されうるその活性部位に隣接するキャビティの存在を示した。この発見は、Ｈ５Ｎ１ウイルスのためのオセルタミビル(タミフル)およびザナミビル(リレンザ)に対する薬剤耐性の出現の報告を考慮すると、特に重要である。
ＨＡのＨＡ１とＨＡ２鎖は免疫原性であり、ヒトの自然感染の後に両鎖と反応する抗体が示された。ＨＡ１に特異的な抗体は主に中和であるが、インビトロのＨＡ１特異的Ｍａｂによるウイルス中和の異なる機構は、抗体の濃度に応じて、ＨＡ１上のレセプター部位のブロック、ウイルス−細胞融合の細胞内阻害、又は同時付着阻害及びウイルス−細胞融合阻害を含み、記載されている。あまり研究されていないが、抗ＨＡ２抗体による細胞融合の阻害が報告されている。
【００１４】
２０年以上前、Ｈ３サブタイプのＨＡ分子は、抗原性ドリフト変異および回避変異のＨＡを配列決定することによって特徴付けされ、抗原エピトープは分子の三次元構造にマップされた。それ以来、トリ病原性ウイルスのＨ１、Ｈ２およびＨ５上の抗原性部位はＨ３の三次元構造にマップされた。１９９７年の香港におけるヒトのＨ５Ｎ１感染の発生と、１９９９年のヒトの症例からのＨ９Ｎ２ウイルスの単離の後、両方のタンパク質のＸ線構造が解析された。しかしながら、構造解析に用いられた１９９７年のブタ単離物(Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７)の抗原ドリフトと、最近単離された病原性が高い菌株は意義深いものである。実際、ブタ単離物(Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７)とＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１株(Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ１２０３／０４)との間には、２８のマイナーな変化と２つのメジャーになりうる変化がある。
２００４〜２００５年の発生からのＨ５ ＨＡ遺伝子の系統学的分析により、クレイド１及び２と称される、ＨＡ遺伝子の２つの異なる系統が示された。ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１株(Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ１２０３／０４)はクレイド１のメンバーである。これらクレイドのそれぞれのウイルスは地理的にオーバーラップしていないアジア地域に分布している。インドシナからのＨ５Ｎ１ウイルスはクレイド１内に密接に集まっているのに対して、いくつかの周辺国から単離されるＨ５Ｎ１はクレイド１単離物とは異なり、分岐したクレイド２に属する。クレイド１ウイルスは、ベトナム、タイおよびカンボジアのヒトとトリ、そしてラオスおよびマレーシアのトリだけから単離された。クレイド２ウイルスは、中国、インドネシア、日本および韓国のトリのみから単離されるウイルスに見られた。ウイルス導入、風土性および進化に関連する疑問を解決するために、最新の疫学研究は、インドネシアおよびベトナム中の家禽、並びに１１人の南ベトナムのヒト試料から単離された８２のＨ５Ｎ１型ウイルスを、公共のデータベースで利用可能な配列データと共に分析した^３６。系統学的分析により、インドネシアのウイルスすべてがＨ５Ｎ１遺伝子型Ｚウイルスの異なるサブ系統を示したことから、この発生は過去２年の間に国中への蔓延により単独導入から生じたであろうことが示唆される。インドネシアの継続したウイルス活動は、トリの移動による繰り返された導入というよりも、国内での家禽の移動により伝搬されたものであった。インドネシアおよびベトナム内では、Ｈ５Ｎ１ウイルスは、各々の国の中で時間とともに地理的に異なるグループに進化した。
【００１５】
近年、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ１２０３／４からのＨＡの構造が解析された。クレイド１及び２ウイルスのＨＰＡＩ２００４年および２００５年の単離物からのＨＡ遺伝子とそのアミノ酸配列を比較したところ、主にレセプター結合ドメイン周辺に集中しており、残りは退化したエステラーゼドメイン内にある抗原性変異の１３の位置が同定された。抗原性変異の領域はＨ１およびＨ３セロタイプにおいて同定された(図１Ａ)。Ｈ１ではこれらの部位はＳａ、Ｓｂ、ＣａおよびＣｂと称され、Ｈ３ではＡ、Ｂ、ＣおよびＤと称される。Ｈ５ ＨＡの回避変異は３つのエピトープに集中している。部位１：Ｈ３の抗原性部位ＡとＨ^２のＣａ２にオーバーラップする露出したループ(ＨＡ１ １４０−１４５)；部位２：Ｈ３セロタイプの抗原性部位Ｂに相当するＨＡ１残基１５６および１５７；そして、３) Ｈ１ ＨＡとＨ９セロタイプのＳａ部位に制限されるＨＡ１ １２９−１３３。Ｓｍｉｔｈによる近年の研究では、アミノ酸レベルでポジティブな選別が検出されると、ＨＡタンパク質の８つの残基がポジティブ選択下であったことが示された(図１Ｂ)。これらの残基には、抗原性部位ＡおよびＥの５つ(位置８３、８６、１３８、１４０および１４１)が含まれ、２つはレセプター結合に関与し(位置１２９および１７５)、位置１５６はレセプター結合部位に近い潜在的なＮ結合グリコシル化のための部位である。さらに、結果から、ＨＡ内の３つの残基(Ｖａｌ８６、Ｓｅｒ１２９およびＴｈｒ１５６)が、ニワトリ又はカモ単離物よりもヒトの単離物において観察されることが多く、ヒトに対するＨ５Ｎ１遺伝子型Ｚの初期適応を表すようであることが明らかとなった。これらの研究のさらに重要な発見は、インドネシアとベトナムとのサブ系統間の系統学的相違はこれら２つの群のウイルス間での抗原交差反応の統計学的相違も反映していたことである。具体的には、インドネシアのウイルスはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ１２０３／０４に対するフェレット抗血清に応答せず、ベトナムの代表的なウイルスはインドネシアウイルスＩＤＮ／５／０６およびＤｋ／ＩＤＮ／ＭＳ／０４に対するフェレット抗血清に応答しなかった。これらの所見は、系統学的にだけでなく抗原的に異なっているヒトの１９９７年と２００３年のＨ５Ｎ１ウイルスと免疫ヒト血清による以前の研究と一致している。ゆえに、自然変異並びに回避変異は、ウイルスの継続した進化が菌株(一又は複数)が受動的および能動的な免疫化に用いられるべきかの決定に影響を与えうることを示唆している。
本発明は、ヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体の同定、製造及び特徴付けのための方法を提供する。
【００１６】
ｓｃＦｖ及びモノクローナル抗体の同定と特徴付け
高親和性、交差サブタイプの広く中和するヒト抗ＨＡ ｍＡｂが同定された。これらｎＡｂは、立体構造変化の重要な成分( 融合ペプチドとヘリックスαＡの露出した表面)が非常に同格にあるポイントのステム領域内の新規の高く保存された中和エピトープを認識することによって接着後の融合プロセスを阻害する。１６すべてのＨＡサブタイプの構造及び配列分析により、ＨＡの２つの系統学的グループ分け(グループ１および２)に一致する、２つのみのエピトープの変異の存在を示す。これらの結果は、各群のサブセットから得られるｎＡｂのわずかな反応混液が季節性で全国的に流行しているインフルエンザの幅広い予防を可能にしうるという可能性を示す。
最近の報告は、Ｈ５Ｎ１感染患者の免疫細胞を利用して抗ＨＡ ｎＡｂを単離していた。しかしながら、それらのエピトープや作用様式は報告されなかった。珍しいことに、我々は、同じＶＨ生殖系統遺伝子ＩＧＨＶ１−６９＊０１を利用し、Ｙ１０２と同等の位置にチロシンを含むＣＤＲ３ループをコードするｎＡｂを非免疫ライブラリから繰り返し単離した。これは、おそらく以前にＨ１に、そして１９６８年以前に生まれたライブラリドナーではＨ２サブタイプに曝露したために、広い抗ＨＡ交差免疫がＨ５ナイーブ集団に既に存在していることを示唆する。この生殖系統ＶＨセグメントの反復使用、Ｎ挿入および／または生殖系統Ｄ遺伝子アセンブリにより導入されるＣＤＲ３チロシンの共通性、および両研究において発見されたｎＡｂによるＶＬ遺伝子のランダムな使用は、このエピトープを認識することができる再編成されたＶＨセグメントの前駆体頻度が重要であることを示唆する。これは、本明細書において同定されたＦ１０エピトープへの適切な曝露により、これら広域スペクトルのｎＡｂはインビボで容易に誘導されうる可能性を示す。両群のウイルスサブタイプに対して万能的に保護するために必要とされるｎＡｂの遺伝学的及び構造的な複雑さは以前として未知であるが、我々のデータは驚くほど単純な解決策を示すであろう。
【００１７】
３つの異なる抗ＨＡ-１ ｓｃＦｖが、５８のＨＡ-１ポジティブクローンの配列決定分析によって同定された。これらのｓｃＦｖを３８Ｂおよび１Ｃとした。２ＡのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を図４に示す。
１０の異なる抗ＨＡ０ ｓｃＦｖが、９７のＨＡ０ポジティブクローンの配列決定分析によって同定された。これらのｓｃＦｖを７、８、１０、１７、４０、６６、８０、８８、９０及び９８とした。６の異なるＶＨと１０の異なるＶＬ遺伝子が明らかとなった。いくつかのｓｃＦｖは同じＶＨ遺伝子を共有していた。６の異なるＶＨ遺伝子のうちの５つは、ＩＧＨＶ１-６９遺伝子ファミリに属した。１０のＶＬ遺伝子のうちの３つはκ鎖であった。
２Ａ ｓｃＦｖは中程度の中和抗体であり、３８Ｂ及び１Ｃは非中和抗体である。１０のｓｃＦｖ、７、８、１０、１７、４０、６６、８０、８８、９０および９８は強力な中和抗体である(図６)。
【００１８】
中和インフルエンザ抗体の核酸およびアミノ酸配列を以下に示す。



















【００１９】
中和インフルエンザ抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列を以下の表２および図４に示す。
表２

当業者は、異なる結合親和性を有する更なるｓｃＦｖやモノクローナル抗体が治療的に有効となりうることを理解するであろう。例えば、およそ１ｐＭからおよそ２００ｍＭの結合親和性を有する抗体およびｓｃＦｖもまた治療的に有効となりうる。
【００２０】
抗インフルエンザ抗体によるＨ５Ｎ１の中和。
Ｈ-５偽型ウイルスは、二価のｓｃＦｖと完全長抗体と共にインキュベートし、抗体−ウイルス混合物を２９３Ｔ細胞と接触させた。感染力は、標的細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定することによって定量化した。Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０およびＨ９８抗体は、Ｈ５に対して強力な中和活性を有する。また、Ｄ８、Ｆ１０およびＡ６６抗体は、Ｈ１Ｎ１を交差中和し、株Ｈ１-ＳＣ／１９１８を強力に中和し、株Ｈ１-ＰＲ-３４を中程度に中和した(図６)。
【００２１】
８、１０、６６のエピトープの特徴づけ。
インフルエンザヘマグルチニン(ＨＡ)タンパク質に対する８、１０及び６６の結合の一次エピトープマッピングにより、これら３つの抗体のエピトープが類似しており、ＨＡ１の位置３０７に、そして、ＨＡ２の位置５２、５９、６５および９３に位置することが示された。このエピトープは、ウイルスによって脱落されないヘマグルチニンタンパク質を含む。ウイルスによって脱落されるノイラミニダーゼタンパク質を結合するほとんどの他の公知の抗インフルエンザ抗体とは異なっている。
【００２２】
ｎＡｂエピトープの構造的特徴づけ
３．２Å解像度のＨＡ(Ｈ５-ＶＮ０４)と複合体化したｓｃＦｖ断片の結晶構造を解析することと突然変異誘発による、ｎＡｂの一つであるＦ１０のエピトープと結合様式。(図６および表４)。
複合体において、各々のＨ５三量体は、１抗体当たりおよそ１５００Å^２のタンパク質表面を埋没している、対称性-関連部位で、Ｆ１０の３つの分子を結合する。Ｈ５自体の構造はＦ１０結合によってほとんど変化されない。ＨＡは単鎖のＨＡ０として合成され、２つのサブユニット、ＨＡ１およびＨＡ２にタンパク質分解性切断される。切断により、膜近位ステムに「融合ペプチド」(ＨＡ２の初めのおよそ２１残基を含む)が埋没される。Ｆ１０結合はもっぱらこの領域でのみ起こり(図６)、融合ペプチド、中性ｐＨ配座の場所に該ペプチドを固定するＨＡ１とＨＡ２のエレメント(いずれもこの領域の構造に不可欠なもの)、並びに酸性ｐＨで大きな構造変化を受ける大きなＨＡ２のらせん状ヘアピンと密接に接触し、このウイルス膜近位のポケットからウイルスの遠位の表面へ該融合ペプチドを押し出す。これがエンドソーム膜との融合を引き起こす。
【００２３】
Ｆ１０の重鎖はＨ５結合に主に役割があり、その３つの相補性決定領域(ＣＤＲ)の先端を利用する。各Ｆ１０分子は、ＨＡ三量体の単一の単量体内のＨＡ１及びＨＡ２サブユニットの両方と接触する(図６)。接触領域は、ＨＡ２融合ペプチドの一部によって形成されるポケットと、一端にＨＡ１のエレメントと他端にＨＡ２のヘリックスαＡの露出面とを含む(図４および６)。主要な接触点の３組の抗体残基−ＣＤＲ Ｈ２のＦ５５及びＭ５４とＣＤＲ Ｈ３のＹ１０２。Ｆ５５のフェニル環は、融合ペプチドループの突出したループ(ＨＡ２残基ＤＧＷ１９_２−２１_２(Ｈ３番号付け様式；下つき文字の１および２はＨＡ１およびＨＡ２鎖を指す))と、ポケットの背面を形成する２つの隣接ヒスチジン(残基１８_１および３８_１)およびトリプトファンの芳香族側鎖、Ｗ２１_２によって形成される平坦な表面全体に位置する。また、Ｍ５４の側鎖は、Ｗ２１_２およびＨ３８_１の芳香族環、並びにヘリックスαＡのＩ４５_２の側鎖と接するが、主鎖のカルボニル酸素はＨ３８_１の側鎖と水素結合する。Ｙ１０２は、その側鎖を、αＡヘリックスの４つの側鎖と、融合ペプチドの主鎖カルボニル(Ｄ１９２)に対する水素結合によってつくられる疎水性間隙(ｃｒｅｖｉｃｅ)に嵌入する。ＣＤＲ Ｈ１ループは、ヘッド領域の基部のＨＡ１のループとヘリックスαＡのＣ末端と複数回接触する(図１２ｄ、ｅ)。
同時に、エピトープを定めるためにヘリックスαＡ上で突然変異誘発実験を行った(図６)。抗体と直接接触する３つの残基の突然変異：Ｖ５２Ａ／Ｅ、Ｎ５３ＡおよびＩ５６Ａは抗体の結合を有意に低減又は取り除いたのに対して、保存的突然変異であるＶ５２Ｌは効果がなかった。コントロールとして、抗体と接触しないヘリックスの異なる露出面上の突然変異は抗体結合に対して効果がなかった(図１２ｂ−ｃ)。ゆえに、αＡヘリックスの突然変異誘発は、Ｆ１０について結晶学的に定められるエピトープと十分に一致している。さらに、他の２つのｎＡｂ(構造的データはない)がほぼ同じ変異-ｎＡｂ結合性質を示したことから、密接にオーバーラップするエピトープが示唆され、競合的結合と一致していた(図６、図９)。まとめると、我々は、３つすべてのｎＡｂが、ある領域内のＨＡの中性ｐＨ構造を安定化することによってウイルスを中和し、この領域が膜融合状態を引き起こす構造変化の引き金(ポケットからの融合ペプチドの起こりうる放出)となると結論づけた。
【００２４】
抗体
本明細書中で用いる「抗体」なる用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部位、すなわち抗原を特異的に結合する(と免疫応答する)抗原結合部位を含む分子を指す。「特異的に結合する」又は「免疫応答する」とは、抗体が所望の抗原の一又は複数の抗原決定基と反応して、他のポリペプチドとは反応しないことを意味する。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ(ドメイン抗体)、単鎖、Ｆ_ａｂ、Ｆ_ａｂ'、及びＦ_(ａｂ')２断片、ｓｃＦｖおよびＦａｂ発現ライブラリが含まれるがこれらに限定されない。
単鎖Ｆｖ(「ｓｃＦｖ」)ポリペプチド分子は、共有結合したＶＨ：:ＶＬヘテロ二量体であり、ペプチドコードリンカーによって連結したＶＨ−及びＶＬ−コード遺伝子を含む遺伝子融合から発現されうる。(Huston et al. (1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16): 5879-5883を参照)。自然に凝集するが化学的に分離される、抗体Ｖ領域の軽鎖及び重鎖のポリペプチドをｓｃＦｖ分子に転換するための化学構造を識別するための多くの方法が記載されている。このｓｃＦｖ分子は抗原結合部位の構造と実質的に類似する三次元構造にホールドする。例として米国特許第５０９１５１３号；同第５１３２４０５号；及び同第４９４６７７８号を参照。
【００２５】
大量の標的分子に対して再編成された抗体遺伝子の大きな供与源を提供するために、非常に大きなナイーブヒトｓｃＦｖライブラリがあり、作製されうる。疾患特異的な抗体を単離するために、感染症を有する個体から小さいライブラリが造られうる。(Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43 (1992)；Zebedee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992)を参照)。
通常、ヒトから得られた抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの何れかに関連しており、分子に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。あるクラスは、同様にＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２及びその他のようなサブクラスを有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はκ鎖又はλ鎖であってよい。
【００２６】
「抗原結合部位」又は「結合部分」なる用語は、抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗原結合部位は、重鎖(「Ｈ」)及び軽鎖(「Ｌ」)のＮ末端可変(「Ｖ」)領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの非常に異なる範囲(stretch)は、「高頻度可変領域」と称され、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として知られる保存された隣接範囲の間に配置する。ゆえに、「ＦＲ」なる用語は、免疫グロブリン内の高頻度可変領域間に天然に見られ、その領域に隣接しているアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの高頻度可変領域と重鎖の３つの高頻度可変領域は、三次元空間内で互いに関連して整理され、抗原結合界面を形成する。抗原結合界面は、結合した抗原の三次元界面に相補的であり、重鎖および軽鎖各々３つの高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称される。１１Ａおよび２５６の抗体のＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲはそれぞれ図１および図６に示される。
本明細書中で用いる「エピトープ」なる用語には、免疫グロブリンに特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基、ｓｃＦｖ又はＴ細胞レセプターが含まれる。エピトープ決定基は、アミノ酸や糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピング(grouping)から成り、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性をもつのが普通である。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端ペプチドに対して生じうる。
【００２７】
本明細書中で用いる「免疫学的結合」及び「免疫学的結合性質」なる用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる非共有的相互作用の類を指す。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数(Ｋ_ｄ)により表され、小さいＫ_ｄは大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合性質は当分野で周知の方法を使用して定量化されてよい。ある一つの方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成と解離の速度を計測することを伴うものであり、このときこの速度は複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響する幾何級数的パラメータに依存する。ゆえに、「会合速度定数」(Ｋ_ｏｎ)及び「解離速度定数」(Ｋ_ｏｆｆ)の両方は、濃度と会合および解離の実際の速度の計算によって決定されうる。(Nature 361:186-87 (1993)を参照)。Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎの比率は、親和性に関連しないすべてのパラメータを解除することが可能であり、解離定数Ｋ_ｄに等しい。(概して、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照)。平衡結合定数(Ｋ_ｄ)が当分野の技術者に公知の放射性リガンド結合アッセイ又は類似のアッセイによって測定するところの、およそ１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは１００ｐＭ以下〜およそ１ｐＭである場合に、本発明の抗体は、インフルエンザエピトープに特異的に結合するという。
本発明のインフルエンザタンパク質(例えばＨＡ又はノイラミニダーゼ)、又はその誘導体、断片、アナログ、ホモログ又はオルソログは、これらのタンパク質成分を免疫特異的に結合する抗体の生成における免疫原として利用されてよい。
【００２８】
当業者は、過度な実験を行うことなく、ヒトモノクローナル抗体がインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質への本発明のヒトモノクローナル抗体の結合を妨げるか否かを確認することによって、前者のヒトモノクローナル抗体が後者の本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ特異性を有することを決定することができる。本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の減少で示されるように、試験するヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場合、それはおそらく、２つのモノクローナル抗体が同じエピトープに結合するか又は非常に関連するエピトープに結合する。
ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するか否かを決定するもう一つの方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を通常反応するインフルエンザＨＡタンパク質とプレインキュベートし、次いで、試験するヒトモノクローナル抗体を添加して、試験するヒトモノクローナル抗体のＨＡタンパク質を結合する能力が阻害されるか否かを決定することである。試験するヒトモノクローナル抗体が阻害される場合、おそらく、本発明のモノクローナル抗体と同じ、又は機能的に等価なエピトープ特異性を有する。また、インフルエンザウイルスを利用して、試験モノクローナル抗体がインフルエンザウイルスを中和することができるか否かを決定することによって、本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングを行うことができる。
