インプラント用の、ＤＮＡをベースとしたコーティング
本発明は、移植部位における組織反応を改善するための、ＤＮＡを含有するコーティングを有するインプラントに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インプラント移植部位における組織反応を改善するコーティングを有するインプラントの分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
インプラント学においては、満足な特性を備えた生物医学デバイスを製造するために多様な材料が用いられている。適用の際の適合性を決定するのは主に材料のバルク特性であるが、生物学的反応は、主にその生体材料表面における、周囲の生体環境中の成分との相互作用により決まる。生体材料表面の修飾はここ数十年の主流な研究テーマであり、生物学的反応を改善するために、生体材料表面を効果的に修飾する多くの技術が開発されてきた。その例として、骨インプラント用のリン酸カルシウム析出法や、生体化合物及び／又は医薬品の認識部位を生体材料表面に導入する技術を挙げることができる。前者の技術は骨インプラントの生物活性を顕著に上昇させ（非特許文献１及び２）、一方、後者の技術は細胞の（初期）接着を改善し、生物学的反応に重要な修飾化合物（例えば、サイトカインや成長因子）の移植部位における特異的な送達方法を提供した（非特許文献３及び４参照）。
【０００３】
ＤＮＡ（遺伝子）送達のための非ウイルス性ベクターとして登場した、カチオン性ポリマーとＤＮＡとの高分子電解質複合体についての概念が広がってきており、特許文献１は、治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだポリマー・マトリックスでコーティングしたステントを開示している。動脈細胞によりレポーター酵素が実際に発現されることが実証されており、これはＤＮＡが確かにポリマー・マトリックスから細胞に入ったことを意味している。この方法では、ＤＮＡがマトリックスから離れて、コーティングしていた物を覆わなくなってしまうので、移植された組織内に定着する必要があるインプラントには好ましくない。
【０００４】
また、遺伝情報のためではなく、機能性生体材料としてのＤＮＡの使用が既に示唆されており（非特許文献５及び６）、先駆者的努力の結果、ＤＮＡを含有するバルク（生体）材料、特にＤＮＡ−脂質コンプレックスをキャストすることで作製される自立性のＤＮＡ脂質膜が製造され（非特許文献７）、これはラット背部に皮下移植しても副作用を起こさないことが示されている。
【０００５】
特許文献２は、機能化した表面を有するインプラントを開示している。炭素を含有する層をインプラント上に付加し、酸化及び／又は還元反応によってこの層を活性化して多孔性にし、続いて、この活性化された炭素をＤＮＡ等の添加によって機能化している。
【０００６】
特許文献３は、金属水素化物（すなわち、水素化チタン、水素化ジルコニウム、水素化タンタル、水素化ハフニウム、ニオブ水素化物、クロム水素化物、又はバナジウム水素化物）層に結合されたＤＮＡ等でコーティングされた、生体適合性の改善されたインプラントを開示している。
【０００７】
特許文献４は、インプラント上に微細構造をエッチングすることよるインプラント製造方法を開示している。このようなインプラントは金のような接着性の金属（adhesive metal）を介してＤＮＡでコーティングすることができる。ここで述べられているＤＮＡは、その遺伝情報のために利用されている（すなわち、このＤＮＡは一酸化窒素又は血管内皮増殖因子をコードする遺伝子である）。
【０００８】
しかし、コーティング材料としてのＤＮＡの利用は、（ａ）核酸分解されやすいこと、及び（ｂ）水溶液への溶解性、のために制限されている。前述のＤＮＡ含有バルク材料の使用では、様々な材料上でコーティングが剥がれ易いという結果になった。
【０００９】
このような欠点があるものの、本発明の目的はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むコーティングを有するインプラント物（implant object）を提供することである。なぜなら、この興味深い材料はインプラント学において多くの利点を提供すると考えられるからである。
【００１０】
したがって、本発明は、ＤＮＡを含む安定なコーティングを有するインプラント物をどうすれば提供できるかという課題の解決方法を求めるものであり、該コーティングは、少なくとも上記インプラント物が移植される組織内に十分に埋め込まれるのに必要な期間、上記インプラント物に安定に付着したままであり、且つ移植される組織に対するＤＮＡの利点を示すことができるものである。
【特許文献１】国際公開第９９／０００７１号パンフレット
【特許文献２】独国特許第１０２３３０９９号
【特許文献３】国際公開第０２／４７５６４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０７２２８７号パンフレット
【非特許文献１】Dorozhkin and Epple, Angew. Chem Int. Ed. Engl. 2002, vol 41 3130
【非特許文献２】Ducheyne and Qiu Biomaterials 1999, 20 (23-24):2287
【非特許文献３】Reyes and Garcia J. Biomed. Mat Res. 1999, vol 67A, 328
【非特許文献４】Bures et al. J. Conrol Release 2001vol 72, 25
【非特許文献５】Yamada et al. Chemistry 2002, vol 8, 1407
【非特許文献６】Inoue et al. J. Biomed. Mat Res. 2003, vol 65A, 203
【非特許文献７】Fukushima et al. J. Dent. Res. 2001, vol 80, 1772
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＤＮＡが、その遺伝情報のためではなく、ＤＮＡの構造による利点から、インプラントのコーティングとしてうまく利用できることが分かった。ＤＮＡを含む又はＤＮＡからなるコーティングはインプラント物上に吸着させることができ、ＤＮＡコーティングしたインプラント物を効率的に得ることができる。特に、正の多電荷を帯びた表面若しくは層と静電相互作用との組合せによってインプラント物のコーティングにＤＮＡを組み込むことで、ＤＮＡがインプラント物に安定的に結合された。さらに、ＤＮＡの形状が保持されていたため、ＤＮＡの構造に付随する有利な効果が発揮され、同時に核酸分解（例えば血清中のヌクレアーゼ）切断から保護された。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、ポリヌクレオチド又はその均等物を含み且つ吸着によってインプラントに付着していることを特徴とするコーティングを有する上記インプラント物に関する。詳細には、本発明は、ポリヌクレオチド又はその均等物とポリカチオンとを含有するコーティングを有するインプラント物に関する。ポリヌクレオチド又はその均等物及びポリカチオンは二重層であること、すなわち、インプラント物がポリカチオン及びポリヌクレオチド（均等物）の二重層でコーティングされていることが好ましい。そのような二重層は、コーティング中に生物学的活性成分を組み込むことが可能であり、その生物学的活性活性をコーティングで調節しながら発揮させることができる。すなわち、生物学的活性成分の活性は、ポリヌクレオチド（均等物）−ポリカチオンコーティング（特に複数の二重層）の積層及び上記生物学的活性成分の組み込み様式によって調節することができる。生物学的活性成分を二重層コーティングの表面に組み込む、又はより深く多層コーティング中若しくは複数の二重層コーティング中に上記生物学的活性成分を組み込むことで、そのような生物学的活性成分の放出及び効果を調節することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、ポリヌクレオチド又はその均等物とは、ポリアニオン性構造を形成すあらゆるヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対応する均等な構成要素のポリマーを指す。通常、負電荷は、ヌクレオチド又はヌクレオチドに均等な構成要素を連結するリン酸基（若しくはその均等物）によって提供されるか、リン酸基（若しくはその均等物）に局在する。１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド又はその均等物は、ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ又は２’−Ｏ−アリルＲＮＡ、ＤＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び固定核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）からなる群から選択される。
【００１４】
１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡが何から得られるかは重要ではない。ＤＮＡの好ましい出所としては、ＤＮＡを多く含む材料を産業廃棄物としてしばしば廃棄している食品業界がある。遺伝情報に関係なく、ＤＮＡの構造的特性によって、この独特な天然材料はインプラントのコーティングに使用するのに理想的なものになっている。ＤＮＡ分子の特異的なビルドアップが、様々な移植部位における多様な使用を保証している。脊椎動物種におけるＤＮＡの分子構造が均質であること、及び（タンパク質や糖などのその他の生物学的抗原と比べて）ＤＮＡの非又は低免疫原性という特性が先天性免疫応答及び獲得免疫反応の両方を抑えている。さらに、ＤＮＡは、溝結合及びインターカレーションによって他の分子を取り込むことができ、所望の生物学的メディエーターを移植部位の近傍に特異的に送達できる可能性が生まれる。その上、ＤＮＡはリン酸基を多く含有しているので、カルシウムイオンに対するリン酸の高親和性により、骨形成過程におけるカルシウムの沈着に良い影響を与える。
【００１５】
本発明において、インプラント物とは、損傷した組織構造の回復を助けるため、又は組織及び／若しくは臓器を支持する、又は（一部）置換するために、ヒト又は動物の身体に移植できるあらゆる物を指す。インプラント物の例として、ステント、固定プレート（fixation plates）、固定ねじ、骨髄ピン（medullary nails）、寛骨臼カップ、組織再生誘導膜、口腔用インプラント、カテーテル、整形外科用インプラント、ペースメーカー、心臓弁等を挙げることができる。
【００１６】
本発明において、吸着した（adsorbed）又は吸着（adsorption）とは、あらゆる非共有結合性の結合を意味する。
【００１７】
１つの実施形態において、ポリヌクレオチド又はその均等物を含有するコーティングは、静電的相互作用によってインプラント物上に吸着される。ポリヌクレオチド又はその均等物をインプラント物に静電的に付着させる技術の１つに、静電的自己組織化（electrostatic self-assemby）（ＥＳＡ）がある。例えば、インプラントの表面は、インプラント上への吸着を容易にするために気体プラズマ（グロー放電）、アルカリ又は酸処理（飽和水酸化ナトリウム又は強酸溶液に基材を浸漬する）を適用する等の処理をすることができる。表面が正電荷を帯びたインプラントを、例えばＤＮＡの溶液に単に浸漬するだけで、ＤＮＡがインプラント上に自己組織化する。あるいは、表面が負電荷を帯びるようにインプラントを処理しても良い。その場合、インプラントをポリカチオン溶液に浸漬することでインプラント上にポリカチオンを自己組織化させることができ、次の工程で上記インプラントをＤＮＡ溶液に浸漬することで、静電的に付着するＤＮＡでインプラント物をコーティングすることができる。また、適切な機能を付与するポリカチオンが静電的にインプラント物に付着している場合、ＤＮＡ又はその均等物を上記ポリカチオンに結合させることで共有結合性相互作用を生じさせることができる。また、ポリヌクレオチド又はその均等物を含有する多層膜は、交互吸着法（layer-by-layer (LbL) assembly）としても知られるＥＳＡによって作製することができる。この技術を用いれば、反対の電荷をもつ高分子電解質を、静電相互作用によって交互に段階的に吸着させることで、高分子電解質多層（ＰＥＭ）を製造することができる。また、（静電的に）インプラント物上に吸着する最初のコーティング層を別にすれば、どの時点でも、静電的ではない相互作用、特に共有結合性の付着によって更なる層を付着させることができる。1つの実施形態において、本発明は、コーティングを有するインプラント物に関し、上記コーティングは吸着、又は特に静電相互作用によってインプラント物に付着しているポリヌクレオチド又はその均等物を含有する。
【００１８】
以前にも、ＤＮＡをポリアニオン性の構成要素として、ＥＳＡ技術が応用されたことがある。例えば、Pei et al., Biomacromolecules 2001, vol 2(2), 463は、最初にポリ（エチレンイミン）−（ＰＥＩ−）コーティングされたセンサーチップで開始したリアルタイム表面プラズモン共鳴法によって、ポリ（ジメチルジアリルアンモニウムクロライド）（ＰＤＤＡ）とＤＮＡとからなる連続的な多層膜の形成をモニターしている。また、Luo et al, Biophys. Chem, 2001, vol 94(1-2), 11は、ガラス状カーボン電極及び石英スライド上にＬｂＬ静電堆積法（LbL electrostatic deposition techniques）により作製したＰＤＤＡとＤＮＡの多層膜の研究をしている。
【００１９】
ＥＳＡ法について述べると、インプラントを、正に帯電した（高分子）電解質溶液に浸漬し、次いで負に帯電したポリヌクレオチド又はその均等物（特にＤＮＡ）の溶液に続けて浸漬することで、本発明のコーティングされたインプラント物を調製することができる。この過程は、２回、若しくは３回、若しくは４回、若しくは５回繰り返してもよく、又は６、７、８、９、若しくは１０回若しくはそれ以上繰り返してもよく、それにより多層コーティングを作ることができる。そのような多層コーティングの形成及び特性に影響を与えるパラメーターとしては、正に帯電した高分子電解質の具体的な種類及びポリヌクレオチドの種類の他に、高分子電解質溶液の濃度、浸漬時間、溶液のｐＨ、溶液のイオン強度等がある。
【００２０】
さらに、この作製方法（すなわち、水溶液中への浸漬中）では、ＰＥＭを含むポリヌクレオチドが水に不溶性であることが示されている。ＰＥＭをイオンを多く（すなわち、生理的条件を超えて）含む溶液に浸漬しても、ＰＥＭ構造の解離は起こらなかった。しかし、作製過程中の高分子電解質中のイオン量を変えることは、層の厚みなどのＰＥＭの特性を調節する手段の１つである。インプラント物が十分にコーティングされるようにこれらのパラメーターを選ぶことは、当業者に十分可能である。
【００２１】
１つの実施形態において、正に帯電した（高分子）電解質はポリカチオンであり、したがって、ポリヌクレオチド又はその均等物が二重層中でポリカチオンと静電的に相互作用しているコーティングを有するインプラント物は本発明の一実施形態である。好ましくは、ポリカチオンは、ポリ（Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｔｙｒ）臭化水素酸塩、ポリ−Ｄ／Ｌ−アルギニン塩酸塩、ポリ（Ａｒｇ，Ｐｒｏ，Ｔｈｒ）塩酸塩、ポリ（Ａｒｇ，Ｔｒｐ）塩酸塩、ポリ（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ）臭化水素酸塩、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｄ／Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ／Ｌ−リジン、 ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルポリピロリドン）、ポリアクリルアミド、 ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、 ポリアミリエ（Polyamilie）（エメラルディン塩）、４級化ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−アルト−１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］ウレア］、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（４−ビニルピリジニウムトリブロミドからなる群から選択される。別の実施形態において、インプラント物は、１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０若しくはそれ以上のポリカチオン及びポリヌクレオチドの二重層を含むコーティングを有する。
