エラスチン分解ペプチド並びにエラスチン及びその酵素分解ペプチドの製造方法
【課題】 豚大動脈血管を原料として得られるエラスチンの酵素分解ペプチド並びに豚大動脈血管由来エラスチン及びその酵素分解ペプチドの製造方法を提供する。
【解決手段】 本発明のエラスチン酵素分解ペプチドは豚大動脈血管に由来するものであり、そのアミノ酸組成をヒトエラスチンに近いものとすることができる。更に豚大動脈血管は原料として豊富に存在し、しかも従来は廃棄されていたものであるので、コスト的に有利である。また、本発明のエラスチン及びその酵素分解ペプチドの製造方法は、豚大動脈血管からエラスチン及びその酵素分解ペプチドを効率的に製造する方法である。
【解決手段】 本発明のエラスチン酵素分解ペプチドは豚大動脈血管に由来するものであり、そのアミノ酸組成をヒトエラスチンに近いものとすることができる。更に豚大動脈血管は原料として豊富に存在し、しかも従来は廃棄されていたものであるので、コスト的に有利である。また、本発明のエラスチン及びその酵素分解ペプチドの製造方法は、豚大動脈血管からエラスチン及びその酵素分解ペプチドを効率的に製造する方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚大動脈血管を原料として得られるエラスチンの酵素分解ペプチド並びに当該エラスチン及びその酵素分解ペプチドの製造方法に関する。係るエラスチン酵素分解ペプチドは健康食品素材としてだけでなく、化粧品素材や医療用素材としても有用である。
【背景技術】
【０００２】
エラスチンは皮膚、血管、肺、腱などにおいてコラーゲンなどの結合組織成分とともに存在する蛋白質であり、組織としての構造を保持するほか、組織の様々な形状変化に対応できる弾力性を与える役割を担っている。エラスチンのアミノ酸残基の約９５％が非極性アミノ酸であり、デスモシン及びイソデスモシンが特徴的に含まれ、またコラーゲンに較べてヒドロキシプロリン含量が少ないという特徴を有する。デスモシン及びイソデスモシンによる架橋構造を有することから酸やアルカリに対して強い耐性を有する。
エラスチンは、皮膚真皮部分のコラーゲンに絡みつくようにして存在し、その伸縮性から肌に弾力を与えてハリを維持しており、エラスチンの減少は皮膚のシワ、タルミなどの原因となる。そのため、エラスチン及びその分解ペプチドは外用又は経口の皮膚老化防止・改善剤として有用であることが知られている（特許文献１、２など参照）。
また、血管の弾性維持や創傷治癒にも効果があることから、医療の分野での利用も注目されている。
【特許文献１】特開２００１−７２５７２公報
【特許文献２】特開２００６−１４３６７１公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
エラスチン及びその分解ペプチドは、化粧品、食品、医療などの分野で利用されている物質であり、エラスチンの原料として、牛項靭帯や魚類の皮膚や動脈球が使用されてきた。
より具体的には、従来、エラスチン高含有の組織として牛項靭帯が知られており、エラスチンは牛項靭帯より製造されていた。しかし、日本国内で牛海綿状脳症（ＢＳＥ）感染牛が発見され、牛由来のエラスチンペプチドは敬遠されるようになっている。
その代替として魚由来のエラスチンが利用されるようになった（特許文献３）。しかし、魚皮のエラスチン含量は少ない。エラスチン含量の高い動脈球の場合でも、一匹から採取できるエラスチン量は少ないことから、魚類動脈球由来エラスチン及びエラスチン分解ペプチドは高価となり、牛項靭帯の代替原料として十分とは言えない。
また、魚由来エラスチンは、牛項靭帯など哺乳類組織由来エラスチンに比べ、そのアミノ酸組成がヒトの皮膚や血管におけるエラスチンの組成とはかけ離れているため、化粧品や機能性素材としての効果にも疑問があった。
【特許文献３】特開２００５−３４３８５１公報
【０００４】
上記の課題から、豊富であり、ＢＳＥの問題が無く、ヒトのエラスチンと似た組成であり且つエラスチン濃度の高い原料が求められていた。
そこで、本発明者らは上記の条件を満たす原料を検討した結果、ヒトと同じ哺乳類であり、ＢＳＥの心配がない豚を原料にすることを想起した。しかし、牛エラスチンの原材料として用いられていた項靭帯は首の靱帯であるが、豚では首が短いため、項靱帯も小さく、原料として用いることが出来なかった。そこで、豚において、原材料となり得る部位を検討したところ、大動脈血管が最もエラスチンのトータル収量が高い組織であることを見出した。しかも、豚の大動脈血管は、現状では一部が食用として供される他は、そのほとんどが廃棄されており、これを原料とすることは、未利用の畜産資源を有効活用することにもつながる。
しかし、項靱帯に比べ、豚の大動脈血管は、エラスチン以外の種々の組織、成分が夾雑し、牛の項靱帯からエラスチンを精製する方法をそのまま適用しても、高純度のエラスチンを得ることが出来なかった。
また、豚の組織・臓器からエラスチンを精製する場合、異臭（獣臭）が発生し作業環境を悪化させる問題があり、ひいては精製したエラスチン及びその分解ペプチドにも異臭が残ることがあり、係る異臭の少ない高品質のエラスチンが求められていた。
【０００５】
このような問題点から、本発明者らは、豚の大動脈血管を原料にして、エラスチンと共存するコラーゲンなどの夾雑蛋白質を効果的に除去でき、高品質のエラスチンが得られ、しかも異臭を生じない精製条件を種々検討したところ、特定の条件で精製することにより所期の目的を達成できることが判明した。本発明は係る知見に基づくもので、高純度、高品質且つ異臭の少ない豚大動脈血管由来エラスチン酵素分解ペプチド並びに豚大動脈血管由来エラスチン及びその酵素分解ペプチドの製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、豚大動脈血管由来エラスチンの酵素分解物であるエラスチン分解ペプチドである。特に、アミノ酸組成（モル比）におけるデスモシン及び/又はイソデスモシンの含量が０．０６％以上であり、更にデスモシン含量とイソデスモシン含量の和/ヒドロキシプロリン含量の比（モル比）が０．１以上、より好ましくは０．２２以上、更に好ましくは０．２７以上であるエラスチン分解ペプチドが好ましい。
また、本発明のエラスチンの製造方法は、豚大動脈血管を、加熱下、０．０５〜０．５Ｎのアルカリ性水溶液で処理して豚大動脈血管由来エラスチンを得るものであり、更に当該エラスチンをプロテアーゼで酵素分解することから成るエラスチン酵素分解ペプチドの製造方法である。
更に、本発明の皮膚改善剤は、前記のエラスチン分解ペプチドを含有するものであり、特にコラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを含有することが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のエラスチン分解ペプチドは、豚大動脈血管に由来するものであり、哺乳類組織を原料とするので、そのアミノ酸組成をヒトエラスチンに近いものとすることができる。更に豚大動脈血管は原料として豊富に存在し、しかも従来は廃棄されていたものであるので、コスト的に有利である。
また、本発明のエラスチン及びエラスチン分解ペプチドの製造方法によれば、高純度のエラスチン及びエラスチン分解ペプチドが得られるのみならず、製造時に発生する異臭を防止又は抑制でき、作業環境の改善を図ることができ、更に得られたエラスチン及びエラスチン分解ペプチドの異臭を低減できる。
更に、本発明の皮膚改善剤は、前記のエラスチン分解ペプチド並びに必要に応じてコラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを含有するものであり、経口的に摂取するか又は外用的に投与（塗布）することにより、肌に弾力を与えてハリを維持し、皮膚のシワ、タルミなどを予防・改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
前記のとおり、本発明のエラスチン分解ペプチドは、豚大動脈血管由来エラスチンを酵素的に分解したペプチドであり、種々の製法により調製することができるが、本発明のエラスチン及びエラスチン分解ペプチドの製造方法に準じて調製するのが好ましい。
即ち、本発明のエラスチンの製造方法は、豚大動脈血管を加熱下、０．０５〜０．５Ｎのアルカリ性水溶液で処理してエラスチンを得るものである。前述のように、エラスチンはアルカリ耐性を有するので、豚大動脈血管をアルカリ性溶液で処理すると、コラーゲンはゼラチン化して可溶化し、また他の夾雑物質（例えば蛋白質）も可溶化するので、反応液から不溶性物質を採取することにより豚エラスチンを選択的に得ることができる。
しかし、前記のとおり、豚などの家畜組織・臓器を原料として素材精製を行う場合、異臭（獣臭）が発生し作業環境を悪化させる問題があり、ひいては精製したエラスチン及びその分解ペプチドにも異臭が残る問題がある。
【０００９】
そこで、係る問題を解決するために種々検討したところ、後記実施例１に示されるように、豚大動脈血管を、加熱下、０．０５〜０．５Ｎのアルカリ性水溶液で処理すると異臭の低減を図ることができると共にエラスチンの精製度を向上させ得ることが明らかとなった。
係る方法において、原料である豚大動脈血管は、豚を食肉加工する処理場（と殺場など）から得ることができる。特に、豚大動脈血管は、従来、廃棄処理されていた部分であり、廃棄物の有効利用を図ることができる。豚の種類（例えば、バークシャー種、三元交配種など）は特に限定されず、いずれの種類であってもよい。