【００２９】
当分野で公知の様々な手順が、本発明のタンパク質に対する、または、その誘導体、断片、アナログ、ホモログ又はオルソログに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の産生のために用いられてよい。(例として、出典明記によって本明細書中に援用される、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照)。
抗体は周知の技術、例えば、主に免疫血清のＩｇＧ分画を供給するプロテインＡ又はプロテインＧを用いた親和性クロマトグラフィによって精製されてよい。その後又はあるいは、調査する免疫グロブリンの標的又はそのエピトープである特異的な抗原をカラムに固定し、免疫アフィニティークロマトグラフィによって免疫特異抗体を精製してよい。免疫グロブリンの精製は、例えばD. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)によって述べられている。
【００３０】
本明細書中で用いられる「モノクローナル抗体」又は「ＭＡｂ」又は「モノクローナル抗体組成物」は、固有の軽鎖遺伝子産物と固有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の唯一の分子種を含む抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は集団のすべての分子において同一である。ＭＡｂは、エピトープに対する固有の結合親和性によって特徴が表される抗原の特定のエピトープと免疫応答することができる抗原結合部位を含む。
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)によって記述されるようなハイブリードーマ法を使用して調製されうる。ハイブリードーマ法では一般に、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を免疫化剤にて免疫化し、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。
免疫化剤には一般的に、タンパク質抗原、その断片又はその融合タンパク質が含まれる。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合、末梢血液リンパ球が使われ、または、非ヒト哺乳類の供与源が望ましい場合、脾細胞又はリンパ節細胞が使われる。次いで、適切な融剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、リンパ球を不死化細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103)。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯類、ウシ及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適切な培養培地中で培養されうる。例えば、親の細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いている場合、ハイブリドーマの培養培地は通常、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を妨げる、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン(「ＨＡＴ培地」)を含む。
【００３１】
好適な不死化細胞株は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞により安定して高いレベルで抗体を発現するものであり、ＨＡＴ培地などの培地に影響されやすい。より好適な不死化細胞株はマウスの骨髄腫細胞株であり、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手することができる。ヒト骨髄腫およびマウスヒトヘテロメラノーマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生について記述されている。(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)を参照)。
そして、ハイブリドーマ細胞が培養された培養培地が、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされてよい。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、または、インビトロ結合アッセイ、例としてラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)によって決定される。このような技術およびアッセイは当分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析によって測定されてよい。さらに、モノクローナル抗体の治療的適用法では、標的抗原に対して高い特異性と高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。
【００３２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定されたあと、限界希釈手順によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させてよい。(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103を参照)。このための適切な培養培地には、例えば、ダルベッコの変更イーグル培地およびＲＰＭＩ１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物の腹水のようなインビボで増殖させてよい。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィによって、培養培地又は腹水液から単離されるか又は精製されてよい。
【００３３】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号において記述されるものによって作製されてよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)、容易に単離され、配列決定されうる。本発明のハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好適な供与源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れられ、次いで、宿主細胞、例えばサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞に形質移入し、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成させることができる。また、ＤＮＡは、例えば、相同なマウス配列をヒトの重鎖及び軽鎖の定常ドメインのコード配列に置換するか(米国特許第４８１６５６７号；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)を参照)又は、免疫グロブリンコード配列のすべて又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部に共有的に系都合させることによって変更してよい。このような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインと置換させるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインと置換させて、キメラ二価抗体を作製してよい。
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖及び重鎖の配列全体がヒト遺伝子に起因する抗体分子である。このような抗体は、本明細書中では「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」と称する。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技法；ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)；及び、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole, et al., 1985: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)を用いて調製されうる。ヒトモノクローナル抗体が利用され、ヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)又はインビトロのエプスタインバーウイルスによるヒトＢ細胞形質転換により(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)産生されてよい。
【００３４】
さらに、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む更なる技術を使用して生産されてよい。(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)を参照)。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化されているマウスに導入することによって作製されてよい。抗原刺激によりヒト抗体産生が観察され、それは遺伝子再構成、集合(assembly)および抗体レパートリ(repertoire)を含むすべての点においてヒトで観察されるものと非常に似ている。この手法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号、及びMarks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００３５】
さらに、抗原による刺激に応答して動物の内在性抗体よりもむしろ完全ヒト抗体を生産させるために、変更されているトランスジェニック非ヒト動物を用いてヒト抗体を生産してよい。(ＰＣＴ刊行国際公開９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主の重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン鎖をコードする内在性遺伝子の活動能力を無くし、ヒトの重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座を宿主ゲノム内に挿入する。例えば必要なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を用いて、ヒト遺伝子を組み込む。次いで、完全な変更の構成成分をあまり含まない中間のトランスジェニック動物を交雑することによって、望ましい変更を完全に提供する動物をプロジェニーとして得る。このような非ヒト動物の好ましい実施態様はマウスであり、ＰＣＴ刊行物国際公開９６／３３７３５および国際公開９６／３４０９６に開示されるゼノマウス^ＴＭと呼ばれる。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を生産する。抗体は、所望の免疫原による免疫化後の動物から直接、例えばポリクローナル抗体の調製物として、あるいは、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのような動物由来の不死化Ｂ細胞から得られうる。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現させて抗体を直接得るか、又は、さらに変更して、例えば単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)分子のような抗体のアナログを得てもよい。
【００３６】
内在性免疫グロブリン重鎖の発現を欠いているマウスに例証される、非ヒト宿主の作製方法の一例は、米国特許第５９３９５９８号に開示される。胚性幹細胞内の少なくとも一の内在性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失させて、遺伝子座の再編成を妨げると同時に再編成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写の形成を妨げることと（この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含むターゲティングベクターによって達成される）、その胚性幹細胞から、その体細胞および生殖系細胞に選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを生産することとを含む方法によって得られる。
ヒト抗体などの所望の抗体を製造する一つの方法は、米国特許第５９１６７７１号に開示される。この方法は、培養物中の一方の哺乳動物宿主細胞に重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入し、他方の哺乳動物宿主細胞に軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入し、そして、２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成することを含む。ハイブリッド細胞は重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【００３７】
この手順の更なる改善法では、免疫原上の臨床的に関連するエピトープの同定方法、及び高い親和性で関連のエピトープに免疫特異的に結合する抗体の選択相関方法は、ＰＣＴ刊行物国際公開９９／５３０４９に開示される。
抗体は、前記の一本鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターにより発現されうる。
これらには、ベクター、リポソーム、ネイキッドＤＮＡ、アジュバント支援ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどが含まれる。ベクターには、国際公開９３／６４７０１に記載されるような、ターゲティング部分を有する化学的コンジュゲート(例えば細胞表面レセプターに対するリガンド)、および核酸結合部分(例えばポリリジン)、ウイルスベクター(例えばＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクター)、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０(国際公開９５／２２６１８)に記述されるような、標的部分(例えば標的細胞に特異的な抗体)および核酸結合部分(例えばプロタミン)を含む融合タンパク質である融合タンパク質、プラスミド、ファージなどが含まれる。このベクターは、染色体制、非染色体性又は合成されたものであってよい。
【００３８】
好ましいベクターには、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学的コンジュゲートが含まれる。レトロウイルスベクターにはモロニーマウス白血病ウイルスが含まれる。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターには、オルソポックス又はアビポックスベクターのようなポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス(ＨＳＶ)ベクターのようなヘルペスウイルスベクター(Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995)；Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995)；Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993)；Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990)を参照)、アデノウイルスベクター(LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993)；Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993)；Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)を参照)およびアデノ関連ウイルスベクター(Kaplitt, M. G.. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)を参照)が含まれる。
ポックスウイルスベクターは遺伝子を細胞質に導入する。アビポックスウイルスベクターにより核酸の短期発現が生じる。アデノウイルスベクタ、アデノ関連ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)ベクターは、核酸を神経細胞に導入するために適する。アデノウイルスベクターにより、アデノ関連ウイルス(およそ４か月)より短い期間の発現(およそ２か月)が生じ、それはＨＳＶベクターよりも短い期間である。選択される特定のベクターは、治療される標的細胞および状態に依存するであろう。導入は、標準的な技術、例えば感染、形質移入(トランスフェクション)、形質導入(トランスダクション)又は形質転換(トランスフォーム)によるものであってよい。遺伝子導入の様式の例には、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ_４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクションおよびウイルスベクターが含まれる。
【００３９】
ベクターを用いて、基本的に任意の所望の標的細胞をターゲティングすることができる。例えば、定位注射を用いて、ベクター(例えばアデノウイルス、ＨＳＶ)を所望の場所にあててもよい。さらに、ミニポンプ注入システム、例えばＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ注入システムを用いた脳室内(ｉｃｖ)注入によって粒子が運搬されてよい。また、対流(convection)と称されるバルク流量に基づく方法は、脳の拡張領域への大分子の運搬に有効であり、標的細胞へのベクターの運搬に有用である。(Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994)；Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)を参照)。用いられうる他の方法には、カテーテル、静脈内、非経口、腹膜内、及び皮下の注射や、投与や他の公知の投与経路が含まれる。
これらのベクターを用いて、さまざまな方法で用いられうる大量の抗体を発現させることができる。例えば、試料中のｏｆａｎインフルエンザウイルスを検出するためである。また、抗体を用いて、結合させ、インフルエンザウイルス細胞膜融合を破壊しようと試みることができる。
【００４０】
本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のための技術を応用することができる(例えば米国特許第４９４６７７８号を参照)。さらに、Ｆ_ａｂ発現ライブラリの構築のための方法を応用して(例えばHuse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281を参照)、タンパク質又はその誘導体、断片、アナログないしはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ効率よく同定することができる。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体断片は当分野で公知の技術によって製造され得、限定するものではないが以下のようなものがある。(i) 抗体分子のペプシン消化によって製造されるＦ_(ａｂ')２断片、(ii) Ｆ_(ａｂ')２断片のジスルフィド架橋を還元することによって製造されるＦ_ａｂ断片、(iii) パパインや還元剤により抗体分子が処理されて製造されるＦ_ａｂ断片、及び(iv) Ｆ_ｖ断片。
また、ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は２つの共有結合して接合された抗体から成る。このような抗体は、例えば、不必要な細胞に対して免疫系細胞を標的化するため(米国特許第４６７６９８０号を参照)、そして、ＨＩＶ感染の治療のため(国際公開９１／００３６０；国際公開９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号を参照)に提唱された。抗体が架橋剤を伴うものを含む合成タンパク質化学における公知の方法を使用してインビトロで調製されてよいことは考えられる。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築されうる。この目的のための適切な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル-４-メルカプトブチルイミダートおよび、例えば米国特許第４６７６９８０号において開示されるものが含まれる。
【００４１】
例えば、インフルエンザを治療する際の抗体の有効性を上げるために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(一又は複数)はＦｃ領域に導入され、それによって、この領域の鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、生成されるホモ二量体抗体は内部移行する能力を改善する、および／または、補体媒介性細胞殺傷能および抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を増加することができた。(Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照)。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、このことにより補体細胞溶解およびＡＤＣＣ能を亢進した抗体が設計されてよい。(Stevenson et al., Anti Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照)。
【００４２】
また、本発明は、細胞障害性剤、例えば毒素(例えば細菌、真菌、植物又は動物の起源の酵素活性を有する毒素ないしはその断片)、又は放射性同位体(すなわちラジオコンジュゲート)にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲートに関する。
