ウイルス感染の治療及び予防又は治療及び予防の改善
ＨＣＶ遺伝子型１〜６の各々を代表するＨＣＶ Ｅ２試料に結合することができる、抗体結合部位を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそのような性質を有するポリペプチド及びＨＣＶ感染を検出し治療する際のそのようなポリペプチドの使用を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を中和することができるリガンド、ＨＣＶに対する抗体を誘発するための様々なアミノ酸残基含有及び／又はヌクレオチド含有組成物、ＨＣＶ感染を予防する及び／又は治療するための方法、及びＨＣＶを検出するための検定装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）に属するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の主要な原因である。ＨＣＶは、これまでに約２億人が感染し、現在の推定では毎年３百万人が新たに感染すると示唆されている（参考文献３）。感染者の約８０％はウイルスを排除することができない。慢性感染が結果として起こり、しばしば重症の慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌を導く（参考文献２、４５）。慢性感染のための現在の治療は効果がなく、予防及び治療ワクチンの開発が急務である。
【０００３】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのエラーの起こりやすい性質及びインビボでの高い複製率（参考文献３４、５０）の故に、ＨＣＶは高い度合の遺伝的変異性を示す。ＨＣＶは６つの遺伝学的に異なる遺伝子型に分類することができ、さらに、それぞれヌクレオチドレベルで約３０％及び１５％に異なる少なくとも７０のサブタイプに細分できる（参考文献６４、６６）。ワクチンの開発のための重要な課題は、ウイルス遺伝子型及びサブタイプの大部分において保存される保護エピトープを同定することである。この問題は、中和応答のための天然の標的であるエンベロープタンパク質が最も可変性の高い２つのタンパク質であるということにより、さらに困難なものとなる（参考文献１０）。
【０００４】
エンベロープタンパク質、Ｅ１及びＥ２は、細胞の結合と侵入の役割を担う（参考文献４、８、１７、５５、６１）。それらは、Ｎ末端細胞外ドメイン及びＣ末端疎水性膜アンカーを有する（参考文献１２、２３、２４）Ｎ結合グリコシル化（参考文献２２、２５、３５、４７、６７）膜貫通タンパク質である。インビトロでの発現実験は、Ｅ１及びＥ２タンパク質が非共有結合へテロ二量体を形成することを示し、そのヘテロ二量体はウイルス表面の機能性複合体であると提案されている（参考文献１４、１５、１８、２４）。また、ウイルス侵入の正確な機構については、効率的な培養系が存在しないため不明である。単離一次肝細胞及び細胞系への侵入が、細胞表面受容体ＣＤ８１及びスカベンジャー受容体クラスＢ１型（ＳＲ−Ｂ１）との相互作用を必要とする（参考文献６、７、２０、６３、７１）という報告は増加傾向にあるが、これらの受容体単独ではウイルスの侵入を可能にするためには十分でない。
【０００５】
現在の証拠は、細胞性免疫が急性感染におけるウイルス複製の排除と制御に関して極めて重要であることを示唆する（参考文献３６、７２）。しかし、動物感染や細胞及び受容体結合アッセイなどの感染の代理モデルは、急性及び慢性の両方の感染における抗体の潜在的役割を強調した（参考文献５、２６、２７、４０、５９、６１、６２、６８、７３、７４）。当然ながら、中和抗体は線状エピトープと立体的エピトープの両方を認識する。幅広い中和能力を示す抗体の大部分は、Ｅ２内の立体的エピトープを対象とする（参考文献１、９、３７、３８、４０）。保存された立体的エピトープを認識する抗体の誘導はワクチン設計にとって極めて重要であるが、可変領域は免疫優性であると思われるので（参考文献５９）、これはおそらく困難であることが判明する可能性が高い。１つのそのような免疫優性線状エピトープはＥ２の第一超可変領域内に存在する（ＨＶＲ１）（参考文献７３）。保存されたＨＶＲ１ミモトープの使用は限られた特異性の問題を克服すると提案されたが（参考文献１１、６０、７５）、このアプローチが成功を収めるかどうかはまだ不明である。本発明者らや他の著者は、ＨＶＲ１のすぐ下流の領域が多くのエピトープを含むことを記述した（参考文献１６、２９、３２、５２、５４、６９）。残基４１２〜４２３を含み、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定義される１個のエピトープは、ＣＤ８１と、可溶性Ｅ２、Ｅ１Ｅ２及びウイルス様粒子を含むＥ２の一連の提示との間の相互作用を阻害する（参考文献５２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＡＰ３３はＣＤ８１結合をブロックすることができるが、これが直接中和能力と相関するかどうか、そしてもし相関するとすれば、それが、任意の有望な治療抗体にとっての基本的性質であるＨＣＶの多様な一連の遺伝的変異体を中和するかどうかは不明である。加えて、ＨＶＲ１の下流の他の線状エピトープも、抗体に基づくワクチンの開発において重要であり得るかどうかは不明である。本発明者ら（参考文献６、８）及び他の著者（参考文献７１）は最近、レトロウイルス粒子の感染力がＨＣＶ Ｅ１Ｅ２エンベロープタンパク質によって付与されるレトロウイルス偽粒子（ｐｐ）アッセイを開発した。このアッセイはまた、抗体及び血清の中和能力を測定するためにも使用できる（参考文献５、４４）。本発明者らは本明細書で、ＡＰ３３抗体、及びＡＰ３３エピトープ並びにＨＶＲ１に近接する領域に位置づけられるエピトープを認識するポリクローナル抗血清の交差中和能力を測定するための遺伝子型１から６を表わすＥ１Ｅ２クローンで再構成されたＨＣＶppの使用を述べる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、先に述べたＡＰ３３と称されるモノクローナル抗体がＨＣＶの６個の公知の遺伝子型１〜６の各々に結合して、それらを中和できることを見出した。ＡＰ３３モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約の下にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ，ＣＡＭＲ Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ ＵＫ；寄託日２００６年１月２７日、アクセッション番号０５１２２１０１）への寄託の対象である。従って、ＡＰ３３によって標的されるエピトープはＨＣＶの遺伝子型１〜６の全てと交差反応性であると推論され、ＡＰ３３を抗ＨＣＶリガンドの標的として及び抗ＨＣＶ抗体を惹起するための免疫原として示唆する。
【０００８】
本発明の最初の態様によれば、従って、ＨＣＶの遺伝子型１〜６の各々による感染の予防又は治療のための組成物の製造において、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定義されるＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドのエピトープに結合することができるリガンドの使用が提供される。
【０００９】
これに関連して、「によって定義される」とは、エピトープが、本発明のリガンドとＡＰ３３がそのエピトープへの結合に関して競合することができるように、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって結合されるのと同じエピトープであることを意味する。
【００１０】
好ましくは、リガンドは、配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（式中、Ｘ1〜7は何らかのアミノ酸である）を有するポリペプチドエピトープに結合することができる。
【００１１】
好ましい実施形態では、Ｘ1は、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｐ及びＬからなる群より選択される。
【００１２】
好ましい実施形態では、Ｘ2は、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＦからなる群より選択される。
【００１３】
好ましい実施形態では、Ｘ3は、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｌ及びＡからなる群より選択される。
【００１４】
好ましい実施形態では、Ｘ4は、Ｎ、Ｑ及びＧからなる群より選択される。
【００１５】
好ましい実施形態では、Ｘ5は、Ｓ、Ｋ及びＴからなる群より選択される。
【００１６】
好ましい実施形態では、Ｘ6は、Ｈ、Ｒ及びＱからなる群より選択される。
【００１７】
好ましい実施形態では、Ｘ7は、Ｉ、Ｌ、Ｆ又はＰからなる群より選択される。
【００１８】
好都合には、ポリペプチドエピトープは、ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＩＮＳＮＧＳＷＨＩ、ＳＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＥＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＨＬＡＮＨＱＧＫＷＲＬ、ＰＬＦＮＡＮＧＴＷＱＦ及びＥＬＲＮＬＧＧＴＷＲＰからなる群より選択される。
【００１９】
リガンドは、好ましくは免疫グロブリンである。本明細書で使用する、「免疫グロブリン」という用語は、以下で述べる免疫グロブリンスーパーファミリーの構成物を含む。好ましくは、免疫グロブリンは抗体である。「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）分子などの抗体フラグメントを含む。
【００２０】
好ましくは、免疫グロブリンは図８に示すような、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１以上のＣＤＲを含む。ＣＤＲは、好都合には、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列からの１、２又は３個のアミノ酸付加、置換又は欠失を有する配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在するとき（ａ）に示す配列と構造的に類似する配列
からなる群より選択される。
【００２１】
構造的な類似性とは、この場合、免疫グロブリンループ内の生じるポリペプチド鎖の主鎖立体配座の類似性を指す。好ましくは、構造的に類似する配列は、ＡＰ３３の主鎖立体配座から０．２オングストロームである、好都合にはＡＰ３３の主鎖立体配座から０．１オングストローム内である主鎖立体配座を有する。
【００２２】
好ましくは、本発明は、ＨＣＶによる脊椎動物細胞の感染の予防のために有用である。本発明の免疫グロブリンはＨＣＶの遺伝子型１〜６の各々の例を中和することができるので、本発明は全てのＨＣＶ感染に広く適用し得る。好都合には、免疫グロブリンは全てのＨＣＶ遺伝子型に対して有効であるので、本発明は、リガンドの投与前に除くべきＨＣＶ遺伝子型についての試験を可能にする。
【００２３】
さらなる態様では、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定義されるＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドのエピトープに結合するリガンドの有効量を投与することを含む、ＨＣＶの遺伝子型１〜６の２以上による感染の予防又は治療のための方法が提供される。
【００２４】
なおさらなる態様では、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンの有効量を投与することを含む、ＨＣＶの遺伝子型１〜６の２以上による感染の予防又は治療のための方法が提供される。
【００２５】
本発明の方法は、本発明の使用に関して上述したような特徴を含み得る。
【００２６】
本発明はさらに、ＨＣＶの遺伝子型１〜６の２以上に属するＨＣＶ単離物を中和する免疫グロブリン分子を提供し、前記免疫グロブリン分子は、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１以上のＣＤＲを含み、モノクローナル抗体ＡＰ３３以外の免疫グロブリンである。
【００２７】
好都合には、前記１以上のＣＤＲは、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列からの１、２又は３個のアミノ酸付加、置換又は欠失を有する配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在するとき（ａ）に示す配列と構造的に類似する配列からなる群より選択される。
【００２８】
好ましい実施形態では、免疫グロブリンは、配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（Ｘ1〜7は何らかのアミノ酸である）を有するポリペプチドエピトープに結合することができ、前記免疫グロブリンは、モノクローナル抗体ＡＰ３３以外である。
【００２９】
好ましくは、免疫グロブリンは１以上のヒトフレームワーク領域を含む。好都合には、免疫グロブリンは１以上のヒトＣＤＲを含む。抗体のヒト化及び脱免疫のための方法は当分野において公知であり、ヒトにおける抗体の免疫原性を低減又は排除しながらマウス抗体の特異性を維持して、フレームワーク及び／又はＣＤＲ配列をヒト配列で置換することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
異なる定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、当業者（例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学、抗体工学及び生化学における当業者）によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明は、異なる指示がない限り、当業者の能力の範囲内である従来の手法を用いる。そのような手法は文献の中で説明されている。例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ参照。これらの一般的テキストの各々が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
（Ａ．リガンド）
本発明に従ったリガンドは、ポリペプチドエピトープに結合することができる何らかの分子であり得る。例えばリガンドは、タンパク質又は核酸アプタマー、又は免疫グロブリンであり得る。免疫グロブリン分子は、本発明によれば、２つのβシート及び、通常は、保存されたジスルフィド結合を含む、抗体分子の特徴である免疫グロブリンの折りたたみを含むポリペプチドのファミリーである免疫グロブリンスーパーファミリーを指す。免疫グロブリンスーパーファミリーは、免疫系における幅広い役割（例えば抗体、Ｔ細胞受容体分子等）、細胞接着への関与（例えばＩＣＡＭ分子）及び細胞内シグナル伝達（例えばＰＤＧＦ受容体などの受容体分子）を含む、インビボでの細胞及び非細胞相互作用の多くの態様に関与する。本発明は、標的分子に結合することができる全ての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用できる。好ましくは、本発明は抗体に関する。好ましくは、本発明に従ったリガンドは、本明細書で述べるＨＣＶpp中和アッセイによって判定したとき、ＨＣＶ遺伝子型１〜６の各々を代表するＨＣＶ試料を３５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ50で中和する。
【００３２】
ＡＰ３３のような従来の抗体は、少なくとも４本のポリペプチド鎖を含む大きな多サブユニットタンパク質分子である。例えばヒトＩｇＧは、機能的抗体を形成するためにジスルフィド結合されている２本の「重」鎖と２本の「軽」鎖を有する。各々の重及び軽鎖自体は、「定常」（Ｃ）及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は、抗体の抗原結合特異性を決定し、一方Ｃ領域は、構造的支持と免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用における機能を提供する。
【００３３】
抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの抗原結合特異性は、特定抗原に結合する抗体又はそのフラグメントの能力を表わす。抗体の抗原結合特異性はＶ領域の構造特徴によって決定される。各々のＶ領域は、典型的には３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」、その各々が「超可変ループ」を含む）及び４つのフレームワーク領域を含む。従って、特定所望抗原に実質的な親和性で結合するために必要な最小構造単位である抗体結合部位は、典型的には３個のＣＤＲ、及びＣＤＲを適切な立体配座に保持し、提示するためにそれらの間に組み入れられる少なくとも３、好ましくは４個のフレームワーク領域を含む。
【００３４】
本明細書で使用する、抗体は、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2、ｄＡｂ、キメラ、ＣＤＲ移植及びヒト化抗体を含む改変抗体、及びファージディスプレイ又は選択的手法を用いて作製される人為的に選択される抗体を含む、完全抗体又は選択標的に結合することができる抗体フラグメントを指す。ｄＡｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖなどの低分子フラグメントは、それらの小さなサイズ及びその結果として生じる優れた組織分布の故に、診断及び治療適用のための有利な特性を有する。好ましくは、抗体は一本鎖抗体又はｓｃＦｖである。
【００３５】
一般に抗体は、少なくとも３個の認識可能なＣＤＲ又は超可変ループ及び少なくとも３、好ましくは４個の認識可能なフレームワーク領域を含み、いかなる場合もＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合する能力を保持しなければならない。典型的には、必ずではないが、ポリペプチドはまた、軽鎖定常領域及び／又は重鎖定常領域、好ましくは両方を含む。ポリペプチドの好ましい特徴は、典型的には、本質的に本発明の最初の態様のポリヌクレオチド分子によってコードされるポリペプチドに関して上述したとおりである。
【００３６】
１つの特定実施形態では、ポリペプチドは、１以上の超可変ループ又は図８に示すものと実質的に又は完全に同一のアミノ酸残基配列を有するＣＤＲを含み得るが、ヒト免疫グロブリンのものに対応するように変化した１以上のフレームワーク領域を含み得る。ポリペプチドのアミノ酸配列が「ヒトフレームワーク領域」と「マウス」又は「外来性」ＣＤＲの理論的理想と異なる場合、そのような逸脱は、好ましくは保存的置換を含む。保存的置換は、１個のアミノ酸残基によるもう１つ別の残基の置換であり、両方の残基は同じ機能的グループ（Ｆｉｇｓ．２．８−２．１５ ｏｆ 「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，２nd ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏに定義されている）内の側鎖を有する。
【００３７】
結合活性を有する非免疫グロブリンポリペプチドを含むポリペプチドは、例えばランダムなポリペプチド構造の組換え体ライブラリーから開発され得る。ファージディスプレイ、ＳＥＬＥＸ、ｍＲＮＡディスプレイ又は表面プラズモン共鳴、続いて、必要に応じて突然変異と選択の反復による結合特異性及び親和性の改善などの手法による、所望標的に対して結合親和性を有するポリペプチドの選択は、当業者に公知の手法である。
【００３８】
例えばｍＲＮＡ選択による結合ポリペプチドの選択は、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３７５０−３７５５によって記述されている。Ｓｒｅｂａｌｕｓ ａｎｄ Ｃｌｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３７５０−３７５５は、ポリペプチドのライブラリーの標的分子への結合を特性付けるためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの使用を述べている。ファージディスプレイの使用は、Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２０００ Ｓｅｐ ３０；４３（２−３）：１６５−９６及びＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９６ Ｏｃｔ；６（２）：１５５−６２によって総説されている。核酸アプタマーの使用は、Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００ Ｆｅｂ ４；２８７（５４５４）：８２０−５によって総説されている。ＳＥＬＥＸは、標的分子への高度特異的結合を有する核酸分子をインビトロで発生させるための方法である。それは、例えば米国特許第５６５４１５１号明細書、同第５５０３９７８号明細書、同第５５６７５８８号明細書及び同第５２７０１６３号明細書、並びに国際公開第ＷＯ９６／３８５７９号パンフレットに述べられている。
【００３９】
ファージディスプレイやＳＥＬＥＸなどの反復選択手順は、多数の可能な配列及び構造を含むライブラリー内に、所与の標的に対する広範囲の結合親和性が存在するという原理に基づく。例えば２０サブユニットのランダム化ポリペプチド又は核酸ポリマーを含むライブラリーは、４20の構造可能性を有し得る。標的に対してより高い親和定数を有するものが、最も結合の可能性が高いとみなされる。分配、分離及び増幅の工程は、より高い結合親和性候補に富む第二の核酸ライブラリーを作成する。さらなる回数の選択は、生じるライブラリーが主として１個だけ又は数個の配列で構成されるまで、漸進的に最良のリガンドを支持する。次にこれらをクローニングし、配列決定して、純粋なリガンドとしての結合親和性に関して個々に試験することができる。
【００４０】
所望の目標が達成されるまで選択と突然変異／増幅のサイクルを反復する。最も一般的な場合、サイクルの反復後に結合強度の有意の改善が達成されなくなるまで選択／増幅を続ける。選択／増幅反復法は、少なくとも１０14個の配列を含むライブラリーにおいて１個の配列変異体の単離を可能にするのに十分な感受性がある。本方法は、原則として、約１０18の異なる核酸種と同数をサンプリングするために使用できる。ライブラリーは、好ましくはランダム化配列部分並びに効率的な増幅のために必要な保存配列を含む。配列変異体は、ランダム化核酸配列の合成及びランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含む多くの方法で生産できる。可変配列部分は、完全に又は部分的にランダムな配列を含み得る。それはまた、ランダム化配列と共に組み込まれた保存配列の小部分を含み得る。試験核酸における配列変異は、選択／増幅反復の前又はその間の突然変異誘発によって及び特異的修飾によって導入又は増加させ得る。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の手法を用いて形質転換細胞から又はトランスジェニック生物から作製し得る。典型的なプロトコールを例示のために以下で述べる。
【００４２】
（（ａ）ＣＯＳ−７細胞における抗体の一過性発現）
ＤＮＡは、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン及びリン酸カルシウム沈殿法などの多くの手段によってＣＯＳ−７細胞に導入することができる。
【００４３】
電気穿孔法に関しては、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ（１９９１ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４，７７３−７８３）の方法が使用できる。重及び軽鎖発現ベクターのコトランスフェクションのために、各々のベクター１０μｇを使用する。両方の抗体鎖を発現する１個のベクターに関して１３μｇを使用する。ＤＮＡを、ＰＢＳ中１×１０7細胞／ｍｌの０．７ｍｌアリコートに添加し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）装置を用いて１９００Ｖ、２５μＦ静電容量でパルスする。対照として、非特異的抗体を発現するベクター１３μｇもＣＯＳ−７にトランスフェクトする。ＤＮＡの非存在下で電気穿孔したＣＯＳ−７細胞を陰性対照として含める。室温で１０分間の回復後、電気穿孔した細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ ８ｍｌに添加し、５％ＣＯ2中３７℃で７２時間インキュベートする。７２時間のインキュベーション後、培地を収集し、細胞デブリを除去するために遠心して、分析のために保存する。
【００４４】
若しくは、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法が使用できる。本方法は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）に述べられている。ＣＯＳ−７細胞を、１×１０6細胞／１００ｍｍディッシュでＤＭＥＭ（ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に接種する。２日目に、プラスミドＤＮＡをエタノール沈殿させ、滅菌ＴＥ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に２０μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁する。ＤＮＡ １５０μｌを、滅菌ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．４ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、２５ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ2及び０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）３００μｌ及び滅菌ＤＥＡＥデキストラン（ＳＩＧＭＡ、ＴＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）３００μｌと混合する。増殖培地を吸引し、細胞単層をＰＢＳで１回及びＴＢＳで１回洗う。７５０μｌのＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／ＴＢＳ混合物を単層に添加する。ディッシュを、５分ごとに揺り動かしながら層流フード内で周囲温度にて１時間インキュベートする。１時間のインキュベーション後、ＤＮＡ溶液を吸引し、細胞をＴＢＳで１回及びその後ＰＢＳで１回洗う。細胞を、１００μＭのクロロキン（ＳＩＧＭＡ）を添加した完全培地中で３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートする。４時間後、培地を完全培地と交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートする。トランスフェクションの４８時間後、細胞に、血清を含まないＤＭＥＭ増殖培地を供給する。２４時間後、培地を採集し、卓上臨床遠心分離機において１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞デブリを除去する。
【００４５】
（（ｂ）ＣＨＯ細胞における本発明の抗体の安定な発現）
この手順のための典型的なプロトコールは以下の通りである。
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ ＤＵＸＢ−１１、Ｕｒｌａｕｂ ＆ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，４２１６−４２２０）をトリプシン処理し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗う。ＤＮＡ（１３μｇの重及び軽免疫グロブリン鎖についての遺伝子を含むプラスミド）及びＰＢＳ中１×１０7細胞／ｍｌの０．８ｍｌアリコートを滅菌Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）キュベット（０．４ｃｍギャップ）に入れる。パルスを１９００ボルト、２５μＦ静電容量で送達する。室温で１０分間の回復期間後、電気穿孔した細胞を２０ｍｌのα−ＭＥＭ（プラスリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド）／１０％ＦＢＳに添加する。２４〜４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、α−ＭＥＭ（マイナスリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド）／１０％透析ＦＢＳ中、１００ｍｍディッシュにプレートする（ｄｈｆｒ含有プラスミドの発現に関して選択するため）。コロニーが出現するまで培地を３〜４日ごとに交換する。クローニングシリンダーによって単一クローンを単離し、増殖させて、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ産生に関して分析する。次に、漸増量のＩｇＧを発現するクローンを選択するために、単一クローンを連続的に漸増濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）（１０9Ｍ-1 ＭＴＸから出発する）に供する。コロニーが出現するまで培地を３〜４日ごとに交換する。クローニングシリンダーによって単一クローンを単離し、増殖させて、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ産生に関して分析する。
【００４６】
（（ｃ）抗体フラグメントの酵素的生産）
抗原結合抗体フラグメントは、無処置免疫グロブリンの酵素的又は化学的分離によって生産することができる。フラグメントはまた、組換えＤＮＡ手法（例えばＫｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８１，３１７−３２３；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，１６３−１６７）によっても生産できる。選択フラグメントをコードする核酸のセグメントは、適切な制限酵素による完全長コード配列の消化によって、又は新規合成によって生産される。
【００４７】
例えばＦ（ａｂ’）2フラグメントは、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）に述べられているような標準方法を用いてｐＨ３．０−３．５でのペプシンによるタンパク質分解消化によってＩｇＧ分子から入手できる。
【００４８】
Ｆａｂフラグメントは、限定還元によってＦ（ａｂ’）2フラグメントから、又は還元剤の存在下にパパインでの消化によって完全抗体から入手し得る。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、当業者に明白な多くの方法で特徴づけし得る。これらは、ＥＬＩＳＡなどの手法による濃度の物理的測定及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗体純度の物理的測定を含む。加えて、ポリペプチドの有効性は、溶液中で、又はＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（例えばＢＩＡコア）又は免疫蛍光アッセイなどの固相系においてＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質への分子の結合を検出することによって測定できる。より詳細には、本明細書で述べるようなＨＣＶpp中和アッセイにおいて６つの公知の遺伝子型を代表するＨＣＶ試料に対してポリペプチドの中和能力を試験することができる。
【００５０】
本発明のポリペプチドは非アミノ酸部分を含み得る。例えばポリペプチドはグリコシル化され得る。そのようなグリコシル化は、宿主細胞又は宿主生物におけるポリペプチドの発現の間に自然に起こり得るか、又は人為的介入から生じる意図的な修飾であり得る。付加的に又は選択的に、本発明のポリペプチドは他の化学修飾に供し得る。１つのそのような望ましい修飾は、１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加である。ペグ化は、インビボで様々な抗体フラグメントの半減期を有意に上昇させることが示された（Ｃｈａｐｍａｎ ２００２ Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５４，５３１−５４５によって総説された）。しかし、抗体フラグメントのランダムなペグ化は、抗原に対するフラグメントの結合親和性に極めて有害な作用を及ぼし得る。これを避けるため、ペグ化は抗体又は抗体フラグメントの特定の標的残基に限定することが望ましい （Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ，２００４ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５，４０９−４１８及び上記で引用した、Ｃｈａｐｍａｎ参照）。
【００５１】
（Ｂ．抗体作製）
本発明に従った抗体は、例えばそれらが天然に生じる抗体の一時配列とは異なる一次配列を有するように、好都合に作製される抗体である。特に、ＡＰ３３抗体は、好ましくは修飾される。
【００５２】
天然のＡＰ３３配列を有さない、本発明に従った抗体は、ＡＰ３３のフラグメント、アミノ酸配列における１以上の付加、置換又は欠失、標識又はエフェクター基の付加等を含む修飾ＡＰ３３であり得る。好都合には、抗体は、ヒト被験者における免疫原性をより低くするためにヒト化又は脱免疫されている。
【００５３】
本発明において有用な抗体は、新規生成し得るか又はＡＰ３３を操作することによって生産し得る。
【００５４】
（Ｂ（ｉ）新規抗体生成）
抗体は、本明細書で述べるペプチド免疫原を使用した動物又はヒトの免疫によって生成し得る。抗体は、免疫動物の血清から入手し得るか又は細胞培養において生産し得る。組換えＤＮＡテクノロジーは、細菌又は好ましくは哺乳動物細胞培養において、確立された手順に従って抗体を生産するために使用し得る。選択細胞培養系は、好ましくは抗体産物を分泌する。
【００５５】
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的方法は周知である。非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス、ウサギ、ウマモノクローナル抗体の作製は周知であり、例えばＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質又はそのフラグメントを含む製剤で動物を免疫することによって実施できる。免疫動物から得られる抗体産生細胞を不死化し、スクリーニングするか、又は最初にＥ２に結合する抗体の産生に関してスクリーニングし、その後不死化する。（上記で引用した、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ参照）。
【００５６】
不死化抗体産生細胞系は、細胞融合によって、及びまた、腫瘍形成性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換又はエプスタイン−バーウイルスによるトランスフェクションなどの他の手法によって樹立できる。ＨＣＶ Ｅ２エピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは、様々な性質に関して、例えばアイソタイプ及びエピトープ親和性に関してスクリーニングすることができる。
【００５７】
ＨＣＶ Ｅ２含有ポリペプチドはまた、ヒトモノクローナル抗体を選択するためにも使用できる。例えば、ＡＰ３３などの特定マウス抗体と同じエピトープ特異性を有する一部のヒト抗体は、競合結合実験によって選択し得る。そのような抗体は、ＡＰ３３に関して明らかにされた有用なＨＣＶ中和特性を共有する可能性が特に高い。ＨＣＶ Ｅ２に対するヒト抗体は、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって作製できる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，１２７５−１２８１参照）。ＨＣＶ Ｅ２又はそのフラグメントに結合する抗体を選択する。次に、そのような抗体（又は結合フラグメント）をコードする配列を、クローニングして増幅し得る。このプロトコールは、ファージディスプレイテクノロジーとの組合せによって改善される（例えば国際公開第９１／１７２７１号パンフレット及び国際公開第９２／０１０４７号パンフレット）。
【００５８】
インビトロでのハイブリドーマ細胞又は哺乳動物宿主細胞の増殖は、慣例的な標準培地である適切な培地、例えば、場合により哺乳動物血清、例えばウシ胎仔血清、又は微量元素及び増殖維持サプリメント、例えば正常マウス腹膜滲出物細胞などの支持細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＲＰＭＩ １６４０培地において実施される。細菌細胞又は酵母細胞である宿主細胞の増殖は、同様に、当分野において公知の適切な培地、例えば細菌に関してはＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、テリフィックブロス、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴ又はＭ９最小培地、及び酵母に関しては培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地又は完全最小ドロップアウト培地において実施される。
【００５９】
インビトロ生産は比較的純粋な抗体製剤を提供し、所与の大量の所望抗体を与えるためのスケールアップを可能にする。細菌細胞、酵母又は哺乳動物細胞培養のための手法は当分野において公知であり、例えばエアリフト反応器又は連続攪拌反応器における均一懸濁培養、又は例えば中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ又はセラミックカートリッジ上での固定化又はエントラップ細胞培養を含む。
【００６０】
大量の所望抗体はまた、哺乳動物細胞をインビボで増殖させることによって入手できる。このために、所望抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、抗体産生腫瘍の増殖を生じさせる組織適合性哺乳動物に注入する。場合により、注入の前に動物を炭化水素で、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などの鉱物油でプライミングする。１〜３週間後、抗体をそれらの動物の体液から単離する。例えばＢａｌｂ／ｃマウスからの抗体産生脾臓細胞と適切な骨髄腫細胞の融合によって得られるハイブリドーマ細胞、又は所望抗体を産生するハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクト細胞を、場合によりプリスタンで前処置したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、１〜２週間後に、動物から腹水を採取する。
【００６１】
前記や他の手法は、例えば参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒの中で論じられている。組換え抗体分子の調製のための手法は、上記参考文献及びまた、例えば参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第０６２３６７９号明細書；欧州特許第０３６８６８４号明細書及び欧州特許第０４３６５９７号明細書に述べられている。
【００６２】
細胞培養上清は、優先的に所望標的を発現する細胞の免疫蛍光染色によって、免疫ブロット法によって、酵素免疫測定法、例えばサンドイッチアッセイ又はドットアッセイ、又は放射免疫測定法によって、所望抗体に関してスクリーニングされる。
【００６３】
抗体の単離のために、培養上清中又は腹水中の免疫グロブリンを、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性材料に対する透析、選択膜を通してのろ過等によって、濃縮し得る。必要に応じて及び／又は所望する場合は、慣例的なクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー及び／又は（免疫）アフィニティークロマトグラフィー、例えば標的分子又はプロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体を精製する。
【００６４】
前記手順に従って生成された抗体は、標準手順に従って、細胞からの核酸の単離によってクローニングし得る。有用には、抗体の核酸可変ドメインを単離し、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメントを構築するために使用し得る。
【００６５】
何らかの所望ポリペプチドに特異的な完全ヒト抗体も、ライブラリーからの選択によって又はヒト抗体遺伝子レパートリーを担持するトランスジェニックマウスにおいて作製し得る。