更に、エラスチンの含量は加齢により劇的に減少する。例えば、ヒトの場合２０歳代を境に急減する。牛は通常２年半程度で出荷／と殺されるが、豚は通常６ヶ月程度で出荷／と殺される。従って、牛より豚の方がより若く、エラスチン含量も豊富で望ましい原材料と考えられる。
【００１０】
本発明のエラスチンの製造方法においては、豚大動脈血管をアルカリ性水溶液で処理する。アルカリ性物質としては特に限定されず、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属水酸化物などが利用されるが、操作性やコスト的な面からアルカリ金属水酸化物、特に水酸化ナトリウムを使用するのが好ましい。
アルカリ性水溶液としては、０．０５〜０．５Ｎの溶液が使用される。０．０５Ｎ未満では豚大動脈血管の分解が遅くなり、また０．５Ｎを超えると処理の際及びエラスチン調製物の異臭が強くなり好ましくない。
【００１１】
上記のアルカリ性水溶液は、原料である豚大動脈血管の湿重量に対し、０．５〜３倍量（重量比）、好ましくは１〜２倍量（重量比）が使用される。また、アルカリ性物質として、アルカリ金属水酸化物を使用する場合、豚大動脈血管１００重量部（湿重量）に対して０．００５〜０．０２５モルの割合で使用するのが好ましい。
【００１２】
係るアルカリ性水溶液による豚大動脈血管の処理は加温下に行われ、通常５０〜９５℃程度、好ましくは８０〜９０℃程度にて行われる。処理時間としては、アルカリ性水溶液のアルカリ濃度、コラーゲンや他の夾雑物質の分解程度により適宜調整することができるが、通常は０．５〜５時間程度、好ましくは１〜２時間程度である。
【００１３】
上記の処理により、豚大動脈血管の主成分であるコラーゲンはゼラチン化し、また他の夾雑物質も分解して可溶化するので、反応液の不溶性部分を回収し、必要に応じて水洗、塩水洗浄及び／又は酸洗浄することにより豚大動脈血管由来エラスチンを得ることができる。
【００１４】
なお、上記のアルカリ性水溶液処理が終了した後、反応液を慣用の酸（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸等）を用いて中和処理を行うのが好ましい。係る中和処理により、精製したエラスチンの精製度を高めることができる（後記実施例１参照）。
【００１５】
かくして得られた豚大動脈血管由来エラスチンをプロテアーゼで酵素的に分解することにより、エラスチン分解ペプチドが得られる。
ここで使用されるプロテアーゼは、エラスチンを分解し得る酵素であれば特に限定されず、例えばブロメライン、パパイン、トリプシン、ペプシン、エラスターゼなどを挙げることができるが、好ましくは微生物由来のアルカリ性プロテアーゼ（例えば、アルカラーゼ、ノボザイムＦＭ、プロテアーゼＰなど、いずれも商品名）が使用される。
当該酵素の使用量は、酵素の活性、反応温度、反応時間などに応じて適宜選択することができるが、基質（エラスチン）に対して酵素を、１：０．００５〜０．０５（重量比）、好ましくは１：０．０１（重量比）で使用される。
エラスチン分解ペプチドの分子量は、使用する酵素量、反応温度、反応時間、当該ペプチドの使用目的などにより適宜調整することができ、例えば、平均分子量３００〜８０００程度、好ましくは５００〜５０００程度、より好ましくは１０００〜３０００程度に調整される。
【００１６】
エラスチン分解ペプチドの調製法をより具体的に説明すると、豚大動脈血管由来エラスチンを、使用するプロテアーゼの至適ｐＨに調整した緩衝液又は精製水と混合し、次いで所定量のプロテアーゼを添加し、プロテアーゼの至適温度で適当な時間（例えば、２４時間程度）インキュベートしエラスチンを酵素分解する。分解後、加熱（例えば、９０℃で１０分間程度）して酵素を失活させ、放冷後、濾過して不溶物を除去し、必要に応じて珪藻土、活性炭などを用いた処理を行うことにより、エラスチン酵素分解ペプチド溶液が得られる。なお、上記の処理に際して、プロテアーゼとして、アルカリ性プロテアーゼを使用した場合、酵素反応の終了後に、反応液を慣用の酸剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸など）で中和、脱塩するのが好ましい。この操作により、得られたエラスチン酵素分解ペプチドの異臭を著しく低減することができる。
かくして得られたエラスチン酵素分解ペプチドは、更に、限外ろ過、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの慣用の方法で精製することができる。
更に、得られたエラスチン酵素分解ペプチド溶液は、凍結乾燥、通風乾燥などの慣用の方法で乾燥することにより、粉末化することができる。
【００１７】
上記の製法で得られた豚大動脈血管由来エラスチン及びその酵素分解物であるエラスチン酵素分解ペプチドは、エラスチンの特徴的アミノ酸であるデスモシン及び／又はイソデスモシンを、アミノ酸組成（モル比）において０．０６％以上含有しており、更にデスモシン（Ｄｅｓ）含量とイソデスモシン（Ｉｄｅ）含量の和/ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）含量の比（モル比）が０．１以上、より好ましくは０．２２以上、更に好ましくは０．２７以上であるという特徴を有していた。
【００１８】
本発明の皮膚改善剤は、上記の豚大動脈血管由来エラスチン分解ペプチドを有効成分として含有するものであり、更にコラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを含有することが好ましい。
上記コラーゲンの由来は特に限定されないが、豚由来コラーゲンが好適に使用される。コラーゲンの製法などは既に周知であり、市販のコラーゲンを使用してもよい。また、コラーゲン分解ペプチドは、前述のプロテアーゼを用いてコラーゲンを酵素分解して得られるペプチドであり、分子量１５０〜３０００程度、好ましくは分子量２５０〜２５００程度のペプチドが使用される。コラーゲン分解ペプチドは市販されているものを使用してもよい。
係るコラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドの上記エラスチン分解ペプチドに対する使用量は特に制限されないが、エラスチン分解ペプチドに対して、コラーゲンとコラーゲン分解ペプチドの合計量として０．５〜１００倍量（重量比）、好ましくは１〜５０倍量の割合で使用される。
【００１９】
本発明の皮膚改善剤は、経口摂取（投与）又は外用投与（塗布）のいずれの投与形態の剤であってもよい。
経口摂取（投与）の形態としては、食品（健康食品素材）、医薬品などの形態を例示できる。
食品（健康食品素材）としては、そのまま、固形状物又は飲食物などの種々の形態でヒトに摂取される。
固形状物としては、前記各成分を、必要に応じて、適宜の生理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）などの製剤上必要な成分と混合し、適宜な剤形の形態に調製することにより得られ、係る形態としては錠剤状、粉末状、顆粒状、カプセル剤状などが例示できる。
【００２０】
また、飲食物としては、例えば、飲料類（例えば、ドリンク剤、乳酸菌飲料、ミルク飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、ジュース等）、菓子類（例えば、ビスケット、クッキー、キャンディー、スナック菓子、ラムネ菓子等）、調味液類（例えば、たれ汁等）、食肉製品類（例えば、ハム、ソーセージ等）、魚肉製品類（例えば、かまぼこ、ちくわ等）、乳製品類（例えば、バター、チーズ等）に添加して摂取させる。
係る飲食物は、その調製段階の適当な工程において有効成分を添加する以外は常法に準じて調製することができる。また、このような飲食物には、必要に応じて慣用の添加剤を添加してもよく、係る添加剤としては、例えば、ビタミン類（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＡ，ビタミンＥ等）、ミネラル類（例えば、亜鉛、銅、マンガン等）、生理活性物質、甘味料、酸味料、抗酸化剤、香料、塩分、賦形剤、着色料などが挙げられる。
【００２１】
また、医薬品としては、前記各成分を、必要に応じて、適宜の生理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）などの製剤上必要な成分と混合し、適宜な剤形の形態に調製することにより得られ、係る形態としては錠剤状、粉末状、顆粒状、カプセル剤状などが例示できる。
【００２２】
また、外用剤としては、例えは、クリーム、乳剤、ローション、軟膏、パック類などの形態をとることができる。これらの製剤は、化粧品製造における慣用の方法に準じて調製することができる。
当該製剤には、必要に応じて、保湿剤、抗酸化剤などの慣用の成分を添加してもよい。
【００２３】
本発明の皮膚改善剤において、経口摂取（投与）の形態とする場合には、一日当り、本発明のエラスチン分解ペプチドを０．１〜１０ｇ、好ましくは０．５〜７ｇ、更に好ましくは１〜５ｇを、一回又は数回に分けて摂取するようにすればよい。また、より好ましい形態として、コラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを添加した場合においては、当該成分を、一日当り０．５〜１０ｇ、好ましくは１〜７ｇ、更に好ましくは５ｇを摂取するように調整すればよい。