使われうる酵素活性を有する毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖(緑膿菌から)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、αサルシナ、アブラギリｆｏｒｄｉｉタンパク質、ｄｉａｎｔｈｉｎタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰＳ)、ニガウリ(momordica charantia)インヒビター、ｃｕｒｃｉｎ、クロチン、sapaonaria officinalisインヒビター、ゲロニン、ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテシンが含まれる。様々な放射性核種がラジオコンジュゲートされた抗体の産生に利用できる。例として、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅなどがある。
【００４３】
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ)、活性なエステル(例えばスベリン酸ジサクシンイミジル)、アルデヒド(例えばグルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えばビス-(ｐ-アジドベンゾイル)-ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えばビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えばトリエン-２,６-ジイソシアナート)、およびビス-活性フッ素化合物(例えば１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を用いて作製される。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載されるように調製されてよい。カルボン-１４-標識１-イソチオシアネートベンジル-３-メチルジエチレン トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲートのための例示的なキレート剤である。(国際公開９４／１１０２６を参照)。
当分野の通常の技術者は、多種多様な可能な部分が結果として生じる抗体に、または、本発明の他の分子に連結されてよいことを認識するであろう。(例として"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照、この内容全体は出典明記によって本明細書中に援用される)。
【００４４】
カップリングは、抗体および他の部分がそれらそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合する任意の化学反応によって達成されうる。この結合には、多くの化学機構、たとえば共有結合、親和性結合、インターカレーション、座標結合および複合体生成が含まれうる。しかしながら、好適な結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接的な縮合によって又は外的架橋分子の取込みによって達成されうる。多くの二価又は多価の連結剤は、他の分子に対する、本発明の抗体のようなカップリングタンパク質分子において有用である。例えば、代表的なカップリング剤には、有機化合物、例えばチオエステル類、カルボジイミド類、スクシンイミドエステル類、ジイソシアナート類、グルタールアルデヒド、ジアゾベンゼン類およびヘキサメチレンジアミン類が含まれうる。このリストは、当分野で公知のカップリング剤の様々な種類を網羅しているものではなく、むしろ、一般的なカップリング剤の例示である。(Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984)；Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982)；及びVitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照)。 好適なリンカーは文献に記述されている。例として、ＭＢＳ(Ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル)の使用を記述しているRamakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44: 201-208 (1984)を参照のこと。また、オリゴペプチドリンカーにより抗体にカップリングされるハロゲン化されたアセチルヒドラジド誘導体の使用を記述している、米国特許第５０３０７１９号も参照のこと。特に好適なリンカーには以下のものなどがある。(i) ＥＤＣ(１-エチル-３-(３-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミド、(ii) ＳＭＰＴ(４−サクシニミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(２-プリジル-ジチオ)-トルエン(Pierce Chem. Co.、カタログ番号(２１５５８Ｇ)、(iii) ＳＰＤＰ(サクシニミジル-６[３-(２-ピリジルジチオ) プロピオンアミド]ヘキサノエート(Pierce Chem. Co.、カタログ番号２１６５１Ｇ)、(iv) スルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ (スルホサクシニミジル-６ [３-(２-ピリジルジチオ)-プロピアンアミド]ヘキサノエート(Pierce Chem. Co. カタログ番号２１６５-Ｇ)、及び(v) ＥＤＣにコンジュゲートしたスルホ-ＮＨＳ (Ｎ-ヒドロキシスルホ-サクシニミジル: Pierce Chem. Co., カタログ番号２４５１０)。
【００４５】
上記のリンカーは異なる特質を有する構成成分を含み、ゆえに、異なる生理化学的な性質を有するコンジュゲートとなる。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ-ＮＨＳエステル類は、芳香族のカルボキシレート類のスルホ-ＮＨＳエステル類より安定している。ＮＨＳ-エステル含有リンカーはスルホ-ＮＨＳエステル類より可溶性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体障害型ジスルフィド結合を含み、コンジュゲートを形成して安定性を増しうる。ジスルフィド結合はインビトロ切断されるので、ジスルフィド結合は他の結合より一般的に安定性が低く、コンジュゲート利用性が低くなる。特に、スルホ-ＮＨＳはカルボジイミドカップリングの安定性を上げうる。カルボジイミドカップリング(例えばＥＤＣ)は、スルホ-ＮＨＳとともに使われる場合に、カルボジイミドカップリング反応単独より加水分解に対して抵抗力があるエステル類を形成する。
また、本明細書において開示される抗体は免疫リポソームとして調製されてもよい。抗体を含むリポソームは当分野で公知の方法によって調整され、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；及び米国特許第4485045号及び同第4544545号に記載されている。増加した循環時間を有するリポソームは、米国特許第５０１３５５６号において開示される。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により産生することができる。リポソームは定められた細孔径のフィルターにて押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド相互交換反応によりMartin et al., J. Biol. Chem., 257: 286 288 (1982)に記載されるリポソームにコンジュゲートされてよい。
【００４６】
インフルエンザウイルスに対する抗体の使用
所望の特異性を有する抗体を選別する方法には、非限定的に酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当技術分野で公知の他の免疫仲介技術が含まれる。
例えばＨＡ（又はそのフラグメント）等のインフルエンザウイルス・タンパク質に対する抗体を、インフルエンザウイルス・タンパク質の局在化及び／又は定量化に関連する、当技術分野で公知の方法において使用することができる（例えば、適切な生理学的試料におけるインフルエンザウイルス・タンパク質のレベルの測定での使用、診断法における使用、蛋白質の画像診断における使用等）。所定の実施形態では、抗体誘導抗原結合性ドメインを含む、インフルエンザウイルス・タンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、又はホモログに特異的な抗体が、（以下に「療法」と呼ばれる）薬理学的な活性体として用いられる。
【００４７】
本発明のインフルエンザウイルス・タンパク質に特異的な抗体を使用して、例えば免疫アフィニティー、クロマトグラフィー、又は免疫沈降等の標準技術によって、インフルエンザウイルスポリペプチドを単離することができる。インフルエンザウイルス・タンパク質（又はそのフラグメント）に対する抗体を、例えば、所定の治療計画の効能を判定するための臨床試験方法の一部として診断上使用して、細胞中の蛋白質レベルを監視することができる。検出は、抗体を検出可能な物質に連結させる（すなわち物理的に結合させる）ことによって促進できる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、接合団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な接合団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニラミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン、そして好適な放射性物質の例として^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ又は^３Ｈが挙げられる。
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化及び、完全ヒト抗体を含む本発明の抗体は治療薬として使用することができる。この種の薬品は通常、被検体のインフルエンザウイルス関連の疾患または病理学（例えば鳥インフルエンザ）を治療するまたは予防するために用いられる。抗体の製剤、好ましくは標的抗原に対する高い特異性及び高い親和性を有する抗体の製剤は被検体に投与され、通常、製剤が標的と結合することにより効果が発揮される。抗体の投与は、細胞へのウイルスの内部移行を無効にする、又は阻害する又は干渉することができる。この場合、抗体が標的と結合して、自然発生的なリガンドの結合部位をマスキングすることにより、ウイルスの細胞膜への融合を妨げて、ウイルスの内部移行を阻害する。
【００４８】
本発明の抗体の治療上有効量は一般に、治療の目的を達成するために必要な量に関連している。上述したように、これは特定の場合において標的の機能に干渉する、抗体とその標的抗原との間の結合相互作用であってよい。必要な投与量は、さらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存する、また、投与された抗体が、その抗体が投与される他の被検体の自由体積から減少する率に依存する。本発明の抗体又は抗体フラグメントの治療上有効量の一般的な範囲は、非限定的な実施例として、約０．１〜５０ｍｇ/ｋｇの体重であってよい。一般的な投与頻度は例えば一日２回から一週間に１回の範囲であってよい。
本発明の、特にインフルエンザウイルス・タンパク質と結合する抗体又はそのフラグメントだけでなく、本明細書に開示されるスクリーニング・アッセイによって特定される他の分子を、医薬組成物の形態で、インフルエンザウイルス関連の疾患の治療のために投与することができる。上記組成物の調製に関連する原理および考察だけでなく、構成要素の選択におけるガイダンスは、例えば、Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkにおいて提供されている。
抗体フラグメントが使用されるところでは、特に標的タンパク質のドメインと結合する最も小さい抑制フラグメントが好まれる。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列を結合する能力を保持するペプチド分子を構成することができる。上記ペプチド分子は、化学的に合成することができる及び／又は組み換えＤＮＡ技術によって生成することができる。(例えば Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)参照)。製剤はまた、必要に応じて治療中の特定の適応症の複数の活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性化合物を含むこともできる。代わりに又は加えて、組成物は、その機能、例えば細胞毒性薬剤、サイトカイン、化学療法剤または増殖抑制薬剤を強化する薬剤を含むことができる。上記分子は、意図する目的に効果的な量で好適に組み合わせられる。
【００４９】
活性成分はまた、例えばそれぞれコロイド薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミン微小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、そして、ナノ・カプセル）又はマクロエマルジョン類のヒドロキシ・メチルセルロース又はゼラチン・マイクロカプセル及びポリ（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル等の、例えばコアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセルに封入することができる。
生体内投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌の濾過膜を介した濾過によって、容易に達成される。
徐放性製剤を調合することができる。徐放性製剤の好適な実施例には、抗体（マトリックスが造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形である）を含んでいる固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの実施例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール）、ポリ・ラクチド（米国特許第３７７３９１９号明細書）、Ｌグルタミン酸およびγエチルＬグルタミン酸塩の共重合体、分解不能なエチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ^ＴＭ（乳酸グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスティア）等の分解可能な乳酸グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸グリコール酸等のポリマーにより１００日間以上の分子の放出が可能になるとともに、特定のヒドロゲルがより短い期間にタンパク質を放出する。
【００５０】
本発明による抗体は、試料中のインフルエンザウイルス（またはタンパク質またはそのタンパク質フラグメント）の存在を検出するための薬剤として使用することができる。好ましくは、抗体は、検出可能な標識を含む。抗体は、ポリクローナル、より好ましくはモノクローナルであってよい。無傷の抗体、又はそのフラグメント（例えば、Ｆ_ａｂ、ｓｃＦｖ又はＦ_{（ａｂ）２}）を使用することができる。プローブまたは抗体に関する用語「標識」は、直接標識化された別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的な標識化だけでなく、検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブまたは抗体の直接的な標識化を含む。間接的な標識化の実施例には、主要抗体を蛍光標識ストレプトアビジンによって検出できるように、第２の蛍光標識抗体とビオチンを有するＤＮＡプローブの末端標識化を使用した主要抗体の検出が含まれる。用語「生物学的試料」は、被検体内に存在する組織、細胞及び体液だけでなく、被検体から分離される組織、細胞および体液を含む。したがって、用語「生物学的試料」の使用には、血液および血清、血漿またはリンパを含む血液の部分又は構成要素が含まれる。すなわち、本発明の検出方法は、インビボのみでなくインビトロで生物学的試料の被検体ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出するのに使用することができる。例えば、被検体ｍＲＮＡ検出のインビトロ技術には、ノーザンハイブリダイゼーションと、インサイツハイブリダイゼーションが含まれる。被検体タンパク質検出の生体外技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、及び免疫蛍光検査が含まれる。被検体ゲノムＤＮＡ検出のインビトロ技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。免疫アッセイを実施する手順は、例えばELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、被検体タンパク質検出のインビボ技術には、標識非被検体タンパク質抗体を被検体に導入することが含まれる。例えば、抗体は、被検体内での存在及び位置が標準撮像技術によって検出可能な放射性マーカーによる標識化が可能である。
【００５１】
医薬組成物
本発明の抗体又は薬剤（また、本明細書において「活性化合物」とも称される）、及びその誘導体、フラグメント、類似体及び相同体は、投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。上記組成物は通常、抗体又は薬剤、及び薬学的に受容可能な担体を含む。本明細書で使用しているように、用語「薬学的に受容可能な担体」は、薬学的投与に適合する、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等浸透及び吸収遅延剤等が含まれる。好適な担体は、参照により本明細書に組み込まれる当技術分野における標準参照テキストである、Remington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。上記担体又は希釈剤の好適な実施例は、非限定的に、水、食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％のヒト血清アルブミンを含む。不揮発性油等のリポソームおよび非水性ビヒクルを使用することもできる。薬学的活性物質に対する上記媒体及び薬剤の使用は当技術分野において公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物と適合しない場合以外は、上記媒体及び薬剤の組成物における使用が考察される。補助活性化合物を組成物に組み込むことも可能である。
本発明の医薬組成物は、意図された投与ルートに適合するように調合される。投与ルートの実施例には、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（すなわち局所の）、経粘膜、直腸投与等の非経口投与が含まれる。非経口、皮内、皮下投与に使用する溶液または懸濁液は以下の構成要素を含むことができる：例えば注射用の水、食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒等の無菌の希釈剤；例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤；例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；例えば塩化ナトリウム又はブドウ糖等の張度調整用の酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩及び薬品等のバッファ。ｐＨは例えば、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸または塩基によって調整可能である。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又はガラス若しくはプラスチック製の複数回投与瓶に封入することができる。
【００５２】
注射可能な用途に好適な医薬組成物には、無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性の）、又は分散液及び無菌粉が含まれる。静脈内投与については、好適な担体は、生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ^ＴＭ（BASF, Parsippany, N.J.）、またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において組成物は無菌であり、容易に注射針を通過できる程度に流動的でなければならない。組成物は、製造及び保管の条件下で安定しているべきであり、例えばバクテリア及び菌類等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により微生物の作用を防止することができる。多くの場合において、組成物中に等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注入可能な組成物の持続的な吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばモノコテアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより成すことができる。
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて必要量の活性化合物を上に列挙された成分を組合せた適切な溶媒に組み込むことによって調製することができ、その後フィルタ殺菌が行われる。通常、分散液は活性化合物を基本的な分散媒及び上に列挙したうちの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルへ組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調整用の無菌粉の場合、調整の方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、この方法により、事前に無菌のフィルタ処理された溶液から、活性成分と任意の所望の添加成分の粉が生成される。
【００５３】