【００６６】
ライブラリーからの抗体の選択のための様々な手法が記述されており、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１１０５−１１１６によって総説されている。簡単に述べると、抗体ライブラリー選択のために使用可能な方法は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ及び微生物細胞ディスプレイを含む。
【００６７】
いかなるライブラリー選択システムも本発明と共に使用し得る。大きなライブラリーの所望数を単離するための選択プロトコールは、ファージディスプレイ手法に代表されるように、当分野において公知である。様々なペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面に提示されるそのようなシステムは（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９０、上記）、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのインビトロ選択と増幅のための抗体フラグメント（及びそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作成するために有用であることが明らかになった。ＶH及びＶL領域をコードするヌクレオチド配列を、それらを大腸菌の細胞周辺腔へと差し向けるリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結し、その結果として生じる抗体フラグメントは、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質（例えばｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩ）への融合物として、バクテリオファージの表面に提示される。あるいは、抗体フラグメントは、λファージキャプシド（ファージ体）の外側に提示される。ファージに基づく提示システムの利点は、それらが生物系であるので、選択されるライブラリー構成物が、単に選択ライブラリー構成物を含むファージを細菌細胞において増殖させることによって増幅できることである。さらに、ポリペプチドライブラリー構成物をコードするヌクレオチド配列はファージ又はファージミドベクターに含まれるので、配列決定、発現及びその後の遺伝子操作が比較的容易である。
【００６８】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリー及びλファージ発現ライブラリーの構築のための方法は当分野において周知である（参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ （１９９０）上記；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：４１３３；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｇｅｎｅ，１０４：１４７；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）上記；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）上記；Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２：８６７；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７；Ｌｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３１３）。
【００６９】
１つの特に有利なアプローチは、ｓｃＦｖファージライブラリーの使用であった（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）上記；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）上記；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ（１９９１）上記；Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：８０；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）上記）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されるｓｃＦｖライブラリーの様々な実施形態が記述されている。ファージディスプレイアプローチの洗練も公知であり、例えば参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第９６／０６２１３号パンフレット及び国際公開第９２／０１０４７号パンフレット（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｅｔ ａｌ．）及び国際公開第９７／０８３２０号パンフレット（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，上記）に述べられている。
【００７０】
ファージディスプレイ法では、それらの外側表面に種々の抗体又はフラグメントを提示するファージのライブラリーを作成する。抗体は通常、ｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメントとして提示される。所望特異性を有する抗体を提示するファージを、ＨＣＶ Ｅ２ポリペプチド又はそのフラグメントへの親和性の強化によって選択する。
【００７１】
ファージディスプレイ法の変法では、ＡＰ３３などの選択マウスＭＡｂの結合特異性を有するヒト抗体を作製することができる（国際公開第９２／２０７９１号パンフレット参照）。この手法では、選択マウス抗体（例えばＡＰ３３）の重又は軽鎖可変領域を出発物質として使用する。例えば軽鎖可変領域を出発物質として選択する場合、同じ軽鎖可変領域（すなわちマウス出発物質）及び異なる重鎖可変領域を提示するファージライブラリーを構築する。重鎖可変領域は再構成されたヒト重鎖可変領域のライブラリーから得られる。ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質に対して強い特異的結合（例えば少なくとも１０8、好ましくは少なくとも１０9Ｍ-1）を示すファージを選択する。その後、このファージからのヒト重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリーを構築するための出発物質として役立つ。このライブラリーでは、各々のファージは、同じ重鎖可変領域（すなわち最初のディスプレイライブラリーから特定された領域）及び異なる軽鎖可変領域を提示する。軽鎖可変領域は、再構成されたヒト軽鎖可変領域のライブラリーから得られる。再び、ＨＣＶ Ｅ２に対して強い特異的結合を示すファージを選択する。これらのファージは、完全なヒトＨＣＶ Ｅ２抗体の可変領域を提示する。これらの抗体は通常、マウス出発物質と同じ又は類似のエピトープ特異性を有する。この変異体として、選択は、付加的に又は選択的に、ＨＣＶの６つの遺伝子型全てを中和する能力に基づき得る。
【００７２】
本発明のＨＣＶ Ｅ２結合ポリペプチドはまた、トランスジェニックヤギ、マウス又は植物系などのトランスジェニック生物によって発現され、それらから精製され得る。植物における組換え抗体の生産は、Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，（２００５ Ｖａｃｃｉｎｅ ２３，１７６４−１７６９ ａｎｄ ２００３ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０，４３３−４４５）によって総説された。抗体又は抗体フラグメントの発現に関して成功裏に使用された植物は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、シロイヌナズナ）Ｄｅ Ｗｉｌｄｅ ｅｔ ａｌ，１９９８ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，６３９−６４６）及びタバコ（Ｖａｌｄｅｓ ｅｔ ａｌ，２００３ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３０８，９４−１００）を含む。
【００７３】
ひとたび発現されると、本発明の完全抗体又は抗体フラグメントは、硫酸アンモニウム沈殿法、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当分野の標準手法に従って精製できる（一般にＳｃｏｐｉｅｓ ＆ Ｓｔｏｔｅｒ，１９８２ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９０ Ｐａｒｔ Ｅ，４７９−４９０参照）。医薬用途のためには、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％又はそれ以上の均一性の免疫グロブリンが最も好ましい。
【００７４】
選択的なライブラリー選択テクノロジーは、どちらも先に述べられているように（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５；Ｃａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：８０９５；Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：２４３２）、バクテリオファージプラークとして又は溶原菌のコロニーとして直接スクリーニングでき、本発明において有用である、バクテリオファージλ発現系を含む。そのような発現系は、ライブラリーの１０6までの異なる構成物をスクリーニングするために使用できるが、それらはより大きな数（１０6以上）のスクリーニングには実際上適さない。他のスクリーニングシステムは、例えばライブラリー構成物の直接化学合成に基づく。初期の１つの方法は、国際公開第８４／０３５６４号パンフレットに述べられているような、一組のピン又はロッド上でのペプチドの合成を含む。各々のビーズが個々のライブラリー構成物であるペプチドライブラリーを形成するビーズ上でのペプチド合成を含む同様の方法が、米国特許第４，６３１，２１１号明細書に述べられており、関連方法が国際公開第９２／０００９１号パンフレットに述べられている。ビーズに基づく方法の有意の改善は、各々のライブラリー構成物のアミノ酸配列の同定を容易にするために、オリゴヌクレオチドなどの独自の同定タグで各々のビーズを標識することを含む。これらの改善されたビーズベースの方法は国際公開第９３／０６１２１号パンフレットに述べられている。
【００７５】
もう１つの化学合成法は、各々の異なるライブラリー構成物（例えばユニークペプチド配列）をアレイ内の離れた、所定の位置に置く方法による表面上でのペプチド（又はペプチドミメティック）のアレイの合成を含む。各ライブラリー構成物の同一性をアレイ内のその空間位置によって決定する。所定の分子（例えば受容体）と反応性ライブラリー構成物との間で結合相互作用が起こるアレイ内の位置を決定し、それによって空間位置に基づき反応性ライブラリー構成物の配列を同定する。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号明細書；国際公開第９０／１５０７０号明細書及び国際公開第９２／１００９２号明細書；Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７；Ｄｏｗｅｒ ａｎｄ Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２６：２７１に述べられている。
【００７６】
ポリペプチド又はヌクレオチドのライブラリーを作成するための他のシステムは、ライブラリー構成物のインビトロ合成のための無細胞酵素機構の使用を含む。１つの方法では、標的リガンドに対する選択とＰＣＲ増幅を交互に実施することによってＲＮＡ分子を選択する（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ （１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８）。同様の手法は、所定のヒト転写因子に結合するＤＮＡ配列を同定するために使用し得る（Ｔｈｉｅｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｃｈ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３２０３；Ｂｅａｕｄｒｙ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５；国際公開第９２／０５２５８号パンフレット及び国際公開第９２／１４８４３号パンフレット）。同様に、インビトロ翻訳は、大きなライブラリーを作成するための方法としてポリペプチドを合成するために使用できる。一般に安定化ポリソーム複合体を含むこれらの方法は、さらに、国際公開第８８／０８４５３号パンフレット、国際公開第９０／０５７８５号パンフレット、国際公開第９０／０７００３号パンフレット、国際公開第９１／０２０７６号パンフレット、国際公開第９１／０５０５８号パンフレット及び国際公開第９２／０２５３６号パンフレットに述べられている。国際公開第９５／２２６２５号パンフレット及び国際公開第９５／１１９２２号パンフレット（Ａｆｆｙｍａｘ）に述べられているような、ファージに基づかない選択的ディスプレイシステムは、選択のためのポリペプチドを提示するためにポリソームを使用する。これら及び全ての前記資料も、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
ファージ又は他のクローン化ライブラリーの使用に代わるのは、選択標的で免疫した動物の脾臓に由来する核酸、好ましくはＲＮＡを使用することである。このようにして得られたＲＮＡは、免疫グロブリンの天然のライブラリーを表す。Ｖ領域及びＣ領域のｍＲＮＡの単離は、Ｆａｂ又はＦｖなどの抗体フラグメントが本発明に従って細胞内で発現されることを可能にする。
【００７８】
簡単に述べると、ＲＮＡを免疫動物の脾臓から単離し、ＰＣＲプライマーを使用してＲＮＡプールからＶH及びＶL ｃＤＮＡを選択的に増幅する。このようにして得られたＶH及びＶL配列を、ｓｃＦｖ抗体を作製するために連結する。ＰＣＲプライマー配列は、公開されているＶH及びＶL配列に基づいており、キットの形態で市販されている。
【００７９】
全ての選択及びディスプレイシステムと組み合わせて、本発明は、所望結合活性の単離のためにＡＰ３３によって結合されるエピトープを形成することが同定されたペプチドを提供する。そのようなペプチドを本明細書でより詳細に説明する。
【００８０】
（Ｂ（ｉｉ）ＡＰ３３の作製）
ＡＰ３３又はＡＰ３３のエピトープ特異性を共有する他の抗体は、免疫原性を低減する及び／又は結合特性を改善するように操作し得る。
【００８１】
抗体を操作するためのいくつかの手法が当分野において公知である。一般に、ＣＤＲを供与側（非ヒト）抗体から受容側（ヒト）抗体のフレームワークに移入することによって抗体の免疫原性が低下する。この手順は、ＣＤＲ移植又はヒト化として知られる。この手順の難点は、供与側と受容側のフレームワークの相違の結果として、結合活性が失われ得ることである。さらに、ＣＤＲ自体によって一定量の免疫原性が保持され得る。薄板化、再表面作成、ＳＤＲ移入及び脱免疫化を含む、様々な補足的及び選択的手法が、これらの問題に対処するために提案されてきた。
【００８２】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドはＣＤＲ移植分子をコードする。ＣＤＲ移植分子は、図８に示すＡＰ３３の軽又は重鎖のＣＤＲ配列と実質的に又は完全に同一のアミノ酸配列を有する軽及び／又は重鎖ＣＤＲ、及び図８に示すＡＰ３３のフレームワーク領域配列と実質的に同一でないフレームワーク領域を含むものである。本発明に関して、ＣＤＲは、各々のＣＤＲ配列が図８に示す対応ＣＤＲの配列と１又は２アミノ酸残基だけ、好ましくは１アミノ酸残基だけ異なる（すなわち好ましくは図８に示すＡＰ３３のＣＤＲ配列と比較して各々のＣＤＲ内に１個だけのアミノ酸残基置換）場合、ＡＰ３３のＣＤＲと「実質的に同一」とみなす。好ましくは、ＣＤＲ移植分子のＣＤＲ配列は、図８に示すＡＰ３３のＣＤＲ配列と完全に同一である。
【００８３】
特に好ましい種類のＣＤＲ移植分子は、図８に示すＡＰ３３のものと実質的に又は完全に同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むが、ヒトフレームワーク領域配列を含む抗体又は抗原結合フラグメントである。そのような分子は「ヒト化」と称され得る。ヒト抗体のものとより密接に類似する（又はさらには同一である）ために、ＡＰ３３のものと比較して変化したフレームワーク領域の使用は、生じるポリペプチドのヒト被験者における免疫原性を大きく低下させるはずである（ＡＰ３３と比較して）。「ヒトフレームワーク領域配列」は、ヒト抗体のものと同一であるか又は有意ではない量だけ（例えばフレームワーク領域につき７アミノ酸残基以下、好ましくはフレームワーク領域につき４残基以下、より好ましくはフレームワーク領域につき３残基以下、最も好ましくはフレームワーク領域につき２残基以下）ヒト抗体のものと異なる配列である。好都合には、コードされるポリペプチドは、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによってコードされるものと同一のフレームワーク領域を含む。
【００８４】
一般論として、「ＣＤＲ移植」は、ヒトフレームワーク領域と組み合わせて非ヒト起源（マウス又は他の非ヒト哺乳動物など）からのＣＤＲをコードするポリヌクレオチドの形成を含む。定常領域も、存在する場合には、好ましくはヒト起源である。
【００８５】
慣例的に「供与抗体」及び「受容抗体」という用語が使用される。非ヒト供与抗体からのＣＤＲがヒト受容抗体のフレームワークに移植される。ＣＤＲ移植の手法は当業者に周知である。その手順は、最初にＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，（１９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５２５）及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，（１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−３２７）によって記述され、非ヒト起源のＣＤＲのヒトフレームワークへの移植だけを含んだ。
【００８６】
この手法は、ＣＤＲの外側の、一定のフレームワーク残基の変化を移植抗体内に付加的に移入することを必要とし得る（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−３２７）。従って、本明細書では「ＣＤＲ移植」という用語は、単にＣＤＲ残基の異なるフレームワークへの移入を意味すると解釈されるべきではないが、生じる分子にＣＤＲが由来する抗体の抗原結合特性を付与するための実質的な必要に応じて、そのようなフレームワーク残基の付加的な移入も包含する。「ＣＤＲ移植分子」という用語は、それに準じて、ＣＤＲに加えて一定のフレームワーク残基も同時に「移植される」ポリペプチドを包含すると解釈されるべきである。
【００８７】
抗体のヒト化は、例えば欧州特許第４６０１６７号明細書、欧州特許第６８２０４０号明細書、米国特許第５５３０１０１号明細書、同第５５８５０８９号明細書、同第５６９３７６１号明細書、同第５６９３７６２号明細書、同第５７６６８８６号明細書、同第５８２１３３７号明細書、同第５８５９２０５号明細書、同第５８８６１５２号明細書、同第５８８７２９３号明細書、同第５９５５３５８号明細書、同第６０５４２９７号明細書及び同第６１８０３７０号明細書に述べられている。これらの方法は全て、抗原結合特異性を付与する役割を担うアミノ酸残基がヒト抗体可変領域のフレームワーク領域内に組み込まれるように、抗体の可変領域を再設計することを含む。
【００８８】
一部の場合には、非ヒト抗体の免疫原性部分をヒト抗体からの残基によって置換する（例えば米国特許第５７１２１２０号号明細書）。あるいは非ヒト可変ドメインを「再表面作成する」ために、抗体可変ドメインの表面の残基をヒト抗体からの残基によって置換することができる（例えば米国特許第５６３９６４１号号明細書）。再表面作成はＰａｄｌａｎ（１９９１，欧州特許第０５１９５９６号明細書）によって示唆されたもので、「薄板化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」とも称される。この手法では、第一（供与側の等価物−ＣＤＲのソース）抗体の溶媒接触残基を第二（「受容」）抗体からの残基によって置換する。典型的には、第二抗体はヒト抗体である。溶媒非接触残基、ＣＤＲ、ドメイン間の接触残基、及びＣＤＲに直接隣接する残基は全て、第一抗体におけるのと同じままである。この戦略は、完全な抗原結合活性の保持を助けると考えられる、第一抗体からのパッキング及びインターフェース相互作用の全てを保持しながら第二抗体の表面を模倣することを意図する。これはＢ細胞エピトープの数を低下させるはずであり（及びまた一部のＴエピトープも低下させると考えられる）、より低い免疫原性を導く。
【００８９】
溶媒接触残基は、抗体の高分解能構造の検討によって同定される。ヒト化に関連すると考えられる抗体の他の領域、つまりＣＤＲと接触し、マウスとヒト抗体の間で異なる（そのような場合はげっ歯動物残基が使用される）埋もれた残基や、両方のドメインに関してＣＤＲの近くに位置し、抗原結合において役割を果たすと考えられるＮ末端領域、及び離れた距離であっても役割を果たし得る静電的相互作用である。置換すべき表面残基の選択は、第一抗体可変ドメインと第二抗体種からの使用可能な配列（個別又はコンセンサス配列）のドメインとの間の相同性マッチングによって決定される。
【００９０】
米国特許第５６３９６４１号明細書及び欧州特許出願公報第０５９２１０６号明細書は、再表面作成のための選択的方法を述べている。ここでは、第二抗体種の残基に変更すべき溶媒接触可能残基をＰａｄｌａｎと同様の手順を用いて同定するが、各々の位置に関する平均接触可能性を得るためにより多くの数の構造を分析する。一定レベル以上の接触可能性を有する残基を検討し、それを、抗体を使用すべき種からの抗体からの残基に変更する。置換すべき残基の選択は、全体的相同性を有する抗体から又は溶媒接触可能残基だけを考慮したときに最も高い相同性を有する抗体からであり得る。
【００９１】
国際公開第９３／１７１０５号パンフレット及び米国特許第５７６６６８６号明細書に述べられているヒト化法は、通常ヒト等価物に安全に変更し得る低危険度残基を同定する。これらの残基は溶媒接触可能性の傾向がある。従って、溶媒接触可能残基だけを変化させる場合、この工程は再表面作成法に類似する。
【００９２】
再表面作成又は薄板化抗体を提供する正味の効果がある２つのさらなる手法が記述されている欧州特許出願公開第０４３８３１０号明細書及び欧州特許出願公開第０５１９５９６号明細書参照。
【００９３】
さらなる手法は、免疫応答のためのＴ細胞のヘルパー機能を使用不能にするか又は低減して、導入される抗体に対する最小限の免疫応答を導くために、Ｔ細胞エピトープを同定し、除去する（「デトープ」と呼ばれる）ことを目指す（米国特許第５７１２１２０号明細書；欧州特許出願第０６９９７５５号明細書）。この工程でＢ細胞エピトープを除去することも可能である。
【００９４】
「脱免疫（ＤｅＩｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ）」テクノロジーは、抗体配列内のＢ及びＴ細胞エピトープの両方を低減しようとするものであり、予測アルゴリズム及びまた、これらのモチーフを同定するためにＭＨＣペプチド結合部位をモデリングするための構造情報に依存する。欧州特許第９８／５２９７６号明細書、欧州特許第０９８３３０３号明細書、国際公開第００／３４３１７号明細書、欧州特許第１０５１４３２号明細書参照。
【００９５】
抗体ヒト化手法はまた、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（Ｅｄｓ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｈｕｂｅｌ），Ｃｈａｐｔｅｒ ４０ ｐ５６７−５９２（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ）においても示されている。
【００９６】
一部の試験は、必ずしも全てのＣＤＲが抗原と接触しない例があることを認めており、例えばＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ，（１９９６ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２−７４５）がある。従って、一部の場合には、ヒト化は、ＣＤＲ残基のサブセットの移入によって達成でき、例えばＳａｎｔｏｓ ＆ Ｐａｄｌａｎ（１９８８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６０，１６９−１９４）及びＴａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，（２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，１４３２−１４４１）に示される。これはＳＤＲ移入と称される。
【００９７】
（Ｂ（ｉｉｉ）．結合型ヒト化及び選択）
フレームワークの相対的重要性における不確実性は、様々な手法の開発において、ヒト化成功への１つの因子であり、一部には様々な選択推進ライブラリー手法を導いてきた。これらは、選択的組合せの集団から最良の結合相手を実際的に同定することを目指す。例えば、ヒト化変異体を試験するための、１以上のフレームワーク位置における変更可能性を有する特定抗体可変ドメインのライブラリーの使用（例えばＢａｃａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８）、
特定ソースからのＣＤＲ３と組み合わせた可変領域フレームワークのライブラリーの使用（例えばＲａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＰＮＡＳ ９５：８９１０）、
特定親和性及び特異性のヒト抗体又はヒト抗体結合部位を形成するために非ヒト抗体可変ドメインを置換するためのライブラリー内からのヒトパートナードメインの選択（例えばＧｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ． １９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９；Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３）、
特異的結合を得るためのＣＤＲ３（例えばＨｕＣａｌ：Ｋｎａｐｐｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７）又は全てのＣＤＲのライブラリーを有する特定フレームワークの使用。
【００９８】
Ｗｕ ｅｔ ａｌ（１９９９ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４，１５１−１６２）は、ヒト化及びヒト化抗体の同時親和性改善のための手順を述べた（米国特許第５９５５３５８号明細書も参照のこと）。コンビナトリアルライブラリーは、集中的ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３ライブラリーと共に８つの潜在的に重要なフレームワーク位置を検討した。１個のマウスフレームワーク残基だけを含み、最初のキメラＦａｂよりも約５００倍高い親和性を示す多数の抗ＣＤ４０Ｆａｂ変異体が同定された。
【００９９】
ファージディスプレイテクノロジーはそのような免疫グロブリンを選択するための強力な手法を提供する（国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９２／０６２０４号パンフレット参照）。従って、例えば抗体のヒト化は、ファージディスプレイと細菌細胞を使用するＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらのエピトープ「刷り込み」手法を用いて（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ １９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，３８１−３８８によって記述され；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ２００２ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，１−３７ ａｎｄ ２００５ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１１０５−１１１６によって総説された）、又はＶａｃｃｉｎｅｘ Ｉｎｃ．（例えば米国特許第２００５／０２６６４２５号明細書に述べられている）によって開発された、ワクシニアウイルスディスプレイライブラリーと哺乳動物細胞を用いるその改変型を用いて達成し得る。
【０１００】
（Ｃ．ポリヌクレオチド）
本発明は、本明細書で述べるポリペプチドリガンドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、所望のＨＣＶ Ｅ２結合活性を有するいかなるポリペプチドもコードし得る。
【０１０１】
例えばポリヌクレオチドは、軽鎖又は重鎖などの免疫グロブリン分子鎖全体をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）だけでなく、典型的には３つの定常ドメイン、すなわちＣH１、ＣH２及びＣH３を含む重鎖定常領域（ＣH）、及び「ヒンジ」領域を含む。一部の状況では、定常領域の存在が望ましい。例えば抗体がＨＣＶ感染細胞を死滅させることを所望する場合、完全定常領域の存在は補体を活性化するために望ましい。しかし、また別の状況では、完全定常領域の存在は望ましくないと考えられる。例えば抗体が画像化のために必要である場合、定常領域が存在すると分子サイズの上昇により組織浸透が低下し得る。
【０１０２】
ポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドは、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2及び「ミニ抗体」などの抗原結合抗体フラグメントを含む。ミニ抗体は、（典型的には）ＣH１及びＣK又はＣLドメインが除去された二価抗体フラグメントである。ミニ抗体は従来の抗体よりも小さいので、臨床／診断用途においてはより良好な組織浸透を達成するはずであるが、二価であるため、ｄＡｂなどの一価抗体フラグメントよりも高い結合親和性を保持するはずである。従って、文脈によって異なる指示が為されない限り、本明細書で使用する「抗体」という用語は、完全抗体分子だけでなく、上記で論じた種類の抗原結合抗体フラグメントも包含する。
【０１０３】
特定実施形態では、本発明は、少なくとも３つの免疫グロブリン超可変重又は軽鎖ループを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供し、前記ポリペプチドは、抗原結合を保持し、３つの相補的免疫グロブリン超可変軽又は重鎖ループを含むポリペプチドと組み合わせたとき、本明細書で述べるＨＣＶpp中和アッセイによって判定される３５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ50でＨＣＶ遺伝子型１〜６の各々を代表するＨＣＶ試料を中和する抗体分子又はそのフラグメントを形成する。
【０１０４】
ポリヌクレオチドによってコードされる超可変ループは、好ましくはＡＰ３３内に存在する超可変ループのアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。ループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，（１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５th Ｅｄｎ．ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）によって考案された番号付け慣例を用いて、図８に示すようにＡＰ３３軽鎖内のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６及び８７〜８９及びＡＰ３３重鎖内の３１〜３５Ｂ、５０〜６５及び９５〜１０２によって表わされる。
【０１０５】
コードされるポリペプチドは、典型的にはＡＰ３３と同一又は実質的に同一のＣＤＲ配列を有するが、フレームワーク領域は、好ましくはＡＰ３３と異なる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＰ３３の重及び／又は軽鎖（適宜に）と比較して、特にフレームワーク領域内に、アミノ酸残基置換を含む重及び／又は軽鎖可変領域を有するポリペプチドをコードする。コードされるポリペプチドが部分的又は完全な重及び／又は軽鎖定常領域を含む場合、これもまた、ＡＰ３３の定常領域と比較して置換を含み得る。
【０１０６】
置換の影響は、ＡＰ３３と比較して、コードされるポリペプチドが、
（ｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質への結合の高い親和性（例えば標準ＥＬＩＳＡによって測定される）、及び／又は
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質への結合の高い特異性（すなわち他のタンパク質、特にヒトタンパク質との低い交差反応性）、及び／又は
（ｉｉｉ）本明細書で述べるＨＣＶpp中和アッセイによって測定したとき、ＨＣＶの１以上の遺伝子型の中和のための低いＩＣ50、及び／又は
（ｉｖ）ヒト被験者における低い免疫原性（例えばコードされるポリペプチドの標準用量をヒト被験者に静脈内投与した後、標準ＥＬＩＳＡによって測定される抗イディオタイプ応答によって決定される）
を有することであり得る。
【０１０７】
好ましくは、コードされるポリペプチドフレームワーク格領域の少なくとも１つ、最も好ましくはフレームワーク領域の各々が、生じるポリペプチドのヒト被験者における免疫原性を低下させる（ＡＰ３３に比べて）ために、ヒト抗体のものとより類似するようにＡＰ３３と比較してアミノ酸置換を含む。
【０１０８】
好ましくは、コードされるポリペプチド内に存在する各々のフレームワーク領域は、対応するＡＰ３３のフレームワークと比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。従って、例えば前記フレームワーク領域は、ＡＰ３３内に存在するフレームワーク領域と比べて、合計で、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個のアミノ酸置換を含み得る。
【０１０９】
ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの超可変ループはまた、図８に示すようなＡＰ３３のアミノ酸配列と比較して合計１以上のアミノ酸置換を含み得ることが可能である。コードされるポリペプチドは、例えばＡＰ３３の超可変ループ配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個又は１２個のアミノ酸置換を含み得る（重及び／又は軽鎖内に）。一般に、コードされるポリペプチドはＡＰ３３内のものと実質的に同一、好ましくは同一のＣＤＲ又は超可変ループ配列を有すると想定されるが、場合により超可変ループの各々は、ＡＰ３３超可変ループ配列と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を含み得る。
【０１１０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは単離及び／又は精製される。単離という用語は、分子がその自然又は天然環境から取り出されている又は分離されていること、又はその自然又は天然環境では存在しない方法で生産されたことを指示することが意図されている。精製という用語は、少なくとも一部の汚染分子又は物質が除去されていることを指示することが意図されている。好ましくは、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、関連ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが、組成物中に存在する支配的な（すなわち最も豊富な）ポリヌクレオチド又はポリペプチドを構成するように、実質的に精製される。
【０１１１】
従って、本発明は、好ましくは抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする挿入物を含む組換え核酸を使用する。定義によりそのような核酸は、一本鎖コード核酸、前記コード核酸とそれに相補的な核酸からなる二本鎖核酸、又はこれらの相補的（一本鎖）核酸自体を含む。
【０１１２】
さらに、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然に生じる重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする真正配列、又はその突然変異型を有する酵素的又は化学的に合成された核酸であり得る。真正配列の突然変異型は、１以上のアミノ酸が欠失している又は１以上の他のアミノ酸で交換されている、上記抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸である。好ましくは、前記修飾は、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側である。そのような突然変異型核酸はまた、１以上のヌクレオチドが、同じアミノ酸をコードする新しいコドンを有する他のヌクレオチドによって置換されているサイレント突然変異型であることが意図されている。そのような突然変異型配列はまた、縮重配列である。縮重配列は、無制限の数のヌクレオチドが、最初にコードされたアミノ酸配列の変化を生じさせることなく他のヌクレオチドによって置換されるという点において遺伝暗号の意味の範囲内で縮重する。そのような縮重配列は、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインの最適発現を得るために、特定宿主、特に酵母、細菌又は哺乳動物細胞にとって好ましいそれらの異なる制限部位及び／又は特定コドンの使用頻度の故に、有用であり得る。
【０１１３】
本発明はさらに、本発明の最初の態様に従ったポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供する。典型的には構築物は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの適切な宿主における発現を可能にする発現ベクターである。構築物は、例えば以下の１以上を含み得る。すなわち、宿主において活性なプロモーター、エンハンサーなどの１以上の調節配列、複製起点及びマーカー、好ましくは選択マーカーを含み得る。宿主は真核又は原核生物宿主であり得るが、真核生物（特に哺乳動物）宿主が好ましいと考えられる。適切なプロモーターの選択は、明らかに、使用する宿主細胞にある程度まで依存するが、ＨＳＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ等のようなヒトウイルスからのプロモーターを含み得る。数多くのプロモーターが当業者に公知である。
【０１１４】
構築物は、３つの軽鎖超可変ループ又は３つの重鎖超可変ループを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。あるいはポリヌクレオチドは、適切な長さの適切に柔軟性のリンカーによって連結された３つの重鎖超可変ループ及び３つの軽鎖超可変ループを含むポリペプチドをコードし得る。もう１つの可能性は、単一構築物が２つの別個のポリペプチド−１つは軽鎖ループを含み、１つは重鎖ループを含む−をコードするポリヌクレオチドを含み得ることである。別個のポリペプチドは、独立して発現され得るか又は１個の共通オペロンの部分を形成し得る。
【０１１５】
本発明のＨＣＶ Ｅ２結合ポリペプチドをコードする核酸構築物は、例えばオリゴヌクレオチド誘発型部位特異的突然変異誘発（例えばＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８１２７−８１３１参照）及びＰＣＲ（Ｈｏ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １９８９ ７７，５１−５９）を含む、当業者に周知の標準組換え核酸手法を用いて作製し得る。
【０１１６】
本発明はさらに、上記で定義したポリヌクレオチド又は構築物を含む、インビトロでの宿主細胞を提供する。宿主細胞は、細菌、酵母又は他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であり得る。本発明はまた、本発明に従ったポリペプチドを生産するように遺伝子操作されたトランスジェニック多細胞宿主生物を提供し得る。生物は、例えばトランスジェニック哺乳動物（例えばトランスジェニックヤギ又はマウス系）又はトランスジェニック植物系であり得る。ポリペプチドを生産する方法を以下でさらに説明する。