【００２２】
上に記載したＤＮＡの利点を完全に活用するためには、コーティングの中に静電的に固定されるＤＮＡの量及び形状を調節することが有益である。この目的のために、異なる種類のカチオン性高分子電解質を使用した、異なる種類の多層ＤＮＡコーティングを作製してもよい。この多層ＤＮＡコーティングの性質は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、Ｘ線分光法（X-ray photospectroscopy）（ＸＰＳ）、接触角の測定、及びフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）によって決定することができる。また、コーティング中に固定されたＤＮＡの量は放射性標識ＤＮＡを用いて解析することができる。
【００２３】
コーティング中のポリヌクレオチドはさらに、ポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）中に組み込むことができる薬剤（抗生剤及び／又は抗炎症成分）、及び／又はシグナル伝達物質（例えば、成長因子及び／又はサイトカイン）、及び／又はその他の機能性化合物のような機能的な添加剤を含んでいてよい。要するに、上で定義したＤＮＡを含有し、さらに１つ以上の生物学的活性成分を含有するコーティングを有するインプラントも、本発明の一実施形態である。
【００２４】
インプラント自体を作る材料は、その特定のインプラントの具体的な用途によって決定される。金属からなる又は金属を含むものがインプラントの材料に特に適しており、インプラントに好適な金属にはニオブ、タンタル、コバルトクロム合金、（ステンレス）スチール、特にチタン及びチタン合金がある。例えばチタンなどの複数の金属は、その固有の性質及び天然の形状のため、表面に酸化被膜を形成する。その他にあり得る、コーティングされるのに好適な材料にはバイオセラミックスがあり、例えば酸化アルミニウム（アルミナセラミック；Ａｌ２Ｏ３）、酸化ジルコニウム（ジルコニア；ＺｒＯ２）、リン酸カルシウムセラミックス（ＣａＰ）、及びバイオガラスがある。また、インプラント物は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ（エチレンテレフタラート）（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＦＴＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＬＡ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリプロピレンフマラート（ＰＰＦ）、若しくはポリブチルテレフタラート（ＰＢＴ）のようなポリマー材料からなってもよいし又はこれらを含んでいてもよい。さらに、上で考慮した材料の混合物の全てがインプラント材料の候補となる。
【００２５】
本発明で既に述べたように、ＤＮＡは、その遺伝的特性のためではなく、ＤＮＡの構造に固有な有利な特性のためにコーティングとしてうまく利用できることが判明した。したがって、特にインプラントを受ける必要のある対象にとって、本発明のインプラント物を利用することは、インプラント移植部位における組織反応を改善するために有益である。特に、本発明のインプラント物の使用は、該インプラント物の周辺組織の治癒に有益であり、また、本発明のインプラント物の使用はバイオミネラリゼーションのサポートに有益である。言い換えると、本発明はインプラント移植部位における組織反応の改善方法に関し、該方法はインプラントを受ける必要のある対象への本発明のインプラントの移植を含む。また、該方法は、インプラント物の周辺組織の治癒のための方法であり、バイオミネラリゼーションのサポートのための方法である。
【００２６】
本明細書中及び特許請求の範囲中において、「含有する（含む）（to comprise）」という動詞及びその活用形は、この単語の前にある項目を含みつつ、具体的に言及されていないものも排除しないという、非限定的な意味で使用されている。加えて、不定冠詞”a”又は”an”による要素への言及は、文脈で１つ且つ１つだけの要素であると明示していない限り、その要素が２つ以上ある可能性を排除しない。したがって、不定冠詞”a”又は”an”は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【実施例１】
【００２７】
インプラントを身体組織中に埋植すると、そのデバイスに対する反応が引き起こされる。この反応は異物反応として知られ、炎症や創傷治癒過程が含まれる。この反応の強さ及び期間は、主に表面特性によって決定される。したがって、インプラント材料の表面を調節することで、生体材料界面における生物学的反応を調節する手段を提供することができる。本発明で新規なアプローチは、コーティング材料にＤＮＡを使用することである。ＤＮＡは、その遺伝情報とは関係なく、非免疫原性又は低免疫原性のコーティング材料であり、軟部組織及び硬組織の両方の環境において薬物送達能をもつ。そこで、静電的自己組織化（ＥＳＡ）法によりインプラント物上にＤＮＡコーティングを作製し、多層ＤＮＡコーティングの細胞組織適合性を、初代細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ及びｉｎ ｖｉｖｏでのラットへの移植実験によって評価した。
【００２８】
材料と方法：
ポリアニオン性のＤＮＡ（±３００ｂｐ／分子；ナトリウム塩）は、Nichiro Corporation （横須賀市、神奈川県、日本）の厚意により提供された。ＤＮＡ中のタンパク質不純物の有無をＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce社製、Rockford, Illinois, USA）で調べ、計測の結果、０．２０％ｗ／ｗ未満であった。ポリカチオン性の高分子電解質であるポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ；ＭＷ 約７００００）及びポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ；ＭＷ３００００〜７００００）はSigma社から購入した（Sigma-Aldrich Chemie B.V.社製, Zwijndrecht, the Netherlands）。
【００２９】
ガラス基材及びチタン基材をＥＳＡ法を用いてコーティングした。［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５又は［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５の最終コーティング構造を得るために、ポリカチオン性のポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）又はポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、及びポリアニオン性のＤＮＡを以下に記すように交互に吸着させた。初代ラット皮膚線維芽細胞（ＲＤＦ）を用いて、増殖、細胞毒性（ＭＴＴ）、及び細胞形態（ＳＥＭ）をモニターし、細胞適合性を評価した。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、検体をラットの背部皮下に４〜１２週間移植した。回収した検体（周辺組織を含む）を、組織学的及び組織形態計測的分析に用いて、組織反応をモニターした。
【００３０】
多層ＤＮＡコーティングの作製
Luo et al., Biophys. Chem, 2001, vol 94(1-2), 11に記載のＥＳＡ法に少し修正を加えて用い、多層ＤＮＡコーティングを作製した。クリーニングした基材を、ＰＤＬ（０．１ｍｇ／ｍｌ）又はＰＡＨ（１ｍｇ／ｍｌ）のどちらかの水溶液に、最初のカチオン性の高分子電解質層が基材に吸着するのに十分な時間である３０分間浸漬した。次いで、この基材を超純水で洗浄（５分間、連続流水）し、高圧空気噴流（pressurized air stream）で乾燥させた。その後、この基材を、アニオン性のＤＮＡ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）とそれぞれのカチオン性高分子電解質溶液に、間に超純水での洗浄（５分間、連続流水）及び高圧空気噴流を用いた乾燥をはさみ、交互に７分間ずつ浸漬した。多層ＤＮＡコーティングの積層を、全部で二重層が５つになるまで続けた。これらを［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５又は［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５と呼ぶ（コーティングの表示は二重層の数を指すことに限定される。すなわち、１／２とは、二重層のうちのカチオン性部分のみを意味する）。
【００３１】
コーティング分析−原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）
チタンをスパッタした非コーティングシリコン、部分的多層ＤＮＡコーティング（［ＰＤＬ／ＤＮＡ］１／２及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］１／２；［ＰＤＬ／ＤＮＡ］２及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］２；［ＰＤＬ／ＤＮＡ］３と１／２及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］３と１／２）、及び完全多層ＤＮＡコーティング（［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５）の形状を、Nanoscope IIIa AFM (Digital Instruments社製、Buffalo, NY, USA)を用いて分析した。
【００３２】
コーティング分析−放射性標識ＤＮＡを用いた多層ＤＮＡコーティングの積層
放射性標識ＤＮＡを用いて、多層コーティング中に固定されたＤＮＡの量を調べた。ＤＮＡ水溶液に、放射性標識ＤＮＡを最終濃度１ｍｇ／ｍｌで添加した。カチオン性の高分子電解質水溶液の濃度は上述の通りである。ガラス基材及びチタン基材上に、多層コーティングを上述の通り作製した。二重層が１、２、３、４、及び５つ完成した後、基材を作製工程から取り出し、シンチレーション液に浸漬し、液体シンチレーションカウンターを用いて計測した。比較として、最初のＤＮＡ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを含むサンプルを計測した。全ての実験サンプル及びコントロールサンプルは３連で行った。
【００３３】
結果
ＥＳＡ法を用いて、ガラス基材及びチタン基材上にＤＮＡコーティングを作製した。これらの多層ＤＮＡコーティングは、約３μｇＤＮＡ／ｃｍ２／二重層を取り込んでおり、ＡＦＭによって、ナノレベルの表面粗さが確認された。
【００３４】
原子間力顕微鏡
チタンをスパッタしたシリコン上の、部分的又は完全な多層ＤＮＡコーティングの表面形状をＡＦＭを用いて調べた。
【００３５】
［ＰＤＬ／ＤＮＡ］二重層及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］二重層の（部分的又は完全な）多層ＤＮＡコーティングの高さを分析したところ、どちらの種類のコーティングにおいても、表面粗さの増加が視認された。両方の種類の多層ＤＮＡコーティングのＲＭＳ値を用いて、表面粗さを更に調べたところ、［ＰＤＬ／ＤＮＡ］１／２及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］２からの全ての段階（すなわち、１と１／２二重層）で、コーティングを積層している間の有意な増加が示された。さらに、二重層が２つ堆積した後では、［ＰＤＬ／ＤＮＡ］コーティングのＲＭＳ値は対応する［ＰＡＨ／ＤＮＡ］コーティングのＲＭＳ値より有意に低かった。
【００３６】
２種類のコーティング間での表面形状の代表的な違いとして、高度（elevation）の高さの平均値に加えて、その空間的分布があった。［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５の外観が比較的均質な形状で、その高度は高さが比較的低く（平均６ｎｍ）、等間隔な分布を示したのに対し、［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５はランダムに分布された比較的高い（平均１４ｎｍ）高度を示した。これらの違いを図で説明するために、両方の完全多層ＤＮＡコーティングの３Ｄ画像再構成を図１に示す。
【００３７】
多層コーティング積層中のＤＮＡ固定化
多層ＤＮＡコーティング中に固定されるＤＮＡの量（μｇ／基材）を放射性標識ＤＮＡを用いて分析した。ガラス上では、最初の二重層に固定されるＤＮＡ量は、［ＰＡＨ／ＤＮＡ］コーティングより［ＰＤＬ／ＤＮＡ］コーティングの方が多い。チタン基材上では、両方の種類の多層ＤＮＡコーティングの最初の二重層中に同量のＤＮＡが固定された。基材材料（すなわち、ガラス又はチタン）に関係なく両方の種類の多層ＤＮＡコーティングで、続いて吸着した各二重層中には一定量のＤＮＡが固定される。多層ＤＮＡコーティング中に固定されるＤＮＡの量は、おおよそ１〜１５μｇＤＮＡ／ｃｍ２／二重層である。
【００３８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験によって、下地の基材に関係なく、両方の種類の多層ＤＮＡコーティング上でＲＤＦ細胞増殖の増加が示された（ｐ＜０．０５）（図２）。どちらの種類の多層ＤＮＡコーティングにも細胞毒性がないことがＭＴＴアッセイで示された。さらに、細胞の形態に変化は見られなかった。
【００３９】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験において、移植期間中、創傷治癒に伴う合併症の兆しは見られなかった。組織学的解析により、非コーティングコントロールと比べて、コーティングした検体に対する組織反応に変化がないことが示された（図３）。線維組織被膜における線維細胞層の数及び線維被膜の質について、コントロールと比較して、コーティングした検体で違いはみられなかった。
【００４０】
ディスカッション及び結論
反対に帯電された基材を最適に被覆するための１つの方法は、中性の酸性度（neutral acidity）で過度に帯電している高分子電解質（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ＰＥＩ；又はポリ（スチレンスルホン酸）、ＰＳＳ）を最初の層として利用することである。しかし、これは必須ではない。
【００４１】
［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５及び［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５コーティングの成長は両方とも直線的であった。しかし、最初の吸着層に吸着されるカチオン性高分子電解質の量、及び使用されるカチオン性高分子電解質に特有な異なる種類の基材に対する特異的親和性の結果、最初の二重層に固定されるＤＮＡ量の基材依存的な差異が生じ得る。
【００４２】
多層ＤＮＡコーティングは線維芽細胞の増殖を促進し、細胞毒性効果を誘導せず、且つ線維芽細胞の形態を変化させない。移植したとき、多層ＤＮＡコーティングは、非コーティングコントロールと比べて、被膜中の線維芽細胞層の数及び被膜の質に何の違いも生じさせない。したがって、多層ＤＮＡコーティングの細胞組織適合性が実証される。
【実施例２】
【００４３】
インプラント学分野においては、生体材料を埋入した後の組織反応の調節が課題である。ここ数十年、例えば生体材料表面の局所的及び／又は化学的修飾などの、組織反応を調節するための様々な方法が研究されてきた。さらに、インプラント周辺において所望の組織反応を誘導するために、生体材料を生物学的活性因子と組み合わせることが行われてきた。