経口用組成物は一般に、不活性希釈剤または食用の担体を含む。これらは、ゼラチン・カプセルに格納するまたは錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的で、活性化合物を賦形剤と合わせて、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いることができる。経口用組成物はまた、うがい薬として使用するために流体担体を使用して調整することができ、この場合流体担体の化合物は経口投与され、口内でかき回されて、喀出される又は嚥下される。薬学的に混合可能な結合剤、及び／又は補助材料を、組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか又は類似の性質の化合物を含むことができる：例えば微晶質性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン等のバインダ；例えば澱粉またはラクトース等の賦形剤、例えば澱粉またはラクトース、例えばアルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチ等の崩壊剤；例えばステアリン酸マグネシウム又はステローツ等の潤滑剤；例えばコロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；例えばスクロース又はサッカリン等の甘味剤；例えばペパーミント、メチルサリチレートまたはオレンジ香味料等の香味剤。
吸入による投与のために、化合物はエアロゾルスプレーの形態で、好適な噴霧剤、例えば二酸化炭素等のガスを含む加圧容器またはディスペンサ、又はネブライザーから送出される。
【００５４】
全身投与はまた、経粘膜的又は経皮的手段によるものであってよい。経粘膜的又は経皮的投与には、浸透するべきバリアに対する適切な浸透剤が製剤中に使用される。この種の浸透剤は従来技術において一般に公知であり、例えば、経粘膜的投与には、洗剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜的投与は、鼻噴霧または坐薬の使用を通して行うことができる。経皮的投与には、活性化合物は、当技術分野で一般に知られているような軟膏、膏薬またはクリームに調合される。
化合物はまた、直腸送達のために、坐薬（例えば、カカオバター及び他のグリセリド等の従来の坐薬基剤によって）又は停留浣腸の形に調製可能である。
一実施形態においては、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル封入送達システムを含む、放出制御製剤等の体内からの急速な排出から化合物を保護する担体で調製される。例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の、生物分解性で生物学的適合性を有するポリマーを用いることができる。この種の製剤の調製方法は、当業者にとって明らかである。材料はまた、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticalsから市販されている。（ウイルス抗原にモノクローナル抗体を有する感染した細胞を標的とするリポソームを含む）リポソームの懸濁は、また、薬学的に受容可能な担体としても用いることができる。これらは、例えば、米国特許第４５２２８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【００５５】
経口又は非経口的組成物を投薬量単位の形態で製剤することは 投与の容易さ及び投薬量の均一性のために特に有利である。本明細書で使用される投薬量単位は、治療される被検体均一な投薬量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は必要な薬学的担体に関連する所望の治療効果を生み出すように計算された活性化合物の所定量を含む。本発明の投薬量単位の形態の規格は、活性化合物の独特の特徴及び達成される特定の治療効果、及び個人の治療向けのこの種の活性化合物の当技術分野に特有の限界によって決定され、直接依存している。
医薬品組成物は、投与説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサに含むことができる。
【００５６】
スクリーニング方法
本発明は、モジュレータ、（本明細書においては「スクリーニング分析」とも称される）、すなわち変調するかまたはさもないと細胞膜へのインフルエンザウイルスの融合を調整する又はそうでなければ干渉する候補または試験化合物または薬剤（例えばペプチド、ペプチド模倣薬、小さい分子または他の薬）を識別する方法を提供する。インフルエンザ感染症を治療するのに役立つ化合物を識別する方法も提供されている。本発明はまた、本明細書において記載されているスクリーニング分析を使用して識別される化合物も含む。
例えば、本発明は、インフルエンザウイルス及び細胞膜の間の相互作用を調整するスクリーニング候補または試験化合物のための分析を提供する。本発明の試験化合物は、当技術分野で公知の組合せライブラリ法の多数の方法のいずれかを用いて得ることができ、組合せライブラリ法には：生物学的ライブラリ；空間的にアドレス可能な平行した固体位相または溶液位相ライブラリ；逆重畳積分が必要である合成ライブラリ法；「一ビーズ一化合物」ライブラリ法；及び親和性クロマトグラフィ選択を使用する合成ライブラリ法が含まれる。生物学的ライブラリ法はペプチド・ライブラリに限られる一方、その他の４つの方法は化合物のペプチド、非ペプチド・オリゴマー又は小さい分子ライブラリに適用可能である。（例えば Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145参照）。
【００５７】
本明細書において使われる「小分子」は、約５ｋＤ未満及び最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。小さい分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、炭水化物、脂質または他の有機又は無機分子であってよい。例えば菌類、細菌、藻類抽出物等の化学及び／又は生物学的混合物のライブラリは、当技術技術で公知であり、本発明の任意の分析によってスクリーニングすることができる。
分子ライブラリの合成方法の実施例は、当技術分野において例えば：DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422; Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678; Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; and Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233に見受けられる。
化合物のライブラリは溶液内に（例えばHoughten, 1992. Biotechniques 13: 412-421参照）、又はビーズ上に（Lam, 1991. Nature 354: 82-84参照）、チップ上に（Fodor, 1993. Nature 364: 555-556参照）、バクテリア（米国特許第5,223,409号明細書参照）、胞子（米国特許第5,233,409号明細書参照）、プラスミド（Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869参照）、又はファージに（Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406; Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382; Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310; 及び米国特許第5,233,409号明細書参照）含まれることが可能である。
【００５８】
一実施形態において、候補化合物は抗体-抗原複合体に導入されて、候補化合物が抗体-抗原複合体を崩壊させるかどうかを決定し、この複合体の崩壊は候補合成物がインフルエンザウイルスおよび細胞膜の間の相互作用を調整することを表す。例えば、抗体はモノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０およびＨ９８であってよく、抗原はインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質上に位置することができる。
別の実施形態では、少なくとも一つのＨＡタンパク質は形成され、このタンパク質は少なくとも一つの中和モノクローナル抗体に曝露される。抗体-抗原複合体の形成が検出され、一又は複数の候補化合物が複合体に導入される。抗体-抗原複合体が一又は複数の候補化合物の導入後に崩壊する場合、候補化合物は、例えば鳥インフルエンザ等のインフルエンザウイルス関連の疾患又は障害を治療するのに有用である。例えば、少なくとも一つのインフルエンザウイルス・タンパク質をインフルエンザウイルス分子として、供給することができる。
【００５９】
抗原またはその生物学的に活性な部分に対する試験化合物の結合が、複合体の標識化合物を検出することによって決定できるように、試験化合物を放射性同位体または酵素標識に連結することにより、試験化合物の、抗体-抗原複合体を干渉するかまたは崩壊させる能力を決定することができる。例えば、試験化合物は直接又は間接的に、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３Ｈで標識化することができ、放射性同位体は電波放射の直接計数によって又はシンチレーション計数によって検出される。あるいは、試験化合物は例えば、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又は発光酵素で酵素的に標識化することができ、酵素的標識は、適切な物質の製品への転換の決定によって検出される。
一実施形態において、分析は、抗体-抗原複合体を試験化合物に接触させて、抗原と相互作用する又はさもなければ、既存の抗体-抗原複合体を崩壊させる試験化合物の能力を決定することを含む。本実施形態では、抗原と相互作用する又はさもなければ、既存の抗体-抗原複合体を崩壊させる試験化合物の能力を決定することは、抗原又は抗原の生物学的に活性な部分と優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。
【００６０】
別の実施形態では、分析は、抗体-抗原複合体を試験化合物に接触させて、抗体-抗原複合体を調整する試験化合物の能力を決定することを含む。抗体-抗原複合体を調整する試験化合物の能力を決定することは、例えば、試験化合物の存在下で、抗体と結合する又は相互作用する抗原の能力を決定することによって達成可能である。
当業者は、本明細書において開示されるスクリーニング方法全てにおいて、抗原は、モノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０およびＨ９８等のインフルエンザウイルス中和口外であってよい。さらに、抗原はＨＡタンパク質又はその一部であってよい。本明細書に記載された全ての分析において、モノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０およびＨ９８とＨＡタンパク質との間の結合に干渉する候補化合物の能力は、候補化合物がインフルエンザウイルス及び細胞膜との融合に干渉するまたは調整することが可能であることを表している。さらに、ＨＡタンパク質の細胞への結合は、細胞へのインフルエンザウイルスの侵入の原因となるため、上記候補化合物は、例えば鳥インフルエンザ等のインフルエンザウイルス関連の疾患または障害の治療にも役立つ。
【００６１】
本願明細書に開示されるスクリーニング方法は、細胞に基づいた分析として又は無細胞分析として実行可能である。本発明の無細胞分析は、ＨＡタンパク質とその一部の可溶形態または膜結合形態の両方の使用に修正可能である。ＨＡタンパク質の膜結合形態を含む無細胞分析の場合、タンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を用いることが望ましいことであり得る。上記可溶化剤の実施例には、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−N−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ(エチレン・グリコール・エーテル)_ｎ、Ｎ−ドデシル−−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳ）、又は３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳＯ）等の非イオン洗剤が挙げられる。
複数の実施形態において、以下の候補化合物の導入の一方または両方の非複合形態からの複合体の分離を容易にする抗体又は抗原を静止させると同時に、分析の自動化を図ることは、望ましいことであり得る。候補化合物の有無における抗体-抗原複合体の観察は、反応物を含むのに適した全ての容器にもおいて行うことができる。上記容器の実施例には、マイクロタイタープレート、試験管、及びマイクロ遠心分離管が含まれる。一実施形態では、タンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することが可能になるドメインを加える融合タンパク質が提供可能である。例えば、ＧＳＴ抗体融合タンパク質またはＧＳＴ抗原融合タンパク質はグルタチオンセファロースビーズ（ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上へ吸着することができ、その後試験化合物と結合し、この混合物は複合体形成（例えば、塩およびｐＨの生理的条件で）につながる条件下で培養される。培養後、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルは洗浄されて未結合の構成要素が全て除去され、ビーズの場合はマトリックスが固定化され、複合体が直接又は間接的に決定される。あるいは、複合体はマトリックスから分離可能であり、抗体-抗原複合体形成のレベルは標準の技術を使用して決定することができる。
【００６２】
マトリックス上のタンパク質を固定化することの他の技術を、本発明のスクリーニング分析に用いることができる。例えば、抗体又は抗原は、ビオチン及びストレプトアビジンの共役を用いて固定化できる。ビオチン化抗体又は抗原分子は、当技術分野で公知の技術（例えばイリノイ州ロックフォードのピアスケミカル社のビオチン化キット）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（ピアスケミカル社）のウェルにおいて固定化することができる。あるいは、対象の抗体または抗原と反応するが、対象の抗体-抗原複合体の形成には干渉しない他の抗体を、プレートのウェルに誘導体化させて、抗体コンジュゲートによってウェルに捕獲された抗体又は抗原を開放することができる。上記複合体を検出する方法は、ＧＳＴが固定化された複合体について上述したものに加えて、抗体又は抗原と反応する上記の他の抗体を使用する複合体の免疫検出を含む。
本発明は、更なる本発明は処理のために任意の前述したスクリーニング分析およびその使用によって識別される新規の薬剤さらに関連する。
【００６３】
診断分析
本発明の抗体は、適切な分析、例えば従来の種類の免疫測定法によって検出が可能である。例えば、ある分析は、インフルエンザ・タンパク質（例えばＨＡ１、ＨＡ２又はノイラミニダーゼ）又はそのフラグメントが固相に加えられる方法で実行することができる。培養は、試料中の抗体が固相上の固定化されたポリペプチドと結合することができるように、十分な期間維持される。この最初の培養後に、固相が試料から分離される。この固相は洗浄されて、試料中にも存在しえる未結合材料と例えば非特異的タンパク質等の干渉物質が除去される。ポリペプチドと結合した関心対象の抗体を含む固相は次に、第２の標識化抗体又はビオチンまたはアビジン等の結合剤と結合した抗体で培養される。この第２の抗体は、他の抗インフルエンザ抗体又は他の抗体であってよい。抗体の標識は、当技術分野において公知であり、放射性核種、酵素（例えばマレアート・デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、ブドウ糖オキシダーゼ、カタラーゼ）、蛍石（フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコシアニン、フルオレカーミン(fluorescarmine)）、ビオチンなどを含む。標識化抗体は固体で培養され、固相に結合される標識が測定される。これらの、及び他の免疫分析は、当業者によって容易に実行されることができる。
生体試料中のインフルエンザウイルスの有無を検出する実例となる方法は、インフルエンザウイルスの存在が生体試料において検出されるように、被検体から生体試料を得て、生体試料を本発明による標識化モノクローナル又はｓｃＦｖ抗体と接触させることを含む。
【００６４】
本明細書で使用している、プローブ又は抗体に関連する用語「標識化」は、検出可能な物質をプローブ又は抗体に結合させる（すなわち物理的に連結させる）ことによってプローブ又は抗体を直接標識化することだけでなく、直接標識化された別の試薬との反応によるプローブ又は抗体の間接的な標識化を含む。間接的な標識化の実施例には、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるように、蛍光標識された第２の抗体及びビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識化を使用した主要抗体の検出が含まれる。用語「生体試料」には、被検体内に存在する組織、細胞及び体液と同様に、被検体から分離された組織、細胞および生体液が含まれる。すなわち、本発明の検出方法は、生体外だけでなく生体内における生体試料のインフルエンザウイルスを検出するために用いることができる。例えば、インフルエンザウイルス検出の生体外技術は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、及び免疫蛍光法を含む。さらに、インフルエンザウイルスを検出する生体内技術は、標識抗インフルエンザウイルス抗体を被検体に導入することを含む。例えば、抗体は、被検体の存在および位置が標準の撮像技術によって検出可能な放射性マーカーで標識することができる。
一実施形態では、生体試料は被検体からのタンパク質分子を含む。ある好適な生体試料は、被検体から従来の手段によって分離された末梢血白血球の試料である。
本発明はまた、生体試料におけるインフルエンザウイルスの存在を検出するためのキットを含む。例えばキットは：生体試料のインフルエンザウイルス（例えば抗インフルエンザｓｃＦｖ又はモノクローナル抗体）を検出することができる標識化合物または薬剤；試料中のインフルエンザウイルスの量を決定するための手段；及び試料中のインフルエンザウイルスの量を標準と比較するための手段を含むことができる。化合物または薬剤は、好適な容器にパッケージ化することができる。キットはさらに、キットを使用して試料中のインフルエンザウイルスを検出する説明書を含むことができる。
【００６５】
受動免疫法
受動免疫法は、ウイルス疾患の予防および治療に対する効果的で安全な戦略であると判明した。（Keller et al., Clin. Microbiol. Rev. 13:602-14 (2000); Casadevall, Nat. Biotechnol. 20:114 (2002); Shibata et al., Nat. Med. 5:204-10 (1999); and Igarashi et al., Nat. Med. 5:211-16 (1999) 参照。各文献は参照することによって本明細書に組み込まれる。）中和ヒトモノクローナル抗体を使用した受動免疫法は、鳥インフルエンザ等のインフルエンザの救急予防及び治療のための緊急治療戦略を提供する一方で、代替的な、そして時間のかかるワクチン及び新薬の開発が進行中である。
サブユニットワクチンは潜在的に、従来の免疫原に勝る重要な利点を提供する。サブユニットワクチンは、従来の死菌又は弱毒化全病原体ワクチンの製造、配布及び配送特有の安全上の問題を回避する。さらにサブユニットワクチンは、承認された防御エピトープのみを含むように合理的に構成することができ、これにより、抑制Ｔエピトープ（Steward et al., J. Virol. 69:7668 (1995)参照）、又は効果のない非保護反応（例えば、「デコイ」エピトープ）を生じさせることによって免疫システムを破壊する、免疫優勢Ｂエピトープを回避する（Garrity et al., J. Immunol. 159:279 (1997)参照。
さらに、当業者は、多くの異なるウイルス、チャレンジ・ルートおよび動物モデルに対する生体外の抗体中和作用及び生体内での予防の間に良い創刊関係があることを認識する（Burton, Natl. Rev. Immunol. 2:706-13 (2002); Parren et al., Adv. Immunol. 77:195-262 (2001)参照）。本明細書において示されるデータは、Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０及びＨ９８ヒトモノクローナル交代を更に開発し生体内動物試験において試験して、インフルエンザの救急予防及び治療向けの良く効くウイルス侵入阻害剤としての臨床有用性を決定することができることを示している。
【００６６】
ワクチンの抗体−Ｉｇキメラ
第１抗体が、免疫システムに対する抗原決定基の効果的な提示のための骨格として使用されて１０年以上がたつ（Zanetti, Nature 355:476-77 (1992)；Zaghouani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:631-35 (1995) 参照）。ペプチドがＩｇＧ分子（例えば本明細書において記載されている１１Ａ又は２５６ＩｇＧ1モノクローナル抗体）の一体部分として含まれるときに、ペプチド・エピトープの抗原性および免疫原性は遊離したペプチドと比較して非常に強化される。この種の強化は、おそらく抗原−ＩｇＧキメラの、それらの自然構造を模倣するより長い半減期、より良い提示、及び拘束配座に起因する。
さらに、抗原−Ｉｇキメラを使用することの更なる利点は、変数又は抗原−ＩｇキメラのＦｃ領域を使用して、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）のターゲッティングすることができる。今までは、重鎖可変遺伝子（Ｖ_Ｈ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）がＢ又はＴ細胞によって認識される様々な抗原ペプチドに置換される、組み換えＩｇが生成されてきた。この種の抗原−Ｉｇキメラは、体液及び細胞免疫反応の両方を誘発するために用いられてきた（Bona et al., Immunol. Today 19:126-33 (1998)参照）。
【００６７】
ＣＤＲ３ループに移植された特定のエピトープを有するキメラは、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３−ループ又はヒトＣＤ４レセプタの第１の細胞外ドメイン（Ｄ１）に対する体液反応を誘導するために用いられてきた（Lanza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11683-87 (1993); Zaghouani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:631-35 (1995) 参照）。免疫血清により、ＨＩＶ−１ＭＮ（抗−ｇｐ１２０ Ｖ３Ｃ）によってＣＤ４ ＳｕｐＴ１細胞の感染を予防する又はシンシチウム形成（抗−ＣＤ４−Ｄ１）を阻害することが可能であった。ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は同時にペプチド・エピトープと置換することができ、挿入されるペプチドの長さは最大１９アミノ酸長にもなり得る。