【０１１７】
（Ｄ．免疫原）
さらなる態様では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２糖タンパク質に結合する抗体を導入するための組成物を提供し、前記組成物は、アミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸを有するペプチド及び生理的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含み、前記ペプチドは、場合によりＮ及び／又はＣ末端に付加的なアミノ酸残基を含むが、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質全体又はそのＥ２660フラグメント（すなわちＨＣＶポリタンパク質の残基３８４〜６６０）を包含せず、アミノ酸残基の１以上が共有結合修飾されていてもよい。
【０１１８】
また、配列内のＸ残基の２以上が同じであってもよく、又はあらゆるＸ残基が異なっていてもよい。
【０１１９】
Ｘは、天然に生じるアミノ酸残基のいずれかであり得るか又は、より好ましくないが、非慣例的な残基（例えばオルニチン、シトルリン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン）であってもよい。考慮される他の共有結合修飾は、特に、グリコシル化（特に１以上のＮ残基のＮ−グリコシル化）を含む。
【０１２０】
本発明に関して、第一Ｘ残基（すなわちアミノ末端に最も近いもの）をＸ1と称し、第二Ｘ残基をＸ2と称し、第三残基をＸ3等々と称し得る。
【０１２１】
好ましい実施形態では、Ｘ1はＳ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｐ又はＬである。
【０１２２】
好ましい実施形態では、Ｘ2はＶ、Ｉ、Ａ、Ｒ又はＦである。
【０１２３】
好ましい実施形態では、Ｘ3はＳ、Ｔ、Ｈ、Ｌ又はＡである。
【０１２４】
好ましい実施形態では、Ｘ4はＮ、Ｑ又はＧである。
【０１２５】
好ましい実施形態では、Ｘ5はＳ、Ｋ又はＴである。
【０１２６】
好ましい実施形態では、Ｘ6はＨ、Ｒ又はＱである。
【０１２７】
好ましい実施形態では、Ｘ7はＩ、Ｌ、Ｆ又はＰである。
【０１２８】
従って、好ましいアミノ酸配列の例は以下を含む。
【化１】
【０１２９】
特に好ましい配列は以下に示す配列、ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＩＮＳＮＧＳＷＨＩ、ＳＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＥＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＨＬＡＮＨＱＧＫＷＲＬ、ＰＬＦＮＡＮＧＴＷＱＦ、及びＥＬＲＮＬＧＧＴＷＲＰを含む。
【０１３０】
１つの実施形態では、ペプチドは、実質的に又は基本的にアミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸからなる。
【０１３１】
より好ましくは、ペプチドは、式：
Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3ＮＧＳＷＨＩ又は
Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3ＮＧＳＷＨＩＮ
に合致するアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
この配列は、典型的には４１２、４１４及び４１６位だけが天然変異を示すＨＣＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸残基番号４１２〜４２３の保存配列に合致する。好ましくは、Ｘ1はＱ、Ｓ又はＥである。好ましくは、Ｘ2はＩ又はＶである。好ましくは、Ｘ3はＴ又はＳである。
【０１３３】
１つの実施形態では、ペプチドは、実質的に又は基本的にアミノ酸残基配列：
Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3ＮＧＳＷＨＩＮ
からなる。
【０１３４】
もう１つの好ましい実施形態では、ペプチドは付加的なアミノ酸残基を含む。特に、ペプチドは１以上の付加的なＢ又はＴ細胞ペプチドエピトープを含み得る。特に、ペプチドは１以上の付加的なＴヘルパー細胞ペプチドエピトープを含み得る。
【０１３５】
付加的なアミノ酸残基は、例えば配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸの１以上の反復を含み得るか、及び／又はＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質の他の部分からのペプチドエピトープ、及び／又は完全に他のＨＣＶタンパク質から又は他のタンパク質からのペプチドエピトープを含み得る。例えばペプチドは、アミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸが、１以上のＢ又はＴ細胞エピトープを含むペプチド又はポリペプチドなどの他の何らかの望ましい部分に共有結合している（が、典型的に必ずしもペプチド結合によってではない）、分子の部分として提供され得る。好都合には、そのような分子は、生物系において（例えば微生物によって又は組織培養系によって）発現され、合成され得る、融合タンパク質であり得る。ペプチド配列の反復は、場合により介在スペーサーによって分離されていてもよく、又は直接隣接していてもよい。
【０１３６】
若しくは、エピトープ配列は、エピトープ配列の複数の反復を含む分枝した分子として提供され得る。１つの実施形態では、分子は、リシンの分岐コア及びエピトープの複数のコピーが連結しているＣ末端アラニン残基を含む。
【０１３７】
エピトープが組成物内に複数回存在する場合、変異配列を含む可能性が生じる、例えば１個のペプチド配列は、Ｘ1がＳであり、Ｘ2がＶである配列であり得、分子内に存在するもう１個のペプチド配列は、Ｘ1がＱであり、Ｘ2がＩである配列であり得る。
【０１３８】
さらなる態様では、本発明は、アミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸを有するペプチドをコードする核酸構築物を提供し、前記ペプチドは、場合によりＮ及び／又はＣ末端に付加的なアミノ酸残基を含むが、前記核酸構築物は、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質全体又はそのＥ２660フラグメントをコードしない。構築物は、典型的には、コードされるペプチドが適切な原核又は真核生物宿主において発現され得るように、プロモーターを含む発現構築物である。好都合には、プロモーターは、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において作動可能なものである。数多くの適切なプロモーターが当業者に公知である（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター、レチノイン酸受容体β（ＲＡＲ−β）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子１（ＨＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ−４０プロモーター、ヒトｃ−ｆｏｓプロモーター）。
【０１３９】
１つの特定実施形態では、核酸構築物は、アミノ酸配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸが、隣接反復配列として又は介在スペーサーによって分離された反復配列として複数回存在するペプチドをコードする。
【０１４０】
構築物は、エンハンサーなどの１以上の調節要素、複製起点、及び１以上のマーカー（選択又はその他）を含み得る。構築物は、プラスミド、酵母人工染色体、酵母ミニ染色体の形態をとり得るか、又はウイルス、特に弱毒化ウイルス又はヒトにとって非病原性である類似ウイルスのゲノムの全部又は一部に組み込まれ得る。
【０１４１】
組成物又は構築物は、好都合には、哺乳動物被験者、好ましくはヒト被験者への安全な投与のために製剤される。典型的には、それらは複数のアリコートに提供され、各々のアリコートは、少なくとも１名の健常成人被験者の有効な免疫のために十分な組成物又は構築物を含有する。所望する場合は、上記で定義した本発明の４番目と５番目の両方の態様に従った組成物が製剤され得る。
【０１４２】
組成物又は構築物は、液体又は固体形態で、好ましくは、典型的には使用前に滅菌水性液体で再水和される凍結乾燥粉末として、提供され得る。
【０１４３】
好ましくは、組成物又は構築物は、アジュバント又は、組成物又は構築物の投与に応答して被験者の免疫応答（例えば特異的抗体力価によって測定される）を上昇させる作用を有する他の成分と共に製剤される。
【０１４４】
アジュバントは、免疫応答の抗原非特異的刺激を生じさせる物質である。公知のアジュバントは、コレラ毒素（ＣＴ）及び大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、その非毒性Ｂサブユニット及びトキソイド（すなわち１以上の突然変異がそれらを非毒性にした突然変異体分子又はＡ及びＢサブユニット架橋などの化学的処理によって非毒性にされた分子）などのＡＤＰリボシル化細菌毒素を含む。もう１つの公知のアジュバントは、ヒトワクチンにおける使用が承認されているミョウバンである。免疫応答を増強し得る他の物質は、脂質、特に脂質含有小胞、リポソーム、ミセル等を含む。
【０１４５】
被験者への構築物の投与は、被験者の細胞の少なくとも一部におけるペプチドエピトープの発現を生じさせ、それが次に、エピトープに対する免疫応答を誘導し得る（すなわちエピトープに結合する抗体を産生するＢ細胞の集団の発生及び／又は増殖を誘導し得る）。そのような構築物は一般に「ＤＮＡワクチン」と称される。核酸は、何らかの適切な経路で、例えば静脈内、皮下経路で、又は皮膚内への又は皮膚を通しての無針投与によって宿主に投与し得る。核酸は、「裸の」形態で投与し得るか、又は他の分子と又は、核酸が何らかの方法で粒子内に被包されている又は粒子と結合している、様々な種類の粒子と同時投与し得る（例えば、表面に結合、典型的に静電気引力によって）。使用し得る粒子は、リポソーム、ウイルス粒子、金マイクロ粒子等を含む。この一般的領域で研究のために広く使用されてきた１つのウイルス粒子は、核酸を被験者における宿主細胞に送達するためのベクターとして使用し得る、修飾ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）である。ＭＶＡはこれまで安全と認められた。ベクターとして使用されてきた他のウイルスは、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を含む。
【０１４６】
当業者は、構築物がＤＮＡとして投与される必要はなく、実際には、ＲＮＡウイルスの一部としてのＲＮＡとして投与することができ、それが次に宿主細胞においてＤＮＡに転写され、その後翻訳されることを認識する。
【０１４７】
組成物は、何らかの適切な経路によって被験者に投与し得る。経口、経鼻又は他の粘膜経路は非侵襲性であり、従ってそれらが有効であると認められる場合は好ましいと考えられるが、静脈内、皮下又は筋肉内注射などのより慣例的な経路は、より強い免疫応答を惹起する可能性が高い。投与するペプチドの最適用量は、被験者の大きさ及び年齢、投与経路等に依存し得る。一般的指針として、有効用量（すなわち、それまでエピトープに対して検出可能な抗体を有していなかった被験者において検出可能な抗体力価を誘導する、又はある程度の既存の抗体力価を有する被験者において抗体力価の検出可能な上昇を生じさせる用量）は、成人に関して５０μｇ〜５００ｍｇの範囲内、好ましくは１００μｇ〜２５ｍｇの範囲内のエピトープの量を含む。
【０１４８】
本発明の１つの特定実施形態では、本発明の４番目の態様に従った組成物であって、本発明の５番目の態様に従った核酸構築物をさらに含む組成物が提供される。
【０１４９】
生理的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤は、固体又は液体であり得る。適切な液体は、水及び食塩水、リン酸緩衝食塩水等のような水性溶液を含む。適切な固体は、デンプン、デキストラン及びゲル（例えばカラゲナン、アルギネート等）を含む。
【０１５０】
本発明の組成物及び／又は構築物は、ＨＣＶに結合して、ウイルスを中和する（すなわち非感染性にする）抗体を被験者において誘導するために使用し得る。本発明に関して、抗体をウイルスと共に３７℃で１時間プレインキュベートし、抗体が１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは７５μｇ／ｍｌ以下の濃度を有するとき、インビトロアッセイにおいてＨＣＶの感染力価の少なくとも５０の％低下を生じさせることができる場合、抗体は中和性であるとみなすことができる。従って、組成物及び／又は構築物は、被験者がその後ＨＣＶに遭遇した場合、感染を予防し得る、又は少なくとも感染の重症度を軽減することによって限られた保護を提供し得る抗体を生成するために使用できる。従って、組成物／構築物は、疾患を完全に予防するため又は少なくとも感染の症状を改善するために使用できる。
【０１５１】
若しくは、組成物／構築物は、既にＨＣＶに感染している被験者においてＨＣＶに対する免疫応答を増強する、すなわち疾患を治療するために使用し得る。そのような治療は、急性又は慢性感染している被験者からのウイルスの清掃を促進し得る。
【０１５２】
従って、さらなる態様では、本発明は、被験者においてＨＣＶ中和抗体を惹起する又はＨＣＶ中和抗体の合成を高めるために、本発明に従った組成物及び／又は構築物の有効量を投与することを含む、哺乳動物被験者、好ましくはヒト被験者においてＨＣＶ感染を予防する及び／又は治療する方法を提供する。用量及び投与経路は、好都合には、先に述べられているとおりであり得る。
【０１５３】
別の部分で説明したように、本発明者らは、驚くべきことに、エピトープＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに結合する抗体がＨＣＶの各々の公知の遺伝子型を代表するウイルスを中和できることを見出した。従って、そのような抗体が十分に高い濃度で被験者内に存在すれば、それらは、ＨＣＶの何らかの遺伝子型によって引き起こされる感染及び／又は疾患に対して防護できるはずである。抗体の十分に高い濃度を達成する１つの方法は、能動免疫である。選択的なアプローチは、既存の抗体を被験者に投与する、受動免疫である。
【０１５４】
従ってさらなる態様では、本発明は、エピトープＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに結合する１以上のＨＣＶ中和抗体の有効量を被験者に投与することを含む、哺乳動物被験者、好ましくはヒト被験者においてＨＣＶ感染を予防する及び／又は治療する方法を提供する。そのような抗体は、好都合には上記で定義した本発明の３番目の態様に従ったポリペプチド、特にキメラ又は、好ましくは、ヒト化抗体又はＡＰ３３のものと同一又は実質的に同一のＣＤＲを含む抗体フラグメントであり得る。
【０１５５】
抗体は、例えば免疫血清の形態で投与し得るか、又はより好ましくは精製組換え又はモノクローナル抗体であり得る。所望特異性を有する血清又はモノクローナル抗体を生産する方法は常套的であり、当業者に周知である。抗体は、静脈内又は筋肉内注射、腹腔内又は経皮的経路を含むがこれらに限定されない、何らかの適切な経路によって投与し得る。
【０１５６】
好ましくは、投与する抗体は実質的に精製されている（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定したとき、好ましくは少なくとも９５％の均一性、より好ましくは少なくとも９７％の均一性、最も好ましくは少なくとも９８％の均一性）。抗体は、食塩水、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液等のような、医薬的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と好都合に混合又は組み合わせることができ、場合によりゼラチン、デンプン、アルギネート及び誘導体化セルロースなどの増粘剤を含み得る。
【０１５７】
受動免疫法は、好都合には、ＨＣＶ抗原に対して異なる特異性を有する複数の抗体の投与及び／又は他の抗ウイルス治療化合物と組み合わせた抗体の投与を含み得る。最近、そのような受動免疫手法はＨＩＶ感染を治療するために安全に使用されている（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２００４ Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５４，９１５−９２０；Ｓｔｉｅｇｌｅｒ ＆ Ｋａｔｉｎｇｅｒ ２００３ Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５１，７５７−７５９）。
【０１５８】
本発明の能動又は受動免疫法は、上記で定義したコンセンサスペプチドエピトープと比較していくつかのアミノ酸の相違を含む非常にまれな突然変異体単離物（以下のＵＫＮ５．１４．４に例示されるような）を除き、ＨＣＶの遺伝子型１〜６のいずれかのウイルスによる感染に対する個体の保護又は治療を可能にするはずである。
【０１５９】
さらなる態様では、本発明は、ＨＣＶの存在を検出するための診断試験装置及び方法をそれぞれ提供する。装置は、試薬として、エピトープＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに結合する１以上の抗体を含み得る。抗体は、例えば固体支持体上（例えばマイクロタイターアッセイプレート上、又は微粒子支持体上）に固定化されており、試料（例えば血液又は血清試料又は肝生検などの他の臨床標本）からＨＣＶ粒子を「捕獲する」働きをし得る。捕獲されたウイルス粒子は、その後、例えば捕獲ウイルス粒子に結合するさらなる標識試薬を添加することによって検出できる。好都合には、アッセイはＥＬＩＳＡ、特にサンドイッチ型ＥＬＩＳＡの形態をとり得るが、免疫クロマトグラフィー又はディップスティック型アッセイを含む他のいかなるアッセイ形式も原則的に採用できる（例えば放射免疫測定法、ウエスタンブロット法）。
【０１６０】
ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸエピトープに結合する抗体は、標識されていてもよく又は非標識でもよい。いかなる適切な標識も使用でき、例えば放射能標識、酵素標識、蛍光標識又は染料負荷微粒子標識が使用できる。
【０１６１】
本発明のアッセイ方法は、エピトープＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに結合する抗体の使用を含む。
【０１６２】
抗体は遺伝子型１〜６のいずれかからのＨＣＶに結合できるので、アッセイ装置及び対応する方法は、試料においてこれらの遺伝子型のいずれかを代表するＨＣＶを検出することができるはずである。
【０１６３】
最後の態様では、一般式ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに合致するペプチドを含む分子が、融合工程に干渉することによってＨＣＶの感受性細胞への侵入を阻害し得ると考えられる。そこで、例えば上記アミノ酸残基配列を含むペプチド又はポリペプチドは臨床的有用性を有すると考えられ、従って、本発明は、生理的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と混合してそのような分子を含む医薬組成物を包含する。そのようなアプローチは、ＨＩＶ ｇｐ４１の一部に対応する、Ｔ２０ペプチドに関して最近記述された（Ｚｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ，２００４ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０，１３３−１３４）。
【０１６４】
疑いを回避するため、文脈によって異なる指示が為されない限り、本発明は、単独で又はそのように記述される他の何らかの特徴による組合せと共に、本明細書で「好ましい」、「有利」、「好都合」等と表わされるいかなる特徴も含み得ることをここで明白に言明する。さらに、本明細書において言及される全ての刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
ここで、説明的実施例によって本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１６６】
ＨＣＶの種々の遺伝子型に感染した患者からの、Ｅ１Ｅ２糖タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列の単離がＬａｖｉｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（参考文献４３）によって報告された。種々の遺伝子型に由来する糖タンパク質で被包されたＨＣＶ偽粒子（ＨＣＶpp）を生成するため、本発明者らは、適切なＨＣＶ Ｅ１Ｅ２及びマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）Ｇａｇ−Ｐｏｌを発現するベクターを使用した。本発明者らはまた、形質導入マーカーとして働くＧＦＰレポータータンパク質をコードするＭＬＶ導入ベクターを利用した。
【０１６７】
ヒトＣＭＶプロモーターの制御下でＨＣＶ遺伝子型１ａのＨ系統由来完全長Ｅ１Ｅ２、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）Ｇａｇ−Ｐｏｌ及びＧＦＰを担持するＭＬＶ導入ベクターを発現するプラスミドがこれまでに報告されている（参考文献６）。様々な臨床単離物からのＨＣＶの完全長Ｅ１Ｅ２をコードするｃＤＮＡ配列［Ｈ７７ｃ系統に関するＨＣＶオープンリーディングフレームのアミノ酸残基１７０〜７４６を示す（参考文献７０）］は、ＰＣＲによって作製され、発現ベクターｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はｐｈＣＭＶ−７ａ（６）内のヒトＣＭＶプロモーターから下流にクローニングされ（参考文献６）、記述されているように（４３）それらのヌクレオチド配列を決定した。
【０１６８】
実験は、ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）及びヒト肝細胞癌（Ｈｕｈ−７）の細胞の使用を含んだ。これらを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５％可欠アミノ酸、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＢＣＯ ＢＲＬ）において増殖させた。
【０１６９】
ＨＣＶppは、基本的に以前に記述されているように作製した（参考文献６）。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３％細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション法（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＭＬＶ Ｇａｇ−Ｐｏｌパッケージングベクター、ＭＬＶ−ＧＦＰ導入構築物、及びＨＣＶ Ｅ１Ｅ２を発現するプラスミドとコトランスフェクトした。全ての実験において、ＨＣＶ糖タンパク質発現構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコトランスフェクションから除外した、無エンベロープ対照を使用した。トランスフェクションの２日後、ＨＣＶppを含む培地を収集し、清澄化して、０．４５μｍ細孔径の膜でろ過し、Ｈｕｈ−７細胞の感染のために使用した。感染の４日後、細胞を採集し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。形質導入効率をＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして決定した（典型的には０．０５％であった、無エンベロープ対照に「感染した」ＧＦＰ陽性Ｈｕｈ−７細胞の数を差し引いた後）。形質導入単位／ｍｌとして表わされる感染力価を形質導入効率から算定した。
【０１７０】
確立された感染性クローン１ａ型Ｈ系統（参考文献６）からのＥ１Ｅ２配列を、実験のこのシリーズ全体を通じて患者由来のＥ１Ｅ２クローンと共に対照として使用した。合計２８９の患者単離物をスクリーニングし、これらのうちで３９は偽粒子を感染性にすることができた。そのうちの一部の性質が本発明者らによって最近報告された（参考文献４３）、これらの機能性クローンの代表的選択を表１に示す。遺伝子型の各々を代表する少なくとも１個の感染性クローンを同定した。一部の患者単離物に由来するＨＣＶppは、このアッセイにおいて対照遺伝子型１ａ Ｈ系統からのものよりも再現可能により感染性であった。例えば構築物ＵＫＮ２Ｂ１．１に由来するＨＣＶppは通例標的細胞の３０％以上を形質導入したが、Ｈ７７に由来するものは１０〜２０％しか導入しなかった。典型的には、形質導入単位／ミリリットル（ＴＵ／ｍｌ）として表わされる感染力価は、ＵＫＮ２Ｂ１．１に関しては約１×１０5ＴＵ／ｍｌ、１ａ型Ｈ系統に関しては４×１０4ＴＵ／ｍｌであった。これに対し、遺伝子型３、５及び６のＨＣＶppは非常に低い力価を与えた（（参考文献１〜４）×１０3ＴＵ／ｍｌ）（表１）。
【０１７１】
【表１】
【実施例２】
【０１７２】
なぜ単離物の多くが感染力を有していなかったのかを検討するため、本発明者らは、ＨＣＶ糖タンパク質がトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたかどうかを調べた。各々の細胞溶解産物中のＥ２糖タンパク質の相対レベルを、ＧＮＡ（ガランサス・ニヴァリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ））レクチン被覆ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、及び全て１ａ型Ｅ２に対して惹起し先に述べられている（参考文献５２、１６）ポリクローナルウサギ血清Ｒ６４６及び２個のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、ＡＰ３３とＡＬＰ９８を含むＥＬＩＳＡによって測定した。ＭＡｂ ＡＰ３３及びＲ６４６抗血清を、製造者のプロトコールに従って（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）プロテインＧカラムで精製した。
【０１７３】
Ｅ２糖タンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイを、基本的に先に述べられているように（参考文献５４）実施した。簡単に述べると、上述したようにコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の清澄化溶解産物からのＥ１Ｅ２糖タンパク質を連続的に３倍希釈し、ＧＮＡレクチン被覆ＥＬＩＳＡプレート上に捕獲した。結合糖タンパク質を、抗Ｅ２ ＭＡｂ ＡＰ３３又はＡＬＰ９８又はウサギポリクローナル血清Ｒ６４６、次に抗種ＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）及びＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジン、Ｓｉｇｍａ）基質を用いて検出した。吸光度値を４５０ｎｍで測定した。
【０１７４】
結果を、試験した様々な溶解産物についての、希釈の逆数に対する吸光度（任意の単位）の一連のグラフである図１ａに示す。ＡＰ３３による検出についての結果を黒い丸で表わし、ＡＬＰ９８については白い丸、及びＲ６４６ポリクローナル抗血清については黒い三角で表わしている。
【０１７５】
ＭＬＶ Ｇａｇ−Ｐｏｌ及びＧＦＰレポーター構築物と共に感染性クローンの各々でコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解産物は、２個のＭＡｂの少なくとも１個に関して、強力な、濃度依存性シグナルを与えるＥ２のレベルを含んだ。４型単離物（ＵＫＮ４．２１．１６）及び試験した２個の５型単離物の１個（ＵＫＮ５．１４．４）が、それぞれＭＡｂ ＡＬＰ９８及びＡＰ３３によって認識されなかったことは注目すべきである。これは、これらの抗体によって認識されるエピトープ内の変異アミノ酸の存在によるものである（下記参照）。ウサギ抗血清Ｒ６４６は、ほとんど排他的に遺伝子型１ａ Ｈ系統Ｅ２を認識した。すなわち、他の遺伝子型からのＥ２だけでなく、同じサブタイプ（１Ａ．１４．３６）の異なる単離物からのＥ２も認識することができなかった。
【０１７６】
感染性ＨＣＶppを生成しない単離物全てでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の溶解産物も、Ｅ２の存在に関してＧＮＡ ＥＬＩＳＡによって分析した。一部は、Ｅ２が検出不能であるか又は低レベルのＥ２を有していたが、また別のものは、感染性クローンでトランスフェクトした細胞の溶解産物において認められるのと同様のＥ２レベルを含んだ（データは示していない）。本発明者らは、一部の単離物はＥ２を発現しないために感染力を欠き、また別のものは、おそらくそれらがコードするＥ２又はＥ１Ｅ２複合体が何らかの意味で非機能性であるために、高レベルのＥ２を発現するにもかかわらず非感染性であると結論した。
【実施例３】
【０１７７】
ＨＣＶppの感染性は、粒子のエンベロープへの完全長Ｅ１Ｅ２複合体の組込みに依存する（参考文献６、３９）。上記ＥＬＩＳＡデータは種々の遺伝子型に由来するＥ２の存在を確認したが、Ｅ１の存在は、広範に反応性の抗Ｅ１抗体がないため分析できなかった。その代わりに、本発明者らは、免疫沈降アッセイによってＥ１Ｅ２複合体の形成を検討した。ＨＣＶ糖タンパク質発現構築物とＭＬＶ Ｇａｇ−Ｐｏｌ及びＧＦＰ導入ベクターでコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を［35Ｓ］メチオニン／システインで放射性標識した。
【０１７８】
放射性標識は以下のように実施した。
【０１７９】
トランスフェクションの１８時間後、細胞をＰＢＳで洗い、２５μＣｉ／ｍｌのＬ−［35Ｓ］Ｒｅｄｉｖｕｅ（商標）Ｐｒｏ−Ｍｉｘ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むメチオニン／システイン不含培地で４８時間インキュベートした。トランスフェクト細胞の培地を採集し、遠心分離によって清澄化した。細胞をＰＢＳで洗い、溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭヨードアセトアミド、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００）に溶解して、核を除去するために溶解産物を短時間遠心した。清澄化した細胞溶解産物及びＨＣＶppを含む培地を抗Ｅ２ ＭＡｂ ＡＰ３３とＡＬＰ９８の混合物と共に４℃で２時間インキュベートし、生じた免疫複合体を、プロテインＡ−セファロースを用いて沈殿させた。プロテインＡ−セファロースビーズの洗浄後、免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性緩衝液（２００ ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．７；０．５％ＳＤＳ；１０％グリセロール；２０ｍＭ ＤＴＴ）に放出し、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを乾燥し、蛍光スクリーンに一晩暴露して、放射性標識タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ＦＸホスファイメージャーで視覚化した。
【０１８０】
結果を図１ｂに示す。
【０１８１】
Ｅ１を、糖タンパク質発現構築物の大部分でトランスフェクトした細胞の溶解産物からのＥ２と共に共免疫沈降させた。生じたタンパク質の相対量にはある程度の変動があり、沈降タンパク質（特にＥ１）の分子量に興味深い差が認められた。ヌクレオチド配列分析は種々の遺伝子型の間で予測グリコシル化部位の変動を示すので（参考文献４３）、これらはおそらくグリコシル化の相違によると考えられる。種々の遺伝子型のＥ１とＥ２の間で相対的化学量論に有意の変動があったことは注目すべきである。同様に、トランスフェクト細胞の培地に分泌されたＥ１Ｅ２複合体（そのうちのある程度の割合はＨＣＶppの形態であると予想された）も、同じＭＡｂによる免疫沈降によって検出された（データは示していない）。
【実施例４】
【０１８２】
（ＨＣＶpp感染した標的細胞の抗体による中和）
本発明者らは、細胞のＨ７７ｃ系統ＨＣＶpp感染を阻害するＭＡｂ ＡＰ３３、ウサギ抗血清Ｒ６４５及びＲ６４６（どちらも１ａ型Ｈ７７ｃ系統の可溶性細胞外ドメインに対して惹起した）の能力を試験した。
【０１８３】
また、遺伝子型１ａ Ｈ７７ｃ系統の超可変ＨＶＲ−１領域（残基３８４〜４１１）に対応する分枝ペプチドで免疫したニュージーランドウサギにおいて惹起した抗血清Ｒ１０２０及びＲ１０２１も試験した。これらの抗血清を生成するために使用した免疫プロトコールは先に記述されている（参考文献５３）。
【０１８４】
中和アッセイを以下のように実施した。遺伝子型１ａ Ｈ系統Ｅ１Ｅ２を有するＨＣＶppを、抗Ｅ２血清Ｒ６４５、Ｒ６４６、Ｒ１０２０及びＲ１０２１又はそれらの免疫前（ＰＩ）対応物の１：１２０希釈、又はＭＡｂ ＡＰ３３ ５０μｇ／ｍｌと共に３７℃で１時間プレインキュベートした。次に、６穴組織培養ディッシュにプレートしたＨｕｈ−７細胞にウイルス／抗体混合物を添加し、細胞を３７℃で３時間インキュベートした。接種物の除去後、細胞に新鮮培地を再供給し、３７℃で４日間インキュベートした。感染細胞の割合を、上述したようにＦＡＣＳによるＧＦＰの測定によって決定した。中和活性を、それぞれ感染の５０％又は９０％阻害を達成するために必要な抗体濃度と定義される、ＩＣ50又はＩＣ90で表わした。
【０１８５】
結果を図２Ａに示す。
【０１８６】
試験したウサギ抗血清のうちで、Ｒ６４６は感染を完全に排除することができ、一方Ｒ６４５は感染を約５０％ブロックした。Ｒ１０２０及びＲ１０２１抗ＨＶＲ１抗血清はいずれも、感染を６５％中和することができた。予想されたように、対応する免疫前ウサギ血清はＨＣＶpp感染に影響を及ぼさなかった。Ｒ６４６と同様に、ＭＡｂ ＡＰ３３はＨ７７ｃ系統ＨＣＶppによるＨｕｈ−７細胞の感染を完全にブロックした。
【０１８７】
次に、本発明者らは１ａ Ｈ７７系統以外のＨＣＶ遺伝子型を中和するこれらの抗血清及びＭＡｂ ＡＰ３３の能力を試験した。ＡＰ３３が広く交差中和性であるのに対し、抗血清Ｒ６４５、Ｒ６４６及びＲ１０２０は、１ｂ、２ａ又は２ｂ型糖タンパク質を組み込んだＨＣＶppの感染力にごくわずかな作用しか及ぼさないことが認められた（図２ｂ）。Ｒ６４６は１ａ以外の遺伝子型に由来するＨＣＶppによる感染を有意に阻害しないことが確立されているので、本発明者らは、その特異性が１ａ型Ｈ系統の糖タンパク質に限定されるのかどうか、又は他の１ａ型単離物を阻害し得るのかどうかを検討した。図２ｃに示すように、この抗血清は、１ａ Ｈ系統以外の２つの患者由来単離物１Ａ１４．８及び１Ａ１４．３６に対してあまり有効ではなく、２００ｎｇ ＩｇＧ／ｍｌのＩＣ50値を有していた。
【０１８８】
ＭＡｂ ＡＰ３３の広い反応性を、遺伝子型の完全な相補物を表す単離物に由来するＥ１Ｅ２を組み込んだＨＣＶppのパネルに関して一連の濃度で試験することによってさらに検討した。図３に示すように、６つの遺伝子型全てを代表する単離物のＭＡｂ ＡＰ３３反応性Ｅ２を有するＨＣＶppは、遺伝子型５についての０．６μｇ／ｍｌから遺伝子型３ａについての２２μｇ／ｍｌまでの範囲にわたるＩＣ50で有効に中和された。遺伝子型５のＨＣＶpp単離物の１つ、ＵＫＮ５．１４．４の感染力はＭＡｂ ＡＰ３３によって影響を受けなかった（データは示していない）が、これは、この感染性単離物のＥ２糖タンパク質がこの抗体によって認識されないからである（図１Ａ）。
【０１８９】
この試験で使用した種々の遺伝子型のＥ２のＮ末端領域のアミノ酸配列アラインメント（図４ａ）は、ＭＡｂ ＡＰ３３エピトープ（残基４１２〜４２３）が、３個の変異アミノ酸部位（残基４１２、４１４及び４１６）だけしか有さず、比較的良好に保存されていることを示した。このエピトープ内の他の部位は絶対的に保存されている。これに対する例外は、遺伝子型５の単離物ＵＫＮ５．１．４．４によってコードされるＥ２内の対応アミノ酸配列であった。これは、その他の単離物と比較して潜在的グリコシル化部位（ＮＧＳ）の−１シフトと配列内の４残基変化を有していた（図４ａ）。これに対し、Ｒ６４６によって認識される遺伝子型１ａ Ｈ系統の線状エピトープに対応する配列には、その限られた特異性と一致して、異なる遺伝子型の間で有意の変動が見られた。最後に、ＡＬＰ９８抗体によって認識されるエピトープ（残基６４４〜６５１）も保存されていたが、遺伝子型４のクローンの６５１位に存在するアルギニンからバリンへの突然変異はこの抗体による認識を無効にした（図４ｂ）。ＡＰ３３によって認識されるエピトープをより詳細に検討するため、エピトープを詳細に位置づけた。
【実施例５】
【０１９０】
（ファージバイオパニングスクリーンを用いるＡＰ３３接触残基の詳細なマッピング）
ファージ提示されるランダムペプチドライブラリー（ＲＰＤＬ）のＰｈＤ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ［ＮＥＢ］）シリーズは、３型ファージペプチド提示ベクターＭ１３ＫＥに基づく。これらのライブラリー内の個々のファージは、スペーサー配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒによって成熟ｐＩＩＩキャプシドタンパク質のＮ末端に融合されたランダムペプチドの５コピーまでを発現する。ランダムな１２量体ペプチドを発現するライブラリーを本発明者らの実験において使用した（ＮＥＢカタログ番号Ｅ８１１０Ｓ）。ＰｈＤファージ−ライブラリーのアフィニティー選択を、基本的に製造者によって述べられているように実施した。簡単に述べると、ＡＰ３３を、１００μｌの被覆緩衝液（ＣＢ）（０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩、ｐＨ９．６）４℃で一晩インキュベートすることにより、マキシソープマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のウエルに１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で被覆した。被覆後、抗体溶液を廃棄し、その後ウエルを、３００μｌのＴＢＳ−ＴＢ（０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０及び５％（ｗ／ｖ）粉乳（Ｍａｒｖｅｌ（登録商標），Ｃａｄｂｕｒｙ’ｓ）を含むトリス緩衝食塩水、ｐＨ７．６［ＴＢＳ］）によって４℃で１時間ブロックした。ブロック溶液を廃棄した後、ウエルをＴＢＳ−Ｔ（０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０を含むＴＢＳ）で６回洗浄し、その後ＴＢＳ−Ｔ １００μｌ中で希釈したＰｈＤライブラリーから１×１０11ファージを添加した。これらのファージを２５℃で１時間放置して固定化ＡＰ３３に結合させた後、ＴＢＳ−Ｔによる連続洗浄を通して非結合ファージを除去した。結合ファージを１００μｌの０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で１０分間溶出し、微量遠心機チューブに移して、その後１５μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）の添加によって中和した。
【０１９１】
回収したファージを、ＬＢ中で溶出ファージの連続希釈を調製することによって力価測定し、各々の希釈溶液１０．０μｌを、対数増殖期（０．３ＯＤ600nm）の大腸菌ＥＲ２５３７株（ＮＥＢ）２５０μｌに添加した。ファージを２５℃で５分間細菌に感染させた後、細菌を、１ｍＭ Ｘ−Ｇａｌ及び１ｍＭ ＩＰＴＧを含む０．７％寒天３ｍｌと混合し、ＬＢ寒天プレートに重ねた。寒天を５分間凝固させた後、プレートを裏返して、３７℃で一晩インキュベートした。その後、方程式：ファージμｌ-1＝（［青色プラークの平均数］×［希釈］-1）／１０を用いて、形成された青色プラークの平均数からファージの力価を算定した。
【０１９２】
次に、強化ファージライブラリーを、溶出ファージ５０μｌ（約１×１０5ＰＦＵ）をＬＢ中の対数期大腸菌ＥＲ２５３７株２０ｍｌに添加し、３７℃で少なくとも４時間半インキュベートすることによって増殖させた。ファージ増殖後、１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４）によって細菌及び他のデブリを除去した。５分の１容量のＰＥＧ（２０％［ｗ／ｖ］ポリエチレングリコール−８０００、２．５Ｍ塩化ナトリウム）を４℃で１時間添加してこの培養物の上清からファージを沈殿させ、１５，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって収集した。次にファージペレットをＴＢＳ １．０ｍｌに再懸濁した後、氷上で１時間、５分の１容量のＰＥＧで２回目の沈殿を実施した。その後１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離（ＭＳＥ Ｍｉｃｒｏ Ｃｅｎｔａｕｒ）によってファージを収集し、最終容量２００μｌの滅菌ＴＢＳに再懸濁した。増殖させたライブラリー内のファージの濃度を上述した力価測定によって決定し、その後１×１０12ファージを、さらなる２〜３回のアフィニティー選択への投入物として使用した。