【００４４】
現在の研究は、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）又はポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）のどちらかをカチオン性成分、ＤＮＡをアニオン性成分として積層された多層ＤＮＡコーティングの３種類の機能化に焦点を合わせている（図４）。多層ＤＮＡコーティング中にローディングされるＢＭＰ−２の量及びその後の放出特性を放射性標識したＢＭＰ−２を用いて調べた。続いて、骨髄に由来する骨芽細胞様細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける挙動に対する、ＢＭＰ−２機能化多層ＤＮＡコーティングの影響を、増殖、分化、ミネラリゼーション、及び細胞形態の点から評価した。
【００４５】
材料と方法：
ポリアニオン性のＤＮＡ（３００ｂｐ／分子；ナトリウム塩）はCentral Research Laboratory of Nichiro Corporation（川崎市、神奈川県、日本）の厚意により提供された。ＤＮＡ中のタンパク質不純物の有無について、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce社製、Rockford, IL, US）を用いて調べたところ、測定値は０．２０％ｗ／ｗ未満であった（データ非公開）。ポリカチオン性高分子電解質であるポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ；ＭＷ 約７００００）及びポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ；ＭＷ ３０，０００〜７０，０００）はSigma社（Sigma-Aldrich Chemie B.V., Zwijndrecht, the Netherlands）から購入した。組換えヒト骨形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ−２；ＭＷ ３２，０００）はYamanouchi Europe B.V.社（Leiderdorp, the Netherlands）の厚意で提供された。全ての材料は更に精製することなく用いた。
【００４６】
基材の調製及びクリーニング
ディスク型のチタン基材（直径１２ｍｍに機械加工）を使用した。多層ＤＮＡコーティングを製造する前に、基材をそれぞれ、硝酸（１０％ｖ／ｖ）、アセトン、及びイソプロパノール中で超音波洗浄し、その後、その基材を風乾した。
【００４７】
多層ＤＮＡコーティングの作製
以前の記述のとおり、ＥＳＡ法を用いて多層ＤＮＡコーティングを作製した。簡潔に述べると、クリーニングした基材をＰＤＬ（０．１ｍｇ／ｍｌ）又はＰＡＨ（１ｍｇ／ｍｌ）の水溶液に、基材上に最初のカチオン性高分子電解質層が吸着するのに十分な時間である３０分間浸漬した。次いで、その基材を超純水で洗浄（５分間、連続流水）し、高圧空気噴流で乾燥させた。その後、アニオン性ＤＮＡ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）とそれぞれのカチオン性高分子電解質溶液に、間に超純水による洗浄（５分間、連続流水）及び高圧空気噴流による乾燥を挟みつつ、基材を交互に７分間ずつ浸漬した。二重層が全部で５つになるまで多層ＤＮＡコーティングの積層を続けた。これらのコーティングを［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５又は［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５と呼ぶこととする。
【００４８】
多層ＤＮＡコーティングの機能化
ｒｈＢＭＰ−２を３つの異なる様式でローディングすることで、多層ＤＮＡコーティングを機能化した（図４）。上記ローディング様式を、ＢＭＰ−２の位置により、表層（ｓ）、深層（ｄ）、及び二重層（ｄｌ）と呼ぶこととする。多層ＤＮＡコーティングの積層中に、ｒｈＢＭＰ−２を適当な位置にローディングし（１０μｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２溶液１０μｌを含む０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ）、７分間吸着させた。多層ＤＮＡコーティングの最表面にｒｈＢＭＰ−２が適用されたときを除いて、基材を超純水で洗浄し、その後、コーティングの積層を上述のように続けた。コーティングの最表面に適用した（ｄｌ−ローディングの最後の段階及びｓ−ローディングの場合）ｒｈＢＭＰ−２は室温で乾燥させた。
【００４９】
ｒｈＢＭＰ−２の放射性ヨウ素化（radioiodination）
以前の記述のとおり、Iodogen法を用いて、ｒｈＢＭＰ−２を１２５Ｉで標識した。簡潔に述べると、１００μｇのiodogenが入った５００μｌエッペンドルフチューブに、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１０μｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を８０μｌ、（２．６μｌのＰＢＳ中）ｒｈＢＭＰ−２を１０μｇ、及び１２５Ｉ（０．３ｍＣｉ）を３μｌ添加した。このチューブを室温で１０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳのチロシン飽和溶液１００μｌを添加し、消光反応を開始させた。最後に、プレリンスした使い捨てセファッデクスＧ２５Ｍカラム（ＰＤ−１０；Pharmacia社製、Uppsala,Sweden）上で、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いてこの反応混合液を溶出し、標識ｒｈＢＭＰ−２を遊離１２５Ｉから分離した。ｒｈＢＭＰ−２が固着するのを防ぐために、放射性ヨウ素化時に使用するピペットのチップとチューブには、SigmaCoat（登録商標）（Sigma社製）を用いてシラン処理を行った。
【００５０】
Gelman ITLC-SG strip（Gelman Laboratories社製、Ann Arbor, MI, USA）上で、移動相として０．１Ｍクエン酸（ｐＨ５．０）を用いたインスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）により、１２５Ｉ標識ｒｈＢＭＰ−２の放射化学的純度を調べた。この１２５Ｉ標識ｒｈＢＭＰ−２標品の放射化学的純度は９７．３％であった。これは、９７．３％の１２５Ｉ標識がｒｈＢＭＰ−２に共有結合的に結合していることを示している。標識ｒｈＢＭＰ−２の比活性は１４．１μＣｉ／μｇであった。
【００５１】
ｒｈＢＭＰ−２ローディング及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒｈＢＭＰ−２放出の決定
機能化多層ＤＮＡコーティング中にローディングされたｒｈＢＭＰ−２の量を放射性標識ｒｈＢＭＰ−２を用いて調べた。機能化は、放射性標識ｒｈＢＭＰ−２を用いた以外は、「多層ＤＮＡコーティングの機能化」のセクションに記載の通りに行った。各種類のコーティングについて、３個の基材（ｎ＝３）を、機能化多層ＤＮＡコーティングでコーティングした。
【００５２】
ローディングされたｒｈＢＭＰ−２の量は、遮蔽したウェル型ガンマカウンター（Wizard, Pharmacia-LKB社製、 Sweden）中における実験基材の活性を測定することで決定した。深層にローディングした（ｄ−機能化）多層ＤＮＡコーティング及び二重層にローディングした（ｄｌ−機能化）多層ＤＮＡコーティングのガンマ放射量は、表層にローディングした（ｓ−機能化）多層ＤＮＡコーティングのガンマ放射量（１００ｎｇに設定）と相関していた。
【００５３】
ｒｈＢＭＰ−２のｉｎ ｖｉｔｒｏ放出特性を調べるために、各種の機能化多層ＤＮＡコーティングを施した基材（ｎ＝３）を別々に、４ｍｌのＰＢＳの入った１０ｍｌのガラスバイアルに入れ、３７℃で最大８週間まで静かにインキュベートした。選択した時間（４時間、１、７、１４、２２、２８、４２、及び５６日）に、新鮮なＰＢＳを含む新しいバイアルにサンプルを注意深く移した。その後、基材上の活性をガンマカウンター内で測定した。放射性崩壊を補正するために、標準を同時に計測した。
【００５４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
細胞培養実験には、コーティングの成分及びローディング様式に基づいて、７つの実験群を用いた。
１．［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５−ｓ（表層）
２．［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５−ｄ（深層）
３．［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５−ｄｌ（二重層）
４．［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｓ（表層）
５．［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄ（深層）
６．［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄｌ（二重層）
７．コントロール（非コーティングチタン）
【００５５】
以前のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験により、［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５多層コーティングと比較したとき、非コーティングチタン上において、骨芽細胞様細胞が、細胞増殖、分化、ミネラリゼーション、及び形態に関して、同様な挙動をすることが示されていた（非公開データ）ことから、非コーティングチタンからなるコントロールの使用が適切であると判断した。
【００５６】
いずれかの種類の多層ＤＮＡコーティングがされた基材又は非コーティングコントロール基材の全てをＵＶ照射処理（２５４ｎｍ；４時間）により滅菌した。独立した２連で、全ての細胞培養実験を行い、１連につき１頭のラットからの骨髄細胞を用いた。
【００５７】
ラット骨髄細胞の単離及び前培養
Maniatopoulos et al.から採用した方法を用いて、ラット骨髄（ＲＢＭ）細胞を単離及び培養した。簡潔に述べると、オスWistar WUラットの大腿骨を取り出し、きれいにし、骨端を切除した。細胞培養液（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Gibco社製）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Sigma社製）、１０ｍＭ β−グリセロリン酸Ｎａ（Sigma社製）、１０−８Ｍ デキサメタゾン（Sigma社製）、及び５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（Gibco社製）を添加したα−ＭＥＭ（Gibco社製））を用いて、残った骨幹から髄を洗い流した。２つの大腿骨のＲＢＭ細胞を、７５ｃｍ２の培養フラスコ（Greiner Bio-One社製）を３つ用いて、細胞培養液中で１日、静的条件下で培養し、次いで、培養液を新鮮なものと交換して非接着細胞を除去した。その後、付着細胞をさらに６日間前培養した。７日間初代培養して骨芽細胞様細胞を得た後、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン、０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ）を用いて細胞を剥がし、Coulter（登録商標）カウンター（Beckman Coulter Inc.社製, Fullerton, CA, USA）を用いて総細胞数を決定した。最後に、実験基材上に細胞を１×１０４細胞／ｃｍ２の密度で２４ウェルプレート（Greiner Bio-One社製）上に播種した。播種１日後、及びその後は週に３回、細胞培養液を新鮮なものに変えた。
【００５８】
細胞増殖
総細胞タンパク質の測定値に基づいて細胞増殖曲線を作成した。播種後４、８、１２、及び１６日目に培地を除去して細胞をＰＢＳで３回洗浄した。続いて、付着細胞の付いた実験基材を新しい２４ウェルプレートに移し、各実験基材を１ｍｌの超純水に浸した。これらのサンプルを３回繰り返し凍結及び解凍し、その後マイクロＢＣＡタンパク質アッセイ（micro BCA protein assay）（Pierce社製、Rockford, IL, USA）をメーカーの説明書に従って用いて、水溶性サンプルに含有される細胞タンパク質含量を解析した。各実験の連で、再現性を高めるために、それぞれの実験条件に対して各時間のサンプルを３つ（ｎ＝３）用いた。
【００５９】
アルカリホスファターゼ活性
以前に記載されている方法により、増殖アッセイの水溶性サンプルを用いて、骨芽細胞様細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を骨芽細胞様細胞の早期分化マーカーとして測定した。体積８０μｌのサンプル又は標準、及び２０μｌの緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）をピペットで９６ウェルプレート（Greiner Bio-One社製）に２連（in duplo）で移し、各ウェルに１００μｌの基質溶液（５ｍＭ ｐ−ニトロ−フェニル−ホスフェート）を加えた。続いてこのプレートを３７℃で１時間インキュベートし、その後、０．３ＭのＮａＯＨを１００μｌ加えることで反応を停止させた。４ニトロフェノールの段階希釈物（最終濃度０〜２５ｎＭ）を検量線に用いた。プレートは、ＥＬＩＳＡリーダー内で４０５ｎｍを読み取った。各実験の連で、それぞれの実験条件に対して各時間のサンプルを３つ（ｎ＝３）用いた。
【００６０】
カルシウム沈着
骨芽細胞様細胞の後期分化マーカーとして、カルシウムの沈着を用いた。細胞培養４、８、１２、１６、及び２４日後のカルシウム沈着量を、以前に記載があるように、オルトクレゾールフタレインコンプレクソン（ＯＣＰＣ）法（Sigma）で測定した。簡潔に述べると、実験基材をＰＢＳで２回洗浄し、その後、０．５Ｎの酢酸を１ｍｌ添加した。振盪器上で一晩インキュベートした後、９６ウェルプレート（Greiner Bio-One社製）中で、サンプル１０μｌに希釈標準溶液を３００μｌ加えた。希釈標準溶液は、（ａ）ＯＣＰＣ溶液（８０ｍｇのＯＣＰＣを溶かしたミリＱ７５ｍｌ＋１ＭのＫＯＨを０．５ｍｌ＋０．５Ｎの酢酸を０．５ｍｌ）、（ｂ）１４．８Ｍエタノールアミン／ホウ酸緩衝液（ｐＨ＝１１）、（ｃ）８−ヒドロキシキノリン（２０ｍｌの９５％エタノール中に１ｇ）、及び（ｄ）ミリＱからなり、これらの比率は５：５：２：８８（ａ：ｂ：ｃ：ｄ）である。ＣａＣｌ２の段階希釈（０〜１００μｇ／ｍｌ）を調製し、検量線を作成した。各実験の連において、それぞれの実験条件における各時間の３つの基材を用いてカルシウムアッセイを行った（ｎ＝３）。
【００６１】
細胞形態
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、細胞の外観（appearance）の形態を評価した。播種後４及び１６日目、基材及び付着した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、グルタールアルデヒド（０．１Ｍ カコジル酸緩衝液中、４％）で２０分固定した。続いて、この基材を０．１Ｍのカコジル酸緩衝液で２回洗浄し、段階的なエタノールシリーズで脱水した。最後に、基材をテトラメチルシランで乾燥させ、金でスパッタコーティングし、JEOL 6310 SEMを用いて、１０ｋＶの加速電圧で評価した。
【００６２】
統計分析
測定値は、Graphpad（登録商標） Instat 3.05ソフトウェア（GraphPad Software Inc.社製, San Diego, CA, USA）を用いて評価した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの放出実験及び細胞培養実験のデータは、一元配置分散分析と事後（post-hoc）Tukey-Kramer多重比較検定を組み合わせて用いて解析した。有意水準はｐ＜０．０５とした。