あるいは、あるグループは、ペプチド抗原がＩｇ一定の（Ｃ）領域のループで提示され、キメラの可変領域をＢ細胞の表層上のＩｇＤ又はＢ細胞、樹枝細胞（ＤＣ）及び大食細胞を含むプロフェッショナルＡＰＣ上のＭＨＣクラスII分子をターゲッティングするために用いることができる「troybody」戦略を開発した（Lunde et al., Biochem. Soc. Trans. 30:500-6 (2002) 参照）。
抗原−Ｉｇキメラはまた、直接抗原をＩｇＧ分子のＦｃ部分と融和させることによって生成することもできる。You et al., Cancer Res. 61:3704-11 (2001)は、この方法を使用して、非常に高いレベルの抗体からＢ型肝炎ウイルス核抗原までを含む特定の免疫反応の全てのアームを得ることができた。
【００６８】
ＤＮＡワクチン接種
ＤＮＡワクチンは安定しており、抗原が自然に処理される機会を提供することができ、比較的長く続く反応を誘発することができる。非常に魅力的な免疫化戦略ではあるが、ＤＮＡワクチンの免疫反応を誘発する効力はしばしば非常に限られている。例えば樹枝細胞（ＤＣ）等のプロフェッショナルＡＰＣによって注入されたＤＮＡの取り込み不足が、上記限界の主な原因であり得る。抗原−Ｉｇキメラ・ワクチンと組み合わせて、ＤＣの表層上のＦｃレセプタ（ＦｃγＲ）の存在を利用する、ＡＰＣ抗原提示の促進に基づく有望な新規ＤＮＡワクチン戦略が報告された（Casares, et al., Viral Immunol. 10:129-36 (1997); Gerloni et al., Nat. Biotech. 15:876-81 (1997); Gerloni et al., DNA Cell Biol. 16:611-25 (1997); You et al., Cancer Res. 61:3704-11 (2001) 参照）。
抗原（Ａｇ）−Ｉｇキメラをコード化するＤＮＡワクチンを生成することは可能である。免疫処置においては、ＤＮＡ分子を処理する細胞によってＡｇ−Ｉｇ融合タンパク質が発現し、分泌される。分泌されたＡｇ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｂ細胞反応を誘発すると共に、ＤＣ表層上のＦｃγＲを有するＦｃフラグメントの相互作用によって捕獲され、取り込まれることが可能であり、これにより、効率的な抗原提示を増進し、抗原特有の免疫反応を大幅に促進する。機能性抗ＭＨＣ II特異的ｓｃＦｖ領域遺伝子を担持しているＤＮＡコード化抗原−Ｉｇキメラはまた、同じ原理を適用して、免疫原をＡＰＣの全３種類にターゲッティングすることもできる。免疫反応は、必要に応じて、生体外で生成される（すなわちプライム及びブースト）同じタンパク質抗原を使用して、さらに促進することができる。この戦略を使用して、インフルエンザウイルスの感染に対する特定細胞及び体液の免疫反応は、ＤＮＡワクチンの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって達成された（Casares et al., Viral. Immunol. 10:129-36 (1997)参照）。
【００６９】
ワクチン組成物
治療又は予防組成物は本明細書において提供されており、これらは一般に、一又は複数のモノクローナル抗体またはＳｃＦｖの混合物及びこれらの組合せを含む。予防ワクチンは、インフルエンザウイルス感染を予防するために用いることができ、治療ワクチンは、インフルエンザウイルスに感染した人を治療するために用いることができる。予防的な使用には、ワクチンの接種対象者のインフルエンザウイルスに、増加した抗体価を供給することが含まれる。このように、インフルエンザにかかるリスクが高い被検体に、インフルエンザウイルスに対する受動免疫を付与することができる。
これらワクチン組成物は、補助免疫調節剤とともに投与することができる。例えば、非限定的にＩＬ−２、変性ＩＬ−２（Ｃｙｓ１２５→Ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、及びＲＡＮＴＥＳを含む、サイトカイン、リンフォカイン及びケモカインである。
【００７０】
免疫化の方法
本発明のワクチンは、他の抗ウイルス・ワクチンよりも優れた免疫保護及び免疫療法特性を有する。
本発明は被検体の免疫化、例えば免疫反応を誘発する方法を提供する。被検体は、病原体外膜ウイルスの膜融合タンパク質を含む組成物を被検体へ投与することによって、免疫化される。融合タンパク質は、生物学的に適合したマトリックスで覆われている又は埋め込まれている。
融合タンパク質はグリコシル化され、例えば糖鎖を含む。糖鎖は、単糖類、一又は複数の二糖類、一又は複数のオリゴ糖類、一又は複数の多糖類又はそれらの誘導体（例えばスルホ又はホスホ置換された）の形であってよい。炭水化物は、直鎖状である又は分岐している。糖鎖は、ポリペプチドにＮ結合又はＯ結合している。Ｎ−結合グリコシル化はアスパラギン側鎖のアミド窒素へ、Ｏ−結合グリコシル化はセリン及びトレオニン側鎖のヒドロキシ酸素へ結合している。
糖鎖は、ワクチン接種を受けている被検体に対し内在性である。あるいは、糖鎖は、ワクチン接種を受けている被検体に対し外生的である。糖鎖は、ワクチン接種を受けている被検体のポリペプチドに通常発現しない糖鎖である。例えば、炭水化物半分は、植物特異的な炭水化物である。植物特異的な糖鎖は、例えばコア結合α１,３フコース又はコア結合１,2キシロースを有するＮ−結合型グリカンを含む。あるいは、糖鎖は、ワクチン接種を受けている被検体のポリペプチド又は脂質に発現する糖鎖である。例えば、多くの宿主細胞は、ヒト様糖付着品を有するヒトタンパク質を生成するために遺伝子操作が行われてきた。
【００７１】
例えば、融合タンパク質は、三量体赤血球凝集素タンパク質である。任意に、赤血球凝集素タンパク質は、例えば植物細胞等の非哺乳類細胞において生成される。被検体は、ウイルス感染症を発症する又はウイルス感染症に苦しむ危険にさらされている。外膜ウイルスは例えば、エプスタイン・バーウイルス、単純疱疹ウイルス、１及び２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、８型、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、はしかウイルス、耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス及び風疹ウイルスを含む。本明細書に記載した方法により、ウイルス感染の一又は複数の症状の重症度が軽減又は緩和される。感染症は、標準的な手順を使用する医師によって診断される及び又は監視される。予防接種が必要な被検体は、当技術分野で公知の方法によって識別される。例えば、被検体には、ＣＤＣのGeneral Recommendation on Immunization（51（RR02）pp1-36）に概説されているように予防接種が行われる。癌は例えば物理的な試験、生検、血液検査またはＸ線によって診断される。被検体は例えば、全ての哺乳類、例えばヒト、霊長類、マウス、ネズミ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、魚または鳥である。処置は、感染症の診断の前に行われる。あるいは、処置は診断後に行われる。
処置の効果は、特定の障害または感染症を診断する又は治療する全ての公知の方法に関連して決定される。障害の一又は複数の症状の緩和は、化合物が臨床的利点をもたらすことを示す。
【００７２】
ワクチンの可能性のための抗原性タンパク質フラグメント（ＡＰＦ）の評価
体液性免疫を標的とするワクチン候補は、少なくとも３つの基準を満たさなければ成功しない：強い抗体反応（「免疫原性」）を引き起こさなければならない；それが引き起こす抗体の重要なフラグメントは、病原体（「免疫原性適合性」）と交差反応しなければならない；それが引き起こす抗体は、保護するものでなければならない。免疫原性が佐剤又は担体を使用してしばしば促進可能である一方で、免疫原性適合性及び（中和によって明白なように）保護を誘導する能力は、ワクチン構成要素としてのその抗原の成功を最終的に決定する抗原の固有特性である。
【００７３】
免疫原性適合性の評価
「免疫原性適合性」は、病原体と交差反応する抗原によって誘導される抗体の一部として定義される（Matthews et al., J. Immunol. 169:837 (2002)参照）。これは、病原体と交差反応しない抗体を含む抗原によって誘導された全ての抗体の力価によって測定される免疫原性とは別のものである。不十分な免疫原性適合性は、おそらく今までペプチド・ワクチンの期待外れの実績に寄与してきた。抗体に高い親和性で結合し、高い抗体価を引き出すペプチドはしばしば十分な免疫原性適合性に欠くため、見込みのあるワクチン構成要素としては不合格である。したがって、インフルエンザ・ワクチン候補を選ぶ基準の一つとして、免疫原性適合性を含むことは重要である。
低い免疫原性適合性の一般的な理由は、一番短いペプチドの立体配座の柔軟性である。
具体的には、可撓性ペプチドは、患者からの抗体と良好に結合することができ、未投与の被検体において実質的な抗体価を導き出すことができる。しかしながら、ペプチドが多数の配座のレパートリを有する場合、それが未投与の被検体に引き起こす抗体の優位により、完全な病原体上の対応するネイティブエピトープと交差反応できない可能性がある。
短いペプチドのように、あるＡＰＦは非常に可撓性である可能性があり、従って、ワクチンの構成要素としてはふさわしくない。最も免疫原性的に適切なＡＰＦは、総タンパクの状況とは別に本質的に拘束されている自己折りたたみ型タンパク質サブドメインで構成される傾向にある。免疫原性適合性は主にＡＰＦ自体のものであって、反応する免疫システムのものではないため、最終的にはＡＰＦはヒトにおいて作用しなければならないが、動物モデル（例えばマウス）において免疫原性適合性を評価することが可能である。
【００７４】
ＡＰＦによって達成される免疫原性適合性は、Matthews et al., J. Immunol. 169:837 (2002)に記載されたものに類似した手順で、精製されたスパイクまたは膜タンパク質を有する抗ＡＰＦ血清の免疫吸収によって評価される。ＩｇＧは、予防接種をされたマウスから採取された血清から精製される。精製され、ビオチン化されたタンパク質（マウスが予防接種された特定のＡＰＦにより必要に応じて）は、マウスのＩｇＧと混合されて、培養される。ストレプトアビジンでコーティングされた十分な量のセファロースビーズが次に添加され、全ての結合ＩｇＧとともに、ビオチン化されたタンパク質を全て捕捉する。ストレプトアビジンでコーティングされたビーズは、それぞれ、タンパク質に対する抗体が枯渇されたＩｇＧを残す、マイクロ遠心分離機において１３，０００ｒｐｍの遠心分離によって除去される。偽免疫吸収は、ビオチン化されたＢＳＡが偽吸収剤としてインフルエンザ・タンパク質と置換される以外は、同じように平行して行われる。
ＡＰＦの免疫原性適合性を測定するために、吸収された抗体および偽吸収された抗体は、免疫ＡＰＦに対するＥＬＩＳＡにおいて並んで滴定される。ファージ提示ＮＰＬから選択されるＡＰＦの親和性については、これらＥＬＩＳＡの抗原が、精製されたＡＰＦ−ＧＳＴ融合タンパク質となる。哺乳類細胞提示ＮＰＬからの潜在的にグリコシル化されたＡＰＦについては、これらＥＬＩＳＡの抗原が、哺乳類細胞によって分泌され、プロテインＡによって精製されたＡＰＦ−Ｆｃ融合タンパク質となる。偽吸収された抗体と比較して、吸収された抗体の抗ＡＰＦ滴定量の減少率により、ＡＰＦの免疫原性適合性の量が得られる。
【００７５】
治療方法
本発明は、インフルエンザウイルス関連の疾患または障害の（又はこれに感染しやすい）危険にさらされている被検体を治療する、予防的及び治療的な方法の両方を提供する。例えば、この種の疾患または障害は、鳥インフルエンザを含むが、これに限定されるものではない。
【００７６】
予防方法
一態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はｓｃＦｖ抗体、あるいは本発明の方法にしたがって識別された薬剤を投与することによって、被検体のインフルエンザウイルス関連の疾患または障害を予防する方法を提供する。例えば、ｓｃＦｖ及び／又はモノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０及びＨ９８の治療上有効量を投与することができる。任意には、２つ以上の抗インフルエンザ抗体が同時投与される。
インフルエンザウイルス関連の疾患または障害の危険にさらされている被検体は、感染者と接触した患者、又は、何らかの他の方法でインフルエンザウイルスにさらされた患者を含む。予防薬剤の投与は、インフルエンザウイルス関連の疾患または障害に特有の症状の徴候が現れる前に行うことができ、これにより、疾患または障害が予防される、又は、その進行が遅らされる。
適切な薬剤は、本明細書に記載されているスクリーニング分析に基づいて決定することができる。代わりに又は加えて、投与される薬剤は、本発明の方法に従って識別されたインフルエンザウイルスを中和するｓｃＦｖ又はモノクローナル抗体である。
【００７７】
治療方法
本発明の別の態様は、患者のインフルエンザウイルス関連の疾患または障害を治療する方法に関連する。一実施形態では、この方法には、疾患または障害を患っている患者に、インフルエンザを中和する薬剤（例えば、本明細書に記載されているスクリーニング分析によって識別される薬剤及び／又は本発明の方法に従って識別されるｓｃＦｖ抗体又はモノクローナル抗体）又は薬剤の組合せを投与することが含まれる。
【００７８】
組み合わせ方法
本発明は、例えばＨＡタンパク質の同じエピトープと結合するＤ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０及びＨ９８等の２つ以上の抗体を投与することによって、患者のインフルエンザ関連の疾患又は障害（例えば鳥インフルエンザ等）を治療することを提供する。
【００７９】
本発明は、請求項に記載されている本発明の範囲を制限しない以下の実施例において更に説明される。
【実施例】
【００８０】
実施例1：一般的な方法
ファージ提示抗体ライブラリの選択のための様々なパニング抗原の発現及び調製
ＨＡ１ ＨＡ１は（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／２（ＳＰ−３３）／２００４（Ｈ５Ｎ１）のＮ末端フラグメント（ａａ１７−３３８）である。遺伝子は、コドン最適化し、Ｃ末端９アミノ酸タグ（Ｃ９−タグ：ＧＴＥＴＳＱＶＡＰＡ）を有する融合タンパク質として発現させた。融合タンパク質ＨＡ１−Ｃ９は、２９３Ｔ細胞において一時的に発現させ、分泌されたタンパク質は親和性クロマトグラフィによって上澄みから精製した。ＨＡ１−Ｃ９の精製のために、抗Ｃ９抗体１Ｄ４（国立細胞培養センター）に共有結合的に結合するプロテインＡセファロースを使用した。
三量体ＨＡ０ 前述したプロトコル^３３を適応させることにより、Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／２００４の赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の細胞外ドメイン（ＨＡ０）を昆虫細胞において融合タンパク質として発現させた。このコンストラクトは三量体化構造を安定させるためのバクテリオファージＴ４フィブリチンからのＣ末端三量体化「フォールドン」シーケンスと、その後にトロンビン・サイト及びＨｉｓ６タグを含む。融合タンパク質のｃＤＮＡは、バキュロウイルス移入ベクター、ｐＡｃＧＰ６７Ａ（マサチューセッツ州ベッドフォードのＢＤバイオサイエンス社）にクローニングし、組み換えタンパク質の効率的な分泌を可能とした。９×１０^６細胞は、ウイルス株によって感染した。感染３日後に細胞を沈降させ、そして、上澄みは６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡビーズ（カリフォルニア州バレンシアのＱｉａｇｅｎ社）で培養した。ビーズは、１０ｍＭのイミダゾールを有するＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ／８０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄し、２５０ｍＭのイミダゾールを有するＴＢＳによって溶出させた。溶出させたＨＡ５タンパク質は、ＴＢＳ緩衝液で透析処理して、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ１０／１０カラム（ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥヘルスケア社）を使用したイオン交換によって更に精製した。精製したＨＡ５を終夜トロンビンによって消化させた。ＨＡ０三量体の完全性及び性質は、ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して調べた。
【００８１】
ファージ抗体ライブラリの選択及びＨ５に対する抗体のスクリーニング
５７人のワクチン接種を受けていない提供者のＢ細胞から構成される２つのヒト非免疫性ｓｃＦｖライブラリ（合計２．７×１０^１０メンバー）を、精製されたＨＡ１又は三量体ＨＡ０に対するｓｃＦｖｓの選択のために用いた。各々のライブラリから調製される５×１０^１１ｐｆｕのファージ−ｓｃＦｖｓを、別々に、１０μｇのＨＡ１又はＨＡ０でコーティングされたイムノチューブ（イリノイ州ネーパービルのヌンク社）で培養した。選択手順は前述したのと同じであった。選択手順を２回繰り返した後で、ランダムに選択した単一のファージ−ｓｃＦｖクローンを前述したように、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によってＨＡ１又はＨＡ０への特異結合のためにスクリーニングした。＞１．０のＡ_４５０値を有するＨＡ１又はＨＡ０と結合したクローンは陽性として記録し、その一方で負のクローンの値は＜０．１であった。ＨＡ１又はＨＡ０特異結合クローンについては、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の遺伝子を配列決定し、それらの対応するアミノ酸配列は、抗体を更に特徴づけするために異なる配列で識別するように整列配置した。
【００８２】
可溶なｓｃＦｖ−Ｆｃｓ及び完全長ヒトＩｇＧ１の発現及び精製
ファージ・ライブラリを作製するのと同じ方法を使用して、中和分析のために個々のクローンのファージ−ｓｃＦｖｓを生成した。ファージ粒子は、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿を利用して２５倍に濃縮した。前述したように、ｓｃＦｖ−Ｆｃｓ及び完全ヒトＩｇＧ１sを生成した。簡単に言うと、選択されたｓｃＦｖｓを、ｓｃＦｖを、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３領域を含むが、ＣＨ１を欠くヒンジを含むＦｃ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｎｇｅへサブクローニングすることによって、ｓｃＦｖ−Ｆｃｓへ変換した。完全ヒトＩｇＧ１については、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ遺伝子のフラグメントを、ヒトＩｇＧ１カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖発現ベクター、ＴＣＡＥ５又はＴＣＡＥ６へ別々にサブクローニングした。ｓｃＦｖ−Ｆｃｓ又はＩｇＧ１は、一時的な移入によって２９３Ｔ又は２９３Ｆ細胞（インビトロゲン）において発現させ、タンパク質Ａセファロース親和性クロマトグラフィによって精製した。
【００８３】
表層プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
組み替え型ＨＡ０（ＶｉｅｔＮａｍ１２０３／０４）三量体に結合するＨ５ ＨＡ Ｍａｂｓの動態分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ）上で２５℃で行った。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ）を、アミン結合キット（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、アミン結合によってＣＭ４センサチップの個々のフローセル表面に、共有結合的にコーティングを施した。ＨＡ Ｍａｂを、Ｍａｂ−ＨＡ０結合が均一の１：１ラングミュア相互作用として行われるように、ＨＢＳ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ）において１０ｕｌ／分の流動率で抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ表面上で捕捉させた。ＨＡ０は、ＨＢＳ緩衝液において３０ｕｌ／分の流動率、及び０．３１〜２０ｎＭの範囲の濃度で、各フローセルを通して注入した。緩衝注射は、負の制御として機能した。全ての実験には付加的な抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体コントロール表面を含め、緩衝屈折指標の変化を考慮し、またＨＡ０と抗ヒトＩｇＧ Ｆｃの間の潜在的な非特異性相互作用を検査した。各々の会合及び解離サイクルが完成したときに、表層は、３Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液によって再構成した。会合速度（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び親和定数（ＫＤ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価用ソフトを使用して算出した。各適合度は、実験データ及び算出された適合との一致に基づいており、ここで、Ｃｈｉ^２値は１．０未満であった。ＨＡ０に対するＭａｂの表面密度は、質量移動を最小限に抑え、親和効果の寄与を完全になくすために最適化された。本明細書で報告される全てのｋａ、ｋｄ、ＫＤは、３つの実験の手段及び標準誤差を表す。
【００８４】
ウイルス及び細胞
Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／１９６０（Ｈ２Ｎ２）の低温適応ワクチン株だけでなく、野生型インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１；Ｈ５−ＶＮ０４）型、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８３／１９９７（Ｈ５Ｎ１；Ｈ５−ＨＫ９７）型、Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３（Ｈ７Ｎ７；Ｈ７−ＮＬ０３）、及びＡ／Ｏｈｉｏ／４／１９８３（Ｈ１Ｎ１；Ｈ１−ＯＨ８３）ウイルスは、ＷＨＯ世界インフルエンザサーベイランスネットワークから入手し、アレキサンダー・クリモフ氏（米国アトランタのＣＤＣ）によって提供された。Ｈ１−ＰＲ３４及びメイディン・ダービー犬の腎臓（ＭＤＣＫ）細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手し、１０％のウシ胎仔血清を有するダルベッコ変法イーグル培地において増殖させた。ウイルスの伝染力は、ＭＤＣＫ細胞のプラーク分析で判定した。活野生Ｈ５Ｎ１型ウイルスは、米国農務省の選択物質プログラム(http://www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm)によって要求される強化を含む、バイオセーフティレベル３の格納容器内で取り扱った。
【００８５】
ＨＡ−偽型ウイルスの中和分析
プラスミド及びコンストラクト
Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／２（ＳＰ−３３）／２００４（Ｈ５Ｎ１））の全長ＨＡ遺伝子、Ｈ５−ＳＰ３３、及びＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ １２０３／２００４のノイラミダーゼ遺伝子、Ｎ１をコドン最適化し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクトルへクローン化して、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈ５−ＳＰ３３及びｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ１発現プラスミドを別々に生成した。ｐＣＡＧＧＳ−Ｈ１（ＳＣ）プラスミドコード化Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）全長ＨＡタンパク質は、Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ博士（米国シナイ山医学部）によって、好意で提供された。ｐＣＡＧＧＳ−Ｈ１（ＰＲ）プラスミドコード化Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ （Ｈ１Ｎ１） ＨＡタンパク質は、Ｍ． Ｆａｒｚａｎ博士（米国ハーバード・メディカル・スクール）からの寛大な贈り物である。
【００８６】
ＨＡ−偽型ウイルスの生成
Ｈ５−ＳＰ３３、Ｈ１−ＳＣ／１９１８又はＨ１−ＰＲ／３４によって偽型化されたＨ５Ｎ１又はＨ１Ｎ１のsingle-roundＨＩＶ発光酵素リポータ・ウイルスを、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈ５−ＳＰ３３、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ−ＰｏｌをコードするＨＩＶパッケージ化ベクターｐＣＭＶΔＲ ８．２^５７、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ制御下にＨＩＶ−１ホタル・ルシフェラーゼリポータ遺伝子をコードするトランスファーベクターｐＨＩＶ−Ｌｕｃ、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ１の４つのプラスミドによる２９３Ｔ細胞の同時移入により作製した。３６時間の移入後に、ウイルス上澄みを採取し、４℃で保管した。
【００８７】
中和分析
細胞を導入する前に、Ｈ１−ＳＣ／１９１８又はＨ１−ＰＲ／３４Ｆ偽型ウイルスのウイルス上澄みを、１６μｇ／ｍＬの ＴＰＣＫ処理トリプシンで２５℃で１時間培養し、次に１：１（Ｖ／Ｖ）の比率のトリプシン中和溶液（TNS、Cambrex）で中和した。試験抗体又は血清は、ＲＴにおいて３０分間、十分な量のＨ５−ＳＰ３３偽型又はトリプシン処理Ｈ１偽型ウイルスで培養した。混合物はその後、９６ウェルプレートの２９３Ｔ細胞に加えて、４８時間培養を継続した。ウイルス侵入レベルは、マイクロプレート照度計で標的細胞のルシフェラーゼ活性を測定することによって評価した。
【００８８】
抗体８、１０及び６６のエピトープ・マッピング
プラスミド及びコンストラクト ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈ５−ＳＰ３３、ｐＣＡＧＧＳ−Ｈ１（ＳＣ）及びｐＣＡＧＧＳ−Ｈ１（ＰＲ）は、上に説明したのと同様である。Ａ／ＦＰＶ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４（Ｈ７Ｎ１）のＨＡタンパク質をコード化するｐＣＡＧＧＳ−Ｈ７（ＦＰＶ）は、Ｘ．ヤン博士（ベス・イスラエルディーコネス医療センター）によって、好意的に提供された。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈ５−ＳＰ３３又はｐＣＡＧＧＳ−Ｈ７（ＦＰＶ）の変異体は全て、QuikChange方法（ストラタジーン）によって作製した。抗Ｈ５抗体のＨＡ発現細胞への結合のフローサイトメトリー分析である。Ｈ１、Ｈ５又はＨ７のプラスミドを発現している様々な完全長野生型ＨＡ及びＨＡ変異体を、２９３Ｔ細胞に一時的に移入した。移入の４８時間後に、抗Ｈ５抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）は４℃において、移入された２９３Ｔ細胞と共に１時間培養した。次に細胞を、０．５％のＢＳＡ及び０．１％のＮａＮ３を含むＰＢＳで３回洗浄した。ＨＡ移入細胞に結合する抗Ｈ５抗体を検出するために、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ピアス）を第２の抗体として使用して、細胞とともに３０分間４℃で培養した。細胞を上記したように再度洗浄し、CellQuestソフトウェアを有するBecton Dickinson FACScaliber with CellQuest softwareを使用して分析した。
【００８９】
マイクロ中和分析
本方法は、前述したように^４８行った。簡単に説明すると、ウイルスのＴＣＩＤ_５０（半組織培養感染量）を、９６−ウェル組織培養プレートにおいて等しい容量の抗体貯蔵液（１ｍｇ／ｍｌ）のｌｏｇ２希釈剤と混合し、３７℃で１時間培養した。指示薬ＭＤＣＫ細胞（１．５×１０^４細胞／ウェル）をプレートに加えて、３７℃で２０時間で培養した。エンドポイントを確立するために、細胞単分子層を次に、アセトンに固定されたＰＢＳで洗浄し、ウイルス抗原をインフルエンザＡ型ＮＰ（Ａ−３、Accurate）に対するｍＡｂを有する間接的なＥＬＩＳＡによって検出した。
【００９０】
プラーク減少分析
Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ １２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）又はＡ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ／２１９／０３（Ｈ７Ｎ７）ウイルス（１０，０００ｐｆｕ）を、抗Ｈ５ ｓｃＦｖ−Ｆｃｓで、３７℃で３０分間、３つの異なる濃度１００ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ及び１ｕｇ／ｍｌで培養した。ウイルス−抗体混合物を、１２−ウェルプレートのＭＤＣＫ細胞単分子層に移して３７℃で１時間培養し、その後細胞を洗浄し寒天で覆った。４日間の培養後に寒天の覆いを廃棄し、斑をクリスタル・バイオレットに染色して視覚化した。
【００９１】
赤血球凝集阻止（ＨＩ）分析
鳥インフルエンザウイルスは、優先的にＮ−アセチルノイラミン酸α２,３−ガラクトース（α２,３Ｇａｌ）を含むシアル酸レセプターと結合するが、ヒトウイルスは優先的にＮ−アセチルノイラミン酸α２,６−ガラクトース（（α２,６Ｇａｌ）結合を含むシアル酸レセプターと結合する。レセプター特性の分子基礎は、ウイルスＨＡの複合的な残留物でおそらく測定される。赤血球凝集阻止（ＨＩ）試験は、インフルエンザ赤血球凝集素に対する抗体反応を評価する、単純で広く使われている方法である。スティーブンソン氏他は、ウマ赤血球を使用することにより、結合に利用可能なα２,３Ｇａｌ結合の比率を増やすことによって、赤血球凝集分析の感度が改善されたと報告している。加えて、ＨＩ分析の滴定濃度は、マイクロ中和分析の滴定濃度と良好に相関した。偽型ウイルスは、説明したようにウマ赤血球の赤血球凝集を使用して、最初に滴定される。最初のハイスループットスクリーニングは同様に、ウマ赤血球懸濁液を使用し、滴定されたＨ５／Ｎ１ウイルスのＨＩエンドポイントを阻害するファージ抗体の能力を分析することによって行われる。Ｈ５Ｎ１リポータ・ウイルス侵入及びＨＩを抑制するためのより詳細な第２のスクリーニングは、一時的に移入された２９３Ｔ細胞によって生成しタンパク質Ａビーズによって精製された可溶ｓｃＦｖＦｃタンパク質で用量反応研究を使用して行われる。
【００９２】
ウイルス結合抑制分析
０．５×１０^６の２９３Ｔ細胞を、抗Ｈ５ ｍＡｂ、コントロールｍＡｂの存在下、または抗体のない状態で、Ｈ５−ＴＨ０４−偽型ＨＩＶウイルス（ｐ２４のおよそ５００ｎｇ）とともに、０．５％のＢＳＡ及び０．０２％のＮａＮ_３を含むＰＢＳ緩衝液において４℃で培養した。１時間培養した後に、細胞を遠心沈殿させた。上澄みを採取して、ＨＩＶ−１ ｐ２４^ＣＡ捕捉ＥＬＩＳＡキット（ＮＣＩ、フレデリック、ＮＩＨ）を使用し、未結合のウイルスを定量化した。細胞を次に１又は２回洗浄して、同様の方法を使用して細胞結合ウイルスを定量化するために溶解した。
【００９３】
細胞融合抑制分析
（６つのウェルプレートにおいて融合性が最高９０％の）２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を使用して４：１の比率（ＤＮＡ／ウェル合計３μｇ）で、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈ５−ＴＨ０４プラスミド及びｐｃＤＮＡ ３．１−Ｎ１を移入させた。トランスフェクションの６時間後に培養基に１ｍｌの抗H５、制御又は模擬ｍＡｂｓを追加し、細胞を３６時間培養した。細胞を位相差顕微鏡でシンシチウム形成について観察した。顕微鏡写真は１０ｘの倍率で撮影した。
【００９４】
パニングのための様々なＨＡタンパク質の発現及び調製
ＨＡ１は、Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／２（ＳＰ−３３）／２００４（Ｈ５−ＴＨ０４）のＨＡのＮ末端フラグメントであり、残留物は１１〜３２５である（Ｈ３ナンバリング）。遺伝子をコドン最適化して、Ｃ末端９アミノ酸タグ（Ｃ９−タグ：ＧＴＥＴＳＱＶＡＰＡ）を有する融合タンパク質として発現させた。融合タンパク質ＨＡ１−Ｃ９を一時的に２９３Ｔ細胞において発現させ、トランスフェクションから４８時間後に上澄み中の分泌タンパク質を回収し、抗Ｃ９抗体１Ｄ４（国立細胞培養センター）と共有結合的に結合したタンパク質Ａセファロースを使用した親和性クロマトグラフィによって上澄みから精製した。Ｈ５−ＶＮ０４のＨＡ０タンパク質を生成する方法は、furin-開裂のためのbaculovirus重感染がない以外は、下記に記載するＨ５−Ｆ１０複合体の結晶化の方法と同様である。
【００９５】
ＥＬＩＳＡ
０．２μｇの純粋なＨ５ ＨＡタンパク質を２μｇ／ｍＬ含むＰＢＳにて９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート(Nunc, NY)を４℃で終夜をかけてコートした。プレートをＰＢＳにて３回洗浄し、コートしていないタンパク質を除去した。通常のＥＬＩＳＡのために、１μｇ／ｍＬの抗Ｈ５ ｓｃＦｖ−Ｆｃの後にＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ１を用いて、Ｈ５ ＨＡタンパク質への抗Ｈ５ ｓｃＦｖ−Ｆｃの結合を検出した。競合ＥＬＩＳＡのために、５０μＬ(１０^１２ｐｆｕ)の抗Ｈ５ファージ−ｓｃＦｖを、５μｇ／ｍＬの抗Ｈ５ ｓｃＦｖ−Ｆｃと混合し、Ｈ５-ＶＮ０４ ＨＡコートＥＬＩＳＡプレートに適用した。ＨＡ０に対するファージ−ｓｃＦｖの結合についてのｓｃＦｖ−Ｆｃの競合は、ＨＲＰ−抗Ｍ１３を用いたファージ−ｓｃＦｖの残りの結合を測定することによって決定した。ペルオキシダーゼテトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)基質システム(KPL, Gaithersburg MD)の培養の後に４５０ｎｍの光学濃度を測定した。
【００９６】
Ｈ５−Ｆ１０複合体の発現、精製および結晶化
単鎖(ＶＨ−リンカー−ＶＬ)Ｆ１０(ｓｃＦｖ)をコードする遺伝子を、Ｎ末端周辺質分泌シグナルｐｅｌＢおよびＣ末端６ｘＨｉｓタグを含むｐＳｙｎＩベクターにクローニングした。Ｆ１０ ｓｃＦｖは、０．５ｍＭのＩＰＴＧと１５時間おき、２５℃の０．１％グルコース(ｗ／ｖ)を含む２ＹＴ培地中でＸＬ１０細胞において発現させた。タンパク質は、始めに製造業者の指示に従ってＨｉｓｂｉｎｄ Ｎｉ-ＮＴＡ(Novagen)にて、次いで５０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００(Amersham Biosciences)にて精製した。
既に記載されているプロトコール６を用いて、Ｈ５-ＶＮ０４ ＨＡ遺伝子の外部ドメインを融合タンパク質として昆虫細胞において発現させた。このコンストラクトは、三量体構造を安定させるためのバクテリオファージＴ４フィブリチンのＣ末端三量体形成「ｆｏｌｄｏｎ」配列と、その後にトロンビン部位およびＨｉｓ６タグを含む。融合タンパク質のｃＤＮＡを、バキュロウイルス導入ベクターであるｐＡｃＧＰ６７Ａ(BD Biosciences, Bedford, MA)にクローニングし、組み換えタンパク質を効率よく分泌させた。十分に切断されたＨＡ(ＨＡ１−ＨＡ２三量体)を得るために、ｓｆ９細胞を、経験的に得られた比率のＨＡ０およびフューリンのバキュロウイルス系統と共に同時感染させた。フューリンｃＤＮＡは、Dr. Robert Fuller (University of Michigan)からの贈り物であった。感染の３日後に、細胞を遠心にかけ、上清をＮｉ-ＮＴＡビーズ(Qiagen Inc., Valencia, CA)と共にインキュベートした。ビーズは、１０ｍＭ イミダゾールを有するＴＢＳバッファ(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ、８０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０)にて洗浄し、２５０ｍＭ イミダゾールを有するＴＢＳにて溶出した。溶出したＨ５タンパク質は、ＴＢＳバッファに対して透析し、さらにＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０カラム(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を用いたイオン交換によって精製した。精製されたＨ５は終夜をかけてトロンビンによって消化させ、さらにＴＢＳバッファのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにて精製した。
Ｈ５−Ｆ１０複合体は、２つの精製した構成成分を混合することによって形成され、ＴＢＳバッファのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００にて単離した(補足図１b)。ピークの分画をプールし、およそ１１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。Ｈ５三量体の完全性は、ゲルろ過法(Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム)およびＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて調べた。結晶は２２℃の懸滴蒸気拡散法にて大きくした。２μＬのＨ５−Ｆ１０を、等しい体積の１２．５％ＰＥＧ １Ｋ、２５％エチレングリコール、１００ｍＭ トリス、ｐＨ８．５と混合した。結晶は液体窒素にて急速冷凍し、データ採取した。
【００９７】
Ｈ５−Ｆ１０複合体の共結晶化
Ｈ５−Ｆ１０の共結晶化のために、Ｆ１０を大腸菌において発現させ、Ｎｉ-ＮＴＡおよびゲル濾過によって精製した。Ｈ５は、Ｈ５及びフューリンバキュロウイルス系統の共感染によりｓｆ９細胞において発現させ、Ｎｉ-ＮＴＡ、陰イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィにて精製した。Ｈ５−Ｆ１０複合体は、Ｈ５を過剰量のＦ１０と混合することによって得、ゲル濾過にて単離した。結晶は、２２℃の懸滴蒸気拡散法を用いて、２μＬの複合体(およそ１１ｍｇ／ｍｌ)を、等しい体積の１２．５％ＰＥＧ １Ｋ、２５％エチレングリコール、１００ｍＭ トリス、ｐＨ８．５と混合することによって大きくした。結晶構造は、分子置換(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ)による３．２Å分解能で測定し、優れた幾何学を有する０．２９のＲ_ＦＲＥＥに精密化した。
【００９８】
データ採取、構造決定および分子構造精密化
Ｘ線回折データは、Stanford Synchrotron Radiation Laboratory(ＳＳＲＬ)ビーム−ライン７．１および９．２で採取した。データは、ＸＤＳ^７およびＨＫＬ２０００パッケージにて処理した。
Ｈ５−Ｆ１０複合体の構造は、探索モデルとして、Ｈ５(Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４；ＰＤＢコード２ＩＢＸ)の構造とＳＡＲＳ ｎＡｂ ８０Ｒ(ＰＤＢコード２ＧＨＷ)のｓｃＦｖ構造を使用したＰＨＡＳＥＲによる分子置換によって測定した。ｓｃＦｖ構造相同モデルをＷＨＡＴＩＦ９にて構築した。非対称性ユニットは２つのＨ５三量体および６つのＦ１０分子を含む。
分子置換の溶液は、ＣｏｏｔおよびＸｔａｌｖｉｅｗによる手動モデル再構築とＣＮＳにおける模擬アニーリングを有するプログラムＲＥＦＭＡＣ５による数ラウンドの分子構造精密化に用いた。最終モデルは、６つのＨＡコピーについてそれぞれ５０６／５０３／５０３／４９６／４９５／４９６残基、各ｎＡｂ１０について２３３残基、２４のＮ−アセチル−ｄ−グルコサミンおよび６ β−ｄ−マンノース、０の水分子を含む。幾何学的なパラメータは、ＰＲＯＣＨＥＣＫおよびＲａｍｐａｇｅにて評価した。
【００９９】
Ｈ５に対するｈＭａｂによるマウスの保護
すべてのマウス実験は、ＣＤＣ動物保護と使用委員会にて承認されるプロトコールに従って、ＵＳＤＡおよびＣＤＣ 公認の生物学的安全性レベル３(ＢＳＬ３)動物施設において実施した。雌８〜１０週齢のＢａｌｂ／Ｃマウス(１群につき５匹)をすべての実験に用いた。すべての群について、マウスを２週間観察し、加重させ、死亡を毎日確認した。
予防的マウス研究。１０ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇ^５３の２用量の３つのｈＭａｂ(Ｄ８-ＩｇＧ１、Ｆ１０−ＩｇＧ１およびＡ６６-ＩｇＧ１)又はコントロールｈＭａｂ ８０Ｒ−ＩｇＧ１をマウスの腹膜内に投与した(ｉ.ｐ.)。ｈＭａｂ投与の２４時間後に、すべてのマウス群を、軽い麻酔下で、１０ＭＬＤ_５０(５０％のマウス致死量)ウイルス用量のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４(Ｈ５Ｎ１)又はＡ／ＨＫ／４８３／９７(Ｈ５Ｎ１)を鼻腔内投与(ｉ.ｎ.)することにより抗原刺激した。
治療的マウス研究。マウスは、始めにＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４(Ｈ５Ｎ１)又はＡ／ＨＫ／４８３／９７(Ｈ５Ｎ１)の１０ＭＬＤ_５０にてｉ.ｎ.感染させた。次いで、１０ｍｇ／ｋｇのＨ５に対する３つのｈＭａｂまたはコントロールｈＭａｂを、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４(Ｈ５Ｎ１)感染の２４、４８および７２時間後にマウスに腹腔内投与した。Ａ／ＨＫ／４８３／９７(Ｈ５Ｎ１)感染マウスでは、ｈＭａｂをウイルス抗原刺激の２４時間後にのみ注入した。
【０１００】
抗Ｈ５ファージ抗体の同定。
ＨＡ１に対する抗体。精製した組み換えＨＡ１を用いて、２つの非免疫性ヒトｓｃＦｖライブラリから別々に抗体を選択した。ＨＡ１について２ラウンドの選別の後、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされた９６のうち５８のクローンは、ＨＡ１特異的なポジティブクローンであった。５８のＨＡ１ポジティブクローンの配列決定分析によって、３つの固有の抗ＨＡ１ ｓｃＦｖが同定された(３８Ｂおよび１Ｃ)。同種の選別およびスクリーニング実験を繰り返した。新規なクローンは同定されなかったが、上記と同じ３つのｓｃＦｖが得られた。２Ａのアミノ酸配列を図４に示す。
Ｈ５の外部ドメイン(ＨＡ０)に対する抗体。精製した組み換え三量体ＨＡ０を用いて、ＨＡ１について使用したのと同じ抗体ライブラリを選択した。ＨＡ０について２ラウンドの選別の後、ＥＬＩＳＡにより、ＨＡ０特異的結合について合計３９２のクローンがスクリーニングされた。９７のクローンはＨＡ０タンパク質を特異的に認識した。配列分析によって１０の固有の抗ＨＡ０ ｓｃＦｖ(７、８、１０、１７、４０、６６、８０、８８、９０および９８)が同定された。６の異なるＶＨと１０の異なるＶＬ遺伝子が明らかとなった(いくつかのｓｃＦｖは同じＶＨ遺伝子を共有していた)。６のうち５の異なるＶＨは、一つの遺伝子ファミリ、ＩＧＨＶ１−６９に属する。ＶＬ遺伝子はＶＨ遺伝子より非常に多様であり、１０のうち３つのＶＬはカッパ鎖である。(図４)。
【０１０１】
確実な単回ラウンドレポーターウイルスシステムの確立
Ｈ５-ＳＰ３３、Ｈ１−ＳＣ／１９１８又はＨ１−ＰＲ／３４によって偽型化したＨ５Ｎ１又はＨ１Ｎ１の単回ラウンドＨＩＶルシフェラーゼレポーターウイルスは、ｐｃＤＮＡ３.１-Ｈ５-ＳＰ３３、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ−ＰｏｌをコードするＨＩＶパッケージベクターｐＣＭＶ Ｒ８．２、ＨＩＶ−１ ＬＴＲのコントロール下にホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードしている導入ベクターｐＨＩＶ-Ｌｕｃ、及び発現プラスミドｐｃＤＮＡ３.１-Ｎ１である４つのプラスミドにより２９３Ｔ細胞を共形質移入することによって作製した。形質移入の３６時間後、ウイルス上清を回収し、４℃に保存した。ＨＡ０偽型ウイルスの力価は２９３Ｔ細胞を感染させて、測定した。偽型ウイルスを作製する形質移入においてＮ１発現プラスミドを含めることにより、Ｈ５偽型ウイルスの力価が劇的に増加しうる。Ｈ５偽型ウイルスの適切な行動はＨ５Ｎ１(Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／２００４)に対するフェレット免疫血清を使用して調べた。これらのウイルスは抗血清によって強力に中和されうるが、出血前(pre-bleeding)血清によっては中和されない。ゆえに、中和抗体の効率的なスクリーニングのために、確実な単回ラウンド高効率レポーターウイルスシステムが確立した。