【０１９３】
最終回のアフィニティー選択後、溶出ファージの力価測定から得た個々のプラークを、滅菌ピペットチップを用いてＥＲ２５３７の対数期培養物２ｍｌに接種し、３７℃で４時間半増殖させた。２回の上述した沈殿によってこの培養物の上清からファージを回収し、ＴＢＳ １００μｌに再懸濁した。ファージ原液を−２０℃で保存した。
【０１９４】
１２塩基の無処置ＲＰＤＬから濃縮したペプチドの抗原性を調べるため、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＩＡ）を使用した。ＣＢ ５０μｌ中で１．０〜１００μｇ／ｍｌに希釈したＡＰ３３を、４℃で一晩のインキュベーションによってマイクロタイタープレートのウエルに直接被覆した。ブロックキング後（上述したように）、約１×１０11ファージ粒子をウエルに添加し、１〜２時間結合させた。その後、ＴＢＳ−Ｔ中で１：１０００に希釈した抗ｆｄ
（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ−７７８６）とのインキュベーションによって結合ファージを検出した。次に、これらの抗体の結合を、抗ウサギ二次抗体に複合したアルカリホスファターゼ及びｐＮＰＰ基質（Ｓｉｇｍａ）との連続インキュベーションによって検出し、ＯＤを４９０ｎｍで読み取った。
【０１９５】
配列決定鋳型ＤＮＡは、プライマーｇＩＩＩ（ｆ）５’−ＡＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣ−３’を、製造者によって供給された−９６配列決定プライマーと共に使用して、約１×１０9ファージからのＤＮＡのＰＣＲ増幅によって調整した。標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をファージ粒子及び細菌の両方からのＤＮＡの増幅のために使用した。各々の反応のために、１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ ＫＣｌ［ｐＨ８．３］）２．５μｌ、各々のプライマー５．０μｌ（５．０ｐｍｏｌ）、ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）０．１μｌ（０．５単位）及び１０．０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む）０．５μｌを薄壁マイクロ遠心チューブに添加した。ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水で反応容量を２５．０μｌにした後、ＤＮＡ不含水で約１×１０9ファージ／ｍｌに希釈したファージ粒子１．０μｌを添加した。次にＰＴＣ−１００／２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でのＰＣＲサイクリング（９５℃、４５秒間、５０℃、４５秒間、７２℃、９０秒間の３５サイクル）によってＤＮＡを増幅した。
【０１９６】
増幅後、組み込まれなかったヌクレオチドとオリゴヌクレオチドを、配列決定の前に、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）及びエキソヌクレアーゼＩ（Ｅｘｏ Ｉ）各々１．０μｌを添加し、次に３７℃で３０分間インキュベートすることによって除去した。その後ＳＡＰとＥｘｏ Ｉ酵素を７５℃で１５分間不活性化し、５．０μｌのＳＡＰ／Ｅｘｏ Ｉ処理したＰＣＲ産物からの鋳型ＤＮＡを、薄壁ＰＣＲチューブ中のＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４．０μｌ及び−９６配列決定プライマー１．０μｌ（１ｐｍｏｌ）と混合し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サーマルサイクラーを用いてサイクルシークエンス法（９６℃、１０秒間、５０℃、５秒間、６０℃、４分間の２５サイクル）を実施した。次にＤＮアーゼ不含水１０．０μｌ及び３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２．０μｌ（０．１容量）をチューブに添加した後、短時間遠心分離し、滅菌マイクロ遠心チューブに移した。その後、配列決定したＤＮＡを、１００％エタノール４５．０μｌの添加と２５℃で１０分間のインキュベーションによって沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して回収し、７０％エタノール４５．０μｌで洗った後、３７℃で１５分間乾燥した。その後、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０遺伝子アナライザーを用いて配列分析を実施した。
【０１９７】
ＡＰ３３パラトープとの接触を形成する可能性が高いＥＩＡ反応性強化提示ペプチドの保存残基の同定を、推定ペプチドのコンピュータ援用アラインメントによって実施した。
【０１９８】
固定化ＡＰ３３に対する３回の選択バイオパニング後、２２個のファージクローンを採取し、増殖させて、ＡＰ３３抗体に対するそれらの反応性をＥＩＡによって測定した（図５）。図５は、強化ファージの大部分によって提示されるペプチドがＡＰ３３抗体と特異的に相互作用することを示す。相互作用の特異性は、対照ＡＬＰ９８抗体に対する反応性の欠如によって確認される。
【０１９９】
前記ペプチドのＡＰ３３ペプチドへの結合を媒介することに関与する可能性が最も高い残基を同定するため、選択ペプチドのＤＮＡ塩基配列決定を実施し、コンピュータ援用アラインメントを用いてそれらの推定アミノ酸配列を整列した。各々の群がユニークペプチド配列を含む、３つの群のファージを同定した（図６）。それらのコンセンサス配列は、予測ＡＰ３３エピトープに対する各々の群のアラインメントと共に、決定的に重要な結合モチーフがＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸと定義できることを指し示す。
【０２００】
図６において、抗体ＡＰ３３によって選択したファージ内に存在するランダムペプチド挿入物の推定アミノ酸配列をパネルＡに示す。推定上のＡＰ３３エピトープに対して整列した反応群の選択ファージペプチド内各々に存在する推定アミノ酸配列（パネルＢ）は、抗体−エピトープ相互作用に関与する保存された接触残基を明らかにする。クローンＰ３．５はＡＰ３３ ＥＩＡにおいて非反応性であり（図５）、このペプチドはＡＰ３３エピトープに対してごくわずかな相補性しか示さないことに留意しなければならない。
【実施例６】
【０２０１】
（アラニン置換突然変異型Ｅ１Ｅ２タンパク質を用いるＡＰ３３及び３／１１エピトープの詳細なマッピング）
上記実施例５で述べた所見を、推定上のＡＰ３３エピトープ内の全ての位置で１個の残基をアラニンによって置換した、Ｈ７７ Ｅ１Ｅ２突然変異型クローンのパネルを用いる実験によってさらに強化した。このパネルはまた、同じエピトープに結合すると記述されている（Ｆｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ，１９９９ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，６２３５−６２４４）、ラットモノクローナル抗体３／１１の結合を検討するためにも使用した。３／１１及びＡＰ３３は、どちらもプロテインＧカラムを用いてハイブリドーマ上清から精製した。
【０２０２】
様々なＥ１Ｅ２突然変異型がＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現され、生じたタンパク質のＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１に対する反応性を、ＧＮＡ捕獲ＥＩＡを用いて評価した（図９）。突然変異型Ｌ４１３Ａ、Ｎ４１５Ａ、Ｇ４１８Ａ及びＷ４２０Ａに関するＡＰ３３の結合は、野生型と比較して７５％より多く低下し、これらの残基が結合のために非常に重要であることを指示した。突然変異型Ｔ４１６Ａ及びＮ４１７ＡもＡＰ３３結合を低下させたが、この作用はその他の４つの突然変異型に関するほど著明ではなかった。４１２位のアラニンによるグルタミンの置換（Ｑ４１２Ａ）は、ＡＰ３３のＥ１Ｅ２への結合を一貫して増強し、野生型Ｈ７７タンパク質と比較して約５０％上昇させた。これに対し、この置換はＭＡｂ ３／１１結合には影響を及ぼさなかった。残りの５残基のアラニン置換は、ＡＰ３３認識に対して無視し得る程度の作用しか及ぼさなかった。
【０２０３】
野生型Ｈ７７タンパク質と比較してＭＡｂ ３／１１による結合の一貫した有意の低下は、突然変異型Ｎ４１５Ａ、Ｗ４２０Ａ及びＨ４２１Ａに関して認められ、ＭＡｂ ３／１１による結合におけるこれらの残基の重要性を強調した（簡潔さのためにデータは省いている）。４２２位のイソロイシンの置換は３／１１結合の中等度の増強を生じさせた。残りの残基のアラニン置換は、影響を及ぼさないか又は野生型と比較して中等度の結合低下を生じさせた。
【０２０４】
（ＭＡｂ ＡＰ３３とＭＡｂ ３／１１の結合親和性及びＨＣＶpp中和効率の比較）
詳細なエピトープマッピング実験は、ＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１がＥ２タンパク質内の異なる接触残基を認識していることを示唆したので、本発明者らは、これらの相違が結合親和性又は中和効力の差へと翻訳され得るのかどうかを評価することへと進んだ。４１２〜４２３分枝ペプチドへの５０％結合を得るために必要なＭＡｂ ＡＰ３３の濃度は、ＭＡｂ ３／１１に関して必要な濃度よりも１０より多く低かった（図１０：ＡＰ３３＝丸、３／１１＝三角）。同様に、ビオチニル化ＭＡｂ結合アッセイにおいて、ＡＰ３３は結合のための競合において３／１１よりも効率的であった（データは示していない）。ＭＡｂ ３／１１と比較して、ＭＡｂ ＡＰ３３による競合は、ビオチニル化ＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１の両方による結合のより大きな低下を生じさせた。前記ＭＡｂはまた、様々なＨＣＶ遺伝子型を代表するＥ１Ｅ２への親和性の著明な差を示した（図１１）。Ｅ１Ｅ２タンパク質への５０％結合を得るために必要なＭＡｂ ＡＰ３３の濃度は約１×１０1〜１×１０3ｎｇ／ｍｌの範囲であったが、一方約１×１０2〜１×１０4ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度の３／１１を使用して５０％結合が達成可能であった。合わせて考慮すると、これらのデータは、ＡＰ３３がＭＡｂ ３／１１よりもＥ２に対してより高い親和性を有することを指し示す。
【０２０５】
同様に、遺伝子型１〜６を代表するＥ１Ｅ２を担持するＨＣＶppを中和するＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１の能力の比較（図１２）は、両方の抗体が広い中和能を有するが、ＡＰ３３の中和効力はＭＡｂ ３／１１よりも一貫して高かった（ｐ＜０．００１、ウィルコクソンのマッチドペア検定）。５０μｇ／ｍｌの濃度で使用したとき、ＭＡｂ ＡＰ３３はＨＣＶppの感染力を８０〜９９％中和することができた。これに対し、ＭＡｂ ３／１１の同じ濃度は１０〜８０％の中和だけを生じさせた。本明細書で述べるように、ＭＡｂ ＡＰ３３は遺伝子型５のＵＫＮ５．１４．４系統からのＥ１Ｅ２を担持するＨＣＶppをほとんど中和しなかった。同様にＭＡｂ ３／１１もこのＥ１Ｅ２クローンを担持するＨＣＶppを中和することができなかった。この単離物は、残基４１２〜４２３に対応するＥ２領域内に４アミノ酸変化（ＱＬＩＱＮＧＳＳＷＨＩＮ）を有する。この突然変異は、ＡＰ３３認識のために重要な残基のうちの２個（Ｎ４１５とＧ４１８）及び３／１１にとって重要な１個（Ｎ４１５）を変化させる。ＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１のどちらも、ＵＫＮ５．１５．４ Ｅ２と反応することができない。従って、驚くべきことではないが、両方のＭＡｂはまたＵＫＮ５．１４．４ ＨＣＶppも中和することができない。
【実施例７】
【０２０６】
（ＡＰ３３及び３／１１のＶH及びＶL領域の配列分析）
約１０6ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡを、製造者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。全ＲＮＡ４μｌを、キットに含まれるポリ−ｄＴオリゴヌクレオチドプライマーと共にＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）を使用して逆転写した。生じた２μｌのｃＤＮＡを、軽及び重鎖の可変領域を増幅するために設計したＰＣＲにおける鋳型として使用した。
【０２０７】
重鎖の増幅は、センスプライマーＶＨｌＢＡＣＫ （５’−ＡＧＧ ＴＳＭ ＡＲＣ ＴＧＣ ＡＧＳ ＡＧＴ ＣＷＧ Ｇ−３’）とアンチセンスプライマーＶＨ１ＦｏＲ−２ （５’−ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＣＡ ＣＧＧ ＴＣＡ ＣＣＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡ−３’）及びＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、先に述べられているように（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｉｎ：「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」．Ｅｄ．Ｋａｙ ｅｔ ａｌ １９９６，ｐ７９−１１１）実施した。軽鎖の増幅は、プライマーＭｋ（５’−ＧＧＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＡＹＡ ＴＴＧ ＴＧＭ ＴＳＡ ＣＭＣ ＡＲＷ ＣＴＡ ＭＣＡ−３’）と逆プライマーＫｃ（５’−ＧＧＴ ＧＣＡ ＴＧＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ−３’）を使用して先に述べられているように（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０００ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３，１６７−１７７）実施した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてカラム精製し、次にｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクター系を製造者の推奨に従って使用して、Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクターにクローニングした。重及び軽鎖の各々について２個のクローンを、Ｔ７正プライマー及びＭ１３逆プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造者のプロトコールに従って配列決定した。ＡＰ３３について決定したヌクレオチド配列を図７に示す。
【０２０８】
（結果）
ＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１の軽及び重鎖可変領域に対応する推定アミノ酸配列を比較した。この比較の最も著しい特徴は、ＭＡｂ ＡＰ３３についての重鎖ＣＤＲ３が１０個の、主として疎水性のアミノ酸を含むことであった。これに対し、ＭＡｂ ３／１１の重鎖ＣＤＲ３は３個のアミノ酸だけを含んだ。ＩｇＢＬＡＳＴ検索は、ＭＡｂ ＡＰ３３の重及び軽鎖がマウスＶＨ−３６−６０、サブグループＶＨ−Ｉ（アクセッション番号Ｋ０１５６９）及びＶＫ−２１−１０（アクセッション番号Ｋ０２１６０）に最も類似することを明らかにした。３／１１配列の生殖細胞系分析は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで入手可能なラット生殖細胞系配列が少ないため不可能であった。
【実施例８】
【０２０９】
（ＨＣＶの中和）
本実施例では、ＡＰ３３がＨＣＶウイルスを中和できることを示す。
【０２１０】
キメラＨＣＶ Ｊ６−ＪＦＨ１ゲノムｃＤＮＡの作製。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流の完全長ＨＣＶ遺伝子型２ａ ＪＦＨ１系統のｃＤＮＡを担持するプラスミドｐＪＦＨ１は、Ｔ．Ｗａｋｉｔａ（Ｗａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１，７９１−７９６）によって本発明者らに供給された。キメラ構築物を作製するため、ＪＦＨ１系統ｃＤＮＡのＮＳ２のコア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７及びＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列を、もう１つ別の遺伝子型２ａ Ｊ６ＣＦ系統からのヌクレオチド配列で置換した（Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６２，２５０−２６３）。Ｊ７１と称される、生じたキメラＪ６−ＪＦＨ１構築物から生成された感染性ウイルスを、以下で述べるウイルス中和アッセイにおいて使用した。
【０２１１】
（ＨＣＶ Ｊ７１ ＲＮＡトランスフェクション及び細胞培養におけるウイルス生産）Ｊ７１構築物を、ウイルスゲノムｃＤＮＡの３’末端の直後に位置する制限酵素部位での切断によって線状化した。ＨＣＶ Ｊ７１ ＲＮＡを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｍｂｉｏｎ）を製造者によって述べられているように使用して、線状化構築物からインビトロで転写した。約１０μｇのインビトロ合成したＪ７１ ＲＮＡを、０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）においてＨｕｈ−７細胞と混合し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）電気穿孔装置を使用して９６０μＦ、２７０Ｖで１回パルスした。トランスフェクトした細胞を直ちに細胞培地と混合し、８０ｃｍ2フラスコ及びカバーガラスに接種した。３７℃で４日間のインキュベーション後、フラスコからの培地を収集し、細胞デブリを除去するための短時間の遠心分離によって清澄化して、０．４５μｍ細孔径の膜でろ過し、ナイーブＨｕｈ−７細胞を感染させるために使用した。３７℃で４日間のインキュベーション後、感染細胞は、電気穿孔細胞から収集した培地中に感染性ウイルス子孫が存在することを確認するウイルス抗原を含むことを見出した。カバーガラス上の電気穿孔細胞を固定し、間接免疫蛍光検査法によってウイルスタンパク質の存在を判定した。
【０２１２】
第７継代まで細胞の大部分が複製ウイルスゲノムを内包するように電気穿孔細胞を継代したとき、ウイルス抗原陽性細胞の数が上昇することが認められた。
【０２１３】
（ＨＣＶ中和アッセイ）
細胞培養産生ＨＣＶ Ｊ７１ウイルスを、第１０継代のウイルスＲＮＡトランスフェクトＨｕｈ−７細胞の培地から採集し、清澄化して、上述したようにろ過し、以下で述べるようにウイルス中和アッセイにおいて使用した。ウイルスを含む培地を、２００、４０、８、１．６、０．３２、０．０６４μｇ／ｍｌの精製ＭＡｂ ＡＰ３３又は３／１１と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次に各々のウイルス−抗体混合物を、１０-1〜１０-7の範囲で、完全培地中で連続的に１０倍希釈した。各々の希釈溶液を、４８穴組織培養皿中のＨｕｈ−７細胞を感染させるために使用し（各希釈溶液につき６穴）、細胞を３７℃で３時間インキュベートした後、接種物を除去し、細胞に新鮮培地を再供給して、３７℃で４日間インキュベートした。その後細胞をＰＢＳで１回洗い、メタノールで固定して、ヒツジ抗ＮＳ５ａ抗血清（Ｍａｒｋ Ｈａｒｒｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｅｄｓの好意により提供された）を使用してウイルスＮＳ５ａをプローブし、抗ヒツジＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を使用して結合抗体を検出した。穴を蛍光細胞の存在又は非存在に関して記録し、ウイルスの感染力を、基本的にＬｉｎｄｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９，６２３−６２６によって述べられたようにＴＣＩＤ50（組織培養感染量）として測定した。
【０２１４】
（考察）
これまでの試験は、非常に限られた範囲のＨＣＶ遺伝子型だけに対する血清又は抗体の中和能力を測定していた（５、２１、３０）。本発明者らは、主要遺伝子型１〜６の全てを代表するＥ１Ｅ２を担持するＨＣＶppを中和する一連のＥ２特異的抗体及び血清の能力を評価するためにＨＣＶppアッセイを使用した。
【０２１５】
主要遺伝子型全てを代表する機能性Ｅ１Ｅ２クローンのパネルを確立したので、本発明者らは、ＭＡｂ ＡＰ３３及びＨ７７ｃ系統のＥ２タンパク質のＨＶＲ１領域又は細胞外部分のいずれかに対して惹起したウサギ抗血清の、ＨＣＶppの侵入を中和する能力を評価することへと進んだ。Ｅ２のＨＶＲ１及び細胞外ドメインに対して惹起したウサギ抗血清は、どちらも、Ｈ７７ｃ Ｅ１Ｅ２を組み込んだＨＣＶppを中和することができたが、同じ免疫原で免疫したウサギの間での中和効力の差は明白であった。しかし、どちらも、異種遺伝子型１ａ Ｅ１Ｅ２を組み込んだＨＣＶppの低い中和を示し、試験した他の遺伝子型由来のＥ１Ｅ２を含むＨＣＶppを中和しなかった。ＨＶＲ１の高度の遺伝的多様性は観察された低い交差中和を説明し、この所見は、天然ＨＶＲ１特異的抗体の限られた中和能力という以前の報告と一致する（７６）。Ｅ２細胞外ドメインによるウサギの免疫も中和抗体の誘導を生じさせたが、やはりこれらの応答は高度に系統特異的であった。ペプチドマッピング及び競合アッセイは、最も強力な中和血清（Ｒ６４６）が立体配座及び線状決定基の両方を認識することを示した。中和は、天然であるが変性したｓＥ２によって阻害することができ、中和抗体が立体配座エピトープを認識する可能性が高いことを示唆した。
【０２１６】
これまでの研究は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質による免疫後に惹起される抗体が、同種攻撃誘発に対して少なくとも部分的に保護し得ることを示した（３３、５９）。同様に、多くの広範に中和するヒトモノクローナル抗体が記述されており、それらの全てが立体配座エピトープを認識する（１、９、３７、３８、４０、４２）。これらの抗体は、ＨＣＶ感染の治療における将来的な役割を有し得る。それらはまた、将来のワクチン候補を定義するためにも役立つと考えられる。しかし、ＨＩＶ−１に関する試験は、広範な中和抗体によって認識されるエピトープに免疫応答を集中させることが重要な課題であることを示した。これに関して、ＡＰ３３が極めて多様なＥ１Ｅ２を担持するＨＣＶppの侵入を強力に中和するという所見は、そのエピトープが線状であり、ＨＣＶの種々の遺伝子型にわたって高度に保存されているので、重要である。ＡＰ３３によって認識されるエピトープは、残基４１２〜４２３（配列ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮによって実証される）に位置づけられ、１つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を担持する（５２）。１個の遺伝子型５単離物（ＵＫＮ５．１４．４）に由来するＨＣＶppが、感染性であるが、ＭＡｂ ＡＰ３３によって認識されなかった（従って中和されなかった）ことに留意するのは興味深い。この単離物は、その他の単離物と比較して−１シフトした、良好に保存されたＮ結合グリコシル化部位と、ＡＰ３３エピトープに対応するＥ２領域内に４アミノ酸変化を有していた（ＱＬＩＱＮＧＳＳＷＨＩＮ）。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに寄託した配列のその後の分析は、ＡＰ３３エピトープが高度に保存されていることを示した。原型ＡＰ３３エピトープと比較した配列の平均多様性は４．７％であり、可変アミノ酸の大部分は予測エピトープのＮ末端に位置した。重要な点として、ＵＫＮ５．１４．４内に存在するものと類似の配列は明らかではなかった。本発明者らの予備的なデータは、４個の変異アミノ酸の１個の、その保存された対応物への復帰（すなわちＱからＮへ）はＵＫＮ５．１４．４ ＨＣＶppを非感染性にし（ＭＡｂ ＡＰ３３に対しても非反応性のままである）（示していない）、従って感染におけるＥ２のこの領域の潜在的重要性を強調する。この所見は、ＵＫＮ５．１４．４ ＨＣＶppの感染力がＮ４１５Ｑ及びＮ結合グリコシル化配列の−１シフトによって影響されないという事実と共に、この特定単離物が中和回避突然変異体を表し得ることを示唆する。
【０２１７】
結論として、本発明者らは、ＡＰ３３抗体によって定義されるエピトープが全ての主要遺伝子型にわたって高度に保存されていること及びこの抗体が広い中和能力を有することを示した。
【０２１８】
（参考文献）
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【０２１９】
上記明細書において言及した全ての刊行物は、参照により本明細書の一部をなすものとする。記述した方法及び本発明のシステムの様々な修正及び変法が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明白である。本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明したが、特許請求される本発明がそのような特定実施形態に不当に限定されるべきでないことは了解されるべきである。実際に、分子生物学又は関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するための記述した様式の様々な修正は、特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１ａ】様々なＥＬＩＳＡの結果を表しており、希釈倍率に対する吸光度（任意の単位）の一連のグラフを示す。
【図１ｂ】抗Ｅ２ ＭＡｂ ＡＰ３３とＡＬＰ９８の混合物によって免疫沈降させた放射性標識ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左側の数字は分子量マーカーを示す。
【図２ａ】様々な抗血清及び免疫前対照血清（「ＰＩ」接尾辞）又はＭＡｂ ＡＰ３３によるＨＣＶ遺伝子型１偽粒子の中和の程度を示す棒グラフを示す。縦軸は、蛍光細胞（感染した細胞）の割合（％）を示す。
【図２ｂ】様々な抗血清又はＭＡｂ ＡＰ３３による遺伝子型１Ａ、１Ｂ、２Ａ及び２Ｂ ＨＣＶppの中和の程度を示すグラフである。
【図２ｃ】遺伝子型１Ａ ＨＣＶサブタイプに対する抗血清Ｒ６４６についての濃度と中和との関係を示すグラフである。
【図３】種々のＨＣＶ遺伝子型に対するＭＡｂ ＡＰ３３の濃度と中和との関係を示すグラフである。
【図４ａ】６つの公知の遺伝子型の各々を代表する様々なＨＣＶ単利物のＥ２のタンパク質のアミノ酸配列の一部を示す。
【図４ｂ】６つの公知の遺伝子型の各々を代表する様々なＨＣＶ単利物のＥ２のタンパク質のアミノ酸配列の一部を示す。
【図５】ＥＩＡアッセイにおける、抗体ＡＰ３３（白い棒）及びＡＬＰ９８（黒い棒）と様々な選択ファージとの反応性を示す棒グラフである。
【図６】様々なファージクローンによって発現されるペプチドの推定アミノ酸配列（パネルＡ）及びＨＣＶ Ｈ７７ Ｅ２タンパク質の対応する部分とのアラインメント（パネルＢ）を示す。
【図７】ＡＰ３３モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の可変領域をコードするハイブリドーマから本発明者らによって誘導されたヌクレオチド配列（プライマー決定配列は省いている）を示す。
【図８】軽鎖及び重鎖可変領域に関する、ＡＰ３３ハイブリドーマからクローニングしたｃＤＮＡから得たＤＮＡ配列（下段ＤＮＡ配列）及び使用したプライマーのＤＮＡ配列（上段）を示す。推定アミノ酸配列をＤＮＡ配列の上部に示す。ＣＤＲを構成するアミノ酸配列基を下線で示す。付加的な残基（「Ｘ」）が重鎖のフレームワーク領域１の開始部に存在すると考えられる。
【図９】野生型Ｅ１Ｅ２配列への結合と比較した、ＥＩＡによって判定したときの、Ｅ１Ｅ２タンパク質の様々なアラニン含有突然変異型へのＡＰ３３の結合の量を示す棒グラフである。
【図１０】関連ペプチドへのＡＰ３３（丸記号）及び３／１１（三角記号）の結合を比較した、抗体濃度と結合の割合（％）との関係を示すグラフである。
【図１１】種々のＨＣＶ遺伝子型Ｅ１Ｅ２タンパク質に結合するときのＡＰ３３（丸）及び３／１１（三角）についての抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）と結合する割合（％）の関係を示す一連のグラフである。
【図１２】５０μｇ／ｍｌの最終濃度でＡＰ３３（黒いバー）又は３／１１（白いバー）に暴露したときの、種々のＨＣＶ遺伝子型を表わす様々なＨＣＶppクローンに関する感染力の割合を示す棒グラフである。
【図１３】ＡＰ３３（黒丸）及び３／１１（白丸）モノクローナル抗体によるＨＣＶ Ｊ７１の中和を示すグラフである。無関係なモノクローナル抗体ＤＢ１６５（黒い三角）及び抗体なし（白い三角）を対照として示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を中和することができるリガンド、ＨＣＶに対する抗体を誘発するための様々なアミノ酸残基含有及び／又はヌクレオチド含有組成物、ＨＣＶ感染を予防する及び／又は治療するための方法、及びＨＣＶを検出するための検定装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）に属するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の主要な原因である。ＨＣＶは、これまでに約２億人が感染し、現在の推定では毎年３百万人が新たに感染すると示唆されている（参考文献３）。感染者の約８０％はウイルスを排除することができない。慢性感染が結果として起こり、しばしば重症の慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌を導く（参考文献２、４５）。慢性感染のための現在の治療は効果がなく、予防及び治療ワクチンの開発が急務である。
【０００３】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのエラーの起こりやすい性質及びインビボでの高い複製率（参考文献３４、５０）の故に、ＨＣＶは高い度合の遺伝的変異性を示す。ＨＣＶは６つの遺伝学的に異なる遺伝子型に分類することができ、さらに、それぞれヌクレオチドレベルで約３０％及び１５％に異なる少なくとも７０のサブタイプに細分できる（参考文献６４、６６）。ワクチンの開発のための重要な課題は、ウイルス遺伝子型及びサブタイプの大部分において保存される保護エピトープを同定することである。この問題は、中和応答のための天然の標的であるエンベロープタンパク質が最も可変性の高い２つのタンパク質であるということにより、さらに困難なものとなる（参考文献１０）。
【０００４】
エンベロープタンパク質、Ｅ１及びＥ２は、細胞の結合と侵入の役割を担う（参考文献４、８、１７、５５、６１）。それらは、Ｎ末端細胞外ドメイン及びＣ末端疎水性膜アンカーを有する（参考文献１２、２３、２４）Ｎ結合グリコシル化（参考文献２２、２５、３５、４７、６７）膜貫通タンパク質である。インビトロでの発現実験は、Ｅ１及びＥ２タンパク質が非共有結合へテロ二量体を形成することを示し、そのヘテロ二量体はウイルス表面の機能性複合体であると提案されている（参考文献１４、１５、１８、２４）。また、ウイルス侵入の正確な機構については、効率的な培養系が存在しないため不明である。単離一次肝細胞及び細胞系への侵入が、細胞表面受容体ＣＤ８１及びスカベンジャー受容体クラスＢ１型（ＳＲ−Ｂ１）との相互作用を必要とする（参考文献６、７、２０、６３、７１）という報告は増加傾向にあるが、これらの受容体単独ではウイルスの侵入を可能にするためには十分でない。
【０００５】
現在の証拠は、細胞性免疫が急性感染におけるウイルス複製の排除と制御に関して極めて重要であることを示唆する（参考文献３６、７２）。しかし、動物感染や細胞及び受容体結合アッセイなどの感染の代理モデルは、急性及び慢性の両方の感染における抗体の潜在的役割を強調した（参考文献５、２６、２７、４０、５９、６１、６２、６８、７３、７４）。当然ながら、中和抗体は線状エピトープと立体的エピトープの両方を認識する。幅広い中和能力を示す抗体の大部分は、Ｅ２内の立体的エピトープを対象とする（参考文献１、９、３７、３８、４０）。保存された立体的エピトープを認識する抗体の誘導はワクチン設計にとって極めて重要であるが、可変領域は免疫優性であると思われるので（参考文献５９）、これはおそらく困難であることが判明する可能性が高い。１つのそのような免疫優性線状エピトープはＥ２の第一超可変領域内に存在する（ＨＶＲ１）（参考文献７３）。保存されたＨＶＲ１ミモトープの使用は限られた特異性の問題を克服すると提案されたが（参考文献１１、６０、７５）、このアプローチが成功を収めるかどうかはまだ不明である。本発明者らや他の著者は、ＨＶＲ１のすぐ下流の領域が多くのエピトープを含むことを記述した（参考文献１６、２９、３２、５２、５４、６９）。残基４１２〜４２３を含み、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定義される１個のエピトープは、ＣＤ８１と、可溶性Ｅ２、Ｅ１Ｅ２及びウイルス様粒子を含むＥ２の一連の提示との間の相互作用を阻害する（参考文献５２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＡＰ３３はＣＤ８１結合をブロックすることができるが、これが直接中和能力と相関するかどうか、そしてもし相関するとすれば、それが、任意の有望な治療抗体にとっての基本的性質であるＨＣＶの多様な一連の遺伝的変異体を中和するかどうかは不明である。加えて、ＨＶＲ１の下流の他の線状エピトープも、抗体に基づくワクチンの開発において重要であり得るかどうかは不明である。本発明者ら（参考文献６、８）及び他の著者（参考文献７１）は最近、レトロウイルス粒子の感染力がＨＣＶ Ｅ１Ｅ２エンベロープタンパク質によって付与されるレトロウイルス偽粒子（ｐｐ）アッセイを開発した。このアッセイはまた、抗体及び血清の中和能力を測定するためにも使用できる（参考文献５、４４）。本発明者らは本明細書で、ＡＰ３３抗体、及びＡＰ３３エピトープ並びにＨＶＲ１に近接する領域に位置づけられるエピトープを認識するポリクローナル抗血清の交差中和能力を測定するための遺伝子型１から６を表わすＥ１Ｅ２クローンで再構成されたＨＣＶppの使用を述べる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、先に述べたＡＰ３３と称されるモノクローナル抗体がＨＣＶの６個の公知の遺伝子型１〜６の各々に結合して、それらを中和できることを見出した。ＡＰ３３モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約の下にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ，ＣＡＭＲ Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ ＵＫ；寄託日２００６年１月２７日、アクセッション番号０５１２２１０１）への寄託の対象である。従って、ＡＰ３３によって標的されるエピトープはＨＣＶの遺伝子型１〜６の全てと交差反応性であると推論され、ＡＰ３３を抗ＨＣＶリガンドの標的として及び抗ＨＣＶ抗体を惹起するための免疫原として示唆する。
【０００８】
本発明の最初の態様によれば、従って、ＨＣＶの遺伝子型１〜６の各々による感染の予防又は治療のための組成物の製造において、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定義されるＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドのエピトープに結合することができるリガンドの使用が提供される。
【０００９】
これに関連して、「によって定義される」とは、エピトープが、本発明のリガンドとＡＰ３３がそのエピトープへの結合に関して競合することができるように、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって結合されるのと同じエピトープであることを意味する。
【００１０】
好ましくは、リガンドは、配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（式中、Ｘ1〜7は何らかのアミノ酸である）を有するポリペプチドエピトープに結合することができる。
【００１１】
好ましい実施形態では、Ｘ1は、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｐ及びＬからなる群より選択される。
【００１２】
好ましい実施形態では、Ｘ2は、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＦからなる群より選択される。
【００１３】
好ましい実施形態では、Ｘ3は、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｌ及びＡからなる群より選択される。
【００１４】
好ましい実施形態では、Ｘ4は、Ｎ、Ｑ及びＧからなる群より選択される。
【００１５】
好ましい実施形態では、Ｘ5は、Ｓ、Ｋ及びＴからなる群より選択される。
【００１６】
好ましい実施形態では、Ｘ6は、Ｈ、Ｒ及びＱからなる群より選択される。
【００１７】
好ましい実施形態では、Ｘ7は、Ｉ、Ｌ、Ｆ又はＰからなる群より選択される。
【００１８】
好都合には、ポリペプチドエピトープは、ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＩＮＳＮＧＳＷＨＩ、ＳＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＥＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＨＬＡＮＨＱＧＫＷＲＬ、ＰＬＦＮＡＮＧＴＷＱＦ及びＥＬＲＮＬＧＧＴＷＲＰからなる群より選択される。
【００１９】
リガンドは、好ましくは免疫グロブリンである。本明細書で使用する、「免疫グロブリン」という用語は、以下で述べる免疫グロブリンスーパーファミリーの構成物を含む。好ましくは、免疫グロブリンは抗体である。「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）分子などの抗体フラグメントを含む。
【００２０】
好ましくは、免疫グロブリンは図８に示すような、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１以上のＣＤＲを含む。ＣＤＲは、好都合には、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列からの１、２又は３個のアミノ酸付加、置換又は欠失を有する配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在するとき（ａ）に示す配列と構造的に類似する配列
からなる群より選択される。
【００２１】
構造的な類似性とは、この場合、免疫グロブリンループ内の生じるポリペプチド鎖の主鎖立体配座の類似性を指す。好ましくは、構造的に類似する配列は、ＡＰ３３の主鎖立体配座から０．２オングストロームである、好都合にはＡＰ３３の主鎖立体配座から０．１オングストローム内である主鎖立体配座を有する。
【００２２】
好ましくは、本発明は、ＨＣＶによる脊椎動物細胞の感染の予防のために有用である。本発明の免疫グロブリンはＨＣＶの遺伝子型１〜６の各々の例を中和することができるので、本発明は全てのＨＣＶ感染に広く適用し得る。好都合には、免疫グロブリンは全てのＨＣＶ遺伝子型に対して有効であるので、本発明は、リガンドの投与前に除くべきＨＣＶ遺伝子型についての試験を可能にする。
【００２３】
さらなる態様では、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定義されるＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドのエピトープに結合するリガンドの有効量を投与することを含む、ＨＣＶの遺伝子型１〜６の２以上による感染の予防又は治療のための方法が提供される。
【００２４】
なおさらなる態様では、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンの有効量を投与することを含む、ＨＣＶの遺伝子型１〜６の２以上による感染の予防又は治療のための方法が提供される。
【００２５】
本発明の方法は、本発明の使用に関して上述したような特徴を含み得る。
【００２６】
本発明はさらに、ＨＣＶの遺伝子型１〜６の２以上に属するＨＣＶ単離物を中和する免疫グロブリン分子を提供し、前記免疫グロブリン分子は、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１以上のＣＤＲを含み、モノクローナル抗体ＡＰ３３以外の免疫グロブリンである。