一方、外用剤とする場合には、本発明のエラスチン分解ペプチドを１〜１０％、好ましくは２〜５％程度含有する製剤を、一日一回又は数回塗布すればよい。また、より好ましい形態として、コラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを添加した場合においては、当該成分を１〜１０％、好ましくは２〜５％程度含有する製剤とすればよい。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例・試験例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
豚大動脈血管由来エラスチンの製法の検討
豚大動脈血管１００ｇ（湿重量）を、表１−Ｉに示される濃度の水酸化ナトリウム水溶液２００ｇに分散させ、９０℃で表１に示される時間処理し、その際の異臭及び得られたエラスチンの精製度を調べた。
なお、表中、エラスチンの精製度とは、エラスチンに特異的なアミノ酸であるデスモシン（Ｄｅｓ）含量とイソデスモシン（Ｉｄｅ）含量の和と、コラーゲンに特異的なアミノ酸であるヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）含量の比を目安とし、高とはその比が０．３程度、中とは０．２程度、低とは０．１程度を意味する。
また、異臭の測定は、成人男女３人ずつによる官能試験（１点：臭わない、２点：やや臭う、３点：臭う、４点：ひどく臭う）により実施し、平均点を四捨五入した結果に基づいて示した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
豚大動脈血管に対するアルカリ処理の反応条件としては、エラスチンの精製度及び異臭の問題を考えた場合、表１に示されるように、水酸化ナトリウム水溶液の濃度が０．０５〜０．５Ｎが好ましく、反応時間としては０．５〜５時間程度が好ましいことが分かった。更に好ましくは、水酸化ナトリウム水溶液の濃度が０．１２５〜０．５Ｎ、反応時間０．５〜２時間程度、最も好ましくは０．１２５Ｎ、反応時間１〜２時間程度であることが判明した。
【００２８】
表１―Ｉの実験番号２におけるアルカリ処理を行った後、処理液を１Ｎ塩酸で中和処理を行ったところ、表１−ＩＩに示されるように、得られたエラスチンの精製度を向上し得ることが判明した。
【００２９】
また、表１−Ｉの実験番号４におけるアルカリ処理を行って得られたエラスチン３０ｇを５０ｍｌの水に加え、６０℃、ｐＨ８．０の条件で、酵素アルカラーゼ（商品名、アルカリ性プロテアーゼ、ノボザイム社製）処理し、酵素分解が進んだ時点（約２４０分）で、９０℃、１０分間加熱して酵素を失活させ、次いで０．１Ｎ塩酸で中和処理をした後、メッシュで不溶物を除去し、珪藻土（濾過助剤、セルピュアS1000）を用いてフィルタープレスした。得られたエラスチン酵素分解ペプチドの異臭を前記と同様にして測定したところ、表１−ＩＩＩに示されるように、上記の塩酸中和処理を行うことにより、得られたエラスチン酵素分解ペプチドの異臭が低減することが明らかとなった。
【００３０】
実施例２
新鮮な豚の大動脈血管５００ｋｇ（湿重量）に水１０００ｋｇを投入し、水酸化ナトリウムフレーク５ｋｇを加え、９０℃で１時間攪拌後、アルカリ液を排出した。次いで、５０℃の水５００ｋｇを投入し、１５分間撹拌して洗浄し洗浄水を排出した。更に５０℃の水５００ｋｇを投入し、１５分間撹拌し、洗浄水を排出し、５０℃の水４００ｋｇを投入し、１０％塩酸３００ｍｌを加えて、１時間撹拌して中和し、中和水を排出後、５０℃の水４００ｋｇ及び塩化ナトリウム１６ｋｇを投入し１時間攪拌した。次いで、食塩水を排出し、冷水５００ｋｇを投入し、１５分間撹拌し、更に冷水５００ｋｇを投入し、１５分間撹拌し、冷水を排出し不溶物（エラスチン）を採取した。得られた不溶物をチョッパーにて粉砕し、粉砕物１２５ｋｇを得た。同様の操作を繰り返し、粉砕物合計２５０ｋｇを得た。
得られた粉砕物２５０ｋｇに水５００ｋｇ加え、撹拌しながら６０℃に加温した。６０℃に到達したのを確認後、酵素アルカラーゼ２．５Lを投入し、ｐＨ８．０に調整しつつブリックス測定を行い、酵素分解が進んだ時点（約３６０分、ブリックス９．５）で、９０℃、１０分間加熱し酵素を失活させた。酵素処理液をメッシュで濾過し不溶物を除去した。濾液を珪藻土（商品名：セルピュアS1000）充填フィルターで濾過し、活性炭処理し、更に珪藻土（セルピュアS300）充填フィルターで濾過した後、９０℃に加熱し、７０℃を保持しながらブリックス５０になるまで濃縮した。次いで９０℃で加熱殺菌した後、通風乾燥機で乾燥させ、更に粉末化させ、粉砕し、篩別し（40メッシュ）、エラスチン分解ペプチド粉末を得た。
【００３１】
かくして得られたエラスチン分解ペプチド粉末（以下、単に本発明のエラスチンペプチドという）は、表２に示されるアミノ酸組成（モル比）を有しており、エラスチンのみに含まれるアミノ酸で、エラスチンの含有量の指標とされるデスモシン（Ｄｅｓ）及びイソデスモシン（Ｉｄｅ）を合計０．２８％含有していた。また、Ｄｅｓ含量＋Ｉｄｅ含量の和／Ｈｙｐ含量の比は０．３３であった。
本発明のエラスチンペプチドと従来品（市販品Ａ及びＢ）のＤｅｓ、Ｉｄｅ及びＨｙｐの含量（％）を比較した結果を表３に示す。表３に示されるように、本発明のエラスチンペプチドは、従来品に比べＤｅｓ及びＩｄｅを高度に含有しており、またＨｙｐ含量が低いことから、精製度が高く、優れたエラスチン分解ペプチドであることを示すものであった。
【００３２】
また、前記特許文献３に記載される魚由来エラスチン分解物のアミノ酸組成と比較すると、本発明のエラスチンペプチドは、Ａｌａ及びＶａｌ含量が高く、一方Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ及びＬｉｓ含量が低いという特徴を有し、魚由来エラスチン分解物とは明確に区別することができる。
また、既に知られている牛靭帯由来エラスチン分解物のアミノ酸組成と比較すると、本発明のエラスチンペプチドはＨｉｓ及びＴｙｒ含量が高く、一方Ｉｌｅ及びＬｅｕ含量が低いという特徴を有し、牛靭帯由来エラスチン分解物と区別することができる。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
実施例３
本発明のエラスチンペプチドの分子量を、下記の条件化にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
カラム＝Superdex
Peptide (GEヘルスケアバイオサイエンス社製)
溶離液＝0.1%TFA及び30%アセトニトリル
HPLC条件＝流速：0.5 ml/min、検出：240 nm、グラジエント混合溶媒
その結果、平均分子量約２，５００（分子量の幅：５００〜７，５００）であった。エラスチンは前駆体であるトロポエラスチンがデスモシン、イソデスモシンなどにより分子間架橋結合された蛋白質であるため、分子量の特定が困難であるが、トロポエラスチンの分子量は一般に68,000〜70,000と言われていることから、エラスチン自身は100,000を超えるかなり巨大な蛋白質であると推察され、水に対して不溶性蛋白質である。本発明のエラスチンペプチドは、上記のように分子量約2,500まで低分子化されているので、水に対する溶解性を著しく向上させることができた。
即ち、上記のとおり、エラスチンは実質的に不溶性の蛋白質であるが、本発明のエラスチンペプチドでは、常温の蒸留水100 mlに対して36.7ｇが溶解し、その溶解性は26.86%であることがわかった。つまり、エラスチンのペプチド化により溶解性が著しく向上し、それに伴い吸収性も向上させることができる。
【００３６】
試験例１
本発明のエラスチンペプチドと豚由来コラーゲン分解ペプチドを用いた飲料水を作製し、２０代から５０代の女性７０人（各試験群１０名ずつ）に飲用してもらい、肌のつやに対する効果を、以下のように試験した。
なお、豚由来コラーゲン分解ペプチド（以下、コラーゲン分解ペプチドという）は豚皮より常法に従い精製したものを用いた。即ち、新鮮豚皮より得られた不溶性コラーゲンを酵素トリプシンで、３０〜８０℃、０．５〜３時間程度反応させ、限外濾過、珪藻土濾過により精製したものを使用した（ペプチドの平均分子量：約2500）。また、比較例として、魚由来エラスチン分解ペプチド（市販品）も試験に供した。
【００３７】
試験例１
本発明のエラスチンペプチドを５％（重量％、以下同様）含有する飲料水１００ｍｌを２０日間、毎日１本摂取させた。
試験例２
本発明のエラスチンペプチド５％及びコラーゲン分解ペプチド５％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
試験例３
本発明のエラスチンペプチド０．１％及びコラーゲン分解ペプチド５％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
比較例１
魚由来エラスチン分解ペプチド５％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
比較例２
単なる飲料水（本発明のエラスチンペプチド非含有の飲料水）を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
比較例３