【００６３】
結果
ｒｈＢＭＰ−２と多層ＤＮＡコーティングのローディング
多層ＤＮＡコーティング中へローディングされたｒｈＢＭＰ−２の量を図５に示す。この結果は、異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング中へ取り込まれたｒｈＢＭＰ−２の量がｄｌ−ローディングで最大となり、ｓ−ローディングでは中間、そしてｄ−ローディングで最も少ない（ｄｌ−ローディング＞ｓ−ローディング＞ｄ−ローディング）ことを示している。［ＰＤＬ／ＤＮＡ］ベースのコーティングと［ＰＡＨ／ＤＮＡ］ベースのコーティングの間に統計的に有意な差は見られなかった。
【００６４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける多層ＤＮＡコーティングからのｒｈＢＭＰ−２の放出
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける多層ＤＮＡコーティングからのｒｈＢＭＰ−２の放出特性を、放射性標識ｒｈＢＭＰ−２を用いて調べた。図６Ａ及び図６Ｂに、異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティングからのｒｈＢＭＰ−２の累積放出を示す。異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティングの全てにおいて、ＰＢＳ中での最初の２４時間のインキュベーション中に、初期バースト放出（initial burst release）がみられ、この放出は最初にローディングされたｒｈＢＭＰ−２の量の３５〜７５％の範囲であった。割合としては、このバースト放出はｄ−ローディングで低く（［ＰＤＬ／ＤＮＡ］ベースの多層ＤＮＡコーティングで４７．６％、［ＰＡＨ／ＤＮＡ］ベースの多層ＤＮＡコーティングで３４．８％）、ｓ−及びｄｌ−ローディングの多層ＤＮＡコーディングの両方で高かった（＞６０％）。バースト放出の後は、異なるローディングをした全ての多層ＤＮＡコーティングが、一定の割合（１週間毎に、残りのｒｈＢＭＰ−２の約６〜８％）の持続性放出を示した（表１）。８週間インキュベートした後のｒｈＢＭＰ−２の累積放出量は、ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングでは約７０％であり、一方、ｓ−ローディング及びｄｌ−ローディングＤＮＡコーティングでは約８５％であった。統計分析により、放出されたｒｈＢＭＰ−２の実際の累積量はｄｌ−ローディングで最大、ｓ−ローディングで中間、そしてｄ−ローディングで最小であることが示された。［ＰＤＬ／ＤＮＡ］又は［ＰＡＨ／ＤＮＡ］のいずれをベースにして均等に機能化したコーティングにおいても、パーセンテージの上では、放出特性に統計的に有意な差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。
【００６５】
【表１】
【００６６】
ｒｈＢＭＰ−２をローディングした多層ＤＮＡコーティング上での骨芽細胞様細胞の挙動
異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での骨芽細胞様細胞の挙動を評価し、取り込まれたｒｈＢＭＰ−２の生物学的活性を検出した。
【００６７】
細胞増殖
総細胞タンパク質含量測定値に基づく骨芽細胞様細胞の増殖を図７に示す。骨芽細胞様細胞は、異なるローディングをした全ての多層ＤＮＡコーティング上及び非コーティングコントロール基材上で、同様な増殖パターンを示した。細胞播種後、骨芽細胞様細胞が増殖を始め、約１２日目で最大数に達し、その後は減少が観察された。両方の種類のｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングで、１２日目に、細胞タンパク質含量について幾分低いが有意な差が見られた（［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５−ｄ vs コントロール、ｐ＜０．０１；［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄ vs コントロール、ｐ＜０．０５）。骨芽細胞様細胞の培養１６日後において、両方の種類のｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングとコントロールとの間に有意な差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。
【００６８】
アルカリフォスファターゼ活性
骨芽細胞様細胞のＡＬＰ活性は、全ての実験基材上で、培養の最初の１２日間は増加し、その後急速に減少した（図８）。１２日目において、両方の種類のｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングで、コントロールと比べて有意な差が見られた（ｐ＜０．０５）。
【００６９】
カルシウム沈着
骨芽細胞様細胞によってミネラル化した細胞外マトリックスの沈着を、細胞培養中に実験基材上に沈着したカルシウムの量を測ることで調べた（図９）。非コーティングコントロールと比較して、ｓ−及びｄｌ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上において、骨芽細胞様細胞による加速的なカルシウムの沈着が見られた。１２日目において、ｓ−及びｄｌ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上で骨芽細胞様細胞が沈着させたカルシウムの量は、非コーティングコントロールと比べて有意に増加していた（ｐ＜０．００１）。その一方で、ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングでは、骨芽細胞様細胞によるカルシウム沈着は減少していた。１６及び２４日目において、これらの種類の機能化多層ＤＮＡコーティング上でのカルシウム沈着の有意な減少が観察された（ｐ＜０．００１）。
【００７０】
細胞形態
異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上で培養した骨芽細胞様細胞の形態学的外観を、走査型電子顕微鏡を用いて評価した。４日目には、異なるローディングをした全ての多層ＤＮＡコーティング及び非コーティングコントロールが、骨芽細胞様細胞の層で覆われていた。細胞の形態に違いは見られなかった。対照的に、ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングの１６日目では、他の全ての実験群と比較して、骨芽細胞様細胞の異常な形態が観察された（図１０）。ｓ−、及びｄｌ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上並びに非コーティングコントロール上に、コラーゲンの束に付着した多くの石灰化した球形の沈着が見られた。ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上では、より少ないミネラリゼーションが観察された。
【００７１】
結論
本研究は、異なる３つのローディング様式（すなわち、表層（ｓ）、深層（ｄ）、及び二重層（ｄｌ））でＢＭＰ−２を埋め込むことで、多層ＤＮＡコーティングを機能化できることを実証している。ＢＭＰ−２は、ｓ＋（４＊ｄ）＝ｄｌという割合で、多層ＤＮＡコーティング中に取り込まれた。放出特性では、異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティングの全てで、初期バースト放出、続いて（少なくとも）８週間にわたる残りのＢＭＰ−２の持続性放出が示された。ラット骨髄由来骨芽細胞様細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養実験によって、ｓ−、及びｄｌ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上でカルシウム沈着が加速されたことから、ローディングした成分が生物学的活性を維持しており、細胞増殖にも影響しないことが示された。対照的に、ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングでは、骨芽細胞様細胞の挙動に影響が現れ、カルシウム沈着が減少した。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１ａ】［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５のＡＦＭ画像の３次元再構成を示す図である。
【図１ｂ】［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５のＡＦＭ画像の３次元再構成を示す図である。
【図２】チタン基材上でのＲＤＦの増殖を示す図である。白いバー＝非コーティング・コントロール、灰色のバー＝［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５、黒いバー＝［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５。＊は、非コーティング・コントロールと比べて有意な差があることを示す（ｐ＜０．０５）。
【図３】ガラス［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５基材周辺の組織被膜（tissue capsule）の組織学的横断切片を示す図である。
【図４】ＢＭＰ２のローディング様式が異なる、多層ＤＮＡコーティングを表す模式図である。
【図５】多層ＤＮＡコーティング中へのｒｈＢＭＰ−２の取り込みを示す図である。結果は平均値＋ＳＤで示している（ｎ＝３）。
【図６】ＰＢＳに浸漬した後の、異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティングからのｒｈＢＭＰ−２のｉｎ ｖｉｔｒｏ放出を示す図である。（Ａ）［ＰＤＬ／ＤＮＡ］をベースにした多層ＤＮＡコーティングにおける放出特性；（Ｂ）［ＰＡＨ／ＤＮＡ］をベースにした多層ＤＮＡコーティングにおける放出特性（ｓ＝表層、ｄ＝深層、ｄｌ＝二重層）。結果は平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で示している。
【図７】異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での、骨髄由来骨芽細胞様細胞の増殖を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（コントロールとの比較において））。
【図８】異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での、骨髄由来骨芽細胞様細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す図である（＊コントロールとの比較でｐ＜０．０５）。
【図９】異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での、骨髄由来骨芽細胞様細胞のミネラリゼーション（カルシウム沈着）を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１（コントロールとの比較において））。
【図１０】異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での、１６日間培養後の骨髄由来骨芽細胞様細胞の走査型顕微鏡像を示す図である。（Ａ）非コーティングコントロール、（Ｂ）［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｓ、（Ｃ）［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄ、及び（Ｄ）［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄｌ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インプラント移植部位における組織反応を改善するコーティングを有するインプラントの分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
インプラント学においては、満足な特性を備えた生物医学デバイスを製造するために多様な材料が用いられている。適用の際の適合性を決定するのは主に材料のバルク特性であるが、生物学的反応は、主にその生体材料表面における、周囲の生体環境中の成分との相互作用により決まる。生体材料表面の修飾はここ数十年の主流な研究テーマであり、生物学的反応を改善するために、生体材料表面を効果的に修飾する多くの技術が開発されてきた。その例として、骨インプラント用のリン酸カルシウム析出法や、生体化合物及び／又は医薬品の認識部位を生体材料表面に導入する技術を挙げることができる。前者の技術は骨インプラントの生物活性を顕著に上昇させ（非特許文献１及び２）、一方、後者の技術は細胞の（初期）接着を改善し、生物学的反応に重要な修飾化合物（例えば、サイトカインや成長因子）の移植部位における特異的な送達方法を提供した（非特許文献３及び４参照）。
【０００３】
ＤＮＡ（遺伝子）送達のための非ウイルス性ベクターとして登場した、カチオン性ポリマーとＤＮＡとの高分子電解質複合体についての概念が広がってきており、特許文献１は、治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだポリマー・マトリックスでコーティングしたステントを開示している。動脈細胞によりレポーター酵素が実際に発現されることが実証されており、これはＤＮＡが確かにポリマー・マトリックスから細胞に入ったことを意味している。この方法では、ＤＮＡがマトリックスから離れて、コーティングしていた物を覆わなくなってしまうので、移植された組織内に定着する必要があるインプラントには好ましくない。
【０００４】
また、遺伝情報のためではなく、機能性生体材料としてのＤＮＡの使用が既に示唆されており（非特許文献５及び６）、先駆者的努力の結果、ＤＮＡを含有するバルク（生体）材料、特にＤＮＡ−脂質コンプレックスをキャストすることで作製される自立性のＤＮＡ脂質膜が製造され（非特許文献７）、これはラット背部に皮下移植しても副作用を起こさないことが示されている。
【０００５】
特許文献２は、機能化した表面を有するインプラントを開示している。炭素を含有する層をインプラント上に付加し、酸化及び／又は還元反応によってこの層を活性化して多孔性にし、続いて、この活性化された炭素をＤＮＡ等の添加によって機能化している。
【０００６】
特許文献３は、金属水素化物（すなわち、水素化チタン、水素化ジルコニウム、水素化タンタル、水素化ハフニウム、ニオブ水素化物、クロム水素化物、又はバナジウム水素化物）層に結合されたＤＮＡ等でコーティングされた、生体適合性の改善されたインプラントを開示している。
【０００７】
特許文献４は、インプラント上に微細構造をエッチングすることよるインプラント製造方法を開示している。このようなインプラントは金のような接着性の金属（adhesive metal）を介してＤＮＡでコーティングすることができる。ここで述べられているＤＮＡは、その遺伝情報のために利用されている（すなわち、このＤＮＡは一酸化窒素又は血管内皮増殖因子をコードする遺伝子である）。
【０００８】
しかし、コーティング材料としてのＤＮＡの利用は、（ａ）核酸分解されやすいこと、及び（ｂ）水溶液への溶解性、のために制限されている。前述のＤＮＡ含有バルク材料の使用では、様々な材料上でコーティングが剥がれ易いという結果になった。
【０００９】
このような欠点があるものの、本発明の目的はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むコーティングを有するインプラント物（implant object）を提供することである。なぜなら、この興味深い材料はインプラント学において多くの利点を提供すると考えられるからである。
【００１０】
したがって、本発明は、ＤＮＡを含む安定なコーティングを有するインプラント物をどうすれば提供できるかという課題の解決方法を求めるものであり、該コーティングは、少なくとも上記インプラント物が移植される組織内に十分に埋め込まれるのに必要な期間、上記インプラント物に安定に付着したままであり、且つ移植される組織に対するＤＮＡの利点を示すことができるものである。