【００２７】
好都合には、前記１以上のＣＤＲは、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列からの１、２又は３個のアミノ酸付加、置換又は欠失を有する配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在するとき（ａ）に示す配列と構造的に類似する配列からなる群より選択される。
【００２８】
好ましい実施形態では、免疫グロブリンは、配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（Ｘ1〜7は何らかのアミノ酸である）を有するポリペプチドエピトープに結合することができ、前記免疫グロブリンは、モノクローナル抗体ＡＰ３３以外である。
【００２９】
好ましくは、免疫グロブリンは１以上のヒトフレームワーク領域を含む。好都合には、免疫グロブリンは１以上のヒトＣＤＲを含む。抗体のヒト化及び脱免疫のための方法は当分野において公知であり、ヒトにおける抗体の免疫原性を低減又は排除しながらマウス抗体の特異性を維持して、フレームワーク及び／又はＣＤＲ配列をヒト配列で置換することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
異なる定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、当業者（例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学、抗体工学及び生化学における当業者）によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明は、異なる指示がない限り、当業者の能力の範囲内である従来の手法を用いる。そのような手法は文献の中で説明されている。例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ参照。これらの一般的テキストの各々が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
（Ａ．リガンド）
本発明に従ったリガンドは、ポリペプチドエピトープに結合することができる何らかの分子であり得る。例えばリガンドは、タンパク質又は核酸アプタマー、又は免疫グロブリンであり得る。免疫グロブリン分子は、本発明によれば、２つのβシート及び、通常は、保存されたジスルフィド結合を含む、抗体分子の特徴である免疫グロブリンの折りたたみを含むポリペプチドのファミリーである免疫グロブリンスーパーファミリーを指す。免疫グロブリンスーパーファミリーは、免疫系における幅広い役割（例えば抗体、Ｔ細胞受容体分子等）、細胞接着への関与（例えばＩＣＡＭ分子）及び細胞内シグナル伝達（例えばＰＤＧＦ受容体などの受容体分子）を含む、インビボでの細胞及び非細胞相互作用の多くの態様に関与する。本発明は、標的分子に結合することができる全ての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用できる。好ましくは、本発明は抗体に関する。好ましくは、本発明に従ったリガンドは、本明細書で述べるＨＣＶpp中和アッセイによって判定したとき、ＨＣＶ遺伝子型１〜６の各々を代表するＨＣＶ試料を３５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ50で中和する。
【００３２】
ＡＰ３３のような従来の抗体は、少なくとも４本のポリペプチド鎖を含む大きな多サブユニットタンパク質分子である。例えばヒトＩｇＧは、機能的抗体を形成するためにジスルフィド結合されている２本の「重」鎖と２本の「軽」鎖を有する。各々の重及び軽鎖自体は、「定常」（Ｃ）及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は、抗体の抗原結合特異性を決定し、一方Ｃ領域は、構造的支持と免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用における機能を提供する。
【００３３】
抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの抗原結合特異性は、特定抗原に結合する抗体又はそのフラグメントの能力を表わす。抗体の抗原結合特異性はＶ領域の構造特徴によって決定される。各々のＶ領域は、典型的には３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」、その各々が「超可変ループ」を含む）及び４つのフレームワーク領域を含む。従って、特定所望抗原に実質的な親和性で結合するために必要な最小構造単位である抗体結合部位は、典型的には３個のＣＤＲ、及びＣＤＲを適切な立体配座に保持し、提示するためにそれらの間に組み入れられる少なくとも３、好ましくは４個のフレームワーク領域を含む。
【００３４】
本明細書で使用する、抗体は、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2、ｄＡｂ、キメラ、ＣＤＲ移植及びヒト化抗体を含む改変抗体、及びファージディスプレイ又は選択的手法を用いて作製される人為的に選択される抗体を含む、完全抗体又は選択標的に結合することができる抗体フラグメントを指す。ｄＡｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖなどの低分子フラグメントは、それらの小さなサイズ及びその結果として生じる優れた組織分布の故に、診断及び治療適用のための有利な特性を有する。好ましくは、抗体は一本鎖抗体又はｓｃＦｖである。
【００３５】
一般に抗体は、少なくとも３個の認識可能なＣＤＲ又は超可変ループ及び少なくとも３、好ましくは４個の認識可能なフレームワーク領域を含み、いかなる場合もＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合する能力を保持しなければならない。典型的には、必ずではないが、ポリペプチドはまた、軽鎖定常領域及び／又は重鎖定常領域、好ましくは両方を含む。ポリペプチドの好ましい特徴は、典型的には、本質的に本発明の最初の態様のポリヌクレオチド分子によってコードされるポリペプチドに関して上述したとおりである。
【００３６】
１つの特定実施形態では、ポリペプチドは、１以上の超可変ループ又は図８に示すものと実質的に又は完全に同一のアミノ酸残基配列を有するＣＤＲを含み得るが、ヒト免疫グロブリンのものに対応するように変化した１以上のフレームワーク領域を含み得る。ポリペプチドのアミノ酸配列が「ヒトフレームワーク領域」と「マウス」又は「外来性」ＣＤＲの理論的理想と異なる場合、そのような逸脱は、好ましくは保存的置換を含む。保存的置換は、１個のアミノ酸残基によるもう１つ別の残基の置換であり、両方の残基は同じ機能的グループ（Ｆｉｇｓ．２．８−２．１５ ｏｆ 「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，２nd ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏに定義されている）内の側鎖を有する。
【００３７】
結合活性を有する非免疫グロブリンポリペプチドを含むポリペプチドは、例えばランダムなポリペプチド構造の組換え体ライブラリーから開発され得る。ファージディスプレイ、ＳＥＬＥＸ、ｍＲＮＡディスプレイ又は表面プラズモン共鳴、続いて、必要に応じて突然変異と選択の反復による結合特異性及び親和性の改善などの手法による、所望標的に対して結合親和性を有するポリペプチドの選択は、当業者に公知の手法である。
【００３８】
例えばｍＲＮＡ選択による結合ポリペプチドの選択は、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３７５０−３７５５によって記述されている。Ｓｒｅｂａｌｕｓ ａｎｄ Ｃｌｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３７５０−３７５５は、ポリペプチドのライブラリーの標的分子への結合を特性付けるためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの使用を述べている。ファージディスプレイの使用は、Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２０００ Ｓｅｐ ３０；４３（２−３）：１６５−９６及びＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９６ Ｏｃｔ；６（２）：１５５−６２によって総説されている。核酸アプタマーの使用は、Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００ Ｆｅｂ ４；２８７（５４５４）：８２０−５によって総説されている。ＳＥＬＥＸは、標的分子への高度特異的結合を有する核酸分子をインビトロで発生させるための方法である。それは、例えば米国特許第５６５４１５１号明細書、同第５５０３９７８号明細書、同第５５６７５８８号明細書及び同第５２７０１６３号明細書、並びに国際公開第ＷＯ９６／３８５７９号パンフレットに述べられている。
【００３９】
ファージディスプレイやＳＥＬＥＸなどの反復選択手順は、多数の可能な配列及び構造を含むライブラリー内に、所与の標的に対する広範囲の結合親和性が存在するという原理に基づく。例えば２０サブユニットのランダム化ポリペプチド又は核酸ポリマーを含むライブラリーは、４20の構造可能性を有し得る。標的に対してより高い親和定数を有するものが、最も結合の可能性が高いとみなされる。分配、分離及び増幅の工程は、より高い結合親和性候補に富む第二の核酸ライブラリーを作成する。さらなる回数の選択は、生じるライブラリーが主として１個だけ又は数個の配列で構成されるまで、漸進的に最良のリガンドを支持する。次にこれらをクローニングし、配列決定して、純粋なリガンドとしての結合親和性に関して個々に試験することができる。
【００４０】
所望の目標が達成されるまで選択と突然変異／増幅のサイクルを反復する。最も一般的な場合、サイクルの反復後に結合強度の有意の改善が達成されなくなるまで選択／増幅を続ける。選択／増幅反復法は、少なくとも１０14個の配列を含むライブラリーにおいて１個の配列変異体の単離を可能にするのに十分な感受性がある。本方法は、原則として、約１０18の異なる核酸種と同数をサンプリングするために使用できる。ライブラリーは、好ましくはランダム化配列部分並びに効率的な増幅のために必要な保存配列を含む。配列変異体は、ランダム化核酸配列の合成及びランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含む多くの方法で生産できる。可変配列部分は、完全に又は部分的にランダムな配列を含み得る。それはまた、ランダム化配列と共に組み込まれた保存配列の小部分を含み得る。試験核酸における配列変異は、選択／増幅反復の前又はその間の突然変異誘発によって及び特異的修飾によって導入又は増加させ得る。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の手法を用いて形質転換細胞から又はトランスジェニック生物から作製し得る。典型的なプロトコールを例示のために以下で述べる。
【００４２】
（（ａ）ＣＯＳ−７細胞における抗体の一過性発現）
ＤＮＡは、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン及びリン酸カルシウム沈殿法などの多くの手段によってＣＯＳ−７細胞に導入することができる。
【００４３】
電気穿孔法に関しては、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ（１９９１ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４，７７３−７８３）の方法が使用できる。重及び軽鎖発現ベクターのコトランスフェクションのために、各々のベクター１０μｇを使用する。両方の抗体鎖を発現する１個のベクターに関して１３μｇを使用する。ＤＮＡを、ＰＢＳ中１×１０7細胞／ｍｌの０．７ｍｌアリコートに添加し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）装置を用いて１９００Ｖ、２５μＦ静電容量でパルスする。対照として、非特異的抗体を発現するベクター１３μｇもＣＯＳ−７にトランスフェクトする。ＤＮＡの非存在下で電気穿孔したＣＯＳ−７細胞を陰性対照として含める。室温で１０分間の回復後、電気穿孔した細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ ８ｍｌに添加し、５％ＣＯ2中３７℃で７２時間インキュベートする。７２時間のインキュベーション後、培地を収集し、細胞デブリを除去するために遠心して、分析のために保存する。
【００４４】
若しくは、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法が使用できる。本方法は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）に述べられている。ＣＯＳ−７細胞を、１×１０6細胞／１００ｍｍディッシュでＤＭＥＭ（ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に接種する。２日目に、プラスミドＤＮＡをエタノール沈殿させ、滅菌ＴＥ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に２０μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁する。ＤＮＡ １５０μｌを、滅菌ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．４ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、２５ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ2及び０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）３００μｌ及び滅菌ＤＥＡＥデキストラン（ＳＩＧＭＡ、ＴＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）３００μｌと混合する。増殖培地を吸引し、細胞単層をＰＢＳで１回及びＴＢＳで１回洗う。７５０μｌのＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／ＴＢＳ混合物を単層に添加する。ディッシュを、５分ごとに揺り動かしながら層流フード内で周囲温度にて１時間インキュベートする。１時間のインキュベーション後、ＤＮＡ溶液を吸引し、細胞をＴＢＳで１回及びその後ＰＢＳで１回洗う。細胞を、１００μＭのクロロキン（ＳＩＧＭＡ）を添加した完全培地中で３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートする。４時間後、培地を完全培地と交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートする。トランスフェクションの４８時間後、細胞に、血清を含まないＤＭＥＭ増殖培地を供給する。２４時間後、培地を採集し、卓上臨床遠心分離機において１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞デブリを除去する。
【００４５】
（（ｂ）ＣＨＯ細胞における本発明の抗体の安定な発現）
この手順のための典型的なプロトコールは以下の通りである。
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ ＤＵＸＢ−１１、Ｕｒｌａｕｂ ＆ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，４２１６−４２２０）をトリプシン処理し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗う。ＤＮＡ（１３μｇの重及び軽免疫グロブリン鎖についての遺伝子を含むプラスミド）及びＰＢＳ中１×１０7細胞／ｍｌの０．８ｍｌアリコートを滅菌Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）キュベット（０．４ｃｍギャップ）に入れる。パルスを１９００ボルト、２５μＦ静電容量で送達する。室温で１０分間の回復期間後、電気穿孔した細胞を２０ｍｌのα−ＭＥＭ（プラスリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド）／１０％ＦＢＳに添加する。２４〜４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、α−ＭＥＭ（マイナスリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド）／１０％透析ＦＢＳ中、１００ｍｍディッシュにプレートする（ｄｈｆｒ含有プラスミドの発現に関して選択するため）。コロニーが出現するまで培地を３〜４日ごとに交換する。クローニングシリンダーによって単一クローンを単離し、増殖させて、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ産生に関して分析する。次に、漸増量のＩｇＧを発現するクローンを選択するために、単一クローンを連続的に漸増濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）（１０9Ｍ-1 ＭＴＸから出発する）に供する。コロニーが出現するまで培地を３〜４日ごとに交換する。クローニングシリンダーによって単一クローンを単離し、増殖させて、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ産生に関して分析する。
【００４６】
（（ｃ）抗体フラグメントの酵素的生産）
抗原結合抗体フラグメントは、無処置免疫グロブリンの酵素的又は化学的分離によって生産することができる。フラグメントはまた、組換えＤＮＡ手法（例えばＫｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８１，３１７−３２３；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，１６３−１６７）によっても生産できる。選択フラグメントをコードする核酸のセグメントは、適切な制限酵素による完全長コード配列の消化によって、又は新規合成によって生産される。
【００４７】
例えばＦ（ａｂ’）2フラグメントは、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）に述べられているような標準方法を用いてｐＨ３．０−３．５でのペプシンによるタンパク質分解消化によってＩｇＧ分子から入手できる。
【００４８】
Ｆａｂフラグメントは、限定還元によってＦ（ａｂ’）2フラグメントから、又は還元剤の存在下にパパインでの消化によって完全抗体から入手し得る。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、当業者に明白な多くの方法で特徴づけし得る。これらは、ＥＬＩＳＡなどの手法による濃度の物理的測定及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗体純度の物理的測定を含む。加えて、ポリペプチドの有効性は、溶液中で、又はＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（例えばＢＩＡコア）又は免疫蛍光アッセイなどの固相系においてＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質への分子の結合を検出することによって測定できる。より詳細には、本明細書で述べるようなＨＣＶpp中和アッセイにおいて６つの公知の遺伝子型を代表するＨＣＶ試料に対してポリペプチドの中和能力を試験することができる。
【００５０】
本発明のポリペプチドは非アミノ酸部分を含み得る。例えばポリペプチドはグリコシル化され得る。そのようなグリコシル化は、宿主細胞又は宿主生物におけるポリペプチドの発現の間に自然に起こり得るか、又は人為的介入から生じる意図的な修飾であり得る。付加的に又は選択的に、本発明のポリペプチドは他の化学修飾に供し得る。１つのそのような望ましい修飾は、１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加である。ペグ化は、インビボで様々な抗体フラグメントの半減期を有意に上昇させることが示された（Ｃｈａｐｍａｎ ２００２ Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５４，５３１−５４５によって総説された）。しかし、抗体フラグメントのランダムなペグ化は、抗原に対するフラグメントの結合親和性に極めて有害な作用を及ぼし得る。これを避けるため、ペグ化は抗体又は抗体フラグメントの特定の標的残基に限定することが望ましい （Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ，２００４ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５，４０９−４１８及び上記で引用した、Ｃｈａｐｍａｎ参照）。
【００５１】
（Ｂ．抗体作製）
本発明に従った抗体は、例えばそれらが天然に生じる抗体の一時配列とは異なる一次配列を有するように、好都合に作製される抗体である。特に、ＡＰ３３抗体は、好ましくは修飾される。
【００５２】
天然のＡＰ３３配列を有さない、本発明に従った抗体は、ＡＰ３３のフラグメント、アミノ酸配列における１以上の付加、置換又は欠失、標識又はエフェクター基の付加等を含む修飾ＡＰ３３であり得る。好都合には、抗体は、ヒト被験者における免疫原性をより低くするためにヒト化又は脱免疫されている。
【００５３】
本発明において有用な抗体は、新規生成し得るか又はＡＰ３３を操作することによって生産し得る。
【００５４】
（Ｂ（ｉ）新規抗体生成）
抗体は、本明細書で述べるペプチド免疫原を使用した動物又はヒトの免疫によって生成し得る。抗体は、免疫動物の血清から入手し得るか又は細胞培養において生産し得る。組換えＤＮＡテクノロジーは、細菌又は好ましくは哺乳動物細胞培養において、確立された手順に従って抗体を生産するために使用し得る。選択細胞培養系は、好ましくは抗体産物を分泌する。
【００５５】
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的方法は周知である。非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス、ウサギ、ウマモノクローナル抗体の作製は周知であり、例えばＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質又はそのフラグメントを含む製剤で動物を免疫することによって実施できる。免疫動物から得られる抗体産生細胞を不死化し、スクリーニングするか、又は最初にＥ２に結合する抗体の産生に関してスクリーニングし、その後不死化する。（上記で引用した、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ参照）。
【００５６】
不死化抗体産生細胞系は、細胞融合によって、及びまた、腫瘍形成性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換又はエプスタイン−バーウイルスによるトランスフェクションなどの他の手法によって樹立できる。ＨＣＶ Ｅ２エピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは、様々な性質に関して、例えばアイソタイプ及びエピトープ親和性に関してスクリーニングすることができる。
【００５７】
ＨＣＶ Ｅ２含有ポリペプチドはまた、ヒトモノクローナル抗体を選択するためにも使用できる。例えば、ＡＰ３３などの特定マウス抗体と同じエピトープ特異性を有する一部のヒト抗体は、競合結合実験によって選択し得る。そのような抗体は、ＡＰ３３に関して明らかにされた有用なＨＣＶ中和特性を共有する可能性が特に高い。ＨＣＶ Ｅ２に対するヒト抗体は、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって作製できる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，１２７５−１２８１参照）。ＨＣＶ Ｅ２又はそのフラグメントに結合する抗体を選択する。次に、そのような抗体（又は結合フラグメント）をコードする配列を、クローニングして増幅し得る。このプロトコールは、ファージディスプレイテクノロジーとの組合せによって改善される（例えば国際公開第９１／１７２７１号パンフレット及び国際公開第９２／０１０４７号パンフレット）。
【００５８】
インビトロでのハイブリドーマ細胞又は哺乳動物宿主細胞の増殖は、慣例的な標準培地である適切な培地、例えば、場合により哺乳動物血清、例えばウシ胎仔血清、又は微量元素及び増殖維持サプリメント、例えば正常マウス腹膜滲出物細胞などの支持細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＲＰＭＩ １６４０培地において実施される。細菌細胞又は酵母細胞である宿主細胞の増殖は、同様に、当分野において公知の適切な培地、例えば細菌に関してはＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、テリフィックブロス、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴ又はＭ９最小培地、及び酵母に関しては培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地又は完全最小ドロップアウト培地において実施される。
【００５９】
インビトロ生産は比較的純粋な抗体製剤を提供し、所与の大量の所望抗体を与えるためのスケールアップを可能にする。細菌細胞、酵母又は哺乳動物細胞培養のための手法は当分野において公知であり、例えばエアリフト反応器又は連続攪拌反応器における均一懸濁培養、又は例えば中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ又はセラミックカートリッジ上での固定化又はエントラップ細胞培養を含む。
【００６０】
大量の所望抗体はまた、哺乳動物細胞をインビボで増殖させることによって入手できる。このために、所望抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、抗体産生腫瘍の増殖を生じさせる組織適合性哺乳動物に注入する。場合により、注入の前に動物を炭化水素で、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などの鉱物油でプライミングする。１〜３週間後、抗体をそれらの動物の体液から単離する。例えばＢａｌｂ／ｃマウスからの抗体産生脾臓細胞と適切な骨髄腫細胞の融合によって得られるハイブリドーマ細胞、又は所望抗体を産生するハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクト細胞を、場合によりプリスタンで前処置したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、１〜２週間後に、動物から腹水を採取する。
【００６１】
前記や他の手法は、例えば参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒの中で論じられている。組換え抗体分子の調製のための手法は、上記参考文献及びまた、例えば参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第０６２３６７９号明細書；欧州特許第０３６８６８４号明細書及び欧州特許第０４３６５９７号明細書に述べられている。
【００６２】
細胞培養上清は、優先的に所望標的を発現する細胞の免疫蛍光染色によって、免疫ブロット法によって、酵素免疫測定法、例えばサンドイッチアッセイ又はドットアッセイ、又は放射免疫測定法によって、所望抗体に関してスクリーニングされる。
【００６３】
抗体の単離のために、培養上清中又は腹水中の免疫グロブリンを、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性材料に対する透析、選択膜を通してのろ過等によって、濃縮し得る。必要に応じて及び／又は所望する場合は、慣例的なクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー及び／又は（免疫）アフィニティークロマトグラフィー、例えば標的分子又はプロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体を精製する。
【００６４】
前記手順に従って生成された抗体は、標準手順に従って、細胞からの核酸の単離によってクローニングし得る。有用には、抗体の核酸可変ドメインを単離し、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメントを構築するために使用し得る。
【００６５】
何らかの所望ポリペプチドに特異的な完全ヒト抗体も、ライブラリーからの選択によって又はヒト抗体遺伝子レパートリーを担持するトランスジェニックマウスにおいて作製し得る。
【００６６】
ライブラリーからの抗体の選択のための様々な手法が記述されており、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１１０５−１１１６によって総説されている。簡単に述べると、抗体ライブラリー選択のために使用可能な方法は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ及び微生物細胞ディスプレイを含む。
【００６７】
いかなるライブラリー選択システムも本発明と共に使用し得る。大きなライブラリーの所望数を単離するための選択プロトコールは、ファージディスプレイ手法に代表されるように、当分野において公知である。様々なペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面に提示されるそのようなシステムは（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９０、上記）、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのインビトロ選択と増幅のための抗体フラグメント（及びそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作成するために有用であることが明らかになった。ＶH及びＶL領域をコードするヌクレオチド配列を、それらを大腸菌の細胞周辺腔へと差し向けるリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結し、その結果として生じる抗体フラグメントは、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質（例えばｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩ）への融合物として、バクテリオファージの表面に提示される。あるいは、抗体フラグメントは、λファージキャプシド（ファージ体）の外側に提示される。ファージに基づく提示システムの利点は、それらが生物系であるので、選択されるライブラリー構成物が、単に選択ライブラリー構成物を含むファージを細菌細胞において増殖させることによって増幅できることである。さらに、ポリペプチドライブラリー構成物をコードするヌクレオチド配列はファージ又はファージミドベクターに含まれるので、配列決定、発現及びその後の遺伝子操作が比較的容易である。
【００６８】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリー及びλファージ発現ライブラリーの構築のための方法は当分野において周知である（参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ （１９９０）上記；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：４１３３；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｇｅｎｅ，１０４：１４７；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）上記；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）上記；Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２：８６７；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７；Ｌｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３１３）。
【００６９】
１つの特に有利なアプローチは、ｓｃＦｖファージライブラリーの使用であった（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）上記；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）上記；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ（１９９１）上記；Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：８０；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）上記）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されるｓｃＦｖライブラリーの様々な実施形態が記述されている。ファージディスプレイアプローチの洗練も公知であり、例えば参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第９６／０６２１３号パンフレット及び国際公開第９２／０１０４７号パンフレット（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｅｔ ａｌ．）及び国際公開第９７／０８３２０号パンフレット（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，上記）に述べられている。
【００７０】
ファージディスプレイ法では、それらの外側表面に種々の抗体又はフラグメントを提示するファージのライブラリーを作成する。抗体は通常、ｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメントとして提示される。所望特異性を有する抗体を提示するファージを、ＨＣＶ Ｅ２ポリペプチド又はそのフラグメントへの親和性の強化によって選択する。
【００７１】
ファージディスプレイ法の変法では、ＡＰ３３などの選択マウスＭＡｂの結合特異性を有するヒト抗体を作製することができる（国際公開第９２／２０７９１号パンフレット参照）。この手法では、選択マウス抗体（例えばＡＰ３３）の重又は軽鎖可変領域を出発物質として使用する。例えば軽鎖可変領域を出発物質として選択する場合、同じ軽鎖可変領域（すなわちマウス出発物質）及び異なる重鎖可変領域を提示するファージライブラリーを構築する。重鎖可変領域は再構成されたヒト重鎖可変領域のライブラリーから得られる。ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質に対して強い特異的結合（例えば少なくとも１０8、好ましくは少なくとも１０9Ｍ-1）を示すファージを選択する。その後、このファージからのヒト重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリーを構築するための出発物質として役立つ。このライブラリーでは、各々のファージは、同じ重鎖可変領域（すなわち最初のディスプレイライブラリーから特定された領域）及び異なる軽鎖可変領域を提示する。軽鎖可変領域は、再構成されたヒト軽鎖可変領域のライブラリーから得られる。再び、ＨＣＶ Ｅ２に対して強い特異的結合を示すファージを選択する。これらのファージは、完全なヒトＨＣＶ Ｅ２抗体の可変領域を提示する。これらの抗体は通常、マウス出発物質と同じ又は類似のエピトープ特異性を有する。この変異体として、選択は、付加的に又は選択的に、ＨＣＶの６つの遺伝子型全てを中和する能力に基づき得る。
【００７２】
本発明のＨＣＶ Ｅ２結合ポリペプチドはまた、トランスジェニックヤギ、マウス又は植物系などのトランスジェニック生物によって発現され、それらから精製され得る。植物における組換え抗体の生産は、Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，（２００５ Ｖａｃｃｉｎｅ ２３，１７６４−１７６９ ａｎｄ ２００３ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０，４３３−４４５）によって総説された。抗体又は抗体フラグメントの発現に関して成功裏に使用された植物は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、シロイヌナズナ）Ｄｅ Ｗｉｌｄｅ ｅｔ ａｌ，１９９８ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，６３９−６４６）及びタバコ（Ｖａｌｄｅｓ ｅｔ ａｌ，２００３ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３０８，９４−１００）を含む。
【００７３】
ひとたび発現されると、本発明の完全抗体又は抗体フラグメントは、硫酸アンモニウム沈殿法、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当分野の標準手法に従って精製できる（一般にＳｃｏｐｉｅｓ ＆ Ｓｔｏｔｅｒ，１９８２ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９０ Ｐａｒｔ Ｅ，４７９−４９０参照）。医薬用途のためには、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％又はそれ以上の均一性の免疫グロブリンが最も好ましい。
【００７４】
選択的なライブラリー選択テクノロジーは、どちらも先に述べられているように（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５；Ｃａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：８０９５；Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：２４３２）、バクテリオファージプラークとして又は溶原菌のコロニーとして直接スクリーニングでき、本発明において有用である、バクテリオファージλ発現系を含む。そのような発現系は、ライブラリーの１０6までの異なる構成物をスクリーニングするために使用できるが、それらはより大きな数（１０6以上）のスクリーニングには実際上適さない。他のスクリーニングシステムは、例えばライブラリー構成物の直接化学合成に基づく。初期の１つの方法は、国際公開第８４／０３５６４号パンフレットに述べられているような、一組のピン又はロッド上でのペプチドの合成を含む。各々のビーズが個々のライブラリー構成物であるペプチドライブラリーを形成するビーズ上でのペプチド合成を含む同様の方法が、米国特許第４，６３１，２１１号明細書に述べられており、関連方法が国際公開第９２／０００９１号パンフレットに述べられている。ビーズに基づく方法の有意の改善は、各々のライブラリー構成物のアミノ酸配列の同定を容易にするために、オリゴヌクレオチドなどの独自の同定タグで各々のビーズを標識することを含む。これらの改善されたビーズベースの方法は国際公開第９３／０６１２１号パンフレットに述べられている。
【００７５】
もう１つの化学合成法は、各々の異なるライブラリー構成物（例えばユニークペプチド配列）をアレイ内の離れた、所定の位置に置く方法による表面上でのペプチド（又はペプチドミメティック）のアレイの合成を含む。各ライブラリー構成物の同一性をアレイ内のその空間位置によって決定する。所定の分子（例えば受容体）と反応性ライブラリー構成物との間で結合相互作用が起こるアレイ内の位置を決定し、それによって空間位置に基づき反応性ライブラリー構成物の配列を同定する。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号明細書；国際公開第９０／１５０７０号明細書及び国際公開第９２／１００９２号明細書；Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７；Ｄｏｗｅｒ ａｎｄ Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２６：２７１に述べられている。
【００７６】