本発明のエラスチンペプチド０．１％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
比較例４
コラーゲン分解ペプチド５％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
【００３８】
上記試験例の結果を表４に示す。なお、効果の判定は各被験者の申告に基づき、下記のように評価した。
１：効果無し ２：やや効果有り ３：効果有り ４：やや強い効果有り ５：強い効果有り
【００３９】
【表４】
【００４０】
表４に示されるように、本発明のエラスチンペプチド５％含有飲料水は、魚由来エラスチン分解ペプチド５％含有飲料水、エラスチンペプチド非含有飲料水及びコラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水に比べ、肌つやに関し、有意に優れた効果を示した。
また、本発明のエラスチンペプチド０．１％＋コラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水は、本発明のエラスチンペプチド０．１％含有飲料水やコラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水に比べ相乗的に優れた効果を示した。
更に、本発明のエラスチンペプチド５％＋コラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水は極めて顕著な効果を奏し、本発明のエラスチンペプチド５％含有飲料水やコラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水に比べ相乗的に優れた効果を示した。
【００４１】
試験例４
エラスチン分解ペプチドを用いた細胞培養液を調製し、正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養を行い、細胞増殖促進作用及びコラーゲン産生促進作用を検討した。
即ち、本発明のエラスチンペプチドを５又は50ng/mlとなるよう細胞培養液(DMEM、5％FBS及び0.1％ゲンタマイシン添加、何れもSigma)に添加し、この培養液(100μl)を用いてヒト皮膚由来線維芽細胞NHDF (Normal Human Dermal
Fibroblasts (Neonatal Skin), 三光純薬, 細胞数：5000個) を37℃, CO2 5.0% の条件下で５日間培養した。
培養後、細胞数の測定はCell Counting Kit-8（DOJINDO）により行った。また、コラーゲン量の測定はコラーゲン・ステイン・キット（コラーゲン研修会）を用い、細胞外に産生されたコラーゲン量を測定した。それぞれの作用の評価は、エラスチンペプチド無添加の場合（対照）との比較により行った。
その結果を図１に示す。図１に示されるように、本発明のエラスチンペプチドの添加量に依存して、細胞数及びコラーゲン量のいずれも増加し、本発明のエラスチンペプチド50ng/mlの添加において有意に増加することがわかった。つまり、本発明のエラスチンペプチドが線維芽細胞の増殖促進作用及びコラーゲン産生促進作用を持つことがわかった。
【００４２】
試験例５
本発明のエラスチンペプチドを用いたマウス用飼料を調製し、ヘアレスマウスへの投与を行い、マウス皮膚粘弾性への効果を検討した。
基本飼料（AIN-93G、オリエンタル酵母）をもとに、蛋白質量のうち１／４を本発明のエラスチンペプチドに置き換えた飼料を調製し、雄性ヘアレスマウス（Hos:HR-1、６週齢）へ自由摂取による投与を行った（エラスチン群）。また、対照として、エラスチンペプチド不含の飼料をマウスに自由摂取させた（対照群）。なお、飼育環境は以下のとおりである。
水：自動給水装置による自由摂取
温度・湿度：21−23℃・55−60％
明暗時間：12時間ずつ
飼育期間は８週間とし、その間、紫外線照射装置による紫外線（UVB）の照射を行い(total 540 mJ/cm2）、皮膚の光老化を促進させた。皮膚粘弾性の測定にはCUTOMETER (MPA580, C+K electronic) を用い、戻り弾性率を粘弾性の指標とした。なお、結果は、投与前の粘弾性を１００とする相対値で表した。
その結果を図２に示す。図２に示されるように、使用したマウスが若齢であったことから、飼育に伴い、いずれのマウスも皮膚の粘弾性は向上したが、エラスチン群（本発明のエラスチンペプチド摂取群）においてさらに向上し、飼育6週目以降では対照群と比較し、有意に皮膚の粘弾性が向上していることが明らかになった。
【００４３】
また、飼育後のマウス皮膚を採取し、当該皮膚中のデスモシン含量を測定した。その結果を図３に示す。図３に示されるように、対照群に比べてエラスチン群では、エラスチン特有のアミノ酸であるデスモシンが増加していた。つまり、本発明のエラスチンペプチドは経口摂取された後、体内に吸収され、加齢に伴い生じる“しわ”や“たるみ”の抑制に対して効果的であることがわかった。
【００４４】
試験例６
エラスチン分解ペプチドを用いたラット用飼料を調製し、自然発症高血圧ラットへの投与を行い、ラット血管に対する効果を試験した。
即ち、本発明のエラスチンペプチドの50％含有水溶液を調製し、雄性自然発症高血圧ラット（SHR/Ism、18週齢）へ、当該ペプチドとして4 g/kg体重/日となるよう強制経口投与を行った（エラスチン群）。また、対照としては、同量の水をラットに強制経口投与した（対照群）。なお、飼育環境は以下のとおりである。
飼料：AIN-93G(オリエンタル酵母)の自由摂取
給水：自動給水装置による自由摂取
温度・湿度：21−23℃・55−60％
明暗時間：12時間ずつ
飼育期間は10週間とし、飼育終了後にラットから血液を採取し、血液中の各種因子を測定した。また、飼育終了後に胸部大動脈を採取し、冠動脈中のデスモシン含量を測定した。
その結果を図４（血液検査）及び図５（冠動脈中のデスモシン含量）を示す。図４に示されるように、採取した血液においては、炎症性刺激を受けた血管内皮細胞などに発現する接着因子であるVCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)や動脈硬化発症に関与していると考えられている接着因子であるMCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1)が減少し、細胞外マトリックス分解阻害因子であるTIMP-1 (Tissue inhibitor of Metalloproteinases-1)が増加していた。また、図５に示されるように、冠動脈におけるデスモシンの含量を測定したところ、対照群に比べてエラスチン群ではデスモシン含量が増加していた。これらのことから、本発明のエラスチンペプチドは動脈硬化を抑制し、血管の保全に効果的であることがわかった。
【００４５】
製剤例１
カプセル剤の製造
本発明のエラスチンペプチド500ｍｇを常法に準じてハードカプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
製剤例２
果汁飲料の製造
精製水（２９．８重量部）にクエン酸（０．２重量部）、オレンジ果汁（３５重量部）及び砂糖（５重量部）を加熱溶解させ、更に本発明のエラスチンペプチドの１０％水溶液３０重量部を添加し、冷却後、容器充填及び８５℃３０分間の加熱殺菌を行って果汁飲料を製造した。
製造例３
化粧水の製造
本発明のエラスチンペプチド１重量部、エタノール５重量部、グリセリン２．５重量部、コラーゲン分解ペプチド１重量部、ピロリドンカルボン酸ナトリウム０．２重量部、ヒアルロン酸ナトリウム０．２重量部、メチルパラベン０．１重量部及び精製水９０重量部を混合することにより化粧水を製造した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明のエラスチンペプチドの線維芽細胞増殖促進効果及びコラーゲン産生促進効果を示す図である。
【図２】本発明のエラスチンペプチドを摂取したマウスの皮膚粘弾性改善効果を示す図である。
【図３】本発明のエラスチンペプチドを摂取したマウスの皮膚中デスモシン含量増加効果を示す図である。
【図４】本発明のエラスチンペプチドを投与したラットの血液中のVCAM-1、MCP-1及びTIMP-1の動向を示す図である。
【図５】本発明のエラスチンペプチドを投与したラットの冠動脈中のデスモシン含量増加効果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚大動脈血管を原料として得られるエラスチンの酵素分解ペプチド並びに当該エラスチン及びその酵素分解ペプチドの製造方法に関する。係るエラスチン酵素分解ペプチドは健康食品素材としてだけでなく、化粧品素材や医療用素材としても有用である。
【背景技術】
【０００２】
エラスチンは皮膚、血管、肺、腱などにおいてコラーゲンなどの結合組織成分とともに存在する蛋白質であり、組織としての構造を保持するほか、組織の様々な形状変化に対応できる弾力性を与える役割を担っている。エラスチンのアミノ酸残基の約９５％が非極性アミノ酸であり、デスモシン及びイソデスモシンが特徴的に含まれ、またコラーゲンに較べてヒドロキシプロリン含量が少ないという特徴を有する。デスモシン及びイソデスモシンによる架橋構造を有することから酸やアルカリに対して強い耐性を有する。