【特許文献１】国際公開第９９／０００７１号パンフレット
【特許文献２】独国特許第１０２３３０９９号
【特許文献３】国際公開第０２／４７５６４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０７２２８７号パンフレット
【非特許文献１】Dorozhkin and Epple, Angew. Chem Int. Ed. Engl. 2002, vol 41 3130
【非特許文献２】Ducheyne and Qiu Biomaterials 1999, 20 (23-24):2287
【非特許文献３】Reyes and Garcia J. Biomed. Mat Res. 1999, vol 67A, 328
【非特許文献４】Bures et al. J. Conrol Release 2001vol 72, 25
【非特許文献５】Yamada et al. Chemistry 2002, vol 8, 1407
【非特許文献６】Inoue et al. J. Biomed. Mat Res. 2003, vol 65A, 203
【非特許文献７】Fukushima et al. J. Dent. Res. 2001, vol 80, 1772
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＤＮＡが、その遺伝情報のためではなく、ＤＮＡの構造による利点から、インプラントのコーティングとしてうまく利用できることが分かった。ＤＮＡを含む又はＤＮＡからなるコーティングはインプラント物上に吸着させることができ、ＤＮＡコーティングしたインプラント物を効率的に得ることができる。特に、正の多電荷を帯びた表面若しくは層と静電相互作用との組合せによってインプラント物のコーティングにＤＮＡを組み込むことで、ＤＮＡがインプラント物に安定的に結合された。さらに、ＤＮＡの形状が保持されていたため、ＤＮＡの構造に付随する有利な効果が発揮され、同時に核酸分解（例えば血清中のヌクレアーゼ）切断から保護された。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、ポリヌクレオチド又はその均等物を含み且つ吸着によってインプラントに付着していることを特徴とするコーティングを有する上記インプラント物に関する。詳細には、本発明は、ポリヌクレオチド又はその均等物とポリカチオンとを含有するコーティングを有するインプラント物に関する。ポリヌクレオチド又はその均等物及びポリカチオンは二重層であること、すなわち、インプラント物がポリカチオン及びポリヌクレオチド（均等物）の二重層でコーティングされていることが好ましい。そのような二重層は、コーティング中に生物学的活性成分を組み込むことが可能であり、その生物学的活性活性をコーティングで調節しながら発揮させることができる。すなわち、生物学的活性成分の活性は、ポリヌクレオチド（均等物）−ポリカチオンコーティング（特に複数の二重層）の積層及び上記生物学的活性成分の組み込み様式によって調節することができる。生物学的活性成分を二重層コーティングの表面に組み込む、又はより深く多層コーティング中若しくは複数の二重層コーティング中に上記生物学的活性成分を組み込むことで、そのような生物学的活性成分の放出及び効果を調節することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、ポリヌクレオチド又はその均等物とは、ポリアニオン性構造を形成すあらゆるヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対応する均等な構成要素のポリマーを指す。通常、負電荷は、ヌクレオチド又はヌクレオチドに均等な構成要素を連結するリン酸基（若しくはその均等物）によって提供されるか、リン酸基（若しくはその均等物）に局在する。１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド又はその均等物は、ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ又は２’−Ｏ−アリルＲＮＡ、ＤＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び固定核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）からなる群から選択される。
【００１４】
１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡが何から得られるかは重要ではない。ＤＮＡの好ましい出所としては、ＤＮＡを多く含む材料を産業廃棄物としてしばしば廃棄している食品業界がある。遺伝情報に関係なく、ＤＮＡの構造的特性によって、この独特な天然材料はインプラントのコーティングに使用するのに理想的なものになっている。ＤＮＡ分子の特異的なビルドアップが、様々な移植部位における多様な使用を保証している。脊椎動物種におけるＤＮＡの分子構造が均質であること、及び（タンパク質や糖などのその他の生物学的抗原と比べて）ＤＮＡの非又は低免疫原性という特性が先天性免疫応答及び獲得免疫反応の両方を抑えている。さらに、ＤＮＡは、溝結合及びインターカレーションによって他の分子を取り込むことができ、所望の生物学的メディエーターを移植部位の近傍に特異的に送達できる可能性が生まれる。その上、ＤＮＡはリン酸基を多く含有しているので、カルシウムイオンに対するリン酸の高親和性により、骨形成過程におけるカルシウムの沈着に良い影響を与える。
【００１５】
本発明において、インプラント物とは、損傷した組織構造の回復を助けるため、又は組織及び／若しくは臓器を支持する、又は（一部）置換するために、ヒト又は動物の身体に移植できるあらゆる物を指す。インプラント物の例として、ステント、固定プレート（fixation plates）、固定ねじ、骨髄ピン（medullary nails）、寛骨臼カップ、組織再生誘導膜、口腔用インプラント、カテーテル、整形外科用インプラント、ペースメーカー、心臓弁等を挙げることができる。
【００１６】
本発明において、吸着した（adsorbed）又は吸着（adsorption）とは、あらゆる非共有結合性の結合を意味する。
【００１７】
１つの実施形態において、ポリヌクレオチド又はその均等物を含有するコーティングは、静電的相互作用によってインプラント物上に吸着される。ポリヌクレオチド又はその均等物をインプラント物に静電的に付着させる技術の１つに、静電的自己組織化（electrostatic self-assemby）（ＥＳＡ）がある。例えば、インプラントの表面は、インプラント上への吸着を容易にするために気体プラズマ（グロー放電）、アルカリ又は酸処理（飽和水酸化ナトリウム又は強酸溶液に基材を浸漬する）を適用する等の処理をすることができる。表面が正電荷を帯びたインプラントを、例えばＤＮＡの溶液に単に浸漬するだけで、ＤＮＡがインプラント上に自己組織化する。あるいは、表面が負電荷を帯びるようにインプラントを処理しても良い。その場合、インプラントをポリカチオン溶液に浸漬することでインプラント上にポリカチオンを自己組織化させることができ、次の工程で上記インプラントをＤＮＡ溶液に浸漬することで、静電的に付着するＤＮＡでインプラント物をコーティングすることができる。また、適切な機能を付与するポリカチオンが静電的にインプラント物に付着している場合、ＤＮＡ又はその均等物を上記ポリカチオンに結合させることで共有結合性相互作用を生じさせることができる。また、ポリヌクレオチド又はその均等物を含有する多層膜は、交互吸着法（layer-by-layer (LbL) assembly）としても知られるＥＳＡによって作製することができる。この技術を用いれば、反対の電荷をもつ高分子電解質を、静電相互作用によって交互に段階的に吸着させることで、高分子電解質多層（ＰＥＭ）を製造することができる。また、（静電的に）インプラント物上に吸着する最初のコーティング層を別にすれば、どの時点でも、静電的ではない相互作用、特に共有結合性の付着によって更なる層を付着させることができる。1つの実施形態において、本発明は、コーティングを有するインプラント物に関し、上記コーティングは吸着、又は特に静電相互作用によってインプラント物に付着しているポリヌクレオチド又はその均等物を含有する。
【００１８】
以前にも、ＤＮＡをポリアニオン性の構成要素として、ＥＳＡ技術が応用されたことがある。例えば、Pei et al., Biomacromolecules 2001, vol 2(2), 463は、最初にポリ（エチレンイミン）−（ＰＥＩ−）コーティングされたセンサーチップで開始したリアルタイム表面プラズモン共鳴法によって、ポリ（ジメチルジアリルアンモニウムクロライド）（ＰＤＤＡ）とＤＮＡとからなる連続的な多層膜の形成をモニターしている。また、Luo et al, Biophys. Chem, 2001, vol 94(1-2), 11は、ガラス状カーボン電極及び石英スライド上にＬｂＬ静電堆積法（LbL electrostatic deposition techniques）により作製したＰＤＤＡとＤＮＡの多層膜の研究をしている。
【００１９】
ＥＳＡ法について述べると、インプラントを、正に帯電した（高分子）電解質溶液に浸漬し、次いで負に帯電したポリヌクレオチド又はその均等物（特にＤＮＡ）の溶液に続けて浸漬することで、本発明のコーティングされたインプラント物を調製することができる。この過程は、２回、若しくは３回、若しくは４回、若しくは５回繰り返してもよく、又は６、７、８、９、若しくは１０回若しくはそれ以上繰り返してもよく、それにより多層コーティングを作ることができる。そのような多層コーティングの形成及び特性に影響を与えるパラメーターとしては、正に帯電した高分子電解質の具体的な種類及びポリヌクレオチドの種類の他に、高分子電解質溶液の濃度、浸漬時間、溶液のｐＨ、溶液のイオン強度等がある。
【００２０】
さらに、この作製方法（すなわち、水溶液中への浸漬中）では、ＰＥＭを含むポリヌクレオチドが水に不溶性であることが示されている。ＰＥＭをイオンを多く（すなわち、生理的条件を超えて）含む溶液に浸漬しても、ＰＥＭ構造の解離は起こらなかった。しかし、作製過程中の高分子電解質中のイオン量を変えることは、層の厚みなどのＰＥＭの特性を調節する手段の１つである。インプラント物が十分にコーティングされるようにこれらのパラメーターを選ぶことは、当業者に十分可能である。
【００２１】
１つの実施形態において、正に帯電した（高分子）電解質はポリカチオンであり、したがって、ポリヌクレオチド又はその均等物が二重層中でポリカチオンと静電的に相互作用しているコーティングを有するインプラント物は本発明の一実施形態である。好ましくは、ポリカチオンは、ポリ（Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｔｙｒ）臭化水素酸塩、ポリ−Ｄ／Ｌ−アルギニン塩酸塩、ポリ（Ａｒｇ，Ｐｒｏ，Ｔｈｒ）塩酸塩、ポリ（Ａｒｇ，Ｔｒｐ）塩酸塩、ポリ（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ）臭化水素酸塩、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｄ／Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ／Ｌ−リジン、 ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルポリピロリドン）、ポリアクリルアミド、 ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、 ポリアミリエ（Polyamilie）（エメラルディン塩）、４級化ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−アルト−１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］ウレア］、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（４−ビニルピリジニウムトリブロミドからなる群から選択される。別の実施形態において、インプラント物は、１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０若しくはそれ以上のポリカチオン及びポリヌクレオチドの二重層を含むコーティングを有する。
【００２２】
上に記載したＤＮＡの利点を完全に活用するためには、コーティングの中に静電的に固定されるＤＮＡの量及び形状を調節することが有益である。この目的のために、異なる種類のカチオン性高分子電解質を使用した、異なる種類の多層ＤＮＡコーティングを作製してもよい。この多層ＤＮＡコーティングの性質は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、Ｘ線分光法（X-ray photospectroscopy）（ＸＰＳ）、接触角の測定、及びフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）によって決定することができる。また、コーティング中に固定されたＤＮＡの量は放射性標識ＤＮＡを用いて解析することができる。
【００２３】
コーティング中のポリヌクレオチドはさらに、ポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）中に組み込むことができる薬剤（抗生剤及び／又は抗炎症成分）、及び／又はシグナル伝達物質（例えば、成長因子及び／又はサイトカイン）、及び／又はその他の機能性化合物のような機能的な添加剤を含んでいてよい。要するに、上で定義したＤＮＡを含有し、さらに１つ以上の生物学的活性成分を含有するコーティングを有するインプラントも、本発明の一実施形態である。
【００２４】
インプラント自体を作る材料は、その特定のインプラントの具体的な用途によって決定される。金属からなる又は金属を含むものがインプラントの材料に特に適しており、インプラントに好適な金属にはニオブ、タンタル、コバルトクロム合金、（ステンレス）スチール、特にチタン及びチタン合金がある。例えばチタンなどの複数の金属は、その固有の性質及び天然の形状のため、表面に酸化被膜を形成する。その他にあり得る、コーティングされるのに好適な材料にはバイオセラミックスがあり、例えば酸化アルミニウム（アルミナセラミック；Ａｌ２Ｏ３）、酸化ジルコニウム（ジルコニア；ＺｒＯ２）、リン酸カルシウムセラミックス（ＣａＰ）、及びバイオガラスがある。また、インプラント物は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ（エチレンテレフタラート）（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＦＴＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＬＡ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリプロピレンフマラート（ＰＰＦ）、若しくはポリブチルテレフタラート（ＰＢＴ）のようなポリマー材料からなってもよいし又はこれらを含んでいてもよい。さらに、上で考慮した材料の混合物の全てがインプラント材料の候補となる。
【００２５】
本発明で既に述べたように、ＤＮＡは、その遺伝的特性のためではなく、ＤＮＡの構造に固有な有利な特性のためにコーティングとしてうまく利用できることが判明した。したがって、特にインプラントを受ける必要のある対象にとって、本発明のインプラント物を利用することは、インプラント移植部位における組織反応を改善するために有益である。特に、本発明のインプラント物の使用は、該インプラント物の周辺組織の治癒に有益であり、また、本発明のインプラント物の使用はバイオミネラリゼーションのサポートに有益である。言い換えると、本発明はインプラント移植部位における組織反応の改善方法に関し、該方法はインプラントを受ける必要のある対象への本発明のインプラントの移植を含む。また、該方法は、インプラント物の周辺組織の治癒のための方法であり、バイオミネラリゼーションのサポートのための方法である。
【００２６】