ポリペプチド又はヌクレオチドのライブラリーを作成するための他のシステムは、ライブラリー構成物のインビトロ合成のための無細胞酵素機構の使用を含む。１つの方法では、標的リガンドに対する選択とＰＣＲ増幅を交互に実施することによってＲＮＡ分子を選択する（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ （１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８）。同様の手法は、所定のヒト転写因子に結合するＤＮＡ配列を同定するために使用し得る（Ｔｈｉｅｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｃｈ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３２０３；Ｂｅａｕｄｒｙ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５；国際公開第９２／０５２５８号パンフレット及び国際公開第９２／１４８４３号パンフレット）。同様に、インビトロ翻訳は、大きなライブラリーを作成するための方法としてポリペプチドを合成するために使用できる。一般に安定化ポリソーム複合体を含むこれらの方法は、さらに、国際公開第８８／０８４５３号パンフレット、国際公開第９０／０５７８５号パンフレット、国際公開第９０／０７００３号パンフレット、国際公開第９１／０２０７６号パンフレット、国際公開第９１／０５０５８号パンフレット及び国際公開第９２／０２５３６号パンフレットに述べられている。国際公開第９５／２２６２５号パンフレット及び国際公開第９５／１１９２２号パンフレット（Ａｆｆｙｍａｘ）に述べられているような、ファージに基づかない選択的ディスプレイシステムは、選択のためのポリペプチドを提示するためにポリソームを使用する。これら及び全ての前記資料も、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
ファージ又は他のクローン化ライブラリーの使用に代わるのは、選択標的で免疫した動物の脾臓に由来する核酸、好ましくはＲＮＡを使用することである。このようにして得られたＲＮＡは、免疫グロブリンの天然のライブラリーを表す。Ｖ領域及びＣ領域のｍＲＮＡの単離は、Ｆａｂ又はＦｖなどの抗体フラグメントが本発明に従って細胞内で発現されることを可能にする。
【００７８】
簡単に述べると、ＲＮＡを免疫動物の脾臓から単離し、ＰＣＲプライマーを使用してＲＮＡプールからＶH及びＶL ｃＤＮＡを選択的に増幅する。このようにして得られたＶH及びＶL配列を、ｓｃＦｖ抗体を作製するために連結する。ＰＣＲプライマー配列は、公開されているＶH及びＶL配列に基づいており、キットの形態で市販されている。
【００７９】
全ての選択及びディスプレイシステムと組み合わせて、本発明は、所望結合活性の単離のためにＡＰ３３によって結合されるエピトープを形成することが同定されたペプチドを提供する。そのようなペプチドを本明細書でより詳細に説明する。
【００８０】
（Ｂ（ｉｉ）ＡＰ３３の作製）
ＡＰ３３又はＡＰ３３のエピトープ特異性を共有する他の抗体は、免疫原性を低減する及び／又は結合特性を改善するように操作し得る。
【００８１】
抗体を操作するためのいくつかの手法が当分野において公知である。一般に、ＣＤＲを供与側（非ヒト）抗体から受容側（ヒト）抗体のフレームワークに移入することによって抗体の免疫原性が低下する。この手順は、ＣＤＲ移植又はヒト化として知られる。この手順の難点は、供与側と受容側のフレームワークの相違の結果として、結合活性が失われ得ることである。さらに、ＣＤＲ自体によって一定量の免疫原性が保持され得る。薄板化、再表面作成、ＳＤＲ移入及び脱免疫化を含む、様々な補足的及び選択的手法が、これらの問題に対処するために提案されてきた。
【００８２】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドはＣＤＲ移植分子をコードする。ＣＤＲ移植分子は、図８に示すＡＰ３３の軽又は重鎖のＣＤＲ配列と実質的に又は完全に同一のアミノ酸配列を有する軽及び／又は重鎖ＣＤＲ、及び図８に示すＡＰ３３のフレームワーク領域配列と実質的に同一でないフレームワーク領域を含むものである。本発明に関して、ＣＤＲは、各々のＣＤＲ配列が図８に示す対応ＣＤＲの配列と１又は２アミノ酸残基だけ、好ましくは１アミノ酸残基だけ異なる（すなわち好ましくは図８に示すＡＰ３３のＣＤＲ配列と比較して各々のＣＤＲ内に１個だけのアミノ酸残基置換）場合、ＡＰ３３のＣＤＲと「実質的に同一」とみなす。好ましくは、ＣＤＲ移植分子のＣＤＲ配列は、図８に示すＡＰ３３のＣＤＲ配列と完全に同一である。
【００８３】
特に好ましい種類のＣＤＲ移植分子は、図８に示すＡＰ３３のものと実質的に又は完全に同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むが、ヒトフレームワーク領域配列を含む抗体又は抗原結合フラグメントである。そのような分子は「ヒト化」と称され得る。ヒト抗体のものとより密接に類似する（又はさらには同一である）ために、ＡＰ３３のものと比較して変化したフレームワーク領域の使用は、生じるポリペプチドのヒト被験者における免疫原性を大きく低下させるはずである（ＡＰ３３と比較して）。「ヒトフレームワーク領域配列」は、ヒト抗体のものと同一であるか又は有意ではない量だけ（例えばフレームワーク領域につき７アミノ酸残基以下、好ましくはフレームワーク領域につき４残基以下、より好ましくはフレームワーク領域につき３残基以下、最も好ましくはフレームワーク領域につき２残基以下）ヒト抗体のものと異なる配列である。好都合には、コードされるポリペプチドは、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによってコードされるものと同一のフレームワーク領域を含む。
【００８４】
一般論として、「ＣＤＲ移植」は、ヒトフレームワーク領域と組み合わせて非ヒト起源（マウス又は他の非ヒト哺乳動物など）からのＣＤＲをコードするポリヌクレオチドの形成を含む。定常領域も、存在する場合には、好ましくはヒト起源である。
【００８５】
慣例的に「供与抗体」及び「受容抗体」という用語が使用される。非ヒト供与抗体からのＣＤＲがヒト受容抗体のフレームワークに移植される。ＣＤＲ移植の手法は当業者に周知である。その手順は、最初にＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，（１９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５２５）及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，（１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−３２７）によって記述され、非ヒト起源のＣＤＲのヒトフレームワークへの移植だけを含んだ。
【００８６】
この手法は、ＣＤＲの外側の、一定のフレームワーク残基の変化を移植抗体内に付加的に移入することを必要とし得る（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−３２７）。従って、本明細書では「ＣＤＲ移植」という用語は、単にＣＤＲ残基の異なるフレームワークへの移入を意味すると解釈されるべきではないが、生じる分子にＣＤＲが由来する抗体の抗原結合特性を付与するための実質的な必要に応じて、そのようなフレームワーク残基の付加的な移入も包含する。「ＣＤＲ移植分子」という用語は、それに準じて、ＣＤＲに加えて一定のフレームワーク残基も同時に「移植される」ポリペプチドを包含すると解釈されるべきである。
【００８７】
抗体のヒト化は、例えば欧州特許第４６０１６７号明細書、欧州特許第６８２０４０号明細書、米国特許第５５３０１０１号明細書、同第５５８５０８９号明細書、同第５６９３７６１号明細書、同第５６９３７６２号明細書、同第５７６６８８６号明細書、同第５８２１３３７号明細書、同第５８５９２０５号明細書、同第５８８６１５２号明細書、同第５８８７２９３号明細書、同第５９５５３５８号明細書、同第６０５４２９７号明細書及び同第６１８０３７０号明細書に述べられている。これらの方法は全て、抗原結合特異性を付与する役割を担うアミノ酸残基がヒト抗体可変領域のフレームワーク領域内に組み込まれるように、抗体の可変領域を再設計することを含む。
【００８８】
一部の場合には、非ヒト抗体の免疫原性部分をヒト抗体からの残基によって置換する（例えば米国特許第５７１２１２０号号明細書）。あるいは非ヒト可変ドメインを「再表面作成する」ために、抗体可変ドメインの表面の残基をヒト抗体からの残基によって置換することができる（例えば米国特許第５６３９６４１号号明細書）。再表面作成はＰａｄｌａｎ（１９９１，欧州特許第０５１９５９６号明細書）によって示唆されたもので、「薄板化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」とも称される。この手法では、第一（供与側の等価物−ＣＤＲのソース）抗体の溶媒接触残基を第二（「受容」）抗体からの残基によって置換する。典型的には、第二抗体はヒト抗体である。溶媒非接触残基、ＣＤＲ、ドメイン間の接触残基、及びＣＤＲに直接隣接する残基は全て、第一抗体におけるのと同じままである。この戦略は、完全な抗原結合活性の保持を助けると考えられる、第一抗体からのパッキング及びインターフェース相互作用の全てを保持しながら第二抗体の表面を模倣することを意図する。これはＢ細胞エピトープの数を低下させるはずであり（及びまた一部のＴエピトープも低下させると考えられる）、より低い免疫原性を導く。
【００８９】
溶媒接触残基は、抗体の高分解能構造の検討によって同定される。ヒト化に関連すると考えられる抗体の他の領域、つまりＣＤＲと接触し、マウスとヒト抗体の間で異なる（そのような場合はげっ歯動物残基が使用される）埋もれた残基や、両方のドメインに関してＣＤＲの近くに位置し、抗原結合において役割を果たすと考えられるＮ末端領域、及び離れた距離であっても役割を果たし得る静電的相互作用である。置換すべき表面残基の選択は、第一抗体可変ドメインと第二抗体種からの使用可能な配列（個別又はコンセンサス配列）のドメインとの間の相同性マッチングによって決定される。
【００９０】
米国特許第５６３９６４１号明細書及び欧州特許出願公報第０５９２１０６号明細書は、再表面作成のための選択的方法を述べている。ここでは、第二抗体種の残基に変更すべき溶媒接触可能残基をＰａｄｌａｎと同様の手順を用いて同定するが、各々の位置に関する平均接触可能性を得るためにより多くの数の構造を分析する。一定レベル以上の接触可能性を有する残基を検討し、それを、抗体を使用すべき種からの抗体からの残基に変更する。置換すべき残基の選択は、全体的相同性を有する抗体から又は溶媒接触可能残基だけを考慮したときに最も高い相同性を有する抗体からであり得る。
【００９１】
国際公開第９３／１７１０５号パンフレット及び米国特許第５７６６６８６号明細書に述べられているヒト化法は、通常ヒト等価物に安全に変更し得る低危険度残基を同定する。これらの残基は溶媒接触可能性の傾向がある。従って、溶媒接触可能残基だけを変化させる場合、この工程は再表面作成法に類似する。
【００９２】
再表面作成又は薄板化抗体を提供する正味の効果がある２つのさらなる手法が記述されている欧州特許出願公開第０４３８３１０号明細書及び欧州特許出願公開第０５１９５９６号明細書参照。
【００９３】
さらなる手法は、免疫応答のためのＴ細胞のヘルパー機能を使用不能にするか又は低減して、導入される抗体に対する最小限の免疫応答を導くために、Ｔ細胞エピトープを同定し、除去する（「デトープ」と呼ばれる）ことを目指す（米国特許第５７１２１２０号明細書；欧州特許出願第０６９９７５５号明細書）。この工程でＢ細胞エピトープを除去することも可能である。
【００９４】
「脱免疫（ＤｅＩｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ）」テクノロジーは、抗体配列内のＢ及びＴ細胞エピトープの両方を低減しようとするものであり、予測アルゴリズム及びまた、これらのモチーフを同定するためにＭＨＣペプチド結合部位をモデリングするための構造情報に依存する。欧州特許第９８／５２９７６号明細書、欧州特許第０９８３３０３号明細書、国際公開第００／３４３１７号明細書、欧州特許第１０５１４３２号明細書参照。
【００９５】
抗体ヒト化手法はまた、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（Ｅｄｓ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｈｕｂｅｌ），Ｃｈａｐｔｅｒ ４０ ｐ５６７−５９２（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ）においても示されている。
【００９６】
一部の試験は、必ずしも全てのＣＤＲが抗原と接触しない例があることを認めており、例えばＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ，（１９９６ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２−７４５）がある。従って、一部の場合には、ヒト化は、ＣＤＲ残基のサブセットの移入によって達成でき、例えばＳａｎｔｏｓ ＆ Ｐａｄｌａｎ（１９８８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６０，１６９−１９４）及びＴａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，（２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，１４３２−１４４１）に示される。これはＳＤＲ移入と称される。
【００９７】
（Ｂ（ｉｉｉ）．結合型ヒト化及び選択）
フレームワークの相対的重要性における不確実性は、様々な手法の開発において、ヒト化成功への１つの因子であり、一部には様々な選択推進ライブラリー手法を導いてきた。これらは、選択的組合せの集団から最良の結合相手を実際的に同定することを目指す。例えば、ヒト化変異体を試験するための、１以上のフレームワーク位置における変更可能性を有する特定抗体可変ドメインのライブラリーの使用（例えばＢａｃａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８）、
特定ソースからのＣＤＲ３と組み合わせた可変領域フレームワークのライブラリーの使用（例えばＲａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＰＮＡＳ ９５：８９１０）、
特定親和性及び特異性のヒト抗体又はヒト抗体結合部位を形成するために非ヒト抗体可変ドメインを置換するためのライブラリー内からのヒトパートナードメインの選択（例えばＧｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ． １９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９；Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３）、
特異的結合を得るためのＣＤＲ３（例えばＨｕＣａｌ：Ｋｎａｐｐｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７）又は全てのＣＤＲのライブラリーを有する特定フレームワークの使用。
【００９８】
Ｗｕ ｅｔ ａｌ（１９９９ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４，１５１−１６２）は、ヒト化及びヒト化抗体の同時親和性改善のための手順を述べた（米国特許第５９５５３５８号明細書も参照のこと）。コンビナトリアルライブラリーは、集中的ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３ライブラリーと共に８つの潜在的に重要なフレームワーク位置を検討した。１個のマウスフレームワーク残基だけを含み、最初のキメラＦａｂよりも約５００倍高い親和性を示す多数の抗ＣＤ４０Ｆａｂ変異体が同定された。
【００９９】
ファージディスプレイテクノロジーはそのような免疫グロブリンを選択するための強力な手法を提供する（国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９２／０６２０４号パンフレット参照）。従って、例えば抗体のヒト化は、ファージディスプレイと細菌細胞を使用するＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらのエピトープ「刷り込み」手法を用いて（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ １９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，３８１−３８８によって記述され；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ２００２ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，１−３７ ａｎｄ ２００５ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１１０５−１１１６によって総説された）、又はＶａｃｃｉｎｅｘ Ｉｎｃ．（例えば米国特許第２００５／０２６６４２５号明細書に述べられている）によって開発された、ワクシニアウイルスディスプレイライブラリーと哺乳動物細胞を用いるその改変型を用いて達成し得る。
【０１００】
（Ｃ．ポリヌクレオチド）
本発明は、本明細書で述べるポリペプチドリガンドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、所望のＨＣＶ Ｅ２結合活性を有するいかなるポリペプチドもコードし得る。
【０１０１】
例えばポリヌクレオチドは、軽鎖又は重鎖などの免疫グロブリン分子鎖全体をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）だけでなく、典型的には３つの定常ドメイン、すなわちＣH１、ＣH２及びＣH３を含む重鎖定常領域（ＣH）、及び「ヒンジ」領域を含む。一部の状況では、定常領域の存在が望ましい。例えば抗体がＨＣＶ感染細胞を死滅させることを所望する場合、完全定常領域の存在は補体を活性化するために望ましい。しかし、また別の状況では、完全定常領域の存在は望ましくないと考えられる。例えば抗体が画像化のために必要である場合、定常領域が存在すると分子サイズの上昇により組織浸透が低下し得る。
【０１０２】
ポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドは、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2及び「ミニ抗体」などの抗原結合抗体フラグメントを含む。ミニ抗体は、（典型的には）ＣH１及びＣK又はＣLドメインが除去された二価抗体フラグメントである。ミニ抗体は従来の抗体よりも小さいので、臨床／診断用途においてはより良好な組織浸透を達成するはずであるが、二価であるため、ｄＡｂなどの一価抗体フラグメントよりも高い結合親和性を保持するはずである。従って、文脈によって異なる指示が為されない限り、本明細書で使用する「抗体」という用語は、完全抗体分子だけでなく、上記で論じた種類の抗原結合抗体フラグメントも包含する。
【０１０３】
特定実施形態では、本発明は、少なくとも３つの免疫グロブリン超可変重又は軽鎖ループを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供し、前記ポリペプチドは、抗原結合を保持し、３つの相補的免疫グロブリン超可変軽又は重鎖ループを含むポリペプチドと組み合わせたとき、本明細書で述べるＨＣＶpp中和アッセイによって判定される３５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ50でＨＣＶ遺伝子型１〜６の各々を代表するＨＣＶ試料を中和する抗体分子又はそのフラグメントを形成する。
【０１０４】
ポリヌクレオチドによってコードされる超可変ループは、好ましくはＡＰ３３内に存在する超可変ループのアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。ループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，（１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５th Ｅｄｎ．ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）によって考案された番号付け慣例を用いて、図８に示すようにＡＰ３３軽鎖内のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６及び８７〜８９及びＡＰ３３重鎖内の３１〜３５Ｂ、５０〜６５及び９５〜１０２によって表わされる。
【０１０５】
コードされるポリペプチドは、典型的にはＡＰ３３と同一又は実質的に同一のＣＤＲ配列を有するが、フレームワーク領域は、好ましくはＡＰ３３と異なる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＰ３３の重及び／又は軽鎖（適宜に）と比較して、特にフレームワーク領域内に、アミノ酸残基置換を含む重及び／又は軽鎖可変領域を有するポリペプチドをコードする。コードされるポリペプチドが部分的又は完全な重及び／又は軽鎖定常領域を含む場合、これもまた、ＡＰ３３の定常領域と比較して置換を含み得る。
【０１０６】
置換の影響は、ＡＰ３３と比較して、コードされるポリペプチドが、
（ｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質への結合の高い親和性（例えば標準ＥＬＩＳＡによって測定される）、及び／又は
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質への結合の高い特異性（すなわち他のタンパク質、特にヒトタンパク質との低い交差反応性）、及び／又は
（ｉｉｉ）本明細書で述べるＨＣＶpp中和アッセイによって測定したとき、ＨＣＶの１以上の遺伝子型の中和のための低いＩＣ50、及び／又は
（ｉｖ）ヒト被験者における低い免疫原性（例えばコードされるポリペプチドの標準用量をヒト被験者に静脈内投与した後、標準ＥＬＩＳＡによって測定される抗イディオタイプ応答によって決定される）
を有することであり得る。
【０１０７】
好ましくは、コードされるポリペプチドフレームワーク格領域の少なくとも１つ、最も好ましくはフレームワーク領域の各々が、生じるポリペプチドのヒト被験者における免疫原性を低下させる（ＡＰ３３に比べて）ために、ヒト抗体のものとより類似するようにＡＰ３３と比較してアミノ酸置換を含む。
【０１０８】
好ましくは、コードされるポリペプチド内に存在する各々のフレームワーク領域は、対応するＡＰ３３のフレームワークと比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。従って、例えば前記フレームワーク領域は、ＡＰ３３内に存在するフレームワーク領域と比べて、合計で、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個のアミノ酸置換を含み得る。
【０１０９】
ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの超可変ループはまた、図８に示すようなＡＰ３３のアミノ酸配列と比較して合計１以上のアミノ酸置換を含み得ることが可能である。コードされるポリペプチドは、例えばＡＰ３３の超可変ループ配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個又は１２個のアミノ酸置換を含み得る（重及び／又は軽鎖内に）。一般に、コードされるポリペプチドはＡＰ３３内のものと実質的に同一、好ましくは同一のＣＤＲ又は超可変ループ配列を有すると想定されるが、場合により超可変ループの各々は、ＡＰ３３超可変ループ配列と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を含み得る。
【０１１０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは単離及び／又は精製される。単離という用語は、分子がその自然又は天然環境から取り出されている又は分離されていること、又はその自然又は天然環境では存在しない方法で生産されたことを指示することが意図されている。精製という用語は、少なくとも一部の汚染分子又は物質が除去されていることを指示することが意図されている。好ましくは、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、関連ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが、組成物中に存在する支配的な（すなわち最も豊富な）ポリヌクレオチド又はポリペプチドを構成するように、実質的に精製される。
【０１１１】
従って、本発明は、好ましくは抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする挿入物を含む組換え核酸を使用する。定義によりそのような核酸は、一本鎖コード核酸、前記コード核酸とそれに相補的な核酸からなる二本鎖核酸、又はこれらの相補的（一本鎖）核酸自体を含む。
【０１１２】
さらに、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然に生じる重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする真正配列、又はその突然変異型を有する酵素的又は化学的に合成された核酸であり得る。真正配列の突然変異型は、１以上のアミノ酸が欠失している又は１以上の他のアミノ酸で交換されている、上記抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸である。好ましくは、前記修飾は、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側である。そのような突然変異型核酸はまた、１以上のヌクレオチドが、同じアミノ酸をコードする新しいコドンを有する他のヌクレオチドによって置換されているサイレント突然変異型であることが意図されている。そのような突然変異型配列はまた、縮重配列である。縮重配列は、無制限の数のヌクレオチドが、最初にコードされたアミノ酸配列の変化を生じさせることなく他のヌクレオチドによって置換されるという点において遺伝暗号の意味の範囲内で縮重する。そのような縮重配列は、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインの最適発現を得るために、特定宿主、特に酵母、細菌又は哺乳動物細胞にとって好ましいそれらの異なる制限部位及び／又は特定コドンの使用頻度の故に、有用であり得る。
【０１１３】
本発明はさらに、本発明の最初の態様に従ったポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供する。典型的には構築物は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの適切な宿主における発現を可能にする発現ベクターである。構築物は、例えば以下の１以上を含み得る。すなわち、宿主において活性なプロモーター、エンハンサーなどの１以上の調節配列、複製起点及びマーカー、好ましくは選択マーカーを含み得る。宿主は真核又は原核生物宿主であり得るが、真核生物（特に哺乳動物）宿主が好ましいと考えられる。適切なプロモーターの選択は、明らかに、使用する宿主細胞にある程度まで依存するが、ＨＳＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ等のようなヒトウイルスからのプロモーターを含み得る。数多くのプロモーターが当業者に公知である。
【０１１４】
構築物は、３つの軽鎖超可変ループ又は３つの重鎖超可変ループを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。あるいはポリヌクレオチドは、適切な長さの適切に柔軟性のリンカーによって連結された３つの重鎖超可変ループ及び３つの軽鎖超可変ループを含むポリペプチドをコードし得る。もう１つの可能性は、単一構築物が２つの別個のポリペプチド−１つは軽鎖ループを含み、１つは重鎖ループを含む−をコードするポリヌクレオチドを含み得ることである。別個のポリペプチドは、独立して発現され得るか又は１個の共通オペロンの部分を形成し得る。
【０１１５】
本発明のＨＣＶ Ｅ２結合ポリペプチドをコードする核酸構築物は、例えばオリゴヌクレオチド誘発型部位特異的突然変異誘発（例えばＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８１２７−８１３１参照）及びＰＣＲ（Ｈｏ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １９８９ ７７，５１−５９）を含む、当業者に周知の標準組換え核酸手法を用いて作製し得る。
【０１１６】
本発明はさらに、上記で定義したポリヌクレオチド又は構築物を含む、インビトロでの宿主細胞を提供する。宿主細胞は、細菌、酵母又は他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であり得る。本発明はまた、本発明に従ったポリペプチドを生産するように遺伝子操作されたトランスジェニック多細胞宿主生物を提供し得る。生物は、例えばトランスジェニック哺乳動物（例えばトランスジェニックヤギ又はマウス系）又はトランスジェニック植物系であり得る。ポリペプチドを生産する方法を以下でさらに説明する。
【０１１７】
（Ｄ．免疫原）
さらなる態様では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２糖タンパク質に結合する抗体を導入するための組成物を提供し、前記組成物は、アミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸを有するペプチド及び生理的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含み、前記ペプチドは、場合によりＮ及び／又はＣ末端に付加的なアミノ酸残基を含むが、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質全体又はそのＥ２660フラグメント（すなわちＨＣＶポリタンパク質の残基３８４〜６６０）を包含せず、アミノ酸残基の１以上が共有結合修飾されていてもよい。
【０１１８】
また、配列内のＸ残基の２以上が同じであってもよく、又はあらゆるＸ残基が異なっていてもよい。
【０１１９】
Ｘは、天然に生じるアミノ酸残基のいずれかであり得るか又は、より好ましくないが、非慣例的な残基（例えばオルニチン、シトルリン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン）であってもよい。考慮される他の共有結合修飾は、特に、グリコシル化（特に１以上のＮ残基のＮ−グリコシル化）を含む。
【０１２０】
本発明に関して、第一Ｘ残基（すなわちアミノ末端に最も近いもの）をＸ1と称し、第二Ｘ残基をＸ2と称し、第三残基をＸ3等々と称し得る。
【０１２１】
好ましい実施形態では、Ｘ1はＳ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｐ又はＬである。
【０１２２】
好ましい実施形態では、Ｘ2はＶ、Ｉ、Ａ、Ｒ又はＦである。
【０１２３】
好ましい実施形態では、Ｘ3はＳ、Ｔ、Ｈ、Ｌ又はＡである。
【０１２４】
好ましい実施形態では、Ｘ4はＮ、Ｑ又はＧである。
【０１２５】
好ましい実施形態では、Ｘ5はＳ、Ｋ又はＴである。
【０１２６】
好ましい実施形態では、Ｘ6はＨ、Ｒ又はＱである。
【０１２７】
好ましい実施形態では、Ｘ7はＩ、Ｌ、Ｆ又はＰである。
【０１２８】
従って、好ましいアミノ酸配列の例は以下を含む。
【化１】
【０１２９】
特に好ましい配列は以下に示す配列、ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＩＮＳＮＧＳＷＨＩ、ＳＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＥＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＨＬＡＮＨＱＧＫＷＲＬ、ＰＬＦＮＡＮＧＴＷＱＦ、及びＥＬＲＮＬＧＧＴＷＲＰを含む。
【０１３０】
１つの実施形態では、ペプチドは、実質的に又は基本的にアミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸからなる。
【０１３１】
より好ましくは、ペプチドは、式：
Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3ＮＧＳＷＨＩ又は
Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3ＮＧＳＷＨＩＮ
に合致するアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
この配列は、典型的には４１２、４１４及び４１６位だけが天然変異を示すＨＣＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸残基番号４１２〜４２３の保存配列に合致する。好ましくは、Ｘ1はＱ、Ｓ又はＥである。好ましくは、Ｘ2はＩ又はＶである。好ましくは、Ｘ3はＴ又はＳである。
【０１３３】
１つの実施形態では、ペプチドは、実質的に又は基本的にアミノ酸残基配列：
Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3ＮＧＳＷＨＩＮ
からなる。
【０１３４】
もう１つの好ましい実施形態では、ペプチドは付加的なアミノ酸残基を含む。特に、ペプチドは１以上の付加的なＢ又はＴ細胞ペプチドエピトープを含み得る。特に、ペプチドは１以上の付加的なＴヘルパー細胞ペプチドエピトープを含み得る。
【０１３５】
付加的なアミノ酸残基は、例えば配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸの１以上の反復を含み得るか、及び／又はＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質の他の部分からのペプチドエピトープ、及び／又は完全に他のＨＣＶタンパク質から又は他のタンパク質からのペプチドエピトープを含み得る。例えばペプチドは、アミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸが、１以上のＢ又はＴ細胞エピトープを含むペプチド又はポリペプチドなどの他の何らかの望ましい部分に共有結合している（が、典型的に必ずしもペプチド結合によってではない）、分子の部分として提供され得る。好都合には、そのような分子は、生物系において（例えば微生物によって又は組織培養系によって）発現され、合成され得る、融合タンパク質であり得る。ペプチド配列の反復は、場合により介在スペーサーによって分離されていてもよく、又は直接隣接していてもよい。
【０１３６】
若しくは、エピトープ配列は、エピトープ配列の複数の反復を含む分枝した分子として提供され得る。１つの実施形態では、分子は、リシンの分岐コア及びエピトープの複数のコピーが連結しているＣ末端アラニン残基を含む。
【０１３７】
エピトープが組成物内に複数回存在する場合、変異配列を含む可能性が生じる、例えば１個のペプチド配列は、Ｘ1がＳであり、Ｘ2がＶである配列であり得、分子内に存在するもう１個のペプチド配列は、Ｘ1がＱであり、Ｘ2がＩである配列であり得る。
【０１３８】
さらなる態様では、本発明は、アミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸを有するペプチドをコードする核酸構築物を提供し、前記ペプチドは、場合によりＮ及び／又はＣ末端に付加的なアミノ酸残基を含むが、前記核酸構築物は、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質全体又はそのＥ２660フラグメントをコードしない。構築物は、典型的には、コードされるペプチドが適切な原核又は真核生物宿主において発現され得るように、プロモーターを含む発現構築物である。好都合には、プロモーターは、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において作動可能なものである。数多くの適切なプロモーターが当業者に公知である（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター、レチノイン酸受容体β（ＲＡＲ−β）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子１（ＨＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ−４０プロモーター、ヒトｃ−ｆｏｓプロモーター）。
【０１３９】
１つの特定実施形態では、核酸構築物は、アミノ酸配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸが、隣接反復配列として又は介在スペーサーによって分離された反復配列として複数回存在するペプチドをコードする。
【０１４０】
構築物は、エンハンサーなどの１以上の調節要素、複製起点、及び１以上のマーカー（選択又はその他）を含み得る。構築物は、プラスミド、酵母人工染色体、酵母ミニ染色体の形態をとり得るか、又はウイルス、特に弱毒化ウイルス又はヒトにとって非病原性である類似ウイルスのゲノムの全部又は一部に組み込まれ得る。
【０１４１】
組成物又は構築物は、好都合には、哺乳動物被験者、好ましくはヒト被験者への安全な投与のために製剤される。典型的には、それらは複数のアリコートに提供され、各々のアリコートは、少なくとも１名の健常成人被験者の有効な免疫のために十分な組成物又は構築物を含有する。所望する場合は、上記で定義した本発明の４番目と５番目の両方の態様に従った組成物が製剤され得る。
【０１４２】
組成物又は構築物は、液体又は固体形態で、好ましくは、典型的には使用前に滅菌水性液体で再水和される凍結乾燥粉末として、提供され得る。
【０１４３】
好ましくは、組成物又は構築物は、アジュバント又は、組成物又は構築物の投与に応答して被験者の免疫応答（例えば特異的抗体力価によって測定される）を上昇させる作用を有する他の成分と共に製剤される。
【０１４４】
アジュバントは、免疫応答の抗原非特異的刺激を生じさせる物質である。公知のアジュバントは、コレラ毒素（ＣＴ）及び大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、その非毒性Ｂサブユニット及びトキソイド（すなわち１以上の突然変異がそれらを非毒性にした突然変異体分子又はＡ及びＢサブユニット架橋などの化学的処理によって非毒性にされた分子）などのＡＤＰリボシル化細菌毒素を含む。もう１つの公知のアジュバントは、ヒトワクチンにおける使用が承認されているミョウバンである。免疫応答を増強し得る他の物質は、脂質、特に脂質含有小胞、リポソーム、ミセル等を含む。
【０１４５】
被験者への構築物の投与は、被験者の細胞の少なくとも一部におけるペプチドエピトープの発現を生じさせ、それが次に、エピトープに対する免疫応答を誘導し得る（すなわちエピトープに結合する抗体を産生するＢ細胞の集団の発生及び／又は増殖を誘導し得る）。そのような構築物は一般に「ＤＮＡワクチン」と称される。核酸は、何らかの適切な経路で、例えば静脈内、皮下経路で、又は皮膚内への又は皮膚を通しての無針投与によって宿主に投与し得る。核酸は、「裸の」形態で投与し得るか、又は他の分子と又は、核酸が何らかの方法で粒子内に被包されている又は粒子と結合している、様々な種類の粒子と同時投与し得る（例えば、表面に結合、典型的に静電気引力によって）。使用し得る粒子は、リポソーム、ウイルス粒子、金マイクロ粒子等を含む。この一般的領域で研究のために広く使用されてきた１つのウイルス粒子は、核酸を被験者における宿主細胞に送達するためのベクターとして使用し得る、修飾ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）である。ＭＶＡはこれまで安全と認められた。ベクターとして使用されてきた他のウイルスは、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を含む。
【０１４６】
当業者は、構築物がＤＮＡとして投与される必要はなく、実際には、ＲＮＡウイルスの一部としてのＲＮＡとして投与することができ、それが次に宿主細胞においてＤＮＡに転写され、その後翻訳されることを認識する。
【０１４７】
組成物は、何らかの適切な経路によって被験者に投与し得る。経口、経鼻又は他の粘膜経路は非侵襲性であり、従ってそれらが有効であると認められる場合は好ましいと考えられるが、静脈内、皮下又は筋肉内注射などのより慣例的な経路は、より強い免疫応答を惹起する可能性が高い。投与するペプチドの最適用量は、被験者の大きさ及び年齢、投与経路等に依存し得る。一般的指針として、有効用量（すなわち、それまでエピトープに対して検出可能な抗体を有していなかった被験者において検出可能な抗体力価を誘導する、又はある程度の既存の抗体力価を有する被験者において抗体力価の検出可能な上昇を生じさせる用量）は、成人に関して５０μｇ〜５００ｍｇの範囲内、好ましくは１００μｇ〜２５ｍｇの範囲内のエピトープの量を含む。
【０１４８】
本発明の１つの特定実施形態では、本発明の４番目の態様に従った組成物であって、本発明の５番目の態様に従った核酸構築物をさらに含む組成物が提供される。
【０１４９】
生理的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤は、固体又は液体であり得る。適切な液体は、水及び食塩水、リン酸緩衝食塩水等のような水性溶液を含む。適切な固体は、デンプン、デキストラン及びゲル（例えばカラゲナン、アルギネート等）を含む。
【０１５０】