エラスチンは、皮膚真皮部分のコラーゲンに絡みつくようにして存在し、その伸縮性から肌に弾力を与えてハリを維持しており、エラスチンの減少は皮膚のシワ、タルミなどの原因となる。そのため、エラスチン及びその分解ペプチドは外用又は経口の皮膚老化防止・改善剤として有用であることが知られている（特許文献１、２など参照）。
また、血管の弾性維持や創傷治癒にも効果があることから、医療の分野での利用も注目されている。
【特許文献１】特開２００１−７２５７２公報
【特許文献２】特開２００６−１４３６７１公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
エラスチン及びその分解ペプチドは、化粧品、食品、医療などの分野で利用されている物質であり、エラスチンの原料として、牛項靭帯や魚類の皮膚や動脈球が使用されてきた。
より具体的には、従来、エラスチン高含有の組織として牛項靭帯が知られており、エラスチンは牛項靭帯より製造されていた。しかし、日本国内で牛海綿状脳症（ＢＳＥ）感染牛が発見され、牛由来のエラスチンペプチドは敬遠されるようになっている。
その代替として魚由来のエラスチンが利用されるようになった（特許文献３）。しかし、魚皮のエラスチン含量は少ない。エラスチン含量の高い動脈球の場合でも、一匹から採取できるエラスチン量は少ないことから、魚類動脈球由来エラスチン及びエラスチン分解ペプチドは高価となり、牛項靭帯の代替原料として十分とは言えない。
また、魚由来エラスチンは、牛項靭帯など哺乳類組織由来エラスチンに比べ、そのアミノ酸組成がヒトの皮膚や血管におけるエラスチンの組成とはかけ離れているため、化粧品や機能性素材としての効果にも疑問があった。
【特許文献３】特開２００５−３４３８５１公報
【０００４】
上記の課題から、豊富であり、ＢＳＥの問題が無く、ヒトのエラスチンと似た組成であり且つエラスチン濃度の高い原料が求められていた。
そこで、本発明者らは上記の条件を満たす原料を検討した結果、ヒトと同じ哺乳類であり、ＢＳＥの心配がない豚を原料にすることを想起した。しかし、牛エラスチンの原材料として用いられていた項靭帯は首の靱帯であるが、豚では首が短いため、項靱帯も小さく、原料として用いることが出来なかった。そこで、豚において、原材料となり得る部位を検討したところ、大動脈血管が最もエラスチンのトータル収量が高い組織であることを見出した。しかも、豚の大動脈血管は、現状では一部が食用として供される他は、そのほとんどが廃棄されており、これを原料とすることは、未利用の畜産資源を有効活用することにもつながる。
しかし、項靱帯に比べ、豚の大動脈血管は、エラスチン以外の種々の組織、成分が夾雑し、牛の項靱帯からエラスチンを精製する方法をそのまま適用しても、高純度のエラスチンを得ることが出来なかった。
また、豚の組織・臓器からエラスチンを精製する場合、異臭（獣臭）が発生し作業環境を悪化させる問題があり、ひいては精製したエラスチン及びその分解ペプチドにも異臭が残ることがあり、係る異臭の少ない高品質のエラスチンが求められていた。
【０００５】
このような問題点から、本発明者らは、豚の大動脈血管を原料にして、エラスチンと共存するコラーゲンなどの夾雑蛋白質を効果的に除去でき、高品質のエラスチンが得られ、しかも異臭を生じない精製条件を種々検討したところ、特定の条件で精製することにより所期の目的を達成できることが判明した。本発明は係る知見に基づくもので、高純度、高品質且つ異臭の少ない豚大動脈血管由来エラスチン酵素分解ペプチド並びに豚大動脈血管由来エラスチン及びその酵素分解ペプチドの製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、豚大動脈血管由来エラスチンの酵素分解物であるエラスチン分解ペプチドである。特に、アミノ酸組成（モル比）におけるデスモシン及び/又はイソデスモシンの含量が０．０６％以上であり、更にデスモシン含量とイソデスモシン含量の和/ヒドロキシプロリン含量の比（モル比）が０．１以上、より好ましくは０．２２以上、更に好ましくは０．２７以上であるエラスチン分解ペプチドが好ましい。
また、本発明のエラスチンの製造方法は、豚大動脈血管を、加熱下、０．０５〜０．５Ｎのアルカリ性水溶液で処理して豚大動脈血管由来エラスチンを得るものであり、更に当該エラスチンをプロテアーゼで酵素分解することから成るエラスチン酵素分解ペプチドの製造方法である。
更に、本発明の皮膚改善剤は、前記のエラスチン分解ペプチドを含有するものであり、特にコラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを含有することが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のエラスチン分解ペプチドは、豚大動脈血管に由来するものであり、哺乳類組織を原料とするので、そのアミノ酸組成をヒトエラスチンに近いものとすることができる。更に豚大動脈血管は原料として豊富に存在し、しかも従来は廃棄されていたものであるので、コスト的に有利である。
また、本発明のエラスチン及びエラスチン分解ペプチドの製造方法によれば、高純度のエラスチン及びエラスチン分解ペプチドが得られるのみならず、製造時に発生する異臭を防止又は抑制でき、作業環境の改善を図ることができ、更に得られたエラスチン及びエラスチン分解ペプチドの異臭を低減できる。
更に、本発明の皮膚改善剤は、前記のエラスチン分解ペプチド並びに必要に応じてコラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを含有するものであり、経口的に摂取するか又は外用的に投与（塗布）することにより、肌に弾力を与えてハリを維持し、皮膚のシワ、タルミなどを予防・改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
前記のとおり、本発明のエラスチン分解ペプチドは、豚大動脈血管由来エラスチンを酵素的に分解したペプチドであり、種々の製法により調製することができるが、本発明のエラスチン及びエラスチン分解ペプチドの製造方法に準じて調製するのが好ましい。
即ち、本発明のエラスチンの製造方法は、豚大動脈血管を加熱下、０．０５〜０．５Ｎのアルカリ性水溶液で処理してエラスチンを得るものである。前述のように、エラスチンはアルカリ耐性を有するので、豚大動脈血管をアルカリ性溶液で処理すると、コラーゲンはゼラチン化して可溶化し、また他の夾雑物質（例えば蛋白質）も可溶化するので、反応液から不溶性物質を採取することにより豚エラスチンを選択的に得ることができる。
しかし、前記のとおり、豚などの家畜組織・臓器を原料として素材精製を行う場合、異臭（獣臭）が発生し作業環境を悪化させる問題があり、ひいては精製したエラスチン及びその分解ペプチドにも異臭が残る問題がある。
【０００９】
そこで、係る問題を解決するために種々検討したところ、後記実施例１に示されるように、豚大動脈血管を、加熱下、０．０５〜０．５Ｎのアルカリ性水溶液で処理すると異臭の低減を図ることができると共にエラスチンの精製度を向上させ得ることが明らかとなった。
係る方法において、原料である豚大動脈血管は、豚を食肉加工する処理場（と殺場など）から得ることができる。特に、豚大動脈血管は、従来、廃棄処理されていた部分であり、廃棄物の有効利用を図ることができる。豚の種類（例えば、バークシャー種、三元交配種など）は特に限定されず、いずれの種類であってもよい。
更に、エラスチンの含量は加齢により劇的に減少する。例えば、ヒトの場合２０歳代を境に急減する。牛は通常２年半程度で出荷／と殺されるが、豚は通常６ヶ月程度で出荷／と殺される。従って、牛より豚の方がより若く、エラスチン含量も豊富で望ましい原材料と考えられる。
【００１０】
本発明のエラスチンの製造方法においては、豚大動脈血管をアルカリ性水溶液で処理する。アルカリ性物質としては特に限定されず、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属水酸化物などが利用されるが、操作性やコスト的な面からアルカリ金属水酸化物、特に水酸化ナトリウムを使用するのが好ましい。
アルカリ性水溶液としては、０．０５〜０．５Ｎの溶液が使用される。０．０５Ｎ未満では豚大動脈血管の分解が遅くなり、また０．５Ｎを超えると処理の際及びエラスチン調製物の異臭が強くなり好ましくない。
【００１１】
上記のアルカリ性水溶液は、原料である豚大動脈血管の湿重量に対し、０．５〜３倍量（重量比）、好ましくは１〜２倍量（重量比）が使用される。また、アルカリ性物質として、アルカリ金属水酸化物を使用する場合、豚大動脈血管１００重量部（湿重量）に対して０．００５〜０．０２５モルの割合で使用するのが好ましい。
【００１２】
係るアルカリ性水溶液による豚大動脈血管の処理は加温下に行われ、通常５０〜９５℃程度、好ましくは８０〜９０℃程度にて行われる。処理時間としては、アルカリ性水溶液のアルカリ濃度、コラーゲンや他の夾雑物質の分解程度により適宜調整することができるが、通常は０．５〜５時間程度、好ましくは１〜２時間程度である。
【００１３】
上記の処理により、豚大動脈血管の主成分であるコラーゲンはゼラチン化し、また他の夾雑物質も分解して可溶化するので、反応液の不溶性部分を回収し、必要に応じて水洗、塩水洗浄及び／又は酸洗浄することにより豚大動脈血管由来エラスチンを得ることができる。
【００１４】