本明細書中及び特許請求の範囲中において、「含有する（含む）（to comprise）」という動詞及びその活用形は、この単語の前にある項目を含みつつ、具体的に言及されていないものも排除しないという、非限定的な意味で使用されている。加えて、不定冠詞”a”又は”an”による要素への言及は、文脈で１つ且つ１つだけの要素であると明示していない限り、その要素が２つ以上ある可能性を排除しない。したがって、不定冠詞”a”又は”an”は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【実施例１】
【００２７】
インプラントを身体組織中に埋植すると、そのデバイスに対する反応が引き起こされる。この反応は異物反応として知られ、炎症や創傷治癒過程が含まれる。この反応の強さ及び期間は、主に表面特性によって決定される。したがって、インプラント材料の表面を調節することで、生体材料界面における生物学的反応を調節する手段を提供することができる。本発明で新規なアプローチは、コーティング材料にＤＮＡを使用することである。ＤＮＡは、その遺伝情報とは関係なく、非免疫原性又は低免疫原性のコーティング材料であり、軟部組織及び硬組織の両方の環境において薬物送達能をもつ。そこで、静電的自己組織化（ＥＳＡ）法によりインプラント物上にＤＮＡコーティングを作製し、多層ＤＮＡコーティングの細胞組織適合性を、初代細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ及びｉｎ ｖｉｖｏでのラットへの移植実験によって評価した。
【００２８】
材料と方法：
ポリアニオン性のＤＮＡ（±３００ｂｐ／分子；ナトリウム塩）は、Nichiro Corporation （横須賀市、神奈川県、日本）の厚意により提供された。ＤＮＡ中のタンパク質不純物の有無をＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce社製、Rockford, Illinois, USA）で調べ、計測の結果、０．２０％ｗ／ｗ未満であった。ポリカチオン性の高分子電解質であるポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ；ＭＷ 約７００００）及びポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ；ＭＷ３００００〜７００００）はSigma社から購入した（Sigma-Aldrich Chemie B.V.社製, Zwijndrecht, the Netherlands）。
【００２９】
ガラス基材及びチタン基材をＥＳＡ法を用いてコーティングした。［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５又は［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５の最終コーティング構造を得るために、ポリカチオン性のポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）又はポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、及びポリアニオン性のＤＮＡを以下に記すように交互に吸着させた。初代ラット皮膚線維芽細胞（ＲＤＦ）を用いて、増殖、細胞毒性（ＭＴＴ）、及び細胞形態（ＳＥＭ）をモニターし、細胞適合性を評価した。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、検体をラットの背部皮下に４〜１２週間移植した。回収した検体（周辺組織を含む）を、組織学的及び組織形態計測的分析に用いて、組織反応をモニターした。
【００３０】
多層ＤＮＡコーティングの作製
Luo et al., Biophys. Chem, 2001, vol 94(1-2), 11に記載のＥＳＡ法に少し修正を加えて用い、多層ＤＮＡコーティングを作製した。クリーニングした基材を、ＰＤＬ（０．１ｍｇ／ｍｌ）又はＰＡＨ（１ｍｇ／ｍｌ）のどちらかの水溶液に、最初のカチオン性の高分子電解質層が基材に吸着するのに十分な時間である３０分間浸漬した。次いで、この基材を超純水で洗浄（５分間、連続流水）し、高圧空気噴流（pressurized air stream）で乾燥させた。その後、この基材を、アニオン性のＤＮＡ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）とそれぞれのカチオン性高分子電解質溶液に、間に超純水での洗浄（５分間、連続流水）及び高圧空気噴流を用いた乾燥をはさみ、交互に７分間ずつ浸漬した。多層ＤＮＡコーティングの積層を、全部で二重層が５つになるまで続けた。これらを［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５又は［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５と呼ぶ（コーティングの表示は二重層の数を指すことに限定される。すなわち、１／２とは、二重層のうちのカチオン性部分のみを意味する）。
【００３１】
コーティング分析−原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）
チタンをスパッタした非コーティングシリコン、部分的多層ＤＮＡコーティング（［ＰＤＬ／ＤＮＡ］１／２及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］１／２；［ＰＤＬ／ＤＮＡ］２及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］２；［ＰＤＬ／ＤＮＡ］３と１／２及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］３と１／２）、及び完全多層ＤＮＡコーティング（［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５）の形状を、Nanoscope IIIa AFM (Digital Instruments社製、Buffalo, NY, USA)を用いて分析した。
【００３２】
コーティング分析−放射性標識ＤＮＡを用いた多層ＤＮＡコーティングの積層
放射性標識ＤＮＡを用いて、多層コーティング中に固定されたＤＮＡの量を調べた。ＤＮＡ水溶液に、放射性標識ＤＮＡを最終濃度１ｍｇ／ｍｌで添加した。カチオン性の高分子電解質水溶液の濃度は上述の通りである。ガラス基材及びチタン基材上に、多層コーティングを上述の通り作製した。二重層が１、２、３、４、及び５つ完成した後、基材を作製工程から取り出し、シンチレーション液に浸漬し、液体シンチレーションカウンターを用いて計測した。比較として、最初のＤＮＡ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを含むサンプルを計測した。全ての実験サンプル及びコントロールサンプルは３連で行った。
【００３３】
結果
ＥＳＡ法を用いて、ガラス基材及びチタン基材上にＤＮＡコーティングを作製した。これらの多層ＤＮＡコーティングは、約３μｇＤＮＡ／ｃｍ２／二重層を取り込んでおり、ＡＦＭによって、ナノレベルの表面粗さが確認された。
【００３４】
原子間力顕微鏡
チタンをスパッタしたシリコン上の、部分的又は完全な多層ＤＮＡコーティングの表面形状をＡＦＭを用いて調べた。
【００３５】
［ＰＤＬ／ＤＮＡ］二重層及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］二重層の（部分的又は完全な）多層ＤＮＡコーティングの高さを分析したところ、どちらの種類のコーティングにおいても、表面粗さの増加が視認された。両方の種類の多層ＤＮＡコーティングのＲＭＳ値を用いて、表面粗さを更に調べたところ、［ＰＤＬ／ＤＮＡ］１／２及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］２からの全ての段階（すなわち、１と１／２二重層）で、コーティングを積層している間の有意な増加が示された。さらに、二重層が２つ堆積した後では、［ＰＤＬ／ＤＮＡ］コーティングのＲＭＳ値は対応する［ＰＡＨ／ＤＮＡ］コーティングのＲＭＳ値より有意に低かった。
【００３６】
２種類のコーティング間での表面形状の代表的な違いとして、高度（elevation）の高さの平均値に加えて、その空間的分布があった。［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５の外観が比較的均質な形状で、その高度は高さが比較的低く（平均６ｎｍ）、等間隔な分布を示したのに対し、［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５はランダムに分布された比較的高い（平均１４ｎｍ）高度を示した。これらの違いを図で説明するために、両方の完全多層ＤＮＡコーティングの３Ｄ画像再構成を図１に示す。
【００３７】
多層コーティング積層中のＤＮＡ固定化
多層ＤＮＡコーティング中に固定されるＤＮＡの量（μｇ／基材）を放射性標識ＤＮＡを用いて分析した。ガラス上では、最初の二重層に固定されるＤＮＡ量は、［ＰＡＨ／ＤＮＡ］コーティングより［ＰＤＬ／ＤＮＡ］コーティングの方が多い。チタン基材上では、両方の種類の多層ＤＮＡコーティングの最初の二重層中に同量のＤＮＡが固定された。基材材料（すなわち、ガラス又はチタン）に関係なく両方の種類の多層ＤＮＡコーティングで、続いて吸着した各二重層中には一定量のＤＮＡが固定される。多層ＤＮＡコーティング中に固定されるＤＮＡの量は、おおよそ１〜１５μｇＤＮＡ／ｃｍ２／二重層である。
【００３８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験によって、下地の基材に関係なく、両方の種類の多層ＤＮＡコーティング上でＲＤＦ細胞増殖の増加が示された（ｐ＜０．０５）（図２）。どちらの種類の多層ＤＮＡコーティングにも細胞毒性がないことがＭＴＴアッセイで示された。さらに、細胞の形態に変化は見られなかった。
【００３９】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験において、移植期間中、創傷治癒に伴う合併症の兆しは見られなかった。組織学的解析により、非コーティングコントロールと比べて、コーティングした検体に対する組織反応に変化がないことが示された（図３）。線維組織被膜における線維細胞層の数及び線維被膜の質について、コントロールと比較して、コーティングした検体で違いはみられなかった。
【００４０】
ディスカッション及び結論
反対に帯電された基材を最適に被覆するための１つの方法は、中性の酸性度（neutral acidity）で過度に帯電している高分子電解質（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ＰＥＩ；又はポリ（スチレンスルホン酸）、ＰＳＳ）を最初の層として利用することである。しかし、これは必須ではない。
【００４１】
［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５及び［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５コーティングの成長は両方とも直線的であった。しかし、最初の吸着層に吸着されるカチオン性高分子電解質の量、及び使用されるカチオン性高分子電解質に特有な異なる種類の基材に対する特異的親和性の結果、最初の二重層に固定されるＤＮＡ量の基材依存的な差異が生じ得る。
【００４２】
多層ＤＮＡコーティングは線維芽細胞の増殖を促進し、細胞毒性効果を誘導せず、且つ線維芽細胞の形態を変化させない。移植したとき、多層ＤＮＡコーティングは、非コーティングコントロールと比べて、被膜中の線維芽細胞層の数及び被膜の質に何の違いも生じさせない。したがって、多層ＤＮＡコーティングの細胞組織適合性が実証される。
【実施例２】
【００４３】
インプラント学分野においては、生体材料を埋入した後の組織反応の調節が課題である。ここ数十年、例えば生体材料表面の局所的及び／又は化学的修飾などの、組織反応を調節するための様々な方法が研究されてきた。さらに、インプラント周辺において所望の組織反応を誘導するために、生体材料を生物学的活性因子と組み合わせることが行われてきた。
【００４４】
現在の研究は、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）又はポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）のどちらかをカチオン性成分、ＤＮＡをアニオン性成分として積層された多層ＤＮＡコーティングの３種類の機能化に焦点を合わせている（図４）。多層ＤＮＡコーティング中にローディングされるＢＭＰ−２の量及びその後の放出特性を放射性標識したＢＭＰ−２を用いて調べた。続いて、骨髄に由来する骨芽細胞様細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける挙動に対する、ＢＭＰ−２機能化多層ＤＮＡコーティングの影響を、増殖、分化、ミネラリゼーション、及び細胞形態の点から評価した。
【００４５】
材料と方法：
ポリアニオン性のＤＮＡ（３００ｂｐ／分子；ナトリウム塩）はCentral Research Laboratory of Nichiro Corporation（川崎市、神奈川県、日本）の厚意により提供された。ＤＮＡ中のタンパク質不純物の有無について、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce社製、Rockford, IL, US）を用いて調べたところ、測定値は０．２０％ｗ／ｗ未満であった（データ非公開）。ポリカチオン性高分子電解質であるポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ；ＭＷ 約７００００）及びポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ；ＭＷ ３０，０００〜７０，０００）はSigma社（Sigma-Aldrich Chemie B.V., Zwijndrecht, the Netherlands）から購入した。組換えヒト骨形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ−２；ＭＷ ３２，０００）はYamanouchi Europe B.V.社（Leiderdorp, the Netherlands）の厚意で提供された。全ての材料は更に精製することなく用いた。
【００４６】
基材の調製及びクリーニング
ディスク型のチタン基材（直径１２ｍｍに機械加工）を使用した。多層ＤＮＡコーティングを製造する前に、基材をそれぞれ、硝酸（１０％ｖ／ｖ）、アセトン、及びイソプロパノール中で超音波洗浄し、その後、その基材を風乾した。
【００４７】
多層ＤＮＡコーティングの作製
以前の記述のとおり、ＥＳＡ法を用いて多層ＤＮＡコーティングを作製した。簡潔に述べると、クリーニングした基材をＰＤＬ（０．１ｍｇ／ｍｌ）又はＰＡＨ（１ｍｇ／ｍｌ）の水溶液に、基材上に最初のカチオン性高分子電解質層が吸着するのに十分な時間である３０分間浸漬した。次いで、その基材を超純水で洗浄（５分間、連続流水）し、高圧空気噴流で乾燥させた。その後、アニオン性ＤＮＡ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）とそれぞれのカチオン性高分子電解質溶液に、間に超純水による洗浄（５分間、連続流水）及び高圧空気噴流による乾燥を挟みつつ、基材を交互に７分間ずつ浸漬した。二重層が全部で５つになるまで多層ＤＮＡコーティングの積層を続けた。これらのコーティングを［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５又は［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５と呼ぶこととする。
【００４８】
多層ＤＮＡコーティングの機能化
ｒｈＢＭＰ−２を３つの異なる様式でローディングすることで、多層ＤＮＡコーティングを機能化した（図４）。上記ローディング様式を、ＢＭＰ−２の位置により、表層（ｓ）、深層（ｄ）、及び二重層（ｄｌ）と呼ぶこととする。多層ＤＮＡコーティングの積層中に、ｒｈＢＭＰ−２を適当な位置にローディングし（１０μｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２溶液１０μｌを含む０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ）、７分間吸着させた。多層ＤＮＡコーティングの最表面にｒｈＢＭＰ−２が適用されたときを除いて、基材を超純水で洗浄し、その後、コーティングの積層を上述のように続けた。コーティングの最表面に適用した（ｄｌ−ローディングの最後の段階及びｓ−ローディングの場合）ｒｈＢＭＰ−２は室温で乾燥させた。