本発明の組成物及び／又は構築物は、ＨＣＶに結合して、ウイルスを中和する（すなわち非感染性にする）抗体を被験者において誘導するために使用し得る。本発明に関して、抗体をウイルスと共に３７℃で１時間プレインキュベートし、抗体が１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは７５μｇ／ｍｌ以下の濃度を有するとき、インビトロアッセイにおいてＨＣＶの感染力価の少なくとも５０の％低下を生じさせることができる場合、抗体は中和性であるとみなすことができる。従って、組成物及び／又は構築物は、被験者がその後ＨＣＶに遭遇した場合、感染を予防し得る、又は少なくとも感染の重症度を軽減することによって限られた保護を提供し得る抗体を生成するために使用できる。従って、組成物／構築物は、疾患を完全に予防するため又は少なくとも感染の症状を改善するために使用できる。
【０１５１】
若しくは、組成物／構築物は、既にＨＣＶに感染している被験者においてＨＣＶに対する免疫応答を増強する、すなわち疾患を治療するために使用し得る。そのような治療は、急性又は慢性感染している被験者からのウイルスの清掃を促進し得る。
【０１５２】
従って、さらなる態様では、本発明は、被験者においてＨＣＶ中和抗体を惹起する又はＨＣＶ中和抗体の合成を高めるために、本発明に従った組成物及び／又は構築物の有効量を投与することを含む、哺乳動物被験者、好ましくはヒト被験者においてＨＣＶ感染を予防する及び／又は治療する方法を提供する。用量及び投与経路は、好都合には、先に述べられているとおりであり得る。
【０１５３】
別の部分で説明したように、本発明者らは、驚くべきことに、エピトープＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに結合する抗体がＨＣＶの各々の公知の遺伝子型を代表するウイルスを中和できることを見出した。従って、そのような抗体が十分に高い濃度で被験者内に存在すれば、それらは、ＨＣＶの何らかの遺伝子型によって引き起こされる感染及び／又は疾患に対して防護できるはずである。抗体の十分に高い濃度を達成する１つの方法は、能動免疫である。選択的なアプローチは、既存の抗体を被験者に投与する、受動免疫である。
【０１５４】
従ってさらなる態様では、本発明は、エピトープＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに結合する１以上のＨＣＶ中和抗体の有効量を被験者に投与することを含む、哺乳動物被験者、好ましくはヒト被験者においてＨＣＶ感染を予防する及び／又は治療する方法を提供する。そのような抗体は、好都合には上記で定義した本発明の３番目の態様に従ったポリペプチド、特にキメラ又は、好ましくは、ヒト化抗体又はＡＰ３３のものと同一又は実質的に同一のＣＤＲを含む抗体フラグメントであり得る。
【０１５５】
抗体は、例えば免疫血清の形態で投与し得るか、又はより好ましくは精製組換え又はモノクローナル抗体であり得る。所望特異性を有する血清又はモノクローナル抗体を生産する方法は常套的であり、当業者に周知である。抗体は、静脈内又は筋肉内注射、腹腔内又は経皮的経路を含むがこれらに限定されない、何らかの適切な経路によって投与し得る。
【０１５６】
好ましくは、投与する抗体は実質的に精製されている（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定したとき、好ましくは少なくとも９５％の均一性、より好ましくは少なくとも９７％の均一性、最も好ましくは少なくとも９８％の均一性）。抗体は、食塩水、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液等のような、医薬的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と好都合に混合又は組み合わせることができ、場合によりゼラチン、デンプン、アルギネート及び誘導体化セルロースなどの増粘剤を含み得る。
【０１５７】
受動免疫法は、好都合には、ＨＣＶ抗原に対して異なる特異性を有する複数の抗体の投与及び／又は他の抗ウイルス治療化合物と組み合わせた抗体の投与を含み得る。最近、そのような受動免疫手法はＨＩＶ感染を治療するために安全に使用されている（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２００４ Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５４，９１５−９２０；Ｓｔｉｅｇｌｅｒ ＆ Ｋａｔｉｎｇｅｒ ２００３ Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５１，７５７−７５９）。
【０１５８】
本発明の能動又は受動免疫法は、上記で定義したコンセンサスペプチドエピトープと比較していくつかのアミノ酸の相違を含む非常にまれな突然変異体単離物（以下のＵＫＮ５．１４．４に例示されるような）を除き、ＨＣＶの遺伝子型１〜６のいずれかのウイルスによる感染に対する個体の保護又は治療を可能にするはずである。
【０１５９】
さらなる態様では、本発明は、ＨＣＶの存在を検出するための診断試験装置及び方法をそれぞれ提供する。装置は、試薬として、エピトープＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに結合する１以上の抗体を含み得る。抗体は、例えば固体支持体上（例えばマイクロタイターアッセイプレート上、又は微粒子支持体上）に固定化されており、試料（例えば血液又は血清試料又は肝生検などの他の臨床標本）からＨＣＶ粒子を「捕獲する」働きをし得る。捕獲されたウイルス粒子は、その後、例えば捕獲ウイルス粒子に結合するさらなる標識試薬を添加することによって検出できる。好都合には、アッセイはＥＬＩＳＡ、特にサンドイッチ型ＥＬＩＳＡの形態をとり得るが、免疫クロマトグラフィー又はディップスティック型アッセイを含む他のいかなるアッセイ形式も原則的に採用できる（例えば放射免疫測定法、ウエスタンブロット法）。
【０１６０】
ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸエピトープに結合する抗体は、標識されていてもよく又は非標識でもよい。いかなる適切な標識も使用でき、例えば放射能標識、酵素標識、蛍光標識又は染料負荷微粒子標識が使用できる。
【０１６１】
本発明のアッセイ方法は、エピトープＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに結合する抗体の使用を含む。
【０１６２】
抗体は遺伝子型１〜６のいずれかからのＨＣＶに結合できるので、アッセイ装置及び対応する方法は、試料においてこれらの遺伝子型のいずれかを代表するＨＣＶを検出することができるはずである。
【０１６３】
最後の態様では、一般式ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに合致するペプチドを含む分子が、融合工程に干渉することによってＨＣＶの感受性細胞への侵入を阻害し得ると考えられる。そこで、例えば上記アミノ酸残基配列を含むペプチド又はポリペプチドは臨床的有用性を有すると考えられ、従って、本発明は、生理的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と混合してそのような分子を含む医薬組成物を包含する。そのようなアプローチは、ＨＩＶ ｇｐ４１の一部に対応する、Ｔ２０ペプチドに関して最近記述された（Ｚｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ，２００４ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０，１３３−１３４）。
【０１６４】
疑いを回避するため、文脈によって異なる指示が為されない限り、本発明は、単独で又はそのように記述される他の何らかの特徴による組合せと共に、本明細書で「好ましい」、「有利」、「好都合」等と表わされるいかなる特徴も含み得ることをここで明白に言明する。さらに、本明細書において言及される全ての刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
ここで、説明的実施例によって本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１６６】
ＨＣＶの種々の遺伝子型に感染した患者からの、Ｅ１Ｅ２糖タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列の単離がＬａｖｉｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（参考文献４３）によって報告された。種々の遺伝子型に由来する糖タンパク質で被包されたＨＣＶ偽粒子（ＨＣＶpp）を生成するため、本発明者らは、適切なＨＣＶ Ｅ１Ｅ２及びマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）Ｇａｇ−Ｐｏｌを発現するベクターを使用した。本発明者らはまた、形質導入マーカーとして働くＧＦＰレポータータンパク質をコードするＭＬＶ導入ベクターを利用した。
【０１６７】
ヒトＣＭＶプロモーターの制御下でＨＣＶ遺伝子型１ａのＨ系統由来完全長Ｅ１Ｅ２、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）Ｇａｇ−Ｐｏｌ及びＧＦＰを担持するＭＬＶ導入ベクターを発現するプラスミドがこれまでに報告されている（参考文献６）。様々な臨床単離物からのＨＣＶの完全長Ｅ１Ｅ２をコードするｃＤＮＡ配列［Ｈ７７ｃ系統に関するＨＣＶオープンリーディングフレームのアミノ酸残基１７０〜７４６を示す（参考文献７０）］は、ＰＣＲによって作製され、発現ベクターｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はｐｈＣＭＶ−７ａ（６）内のヒトＣＭＶプロモーターから下流にクローニングされ（参考文献６）、記述されているように（４３）それらのヌクレオチド配列を決定した。
【０１６８】
実験は、ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）及びヒト肝細胞癌（Ｈｕｈ−７）の細胞の使用を含んだ。これらを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５％可欠アミノ酸、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＢＣＯ ＢＲＬ）において増殖させた。
【０１６９】
ＨＣＶppは、基本的に以前に記述されているように作製した（参考文献６）。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３％細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション法（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＭＬＶ Ｇａｇ−Ｐｏｌパッケージングベクター、ＭＬＶ−ＧＦＰ導入構築物、及びＨＣＶ Ｅ１Ｅ２を発現するプラスミドとコトランスフェクトした。全ての実験において、ＨＣＶ糖タンパク質発現構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコトランスフェクションから除外した、無エンベロープ対照を使用した。トランスフェクションの２日後、ＨＣＶppを含む培地を収集し、清澄化して、０．４５μｍ細孔径の膜でろ過し、Ｈｕｈ−７細胞の感染のために使用した。感染の４日後、細胞を採集し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。形質導入効率をＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして決定した（典型的には０．０５％であった、無エンベロープ対照に「感染した」ＧＦＰ陽性Ｈｕｈ−７細胞の数を差し引いた後）。形質導入単位／ｍｌとして表わされる感染力価を形質導入効率から算定した。
【０１７０】
確立された感染性クローン１ａ型Ｈ系統（参考文献６）からのＥ１Ｅ２配列を、実験のこのシリーズ全体を通じて患者由来のＥ１Ｅ２クローンと共に対照として使用した。合計２８９の患者単離物をスクリーニングし、これらのうちで３９は偽粒子を感染性にすることができた。そのうちの一部の性質が本発明者らによって最近報告された（参考文献４３）、これらの機能性クローンの代表的選択を表１に示す。遺伝子型の各々を代表する少なくとも１個の感染性クローンを同定した。一部の患者単離物に由来するＨＣＶppは、このアッセイにおいて対照遺伝子型１ａ Ｈ系統からのものよりも再現可能により感染性であった。例えば構築物ＵＫＮ２Ｂ１．１に由来するＨＣＶppは通例標的細胞の３０％以上を形質導入したが、Ｈ７７に由来するものは１０〜２０％しか導入しなかった。典型的には、形質導入単位／ミリリットル（ＴＵ／ｍｌ）として表わされる感染力価は、ＵＫＮ２Ｂ１．１に関しては約１×１０5ＴＵ／ｍｌ、１ａ型Ｈ系統に関しては４×１０4ＴＵ／ｍｌであった。これに対し、遺伝子型３、５及び６のＨＣＶppは非常に低い力価を与えた（（参考文献１〜４）×１０3ＴＵ／ｍｌ）（表１）。
【０１７１】
【表１】
【実施例２】
【０１７２】
なぜ単離物の多くが感染力を有していなかったのかを検討するため、本発明者らは、ＨＣＶ糖タンパク質がトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたかどうかを調べた。各々の細胞溶解産物中のＥ２糖タンパク質の相対レベルを、ＧＮＡ（ガランサス・ニヴァリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ））レクチン被覆ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、及び全て１ａ型Ｅ２に対して惹起し先に述べられている（参考文献５２、１６）ポリクローナルウサギ血清Ｒ６４６及び２個のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、ＡＰ３３とＡＬＰ９８を含むＥＬＩＳＡによって測定した。ＭＡｂ ＡＰ３３及びＲ６４６抗血清を、製造者のプロトコールに従って（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）プロテインＧカラムで精製した。
【０１７３】
Ｅ２糖タンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイを、基本的に先に述べられているように（参考文献５４）実施した。簡単に述べると、上述したようにコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の清澄化溶解産物からのＥ１Ｅ２糖タンパク質を連続的に３倍希釈し、ＧＮＡレクチン被覆ＥＬＩＳＡプレート上に捕獲した。結合糖タンパク質を、抗Ｅ２ ＭＡｂ ＡＰ３３又はＡＬＰ９８又はウサギポリクローナル血清Ｒ６４６、次に抗種ＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）及びＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジン、Ｓｉｇｍａ）基質を用いて検出した。吸光度値を４５０ｎｍで測定した。
【０１７４】
結果を、試験した様々な溶解産物についての、希釈の逆数に対する吸光度（任意の単位）の一連のグラフである図１ａに示す。ＡＰ３３による検出についての結果を黒い丸で表わし、ＡＬＰ９８については白い丸、及びＲ６４６ポリクローナル抗血清については黒い三角で表わしている。
【０１７５】
ＭＬＶ Ｇａｇ−Ｐｏｌ及びＧＦＰレポーター構築物と共に感染性クローンの各々でコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解産物は、２個のＭＡｂの少なくとも１個に関して、強力な、濃度依存性シグナルを与えるＥ２のレベルを含んだ。４型単離物（ＵＫＮ４．２１．１６）及び試験した２個の５型単離物の１個（ＵＫＮ５．１４．４）が、それぞれＭＡｂ ＡＬＰ９８及びＡＰ３３によって認識されなかったことは注目すべきである。これは、これらの抗体によって認識されるエピトープ内の変異アミノ酸の存在によるものである（下記参照）。ウサギ抗血清Ｒ６４６は、ほとんど排他的に遺伝子型１ａ Ｈ系統Ｅ２を認識した。すなわち、他の遺伝子型からのＥ２だけでなく、同じサブタイプ（１Ａ．１４．３６）の異なる単離物からのＥ２も認識することができなかった。
【０１７６】
感染性ＨＣＶppを生成しない単離物全てでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の溶解産物も、Ｅ２の存在に関してＧＮＡ ＥＬＩＳＡによって分析した。一部は、Ｅ２が検出不能であるか又は低レベルのＥ２を有していたが、また別のものは、感染性クローンでトランスフェクトした細胞の溶解産物において認められるのと同様のＥ２レベルを含んだ（データは示していない）。本発明者らは、一部の単離物はＥ２を発現しないために感染力を欠き、また別のものは、おそらくそれらがコードするＥ２又はＥ１Ｅ２複合体が何らかの意味で非機能性であるために、高レベルのＥ２を発現するにもかかわらず非感染性であると結論した。
【実施例３】
【０１７７】
ＨＣＶppの感染性は、粒子のエンベロープへの完全長Ｅ１Ｅ２複合体の組込みに依存する（参考文献６、３９）。上記ＥＬＩＳＡデータは種々の遺伝子型に由来するＥ２の存在を確認したが、Ｅ１の存在は、広範に反応性の抗Ｅ１抗体がないため分析できなかった。その代わりに、本発明者らは、免疫沈降アッセイによってＥ１Ｅ２複合体の形成を検討した。ＨＣＶ糖タンパク質発現構築物とＭＬＶ Ｇａｇ−Ｐｏｌ及びＧＦＰ導入ベクターでコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を［35Ｓ］メチオニン／システインで放射性標識した。
【０１７８】
放射性標識は以下のように実施した。
【０１７９】
トランスフェクションの１８時間後、細胞をＰＢＳで洗い、２５μＣｉ／ｍｌのＬ−［35Ｓ］Ｒｅｄｉｖｕｅ（商標）Ｐｒｏ−Ｍｉｘ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むメチオニン／システイン不含培地で４８時間インキュベートした。トランスフェクト細胞の培地を採集し、遠心分離によって清澄化した。細胞をＰＢＳで洗い、溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭヨードアセトアミド、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００）に溶解して、核を除去するために溶解産物を短時間遠心した。清澄化した細胞溶解産物及びＨＣＶppを含む培地を抗Ｅ２ ＭＡｂ ＡＰ３３とＡＬＰ９８の混合物と共に４℃で２時間インキュベートし、生じた免疫複合体を、プロテインＡ−セファロースを用いて沈殿させた。プロテインＡ−セファロースビーズの洗浄後、免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性緩衝液（２００ ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．７；０．５％ＳＤＳ；１０％グリセロール；２０ｍＭ ＤＴＴ）に放出し、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを乾燥し、蛍光スクリーンに一晩暴露して、放射性標識タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ＦＸホスファイメージャーで視覚化した。
【０１８０】
結果を図１ｂに示す。
【０１８１】
Ｅ１を、糖タンパク質発現構築物の大部分でトランスフェクトした細胞の溶解産物からのＥ２と共に共免疫沈降させた。生じたタンパク質の相対量にはある程度の変動があり、沈降タンパク質（特にＥ１）の分子量に興味深い差が認められた。ヌクレオチド配列分析は種々の遺伝子型の間で予測グリコシル化部位の変動を示すので（参考文献４３）、これらはおそらくグリコシル化の相違によると考えられる。種々の遺伝子型のＥ１とＥ２の間で相対的化学量論に有意の変動があったことは注目すべきである。同様に、トランスフェクト細胞の培地に分泌されたＥ１Ｅ２複合体（そのうちのある程度の割合はＨＣＶppの形態であると予想された）も、同じＭＡｂによる免疫沈降によって検出された（データは示していない）。
【実施例４】
【０１８２】
（ＨＣＶpp感染した標的細胞の抗体による中和）
本発明者らは、細胞のＨ７７ｃ系統ＨＣＶpp感染を阻害するＭＡｂ ＡＰ３３、ウサギ抗血清Ｒ６４５及びＲ６４６（どちらも１ａ型Ｈ７７ｃ系統の可溶性細胞外ドメインに対して惹起した）の能力を試験した。
【０１８３】
また、遺伝子型１ａ Ｈ７７ｃ系統の超可変ＨＶＲ−１領域（残基３８４〜４１１）に対応する分枝ペプチドで免疫したニュージーランドウサギにおいて惹起した抗血清Ｒ１０２０及びＲ１０２１も試験した。これらの抗血清を生成するために使用した免疫プロトコールは先に記述されている（参考文献５３）。
【０１８４】
中和アッセイを以下のように実施した。遺伝子型１ａ Ｈ系統Ｅ１Ｅ２を有するＨＣＶppを、抗Ｅ２血清Ｒ６４５、Ｒ６４６、Ｒ１０２０及びＲ１０２１又はそれらの免疫前（ＰＩ）対応物の１：１２０希釈、又はＭＡｂ ＡＰ３３ ５０μｇ／ｍｌと共に３７℃で１時間プレインキュベートした。次に、６穴組織培養ディッシュにプレートしたＨｕｈ−７細胞にウイルス／抗体混合物を添加し、細胞を３７℃で３時間インキュベートした。接種物の除去後、細胞に新鮮培地を再供給し、３７℃で４日間インキュベートした。感染細胞の割合を、上述したようにＦＡＣＳによるＧＦＰの測定によって決定した。中和活性を、それぞれ感染の５０％又は９０％阻害を達成するために必要な抗体濃度と定義される、ＩＣ50又はＩＣ90で表わした。
【０１８５】
結果を図２Ａに示す。
【０１８６】
試験したウサギ抗血清のうちで、Ｒ６４６は感染を完全に排除することができ、一方Ｒ６４５は感染を約５０％ブロックした。Ｒ１０２０及びＲ１０２１抗ＨＶＲ１抗血清はいずれも、感染を６５％中和することができた。予想されたように、対応する免疫前ウサギ血清はＨＣＶpp感染に影響を及ぼさなかった。Ｒ６４６と同様に、ＭＡｂ ＡＰ３３はＨ７７ｃ系統ＨＣＶppによるＨｕｈ−７細胞の感染を完全にブロックした。
【０１８７】
次に、本発明者らは１ａ Ｈ７７系統以外のＨＣＶ遺伝子型を中和するこれらの抗血清及びＭＡｂ ＡＰ３３の能力を試験した。ＡＰ３３が広く交差中和性であるのに対し、抗血清Ｒ６４５、Ｒ６４６及びＲ１０２０は、１ｂ、２ａ又は２ｂ型糖タンパク質を組み込んだＨＣＶppの感染力にごくわずかな作用しか及ぼさないことが認められた（図２ｂ）。Ｒ６４６は１ａ以外の遺伝子型に由来するＨＣＶppによる感染を有意に阻害しないことが確立されているので、本発明者らは、その特異性が１ａ型Ｈ系統の糖タンパク質に限定されるのかどうか、又は他の１ａ型単離物を阻害し得るのかどうかを検討した。図２ｃに示すように、この抗血清は、１ａ Ｈ系統以外の２つの患者由来単離物１Ａ１４．８及び１Ａ１４．３６に対してあまり有効ではなく、２００ｎｇ ＩｇＧ／ｍｌのＩＣ50値を有していた。
【０１８８】
ＭＡｂ ＡＰ３３の広い反応性を、遺伝子型の完全な相補物を表す単離物に由来するＥ１Ｅ２を組み込んだＨＣＶppのパネルに関して一連の濃度で試験することによってさらに検討した。図３に示すように、６つの遺伝子型全てを代表する単離物のＭＡｂ ＡＰ３３反応性Ｅ２を有するＨＣＶppは、遺伝子型５についての０．６μｇ／ｍｌから遺伝子型３ａについての２２μｇ／ｍｌまでの範囲にわたるＩＣ50で有効に中和された。遺伝子型５のＨＣＶpp単離物の１つ、ＵＫＮ５．１４．４の感染力はＭＡｂ ＡＰ３３によって影響を受けなかった（データは示していない）が、これは、この感染性単離物のＥ２糖タンパク質がこの抗体によって認識されないからである（図１Ａ）。
【０１８９】
この試験で使用した種々の遺伝子型のＥ２のＮ末端領域のアミノ酸配列アラインメント（図４ａ）は、ＭＡｂ ＡＰ３３エピトープ（残基４１２〜４２３）が、３個の変異アミノ酸部位（残基４１２、４１４及び４１６）だけしか有さず、比較的良好に保存されていることを示した。このエピトープ内の他の部位は絶対的に保存されている。これに対する例外は、遺伝子型５の単離物ＵＫＮ５．１．４．４によってコードされるＥ２内の対応アミノ酸配列であった。これは、その他の単離物と比較して潜在的グリコシル化部位（ＮＧＳ）の−１シフトと配列内の４残基変化を有していた（図４ａ）。これに対し、Ｒ６４６によって認識される遺伝子型１ａ Ｈ系統の線状エピトープに対応する配列には、その限られた特異性と一致して、異なる遺伝子型の間で有意の変動が見られた。最後に、ＡＬＰ９８抗体によって認識されるエピトープ（残基６４４〜６５１）も保存されていたが、遺伝子型４のクローンの６５１位に存在するアルギニンからバリンへの突然変異はこの抗体による認識を無効にした（図４ｂ）。ＡＰ３３によって認識されるエピトープをより詳細に検討するため、エピトープを詳細に位置づけた。
【実施例５】
【０１９０】
（ファージバイオパニングスクリーンを用いるＡＰ３３接触残基の詳細なマッピング）
ファージ提示されるランダムペプチドライブラリー（ＲＰＤＬ）のＰｈＤ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ［ＮＥＢ］）シリーズは、３型ファージペプチド提示ベクターＭ１３ＫＥに基づく。これらのライブラリー内の個々のファージは、スペーサー配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒによって成熟ｐＩＩＩキャプシドタンパク質のＮ末端に融合されたランダムペプチドの５コピーまでを発現する。ランダムな１２量体ペプチドを発現するライブラリーを本発明者らの実験において使用した（ＮＥＢカタログ番号Ｅ８１１０Ｓ）。ＰｈＤファージ−ライブラリーのアフィニティー選択を、基本的に製造者によって述べられているように実施した。簡単に述べると、ＡＰ３３を、１００μｌの被覆緩衝液（ＣＢ）（０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩、ｐＨ９．６）４℃で一晩インキュベートすることにより、マキシソープマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のウエルに１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で被覆した。被覆後、抗体溶液を廃棄し、その後ウエルを、３００μｌのＴＢＳ−ＴＢ（０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０及び５％（ｗ／ｖ）粉乳（Ｍａｒｖｅｌ（登録商標），Ｃａｄｂｕｒｙ’ｓ）を含むトリス緩衝食塩水、ｐＨ７．６［ＴＢＳ］）によって４℃で１時間ブロックした。ブロック溶液を廃棄した後、ウエルをＴＢＳ−Ｔ（０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０を含むＴＢＳ）で６回洗浄し、その後ＴＢＳ−Ｔ １００μｌ中で希釈したＰｈＤライブラリーから１×１０11ファージを添加した。これらのファージを２５℃で１時間放置して固定化ＡＰ３３に結合させた後、ＴＢＳ−Ｔによる連続洗浄を通して非結合ファージを除去した。結合ファージを１００μｌの０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で１０分間溶出し、微量遠心機チューブに移して、その後１５μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）の添加によって中和した。
【０１９１】
回収したファージを、ＬＢ中で溶出ファージの連続希釈を調製することによって力価測定し、各々の希釈溶液１０．０μｌを、対数増殖期（０．３ＯＤ600nm）の大腸菌ＥＲ２５３７株（ＮＥＢ）２５０μｌに添加した。ファージを２５℃で５分間細菌に感染させた後、細菌を、１ｍＭ Ｘ−Ｇａｌ及び１ｍＭ ＩＰＴＧを含む０．７％寒天３ｍｌと混合し、ＬＢ寒天プレートに重ねた。寒天を５分間凝固させた後、プレートを裏返して、３７℃で一晩インキュベートした。その後、方程式：ファージμｌ-1＝（［青色プラークの平均数］×［希釈］-1）／１０を用いて、形成された青色プラークの平均数からファージの力価を算定した。
【０１９２】
次に、強化ファージライブラリーを、溶出ファージ５０μｌ（約１×１０5ＰＦＵ）をＬＢ中の対数期大腸菌ＥＲ２５３７株２０ｍｌに添加し、３７℃で少なくとも４時間半インキュベートすることによって増殖させた。ファージ増殖後、１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４）によって細菌及び他のデブリを除去した。５分の１容量のＰＥＧ（２０％［ｗ／ｖ］ポリエチレングリコール−８０００、２．５Ｍ塩化ナトリウム）を４℃で１時間添加してこの培養物の上清からファージを沈殿させ、１５，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって収集した。次にファージペレットをＴＢＳ １．０ｍｌに再懸濁した後、氷上で１時間、５分の１容量のＰＥＧで２回目の沈殿を実施した。その後１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離（ＭＳＥ Ｍｉｃｒｏ Ｃｅｎｔａｕｒ）によってファージを収集し、最終容量２００μｌの滅菌ＴＢＳに再懸濁した。増殖させたライブラリー内のファージの濃度を上述した力価測定によって決定し、その後１×１０12ファージを、さらなる２〜３回のアフィニティー選択への投入物として使用した。
【０１９３】
最終回のアフィニティー選択後、溶出ファージの力価測定から得た個々のプラークを、滅菌ピペットチップを用いてＥＲ２５３７の対数期培養物２ｍｌに接種し、３７℃で４時間半増殖させた。２回の上述した沈殿によってこの培養物の上清からファージを回収し、ＴＢＳ １００μｌに再懸濁した。ファージ原液を−２０℃で保存した。
【０１９４】
１２塩基の無処置ＲＰＤＬから濃縮したペプチドの抗原性を調べるため、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＩＡ）を使用した。ＣＢ ５０μｌ中で１．０〜１００μｇ／ｍｌに希釈したＡＰ３３を、４℃で一晩のインキュベーションによってマイクロタイタープレートのウエルに直接被覆した。ブロックキング後（上述したように）、約１×１０11ファージ粒子をウエルに添加し、１〜２時間結合させた。その後、ＴＢＳ−Ｔ中で１：１０００に希釈した抗ｆｄ
（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ−７７８６）とのインキュベーションによって結合ファージを検出した。次に、これらの抗体の結合を、抗ウサギ二次抗体に複合したアルカリホスファターゼ及びｐＮＰＰ基質（Ｓｉｇｍａ）との連続インキュベーションによって検出し、ＯＤを４９０ｎｍで読み取った。
【０１９５】
配列決定鋳型ＤＮＡは、プライマーｇＩＩＩ（ｆ）５’−ＡＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣ−３’を、製造者によって供給された−９６配列決定プライマーと共に使用して、約１×１０9ファージからのＤＮＡのＰＣＲ増幅によって調整した。標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をファージ粒子及び細菌の両方からのＤＮＡの増幅のために使用した。各々の反応のために、１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ ＫＣｌ［ｐＨ８．３］）２．５μｌ、各々のプライマー５．０μｌ（５．０ｐｍｏｌ）、ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）０．１μｌ（０．５単位）及び１０．０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む）０．５μｌを薄壁マイクロ遠心チューブに添加した。ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水で反応容量を２５．０μｌにした後、ＤＮＡ不含水で約１×１０9ファージ／ｍｌに希釈したファージ粒子１．０μｌを添加した。次にＰＴＣ−１００／２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でのＰＣＲサイクリング（９５℃、４５秒間、５０℃、４５秒間、７２℃、９０秒間の３５サイクル）によってＤＮＡを増幅した。
【０１９６】
増幅後、組み込まれなかったヌクレオチドとオリゴヌクレオチドを、配列決定の前に、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）及びエキソヌクレアーゼＩ（Ｅｘｏ Ｉ）各々１．０μｌを添加し、次に３７℃で３０分間インキュベートすることによって除去した。その後ＳＡＰとＥｘｏ Ｉ酵素を７５℃で１５分間不活性化し、５．０μｌのＳＡＰ／Ｅｘｏ Ｉ処理したＰＣＲ産物からの鋳型ＤＮＡを、薄壁ＰＣＲチューブ中のＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４．０μｌ及び−９６配列決定プライマー１．０μｌ（１ｐｍｏｌ）と混合し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サーマルサイクラーを用いてサイクルシークエンス法（９６℃、１０秒間、５０℃、５秒間、６０℃、４分間の２５サイクル）を実施した。次にＤＮアーゼ不含水１０．０μｌ及び３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２．０μｌ（０．１容量）をチューブに添加した後、短時間遠心分離し、滅菌マイクロ遠心チューブに移した。その後、配列決定したＤＮＡを、１００％エタノール４５．０μｌの添加と２５℃で１０分間のインキュベーションによって沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して回収し、７０％エタノール４５．０μｌで洗った後、３７℃で１５分間乾燥した。その後、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０遺伝子アナライザーを用いて配列分析を実施した。
【０１９７】
ＡＰ３３パラトープとの接触を形成する可能性が高いＥＩＡ反応性強化提示ペプチドの保存残基の同定を、推定ペプチドのコンピュータ援用アラインメントによって実施した。
【０１９８】
固定化ＡＰ３３に対する３回の選択バイオパニング後、２２個のファージクローンを採取し、増殖させて、ＡＰ３３抗体に対するそれらの反応性をＥＩＡによって測定した（図５）。図５は、強化ファージの大部分によって提示されるペプチドがＡＰ３３抗体と特異的に相互作用することを示す。相互作用の特異性は、対照ＡＬＰ９８抗体に対する反応性の欠如によって確認される。
【０１９９】
前記ペプチドのＡＰ３３ペプチドへの結合を媒介することに関与する可能性が最も高い残基を同定するため、選択ペプチドのＤＮＡ塩基配列決定を実施し、コンピュータ援用アラインメントを用いてそれらの推定アミノ酸配列を整列した。各々の群がユニークペプチド配列を含む、３つの群のファージを同定した（図６）。それらのコンセンサス配列は、予測ＡＰ３３エピトープに対する各々の群のアラインメントと共に、決定的に重要な結合モチーフがＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸと定義できることを指し示す。
【０２００】
図６において、抗体ＡＰ３３によって選択したファージ内に存在するランダムペプチド挿入物の推定アミノ酸配列をパネルＡに示す。推定上のＡＰ３３エピトープに対して整列した反応群の選択ファージペプチド内各々に存在する推定アミノ酸配列（パネルＢ）は、抗体−エピトープ相互作用に関与する保存された接触残基を明らかにする。クローンＰ３．５はＡＰ３３ ＥＩＡにおいて非反応性であり（図５）、このペプチドはＡＰ３３エピトープに対してごくわずかな相補性しか示さないことに留意しなければならない。
【実施例６】
【０２０１】
（アラニン置換突然変異型Ｅ１Ｅ２タンパク質を用いるＡＰ３３及び３／１１エピトープの詳細なマッピング）
上記実施例５で述べた所見を、推定上のＡＰ３３エピトープ内の全ての位置で１個の残基をアラニンによって置換した、Ｈ７７ Ｅ１Ｅ２突然変異型クローンのパネルを用いる実験によってさらに強化した。このパネルはまた、同じエピトープに結合すると記述されている（Ｆｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ，１９９９ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，６２３５−６２４４）、ラットモノクローナル抗体３／１１の結合を検討するためにも使用した。３／１１及びＡＰ３３は、どちらもプロテインＧカラムを用いてハイブリドーマ上清から精製した。
【０２０２】
様々なＥ１Ｅ２突然変異型がＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現され、生じたタンパク質のＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１に対する反応性を、ＧＮＡ捕獲ＥＩＡを用いて評価した（図９）。突然変異型Ｌ４１３Ａ、Ｎ４１５Ａ、Ｇ４１８Ａ及びＷ４２０Ａに関するＡＰ３３の結合は、野生型と比較して７５％より多く低下し、これらの残基が結合のために非常に重要であることを指示した。突然変異型Ｔ４１６Ａ及びＮ４１７ＡもＡＰ３３結合を低下させたが、この作用はその他の４つの突然変異型に関するほど著明ではなかった。４１２位のアラニンによるグルタミンの置換（Ｑ４１２Ａ）は、ＡＰ３３のＥ１Ｅ２への結合を一貫して増強し、野生型Ｈ７７タンパク質と比較して約５０％上昇させた。これに対し、この置換はＭＡｂ ３／１１結合には影響を及ぼさなかった。残りの５残基のアラニン置換は、ＡＰ３３認識に対して無視し得る程度の作用しか及ぼさなかった。
【０２０３】
野生型Ｈ７７タンパク質と比較してＭＡｂ ３／１１による結合の一貫した有意の低下は、突然変異型Ｎ４１５Ａ、Ｗ４２０Ａ及びＨ４２１Ａに関して認められ、ＭＡｂ ３／１１による結合におけるこれらの残基の重要性を強調した（簡潔さのためにデータは省いている）。４２２位のイソロイシンの置換は３／１１結合の中等度の増強を生じさせた。残りの残基のアラニン置換は、影響を及ぼさないか又は野生型と比較して中等度の結合低下を生じさせた。
【０２０４】
（ＭＡｂ ＡＰ３３とＭＡｂ ３／１１の結合親和性及びＨＣＶpp中和効率の比較）
詳細なエピトープマッピング実験は、ＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１がＥ２タンパク質内の異なる接触残基を認識していることを示唆したので、本発明者らは、これらの相違が結合親和性又は中和効力の差へと翻訳され得るのかどうかを評価することへと進んだ。４１２〜４２３分枝ペプチドへの５０％結合を得るために必要なＭＡｂ ＡＰ３３の濃度は、ＭＡｂ ３／１１に関して必要な濃度よりも１０より多く低かった（図１０：ＡＰ３３＝丸、３／１１＝三角）。同様に、ビオチニル化ＭＡｂ結合アッセイにおいて、ＡＰ３３は結合のための競合において３／１１よりも効率的であった（データは示していない）。ＭＡｂ ３／１１と比較して、ＭＡｂ ＡＰ３３による競合は、ビオチニル化ＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１の両方による結合のより大きな低下を生じさせた。前記ＭＡｂはまた、様々なＨＣＶ遺伝子型を代表するＥ１Ｅ２への親和性の著明な差を示した（図１１）。Ｅ１Ｅ２タンパク質への５０％結合を得るために必要なＭＡｂ ＡＰ３３の濃度は約１×１０1〜１×１０3ｎｇ／ｍｌの範囲であったが、一方約１×１０2〜１×１０4ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度の３／１１を使用して５０％結合が達成可能であった。合わせて考慮すると、これらのデータは、ＡＰ３３がＭＡｂ ３／１１よりもＥ２に対してより高い親和性を有することを指し示す。
【０２０５】
同様に、遺伝子型１〜６を代表するＥ１Ｅ２を担持するＨＣＶppを中和するＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１の能力の比較（図１２）は、両方の抗体が広い中和能を有するが、ＡＰ３３の中和効力はＭＡｂ ３／１１よりも一貫して高かった（ｐ＜０．００１、ウィルコクソンのマッチドペア検定）。５０μｇ／ｍｌの濃度で使用したとき、ＭＡｂ ＡＰ３３はＨＣＶppの感染力を８０〜９９％中和することができた。これに対し、ＭＡｂ ３／１１の同じ濃度は１０〜８０％の中和だけを生じさせた。本明細書で述べるように、ＭＡｂ ＡＰ３３は遺伝子型５のＵＫＮ５．１４．４系統からのＥ１Ｅ２を担持するＨＣＶppをほとんど中和しなかった。同様にＭＡｂ ３／１１もこのＥ１Ｅ２クローンを担持するＨＣＶppを中和することができなかった。この単離物は、残基４１２〜４２３に対応するＥ２領域内に４アミノ酸変化（ＱＬＩＱＮＧＳＳＷＨＩＮ）を有する。この突然変異は、ＡＰ３３認識のために重要な残基のうちの２個（Ｎ４１５とＧ４１８）及び３／１１にとって重要な１個（Ｎ４１５）を変化させる。ＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１のどちらも、ＵＫＮ５．１５．４ Ｅ２と反応することができない。従って、驚くべきことではないが、両方のＭＡｂはまたＵＫＮ５．１４．４ ＨＣＶppも中和することができない。
【実施例７】
【０２０６】
（ＡＰ３３及び３／１１のＶH及びＶL領域の配列分析）