【０１０２】
実施例２：Ｈ５-ＳＰ３３により偽型化されたウイルスを用いたＨ５Ｎ１に対する中和抗体の同定とマイクロ中和アッセイ
偽型化されたウイルスを用いた中和アッセイの結果。
抗Ｈ５抗体の二価のｓｃＦｖＦｃを産生し、ＨＡ０−偽型ウイルスに対する中和活性について試験した。我々は、２Ａが中程度の中和抗体であり、３８Ｂおよび１Ｃが中和抗体でないことを発見した(データは示さない)。以下に示す他のアッセイ(エピトープマッピング)のための有用な抗ＨＡ試薬として２Ａ抗体を用いた。ＨＡ０三量体を標的として使用して、我々はＨＡ０に対する１０の新規な固有の抗体を同定した。これらのＡｂは、我々の研究室において最近設けられた新しいハイスループットファージ-ｓｃＦｖスクリーニング法を用いて、中和活性についてスクリーニングした。簡単にいうと、個々のクローンのファージ-ｓｃＦｖを、直接中和アッセイに用いて、その後すぐに９６ウェルプレートにおいてポジティブクローンについてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。この計画では、中和活性は４８時間でみられるであろう。こうすることによって、我々は、時間を要する可溶性Ａｂのサブクローニングと発現の工程を回避する。
図に示されるように、ファージ-ｓｃＦｖによって示された中和Ａｂ(図６の上段左パネル)は、可溶性ｓｃＦｖＦｃ Ａｂにて確認した場合に強力に中和していることがわかった(図６の上段真ん中パネル)。ファージ-ｓｃＦｖによってスクリーニングされた１０すべての抗体は強力な中和Ａｂである。また、我々は、１０のうちの３つの抗体(Ｄ８、Ｆ１０およびＡ６６)を完全長ヒトＩｇＧ１に変換したところ、Ｈ５-ＳＰ３３偽型ウイルスにも強力な活性がみられた(図６の下段左パネル)。また、３つの抗体はＨ１Ｎ１を交差中和した。Ｈ１−ＳＣ／１９１８の強力に中和された菌株(図６の下段左パネル)およびＨ１−ＰＲ／３４の中程度に中和された菌株(図６の下段右パネル)。
【０１０３】
マイクロ中和アッセイの結果。図６の上段右パネルに示されるように、１０の抗Ｈ5抗体は異なるレベルの中和を表した。Ｆ１０−Ｆｃ、Ａ６６-Ｆｃ、Ｅ８８-ＦｃおよびＥ９０-Ｆｃは最も強力な阻害薬であるようであり、１０ｕｇ／ｍｌで１００００ｐｆｕウイルスの９５％以上、そして１ｕｇ／ｍｌで５０％以上を中和する。また、我々は、１０ｕｇ／ｍｌまたは１ｕｇ／ｍｌのこれら４つの抗体に１００ｐｆｕを用いた場合に完全なプラーク減少を観察した(データは示さない)。
１０の抗体(ｓｃＦｖ−Ｆｃ)は、この場合クレイド１ウイルス、Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／２−ＳＰ−３３／２００４(Ｈ５Ｎ１)のＨ５偽−ウイルス(表面にＨ５を提示するＨＩＶ−１コアのみを有するウイルス様粒子)(「Ｈ５-ＴＨ０４」)を中和することが明らかとなった。また、１０すべての抗体は、ストリンジェントなプラーク減少アッセイ(図９)においてＨ５-ＶＮ０４(クレイド１)およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５(「Ｈ５-ＩＮ０５」、クレイド２.１)ウイルスに対して高いが異なるレベルの中和を示したことから、中和エピトープ(一又は複数)は異なるＨ５クレイド間で保存されていることが示唆される。しかしながら、いずれのＡｂもグループ２ウイルス、ＨＰＡＩ Ｈ７Ｎ７株、Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／０３(Ｈ７Ｎ７)(Ｈ７-ＮＬ０３)を中和しなかった(図４)。
１０すべてのｎＡｂが三量体Ｈ５を結合し、互いに対して交差競合したことから(図１６)、これらのｎＡｂはオーバーラップするエピトープを認識することが示される。この発見とＶＨ配列多様性および中和作用強度に基づいて、３つのｎＡｂ(Ｄ８、Ｆ１０およびＡ６６)が選択され、完全長ヒトＩｇＧ１に変換した。３つすべてのｎＡｂ ＩｇＧ１は、高い親和性(Ｋｄおよそ１００〜２００ｐＭ)および非常に遅い解離速度(ｋｄおよそ１０^−４ｓ^−１)で、インビトロで組み換えＨ５(Ｈ５-ＶＮ０４)に結合した(図１７)。
【０１０４】
実施例３：ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ-１００を用いることによるＤ８-ＩｇＧ１、Ｆ１０−ＩｇＧ１およびＡ６６-ＩｇＧ１に対するＨＡ０(Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ１２０３／０４のＨＡの外部ドメイン)の結合の動態学的特徴づけ
Ｍａｂは抗ヒトＩｇＧ１によりＣＭ４チップに捕獲させ、様々な濃度(２０、１０、５、２．５、２．５、１．２５、０．６２５ｎＭ)の三量体ＨＡ０をチップ表面に注入した。結合動態は、１：１ラングミュア結合モデルを使用して評価した。記録された結合曲線(ブランク比較対象を減算したもの)を黒で、算出カーブを赤で示す。すべてのｋａ、ｋｄ、ＫＤは、３回の実験の平均と標準誤差を表す。我々は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００およびＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価用ソフトウェアを使用して、１:１ラングミュアモデルにフィッティングさせることによって、３つの抗ＨＡ ＭＡｂの動態学的速度および親和定数を決定した。下記の図に示すように、Ｄ８およびＦ１０では類似したｋａ、ｋｄおよびＫＤが観察され、Ａ６６はその他２つの抗体より相対的に速い解離速度のため、８および１０より１．８倍低いＫＤを有していた。ＭａｂとＨＡ０との複合体は安定しており、これは非常に遅い解離速度(８.８±１.１×１０^−５ｓ^−１〜１．８±０．３×１０^−４ｓ^−１)とｐＭレベルでＨ５三量体との高い親和性結合により示された。(図７)
【０１０５】
実施例４：抗Ｈ５抗体の予防的および治療的効果
Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１ウイルス感染に対するヒトｎＡｂの予防効果を、ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおいて評価した。マウスは、致死的ウイルス抗原刺激の前又は後に異なる用量のｎＡｂにて処置した。
予防効果(図７、ｂ、ｇ及びｈ)。マウスは、１０半致死量(ＭＬＤ_５０)のＨ５Ｎ１又はＨ１Ｎ１の鼻腔内投与(ｉ.ｎ.)による致死的抗原刺激の２４時間前に、抗Ｈ５ ｎＡｂ又はコントロールｍＡｂにて処置した。１０ｍｇ／ｋｇの３つのｎＡｂ何れかの腹膜内(ｉ.ｐ.) 投与により、Ｈ５-ＶＮ０４(Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４(Ｈ５Ｎ１)、クレイド１)にて抗原刺激したマウスは完全に予防された。低い抗体用量(２．５ｍｇ／ｋｇ)でも高い予防作用であった(図７ａ)。１０ｍｇ／ｋｇの３つのｎＡｂ何れかにて処置したマウスの８０〜１００％において、Ｈ５-ＨＫ９７(Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８３／９７(Ｈ５Ｎ１)、クレイド０)ウイルスに対する予防効果が観察された(図７ｂ)。３つ何れかのｎＡｂ(１０ｍｇ／ｋｇの単回注射)により、Ｈ１-ＷＳＮ３３(Ａ／ＷＳＮ／１９３３(Ｈ１Ｎ１))ウイルスにて抗原刺激したマウスが完全に予防された(図７ｇ)。１０ｍｇ／ｋｇの単回注射の場合、Ｄ８およびＦ１０は、Ｈ１-ＰＲ３４(Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４(Ｈ１Ｎ１))にて抗原刺激したマウスを完全に予防した。２５ｍｇ／ｋｇの抗体を単回注射した場合、Ａ６６はマウスを完全に予防した(図７ｈ)。
治療効果(図７ｃ−ｆ)。マウスにＨ５-ＶＮ０４を接種し、２４、４８、７２ｈｐｉ(図７ｃ、ｅおよびｆ)のｎＡｂ、または、２４ｈｐｉにＨ５-ＨＫ９７(図７ｄ)を注射した。接種後２４時間(２４ｈｐｉ)に１５ｍｇ／ｋｇ(ヒトにおいて治療上達成可能な用量)の３つのｎＡｂの何れかを腹腔内投与することにより、１０倍ＭＬＤ５０のＨ５-ＶＮ０４又はＨ５-ＨＫ９７ウイルスにて抗原刺激したマウスの８０〜１００％が予防された(図７ｃ−ｄ)。Ｈ５-ＶＮ０４にて４８又は７２ｈｐｉに同じ用量のｎＡｂにて処置したマウスは、類似又はより高いレベルの予防を示した(図７ ２ｅ−ｆ)。すべての抗Ｈ５ ｎＡｂ処置群における生存マウスは健康なままであり、２週間の診察期間にわたって体重損失は僅かであった(データは示さない)。
【０１０６】
実施例５：治療的動物実験における抗Ｈ５抗体による組織でのウイルス力価の抑制
更に、治療上用いられるｎＡｂの抗ウイルス効果を、局所的な複製の抑制の指標として肺での、又はＨ５Ｎ１感染の特徴である全身の蔓延を表す脾臓及び脳での、抗原刺激後４日目のウイルス力価を測定することによって調べた。ｎＡｂは、抗原刺激後４８時間内に投与された場合、コントロールと比較して、Ｈ５ ｎＡｂ処置マウスの肺におけるウイルス複製を有意に抑制した(図１２)。特に、Ｄ８およびＦ１０の２つのｎＡｂは７２ｈｐｉに投与された場合抗ウイルス効果を示した。脳への全身性ウイルス蔓延はコントロール動物において低く、ｎＡｂ治療の何らかの効果を不明瞭にするものであった。しかしながら、３つのｎＡｂが７２ｈｐｉ以内に投与される場合であってもウイルスの脾臓への蔓延が１０００倍以上抑制されることから、ｎＡｂ治療の全身蔓延に対する劇的な効果が示された。
【０１０７】
実施例６：抗体Ｄ8、Ｆ１０およびＡ66の初期エピトープマッピング
Ｈ５-ＳＰ３３の、様々な完全長野生型ＨＡおよびＨＡ変異発現プラスミドを、２９３Ｔ細胞に過渡的に形質移入した。形質移入の４８時間後に、抗Ｈ５抗体(１０ｕｇ／ｍｌ)を、形質移入した２９３Ｔ細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳにて３回洗浄した。ＨＡ形質移入細胞に対する抗Ｈ５抗体の結合の検出のために、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｐｉｅｒｃｅ)を二次抗体として用い、細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。各変異体の発現を示すために、抗体２Ａをコントロール抗体として用いた。以下の表からわかるように、Ｍａｂ Ｄ８、１Ｆ０およびＡ６６のエピトープは類似しており、ＨＡ１上の位置３０７およびＨＡ２上の５２、５９、６５、９３に位置している。これらのアミノ酸の位置は、Ｈ５(Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４(Ｈ５Ｎ１))の結晶構造において強調して示す。
【０１０８】
実施例７：クラスターＨ1ウイルスの結合と中和。
Ｈ５Ｎ１ウイルスの交差クレイド中和(図４)により、グループ１ Ｈ１クラスター内の他のＨＡサブタイプの中和についての試験を行った(図１１)。３つすべてのｎＡｂは、完全長Ｈ１(Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８(Ｈ１Ｎ１)(「Ｈ１-ＳＣ１９１８」)及びＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４(Ｈ１Ｎ１)(「Ｈ１-ＰＲ３４」))、Ｈ２(Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／５７(Ｈ２Ｎ２))(「Ｈ２-ＪＰ５７」)、Ｈ６(Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１４６７７-１３／１９９８(Ｈ６Ｎ２))(Ｈ６-ＮＹ９８)を発現する細胞には結合したが、グループ２サブタイプ、Ｈ７((Ａ／ＦＰＶ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４(Ｈ７Ｎ１)(「Ｈ７-ＦＰ３４」))には結合しなかった(図４)。また、これらは、Ｈ１-ＳＣ１９１８−及びＨ１−ＰＲ３４−偽型ウイルス感染も中和した(図４)。加えて、Ｆ１０は、ＰＲ３４(Ｈ１Ｎ１)、Ａ／Ｏｈｉｏ／８３(Ｈ１Ｎ１)(「Ｈ１-ＯＨ８３」)およびＡ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０(Ｈ２Ｎ２)感染を中和した(図４)。これらの結果から、これらのｎＡｂがＨ５クレイドの間で高く保存されているだけでなく、Ｈ１、Ｈ２およびＨ６サブタイプ及び他のクラスター内の潜在的なサブタイプにも存在するＨＡ上のエピトープを認識することが示唆される。したがって、我々は、ウイルス中和のメカニズムを詳細に調査することに決めた。
【０１０９】
実施例８：ｎＡｂは細胞融合を阻害するがウイルス結合を阻害しない。
抗ＨＡ Ａｂが中和を媒介する２つの方法は、その細胞レセプターへのＨＡ結合をブロックすることと、低ｐＨにより誘導されるＨＡの立体構造変化を妨げることによるウイルス−宿主膜融合の阻害である。我々は、３つのｎＡｂは細胞へのウイルス結合に影響せず、また血球凝集反応(赤血球の結合および架橋結合)も阻害しなかったのに対して、血球凝集反応を阻害するマウス抗Ｈ５ ｎＡｂ、１７Ａ２.１.２およびフェレット抗Ｈ５Ｎ１血清はバックグラウンドレベルにまで結合を低減した。
次に、我々は、Ｈ５-ＴＨ０４のＨ５とＮ１との発現プラスミドが高密度の２９３Ｔ細胞に同時形質移入されているモデルシステムを用いて、宿主細胞膜の融合を阻害するｎＡｂの能力を試験した。表面に発現されたウイルスタンパク質によって細胞が融合し、融合細胞が形成される。これは、通常の培養条件下で形質移入後３６〜４８時間以内に自発的に起こる。形質移入の６時間後にｎＡｂを添加し、３６時間後に観察した場合、３つすべての場合において融合細胞形成の完全な阻害が観察された。ｎＡｂがない場合、形質移入の３０時間目に酸性培地(ｐＨ５)に短時間(３〜４分)さらした細胞はたくさんの融合細胞を形成する。また、ｎＡｂ(５μｇ／ｍｌ)は、これらの条件下で融合細胞形成を完全に妨げた(データは示さない)。まとめると、これらの結果は、３つすべてのｎＡｂは、レセプター結合を妨げることなく膜融合を阻害することを示す。
【０１１０】
実施例９：ｎＡｂエピトープの構造的特徴づけ
次に、我々は、３．２Å分解能のＨＡ(Ｈ５-ＶＮ０４)と複合体化したｓｃＦｖ断片の結晶構造の解析と突然変異により、ｎＡｂの一つであるＦ１０の結合のエピトープと様式を決定した。(図６および表４)。
複合体では、各Ｈ５三量体は、抗体１つにつきタンパク質表面のおよそ１５００Å^２を覆っている対称性関連部位で、Ｆ１０の３つの分子を結合する。Ｈ５自体の構造はＦ１０結合によってほとんど変わらない。ＨＡは、ＨＡ１およびＨＡ２の２つのサブユニットへのタンパク分解性切断によって活性化される、単鎖、ＨＡ０として合成される。切断により、膜近位のステムに「融合ペプチド」(ＨＡ２の始めのおよそ２１残基を含む)が覆われる。Ｆ１０結合はもっぱらこの領域で起こり(図６)、融合ペプチド、中性ｐＨ立体構造内の場所にペプチドを固定するＨＡ１とＨＡ２の成分(いずれもこの領域の構造に不可欠なもの)、並びに酸性ｐＨで多くの立体構造変化を受けるＨＡ２の大きならせん状ヘアピンと密接に接触し、これによりウイルス膜近位のポケットからウイルスの遠位の表面へ融合ペプチドが押し出される。これはエンドソーム膜との融合の引き金となりうる。
【０１１１】
Ｆ１０の重鎖はＨ５結合において主に働くことから、その３つの相補性決定領域(ＣＤＲ)の先端を利用する。各々のＦ１０分子は、ＨＡ三量体の一つの単量体内でＨＡ１及びＨＡ２サブユニットの両方と接触する(図６)。接触領域はＨＡ２融合ペプチドの一部によって形成されるポケットを含み、一端にＨＡ１の成分を他端にＨＡ２のヘリックスαＡの露出面を有する(図４および６)。３組の抗体残基−ＣＤＲ Ｈ２のＦ５５とＭ５４、及びＣＤＲ Ｈ３のＹ１０２は主要な接触点を形成する。Ｆ５５のフェニル環は、融合ペプチドループの突出ループ(ＨＡ２残基ＤＧＷ１９_２−２１_２(Ｈ３番号付けスキーム；下付き文字１および２はＨＡ１鎖およびＨＡ２鎖を指す))と、２つの隣接ヒスチジン(残基１８１および３８１)及びトリプトファン、Ｗ２１_２の芳香族側鎖とによって形成される平坦表面全体に位置する。また、Ｍ５４の側鎖は、Ｗ２１_２およびＨ３８_１の芳香族環、並びにヘリックスＡのＩ４５_２の側鎖と接触するのに対して、その主鎖はＨ３８_１の側鎖とカルボニル酸素水素結合する。Ｙ１０２は、その側鎖を、Ａヘリックスの４つの側鎖によって造られる疎水性クレバスに嵌入し、更に、融合ペプチドの主鎖カルボニル(Ｄ１９_２)に水素結合する。ＣＤＲ Ｈ１ループは、ヘリックスαＡのＣ末端と先端領域の基部のＨＡ１のループと複数接触する(図１２ｄ、ｅ)。
並行して、エピトープ決定の補助のためにらせんαＡについて突然変異誘発実験を行った(図６)。抗体と直接接触する３つの残基の突然変異：Ｖ５２Ａ／Ｅ、Ｎ５３ＡおよびＩ５６Ａは抗体結合を有意に低減するか又は抗体結合を除くが、保存的突然変異であるＶ５２Ｌは影響を及ぼさなかった。コントロールとして、抗体と接触しないらせんの異なる露出面上の突然変異は抗体結合に影響を及ぼさなかった(図１２ｂ−ｃ)。ゆえに、αＡヘリックスの突然変異誘発は、Ｆ１０のために結晶学的に定められるエピトープと、十分に一致している。さらに、その他の２つのｎＡｂはほぼ同じ変異体−ｎＡｂ結合プロファイルを示したことから(構造的データは存在しない)、密接に重なり合うエピトープと、競合的結合との一致を示唆する(図６、図９)。まとめると、我々は、膜融合の状態を引き起こす立体構造変化の引き金(多くの場合ポケットからの融合ペプチドの放出)となる領域においてＨＡの中性ｐＨ立体構造を安定させることによって、３つすべてのｎＡｂが、ウイルスを中和したと結論づける。
【０１１２】
実施例１０：広域スペクトル中和の構造的基本
Ｆ１０エピトープによって定められるＨＡの領域は、１６のＨＡサブタイプ間で高く保存されている(図６および表５)。融合ペプチドは、中性ｐＨ立体構造においても膜融合の過程の間においても明確な構造をとっており、突然変異誘発研究により許容される配列変化はほとんどないことが示された。また、ＨＡ２ αＡの露出したらせん状の表面は、両群全体でほとんど変化していない。その理由はおそらく、その表面が、膜融合状態において長い三量体のコイルドコイルの内側表面を形成するために再編成されるためであろう。ゆえに、２つの異なる環境において２つの非常に異なる構造を取るためのこれらセグメントの必要性はおそらく、配列に対する進化の上での強い制約であり、１６のＨＡサブタイプにわたる保存の明確な理論的根拠となりうる。
グループ１のサブタイプＨ１、Ｈ５およびＨ９、そしてグループ２のＨ３およびＨ７について結晶構造を決定し、構造を、系統発生分析によって定まる２つのグループと一致する２つの異なるクラスに分けた。更なる比較により、２つのクラスがＦ１０エピトープによって定まる領域内の詳細な三次元レベルで容易に区別されることが示唆される。各々のクラスの特徴であるコア内に覆われた２、３の重要なアミノ酸(例えば１７_１および１１１_２)において配列が異なることにより、エピトープ内の様々な側鎖の定位と、らせんαＡに関するポケットの配置が一致して異なる。
各グループ／クラス内で、エピトープ領域は高く保存されており、所定のクラスター内の相違が非常に僅かであり、たった２、３しか変化しておらず、一般にクラスター間で保存されている(例えば位置１８_１および３８_１、図６ａ)。３つのｎＡｂがＨ１クラスターの４つすべてのメンバーを認識しうるという我々の所見は、エピトープ周辺でのアミノ酸相違(このクラスターではＫ、Ｑ又はＶである残基４０１など)は結合に重要でないことを示す。
我々が選択した１０の抗体は、実質的に配列と長さが異なる異なる５セットのＶＨ ＣＤＲ１−３を有している。しかしながら、ポケット内に挿入するＣＤＲ２(Ｍ５４、Ｆ５５)およびＣＤＲ３(Ｙ１０２)の３つの重要な残基は保存されている。変化したＣＤＲ内の重要な残基の保存は、ここで試験したものを越えて、ｎＡｂのこのグループによるＨＡサブタイプ／クラスター認識の範囲を拡大するものであってよい。しかしながら、６のうち４つのグループ２サブタイプは位置３８１でグリコシル化されており、Ｆ１０エピトープ周辺に位置していることは注目すべきことである。モデリング研究は立体的衝突(しかし、ＣＤＲ Ｈ１ループとのみ)を予測するものであり、それはおそらくＨ７ウイルスの結合／中和の欠如の観察に貢献するであろう。
【０１１３】
実施例１１：抗Ｈ５ ｎＡｂはグループ１ＨＡサブタイプの広範囲に結合する
グループ１ウイルスはインフルエンザＡウイルスの合計１６のうち１０のサブタイプを含み、さらに３つの「クラスター」、Ｈ１ａ、Ｈ１ｂおよびＨ９に分類される。我々は、グループ２サブタイプＨ３を除き、トリＨ５と最も一般的なヒトインフルエンザサブタイプを含む、クラスターＨ１ａおよびＨ１ｂの７つすべてのＨＡサブタイプへの結合について我々のｎＡｂを試験した。Ｈ５に加えて、我々は、３つすべてのｎＡｂ ＩｇＧ１が、１９１８の「スペインのインフルエンザ」；Ｈ２Ｎ２のＨ２；及びＨ６Ｎ２からのＨ６；並びにクラスター１ｂサブタイプ：Ｈ１１Ｎ９のＨ１１；Ｈ１３Ｎ６のＨ１３；及びＨ１６Ｎ３のＨ１６を含む、Ｈ１Ｎ１の２つの異なる菌株の完全長Ｈ１を発現する細胞に結合したことを発見した。しかしながら、これらはいずれも、グループ２サブタイプ、Ｈ７Ｎ１のＨ７には結合しなかった(図１３)。図１３についての詳細を以下に示す。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６(クラスタＨ１ａ)およびＨ１１、Ｈ１３およびＨ１６(クラスタＨ１ｂ)への抗Ｈ５ ｎＡｂ結合のＦＡＣＳ分析。２９３Ｔ細胞は、異なるＨＡ発現プラスミドを過渡的に形質移入した。細胞へのＮＡｂ結合はＦＡＣＳによって分析した。Ｈ５-特異的抗体２Ａおよび８０Ｒはネガティブコントロールである。グループ２ＨＡ、Ｈ７への結合の欠如も示される。ウイルス株についての詳細は以下の通りである。Ｈ１-ＳＣ１９１８((Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８(Ｈ１Ｎ１)) Ｈ１-ＰＲ３４(Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４(Ｈ１Ｎ１))、Ｈ２-ＪＰ５７(Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／５７(Ｈ２Ｎ２))、Ｈ５-ＴＨ０４(Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／２−ＳＰ−３３／２００４(Ｈ５Ｎ１))、Ｈ６-ＮＹ９８(Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１４６７７-１３／１９９８(Ｈ６Ｎ２))、Ｈ７-ＦＰ３４(Ａ／ＦＰＶ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４(Ｈ７Ｎ１))、Ｈ１１-ＭＰ７４(Ａ／Ｄｕｃｋ／ｍｅｍｐｈｉｓ／５４６／７４(Ｈ１１Ｎ９))、Ｈ１３-ＭＤ７７(Ａ／Ｇｕｌｌ／ＭＤ／７０４／７７(Ｈ１３Ｎ６))、およびＨ１６-ＤＥ０６(Ａ／Ｓｈｏｒｅｂｉｒｄ／ＤＥ／１７２／０６(Ｈ１６Ｎ３))。
【０１１４】
参考文献
1. W.H.O. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/2003/fs211/en/. World Health Organization factsheet 211: influenza (2003 ).