なお、上記のアルカリ性水溶液処理が終了した後、反応液を慣用の酸（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸等）を用いて中和処理を行うのが好ましい。係る中和処理により、精製したエラスチンの精製度を高めることができる（後記実施例１参照）。
【００１５】
かくして得られた豚大動脈血管由来エラスチンをプロテアーゼで酵素的に分解することにより、エラスチン分解ペプチドが得られる。
ここで使用されるプロテアーゼは、エラスチンを分解し得る酵素であれば特に限定されず、例えばブロメライン、パパイン、トリプシン、ペプシン、エラスターゼなどを挙げることができるが、好ましくは微生物由来のアルカリ性プロテアーゼ（例えば、アルカラーゼ、ノボザイムＦＭ、プロテアーゼＰなど、いずれも商品名）が使用される。
当該酵素の使用量は、酵素の活性、反応温度、反応時間などに応じて適宜選択することができるが、基質（エラスチン）に対して酵素を、１：０．００５〜０．０５（重量比）、好ましくは１：０．０１（重量比）で使用される。
エラスチン分解ペプチドの分子量は、使用する酵素量、反応温度、反応時間、当該ペプチドの使用目的などにより適宜調整することができ、例えば、平均分子量３００〜８０００程度、好ましくは５００〜５０００程度、より好ましくは１０００〜３０００程度に調整される。
【００１６】
エラスチン分解ペプチドの調製法をより具体的に説明すると、豚大動脈血管由来エラスチンを、使用するプロテアーゼの至適ｐＨに調整した緩衝液又は精製水と混合し、次いで所定量のプロテアーゼを添加し、プロテアーゼの至適温度で適当な時間（例えば、２４時間程度）インキュベートしエラスチンを酵素分解する。分解後、加熱（例えば、９０℃で１０分間程度）して酵素を失活させ、放冷後、濾過して不溶物を除去し、必要に応じて珪藻土、活性炭などを用いた処理を行うことにより、エラスチン酵素分解ペプチド溶液が得られる。なお、上記の処理に際して、プロテアーゼとして、アルカリ性プロテアーゼを使用した場合、酵素反応の終了後に、反応液を慣用の酸剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸など）で中和、脱塩するのが好ましい。この操作により、得られたエラスチン酵素分解ペプチドの異臭を著しく低減することができる。
かくして得られたエラスチン酵素分解ペプチドは、更に、限外ろ過、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの慣用の方法で精製することができる。
更に、得られたエラスチン酵素分解ペプチド溶液は、凍結乾燥、通風乾燥などの慣用の方法で乾燥することにより、粉末化することができる。
【００１７】
上記の製法で得られた豚大動脈血管由来エラスチン及びその酵素分解物であるエラスチン酵素分解ペプチドは、エラスチンの特徴的アミノ酸であるデスモシン及び／又はイソデスモシンを、アミノ酸組成（モル比）において０．０６％以上含有しており、更にデスモシン（Ｄｅｓ）含量とイソデスモシン（Ｉｄｅ）含量の和/ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）含量の比（モル比）が０．１以上、より好ましくは０．２２以上、更に好ましくは０．２７以上であるという特徴を有していた。
【００１８】
本発明の皮膚改善剤は、上記の豚大動脈血管由来エラスチン分解ペプチドを有効成分として含有するものであり、更にコラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを含有することが好ましい。
上記コラーゲンの由来は特に限定されないが、豚由来コラーゲンが好適に使用される。コラーゲンの製法などは既に周知であり、市販のコラーゲンを使用してもよい。また、コラーゲン分解ペプチドは、前述のプロテアーゼを用いてコラーゲンを酵素分解して得られるペプチドであり、分子量１５０〜３０００程度、好ましくは分子量２５０〜２５００程度のペプチドが使用される。コラーゲン分解ペプチドは市販されているものを使用してもよい。
係るコラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドの上記エラスチン分解ペプチドに対する使用量は特に制限されないが、エラスチン分解ペプチドに対して、コラーゲンとコラーゲン分解ペプチドの合計量として０．５〜１００倍量（重量比）、好ましくは１〜５０倍量の割合で使用される。
【００１９】
本発明の皮膚改善剤は、経口摂取（投与）又は外用投与（塗布）のいずれの投与形態の剤であってもよい。
経口摂取（投与）の形態としては、食品（健康食品素材）、医薬品などの形態を例示できる。
食品（健康食品素材）としては、そのまま、固形状物又は飲食物などの種々の形態でヒトに摂取される。
固形状物としては、前記各成分を、必要に応じて、適宜の生理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）などの製剤上必要な成分と混合し、適宜な剤形の形態に調製することにより得られ、係る形態としては錠剤状、粉末状、顆粒状、カプセル剤状などが例示できる。
【００２０】
また、飲食物としては、例えば、飲料類（例えば、ドリンク剤、乳酸菌飲料、ミルク飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、ジュース等）、菓子類（例えば、ビスケット、クッキー、キャンディー、スナック菓子、ラムネ菓子等）、調味液類（例えば、たれ汁等）、食肉製品類（例えば、ハム、ソーセージ等）、魚肉製品類（例えば、かまぼこ、ちくわ等）、乳製品類（例えば、バター、チーズ等）に添加して摂取させる。
係る飲食物は、その調製段階の適当な工程において有効成分を添加する以外は常法に準じて調製することができる。また、このような飲食物には、必要に応じて慣用の添加剤を添加してもよく、係る添加剤としては、例えば、ビタミン類（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＡ，ビタミンＥ等）、ミネラル類（例えば、亜鉛、銅、マンガン等）、生理活性物質、甘味料、酸味料、抗酸化剤、香料、塩分、賦形剤、着色料などが挙げられる。
【００２１】
また、医薬品としては、前記各成分を、必要に応じて、適宜の生理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）などの製剤上必要な成分と混合し、適宜な剤形の形態に調製することにより得られ、係る形態としては錠剤状、粉末状、顆粒状、カプセル剤状などが例示できる。
【００２２】
また、外用剤としては、例えは、クリーム、乳剤、ローション、軟膏、パック類などの形態をとることができる。これらの製剤は、化粧品製造における慣用の方法に準じて調製することができる。
当該製剤には、必要に応じて、保湿剤、抗酸化剤などの慣用の成分を添加してもよい。
【００２３】
本発明の皮膚改善剤において、経口摂取（投与）の形態とする場合には、一日当り、本発明のエラスチン分解ペプチドを０．１〜１０ｇ、好ましくは０．５〜７ｇ、更に好ましくは１〜５ｇを、一回又は数回に分けて摂取するようにすればよい。また、より好ましい形態として、コラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを添加した場合においては、当該成分を、一日当り０．５〜１０ｇ、好ましくは１〜７ｇ、更に好ましくは５ｇを摂取するように調整すればよい。
一方、外用剤とする場合には、本発明のエラスチン分解ペプチドを１〜１０％、好ましくは２〜５％程度含有する製剤を、一日一回又は数回塗布すればよい。また、より好ましい形態として、コラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを添加した場合においては、当該成分を１〜１０％、好ましくは２〜５％程度含有する製剤とすればよい。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例・試験例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
豚大動脈血管由来エラスチンの製法の検討
豚大動脈血管１００ｇ（湿重量）を、表１−Ｉに示される濃度の水酸化ナトリウム水溶液２００ｇに分散させ、９０℃で表１に示される時間処理し、その際の異臭及び得られたエラスチンの精製度を調べた。
なお、表中、エラスチンの精製度とは、エラスチンに特異的なアミノ酸であるデスモシン（Ｄｅｓ）含量とイソデスモシン（Ｉｄｅ）含量の和と、コラーゲンに特異的なアミノ酸であるヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）含量の比を目安とし、高とはその比が０．３程度、中とは０．２程度、低とは０．１程度を意味する。
また、異臭の測定は、成人男女３人ずつによる官能試験（１点：臭わない、２点：やや臭う、３点：臭う、４点：ひどく臭う）により実施し、平均点を四捨五入した結果に基づいて示した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
豚大動脈血管に対するアルカリ処理の反応条件としては、エラスチンの精製度及び異臭の問題を考えた場合、表１に示されるように、水酸化ナトリウム水溶液の濃度が０．０５〜０．５Ｎが好ましく、反応時間としては０．５〜５時間程度が好ましいことが分かった。更に好ましくは、水酸化ナトリウム水溶液の濃度が０．１２５〜０．５Ｎ、反応時間０．５〜２時間程度、最も好ましくは０．１２５Ｎ、反応時間１〜２時間程度であることが判明した。