約１０6ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡを、製造者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。全ＲＮＡ４μｌを、キットに含まれるポリ−ｄＴオリゴヌクレオチドプライマーと共にＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）を使用して逆転写した。生じた２μｌのｃＤＮＡを、軽及び重鎖の可変領域を増幅するために設計したＰＣＲにおける鋳型として使用した。
【０２０７】
重鎖の増幅は、センスプライマーＶＨｌＢＡＣＫ （５’−ＡＧＧ ＴＳＭ ＡＲＣ ＴＧＣ ＡＧＳ ＡＧＴ ＣＷＧ Ｇ−３’）とアンチセンスプライマーＶＨ１ＦｏＲ−２ （５’−ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＣＡ ＣＧＧ ＴＣＡ ＣＣＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡ−３’）及びＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、先に述べられているように（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｉｎ：「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」．Ｅｄ．Ｋａｙ ｅｔ ａｌ １９９６，ｐ７９−１１１）実施した。軽鎖の増幅は、プライマーＭｋ（５’−ＧＧＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＡＹＡ ＴＴＧ ＴＧＭ ＴＳＡ ＣＭＣ ＡＲＷ ＣＴＡ ＭＣＡ−３’）と逆プライマーＫｃ（５’−ＧＧＴ ＧＣＡ ＴＧＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ−３’）を使用して先に述べられているように（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０００ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３，１６７−１７７）実施した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてカラム精製し、次にｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクター系を製造者の推奨に従って使用して、Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクターにクローニングした。重及び軽鎖の各々について２個のクローンを、Ｔ７正プライマー及びＭ１３逆プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造者のプロトコールに従って配列決定した。ＡＰ３３について決定したヌクレオチド配列を図７に示す。
【０２０８】
（結果）
ＭＡｂ ＡＰ３３及び３／１１の軽及び重鎖可変領域に対応する推定アミノ酸配列を比較した。この比較の最も著しい特徴は、ＭＡｂ ＡＰ３３についての重鎖ＣＤＲ３が１０個の、主として疎水性のアミノ酸を含むことであった。これに対し、ＭＡｂ ３／１１の重鎖ＣＤＲ３は３個のアミノ酸だけを含んだ。ＩｇＢＬＡＳＴ検索は、ＭＡｂ ＡＰ３３の重及び軽鎖がマウスＶＨ−３６−６０、サブグループＶＨ−Ｉ（アクセッション番号Ｋ０１５６９）及びＶＫ−２１−１０（アクセッション番号Ｋ０２１６０）に最も類似することを明らかにした。３／１１配列の生殖細胞系分析は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで入手可能なラット生殖細胞系配列が少ないため不可能であった。
【実施例８】
【０２０９】
（ＨＣＶの中和）
本実施例では、ＡＰ３３がＨＣＶウイルスを中和できることを示す。
【０２１０】
キメラＨＣＶ Ｊ６−ＪＦＨ１ゲノムｃＤＮＡの作製。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流の完全長ＨＣＶ遺伝子型２ａ ＪＦＨ１系統のｃＤＮＡを担持するプラスミドｐＪＦＨ１は、Ｔ．Ｗａｋｉｔａ（Ｗａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１，７９１−７９６）によって本発明者らに供給された。キメラ構築物を作製するため、ＪＦＨ１系統ｃＤＮＡのＮＳ２のコア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７及びＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列を、もう１つ別の遺伝子型２ａ Ｊ６ＣＦ系統からのヌクレオチド配列で置換した（Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６２，２５０−２６３）。Ｊ７１と称される、生じたキメラＪ６−ＪＦＨ１構築物から生成された感染性ウイルスを、以下で述べるウイルス中和アッセイにおいて使用した。
【０２１１】
（ＨＣＶ Ｊ７１ ＲＮＡトランスフェクション及び細胞培養におけるウイルス生産）Ｊ７１構築物を、ウイルスゲノムｃＤＮＡの３’末端の直後に位置する制限酵素部位での切断によって線状化した。ＨＣＶ Ｊ７１ ＲＮＡを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｍｂｉｏｎ）を製造者によって述べられているように使用して、線状化構築物からインビトロで転写した。約１０μｇのインビトロ合成したＪ７１ ＲＮＡを、０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）においてＨｕｈ−７細胞と混合し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）電気穿孔装置を使用して９６０μＦ、２７０Ｖで１回パルスした。トランスフェクトした細胞を直ちに細胞培地と混合し、８０ｃｍ2フラスコ及びカバーガラスに接種した。３７℃で４日間のインキュベーション後、フラスコからの培地を収集し、細胞デブリを除去するための短時間の遠心分離によって清澄化して、０．４５μｍ細孔径の膜でろ過し、ナイーブＨｕｈ−７細胞を感染させるために使用した。３７℃で４日間のインキュベーション後、感染細胞は、電気穿孔細胞から収集した培地中に感染性ウイルス子孫が存在することを確認するウイルス抗原を含むことを見出した。カバーガラス上の電気穿孔細胞を固定し、間接免疫蛍光検査法によってウイルスタンパク質の存在を判定した。
【０２１２】
第７継代まで細胞の大部分が複製ウイルスゲノムを内包するように電気穿孔細胞を継代したとき、ウイルス抗原陽性細胞の数が上昇することが認められた。
【０２１３】
（ＨＣＶ中和アッセイ）
細胞培養産生ＨＣＶ Ｊ７１ウイルスを、第１０継代のウイルスＲＮＡトランスフェクトＨｕｈ−７細胞の培地から採集し、清澄化して、上述したようにろ過し、以下で述べるようにウイルス中和アッセイにおいて使用した。ウイルスを含む培地を、２００、４０、８、１．６、０．３２、０．０６４μｇ／ｍｌの精製ＭＡｂ ＡＰ３３又は３／１１と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次に各々のウイルス−抗体混合物を、１０-1〜１０-7の範囲で、完全培地中で連続的に１０倍希釈した。各々の希釈溶液を、４８穴組織培養皿中のＨｕｈ−７細胞を感染させるために使用し（各希釈溶液につき６穴）、細胞を３７℃で３時間インキュベートした後、接種物を除去し、細胞に新鮮培地を再供給して、３７℃で４日間インキュベートした。その後細胞をＰＢＳで１回洗い、メタノールで固定して、ヒツジ抗ＮＳ５ａ抗血清（Ｍａｒｋ Ｈａｒｒｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｅｄｓの好意により提供された）を使用してウイルスＮＳ５ａをプローブし、抗ヒツジＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を使用して結合抗体を検出した。穴を蛍光細胞の存在又は非存在に関して記録し、ウイルスの感染力を、基本的にＬｉｎｄｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９，６２３−６２６によって述べられたようにＴＣＩＤ50（組織培養感染量）として測定した。
【０２１４】
（考察）
これまでの試験は、非常に限られた範囲のＨＣＶ遺伝子型だけに対する血清又は抗体の中和能力を測定していた（５、２１、３０）。本発明者らは、主要遺伝子型１〜６の全てを代表するＥ１Ｅ２を担持するＨＣＶppを中和する一連のＥ２特異的抗体及び血清の能力を評価するためにＨＣＶppアッセイを使用した。
【０２１５】
主要遺伝子型全てを代表する機能性Ｅ１Ｅ２クローンのパネルを確立したので、本発明者らは、ＭＡｂ ＡＰ３３及びＨ７７ｃ系統のＥ２タンパク質のＨＶＲ１領域又は細胞外部分のいずれかに対して惹起したウサギ抗血清の、ＨＣＶppの侵入を中和する能力を評価することへと進んだ。Ｅ２のＨＶＲ１及び細胞外ドメインに対して惹起したウサギ抗血清は、どちらも、Ｈ７７ｃ Ｅ１Ｅ２を組み込んだＨＣＶppを中和することができたが、同じ免疫原で免疫したウサギの間での中和効力の差は明白であった。しかし、どちらも、異種遺伝子型１ａ Ｅ１Ｅ２を組み込んだＨＣＶppの低い中和を示し、試験した他の遺伝子型由来のＥ１Ｅ２を含むＨＣＶppを中和しなかった。ＨＶＲ１の高度の遺伝的多様性は観察された低い交差中和を説明し、この所見は、天然ＨＶＲ１特異的抗体の限られた中和能力という以前の報告と一致する（７６）。Ｅ２細胞外ドメインによるウサギの免疫も中和抗体の誘導を生じさせたが、やはりこれらの応答は高度に系統特異的であった。ペプチドマッピング及び競合アッセイは、最も強力な中和血清（Ｒ６４６）が立体配座及び線状決定基の両方を認識することを示した。中和は、天然であるが変性したｓＥ２によって阻害することができ、中和抗体が立体配座エピトープを認識する可能性が高いことを示唆した。
【０２１６】
これまでの研究は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質による免疫後に惹起される抗体が、同種攻撃誘発に対して少なくとも部分的に保護し得ることを示した（３３、５９）。同様に、多くの広範に中和するヒトモノクローナル抗体が記述されており、それらの全てが立体配座エピトープを認識する（１、９、３７、３８、４０、４２）。これらの抗体は、ＨＣＶ感染の治療における将来的な役割を有し得る。それらはまた、将来のワクチン候補を定義するためにも役立つと考えられる。しかし、ＨＩＶ−１に関する試験は、広範な中和抗体によって認識されるエピトープに免疫応答を集中させることが重要な課題であることを示した。これに関して、ＡＰ３３が極めて多様なＥ１Ｅ２を担持するＨＣＶppの侵入を強力に中和するという所見は、そのエピトープが線状であり、ＨＣＶの種々の遺伝子型にわたって高度に保存されているので、重要である。ＡＰ３３によって認識されるエピトープは、残基４１２〜４２３（配列ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮによって実証される）に位置づけられ、１つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を担持する（５２）。１個の遺伝子型５単離物（ＵＫＮ５．１４．４）に由来するＨＣＶppが、感染性であるが、ＭＡｂ ＡＰ３３によって認識されなかった（従って中和されなかった）ことに留意するのは興味深い。この単離物は、その他の単離物と比較して−１シフトした、良好に保存されたＮ結合グリコシル化部位と、ＡＰ３３エピトープに対応するＥ２領域内に４アミノ酸変化を有していた（ＱＬＩＱＮＧＳＳＷＨＩＮ）。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに寄託した配列のその後の分析は、ＡＰ３３エピトープが高度に保存されていることを示した。原型ＡＰ３３エピトープと比較した配列の平均多様性は４．７％であり、可変アミノ酸の大部分は予測エピトープのＮ末端に位置した。重要な点として、ＵＫＮ５．１４．４内に存在するものと類似の配列は明らかではなかった。本発明者らの予備的なデータは、４個の変異アミノ酸の１個の、その保存された対応物への復帰（すなわちＱからＮへ）はＵＫＮ５．１４．４ ＨＣＶppを非感染性にし（ＭＡｂ ＡＰ３３に対しても非反応性のままである）（示していない）、従って感染におけるＥ２のこの領域の潜在的重要性を強調する。この所見は、ＵＫＮ５．１４．４ ＨＣＶppの感染力がＮ４１５Ｑ及びＮ結合グリコシル化配列の−１シフトによって影響されないという事実と共に、この特定単離物が中和回避突然変異体を表し得ることを示唆する。
【０２１７】
結論として、本発明者らは、ＡＰ３３抗体によって定義されるエピトープが全ての主要遺伝子型にわたって高度に保存されていること及びこの抗体が広い中和能力を有することを示した。
【０２１８】
（参考文献）
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【０２１９】
上記明細書において言及した全ての刊行物は、参照により本明細書の一部をなすものとする。記述した方法及び本発明のシステムの様々な修正及び変法が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明白である。本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明したが、特許請求される本発明がそのような特定実施形態に不当に限定されるべきでないことは了解されるべきである。実際に、分子生物学又は関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するための記述した様式の様々な修正は、特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１ａ】様々なＥＬＩＳＡの結果を表しており、希釈倍率に対する吸光度（任意の単位）の一連のグラフを示す。
【図１ｂ】抗Ｅ２ ＭＡｂ ＡＰ３３とＡＬＰ９８の混合物によって免疫沈降させた放射性標識ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左側の数字は分子量マーカーを示す。
【図２ａ】様々な抗血清及び免疫前対照血清（「ＰＩ」接尾辞）又はＭＡｂ ＡＰ３３によるＨＣＶ遺伝子型１偽粒子の中和の程度を示す棒グラフを示す。縦軸は、蛍光細胞（感染した細胞）の割合（％）を示す。
【図２ｂ】様々な抗血清又はＭＡｂ ＡＰ３３による遺伝子型１Ａ、１Ｂ、２Ａ及び２Ｂ ＨＣＶppの中和の程度を示すグラフである。
【図２ｃ】遺伝子型１Ａ ＨＣＶサブタイプに対する抗血清Ｒ６４６についての濃度と中和との関係を示すグラフである。
【図３】種々のＨＣＶ遺伝子型に対するＭＡｂ ＡＰ３３の濃度と中和との関係を示すグラフである。
【図４ａ】６つの公知の遺伝子型の各々を代表する様々なＨＣＶ単利物のＥ２のタンパク質のアミノ酸配列の一部を示す。
【図４ｂ】６つの公知の遺伝子型の各々を代表する様々なＨＣＶ単利物のＥ２のタンパク質のアミノ酸配列の一部を示す。
【図５】ＥＩＡアッセイにおける、抗体ＡＰ３３（白い棒）及びＡＬＰ９８（黒い棒）と様々な選択ファージとの反応性を示す棒グラフである。
【図６】様々なファージクローンによって発現されるペプチドの推定アミノ酸配列（パネルＡ）及びＨＣＶ Ｈ７７ Ｅ２タンパク質の対応する部分とのアラインメント（パネルＢ）を示す。
【図７】ＡＰ３３モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の可変領域をコードするハイブリドーマから本発明者らによって誘導されたヌクレオチド配列（プライマー決定配列は省いている）を示す。
【図８】軽鎖及び重鎖可変領域に関する、ＡＰ３３ハイブリドーマからクローニングしたｃＤＮＡから得たＤＮＡ配列（下段ＤＮＡ配列）及び使用したプライマーのＤＮＡ配列（上段）を示す。推定アミノ酸配列をＤＮＡ配列の上部に示す。ＣＤＲを構成するアミノ酸配列基を下線で示す。付加的な残基（「Ｘ」）が重鎖のフレームワーク領域１の開始部に存在すると考えられる。
【図９】野生型Ｅ１Ｅ２配列への結合と比較した、ＥＩＡによって判定したときの、Ｅ１Ｅ２タンパク質の様々なアラニン含有突然変異型へのＡＰ３３の結合の量を示す棒グラフである。
【図１０】関連ペプチドへのＡＰ３３（丸記号）及び３／１１（三角記号）の結合を比較した、抗体濃度と結合の割合（％）との関係を示すグラフである。
【図１１】種々のＨＣＶ遺伝子型Ｅ１Ｅ２タンパク質に結合するときのＡＰ３３（丸）及び３／１１（三角）についての抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）と結合する割合（％）の関係を示す一連のグラフである。
【図１２】５０μｇ／ｍｌの最終濃度でＡＰ３３（黒いバー）又は３／１１（白いバー）に暴露したときの、種々のＨＣＶ遺伝子型を表わす様々なＨＣＶppクローンに関する感染力の割合を示す棒グラフである。
【図１３】ＡＰ３３（黒丸）及び３／１１（白丸）モノクローナル抗体によるＨＣＶ Ｊ７１の中和を示すグラフである。無関係なモノクローナル抗体ＤＢ１６５（黒い三角）及び抗体なし（白い三角）を対照として示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定義されるＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドのエピトープに結合することができるリガンドを、遺伝子型１〜６の各々のＨＣＶによる感染の予防又は治療のための組成物の製造に使用する方法。
【請求項２】
前記リガンドが、配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（Ｘ1〜7はアミノ酸である）を有するポリペプチドエピトープに結合することができるものである請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
前記Ｘ1が、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｐ及びＬからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項４】
前記Ｘ2が、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＦからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項５】
前記Ｘ3が、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｌ又はＡからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項６】
前記Ｘ4が、Ｎ、Ｑ又はＧからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項７】
前記Ｘ5が、Ｓ、Ｋ又はＴからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項８】
前記Ｘ6が、Ｈ、ｒ又はＱからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項９】
前記Ｘ7が、Ｉ、Ｌ、Ｆ又はＰからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドエピトープが、ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＩＮＳＮＧＳＷＨＩ、ＳＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＥＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＨＬＡＮＨＱＧＫＷＲＬ、ＰＬＦＮＡＮＧＴＷＱＦ及びＥＬＲＮＬＧＧＴＷＲＰからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項１１】
前記リガンドが免疫グロブリンである請求項１に記載の使用方法。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）分子からなる群より選択される免疫グロブリンフラグメントである請求項１１に記載の使用方法。
【請求項１３】
前記リガンドが、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１又は複数のＣＤＲを含むものである請求項１１又は１２に記載の使用方法。
【請求項１４】
前記１又は複数のＣＤＲが、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列から１、２又は３個のアミノ酸が付加、置換又は欠失した配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在する場合、（ａ）に示す配列に構造的に類似する配列からなる群より選択される請求項１３に記載の使用方法。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンが、ヒト化、薄板化、再表面作成、ＣＤＲ移植、ＳＤＲ移入又は脱免疫化免疫グロブリンである請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１６】
ＨＣＶによる脊椎動物細胞の感染の予防のための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１７】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶによる感染の予防又は治療のための方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１８】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶによる感染の予防又は治療のための方法であって、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の免疫グロブリンの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１９】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶに属するＨＣＶ単離物を中和する免疫グロブリン分子であって、前記免疫グロブリンはモノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１又は複数のＣＤＲを含み、前記免疫グロブリン分子はモノクローナル抗体ＡＰ３３以外である、免疫グロブリン分子。
【請求項２０】
前記１又は複数のＣＤＲが、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列から１、２又は３個のアミノ酸が付加、置換又は欠失した配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在する場合、（ａ）に示す配列に構造的に類似する配列からなる群より選択される請求項１９に記載の免疫グロブリン分子。
【請求項２１】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶに属するＨＣＶ単離物を中和する免疫グロブリン分子であって、前記免疫グロブリン分子は配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（Ｘ1〜7はアミノ酸である）を有するポリペプチドエピトープに結合することができるものであり、前記免疫グロブリンはモノクローナル抗体ＡＰ３３以外である、免疫グロブリン分子。
【請求項２２】
１又は複数のヒトフレームワーク領域を含む請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
【請求項２３】
ヒト化、薄板化、再表面作成、ＣＤＲ移植、ＳＤＲ移入又は脱免疫化免疫グロブリンである請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
【請求項２４】
１又は複数のヒトＣＤＲを含む請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２糖タンパク質に結合する抗体を誘導するための組成物であって、前記組成物はアミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸを有するペプチド及び生理的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含み、前記ペプチドは、場合によりＮ及び／又はＣ末端に付加的なアミノ酸残基を含むが、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質全体又はそのＥ２660フラグメント（すなわちＨＣＶポリタンパク質の残基３８４〜６６０）を包含せず、アミノ酸残基の１又は複数が共有結合修飾されていてもよい、組成物。
【請求項２７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（Ｘ1はＳ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｐ及びＬからなる群より選択され、Ｘ2はＶ、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＦからなる群より選択され、Ｘ3はＳ、Ｔ、Ｈ、Ｌ及びＡからなる群より選択され、Ｘ4はＮ、Ｑ及びＧからなる群より選択され、Ｘ5はＳ、Ｋ及びＴからなる群より選択され、Ｘ6はＨ、ｒ及びＱからなる群より選択され、及びＸ7はＩ、Ｌ、Ｆ及びＰからなる群より選択される）を含む請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ペプチドが、ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＩＮＳＮＧＳＷＨＩ、ＳＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＥＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＨＬＡＮＨＱＧＫＷＲＬ、ＰＬＦＮＡＮＧＴＷＱＦ及びＥＬＲＮＬＧＧＴＷＲＰからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ペプチドが、Ｔ細胞エピトープ及び／又はさらにＢ細胞エピトープを付加的に含む請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ペプチドが、一般配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに一致するアミノ酸残基配列の１又は複数の反復を含む請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ペプチドが、配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに一致する２以上の非同一アミノ酸残基配列を含む請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ペプチドが融合タンパク質の一部として存在するものである請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物が分枝ペプチドを含む請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
アジュバントをさらに含む請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の組成物に使用されるペプチドをコードする核酸構築物。
【請求項３６】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶに属するＨＣＶの存在を検出するためのキットであって、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１又は複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンを含むキット。
【請求項３７】
前記１又は複数のＣＤＲが、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列から１、２又は３個のアミノ酸が付加、置換又は欠失した配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在する場合（ａ）に示す配列と構造的に類似する配列からなる群より選択される請求項３６に記載のキット。
【請求項１】
モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定義されるＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドのエピトープに結合することができるリガンドを、遺伝子型１〜６の各々のＨＣＶによる感染の予防又は治療のための組成物の製造に使用する方法。
【請求項２】
前記リガンドが、配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（Ｘ1〜7はアミノ酸である）を有するポリペプチドエピトープに結合することができるものである請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
前記Ｘ1が、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｐ及びＬからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項４】
前記Ｘ2が、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＦからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項５】
前記Ｘ3が、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｌ又はＡからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項６】
前記Ｘ4が、Ｎ、Ｑ又はＧからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項７】
前記Ｘ5が、Ｓ、Ｋ又はＴからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項８】
前記Ｘ6が、Ｈ、ｒ又はＱからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項９】
前記Ｘ7が、Ｉ、Ｌ、Ｆ又はＰからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドエピトープが、ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＩＮＳＮＧＳＷＨＩ、ＳＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＥＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＨＬＡＮＨＱＧＫＷＲＬ、ＰＬＦＮＡＮＧＴＷＱＦ及びＥＬＲＮＬＧＧＴＷＲＰからなる群より選択される請求項２に記載の使用方法。
【請求項１１】
前記リガンドが免疫グロブリンである請求項１に記載の使用方法。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）分子からなる群より選択される免疫グロブリンフラグメントである請求項１１に記載の使用方法。
【請求項１３】
前記リガンドが、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１又は複数のＣＤＲを含むものである請求項１１又は１２に記載の使用方法。
【請求項１４】
前記１又は複数のＣＤＲが、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列から１、２又は３個のアミノ酸が付加、置換又は欠失した配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在する場合、（ａ）に示す配列に構造的に類似する配列からなる群より選択される請求項１３に記載の使用方法。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンが、ヒト化、薄板化、再表面作成、ＣＤＲ移植、ＳＤＲ移入又は脱免疫化免疫グロブリンである請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１６】
ＨＣＶによる脊椎動物細胞の感染の予防のための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１７】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶによる感染の予防又は治療のための方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１８】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶによる感染の予防又は治療のための方法であって、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の免疫グロブリンの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１９】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶに属するＨＣＶ単離物を中和する免疫グロブリン分子であって、前記免疫グロブリンはモノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１又は複数のＣＤＲを含み、前記免疫グロブリン分子はモノクローナル抗体ＡＰ３３以外である、免疫グロブリン分子。
【請求項２０】
前記１又は複数のＣＤＲが、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列から１、２又は３個のアミノ酸が付加、置換又は欠失した配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在する場合、（ａ）に示す配列に構造的に類似する配列からなる群より選択される請求項１９に記載の免疫グロブリン分子。
【請求項２１】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶに属するＨＣＶ単離物を中和する免疫グロブリン分子であって、前記免疫グロブリン分子は配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（Ｘ1〜7はアミノ酸である）を有するポリペプチドエピトープに結合することができるものであり、前記免疫グロブリンはモノクローナル抗体ＡＰ３３以外である、免疫グロブリン分子。
【請求項２２】
１又は複数のヒトフレームワーク領域を含む請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
【請求項２３】
ヒト化、薄板化、再表面作成、ＣＤＲ移植、ＳＤＲ移入又は脱免疫化免疫グロブリンである請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
【請求項２４】
１又は複数のヒトＣＤＲを含む請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２糖タンパク質に結合する抗体を誘導するための組成物であって、前記組成物はアミノ酸残基配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸを有するペプチド及び生理的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含み、前記ペプチドは、場合によりＮ及び／又はＣ末端に付加的なアミノ酸残基を含むが、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質全体又はそのＥ２660フラグメント（すなわちＨＣＶポリタンパク質の残基３８４〜６６０）を包含せず、アミノ酸残基の１又は複数が共有結合修飾されていてもよい、組成物。
【請求項２７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ1ＬＸ2ＮＸ3Ｘ4ＧＸ5ＷＸ6Ｘ7（Ｘ1はＳ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｐ及びＬからなる群より選択され、Ｘ2はＶ、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＦからなる群より選択され、Ｘ3はＳ、Ｔ、Ｈ、Ｌ及びＡからなる群より選択され、Ｘ4はＮ、Ｑ及びＧからなる群より選択され、Ｘ5はＳ、Ｋ及びＴからなる群より選択され、Ｘ6はＨ、ｒ及びＱからなる群より選択され、及びＸ7はＩ、Ｌ、Ｆ及びＰからなる群より選択される）を含む請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ペプチドが、ＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＱＬＩＮＳＮＧＳＷＨＩ、ＳＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＥＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＨＬＡＮＨＱＧＫＷＲＬ、ＰＬＦＮＡＮＧＴＷＱＦ及びＥＬＲＮＬＧＧＴＷＲＰからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ペプチドが、Ｔ細胞エピトープ及び／又はさらにＢ細胞エピトープを付加的に含む請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ペプチドが、一般配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに一致するアミノ酸残基配列の１又は複数の反復を含む請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ペプチドが、配列ＸＬＸＮＸＸＧＸＷＸＸに一致する２以上の非同一アミノ酸残基配列を含む請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ペプチドが融合タンパク質の一部として存在するものである請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物が分枝ペプチドを含む請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
アジュバントをさらに含む請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の組成物に使用されるペプチドをコードする核酸構築物。
【請求項３６】
遺伝子型１〜６のいずれかである２以上のＨＣＶに属するＨＣＶの存在を検出するためのキットであって、モノクローナル抗体ＡＰ３３に由来する１又は複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンを含むキット。
【請求項３７】
前記１又は複数のＣＤＲが、
（ａ）ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ、ＬＡＳＮＬＮＳ、ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ、ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ又はＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹからなる配列、
（ｂ）（ａ）に示す配列から１、２又は３個のアミノ酸が付加、置換又は欠失した配列、及び
（ｃ）前記ＣＤＲが免疫グロブリン内に存在する場合（ａ）に示す配列と構造的に類似する配列からなる群より選択される請求項３６に記載のキット。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５３２５５９（Ｐ２００８−５３２５５９Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０２４５６（Ｐ２００８−５０２４５６）
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００９８７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１００４４９
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５９７１６６５７８）メディカル リサーチ カウンシル (60)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００９８７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１００４４９
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５９７１６６５７８）メディカル リサーチ カウンシル (60)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]