2. Webster, R. G. 1918 Spanish influenza: the secrets remain elusive. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 1164-6 (1999).
3. de Wit, E. & Fouchier, R. A. Emerging influenza. J Clin Virol 41, 1-6 (2008).
4. Wright, P., Neumann, G. & Kawaoka, Y. in Fields Virology (eds. Knipe, D., Howley, P., Griffin, D., Lamb, R. & Martin, M.) 1692-1740 (Lippincott Williams & Wilkins 2006).
5. Fauci, A. S. Pandemic influenza threat and preparedness. Emerg Infect Dis 12, 73-7 (2006).
6. Fouchier, R. A. et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol 79, 2814-22 (2005).
7. Ha, Y., Stevens, D. J., Skehel, J. J. & Wiley, D. C. H5 avian and H9 swine influenza virus haemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes. Embo J 21, 865-75 (2002).
8. Russell, R. J. et al. H1 and H7 influenza haemagglutinin structures extend a structural classification of haemagglutinin subtypes. Virology 325, 287-96 (2004).
9. W.H.O. (http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/summaryH520070403.pdf, 2007).
10. W.H.O. Evolution of H5N1 avian influenza viruses in Asia. Emerg Infect Dis 11, 1515-21 (2005).
11. Subbarao, K. et al. Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness. Science 279, 393-6 (1998).
12. de Jong, J. C., Claas, E. C., Osterhaus, A. D., Webster, R. G. & Lim, W. L. A pandemic warning? Nature 389, 554 (1997).
13. W.H.O. http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/en/. (2008).
14. Nicholson, K. G. et al. Safety and antigenicity of non-adjuvanted and MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a randomised trial of two potential vaccines against H5N1 influenza. Lancet 357, 1937-43 (2001).
15. Stephenson, I. et al. Cross-reactivity to highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses after vaccination with nonadjuvanted and MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a potential priming strategy. J Infect Dis 191, 1210-5 (2005).
16. Stephenson, I. et al. Boosting immunity to influenza H5N1 with MF59-adjuvanted H5N3 A/Duck/Singapore/97 vaccine in a primed human population. Vaccine 21, 1687-93 (2003).
17. Treanor, J. J., Campbell, J. D., Zangwill, K. M., Rowe, T. & Wolff, M. Safety and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine. N Engl J Med 354, 1343-51 (2006).
18. Treanor, J. J. et al. Safety and immunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5 influenza in humans. Vaccine 19, 1732-7 (2001).
19. Bresson, J. L. et al. Safety and immunogenicity of an inactivated split-virion influenza A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) vaccine: phase I randomised trial. Lancet 367, 1657-64 (2006).
20. Lin, J. et al. Safety and immunogenicity of an inactivated adjuvanted whole-virion influenza A (H5N1) vaccine: a phase I randomised controlled trial. Lancet 368, 991-7 (2006).
21. W.H.O. http://www.who.int/csr/disease/influenza/influenzanetwork/en/index.html. (2008).
22. Carrat, F. & Flahault, A. Influenza vaccine: the challenge of antigenic drift. Vaccine 25, 6852-62 (2007).
23. Cinatl, J., Jr., Michaelis, M. & Doerr, H. W. The threat of avian influenza A (H5N1). Part IV: Development of vaccines. Med Microbiol Immunol 196, 213-25 (2007).
24. Subbarao, K. & Luke, C. H5N1 viruses and vaccines. PLoS Pathog 3, e40 (2007).
25. Leroux-Roels, I. et al. Broad Clade 2 Cross-Reactive Immunity Induced by an Adjuvanted Clade 1 rH5N1 Pandemic Influenza Vaccine. PLoS ONE 3, e1665 (2008).
26. Baras, B. et al. Cross-Protection against Lethal H5N1 Challenge in Ferrets with an Adjuvanted Pandemic Influenza Vaccine. PLoS ONE 3, e1401 (2008).
27. Marasco, W. A. & Sui, J. The growth and potential of human antiviral monoclonal antibody therapeutics. Nat Biotechnol 25, 1421-34 (2007).
28. Stevens, J. et al. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus. Science 312, 404-10 (2006).
29. Sui, J. et al. Potent neutralization of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus by a human mAb to S1 protein that blocks receptor association. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2536-41 (2004).
30. Huang, C. C. et al. Structural basis of tyrosine sulfation and VH-gene usage in antibodies that recognize the HIV type 1 coreceptor-binding site on gp120. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2706-11 (2004).
31. Skehel, J. J. & Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem 69, 531-69 (2000).
32. Kida, H., Yoden, S., Kuwabara, M. & Yanagawa, R. Interference with a conformational change in the haemagglutinin molecule of influenza virus by antibodies as a possible neutralization mechanism. Vaccine 3, 219-22 (1985).
33. Vanlandschoot, P. et al. An antibody which binds to the membrane-proximal end of influenza virus haemagglutinin (H3 subtype) inhibits the low-pH-induced conformational change and cell-cell fusion but does not neutralize virus. J Gen Virol 79 ( Pt 7), 1781-91 (1998).
34. Su, Y., Zhu, X., Wang, Y., Mu, M. & Tien, P. Evaluation of Glu11 and Gly8 of the H5N1 influenza hemagglutinin fusion peptide in membrane fusion using pseudotype virus and reverse genetics. Acta Virol 153, 247-257 (2008).
35. Yamada, S. et al. Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors. Nature 444, 378-82 (2006).
36. Stevens, J. et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science 303, 1866-70 (2004).
37. Daniels, R. S. et al. Fusion mutants of the influenza virus hemagglutinin glycoprotein. Cell 40, 431-9 (1985).
38. Thoennes, S. et al. Analysis of residues near the fusion peptide in the influenza hemagglutinin structure for roles in triggering membrane fusion. Virology 370, 403-14 (2008).
39. Earp, L. J., Delos, S. E., Park, H. E. & White, J. M. The many mechanisms of viral membrane fusion proteins. Curr Top Microbiol Immunol 285, 25-66 (2005).
40. Godley, L. et al. Introduction of intersubunit disulfide bonds in the membrane-distal region of the influenza hemagglutinin abolishes membrane fusion activity. Cell 68, 635-45 (1992).
41. Bullough, P. A., Hughson, F. M., Skehel, J. J. & Wiley, D. C. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 371, 37-43 (1994).
42. Ha, Y., Stevens, D. J., Skehel, J. J. & Wiley, D. C. X-ray structures of H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human receptor analogs. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 11181-6 (2001).
43. Wilson, I. A., Skehel, J. J. & Wiley, D. C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature 289, 366-73 (1981).
44. Kashyap, A. K. et al. Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. . Proc Natl Acad Sci U S A Early edition (2008).
45. Huang, I. C. et al. Influenza A virus neuraminidase limits viral superinfection. J Virol (2008).
46. Glaser, L. et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol 79, 11533-6 (2005).
47. Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D. & Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 11382-8 (1996).
48. Rowe, T. et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol 37, 937-43 (1999).
【０１１５】

【０１１６】

【０１１７】

【０１１８】
他の実施態様
本明細書中では特定の実施態様を詳細に開示したが、これは例示のみを目的とするものであって、以下に続く添付の特許請求の範囲を限定するものではない。特に、特許請求の範囲によって定められる本発明の精神及び権利範囲を逸脱することなく、本発明に様々な置き換え、変更および修飾がなされうることは発明者が意図するものである。他の態様、便宜及び修飾は以下の特許請求の範囲内であるとみなされる。示される特許請求の範囲は、本明細書において開示される本発明の代表である。他の特許請求の範囲に記載していない発明もまた包含される。出願人は、後の特許請求の範囲の発明を取得する権利を保有する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(ＨＡ)タンパク質のステム領域のエピトープに結合し、インフルエンザＡウイルスを中和する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルスがグループＩインフルエンザウイルスである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記インフルエンザウイルスがＨ１クラスターインフルエンザウイルスである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記Ｈ１クラスターインフルエンザウイルスがＨ１ａクラスターインフルエンザウイルス又はＨ１ｂクラスターインフルエンザウイルスである、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記エピトープが非線形である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記エピトープがＨＡ１とＨＡ２のポリペプチドを含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
エピトープが、ＨＡ１ポリペプチドの位置１８、３８、４０、２９１のアミノ酸と、ＨＡ２ポリペプチドの位置１８、１９、２０、２１、３８、４１、４２、４５、４９、５２、５３および５６のアミノ酸を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体がウイルスと細胞の膜融合を阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０又はＨ９８のＨＡタンパク質への結合と競合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が完全なヒト抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(ＨＡ)タンパク質のエピトープに結合し、インフルエンザＡウイルスを中和する、単離されたｓｃＦｖ抗体。
【請求項１２】
前記インフルエンザウイルスがグループＩインフルエンザウイルスである、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記インフルエンザウイルスがＨ１クラスターインフルエンザウイルスである、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
前記Ｈ１クラスターインフルエンザウイルスがＨ１ａクラスターインフルエンザウイルスである、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
前記エピトープが非線形である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１６】
エピトープがＨＡ１とＨＡ２のポリペプチドを含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１７】
エピトープが、ＨＡ１ポリペプチドの位置１８、３８、４０、２９１のアミノ酸と、ＨＡ２ポリペプチドの位置１８、１９、２０、２１、３８、４１、４２、４５、４９、５２、５３および５６のアミノ酸を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体がウイルスと細胞の膜融合を阻害する、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、モノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０又はＨ９８のＨＡタンパク質への結合と競合する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患又は疾病の予防方法であって、前記疾患又は疾病を患うリスクにあるヒトに、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は請求項１１に記載のｓｃＦｖ抗体の治療上の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２１】
抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害薬又はウイルス接着阻害薬を投与することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗ウイルス薬が、ノイラミニダーゼ阻害薬、 ＨＡ阻害薬、シアル酸阻害薬又はＭ２イオンチャネルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｍ２イオンチャネル阻害薬がアマンタジン又は リマンタジンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ノイラミニダーゼ阻害薬がザナミビル又は リン酸オセルタミビルである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
グループＩインフルエンザウイルスに特異的な２以上の抗体を投与することを含む、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
グループＩＩインフルエンザウイルスに特異的な抗体を投与することを更に含む、請求項２０、請求項２１又は請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がインフルエンザウイルスへの曝露の前又はその後に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、 前記インフルエンザウイルスを中和するために十分な用量で投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患又は疾病の治療方法であって、前記疾患又は疾病を患うリスクにあるヒトに、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は請求項１１に記載のｓｃＦｖ抗体の治療上の有効量を投与することを含む方法。
【請求項３０】
抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害薬又はウイルス接着阻害薬を投与することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ウイルス薬が、ノイラミニダーゼ阻害薬、ＨＡ阻害薬、シアル酸阻害薬又はＭ２イオンチャネルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｍ２イオンチャネル阻害薬がアマンタジン又はリマンタジンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ノイラミニダーゼ阻害薬がザナミビル又はリン酸オセルタミビルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
グループＩインフルエンザウイルスに特異的な２以上の抗体を投与することを含む、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
グループＩＩインフルエンザウイルスに特異的な抗体を投与することを更に含む、請求項２９、請求項３０又は請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体がインフルエンザウイルスへの曝露の前又はその後に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、 前記インフルエンザウイルスを中和するために十分な用量で投与される、請求項２９に記載の方法 。
【請求項３８】
請求項１に記載のモノクローナル抗体又は請求項１１に記載のｓｃＦｖ抗体と担体を含む組成物。
【請求項３９】
抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害薬又はウイルス接着阻害薬を更に含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗ウイルス薬が、ノイラミニダーゼ阻害薬、 ＨＡ阻害薬、シアル酸阻害薬又はＭ２イオンチャネルである、 請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記Ｍ２イオンチャネル阻害薬がアマンタジン又は リマンタジンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ノイラミニダーゼ阻害薬がザナミビル又はリン酸オセルタミビルである、 請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
グループＩインフルエンザウイルスに特異的な２以上の抗体を更に含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４４】
グループＩＩインフルエンザウイルスに特異的な抗体を更に含む、請求項３８、請求項３９又は請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
インフルエンザウイルスに特異的な抗体の同定方法であって、
固形表面に固定されている三量体ヘマグルチニン(ＨＡ)タンパク質を試験抗体と接触させることと、そしてＨＡタンパク質−抗体複合体を検出することを含む方法。
【請求項４６】
前記固形表面が可塑性である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＨＡタンパク質が非哺乳動物細胞において生産される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＨＡタンパク質が昆虫細胞において生産される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＨＡタンパク質が、野生型ＨＡタンパク質に比べて変更したグリコシル化を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＨＡタンパク質が、前記ＨＡタンパク質の球状上部をマスキングするように前記固形表面上で固定されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
三量体ヘマグルチニン(ＨＡ)タンパク質を特異的に結合する単離された抗体の製造方法であって、(ａ)固形表面に固定されているＨＡタンパク質に単鎖又はＦａｂ発現ライブラリをさらし、(ｂ)該タンパク質を特異的に結合する該ライブラリ中の抗体を同定し、そして、(ｃ)抗体をライブラリから単離することを含む方法。
【請求項５２】
前記固形表面が可塑性である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＨＡタンパク質が非哺乳動物細胞において生産される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＨＡタンパク質が、野生型ＨＡタンパク質に比べて変更したグリコシル化を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＨＡタンパク質が、前記ＨＡタンパク質の球状上部をマスキングするように前記固形表面上で固定されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記発現ライブラリが非免疫性ライブラリである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記発現ライブラリがＨ５ナイーブライブラリである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
インフルエンザウイルスに対する被検体の予防接種方法であって、生物学的に適合したマトリックスにコート又は包埋された三量体ヘマグルチニン(ＨＡ)タンパク質を被検体に投与することを含む方法。
【請求項５９】
前記ＨＡタンパク質が非哺乳動物の糖鎖構造を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＨＡタンパク質が、野生型ＨＡタンパク質に比べて変更したグリコシル化を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＨＡタンパク質が、前記ＨＡタンパク質の球状上部をマスキングするように前記生物学的に適合したマトリックスにコート又は包埋されている、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
病原性エンベロープウイルスを特異的に結合する単離された抗体の製造方法であって、(ａ)固形表面に固定されている、ウイルスの膜融合タンパク質に単鎖又はＦａｂ発現ライブラリをさらし、(ｂ)該タンパク質を特異的に結合する該ライブラリ中の抗体を同定し、そして、(ｃ)抗体をライブラリから単離することを含む方法。
【請求項６３】
前記固形表面が可塑性である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記膜融合タンパク質が非哺乳動物細胞において生産される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記膜融合タンパク質が非哺乳動物の糖鎖構造を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記膜融合タンパク質が、野生型膜融合タンパク質に比べて変更したグリコシル化を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記発現ライブラリが非免疫性ライブラリである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記発現ライブラリがＨ５ナイーブライブラリである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
病原性エンベロープウイルスに対する被検体の予防接種方法であって、生物学的に適合したマトリックスにコート又は包埋された、ウイルスの膜融合タンパク質を被検体に投与することを含む方法。
【請求項７０】
前記融合タンパク質が非哺乳動物の糖鎖構造を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記融合タンパク質が、野生型膜融合タンパク質に比べて変更したグリコシル化を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
試料中のインフルエンザウイルスの存在の検出方法であって、
ａ) 試料を請求項に記載のモノクローナル抗体と接触させ、そして、ｂ) 抗体−抗原複合体の有無を検出し、このことにより試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出することを含む方法。
【請求項７３】
検出がインビボで起こる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
試料が血液、体毛、頬擦過物、唾液、生検又は精液から得られる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
ＶＨ生殖系遺伝子ＩＧＨＶ１-６９*０１によってコードされるＶＨアミノ酸配列を含み、ａ) 位置２７のアミノ酸がバリンであり、ｂ) 位置２８のアミノ酸がスレオニンであり、ｃ) 位置３０のアミノ酸がセリンであり、ｄ) 位置３１のアミノ酸がセリンであり、ｅ) 位置５４のアミノ酸がメチオニンであり、ｆ) 位置５５のアミノ酸がフェニルアラニンであり、ｇ) 位置５８のアミノ酸がスレオニンであり、ｈ) 位置１００のアミノ酸がプロリンであり、ｉ) 位置１０１のアミノ酸がセリンであり、ｊ) 位置１０２のアミノ酸がチロシンであり、ｋ) 位置１０３のアミノ酸がイソロイシンであり、位置１０５のアミノ酸がセリンであり、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(ＨＡ)タンパク質のステム領域のエピトープに結合して、インフルエンザＡウイルスを中和する、単離されたモノクローナル抗体。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図５】

【図６Ａ−Ｂ】

【図６Ｃ−Ｄ】

【図６Ｅ】

【図７Ａ−Ｃ】

【図７Ｄ−Ｆ】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【公表番号】特表２０１１−５０６３４４（Ｐ２０１１−５０６３４４Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３７１４３（Ｐ２０１０−５３７１４３）
【出願日】平成２０年１２月８日（２００８．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８５８７６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７９２５９
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５９１１８３９９１）ダナ−ファーバー　キャンサー　インスティテュート，インコーポレイテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＡ−ＦＡＲＢＥＲ　ＣＡＮＣＥＲ　ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ，　ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０８２３６８４８）バーナム　インスティテュート　フォー　メディカル　リサーチ (9)
【Ｆターム（参考）】