【００２８】
表１―Ｉの実験番号２におけるアルカリ処理を行った後、処理液を１Ｎ塩酸で中和処理を行ったところ、表１−ＩＩに示されるように、得られたエラスチンの精製度を向上し得ることが判明した。
【００２９】
また、表１−Ｉの実験番号４におけるアルカリ処理を行って得られたエラスチン３０ｇを５０ｍｌの水に加え、６０℃、ｐＨ８．０の条件で、酵素アルカラーゼ（商品名、アルカリ性プロテアーゼ、ノボザイム社製）処理し、酵素分解が進んだ時点（約２４０分）で、９０℃、１０分間加熱して酵素を失活させ、次いで０．１Ｎ塩酸で中和処理をした後、メッシュで不溶物を除去し、珪藻土（濾過助剤、セルピュアS1000）を用いてフィルタープレスした。得られたエラスチン酵素分解ペプチドの異臭を前記と同様にして測定したところ、表１−ＩＩＩに示されるように、上記の塩酸中和処理を行うことにより、得られたエラスチン酵素分解ペプチドの異臭が低減することが明らかとなった。
【００３０】
実施例２
新鮮な豚の大動脈血管５００ｋｇ（湿重量）に水１０００ｋｇを投入し、水酸化ナトリウムフレーク５ｋｇを加え、９０℃で１時間攪拌後、アルカリ液を排出した。次いで、５０℃の水５００ｋｇを投入し、１５分間撹拌して洗浄し洗浄水を排出した。更に５０℃の水５００ｋｇを投入し、１５分間撹拌し、洗浄水を排出し、５０℃の水４００ｋｇを投入し、１０％塩酸３００ｍｌを加えて、１時間撹拌して中和し、中和水を排出後、５０℃の水４００ｋｇ及び塩化ナトリウム１６ｋｇを投入し１時間攪拌した。次いで、食塩水を排出し、冷水５００ｋｇを投入し、１５分間撹拌し、更に冷水５００ｋｇを投入し、１５分間撹拌し、冷水を排出し不溶物（エラスチン）を採取した。得られた不溶物をチョッパーにて粉砕し、粉砕物１２５ｋｇを得た。同様の操作を繰り返し、粉砕物合計２５０ｋｇを得た。
得られた粉砕物２５０ｋｇに水５００ｋｇ加え、撹拌しながら６０℃に加温した。６０℃に到達したのを確認後、酵素アルカラーゼ２．５Lを投入し、ｐＨ８．０に調整しつつブリックス測定を行い、酵素分解が進んだ時点（約３６０分、ブリックス９．５）で、９０℃、１０分間加熱し酵素を失活させた。酵素処理液をメッシュで濾過し不溶物を除去した。濾液を珪藻土（商品名：セルピュアS1000）充填フィルターで濾過し、活性炭処理し、更に珪藻土（セルピュアS300）充填フィルターで濾過した後、９０℃に加熱し、７０℃を保持しながらブリックス５０になるまで濃縮した。次いで９０℃で加熱殺菌した後、通風乾燥機で乾燥させ、更に粉末化させ、粉砕し、篩別し（40メッシュ）、エラスチン分解ペプチド粉末を得た。
【００３１】
かくして得られたエラスチン分解ペプチド粉末（以下、単に本発明のエラスチンペプチドという）は、表２に示されるアミノ酸組成（モル比）を有しており、エラスチンのみに含まれるアミノ酸で、エラスチンの含有量の指標とされるデスモシン（Ｄｅｓ）及びイソデスモシン（Ｉｄｅ）を合計０．２８％含有していた。また、Ｄｅｓ含量＋Ｉｄｅ含量の和／Ｈｙｐ含量の比は０．３３であった。
本発明のエラスチンペプチドと従来品（市販品Ａ及びＢ）のＤｅｓ、Ｉｄｅ及びＨｙｐの含量（％）を比較した結果を表３に示す。表３に示されるように、本発明のエラスチンペプチドは、従来品に比べＤｅｓ及びＩｄｅを高度に含有しており、またＨｙｐ含量が低いことから、精製度が高く、優れたエラスチン分解ペプチドであることを示すものであった。
【００３２】
また、前記特許文献３に記載される魚由来エラスチン分解物のアミノ酸組成と比較すると、本発明のエラスチンペプチドは、Ａｌａ及びＶａｌ含量が高く、一方Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ及びＬｉｓ含量が低いという特徴を有し、魚由来エラスチン分解物とは明確に区別することができる。
また、既に知られている牛靭帯由来エラスチン分解物のアミノ酸組成と比較すると、本発明のエラスチンペプチドはＨｉｓ及びＴｙｒ含量が高く、一方Ｉｌｅ及びＬｅｕ含量が低いという特徴を有し、牛靭帯由来エラスチン分解物と区別することができる。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
実施例３
本発明のエラスチンペプチドの分子量を、下記の条件化にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
カラム＝Superdex
Peptide (GEヘルスケアバイオサイエンス社製)
溶離液＝0.1%TFA及び30%アセトニトリル
HPLC条件＝流速：0.5 ml/min、検出：240 nm、グラジエント混合溶媒
その結果、平均分子量約２，５００（分子量の幅：５００〜７，５００）であった。エラスチンは前駆体であるトロポエラスチンがデスモシン、イソデスモシンなどにより分子間架橋結合された蛋白質であるため、分子量の特定が困難であるが、トロポエラスチンの分子量は一般に68,000〜70,000と言われていることから、エラスチン自身は100,000を超えるかなり巨大な蛋白質であると推察され、水に対して不溶性蛋白質である。本発明のエラスチンペプチドは、上記のように分子量約2,500まで低分子化されているので、水に対する溶解性を著しく向上させることができた。
即ち、上記のとおり、エラスチンは実質的に不溶性の蛋白質であるが、本発明のエラスチンペプチドでは、常温の蒸留水100 mlに対して36.7ｇが溶解し、その溶解性は26.86%であることがわかった。つまり、エラスチンのペプチド化により溶解性が著しく向上し、それに伴い吸収性も向上させることができる。
【００３６】
試験例１
本発明のエラスチンペプチドと豚由来コラーゲン分解ペプチドを用いた飲料水を作製し、２０代から５０代の女性７０人（各試験群１０名ずつ）に飲用してもらい、肌のつやに対する効果を、以下のように試験した。
なお、豚由来コラーゲン分解ペプチド（以下、コラーゲン分解ペプチドという）は豚皮より常法に従い精製したものを用いた。即ち、新鮮豚皮より得られた不溶性コラーゲンを酵素トリプシンで、３０〜８０℃、０．５〜３時間程度反応させ、限外濾過、珪藻土濾過により精製したものを使用した（ペプチドの平均分子量：約2500）。また、比較例として、魚由来エラスチン分解ペプチド（市販品）も試験に供した。
【００３７】
試験例１
本発明のエラスチンペプチドを５％（重量％、以下同様）含有する飲料水１００ｍｌを２０日間、毎日１本摂取させた。
試験例２
本発明のエラスチンペプチド５％及びコラーゲン分解ペプチド５％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
試験例３
本発明のエラスチンペプチド０．１％及びコラーゲン分解ペプチド５％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
比較例１
魚由来エラスチン分解ペプチド５％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
比較例２
単なる飲料水（本発明のエラスチンペプチド非含有の飲料水）を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
比較例３
本発明のエラスチンペプチド０．１％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
比較例４
コラーゲン分解ペプチド５％含有の飲料水を用いた以外は試験例１と同様に試験した。
【００３８】
上記試験例の結果を表４に示す。なお、効果の判定は各被験者の申告に基づき、下記のように評価した。
１：効果無し ２：やや効果有り ３：効果有り ４：やや強い効果有り ５：強い効果有り
【００３９】
【表４】
【００４０】
表４に示されるように、本発明のエラスチンペプチド５％含有飲料水は、魚由来エラスチン分解ペプチド５％含有飲料水、エラスチンペプチド非含有飲料水及びコラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水に比べ、肌つやに関し、有意に優れた効果を示した。
また、本発明のエラスチンペプチド０．１％＋コラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水は、本発明のエラスチンペプチド０．１％含有飲料水やコラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水に比べ相乗的に優れた効果を示した。
更に、本発明のエラスチンペプチド５％＋コラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水は極めて顕著な効果を奏し、本発明のエラスチンペプチド５％含有飲料水やコラーゲン分解ペプチド５％含有飲料水に比べ相乗的に優れた効果を示した。
【００４１】
試験例４
エラスチン分解ペプチドを用いた細胞培養液を調製し、正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養を行い、細胞増殖促進作用及びコラーゲン産生促進作用を検討した。
即ち、本発明のエラスチンペプチドを５又は50ng/mlとなるよう細胞培養液(DMEM、5％FBS及び0.1％ゲンタマイシン添加、何れもSigma)に添加し、この培養液(100μl)を用いてヒト皮膚由来線維芽細胞NHDF (Normal Human Dermal