【００４９】
ｒｈＢＭＰ−２の放射性ヨウ素化（radioiodination）
以前の記述のとおり、Iodogen法を用いて、ｒｈＢＭＰ−２を１２５Ｉで標識した。簡潔に述べると、１００μｇのiodogenが入った５００μｌエッペンドルフチューブに、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１０μｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を８０μｌ、（２．６μｌのＰＢＳ中）ｒｈＢＭＰ−２を１０μｇ、及び１２５Ｉ（０．３ｍＣｉ）を３μｌ添加した。このチューブを室温で１０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳのチロシン飽和溶液１００μｌを添加し、消光反応を開始させた。最後に、プレリンスした使い捨てセファッデクスＧ２５Ｍカラム（ＰＤ−１０；Pharmacia社製、Uppsala,Sweden）上で、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いてこの反応混合液を溶出し、標識ｒｈＢＭＰ−２を遊離１２５Ｉから分離した。ｒｈＢＭＰ−２が固着するのを防ぐために、放射性ヨウ素化時に使用するピペットのチップとチューブには、SigmaCoat（登録商標）（Sigma社製）を用いてシラン処理を行った。
【００５０】
Gelman ITLC-SG strip（Gelman Laboratories社製、Ann Arbor, MI, USA）上で、移動相として０．１Ｍクエン酸（ｐＨ５．０）を用いたインスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）により、１２５Ｉ標識ｒｈＢＭＰ−２の放射化学的純度を調べた。この１２５Ｉ標識ｒｈＢＭＰ−２標品の放射化学的純度は９７．３％であった。これは、９７．３％の１２５Ｉ標識がｒｈＢＭＰ−２に共有結合的に結合していることを示している。標識ｒｈＢＭＰ−２の比活性は１４．１μＣｉ／μｇであった。
【００５１】
ｒｈＢＭＰ−２ローディング及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒｈＢＭＰ−２放出の決定
機能化多層ＤＮＡコーティング中にローディングされたｒｈＢＭＰ−２の量を放射性標識ｒｈＢＭＰ−２を用いて調べた。機能化は、放射性標識ｒｈＢＭＰ−２を用いた以外は、「多層ＤＮＡコーティングの機能化」のセクションに記載の通りに行った。各種類のコーティングについて、３個の基材（ｎ＝３）を、機能化多層ＤＮＡコーティングでコーティングした。
【００５２】
ローディングされたｒｈＢＭＰ−２の量は、遮蔽したウェル型ガンマカウンター（Wizard, Pharmacia-LKB社製、 Sweden）中における実験基材の活性を測定することで決定した。深層にローディングした（ｄ−機能化）多層ＤＮＡコーティング及び二重層にローディングした（ｄｌ−機能化）多層ＤＮＡコーティングのガンマ放射量は、表層にローディングした（ｓ−機能化）多層ＤＮＡコーティングのガンマ放射量（１００ｎｇに設定）と相関していた。
【００５３】
ｒｈＢＭＰ−２のｉｎ ｖｉｔｒｏ放出特性を調べるために、各種の機能化多層ＤＮＡコーティングを施した基材（ｎ＝３）を別々に、４ｍｌのＰＢＳの入った１０ｍｌのガラスバイアルに入れ、３７℃で最大８週間まで静かにインキュベートした。選択した時間（４時間、１、７、１４、２２、２８、４２、及び５６日）に、新鮮なＰＢＳを含む新しいバイアルにサンプルを注意深く移した。その後、基材上の活性をガンマカウンター内で測定した。放射性崩壊を補正するために、標準を同時に計測した。
【００５４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
細胞培養実験には、コーティングの成分及びローディング様式に基づいて、７つの実験群を用いた。
１．［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５−ｓ（表層）
２．［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５−ｄ（深層）
３．［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５−ｄｌ（二重層）
４．［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｓ（表層）
５．［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄ（深層）
６．［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄｌ（二重層）
７．コントロール（非コーティングチタン）
【００５５】
以前のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験により、［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５及び［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５多層コーティングと比較したとき、非コーティングチタン上において、骨芽細胞様細胞が、細胞増殖、分化、ミネラリゼーション、及び形態に関して、同様な挙動をすることが示されていた（非公開データ）ことから、非コーティングチタンからなるコントロールの使用が適切であると判断した。
【００５６】
いずれかの種類の多層ＤＮＡコーティングがされた基材又は非コーティングコントロール基材の全てをＵＶ照射処理（２５４ｎｍ；４時間）により滅菌した。独立した２連で、全ての細胞培養実験を行い、１連につき１頭のラットからの骨髄細胞を用いた。
【００５７】
ラット骨髄細胞の単離及び前培養
Maniatopoulos et al.から採用した方法を用いて、ラット骨髄（ＲＢＭ）細胞を単離及び培養した。簡潔に述べると、オスWistar WUラットの大腿骨を取り出し、きれいにし、骨端を切除した。細胞培養液（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Gibco社製）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Sigma社製）、１０ｍＭ β−グリセロリン酸Ｎａ（Sigma社製）、１０−８Ｍ デキサメタゾン（Sigma社製）、及び５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（Gibco社製）を添加したα−ＭＥＭ（Gibco社製））を用いて、残った骨幹から髄を洗い流した。２つの大腿骨のＲＢＭ細胞を、７５ｃｍ２の培養フラスコ（Greiner Bio-One社製）を３つ用いて、細胞培養液中で１日、静的条件下で培養し、次いで、培養液を新鮮なものと交換して非接着細胞を除去した。その後、付着細胞をさらに６日間前培養した。７日間初代培養して骨芽細胞様細胞を得た後、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン、０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ）を用いて細胞を剥がし、Coulter（登録商標）カウンター（Beckman Coulter Inc.社製, Fullerton, CA, USA）を用いて総細胞数を決定した。最後に、実験基材上に細胞を１×１０４細胞／ｃｍ２の密度で２４ウェルプレート（Greiner Bio-One社製）上に播種した。播種１日後、及びその後は週に３回、細胞培養液を新鮮なものに変えた。
【００５８】
細胞増殖
総細胞タンパク質の測定値に基づいて細胞増殖曲線を作成した。播種後４、８、１２、及び１６日目に培地を除去して細胞をＰＢＳで３回洗浄した。続いて、付着細胞の付いた実験基材を新しい２４ウェルプレートに移し、各実験基材を１ｍｌの超純水に浸した。これらのサンプルを３回繰り返し凍結及び解凍し、その後マイクロＢＣＡタンパク質アッセイ（micro BCA protein assay）（Pierce社製、Rockford, IL, USA）をメーカーの説明書に従って用いて、水溶性サンプルに含有される細胞タンパク質含量を解析した。各実験の連で、再現性を高めるために、それぞれの実験条件に対して各時間のサンプルを３つ（ｎ＝３）用いた。
【００５９】
アルカリホスファターゼ活性
以前に記載されている方法により、増殖アッセイの水溶性サンプルを用いて、骨芽細胞様細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を骨芽細胞様細胞の早期分化マーカーとして測定した。体積８０μｌのサンプル又は標準、及び２０μｌの緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）をピペットで９６ウェルプレート（Greiner Bio-One社製）に２連（in duplo）で移し、各ウェルに１００μｌの基質溶液（５ｍＭ ｐ−ニトロ−フェニル−ホスフェート）を加えた。続いてこのプレートを３７℃で１時間インキュベートし、その後、０．３ＭのＮａＯＨを１００μｌ加えることで反応を停止させた。４ニトロフェノールの段階希釈物（最終濃度０〜２５ｎＭ）を検量線に用いた。プレートは、ＥＬＩＳＡリーダー内で４０５ｎｍを読み取った。各実験の連で、それぞれの実験条件に対して各時間のサンプルを３つ（ｎ＝３）用いた。
【００６０】
カルシウム沈着
骨芽細胞様細胞の後期分化マーカーとして、カルシウムの沈着を用いた。細胞培養４、８、１２、１６、及び２４日後のカルシウム沈着量を、以前に記載があるように、オルトクレゾールフタレインコンプレクソン（ＯＣＰＣ）法（Sigma）で測定した。簡潔に述べると、実験基材をＰＢＳで２回洗浄し、その後、０．５Ｎの酢酸を１ｍｌ添加した。振盪器上で一晩インキュベートした後、９６ウェルプレート（Greiner Bio-One社製）中で、サンプル１０μｌに希釈標準溶液を３００μｌ加えた。希釈標準溶液は、（ａ）ＯＣＰＣ溶液（８０ｍｇのＯＣＰＣを溶かしたミリＱ７５ｍｌ＋１ＭのＫＯＨを０．５ｍｌ＋０．５Ｎの酢酸を０．５ｍｌ）、（ｂ）１４．８Ｍエタノールアミン／ホウ酸緩衝液（ｐＨ＝１１）、（ｃ）８−ヒドロキシキノリン（２０ｍｌの９５％エタノール中に１ｇ）、及び（ｄ）ミリＱからなり、これらの比率は５：５：２：８８（ａ：ｂ：ｃ：ｄ）である。ＣａＣｌ２の段階希釈（０〜１００μｇ／ｍｌ）を調製し、検量線を作成した。各実験の連において、それぞれの実験条件における各時間の３つの基材を用いてカルシウムアッセイを行った（ｎ＝３）。
【００６１】
細胞形態
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、細胞の外観（appearance）の形態を評価した。播種後４及び１６日目、基材及び付着した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、グルタールアルデヒド（０．１Ｍ カコジル酸緩衝液中、４％）で２０分固定した。続いて、この基材を０．１Ｍのカコジル酸緩衝液で２回洗浄し、段階的なエタノールシリーズで脱水した。最後に、基材をテトラメチルシランで乾燥させ、金でスパッタコーティングし、JEOL 6310 SEMを用いて、１０ｋＶの加速電圧で評価した。
【００６２】
統計分析
測定値は、Graphpad（登録商標） Instat 3.05ソフトウェア（GraphPad Software Inc.社製, San Diego, CA, USA）を用いて評価した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの放出実験及び細胞培養実験のデータは、一元配置分散分析と事後（post-hoc）Tukey-Kramer多重比較検定を組み合わせて用いて解析した。有意水準はｐ＜０．０５とした。
【００６３】
結果
ｒｈＢＭＰ−２と多層ＤＮＡコーティングのローディング
多層ＤＮＡコーティング中へローディングされたｒｈＢＭＰ−２の量を図５に示す。この結果は、異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング中へ取り込まれたｒｈＢＭＰ−２の量がｄｌ−ローディングで最大となり、ｓ−ローディングでは中間、そしてｄ−ローディングで最も少ない（ｄｌ−ローディング＞ｓ−ローディング＞ｄ−ローディング）ことを示している。［ＰＤＬ／ＤＮＡ］ベースのコーティングと［ＰＡＨ／ＤＮＡ］ベースのコーティングの間に統計的に有意な差は見られなかった。
【００６４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける多層ＤＮＡコーティングからのｒｈＢＭＰ−２の放出
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける多層ＤＮＡコーティングからのｒｈＢＭＰ−２の放出特性を、放射性標識ｒｈＢＭＰ−２を用いて調べた。図６Ａ及び図６Ｂに、異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティングからのｒｈＢＭＰ−２の累積放出を示す。異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティングの全てにおいて、ＰＢＳ中での最初の２４時間のインキュベーション中に、初期バースト放出（initial burst release）がみられ、この放出は最初にローディングされたｒｈＢＭＰ−２の量の３５〜７５％の範囲であった。割合としては、このバースト放出はｄ−ローディングで低く（［ＰＤＬ／ＤＮＡ］ベースの多層ＤＮＡコーティングで４７．６％、［ＰＡＨ／ＤＮＡ］ベースの多層ＤＮＡコーティングで３４．８％）、ｓ−及びｄｌ−ローディングの多層ＤＮＡコーディングの両方で高かった（＞６０％）。バースト放出の後は、異なるローディングをした全ての多層ＤＮＡコーティングが、一定の割合（１週間毎に、残りのｒｈＢＭＰ−２の約６〜８％）の持続性放出を示した（表１）。８週間インキュベートした後のｒｈＢＭＰ−２の累積放出量は、ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングでは約７０％であり、一方、ｓ−ローディング及びｄｌ−ローディングＤＮＡコーティングでは約８５％であった。統計分析により、放出されたｒｈＢＭＰ−２の実際の累積量はｄｌ−ローディングで最大、ｓ−ローディングで中間、そしてｄ−ローディングで最小であることが示された。［ＰＤＬ／ＤＮＡ］又は［ＰＡＨ／ＤＮＡ］のいずれをベースにして均等に機能化したコーティングにおいても、パーセンテージの上では、放出特性に統計的に有意な差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。
【００６５】
【表１】
【００６６】
ｒｈＢＭＰ−２をローディングした多層ＤＮＡコーティング上での骨芽細胞様細胞の挙動
異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での骨芽細胞様細胞の挙動を評価し、取り込まれたｒｈＢＭＰ−２の生物学的活性を検出した。
【００６７】
細胞増殖
総細胞タンパク質含量測定値に基づく骨芽細胞様細胞の増殖を図７に示す。骨芽細胞様細胞は、異なるローディングをした全ての多層ＤＮＡコーティング上及び非コーティングコントロール基材上で、同様な増殖パターンを示した。細胞播種後、骨芽細胞様細胞が増殖を始め、約１２日目で最大数に達し、その後は減少が観察された。両方の種類のｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングで、１２日目に、細胞タンパク質含量について幾分低いが有意な差が見られた（［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５−ｄ vs コントロール、ｐ＜０．０１；［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄ vs コントロール、ｐ＜０．０５）。骨芽細胞様細胞の培養１６日後において、両方の種類のｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングとコントロールとの間に有意な差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。
【００６８】
アルカリフォスファターゼ活性
骨芽細胞様細胞のＡＬＰ活性は、全ての実験基材上で、培養の最初の１２日間は増加し、その後急速に減少した（図８）。１２日目において、両方の種類のｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングで、コントロールと比べて有意な差が見られた（ｐ＜０．０５）。
【００６９】
カルシウム沈着
骨芽細胞様細胞によってミネラル化した細胞外マトリックスの沈着を、細胞培養中に実験基材上に沈着したカルシウムの量を測ることで調べた（図９）。非コーティングコントロールと比較して、ｓ−及びｄｌ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上において、骨芽細胞様細胞による加速的なカルシウムの沈着が見られた。１２日目において、ｓ−及びｄｌ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上で骨芽細胞様細胞が沈着させたカルシウムの量は、非コーティングコントロールと比べて有意に増加していた（ｐ＜０．００１）。その一方で、ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングでは、骨芽細胞様細胞によるカルシウム沈着は減少していた。１６及び２４日目において、これらの種類の機能化多層ＤＮＡコーティング上でのカルシウム沈着の有意な減少が観察された（ｐ＜０．００１）。
【００７０】
細胞形態
異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上で培養した骨芽細胞様細胞の形態学的外観を、走査型電子顕微鏡を用いて評価した。４日目には、異なるローディングをした全ての多層ＤＮＡコーティング及び非コーティングコントロールが、骨芽細胞様細胞の層で覆われていた。細胞の形態に違いは見られなかった。対照的に、ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングの１６日目では、他の全ての実験群と比較して、骨芽細胞様細胞の異常な形態が観察された（図１０）。ｓ−、及びｄｌ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上並びに非コーティングコントロール上に、コラーゲンの束に付着した多くの石灰化した球形の沈着が見られた。ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上では、より少ないミネラリゼーションが観察された。
【００７１】
結論
本研究は、異なる３つのローディング様式（すなわち、表層（ｓ）、深層（ｄ）、及び二重層（ｄｌ））でＢＭＰ−２を埋め込むことで、多層ＤＮＡコーティングを機能化できることを実証している。ＢＭＰ−２は、ｓ＋（４＊ｄ）＝ｄｌという割合で、多層ＤＮＡコーティング中に取り込まれた。放出特性では、異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティングの全てで、初期バースト放出、続いて（少なくとも）８週間にわたる残りのＢＭＰ−２の持続性放出が示された。ラット骨髄由来骨芽細胞様細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養実験によって、ｓ−、及びｄｌ−ローディング多層ＤＮＡコーティング上でカルシウム沈着が加速されたことから、ローディングした成分が生物学的活性を維持しており、細胞増殖にも影響しないことが示された。対照的に、ｄ−ローディング多層ＤＮＡコーティングでは、骨芽細胞様細胞の挙動に影響が現れ、カルシウム沈着が減少した。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１ａ】［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５のＡＦＭ画像の３次元再構成を示す図である。
【図１ｂ】［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５のＡＦＭ画像の３次元再構成を示す図である。
【図２】チタン基材上でのＲＤＦの増殖を示す図である。白いバー＝非コーティング・コントロール、灰色のバー＝［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５、黒いバー＝［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５。＊は、非コーティング・コントロールと比べて有意な差があることを示す（ｐ＜０．０５）。
【図３】ガラス［ＰＤＬ／ＤＮＡ］５基材周辺の組織被膜（tissue capsule）の組織学的横断切片を示す図である。
【図４】ＢＭＰ２のローディング様式が異なる、多層ＤＮＡコーティングを表す模式図である。
【図５】多層ＤＮＡコーティング中へのｒｈＢＭＰ−２の取り込みを示す図である。結果は平均値＋ＳＤで示している（ｎ＝３）。
【図６】ＰＢＳに浸漬した後の、異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティングからのｒｈＢＭＰ−２のｉｎ ｖｉｔｒｏ放出を示す図である。（Ａ）［ＰＤＬ／ＤＮＡ］をベースにした多層ＤＮＡコーティングにおける放出特性；（Ｂ）［ＰＡＨ／ＤＮＡ］をベースにした多層ＤＮＡコーティングにおける放出特性（ｓ＝表層、ｄ＝深層、ｄｌ＝二重層）。結果は平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で示している。
【図７】異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での、骨髄由来骨芽細胞様細胞の増殖を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（コントロールとの比較において））。
【図８】異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での、骨髄由来骨芽細胞様細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す図である（＊コントロールとの比較でｐ＜０．０５）。
【図９】異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での、骨髄由来骨芽細胞様細胞のミネラリゼーション（カルシウム沈着）を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１（コントロールとの比較において））。
【図１０】異なるローディングをした多層ＤＮＡコーティング上での、１６日間培養後の骨髄由来骨芽細胞様細胞の走査型顕微鏡像を示す図である。（Ａ）非コーティングコントロール、（Ｂ）［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｓ、（Ｃ）［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄ、及び（Ｄ）［ＰＡＨ／ＤＮＡ］５−ｄｌ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド又はその均等物とポリカチオンとを含有するコーティングを有するインプラント物。
【請求項２】
ポリヌクレオチド又はその均等物が、ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−Ｏ−アリルＲＮＡ、ＤＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び固定核酸（ＬＮＡ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のインプラント物
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載のインプラント物。
【請求項４】
ポリヌクレオチド及びポリカチオンが二重層中に存在することを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載のインプラント物。
【請求項５】
ポリカチオンが、ポリ（Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｔｙｒ）臭化水素酸塩、ポリ−Ｄ／Ｌ−アルギニン塩酸塩、ポリ（Ａｒｇ，Ｐｒｏ，Ｔｈｒ）塩酸塩、ポリ（Ａｒｇ，Ｔｒｐ）塩酸塩、ポリ（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ）臭化水素酸塩、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｄ／Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ／Ｌ−リジン、ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルポリピロリドン）、ポリアクリルアミド、ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリアミリエ（エメラルディン塩）、４級化ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−アルト−１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］ウレア］、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（４−ビニルピリジニウムトリブロミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載のインプラント物。
【請求項６】
ポリカチオンとポリヌクレオチドの二重層を１つ以上有する１〜５いずれかに記載のインプラント物。
【請求項７】
さらに１又は複数の生物学的活性成分を含むことを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載のインプラント物。
【請求項８】
インプラント物が、ステント、固定プレート、固定ねじ、骨髄ピン、寛骨臼カップ、組織再生誘導膜、口腔用インプラント、カテーテル、整形外科用インプラント、ペースメーカー、心臓弁であることを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載のインプラント物。
【請求項９】
インプラントが移植された部位における組織反応を改善するための請求項１〜８いずれかに記載のインプラント物の使用。
【請求項１０】
インプラント物周辺組織の治癒のための請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
バイオミネラリゼーションをサポートするための請求項９に記載の使用。
【請求項１】
ポリヌクレオチド又はその均等物とポリカチオンとを含有するコーティングを有するインプラント物。
【請求項２】
ポリヌクレオチド又はその均等物が、ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−Ｏ−アリルＲＮＡ、ＤＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び固定核酸（ＬＮＡ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のインプラント物
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載のインプラント物。
【請求項４】
ポリヌクレオチド及びポリカチオンが二重層中に存在することを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載のインプラント物。
【請求項５】
ポリカチオンが、ポリ（Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｔｙｒ）臭化水素酸塩、ポリ−Ｄ／Ｌ−アルギニン塩酸塩、ポリ（Ａｒｇ，Ｐｒｏ，Ｔｈｒ）塩酸塩、ポリ（Ａｒｇ，Ｔｒｐ）塩酸塩、ポリ（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ）臭化水素酸塩、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｄ／Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ／Ｌ−リジン、ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルポリピロリドン）、ポリアクリルアミド、ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリアミリエ（エメラルディン塩）、４級化ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−アルト−１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］ウレア］、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（４−ビニルピリジニウムトリブロミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載のインプラント物。
【請求項６】
ポリカチオンとポリヌクレオチドの二重層を１つ以上有する１〜５いずれかに記載のインプラント物。
【請求項７】
さらに１又は複数の生物学的活性成分を含むことを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載のインプラント物。
【請求項８】
インプラント物が、ステント、固定プレート、固定ねじ、骨髄ピン、寛骨臼カップ、組織再生誘導膜、口腔用インプラント、カテーテル、整形外科用インプラント、ペースメーカー、心臓弁であることを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載のインプラント物。
【請求項９】
インプラントが移植された部位における組織反応を改善するための請求項１〜８いずれかに記載のインプラント物の使用。
【請求項１０】
インプラント物周辺組織の治癒のための請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
バイオミネラリゼーションをサポートするための請求項９に記載の使用。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５２９６５２（Ｐ２００８−５２９６５２Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５５０４５（Ｐ２００７−５５５０４５）
【出願日】平成１８年２月１４日（２００６．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０５００２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８８３６８
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０７２７３０１３）
【氏名又は名称原語表記】Ｓｔｉｃｈｔｉｎｇ ｖｏｏｒ ｄｅ Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｗｅｔｅｎｓｃｈａｐｐｅｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１４日（２００６．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０５００２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８８３６８
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０７２７３０１３）
【氏名又は名称原語表記】Ｓｔｉｃｈｔｉｎｇ ｖｏｏｒ ｄｅ Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｗｅｔｅｎｓｃｈａｐｐｅｎ
【Ｆターム（参考）】
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