Fibroblasts (Neonatal Skin), 三光純薬, 細胞数：5000個) を37℃, CO2 5.0% の条件下で５日間培養した。
培養後、細胞数の測定はCell Counting Kit-8（DOJINDO）により行った。また、コラーゲン量の測定はコラーゲン・ステイン・キット（コラーゲン研修会）を用い、細胞外に産生されたコラーゲン量を測定した。それぞれの作用の評価は、エラスチンペプチド無添加の場合（対照）との比較により行った。
その結果を図１に示す。図１に示されるように、本発明のエラスチンペプチドの添加量に依存して、細胞数及びコラーゲン量のいずれも増加し、本発明のエラスチンペプチド50ng/mlの添加において有意に増加することがわかった。つまり、本発明のエラスチンペプチドが線維芽細胞の増殖促進作用及びコラーゲン産生促進作用を持つことがわかった。
【００４２】
試験例５
本発明のエラスチンペプチドを用いたマウス用飼料を調製し、ヘアレスマウスへの投与を行い、マウス皮膚粘弾性への効果を検討した。
基本飼料（AIN-93G、オリエンタル酵母）をもとに、蛋白質量のうち１／４を本発明のエラスチンペプチドに置き換えた飼料を調製し、雄性ヘアレスマウス（Hos:HR-1、６週齢）へ自由摂取による投与を行った（エラスチン群）。また、対照として、エラスチンペプチド不含の飼料をマウスに自由摂取させた（対照群）。なお、飼育環境は以下のとおりである。
水：自動給水装置による自由摂取
温度・湿度：21−23℃・55−60％
明暗時間：12時間ずつ
飼育期間は８週間とし、その間、紫外線照射装置による紫外線（UVB）の照射を行い(total 540 mJ/cm2）、皮膚の光老化を促進させた。皮膚粘弾性の測定にはCUTOMETER (MPA580, C+K electronic) を用い、戻り弾性率を粘弾性の指標とした。なお、結果は、投与前の粘弾性を１００とする相対値で表した。
その結果を図２に示す。図２に示されるように、使用したマウスが若齢であったことから、飼育に伴い、いずれのマウスも皮膚の粘弾性は向上したが、エラスチン群（本発明のエラスチンペプチド摂取群）においてさらに向上し、飼育6週目以降では対照群と比較し、有意に皮膚の粘弾性が向上していることが明らかになった。
【００４３】
また、飼育後のマウス皮膚を採取し、当該皮膚中のデスモシン含量を測定した。その結果を図３に示す。図３に示されるように、対照群に比べてエラスチン群では、エラスチン特有のアミノ酸であるデスモシンが増加していた。つまり、本発明のエラスチンペプチドは経口摂取された後、体内に吸収され、加齢に伴い生じる“しわ”や“たるみ”の抑制に対して効果的であることがわかった。
【００４４】
試験例６
エラスチン分解ペプチドを用いたラット用飼料を調製し、自然発症高血圧ラットへの投与を行い、ラット血管に対する効果を試験した。
即ち、本発明のエラスチンペプチドの50％含有水溶液を調製し、雄性自然発症高血圧ラット（SHR/Ism、18週齢）へ、当該ペプチドとして4 g/kg体重/日となるよう強制経口投与を行った（エラスチン群）。また、対照としては、同量の水をラットに強制経口投与した（対照群）。なお、飼育環境は以下のとおりである。
飼料：AIN-93G(オリエンタル酵母)の自由摂取
給水：自動給水装置による自由摂取
温度・湿度：21−23℃・55−60％
明暗時間：12時間ずつ
飼育期間は10週間とし、飼育終了後にラットから血液を採取し、血液中の各種因子を測定した。また、飼育終了後に胸部大動脈を採取し、冠動脈中のデスモシン含量を測定した。
その結果を図４（血液検査）及び図５（冠動脈中のデスモシン含量）を示す。図４に示されるように、採取した血液においては、炎症性刺激を受けた血管内皮細胞などに発現する接着因子であるVCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)や動脈硬化発症に関与していると考えられている接着因子であるMCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1)が減少し、細胞外マトリックス分解阻害因子であるTIMP-1 (Tissue inhibitor of Metalloproteinases-1)が増加していた。また、図５に示されるように、冠動脈におけるデスモシンの含量を測定したところ、対照群に比べてエラスチン群ではデスモシン含量が増加していた。これらのことから、本発明のエラスチンペプチドは動脈硬化を抑制し、血管の保全に効果的であることがわかった。
【００４５】
製剤例１
カプセル剤の製造
本発明のエラスチンペプチド500ｍｇを常法に準じてハードカプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
製剤例２
果汁飲料の製造
精製水（２９．８重量部）にクエン酸（０．２重量部）、オレンジ果汁（３５重量部）及び砂糖（５重量部）を加熱溶解させ、更に本発明のエラスチンペプチドの１０％水溶液３０重量部を添加し、冷却後、容器充填及び８５℃３０分間の加熱殺菌を行って果汁飲料を製造した。
製造例３
化粧水の製造
本発明のエラスチンペプチド１重量部、エタノール５重量部、グリセリン２．５重量部、コラーゲン分解ペプチド１重量部、ピロリドンカルボン酸ナトリウム０．２重量部、ヒアルロン酸ナトリウム０．２重量部、メチルパラベン０．１重量部及び精製水９０重量部を混合することにより化粧水を製造した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明のエラスチンペプチドの線維芽細胞増殖促進効果及びコラーゲン産生促進効果を示す図である。
【図２】本発明のエラスチンペプチドを摂取したマウスの皮膚粘弾性改善効果を示す図である。
【図３】本発明のエラスチンペプチドを摂取したマウスの皮膚中デスモシン含量増加効果を示す図である。
【図４】本発明のエラスチンペプチドを投与したラットの血液中のVCAM-1、MCP-1及びTIMP-1の動向を示す図である。
【図５】本発明のエラスチンペプチドを投与したラットの冠動脈中のデスモシン含量増加効果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚大動脈血管由来エラスチンの酵素分解物であるエラスチン分解ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸組成（モル比）におけるイソデスモシン及び/又はデスモシンの含量が０．０６％以上である請求項１記載のエラスチン分解ペプチド。
【請求項３】
デスモシン含量とイソデスモシン含量の和/ヒドロキシプロリン含量の比（モル比）が０．１以上である請求項１又は２記載のエラスチン分解ペプチド。
【請求項４】
豚大動脈血管を、加熱下、０．０５〜０．５Ｎのアルカリ性水溶液で処理してエラスチンを得ることを特徴とする豚大動脈血管由来エラスチンの製造方法。
【請求項５】
請求項４記載のエラスチンを、プロテアーゼで酵素分解することからなるエラスチン分解ペプチドの製造方法。
【請求項６】
請求項１記載のエラスチン分解ペプチドを含有する皮膚改善剤。
【請求項７】
コラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを含有する請求項６記載の皮膚改善剤。
【請求項８】
エラスチン分解ペプチドの平均分子量が、１０００〜３０００である請求項６又は７記載の皮膚改善剤。
【請求項１】
豚大動脈血管由来エラスチンの酵素分解物であるエラスチン分解ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸組成（モル比）におけるイソデスモシン及び/又はデスモシンの含量が０．０６％以上である請求項１記載のエラスチン分解ペプチド。
【請求項３】
デスモシン含量とイソデスモシン含量の和/ヒドロキシプロリン含量の比（モル比）が０．１以上である請求項１又は２記載のエラスチン分解ペプチド。
【請求項４】
豚大動脈血管を、加熱下、０．０５〜０．５Ｎのアルカリ性水溶液で処理してエラスチンを得ることを特徴とする豚大動脈血管由来エラスチンの製造方法。
【請求項５】
請求項４記載のエラスチンを、プロテアーゼで酵素分解することからなるエラスチン分解ペプチドの製造方法。
【請求項６】
請求項１記載のエラスチン分解ペプチドを含有する皮膚改善剤。
【請求項７】
コラーゲン及び／又はコラーゲン分解ペプチドを含有する請求項６記載の皮膚改善剤。
【請求項８】
エラスチン分解ペプチドの平均分子量が、１０００〜３０００である請求項６又は７記載の皮膚改善剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−７４８４６（Ｐ２００８−７４８４６Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１８９４８（Ｐ２００７−２１８９４８）
【出願日】平成１９年８月２４日（２００７．８．２４）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２４日（２００７．８．２４）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
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